JPS60500717A - リポ−タ−グル−プを含んでいる一定配列の1本鎖オリゴヌクレオチド、およびその化学的合成法 - Google Patents
リポ−タ−グル−プを含んでいる一定配列の1本鎖オリゴヌクレオチド、およびその化学的合成法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
リポータ−グループを含んでいる一定配列の1本鎖オリゴヌクレオチド、その化
学的合成法およびその合成法に有用なヌクレオシド
技術分野
本発明は、細胞系または細胞不含系に於いて、問題としている相補的な核酸配列
の同定、位置づけ、および検出に有用な一重鎖オリゴヌクレオチドであって、そ
の塩基(こ、1またはそれ以上の検出可能なリポータ−グループとして機能し得
る置換基が結合しているか、または1またはそれ以上の検出可能なリポータ−グ
ループが結合している、1またはそれ以上のヌクレオチド単位を含んでいる、長
さが200塩基単位9、下の定まった配列の1本鎖オリゴヌクレオチドに関する
。
発明の背景
ニックトランスレーション法(p、 Rigbyら、J、Mol。
Biol、 113 : 237−251.1977年゛)また(まギャップ充
填反応(G、Bourguignonら、J、Viro120 : 290−3
06.1976年)による2本鎖DNAへの放射性同位元素の挿入を含む先行技
術を用G)て、標識した2本鎖デオキシポリヌクレオチドを酵8を用いて製造す
る方法は確立されている。具体的には、DNaselCより切れ目をつくり、D
NAポリメラーゼを用いてDNA鎖iこ活って翻訳させる。このニックトランス
レーション過程では、大腸菌からのDNAポリメラーゼ(PolI)は、添加し
たデオキシヌクレオシド三燐酸の存在下で、2本鎖DNAの1本鎖の切れ目領域
の3′水酸基末端方向へヌクレオチドを縮合していく。
同時に、この酵素は切れ目の5′末端からヌクレオチドを除去していく。もし添
加するこの三燐酸体の1またはそれ以上を、例えは32P燐酸で標識しておくと
、P01■ζこよる新しい鎖にこの標識が導入される。ギャップ充填法
【こよれ
は、制限酵素で切断した後のくはんだ末端をI’ol Iからのクレノー断片ま
たはT4DNAポリメラーゼを用いて充填することができろ。
ニックトランスレーションおよびギャップ充填法のいずれによっても、標識され
た2本鎖DNAが得られる。この生成物の長さはDNase Iをどれくらい反
応に加えるかによる。通常、標識の30%が導入され、鎖の長さが400〜80
0ヌクレオチド単位になる採に行なう。生成物の長さは、400〜800単位の
範囲内では予測できない程度に不均質である。標識したヌクレオチドと同様に酵
素を保存するために、通常各反応容器中、1マイクログラムのDNAだけを標識
する。
c−5位を炭素鎖で修飾したピリミジン塩基を持った2本鎖ポリヌクレオチドが
同様の方法で酵素的に製造されティる。これは、J 、Sagi ら(Bioc
hem、Biospbys。
Acta、5Q5 :196−201.1980年)によって報告されているホ
モポリマーのプライマー鋳型の酵素的伸長法、またはP、Langerら(Pr
oc、Nat、Acad。
Sci、USA 78:6633−6637.1981年)によって報告されて
いるビオチンに共有結合した2′−デオキシウリジン5′−三燐酸を使って、D
NAポリメラーゼにヨリニックトランスレーション/ギャップ充填することによ
って行なわれた。このビオチンは、アビジンのための認識部位として機能し得る
。
Rigbyら、Bou r gu i gnonらおよびLanger らによ
って記載されている酵素法壜こよって、同様の物理的特性を持った生成物が得ら
れる。この酵素法によって製造されたポリヌクレオチドは、長さが400〜80
0単位であり、出発物質として2本鎖ポリヌクレオチドを必要とし、全ゆる場合
に2本鎖ポリヌクレオチドを生産し、そして、予め選択された部位を標識化する
ことができない。
更に、全ての酵素法は、ポリヌクレオチドの両方の鎖を修飾し、生成した鎖を互
いに分離することができない。この方法によれば、酵素は全ての単位を、修飾し
た単位で置き換えるか、あるいは、修飾されたヌクレオシド三燐酸および天然の
ヌクレオシド三燐酸の混合物を添加した場合は、修飾された単位をランダムに挿
入していく。更に、Langer らの酵素法では、螢光性、発光性または抗原
性のレポーターグループを挿入したポリヌクレオチドを製造することはできない
。この技術のいずれを用いても、レポーターグループを持った、あるいは持たな
い、定まった長さの、定まった配列または一本鎖特性のオリゴヌクレオチドを製
造することはできない。更にまた、この先行技術の方法では、レポーターグルー
プが付着した修飾された塩基を、ポリヌクレオチドの予め定められた位置に挿入
することもできない。
c−B位を修飾されたアデニン塩基を取り入れた2本鎖ポリヌクレオチドも酵素
法で製造されている。これは、C:、VincenLら(Nucl 、Ac1d
s Res、 10 : 67B7−6796.1982年)によって報告され
ている様に、DNAフラグメントに8−アミノへキシルアミノ−ATP (リボ
ヌクレオチド)を挿入すること(こより行なわれた。しかしこの方法は範囲が限
定されており、アデニンリボヌクレオチドの三燐酸により3′−末端だけを標識
することができる。修飾したピリミジンヌクレオシドは挿入することができない
。更瘉こ、他の酵素法と同様、2本鎖ポリヌクレオチドの両鎖が標識され、定ま
った配列の短い(<100単位)オリゴヌクレオチドを製造することができない
。
上記の先行技術としての酵素法は、置換されたヌクレオシド5′−三燐酸の化学
合成が必要であり、次いで酵素的な認識およびこの非天然の基質の、切れ目をつ
けた2本鎖DNAへの挿入が必要である。この様な方法は、予め選択した長さま
たは配列のポリヌクレオチドを製造することができす、かつ、ここで使用するポ
リメラーゼやI)Na s eは高価なものである。更に、これらの方法は時間
がかかり、非能率なものて丙り、高い酵素活性を必要とし、2本鎖DNAに限定
されている。
はんの少量の、即ち数マイクログラムのはつきりしないポリヌクレオチド、通常
制限フラグメント、が生産されるだけであるので、これらを天然起源のものがら
煩雑な方法で分離しなくてはならない。更に、DNAポリメラーゼは、螢光また
はジニトロフェニルの様な潜在的(こ有用なリポータ−グループを認識したり挿
入したりできないので、このポリヌクレオチド生成物においては、達成し得る修
飾の範囲が著しく制限される。
限られた生物学的応用のために、長いポリリボヌクレオチド分子(RNA )の
3′末端に1つの螢光分子を取りつける方法がJ 、G、J 、Bauman
らによって開示されている(J 、tlistochem、C:ytochem
、 29二238.1981年)。この方法も、酵素法を使って天然の起源から
煩雑な方法で分離した極く少量(マイクロダラム量)のRNAを使用しており、
この方法には2′および3′の水酸基が必要であるのてl) N Aに応用する
ことはできない。また、DNAに比較してRNAが化学的に遥かに不安定である
ことが、この方法によって製造されたポリリボヌクレオチドの応用範囲を狭くし
ている。
天然の核酸塩基を持った、定まった配列のオリゴヌクレオチドの非酵素的合成法
は、S、A、Narangら(Meth。
Enzymol 65 : 610.1980年)、R,Le t s ing
e r(J、Org、Chem、45 : 2715.1980年)、M。
MaLteucciら(J、Amer、 Chem、 Soc、103 : 3
185、]9982年およびG、Al varado−TJrbinaら(Sc
ience2]4:270.1981年)(こより報告され、またはまとめられ
ている。この様な合成法は、通常、活性化したヌクレオチドモノマーを、生長す
るヌクレオチド鎖の遊離水酸基−含有末端単位とカップリングさせることにより
鎖伸長を行なうものである。このカップリングは、Narangらによってまと
められているホスフ法の1つn→や→り同様、燐含有基を介して行なわれる。後
者の内、LetsingerらおよびAl varado−IJrbinaらの
方法はホスホアミダイトの化学を使用し、MatL−cucciらの方法はホス
ホアミダイトの化学を使用している。
」二記のオリゴヌクレオチドの化学合成では、修飾すれていない、即ち天然の核
酸塩基だけを挿入するのであるから、その目的生成物は短かいフラグメントにあ
り、修飾されていない、即ち天然のR’N AまたはDNAに似ている。この様
な合成の目的生成物は、標識もリポータ−グループも挿入していないという点に
注意すべきである。
ホモポリマーポリヌクレオチドの直接的な修飾は、ポリウリジル酸系で報告され
ている(Biggeう、J −Carb、。
Nucleosides、 Nucleotides 8: 259.1981
年)。
しかし報告された方法は範囲が限定されており、有用な生成物を製造し得ない。
その処置法は、著しいポリヌクレオチドの開裂と破壊を引き起し、除去できない
金属イオン類が混在した生成物が得られ、しがもこの方法は、DNAポリヌクレ
オチドのシトシン残基だけを修飾できる1こ過ぎない。更にこの方法は、特定の
長さの定まった配列のオリゴヌクレオチドを製造することができず、チミンまた
はプリン塩基を修飾することができず、そして予め選択した部位を修飾すること
ができない。
以上の記載から明らかな様に、従来、定まった配列のポリヌクレオチドは、既述
した様な欠点、特に時間、費用、生成物の長さ、配列および収率に関する欠点を
持った酵素法によってαみ生産されて来た。更に、この様な方法は2本鎖生成物
を生産し得るに過ぎない。
2本鎖ポリヌクレオチドは、溶液中でアルカリまたは熱により変性し、短時間、
鎖を自然に分離することができる。しかし、個々の1本鎖を物理的に、互いに分
離することはできず、そしてまた、変性条件を取り除くと、急速(こ自然の2本
鎖の形に戻る。ハイブリダイゼーションを行なうための条件は、自然復帰のため
の条件でもあるので、変性したポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションの条
件下に置(と、このポリヌクレオチドはその元の2本鎖配置に戻る。従って、ど
ちらか一方の鎖と標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションは、もう一
方の鎖との競合によって制限を受ける。
ヌクレオシドの修飾は、例えば抗ウイルス性C−5置換ピリミジンヌクレオシド
の合成(Bergstrom ら、J、Amer、Chetn、Soc、98:
1587 1589.1976年 :RuLhら、 J、Org、 Chem、
4 3 : 2 8 7 0 −2 876.1978年:およびBergs
tromら、米国特許第4.247,544並びに4.267,171号参照)
またはc−B置換アデニン誘導体の合成(Zappel l iら、米国特許第
4,336,188並び(こ4,199,498号参照)において行なわれてい
る。これらのヌクレオチドおよびLangerらおよびD 、Wa r d に
よって報告されているもの(ヨーロッパ特許出願第0063’879号)は、本
発明方法に於いては有用でない。この様な報告されているヌクレオシドは、望ま
しくない部位での反応性が高く、これを化学的方法によるオリゴヌクレオチドの
合成に使用すると、望ましくない副産物が得られたり、コントロールできない合
成が行なわれたり、所望の生成物か得られなかったりする。更(こ、上記のヌク
レオシドは、置換基中に適当な部位を持っておらず、リポータ−グループを結合
させて修飾することができず、また゛、マスク(遮蔽)した反応性官能基も持っ
ていない。この様なヌクレオシドは、いずれも本発明方法に於いては有用でない
。
リポータ−グループを持った、あるいは持っていない、何らかの修飾された塩基
が導入されている定められた配列のオリゴヌクレオチドの化学合成について記載
された先行技術は全くない。
危険な、そして不安定な放射性同位元素を含んでいない、高品質の標識された一
定配列の1本鎖オリゴヌクレオチドの速やかな出現が待たれており、この要求を
満たすことが本発明の主たる目的である。この目的が、予測可能な、優れた製品
を高収率で与える化学的方法、即ち非酵素的方法により達成された。更に詳しく
は、本発明方法は、定められた配列のオリゴヌクレオチド中への、多種多様の選
択された検出可能なリポータ−グループで修飾されたヌクレオチドの化学的導入
を達成したものであり、この様なオリゴヌクレオチドは、例えば、問題としてい
る相補配列の同定、位置づけ、分離そして/または定量に有用である。
本発明のもう1つの目的は、標識した、定められた配列の1本鎖オリゴヌクレオ
チドの化学的合成(こ有用な新規なヌクレオシドを提供するものである。
本発明方法は、標識した、定められた配列のオリゴヌクレオチドの新規な化学合
成法であり、種々の而で先行技術の酵素法に優るものである。更に詳しくは、従
来の酵素法(こよる2本鎖性の、不均質な予測不能な400−10,000塩基
単位のものの生産とは異なり、本発明方法は、好ましくは200塩基単位以下の
、均質な、予測可能な様に定められた長さの、標識された、定められた配列の1
本鎖オリゴヌクレオチドの合成を可能にするものである。
本発明方法(こよって製造される生成物の収量は、先行技術の酵素法によって得
られる2〜3マイクログラムの収量と違って、数百〜致方マイクログラムのオー
ダーである。更に、本発明方法で得られるオリゴヌクレオチドは、酵素法で得ら
れる2本鎖と違って、1本鎖である。オリゴヌクレオチド生成物が1本鎖形態で
あることは、2本鎖ポリヌクレオチドの再ハイブリダイゼーション(こつきもの
の相補鎖からの競合を回避で本発明は、約200塩基単位の長さより短い、定め
られた配列の1本鎖オリゴヌクレオチドであって、]種またはそれ以上の検出可
能なリポータ−グループとして機能し得るか、あるいはまた、1種またはそれル
、」−の検出可能なリポータ−グループと結合し得る置換基が、その塩基の立体
的(こ耐容性のある部位(例えはピリミジンのc−5、プリンのC−8)に結合
している様なヌクレオチド単位を少なくとも1個含んでいる1本鎖オリゴスクレ
オチドを提供するものである。本発明はまた、定められた配列のj本鎖オリコヌ
クレオチドの化学的合成法、即ち、非酵素的合成法を提供するものであり、該方
法は、活性化されたヌクレオチドモノマーと、伸長しつつあるヌクレオチド鎖の
遊離の水酸基を持った端末単位とをカップリングさせることからなり、該七ツマ
−および端末単位の少なくとも一方が、その塩基の立体的に耐容性のある部位に
、1種またはそれ以上の検出可能なリポータ−グループとして機能し得る、ある
いは1種またはそれ以上の検出可能なリポータ−グループと結合し得る置換基が
結合することによって修飾されていることを特徴とするものである。更にまた、
本発明はこの合成法に有用な新規なヌクレオシドを提供するものである。
本発明方法によって製造されるオリゴヌクレオチドは、1種またはそれ以上のピ
リミジンを塩基とする、またはプリンを塩基とする単位を含んでいて、その単位
はりボヌクレオチドであってもデオキシリボヌクレオチドであってもよく、その
合成前に、リポータ−グループか結合する特定のヌクレオチド単位と同様、その
リポータ−グループも、予め選択される。
本発明を実施する上の最も好ましい態様本発明の定められた配列の1本鎖オリゴ
ヌクレオチドを合成するための好ましい化学的方法は、活性化されたヌクレオチ
ドモノマーと、伸長しつつあるヌクレオチド鎖の、遊離の水酸基を持った端末単
位の少なくとも一方か、その塩基の立体的に耐容性のある部位に、1種またはそ
れ以上の検出可能なリポータ−グループとして機能し得る、あるいは1種または
それ以上の検出可能なリポータ−グループと結合し得る置換基が結合することに
よって修飾されているという特徴を有する該ヌクレオチドモノマーと該端末単位
をカップリングさせることからなる。
リポータ−グループと結合し得る本発明をこ於ける置換基は、一般的(こ核性の
性質を示すものであると言うことができる。この様な置換基の例としては、第1
級アミン、芳香族アミン、カルボン酸、水酸基などを含んでいるものが挙げられ
る。
ヌクレオチドモノマーおよび端末単位の塩基は、目的生成物であるオリゴヌクレ
オチド中fこ希望する予め定められたヌクレオチド単位の配列が得られる採に選
択される。この様な塩基はプリン類であるアデニン(5)、グアニン0、または
ヒポキサンチンσカの形をとるか、あるいはピリミジ7類であるウラシル劫、シ
トシンC)、またはチミン(1)の形をとることができる。この様な塩基はまた
、天然から単離し得るその他の塩基の形をとっていてもよい。
ヌクレオチド単位上の立体的に耐容性のある部位とは、その単位の核酸塩基上の
位置であって、その位置1こ、置換基が結合すること1こよって該単位が修飾さ
れるものであり、その際、生成物であるオリゴヌクレオチドと相補的核酸成分と
のハイブリダイゼーションが重大な妨害を受けず、そして該置換基が1若しくは
それ以上のリポータ−グループとして機能したり、あるいは1若しくはそれ以上
のリポータ−グループに結合するのが立体的に妨げられない様な位置であると定
義することがでへる。立体的に耐容性のある部位はプリン類のc−3位、ピリミ
ジン類のc−5位である。本発明のオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーシ
ョン用のプローブとして特に有用であるので、置換基および/またはリポータ−
グループを取り付ける修飾は、特定のハイブリダイゼーションに必要なピリミジ
ンまたはプリン塩基上の部位で行なわれてはいけない。修飾されてはいけない部
位には、アデニン塩基のNlおよび4、グアニン塩基のN】、平およびび、シト
シン塩基の繕およびMなどが含まれる。一般的に、ヘテロ原子(NまたはO)へ
の置換は避けるべきである。
リポータ−グループとは、芳香族および/または多環式グループであってよく、
適当な物理的または化学的検出系あるいは検出法によって容易に測定または検出
し得る物理的あるいは化学的特性を持った化学的グループであると定義すること
ができる。本発明に於けるオリゴヌクレオチドに有用なリポータ−グループは容
易に検出てきる。容易な検出能は、色の変化、発光、螢光または放射活性の様な
特性によって与えられる。
あるいはまた、リポータ−グループがリガンド解職部位として機能し得ること(
こよっても、検出能は得られる。この様なグループは、機能的には着色、発光、
螢光、放射活性またはリガンド認識グループと呼ばれる。
この様なグループの中には、通常の検出技術、例えば比色検出、分光光度検出、
螢光検出または放射活性検出などによって検出するのに適したもの、あるいは、
この様な通常の検出法によって検出てきるグループを含んでいる特定のりガント
−リガンド複合体の形成に関与し得るものなどがある。
本明細書(こおいては、リポータ−グループは、適当な測定法または検出法を使
って容易に測定または検出できる物理的、化学的またはその他の特性を持った置
換基であると定義される。ここで定義されたリポータ−グループには、適当な測
定法または検出法を使って容易に測定または検出できる物理的、化学的またはそ
の他の特性を持った反応生成物または複合体を最終的に与える1若しくはそれ以
上の相互作用、を開始させることができる置換基も含まれる。
この様なグループ、反応生成物または複合体が持っている、あるいは引き起す測
定可能な、あるいは検出可能な特性の例は、色の変化、発光、螢光または放射活
性である。この様な特性は通常の比色計、分光光度計、螢光分析計または放射活
性検出計を使って測定または検出することができる。
ここで定義したリポータ−グループ(こよって開始され得る相互作用には、例え
ば比色法、分光光度法、螢光法または放射活性検出法などによって容易に検出し
得るグループまたは複合体を生成する適当に特異的で選択的なりガント−リガン
ド相互作用が含まれる。この様な相互作用は、タンパク質−リガント、酵素−基
質、抗原−抗体、炭水化物−レクチン、タンパク質−補助因子、タンパク質−作
動因子、核酸−核酸または核酸−リガント相互作用などの形をとることがある。
このリガンド−リガンド相互作用の例として、ジニトロフェニル−ジニトロフェ
ニル抗体、ビオチン−アビジン、オリゴヌクレオチド−相補性オリゴヌクレオチ
ド、DNA−DNA、RNA−DNAおよびNADH−デヒドロゲナーゼなどが
挙げられる。当業者であれば、その他の有用な相互作用についても思い浮ぶこと
であろう。
本発明方法に於いては、選択されたリポータ−グループ(群)は、ヌクレオチド
鎖の端末単位にカップリングさせる前のヌクレオチドモノマーに取り付けてもよ
いが、オリゴヌクレオチド生成物ができ上った後に取り付けることもできる。オ
リゴヌクレオチド生成物におけるヌクレオチド単位の配列は、その最終的な用途
のための正確な特異性を持ったオリゴヌクレオチドが得られる様に、予め選定し
ておく。本発明のオリゴヌクレオチドは、組換えI) N Aおよび核酸の再ハ
イブリダイゼーション技術が関与するその他の泪画を行なうのに有用である。そ
の様な用途として、細胞系または細胞不含系において注目している相補配列の同
定、位置づけ、分離および/または定量などが挙げられる。
更に詳しくは、その様な用途(こは、核酸成分のハイブリダイゼーションが関与
する全ゆる基礎的な生物学的操作または診断的応用、あるいは、立体的に耐容性
のある部位の修飾によってオリゴヌクレオチド生成物を固形担体lこ結合させた
場合の、アフィニティークロマトグラフィーによる相補配列の精製(その後検出
するか否かは不問)が含まれる。
オリゴヌクレオチド生成物中のヌクレオチド単位はプリンまたはピリミジンを塩
基とするものであり、修飾きれた塩基を持った単位とまさり合った天然の塩基を
持った単位を含んでいてもよい。この様な単位はりボヌクレオチド、またはデオ
キシリボヌクレオチドである。カップリング工程は、3′位が活性化されたモノ
マー単位と、伸長しつつあるヌクレオチド鎖の端末単位の遊離の5′ヒドロキシ
をカップリングさせるのが好ましい。あるいは、5′位を活性化したモノマー単
位を、ヌクレオチド鎖の端末単位の遊離の3′ヒドロキシとカップリングさせる
こともできる。この端末単位は、ヌクレオチドモノマーがカップリングする時の
、伸長するヌクレオチド鎖の最初の単位、即ち唯一の単位であるか、あるいは複
数個のヌクレオチド単位群の端末の1つである。
本発明方法により、以下の一般式で示される定まった配列のオリゴヌクレオチド
が生産される。
式中、nは1〜約199、好ましくは約5〜約60、最も好ましくは約10〜約
40.R’は水素またはヒドロキシ、Bは天然に存在するプリンまたはピリミジ
ンクレオチド単位は、それぞれ修飾された塩基(Bol)を持った1またはそれ
以上のヌクレオチド単位と混じり合ッテイル。修飾されたピリミジン塩基(Py
m)ハ、c−5位が置換されたものであり、その典型的な例は以下の一般式で示
されるウラシルおよびシトシン塩基であ修飾されたプリン塩基(Pu )はc−
3位が置換されており、その代表例は以下の一般式で示される修飾されたアデニ
ンおよびグアニン塩基である:置換基には、1またはそれ以上のリポータ−グル
ープとして機能し得る、あるいは]またはそれ以上のりポーターグループ5こ結
合し得るという特徴を持っている。修飾されたピリミジン塩基では、置換基には
2またはそれ以」二の炭素原子を含んでおり、一方、修飾されたプリン塩基ては
、kは1またはそれ以上の炭素原子を含んでいる。これ瘉こ関し、kは以下の官
能化された炭素鎖の1つの形をとるのが好ましい:R== −CI4=GRIR
2、−C:l−12CI(RIR2、−CHR1’R2、−CH=CH,−CN
HR2または−(:I−I=(:R1−C−g2上記式中、当は水素またはアル
キル、−はアルキル、アルケニル、アリールまたは官能化されたアルキル、アル
ケニル、アリール(ここで官能基には1またはそれ以上のアミン、アミド、ニト
リル、カルボン酸、カルボン酸エステル、ヒドロキシ、ジニトロフェニル、アミ
ノベンゼンスルホネートなどが含まれる)、Zは窒素、酸素または硫黄の如き多
価へテロ原子である。
更(こ、−は固形担体あるいは、例えば着色、螢光、発光、放射活性またはりが
ンド認識基として機能する1またはそれ以上のリポータ−グループに結合してい
てよい。機能的な螢光基(こは、フルオレセイン、ローダミンなど、およびそれ
らの伺加物が挙げられる。機能的な発光基には、ルミノール、アクリジン、ルシ
フェリン、ジオキセタン、ジオキサミドなど、およびそれらの付加物か挙けられ
る。リガンド認識基には、蛋白質とのリガンド様相互作用【こよって認識し得る
、あるいはその様なりガント様相互作用を誘導し得るビタミン(例えはビオチン
、イミノビオチンまたはデスチオビオチン)、抗原、例えばジニトロフェノール
、炭水化物およびその他の官能基またはその様な基の付加物が含まれる。核酸と
相互作用し得るもう1つのオリゴヌクレオチドは、リガンド様相互作用を誘導し
得る基の例である。リガンド認識基はまた、認識によって着色が生じる場合は、
機能的な着色リポーターグループニしても役立つ。例えば、ジニトロフェニルを
リポータ−グループとして使用した場合、検出系として、色の変化を生じるパー
オキシダーゼと結合した抗ジニトロフェニル抗体を用いた既知の検出系を使用す
ることかできる。機能的な放射活性基は、選ばれたリポータ−グループ中(こ放
射活性要素を含んでいる。
本明細書に於いて、プリンまたはピリミジン塩基という表現を使用する場合は、
その様な塩基の類似体をも含んでいるものとする。この様な類似体には、デアザ
シトシン(ツベルクリン、ホルミシンなど)の様なプリン塩基類似体、デアザウ
ラシル、デアザシトシン、アザウラシル、アザウラシルなどの様なピリミジン塩
基の類似体か挙げられる。
式Iのオリゴヌクレオチドは、以下の式で示さ九るモノマーヌクレオチド類似体
単位から、化学合成により製造するのが最もよい:
ここで馬=メチル、クロロフェニル;X−クロロ、ジアルキルアミノ、モルホリ
ノ
上記式中、殆はトリチル(トリフェニルメチル)、ジメトキシトリチル、または
5′−ヒドロキシの為のその他の適当なマスキング基であり、Bおよびに′は、
適切ならばマスクされており、■はオリゴヌクレオチド生成物の合成に於ける鎖
伸長に際し、ヌクレオチド間結合形成に適した燐含有基である。ヌクレオチド間
結合形成に適した燐含有基■の好ましいものはアルキルホスホモノアミダイトま
たはアルキルホスホモノアミダイトである。あるいは、ホスフェートトリエステ
ルをこの目的に使用してもよい。このモノマー単位はまた、3′ヒドロキソに結
合したちおよび5′−ヒドロキシに結合した■を持っていてもよい。
一般に、「マスキング基」または「ブロッキング基」という用語は、完全な官能
基の化学反応性を変化させ、望ましくない反応を起さない採に、その官能基に第
2の部分を結合させて、その官能基を化学的(こ修飾することまたは「ブロック
」することの機能的な表現である。この様な修飾は可逆的であり、適当な処理に
よってもとの官能基に変換することができる。多くの場合、この様なマスキング
は、形のよでは構造的な機能性の相互変換である。例えば第1級アミンはアセチ
ル化によってマスクされて置換アミドとなり、これはその後適当な加水分解によ
って第1級アミンにもどすことができる。
式■の化合物には、その許容し得る共役酸塩も含まれる。この様な塩の製造fこ
使用し得る共役酸は非反応性のカチオンを含むものであり、例えば窒素含有塩基
、例えばアンモニウム塩、モノ−、ジー、トリーまたはテトラ−置換アミン塩な
と、あるいは適当な金属塩、例えばナトリウム、カリウムなどの塩である。
以下に本発明の製造工程を概説し、図式的に例示する。その後、本発明をより具
体的に例示し、詳細な説明を挙げる。本発明はピリミジンを塩基とするヌクレオ
チド単位およびプリンを塩基とするヌクレオチド単位の両者を含んでいるオリゴ
ヌクレオチドに関するものであるので、合成過程でピリミジンセよびプリンを塩
基とする固化合物を使用するものを例示する。例示した個々のピリミジンおよび
プリンを塩基とする化合物は、それぞれピリミジンおよびプリン群の一例をこ過
シ
ぎず、それらは、適当であるかまたは所望の場合、その製造工程およびオリゴヌ
クレオチド生成物fこおいて、それぞれの群の他のもので置き換え得るものと理
解されるべきである。大部分に於いて、デオキシリボヌクレオチドを示したか、
本発明はりボヌクレオチドをも意図するものであると理解されるへきであり、オ
リゴヌクレオチド生成物中に於いてリボヌクレオチド化合物か必要である場合は
、デオキシリボヌクレオチド化合物をリボヌクレオチド化合物で置き換えること
ができる。
本発明のより重要な点は、新規なオリゴヌクレオチドの合成法(こ於ける中間体
として必須である新しいヌクレオシド群を提供することである。この様なヌクレ
オシドは全て、官能化された炭素鎖と1またはそれ以上のアミドからなる置換基
によって修飾された塩基を持っており、このアミドの窒素は、この塩の立体的に
耐容し得る部位に、炭素鎖を介して結合している。ピIJ ミジンを基礎とする
ヌクレオシドの場合は、炭素鎖はc−5位に結合しており、プリンを基礎とする
ヌクレオシドの場合は、炭素鎖は多価へテロ原子、例えば窒素、酸素または硫黄
を介してc−3位で結合している。更(こ、この様なヌクレオシドは、オリゴヌ
クレオ+l’の化学合成(こ適した、例えばジメトキシトリチルの様な基で、5
′位(または3′位)が化学的にブロックされている。
この新規なヌクレオシド群に於いて、置換基は−C112C1−TRI GnH
2oY 、 −CH−CRI CnH2,Y 。
から選ばれる。ここ(こ於いてへは水素またはC1−6低級アルキル、Yは]ま
たはそれ見、上のアミド、置換アミド、置換アミノまたは置換アミノアルキルフ
ェニル基である。より詳しくは、Yは1またはそれり、上の1
−NIICCX3(Xは水素、弗素または塩素)を含んでぃてよい。これらのヌ
クレオシドおよびそのマスクされたものの合成は、実施例I、IF、■、Vl、
VI、vui、X、XI および■ に記載しである。好ましいヌクレオシドは
、ピリミジンヌクレオシドのC−51こ置換基を持っている。最も好ましいのは
、ピl) ミジン塩基がウラシルであるヌクレオシドである。
本発明方法は、選択したヌクレオシドの製造から開始することができる。一般に
、最も好ましいヌクレオシドは以下の如くして製造するのが最もよい。Berg
s−trom およびRu L h の方法[J、Amer、chem、Soc
、96 :1587(1976):lにより、2′−デオキシウリジンから5−
(メチル3−アクリリル)−2′−デオキシウリジンを製造する。次いでこのヌ
クレオシドをピリジン中、105当量のジメトキシトリチルクロリドで処理して
5′ヒドロキシをジメトキシトリチル(+)MT)で保護する。2%のトリエチ
ルアミンを含有するクロロホルム中の0〜10%メタノールのグラジェントで溶
出するシリカクロマトグラフィー(こより、得られた生成物を精製する。精製し
たs’ −D MT−5−(メチル3−アクリリル)−2’−デオキシウリジン
を、周囲温度ニテ、INKOtIて24時間処理し、メチルエステルを加水分解
する。得られた5’−DMT−5−(3−アクリリル)−2′−デオキシウリジ
ンを、ピリジン中の過剰のジシクロへキシルカルボジイミドおよびヒドロキシベ
ンズトリアゾールで処理する。4時間後、2〜5倍過剰量の1.7−ジアミノへ
ブタンを加え、反応物を一夜撹拌する。12〜20時間後、10〜20倍過剰量
の無水トリフルオロ酢酸を加え、反応物を室温で4時間撹拌する。2%のトリエ
チルアミンを含有するクロロホルム中の0〜10%メタノールのグラジエンで溶
出するシリカクロマトグラフィー、次いて1チのトリエチルアミンを含むメタノ
ールて溶出するセファデックスL H−20を用いた排斥クロマトグラフィーに
より、生成物を精製する。適切なフラクションを集めると、5/DMT−5−[
N −(7−トリフルオロアセチルアミノヘプチル)−1−アクリルアミド]−
2′−デオキソウリジンが得られる。この生成物は、実施例Wおよびxvl[に
記載したホスホクロラダイト法(こよるオリゴヌクレオチド合成に適切である。
別法として、この化合物は実施例IIおよび111に記載した方法を組み合せて
製造することもてきる。この方法に於けるジアミノへブタンを他のジアミノアル
カン(例えはジアミノプロパン、ジアミノヘキサン、ジアミノドデカン)で置き
換えると、nが3.6まfこは12てあり、基を持った他の化合物が得られる。
この様な2つのヌクレオシド、1つはピリミジン(ウラシル)を塩基とし、他方
はプリン(アデニン)を塩基とするものを、この方法を例示する後記の図式の最
初fこ示した。次いで、反応1に示す様(こ、例えばアデニンを基礎とするヌク
レオシドの6位のアミンにベンゾイル基(Hz )全結合させること(こよって
、ヌクレオシドの塩基上の反応部位をマスクする。この様なマスキング(こつぃ
テハ、[5ynthetic Procedures in Nuclcic
Ac1d (:hemisLryJ、第1巻、W、ZorbachおよびRoT
ipson 編、Wi 1ey−4nt −erscience、N、Y、+
1968に一般的に記載されている。
反応11こ示す様に、例えば、トリフルオロアセチル基(Aりを結合させること
fこよって置換基」二の非保護アミンをマスクする。
次いて、ヌクレオシドの選択した3′または5′ヒドロキシを、ジメトキシトリ
チル(IMI’)基を結合させることによってマスクする。後に示す反応2に於
いては、5′−ヒドロキシをマスクし、3′ヒドロキシを遊離、即ち反応し得る
採にしておく。あるいはまた、3′ヒドロキシをマスクし、5′ヒドロキシを遊
離にしておいてもよい。
次いでこのヌクレオシドを、好ましくはその3′ヒドロキシに、活性化部分を含
んでいる燐含有基を結合させることによって、活性化されたヌクレオチドモノマ
ー(こ変換する。この修飾されたヌクレオシドを適当にブロックする場合は、L
etsingerら、MatteuCCiらによって記載された方法、またはN
arang によってまとめられた方法の改良法をオリゴヌクレオチド合成に使
用することができる。1.、etsingcrらlこよって記載されている様な
ホスホアミダイト化学を用いる方法は実施例XVI −XVNに詳しく述べであ
る。ホスホアミダイト化学を使用する(こけ、Dorper らの改良法[Nu
cleicAcids Res、11 : 2575 (1983) ]と同様
、Mattcucciらの方法の修正法を使用し、保護された、修飾されたヌク
レオシドをメチルクロロ(N、N−ジイソプロピル)ホスホアミデートまたはメ
チルクロロ−ホスホモルホリゾートでホスフィチル化する。あるいは、保護され
、修飾されたヌクレオシドを室温でトリメチルホスフェート中、1.2当量のク
ロロフェニルジクロロホスフェートでホスホリル化し、次いで水に入れて、修飾
されたヌクレオシドの3′−クロロフェニルホスフェート付加物を得ることがで
きる。この様な付加物は、Narang らによって例示的にまとめられている
様(こ、ホスホトリエステル・アプローチの修飾(こ有用である。反応3の図式
は、塩素が活性化部分として機能スるホスホモノクロリダイト基をヌクレオシド
の3′ヒドロキシに結合させることによる、式■の活性化モノマーヌクレオチド
単位の合成を示している。
選択された活性化ヌクレオチドモノマー、即チウラノルを塩基とするモノマーま
たはアデニンを塩基とするモノマーの、伸長しつつあるヌクレオチド鎖の端末単
位へのカップリング即ち縮合は、図式の反応4(こ示しである。ヌクレオチド鎖
は、その右側末端に、天然(こ存在する塩基およびその3′ヒドロキソに結合し
たマスキング基に4または固形の担体を持ったヌクレオシド単位を含む様に描い
である。例示した鎖はまた、天然に存在する塩基を持った1またはそれり、」二
(n′)のヌクレオチド単位を含んでおり、この単位はヌクレオシド単位の5′
ヒドロキシ(こ結合しており、ヌクレオチlj 単位の末端のものは5′位に遊
離のヒドロキシを持っている。このカップリング反応をこ於いて、モノマーの塩
素か端末単位の遊離ヒドロキシの水素と反応して除去され、かくして、図示した
様に端末単位の酸素がモノマーの燐にカップリングし、このモノマーがヌクレオ
チド鎖の新しい端末単位となる。
次いてDMT5’ブロッキング基を除去し、さらに活性化ヌクレオチドモノマー
単位を次々とカップリングさせてヌクレオチド鎖を伸長させ得る様(こする。鎖
に付加するヌクレオチド単位は予め選択することかでき、天然に存在する塩基ま
たは修飾された塩基のいずれかである。天然に存在する塩基を持った1またはそ
れ以」二(n”) のヌクレオチド単位を付加することによる更なる鎖の伸長を
図式の反応4afこ示す。
選択された長さ及び配列のオリゴヌクレオチドを合成したら、その端末単位から
D M T基を除去し、マスクした反応性基を脱マスクする。反応性基が脱マス
クされた修飾されたウラシルおよびアデニン塩基の例を反応5に図式的に゛示す
。鎖の最初のヌクレオチド単位が固形担体に4(こ結合している場合は、その固
形担体から鎖を切り離す。脱マスクの適切な順序は予め選択することができる。
修飾された塩基の置換基が、オリゴヌクレオチド合成生成物の意図する用途に於
いてリポータ−グループとして機能し得ない場合は、反応6(こ例示した様(こ
、適当なリポータ−グループ殆をその様な置換基瘉こ結合させることがてきる。
反応6は、塩基のそれぞれの置換基に結合したリポータ−グループを持ったそれ
ぞれの塩反応4
上記式中、例えば、オリゴヌクレオチド生成物中の1 は以下の通りである:
リポータ−グループを持ったオリゴヌクレオチド生成物(R15ニビオチンまた
はフルオレセイン)
本発明の工程を一般的(こ説明し、図式化して示したが、その説明した各反応(
こつぃて、以下により詳細に説明する。
反応1について、シトシンのN4、アデニンの炉、グアニンのN2、および修飾
された塩基のアルキルまたはアリールアミンの様な化学的に反応性のあるアミン
の、適当なマスキング基によるマスキングは、アルコール類、ピリジノ類、ルチ
ジン類、クロロホルムの様な適当な溶媒中、ヌクレオシドを過剰量の適当な酸無
水物と、0℃〜110℃の範囲の温度、通常20℃〜80℃で、約1〜24時間
反応させることにより好適lこ実施することができる。適当な酸無水物には無水
酢酸、無水トリフルオロ酢酸、無水安息香酸、無水アニス酸などがある。好まし
いのは無水酢酸、無水トリフルオロ酢酸、無水安息香酸および無水イソ酪酸であ
る。
反応2に於ける5′−ヒドロキシのマスキングは、ヌクレオシドをやや過剰量の
適当な酸lこ不安定なマスキング剤、例えばトリチルクロライド、モノメトキシ
トリチルクロライド、ジメトキシトリチルクロライド(DMTC/)、トリメト
キシトリチルクロライドなどと反応させること(こより好都合に行なうことかで
きる。好ましいのはジメトキシトリチルクロライドである。典型的な反応は、例
えばピリジン類、ルチジン類、トリアルキルアミン類などの適当な溶媒中、−2
0°C〜120℃の範囲の温度、通常20℃〜100℃の温度で約1〜48時間
反応させることである。好ましい反応ては、ピリジン中のDMT(J’ ]、、
1当量を使用し、室温で約2時間反応させる。
上記の各反応のそれぞれの生成物は、それを次の反応の出発物質として使用する
前に、分離および/または単離するのが一般的に好ましい。分離および単離は、
例えば蒸発、許過、結晶化、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィ
ーなどの適当な精製法によって行なうことができる。典型的な分離および革離法
の具体的な側については、後記の適当な実施例を参照することができる。しかし
、勿論その他の同等の分離法を採用することもできる。また、典型的な反応条件
(例えば温度、モル比、反応時間)が与えられてはいるが、その様な範囲以上ま
たは以下の条件も、通常好適性lこは劣るものの、使用し得るということも理解
されねばならない。
反応3に示したホスファイト体への活性化は、ヌクレオチド化合物を、適当な溶
媒中、−90℃〜60℃の温度で、1分〜2時間、適当なホスフィチル化剤て処
理することにより、最も好適に行なうことができる。
好適なホスフィチル化剤には、メチルホスホジクロリダイト、0−クロロフェニ
ルホスホジクロリダイト、1) −、−クロロフェニルホスホジクロリダイト、
メチルホスホ(ジアルキルアミノ)モノクロリダイトなどが含まれる。適切な溶
媒としては、0〜20%の適当な塩基(通常j〜5容量矛)、例えばルチジン類
、コリジン類、トリアルキルアミンなどを含有しているピリジン、ルチジン類、
アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、クロロホルムなどが挙げら
れる。好ましいホスフィチル化剤はメチルホスホジクロリダイト、O−タロロフ
ェニルホスホジクロリダイト、およびメチルホスホ(ジ−イソプロピルアミノ)
−モノクロリダイトである。好ましいホスフィチル化条件は、5%の2.6−ル
チジンを含有しているアセトニトリルまたはピリジン中の09g当量のメチルホ
スホジクロリダイトを用いて5〜10分間、室温またはそれり、下で行なうこと
である。
伸長しつつあるヌクレオチド鎖瘉こ、修飾されたヌクレオチドモノマ一体を化学
的に挿入して、一定のヌクレオチド配列を作成する例は反応4および4aiこ示
しである。典型的な条件は、適当な溶媒中、−20℃〜50℃、好ましくは周囲
温度で、約1〜60分間行なうことである。好適な溶媒混合物は、0〜20チの
適当な塩基(通常1〜5容量チ)、例えはルチジン類、コリジン類、トリアルキ
ルアミン類などを含有しているピリジン、ルチジン類、アセトニトリル、テトラ
ヒドロフラン、ジオキサン、クロロホルムなどである。
伸長しつつある鎖は溶解性であるか、非溶解性であるか、または当技術分野で知
られている適当な化学的方法によって適当な固形担体に結合されているかである
。
固形担体(こ結合しているのが好ましい。更lこ、伸長しつつある鎖は、既に1
またはそれ以上の修飾されたヌクレオシド体を含有している場合もあれば、そう
でない場合もある。
反応4で伸長しつつある鎖(こ活性化モノマーを縮合させた後、その最初の生成
物を適当な試薬で処理して中間体ホスファイトトリエステルの酸化を行ない、要
すればオリゴヌクレオチドの未反応の5′−ヒドロキシをブロックするためにキ
ャッピングを行ない、5’−DMT基を除去する。ボスファイトトリエステルの
酸化は、適当な溶媒、例えはテトラヒドロフラン/水/ルヂジン混合物中で、0
.1〜5軍量/容ffi%のヨウ素で処理することにより行なうことができる。
未反応の5′−ヒドロキシの化学的キャッピングは、例えばテトラヒドロフラン
/ルチジン混合物中、無水酢酸および4−ジメチルアミノピリジンを使ってアセ
チル化またはアシル化することで達成し得る。5′−ブロッキング基通常DMT
、の除去は、非プロトン性溶媒中緩和な有機酸で、例えばクロロホルムまたはジ
グコロメタン中の1〜5容i%のジクロロ酢酸またはトリクロロ酢酸で処理する
こと1こより、最も都合よく行なうことができる。DMTを除去された伸長しつ
つあるヌクレオチド鎖は、活性化されたモノマーによる次の反応で更に伸長する
ための受容体となり、その結果、反応4aに示す様に、所望の長さおよび配列の
オリゴヌクレオチドが得られる。
所望の配列のオリゴヌクレオチドが製造されたら、反応5を行なってオリゴヌク
レオチド生成物を得る。
この目的で、チオフェノール処理をしてホスフェートトリエステルからメチルマ
スキング基を除去し、適当な水性アルカリまたはアンモニア処理をして保護され
たアミンからベンゾイル、アセチル、イソブチル、トリフルオロアセチルまたは
その他の基を除去し、そして/または固形担体から生成物を脱離させる。オリゴ
ヌクレオチド生成物からのDMTの除去は、周囲温度〜40℃に於いて、水性酢
酸の様な緩和な酸で10〜60分間適当各こ処理することにより行なう。この様
な反応は、最後の精製段階で、あるいはその前(こ行なうことができる。最後の
精製は適当な方法、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動、高圧液体クロマト
グラフィー(HPLC)、DEAE−セルロース上の逆相またはアニオン交換、
またはこれらの方法の輯合せ(こよって行なう。
ここ(こ述べたオリゴヌクレオチドの合成法は、修飾されたデオキシリボヌクレ
オシド(R’はH)または修飾されたりボスクレオシド(R’はヒドロキシ)1
こも利用できる。リボヌクレオシドを使用する場合は、適当なマスキング基、例
えはシリルエーテルで与えられるもの、によって2′−ヒドロキシをマスクする
。アラビノースおよび3′−デオキシリポースを含むその他のリボース体も、所
望のオリゴヌクレオチドを製造する方法に使用することができる。
ヌクレオチド塩基を修飾する置換基は、それ自体が1またはそれ以上のリポータ
−グループとして機能してもよい。その例は、ジニトロフェニル基を含んている
置換基である。置換基かりポーターグループとして機能し得ない場合は、鎖伸長
のカップリンク反応の前または後で、1またはそれ以上のリポータ−グループと
結合することができなけれはならない。選択されたオリゴヌクレオチド生成物は
、適当な試剤と反応してその様なリポータ−グループと結合する。例えば、修飾
された塩基をオリゴヌクレオチドに挿入し、その置換基の−が1またはそれ以上
の1級アミンを含んでいる場合は、適当な緩和な条件を用いてアミン−反応性基
、例えばインシアネート、インチオシアネート、活性カルボン酸共役体、エクス
ポキシドまたは活性芳香族化合物とカップリングさせてアミド、ウレア、チオウ
レア、アミンまたは芳香族アミン結合を生成させる。
例えば、反応50図式に示した様に、1級アミンを持った置換基で修飾されたウ
ラシルまたはアデニン塩基を含んでいるオリゴヌクレオチドは、フルオレセイン
・イ゛ハチ、オシアネートの様な適当な試剤と反応させて、反応6に示した様に
、置換基に結合したリポータ−グループR5(フルオレセイン)を得ることかで
きる。同様にして結合することができるその他のリポータ−グループには、多種
多様の有機部分、例えはフルオレセイン類、ローダミン類、アクリジニウム塩類
、ジニトロフェニル類、ペンゼ/スルホニル類、ルミノール類、ルシフェリン類
、ビオチン類、ビタミン類、炭水化物なとが含まれる。好適な活性リポータ−グ
ループは市販ノもノヲ使用できるが、例えば[Bioluminescence
and ChemiluminescenccJ に一般的に記載されているタ
イプの方法[M、DeLucaおよびW、McEI roy編、A、cad。
Press、 =ニーヨーク(1981)]、D、Ro swel lらLXI
I 、1978 ]およびそこに引用されている文献の方法(こよって合成する
ことができる。
典型的には、リポータ−グループの付加は、望ましくは水性溶媒中、−がC6H
2nNH2である修飾された塩基の置換基を、過剰の選択されたリポータ−グル
ープと、約−20℃〜50℃(好ましくは20℃〜40℃)の範囲の温度で1〜
24時間反応させることによって達成するのが好都合である。好適な溶媒は水性
緩衝液および0〜50%の有機溶媒、例えば低級アルコール、テトラヒドロフラ
ン、ジメチルホルムアミド、ピリジンなどである。好ましいリポータ−グループ
反応体には、フルオレセイン・インチオシアネート類、ジニトロフェニルインチ
オシアネート類、フルオロジニトロベンゼン、N−ヒドロキシスクシンイミジル
ビオチン、N−ヒドロキシスクシンイミジルジニトロベンゾエート、インチオシ
アネート類、例えばアミノブチルエチルイソルミノールインチオシアネートなど
、カルボキシフルオレセインの活性エステル、ローダミン、ビオチン付加物、ジ
オキセタン類、ジオキサミド類、カルボキシアクリジン類、炭水化物などが含ま
れる。
更に、オリゴヌクレオチド生成物が、Rが1またはそれ以上のカルボン酸を含ん
でいる修飾された塩基を含有している場合は、例えば1級アルキルアミン類と緩
和に縮合させてアミド結合を生成させ得る。典型的(こは、これは、望ましくは
水性溶媒中、オリゴヌクレオチドを、1級アミンを含有している過剰のリポータ
−グループと、水溶性カルボジイミドの様な適当な縮合剤の存在下で、約−20
℃〜50℃(好ましくは20℃〜40℃)の範囲の温度で、6〜72時間反応さ
せて行なうのが好都合である。この種の好ましいリポータ−グループfこは、(
アミノアルキル)−アミノ−ナフタレン−1,2−ジカルボン酸ヒドラジド類、
アミノ−フルオレセイン類、アミノローダミン類、アミノアルキルルミノール類
、アミノアルキルアミノベンゼンスルホニル付加物、アミノ糖類などが含まれる
。
更に、最初のオリゴヌクレオチド生成物の化学合成を、置換基かその様なリポー
タ−グループを含んでいる修飾されたヌクレオチドモノマーを用いて行なっても
よい。その様なグループをマスクする必要がある場合には、カップリング反応の
間に適当にマスクされる。一方、ある種のリポータ−グループはマスキングを必
要としない。例えば、マスキングされていないニトロフェニル付加物は、カップ
リング反応中、悪影響を受けることな(修飾されたヌクレオチドモノマー上に存
在し得る。
本発明方法で使用されるリポータ−グループは、通常芳香族系、多芳香族系、環
系、および多環系の有機部分を含んでおり、これは更に、窒素、酸素、硫黄の様
なペテロ原子を含むことζこよって官能化されているものである。
オリゴヌクレオチド生成物は1つのタイプ以上の修飾、または1つ以上の修飾さ
れた塩基を含むことができる。このタイプのオリゴヌクレオチドの例は、以下の
構造式で示されるものである:
上記式中、Cm は5−(3−アミノプロピル)ントシン、−は5−[N−(4
−アミノブチル)21−アクリルアミド〕ウラシル、AlTl は8−[6−2
,4−ジニトロフェニル)−アミノへキシル〕アミノアデニンでアル。この生成
物を更にフルオレセイン・イソチオシアネートと反応させて修飾し、−および♂
正(こフルオレセインリポータ−グループを付与する。
この様なオリゴヌクレオチド生成物は、本発明方法によって可能となったオリゴ
ヌクレオチド生成物中の修飾された、および修飾されてG)な17)ヌクレオチ
ド単位の選択の多様性を示して0る。より詳細に述べると、この様なオリゴヌク
レオチドは、同じ力)、また(ま異なったタイプのリポータ−グループ機能を提
イ」友する置換基によってその塩基が修飾されてII)る1種シ、」二のヌクレ
オチド単位を用いる例を示して(7)る。また、そのj−基か、リポータ−グル
ープが結合してG)るg換基(こよって修飾されている単位、即ちC1n およ
びU′11力(fli示されており、一方A” は、その塩〕入力く、そtし自
体(こジニトロフェニル基を含んて17)るがためにIJポータークーループと
して機能し得る置換基(こよってイ疹飾されて0る単位の例である。更にこの様
な第1ノコ゛ヌクレオチIJは、それが同じタイプの1以上のヌクレオチド単信
りを含有し得ること、および修飾された塩基を持った単位と混合した、非修飾塩
基を持った単位を含有しj尋ることを示している。
反応6(こ示した様に、置換基の1級アミン(こ1ノポ−ターグループを結合さ
せる代りに、2者択一的にこの様なアミンまたはその他の基を、適当に活性化さ
れた固形担体fこ結合させることができる。こうすること1こ結合している一定
のオリゴヌクレオチド配列が得られる。この様な固形担体は、相補的な核酸成分
の検出および単離(こ有用である。あるいはまた、修飾されたヌクレオシドモノ
マーを、鎖伸長カップリング反応4の前lこ固形担体とカップリングさせ、それ
(こよってカップリング反応中にその様なモノマーのための固形担体を提供して
もよい。
当業者が本発明を実施し得る様(こ、以下に具体的な実施例を挙げる。この実施
例は本発明の範囲を制限するものと解釈してはならず、単に本発明の例示であり
、代表例であると解釈すべきである1、構造を明らかにする為(こ、前記の工程
の図式を参照するとよい。
実施例I
この実施例では修飾されたヌクレオシド前駆体、5−(3−)リフルオロアセチ
ルアミノプロペニル)−2′−デオキシウリジンの合成について説明する。
5−クロロマーキュリー−2′−デオキシウリジン(3,6g、7.8mm0I
)をメタノール200rn1.lこ懸濁する。N−アリルトリフルオロアセトア
ミド(6,8m1..55 mmol )を加え、次いてメタノール中の0.2
Nリチウムテトラクロロパラジウム酸塩41m1を加える。室温で18時間撹
拌した後、この反応物を重力濾過して黒色固型のパラジウムを除去し、黄色のメ
タノール性P液を200巧づつのホウ水素化ナトリウムで5回処理し、次いで減
圧濃縮して固型の残留物を得る。残留物をシリカゲル上フラッシュ・カラムクロ
マトグラフィーlこかり、クロロホルム中のメタノール15容量係混液て溶離し
て精製する。生成物が適当に精製されている両分を合わせて減圧濃縮し、5−(
3−) IJフルオロアセチルアミノプロペニル)−2′−デオキシウリジンの
結晶2.4gを得る。[■λ、、、lx291nm(ε7800) 、λmi
n266nm(ε4400) :TI−C(シリカ、りooホルム中メタノール
15容量係溶液て溶離)R(=0.40実施例11
この実施例では修飾されたヌクレオシド前駆体5−[N−(1−IJフルオロア
セチルアミノヘプチル)−1−アクリルアミド〕−2′−デオキシウリジンの合
成について説明する。
5−クロロマーキュI7 2’−デオキシウリジン(3,6g、7.81Tr1
1o 1 )をメタノール200n+/iこ懸濁する。
N−(7−トリフルオロアセチルアミノヘプチル)−アクリルアミド(55mm
ol )を加え、次いでメタノール中の0.2Nリチウムテトラクロロパラジウ
ム酸塩4]rntを加える。室温で18時間撹拌した後、この反応物を重力沢過
して黒色固型のパラジウムを除く。黄色のメタノールl/’液を200 IQづ
つのホウ水素化ナトリウムで5回処理し、次いで減圧濃縮して固型の残留物を得
る。残留物をシリカゲル」−フラッシュ・カラムクロマトグラフィーにかけ、ク
ロロホルム中のメタノール10容量係混液で溶離して精製する。生成物が適当に
精製されている両分を合わせて減圧濃縮し、5−[N−(7−1−リフルオロア
セチルアミノヘプチル)−1−アクリルアミド〕−2′−デオキシウリジンの結
晶2.8gを得る。俄λ。、ax3020m(ε18000)、λ□、n230
nm、28Qnm; T L C(シリカ、クロロホルム中メタノール15容量
チ混液で溶離する) P−1= 0.3−8実施例III
この実施例では、反応で示した如く、5−ジメトキシトリチル−5(3(ト’)
フルオロアセチルアミノプロペニル)−2′−デオキシウリジンの製造のための
、5′−ヒドロキシのマスキング警こついて説明する。
5 (3)リフルオロアセチルアミノプロペニル)−2′−デオキシウリジン(
2,4!i’)を2回、ピリジンから完全に蒸発させ、次いてピリジン40i中
で撹拌する。ジメトキシトリチル(+)M丁)クロライド(2、37i’ 、
6.5 mmol )を加え、この混合物を室温で4時間撹拌する。薄層クロマ
トグラフィー(シリカ上、クロロホルム中のメタノール10容量係混液て溶Kt
t ル)によって反応の完了を確認した後、この反応物を濃縮して残留固型物
を得る。この残留物をソリ力」−カラムクロマトグラフィー(こかけ、流速の速
い不純物をクロロホルムで全て溶離してしまってから、生成物をクロロホルム中
のメタノール5容量チ混液て溶離する。
次いでこの残留物を濃縮し、5′−ジメトキシトリチル−5−(:3−)リフル
オロアセチルアミノプロペン−1−イル)−2′−デオキシウリジンを、白色の
ふわふわした(毛羽立った)固型物(4g)として得る。この生成物は熱時分解
する:UV2Inax291皿、λmln266nm:T L C(シリカ、ク
ロロホルム中メタノール]0容量チ混液で溶離する):R[0,6である。
実施例■
この実施例では5′−ジメトキシトリチル−5−(3−トリフルオロアセチルア
ミノプロピル)−2′−デオキシウリジンを得るための、環外二重結合に対する
水素添加、並びに5′−ヒドロキシのマスキング(こついて説明する。
実施例IおよびIIJ のヌクレオシド前駆体の合成、並ヒに5′−ヒドロキシ
マスキングを繰返す〔ただし、DMTクロライドの添加前に、精製5−(3−ト
リフルオロアセチルアミノプロペニル)−2′−デオキシウリジンをメタノール
中、10%パラジウム−黒触媒上、室温で撹拌しながら2大気圧の水素で処理す
る〕こと(こより、5′−ジメトキシトリチル−5−(3−)リフルオロアセチ
ルアミノプロピル)−2′−デオキシウリジンを製造する。
実施例■からVIIIにおいては、その他の修飾されたウランルヌクレオシドの
合成、次いて、反応2て示したヒドロキシのマスキングについて説明す゛る。
実施例■
N−アリルトリフルオロアセトアミドを下記の化合物群(番号1〜亀)に置き換
え、実施例Iおよび■の操作を繰返してヌクレオシド前駆体の合成、並びに5′
ヒドロキシのマスキングを行ない、それぞれ、下記合物に置き換えるニ
ド
)アクリルアミド、そして以下の化合物を得る:1′5′−ジメトキシトリチル
ー5−(4−)リクロロアセチルアミノブテン−1−イル)−2′−デオキシウ
リジン
ロアセチルアミノヘキセン−1−イル)−2’−テtキロアセチルアミノー2−
メチルプロペン−1−イル)フルオロアセチルアミノメチルフェニル)エテノ−
1−イル:l−2’−デオキシウリジン
5′5′−ジメトキシトリチル−5(4hリフルオロアセチルアミノ−=4−メ
チルブテン−1−イル)−リクロロアセチルアミノドデソル)−1−アクリルア
フルオロアセチルポリリシル)−1−=−アクリルアミドクロロアセデルアミノ
プロピル
−2′−デオキシウリジン
5−(3−)リフルオロアセチルアミノプロペニル)−2′−デオキシウリジン
を下記の5−置換−2′−デオキシウリジン類(番号、ユ〜11)(こ置換え、
実施例■の5′ヒドロキシのマスキング操作を繰返すことにより、下記の生成物
群(y−18’)を製造する。即ち、以下の化合物(こ置き換える:
8 5−(プロペン−1−イル)−2′−デオキシウリジン
1−イル)−2′−デオキソウリジン
)−2′−デオキシウリジン
ノー1−イル〕−2’−デオキシウリジン165−(4−アセトキシブテン−1
−イル)−2’−デオキシウリジン、そして以下の5′−ジメトキシトリチル−
5−アルキル−2′−デオキシウリジン類を得る=9′5′−ジメトキシトリチ
ルー5−(プロペノ−1−イル)−2′−デオキソウリジン
10’ J’−ジメトキシトリチル−5−(2−カルブメトキシJ二f /し)
−2’−チオキシウリジン11’ 5’−−ジメトキシトリチル−5−(3−
カルブメトキシプロパン−1−イル) −2’−チオキシウリジン12′5′−
ジメトキシトリチル−5−(4−カルフ゛メIキシー2−メチルブテン−1−イ
ル)−2’−チオキシペン−1−イル)−,2’−チオキシウリジン14’ 5
’−ジメトキシトリチル−57(4−シアノ−2−メチルブテン−1−イル)−
27−チオキシウリジン15’ 5’−ジメトキシトリチル−5−[2−(4−
カルブメトキシフェニル)エテノ−1−イル] −2’−デオキソウリジン
16’ 5’−ジメトキシトリチル−5−(4−アセトキシブテン−1−イル)
−2′−デオキシウリジン17’ 5’−ジメトキシトリチル−5−(4−アセ
トキシブタン−1−イル)−2′−デオキシウリジ/18’ 5’−ジメトキシ
トリチル−5−C4−(2,4−ジニトロフェニル)ブチル〕−2’−デオキシ
ウリジン実施例■■
5−クロロマーキュリー−−2′−デオキソウリジンを5−クロロマーキュリ−
ウリジンで置き換えて実施例1− Vlのヌクレオシド前駆体の合成および5’
−1: l’ 。
キシのマスキング法を繰返して行なうこと(こより、対応する5′−ジメトキシ
トリチル−5−置換ウリジン類を製造する。
実施例VIII −、−XIは修飾されたシトシンヌクレオノドの合成を例示す
るものである。シトソ/ヌクレオシド類は、アデノシンヌクレオシド類と同様に
、ワラシルヌクレオシド類と異なり、塩基部分の上に反応性基を持っているので
、その様な反応性基を、望ましくない反応から防御するためにマスクする。これ
らの実施例では、反応2における5′−ヒドロキシのマスキングと同様、反応1
で示したシトシンの塩基部分にある反応性基のマスキング(こついて説明する。
実m例VIII 、5− (3−トリフルオロアセチルアミジン
5−クロロマーキュリー−27−チオキシウリジンを5−クロロマーキュIJ
2/−デオキソシチジンで置換え、実施例Iのヌクレオシド前駆体の合成方法を
繰返して行ない5−(3−)リフルオロアセチルアミノプロペニル)−27−デ
オキソシチジン(trvλma X 287 nm )を製造する。精製5 (
3hリフルオロアセチルアミノプロペニル)−2’−デオキソシチジン(:I−
、3f/、4、6 mmol )を無水エタノール80m!、中で撹拌し、無水
ベンゾイル(1,5g、7 mmol )を加え、この反応物を還流させる。更
(こ、1.5gつつの無水ベンゾイルを1時間毎に5回加える。薄層クロマトグ
ラフィー〔シリカプレート、n−ブタ/ −JL/ /メタノール/濃Nf−1
40H/水(60:20:1:20)で溶離する〕により反応の終了を判定した
後(6−10時間の間)、この反応混合物を冷却し、減圧濃縮して半固型物を得
る。この固型物をエーテルと共に3回こね、デカントし、乾燥する。この粗生成
物を水から再結晶し、クロマトグラフ的に純粋な団−ペンゾイル−5−(3−ト
リフルオロアセチルアミノプロペニル)−2′−デオキソシチジンを白色固型物
として得る。この生成物は120’C以上て分解する: TJV max =
31]nm。
実施例IX 5/−ジメトキシトリチル−5(3−トリフルオロアセチルアミノ
プロペニル)−2−ベンゾイル−2′−デオキソシチジン
5− (3−)リフルオロアセチルアミノプロペニルノー2′−チオキシウリジ
ンを5(3−)リフルオロアセチルアミノプロペニル) −N4−ペンソイル−
2’−デオキソシチジンで置換え、実施例11J の5′−ヒドロキシのマスキ
ング操作を繰返すことにより、5′−ジメトキシトリチル−5−(3−1−リフ
ルオロアセチルアミ/フロベニル) N4−ベンゾイル−2′−デオキソシチジ
ンを製造する。
実施例X
N−アリルトリフルオロアセトアミドを実施例vのN−アルキルトリフルオロア
セトアミド類に置換え、実施例VIIIおよび■のヌクレオノド前駆体の合成お
よび5′ヒドロキシのマスキング操作を繰返すことにより。
対応する5′−ジメトキシトリチル−5−(トリフルオロ7セチルノアミノアル
キル)−団=ベンゾイルー2′−デオキシシチジン類を製造する。即ち、以下の
化合物群である。
5′−ジメトキシトリチル−5−(4−トIJフルオロアセチルアミノブテン−
1−イル)N4−ベンゾイル−2′−デオキソシチジン
5′−ジメトキシトリチル−5−(6−)リフルオロアセチルアミノヘキセン−
1−イル)−団−ベンゾイル−2′−デオキシシチジン
5′−ジメトキシトリチル−5−(3−1−IJフルオロアセチルアミノ−2−
メチルプロペン−1−イル)−団一ペンゾイルー2′−デオキシシヂジン5′−
ジメトキシトリチル−5−42−(4−1−リフルオロアセチルアミツメデルフ
ェニル)エテノ−1−イル]N4−ベンゾイル−2′−デオキシシチジン5′−
ジメトキシトリチル−5−(4−1リフルオロアセチルアミノ−4−メチルブテ
ノ−1−イル)−団−ベンゾイル−2′−デオキシシチジン5′−ジメトキシト
リチル−5−CN−< 12−)リフルオロアセチルアミノドデシル)−1−ア
クリルアミド] N4−ベンゾイル−2′−デオキシフチジン5′−ジメトキシ
トリチル−5−[N−(ペルトリフルオロアセチルポリリシル)−1−アクリル
アミドコイル−5−(2−カルブメトキノエチニル)−2’−チオキソシチジン
の合成
5−(2−カルブメトキシエチニル)−2′−チオキシシチジン(0,82g、
2.6 mnol )を無水エタノール50rn1.中で撹拌する。無水安息香
酸(500〜、2.2+nmo l )を加え、この反応物を加熱還流させる。
更に、500■つつの無水安息香酸を1時間毎に5回加える。
薄層クロマトグラフィーて反応の完了を判定した後(通常、6−8時間)、この
反応物を冷却し、減圧蒸留して黄色の半固型物質を得る。シリカゲルを用いたク
ロマトグラフィー(こかけ、メタノール/クロロホルムの]:19から1=31
こ至る直線的な割合の混合物で溶離し、適当な両分を合わせて蒸発させることに
よりN4−ベンゾイル−5−(2−カルブメトキシエチニル)−2′−デオキシ
シチジンを無晶形の白色固形物質として得る。trvλmax 296nm、λ
min 270nm 。この固型物を完全(こ乾燥させ、ピリジン20,7に溶
かす。ジメトキシトリチルクロライド(1,1当量)を加え、この反応物を周囲
温度で6時間撹拌する。濃縮して固型物を得、次いでこれをシリカゲル上刃ラム
クロマトグラフィーにかけ、クロロホルム中のメタノール10%混液で溶離して
5′−ジメトキシトリチル−N4〜ベンゾイル−5−(2−カルブメトキシエチ
ニル)−2’−チオキソシチジンを、灰色がかった白色のふわふわした固型物と
5−(2−カルブメトキシエチニル)−2′−デオキシシチジンを下記の化合物
群(番号と1からUまて)で置換え、実施例℃のヌクレオシド前駆体の合成法を
繰返して行なうことにより、それぞれ対応する下記の化合物群(番号U′からπ
まて)を得る。即ち、次の化合物群で置き換える:
205−(3−カルブメトキシプロパン−1−イル)−2′−チオキシシチジン
215−(4−カルブメト千シー2−メチルブテン−1−イル)−2′−アオキ
シシチジ/
召 5−(3−シアノプロペン−1−イル)−2′−デフ−1−イル)−2’−
チオキシシチジンそして次の5′−ジメトキシトリチル−N4−ベンゾイル−5
−アルキル−2′−デオキソシチジン類を得る:19’ 5’−D M T −
N4−ベンゾイル−5−(2−カルブメトキンエテノ−1−イル)−2’−チオ
キシシチジン20’ 5’ −D M T −N4−ベンゾイル−5−(3−カ
ルブメトキシプロパン−1−イル)−2’−デオキシシチジメトキシ−2−メチ
ルブテン−1−イル)−2′−チオジン
郡’ 5’ −D M T−N4−ベンゾイル−5−(4−アセトキシブテン−
1−イル)−2′−デオキシシチジン苫 5’ −1) M T−N4−ベンゾ
イル−5−(4−アセトキシブタン−1−イル)−2’−デオキシシチジンで’
5’−DMT−N’l−ベンゾイル−5−[4−(2,4−ジニトロフェニル
)ブチル] −2’−デオキシウリジン様(こ、その他の酸無水物、例えば無水
酢酸、アニフィル無水物またはトリル無水物を用いることにより、実施例Xおよ
びXI(こおいて、ベンゾイルがアセチルまたはアシルで置き換えられてた形の
N4−アシルまたは団−アセチル−5−アルキル−2′−デオキシシチジンが、
それぞれ、製造される。
実施例層■
5−クロロマーキュIJ 2J−デオキシシチジンを5−クロロマーキュリ−シ
チジンに置換え、実施例■からXのヌクレオシド前駆体の合成法および5’ −
1= t’ロキシのマスキング法を繰返すことにより、対応する5′−ジメトキ
シトリチル−N4−ベンゾイル−5f+W換シチジン類を製造する。
実施例型
この実施例は、アデニンヌクレオシドの反応性塩基部分のマスキングおよび5′
ヒドロキシシのマスキンクを例示するものである。
N6−ペンゾイルー8−(6−アミノヘキシル)アミノ−2′−デオキシアデノ
シン(4m+nol )を無水エタノール60m1中で撹拌する。トリフルオロ
酢酸無水物(5rmxol )を加え、この反応物を室温で撹拌する。更(こ1
時間毎にトリフルオロ酢酸無水物を、2部加える。
4時間後、反応物を濃縮して固型残留物を得、これを−夜i結乾燥する。このN
6−ペンゾイルー8−(6−トリフルオロアセチルアミノヘキシル)アミノ−2
′−デオキシアデノシン粗生成物を完全に乾燥し、2回、ピリジン中から固型残
留物(こなるまで濃縮する。この固型物質を撹拌下、ピリジン40.、/lこ入
れ、ジメトキシトリチルクロライド(6,5mmol )を加える。4時間後、
反応物を濃縮して固型残留物を得る。これをシリカゲル」二、カラムクロマトグ
ラフィー(こかけ、クロロポルム中のメタノール含量が0から15係の間である
多段グラディエンド溶離を行ない、5′−ジフトキントリチル−N6−ペンゾイ
ルー8−(6−トIJフルオロアセチルアミノヘキシル)アミノ−2′−デオキ
シアデノシンを灰白色の固型物として得る。
実施例WからXVIIは、図表の反応3の如(,5′位がマスクされた5−置換
−ヌクレオシドおよび天然起源のヌクレオシドを活性化して、各々対応するポス
ホモノクロリダイト類(phosphomonochloridites)とす
ること(こ関する。
実施例XV 5’−1)MT−5−(3−)リフルオロアセチルアミノプロパン
−1−イル) −2’−デオキシウリジンの3′−ホスホモノクロリダイトの製
造乾燥5’−DMT−5−(3−トリフルオロアセチルアミノプロパン−1−イ
ル)−2′−チオキシウリジン(1,54g、2.2 ITTIIOI )を、
残留すル水オヨヒ溶媒ヲ除去するために、いずれも12時間以上を要して3回、
ベンゼン20rnl中から凍結乾燥する。得られた非常1こふわふわした白色粉
末を、減圧下のままで窒素雰囲気中に移し、2.6−ルチジンを5容量褒含有す
る無水アセトニトリル中1こ、最終濃度が3部mMとなる様lこ溶かす。窒素雰
囲気下、激しく撹拌しなからメチルホスホジクロリダイ)(1,0当量)の巨大
丸薬を迅速にシリンジ(注射器)で加える。この反応物を窒素雰囲気下、約1分
間渦巻き状に操作する。次いで、得られた粗5′−DMT−5−(3−)リフル
オロアセデルアミノプロパン−1−イル) −2’−デオキシウリジン3′−メ
チルホスホモノクロリダイトの反応溶液を、更【こ精製することなく、デオキシ
オリゴヌクレオチドの合成(実施例XVI11)にそのまま用いる。この物の3
1p NM R(CH3CN/CDCl5)は、通常、40−70 mo1%
か所望の生産物であることを示している( 167.5 PPm)。残りは、ビ
ス−3’、 3’−[5’DMT−5−(3−トリフルオロアセチルアミノプロ
パン−1−イル)−2′−デオキソウリジリルコメチルホスファイト(140p
pm )と、5′−DMT −5−(3−トリフルオロアセチルアミ/プロパン
−1−イル) −2’−デオキシウリジン3′−メチルホスホネート(9,5P
Pm )で構成され、け生成される。
実施例W■ 天然起源の2′−デオキシヌクレオシドの3′−ホスホモノクロリ
グイト類の製造5’−DMT−5−(3−)リフルオロアセチルアミ/フロパン
−1−イル) −2’−デオキシウリジンを、5’ −1) M T −2’−
デオキシチミジン5’ −1) M T −N4−ベンゾイル−2フーデオキシ
シチジ5’ −1) M T −N6−ペンゾイルー27−ゾオキシアテノ5′
−D Mr −N2−インブチリル−2′−デオキシアゾ/シン
て置換え、実施例Wの操作を繰返すこと(こより、下J己の対応するホスホモノ
クロリグイト類を製造する。即ち、
5’ −D M T −2’−デオキシチミジン3′−メチルホスホモノクロリ
ダイト
5・−〇 M T −N’−ベンゾイル−2′−デオキシシチジン3′−メチル
ホスホモノクロリダイト5’−DMT−N6−ペンゾイルー2′−デオキシアデ
ノノン3′−メチルホスホモノクロリダイト5′−DMT−N2−イソブチリル
−2′−デオキシグアノシン3′−メチルホスホモノクロリダイトルホスホジク
ロリダイトて置き換え、実施例WおよびxvIのホスホモノクロリダイトの合成
法を繰返すこと(こより、対応する5’−DMT−ヌクレオシド3′−ホスホモ
ノクロリグイト類、即ち、
5′−DMT −5−(3−)リフルオロアセチルアミノプロピル) −2’−
デオキシウリジン3′−0−クロロフェニルホスホモノクロリダイト
5’−DMT−2’−デオキシチミジン3′−2−タロロフェニルホスホモノク
ロリダイト、
5′−DMT−N4−ベンゾイル−2′−デオキシシチジ73’−0−’)ロロ
フェニルホスホモノクロリダイト5’ −D M T −N6−ペンゾイルー2
′−デオキシアデノシン−3′−〇−クロロフェニルホスホモノクロリダイト
5’−DMT−N2−インブチリル−2′−デオキシグアノシン3r =−クロ
ロフエニルホスホモノクロリダイ−りロロフェニルホスホモノクロリダイト生成
物の〔32P3 N M R(CH3CN CDCl5)は、160.7.16
0.5ppm (ジアステレオマー)である。
実施例XVIIi −XXVIは、図表の反応4および5に示した如く、修飾さ
れた塩基か組み込まれたオリゴヌクレオチド類の化学合成を例示するものである
。
実施例XVIII 5− (3−アミノプロピル)−ウラシルおよび天然起源の
ヌクレオチド単位を含有するデオキシオリゴヌクレオチド類の合成
デオキシオリゴヌクレオチド合成の直前(こ、実施例WおよびXVIのホスホモ
ノクロリダイトの合成操作を行ない、その生成物をそのませ無水アセトニトリル
15容量%2,6−ルチジン中に3QmMの粗3’−メチルホスホモノクロリダ
イトを含んだものとして使用する。
固体の担体(5−1)MT−N6−ペンゾイルー2′−デオキシアデノシン3′
−サクシンアミドプロピル・シリカ250■、20μ当量)を適当な反応フロー
容器(ガラスまたはテフロン■製のカラムまたは漏斗)lこ入れる。この固体担
体は、予め、アセトニトリル15容i%ルチジン、テトラヒドロフラン/水/ル
チジン中に沃素2 W/V %を含むもので2分間、アセトニトリル15%ルチ
ジン、クロロホルム、クロロボルム中にジクロル酢酸を4容量チ含むもので2.
5分間、そしてアセトニl−IJル15%ルチジンて順次処理して予めコンディ
ションを調整しておく。この場合、各処理は所望〔こ応じて総容量5 15++
+tを2または3回に分けて用いるかあるいは定常的に流すか、そのいずれても
よい。
デオキシオリゴヌクレオチドは反応4に従い、所望の活性化された5’−DMT
−ヌクレオシド3′メチルホスホモノクロリダイトモノマーを連続的に添加し、
伸長しつつあるヌクレオチド鎖の端末単位(これは、最初、この鎖の唯一の単位
である。つまり、固体担体を含んでいるデオキシアゾ/シンを塩基とする単位で
ある。)の遊離の5′−水酸基(ここれを結合させることて合成される。付加は
、実施例双およびXVIの中から選択した3QmMの粗モノクロリダイト10r
ntを、領土の脱保護されたばかりの、5′ヒドロキシと2〜3部づつに分ける
か、または定常的に流し、2〜6分間反応させるととfこより行なう。1つの完
全な試薬サイクルが後に続く所の最初のホスホモ/りロリダイト付加は次の連続
処理で構成されるニ
一5’−DMT−5−(3−トリフルオロアセチルアミノプロピル)−2′−デ
オキシウリジン3′−メチルホスホモノクロリグイト
一アセトニトリル/ルチジン洗浄、
−無水酢酸/ルチジン/テトラヒドロフラン(1:3 : 2 )中0.3M4
−ジメチルアミノピリジンにより5分間キャッピングする、
一アセトニトリル15%ルチジン洗浄、−テトラヒドロフラン/水/ルチジン(
6:2:1)中2%沃素で2分間、酸化する、
−アセトニトリル15%ルチジン洗浄、−クロロホルム洗浄、
一りロロホルム中4容量チジクロル酢酸で2.5分間処理してDMTを除去する
、
一クロロホルム洗浄、
一アセトニトリル/ルチジン洗浄。
上記のサイクルを、各回毎に、5’−DMT−5−(3−トリフルオロアセチル
アミノプロピル)−2’−デオキシウリジン3′−メチルホスホモノクロリグイ
トを下記の3′−メチルホスホモノクロリグイト類の中の異なったもので置換え
、13回繰返して行なう。ただし最終試薬サイクルではジクロル酢酸処理は除外
する:5’−DMT−2’−デオキシチミジン3′−メチルホスホモノクロリグ
イト
5′−DMT −5−(3−トリフルオロアセチルアミノプロピル)−2′−ジ
オキシウリジン3′−メチルホスホモノクロリダイト
5’ −D M T −N6−ペンゾイルー2′−デオキシアゾ/シン3′−メ
チルホスホモノクロリグイト5’−DMT−N’−ベンゾイル−2′−デオキシ
シチジン3′−メチルホスホモノクロリグイト5’ −D M T −N2−イ
ンブチリル−2′−デオキシグアノシン3′−メチルホスホモノクロリダイト5
′−nMT−5−(3−トリフルオロアセチルアミツ
ノプロピル)−2′−デオキシウリジン3′−メチルホスホモノクロリグイト
5’−DMT−2’−デオキシチミジン3′−メチルホスホモノクロリグイト
5’−DMT−5−(3−1−リフルオロアセチルアミノプロピル)−2′−デ
オキシウリジン3′−メチルホスホモノクロリグイト
51−D M T−デオキシチミジン3′−メチルホスホモノクロリグイト
5′−DMT−5−(3−トリフルオロアセチルアミノプロピル)−27−ジオ
キシウリジン3′−メチルホスホモノクロリダイト
5’ −1) M T −N2−インブチリル−2′−デオキシグアノシン3′
−メチルホスホモノクロリグイト5’ −I) M T −N6−ペンゾイルー
2′−チオキシアデノシン3′−メチルホスホモノクロリダイト5’ −D M
T −N’−ベンゾイル−2′−デオキシシチジン3′−メチルホスホモノク
ロリグイト担体を移し、濃水酸化アンモニウム2rnlて、周囲温度において4
時間処理し、この担体から生成物を放出させる。上清を取除き固型物を濃水酸化
アンモニウム0.5dで3回洗浄し、これらの上清を合わせて密封し、−夜50
℃で加熱する。透明な黄色の上清を完全に凍結乾燥する。−次精製は、RP−8
(C−8)カラム上、PH6,8の25mM酢酸アンモニウム中のアセトニトリ
ルの割合が0−30容量チである様なグラディエンド溶離(60分間)による、
逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で行なう。約40分後に鋭いピー
クを示して溶離する5’−DMT−末端化生成物を集める:もつと短い鎖を持つ
ものは、キャップされたものもされていないものも、共(こ25分より以前に溶
離してしまう。集めた生成物を蒸留して固形残留物を得、これを80%酢酸で周
囲温度において20分間処理(DMTを除(ため)した後、凍結乾燥して固型物
残渣を得、これを少量の水性緩衝液Iこ溶かす。生産物は一般に、HP L C
後において90%以上の均質性がある。更(こ、これを通常の20チポリアクリ
ルアミドゲル(厚さ1〜6闘)上、電気泳動にかけ、適当な生成物バンド(生成
物は、通常、同様の長さの修飾されていないデオキシオリゴ、ヌクレオチド類よ
りもゆっくり泳動する)を切り取り、抽出することにより、なお一層精製される
。こうして製造された精製(純化)5−アミノプロピル−ウラシル−含有ペンタ
デカデオキシオリゴヌクレオチド生成物を以下イこ図式的に示す[[中U 二
5−(3アミノプロピルンウラシル〕。
従来のアンモニア釦こよるオリゴヌクレオチドの脱保護によれは、置換基上のマ
スキング基であるトリフルオロアセチル基も除去されてしまったことに注目され
たい。次いて、このオリゴヌクレオチドの長さおよび配列の決定を、適当なプロ
トコール(例えは、そのヌクレオチド単位に含まれる塩基か修飾されていない様
な、従来J★術に属するオリゴヌクレオチド類の長さおよび配列を決定するため
(こ既に用いられたプロトコ−2
ル等)を利用して、P−キナーゼ法および配列決定により行なうことができる。
同様tこ、本発明で採用したメ、ヂルホスホモノクロリダイト付加物の順序およ
び数を計画的(こ変化させることにより、選択された長さおよび塩基配列瘉こお
いて異なる、他の5−(修飾された)ウラシル−含有チオキシオリゴヌクレオチ
ド類が製造される。また、実施例WおよびXVIのヌクレオシド3′〜メチルホ
スポモノク物に置換えると共に、クロロフェニル保護基ヲ除<りめにピリジニウ
ムオキシメート処理を行なう(デオキシオリゴヌクレオチド合成の終りであって
、濃水酸化アンモニウム処理の前)こと(こよっても、同じデオキシオリゴヌク
レオチド生成物が得られる。
実施例京
5′−Dへ4 T −5−(3−1−リフルオIクアセチルアミノプロピル)−
2’−デオキシウリシンを下記の5′−0M T−5−アルキル−2′−デオキ
シウリシン類(番号28−36 )で置換え、実施例XV −>xVtn のポ
スポモノクロリダイトおよびチオキノオリゴヌクレオチドの合成法を繰返すこと
により、それぞれ対応する、ウラシル塩基−を持つ下記のオリゴヌクレオチド類
(番号ロアセチルアミノプロペン−1−イル)−デオキシウリジン
ロアセチルアミ/ブタン−1〜イル)−2′−デオキシロアセヂルアミノブテン
−1−イル)−2′−デオキソロアセチルアミノヘキサン−1−イル)−2′−
チオキロアセチルアミノヘキセ7−1−イル) −2’−チオキロアセチルアミ
ノプロパン−2−イル)−2’−チオキロアセチルアミノ−2ニメチループロペ
ン−1−イルロアセチルアミノ−2−メチル−プロパン−1−イル)−2′−デ
オキシウリシン
ク、I+/オロアセチルアミノメチルフェニル)エテン=1−イル〕−27−ゾ
オキシウリシン
η 5′−ジメトキシトリチル−5−[N−(ペルトリフルオロアセチルポリリ
シル)−1−アクリルアミドチルアミノヘプチル)−1−アクリルアミド]−2
’−デオキシウリジン、
−が下記のものである実施例XvII■の生成物に相当するデオキシヌクレオチ
ド類が製造される。
ル)ウラシル
同様Iこ、他の5’−DMT−5(アシルアミノアルキル)−2′−デオキシウ
リジン類を用いれば、類似のデオキシオリゴヌクレオチド類が製造される。
実施例ハ
5’−〇MT−5−(3−アセチルアミノプロピル)−21−デオキシウリジン
を下記の5−置換−2′−デオキシウリジン類(番号町−用)に置換えて実施例
双〜XVIIIのホスホモノクロリダイトおよびデオキシオリゴヌクレオチドの
合成法を繰返すことにより、それぞれ、下記の対応する、−ウラシル塩基を持っ
たオリゴヌクレオチド類(番号π−川″)を製造する。即ち、次の化合物に置換
える。
37 5’−DMT −5−(プロペン−1−イル)−2’−デオキシウリジン
嬰 5’−DMT−5−(2−カルブメトキシエチル)−2′−デオキシウリジ
ン
嬰 5’−DM”r−5−(3−カルブメトキシプロパン−1−イル)−2′−
デオキシウリジン佃 5’−DMT−5−(4−カルブメトキシ−2−メチルブ
テン−1−イル)−2′〜デオキシウリジン復 5′−DMT−5−(、3−シ
アノプロペン−1−イル)−2′−デオキシウリジン
セ 5′−DMT−s−(4−シアノ−2−メチルブテン−1−イル)−2’−
デオキシウリジン郵 5’−DMT−5−C2−(4−カルブメトキシフェニル
)エテノ−1−イル)−2’−チオキシウリジン阻 5’−j)MT−5−(4
−アセトキシブテン−1−イル)−2′−デオキシウリジン
酌 5’−DMT−5−(4−アセトキシブタン−1−イル)−2′−デオキシ
リジン
襲 5’−1)MT−5−[4−(214−ジニトロフェニル)ブチル〕−2′
−デオキシウリジン。
そしてUITI が以下のものである生成物を得る。
η’5−(プロペン−1−イル)ウラシル38’5−(2−カルボキシエチル)
ウラシル39’5−(3−カルボキシプロパン−1−イル)ウラ迎’5−(4−
カルボキシ−2−メチルブテン−1−イルシンウラシル
41’5−(3−シアノプロペン−1−イル〕ウラシル43’5 C2(4−カ
ルボキシフェニル)エテノ−1−イル〕ウラシル
44’5−(4−ヒドロキシブテン−1−イル)ウラシ45’5−(4−ヒドロ
キシブタン−1−イル〕ウラシ粥’5−(4−(2,4−ジニトロフェニル)ブ
チル〕ウラシル
注:焦′ は、直接リポータ−グループとして機能する、即ち、抗ジニトロフェ
ニル抗体のりガントとして用い得る。同様1こ、他の適当な5’−DMT−5−
アルキル−オリゴヌクレオチド類が製造される。
実施例W
5′−DMT−5−(3−)リフルオロアセチルアミノプロピル)−21−デオ
キシウリジンを5′− D M T −N4−ペンソイル−5 − ( 3 −
) IJ クロロアセチルアミノプロピル)−27−ジオキシシチジンで置換
え、実施例XV − XVLII の操作を繰返すこと(こより、実施例XXと
同様(ただしU”[5−(3−アミノプロピル)−ウラツル〕が5−(3−アミ
ノプロピル)シトシン類で置換えられた)、デオキシオリゴヌクレオチドが製造
される。例えば、式:
)
で示される化合物である。
実施例xxn
5’ − D M T − N4−ベンゾイル−5−(3−トリクロロアセチル
アミノプロピル)−2′−デオキシシチジンを下記の化合物群(香号皿一旦)で
置き換えて実施例Wのデオキシリボヌクレオチド合成法を繰返すことにより、そ
れぞれ、下記のcm シトシン塩基類(番号「−π )を持った、対応するオリ
ゴヌクレオチド類が製造される。即ち、以下の化合物(こ置換える。
47 5−DIVj7r−N4−ベンゾイル−5−、(3−)リフルオロアセチ
ルアミノプロペン−1−イル) −2’−デオキシシチジン
48 5’ −1) M 丁−、N’−ベンゾイル−5−(4−)リフルオロア
セチルアミノブタン−1−イル)−2′−チオルオロアセチルアミノブテン−1
−イル)−2′−デオキシシチジン
50 5’ −D M T −N4−ベンゾイル−5−(6−1−リフルオロア
セチルアミノヘキサン−1−イル)−2’−チオキシシチジン
51 5’ −D M T −N4−ベンゾイル−5−(6−1−リフルオロア
セチルアミノヘキセン−1−イル)−2’−デルオロアセチルアミノプロパン−
2−イル)−2’−デオキシシチジン
53 5’−D M T −N4−ベンゾイル−5−(3−)リフルオロアセチ
ルアミノ−2−メチルプロペン−1−イル)−27−チオキシシチジン
54 5’ −D M T −N4−ベンゾイル−5−(3−トリフルオロアセ
チルアミノ−2−メチルプロパン−1−イル)−27−チオキシシチジン
55 5’ −D M T −N4−ベンゾイル−5(2−(4−トリフルオロ
アセチルアミノメチルフェニル)エテノ−1−イル〕−2′−デオキシシヂジン
56 5’ −1) M T N4−ベンゾイル−5−CN−(ベルトリフルオ
ロアセチルポリリンル)−1−アクIJルアミド〕−2′−デオキソシチジン
貿 5’−D M T −N4−ベンゾイル−5−[N−(トリフルオロアセチ
ルアミノヘプチル)−アクリルアミド〕−27−ゾオキシシチジン。
そしてCmが次のものである生成物を得る。
47’5−(3−アミノプロペン−1−イル)シトシ/48’5−(4−アミノ
ブタン−1−イル)シトシン49’5−(4−アミ/ブテン−1−イル)シトシ
ン50’5−(6−アミノヘキサン−1−イル)シトシン51’5−(6−アミ
ノヘキセン−1−イル)シトシン52’5−(3−アミノプロパン−2−イル)
シトシン嬰′ 5−(3−アミノ−2−メチルプロペン−1−イ55’5−[2
−(4−アミノメチルフェニル)エテン同様に、他のN4−アソルー5−(アシ
ルアミノアルキル類似のデオキシオリゴヌクレオチド類が製造される。
実施例XXIII
5′− D M T − N4−ベンゾイル−5°−(’3−1− リフルオロ
アセチルアミノプロピル)−2′−チオキシシチジンを下記の化合物群(番号5
8 − 68 ) iこ置換えて実施例■のデオキシオリゴヌクレオチド合成法
を繰返すことにより、それぞれ、下記のCmシトシン塩基類(番号58’ −6
8’ )を持った、対応するオリゴヌクレオチド類か製造される。即ち、次の化
合物に置換える。
58 5’ − D M T N4−ベンゾイル−5−(プロペン−1−イル)
−2′−デオキシシチジン
59 5’ − D M T N4−ベンゾイル−5−(2−カルブメトキシエ
チル)−2′−チオキシシチジン60 5’ − D M T − N4−ベン
ゾイル−5−( 2−カルプメトキシエテンー1ーイル)−2′−デオキシシチ
ジン61 5’−DMT−N4−ベンゾイル−5−(3−カルブメトキシプロパ
ン−1−イル)−2’−デオキシシチジ62 5’ − J) M T N4−
ベンゾイル−5−(4−カルブメトキシ−2−メチルブテン−1−イル)−2′
−デオキシシチジン
53 5’ − D M T − N4−ベンゾイル−5−(3−シアノプロペ
ン−1−イル)−2’−チオキシシチジン64 5’ − D M T − N
4−ベンゾイル−5−(4−シアノ−2−メチルブテン−1−イル)−2′−デ
オキシシチジン
邸 5’ − D M T − N4−ベンゾイル−5−[2−(4−カルブメ
トキシフェニル)エテノ−1−イル]−2’−4−ジニトロフエニル)ブチル〕
−2−デオキシンチジン。
そして、Cmが次のものである生成物を得る。
58’5−(フロペン−1−イル)シトシン59’5−<2−−hルポキシエチ
ル)シトジノ60’5−(2−カルポキシェテンー1−イル)ントシ61’ 、
5− (3−カルボキシプロパン−1−イル)シト留’5−(4−カルボキシ−
2−メチルブテン−1−イル)シトシン
63’5−(3−シアノプロペン−1−イル)シトシン廖’ 5−(4−シアノ
−2−メチルブテン−1−イル)シトシン
65’ 5−[1−(4−カルボキシフェニル)エテノ−1−イル〕シトシン
66’5−(4−ヒドロキシブテン−1−イル)シトシロ7’5−(4−ヒドロ
キシブタン−1−イル)ソトシ卯’ 5−C4−(2,4−ジニトロフェニル)
ブチル〕ソトシン
同様に、他の適当な5’ −D M T−N’−アシル−5−アルキル−2′−
デオキシウリジン類を用いること(こより、類似のデオキシオリゴヌクレオチド
類か製造される。
実施例XXI V
5’−DMT −5−(3−)リフルオロアセチルアミノプロピル)−2′−デ
オキシウリジンを5’−DMT−N6−ペンゾイルー8−(6−) IJフルオ
ロアセチルアミ/ヘキシル)アミノ−2′−デオキシアデノシンで置き換えて実
施例XV −XXUlのホスホモノクロリダイトおよびデオキシオリゴヌクレオ
チド合成法を繰返すことにより、実施例XVIIIと同様(こデオキシオリゴヌ
クレオチド類〔ただし、urnはAmて置換えられており、このA は8−(6
−アミノヘキシル)アミノ−2′−デオキシアデノシンを表わす〕を製造する。
実施例xxv−xxvmは、反応6で示される様に、適当に修飾された塩基類を
有するオリゴヌクレオチド類ヘノリポータ−基の結合を例示するものである。
式:
〔式中、tJmは5−[N−(7−アミノヘプチル)−1−アクリルアミド〕ウ
ラシルを表わす〕て示される純化ペンタデカ−ヌクレオチド(実施例Xv■ か
ら得たもの)を、30mMの塩化す) IJウムを含有するpH9,5の300
mMホウ酸ナナトリウム水溶液たは炭酸ナトリウム緩衝液k、25A260単
位/dの割合て溶かす。固型のフルオレツセインインチオシアネート(0,5,
m9/m! )を加え、この混合物を密封し、4℃〜25℃で一夜、ゆるやかに
振盪する。この反応フルオレッセイン添加物を分離する(このものは保持される
):フルオレセイン化チオキソオリゴヌクレオチド付加吻は空容量付近で溶出す
る。顕著(こA260 単位を含む初期の画分を合わせて凍結乾燥し、出発物質
のペンタデカデオキシオリゴヌクレオチド(こ類似した構造の固型の生成物を得
る。ただし、この場合、urnは式:
であるか、あるいは未反応の5−[N−(7−アミノヘプチル)−1−アクリル
アミド〕ウランルのいずれかである。λmax (1−120) 262nm、
498nm実施例XIX +XXI 、■■およびXXIV て述べた化合物群
を用いてこの操作を行なえば、同様にして、対応スルフルオレセイン化されたま
たはポリフルオレセイン化されたデオキシオリゴヌクレオチド類が製造される。
実施例XXV I
フルオレセイン以外のレポーター基の結合は、フルオレッセイン・イソチオシア
ネートを例えば下記の化合物に置き換え、実施例XXVの操作を繰返し行なうこ
とによって達成し得る。それらの化合物群は、例えば
2.4−ジニトロフェニル・イソチオシアネートl−フルオロ−2,4−ジニト
ロベンゼンアミノエチル・イソルミノール・イソチオシアネート
アミノエチルアミノナフタレン−1,2−カルボキシリック・ヒドラジッド・イ
ンチオシアネートN 、 N’−ビス(アルキルスルホニル) −N−アリー里
−スルホニル・アニリン・イソチオシアネート9−(N−ヒドロキシサクシンイ
ミジル)ビオチン9−(N−ヒドロキシサクシンイミジル・カルボキシ)−N−
メチルアクリジン、または
、2ア7ゎ1.。201.、。5o■
てあり、こ、れら(こよって、フルオレラセン以外の基が結合した、対応する付
加物を製造することができる。
実施例XvII イソルミノールおよび遊離の第1級アミン−含有リポータ−グ
ループの結合
実施例xvm がら得た式:
〔式中、Umは5−(2−カルボキシエチニル)ウラシルを表わす〕
で示される純化ペンタデカヌクレオチドを、水に30A260単位勺の割合で溶
かし、1容量のピリジンで希釈する。アミノブチルエチルイソルミノールを終濃
度か1 m;//mlになる採に加え、次いて5倍モル過剰量の1−エチル−3
−(3−ジメチルアミノプロピル)カーポジイミドを加える。この反応物を密封
し、暗所で12〜48時間、ゆるやかに振盪する。、この反応混合物を−ルーデ
オキシオリゴヌクレオチド連結物は、空容量付近で溶出する。顕著瘉こA260
単位を含有している初期の両分を合わせて凍結乾燥し、出発物質のデオキシオリ
ゴヌクレオチド(こ類似した構造を有する固型生成物を得る。ただし、この場合
、而ま式:あるいは未反応の5−(2−カルボキシエチニル)ウラシルのいずれ
かである。
へがカルボキシを含んでいる様な実施例X■ およびXXIII の化合物群を
用いてこの操作を行なえば、同様(こ、対応するデオキシオリゴヌクレオチド−
インルミノールが製造される。
また、アミノブチルイソルミノールをその他の遊離第一級アミンを含むレポータ
ー基で置換え、この操作を繰返すことにより、同様にして相当するデオキシオリ
ゴヌクレオチド−レポーター付加物が製造される。
式:
C式中、A”Lt8− (6アミノヘキシル)アミノアデニンを表わす〕
で示される純化ノナヌクレオチドをpH9の25 QmM炭酸す) IJウム緩
衝液に20A260単(Mdの割合で溶かし、1−フルオロ−2,4−ジニトロ
ベンゼンヲ加よる。顕著にA260単位を含む初期の両分を合わせて濃縮し、出
発物質のデカヌクレオチドと類似の構造を有するオリゴヌクレオチド生成物を得
る。ただし、この場合、Amは式:
で示されるか、あるいは未反応の8−(6−アミノヘキシル)アミノアデニ/で
ある。
8−(6−アミノヘキシル)アミノアデニンをその他の、遊離第一級アミンを含
有する修飾された塩基で置換えてこの操作を繰返し行なうことにより、同様(こ
対応するジニトロフェニル化されたオリゴヌクレオチド付加物が製造される。
国際調査報告
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.活性化されたヌクレオチドモノマーと伸長シつつあるヌクレオチド鎖の遊離 のヒドロキシを持った端末単位とをカップリングさせることからなる定まった配 列の1本鎖オリゴヌクレオチドの化学合成法であって、該モノマーおよび端末単 位の少なくとも一方の塩基が、その立体的に耐容し得る部位に少なくとも1個の リポータ−グループとして機能し得る置換基または少なくとも1個のリポータ− グループと結合し得る置換基が結合することによって修飾されていることを特徴 とする方法。 2、該ヌクレオチドモノマーの塩基が修飾されている第1項に記載の方法。 3、該端末単位の塩基が修飾されている第1項に記載の方法。 4、該モノマーおよびヌクレオチド鎖の少なくとも一方がカップリング工程の前 に固形担体に結合している第1項に記載の方法。 5、該端末単位がカップリング工程の前に固形担体に結合している第1項に記載 の方法。 6、該置換基が芳香族、多環式または芳香族並びに多環式の基である第1項に記 載の方法。 7、置換基が着色、螢光、発光、放射活性またはリガンド認識リポータ−グルー プとして機能する第1項に記載の方法。 8、カップリング工程の前に、少なくとも1個のリポータ−グループを置換基に 結合させる第1項に記載の方法。 9、カップリング工程の後、少なくとも1個のリポータ−グループを置換基に結 合させる第1項に記載の方法。 10、少なくとも1個のリポータ−グループが芳香族、多環式または芳香族並び に多環式の基である第8項または第9項に記載の方法 11、少なくとも1個のリポータ−グループが機能的な着色、螢光、発光、放射 活性またはリガンド認識性の基である第8項または第9項に記載の方法。 12、少なくとも1個のリポータ−グループがフルオレセイン、ローダミン、ア クリジニウム塩、ニトロフェニル、ジニトロフェニル、ベンゼンスルホニル、ビ タミン、ルミノール、イソルミノール、ルシフェリン、ジオキセタンまたはジオ キサミド、またはその付加物である第11項に記載の方法。 13.ヌクレオチドモノマーがその3′位に活性化された燐含有基を持っており 、端末単位の遊離のヒドロキシがその5′位lこある第1項lこ記載の方法。 14、ヌクレオチドモノマーがその5′位に活性化された燐含有基を持っており 、端末単位の遊離のヒドロキシがその3′位にある第1項に記載の方法。 15、ヌクレオチドモノマーがピリミジンを塩基とするものであり、置換基がそ のc−5位に結合している第1項に記載の方法。 16、置換基が2またはそれ以上の炭素原子鎖を含んでいる第15項に記載の方 法。 −CFI2CHRIR2または−CH=CRIR2である第15項に記載の方法 (式中、hは水素またはC1−6低級アルキル、−はCn口2nYであり、ここ lこnは0〜20、Yは水素エニル、置換ニトロフェニル、置換アミ/、エステ ル1、置換カルボキシフェニル、置換アミノアルキルフェニルまたは置換アミノ ベンゼンスルホン酸であるン。 る第17項(こ記載の方法。 19、Xが弗素または塩素である第18項に記載の方法。 20、R2がCn112nYであり、カップリング工程の前に少なくとも1個の 機能的な着色、螢光、発光、放射活性またはリガンド認識性のリポータ−グルー プがYに結合している第17項に記載の方法。 の方法(式中 R1は水素またはC1−6低級アルキル、−はCnH3゜Yであ り、ここにnは0〜20、Yは水素または少なくとも1個のアミド、置換アミド 、ニトロフェニル、置換ニトロフェニル、またはマスクしたアミノ、置換アミノ 、カルボキシ、ヒドロキシ、カルボキシフェニル、置換カルボキシフェニル、ア ミノアルキルフェニル、置換アミノアルキルフェニル、アミノベンゼンスルホン 酸、または置換アミノベンゼンスルホン酸である)。 22、R2がCnH2nY であり、カップリング工程の後、もしYがマスクさ れていれば脱マスクし、そして固形担体をYに結合させる第21項(こ記載の方 法。 23、R2がCnH2nY てあり、カップリング工程の後、もしYがマスクさ れていれば脱マスクし、少なくとも1個の機能的な着色、螢光、発光、放射活性 またはすが/ド認識性のリポータ−グループをYに結合させる第21項に記載の 方法。 24、ヌクレオチドモノマーがウラシル塩基の、またはシトシン塩基のものであ る第1項〜第9項および第12項〜第23項のいずれかに記載の方法。 25、ヌクレオチドモノマーがプリン塩基のものであり、置換基かそのc−B位 に結合している第1項(こ記載の方法。 26、置換基が、多価へテロ原子を介してプリン塩基fこ結合している少なくと も1個の炭素原子を含有している第25項に記載の方法。 27、置換基が式ニーZCf−IR,R2て表わされる第25項(こ記載の方法 (Zは多価へテロ原子、R1ハ水素またはC1−6低級アルキル、−はCnH2 nY であり、ここにnはO〜20、Yは少なくとも1個のアミド、置換アミド 、ニトロフェニル、置換ニトロフェニル、置換アミノ、エステル、置換カルボキ シフェニル、置換アミノT 71/ キJl/ 7 x =ルマタは置換アミノ ベンゼンスルホン28、Yが少なくとも1個のNt−1acx3である第27項 1こ記載の方法(Xは水素またはハロゲンである)。 29、Xが弗素または塩素である第28項lこ記載の方法。 30、R2がCnH2nY であり、カップリング工程の前に、少な(とも1個 の機能的な着色、螢光、発光、放射活性またはリガンド認識性のリポータ−グル ープかyHこ結合している第27項に記載の方法。 31、置換基か式: −ZCl(RIR2て表わされるものである第25項に記 載の方法(Zは多価へテロ原子、町は水素またはCl−6低級アルキル、へはC nl−■2oY てあり、ここにnは0〜20、Yは少なくとも1個のアミド、 置換アミド、ニトロフェニル、置換ニトロフェニル、またはマスクされたアミノ 、置換アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、カルボキシフェニル、置換カルボキシ フェニル、アミノアルキルフェニル、置換アミノアルキルフェニル、アミノベン ゼンスルホン酸、tたi;i置換アミノベンゼンスルホン酸である)。 32、 R2がCnH2nY であり、カップリング工程の後、もしYかマスク されていれば脱マスクし、固形担体をYに結合させる第31項に記載の方法。 33.R2がCnH2nY てあり、カップリング工程の後、もしYがマスクさ れていれば脱マスクし、少なくとも1個の機能的な着色、螢光、発光、放射活性 またはすがンド認識性のリポータ−グループをYに結合させる第31項(こ記載 の方法。 34、少なくとも1個のリポータ−グループかフルオレセイン、ローダミン、ア クリジニウム塩、ニトロフェニル、ジニトロフェニル、ベンゼンスルボニル、ビ タミン、ルミノール、イソルミノール、ルシフェリン、ジオキセタンまたはジオ キサミド、またはその付加物である第20.23.30または33項に記載の方 法。 35、ヘテロ原子がN、0またはSである第26〜33項のいずれか(こ記載の 方法。 36、ヌクレオチドモノマーがアデニン塩基のものである第1〜9項、第12〜 23項および第25〜33項のいずれかに記載の方法。 37、ヌクレオチドモノマーがリポヌクレ牙チドである第1〜9項、第12〜2 3項および第25〜33項のいずれか(こ記載の方法。 あ、ヌクレオチドモノマーがデオキシリボヌクレオチドである第1〜9項、第1 2〜23項および第25〜33項のいずれかに記載の方法。 39、ヌクレオチドモノマーがヌクレオチド鎖にカップリングすること(こより 、その鎖の新しい端末単位となり、そのカップリング工程の後、その新しい端末 単位(こ別のヌクレオチドモノマーがカップリングすることによってそのヌクレ オチド鎖が伸長する第1〜9項、第12〜23項および第25〜33項のいずれ か(こ記載の方法。 40、以上の請求項のいずれかに記載の方法で製造されたオリゴヌクレオチド。 41、約200塩基単位より少ない長さの第1〜39項42、少なくとも1個の リポータ−グループと結合し得るか、または少なくとも1個のリポータ−グルー プとして機能し得る置換基が、塩基の立体的に耐容性のある部位に結合している 少なくとも1個のヌクレオチド単位を含んでいる、約200塩基単位より少ない 長さの定まった配列の1本鎖オリゴヌクレオチド。 43、天然に存在するヌクレオチド塩基を持った少なくとも1個のヌクレオチド 単位を更(こ含有してなる第42項に記載のオリゴヌクレオチド。 44、置換基が芳香族、多環式または芳香族並びに多環式の基である第42項ま たは第43項に記載のオリゴヌクレオチド。 45、置換基か少なくとも1個の着色、螢光、発光、放射活性またはリガンド認 識性のリポータ−グループとして機能する第42項に記載のオリゴヌクレオチド 。 46、少なくとも1個のリポータ−グループが該置換基に結合している第42項 または第43項に記載のオリゴヌクレオチド。 47、少な(とも1個のリポータ−グループが芳香族、多環式または芳香族並び に多環式の基である第46項(こ記載のオリゴヌクレオチド。 48、少なくとも1個のリポータ−グループが機能的な着色、螢光、発光、放射 活性またはリガンド認識性のリポータ−グループである第46項に記載のオリゴ ヌクレオチド。 49、少なくとも1個のリポータ−グループがフルオレセイン、ローダミン、ア クリジニウム塩、ニトロフェニル、ジニトロフェニル、ベンゼンスルホニル、ビ タミン、ルミノール、イソルミノール、ルシフェリン、ジオキセタンまたはジオ キサミド、またはその付加物である第46項に記載のオリゴヌクレオチド。 50、置換基が結合しているヌクレオチド単位がピリミジンを塩基とするもので あり、その置換基がそのC−5位に結合している第42項、第43項および第4 5〜49項のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。 51、置換基が2またはそれ以上の炭素原子鎖を含んでオリゴヌクレオチド(R 1は水素またはC□−6低級アルキル、−はCn112nY であり、ここにn は0〜20、Yは水素または少なくとも1個のアミド、置換アミド、ニトロフェ ニル、置換ニトロフェニル、アミノ、置換アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、カ ルボキシフェニル、置換カルボキシフェニル、アミノアルキルフェニル、置換ア ミノアルキルフェニル、アミノベンゼンスルホン酸マたは置換アミノベンゼンス ルホン酸である)。 53、Yが少なくとも1個のアミド、アミン、カルボキシ、エステルまたはニト ロフェニル、またはその付加物である第52項に記載のオリゴヌクレオチド。 54、R2がCnH2nY であり、少なくとも1個の機能的な着色、螢光、発 光、放射活性またはリガンド認識性のリポータ−グループがYに結合している第 52項lこ記載のオリゴヌクレオチド。 55、置換基が結合しているヌクレオチド単位がウラシルまたはシトシンを塩基 とするものである第42項、第43項、第45項、第47〜49項および第51 〜54項のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。 56、置換基が結合しているヌクレオチド単位がプリンを塩基とするものであり 、置換基がそのC−3位に結合している第42項、第43項および第45〜49 項のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。 57、置換基が、多価へテロ原子を介してプリン塩基に結合している少なくとも 1個の炭素原子を含んでいる第56項(こ記載のオリゴヌクレオチド。 郭、置換基が式: −Z CHR1R2て示されるものである第56項+C記載 のオリゴヌクレオチド(Zは多価へテロ原子、k□は水素またはC□−6低級ア ルキル=R2はCoH2n+1またはCnH2nY であり、ここlこnはo〜 2o1Yは少なくとも1個のアミノ、置換アミド、ニトロフェニル、置換ニトロ フェニル、アミノ、置換アミノ、ヒドロキシ、カルボキシ、カルボキシフェニル 、置換カルボキシフェニル、アミノアルキルフェニル、置換アミ/アルキルフェ ニル、アミノベンゼンスルホン酸または置換アミノベンゼンスルホン酸である) 。 59R2がCnf■2nY てあり、少なくとも1個の機能的な着色、螢光、発 光、放射活性またはリガンド認識性のリポータ−グループがYに結合している第 58項に記載のオリゴヌクレオチド。 60、少なくとも1個のリポータ−グループがフルオレセイン、ローダミン、ア クリジニウム塩、ニトロフェニル、ジニトロフェニル、ベンゼンスルホニル、ビ タミン、ルミノール、イソルミノール、ルシフェリン、ジオキセタンまたはジオ キサミド、またはその付加物である第54項および第57〜59項のいずれかに 記載のオリゴヌクレオチド。 61、Yがアミノであり、少な(とも1個のリポータ−グループがフルオレセイ ン、フルオレスカミン、ローダミン、ルミノール、イソルミノール、ジオキセタ ン、ジオキサミド、ビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン、または その付加物である第59項(こ記載のオリゴヌクレオチド。 62、ペテロ原子がN、0またはSである第57項、第58項または第59項の いずれかに記載のオリゴヌクレオチド。 63、置換基が結合しているヌクレオチド単位がアデニンを塩基とするものであ る第42項、第43項、第45〜49項、第57〜59項および第61項のいず れかに記載のオリゴヌクレオチド。 64、ヌクレオチドがりボヌクレオチドである第42.43.45.47〜49 .51〜54.57〜59および61項のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド 。 65、ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドである第42.43.45.4 7〜49.51〜54.57〜59および61項のいずれかに記載のオリゴヌク レオチド。 66、約5〜約60塩基単位の長さである第42.43.45.47〜49.5 1〜54.57〜′59および61項のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。 67、約10〜約40塩基単位の長さである第42.43.45.47〜49. 51〜54.57〜59および61項のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。 68、炭素鎖および少なくとも1個のアミドを含有している置換基によってその 塩基が修飾されている、オリゴヌクレオチドの化学合成における中間体として有 用なヌクレオシドてあって、その少な(とも1個のアミドの窒素が、該炭素鎖を 介して該塩基上の立体的に耐る第68項に記載のヌクレオシド(式中、町は水素 またはC1−6低級アルキル、yは少なくとも1個のアミド、ff1lアミド、 置換アミノまたは置換アミノアルキ記載のヌクレオシド(式中、Xは水素または ハロゲンである)。 71、ハロゲンが弗素または塩素である第70項に記載レオシト。 73、ピリミジンを塩基とするものであり、炭素鎖かC−5位に結合している第 68〜72項のいずれか(こ記載のヌクレオシド。 74、ウラシルまたはシトシンを塩基とする第73項に記載のヌクレオシド。 75、5’−ヒドロキシがマスキング基でマスクされている第73項(こ記載の ヌクレオシド。 76、マスキング基がモノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルまたはトリメ トキシトリチルである第75項(こ記載のヌクレオシド。 77、マスキング基かジメトキシトリチルである第76項に記載のヌクレオシド 。 78、3’−ヒドロキシがマスクされている第73項に記載のヌクレオシド。 79、プリンを塩基とするものであり、炭素鎖が、窒素、硫黄または酸素原子を 介してそのc−6位(こ結合している第68〜72項のいずれかに記載のヌクレ オシド′。 81、5’−ヒドロキシがマスキング基によってマスクされている第80項に記 載のヌクレオシド。 82、マスキング基がモノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルまたはトリメ トキントリチルである第81項に記載のヌクレオシド。 83、マスキング基がジメトキシトリチルである第82項に記載のヌクレオシド 。 84、3’−ヒドロキシがマスクされている第80項に記載のヌクレオシド。 85、リボヌクレオシドまたはデオキシリポヌクレオシドである第68〜72項 、74〜78項および第80〜第84項のいずれかに記載のヌクレオシド。 86、ビタミンがビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチンである第1 2項または第34項のいずれかに記載の方法。 87、ビタミンがビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチンである第4 9項をこ記載のオリコ゛スクレオチド。
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Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6239598A (ja) * | 1985-08-15 | 1987-02-20 | アモコ・コーポレーション | 標識付けした核酸 |
JPH03505209A (ja) * | 1988-06-20 | 1991-11-14 | コパニー・オリ・インダストリー・ソシエテ・アノニム | 標的付与されたオリゴヌクレオチド類の合成に使用できるヌクレオシド誘導体類、これ等誘導体類から得たオリゴヌクレオチド類及びそれ等の合成 |
JP2004043819A (ja) * | 1996-05-03 | 2004-02-12 | Applera Corp | 硬質リンカ―を有するエネルギ―転移色素 |
WO2005103249A1 (ja) | 2004-04-26 | 2005-11-03 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 結核菌検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたヒト型結核菌の検出方法 |
WO2006121134A1 (ja) | 2005-05-13 | 2006-11-16 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | マイコバクテリウム・カンサシ検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・カンサシの検出方法 |
WO2007105673A1 (ja) | 2006-03-13 | 2007-09-20 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 変異遺伝子の検出方法 |
WO2007129628A1 (ja) | 2006-05-02 | 2007-11-15 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | マイコバクテリウム・イントラセルラーレ検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・イントラセルラーレの検出方法 |
WO2008075520A1 (ja) | 2006-12-18 | 2008-06-26 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | マイコバクテリウム・アビウム検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・アビウムの検出方法 |
WO2009099037A1 (ja) | 2008-02-08 | 2009-08-13 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | クラミドフィラ・キャビエ検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたクラミドフィラ・キャビエの検出方法 |
WO2009145181A1 (ja) | 2008-05-28 | 2009-12-03 | 和光純薬工業株式会社 | マイコバクテリウム・イントラセルラー検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・イントラセルラーの検出方法 |
WO2011118496A1 (ja) | 2010-03-23 | 2011-09-29 | 和光純薬工業株式会社 | クラミジア・トラコマティス検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたクラミジア・トラコマティスの検出方法 |
WO2017170376A1 (ja) | 2016-03-30 | 2017-10-05 | 和光純薬工業株式会社 | クラミジア・トラコマティス検出用プライマーセット及びこれを用いたクラミジア・トラコマティス検出方法、並びにそのための試薬キット |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE8207098D0 (sv) * | 1982-12-10 | 1982-12-10 | Iro Ab | Anordning for temporer upplagring och matning av uppmetta garnlengder, foretredesvis till dysvevmaskiner |
BE899671A (nl) * | 1984-05-16 | 1984-11-16 | Picanol Nv | Regelbare sturing van de inslagdraad van een weefgetouw. |
IT1176259B (it) * | 1984-06-04 | 1987-08-18 | Roy Electrotex Spa | Alimentatore di trama per telai di tessitura |
US4781224A (en) * | 1984-07-20 | 1988-11-01 | Nissan Motor Co., Ltd. | Loom equipped with weft picking control system |
JPH0639735B2 (ja) * | 1984-07-24 | 1994-05-25 | 日産自動車株式会社 | 流体噴射式織機の制御装置 |
US4768565A (en) * | 1984-09-27 | 1988-09-06 | Aktiebolaget Iro | Method for controlling a yarn storing, feeding and measuring device |
DE3440389C1 (de) * | 1984-11-05 | 1986-03-20 | Bernd Dipl-Ing Scheffel | Fadenspeichervorrichtung fuer Webmaschinen und Verfahren zu deren Betrieb |
IT1215235B (it) * | 1985-01-30 | 1990-01-31 | Omv Off Mecc Vilminore | Dell'alimentazione di filati di dispositivo di autoregolazione trama in telai di tessitura ad aria. |
JPH0627398B2 (ja) * | 1985-03-30 | 1994-04-13 | 日産自動車株式会社 | 流体噴射式織機の緯入れ装置 |
CH670263A5 (ja) * | 1986-05-23 | 1989-05-31 | Sulzer Ag | |
DE3675389D1 (de) * | 1986-05-30 | 1990-12-06 | Iro Ab | Vorrichtung fuer die kontrolle eines schusseintrages. |
EP0250359B1 (de) * | 1986-06-16 | 1990-01-17 | GebràDer Sulzer Aktiengesellschaft | Schussfadenspeicher für Webmaschine |
JPS6328944A (ja) * | 1986-07-14 | 1988-02-06 | 津田駒工業株式会社 | よこ入れ装置の測長量設定方法およびその装置 |
EP0253760B1 (de) * | 1986-07-15 | 1991-11-27 | GebràDer Sulzer Aktiengesellschaft | Verfahren für den Betrieb eines Schussfadenspeichers für eine Webmaschine |
DE3628485A1 (de) * | 1986-08-22 | 1988-02-25 | Iro Ab | Geraet zum speichern von garn |
BE905471A (nl) * | 1986-09-23 | 1987-03-23 | Picanol Nv | Werkwijze om bij weefmaschines de lengte van de in de gaap te brengen inslagdraad te regelen en inrichtingen hierbij aangewend. |
DE8800216U1 (de) * | 1987-11-29 | 1989-03-30 | Aktiebolaget Iro, Ulricehamn | Vorrichtung zum Speichern, Liefern und Messen eines Fadens |
JPH01321951A (ja) * | 1988-06-03 | 1989-12-27 | Gebr Sulzer Ag | 緯糸蓄積装置 |
EP0561218A1 (de) * | 1992-03-16 | 1993-09-22 | Lindauer Dornier Gesellschaft M.B.H | Verfahren und Vorrichtung zur Bereitstellung einer definierten Schussfadenreserve bei Webstop |
SE511091C2 (sv) * | 1993-04-21 | 1999-08-02 | Sipra Patent Beteiligung | Garnmatare för textilmaskiner |
JP5648669B2 (ja) * | 2012-10-12 | 2015-01-07 | 株式会社豊田自動織機 | 緯糸測長貯留装置の緯糸送り羽根調整工具 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS57176998A (en) * | 1981-03-27 | 1982-10-30 | University Patents Inc | Phosphoramidate compound and manufacture |
JPS57209297A (en) * | 1981-04-17 | 1982-12-22 | Univ Yale | Modified nucleotide, manufacture and use |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CH394899A (it) * | 1961-10-31 | 1965-06-30 | Sobrevin Soc De Brevets Ind Et | Apparecchio per la regolazione della tensione all'uscita di un filo nel passaggio dal suo svolgimento al suo avvolgimento |
CH404575A (de) * | 1963-09-12 | 1965-12-15 | Saurer Ag Adolph | Dosiervorrichtung an Webmaschine |
JPS5626038A (en) * | 1979-08-10 | 1981-03-13 | Nissan Motor | Weft yarn storage apparatus of shuttleless loom |
CH647999A5 (de) * | 1980-06-17 | 1985-02-28 | Rueti Ag Maschf | Fadenliefervorrichtung fuer textilmaschinen und verfahren zum betrieb der fadenliefervorrichtung. |
JPS5782546A (en) * | 1980-11-12 | 1982-05-24 | Nissan Motor | Storage apparatus of "futakoshi" weft yarn of shuttleless loom |
-
1983
- 1983-09-30 EP EP19830109818 patent/EP0107110B1/en not_active Expired
- 1983-09-30 EP EP19840113290 patent/EP0148356B1/en not_active Expired
- 1983-09-30 DE DE8383109818T patent/DE3371098D1/de not_active Expired
- 1983-09-30 WO PCT/EP1983/000254 patent/WO1984001394A1/de unknown
- 1983-09-30 DE DE8484113290T patent/DE3382053D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1983-09-30 JP JP83503159A patent/JPS59501830A/ja active Granted
-
1984
- 1984-02-22 JP JP50152684A patent/JPS60500717A/ja active Granted
-
1992
- 1992-10-21 JP JP28277992A patent/JPH07100900B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS57176998A (en) * | 1981-03-27 | 1982-10-30 | University Patents Inc | Phosphoramidate compound and manufacture |
JPS57209297A (en) * | 1981-04-17 | 1982-12-22 | Univ Yale | Modified nucleotide, manufacture and use |
Cited By (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6239598A (ja) * | 1985-08-15 | 1987-02-20 | アモコ・コーポレーション | 標識付けした核酸 |
JPH03505209A (ja) * | 1988-06-20 | 1991-11-14 | コパニー・オリ・インダストリー・ソシエテ・アノニム | 標的付与されたオリゴヌクレオチド類の合成に使用できるヌクレオシド誘導体類、これ等誘導体類から得たオリゴヌクレオチド類及びそれ等の合成 |
JP2004043819A (ja) * | 1996-05-03 | 2004-02-12 | Applera Corp | 硬質リンカ―を有するエネルギ―転移色素 |
EP2256218A1 (en) | 2004-04-26 | 2010-12-01 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Probe and primer for tubercle bacillus detection, and method of detecting human tubercle bacillus therewith |
WO2005103249A1 (ja) | 2004-04-26 | 2005-11-03 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 結核菌検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたヒト型結核菌の検出方法 |
US8628926B2 (en) | 2004-04-26 | 2014-01-14 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Probe and primer for tubercle bacillus detection, and method of detecting human tubercle bacillus therewith |
US8044184B2 (en) | 2004-04-26 | 2011-10-25 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Probe and primer for tubercle bacillus detection, and method of detecting human tubercle bacillus therewith |
WO2006121134A1 (ja) | 2005-05-13 | 2006-11-16 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | マイコバクテリウム・カンサシ検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・カンサシの検出方法 |
EP2623597A1 (en) | 2005-05-13 | 2013-08-07 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Primer and probe for use in detection of mycobacterium kansasii and method for detection of mycobacterium kansasii using the same |
EP2284263A2 (en) | 2005-05-13 | 2011-02-16 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Primer and probe for use in detection of mycobacterium kansasii and method for detection of mycobacterium kansasii using the same |
WO2007105673A1 (ja) | 2006-03-13 | 2007-09-20 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 変異遺伝子の検出方法 |
WO2007129628A1 (ja) | 2006-05-02 | 2007-11-15 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | マイコバクテリウム・イントラセルラーレ検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・イントラセルラーレの検出方法 |
EP2383349A2 (en) | 2006-12-18 | 2011-11-02 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Primer and probe for detection of mycobacterium avium and method for detection of mycobacterium avium using the same |
WO2008075520A1 (ja) | 2006-12-18 | 2008-06-26 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | マイコバクテリウム・アビウム検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・アビウムの検出方法 |
WO2009099037A1 (ja) | 2008-02-08 | 2009-08-13 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | クラミドフィラ・キャビエ検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたクラミドフィラ・キャビエの検出方法 |
EP2546344A2 (en) | 2008-02-08 | 2013-01-16 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Primer and probe for detecting chlamydophilia caviae, as well as chlamydophilia caviae detection method using the same |
WO2009145181A1 (ja) | 2008-05-28 | 2009-12-03 | 和光純薬工業株式会社 | マイコバクテリウム・イントラセルラー検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・イントラセルラーの検出方法 |
EP2853594A1 (en) | 2008-05-28 | 2015-04-01 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Primer and probe for detection of Mycobacterium intracellulare, and method for detection of Mycobacterium intracellulare using the primer or the probe |
WO2011118496A1 (ja) | 2010-03-23 | 2011-09-29 | 和光純薬工業株式会社 | クラミジア・トラコマティス検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたクラミジア・トラコマティスの検出方法 |
WO2017170376A1 (ja) | 2016-03-30 | 2017-10-05 | 和光純薬工業株式会社 | クラミジア・トラコマティス検出用プライマーセット及びこれを用いたクラミジア・トラコマティス検出方法、並びにそのための試薬キット |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS59501830A (ja) | 1984-11-01 |
EP0148356A3 (en) | 1989-02-15 |
DE3382053D1 (de) | 1991-01-17 |
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JPH0359914B2 (ja) | 1991-09-12 |
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