KR20230157386A - N-(2-아미노에틸)모르폴린-기반 rna 유사체, 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 주제는 하기 화학식 1의 RNA 유사체, 이의 제조, 및 특히 현미경 관찰, 유전자 발현 과정의 연구, 및 효소 활성의 모니터링에서의 용도이다:
화학식 1
여기서 R1은 (올리고)뉴클레오티드 함유 기이고, R2는 핵염기이고, R3은 작용기이다.
화학식 1
여기서 R1은 (올리고)뉴클레오티드 함유 기이고, R2는 핵염기이고, R3은 작용기이다.
Description
RNA 분자의 선택적 공유 변형 방법은 RNA의 검출, 국소화, 단리 및 서열 분석, 유전자 발현 과정 연구, 면역 체계, 세포 발달 또는 분자 역학을 포함하여 많은 응용 분야를 가지고 있다. 원하는 효과와 채택된 실험 전략에 따라 RNA 변형 방법에는 촉매 핵산(DNAzyme 또는 RNAzyme)과의 반응에 의한 변형, 효소 반응에 의한 변형, 및 화학 반응에 의한 변형 중 하나가 사용될 수 있다. DNAzyme 및 RNAzyme과 같은 촉매 핵산은 서열 덕분에 주어진 화학 반응을 촉매할 수 있는 (종종 합성)분자이다. 10DM24, FH14 또는 FJI와 같은 DNAzyme 및 RNAzyme은 기능화된 뉴클레오티드 유사체의 5' 트리포스페이트 기를, 표적 RNA 서열에 함유되고 촉매적 핵산 서열에 의해 정의된 아데노신의 2'-하이드록실 기와 반응시켜 2'-5'-포스포디에스테르 결합을 생성시킴으로써 RNA를 변형시킨다[1-4]. 대안적으로, 폴리머라제 활성을 갖는 리보자임으로 표적 RNA 또는 DNA의 말단 뉴클레오티드의 3'-하이드록실 기를 변형시키는 것이 가능하다[5]. 리가제, 폴리머라제 또는 트랜스퍼라제와 같은 효소를 사용하여 효소 반응에 의해 RNA를 선택적으로 변형시킬 수 있다. 효소는 천연 기질 또는 보조 인자의 기능화된 유사체를 사용하여 반응을 수행한다. 박테리오파지 T4 RNA 리가제를 사용하면 표적 RNA의 3'-OH 기와 작용화된 5',3'- 뉴클레오티드 디포스페이트(PNP) 유사체의 5'-포스페이트 기 사이에 포스포디에스테르 결합을 생성시킬 수 있다[6-7]. 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제 또는 폴리A 폴리머라제와 같은 RNA 폴리머라제는 기능화된 뉴클레오티드 트리포스페이트 유사체를 사용하여 표적 RNA의 말단 영역(5' 또는 3' 단부의) 또는 내부 뉴클레오티드를 변형되게 한다[8-12]. 트랜스퍼라제 기 중 가장 통상적으로 사용되는 것은 Ecml과 같은 메틸트랜스퍼라제이며, 이는 보조 인자인 S-아데노실메티오닌(SAM)의 기능화된 유사체를 사용하여 표적 RNA 내의 구아노신의 N2 위치, 구아노신의 N7 위치, 아데노신의 N6 위치 및 3'-하이드록실을 변형시킨다[13].
화학 반응에 의해 RNA를 변형시키기 위해서, 질소함유 염기(nitrogenous base) 상의 2'- 및 3'-하이드록실 기, 아미노, 아미드, 이미노, 카르보닐 및 에놀 기, 또는 포스페이트 기와 같은 본래적으로 발생하는 작용기를 사용할 수 있다. 선택적인 화학 반응을 수행하기 위해 이들을 사용하는 것은, RNA의 높은 분자량, 언급된 기 중 다수 기의 유사한 반응성, 및 급격한 조건 하에서 포스포디에스테르 및 N-글리코시드 결합의 분해 가능성으로 인해 어려운 일이다. 이러한 문제는 신속하고 선택적인 화학 반응(생물직교 기(bioorthogonal gorup) 포함)에 참여할 수 있는 비천연 작용기를 도입시킴으로써 제거될 수 있다. 비천연 작용기를 화학적 핵산 합성, 예를 들어 포스포아미다이트 화학을 사용한 고상 합성(solid phase synthesis) 과정에서 도입시킬 수 있다. 이 접근법의 주요 한계는 생성되는 폴리뉴클레오티드 쇄의 길이 제한이다. 100개가 넘는 뉴클레오티드 길이의 DNA와 RNA 분자를 합성하는 것은, 200개 뉴클레오티드 길이의 RNA를 화학적으로 합성하는 것이 사실상 불가능할 정도로 어려운 일이다. 따라서 지금까지는 더 큰 RNA 분자, 예를 들어 200-10,000개 뉴클레오티드 길이의 단백질-암호화 RNA(mRNA)를 변형시키기 위해 효소적 또는 화학효소적 방법만이 사용되어 왔다.
독특한 RNA 변형 방법은 메타퍼요오드산(metaperiodic acid; HIO4) 염을 사용한 리보스 2',3'-시스-디올의 화학적 산화 및 후속적인 아민화 또는 환원적 아민화 반응에 의존한다. 그 결과, RNA의 3'-말단 리보스는 디하이드록시모르폴린 또는 모르폴린 유사체로 전환되는데, 이는 아민화 또는 환원적 아민화에 사용되는 아민 유도체의 구조에 따라 서로 다른 작용기를 가질 수 있다(도 1A). 이 접근법은 히드라진 유사체 및 지방족 아민으로 RNA의 3' 말단을 변형시키는 데 사용되었으며[14-21], 반면에 아민 유도체는 히드라진 및 히드라지드 유도체보다 훨씬 낮은 반응성을 나타낸다(도 1B). 따라서, 히드라진 및 히드라지드 유도체는 RNA 3' 단부 변형에 가장 자주 사용되지만, 이들의 합성은 아민의 합성보다 더 까다롭고, 생성된 접합체는 화학적 안정성이 낮다[22].
본 발명의 목적은 RNA 분자의 화학적 변형과 관련된 상술한 문제를 제거하는 방법 및 화합물을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명의 목적은 RNA의 3' 말단에서 리보스의 2',3'-시스-디올을 산화시킴으로써 수득되는 모르폴린 유사체로 이어지는 환원적 아민화에 사용되는 아민 유도체의 낮은 반응성 문제를 해결하는 것이다.
본 발명의 주제는 하기 화학식 1의 RNA 유사체이다:
화학식 1
여기서:
R 1 은 하기와 같고:
하기 화학식 2a의 RNA 쇄:
화학식 2a
여기서:
n은 1 내지 10,000 범위의 자연수이고,
m은 0 내지 3 범위의 자연수이고,
각각의 X1은 OH 또는 OCH3 중에서 독립적으로 선택된다, 또는
하기 화학식 2b의 RNA 쇄:
화학식 2b
여기서:
n은 1 내지 10,000 범위의 자연수이고,
각각의 X1은 OH 또는 OCH3 중에서 독립적으로 선택되고,
X2는 N3 또는 기임; 또는
하기 화학식 2c의 RNA 쇄:
화학식 2c
여기서:
n은 1 내지 10,000 범위의 자연수이고,
m은 1 내지 4 범위의 자연수이고,
각각의 X1은 OH 또는 OCH3 중에서 독립적으로 선택되고,
X2 및 X3은 독립적으로: OH, OCH3,
또는 임;
각각의 R 2 는 바람직하게는
로부터 선택된, 천연 또는 변형된 퓨린 또는 피리미딘 질소함유 염기 중에서 독립적으로 선택되고,
R 3 은 하기를 포함하는 작용기이고:
하기 화학식 3a의 생물직교 기:
화학식 3a
여기서
Y는 NH2, N3 또는 기임; 또는
하기 화학식 3b의 시아닌 기로부터의 형광단(fluorophore)의 구조를 갖는 치환체:
화학식 3b
여기서
Y1 및 Y2는 독립적으로 CH3, (CH2)3SO3H 또는 (CH2)4SO3H이고,
Z1 및 Z2는 독립적으로 SO3H 또는 H임; 또는
하기 화학식 3c의 로다민 또는 플루오레세인 기로부터의 형광단의 구조를 갖는 치환체:
화학식 3c
여기서
Y1 및 Y2는 독립적으로 SO3H, OCH3, OH, COOH 또는 H이고,
Z1 및 Z2는 독립적으로 NH 또는 O이고,
Z3은 NH2 또는 OH 기임; 또는
하기 화학식 3d의 로다민 기로부터의 형광단의 구조를 갖는 치환체:
화학식 3d
여기서
Y1 및 Y2는 독립적으로 SO3H, OCH3, OH, COOH 또는 H이고,
Y3은 CH2CH3, CH3 또는 H 기이고,
Z1 및 Z2는 독립적으로 NH 또는 O이고,
Z3은 NH2 또는 OH기임; 또는
하기 화학식 3e의 친화성 태그 구조(affinity tag structure)를 갖는 치환체:
화학식 3e
, 또는
하기 화학식 3f의 핵산 구조를 갖는 치환체:
화학식 3f
여기서
각각의 Y는 OCH3, OH 또는 H 중에서 독립적으로 선택되고,
n은 1 내지 30의 자연수이고,
R2는 상기와 같은 질소함유 염기임; 또는
하기 화학식 3g의 핵산 구조를 갖는 치환체:
화학식 3g
여기서
각각의 Y는 OCH3, OH 또는 H 기 중에서 독립적으로 선택되고,
m은 1 내지 4 범위의 자연수이고,
n은 1 내지 30 범위의 자연수이고,
R2는 상기와 같은 질소함유 염기임; 또는
하기 화학식 3h의 핵산:
화학식 3h
여기서
각각의 Y는 OCH3, OH 또는 H 기 중에서 독립적으로 선택되고,
m은 1 내지 4 범위의 자연수이고,
n은 1 내지 30 범위의 자연수이고,
R2는 상기와 같은 질소함유 염기임;
상기 화학식 (3a 내지 3h)에서 X는 하기 기 중 임의의 기 또는 이들 중 다수의 일련의 조합인 화학식의 링커이다:
;
여기서 m은 1 내지 10 범위의 자연수이다.
본 발명의 또 다른 목적은
하기 화학식 4의 RNA의 용액:
화학식 4
을 연속적으로
(i) 메타퍼요오드산 HIO4, 이의 염, 메타퍼요오드산 HIO4 또는 이의 염의 용액과 배양(incubation)하여 하기 화학식 5의 화합물을 제공하고:
화학식 5
(ii) 환원 매질에서 하기 화학식 6의 에틸렌디아민 유사체와 배양하여:
화학식 6
하기 화학식 1의 RNA 유사체를 제공하는 것
을 특징으로 하는, 상기 정의된 바와 같은 화학식 1의 RNA 유사체를 제조하기 위한 방법이다:
화학식 1
상기 화학식들에서 R1, R2 및 R3 기의 의미는 청구항 1에 정의된 바와 같다.
바람직하게, 단계 (i) 및 (ii)를 하나의 반응기에서 수행한다.
바람직하게, RNA는 하기와 같다:
하기 화학식 4a의 화합물:
화학식 4a
여기서
n은 1 내지 10,000 범위의 자연수이고,
m은 0 내지 3 범위의 자연수이고,
각각의 X1은 OCH3 또는 OH 중에서 독립적으로 선택된다, 또는
하기 화학식 4b의 화합물:
화학식 4b
여기서
n은 1 내지 10,000 범위의 자연수이고,
각각의 X1은 OH 또는 CH3 기 중에서 독립적으로 선택되고,
X는 N3 또는 기임; 또는
하기 화학식 4c의 화합물:
화학식 4c
여기서
n은 1 내지 10,000 범위의 자연수이고,
m은 1 내지 4 범위의 자연수이고,
각각의 X1은 OH 또는 OCH3 중에서 독립적으로 선택되고,
X2 및 X3은 독립적으로 OH, OCH3,
또는 이다.
바람직하게는, 단계 (i)를, 바람직하게는 1.0 내지 1.5 mM 농도의 NaIO4의 존재 하에 40℃ 미만의 온도 및 1 내지 100 μM의 RNA 농도에서 수행한다.
바람직하게는, 단계 (ii)를, 바람직하게는 pH 5.5-7.5의 KH2PO4 완충제(buffer), 100 mM을 초과하지 않는 농도, 바람직하게는 20 mM 농도의 NaBH3CN 환원제, 및 1-10 mM 농도의 에틸렌디아민 유사체의 존재 하에서 수행한다.
바람직하게는, 수득된 RNA 유사체를 공지된 RNA 단리 방법에 의해, 바람직하게는 알콜 중에서 RNA 염의 침전에 의해 또는 HPLC에 의해 반응 혼합물로부터 단리한다.
본 발명의 또 다른 목적은 하기 화학식 7의 에틸렌디아민 유사체이다:
화학식 7
여기서
R은 하기와 같고:
하기 화학식 7a의 시아닌 기로부터의 형광단의 구조를 갖는 치환체:
화학식 7a
여기서
Y1 및 Y2는 독립적으로 CH3, (CH2)3SO3H 또는 (CH2)4SO3H이고,
Z1 및 Z2는 독립적으로 SO3H 또는 H임; 또는
하기 화학식 7b의 로다민 또는 플루오레세인 기로부터의 형광단의 구조를 갖는 치환체:
화학식 7b
여기서
Y1 및 Y2는 독립적으로 SO3H, OCH3, OH, COOH 또는 H이고,
Z1 및 Z2는 독립적으로 NH 또는 O이고,
Z3은 NH2 또는 OH 기임; 또는
하기 화학식 7c의 로다민 기로부터의 형광단의 구조를 갖는 치환체:
화학식 7c
여기서
Y1 및 Y2는 독립적으로 SO3H, OCH3, OH, COOH 또는 H이고,
Y3은 CH2CH3, CH3 또는 H 기이고,
Z1 및 Z2는 독립적으로 NH 또는 O이고,
Z3은 NH2 또는 OH 기임; 또는
하기 화학식 7d의 친화성 태그 구조를 갖는 치환체:
화학식 7d
또는
하기 화학식 7e의 핵산 구조를 갖는 치환체:
화학식 7e
여기서
Y는 독립적으로 OCH3, OH 또는 H 기이고,
n은 1 내지 30 범위의 자연수이고,
R2는 상기와 같은 질소함유 염기임; 또는
하기 화학식 7f의 핵산 구조를 갖는 치환체:
화학식 7f
여기서
각각의 Y는 OCH3, OH 또는 H 기 중에서 독립적으로 선택되고,
m은 1 내지 4 범위의 자연수이고,
n은 1 내지 30 범위의 자연수이고,
R2는 상기와 같은 질소함유 염기임; 또는
하기 화학식 7g의 핵산 구조를 갖는 치환체:
화학식 7g
여기서
각각의 Y는 OCH3, OH 또는 H 기 중에서 독립적으로 선택되고,
m은 1 내지 4 범위의 자연수이고,
n은 1 내지 30 범위의 자연수이고,
R2는 상기와 같은 질소함유 염기임;
상기 화학식 (7a 내지 7g)에서 X는 하기 기 중 임의의 기 또는 이들 중 다수의 일련의 조합인 화학식의 링커임:
여기서 m은 1 내지 10 범위의 자연수이다.
바람직하게, 본 발명에 따른 에틸렌디아민 유사체는 하기 화학식의 화합물로부터 선택된다:
.
상기 개시된 N-(2-아미노에틸)모르폴린-기반 RNA 유사체는 핵산 분자(선형 뉴클레오티드 중합체, 폴리뉴클레오티드)의 유사체이며, 여기서 상기 뉴클레오티드(단량체) 중 하나는 독특한 N-(2-아미노에틸)모르폴린 모이어티(화학식 1에 따른)로 대체된다. 상기 모이어티는 3개의 주요 치환체(화학식 1에 따른 R1, R2 및 R3): RNA 쇄(R1), 질소함유 염기(R2) 및 기능적 치환체(R3)를 갖는다. RNA 쇄(화학식 1에 따른 R1)는, 단량체(리보뉴클레오티드)가 포스포디에스테르 결합에 의해 질소함유 염기에 연결되고 이웃하는 단량체의 당 잔기에 연결된 펜토스(당 잔기)로 구성된다. 치환체(R1)는 화학적 합성(예를 들어 포스포아미다이트 화학을 사용하는 고상 합성)뿐만 아니라 효소적 합성(예를 들어 RNA 폴리머라제에 의해 촉매화된 전사 반응)으로부터 유도될 수 있으며, 따라서 치환체(R1)는 광범위한 중합도(1 내지 10,000 뉴클레오티드)를 갖는 RNA 쇄, 또는 당 잔기 또는 질소함유 염기 영역에 변형을 함유하는 RNA 쇄를 포함한다. 또한, 치환체(R1)는 말단 뉴클레오티드 영역(5' 단부)에 천연 및 비천연 변형을 함유하는 다양한 구조의 RNA 쇄, 예를 들어 5'-하이드록실, 포스페이트, 아지드, 아미노 및 뉴클레오시드 기(화학식 2a-2c)(이들의 존재는 N-(2-아미노에틸)모르폴린-기반 RNA 유사체의 화학적 및 생물학적 특성 영역에 영향을 미친다)를 포함한다. 질소함유 염기(화학식 1에 따른 R2)는 피리미딘 및 퓨린 부류로부터의 헤테로사이클릭 유기 화합물이며, 이것은 당 잔기와 함께 N-글리코시드 결합(아데노신, 구아노신, N6-메틸아데노신, N7-메틸구아노신, 이노신, 유리딘, 5-메틸유리딘, 시티딘 및 5-메틸시티딘의 경우에서와 같이) 또는 C-글리코시드 결합(슈도유리딘 및 1-메틸슈도유리딘의 경우에서와 같이)에 의해 뉴클레오시드 잔기를 형성한다. 기능적 치환체(화학식 1에 따른 R3)는 링커(화학식 3a-3e에 따른 치환체 X)에 의해 RNA 유사체의 N-(2 아미노에틸)모르폴린 기에 연결된 작용기 또는 모티프(motif), 특히 생물직교 기, 형광단, 친화성 태그 또는 핵산 모티프(화학식 3a-3e에 따른)이다. 작용기 또는 모티프의 존재는 N-(2-아미노에틸)모르폴린-기반 RNA 유사체의 화학적, 분광학적 및 생물학적 특성에 중요하다. 생물직교 작용기(화학식 3a에 따른), 예를 들어 아지드, 알킨 또는 아민의 존재는, 선택적 CuAAC 반응, SPAAC 반응, NHS 에스테르와의 반응, 또는 천연 핵산에서 발견되는 화학기를 수반하지 않는 다른 반응을 수행할 수 있게 한다. 예를 들어 시아닌, 로다민 또는 플루오레세인(화학식 3b-3c에 따른)의 기로부터의 형광단의 구조를 갖는 기능적 모티프의 존재는, 예를 들어 현미경 관찰 또는 핵산분해 효소의 활성 연구에서, 형광 탐침으로서 N-(2 아미노에틸)모르폴린-기반 RNA 유사체의 사용을 가능하게 하는 형광 특성을 제공한다. 비오틴과 같은 친화성 태그 구조(화학식 3d에 따른)를 갖는 기능적 모티프의 존재는 스트렙트아비딘, 아비딘 및 이의 유사체와 같은 결합 단백질에 의한 N-(2-아미노에틸)모르폴린-기반 RNA 유사체의 결합 및 친화성 탐침으로서 RNA 유사체의 사용을 허용한다. 핵산 구조(화학식 3e에 따른)를 갖는 기능적 모티프는 상기 모티프의 올리고뉴클레오티드 서열과 함께 RNA 쇄의 구조 중에 존재하는 N-(2-아미노에틸)모르폴린-기반 RNA 유사체의 폴리뉴클레오티드 서열을 연장시킨다. 링커(화학식 3a-3e에 따른 치환체 X)는 단순한 화학기의 일련의 조합이다. 상기 링커의 길이 및 구조는 작용기 또는 모티프의 특성뿐만 아니라, 전체로서 N-(2-아미노에틸)모르폴린 RNA 유사체의 특성에 약간의 영향을 미친다.
N-(2-아미노에틸)모르폴린-기반 RNA 유사체를 수득하는 방법은 RNA와 같은 핵산(화학식 4에 따른)에 2개의 후속적인 화학 반응을 가하는 것이다. 단계 (i)에서, RNA의 시스-디올 기를 메타퍼요오드산(또는 이의 염)과 반응시켜, 디알데히드(화학식 5에 따른)를 형성시킨다. 단계 (ii)에서, 상기 생성된 디알데히드를 환원 매질 중에서 에틸렌디아민 유사체(화학식 6에 따른)와 추가로 반응시켜, N-(2-아미노에틸)모르폴린-기반 RNA 유사체를 생성시킨다. 상기 두 단계 모두 수성 환경에서 수행하며 하나의 반응기에서 수행할 수 있다. 더욱 또한, 단계 (i)를 하기의 조건을 사용하여 효율적이고 선택적으로 수행한다: 낮은 퍼요오데이트 농도(1.0-1.5 mM), 넓은 범위의 RNA 농도(1-100 μM), 및 낮은 온도(40℃ 미만). 단계 (ii)는 하기의 조건 하에서 최적이다: 완충된 용액(5.5-7.5 범위의 pH)에서 과잉의 에틸렌디아민 유사체(예를 들어 1-10 mM의 농도)의 존재 하에 선택적인 환원적 아민화의 진행을 허용하는 환원 매질 중에서(예를 들어 20-100 mM 농도의 나트륨 시아노보로하이드라이드의 존재 하에서). 단계 (ii)는 유기 용매의 임의 첨가로 수행하여 에틸렌디아민 유사체의 용해도(예를 들어 수:DMSO 4:1 v/v 혼합물에 대한)를 증가시킬 수 있다. N-(2-아미노에틸)모르폴린-기반 RNA 유사체의 제조를 위한 최적 조건은 높은 중합도(30 뉴클레오티드 초과)로 RNA 기질을 사용하는 효율적인 합성에 중요하다. 상기 생성되는 N-(2-아미노에틸)모르폴린-기반 RNA 유사체를 통상적인 방법, 예를 들어 크로마토그래피 방법, 핵산 염 침전, 또는 상업적으로 입수할 수 있는 핵산 단리 키트에 의해 반응 혼합물로부터 단리할 수 있다. 상기 RNA 기질(화학식 4에 따른)은 N-(2-아미노에틸)모르폴린-기반 RNA 유사체의 3개의 주요 치환체 중 2개의 전구체: RNA 쇄(화학식 1에 따른 R1) 및 질소함유 염기(화학식 1에 따른 R2)인 치환체(화학식 4에 따른 R1 및 R2)를 함유한다. 따라서, 상기 기질의 RNA 및 질소함유 염기는 생성물의 RNA 쇄 및 질소함유 염기와 유사한 구조 및 특성을 가지며, 상기 RNA 기질은 예를 들어 리보스 구조(화학식 4a-4c)의 일부로서 적어도 하나의 시스-디올 모이어티를 함유해야 한다. 에틸렌디아민 유사체(화학식 6에 따른)는 RNA 유사체의 N-(2-아미노에틸)모르폴린 모이어티의 3개의 주요 치환체 중 하나인 작용기(화학식 1에 따른 R3)의 전구체인 치환체(화학식 6에 따른 R3)를 함유한다. 따라서, 상기 에틸렌디아민 유사체의 작용기는 RNA 유사체의 작용기와 유사한 구조 및 특성을 갖는다.
에틸렌디아민의 유사체(화학식 7에 따른)를 N-(2-아미노에틸)모르폴린 RNA 유사체의 합성에 시약으로서 사용할 수 있다. 이것은 링커(화학식 7a-7d에 따른 치환체 X)에 의해 연결된 반응성 에틸렌디아민 모티프(H2N-(CH2)2-NH-CH2-R) 및 기능적 모티프(예를 들어 화학식 7a-7d에 따른 형광단, 친화성 태그 또는 핵산 모티프)를 함유한다. 반응성 에틸렌디아민 모티프의 존재는 N-(2-아미노에틸)모르폴린-기반 RNA 유사체의 제조 공정의 단계 (ii) 동안 발생하는 반응의 속도 및 선택성에 비추어 중요하다. 구조적으로 유사한 모티프, 예를 들어 (H2N-(CH2)2-NH-CO-R) 또는 (H2N-(CH2)3-NH-CH2-R)를 함유하는 화합물은 본 발명에 따른 상기 기재된 방법에 의해 RNA 유사체를 효율적으로 수득하는 데 필요한 특성을 갖지 않는다. 상기 에틸렌디아민 유사체의 기능적 모티프(화학식 7a-7d에 따른)는 N-(2-아미노에틸)모르폴린-기반 RNA 유사체 표적의 화학적, 분광학적 및 생물학적 특성에 비추여 핵심적으로 중요하지만, 동시에 에틸렌디아민 유사체의 반응성 또는 상기 RNA 유사체의 제조 단계 중 어느 하나를 붕괴시킬 수 있다. 링커(화학식 7a-7d에 따른 치환체 X)는 단순한 화학기의 일련의 조합이며, 이의 길이 및 구조는 에틸렌디아민 유사체의 반응성 또는 RNA 유사체의 제조 단계 중 어느 하나를 방해하지 않는한, 일반적으로 상기 에틸렌디아민 유사체의 특성에 비추어 그 중요성이 미미하다. 이러한 유형의 에틸렌디아민 유사체를 단일의 선택적이고 효율적인 합성 단계, 예를 들어 기능적 모티프의 아지드 유도체와 N-프로파길에틸렌디아민간의 CuAAC 반응, 또는 NHS 에스테르의 작용성 유도체와 디에틸렌트리아민간의 반응으로 수득할 수 있다.
본 발명의 더 나은 이해를 위해, 본 발명을 구현예와 첨부된 표 및 도면에 예시하였으며, 도면에서:
도 1은 하기를 도시한다: A) 퍼요오데이트 산화 및 후속 아민화 또는 환원적 아민화에 의한 RNA 변형에 대한 일반적인 반응식. R은 기능적 치환체이고, X는 질소함유 염기이고, NA는 핵산이다; B) 선행 기술에 따라 RNA를 변형시키는 데 사용된 아민 유도체의 구조.
도 2는 HPLC로 모니터링한, NaIO4로 산화된 pUUU 트리뉴클레오티드에 대한 본 발명에 따른 환원적 아민화 반응 과정을 도시한다. A) 반응식. B) 메틸아민(참조 반응), 히드라진(참조 반응), 에틸렌디아민(참조 반응) 및 에틸렌디아민 유사체(본 발명에 따른 반응)에 대한 시간의 함수로서의 반응 수율. C) 반응이 2차 반응인 것으로 가정하여 결정된 반응 속도 상수.
도 3은 HPLC로 모니터링한, NaIO4로 산화된 GMP 모노뉴클레오티드에 대한 본 발명에 따른 환원적 아민화 반응 과정을 도시한다. A) 에틸렌디아민에 대한 반응 과정. B) 히드라진의 반응 과정. C) 시스테아민에 대한 반응 과정.
도 4는 RNA 변형을 위해 수득된 본 발명에 따른 에틸렌디아민 유사체의 구조를 도시한다.
도 5는 본 발명에 따른 형광 RNA 표지화 생성물을 도시한다. A-C) Cy3 형광 염료에 의한 A) 35(RNA1 기질, RNA2 생성물), B) 237(RNA10 기질, RNA11 생성물) 또는 C) 2098(RNA24 기질, RNA25 생성물) 뉴클레오티드의 길이를 갖는 RNA의 3' 단부 표지화의 HPLC 크로마토그램(S는 미반응 출발 물질이고, P는 반응 생성물이다). D-F) 각각 염료 Cy5 및 Cy3에 의한 D) 35(RNA3 기질, RNA5 생성물), E) 276(RNA12 기질, RNA14 생성물), 또는 F) 993(RNA16 기질, RNA19의 생성물) 뉴클레오티드의 길이를 갖는 RNA의 5' 및 3' 단부 표지화의 HPLC 크로마토그램(S는 미반응 기질이고, P는 주요 반응 생성물이고, 3 및 5는 각각 3' 또는 5' 단부에서 단일 표지된 중간체이다).
도 6은 FRET 탐침을 사용한 효소 반응 진행의 모니터링을 도시한다. 핵산분해 활성을 갖는 효소의 존재 하에 각각 5' 및 3' 단부에서 Cy5 및 Cy3 염료로 표지된 RNA5(A-D) 및 RNA8(E)의 형광 스펙트럼 변화. Ribolock - 시판되는 선택적 RNase A 억제제. F) 효소 반응이 진행됨에 따른 564 및 667 ㎚에서의 형광 강도의 비.
도 7은 FRET 탐침을 사용한 RNase H 활성의 모니터링을 도시한다. A-D) RNase H 및 탐침 서열에 상보적인 서열을 갖는 다양한 DNA의 부재 및 존재 하의 RNA5 형광 스펙트럼의 변화. E) 시간 경과에 따른 564 및 667 ㎚에서의 형광 강도 비.
도 8은 HeLa 세포에서 형광 mRNA 유사체에 의해 암호화된 유전자의 현미경 관찰 및 발현을 도시한다. A) mRNA(RNA 16-19) 형질감염 후 가우시아 루시페라제(Gaussia luciferase) 활성(발광)의 시간 의존성 및 B) 88시간 배양 후 단백질의 전체 상대적인 활성(평균 2개의 생물학적 복제물). C) GFP 단백질(RNA20-23)을 암호화하는 형광 mRNA 유사체의 형질감염 후 유식 세포분석에 의해 수행된 세포 내 eGFP 단백질과 Cy3 및 Cy5 염료의 형광 강도 측정. D) 형광 mRNA 유사체로 형질감염시킨 후 세포의 공초점 현미경 이미지. 모의 - mRNA 없이 시험; ppp-Ggluc - 번역 불활성 mRNA(RNA15)로 시험; N3-m7Ggluc 및 N3-m7Gegfp - 표지되지 않은 mRNA(RNA16 및 RNA20)로 시험; N3-m7Ggluc-Cy3 및 N3-m7Gegfp-Cy3 - 본 발명에 따른 방법을 사용하여 3' 단부에서 Cy3으로 표지된 mRNA로 시험(RNA17 및 RNA21); N3-m7Ggluc-Cy3 모의 - NaIO4 산화 단계를 생략하고, 본 발명에 따른 방법을 사용하여 3' 단부에서 Cy3으로 표지된 mRNA로 시험(RNA17); Cy5-m7Ggluc 및 Cy5-m7Gegfp - 5' 단부에서 표지된 mRNA로 시험(RNA18 및 RNA22); Cy5-m7Ggluc-Cy3 및 Cy5-m7Gegfp-Cy3 - 본 발명에 따라 수행된 3' 단부에서의 표지화를 포함하여, 5' 및 3' 단부에서 표지화된 mRNA로 시험(RNA19 및 RNA23).
도 9는 RNA6의 화학적 결찰을 도시한다. A) 반응식. B) DNA 존재(AO-D33, 표 3) 또는 DNA 부재(H20) 하에 기질(NR) 및 반응 생성물을 함유하는 폴리아크릴아미드 겔.
표 1은 수득된 RNA의 명칭과 이의 유형 및 변형 방법을 나타낸다: 5' IVT는 전사 반응 동안 RNA의 5' 단부에 도입된 뉴클레오티드 또는 이의 유사체이고; 3' 표지화: 관심 RNA가 본 발명에 따라 Cy3에 의한 3' 단부 표지화 반응을 겪었음을 의미하고; 5' 표지화: 관심 RNA가 Cy5에 의한 5' 단부 표지화 반응을 겪었음을 의미한다. 이중 표지화 생성물(3' Cy3 및 5' Cy5로 동시에)은 Cy3 및 Cy5를 모두 함유한다.
표 2는 표 1의 RNA 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
표 3은 RNA6의 화학적 결찰 동안 사용된 DNA 서열을 나타낸다(도 9).
도 1은 하기를 도시한다: A) 퍼요오데이트 산화 및 후속 아민화 또는 환원적 아민화에 의한 RNA 변형에 대한 일반적인 반응식. R은 기능적 치환체이고, X는 질소함유 염기이고, NA는 핵산이다; B) 선행 기술에 따라 RNA를 변형시키는 데 사용된 아민 유도체의 구조.
도 2는 HPLC로 모니터링한, NaIO4로 산화된 pUUU 트리뉴클레오티드에 대한 본 발명에 따른 환원적 아민화 반응 과정을 도시한다. A) 반응식. B) 메틸아민(참조 반응), 히드라진(참조 반응), 에틸렌디아민(참조 반응) 및 에틸렌디아민 유사체(본 발명에 따른 반응)에 대한 시간의 함수로서의 반응 수율. C) 반응이 2차 반응인 것으로 가정하여 결정된 반응 속도 상수.
도 3은 HPLC로 모니터링한, NaIO4로 산화된 GMP 모노뉴클레오티드에 대한 본 발명에 따른 환원적 아민화 반응 과정을 도시한다. A) 에틸렌디아민에 대한 반응 과정. B) 히드라진의 반응 과정. C) 시스테아민에 대한 반응 과정.
도 4는 RNA 변형을 위해 수득된 본 발명에 따른 에틸렌디아민 유사체의 구조를 도시한다.
도 5는 본 발명에 따른 형광 RNA 표지화 생성물을 도시한다. A-C) Cy3 형광 염료에 의한 A) 35(RNA1 기질, RNA2 생성물), B) 237(RNA10 기질, RNA11 생성물) 또는 C) 2098(RNA24 기질, RNA25 생성물) 뉴클레오티드의 길이를 갖는 RNA의 3' 단부 표지화의 HPLC 크로마토그램(S는 미반응 출발 물질이고, P는 반응 생성물이다). D-F) 각각 염료 Cy5 및 Cy3에 의한 D) 35(RNA3 기질, RNA5 생성물), E) 276(RNA12 기질, RNA14 생성물), 또는 F) 993(RNA16 기질, RNA19의 생성물) 뉴클레오티드의 길이를 갖는 RNA의 5' 및 3' 단부 표지화의 HPLC 크로마토그램(S는 미반응 기질이고, P는 주요 반응 생성물이고, 3 및 5는 각각 3' 또는 5' 단부에서 단일 표지된 중간체이다).
도 6은 FRET 탐침을 사용한 효소 반응 진행의 모니터링을 도시한다. 핵산분해 활성을 갖는 효소의 존재 하에 각각 5' 및 3' 단부에서 Cy5 및 Cy3 염료로 표지된 RNA5(A-D) 및 RNA8(E)의 형광 스펙트럼 변화. Ribolock - 시판되는 선택적 RNase A 억제제. F) 효소 반응이 진행됨에 따른 564 및 667 ㎚에서의 형광 강도의 비.
도 7은 FRET 탐침을 사용한 RNase H 활성의 모니터링을 도시한다. A-D) RNase H 및 탐침 서열에 상보적인 서열을 갖는 다양한 DNA의 부재 및 존재 하의 RNA5 형광 스펙트럼의 변화. E) 시간 경과에 따른 564 및 667 ㎚에서의 형광 강도 비.
도 8은 HeLa 세포에서 형광 mRNA 유사체에 의해 암호화된 유전자의 현미경 관찰 및 발현을 도시한다. A) mRNA(RNA 16-19) 형질감염 후 가우시아 루시페라제(Gaussia luciferase) 활성(발광)의 시간 의존성 및 B) 88시간 배양 후 단백질의 전체 상대적인 활성(평균 2개의 생물학적 복제물). C) GFP 단백질(RNA20-23)을 암호화하는 형광 mRNA 유사체의 형질감염 후 유식 세포분석에 의해 수행된 세포 내 eGFP 단백질과 Cy3 및 Cy5 염료의 형광 강도 측정. D) 형광 mRNA 유사체로 형질감염시킨 후 세포의 공초점 현미경 이미지. 모의 - mRNA 없이 시험; ppp-Ggluc - 번역 불활성 mRNA(RNA15)로 시험; N3-m7Ggluc 및 N3-m7Gegfp - 표지되지 않은 mRNA(RNA16 및 RNA20)로 시험; N3-m7Ggluc-Cy3 및 N3-m7Gegfp-Cy3 - 본 발명에 따른 방법을 사용하여 3' 단부에서 Cy3으로 표지된 mRNA로 시험(RNA17 및 RNA21); N3-m7Ggluc-Cy3 모의 - NaIO4 산화 단계를 생략하고, 본 발명에 따른 방법을 사용하여 3' 단부에서 Cy3으로 표지된 mRNA로 시험(RNA17); Cy5-m7Ggluc 및 Cy5-m7Gegfp - 5' 단부에서 표지된 mRNA로 시험(RNA18 및 RNA22); Cy5-m7Ggluc-Cy3 및 Cy5-m7Gegfp-Cy3 - 본 발명에 따라 수행된 3' 단부에서의 표지화를 포함하여, 5' 및 3' 단부에서 표지화된 mRNA로 시험(RNA19 및 RNA23).
도 9는 RNA6의 화학적 결찰을 도시한다. A) 반응식. B) DNA 존재(AO-D33, 표 3) 또는 DNA 부재(H20) 하에 기질(NR) 및 반응 생성물을 함유하는 폴리아크릴아미드 겔.
표 1은 수득된 RNA의 명칭과 이의 유형 및 변형 방법을 나타낸다: 5' IVT는 전사 반응 동안 RNA의 5' 단부에 도입된 뉴클레오티드 또는 이의 유사체이고; 3' 표지화: 관심 RNA가 본 발명에 따라 Cy3에 의한 3' 단부 표지화 반응을 겪었음을 의미하고; 5' 표지화: 관심 RNA가 Cy5에 의한 5' 단부 표지화 반응을 겪었음을 의미한다. 이중 표지화 생성물(3' Cy3 및 5' Cy5로 동시에)은 Cy3 및 Cy5를 모두 함유한다.
표 2는 표 1의 RNA 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
표 3은 RNA6의 화학적 결찰 동안 사용된 DNA 서열을 나타낸다(도 9).
놀랍게도, RNA의 3' 단부의 반응성을 연구하는 과정에서, 퍼요오데이트로 산화된 리보뉴클레오티드 또는 리보핵산과의 반응에 사용되는 아민 유도체의 구조가 상기 과정의 반응속도와 효율에 상당한 영향을 미친다는 사실이 밝혀졌다. 놀랍게도, 모노뉴클레오티드(GMP)와 트리뉴클레오티드(pU3)를 RNA 모델로 사용하여, 선택된 에틸렌디아민 유사체(H2N-(CH2)2-NH-CH2-R)가 다른 아민 및 아민 유도체보다 리보스 디알데히드 유도체에 대해 더 큰 반응성을 나타냄을 밝혀냈다. 에틸렌디아민 및 이의 유사체와의 반응은, 히드라진 및 이의 유사체는 물론 에틸렌디아민 모티프를 포함하지 않는 다수의 아민과의 유사 반응보다 더 빠르고 효율적이었다(도 2). 환원적 아민화 반응 과정과 그 안에서 형성된 중간 생성물에 대한 상세한 분석을 통해, 사용된 아민에 따라 이의 가상 기전을 공식화할 수 있었다(도 3). 이러한 예비 연구 결과를 바탕으로 비오틴(Biot-EDA), 형광 염료(FAM-EDA, pHrodo-EDA, Cy3-EDA, Cy5-EDA) 또는 뉴클레오티드(EDA-AG, EDA-m7Gp3G)와 같은 작용기를 포함하는 에틸렌 디아민 유사체를 사용하여 RNA 변형을 수행하였다(도 4). 이러한 유사체의 합성은 유사한 합성 경로, 예를 들어 NHS 에스테르와 디에틸렌트리아민의 반응(FAM-EDA 및 pHrodo-EDA의 합성) 또는 N-프로파길에틸렌디아민과 아지드간의 CuAAC 반응(Biot-EDA, Cy3-EDA, Cy5-EDA, EDA-AG 및 EDA-m7Gp3G의 합성)을 따른다. NHS 에스테르 또는 CuAAC의 반응은 높은 선택성, 효율성 및 온화한 조건으로 알려져 있다. 이러한 이유로, 광범위한 형광 염료, 친화성 태그, 아미노산, 펩티드, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 핵산, 나노입자, 및 아지드, 알킨 또는 NHS 에스테르를 함유한 기타 물질이 시중에 존재한다. 결과적으로, 상기 제안된 에틸렌 디아민 유사체의 합성은 매우 간단하고 효율적이며 광범위한 유도체에 적용 가능하다. RNA의 3' 단부 변형 반응이 RNA 분해를 최소화하면서 효율적이고 선택적으로 진행되는 조건을 이해하기 위해서 수많은 실험이 수행되었다. pH와 관계없이 40℃ 미만 및 100 mM을 초과하지 않는 나트륨 시아노보로하이드라이드 농도에서 가장 높은 디알데히드 안정성이 달성됨이 관찰되었다. 반응 속도는 5.5-7.5 범위의 pH 및 1-10 mM 범위의 에틸렌디아민 유사체 농도에서 크게 변하지 않았다. RNA의 안정성 및 반응성, 및 반응 조건의 추가 최적화에 대한 추가의 연구가 수행되었다. 최상의 결과는 단일-용기 반응을 수행하여 획득되었는데, 여기서 RNA를 먼저 광범위한 농도(1-100 μM) 및 길이(3-2000 nt)에서 NaIO4(1.0-1.5 mM)의 존재 하에 25℃에서 30분 동안 빛을 차단하여 배양하였다. 후속적으로 시약(별도로, 또는 혼합물로서 동시에), 예를 들어 완충제(KH2PO4, pH 6, 100 mM), 환원제(NaBH3CN, 20 mM) 및 에틸렌디아민 유사체(1 mM)를 상기 산화된 RNA 용액에 첨가하였다. 25℃에서 120분 동안 배양 후에, N-(2-아미노에틸)모르폴린-기반 RNA 유사체 생성물을 간단한 방법, 예를 들어 RNA 염의 알콜 침전(80-90% 단리 수율)에 의해, 상업용 RNA 단리 키트(단리 효율 90-100%)를 사용하거나 또는 HPLC(단리 효율 25-60%)에 의해 효율적으로 단리할 수 있었다.
본 발명에 따른 방법은 높은 효율: 1-300 뉴클레오티드 길이를 갖는 RNA의 경우 75-99% 및 900-2100 뉴클레오티드 길이를 갖는 RNA의 경우 65-80%로 RNA의 직접적이고, 저렴하며(효소 및 촉매의 사용이 없음) 신속한 변형을 허용한다(도 5A-C). RNA 유사체는 기능적 화학 모이어티, 예를 들어 형광 염료, 비오틴, 또는 아민, 아지드 및 알킨과 같은 반응성 생물직교 기를 함유할 수 있다.
FRET 쌍(Cy3 및 Cy5)을 형성하기 위해 선택적으로 배치된 2개의 형광 염료를 포함하는 RNA 유사체를 수득하는 데 사용된 SPAAC 반응을 포함하여 여러 화학 공정을 병행하여 수행할 수 있다. 이를 위해 T7 RNA 폴리머라제 및 기질의 뉴클레오티드 유사체를 이용하여 RNA의 효소적 합성(시험관내 전사)을 수행하였고, 그 덕분에 mRNA의 5' 캡 구조 내에 아지드 기를 포함하는 RNA를 수득할 수 있었다[8]. 이어서 전사 생성물을 변형된 화학적 표지화 프로토콜에서 기질로 사용하였고, 이 프로토콜에서 5' 단부의 아지드 기는 SPAAC 반응을 겪었으며 3' 단부의 디알데히드는 환원적 아민화를 겪어, 이중으로 변형된 RNA 유도체로 이어졌다. 반응 생성물을 HPLC로 정제하여 상기 두 변형을 모두 포함하는 RNA 분자를 단리할 수 있었다(도 5D-F). Cy3 및 Cy5 염료로 표지된 35 및 276개 뉴클레오티드 길이의 N-(2-아미노에틸)모르폴린-기반 RNA 유사체(RNA5, RNA8, RNA 14, 표 1)는 RNA 형태 변화를 연구하고 RNase A, RNase Tl, Dcp1/2, RNase R(도 6) 및 RNase H(도 7)와 같은 효소의 활성을 모니터링하는 데 FRET 탐침으로서 사용되었다.
한편으로, Cy3 및 Cy5 염료로 표지된 가우시아 루시페라제(Gaussia luciferase) 및 eGFP(향상된 녹색 형광 단백질)(각각 993 및 1100개 뉴클레오티드 길이)를 암호화하는 N-(2-아미노에틸)모르폴린-기반 mRNA 유사체(RNA17-19 및 RNA21-23, 표 1)를 현미경 관찰 및 번역 연구에 사용하였다(도 8). 후자는 본 발명에 따른 mRNA의 3' 단부의 도입된 변형이 단백질 생합성 과정을 방해하지 않는다는 것을 보여준다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 적용은 두 RNA 분자의 화학적 결찰이다. 시험관내 전사 및 에틸렌디아민 유사체 EDA AG 및 EDA m7Gp3G를 통해, 5' 단부에 에틸렌디아민 기를 함유하는 35개 뉴클레오티드 길이의 RNA(RNA6, RNA9, 표 1)를 수득하였다. RNA6은 본 발명에 따라 변형된 화학적 표지화 프로토콜에 사용되었으며, 여기서 이 RNA는 상보적 DNA(표 3)와 하이브리드화되어 두 RNA 분자의 5' 및 3 단부가 서로 더 가까워지게 한 다음 산화되고, 분자간 환원적 아민화 반응을 겪었다. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 통해, 기질 길이의 배수인 길이를 갖는 RNA 결찰 생성물의 형성이 관찰되었다(도 9).
실시예
하기의 실시예는 단지 본 발명을 예시하고 이의 특정 양태를 예시하기 위해 제공되는 것이지, 이를 제한하려는 것이 아니고, 첨부된 청구범위에 정의된 전체 범위 내에서 거짓으로 해석되어서는 안 된다. 하기의 실시예는 달리 명시되지 않는 한 해당 기술 분야에서 사용되는 표준 물질 및 방법을 사용하거나, 또는 특정 물질 및 방법에 대한 제조사의 권장 사항을 따랐다.
3급-부틸 (2-브로모에틸)카바메이트의 합성
합성을 공개된 프로토콜[23]을 기반으로 수행하였다. 트리에틸아민(1.38 ㎖, 9.92 mmol)을 0/4℃에서 메탄올(70 ㎖) 중의 2-보모에틸아민 하이드로브로마이드(1.02 g, 4.96 mmol)의 용액에 첨가하였다. 이어서, 메탄올(20 ㎖) 중의 디-3급-부틸 디카보네이트(1.09 g, 4.99 mmol)의 용액을 첨가하였다. 0/4℃에서 15분 동안 교반한 후, 냉각 욕을 제거하고 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 용액을 물/디클로로메탄(65 ㎖/65 ㎖)으로 희석하고 분별 깔대기로 옮기고 디클로로메탄(65 ㎖)으로 세척하였다. 합한 유기 분획을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 하에서 농축시켰다. 생성물을 무색 오일의 형태로 수득하였다(1.11 g, 4.95 mmol, ~100%).
3급-부틸 (N-프로파길아미노에틸)카바메이트의 합성
나트륨 비카보네이트(200 ㎎, 2.38 mmol), DMF(2.0 ㎖) 및 프로파길아민(849 ㎕, 13.25 mmol)을 3급-부틸 (2-브로모에틸)카바메이트(495 ㎎, 2.21 mmol)에 첨가하였다. 현탁액을 60℃에서 4.5시간 동안 환류시켰다. 반응 과정을 TLC(n-헥산/2-프로판올 1:1, 닌하이드린 염색, RF ~ 0.4)상에서 모니터링하였다. 현탁액을 포화된 탄산나트륨 및 디클로로메탄의 혼합물(20 ㎖/30 ㎖)로 희석하고, 분별 깔때기로 옮기고, 디클로로메탄(2 x 20 ㎖)으로 세척하였다. 합한 유기상을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 감압 하에서 농축시켰다. 수득된 생강 오일을 n-헥산 중 2-프로판올의 단계 구배로 FLASH 크로마토그래피(건조 하중, 12 g 실리카겔 카트리지)에 의해 분리하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 합하고 감압 하에서 농축시켰다. 생성물을 황색 오일의 형태로 수득하였다(374 ㎎, 1.88 mmol, 86%).
N-프로파길에틸렌디아민(PEDA) 디하이드로클로라이드의 합성
염산(4 ㎖, ~37 중량%)을 메탄올(20 ㎖) 중의 3급-부틸(N-프로파길아미노에틸)카바메이트(374 ㎎, 1.88 mmol) 용액에 적가하였다. 실온에서 30분 동안 배양한 후, 에탄올을 첨가하고 용액을 감압 하에서 증발시켰다. 이어서 침전이 발생할 때까지 무수 에탄올을 조금씩 나누어 첨가하였다. 이어서 혼합물을 냉각시키고 침전물을 여과하고 최소 부피의 저온 무수 에탄올(총 100 ㎖의 무수 에탄올이 소비되었다)로 세척하였다. 침전물을 물에 용해시키고 동결건조시켜 밝은 갈색 분말로서 생성물을 수득하였다(156 ㎎, 0.912 mmol, 48%).
2-아지도에틸아민의 합성
합성을 공개된 프로토콜[8]을 기반으로 수행하였다. 2-브로모에틸아민 하이드로브로마이드(10.09 g, 49.3 mmol)를 수(40 ㎖) 중의 나트륨 아지드(8.14 g, 148 mmol) 용액에 첨가하고 70℃에서 16시간 동안 환류시켰다. 혼합물을 냉각시키고 수(10 ㎖) 중의 수산화칼륨(14 g) 용액을 첨가한 다음, 디클로로메탄(50 ㎖)을 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 교반한 후, 현탁액을 분별 깔대기로 옮기고 디클로로메탄(5 x 50 ㎖)으로 세척하였다. 합한 유기상을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 조심스럽게 농축시켰다(생성물의 중량이 안정화될 때까지 30℃에서 600-50 mbar의 압력 범위 하에서). 생성물을 무색 오일의 형태로 수득하였다(3.78 g, 43.9 mmol, d = 1.04 g/㎖, 89%).
3급-부틸 [N-(2-아지도에틸)아미노에틸]카바메이트의 합성
DMF(2 ㎖) 중의 3급-부틸(2-브로모에틸)카바메이트(1.47 g, 6.58 mmol)의 용액을 2-아지도메틸아민(1.63 ㎖, 19.73 mmol), 중탄산나트륨(0.91 g, 6.58 mmol) 및 DMF(8 ㎖)로 이루어지는 현탁액에 70℃에서 1시간 동안 적가하였다. 반응 과정을 TLC(n-헥산/2-프로판올 1:1, 닌하이드린 염색, RF ~ 0.4)로 모니터링하였다. 현탁액을 포화 탄산나트륨과 디클로로메탄의 혼합물(40 ㎖/50 ㎖)로 희석하고, 분별 깔대기로 옮기고 디클로로메탄(3 x 50 ㎖)으로 세척하였다. 합한 유기상을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 무색 오일을 n-헥산 중의 2-프로판올의 단계 구배로 FLASH 크로마토그래피(건조하중, 12 g 실리카겔 카트리지)에 의해 분리하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 합하고 감압 하에서 농축시켰다. 생성물을 무색 오일의 형태로 수득하였다(940 ㎎, 4.14 mmol, 63%).
N-(2-아지도에틸)에틸렌디아민(AEEDA) 디히드로클로라이드의 합성
희 염산(5 ㎖, ~10 중량%)을 3급-부틸 [N-(2-아지도에틸)아미노에틸]카바메이트(374 ㎎, 1.88 mmol)에 적가하였다. 실온에서 1시간 배양한 후, 혼합물을 물(20 ㎖)로 희석하고, 분별 깔대기로 옮기고 디클로로메탄(3 x 25 ㎖)으로 세척하였다. 에탄올을 수성 상에 첨가하고 용액을 감압 하에서 증발시켰다. 이어서 무수 아세토니트릴을 침전이 발생할 때까지 조금씩 나누어 첨가하였다. 이어서 혼합물을 냉각시키고 침전물을 여과하고 최소 부피의 저온 무수 에탄올로 세척하였다. 침전물을 감압 하에서 건조시켜 생성물을 백색 분말로서 수득하였다(70 ㎎, 0.53 mmol, 13%).
Biot-EDA의 합성
Biot-N3의 합성을 공지된 방법[24]에 따라 수행하였다. 50% DMSO(1.26 ㎖), 및 CuSO4-TBTA 복합체(340 ㎕, 50% DMSO 중의 9.4/10 mM) 용액의 혼합물을 칭량된 시약 Biot-N3(9.81 ㎎, 31.4 μmol), PEDAx2HCl(8.27 ㎎, 48.4 μmol) 및 나트륨 아스코르베이트(146 ㎎, 234 μmol)에 첨가하였다. 실온에서 105분 동안 교반한 후, EDTA(0.5 M 400 ㎕) 및 물(6 ㎖)을 상기 용액에 첨가하였다. 주사기 필터로 여과한 후, HPLC 분리를 수행하였다: SUPELCOSILTM LC-18-T 컬럼, 250x4.6 mm, 5 ㎛, A - 50 mM NH40Ac pH 5.9, B - 50 mM NH40Ac pH 5.9/MeOH 1:1, 1.3 ㎖/분 @ 22℃, 프로그램: 30분 동안 0-100% B(RT = 15분). 분획물을 합하고 3회 동결건조시킨 후에, Biot-EDA 생성물을 아세테이트 염의 형태로 수득하였다(4.5 ㎎, 8.48 μmol, M = 530.7 g/mol), 수율 29%. MS ESI(+): 411.4(계산치[M+H]+: 411.2).
Cy3-EDA의 합성
나트륨 아스코르베이트(5.19 ㎎, 26.2 μmol) 및 PEDAx2HCl(1.13 ㎎, 6.63 μmol)을 설포-Cy3-N3(2.22 ㎎, 3.01 μmol, Lumiprobe)에 첨가하고 50% DMSO(270 ㎕)에 용해하였다. 이어서 CuSO4-TBTA 복합체(32 ㎕, 50% DMSO 중의 9.4/10 mM) 용액을 첨가하고 실온(22℃)에서 60분 동안 배양하였다. 이어서 물(2.7 ㎖) 및 EDTA 용액(6 ㎕, 0.5 M, pH 8.0)을 첨가하고 HPLC 분리를 수행하였다; Gemini® NX-C18 컬럼, 5 ㎛, 110 Å, 250 x 10 mm; 시스템 A: 100 mM TEAA pH 7.0 B: 75% MeCN, 프로그램: 40분 동안 0-27% B, 10분 동안 100% B, 5 ㎖/분 @25℃(RT = 35분). 분획물을 합하고 3회 동결건조시키고, 50% DMSO(180 ㎕)에 용해시킨 후, 생성물을 트리에틸아민 아세테이트 염 용액의 형태로 수득하였다(1.66 μmol, 9.2 mM, A550=1492, ε548=162 mM-1㎝-1), 수율 55%. MS ESI(-): 795.6(계산치[M-H]-: 796.3) ESI(+): 797.4(계산치[M-H]-: 797.3).
Cy5-EDA의 합성
합성을, 설포-Cy5-N3(4.7 ㎎, 6.01 μmol, Lumiprobe)에서 시작하여 Cy3-EDA 합성과 유사한 프로토콜에 따라 수행하였다. HPLC 분획을 합하고 3회 동결건조시키고, 물(360 ㎕)에 용해시킨 후, 생성물을 트리에틸아민 아세테이트 염 용액의 형태로 수득하였다(3.58 μmol, 9.8 mM, A654 = 2450, ε645=250 mM-1㎝-1), 수율 59%. MS ESI(-): 821.8(계산치[M-H]-: 821.4) ESI(+): 823.5(계산치[M-H]-: 823.4).
FAM-EDA의 합성
트리에틸아민(10 ㎕, bioultra) 및 디에틸렌트리아민(30 ㎕)을 DMSO(200 ㎕) 중의 NHS 6-카르복시플루오레세인(4.5 ㎎, 9.5 μmol, ChemGenes)의 용액에 첨가하고 22℃에서 60분 동안 배양하였다. 이어서 에탄올 용액(1 ㎖, 80%)을 첨가하고 감압 하에서 증발시켰다. 이 작업을 2회 반복하였다. 암모늄 아세테이트 용액(1.8 ㎖, 0.5 M, pH 5.9)을 첨가하고 HPLC에 의해 분리를 수행하였다: Gemini® 5 ㎛ NX-C18 컬럼, 110 Å, 250 x 10 mm; 시스템 A: 50 mM NH4OAc pH 5.9, B: MeOH; 30분 동안 0-50% B, 5.0 ㎖/분 @22℃(RT = 27분). 3회 동결건조시킨 후, 암모늄 아세테이트 염 형태의 생성물(2.8 μmol, E490=83 mM-1㎝-1, 30%)을 60% DMSO에 용해시켜 10 mM 용액을 제공하였다, MS ESI(-): 460.5(계산치[M-H]-: 460.2).
pHrodo-EDA의 합성
트리에틸아민(10 ㎕, bioultra) 및 디에틸렌트리아민(20 ㎕)을 DMSO(200 ㎕) 중의 pHrodo RED NHS 에스테르(1 ㎎, 2.0 μmol, Thermo)의 용액에 첨가하고 암실에서 22℃에서 60분 동안 배양하였다. 이어서 에탄올 용액(1 ㎖, 80%)을 첨가하고 감압 하에서 증발시켰다. 이 작업을 2회 수행하였다. 트리에틸아민 아세테이트의 용액(1.8 ㎖, 0.1 M, pH 7.0)을 첨가하고 HPLC에 의해 분리를 수행하였다: Gemini® 5 ㎛ NX-C18 컬럼, 110 Å, 250 x 10 mm; 시스템 A: 50 mM AA pH 5.9, B: MeCN; 60분 동안 0-100% B, 5.0 ㎖/분 @22℃(RT = 26분, MS). 이중 동결건조시키고 물(100 ㎕)에 용해 후, 생성물 용액(2.8 μmol, ε560=65.0 mM-1㎝-1)을, 농도 12.6 mM(A560 = 82, A260 = 30, 1 mm, pH 7.0), 수율 63%로 수득하였다. MS ESI(+): 630.4(계산치[M-H]-: 630.4).
EDA-m
7
Gp
3
G의 합성
나트륨 아스코르베이트(10.3 ㎎, 52 μmol) 및 PEDAx2HCl(3.4 ㎎, 20 μmol)을 N3-m7Gp3G[8](10 ㎎, 8.4 μmol)에 첨가하고 탈기된 트리에틸아민 아세테이트 용액(2.0 ㎖, 45 mM, pH 7)에 용해시켰다. 이어서CuSO4-THPTA 복합체 용액(10 ㎕, 수 중 100/500 mM)을 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 이어서, EDTA 용액(20 ㎕, 100 mM, pH 7.0)을 첨가하고 C18 컬럼에서 HPLC 분리를 수행하였다; 시스템 A: 100 mM NH40Ac pH 5.9, B: 30% MeCN, 프로그램: 40분 동안 0-25% B, 4.5 ㎖/분 @22℃. 분획을 합하고 3회 동결건조시킨 후, 생성물을 암모늄 아세테이트 염의 형태로 수득하였다(1.6 ㎎, 1.75 μmol, ε260=20.0 mM-1㎝-1), 수율 21%. MS ESI(-): 505.4(계산치[M-2H]2-: 505.1), ESI(+): 507.4(계산치[M+2H]2+: 507.1).
pU
3
의 합성
합성을 5'-O-DMT-2'-O-TBDMS-rU 3'-lcaa Primer Support 5G ribo U 300(170 ㎎, 50.7 μmol, 298 μmol/g, GE Healthcare) 고체 지지체상에서 AKTA Oligopilot plus 10 합성기를 사용하여 공지된 방법[11]에 기반하여 수행하였다. 커플링(coupling) 동안, 컬럼 고체 지지체를 아세토니트릴 중의 5-(벤질티오)-1H-테트라졸 용액(0.30 M)과 함께 15분 동안 아세토니트릴 중의 5'-O-DMT-2'-O-TBDMS 유리딘 포스포아미다이트(ChemGenes) 또는 비스시아노에틸 포스포아미다이트(ChemGenes)의 용액(0.6 ㎖, 0.2 M, 2.4 eq)으로 세척하였다. 톨루엔 중의 디클로로아세트산 용액(3% v/v)을 탈트리틸화 시약으로 사용하고, 피리딘 중의 요오드 용액(0.05 M)을 산화제로서 사용하고, 아세토니트릴 중의 N-메틸이미다졸(20% v/v)을 Cap A로 사용하고, 아세토니트릴 중의 아세트산 무수물(40% v/v) 및 피리딘(40% v/v)의 혼합물을 Cap B로 사용하였다. 최종 합성 주기 후, 고체 지지체 상의 RNA 생성물을 아세토니트릴 중의 디에틸아민 용액에서 배양하여 2-시아노에틸 기를 제거하였다. 고체 지지체를 아세토니트릴로 세척하고 아르곤으로 건조시켰다. 생성물의 절단 및 탈보호를 위해, 수지를 AMA(3 ㎖의 40 중량% 메틸아민 및 3 ㎖의 30 중량% 암모니아수)에서 40℃에서 1시간 동안 배양하였다. 생성된 용액을 증발시키고 생성물을 DMAO(0.220 ㎖)에 용해시켰다. TBDMS 기를 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드(250 ㎕, 65℃, 3시간)로 제거하였다. 냉각 후, 용액을 중탄산나트륨 용액(20 ㎖, 0.25 M)으로 희석하였다. 생성물을 DEAE Sephadex(0-1.2 M TEAB 구배)에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해 단리하였다. 분획을 증발시킨 후, 생성물을 트리에틸암모늄 염의 형태로 수득하였다(29 ㎎, 21.0 μmol, 630 mOD260, HPLC260 = 99%, 57% 수율). ESI(+): 467.1, 935.5(계산치[M+2H]2+. 469.1, [M+H]+: 937.1).
N
3
-AG의 합성
합성을 5'-O-DMT-2'-O-TBDMS-rGiBu 3'-lcaa Primer Support 5G ribo G 300(163 ㎎, 49.0 μmol, 300 μmol/g, GE Healthcare) 고체 지지체상에서 AKTA Oligopilot plus 10 합성기를 사용하여 공지된 방법[25]에 기반하여 수행하였다. 커플링 동안, 컬럼 고체 지지체를 아세토니트릴 중의 5-(벤질티오)-1H-테트라졸 용액(0.30 M)과 함께 15분 동안 아세토니트릴 중의 5'-O-DMT-2'-O-TBDMS rAPac 용액(0.6 ㎖, 0.2 M, 2.4 eq)으로 세척하였다. 톨루엔 중의 디클로로아세트산 용액(3% v/v)을 탈트리틸화 시약으로 사용하고, 피리딘 중의 요오드 용액(0.05 M)을 산화제로서 사용하고, 아세토니트릴 중의 N-메틸이미다졸(20% v/v)을 Cap A로 사용하고, 아세토니트릴 중의 아세트산 무수물(40% v/v) 및 피리딘(40% v/v)의 혼합물을 Cap B로 사용하였다. 최종 합성 주기 후, 고체 지지체 상의 RNA 생성물을 아세토니트릴 중의 디에틸아민 용액에서 배양하여 2-시아노에틸 기를 제거하였다. 고체 지지체를 아세토니트릴로 세척하고 아르곤으로 건조시켰다. 고체 지지체를 DMF 중의 트리페녹시메틸포스핀 요오다이드((PhO)3PCH3 +I-)의 용액(1.0 ㎖, 0.6 M)으로 폐쇄된 회로로 15분 동안 세척하였다. 고체 지지체를 DMF, 아세토니트릴로 연속적으로 세척하고, 아르곤으로 건조시키고, 시험관으로 옮겼다. 이어서 DMF 중의 나트륨 아지드의 포화된 용액(1 ㎖)을 첨가하고 60℃에서 1시간 동안 격렬히 교반하였다. 고체 지지체를 물, 에탄올, 아세토니트릴로 연속적으로 세척하고, 아르곤으로 건조시켰다. 생성물의 절단 및 탈보호를 위해, 고체 지지체를 AMA(3 ㎖의 40 중량% 메틸아민 및 3 ㎖의 30 중량% 암모니아수)에서 50℃에서 1시간 동안 배양하였다. 생성된 용액을 증발시키고 생성물을 물에 용해시켰다. 생성물을 DEAE Sephadex(0-0.6 M TEAB 구배 용출)에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해 단리하였다. 분획을 증발시킨 후, 생성물을 트리에틸암모늄 염의 형태로 수득하였다(21 ㎎, 20.8 μmol, 550 mOD260, E260 = 24.3 mM-1㎝-1 HPLC260 = 92%, 42% 수율).
시험관내 전사를 위해, 생성물의 일부(11 ㎎, 11.1 μmol)를 HPLC에 의해 추가로 정제하였다: Vydac Denali HiChrom C18 컬럼, 150x10 mm, 5 ㎛, 120 Å; 용매 A - 50 mM NH40Ac pH 5.9, B - 50 mM NH40Ac pH 5.9/MeCN 7:3 v/v, 프로그램: 40분 동안 0-25% B, 25℃에서 유량 4.5 ㎖/분(RT = 25분). 분획물을 합하고 3회 동결건조시킨 후에, 생성물을 암모늄 염의 형태로 수득하였다(5.5 ㎎, 9.0 μmol, 220 mOD260, E260 = 24.3 mM-1㎝-1, HPLC260 ~100%, 81% 수율). MS ESI(-): 636.3(계산치[M-H]-: 636.1).
EDA-AG의 합성
나트륨 아스코르베이트(10.3 ㎎, 52 μmol) 및 PEDAx2HCl(3.4 ㎎, 20 μmol)을 N3-AG(7.4 ㎎, 11.5 μmol)에 첨가하고 탈기된 트리에틸아민 아세테이트 용액(2.0 ㎖, 45 mM, pH 7)에 용해시켰다. 이어서 CuSO4-THPTA 복합체 용액(10 ㎕, 수 중 100/500 mM)을 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 이어서, EDTA 용액(20 ㎕, 100 mM, pH 7.0)을 첨가하고 HPLC 분리를 C18 컬럼에서 수행하였다; 시스템 A: 100 mM NH40Ac pH 5.9, B: 30% MeCN, 프로그램: 40분 동안 0-25% B, 4.5 ㎖/분 @22℃. 분획을 합하고 3회 동결건조시킨 후, 생성물을 암모늄 아세테이트 염의 형태로 수득하였다(2.8 ㎎, 3.50 μmol, E260=24.3 mM-1㎝-1), 수율 30%. MS ESI(-): 734.4(계산치[M-H]-: 734.2).
A35 및 SP6 서열을 갖는 RNA의 시험관내 전사 반응을 위한 주형 DNA의 제조
A35 서열을 갖는 RNA(RNA1-6) 전사 주형을 하기와 같이 제조하였다:
서열:
CAGTAATACGACTCACTATTAGGGAAGCGGGCATGCGGCCAGCCATAGCCGATCA(암호화 가닥 A35);
TGATCGGCTATGGCTGGCCGCATGCCCGCTTCCCTAATAGTGAGTCGTATTACTG
(주형 가닥 A35)
을 갖는 2개의 DNA 올리고뉴클레오티드(Genomed)의 용액을 하이브리드화 완충제(4 mM 트리스-HCl pH 7.5, 15 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 최종 45 μM의 각각의 DNA 가닥)에서 1:1 혼합하였다. 이어서 상기 용액을 가온하고 서서히 냉각시켰다(1시간 동안 95에서 25℃까지, 단계 구배 -5℃/∼4분).
SP6 서열을 갖는 RNA(RNA7-9)의 전사를 위한 주형을 공지된 과정[8]에 따라 제조하였다
V5x3, G276, gluc, egfp 및 fluc 서열을 갖는 RNA의 시험관내 전사를 위한 주형 DNA의 제조
3xV5 서열을 갖는 RNA의 전사를 위한 주형 DNA를, 3xV5_pUC57 플라스미드를 Aarl(Thermo) 제한 효소로 절단하여 제조하였다. 플라스미드 3xV5_pUC57을 EcoRV 전략을 사용하여 pUC57에 하기 서열의 유전자를 클로닝함으로써 Gen│Script에 의해 제조하였다:
G276 서열의 RNA 전사를 위한 주형 DNA를, hRLuc-pRNA2(A)128 플라스미드를 AdeI 제한 효소(Thermo)로 절단하여 제조하였다. hRLuc-pRNA2(A)128 플라스미드를 공지된 과정에 따라 제조하였다[26].
gluc 서열의 RNA 전사를 위한 주형 DNA를, pJET1.2_T7_Gluc_3'utr-베타-글로빈_A128 플라스미드를 AarI 제한 효소(Thermo)로 절단하여 제조하였다. pJET1.2_T7_Gluc_3'utr-베타-글로빈_A128을 공지된 과정에 따라 제조하였다[11].
egfp 서열의 RNA 전사를 위한 주형 DNA를, pJET1.2_T7_Egfp_3'utr-베타-글로빈_A128 플라스미드를 AarI 제한 효소(Thermo)로 절단하여 제조하였다. pJET1.2_T7_Egfp_3'utr-베타-글로빈_A128을 pJET1.2_T7_Gluc_3'utr-베타-글로빈_A128 플라스미드와 동일한 방식으로, pJET1.2 벡터에 eGFP 유전자를 클로닝하여 제조하였다[11].
fluc 서열의 RNA 전사를 위한 주형 DNA를, pJET1.2_T7_Fluc_3'utr-베타-글로빈_A128 플라스미드를 AarI 제한 효소(Thermo)로 절단하여 제조하였다. pJET1.2_T7_Fluc_3'utr-베타-글로빈_A128을 공지된 과정에 따라 제조하였다[8].
A35 서열을 암호화하는 RNA(RNA1, RNA3, RNA6)의 시험관내 전사 및 단리
RNA3: 시약을 주형 DNA 용액(45 μM, 11 ㎕)에 첨가하여 하기 조성을 갖는 반응 혼합물(250 ㎕)을 수득하였다: 전사 완충제(x1, Thermo), GTP(5.0 mM), UTP(5.0 mM), CTP(5.0 mM), ATP(3.0 mM), N3-AG(6.0 mM), MgC12(20 mM), Ribolock(1U/㎕, Thermo), T7 RNAP(0.125 ㎎/㎖). 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, DNase I(2 ㎕, 30분, Thermo)을 첨가하고 배양을 추가로 30분 동안 계속하였다. 이어서 EDTA 용액(250 ㎕, 30 mM)을 첨가하고 단백질 제거(PhOH/CHCl3 시스템에 이어서 CHCl3에 의한 반응 혼합물의 세척, 1:1 v/v) 및 침전(50 ㎕의 3 M NaOAc, pH 5.2/1.1 ㎖ 99% EtOH, -20℃, ON)을 수행하였다. 원심분리(>10 g, 20분 @4℃), 세척(80% EtOH) 및 진공 건조 후에, RNA 펠릿을 물(200 ㎕)에 용해시켰다. HPLC에 의한 생성물의 분리를 수행하였다: Phenomenex Clarity 3 ㎛ Oligo RP C18 컬럼, 50 x 4.6 ㎜. 완충제 A: 50 mM TEAA, B: MeCN. 프로그램: 5분 동안 5% B, 15분 동안 5-10% B, 1분 동안 10-50% B, 4분 동안 50%, 유량 1.0 ㎖/분, @50℃(RT ~16분). 수집된 분획을 동결건조시키고, 물에 용해시키고, PAA 겔(15% PAA, 8 M 우레아, 1xTBE)에서 분리하여 조성을 분석하였다. 원하는 RNA 생성물을 포함하는 분획을 합하고 동결건조시키고, 물에 용해시켰다. 용액 중의 RNA를 에탄올에 침전시키고(이전과 같이 나트륨 염으로) 물(160 ㎕)에 재용해시켰다. RNA 생성물의 농도를 나노드롭(A260 = 2.48, 1.0 ㎜ 광학 경로)으로 측정하였다. 생성물 RNA3(159 ㎍, 9.1 nmol, 3.98 mOD260, E260 = 437 mM-1㎝-1)을 n량체(~35-36 nt)의 혼합물로 수득하였다.
RNA1: 반응 혼합물이 하기 농도의 선택된 시약: ATP(5.0 mM), N3-AG(0 mM)을 함유하는 것을 제외하고, RNA3에 대해 설명된 대로 RNA1 전사 및 단리를 수행하였다.
RNA6: 반응 혼합물이 하기 농도의 선택된 시약: EDA-AG(46.0 mM), N3-AG(0 mM)을 함유하는 것을 제외하고, RNA3에 대해 설명된 대로 RNA6 전사 및 단리를 수행하였다.
SP6 서열을 암호화하는 RNA(RNA7, RNA9)의 시험관내 전사 및 단리
RNA7: RNA7 전사 및 분리를 공지된 과정에 따라 수행하였다[8]
RNA9: 반응 혼합물이 하기 농도의 선택된 시약: EDA-m7Gp3G(1.0 mM), N3-m7Gp3G(0 mM)를 함유하는 것을 제외하고, RNA7에 대해 설명된 대로 RNA9 전사 및 단리를 수행하였다.
V5x3, G276, gluc, egfp 및 fluc 서열(RNA1O, RNA15, RNA16, RNA20, RNA24)을 암호화하는 RNA의 시험관내 전사 및 단리
RNA20: 시약을 주형 DNA 용액(13 ㎍, 20 ㎕)에 첨가하여 하기 조성의 반응 혼합물(130 ㎕)을 형성시켰다: 전사 완충제(xl, Thermo), ATP(5.0 mM), UTP(5.0 mM), CTP(5.0 mM), GTP(1.0 mM), N3-m7Gp3G(6.0 mM), MgCl2(20 mM), Ribolock(1U/㎕, Thermo), T7 RNAP(0.125 ㎎/㎖). 37℃에서 135분 동안 배양한 후, DNase I(2 ㎕, 30분, Thermo)을 첨가하고 배양을 추가로 30분 동안 계속하였다. 이어서 EDTA 용액(8 ㎕, 0.5 M) 및 물(420 ㎕)을 첨가하였다. 반응 생성물을 NucleoSpin® RNA(MACHEREY-NAGEL): 1 prep, 3회 분취량으로 로딩, 용출 2 x 60 ㎕로 정제하였다. RNA20 용액을 수득하였다(152 ㎍/115 ㎕, 1.32 ㎍/㎕, 2.31 μM). 추가 정제를 위해, 수득된 RNA의 일부를 HPLC 크로마토그래피로 분리하였다: RNASeptTM Prep C18 컬럼, 50x7.8 ㎜, 2 ㎛, A - 100 mM TEAOAc pH 7.0, B - 200mM TEAOAc pH 7.0/ MeCN 1:1, 0.9 ㎖/min @55℃. 프로그램: 40분 동안 18-30% B. 수집된 분획을 ~700 ㎕ 분액으로 나누고, NaOAc(70 ㎕, 3 M), 글리코겐(1 ㎕, 5 ㎎/㎖) 및 iPrOH(800 ㎕)를 첨가하고 -80℃에서 30분 동안 배양하였다. 펠릿을 원심분리하고(30분, 4℃, 15,000 g), 상등액을 조심스럽게 제거하고, EtOH(80%, 0.5 ㎖)를 첨가하고, 펠릿을 다시 원심분리하고(10분, 4℃, 14,000 g), 진공 하에서 건조시키고, 물(샘플당 20 ㎕)에 용해시켰다. 생성물 샘플(60 ng)을 아가로스 겔(1%, 1xTBE, 80 V 60분)에서 분리하였다. 원하는 생성물이 포함된 분획을 합한 후, 양질의 RNA20을 수득하였다(4.76 ㎍, 53%).
RNA10: 적절한 DNA 주형(V5X3)에서의 전사 및 RNA10 단리를, 반응 혼합물이 하기 농도의 선택된 시약을 함유하는 것을 제외하고, RNA20에 대해 설명된 대로 수행하였다: GTP(5.0 mM), N3-m7Gp3G(0 mM). 상이한 HPLC 크로마토그래피 조건을 또한 사용하였다: ScurityGuardTM Cartridge Gemini®-NX C18 예비-컬럼, 4x3.00 ㎜, +Phenomenex Clarity 3 ㎛ Oligo RP C18 컬럼, 150x4.6 ㎜, A - 100 mM TEAOAc pH 7. RNA1O: 적절한 DNA 주형(V5X3)에서의 전사 및 RNA1O 단리를 RNA200에 대해 설명된 대로 수행하였다, B - 200 mM TEAOAc pH 7.0/MeCN 1:1, 1 ㎖/분 @50℃. 프로그램: 60분 동안 10-60% B.
RNA12: 적절한 DNA 주형(G276)에서의 전사 및 RNA12 단리를, 상이한 HPLC 크로마토그래피 조건이 사용된 것을 제외하고 RNA20에 대해 설명된 대로 수행하였다: ScurityGuardTM Cartridge Gemini®-NX C18 예비-컬럼, 4x3.00 ㎜, +Phenomenex Clarity 3 ㎛ Oligo RP C18 컬럼, 150x4.6 ㎜, A - 100 mM TEAOAc pH 7.0, B - 200 mM TEAOAc pH 7.0/MeCN 1:1, 1 ㎖/분 @50℃. 프로그램: 60분 동안 10-60% B.
RNA15: 적절한 DNA 주형(gluc)에서의 전사 및 RNA15 단리를, 반응 혼합물이 하기 농도의 선택된 시약: GTP(5.0 mM), N3-m7Gp3G(0 mM)를 함유하는 것을 제외하고, RNA20에 대해 설명된 대로 수행하였다.
RNA16: 적절한 DNA 주형(gluc)에서의 전사 및 RNA16 단리를 RNA20에 대해 설명된 대로 수행하였다.
RNA24: 적절한 DNA 주형(fluc)에서의 전사 및 RNA24 단리를, 반응 혼합물이 하기 농도의 선택된 시약: GTP(1.0 mM), m2 3'-O,7Gp3G(6.0 mM)[27]를 함유하는 것을 제외하고, RNA20에 대해 설명된 대로 수행하였다.
cy3의 3' 단부에서 본 발명에 따라 표지된 RNA(RNA2, RNA4, RNA11, RNA13, RNA17, RNA21, RNA25)의 제조 및 단리
RNA21: 새로운 NaI04 용액(2 ㎕, 10 mM)을 RNA20 용액(11.43 ㎍/12 ㎕)에 첨가하고 25℃에서 30분 동안 배양하였다. 이어서 KH2P04 완충제(2 ㎕, 1 M, pH 6.0), 새로운 NaBH3CN 용액(2 ㎕, 200 mM) 및 Cy3-EDA(2 ㎕, 10 mM, 50% DMSO)를 첨가하였다. 25℃에서 120분 동안 배양한 후, 물(160 ㎕), NaOAc(20 ㎕, 3 M, pH 5.9), 글리코겐(1 ㎕, 5 ㎎/㎖) 및 EtOH(100%, 600 ㎕)를 첨가하고 -80℃에서 30분 동안 배양 하였다. 펠릿을 원심분리하고(30분, 4℃, 15,000 g), 상등액을 조심스럽게 제거하고, EtOH(80%, 800 ㎕)를 첨가하고 펠릿을 다시 원심분리하고(10분, 25℃, 14,000 g), 진공 하에서 건조시키고 물(100 ㎕)에 용해시켰다. RNA21 용액(101.1 ng/㎕, 10.1 ㎍, 88%)을 수득하였다. 추가 정제를 위해, 상기 수득된 RNA의 일부를 RNA20에 대해 설명된 대로, HPLC 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 원하는 생성물이 포함된 분획을 합한 후, 양질의 RNA21(3.30 ㎍, 37%)을 수득하였다.
RNA2: 표지화 반응 및 RNA2 단리를, 기질로서 RNA1을 사용하여 RNA21에 대해 설명된 대로 수행하였다. HPLC 크로마토그래피 조건: Phenomenex Clarity 3 ㎛ Oligo RP C18 컬럼, 50x4.6 ㎜, A - 50 mM TEAOAc pH 7.0, B MeCN, 1 ㎖/분 @50℃. 프로그램: 10분 동안 5-75% B.
RNA4: 표지화 반응 및 RNA4 단리를, RNA3을 기질로 사용하여 RNA21에 대해 설명된 대로 수행하였다. HPLC 크로마토그래피 조건: RNA2에 대해 설명된 대로.
RNA11: 표지화 반응 및 RNA11 단리를, RNA10을 기질로 사용하여 RNA21에 대해 설명된 대로 수행하였다. HPLC 조건: RNA10에 대해 설명된 대로.
RNA17: 표지화 반응 및 RNA17 단리를, RNA16을 기질로 사용하여 RNA21에 대해 설명된 대로 수행하였다.
RNA25: 표지화 반응 및 RNA25 단리를, RNA24를 기질로 사용하여 RNA21에 대해 설명한 대로 수행하였다.
Cy5의 5' 단부에서 표지된 RNA(RNA18, RNA22)의 제조 및 단리
RNA22: 완충제 KH2P04(2 ㎕, 1 M, pH 6.0) 및 DIBAC-Cy5(2 ㎕, 20 mM, 50% DMSO)를 RNA20 용액(11.43 ㎍/16 ㎕)에 첨가하였다. 25℃에서 120분 동안 배양한 후, 물(160 ㎕), NaOAc(20 ㎕, 3 M, pH 5.9), 글리코겐(1 ㎕, 5 ㎎/㎖) 및 EtOH(100%, 600 ㎕)를 첨가하고 -80℃에서 30분 동안 배양하였다. 펠릿을 원심분리하고(30분, 40℃, 15,000 g), 상등액을 조심스럽게 제거하고, EtOH(80%, 800 ㎕)를 첨가하고 펠릿을 다시 원심분리하고(10분, 25℃, 14,000 g), 진공 하에서 건조시키고 물(100 ㎕)에 용해시켰다. RNA22 용액(94.3 ng/㎕, 9.43 ㎍, 83%)을 수득하였다. 추가 정제를 위해, 상기 수득된 RNA의 일부를 RNA20에 대해 설명된 대로, HPLC 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 원하는 생성물이 포함된 분획을 합한 후, 양질의 RNA22(4.78 ㎍, 53%)를 수득하였다.
RNA18: 표지화 반응 및 RNA18 단리를, 기질로서 RNA16을 사용하여 RNA22에 대해 설명된 대로 수행하였다.
cy3의 3' 단부 및 cy5의 5' 단부에서 본 발명에 따라 표지된 RNA(RNA5, RNA8, RNA14, RNA19, RNA23)의 제조 및 단리
RNA23: 새로운 NaI04 용액(2 ㎕, 10 mM)을 RNA20 용액(11.43 ㎍/10 ㎕)에 첨가하고 25℃에서 30분 동안 배양하였다. 이어서 KH2P04 완충제(2 ㎕, 1 M, pH 6.0), 새로운 NaBH3CN 용액(2 ㎕, 200 mM), DIBAC-sCy5(2 ㎕, 20 mM, 50% DMSO, Lumiprobe) 및 Cy3-EDA(2 ㎕, 10 mM, 50% DMSO)를 첨가하였다. 25℃에서 120분 동안 배양한 후, 물(160 ㎕), NaOAc(20 ㎕, 3 M, pH 5.9), 글리코겐(1 ㎕, 5 ㎎/㎖) 및 EtOH(100%, 600 ㎕)를 첨가하고 -80℃에서 30분 동안 배양 하였다. 펠릿을 원심분리하고(30분, 40℃, 15,000 g), 상등액을 조심스럽게 제거하고, EtOH(80%, 800 ㎕)를 첨가하고 펠릿을 다시 원심분리하고(10분, 25℃, 14,000 g), 진공 하에서 건조시키고 물(100 ㎕)에 용해시켰다. RNA23 용액(94.6 ng/㎕, 9.46 ㎍, 83%)을 수득하였다. 추가 정제를 위해, 상기 수득된 RNA의 일부를 RNA20에 대해 설명된 대로, HPLC 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 원하는 생성물이 포함된 분획을 합한 후, 양질의 RNA23(2.66 ㎍, 37%)을 수득하였다.
RNA5: 표지화 반응 및 RNA5 단리를, 기질로서 RNA3을 사용하여 RNA23에 대해 설명된 대로 수행하였다. HPLC 크로마토그래피 조건: Phenomenex Clarity 3 ㎛ Oligo RP C18 컬럼, 50x4.6 ㎜, A - 50 mM TEAOAc pH 7.0, B MeCN, 1 ㎖/분 @50℃. 프로그램: 20분 동안 5-30% B.
RNA8: 표지화 반응 및 RNA8 단리를, RNA7을 기질로 사용하여 RNA23에 대해 설명된 대로 수행하였다. HPLC 크로마토그래피 조건: RNA5에 대해 설명된 대로.
RNA14: 표지화 반응 및 RNA14 단리를, RNA12를 기질로 사용하여 RNA23에 대해 설명된 대로 수행하였다. HPLC 조건: RNA10에 대해 설명된 대로.
RNA19: 표지화 반응 및 RNA19 단리를, RNA16을 기질로 사용하여 RNA23에 대해 설명된 대로 수행하였다.
RNase A, RNase T1 및 RNAse R의 활성 모니터링
반응 완충제(4 mM Tris-HCl pH 7.5, 15 mM NaCl, 0.1 mM EDTA)를 감압 하에서 탈기시켰다. 이어서, 농축된 표지된 RNA 용액(RNA5)을 완충제와 혼합하여 형광 측정에 적합한 RNA 농도(~100 nM)를 수득하였다. RNA 용액(50 ㎕)을 가온시키고 서서히 냉각시킨 다음(1시간 동안 95℃에서 25℃로, 단계 구배 -5℃/~4분) 암실의 빙상에서 배양하였다. 탈기된 완충제(150 ㎕) 또는 RiboLock RNase 억제제 완충제(Thermo, 10 ㎕ + 140 ㎕)로 희석한 후, 용액을 석영 큐벳(1x1x350 ㎜)에 넣고 형광 스펙트럼을 기록하였다(여기 500 ㎚, 범위 510-850 ㎚, 3개 스펙트럼에 대한 평균, 10 ㎚ 슬릿). 방출 스펙트럼의 변화를 5℃에서 측정하였다. 시스템이 안정화된 후(5-15분), 효소를 적절한 농도로 첨가하였다:
RNase A(Thermo): 10 ㎎/㎖ 모액(stock solution), 1 ㎕의 백만배 희석된(~10 ng/㎖, H2O) 효소를 큐벳에 첨가하였다
RNase T1(Thermo): 1000 U/㎕ 모액, 1 ㎕의 100배 희석된(10 U/㎕, H2O) 효소를 큐벳에 첨가하였다
RNase R(Thermo): 10 U/㎕ 모액, 1 ㎕의 효소를 큐벳에 첨가하였다
이어서 반응이 진행됨에 따라 방출 스펙트럼의 변화를 5℃에서 측정하였다.
Dcp1/2 효소 활성 모니터링
반응 완충제(4 mM Tris-HCl pH 7.5, 15 mM NaCl, 0.1 mM EDTA)를 감압 하에서 탈기시켰다. 이어서, 농축된 표지된 RNA 용액(RNA8)을 완충제와 혼합하여 형광 측정을 위한 탐침 용액(~100 nM)을 수득하였다. FRET 탐침 용액(40 ㎕)을 가온시키고 서서히 냉각시킨 다음(1시간 동안 95℃에서 25℃로, 단계 구배 -5℃/~4분) 암실의 빙상에서 배양하였다. 탈기된 완충제(150 ㎕)로 희석한 후, MgCl2(1 ㎕, 1 M)를 첨가하고, 석영 큐벳(1x1x350 ㎜)으로 옮기고, 형광 스펙트럼을 기록하였다(여기 500 ㎚, 범위 510-850 ㎚, 3개 스펙트럼에 대한 평균, 10 ㎚ 슬릿). 방출 스펙트럼의 변화를 5℃에서 측정하였다. 시스템이 안정화된 후(5-15분), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와의 Dcp1/2 복합체(10 ㎕, 7 μM)를 첨가하였다. 이어서 방출 스펙트럼을 반응이 진행됨에 따라 5℃에서 측정하였다.
RNase H 활성 모니터링
DNA 용액(6.00 ㎕, 1 μM, 1.2 eq)을 완충제(412 ㎕; 4 mM Tris-HCl pH 7.5, 15 mM NaCl, 0.1 mM EDTA) 또는 수(6.00 ㎕) 중의 FRET 탐침 용액(RNA5, ~100 nM, 50 ㎕)에 첨가하고, 가온시키고 서서히 냉각시켰다(1시간 동안 95℃에서 25℃로, 단계 구배 -5℃/~4분). 이어서 탈기된 물(160 ㎕) 및 Rnase H 완충제x10(24 ㎕, 200 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT)을 첨가하고 석영 큐벳(240 ㎕, 1x1x350 ㎜)에 넣었다. 방출 스펙트럼의 변화를 35℃에서 측정하였다(여기 500 ㎚, 범위 510-850 ㎚, 3개 스펙트럼에 대한 평균, 10 ㎚ 슬릿). 시스템이 안정화된 후에(2-5분), RNase H(2.00 ㎕, 0.1 ㎎/㎖)를 첨가하고 방출 스펙트럼의 변화를 반응이 진행됨에 따라 온도에서 측정하였다.
참고 문헌
SEQUENCE LISTING
<110> Uniwersytet Warszawski
<120> N- (2-aminoethyl) morpholine RNA analogs, their preparation and
application
<130> PK/8117/RW
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 55
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> A35 oligo 1
<400> 1
cagtaatacg actcactatt agggaagcgg gcatgcggcc agccatagcc gatca 55
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> A35 oligo 2
<400> 2
tgatcggcta tggctggccg catgcccgct tccctaatag tgagtcgtat tactg 55
<210> 3
<211> 276
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> cDNA 3xV5
<400> 3
cacgctgtgt aatacgactc actatagggg tacgccacca tggaaggtaa gcctatccct 60
aaccctctcc tcggtctcga ttctacgggc agcagcggcg gcaaaccgat tccgaacccg 120
ctgctgggcc tggatagcac cggtagcagc ggcggtaagc ctatccctaa ccctctcctc 180
ggtctcgatt ctacggttta aacaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaagcaggtg tctaga 276
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> A35
<400> 4
agggaagcgg gcatgcggcc agccatagcc gatca 35
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> SP6
<400> 5
gaagaagcgg gcatgcggcc agccatagcc gatca 35
<210> 6
<211> 237
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223> V5x3
<400> 6
gggguacgcc accauggaag guaagccuau cccuaacccu cuccucgguc ucgauucuac 60
gggcagcagc ggcggcaaac cgauuccgaa cccgcugcug ggccuggaua gcaccgguag 120
cagcggcggu aagccuaucc cuaacccucu ccucggucuc gauucuacgg uuuaaacaaa 180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 237
<210> 7
<211> 276
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223> G276
<400> 7
gggagagaua ucacgcguuc uagagcuagc gcuaccggac ucagaucucg agcucaagcu 60
uggcauuccg guacuguugg uaaagccacc auggcuucca agguguacga ccccgagcaa 120
cgcaaacgca ugaucacugg gccucagugg ugggcucgcu gcaagcaaau gaacgugcug 180
gacuccuuca ucaacuacua ugauuccgag aagcacgccg agaacgccgu gauuuuucug 240
caugguaacg cugccuccag cuaccugugg aggcac 276
<210> 8
<211> 993
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223> gluc
<400> 8
ggggguacgc caccauggga gucaaaguuc uguuugcccu gaucugcauc gcuguggccg 60
aggccaagcc caccgagaac aacgaagacu ucaacaucgu ggccguggcc agcaacuucg 120
cgaccacgga ucucgaugcu gaccgcggga aguugcccgg caagaagcug ccgcuggagg 180
ugcucaaaga guuggaagcc aaugcccgga aagcuggcug caccaggggc ugucugaucu 240
gccuguccca caucaagugc acgcccaaga ugaagaaguu caucccagga cgcugccaca 300
ccuacgaagg cgacaaagag uccgcacagg gcggcauagg cgaggcgauc gucgacauuc 360
cugagauucc uggguucaag gacuuggagc ccuuggagca guucaucgca caggucgauc 420
ugugugugga cugcacaacu ggcugccuca aagggcuugc caacgugcag uguucugacc 480
ugcucaagaa guggcugccg caacgcugug cgaccuuugc cagcaagauc cagggccagg 540
uggacaagau caagggggcc gguggugacu aaggauccua gggccgcagc ucgcuuucuu 600
gcuguccaau uucuauuaaa gguuccuuug uucccuaagu ccaacuacua aacuggggga 660
uauuaugaag ggccuugagc auuuggauuc ugccuaauaa aaaacauuua uuuucauugc 720
guuuagcucg cuuucuugcu guccaauuuc uauuaaaggu uccuuuguuc ccuaagucca 780
acuacuaaac ugggggauau uaugaagggc cuugagcauu uggauucugc cuaauaaaaa 840
acauuuauuu ucauugcauu uaaauguuua aacaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 993
<210> 9
<211> 1155
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223> egfp
<400> 9
ggggguacgc caccauggug agcaagggcg aggagcuguu caccggggug gugcccaucc 60
uggucgagcu ggacggcgac guaaacggcc acaaguucag cguguccggc gagggcgagg 120
gcgaugccac cuacggcaag cugacccuga aguucaucug caccaccggc aagcugcccg 180
ugcccuggcc cacccucgug accacccuga ccuacggcgu gcagugcuuc agccgcuacc 240
ccgaccacau gaagcagcac gacuucuuca aguccgccau gcccgaaggc uacguccagg 300
agcgcaccau cuucuucaag gacgacggca acuacaagac ccgcgccgag gugaaguucg 360
agggcgacac ccuggugaac cgcaucgagc ugaagggcau cgacuucaag gaggacggca 420
acauccuggg gcacaagcug gaguacaacu acaacagcca caacgucuau aucauggccg 480
acaagcagaa gaacggcauc aaggugaacu ucaagauccg ccacaacauc gaggacggca 540
gcgugcagcu cgccgaccac uaccagcaga acacccccau cggcgacggc cccgugcugc 600
ugcccgacaa ccacuaccug agcacccagu ccgcccugag caaagacccc aacgagaagc 660
gcgaucacau gguccugcug gaguucguga ccgccgccgg gaucacucuc ggcauggacg 720
agcuguacaa guaaggaucc uagggccgca gcucgcuuuc uugcugucca auuucuauua 780
aagguuccuu uguucccuaa guccaacuac uaaacugggg gauauuauga agggccuuga 840
gcauuuggau ucugccuaau aaaaaacauu uauuuucauu gcguuuagcu cgcuuucuug 900
cuguccaauu ucuauuaaag guuccuuugu ucccuaaguc caacuacuaa acugggggau 960
auuaugaagg gccuugagca uuuggauucu gccuaauaaa aaacauuuau uuucauugca 1020
uuuaaauguu uaaacaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140
aaaaaaaaaa aaaaa 1155
<210> 10
<211> 2098
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> fluc
<400> 10
gggagtactg ttggtaaagc caccatggaa gacgccaaaa acataaagaa aggcccggcg 60
ccattctatc ctctagagga tggaaccgct ggagagcaac tgcataaggc tatgaagaga 120
tacgccctgg ttcctggaac aattgctttt acagatgcac atatcgaggt gaacatcacg 180
tacgcggaat acttcgaaat gtccgttcgg ttggcagaag ctatgaaacg atatgggctg 240
aatacaaatc acagaatcgt cgtatgcagt gaaaactctc ttcaattctt tatgccggtg 300
ttgggcgcgt tatttatcgg agttgcagtt gcgcccgcga acgacattta taatgaacgt 360
gaattgctca acagtatgaa catttcgcag cctaccgtag tgtttgtttc caaaaagggg 420
ttgcaaaaaa ttttgaacgt gcaaaaaaaa ttaccaataa tccagaaaat tattatcatg 480
gattctaaaa cggattacca gggatttcag tcgatgtaca cgttcgtcac atctcatcta 540
cctcccggtt ttaatgaata cgattttgta ccagagtcct ttgatcgtga caaaacaatt 600
gcactgataa tgaattcctc tggatctact gggttaccta agggtgtggc ccttccgcat 660
agaactgcct gcgtcagatt ctcgcatgcc agagatccta tttttggcaa tcaaatcatt 720
ccggatactg cgattttaag tgttgttcca ttccatcacg gttttggaat gtttactaca 780
ctcggatatt tgatatgtgg atttcgagtc gtcttaatgt atagatttga agaagagctg 840
tttttacgat cccttcagga ttacaaaatt caaagtgcgt tgctagtacc aaccctattt 900
tcattcttcg ccaaaagcac tctgattgac aaatacgatt tatctaattt acacgaaatt 960
gcttctgggg gcgcacctct ttcgaaagaa gtcggggaag cggttgcaaa acgcttccat 1020
cttccaggga tacgacaagg atatgggctc actgagacta catcagctat tctgattaca 1080
cccgaggggg atgataaacc gggcgcggtc ggtaaagttg ttccattttt tgaagcgaag 1140
gttgtggatc tggataccgg gaaaacgctg ggcgttaatc agagaggcga attatgtgtc 1200
agaggaccta tgattatgtc cggttatgta aacaatccgg aagcgaccaa cgccttgatt 1260
gacaaggatg gatggctaca ttctggagac atagcttact gggacgaaga cgaacacttc 1320
ttcatagttg accgcttgaa gtctttaatt aaatacaaag gatatcaggt ggcccccgct 1380
gaattggaat cgatattgtt acaacacccc aacatcttcg acgcgggcgt ggcaggtctt 1440
cccgacgatg acgccggtga acttcccgcc gccgttgttg ttttggagca cggaaagacg 1500
atgacggaaa aagagatcgt ggattacgtc gccagtcaag taacaaccgc gaaaaagttg 1560
cgcggaggag ttgtgtttgt ggacgaagta ccgaaaggtc ttaccggaaa actcgacgca 1620
agaaaaatca gagagatcct cataaaggcc aagaagggcg gaaagtccaa attgtaagga 1680
tcctagggcc gcagctcgct ttcttgctgt ccaatttcta ttaaaggttc ctttgttccc 1740
taagtccaac tactaaactg ggggatatta tgaagggcct tgagcatttg gattctgcct 1800
aataaaaaac atttattttc attgcgttta gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta 1860
aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac taaactgggg gatattatga agggccttga 1920
gcatttggat tctgcctaat aaaaaacatt tattttcatt gcatttaaat gtttaaacaa 1980
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2098
<210> 11
<211> 50
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> A0
<400> 11
tggctggccg catgcccgct tcccttgatc ggctatggct ggccgcatgc 50
<210> 12
<211> 51
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> A1
<400> 12
tggctggccg catgcccgct tccctatgat cggctatggc tggccgcatg c 51
<210> 13
<211> 53
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> A3
<400> 13
tggctggccg catgcccgct tccctaaatg atcggctatg gctggccgca tgc 53
<210> 14
<211> 55
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> A5
<400> 14
tggctggccg catgcccgct tccctaaaaa tgatcggcta tggctggccg catgc 55
<210> 15
<211> 50
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> B1
<400> 15
tggctggccg catgcccgct tcccaagatc ggctatggct ggccgcatgc 50
<210> 16
<211> 50
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> B3
<400> 16
tggctggccg catgcccgct tcaaaaattc ggctatggct ggccgcatgc 50
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> B5
<400> 17
tggctggccg catgcccgct aaaaaaataa ggctatggct ggccgcatgc 50
<210> 18
<211> 45
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> C1
<400> 18
tggctggccg catgcccgct tcatcggcta tggctggccg catgc 45
<210> 19
<211> 47
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> C3
<400> 19
tggctggccg catgcccgct tcaaatcggc tatggctggc cgcatgc 47
<210> 20
<211> 49
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> C5
<400> 20
tggctggccg catgcccgct tcaaaaatcg gctatggctg gccgcatgc 49
<210> 21
<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> A2
<400> 21
tggctggccg catgcccgct tccctaatga tcggctatgg ctggccgcat gc 52
<210> 22
<211> 54
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> A4
<400> 22
tggctggccg catgcccgct tccctaaaat gatcggctat ggctggccgc atgc 54
<210> 23
<211> 50
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> B0a
<400> 23
tggctggccg catgcccgct tccctagatc ggctatggct ggccgcatgc 50
<210> 24
<211> 50
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> B0b
<400> 24
tggctggccg catgcccgct tcccatgatc ggctatggct ggccgcatgc 50
<210> 25
<211> 50
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> B1a
<400> 25
tggctggccg catgcccgct tccctaaatc ggctatggct ggccgcatgc 50
<210> 26
<211> 50
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> B1b
<400> 26
tggctggccg catgcccgct tccaatgatc ggctatggct ggccgcatgc 50
<210> 27
<211> 50
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> B2
<400> 27
tggctggccg catgcccgct tccaaaaatc ggctatggct ggccgcatgc 50
<210> 28
<211> 51
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> D11
<400> 28
tggctggccg catgcccgct tcccaaagat cggctatggc tggccgcatg c 51
<210> 29
<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> D22
<400> 29
tggctggccg catgcccgct tccaaaaaaa tcggctatgg ctggccgcat gc 52
<210> 30
<211> 53
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> D33
<400> 30
tggctggccg catgcccgct tcaaaaaaaa ttcggctatg gctggccgca tgc 53
Claims (9)
- 하기 화학식 1의 RNA 유사체:
화학식 1
여기서:
R 1 은 하기와 같고:
하기 화학식 2a의 RNA 쇄:
화학식 2a
여기서:
n은 1 내지 10,000 범위의 자연수이고,
m은 0 내지 3 범위의 자연수이고,
X1은 독립적으로 OH 또는 OCH3임; 또는
하기 화학식 2b의 RNA 쇄:
화학식 2b
여기서:
n은 1 내지 10,000 범위의 자연수이고,
X1은 독립적으로 OH 또는 OCH3이고,
X2는 N3 또는 기임; 또는
하기 화학식 2c의 RNA 쇄:
화학식 2c
여기서:
n은 1 내지 10,000 범위의 자연수이고,
m은 1 내지 4 범위의 자연수이고,
X1은 독립적으로 OH 또는 OCH3이고,
X2 및 X3은 독립적으로: OH, OCH3,
또는 임;
R 2 는 바람직하게는
로부터 선택된, 천연 또는 변형된 퓨린 또는 피리미딘 질소함유 염기(nitrogenous base)이고,
R 3 은 하기와 같은 작용성 치환체(functional substituent)이고:
하기 화학식 3a의 생물직교 기(bioorthogonal group)를 함유하는 치환체:
화학식 3a
여기서
Y는 NH2, N3 또는 기임; 또는
하기 화학식 3b의 시아닌 기로부터의 형광단의 구조를 갖는 치환체:
화학식 3b
여기서
Y1 및 Y2는 독립적으로 CH3, (CH2)3SO3H 또는 (CH2)4SO3H이고,
Z1 및 Z2는 독립적으로 SO3H 또는 H임; 또는
하기 화학식 3c의 로다민 또는 플루오레세인 기로부터의 형광단(fluorophore)의 구조를 갖는 치환체:
화학식 3c
여기서
Y1 및 Y2는 독립적으로 SO3H, OCH3, OH, COOH 또는 H이고,
Z1 및 Z2는 독립적으로 NH 또는 O이고,
Z3은 NH2 또는 OH 기임; 또는
하기 화학식 3d의 로다민 기로부터의 형광단의 구조를 갖는 치환체:
화학식 3d
여기서
Y1 및 Y2는 독립적으로 SO3H, OCH3, OH, COOH 또는 H이고,
Y3은 CH2CH3, CH3 또는 H 기이고,
Z1 및 Z2는 독립적으로 NH 또는 O이고,
Z3은 NH2 또는 OH기임; 또는
하기 화학식 3e의 친화성 태그 구조(affinity tag structure)를 갖는 치환체:
화학식 3e
; 또는
하기 화학식 3f의 핵산 구조를 갖는 치환체:
화학식 3f
여기서
Y는 독립적으로 OCH3, OH 또는 H이고,
n은 1 내지 30 범위의 자연수이고,
R2는 상기와 같은 질소함유 염기임; 또는
하기 화학식 3g의 핵산 구조를 갖는 치환체:
화학식 3g
여기서
Y는 독립적으로 OCH3, OH 또는 H 기이고,
m은 1 내지 4 범위의 자연수이고,
n은 1 내지 30 범위의 자연수이고,
R2는 상기와 같은 질소함유 염기임; 또는
하기 화학식 3h의 핵산 구조를 갖는 치환체:
화학식 3h
여기서
Y는 독립적으로 OCH3, OH 또는 H 기이고,
m은 1 내지 4 범위의 자연수이고,
n은 1 내지 30 범위의 자연수이고,
R2는 상기와 같은 질소함유 염기임;
상기 화학식 (3a 내지 3h)에서 X는 하기 기 중 임의의 기 또는 이들 중 다수의 일련의 조합인 화학식의 링커(linker)이다:
;
여기서 m은 1 내지 10 범위의 자연수이다. - 하기 화학식 4의 RNA의 용액:
화학식 4
을 연속적으로
(i) 메타퍼요오드산(metaperiodic acid; HIO4), 및 이의 염, 메타퍼요오드산(HIO4) 또는 이의 염의 용액과 배양(incubation)하여 하기 화학식 5의 화합물을 제공하고:
화학식 5
(ii) 환원 매질에서 하기 화학식 6의 에틸렌디아민 유사체와 배양하여:
화학식 6
하기 화학식 1의 RNA 유사체를 제공하는 것
을 특징으로 하는, 제1항에 정의된 바와 같은 화학식 1의 RNA 유사체를 제조하기 위한 방법:
화학식 1
상기 화학식들에서, R1, R2 및 R3 기의 의미는 제1항에 정의된 바와 같다. - 제2항에 있어서,
단계 (i) 및 (ii)를 하나의 반응기에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제2항 또는 제3항에 있어서,
RNA가 하기와 같은 것을 특징으로 하는, 방법:
하기 화학식 4a의 화합물:
화학식 4a
여기서
n은 1 내지 10,000 범위의 자연수이고,
m은 0 내지 3 범위의 자연수이고,
X1은 독립적으로 OCH3 또는 OH임; 또는
하기 화학식 4b의 화합물:
화학식 4b
여기서
n은 1 내지 10,000 범위의 자연수이고,
X1은 독립적으로 OH 또는 CH3 기이고,
X는 N3 또는 기임; 또는
하기 화학식 4c의 화합물:
화학식 4c
여기서
n은 1 내지 10,000 범위의 자연수이고,
m은 1 내지 4 범위의 자연수이고,
X1은 독립적으로 OH 또는 OCH3이고,
X2 및 X3은 독립적으로 OH, OCH3,
또는 이다. - 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (i)를, 바람직하게는 1.0 내지 1.5 mM 농도의 NaIO4의 존재 하에 40℃ 미만의 온도 및 1 내지 100 μM의 RNA 농도에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (ii)를, 바람직하게는 pH 5.5-7.5의 KH2PO4 완충제(buffer), 100 mM을 초과하지 않는 농도, 바람직하게는 20 mM 농도의 NaBH3CN 환원제, 및 1-10 mM 농도의 에틸렌디아민 유사체의 존재 하에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
수득된 RNA 유사체를 공지된 RNA 단리 방법에 의해, 바람직하게는 RNA 염의 알콜 침전에 의해 또는 고-성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 반응 혼합물로부터 단리하는 것을 특징으로 하는, 방법. - 하기 화학식 7의 에틸렌디아민 유사체:
화학식 7
여기서
R은 하기와 같고:
하기 화학식 7a의 시아닌 기로부터의 형광단의 구조를 갖는 치환체:
화학식 7a
여기서
Y1 및 Y2는 독립적으로 CH3, (CH2)3SO3H 또는 (CH2)4SO3H이고,
Z1 및 Z2는 독립적으로 SO3H 또는 H임; 또는
하기 화학식 7b의 로다민 또는 플루오레세인 기로부터의 형광단의 구조를 갖는 치환체:
화학식 7b
여기서
Y1 및 Y2는 독립적으로 SO3H, OCH3, OH, COOH 또는 H이고,
Z1 및 Z2는 독립적으로 NH 또는 O이고,
Z3은 NH2 또는 OH 기임; 또는
하기 화학식 7c의 로다민 기로부터의 형광단의 구조를 갖는 치환체:
화학식 7c
여기서
Y1 및 Y2는 독립적으로 SO3H, OCH3, OH, COOH 또는 H이고,
Y3은 CH2CH3, CH3 또는 H 기이고,
Z1 및 Z2는 독립적으로 NH 또는 O이고,
Z3은 NH2 또는 OH 기임; 또는
하기 화학식 7d의 친화성 태그 구조를 갖는 치환체:
화학식 7d
; 또는
하기 화학식 7e의 핵산 구조를 갖는 치환체:
화학식 7e
여기서
Y는 독립적으로 OCH3, OH 또는 H 기이고,
n은 1 내지 30 범위의 자연수이고,
R2는 상기와 같은 질소함유 염기임; 또는
하기 화학식 7f의 핵산 구조를 갖는 치환체:
화학식 7f
여기서
Y는 OCH3, OH 또는 H 기이고,
m은 1 내지 4 범위의 자연수이고,
n은 1 내지 30 범위의 자연수이고,
R2는 상기와 같은 질소함유 염기임; 또는임; 또는임; 또는산 구조를 갖는 치환체:
화학식 7g
여기서
Y는 독립적으로 OCH3, OH 또는 H 기이고,
m은 1 내지 4 범위의 자연수이고,
n은 1 내지 30 범위의 자연수이고,
R2는 상기와 같은 질소함유 염기임;
상기 화학식 (7a 내지 7g)에서 X는 하기 기 중 임의의 기 또는 이들 중 다수의 일련의 조합인 화학식의 링커임:
여기서 m은 1 내지 10 범위의 자연수이다. - 제8항에 있어서,
하기 화학식의 화합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 에틸렌디아민 유사체:
.
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