明 細 書
新規なヌクレオシド若しくはヌクレオチド誘導体及びその利用
技術分野
[0001] 本発明は、新規な非天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチド及びその利 用に関する。
背景技術
[0002] 生体高分子である核酸 (DNA, RNA)は、生命活動に必要となる膨大な量の遺伝 情報を、僅力 4種類の塩基の組合せからなる配列として記録している。また、核酸は 自分自身を铸型として DNAポリメラーゼにより自己複製し、さらに RNAポリメラーゼ による転写、リボソームによる翻訳というプロセスを介して、 DNAから DNAへ、 DNA 力 RNAへ、 RNA力 タンパク質へと遺伝情報を伝達する。この遺伝情報の複製と 伝達を可能としているのは排他的な塩基対形成 (A— T/U、 G— C)のルールである 。また、核酸は、多様な高次構造を形成して様々な機能を発揮する。例えば、 in vit roセレクション法によって、ァプタマ一やリボザィムの機能を有する新規核酸がこれま でに多数見つかつてきたこともその一つである。
[0003] しかし、 20種類のアミノ酸からなるタンパク質に比べて、天然の核酸には 4種類の塩 基(2種類の塩基対)し力、ないという事実は、核酸の化学的 ·物理的多様性に限界を 与えている。たとえば、生体中の tRNA、 rRNA、 mRNA等の機能性 RNAは自分自 身の構造を安定化したり、 RNA—RNA間、 RNA_タンパク質間相互作用を安定化 するために、様々な修飾塩基を利用している。したがって、新規機能性核酸の開発 において、新たな塩基 (対)のレパートリーを増やすことは大変有益であると考えられ る。
[0004] 核酸のさらなる機能拡張をめざして、非天然型塩基をもつヌクレオシド又はヌクレオ チドの創製への取り組みが行われている。核酸に修飾塩基 (もしくは非天然型塩基) を導入する手法として、 1)化学合成により直接導入する方法、 2)核酸合成酵素によ り導入する方法が考えられる。 1)の場合は、アミダイトユニットの安定性や塩基部分 の適当な保護基が存在すること等化学合成上の問題の解決が必要である。また、こ
れらの問題が解決されれば様々な非天然型塩基を位置選択的に導入できるが、そ の核酸の増幅は困難であり、長鎖長の核酸の合成も難しくなる。 2)の場合は、もし、 基質が酵素に認識され、人工塩基対間で相補的に複製、転写されれば、その核酸 の増幅 *調製が可能となるが、そのような基質や塩基対 (非天然型ヌクレオチド)も開 発途中である。
[0005] 人工塩某 の皆景
天然の二本鎖 DNA中の Aと T及び Gと Cは、それぞれ特異的な水素結合を介して 互いに「排他的」な塩基対を形成している。近年、天然型塩基対と異なる水素結合様 式をもち、かつ立体障害によって天然型塩基との対合を排除できるような塩基対を創 出の研究が行われている。例えば、 Ohtsuki et al., 2001及び Hirao et al. , 2002では、プリンの 6位にかさ高い置換基を導入した 2—ァミノ _ 6—ジメチルァミノ プリン (X)と 2—ァミノ _6 _チェ二ルブリン (s)、そしてそのかさ高い置換基に相補す る部位に水素原子をもった 2—ォキソ(1H)ピリジン (y)をデザインし、この X— y、 s— y塩基対形成を Klenowフラグメントによる DNA中への取り込み効率により調べた。 その結果、铸型中の Xに対する yの取り込みは低い選択性しか示さなかった力 sに 対する yの取り込みは、比較的選択性も効率も良いことが示されていた(図 1)。
[0006] 上記 s— y塩基対の開発によって、 RNA中に選択的に yを導入することが可能にな つた。本発明者らはさらに、 yに機能性の置換基が結合した物質が得られれば、アブ タマ一ゃリボザィム等の新規機能性分子が創製可能にある、と考えた。そこで、 5位 力 Sヨウ素等で置換されている 5位置換ー2—ォキソ(1H)ピリジンー3—ィルー基を塩 基として有するヌクレオチドを有する核酸を開発した。人工塩基対の開発の経緯、並 びに 5位置換一 2_ォキソ(1H)ピリジン _ 3—ィル一基を塩基として有するヌクレオ シド及びヌクレオチド ίこつレ、て fま、 WO2004/007713 (2004年 1月 22曰公開)に 詳述されている。
[0007] 核 のネ票言戠 ぴ
従来より、放射性元素、蛍光色素等を用い核酸を標識することが行われている。し かし、天然型の塩基を含む核酸の場合は、核酸の末端のみが標識されるか、あるい は天然型塩基 (A、 T、 G、 C)のいずれか標識されたものを核酸内部に取り込む場合
は、標識核酸が多数ランダムに取り込まれる、という本質的な問題がある。核酸の内 部を、例えば蛍光色素を用いて、部位特異的に標識する方法が希求される。
以下の文献は、参考文献としてその内容が本明細書中に援用される。
特許文献 1: WO2004Z007713
非特許文献 l : Battersby, T.R., Ang, D.N., Burgstaller, P., Jurczyk, S.C., Bowser, M.T., Buchanan, D.D. , Kennedy, R.T. & Benner, S.A. (1999) Quantitative Analysis of Receptors for Adenosine Nucleotides Obtained via In Vitro Selection from a Libra ry Incorporating a Cationic Nucleotide Analog., J. Am. Chem. Soc, 121, 9781 - 9789 非特許文献 2 : Ellington, A.D. & Szostak, J.W. (1990) In vitro selection of RNA mole cules that bind specific ligands., Nature, 346, 818-822.
非特許文献 3 : Fang, X· , Cao, Ζ·, Beck, T. & Tan, W. (2001) Molecular aptamer for real-time oncoprotein platelet-derived growth factor monitoring by fluorescence ani sotropy., Anal. Chem., 73, 5752-5757.
非特許文献 4 : Fujiwara, T" Kimoto, M" Sugiyama, H., Hirao, I. & Yokoyama, S. (20 01) Synthesis of 6_(2_Thienyl)purine Nucleoside Derivatives That Form Unnatural B ase Pairs with Pyridin_2_one Nucleosides., Bioorg. Med. Chem. Lett., 11, 2221-222 3.
非特許文献 5 : Golden, M.C, Collins, B.D., Willis, M.C. & Koch, T.H. (2000) Diagn ostic potential of PhotoSELEX-evolved ssDNA aptamers., J. BiotechnoL, 81, 167-1 78.
非特許文献 6 : Hirao, I" Madin, K., Endo, Υ· , Yokoyama, S. & Ellington, A.D. (2000 ) RNA aptamers That Bind to and Inhibit the Ribosome- inactivating Protein, Pepoci n., J. Biol. Chem., 275, 4943-4948.
特許文献 7 : Hirao, I., Ohtsuki, T., Fujiwara, T., Mitsui, T., Yokogawa, T., Okuni, T., Nakayama, K., Takio, K., Yabuki, T., Kigawa, T., Kodama, K., Yokogawa, T.,
Nishikawa, K. & Yokoyama, S. (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogs in to proteins., Nat. BiotechnoL, 20, 177-182.
非特許文献 8 : Ishikawa, M., Hirao, I. & Yokoyama, S. (2000) Synthesis of 3_(2_deox y-(-D-ribofuranosyl)pyridin-2-one and 2_amino_6_(N,N_dimethylamino)_9_(2_deox y-(-D-ribofuranosyl)purine derivatives for an unnatural base pair., Tetrahedron Lett ·, 41, 3931-3934.
非特許文献 9 : Jensen, K.B. , Atkinson., B丄., Willis, M.C., Koch, T.D. & Gold,し(1 995) Using in vitro selection to direct the covalent attachment of human immunodefi ciency virus type 1 Rev protein to high-affinity RNA ligands., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 12220-12224.
非特許文献 10 : Jhaveri, S., Rajendran, M. & Ellington, A.D. (2000) In vitro selection of signaling aptamers., Nat. Biotechnol., 18, 1293-1297.
非特許文献 11 : Latham, J.A. , Johnson, R. & Toole, J.J. (1994) The application of a modified nucleotide in aptamer selection: novel thrombin aptamers containing 5 - (1 - pentynyl)-2'-deoxyuridine. , Nucleic Acids Res., 22, 2817-2822.
非特許文献 12 : Matulic_Adamic, J. & Beigelman, L. (1997) Synthesis of 3_ _D_Ri bofuranosyl)-2-Fluoropyridine and 3_( β _3_D_Ribofuranosyl)_Pyridin_2_one., Tetr ahedron Lett., 38,203-206.
非特許文献 13 : Meisenheimer, K.M. & Koch, T.H. (1997) Photocross- Linking of Nu cleic Acids to Associated Proteins., Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 32, 101-140. 非特許文献 14 : Morales, J.C. & Kool, E.T. (1999) Minor Groove Interactions b etwee n Polymerase and DNA: More Essential to Replication than Watson-Crick Hydrogen Bonds?, J. Am. Chem. Soc , 121, 2323—2324.
非特許文献 15 : Ohtsuki, T., Kimoto, M" Ishikawa, M" Mitsui, T., Hirao, I. & Yokoy ama, S. (2001) Unnatural base pairs for specific transcription.. Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 98, 4922-4925.
非特許文献 16 : Piccirilli, J.A., Krauch, Τ· , Moroney, S.E. & Benner, S.A. (1990) En zymatic incorporation of a new base pair into DNA and RNA extends the genetic alp habet., Nature, 343, 33—37.
非特許文献 17 : Piccirilli, J.A., Moroney, S.E. & Benner, S.A. (1991) A C- nucleotide
base pair: methylpseudouridine-directed incorporation of formycin triphosphate into RNA catalyzed by T7 RNA polymerase., Biochemistry, 30, 10350-10356.
非特許文献 18:Switzer, C.Y., Moreney, S.E. & Benner, S.A. (1993) Enzymatic Reco gnition of the Base Pair between Isocytidine and Isoguanosine., Biochemistry, 32, 10 489-10496.
非特許文献 19:Tae, E.L., Wu, Υ·, Xia, G., Schultz, P.G. & Romesberg, F.E. (2001) Efforts toward Expansion of the enetic Alphabet: Replication of RNA with Three B ase Pairs., J. Am. Chem. Soc, 123, 7439-7440.
非特許文献 20: Wu, Υ·, Ogawa, A.K., Berger, M., McMinn, D.L., Schultz, P.G. & R omesberg, F.E. (2000) Efforts toward Expansion of the Genetic Alphabet: Optimizati on of Interbase Hydrophobic Interactions., J. Am. Chem. Soc, 122, 7621-7632. 非特許文献 21 : Yamamoto, R., Baba, T. & Kumar, P.K. (2000) Molecular beacon apt amer fluorescences in the presence of Tat protein of HIV-l., Genes Cells, 5, 389-3 96.
非特許文献 22 : Kimoto, M" Endo, M., Mitsui, T., Okuni, T., Hirao, I. & Yokoyama, S. (2004) site-specific incorporation of a photo-crosslinking component into RNA b y T7 transcription mediated by unnatural base pairs., Chem. Biol., 11, 47-55.
非特許文献 23:Tuschl, T., Gohlke, C" Jovin, T.M., Westhof, E. & Eckstein, F. (19 94) A three-dimensional model for the hammerhead ribozyme based on fluorescence measurements., Science, 266, 78b_789.
非特許文献 24:Logsdon, N., Lee, C.G. & Harper, J.W. (1992) Selective 5' modificat ion of T7 RNA polymerase transcripts., Anal. Biochem., 205, 3り -41.
非特許文献 25:Misra, A., Mishra, S. & Misra, K. (2004) Synthesis and fluorescence studies of multiple labeled oligonucleotides containing dansyl fluorophore covalently attached at 2 '-terminus of cytidine via carbamate linkage., Bioconjugate Chem., 15, 638-646.
非特許文献 26: Gibson, U.E., Heid, C.A. & Williams, P.M. (1996) A novel method f or real time quantitative RT-PCR., Genome Res., 6, 995-1001.
非特許文献 27 : Chehab, F.F. & Kan, Y.W. (1989) Detection of specific DNA sequen ces by fluorescence amplification: a color complementation assay., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 9178-9182.
非特許文献 28 : Tyagi, S. & Kramer, F.R. (1996) Molecular beacons: probes that fluo resce upon hyondization., Nat. BiotechnoL, 14, 303 - 308.
非特許文献 29 : Boguszewska - Chachulska, A.M. , Krawczyk, Μ·, Stankiewicz, Α·, Go zdek, A., Haenni, A.L. & Strokovskaya, L. (2004) Direct fluorometric measurement of hepatitis C virus helicase activity., FEBS Lett., 567, 253-258.
非特許文献 30 : Bernacchi, S. & Mely, Y. (2001) Exciton interaction in molecular bea cons: a sensitive sensor for short range modifications of the nucleic acid structure., Nucleic Acids Res. , 29, e62.
非特許文献 31; Qin, Ρ·Ζ· & Pyle, A.M. (1999) Site-specific labeling of RNA with fluo rophores and other structural probes., Methods, 18, 60 - 70.
非特許文献 32 : Walter, N.G. (2001) Structural dynamics of catalytic RNA highlighte d by fluorescence resonance energy transfer., Methods, 25, 19-30.
非特許文献 33 : Klostermeier, D. & Millar, D.P. (2001) RNA conformation and folding studied with fluorescence resonance energy transfer., Methods, 23, 240-254.
非特許文献 34 : Watrob, Η·Μ·, Pan, CP. & Barkley, M.D. (2003) Two-step FRET a s a structural tool, J. Am.Chem. Soc., 125, 733b_7343.
非特許文献 35 : Mergny, J.し, Boutorine, A.S., Garestier, T., Belloc, F., Rougee, M. , Bulychev, N.V., Koskin, A. A. , Bourson, J., Lebedev, A.V., Valeur, B., Thuong, N. T. & Helene, C. (1994) Fluorescence energy transfer as a probe for nucleic acid stru ctures and sequences., Nucleic Acids Res., 22, 920 - 928.
非特許文献 36 : Dragon, A丄, Liu, Υ·, Makeyeva, E.N. & Privalov, P.L. (2004) DNA - binding domain of GCN4 induces bending of both the ATF/CREB and AP - 1 binding sites of DNA., Nucleic Acids Res" 32, 5192—5197.
非特許文献 37 : Jucker, F.M" Phillips, R.M., McCallum, S.A. & Pardi, A. (2003) Rol e of a heterogeneous free state in the formation of a specific RNA— theophylline com
plex., Biochemistry, 42, 2560-2567.
非特許文献 38 : Endo, M. , Mitsui, T., Okuni, T., Kimoto, M. , Hirao, I. & Yokoyama, S. (2004) Unnatural base pairs mediate the site-specific incorporation of an unnatur al hydrophoDic component into RNA transcripts., Bioorg. Med. Chem. Lett., 14, 25 93-2596.
非特許文献 39 : Moriyama, K" Kimoto, M., Mitsui, Τ· , Yokoyama, S. & Hirao, I. (20 05) 5ite-speciric biotinylation of RNA molecules by transcription using unnatural bas e pairs., Nucleic Acids Res., 33, el29.
非特許文献 40 : Kimoto, M., Shirouzu, M., Mizutani, S., Koide, H., Kaziro, Y., Hira o, I. & Yokoyama, S. (2002) Anti-(Raf-l) RNA aptamers that inhibit Ras - induced Ra f-1 activation., Eur. J. Biochem., 269, 697-704.
非特許文献 41 : Jenison, R.D" Gill, S.C., Pardi, A. & Polisky, B. (1994) High-resolu tion molecular discrimination by RNA., Science, 263, 1425-1429.
非特許文献 42 : Zimmermann, G.R., Jenison, R.D., Wick, C丄., Simorre, J.- P. & Par di, A. (1997) Interlocking structural motifs mediate molecular discrimination by a the ophylline-binding RNA., Nat. Struct. Biol., 4, 644-649.
非特許文献 43 : Zimmermann, G.R., Shields, T.P., Jenison, R.D., Wick, C.L. & Pardi , A. (1998) A semiconserved residue inhibits complex formation by stabilizing intera ctions in the free state of a theophylline-binding RNA., Biochemistry, 37, 9186-919 2.
非特許文献 44 : Zimmermann, G.R., Wick, C.L. , Shields, T.P., Jenison, R.D. & Pardi , A. (2000) Molecular interactions and metal binding in the theophylline-binding cor e of an RNA aptamer., RNA, 6, 659-667.
非特許文献 45 : Sibille, N., Pardi, A" Simorre, J.-P. & Blackledge, M. (2001) Refine ment of local and long-range structural order in theophylline-binding RNA using (13 )C-(l)H residual dipolar couplings and restrained molecular dynamics., J. Am. Chem • So , 123, 12135-12146.
非特許文献 46 : Clore, G.M. & Kuszewski, J. (2003) Improving the accuracy of NMR
structures of RNA by means of conformational database potentials of mean force as assessed by complete dipolar coupling cross-validation., 125, 1518-1525.
非特許文献 47 : Stojanovic, M.N. & Kolpashchikov, D.M. (2004) Modular aptameric s ensors. , J. Am. Chem. So , 126, 9266—9270.
非特許文献 48 : Frauendorf, C. & Jaschke, A. (2001) Detection of small organic anal ytes by fluorescing molecular switches., Bioorg. Med.し hem., 9, 2521-2524.
非特許文献 49 : Patel, D.J. & Suri, A.K. (2000) Structure, recognition and discrimina tion in RNA aptamer complexes with cofactors, amino acids, drugs and aminoglycosi de antibiotics., J. BiotechnoL, 74, 39 - 60.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明は、 5位置換 _ 2 _ォキソ(1H)ピリジン _ 3 _ィル—基を塩基として有する ヌクレオシド又はヌクレオチドを提供する。本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドは、 一態様において、前記塩基の 5位に、 5 _カルボキシフルォレセイン(5 _FAM)、 6 —カルボキシフルォレセイン(6 _ FAM)、 5 _カルボキシテトラメチルローダミン(5— TAMRA)、 6 _カルボキシテトラメチルローダミン(6 _TAMRA)、 5 _ (ジメチルアミ ノ)ナフタレン _ 1—スルホン酸(DANSYL)、 5 _カルボキシ _ 2,, 4, 4 ' , 5 ' , 7, 7 ,一へキサクロ口フルォレセイン(5— HEX)、 6—カルボキシ一 2 ' , 4, 4 ', 5 ', 7, 7, 一へキサクロ口フルォレセイン(6— HEX)、 5—カルボキシー 2 ' , 4, 7, 7 '—テトラク ロロフルォレセイン(5— TET)、 6—カルボキシ一 2 ' , 4, 7, 7 '—テトラクロ口フルォ レセイン(6— TET)、 5—カルボキシ一 X—ローダミン(5— R〇X)、及び 6—カルボキ シー X—ローダミン(6— ROX)からなるグループから選択される蛍光色素力 直接又 はリンカ一を介して結合している。本明細書においては、 5— FAM及び 6— FAM、 5 —TAMRA及び 6— TAMRA、 5— 11£ 及び6— 11£ 、 5—ΤΕΤ:¾ΐ '6—ΤΕΤ、 ならびに、 5— ROX及び 6— R〇X、の各々を特に区別する必要のない場合は単に、 それぞれ、 FAM、 TAMRA, HEX, TET、及び ROXと記載することがある。
[0010] 本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドはまた、別の態様において、前記塩基の 5位 力 4 - (4—ジメチルアミノフヱニルァゾ)安息香酸(DABCYL)、 N_メチル _N _ [
4— [2—メトキシ一 5—メチル 4— (2 ニトロ一 4—メチルフエニルァゾ)フエニルァ ゾ]フエ二ル]— 4—ァミノ酪酸(BHQ1)及び N メチル—N— [4 [2, 5—ジメトキシ —4— (4—ニトロフエニルァゾ)フエニルァゾ]フエ二ル]— 4—ァミノ酪酸(BHQ2)力ら なるグループから選択される消光色素が、直接又はリンカ一を介して結合している。
[0011] 本発明はさらに、本発明の前記 5位置換 _ 2_ォキソ(1H)ピリジン _ 3 _ィル—基 を塩基として有するヌクレオチドが組み込まれた、核酸を提供する。本発明の核酸中 のヌクレオチドは、 6位置換された 2—ァミノプリン _ 9 _ィル基を塩基として有するヌ クレオチドと塩基対を形成しうる。本発明の核酸は、一態様において、前記 5位置換 _ 2_ォキソ(1H)ピリジン _ 3—ィル一基を塩基として有するヌクレオチドと、 6位置 換された 2—ァミノプリン _ 9 _ィル基を塩基として有するヌクレオチドが、同一の一本 鎖核酸上に存在する。
[0012] 本発明はさらにまた、標的タンパク質の検出方法を提供する。本発明の検出方法 は、一態様において
1)本発明の 5位置換ー2—ォキソ(1H)ピリジンー3—ィルー基を塩基として有する ヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し;
2)前記核酸を標的タンパク質と結合させ;
3)標的タンパク質を支持体に付着させ;そして
4)支持体に付着した標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する ことを含む。
[0013] 本発明の検出方法は、別の態様において、前記工程 3)及び 4)に代えて
3 ' )標的タンパク質を限外濾過膜を用レ、て溶液中に選択的に留め
;そして
4' )溶液中に留まった標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する ことを含んでもよい。
[0014] 本発明はまた、本発明のヌクレオチドを利用して核酸の二本鎖形成を検出する方 法を提供する。本発明の検出方法は、より具体的には下記の方法 I又は IIの方法を 用いて行うことができる。
[0015] 方法 I
I 1)本発明の、 5位が蛍光色素で置換された、 5位置換 2—ォキソ(1H)ピリジ ンー 3—ィルー基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸と、 5位が消光色素で 置換された、 5位置換 2 ォキソ( 1 H)ピリジン 3 ィルー基を塩基として有する ヌクレオチドを含む核酸とをハイブリダィズさせ、そして
I一 2)蛍光スペクトルの変化を測定する、
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。
[0016] 方法 II
Π_ 1)本発明の、 5位が蛍光色素で置換された、 5位置換 _ 2_ォキソ(1H)ピリジ ン一 3—ィル一基を塩基として有するヌクレオチドを含む、 2種類の核酸であって、各 々異なる蛍光色素であって、互いに蛍光共鳴エネルギー転移 (FRET)を示す 2種類 の蛍光色素を各々含む、前記 2種類の核酸をハイブリダィズさせ、
II一 2)蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。
課題を解決するための手段
[0017] 本発明者らは上記問題の解決のために、鋭意研究に努めた結果、転写で選択的 に機能する人工塩基対の開発に成功し、これを用レ、て RNA中に部位特異的に修飾 ヌクレオチドを導入することを可能にした。本発明の修飾ヌクレオチドは、転写により R NA中に取り込まれ、核酸の部位特異的な蛍光標識を可能にした。本発明者はさら に、標識核酸と相互作用する分子 (核酸、タンパク質)などを検出するシステムを作り 出すことに成功した。
[0018] 5位置換 _ 2 _ォキソ( 1 H)ピリジン _ 3 _ィル某を塩某として有するヌクレオシド又 はヌクレオチド
本発明は、 5位置換 _ 2_ォキソ(1H)ピリジン _ 3 _ィル基を塩基として有するヌク レオシド又はヌクレオチドを提供する。本発明の 5位置換ピリジン塩基を有するヌクレ オシド又はヌクレオチドは、 5位に蛍光色素又は消光色素が、直接又はリンカ一を介 して結合してレ、ることを特徴とする。
[0019] 本発明における「ヌクレオシド」とは、核酸塩基と糖の還元基とがグリコシド結合によ つて結合した配糖体化合物を意味する。なお、前記「核酸塩基」は、アデニン、グァニ
ン、シトシン、チミン、ゥラシル、及びこれら塩基の誘導体も含む概念である。前記「誘 導体」の種類は特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、 5位置換 2 —ォキソ(1H)ピリジン一 3—ィル基に相当する塩基や、 2—アミノー 6— (2—チェ二 ノレ)プリン— 9—ィル基に相当する塩基、などが挙げられる。 「ヌクレオチド」は、前記 ヌクレオシドの糖部分力 リン酸とエステルをつくっている化合物をいう。より好ましく は、一、二、又は三リン酸エステルである。ヌクレオシド又はヌクレオチドの糖部分はリ ボフラノシノレ、 2 '—デォキシリボフラノシル、あるいはハロゲンなどの置換基を 2 '位に 有する 2 '—置換リボフラノシルであってもよぐまた、リン酸部分は、チォリン酸であつ てもよレ、。つまり、糖部分及びリン酸部分は、公知のヌクレオシド、ヌクレオチド、ある いはこれらの誘導体にみられる構成をとつていればよレ、。糖部分がリボフラノシノレで あるリボヌクレオチドは RNAの構成成分となり、デォキシリボフラノシルであるデォキ シリボヌクレオチドは DNAの構成成分となる。
[0020] 本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドは、 2 ォキソ(1H)ピリジンー3—ィル基に 相当する塩基の 5位に蛍光色素又は消光色素が、直接又はリンカ一を介して結合し ている。
[0021] 蛍光色素は、公知の蛍光色素を利用可能であるが、好ましくは、 5 カルボキシフ ルォレセイン(5— FAM)、 6—カルボキシフルォレセイン(6— FAM)、 5—カルボキ シテトラメチルローダミン(5—TAMRA)、 6—カルボキシテトラメチルローダミン(6— TAMRA)、 5—(ジメチルァミノ)ナフタレンー1ースルホン酸(DANSYL)、 5—カル ボキシ 2 ' , 4, 4,, 5,, 7, 7 ' へキサクロ口フルォレセイン(5— HEX)、 6 カル ボキシ 2 ' , 4, 4,, 5,, 7, 7 ' へキサクロ口フルォレセイン(6— HEX)、 5 力ノレ ボキシ _ 2 ', 4, 7, 7 '—テトラクロ口フルォレセイン(5 _TET)、 6 _力ノレボキシ一2 ' , 4, 7, 7 '—テトラクロ口フルォレセイン(6 _TET)、 5 _カルボキシ一 X—ローダミン (5— ROX)、及び 6—カルボキシ一 X—ローダミン(6— ROX)力もなるグループから 選択される。フルォレセイン及びローダミンは、一般的に開環型及びスピロ型の二通 りで表記される。例えば、 5 _カルボキシフルォレセインを開環型で表記すると、
[0023] となり、そしてスピロ型で表記すると、
[0024] [化 2]
[0025] となる。図 1及び図 3ではこれらの蛍光色素は開環型で示している力 スピロ型で表 記したものも本発明に含まれる。これらの蛍光色素については、例えば Tuschl et al. , 1994 ; Misra et al. , 2004 ; Gibson et al. , 1996及び、 Chehab et al. , 1989に言羊述されてレヽる。
[0026] 例えば、 FAMの吸収極大波長は 493nm、蛍光極大波長は 522nmである。また、 TAMRAの吸収極大波長は 553nm、蛍光極大波長は 578nmである。 DANSYL の吸収極大波長は 335nm、蛍光極大波長は 518nmである。 HEXの吸収極大波長 は 535nm、蛍光極大波長は 556nmである。 TETの吸収極大波長は 521nm、蛍光 極大波長は 536nmである。 5— ROXの吸収極大波長は 567nm、蛍光極大波長は 591nmである。 6—ROXの吸収極大波長は 570nm、蛍光極大波長は 590nmであ る。
[0027] 本発明のヌクレオチドは 5位置換基として蛍光分子を有するため、蛍光分子の種類 に応じて、本発明のヌクレオチドを含む核酸の検出を行うことが可能である。よって、 本発明のヌクレオチドを含む核酸は、標識核酸として当該核酸と相互作用する物質 検出のプローブとして使用されうる。また、各蛍光色素によって蛍光色が異なるため、 多重染色に使用することも可能である。
[0028] 消光色素は、公知の消光色素を利用可能である力 好ましくは、 4- (4一ジメチノレ アミノフヱニルァゾ)安息香酸(DABCYL)、 N—メチル _N_ [4 _ [2—メトキシ _ 5 —メチノレ一 4— (2—ニトロ一 4—メチルフエニルァゾ)フエニルァゾ]フエ二ル]— 4—ァ ミノ酪酸(BHQ1)及び N—メチル _N_ [4 _ [2, 5—ジメトキシ _4 _ (4—ニトロフエ ニルァゾ)フエニルァゾ]フエ二ル]— 4—ァミノ酪酸(BHQ2)力、らなるグループから選 択される。これらの消光色素の存在により、蛍光色素の蛍光放出が消光色素へのェ ネルギー転移により抑制され、蛍光色素の蛍光が検出できなくなる。具体的には、 D ABCYLは、 FAM、TET、JOE (6—カルボキシ一 4 ' , 5 '—ジクロロ一 2 ' , 7 '—ジメ トキシフルォレセイン)、 HEX、 Cy3 (Amersham Biosciences社)、 TAMRA、 Cy 3. 5 (Amersham Biosciences社)、 R〇X、 Texas Redなどの 光色素の 光放 出を消光し; BHQ1は、 FAM、 Oregon Green 514 (Molecular Probes社)、 T ET、 Bodipy R6G— X (Molecular Probes社)、 J〇E、 HEX、 Cy3、 Rhodamine Red— X (Molecular Probes社、 TAMRAなどの蛍光色素の蛍光放出を消光し; そして、 BHQ2は、 HEX, Cy3、 Rhodamine Red— X、 TAMRA, Cy3. 5、 ROX 、 Texas Red— X、 Bodipy TR—X (Molecular Probes社)、 LightCycler 64 0 (Roche社)、 Boidipy 630/650— X (Molecular Probes社)、 Cy5 (Amersh am Biosciences社)などの蛍光色素の蛍光放出を消光する。
[0029] これらの消光色素については、例えば Tyagi et al. , 1996及び Boguszewska - Chachulska et al. , 2004、に言羊述されてレヽる。
[0030] 本明細書中、 2 _ォキソ(1H)ピリジン _ 3—ィル一基の 5位に直接又はリンカ一を 介して結合している、蛍光色素及び/又は消光色素を、便宜上必要に応じ 5位の「 置換基」と呼称することがある。また、上記蛍光色素及び消光色素は、例えば、プロリ ゴ'ジヤノ ン株式会社、 Insitech INC. 、 Invitrogen, Sigma _Aldrich、 Biosear
ch Technologies^ Amersham Biosciences等力ら購入すること力 s可肯である。
[0031] 本発明の蛍光色素又は消光色素は、 2 ォキソ(1H)ピリジン 3—ィルー基の 5 位に直接結合させても、あるいはリンカ一を介して結合させてもよい。リンカ一の種類 は特に限定されないが、例えば、下記の化学式 I一 III
[0032] [化 3]
[0033] [式 I中、 nは 1ないし 5の整数から選択される]
[0034] [化 4]
II
[0035] [式 II中、 m及び 1は、 1ないし 5の整数から各々独立に選択される]
及び
[0036] [化 5]
[0037] 力 なるグノレープから選択される。
[0038] 上記 n、 m及び 1は独立に選択され、好ましくは 1ないし 5、最も好ましくは、 5である。
リンカ一が短いものは、転写反応において取り込まれる効率が僅かに落ちる。よって 、長レ、リンカ一である化学式 I又は IIのリンカ一が好ましい。また、化学式 I— IIIのアミ ノアルキニル基部分は、三重結合部分が、単結合又は二重結合の対応するアミノア ノレキル基、又はアミノアルケニル基であってもよレ、。
[0039] その他、リンカ一としては、例えば、ジアミノエトキシエーテル型の
-NH- (CH CH O) -NH-
2 2 η
(Barnacchi et al., 2001参照)、又は、
- [P03] - (CH ) _S _CH _C〇一、もしくは
2 6 2
_ [P03] _ (CH ) _NH_
2 7
(Tyagi et al. , 1996参照)、のような構造のものが利用できる。
[0040] 本発明の 5位置換 _ 2_ォキソ(1H)ピリジン一 3 _ィル基を塩基として有するヌクレ オシド又はヌクレオチドの合成法は、特に限定されることはなレ、。 3 _ ( j3—D—リボフ ラノシル) ピリジン 2 (1H)—オンに、先ず 5位に置換基を導入し、次いで、三リン 酸を導入してもよい。あるいは、 3— ( D リボフラノシル)一ピリジン一 2 (1H)— オンに、先ず三リン酸を導入し、次いで、置換基を導入してもよい。特に、リンカ一等 の大きな基を導入する場合、先ず、ョード等の光反応性基を導入して活性化してから 、置換してもよい。好ましくは、反応基による活性化、リンカ一の導入、三リン酸の導入 、最後に置換基を導入する、また、置換基を導入する際の反応条件などは、ピリジン にこれら置換基を導入する反応の場合を参照して行うことができる。
[0041] 本発明の一態様として、蛍光色素又はアミノ基を化学式 Iの長いリンカ一を介して 5 位に導入した yTPの合成を図 2に示した。さらに、化学式 IIIの短いリンカ一で FAM を結合した yTP (short FAM— yTP)の合成を図 3に示した。まず、 yのヌクレオシド の 5位をヨウ素化し、これにリンカ一を結合し、三リン酸化、保護基の除去を行いアミノ 基を導入した yTP (NH—yTP)を合成した。この NH—yTPを、 5 _カルボキシフル ォレセイン(5_FAM)、あるレ、は、 5 _カルボキシテトラメチルローダミン(5—TAM RA)のコハク酸イミドエステル体で処理することにより、これらの色素を導入した FAM — yTPと TAMRA_yTPが得られた(実施例 1 _ 9)。
[0042] あるいは、本発明における蛍光色素又は消光色素による、 2_ォキソ(1H)ピリジン _ 3 _ィル基を塩基として有するヌクレオチドの修飾は、単独のヌクレオチド合成時で はなぐ当該ヌクレオチドを含む核酸を転写等によって合成した後に行うことも可能で ある。実際、本願明細書の実施例 13では、転写による RNA分子の合成後、蛍光基 を導入することに成功した(図 7)。好ましくは、大過剰量の蛍光分子のコハク酸イミド エステル誘導体を使用する。 5位にリンカ一を結合させた 2 ォキソ(1H)ピリジン— 3 ィル基を塩基として有するヌクレオチドが、核酸分子の内側(中央側)に位置するよ り、末端に存在する方が導入効率が高いと期待される。
[0043] あるいは、単独のヌクレオチド合成時、又は、転写もしくは複製等によって核酸合成 された後の蛍光分子又は消光分子による修飾には、上述の蛍光分子又は消光分子 のコハク酸イミドエステル誘導体の他に、蛍光分子又は消光分子のイソチオシアナ一 ト誘導体(例えば、 FAMのイソチオシアナート誘導体)又はスルホユルクロリド誘導体 (例えば、 DANSYL クロリド)を用いることによって行うことも可能である。
[0044] 本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドが組み i入まれた核酸
本発明は、 5位置換 _ 2_ォキソ(1H)ピリジン _ 3 _ィル基を塩基として有するヌク レオチドが組み込まれた核酸を提供する。本明細書において「核酸」とは、 1より多く のヌクレオチドが、 5 '→3 'の方向に結合した核酸鎖の分子を意味する。本発明の核 酸は、一本鎖又は二本鎖の RNA又は DNAを含む。二本鎖は、 DNA/DNA, RN A/RNA、又は DNA/RNAであってもよレ、。また、 DNAには、 RNAを铸型として 逆転写してなる cDNAも含まれる。あるいは、核酸は 3本鎖、 4本鎖等も形成しうる。
[0045] 本発明者らは、核酸のさらなる機能拡張をめざして、非天然型塩基をもつヌクレオ シド又はヌクレオチドの創製へ取り組んでいる。新たに開発された人工塩基対の態様 として、 2 ァミノ一 6— (2 チェニル)プリン(sと命名)と 2—ォキソ(1H)ピリジン (yと 命名 )との塩基対、並びに 2 _ァミノ一 6 _ (2 _チアゾリル)プリン (Vと命名 )と yとの塩 基対が含まれる。 (図 1)。従来技術に対して、蛍光色素 (及び消光色素)を結合した 第 5番目の塩基を人工塩基対を介して、転写により核酸中の特定部位に導入できれ ば、核酸の標識、そして、それによる核酸の検出が非常に簡便になる。本発明では s _ yという人工塩基対を用いて、これを可能にした。
[0046] 本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドは、 6位置換された 2—ァミノプリン一 9—ィ ル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドとが塩基対を形成することが可 能である。図 1に yと s (2 ァミノ— 6— (2 チェニル)プリン— 9 ィル基)、あるいは 、yと v (2—ァミノ一 6 _ (2_チアゾリル)プリン一 9—ィル基)と例示されているように、 本発明の 5位置換 2 ォキソ(1H)ピリジン 3 ィル基は、 6位置換された 2 アミ ノプリン 9ーィル基と、 2箇所で水素結合を生じる。本発明の 5位置換 2 ォキソ( 1H)ピリジン 3—ィル基は、立体構造上、天然型プリン塩基 A (アデニン)及び G (グ ァニン)とは塩基対を形成できなレ、。そして、 6位置換された 2 ァミノプリン一 9—ィ ル基は立体障害のため、天然型 T (チミン)、 U (ゥラシル)及び C (シトシン)とは塩基 対を形成できない。よって、本発明の 5位置換 2 ォキソ(1H)ピリジン 3—ィル 基は、 6位置換された 2 ァミノプリン 9ーィル基と特異的に塩基対を形成すること が可能である。
[0047] よって、本発明の核酸は、 5位置換ー2 ォキソ(1H)ピリジンー3 ィル基を塩基と して有するヌクレオチドと、 6位置換された 2—ァミノプリン _ 9 _ィル基を塩基として有 するヌクレオチドとが塩基対を形成している、態様を含む。 6位置換された 2 _アミノブ リン— 9 _ィル基は、好ましくは 2—ァミノ— 6 _ (2—チェニル)プリン _ 9_ィル基(s) 又は 2—ァミノ 6 _ (2 _チアゾリル)プリン _ 9 _ィル基 (V)である。後述の実施例で 示されたように Vの方が sよりも転写による yの取り込む効率がよいため、より好ましくは 、 Vである。
[0048] 本発明において、本発明の 5位置換 _ 2_ォキソ(1H)ピリジン _ 3_ィル基を塩基
として有するヌクレオチドと、 6位置換された 2 ァミノプリン 9 ィル基を塩基として 有するヌクレオチドとは、異なる 2本の核酸上に存在して塩基対により二本鎖を形成 しうる。あるいは、本発明の 5位置換ー2 ォキソ(1H)ピリジンー3 ィル基を塩基と して有するヌクレオチドと、 6位置換された 2—ァミノプリン _ 9 _ィル基を塩基として有 するヌクレオチドとは同一の一本の核酸上に存在してもよい。この場合、塩基対により 、一本鎖はループ構造を形成してもよい。
[0049] 後述するように、本発明の、ヌクレオチドが組み込まれた核酸は、アンチセンス DN A若しくは RNA、リボザィム、ァプタマ一又は RNAi (RNA干渉)に用いられる RNA として使用されうる。あるいは、本発明の、ヌクレオチドが組み込まれた DNA又は RN Aは、タンパク質、ペプチドの全体又は一部をコードするものであってもよい。
[0050] 本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドが組み i入まれた核酸の合成
本発明の 5位置換 _ 2_ォキソ(1H)ピリジン一 3 _ィル基を塩基として有するヌクレ ォチドは、転写、複製又は逆転写反応により、 DNA又は RNA等の核酸に取り込む ことが可能である。具体的には、 6位置換された 2 ァミノプリン 9 ィル基を塩基と して有するヌクレオチドを含む核酸、例えば、 sあるいは Vを含む铸型 DNAを用いて T 7 RNAポリメラーゼによる転写反応を行うと、 yの基質 (yTP)が部位特異的に、 sあ るいは Vに相補して、 RNA中に取り込まれる。 yは、その 5位を化学的に修飾すること ができるので、種々の機能性の y誘導体を RNA中の特定の部位に取り込ませること が出来る。
[0051] よって、限定されるわけではないが、本発明のヌクレオチドが組み込まれた核酸は、
6位置換された 2 ァミノプリン 9 ィル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核 酸を錡型として転写、複製又は逆転写を行い、前記 6位置換された 2 _アミノプリン— 9_ィル基を塩基として有するヌクレオチドの相補的な位置に、本発明の核酸を組み 込む、ことを含む、方法によって調製することが可能である。あるいは、天然型塩基を 有するヌクレオシド又はヌクレオチドと同様に、化学合成によって DNA又は RNAに 取り込んでもよい。
[0052] 例えば、 5位に蛍光色素をもつ標識ゥリジン (U)を転写反応により RNA中に導入す る場合には、 UTPと標識 UTPの存在比を変えて転写反応を行レ、、 Uの位置をランダ
ムに標識 uで置換する力 \あるいは UTPの代わりに標識 UTPだけを転写反応に用 いて Uの位置を全て標識 Uに置換するしかない。この場合、標識 Uの導入によって R NAの高次構造が変化してしまったり、 RNAの機能に支障をきたすこともある dense n et al., 1995]。
[0053] これに対し、本発明の 5位置換— 2_ォキソ(1H)ピリジン— 3_ィル基は、 6位置換 された 2—ァミノプリン— 9—ィル基と特異的に塩基対を形成する。よって、所望の位 置に 6位置換— 2—ァミノプリン— 9—ィル基が導入されている DNA又は RNAを錡 型として、転写、複製又は逆転写反応を行うことにより、 5位置換 _ 2_ォキソ(1H)ピ リジン _ 3 _ィル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドを位置選択的( 部位特異的)に導入することが可能となった。
[0054] 転写、複製又は逆転写反応は公知の方法に従って行うことが可能である。限定され るわけではないが、例えば、転写反応は T7 RNAポリメラーゼ (Takara等)、複製反 応は、タレノウフラグメント(KF)、逆転写反応は AMV Reverse Transcriptase XL (AMV— RT) (Life Science社)を使用することが可能である。複製反応は、 反応中に 6位置換された 2 ァミノプリン— 9 ィル基が除去されてしまうのを防ぐた めに、例えば、 3 '→5 'ェキソヌクレアーゼ活性をもたない Taq DNAポリメラーゼ(T akara Taq™)を用いて s又は vを含むプライマーによる铸型 DNAの PCR増幅も可 能である。
[0055] なお、 6位置換された 2 ァミノプリン 9 ィル基を塩基として有するヌクレオチド は、公知の方法、例えば、 [Fujiwara et al. , 2001]に記載の方法で合成可能で ある。
[0056] 本発明では、 5位置換 _ 2_ォキソ(1H)ピリジン— 3—ィル基の、 6位置換された 2 —ァミノプリン— 9—ィル基との特異的な塩基対を利用して、転写反応の 1段階で位 置選択的に本発明のヌクレオチドを RNAに取り込むことが可能になった。本発明の 非天然型の塩基を含む 5種類の塩基からなる RNAを任意に調製出来れば、核酸の 特異的な標識が可能になり、その有用性 ·汎用性は非常に高い。
[0057] 本発明の核酸のアンチセンス DNA若しくは RNA、リボザィム又はァプタマ一として の禾 ilffl
本発明の一態様において、本発明の、ヌクレオチドが組み込まれた核酸は、アンチ センス DNA若しくは RNA、リボザィム、ァプタマ一又は RNAi (RNA干渉)に用いら れる RNAとして使用されうる。アンチセンス DNA若しくは RNAとは、ある特定の遺伝 子の発現を抑える DNA又は RNAである。標的とする遺伝子配列(センス鎖)の全長 又は部分配列に対して相補的という意味で名付けられた。人為的に遺伝子発現を調 節する手法として使用されうる。本発明のヌクレオチドが組み込まれたアンチセンス D NA又は RNAは、非天然型塩基を含むため標的に対する相補性が天然型塩基のみ を使用した場合と比較して異なるものを創製しうる。リボザィムは、 RNAを構成成分と する触媒の総称である。ァプタマ一は、 in vitroセレクション法によって得られた、特 定の分子に結合する機能を有する核酸である。 RNAiとは、細胞内で見つかったシ ステムで、短レ、 RNA断片が翻訳を制御するシステムであり、外部から標的遺伝子に 対応した短レ、 RNA断片を細胞内に加えたり、発現させたりすることで、標的遺伝子 の発現を抑える手法である。
[0058] 例えば、 in vitroセレクションによって得られる、 5位置換 2—ォキソ(1H)ピリジン —3—ィル基を含むアブタマ一は、標的タンパク質と架橋反応する等の新機能を持 つ RNA分子を創製することも可能となる [Kimoto et al, 2004]。
[0059] さらに、蛍光分子を RNAァプタマ一中に導入してアナライト(analyte)として活用 する例も報告されている haveri et al. , 2000 ; Yamamoto et al. , 2000 ; Fa ng et al. , 2001]。
[0060] これまでに、修飾塩基として、フルォレセイン一 12—ゥラシノレ(F— 12— U) [Jhave ri et al. , 2000]、 5— (1—ペンチ二ノレ)ゥラシノレ [Latham et al. , 1994]、 5 — (3,,一ァミノプロビュル)ゥラシル [Battersby et al., 1999]、 5—ョードウラシ ノレ(5IU) Jensen et al., 1995]、 5—ブロモウラシノレ(5BrU) [Golden et al. , 2000]を in vitroセレクションで利用した例が報告されている。し力、しながら、これ らの例では全て、 DNAもしくは RNAプールの調製の段階から修飾塩基を天然型塩 基 (Tもしくは U)と置換してレ、る。
[0061] 蛍光分子を含む本発明の核酸(アブタマ一)は標的タンパク質を検出するためアナ ライトとして利用することが可能である。本発明は、本発明の核酸を利用した標的タン
パク質の検出方法を含む。本発明の検出方法は、一態様において
1)本発明の 5位置換ー2—ォキソ(1H)ピリジンー3—ィルー基を塩基として有する ヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し;
2)前記核酸を標的タンパク質と結合させ;
3)標的タンパク質を支持体に付着させ;そして
4)支持体に付着した標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する ことを含む。
[0062] 本発明の検出方法は、別の態様において、前記工程 3)及び 4)に代えて
3 ' )標的タンパク質を限外濾過膜を用レ、て溶液中に選択的に留め
;そして
4' )溶液中に留まった標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する ことを含んでもよい。
[0063] 本発明において、標的タンパク質は特に限定されず任意のものを対照とすることが できる。結合する核酸分子(アブタマ一)の塩基配列が解明されているものは容易に 利用可能である。そのような標的タンパク質とアブタマ一の組み合わせの例は、本明 細書中に参考文献として援用される WO2004/007713の参考例 1に記載の Raf —1タンパク質と RNA 9A (WO2004/007713 図 13)及び RNA 9Bである。
[0064] 支持体としては、例えば、ニトロセルロースフィルタ一等が利用可能である。これら の支持体は標的タンパク質は付着するが、核酸分子は単独では結合しない。核酸は タンパク質に結合した場合のみ、タンパク質を介して支持体に付着する。支持体に付 着したタンパク質—核酸の複合体は、核酸に結合した蛍光を測定にすることにより検 出すること力 Sできる。
[0065] 本明細書の実施例 14では、 FAM— yを Raf— 1タンパク質に特異的に結合する R NAァプタマ一(抗一 Raf _ lァプタマ一) RNA 9Aの 90番目(全長 100ヌクレオチ ド)に導入し、この蛍光色素を導入した RNAァプタマ一と種々の濃度の Raf _ 1タン パク質を混ぜ、この溶液をニトロセルロースフィルターに通すことにより、タンパク質を ニトロセルロースに吸着させ、そのタンパク質に結合した RNAァプタマ一の蛍光を測 定することにより、タンパク質の量を測定し、解離定数を求めることができた(図 8)。こ
れは、従来のラジオアイソトープで RNAを標識する方法に代わる簡便な方法である 本発明の方法は、標的タンパク質の濃度を好ましくは Opmol— 1000pmol、より好 ましくは Opmol— 500pmol、最も好ましくは lpmol— lOOpmolの範囲で、定量的に 検出することが可能である。
[0066] 支持体を利用する代わりに、限外濾過膜を用いて標的タンパク質を溶液中に選択 的に留めてもよレ、。限外濾過膜を用いた標的タンパク質の検出方法は、前記工程 3) 及び 4)に代えて
3 ' )標的タンパク質を限外濾過膜を用レ、て溶液中に選択的に留め
;そして
4' )溶液中に留まった標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する ことを含んでよレ、。限外濾過膜は標的タンパク質のサイズに応じて適宜公知のものを 使用することが可能である。
[0067] 核酸の二本鎖の検出方法
本発明はさらに、本発明の核酸を利用した核酸の二本鎖の検出方法を提供する。 本発明の検出方法は、より具体的には下記の方法 I又は IIの方法を用いて行うことが できる。
[0068] 方法 I
I 1)本発明の、 5位が蛍光色素で置換された、 5位置換 2—ォキソ(1H)ピリジ ンー 3—ィルー基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸と、 5位が消光色素で 置換された、 5位置換 2—ォキソ( 1 H)ピリジン 3—ィルー基を塩基として有する ヌクレオチドを含む核酸とをハイブリダィズさせ、そして
I一 2)蛍光スペクトルの変化を測定する、
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。
[0069] 方法 II
Π_ 1)本発明の、 5位が蛍光色素で置換された、 5位置換 _ 2_ォキソ(1H)ピリジ ン一 3—ィル一基を塩基として有するヌクレオチドを含む、 2種類の核酸であって、各 々異なる蛍光色素であって、互いに蛍光共鳴エネルギー転移 (FRET)を示す 2種類 の蛍光色素を各々含む、前記 2種類の核酸をハイブリダィズさせ、
II 2)蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。
[0070] 本発明の方法は、蛍光色素と消光色素、あるいは 2種の蛍光色素が各核酸分子に 存在する場合に、核酸の二本鎖が形成され色素同士が物理的に近傍に存在すると 、 光共口 Jtエネノレ ー聿移 (FRET: Fluorescence Resonance Energy Trans fer)が生じて蛍光スペクトルが変化する。本発明の方法は、核酸の二本鎖の形成を FRETによる蛍光スぺタトノレの変化の測定によって検出するものである。
[0071] 「蛍光共鳴エネルギー転移 (FRET)」は、ある蛍光分子から他の分子へ、共鳴によ り励起エネルギーが移動する現象を意味する。エネルギーを与える分子はドナー(供 与体)、受け取る分子はァクセプター(受容体)と呼ばれる。 FRETが生じると、ェネル ギーを失ったドナーは基底状態に戻り、同時にエネルギーを受け取ったァクセプター は励起状態となる。従って、ドナーの蛍光は弱まり、ァクセプターが蛍光分子であれ ばその蛍光が観察される。ァクセプターが消光分子であれば、ドナーが単独の場合 には観察されてレ、た蛍光が FRETにより観察されなくなる。 FRETによるタンパク質の 検出、核酸の検出の一般的な方法は公知であり、例えば、 RNAァプタマ一に 2種類 の FRETを起こす色素を導入して、標的タンパク質を検出する方法 Jhaveri et al . , 2000)や、ヘアピン型核酸を利用した相補鎖核酸の検出法 (Tyagi et al. , 19 96)が知られている。その他、 FRETに関しては、 Walter et al. , 2001及び Klost ermeier et al. , 2001に概説されている。
[0072] FRETが生じるためには、以下の 3条件を満たす必要がある。 i)ドナーの蛍光スぺ タトルとァクセプターの吸収スペクトルの重なりがあること。スペクトルの重なり範囲は 大きい方が望ましいが、必ずしも完全に重なっている必要はなレ、。ドナーの蛍光スぺ タトルとァクセプターの吸収スペクトルが 30%以上重なっていることが好ましぐ 50% 重なっていることがより好ましい。 ii)ドナーとァクセプターが物理的に近距離に存在 すること。 FRETが 50%の確率で生じる距離は lnmないし 10nmと考えられており、 FRETの効率はこの距離の変化に対して敏感に変化する。例えば、方法 Iの場合、 核酸が二本鎖を形成した場合に、蛍光色素で置換された 5位置換一 2—ォキソ(1H )ピリジン— 3—ィル—基 (y)を塩基として有するヌクレオチドに対し、消光色素で置
換された yを有するヌクレオチドが近接し、蛍光色素と消光色素の色素間の距離が好 ましくは 30nm以内、より好ましくは 10nm以内、最も好ましくは 5nm以内である場合 に蛍光スペクトルの変化が検出可能である。 iii)ドナーとァクセプターの相対的な向き が適切であること。
[0073] 本発明で使用される蛍光色素の最大吸収スペクトルと蛍光スペクトルを以下にまと めた。
[0074] [表 1] 吸収スぺクトル (nm) 蛍光スぺクトル
F AM 493 522
TAMRA 553 578
DANS YL 335 518
HEX 535 556
TET 521 536
5 -ROX 567 591
6 -ROX 570 591
[0075] よって、方法 IIにおいて、ァクセプター及びドナーの組み合わせとして使用できる態 様は下記の通りである。
[0076] [表 2] ドナー分子 一 ァクセプ夕一分子
F AM - TAMRA、 HEX, TET
TAMRA - 5 -ROX, 6 -ROX
HEX - TAMRA, 5— ROX、 6 -ROX
TET - TAMRA, HEX
[0077] 一方、方法 Iにおレ、て、消光色素はドナーの種類に限定されず、ァクセプターとして 一般的に使用することができる。
[0078] 本発明の方法は、核酸を合成する際、例えば铸型 DNA力 RNAを調製する際に 、同時に RNAを部位特異的に蛍光標識化することが出来るという利点があり、種々 の検出方法、同定方法、診断方法等に応用できるものである。
[0079] 低 子 >の 法
本発明はさらにまた、低分子化合物を検出する方法を提供する。
[0080] 本発明の検出方法は、
1 )本発明のヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し;
2)前記核酸を低分子化合物を含むと考えられる試料と接触させ;そして
3)前記核酸の蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む。
[0081] 本発明において、好ましくは前記試料は溶液であり、工程 2)において核酸と試料と の接触を溶液中で行うことを含む。本発明において試料が液体試料の場合、例えば 、本発明のヌクレオチドが組み込まれた核酸を含む溶液を、セルに入れて、蛍光スぺ タトルの装置に装着し、そこに低分子化合物を含むと考えられる液体試料を加えて、 そのまま蛍光強度の変化を測定することが可能である。蛍光強度が変化した場合、 標的となる低分子化合物の検出と定量が可能である。定量は、例えば、既知の濃度 の標的低分子化合物を含む試料を用いて予め作成した蛍光スペクトル、測定試料の 蛍光スペクトルを比較することによって行うことが可能である。
[0082] 本発明の方法によって測定される低分子化合物は特に限定されないが、好ましく は 1)核酸へ結合する性質を有する、そして、 2)核酸が本発明の 5位置換 2—ォキ ソ(1H)ピリジン一 3—ィル一基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドを含 むものであっても、核酸への結合が影響を受けなレ、、という性質を有する。限定され るものではないが、低分子化合物の分子量は、約 500なレ、し 1000である。
[0083] 本発明において、非限定的に、テオフィリン、塩基、ヌクレオシド若しくはヌクレオチ ド、アミノ酸からなるグループから選択される(非特許文献 49)。
[0084] 限定されるわけではないが、本発明の検出方法によって、好ましくは約 ΙΟηΜない し約 10mM、より好ましくは約 ΙΟΟηΜないし約 lmM、さらにより好ましくは約 1 μ M ないし約 20 a Μの低分子化合物を検出することができる。
[0085] 本明細書中、 5位置換 2 ォキソ(1H)ピリジン 3 ィル基を塩基として有する ヌクレオシドを「5位置換 y」もしくはもしくは「5—修飾 y」、特に置換基が蛍光色素の 場合には、「蛍光色素—結合 y」と記載することがある。
図面の簡単な説明
[0086] [図 1]図 1は、 s_yと v_yの人工塩基対と 5位を修飾した yの誘導体を示す。
[図 2]図 2は、蛍光色素又はアミノ基を長レ、リンカ一で結合した yTPの合成スキームを 示す。各工程の条件及び収率は下記の通りである。
[0087] (a) DMTr—Cl、ピリジン、室温、 82%;
(b) i) (CH CO) 0、ピリジン、室温、 ii) C H〇H、還流、 84% ;
(c) CuI、 Pd[P (C H ) ] 、 DMF、(C H ) N、室温、次いで、 6—(トリフルォロア セタミド)カプロン酸 プロプー 2 ィニルアミド、 88% ;
(d) CHC1 CO〇H、 CH CI、 0。C、 74%;
(6) 2—クロロー4^1 1 , 3, 2 べンゾジォキサホスフォリンー4 オン/ジォキサ ン、トリ一 n—ブチルァミン、ビス(トリ一 n—ブチルアンモニゥム)ピロホスフェート、 I /
H〇/ピリジン、ジォキサン、ピリジン、室温、次いで NH OH ;
(f) R_N—スクシンィミジルエステル ZDMF、 0. 1M NaHCO、 aq.、室温、次 いで NH OH。
[図 3]図 3は、蛍光色素(FAM)を短レ、リンカ一で結合した yTPの合成スキームを示 す。
[図 4]図 4は、 FAM_yTPと TAMRA_yTPの蛍光特性を示す。図 4aは FAM_yT P及び TAMRA - yTPの吸収スペクトルを示し、図 4bは FAM - yTP及び TAMRA _yTPの蛍光スぺクトノレを示す。ダイヤモンド形は、 FAM_yTPの結果を、正方形 は、 TAMRA_yTPの結果を示す。
[図 5a]図 5aは、 T7 RNAポリメラーゼによる FAM_yTP、 TAMRA_yTPの RNA への導入を示す。铸型が Aの場合を 100とする相対収率は、レーン 1 9の順に、 10 3、 49、 100, 76、 26、 100、 61、 21、 100であった。
[図 5b]図 5bは、 T7 RNAポリメラーゼによる short FAM— yTP、 FAM— yTP、 T AMRA-vTP, Dansyl— x—yTPの RNAへの導入を示す。铸型が Aで天然型塩
基のみの場合を 100とする申目対収率は、レーン 1—9の 1噴に、 72、 108、 80、 96、 62 、 110、 48、 94、 100であった。
[図 6]図 6は、 2次元 TLCによる RNAリガンド中に取り込まれた NH— yと天然型ヌク レオチドの組成分析を示す。
[図 7]図 7は、 NH— yを導入した RNAの転写後の蛍光標識化を示す。標識化の収 率は、 FAM— SEを X 100、 X 1000使用した場合に各々 6%、 40%、 TAMRA—S Eを X 10、 X 100、 X 1000使用した場合に各々 13%、 66%、 99%であった。
[図 8]図 8は、 FAM_yTPの RNAへの導入のアンチ一(Raf _ 1)ァプタマ一への部 位特異的導入とその応用例(Kd測定)を示す。最終の Bio— Rad Molecular Ima ger FxProの測定において、レーザーは 488nm、 530nm BandPatMilterを使 用した。
[図 9]図 9は、テオフィリン結合性 RNAアブタマ一の構造を示す。 (a) 2次構造;(b)テ オフイリン結合部位に関与するヌクレオチド間の相互作用(点線は塩基間での水素 結合を示す); (c) U6— U23—A28からなる塩基トリプレット構造;(d) U6を 5位置換 2—ォキソ(1H)ピリジンに置き換えた場合でのトリプレット構造。
[図 10]図 10は、 T7転写による、 yまたは 5位置換 y (5 修飾塩基)のテオフィリン結合 性アブタマ一の部位特異的導入を示す。
[0088] (A) U6の部位に yまたは 5 修飾塩基を特異的に導入するための転写スキーム
5 修飾塩基の導入部位に対して相補的な位置に sを含む 2本鎖铸型 DNAを用い て、 yTPまたは 5位置換 yTP (Ph— yTPおよび I yTP)存在下で転写を行った。テ オフイリン結合性アブタマ一(41ヌクレオチド)中の番号付けは、非特許文献 43に記 載された 33ヌクレオチドからなるァプタマ一での番号付けと対応させた。転写は 20 a 1スケールで行い、反応組成は、 40mM トリス—塩酸緩衝液(pH8. 0)、 24mM M gCl、 2mM スぺノレミジン、 5mM DTT、 0. 01 %TritonX— 100、 ImM 天然型 ヌクレオチド(NTP)および ImM yTP若しくは ImM Ph_yTP若しくは 0. 25mM I_yTP、 2 μ Ci [ひ _32P] ATP、 2 μ Μ 錡型 DNAおよび 2. 5単位 Z β 1の T7 R NAポリメラーゼである。
[0089] (B) U6の箇所に I— y若しくは y若しくは Ph— yを導入したァプタマ一(I— y6— 41、
y6— 41、 Ph— y6— 41ίこ中目当)のゲノレ電気泳動図。
[0090] sを含む铸型(レーン 1 3: temp59s)又は sの代わりに Aを含む铸型(レーン 4: te mp59)を用いて、上記濃度の yTPもしくは 5位置換 yTP存在下で転写を行い、その 産物をゲル電気泳動で解析した。
[0091] (C)転写産物のヌクレオチド組成分析。
[0092] 転写産物を 0.75単位の RNaseT存在下で、 15mM 酢酸ナトリウム溶液(pH4.
2
5)中、 37。Cで 90分間消ィ匕し、その消化産物を Merck HPTLCプレート(100x100 mm)上で 2次元に展開して解析した。 1次元目、 2次元目の展開溶媒はそれぞれ、ィ ソ酪酸—アンモニア—水(体積比 66 :1:33)、イソプロピルアルコール—塩酸—水( 体積比 70 :15:15)である。 TLCプレート上のスポット(各ヌクレオチドに対応)の放射 活性をバイオイメージングアナライザーで定量し、その結果を TLCパネルの下に示し た。
[0093] 値は以下の式を用いて決定した。
[0094] [化 6]
(各ヌクレオチドの放肘活性) / (全ヌクレオチドの全放射活性) X
[(Aの 5 ' 近傍のヌクレオチドの総数) =9:
[0095] 各ヌクレオチドの理論値を括弧内に記載してある。
[図 11]図 11は、特異的な位置に y又は修飾― yを有する RN Aアブタマ一の3 H -標 識テオフィリンとの結合曲線を示す。 y又は修飾一 yを導入した箇所を括弧内に記載 した。
[0096] 緑線: short FAM— y(6); 黄線: FAM— y(6)
ピンク線: TAMRA— y(6); 水色線: Ph— y(6)
うす茶色: I y(6); 黒色線: y(6)
点線白丸: y(23); 波線 X:y(24)
オレンジ線:非修飾
[図 12]図 12は、本発明の各種非天然型塩基を有するヌクレオチドで部位特異的に
標識されたテオフィリン結合性 RNAァプタマ一の、蛍光スペクトルを示す。
[0097] RNAァプタマ一は、 short FAM— y(a)、 FAM— y (c)または TAMRA— y (d)の いずれかで標識し、様々な濃度のテオフィリン(0— 20 /iM)又はカフェイン(20 μΜ )の存在下での蛍光スペクトルを測定した。黒線、青線、水色線、緑線、オレンジ線、 赤線は、各々 0 μ Μ、 0. 25 μ Μ、 0. 5 μ Μ、 1 μ Μ、 10 μ Μ及び 20 μ Μのテオフィ リンの結果を示す。赤線点線は、 20 μΜのカフヱインの結果を示す。図 12bは、 shor t FAM_y標識 RNAァプタマ一のテオフィリン存在下での蛍光強度変化において 、 522nmにおける蛍光強度をテオフィリン濃度に対してプロットした曲線である。 実施例
[0098] 以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範 囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本 発明に修飾 ·変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
[0099] 以下、実施例 1 9は合成実施例を記載する。
[0100] 実施例 1 3—(5 〇ージメトキシトリチノレー β—D—リボフラノシ /レ)ー5 ョードー 2—ォキソ(1H)ピリジンの合成
3_(β _D—リボフラノシノレ) _5_ョード _2_ォキソ(1H)ピリジン(178mg, 50 5 zmol)を 10mlナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を 3回行った。これを無水ピリ ジン(5ml, 0. ΙμΜ)に溶解させ、塩化ジメトキシトリチル(183mg, 540 zmol)を 加え、室温で 1時間半攪拌した。反応溶液を酢酸ェチル Z水中に加え、水層を除去 した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で 2回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾 燥させた後、溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ 一(展開溶媒;ジクロロメタン:メタノール = 100 :0→100:2)で精製し、 目的物を淡黄 色ァモノレファス状物質(272mg, 416 zmol,収率 82%)として得た。
[0101] JH NMR (270MHZ, DMSO-d ) δ 3. 09— 3. 20 (m, 2H) , 3. 70— 3.
6
86(m, 8H), 3. 92— 3. 94(m, 1H), 4. 73— 4. 76 (m, 2H) , 5. 27(bs, 1 H), 6.89 (d, 2H, J = 8. 9Hz) , 7. 18— 7.43 (m, 9H) , 7. 59-7. 61(m , 2H), 11. 9(bs, 1H).
実施例 2 3- (2._3—ジ一 O ァセチノレ一 5 〇一ジメ上キシ b£チノレー β -D-
ボフラノシル)ー5—ョードー 2—ォキソ(1H)ピリジンの合成
実施例 1で合成した 3— (5 〇一ジメトキシトリチル 1— β—D リボフラノシル)一 5 —ョードー 2—ォキソ(1H)ピリジン(266mg, 406 μ mol)を 10mlナス型フラスコ中、 無水ピリジンで共沸を 3回行った。これを無水ピリジン(4ml, 0. ΙμΜ)に溶解させ、 酢酸無水物 (110 μΐ, 1. 17mmol)を加え、室温でー晚攪拌した。反応溶液を酢 酸ェチルで希釈し、有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で 洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた油状物質を エタノール(50ml)に溶解させ、 1時間半還流させた。濃縮後、得られた粗生成物を シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒;ジクロロメタン:メタノール =100: 1→1 00 :4)で精製し、 目的物を淡黄色アモルファス状物質(253mg, 342 zmol,収率 8 4%)として得た。
JH NMR (270MHZ, DMS〇一 d ) · δ 1. 96(s, 3H), 2. 04 (s, 3H) , 3
6
.14(m, 1H), 3.29— 3.31(m, 1H), 3.73(s, 6H), 4.10— 4. 15(m, 1
H) , 4.91(d, 1H, J = 3.6Hz), 5.25— 5.33 (m, 2H) , 6.88 (d, 4H, J = 8.9Hz), 7.21-7.39(m, 9H) , 7.66 (d, 1H, J = 2.3Hz) , 7.74 (d, 1
H, J = 2.3Hz).
実施例 3 3—(2, 3 ジー O ァセチノレー 5 〇ージメトキシトリチノレー β D リ ボフラノシル) -5-Γ3- (6—トリフルォロアセタミドへキサンアミド) 1 プロピニル Ί 2—ォキソ(1H)ピリジンの合成
実施例 2で合成した 3—(2, 3 ジー〇 ァセチルー 5 〇ージメトキシトリチルー β— D リボフラノシル)一 5 ョード 2 ォキソ(1H)ピリジン(244mg, 330 /i mo
I)を 10mlナス型フラスコ中、無水ァセトニトリルで共沸を 2回行った。ヨウ化銅(13.3 mg, 69.8 zmol)、テトラキストリフエ二ノレホスフィンノヽ。ラジウム(0) (36.4mg, 31.5 zmol)をカ卩え、これらを無水 DMF (2ml)に溶解させ、室温で攪拌させながらトリエ チノレアミン(85 μΐ, 610 zmol)を加え、遮光下室温で攪拌した。これに N— (2—プ ロビニル) -6-トリフルォロアセタミドへキサンアミド(240mg, 908 μ mol)の DMF (
I.5ml)溶液を滴下し、室温で 3.5時間攪拌した。反応溶液を酢酸ェチル /へキサ ン(1: 1)で希釈し、有機層を水及び飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾
燥させた後、溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ 一(展開溶媒;ジクロロメタン:メタノール =100:0· 5→100:3)で精製し、 目的物を 淡黄色アモルファス状物質(255mg, 291/imol,収率 88%)として得た。
[0103] 'Η NMR (270MHZ, DMSO-d ) δ 1.16 (m, 2H) , 1.41— 1.49(m
6
, 4H), 1.89-2.07(m, 8H) , 3.13(dd, 2H, J = 6.6 and 12.9Hz) , 3.23-3.24 (m, 2H) , 3.73 (s, 6H) , 3.90— 3.92 (m, 2H) , 4.10— 4 .13(m, 1H), 4.88(d, 1H, J = 3.6Hz), 5.25— 5.33 (m, 2H) , 6.87( d, 4H, J = 8.9Hz), 7.21— 7.38 (m, 9H) , 7.56— 7.58 (m, 2H) , 8.1 3(t, 1H, J = 5.1Hz), 9.38(bs, 1H), 12.0(bs, 1H) .
HRMS (FAB, 3 -NBA matrix) f or C H F N O [M+l] + : calcd,
46 49 3 3 11
876.3319; found, 876.3369.
実施例 4 3-(2.3—ジ一O—ァセチル _ _D—リボフラノシル)一 5_「3_(6 -トリフルォロアセタミドへキサンアミド) - 1—プロピニル Ί— 2—ォキソ(1H)ピリジン の合成
実施例 3で合成した 3—(2, 3 ジー〇 ァセチルー 5 〇ージメトキシトリチルー β -D—リボフラノシル) 5 [3 (6—トリフルォロアセタミドへキサンアミド) 1— プロピニノレ] 2 ォキソ( 1 Η)ピリジン( 245mg, 279 μ mol)を無水ジクロロメタン(4 6ml)に溶解させ、 0°Cで攪拌させながらジクロロ酢酸(470 /il, 5.69mmol)を加え 、 15分間攪拌した。反応溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に室温で滴下し、激 しく攪拌した。水層をジクロロメタンで 20回以上抽出し、合わせた有機層を硫酸マグ ネシゥム上で乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた油状物質をシリカゲルカラム クロマトグラフィー(展開溶媒;ジクロロメタン:メタノール =100:0.5→100:4)で精 製し、 目的物を淡黄色アモルファス状物質(119mg, 207 μ mol,収率 74%)として 得た。
[0104] 'Η NMR (270MHz, DMSO-d ) δ 1.19— 1.27 (m, 2H) , 1.41— 1
6
.55 (m, 4H), 2.00 (s, 3H) , 2.02 (s, 3H) , 2.08 (t, 2H, J = 7.3Hz) , 3.14(dd, 2H, J = 6.8 and 12.9Hz) , 3.49— 3.68 (m, 2H) , 4.01—4 .05 (m, 3H), 4.85(d, 1H, J = 5.3Hz), 5.15— 5.19 (m, 2H) , 5.24(
t, 1H, J = 5.4Hz), 7. 58(d, 1H, J = 2. 5Hz), 7. 66 (d, 1H, J = 2. 5Hz) , 8. 26(t, 1H, J = 5. 1Hz), 9. 38(bs, 1H), 12. 1 (bs, 1H).
HRMS (FAB, 3 -NBA matrix) f or C H F N〇 [M + l] + : calcd,
25 31 3 3 9
574. 2012; found, 574. 2061.
実施例 5 3-(β _D—リボフラノシル)一 5_「3_ (6—ァミノへキサンアミド)一 1 一プロピニル Ί -2-ォキソ( 1 H)ピリジン 5 '—三リン酸 (NH— vTP)の合成
2
実施例 4で合成した、 3- (2, 3_ジ一 Ο—ァセチル一 β _D—リボフラノシル)一 5 — [3— (6—トリフルォロアセタミドへキサンアミド) - 1—プロピエル]— 2—ォキソ(1 H)ピリジン(58. 3mg, 102 zmol)を 50mlナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を 3回行ったのち、反応容器をアルゴンガスで満たした。これに無水ピリジン(ΙΟΟμΙ) 及び無水ジォキサン(300 xl)を加えて溶解させ、 2_クロ口 _4H_1, 3, 2_ベン ゾジォキサホスフォリン一 4—オンの 1M ジォキサン溶液(110 μΐ, 110 zmol)をカロ えて室温で 10分間攪拌したのちに、トリー n—ブチルァミン(ΙΟΟμΙ)及びビス(トリー η—ブチルアンモニゥム)ピロホスフェートの 0· 5Μ DMF溶液(300μ1)を加えて 10 分間攪拌した。 1% ヨウ素/水/ピリジン溶液 (2ml)を加え、室温で 15分間攪拌し 、 5% 亜硫酸水素ナトリウム水溶液(150 / l)を加えた後に反応溶液を減圧濃縮し た。得られた油状物質に水(10ml)を加え、室温で 30分間攪拌した後に濃アンモニ ァ水(12ml)を加えて 3時間攪拌した。これを減圧濃縮後、 50mlチューブに移し、凍 結乾燥させた。これを濃アンモニア水に溶解させて室温で 3時間攪拌した後に、凍結 乾燥させた。これを DEAE Sephadex A— 25カラムクロマトグラフィー(1. 5x30c m,濃度直線勾酉己; TEABの 50mM— 1M溶液)及び C18— HPLC (濃度勾配; 0% —15% ァセトニトリルの 0. 1M 酢酸トリェチルアンモニゥム緩衝液, pH7. 0)にて 精製し、 目的物を得た。
'Η NMR (270MHZ, D O) δ 1. 13(t, 18H, J = 7. 3Hz) , 1. 21— 1. 3
2
2(m, 2H), 1.48-1. 61(m, 4H) , 2. 19(t, 2H, J = 7. 3Hz) , 2. 83 (t, 2 H, J = 7. 3Hz), 3. 05(q, 12H, J = 7. 3Hz) , 3. 95— 4. 20 (m, 7H), 4. 8 8(d, 1H, J = 3. 0Hz), 7. 49(d, 1H, J = 2. 0Hz) , 7. 83(d, 1H, J = 2. 0Hz
31P NMR(109MHz, D O) δ — 22· 19 (t, 1H, J = 20. 1Hz) , — 10. 60(
2
d, 1H, J = 20. 1Hz), -8. 84 (d, 1H, J = 20. 1Hz).
MS (ESI) for C H N O P [M? 1]?: calcd, 632. 08 ; found, 631.
19 29 3 15 3
84.
実施例 6 3- ( β _D—リボフラノシル) _5_「3_「6_ (フルォレセイン一 5 _力 ルポキサミド)へキサンアミド Ί - 1 _プロピニル Ί - 2 _ォキソ(1H)ピリジン 5 '—三リ ン酸 (FAM— vTP) の合成
実施例 5で合成した 3_ ( j3—D—リボフラノシル)一 5_ [3— (6—ァミノへキサンァ ミド) - 1 _プロビュル] _ 2_ォキソ(1H)ピリジン 5,一三リン酸(10 μ mol)を 5ml の滅菌済みチューブに移し、これを 0. 1M 炭酸水素ナトリウム水溶液 (pH8. 6, 1. 5ml)に溶解させ、 5 _カルボキシフルォレセイン N—ヒドロキシコハク酸イミド エス テル(5. 5mg, 11. 6 μ mol)の DMF溶液(200 μΐ)を加えて、時々振盪させながら 遮光下室温で 3. 5時間反応させた。これに濃アンモニア水(lml)をカ卩え、時々振盪 させながら 2時間反応させた。これを減圧濃縮、凍結乾燥させた後、 DEAE Sepha dex A— 25カラムクロマトグラフィー(1. 5x30cm, 濃度直線勾酉己; TEABの 50m M— 1M溶液)及び C18— HPLC (濃度勾配; 0%— 50% ァセトニトリルの 0· 1M 酢酸トリェチルアンモニゥム緩衝液, ρΗ7· 0)にて精製し、 目的物(3· Ομΐηοΐ, 30 %)を得た。
JH NMR (270MHZ, D O) δ 1. 14(t, 27H, J = 7. 3Hz) , 1. 20— 1.4
2
0(m, 2H), 1.45— 1. 65(m, 4H), 2. 10— 2. 35 (m, 2H) , 2. 90— 3. 60 (m, 22H), 3. 70-4. 20 (m, 5H) , 6. 55— 6. 85 (m, 4H) , 7. 00— 7. 40 (m, 4H), 7. 50-7. 70 (m, 1H), 7. 90— 8. 05 (m, 1H) , 8. 10-8. 20 ( m, 1H).
1P NMR (109MHz, D O) δ -21. 75, —10. 40, 一9. 38.
2
MS (ESI) for C H N O P [M— 1]— : calcd, 990. 13; found, 989. 9
40 39 3 21 3
8.
実施例 7 3- ( β _D—リボフラノシル)一 5_「3_「6—(テトラメチルローダミン一 5 -カルボキサミド)へキサンアミド Ί - 1 -プロピニル 1— 2 -ォキソ 11)_ピリジン 5 '
一三リン酸 (TAMRA— vTP) の合成
実施例 5で合成した 3—( D—リボフラノシル)ー5— [3— (6—ァミノへキサンァ ミド) - 1 プロピエル] 2 ォキソ(1H)ピリジン 5,一三リン酸(8 μ mol)を 5mlの 滅菌済みチューブに移し、これを 0. 1M 炭酸水素ナトリウム水溶液 (pH8. 6, 1. 2 ml)に溶解させ、 5 _カルボキシテトラメチルローダミン N—ヒドロキシコハク酸イミド エステノレ(5mg, 9. 5 μ mol)の DMF/水混合溶夜(150/150 μΐ)をカロえて、時 々振盪させながら遮光下室温で 3. 5時間反応させた。これに濃アンモニア水(lml) を加え、時々振盪させながら 2時間反応させた。これを減圧濃縮、凍結乾燥させた後 、 DEAE Sephadex A—25カラムクロマトグラフィー(1. 5x30cm, 濃度直線勾 酉己; TEABの 50mM— 1M溶液) 及び C18— HPLC (濃度勾配; 0%— 50%ァセ トニトリルの 0. 1M酢酸トリェチルアンモニゥム緩衝液, pH7. 0)にて精製し、 目的物 (4. 0 μ mol, 50%)を得た。
JH NMR (270MHZ, D O) δ 1. 13 (t, 27H, J = 7. 3Hz) , 1. 25— 1. 40
2
(m, 2H), 1. 50— 1. 65(m, 4H), 2. 10— 2. 35 (m, 2H) , 3. 00— 3. 22( m, 32H), 3.40-4. 00 (m, 7H) , 4. 80— 4. 85 (m, 1H) , 6. 55— 6. 60( m, 1H), 6. 65— 6. 75(m, 2H), 6. 80— 6. 90 (m, 1H) , 6. 98— 7. 05( m, 1H), 7. 05-7. 20 (m, 2H) , 7.40— 7. 50 (m, 2H) , 7. 95— 8. 05( m, 1H), 8. 08— 8. 15(m, 1H).
31P NMR (109MHz, D O) 5 —23. 00— — 22. 00 (m, 1H) , —11·
2
50- — 10. 50(m, 1H), —10. 50— — 9. 50(m, 1H).
MS (ESI) for C H N O P [M? l]— : calcd, 1044. 22; found, 1043
44 49 5 19 3
. 90.
実施例 8 3-(β _0_リボフラノシル)_5_「3_「6_「6_「(5_ジメチルァミノ ナフタレン一 1—スルフォニル)ァミノ Ίへキサンアミド Ίへキサンアミド Ί - 1 _プロピニ ノレ Ί 2 ォキソ(1H)ピリジン 5' _三リン酸 (Dansyl_x_vTP) の合成
実施例 5で合成した 3_ ( j3—D—リボフラノシル)一 5_ [3— (6—ァミノへキサンァ ミド) - 1 _プロビュル] _ 2_ォキソ(1H)ピリジン 5,一三リン酸(9 μ mol)を 50ml の滅菌済みチューブに移し、これを 0. 1M ホウ酸ナトリウム水溶液 (PH8. 5, 1. 8
ml)に溶解させ、 6—[ (5—ジメチルァミノナフタレン 1ースルフォニル)ァミノ]へキ サン酸 N ヒドロキシコハク酸イミド エステル(20mg, 44/imol)の DMF溶液(1. 8ml)を加えて、時々振盪させながら遮光下室温で 48時間反応させた。これに濃アン モニァ水(lml)を加え、時々振盪させながら 1時間反応させた。これを減圧濃縮させ た後、 DEAE Sephadex A— 25カラムクロマトグラフィー(1.5x30cm, 濃度直 線勾配; TEABの 50mM— 1M溶液)及び C18— HPLC (濃度勾配; 0%— 50%ァ セトニトリルの 0.1M酢酸トリェチルアンモニゥム緩衝液, pH7.0)にて精製し、 目的 物(6.2 μ mol, 68%)を得た。
'Η NMR (270MHZ, D O) δ 0. 75-0. 90 (m, 2H) , 0. 92— 1. 10(m,
2
4H), 1.08-1.26(m, 29H), 1.26— 1.40 (m, 2H) , 1.40— 1.52(m, 2H), 1.66(t, 2H, J = 7.3Hz) , 2.14(t, 2H, J = 7.3Hz) , 2.72-2.86 (m, 8H), 2.95 (t, 2H, J = 6.6Hz) , 3.06 (q, 18H, J = 7.3 Hz), 3.85 -4.20 (m, 7H), 4.75 (d, 1H, J = 3.0Hz) , 7.25— 7.32 (m, 2H) , 7.5 2— 7.65(m, 3H), 8.10 (d, 1H, J = 7.3Hz) , 8.15 (d, 1H, J = 8.9Hz) , 8.33 (d, 1H, J = 8.9Hz).
31P NMR(109MHz, D O) δ —22.56, —10.54, —10.09. MS (
2
ESI) for C H NO PS [M— 1]— : calcd, 978.22; found, 978.34.
37 51 5 18 3 1
実施例 9 3— ( β—D—リボフラノシル) 5—「3—(フルォレセインー5—カルボキ サミド)ー1 プロピニル Ί 2—ォキソ(1H)ピリジン 5'—三リン酸 (short FAM -vTP) の合成
1)3- (2, 3 ジー〇 ァセチルー D—リボフラノシル)ー5—[3—(2, 2 ジ クロロアセタミド)一 1—プロビュル]— 2—ォキソ(1H)ピリジン
実施例 2で合成した、 3- (2, 3_ジ— O—ァセチル _5_〇—ジメトキシトリチル— β _D—リボフラノシノレ) _5_ョード _2_ォキソ(1H)ピリジン(268mg、 362 μ mo 1)を、 CH CN中に溶解し、乾燥するまで真空内で 2回蒸発させた。残渣を DMF(2
3
ml中)に、 Cu(I)I(12.4mg、 65.2μ mol)及び Pd[P(C H ) ] (37.7mg、 32.6
6 5 3 4
μ mol)と共に溶解した。トリエチノレアミン(91 zl、 652 μ mol)をカロえた後、喑がりで 、室温で攪拌した。溶液に、 DMF(1, 5ml)中の 2, 2—ジクロ口 _N—プロプ _ 2_
ィニルーァセタミド(162mg、 978 μΐηοΐ)を滴下して加え、溶液を室温で 3. 5時間攪 拌した。反応混合物を EtOAcで希釈した。溶液を H O及び食塩水で洗浄し、 MgS
2
Oで乾燥させ、そして真空内で蒸発させた。残渣からシリカゲルカラムクロマトグラフ
4
ィー(CH C1中の 0. 5-3%CH〇H)によって、 3_(2, 3—ジ _0_ァセチノレ _ 5
2 2 3
—0—ジメトキシトリチノレ一 β _D—リボフラノシノレ)一 5_[3_ (2, 2—ジクロロアセタ ミド) _1_プロピニル ]_2_ォキソ(1H)ピリジン(251mg、 89%)を精製した。ジク ロロメタン(32ml)中の 3— (2, 3—ジ一 O—ァセチル一 5—〇一ジメトキシトリチル一 β _D—リボフラノシノレ) -5-[3-(2, 2—ジクロロアセタミド) _1_プロピニノレ]— 2_才キソ(Ιίί)ヒ。リジン(251mg、 323μπιο1)ίこ、ジクロロ醉酸(323 μ 1、 3. 92mm ol)を加え、そして、 0°Cで 15分間攪拌した。反応混合物を飽和 NaHCO溶液に注
3 ぎ、激しく攪拌した。水層をジクロロメタンで 5回抽出した。混合した有機層を MgS〇
4 で乾燥させ、そして真空内で蒸発させた。残渣からシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CH C1中の 2— 10%CH OH)によって、産物(136mg、 88%)を精製した。
2 2 3
JH NMR(300MHZ, DMSO-d ) δ 2. 01(s, 3Η), 2. 04(s, 3Η), 3.
6
50— 3. 70(m, 2H), 4. 00— 4. 05 (m, 1H) , 4. 18 (d, 2H, J = 5. 4Hz) , 4. 87(d, 1H, J = 5. 6Hz), 5. 10— 5. 30 (m, 3H) , 6. 48(s, 1H), 7. 63( d, 1H, J = 2. 3Hz), 7. 68(d, 1H, J = 2. 0Hz) , 9. 10 (t, 1H, J = 5. 0Hz) , 12. 08(brs, 1H).
HRMS (FAB, 3 -NBA matrix) f or C H C N O (M+l): calcd,
19 21 12 2 8
475. 0675; found, 475. 0689.
2)3- ( β—D—リボフラノシル) -5-Γ3- (フルォレセイン一 5—カルボキサミド) _1_プロピニル Ί— 2—ォキソ(1H)ピリジン 5, _三リン酸 (short FAM-yTP 1
3- (2, 3_ジ一〇一ァセチル一 j3 _D—リボフラノシル)一 5_[3_ (2, 2—ジクロ ロアセタミド)一 1—プロピニル ]—2—ォキソ(1H)ピリジン(47. 5mg, lOO xmol)を 50ml ナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を 3回行ったのち、反応容器をァルゴ ンガスで満たした。これに無水ピリジン(100 μ 1)及び無水ジォキサン(300 μ 1)を加 えて溶解させ、 2_クロ口 _4Η_1, 3, 2 _ベンゾジォキサホスフォリン一 4—オンの
1M ジォキサン溶液(110 μ ΐ, 110 μ ΐηοΐ)を加えて室温で 10分間攪拌したのちに 、トリ一 η—ブチルァミン(100 μ 1)及びビス(トリ一 η—ブチルアンモニゥム)ピロホスフ エートの 0. 5Μ DMF溶液(300 μ 1)を加えて 10分間攪拌した。 1% ヨウ素/水/ ピリジン溶液(2ml)を加え、室温で 15分間攪拌し、 5% 亜硫酸水素ナトリウム水溶 液(150 μ 1)をカ卩えた後に反応溶液を減圧濃縮した。得られた油状物質に水(10ml )を加え、室温で 30分間攪拌した後に濃アンモニア水(12ml)をカ卩えて 3時間攪拌し た。これを減圧濃縮後、 50mlチューブに移し、凍結乾燥させた。これを濃アンモニア 水(3ml)に溶解させて 55°Cで 3時間攪拌した後に、減圧濃縮した。これを DEAE S ephadex A— 25カラムクロマトグラフィー(1. 5x30cm, 濃度直線勾酉己; TEABの 50mM— 1M溶液)にて精製し、 3— ( j3—D—リボフラノシル)一 5— [3—ァミノ一 1 —プロピニル ] _ 2_ォキソ(1H)ピリジン 5, _三リン酸を得た。これを 50mlの滅菌 済みチューブに移し、 0. 1M 炭酸水素ナトリウム水溶液 (pH8. 6, 4ml)に溶解さ せ、 5—カルボキシフルォレセイン N—ヒドロキシコハク酸イミド エステル(14. 5mg , 30. 6 μ ΐηο1)の DMF溶液(lml)を加えて、時々振盪させながら遮光下室温で 12 時間反応させた。これに濃アンモニア水(lml)を加え、時々振盪させながら 30分反 応させた。これを減圧濃縮、凍結乾燥させた後、 DEAE Sephadex A— 25カラム クロマトグラフィー(1. 5x30cm, 濃度直線勾酉己; TEABの 50mM— 1M溶液)及び C18— HPLC (濃度勾配; 0%— 50%ァセトニトリルの 0· 1M酢酸トリェチルアンモニ ゥム緩衝液, pH7. 0)にて精製し、 目的物(10· 1 μ mol, 10%)を得た。
¾ NMR (270MHZ, D O) δ 1. 14 (t, 32H, J = 7. 3Hz) , 3. 06 (q, 2
2
1H, J = 7. 3Hz) , 4. 00-4. 35 (m, 7H) , 4. 80— 4. 90 (m, 1H) , 6. 65— 6. 88 (m, 4H) , 6. 92— 7. 06 (m, 2H) , 7. 25— 7. 38 (m, 1H) , 7. 48— 7 . 58 (m, 1H) , 7. 73— 7. 85 (m, 1H) , 7. 95— 8. 10 (m, 1H) , 8. 24— 8. 32 (m, 1H) .
1P NMR (109MHz, D〇) δ —22. 40, 一10. 38, 一10. 38.
2
MS (ESI) for C H N〇 P [M ? l]— : calcd, 877. 04 ; found, 877.
34 28 2 20 3
07.
io VTP„{本のき 収 泡 I
蛍光スペクトルは、 FAM-yTP(l. 0 /i M)、 TAMRA— yTP (1. 0 /i M)、 short FAM-yTP(l. 0/i M)及び Dansyl— x— yTP(l. ΟμΜ)の lOmM リン酸ナト リウム緩衝液 (pH7. 0)の溶液を 25°Cで、 FP— 6500蛍光測定装置(日本分光)によ り測定した。測定には 3x3mmセルを用レ、、レスポンス 1. 0s、感度 low、スリットは励 起側 ·蛍光側ともに 3nmに固定してスペクトル測定を行った。結果を図 4に示す。
[0111] 量子収率 )は以下に示す式から算出し、標準物質としてはフルォレセイン(1. 0 μΜ in 0. IN NaOH, ^s = 0. 90)を用いた。
[0112] φ = (F-As- ?i2' (i)s)/(A-Fs- η 2)
o
F; 蛍光スぺタトノレの面積
A; 励起波長での吸光度
η; 屈折率 (水: 1. 33)
s; 標準物質
[0113] [表 3]
[0114] 図 4及び表 3に示されたように、 FAM— yTPの定常光励起発光スペクトルは、吸収 極大波長の 493nmで励起すると、 522nmに極大を有する蛍光スペクトルを示し、そ の量子収率( φ )は、 0· 55(pH7. 0水溶液中)であった。また、 TAMRA—yTPの 定常光励起発光スペクトルは、吸収極大波長の 553nmで励起すると、 578nmに極 大を有する蛍光スペクトルを示し、その量子収率 )は、 0. 50(pH7. 0水溶液中) であった。
[0115] 以下、実施例 11一 13は転写反応実施例を示す。
[0116] 実施例 11 T7 RNA ポリメラーゼによる転写反応
NH— yTP、 FAM— yTP、 TAMRA— yTPのそれぞれを用いて、 T7 RNAポリ
2
メラーゼによる転写反応を行った。
[0117] 具体的には、二本鎖の铸型 DNA (10 /i M)のアニーリングを 10mM NaClを含む
10mM Tris _HCl緩衝液(pH7. 6)中で、 95°C、 3分→50°C、 3分→4。Cの徐冷 操作で行った。 T7転写反応は、 40mM Tris _HCl緩衝液(pH8. 0)、 24mM M gCl、 2mM スぺノレミジン、 5mM DTT、 0. 01 % TritonX— 100、
2 2 β αί Ύ— 32
P]GTP、 ImM NTPs、 ImM 修飾 yTP、 2 μ M 錡型 DNA、及び 50単位 T7
RNAポリメラーゼ(Takara)の反応溶液(20 μ 1)で行った。
[0118] 铸型 DNAには、 Τ7プロモーターを含む 35量体(35 _mer)の錡型鎖と Τ7プロモ 一ターの非錡型鎖 21 _merとを二本鎖化したものを用いた。そして、錡型中の一箇 所には、 s、あるいは、 Vを導入してある。
[0119] T7プロモーターを含む 35量体(35 _mer) (配列番号 1)
N (5) =v (本発明)、 s (本発明)又は A (対照)
T7プロモーターの非铸型鎖 21— mer (配列番号 2)
5,一 ATAATACGACTCACTATAGGG— 3 '
転写物 (配列番号 3)
5,一 GGGAAUCCCGAGN, AGUG一 3 '
N, (13) =NH— y、 FAM— y又は TAMRA— y
2
天然型の基質と等量の修飾基質を加え、 37°C、 3時間反応を行った後、 10M 尿 素を含む電気泳動用色素溶液(20 β 1)を加えて反応を停止させた。反応溶液を 75 °Cで 3分間加熱後、 20% ポリアクリルアミドー 7M尿素ゲルで電気泳動を行レ、、転 写物をバイオイメージアナライザーで解析した。
[0120] 結果を図 5に示す。図 5に示されたように、それぞれの修飾基質力 ¾NA中に取り込 まれることがわかった。それぞれの修飾基質が取り込まれると RNA断片 17_merの ゲル中での移動度が遅くなることから、それらの取り込みが確認された。さらに、それ ぞれのレーンに天然型の 17 _merのバンドがほとんど見えないこと、さらに、天然型 の錡型を用いた場合には、移動度の遅いバンドが認められないことから、それぞれの
修飾基質が効率よく部位特異的に取り込まれたことがわかった。また、铸型塩基に S を用いるよりも、 Vを用いたほうが、転写効率が良かった。天然型の铸型'基質のみの 転写反応と比較すると、 NH— yが取り込まれた RNAは、同程度の収率で得られ、 F
AM_y、あるレ、は、 TAMRA_yが取り込まれた RNAの収率は、それぞれ、 76%、 61 %であり、非常に効率がよいことが判明した。
[0121] i 2 T7 RNAポリメラーゼによる拿云写 成 の 組成ん斤
実施例 11に次いで、 NH _yが取り込まれた RNAについて、ヌクレオチドの組成分 析を行った。
[0122] 実施例 11と同様の T7 RNAポリメラーゼによる転写反応を、 40mM Tris-HCl 緩衝液(pH8. 0)、 24mM MgCl 、 2mM スぺノレミジン、 5mM DTT、 0. 01 %
TritonX- 100, 2 μ ϋί[ γ _32P]ATP、 ImM NTPs、 ImM 修飾 _yTP、 2 μ M 铸型 DNA、及び 50単位 T7 RNAポリメラーゼ(Takara)の反応溶液で行った 。転写物を、 15% ポリアクリルアミドー 7M 尿素ゲルによる電気泳動後、ゲルから の溶出を行った後、 tRNA(0. 250D)を加えてエタノール沈殿を行い回収した。
[0123] この tRNAを含む溶液(8· 5 μ 1)に、 RNase Τ (1 · 5 /i 1, 1単位/ μ 1)を加えて、
37°Cでー晚反応を行った。この溶液の 0· 3 μ l¾rTLC (Merck, lOcmxlOcm)に スポットし、二次元展開を行った。展開液として、一次元目はイソ酪酸:濃アンモニア 水:水 = 66: 1: 33 (v/v/v)、二次元目は 2—プロパノール:塩酸:水 = 65 : 10 : 25 (v/v/v)を用いた。展開後のスポットをバイオイメージアナライザーで検出し、解析 を行った。
[0124] 結果を図 6に示す。図 6のイメージアナライザーの図には、 32Pで標識された Gp X 2 、 Ap X lと、 N' p X lが検出される。铸型の Nの位置に Vが存在する場合には、対応 する N'として NH _yが検出され、 Upが見出されない。一方、铸型の Nの位置に A が存在する場合には、対応する N'として Upが検出され、 NH —Vが見出されない。 ヌクレオチドの組成分析の結果、 Vに対する NH _yの特異的な取り込みが確認され た。
[0125] 実施例 13 NH —Vを含む RNA 17— merの転写後修飾による蛍光某の導入
NH — yが取り込まれた RNAを用いて、 RNA転写後に FAM、あるいは、 TAMR
Aによる修飾も行った。
[0126] 具体的には、実施例 1 1と同様の T7 RNAポリメラーゼによる転写反応で生成した NH— yを含む RNA17— mer (配列番号 3)を、電気泳動(15% ポリアクリルアミド
- 7M 尿素ゲル)で精製した後、ゲルからの溶出、及び、エタノール沈殿により回収 した。修飾反応は、 RNA17 -mer (20 μ Μ, 2. 5 μ 1)を、 FAM、又は、 TAMRAの コハク酸イミドのエステル体(FAM _ SE又は TAMRA— SE)の DMSO溶液(0もし くは 0. 2? 20mM, 2. 5 μ 1)、0. 1Μ テトラホウ酸ナトリウム— HQ緩衝液(pH8. 3 ) ( 15 μ ΐ)と?昆ぜて、 37。C、 12日寺間行った。
[0127] 10M尿素を含む電気泳動用色素溶液(20 μ 1)を加えて反応を停止させ、 75°Cで
3分間加熱後、 20% ポリアクリルアミドー 7M 尿素ゲルで電気泳動を行った後、生 成物をバイオイメージアナライザーで解析した。
[0128] 結果を図 7に示す。図 7に示されたように、大過剰のそれぞれのコハク酸イミドエス テル誘導体を用いることにより、それぞれの RNA断片を蛍光標識できることがわかつ た。この RNA断片では、 NH — yが配列の中央に位置している力 末端に導入すれ ば、修飾効率はさらに高くなると期待される。また、 NH — yを導入した RNAは、蛍光 色素以外にもいろいろな修飾が可能である。
[0129] 実施例 14 フィルター結合法によるタンパク質と部位特異的に蛍光標識した RNA の結合実,験
A)転写反応用铸型の調製
本実施例に使用する Raf—1タンパク質及び RNAァプタマ一については、本明細 書中に参考文献として援用される WO2004/007713の参考例 1を参照されたい。
[0130] 転写反応用の錡型は、以下の PCR反応により調製された。 PCR反応の錡型には a nti- (Raf - 1 ) ァプタマ一 9Aの遺伝子(配列番号 4)がサブクローニングされたベ クタ一(T〇PO 9Α)を用い、また、 PCR反応の酵素には、 3 '→5 'ェキソヌクレア一 ゼ活性がなレヽ Taq DNAポリメラーゼ(TaKaRa)を用いた。
[0131] 反応組成は、 10mM Tris _ HCl緩衝液(pH 8. 3)、 50mM KC1、 1. 5mM MgCl、0. 2mM dNTPs, 1 μ M プライマー対 [39. 45 (39 -mer) ; 5 ' - GG
、 29. 45v90 (29-mer) ; 5, - GCAGAAGCTTvCTGTCGCTAAGGCATA TG (配列番号 6) ]、 lng/ μ ΐ TOPO 9A、 0. 025単位/ μ 1 Taq DNAポリメラ ーゼである。
[0132] 反応は PTC— 100™ Program Thermal Controller (MJ Research)を用い て、 [94°C 15秒— 50°C 30秒— 72。C 1分] X 15サイクノレ ― 72°C 5分、の条 件で行われた。反応溶液をマイクロピュア—EZ (ミリポア)に通して酵素を除去した後 、溶液をエタノール沈澱して PCR産物を回収した。サンプルは、滅菌水に溶かして保 存し、 T7転写反応の錡型とした。
[0133] B)T7 RNA ポリメラーゼによる転写反応(FAM_yを 90残基目に含む RNA 9 Aの調製)
T7転写反応は、 40mM Tris -HCl 緩衝液(ρΗ8. 0)、 8mM MgCI、 2mM
2 スペルミジン、 5mM DTT、 0. 01% TritonX— 100、 ImM natural NTPs、 1 mM FAM— yTP、 25ng/ /i l 铸型 DNA、及び 2· 5U/ μ 1 T7 RNAポリメラ ーゼ (TaKaRa)を含む溶液で行った。 37°C、 6時間反応を行った後、 10M 尿素を 含む電気泳動用色素溶液を反応溶液と等量加えて反応を停止させた。反応溶液を 75°Cで 3分間加熱後、 10% ポリアクリルアミドー 7M尿素ゲルで電気泳動を行い、 目的の転写反応産物(9A90F ; 100— mer)が含まれるゲルを切り出した。 目的産物 を滅菌水でゲルから溶出した後、エタノール沈殿を行レ、、 RNA 9A90Fを回収した
[0134] C)フィルター結合法によるタンパク質と RNAの結合実験
結合実験には、 human Raf— 1の RBD (アミノ酸残基 51— 131番)の GST融合タ ンパク質(Raf _ lタンパク質)を用いた。本手法では、ニトロセルロースフィルターが タンパク質を吸着する一方、 FAM標識された RNA 9Aは吸着しない性質を利用し 、タンパク質一 RNA複合体をニトロセルロースフィルタ一により単離した。
[0135] RNA 9A90F、 60 μ 1 (最終濃度 10ηΜ)を、さまざまな濃度の Raf _ 1タンパク 質、 2 1 (最終濃度50_ 800111^)と緩衝液?(?83、 5mM MgCI )中で混合し、室
2
温(22°C)で 30分間インキュベートした。その反応溶液 50 μ 1をニトロセルロースフィ ルター(ミリポア, catalog # HAWP01300)に通し、 200 μ 1の緩衝液 Ρで洗浄した
後、フィルター上に吸着した RNAの蛍光量を蛍光スキャナ(Molecular Imager F X Pro、 BIO— RAD)により測定した。測定条件は、フィルターが 530nm BP (Ban dPath)、レーザー波長が 488nm、 PMTセッティングが 80%である。カレイダグラフ (Albelbeck Software)を用いて、測定した蛍光量を y、タンパク質濃度を Mとして
0
、計算式 y= M X M / (M + M )にあてはめ、最小二乗法によるデータフイッテング
0 1 0 2
を行って解離定数 Kd (Mに相当)を求めた。同時に求まる Mは、 RNAとタンパク質
2 0
の結合が飽和した場合 (タンパク質量が無限大)でのフィルター上に吸着される RNA の蛍光量に相当する。結果を図 8に示す。
[0136] 本実施例では、本研究の応用例として、 FAM— yTPを Raf— 1タンパク質に特異 的に結合する RNAァプタマ一(抗一 Raf _ 1ァプタマ一)の 90番目(全長 100ヌクレ ォチド)に導入し、この蛍光色素を導入した RNAァプタマ一と種々の濃度の Raf _ 1 タンパク質を混ぜ、この溶液をニトロセルロースフィルターに通すことにより、タンパク 質をニトロセルロースに吸着させ、そのタンパク質に結合した RNAァプタマ一の蛍光 を測定することにより、タンパク質の量を測定し、解離定数を求めることができた。これ は、従来のラジオアイソトープで RNAを標識する方法に代わる簡便な方法である。
[0137] 実施例 15 テオフィリンに特異的に結合するアブタマ一への蛍光色素 結合 Vの
MA
1 )本実施例では、本発明の部位特異的な蛍光標識の可能性を調べるために、気 管支拡張剤テオフィリン (非特許文献 37、 41 -46)に特異的に結合する別のァプタ マーに、蛍光色素 結合 yを導入した(図 9a)。 RNA分子中の特異的な位置の蛍光 色素は、蛍光強度における変化を測定することによって立体構造の変化を検出する ために、あるいは、標的分子を検出するために有用である。
[0138] テオフィリンの結合により、 RNAァプタマ一中に特有の構造モチーフが生じる(図 9 b)。複合体では、 2組のトリプレット、即ち、 U6 _ U23 _A28 (図 9c)及び A7— C8 一 G26、並びに 2組の独立した塩基、即ち、 C22及び U24力 テオフィリンを囲み、 高度に特異的なリガンド結合部位を形成する。し力 ながら、この部位は、リガンドが 存在しない場合、安定しては形成されなレ、 (非特許文献 37、 41—46)。非特許文献 37は、蛍光アデニン類似体、 2—ァミノプリンをァプタマ一の C27に導入し、ァプタマ
一とテオフィリンとの結合様式について、ストップトフロー蛍光スぺクトノレによる解析を 報告している。
[0139] 本発明者らは、アブタマ一配列内の適当な部位を蛍光色素 結合 yで置換し、蛍 光強度における変化をモニターすることで、テオフィリンとの結合を検出した。以下、 具体的に説明する。
[0140] 2)先ず、蛍光色素—結合 yの導入のための、テオフィリン結合性ァプタマ一内の適 当な部位を決定するために、ァプタマ一の結合モチーフ内の U6、 U23又は U24を それぞれ、非修飾 yで置換した場合の効果を調べた。 yを有する各アブタマ一(41ヌ クレオチド)は、 sを含む铸型 DNAを用いて、 yTP存在下で T7転写を行い、調製され た。 (図 10a)。ァプタマ一への yの部位特異的な導入は、 2次元 TLCを用いたヌクレ ォチド組成分析により確認された(図 1 Oc)。
[0141] アブタマ一のテオフィリン結合に関する解離定数 (Kd)を、公知の平衡濾過アツセィ 法(非特許文献 41)によって、 lOOmM HEPES (pH7. 3)、 50mM NaCl及び 5 mM MgClを含む溶液中で、 3H—標識テオフィリンを用いて測定した。 U23及び U
2
24での yによる置換は、元のァプタマ一の結合能力(Kd= 331 ± 16nM)と比較して 、ァプタマ一の結合能力を有意に減少させた(Kd> 1500nM)。 U23の置換につい ては、 U23の 4—ケト基力 塩基のトリプレットにおいて U6と A28の双方と水素結合 を形成する。非天然型塩基 yは Uの 4 ケト基を欠くため、 U23を yで置換すると、結 合に好ましくない影響を与えうると考えられる。一方、 U24の 4ーケト基が他の塩基や テオフィリンと直接相互作用していることは NMRによる解析では観察されなかったが 、 U24の 3位の窒素原子は、テオフィリンと水素結合を形成している。したがって、 U2 4の 4—ケト基が結合モチーフの形成に重要な役割を果たしており、そして、 U24が 実際に、アブタマ一構造における金属結合及び U ターン形成 (非特許文献 42、 4 4)に関与していることが、 U24を yに置換することにより、示唆された。
[0142] 一方、 U6を yで置換したァプタマ一は、解離定数 217 ± 13nMで、元のァプタマ一 に遜色なぐテオフィリンに結合した。このことは、 U6の 4_ケト基を除いても、ァプタ マーの結合能力には悪い影響を与えないことを示唆する。実際、この 4—ケト基はァ プタマ一中の U6— U23—A28塩基のトリプレットに関与していなレ、(非特許文献 42
, 43)。さらに、 5—フエ二ルェチ二ルー 2—ォキソ(1Η)ピリジン (Ph—y) (非特許文 献 38)及び 5 ョードー 2 ォキソ(1H)ピリジン(I—y) (非特許文献 22)などの、 5— 修飾 yを、 U6の代わりに導入しても、アブタマ一は結合能力を維持した(Ph— y置換 ίこつレヽて、 Kd= 536 ±42nM、そして、 I_y置換【こつレヽて、 Kd= 551 ± 68nM、表 4及び図 11)。
[0143] 表 4 修飾— yを有する RNAァプタマ一のテオフィリン結合能
[0144] [表 4]
[0145] a : テオフィリン結合の解離定数は、 —標識テオフィリン(20nM)及び種々の R NA濃度(25— 1500nM)を用いた平衡濾過アツセィで測定した。
[0146] b : 蛍光強度変化から求めたテオフィリン結合の平衡定数は、種々のテオフィリン 濃度(0— 20 μ Μ)での、蛍光色素一結合 yを有する RNAアブタマ一(ΙΟΟηΜ)の 蛍光測定により決定された。
[0147] U6を yで置換したァプタマ一の Kd値(Kd = 217 ± 13nM)は、非修飾ァプタマ一 の Kd値 (Kd= 331 ± 16nM)よりも若干低かった。従って、 U6を yで置換してもテオ フィリンを結合するために必須な塩基トリプレットの形成が可能であり、 U6は、蛍光色 素 結合 yの導入のために適した部位である。
[0148] 3)本発明者は、 sを有する铸型 DNAを用い T7転写によって、 U6の部位に short FAM— y、 FAM— y、又は TAMRA— yを有するァプタマ一を調製し、テオフィリン の結合を調べた。 short FAM— y及び FAM— yを有するァプタマ一の3 H—標識テ オフィリンへの結合の Kd値は、約 200nM (表 4)であり、これは、元のァプタマ一や U 6を yで置換したァプタマ一のそれと同一である。
[0149] 本発明者らは次いで、 FP— 6500蛍光測定装置を用いて、テオフィリンの存在下又 は非存在下でのァプタマ一の蛍光強度を測定した。 short FAM_y、 FAM_y又 は TAMRA_yを有するァプタマ一の蛍光強度は、テオフィリンの量に依存して増加 し、そして、テオフィリンの飽和濃度(5— 20 μ Μ)の添カ卩によって倍増した(図 12)。
[0150] TAMRA_yを有するァプタマ一の3 Η_標識テオフィリンへの結合の Kd値は非常 に高ぐテオフィリンとの結合が弱いことが示唆された力 テオフィリンの濃度を増加さ せるにつれて、アブタマ一の蛍光強度は増加した(図 12d)。これらの蛍光強度の変 ィ匕は、標的物質であるテオフィリンとの結合により、アブタマ一の構造変化が生じたた めと考えられる。テオフィリンの非存在下において、蛍光残基はァプタマ一の構造の 内部に存在して、近傍の塩基との重なりなどにより、蛍光強度が減少していると考えら れる。テオフィリン存在下では、アブタマ一がテオフィリンと結合することにより、蛍光 残基が外部に押し出され、溶媒にさらされて塩基による消光作用が減少し、蛍光強 度が増加したと考えられる。
[0151] アブタマ一の蛍光強度変化から得られる平衡定数(「Kf」によって表す)(図 12及び 表 4)は、 3H—標識テオフィリンを用いて得られる解離定数 (Kd)と若干相違した。 sh ort FAM— y及び FAM— yを有するァプタマ一の場合、 Kf値は、対応する Kd値よ りも大き力、つた。このことは、約 0. 2-0. 5 μ Μの濃度でテオフィリンが結合した場合 、蛍光色素はまだ構造の内部で近傍の塩基と重なっていることを示唆する。対照的 に、 TAMRA_yを有するァプタマ一の Kf値は Kd値の 2分の 1であった。理論に束 縛されるわけではないが、これは、 TAMRAのジメチルァミノ基が立体障害となり、テ オフィリンとの弱い相互作用によっても TAMRA残基がァプタマ一の構造の内部から 外部へ押し出されやすくなり、また同時にテオフィリン結合能力の低下を引き起こした ことによると考えられる。いずれの場合も、ァプタマ一の Kf値は、テオフィリンの特定
の濃度によって誘導される蛍光残基の環境変化に依存する。よって、 Kf値もァプタ マーのセンサーとしての検出感度を評価するに、実際に有用である。
[0152] 蛍光標識アブタマ一は、テオフィリンに対するその高い特異性を保持している。ァ プタマーの蛍光強度は、構造的にテオフィリンと類似するカフヱイン(20 μ Μ)の存在 下でも増加されなレ、(図 12a、 c及び d)。特に、 short FAM_yで標識したァプタマ 一は、 20 μ Mカフヱインの添カ卩によっても蛍光強度の有意な変化は観察されなかつ た(図 12a)。
[0153] 本発明の方法の感度は、従来のモジュラーァプタマ一センサー及び蛍光分子スィ ツチ(非特許文献 47— 48)よりも、非常に高いものである。従来技術において、テオ フィリン結合性ァプタマ一の C27の部位へ、別の蛍光色素、 2—ァミノプリンを導入し た場合も、プローブとして有用であった(非特許文献 37)が、 2—ァミノプリンを有する アブタマ一の調製は、化学合成を必要とする。本発明の、非天然型塩基対を利用し た転写系は、所望の位置に蛍光プローブを有する RNA分子を調製するための簡便 な方法である。そして、本発明によって提供される、部位特異的に標識された蛍光色 素 結合 y塩基は、その標的分子の選択的かつ効率的な検出を可能にするもので ある。
[0154] 本実施例において、「T7転写による、 yまたはその 5 修飾塩基 (類)のテオフィリン 結合性アブタマ一への部位特異的導入」、「平衡濾過アツセィ」及び「蛍光測定」は、 具体的には以下のように行った。
[0155] T7転写による、 Vまたはその 5 修飾塩某(類)のテオフィリン結合件ァプタマ一へ の部位特異的導入
sを有する化学的に合成された二本鎖錡型 DNAを用いて、 y又はその修飾塩基 (P h— y、 I y及び蛍光色素—結合 y)を、 6U、 23U又は 24Uの代わりに導入した。
[0156] sを含む铸型の配列は、図 10A及び配列番号 7に記載した通りである。
[0157] 図 10Aにおける RNAァプタマ一(41ヌクレオチド)(配列番号 8)中の番号付けは、 非特許文献 43に記載された 33ヌクレオチドからなるアブタマ一の番号付けと対応さ せた。錡型(59ヌクレオチド コード DNA及び 59ヌクレオチド非コード DNAの 10 μ Μ)を、 lOmM Tris -HCl (pH7. 6)及び lOmM NaClを含む緩衝液中で、 95°C
で加熱し、そしてゆつくりと 4°Cまで冷却することによってァニールさせた。
[0158] 転写は 20 β 1スケールで行い、反応組成は、 40mM トリスー塩酸緩衝液(ρΗ8 · 0 )、 24mM MgCl、 2mM スペルミジン、 5mM DTT、 0. 01 %TritonX— 100、
2
ImM 天然型ヌクレオチド(NTP)および ImM yTP若しくは ImM Ph _yTP若し くは 0. 25mM I -yTP, 2 μ Ci [ひ一32 P] ATP、 2 μ Μ 铸型 DNAおよび 2. 5単位
/ μ 1の Τ7 RNAポリメラーゼ(Takara、 Kyoto)である。
[0159] 37°Cで 6時間インキュベーションの後、等量の染色溶液の添カ卩によって反応を終 了させた。反応混合物を 75°Cで 3分加熱し、そして、 41ヌクレオチドの転写産物をゲ ル電気泳動によつて精製した。
[0160] 平衡濾渦アツセィ
特定部位に y又はその 5 _修飾塩基を有する RN Aァプタマ一によるテオフィリンと の結合を、平衡濾過アツセィ(非特許文献 41)によって分析した。種々の濃度のアブ タマ一を含む溶液(54 μ 1、 l OOmM Hepes (pH7. 3)、 50mM NaCl及び 5mM MgCl中、 25— 1500nM)を、 6 μ 1の 200nM 3H—標識テオフィリン溶液(Mora
2
vek)と混合し、そして混合物を 25°Cで 5分間インキュベートした。次いで、混合物を Microcon YM— 10濾過装置(Amicon)に装填し、そして濃縮した。濾液の 10 /i 1 試料を回収し、そして、シンチレーシヨンカウンターで放射活性を測定した。各 RNA ァプタマ一に対するテオフィリン結合の比率は、 RNAの存在下及び非存在下で得ら れた濾液中のテオフィリンの濃度の差から決定された。テオフィリン結合に関する解 離定数(Kd)は、以下の式を用いた KALEIDAGRAPHプログラムによって決定した
[0161] 式: y = M X M Z (M + M )
0 1 0 2
[ここにおいて、
yは、テオフィリン結合の比率であり;
Mは、 RNA濃度であり;
0
Mは、テオフィリンの結合容量であり;そして、
1
Mは、 Kdである]。
2
[0162] 泡 I定
U6の代わりに short FMA— y、 FAM— y又は TAMRA— yを有する各テオフイリ ン結合性ァプタマ一の蛍光プロフィールは、テオフィリン(0— 20 /i M)又はカフエイ ン(20 /i M)の存在下で、 FP— 6500蛍光測定装置 iASCO)を用いて 25°Cで測定 された。蛍光スペクトル測定では、 Ι ΟΟηΜの濃度のァプタマ一も用レ、、励起波長は 5 nmスペクトルバンド幅で 434nm (short FAM _y若しくは FAM _yを有するァプタ マー)、又は 500nm (TAMRA_yを有するァプタマ一)に設定した。
[0163] 各修飾アブタマ一の平衡蛍光強度から決定される、 Kf値は、以下の式を用いた K ALEIDAGRAPHプログラムによつて得られた。
[0164] 式: y= l + C X C
0 1 Z(C + C )
0 2
[ここにおいて、
yは、 FAMについては 522nmであり、そして TAMRAについては 578nmにおけ る相対蛍光強度(テオフィリン非存在下での蛍光強度を「1」と設定する)であり; Cは、テオフィリン濃度であり;
0
Cは、テオフィリンの飽和濃度における相対的増加値に該当し;そして、
1
Cは、 Kfである]。