KR100218113B1 - 신규 염기쌍 설계를 이용한 비특이적 혼성화의 감소방법 - Google Patents

신규 염기쌍 설계를 이용한 비특이적 혼성화의 감소방법 Download PDF

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패트릭 이. 쉐리단
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미카엘 에스. 우르데아
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케네스 엠. 골드만
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Abstract

핵산 혼성화 측정법에서 마주치는 백그라운드 신호를 실질적으로 줄이기 위한 방법이 제공된다. 이 방법은 관심의 표적 폴리뉴클레오티드가 존재할때만 생성되는 검출가능한 신호를 제공하기 위해 비특이적 혼성화 현상의 제거 또는 상당한 감소를 전제로 한다. 또한 이소구아노신 또는 2'-데옥시-이소구아노신의 신규 화학적 합성법이 제공된다. 또한 본 발명은 안티센스 및 압타머 요법 및 약제발견에도 용도를 가진다.

Description

[발명의 명칭]
신규 염기쌍 설계를 이용한 비특이적 혼성화의 감소방법
[기술분야]
본 발명은 일반적으로 핵산화학 및 혼성화 측정법에 관한 것이다. 더 구체적으로 본 발명은 주로 비특이적 혼성화로 인한 백그라운드 노이즈(background noise)를 최소화 시킴으로써 핵산 혼성화 측정법에 있어 더욱 표적-의존성인 신호를 발생시키는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 안티센스 및 압타머(aptamer)요법 및 약제발견에서도 용도를 가진다.
[배경기술]
핵산 혼성화 측정법은 유전학 연구, 생체의학연구 및 임상진단에서 일반적으로 사용된다. 기본 핵산 혼성화 측정법에서는, 단일가닥 분석물(analyte)핵산이 표지된 단일가닥 핵산 프로브에 혼성화되어 결과의 표지된 이중체가 검출된다. 이러한 기본설계의 변화는 정확도를 향상시키고 외부물질로부터 검출될 이중체의 분리를 용이하게 하고 및/또는 검출된 신호를 증폭시키기 위해 개발되어 왔다.
본 발명은 어떤 핵산 혼성화 측정법에서도 마주치는 백그라운드 노이즈를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 일반적으로 본 개시 기술에 의해 다뤄지는 백그라운드 노이즈는 주어진 측정법에 사용된 다양한 폴리뉴클레오티드 성분들의 바람직하지 않은 상호작용, 즉 분석물의 존재 또는 양에 대응하지 않는 신호를 일으키는 상호작용에 기인한다.
본 발명은 폴리뉴클레오티드 분석물의 존재 또는 양과 상관되는 검출가능한 신호를 생성하기 위해 복수의 혼성화 단계가 수행되는 어떤 측정법에서도 유용하다.
그러한 한 측정법은 Urdea et al.의 미국특허번호 4,868,105에 상세히 기재되어 있으며, 그 개시는 여기에 참고문헌으로 포함된다. 그 측정법은 폴리뉴클레오티드 분석물을 고상지지체에 결합시키도록 고안된 2부 포획시스템과 검출가능한 표지를 검출 또는 정량될 폴리뉴클레오티드 분석물에 결합시키도록 고안된 2부 표지시스템의 사용을 포함한다. 2부 포획시스템은 고상 지지체에 결합된 포획프로브와 포획프로브의 절편 및 폴리뉴클레오티드 분석물의 절편에 둘다 혼성화하는 포획확장분자의 사용을 포함한다. 2부 표지시스템은 폴리뉴클레오티드 분석물의 절편에 혼성화하는 표지확장분자와 표지확장분자에 혼성화하고 검출가능한 표지를 함유하거나 결합하는 표지프로브의 사용을 포함한다. 그러한 시스템의 이점은 두 개의 별개 혼성화 반응이 분석물 "포획"을 위해 일어나야 하고 유사하게 두 개의 별개 혼성화 반응이 분석물 표지를 위해 일어나야 하는 한, 분석물의 존재와 상관되도록 표지가 검출되기 위해 복수의 혼성화 단계가 수행되어야 한다는 것이다. 그러나 분석물의 존재 또는 양에 대응하지 않는 방식으로 검출신호가 발생될 수 있는 다수의 방법이 남아 있으며, 이하 이들을 상세히 설명할 것이다.
본 발명이 유용한 측정법의 또다른 예는 Urdea et al.의 미국특허번호 5,124,246에 기재된 신호증폭방법이며, 그 개시는 여기에 참고문헌으로 포함된다. 그 방법에서 신호는 증폭 멀티어, 표지 확장자에 특이적으로 혼성화하는 제1절편과 표지 프로브에 특이적으로 혼성화하는 복수의 동일 제2절편을 함유하도록 구성된 폴리뉴클레오티드의 사용을 통해 증폭된다. 증폭의 정도는 이론적으로 제2절편의 반복수에 비례한다. 멀티머는 선형 또는 분지형일 수 있다. 분지형 멀티머는 포크 또는 빗모양일 수 있으며, 빗-유형 멀티머가 바람직하다.
핵산 혼성화 측정법에서 방해 백그라운드 신호의 문제점을 해결하기 위한 한 접근법이 PCT 공개번호 WO 95/16055에 제공되며, 여기서 검출가능한 신호를 유발하기 위해 적어도 두 개의 포획확장자 및/또는 두 개 이상의 표지확장자가 분석물에 결합해야 한다. 백그라운드 노이즈를 더 줄이기 위해, 측정법은 다중성분 복합체 형성에 유리한 조건하에 수행된다.
혼성화 측정법에서 신호의 표적 의존성을 증가시키기 위해 제안된 또 다른 접근법은 발명자 Heller et al.의 유럽특허공개번호 70,685에 기재되어 있다. 이 참고문헌은 비방사성 에너지 전달이 근접 프로브사이에 일어나고 표적-발생신호가 생성되어 검출의 정확도를 높이기 위해 두 개의 별개 반응이 일어나야 하는 동종 혼성화 측정법을 기술한다.
또한 본 발명은 혼성화 측정법에서 폴리뉴클로티드 분석물의 검출 및 정량의 정확도를 높이기 위해 고안된다. 본 발명은 표적의 부재중 일어나는 신호 발생률을 감소시킴으로써 그러한 축정법의 감도 및 특이성 둘다를 증가시키며, 현재 사용되는 측정법 구성에 비해 시간 또는 비용의 증가를 포함하지 않는다.
본 발명의 목적, 즉 핵산 혼성화 측정법에서 백그라운드 노이즈를 감소시키고 분석물의 검출 및 정량의 정확도를 증가시키는 것은 "비자연적"(nonnatural)수소결합패턴 덕분에 염기쌍을 형성하는 뉴클레오시드 변이체의 사용에 의해 부분적으로 성취되었다. 여기서 사용된 "비자연적" 염기쌍은 아데노신(A), 티미딘(T), 시티딘(C), 구아노신(G) 또는 우리딘(U) 이외의 뉴클레오티드 단위체 사이에 형성된 염기쌍을 의미한다. 그러한 한가지 비자연적 뉴클레오시드 염기쌍은 이소시토신(iso C) 및 이소구아닌(iso G)사이에 형성된다. iso C 및 iso G는 표준배열을 갖는 염기쌍(즉 "Watson-Crick 염기쌍")을 형성할 수 있으나, 다음과 같이 시토신(C) 대 구아닌(G)의 결합에 관여한 것이외의 수소결합을 포함한다:
Figure kpo00001
Leach et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 3675-3683은 분자역학, 분자동역학 및 자유에너지 섭동계산법을 이용하여 iso C * iso G 염기쌍의 구조 및 안정성을 연구하였다. Tor et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115: 4461-4467은 DNA 주형내 변형 iso C 가 iso G유사체의 전사 RNA 산물내로의 통합을 유도하는 방법을 기술한다. Switzer et al. (1993) Biochemistry 32: 10489-10496은 iso C 및 iso G 사이에 형성된 염기쌍이 DNA 및 RNA 중합효소에 의해 DNA 및 RNA내로 통합될 수 있는 조건을 연구하였다.
새로운 염기쌍의 DNA 올리고머 내로의 도입은 혼성화에 대한 더욱 정확한 제어를 가능케하는 잠재능을 재공한다.
[발명의 개요]
본 발명은 샘플에서 핵산 분석물은 검출하기 위한 방법 및 키트를 제공한다. 일반적으로 그 방법은 원위치(in situ) 혼성화 측정법, 서던, 노던, 도트 블롯과 같은 핵산 혼성화 측정법과 중합효소 연쇄반응 측정법에서 개선점을 나타낸다. 특히 그 방법은 분석물을 고상 지지체에 결합시키고 분석물을 표지화하고 지지체상에서 표지의 존재를 검출하는 것을 포함하는 액상 샌드위치 혼성화 측정법 상에서의 개선점을 나타낸다. 바람직한 방법은 분석물-프로브 복합체에 더 많은 표지의 결합을 가능케 하여 분석의 감도 및 특이성을 향상시키는 증폭 멀티머의 사용을 포함한다.
본 발명의 제1태양에서, 염기쌍 형성을 할 수 있는 아데노신(A), 티미딘(T), 시티딘(C), 구아노신(G) 또는 우리딘(U) 이외의 하나 이상의 뉴클레오티드 단위체가 비표적 혼성화 올리고뉴클레오티드 절편, 즉 핵산 혼성화 측정성분중 "범용(universal" 절편내로 통합되는 측정법이 제공된다. 그러한 뉴클레오티드 단위체의 사용은 범용 절편사이의 향상된 결합 특이성을 초래하는 독특한 염기쌍 설계를 일으킨다.
본 발명의 관련 태양에서, A,T,C,G 또는 U 이외의 제2뉴클레오티드 단위체와 염기쌍 형성을 할 수 있는 A,T,C,G 또는 U 이외의 적어도 하나의 제1뉴클레오티드 단위체가 표적 분산물 이외의 측정성분에 존재하는 핵산서열에 상보적인 측정성분 중 핵산 서열내로 통합되는 측정법이 제공된다. 두가지 그러한 뉴클레오티드 단위체 사이에 형성된 염기쌍의 예가 다음 구조식(I) 내지 (Ⅳ)에 주어진다:
Figure kpo00002
Figure kpo00003
Figure kpo00004
및
Figure kpo00005
상기식에서 R은 폴리뉴클레오티드 내로 통합시 염기가 상보적 뉴클레오티드 단위체와 염기쌍을 형성하도록 해주는 골격을 나타내고, R'는 예컨대 수소, 메틸, α-또는 β-프로피닐, 브롬, 플루오르, 요오드 등이다. 그러한 뉴클레오티드 단위체를 그러한 소위 "범용" 서열, 즉 표적분석물과의 혼성화에 관여하지 않는 서열내로 통합시킴으로써, 비특이적 혼성화의 가능성이 크게 감소된다. 한가지 바람직한 구체예에소 제1 및 제2뉴클레오티드 단위체는 식(1)에 도시되듯이 교환적으로 이소시티딘 및 이소구아노신으로 구성된다.
본 발명의 관련 태양에서, 하나 이상의 별개 포획확장분자에 의해 매개된 분서물 및 지지체-결합된 포획 프로브, 및/또는 표지확장자 및 증폭자 또는 전치증폭자 사이에 형성된 복합체의 융점 Tm₁이 표지된 프로브 및 증폭자사이에 형성된 복합체의 융점 Tm₂보다 상당히 더 낮은 측정법이 제공된다. 이 태양에서, 측정은 초기에 혼성 복합체의 형성에 유리한 조건하에 수행된다. 그다음 측정도중 Tm1혼성 복합체를 불안정화시키도록 조건이 변화된다.
추가적으로 본 발명은 상기 각 기술이 조합된, 즉 A,T,G,C 또는 U 이외의 뉴클레오티드 단위체가 측정성분중 범용 절편내로 통합되고 Tm₁ 혼성 복합체의 융점이 Tm₂ 혼성 복합체의 융점보다 상당히 더 낮은 혼성화 측정법을 실시하는 방법을 포함한다.
또다른 태양에서, 본 발명을 이소구아노신 또는 2'-데옥시-이소구아노신을 합성하는 신규방법을 포함한다.
마지막으로 본 발명은 여기에 설명되고 청구된 측정법의 실시에 필요한 시약을 함유하는 키트를 포함한다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 종래기술의 액상 샌드의치 혼성화 측정법을 도시하며, 굵은 선은 범용서열을 가리킨다.
제2도는 프로브를 이중가닥 DNA에 결합시키는 방법을 도시하며, 굵은 선은 범용 서열을 가리킨다.
제3도는 비특이적 혼성화를 막기위한 비자연적 뉴클레오티드-함유 프로브 및 콤페티머(competimer)를 도시한다.
[발명의 상세한 설명]
[정의 및 명명]
본 발명을 상세히 개시 및 설명하기 전에, 본 발명이 특정 측정 포맷, 재료 또는 시약에 한정되지 않고 물론 변할 수도 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한 여기 사용된 용어는 특정 구체예만의 설명을 목적으로 하며 제한될 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서 및 하기 청구의 범위에서 다음 의미를 갖는 것으로 정의될 수 있는 다수의 용어가 언급될 것이다:
여기에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 폴리데옥시리보뉴클레오티드(2-데옥시-D-리보스를 함유), 폴리리보뉴클레오티드(D-리보스를 함유), 퓨린 또는 피리미딘염기의 N-또는 C-글리코시드인 다른 어떤 유형의 폴리뉴클레오티드, 그리고 비뉴클리오티드 골격을 함유하는 다른 폴리머 예컨데 폴리아미드(예컨데 펩티드 핵산(PNA)) 및 폴리모르폴리노(NeugeneTM폴리머로서 Anti-Virals, Inc. Corvallis, Oregon에서 상업적으로 구입가능)와 폴리머가 DNA 및 RNA에서 발견되는 것과 같은 염기쌍 및 염기중첩을 허용하는 구조를 핵염기를 함유하는 한 다른 합성 서열-특정 핵산 폴리머의 일반명일 것이다. 영어 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"사이의 의도된 길이 구별은 없으며, 이들 용어는 호환적으로 사용될 것이다. 이들 용어는 오직 분자의 1차 구조만을 언급한다. 따라서 이들 용어는 이중 및 단일가닥 DNA 뿐만아니라, 이중 및 단일가닥 RNA, DNA:RNA 혼성체와 PAN 및 DNA 또는 RNA 사이의 혼성체도 포함하며, 또는 공지유형의 변형들, 예컨대 당업계에 공지된 표지, 메틸화, "캡", 하나 이상의 자연발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환 예컨대 전하를 띠지 않는 결합 (예컨대 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 카르바메이트 등), 음전하를 띠는 결합(예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)및 양전하를 띠는 결합(예컨대 아미노알킬포스포르아미데이트, 아미노알킬포스포트리에스테르)을 갖는 것, 예컨대 단백질(뉴클레아제, 독소, 항체. 신호펩티드, 폴리-L-리신등을 포함)과 같은 펜던트기를 함유하는 것, 삽입체(예컨대 아크리딘, 소랄렌 등)을 갖는 것, 킬레이터(예컨대 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속등)를 함유하는 것, 알킬레이터를 함유하는 것, 변형결합(예컨대 알파 아노머 핵산등)을 갖는 것과 같은 뉴클레오티드간 변형 뿐만 아니라, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 변형되지 않은 형태도 포함된다.
여기 사용된 용어 "뉴클레오시드" 및 "뉴클레오티드"는 공지의 퓨린 및 파라미딘 염기뿐만 아니라 변형된 다른 헤테로시클릭 염기를 함유하는 부분을 포함한다고 이해될 것이다. 그러한 변형은 메틸화 퓨린 또는 피리미딘, 아실화 퓨린 또는 피리미딘, 또는 다른 헤테로고리를 포함한다. 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 또한 당 부분상의 변형, 예컨대 하나 이상의 히드록실기가 할로겐, 지방족기로 치환되거나 에테르, 아민 등으로 작용화(functionalize)기능화되는 변형을 포함할 것이다, 용어 "뉴클레오티드 단위체"는 뉴클레오시드 및 뉴클리오티드를 포함한다고 의도된다.
더욱이 뉴클레오티드 단위체의 변형은 재배열, 첨부, 치환 또는 개별 상보적 피리미딘 또는 퓨린과 수소 결합을 형성하는 퓨린 또는 피리미딘 염기상의 작용기의 변화를 포함한다. 결과의 변형 뉴클레오티드 단위체는 다른 그러한 변형 뉴클레오티드 단위체와 염기쌍을 형성할 수 있으나 A,T,C,G 또는 U와의 형성하지 못한다. 표준 A-T 및 G-C 염기쌍은 티미딘의 N³-H 및 C⁴-옥시와 아데노신의 각각 N¹ 및 C6-NH₂ 사이 그리고 시티딘의 C²-옥시, N³ 및 C⁴-NH₂와 구아노신의 각각 C²-NH₂,N¹-H 및 C6-옥시 사이의 수소결합 형성을 허용하는 조건하에 형성된다. 따라서 예컨대 구아노신(2-아미노-6-옥시-9-β-D-리보푸라노실-퓨린)이 변형되어 이소구아노신(2-옥시-6-아미노-9-β-D-리보푸라노실-퓨린)을 형성할 수 있다. 그러한 변형은 더 이상 시토신과 표준 염기쌍을 효과적으로 형성하지 않는 뉴클레오시드 염기를 초래한다. 그러나 시토신(1-β-D-리보푸라노실-2-옥시-4-아미노-피리미딘)의 변형으로 인한 이소시토신(1-β-D-리보푸라노실-2-아미노-4-옥시-피리미딘의 형성은 구아노신과 효과적으로 염기쌍을 형성할 수 있으나 이소구아노신과는 염기쌍을 형성하지 않는 변형 뉴클레오티드를 초래한다. 이소시토신은 Sigma Chemical Co.(St.Louis, Mo)에서 구입할 수 있고; 이소시티딘은 Switzer et al. (1993), 상기 및 거기에 인용된 참고문헌에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있고; 2'-데옥시-5-메틸-이소시티딘은 Tor et al. (1993), 상기 및 거기에 인용된 참고문헌에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있고; 이소구아닌 뉴클레오티드는 Switzer et al., 상기 및 Mantsch et al. (1993) Biochem. 14: 5593-5601에 기재된 방법 또는 하기에 상세히 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. ĸ 및 π라고 칭해지는 구조식(Ⅱ)에 도시된 비자연적 염기쌍은 2,6-디아미노피리미딘 및 그것의 상보체 (1-메틸피라졸로[4,3]-피리미딘-5,7-(4H,6H)-디온)의 합성을 위해 Piccirilli et al. (1990) Nature 343: 33-37에 기재된 방법에 의해 합성될 수 있다. 단일(unique) 염기쌍을 형성하는 다른 그러한 변형 뉴클레오티드 단위체는 Leach et al. (1992) J.Am. Chem. Soc. 114: 3675-3683 및 Switzer et al., 상기에 기재되었거나 당업계의 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
용어 "폴리뉴클레오티드 분석물"은 표적 뉴클리오티드 서열을 함유하는 단일 또는 이중가닥 핵산분자를 의미한다. 분석물 핵산은 다양한 공급원, 예컨대 생물학적 유체 또는 고체, 식품, 환경물질등으로부터 얻을 수 있고, 다양한 수단, 예컨대 프로테인아제K/SDS, 카오트로픽염등에 의해 혼성화 분석을 위해 제조될 수 있다. 용어 "폴리뉴클레오티드 분석물"은 여기서 용어 "분석물", "분석물 핵산" 및 "표적"과 혼용된다.
여기서 사용된 용어 "표적영역" 또는 "표적 뉴클레오티드 서열"은 표적분자 내에 함유된 프로브 결합영역을 의미한다. 용어 "표적서열"은 원하는 조건하에 프로브가 안정한 혼성체를 형성할 수 있는 서열을 의미한다.
여기서 사용된 용어 "프로브"는 표적 분석물에 존재하는 핵산서열에 상보적인 핵산서열을 함유하는 상기와 같은 폴리뉴클레오티드로 이루어진 구조물을 의미한다. 프로브의 폴리뉴클레오티드 영역은 DNA 및/또는 RNA 및/또는 합성 뉴클레오티드 유사체로 구성될 수 있다.
결합서열은 안정한 혼성체를 제공하는 완전한 상보성을 가질 필요는 없다는 것이 이해될 것이다. 많은 경우에 4개 이상의 뉴클레오티드의 루프를 무시하고 염기의 약 10%미만이 부정합(mismatch)일때는 안정한 혼성체가 형성될 수 있다. 따라서 여기에 사용된 용어 "상보적"은 일반적으로 약 90%이상의 상동성이 존재하는 경우에 측정조건하에 그것의 "상보체"와 안정한 이중체를 형성하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
여기에 사용된 용어 "핵산 멀티머" 또는 "증폭 멀티머"는 동일 반복 단일가닥 올리고뉴클레오티드 절편 또는 서로 다른 단일가닥 폴리뉴클레오티드 절편의 선형 또는 분지형 플리머를 의미하며, 이들 각각은 표지된 프로브가 결합할 수 있는 영역을 함유하고, 즉 표지된 프로브에 함유된 핵산서열에 상보적인 핵산서열을 함유하며; 올리고뉴클레오티드 절연은 RNA, DNA, 변경 뉴클레오티드 또는 그것의 조합으로 구성될 수 있다. 적어도 하나의 절편은 표지된 프로브에 특이적으로 결합하도록 해주는 서열, 길이 및 조성을 가지고; 추가적으로 적어도 하나의 절편은 그것이 표지확장자 또는 전치증폭자에 특이적으로 결합하도록 해주는 서열, 길이 및 조성을 가진다. 전형적으로 그러한 절편은 약 15 내지 50, 바람직하게는 15 내지 30 뉴클레오티드를 함유할 것이고, 약 20% 내지 80%범위의 GC 함량을 가질 것이다, 멀티머내 올리고뉴클레오티드 절편의 총개수는 일반적으로 약 3 내지 1000의 범위, 더 전형적으로 약 10 내지 100의 범위, 가장 전형적으로 약 50일 것이다. 멀티머의 올리고뉴클레오티드 절편은 포스포디에스테르 결합을 통해 또는 핵산, 아미노산, 탄수화물 또는 폴리올 다리와 간은 삽입된 결합제를 통해 또는 핵산 또는 변형 핵산가닥을 가교 결합시킬수 있는 다른 가교제를 통해 서로 직접 공유결합될 수 있다. 이와 선택적으로 멀티머는 공유결합되지는 않으나 약간 다른 방법, 예컨대 혼성화를 통해 결합된 올리뉴클레오티드 절편으로 이루어질 수도 있다.
그러한 멀티머는 예컨대 Nilsen et al.의 미국특허번호 5,175,270에 기재되어 있다. 결합부위(들)는 절편의 말단에 (정상적 3'-5'방향 또는 임의적 방향) 및/또는 가닥내 하나이상의 내부 뉴클레오티드에 있을 수 있다. 선형 멀티미에서 개별적 절편은 말단과 말단이 연결되어 선형 폴리머를 형성한다. 한유형의 분지형 멀티머에서 3개이상의 올리고뉴클레오티드 절편이 한 기점으로부터 퍼져나가 분지형 구조를 형성한다. 기점은 다른 뉴클레오티드 절편이거나 또는 적어도 3개의 절편이 공유결합될 수 있는 다작용성 분자일 수 있다. 또다른 유형에서 하나 이상의 펜던트 올리고뉴클레오티드 절편을 갖는 올리고뉴클레오티드 절편 골격이 있다. 이들 후자유형의 멀티머는 "포크-유사", "빗-유사" 또는 조합 "포크- 및 빗-유사"의 구조를 가지며, 여기서 바람직한 멀티머인 "빗-유사" 멀티머는 골격어로부터 뻗은 다수의 측쇄를 갖는 선형 골격을 가지는 폴리뉴클레오티드이다. 펜던트 절편은 일반적으로 변형 뉴클레오티드에 또는 올리고뉴클레오티드가 결합되거나 달리 부착될 수 있는 적당한 작용기를 갖는 다른 유기부분에 매달릴 것이다. 멀티머는 전체적으로 선형, 전체적으로 분지형 또는 선형 및 분지형 부분의 조합일 수 있다. 전형적으로 멀티머내에는 적어도 두 개의 분지점, 더 바람직하게는 적어제3도개, 더 바람직하게는 약 5 내지 30범위의 분지점이 있을 것이나, 약간의 구체예에서는 더 많이 있을 수 있다. 멀티머는 이중가닥 서열의 하나 이상의 절편을 포함할 수 있다. 멀티머 합성 및 특정 멀티머 구조에 대한 더 이상의 정보는 Urdea et al.의 미국특허번호 5,124,246에서 발견될 수 있다.
PCT 공개번호 WO 92/02526은 본 방법과 관련하여 특히 바람직한 빗-모양 분지형 멀티머를 설명하며, 그것은 선형 골격 및 펜던트 측쇄로 구성되고; 골격은 분석물 핵산 또는 분석물 결합 핵산에 대한 특이적 혼성화 부위를 제공하는 절편을 포함하는 반면, 펜던트 측쇄는 표지된 프로브에 대한 특이정 혼성화 부위를 제공하는 절편의 반복을 포함한다.
상기와 같이 표지확장분자 및 증폭 멀티머 사이의 가교부분으로서 작용하는 "전치증폭자"분자가 또한 사용될 수 있다. 이경우에 더 많은 증폭자 및 그로 인한 더 많은 표지가 주어진 표적-프로브 복합체에 결합된다. 전치증폭자 분자는 선형 또는 분지형일 수 있고, 전형적으로 약 30 내지 약 300 뉴클레오티드의 범위를 함유한다. 여기의 바람직한 구체예에서, 전치증폭자 분자는 적어도 두 개의 다른 표지확장분자에 결합하여 측정의 전체 정확도를 증가시킨다(즉, 프로브-표적 복합체가 형성되기 위해 다시 복수의 혼성화 반응이 필요하기 때문).
여기에 사용된 "생물학적 샘플"은 개체에서 분리된 조직 또는 유체의 샘플을 의미하며, 예컨대 혈장, 혈청, 척수액, 정액, 림프액, 피부외부절편, 호흡관, 장관 및 성뇨관, 눈물, 타액, 밀크, 혈구, 종양, 기관과 또한 시험관내 세포배양 구성물의 샘플 (세포배양배지내 세포 성장으로 인한 조건배지, 추정상 비루스 감염세포, 재조합 세포 및 세포성분을 포함하거나 이에 한정되지 않음)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 바람직한 용도는 다음과 같은 핵산의 검출 및/또는 정량에 있다: (a) 간염B 비루스("HBV"), 간염C 비루스 ("HCV"), 간염D 비루스 ("HDV"), 인간 면역결핍 비루스("HIV"),과 대상포진(수두), 단순포진 비루스 I ＆ Ⅱ, 사이 토메갈로비루스, 엡스테인-바 비루스 및 최근 분리된 헤르페스 Ⅵ 비루스를 포함하는 헤르페스족 비루스에서와 같은 비루스 핵산; (b) Chlamydia, Mycobacterium tuberculosis 등과 같은 박테리아 핵산; 그리고 (c) 수많은 관심의 인간 서열.
여기에 사용된 용어 "비특이적 혼성화"는 선택된 제2 폴리뉴클레오티드의 절편에 혼성화를 의도한 제1 폴리뉴클레오티드의 절편이 또한 제3 폴리뉴클레오티드에도 혼성화하여 잘못된 결과, 즉 표적분석물이 없는데도 표지가 검출될 수 있는 상황을 발생시키는 것을 의미한다. 용어 "혼성화"의 사용은 비 Watson-Crick 염기쌍을 배제하지 않는다.
여기에 사용된 용어 "비특이적 결합"은 폴리뉴클레오티드가 지지체-결합 폴리뉴클레오티드에의 수소결합을 포함하지 않는 직접 또는 간접 상호작용을 통해 고상 지지체 또는 다른 측정성분에 결합하는 것을 의미한다.
이제 제1도에 나타난 바람직한 구체예를 참조하여, 다음 용어들이 거기에 도시된 혼성화 측정법에 사용된다. 제1도에서 범용서열은 눈에 띄기위해 굵은 선으로 표시되는 것을 주의한다.
여기서 "표지 확장자"라고도 칭해지는 "표지확장분자(LE)"는 분석불 폴리뉴클레오티드를 마주보고 증폭 멀티머("AMP")에 상보적인 영역을 함유한다. 만약 전치증폭자가 사용되면 (도시안됨), 표지확장자는 증폭 멀티머에 직접 보다는 이 중간 종에 결합할 것이다. 만약 전치증폭자 또는 증폭자가 사용되지 않으면, 표지확장분자는 표지 프로브("LP")내 서열에 직접 결합할 것이다. 따라서 표지확장분자는 분석물 폴리뉴클레오티드의 서열에 상보적인 제1 핵산서열 L-1과 표지프로브의 절편 M-1,증폭멀티머 또는 전치증폭자에 상보적인 멀티머 인식서열 L-2를 갖는 제2 범용영역을 갖는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 사슬이다.
"표지 프로브(LP)"는 표지확장자에 또는 만약 증폭멀티머가 측정에 사용되면 멀티머의 반복 올리고뉴클레오티드 절편에 결합하도록 고안된다. LP는 표지를 함유하거나 표지에 결합하도록 구성된다. 따라서 LP는 멀티머의 반복 올리고뉴클레오티드 단위체에 존재하는 핵산서열 M-2에 상보적인 핵산 서열 L-3을 함유하며, 직접 또는 간접으로 검출가능한 신호를 제공하는 표지에 결합되거나 표지에 결합하도록 구성된다.
여기서 "포획 확장자"로도 칭해지는 "포획확장분자(CE)"는 분석물 폴리뉴클레오티드에 그리고 포획프로브에 결합하며, 그것은 다음으로 고상지지체에 결합된다. 따라서 포획확장분자는 분석물의 서열에 상보적인 핵산서열 C-1을 함유하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열영역과 포획프로브 인식서열 C-2를 갖는 제2 비상보적영역을 가지는 단일가닥 폴리뉴클레오티드 사슬이다. 서열 C-1 및 L-1은 각각 분석물의 물리적으로 구별되는 서열에 상보적인 동일하지 않은 비상보적 서열이다.
"포획 프로브(CP)"는 포획 확장자에 그리고 고상 지지체에 결합한다. 따라서 제1도에 도시되듯이, 포획프로브는 C-에 상보적인 핵산서열 C-3을 가지며, 고상지지체에 공유결합된다(또는 공유결합될 수 있다).
일반적으로 액상 혼성화 측정법은 다음과 같이 진행되는 제1도에 도시된 시스템을 사용하여 수행한다. 단일가닥 분석물 핵산을 포획확장자 및 표지확장자와 혼성화 조건하에 배양한다. 결과 생성물은 포획확장자 및 표지확장자에 결합된 분석물 폴린뉴클리오티드의 핵산 복합체이다. 이어서 이 복합체를 혼성화 조건하에 표면에 포획 프로브가 결합된 고상에 첨가할 수 있으나; 바람직한 구체예에서 초기 배양은 지제체-결합 포획 프로브의 존재하에 수행된다. 결과 생성물은 포획확장분자 및 포획 프로브를 통해 고상에 결합된 복합체로 이루어진다. 그다음 결합된 복합체를 가지는 고상을 비결합된 물질에서 분리한다. 그다음 증폭 멀티머, 바람직하게는 상기 빗-형 멀티머를 LE에 대한 멀티머의 혼성화를 허용하는 혼성화 조건하에 고상-분석물-프로브 복합체에 임의로 첨가하고; 만약 전치증폭자 프로브가 사용되면 고상-분석물-프로브 복합체를 증폭멀티머와 함께 또는 바람직하게는 증폭 멜티머와의 배양전에 전치증폭자 프로브와 배양시킨다. 그다음 결과의 고상 복합체를 세척에 의해 어떤 비결합된 전치증폭자 및/또는 멀티머로부터 분리한다. 그다음 표지된 프로브를 혼성화를 허용하는 조건하에 LE에 또는 증폭멀티머가 사용되면 멀티머의 반복 올리고뉴클레오티드 절편에 첨가한다. 그다음 결과의 구상 표지된 핵산 복합체를 세척하여 비합된 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거고 판독한다. 제1도에 나타낸 성분은 눈금을 잴 필요는 없고, 증폭멀티머가 사용되면 각각 표지 프로브를 결합하도록 고안된 도시된 것(상기와 같이) 보다 훨씬 더 많은 수의 반복 올리고뉴클레오티드 절편을 함유한다는 것을 주의해야 한다.
본 방법의 주된 초점은 포획프로브 및 포획확장분자와 표지 프로브, 표지확장분자 및 증폭자의 상호작용을 최소화하여 부정확한 부분이 지지체-결합-포획 프로브에 결합할 가능성을 감소시킴으로써 백그라운드 노이즈의 공급원을 제거하는데 있다.
상보적 올리고뉴클레티드 서열사이의 혼성화는 그안에 함유된 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드가 안정한 염기쌍을 형성할 수 있는 능력을 전제로 한다. 5가지 자연발생 뉴클레오티드 아데노신(A), 구아노신(G), 티미딘(T), 시티딘(C) 및 우리딘(U)은 퓨린-피리미딘 염기쌍 G-C 및 A-T(U)를 형성한다. G-C 염기쌍의 결합에너지는 A-T 염기쌍의 것보다 더 큰데, 그 이유는 다음과 같이 후자의 2개에 비해 전자에 3개의 수소-결합 부분이 존재하기 때문이다.
Figure kpo00006
및
Figure kpo00007
따라서 종래의 액상 핵산 샌드위치 측정법에서, 올리고뉴클레오티드 분자는 위에서 상세히 설명된 바와 같이 다른 측정성분 또는 표적 분석물내 핵산서열에 상보적이어서 그것과 혼성화하는 핵산서열을 함유하도록 고안된다. 본 발명의 방법은 단일 염기쌍을 형성할 수 있는 측정성분의 범용 올리고뉴클레오티드 절편내로 비자연적 뉴클레오티드 단위체를 통합시킴으로써 비특이적 혼성화를 감소시킨다. 더욱이 본 발명의 방법은 비특이적으로 결합되어 측정 백그라운드 노이즈에 기여하는 것들로부터 표적 분석물의 존재 및/또는 양과 관련된 검출가능하게 표지된 측정성분을 분리함으로써 측정성분이 비특이적 결합에 기여하는 것을 감소시킨다.
본 발명의 제1구체에서, 단일 염기쌍을 형성할 수 있는 A,T,C,G 및 U -이외에 뉴클레오티드 단위체가 표적 분석물 특이적이 아닌 측성성분의 혼성화 올리고뉴클레오티드 절편내로 통합되어서 표적-특이적 프로브 서열 또는 외부 비표적 핵산서열과 안정한 혼성제를 형성하기 덜 쉬울 것이다. 따라서 제1도에 보여지듯이 예컨대 그러한 뉴클레오티드 단위체는 상보적 핵산 서열 C-2/C-3,L-2/M-1 및 L-3/M-2에 통합될 수 있다. 표적분석물의 핵산 절편에 상보적인 측정성분의 혼성화 올리고뉴클레오티드 절편은 자연발생 뉴클레오티드 (즉, A,T, C, G 또는 U)로부터 구성된다. 뉴클레오티드 단위체를 함유하는 올리고뉴클레오티드 절편은 자연발생 뉴클레오티드의 약 15% 내지 약 100%를 뉴클레오티드 단위체 상대물로 치환함으로써 구성될 수 있다. 바람직하게는 올리고뉴클레오티드내 3 내지 4번째 염기마다 단일 염기쌍을 형성할 수 있는 뉴클레오티드 단위체로 치환될 것이다. 치환 뉴클레오티드 단위체의 퍼센트가 증가할수록 비특이적 혼성화가 동시에 감소한다는 것은 당업계의 기술자에게 자명할 것이다. 그러나 완전한 치환은 범용서열사이의 비특이적 혼성화를 배제하는 충분한 서열 다양성을 유지하기 위해 적어도 두 개의 새로운 염기쌍을 필요로 할 것이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 표적-의존성 신호 발생의 현상은 C-2/C-3 혼성체 또는 L-2/M-1 혼성체의 융점 Tm₁이 L-3/M-2 혼성체의 융점 Tm₂보다 상당히 더 낮도록 구성된 혼성화 측정법을 제공함으로써 다뤄진다. 이 방법은 융점 Tm₁이 융점 Tm₂보다 적어도 약 5℃ 더 낮고, 바람직하게는 적어도 약 10℃ 더 낮고, 더 바람직하게는 적어도 약 20℃ 더 낮도록 한 혼성 복합체의 디자인 및 구성을 전제로 한다.
이러한 안정성 차이는 초기에 Tm₁ 및 Tm₂ 혼성 복합체의 형성에 유리한 긴축(Stringency) 조건하에 측정을 수행함으로써 이용된다. 긴축성은 측정의 후속 단계에서 변화되어 포획 프로브로부터 표적 분석물의 물리적 분리 또는 표적으로부터 증폭기-결합된 표지 프로브의 물리적 분리를 허용한다. 긴축성은 열역학 변수인 매개변수를 변화시킴으로써 제어될 수 있다. 그러한 변수는 당업계에 잘 알려져 있으며, 포름아미드농도, 염농도, 카오트로픽염농도, pH (수소이온농도), 유기용매 함량 및 온도를 포함한다. 바람직한 긴축성 조절은 pH 및 염농도이다: 한 측정단계는 포획 프로브/포획 확장자 사이에 형성된 혼성 복합체를 불안정화하거나 표지확장자 증폭자 (또는 전치증폭자) 사이에 형성된 혼성체를 불안정화하는 pH 또는 염농도에서 수행된다. 긴축성이 발휘되는 바람직한 단계를 기질의 첨가이다. 따라서 바람직한 구체예에서, 혼성화 측정법은 모든 측정성분들 사이에 형성된 혼성복합체의 안정성에 유리한 조건하에 수행되고, 그후 표지기질의 첨가로 긴축성은 표지 프로브가 표지 확장자 또는 증폭자로부터 이탈되지 않는다면 포획프로브/포획확장자 또는 표지확장자/증폭자(전치증폭자)등과 같은 혼성 복합체를 불안정화시키도록 변화된다.
본 발명의 또다른 구체예는 상기 본 발명의 구체예가 Tm1혼성 복합체를 형성하는 상보적 뉴클레오티드 서열이 Tm2혼성 복합체를 형성하는 것보다 더 짧도록 혼성화 측정법을 구성함으로써 실행될 수 있는 한 방법을 제공한다. 상보적 뉴클레오티드 서열이 짧을수록 그 안에서 서열 다양성의 기회가 감소한다는 것은 당업계의 기술자에 위해 이해될 것이다. 그러나 이러한 다양성은 상보적 서열내로 비자연적 염기쌍, 예컨대 iso C-iso G 염기쌍을 통합시킴으로써 유지될 수 있다.
Tm₁ 및 Tm₂ 사이의 온도차가 클수록 본 방법이 백그라운드 노이즈를 제거하는 "효율성"이 더 커진다는 것은 당업계의 기술자에게 자명할 것이다. 따라서 당업계의 기술자는 더 낮을 수도 있지만 10℃미만, 심지어 5℃미만의 온도차도 또한 백그라운드 노이즈의 감소를 허용할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
비자연적 뉴클레오티드 단위체가 혼성화 올리고뉴클레오티드 서열내로 통합되어 표적 분석물과의 혼성화 특이성을 증가시키는 본 발명의 방법은 다양한 분야에서 용도를 발견한다.
기초 또는 증폭된 액상 핵산 샌드의치 측정법에서 복수의 포획 프로브가 고상표면에 고정된다. 매우 종종 비특이적 결합에 사용되는 표면적은 예컨대 연어정액 또는 소흉선으로부터의 DNA로 표면을 배양함으로써 제어된다. 그러나 이 DNA의 존재는 고상 지지체에 대한 측정성분의 비특이적 혼성화를 위한 잠재능을 증가시키고, 이로 인해 백그라운드 노이즈를 증가시킨다. 이들 자연적 DNA를 비자연적 염기를 함유하는 합성 DNA로 치환하는 것은 비특이적 혼성화 및 비특이적 결합을 최소화할 것이다.
바람직하게는 이들 폴리뉴클레오티드는 당업계에 주지된 방법에 의해 뉴클레오티드 혼합물로 짧은 올리고뉴클레오티드를 3'데일링(tailing)함으로써 제조될 것이다. 이와 선택적으로 비자연적 뉴클레오티드를 함유하는 짧은 거의 임의 서열의 올리고뉴클레오티드를 함께 연결하여 폴리뉴클레오티드를 형성할 수 있다. 분지형 DNA는 이 목적을 위해 용이하게 사용될 수 있다. 예컨대 블록서열 -TNVN-F-TNVN-J-TNVN- (여기서 F는 isi C이고 J는 iso G이다)이 제조되고 화확적으로 연결되어 폴리머를 형성할 수 있다. 효소적 3'테일링 방법을 사용하는 것보다 이 방법을 사용하는 이점은 효모폴리머/효소올리고머 서열의 제거이다.
비자연적 뉴클레오티드 단위체를 함유하는 혼성화 올리고뉴클레오티드의 구성이 사용될 수 있는 또다른 용도는 아티센스 화합물의 설계에 있다. 예컨대 Cing et al.(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 86:10006-10010, Broder et al.(1990) Ann. Int. Med. 113: 604-618, Loreau et al.(1990)FEBS Letters 274: 53-56, 및 PCT 공개번호 WO91/11535, WO91/09865, WO91/04753, WO90/13641, WO91/13080 및, WO91/06629에 설명된 안티센스 화합물은 특정단백질의 발생을 책임지는 mRNA에 결합하여 그 생성을 불능케하거나 방해하는 올리고뉴클레오티드이다. 종래의 안티센스 분자는 일반적으로 다양한 올리고뉴클레오티드종과 반응할 수 있다. 그러나 그들의 길이(일반적으로 최고 30 뉴클레오티드 단위체까지의 올리고뉴클레오티드 서열) 때문에 그러한 안티센스 분자는 비표적 종과의 비특이적 혼성화와 관련된 문제를 제기한다. 한 해결책은 다중 프로브 및 표적사이의 혼성화의 짧은 영역을 사용하는 것이다; 전체 복합체를 강화시키기 위해 Distefano et al.(1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1006-1007에 기술된 바와 같이 프로브 사이의 짧은 "다이머형성도메인"이 사용된다. 다이머형성 도메인은 상보적 서열이 비자연적 뉴클레오티드 단위체를 함유하는 테일을 가져서 비표적 분석물에 대한 증가된 비특이적 혼성화없이 표적 분석물에 대한 고효율적이고 특이적인 결합을 제공하도록 설계될 수 있다. 그 아이디어는 이중가닥 DNA 표적으로 제2도에 도시된다.
제2도에 도시된 바와 같이 가닥 치환을 사용하여 이중가닥 DNA를 떨어뜨릴수 있다. S1뉴클레아제-감수성이어서 이미 부분적으로 단일가닥인 초나선 스트레스하의 AT-풍부 프로모터 서열은 이 유형의 안티유전자 용도를 위한 특히 바람직한 부위이다. 특이성을 최대화하기 위해 짧은 올리고뉴크레오티드가 사용될 것이며; 그들의 표적에 대한 결합에너지는 그들을 함께 연결하여 올리고뉴클레오티드의 네트워크를 형성함으로써 증강될 것이다.
이 구조물에서 표적 부재중 안정한 염기쌍을 형성하지 않는 짧은 범용 서열은 프로브와 인간서열의 비특이적 혼성화를 제한하는 iso C 및 isO G를 함유한다. 프로브 1,2 및 3이 표적에 결합시 범용 서열은 충분히 가까운 근접위치에 있어 그들의 유효 농도가 상당히 증가될 것이다. 그다음 범용 서열이 쌍을 형성하여 결합강도의 더 한층 증가를 초래할 것이다. RNA표적도 또한 이 방법과 관련하여 사용될 수 있다.
Gold et al.의 미국특허번호 5,270,163, Tuerk et al.(1990) Science 249: 505-510, Szostak et al. (1990) Nature 346: 818-822 및 Joyce(1989) G 82: 83-87에 기재된 SELEX 방법은 모양에 의해 원하는 표적분자를 인식하고 결합하는 RNA 또는 DNA 서열을 선택하기 위해 이용될 수 있다. 여기에 사용된 용어 "압타머" (또는 핵산항체)는 그러한 단일 또는 이중가닥 DNA 또는 단일가닥 RNA 분자를 의미한다. 예컨대 여기에 참고문헌으로 포함된 PCT 공개번호 WO92/14843, WO91/19813 및 WO92/05285를 참조한다. "표적 분석물"과 구별되는 "표적분자"는 압타머가 결합하도록 설계된 단백질, 다당류, 올리고뉴클레오티드 또는 다른 고분자와 같은 프리머와약제, 대사물질, 독소등과 같은 소분자를 포함한다.
SELEX 방법에서, n-머, 바람직하게는 올리고뉴클레오티드의 "램더머 푸울"을 형성하는 임의 서열의 뉴클레오티드가 두 개의 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머에 의해 측접(flank)되는 올리고뉴클레오티드가 구성된다. 그다음 구조물을 표적분자에 대한 올리고뉴클레오티드의 결합에 유리한 조건하에 표적분자와 접촉시킨다. 표적분자를 결합하는 올리고뉴클레오티드는 (a) 여과, 원심분리, 크로마토그래피 등과 같은 종래방법을 이용하여 표적분자를 결합하지 않는 올리고뉴클레오티드로부터 분리하고; (b) 표적분자로부터 해리되고; (c) 종래 PCR 기술을 이용하여 증폭되어 올리고뉴클레오티드의 리간드-강화 푸울을 형성한다. 원하는 결합 친화성, 특이성 또는 둘다를 같은 압타머가 얻어질때까지 결합, 분리, 해리 및 증폭의 라운드를 더 수행한다. 그다음 동정된 최종 압타머 서열이 화학적으로 또는 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있다. 그러한 압타머를 제조할 때 선택된 염기쌍은 비자연적 염기쌍으로 치환되어 압타머가 인간 핵산에 혼성화할 가능성을 감소시킨다.
본 발명은 SELEX에서 적어도 두가지 일반적 방법으로 이용될 수 있다. 첫 번째, isod G 및 isod C가 랜더머 DNA 서열 푸울내 서열중에 포함될 수 있다. 단백질 또는 다른 중요한 생체분자를 인식할 수 있는 가능한 랜더머 구조의 개수는 종래의 4가지 뉴클레오티드 A,T,G 및 C보다 오히려 6가지 이상의 뉴클레오티드로부터 DNA 가닥을 합성함으로써 증가된다. 이것은 다음에 표적분자에 더 큰 친화성 및/또는 특이성으로 결합하는 서열을 동정할 수 있는 기회를 향상기킨다.
SELEX에서 선택된 보존적 올리고뉴클레오티드 서열은 세포 서열에 원치않는 혼성화를 가질수 있다. 이 비특이적 혼성화는 선택 공정에서 비자연적 염기를 사용하여 감소시킬수 있다. 인간 RNA 및 DNA 중합효소에 의해 인식되지 않으나 일정한 파지 또는 박테이라 중합효소에 의해 인식되는 뉴클레오티드는 이러한 용도에 특히 유용하다.
SELEX 방법에서 본 발명의 두 번째 용도는 최소한의 비특이적 혼성화를 갖는 최종 압타머 구조물의 제조에 있다. 예컨대 소정의 결합 친화성, 특이성 또는 다른 표적분자 인식특성을 나타내는 압타머는 SELEX 방법을 이용하여 RNA 또는 DNA 서열의 푸울에서 선택된다. 이들 표적분자 인식특성은 유지되는 압타머의 2차구조에 의해, 부분적으로 분자내 올리고뉴클레오티드 혼성 복합체의 형성에 의해 결정된다. 압타머의 2차구조를 설명하면, 일정한 분자내 혼성 복합체에서 염기쌍의 특이성은 2차구조와 그에 따른 압타머의 표적분자 인식 및 결합특성을 유지하는데 매우 바람직하고, 즉 바람직하게는 G-C 또는 A-T인 염기쌍이 존재할 것이라는 것은 당업계의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 이들 분자내 혼성 복합체, 예컨대 스템 루프의 염기쌍 부분에서 다른 염기쌍이 있을 수 있으며, 그것은 압타머의 2차구조를 바꾸지 않고 여기서 N-N' 염기쌍으로 칭해지는 상보적 뉴클레오티드의 어떤 쌍으로도 치환될 수 있다.
최종 압타머 구조물내 선택된 N-N' 염기쌍 및 G-C 및 C-G 염기쌍의 iso G-iso C 또는 iso C-iso G로의 단순 치환은 비표적 올리고뉴클레오티드 서열에 대한 비특이적 혼성화를 줄일 것이다. iso C-iso G 염기쌍은 C-G 염기쌍과 등에너지이기 때문에, 분자의 기본형태와 헤어핀의 강도는 매우 유사할 것이다. 주된 서열이 C-G 보다 A-U 또는 U-A에 강한 선호도를 보이는 염기쌍을 치환하기 위해서는 A-U와 등에너지인 염기쌍이 바람직할 것이다. 이들 치환은 세포 RNA 및 DNA 서열에 대한 원치않는 혼성화의 잠재능을 제한함으로써 표적 분자에 더 특이적인 압타머를 만드는 효과를 가진다.
기초 공정에서 선택된 염기쌍은 iso C- iso G 또는 iso G- iso C 염기쌍으로 치환된다. 최종 구조물에서 iso C-iso G 염기쌍은 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 키메라 압타머(리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드 둘다로 구성된) 분자는 화학적으로 제조될 수 있다. 이와 선택적으로 리보-iso GTP 및 리보-iso CTP (적당한 2'보호를 가짐)가 사용되어 iso C 및 iso G를 함유하는 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 압타머를 제조할 수 있다.
본 발명이 이용될 수 있는 다른 용도는 혼성화 측정법 및 중합효소 연쇄반응(PCR) 측정법에서 비특이적 결합을 감소시키는 원위치 혼성화를 포함한다.
원위치 혼성화는 표적 분석물의 단일 분자를 검출할 정도로 충분한 감도를 결여한다. 원위치 PCR(예컨대 Bagasra et al. (1993) J. Immunological Methods 158: 131-145)은 이러한 감도 요구를 충족시키기 위해 개발되어 왔으나; 정량화는 PCR 방법만큼 정확하지 않다. 또다른 방법은 표적 분석물을 결합하는 다중 표지 확장자 프로브를 사용할 것이다. 표지 확장자는 전치증폭자 또는 증폭자를 결합할 것이다. 전치증폭자가 사용되면 표지 확장자 및 증폭자를 연결시킬 것이다. 증폭자는 바람직하게는 발광도 (감도가 충분히 높으면 형광도)에 의해 검출될 표지된 프로브를 결합할 것이다. 상기와 같이 범용서열, L-2/M-1 및 M-2/L-3은 최적으로 15-30% 사이의 iso C 및 iso G를 함유하는 짧은 올리클레오티드를 구성되어 인간서열에 대한 원치 않는 혼성화를 감소시킬 것이다. 제4염기쌍이 사용되어 이들 서열중 자연적 염기의 나타남을 더욱 감소시킬 수 있다.
상기와 같이, 비특이적 결합뿐만 아니라 비특이적 혼성화는 비자연적 염기쌍을 사용하여 감소될 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 고친화성을 갖는 세포성분에 대한 증폭자 및 표지 프로브의 비특이적 결합을 줄이기 위해 6-8 다른 뉴클레오티드로 구성된 임의 폴리머 또는 거의 임의 블록 공중합체가 사용될 수 있다. 따라서 일반적으로 수행되듯이 소 또는 연어로 부터의 자연적 서열을 도입함으로써 비특이적 혼성화의 증가위험없이 비특이적 결합이 감소될 것이다.
당업계의 기술자는 동일한 방법이 고상지지체에 대한 프로브의 비특이적 혼성화 및 비특이적 결합을 줄이기 위해 도트 블롯, 서던 및 노던과 같은 블롯 측정법에 이용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
본 발명은 또한 PCR 및 다른 지수적 증폭기술에서 여러 용도를 발견한다. 예컨대 네스트(nested) PCR에서 표적 분석물이 초기 증폭된 다음 수천배 희석된 후, 포획을 위해 한 프라이머 상에 5'오버행과 표지를 위해 다른 프라이머상에 5'오버행을 사용하는 것이 일반적이다.중합효소에 의해 판독될 수 없는 스페이서가 삽입되어 오버행은 단일 가닥으로 남는다(예컨대 Newton et al. (1993) Nucl. Acids Res. 21:1155-1162 참조). 이들 5'오버행의 일반서열은 변형 염기쌍을 함유하여 비표적상의 프라이밍 빈도를 줄일수 있도록 제조될 수 있다. 실제로 5'오버행의 제1염기내 isod C 또는 isod G의 존재가 종래 사용된 스페이서를 대신하여 사용될 수 있다; 중합효소는 그 자리에 집어넣을 isod GTP 또는 isod CTP가 없기 때문에 isod C 또는 isod G를 읽을 수 없다. 중합효소는 프라이머내 isod G를 발견시 저빈도로 폴리머내에 T를 도입할 수 있기 때문에, 5'오버행내 제1염기로서 iso C를 사용하는 것이 바람직하다.
[실험]
본 발명의 실행은 다른 언급이 없으면 당업계의 기술범위내에 있는 합성유기화학, 생화학, 분자생물학 등의 종래기술을 이용할 수 있다. 그러한 기술은 문헌에 상세히 설명되어 있다. 예컨대 Sambrook, Fritsch ＆ Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판 (1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames ＆ S.J. Higgins, eds., 1984);과 시리즈, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)를 참조한다.
여기서 언급된 상기 및 하기의 모든 특허, 특허출원 및 공보는 참고문헌으로 포함된다. 본 발명은 그것의 바람직한 특정 구체예와 관련되어 설명되고 상기 설명 및 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하지 않고 이를 예시하기 위한 것임이 이해될 것이다. 본 발명의 범위내의 다른 태양, 이점 및 변형은 본 발명이 속한 당업계의 기술자에게 명백할 것이다.
다음 실시예에서, 사용된 숫자 (예컨대, 양, 온도 등)에 관해 정확도를 높히려고 노력했으나, 약간의 실험적 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 온도는 다른 지시가 없으면 항상 ℃ 단위로 주어지며, 압력은 대기압 근처이다.
[이소구아노신 또는 2'-데옥시-이소구아노신의 합성]
이소구아노신 또는 2'-데옥시-이소구아노신의 합성을 위해 약간의 방법이 보고되었다. 예컨대 2'-데옥시-이소구아노신은 1) 기본 조건하에 직접 광분해에 의해 2'-데옥시아데노신으로부터 2'-데옥시아데노신-(N¹-옥시드)을 거쳐 (Switzer et al. 1993), 상기); 2) 기본 조건하에 직접 광분해에 의해 2-클로로-2'-데옥시아데노신으로부터 (Seela et al. (1992) Helv. Chim. Acta 75: 2298-2306); 그리고 3) 6-아미노-1-(2'-데옥시-베타-D-에리트로펜토푸라노실)-1H-이미다졸-4-카르보니트릴 [AICA 2'-데옥시뉴클레오시드]로부터의 화학 경로에 의해, 즉 그것을 벤조일이소시아네이트와 반응시킨후 암모니아로 처리하여 피리미딘 고리의 어닐링에 영향을 줌으로써 (Kazimerczuk et al. (1991) Helv. Chim. Acta 74: 1742-1748)합성되었다.
그러나 2'-데옥시아데노신-(N'-옥시드)에서 2'-데옥시-이소-구아노신으로의 광분해적 전환이 그 자신을 쉽게 스케일-업시키지 않기 때문에, 쉽게 구할수 있는 2'-데옥시리보뉴클레오시드 출발물질로부터 2'-데옥시-이소구아노신으로의 편리한 화학경로가 개발되었다.
O6-페닐-2'-데옥시구아노신과 같은 특수 "전환성" 2-데옥시구아노신 유도체를 통한 2'-데옥시구아노신에서 2,6-디아미노퓨린 뉴클레오시드 및 N6-알킬-2,6-디아미노퓨린 뉴클레오시드로의 전환을 위한 몇가지 방법이 기술되었다 (Mac Millan et al. (1991) Tetrahedron 47: 2603-2616; Gao et al. (1992) J. Org. Chem. 57: 6954-6959; 및 Xu et al. (1992) Tetrahedron 48: 1729-1740). 또한 Fathi et al. (1990) Tetrahedron Letters 31: 31*322는 2'-데옥시구아노신을 트리플루오로아세트산 무수물/피리딘으로 처리한 후 페놀로 원위치 치환하는 것을 포함하는 방법을 사용하는 O6-페닐-2'-데옥시구아노신의 편리한 합성법을 기술하였다. 이와 선택적으로 2'-데옥시구아노신내로의 O6-페닐 부분의 도입이 Reese et al. (1984) J. Chem. Soc. Parkin Trans. I. 1263-1271에 기술되었으며, 여기서 중간물 O6-(4-톨루엔술포닐)-2'-데옥시구아노신이 트리메틸아민에 이어서 페놀로 처리되어 O6-(4-톨루엔술포닐)의 치환에 영향을 주어 O6-페닐-2'-데옥시구아노신이 얻어진다. 이소구아노신-계열 화합물이 2-(메틸술포닐)-6-아미노-피라졸로피리미딘 리보뉴클레오시드를 생성하는 S-산화후에 NaOH로 치환하여 이소구아노신 유사체를 얻음으로써 2-(메틸메르캅토)-6-아미노-피라졸로피리미딘 리보뉴클레오시드로부터 생성되었다(Cottam et al. (1983) Nucleic Acids Research 11: 871-882).
아질산알킬을 사용한 구아노신 및 2'-데옥시구아노신내 2-아미노기의 전환이 기술되었다. 이것들은 라디칼 반응에서 2-할로(Nair et al. (1982) Synthesis 670-672) 및 2-(메틸메르캅토)-6-클로로-퓨린 리보뉴클레오시드 (Trivedi (1991), Nucleic Acid Chemistry, Townsend et al. (eds.) Wiley Inter-Science, 4부, 269-273)로의 전환을 포함한다. 순수 아질산페닐로 O6-(p-니트로페닐에틸)-3'5'-O-di-t-부틸-디메틸실란-2'-데옥시구아노신을 산화시켜 O6-(p-니트로페닐에틸)-3'5'-O-di-TBDMS-2'-데옥시크산토신을 얻는 것이 보고되었다. (Steinbrecher et al.(1993) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32: 404-406).
2'-데옥시-이소구아노신의 합성방법이 Seela et al. (1994) Helv. Chim. Acta 77: 622-30에 기술되었다. 제1단계에서, 2'-데옥시구아노신을 2-아미노-2'-데옥시아데노신으로 전환하였다. 제2단계에서, 아질산나트륨으로 2-아미노기를 탈질수화하여 2'-데옥시-이소구아노신을 얻음으로써 2-아미노-2'-데옥시아데노신을 탈아민화하였다.
다음 구조식을 갖는 화합물
Figure kpo00008
(상기식에서 R¹은 수소, 히드록실, 술프히드릴, 할로겐, 아미노, 알킬, 알릴 및 -OR²(여기서 R²는 알킬, 알릴, 실릴 또는 포스페이트)로 구성된 군에서 선택된다)을 합성하기 위해 여기에 개시되고 청구된 방법은 다음으로 이루어진다;
a) 다음 구조식을 갖는 화합물을 적당한 시약과 반응시켜 3' 및 5' 히드록실기 둘다를 보호하고;
Figure kpo00009
b) 단계(a)의 생성물을 적당한 시약과 반응시켜 O6-옥시부분을 친핵성 치환 에 민감한 작용기로 전환시킴으로써 작용화된 O6부분을 생성하고;
c) 단계(b)의 생성물의 2-아미노기를 산화하고;
d) 단계(c)의 생성물을 친핵성 시약과 반응시켜 작용화된 O6부분을 치환하고;그리고
e) 단계(d)의 생성물을 적당한 시약과 반응시켜 보호된 3' 및 5' 히드록실기를 탈보호시킨다.
구아노신 또는 2'-데옥시구아노신에서 각각 이소구아노신 또는 2'-데옥시-이소구아노신으로의 전환은 예컨대 TBDMS, 염화벤조일, 무수아세트산 등과 같은 적합한 시약을 사용하여 당 부분상의 히드록실기를 보호함으로써 실행될 수 있다. 상기한 바와 같이 당 부분상의 하나 이상의 히드록실기가 할로겐, 지방족기에 의해 치환되거나, 또는 에테르, 아민등으로 작용화될 수 있다. 생성물을 분리하고 O6을 적당한 친핵체에 의해 치환될 수 있도록 변형시킨다. 그러한 치환성기의 예는 예컨대 CH₃-S-C6H₄-O6-, C6H5-SO₂-O6-, C6H5-O6, 4-니트로-C6H₄-O6-, 2,4,6-트리니트로-C6H₂-O6-등을 포함한다. 그다음 아질산알킬 또는 당업계에 공지된 적당한 시약 (Nair et al. (1992), 상기; Trevidi (1991), 상기; 또는 Steinbrecher et al. (1993), 상기)을 사용하여 2-아미노기를 옥시 작용기로 전환시킨다. 생성물을 적당한 친핵체, 예컨대 NH₄OH 또는 말단 -NH₂, -SH, -COOH 등을 함유하는 다른 아미노알킬, 아미노아릴, 아미노헤테로알킬, 아미노헤테로아릴과 반응시킴으로써 변형 O6이탈기를 변형시킨다. 보호된 히드록실기의 탈보호는 예컨대 염기 또는 플루오르화물로 처리함으로써 실행될 수 있다.
다음 논의에서, O6-(4-메틸티오페닐)은 예시적 치환성기로서 작용할 것이다. 그러나 그것의 사용은 오직 특정 구체예의 설명을 목적으로 하여 제한됨을 의도하지 안하는다.
N6-알킬화 이소구아노신 유도체는 알킬아민을 친핵체로 사용하여 쉽게 합성될 수 있다. 예컨대 헥산디아민을 사용하여 O6-(4-메틸티오페닐)을 치환함으로써 N6-(6-아미노헥실)-이소구아노신을 형성할 수 있다. 아미노헥실기(예컨대 트리플루오로아세타미도 유도체로서)의 보호에 이은 포스포르아미다이트 시약으로의 전환은 더 이상의 합성후 유도체화를 위해 올리고뉴클레오티드내 어떤 원하는 위치에 통합될 수 있는 작용화 가능한 이소구아노신 유사체를 제공한다. 따라서 선택된 이소구아노신/이소시티딘 염기쌍의 이소구아노신 부분을 특이적으로 표지화하는 것이 가능할 것이다. 또한 단순히 O6-(4-메틸티오페닐)기를 적당한 말단의 친핵체, 예컨대 -COOH, -SH, -NH₂ 등으로 치환함으로써 어떤 원하는 작용성을 가지는 일련의 이소구아노신의 N6유도체를 합성하는 것이 가능할 것이고, 유도체는 쉽게 제조될 수 있다.
또한 O²-(4-메틸티오페닐)-2'-데옥시크산토신, 그것의 완전 보호된 포스포르아미다이트 형태 (O²-(4-메틸티오페닐)-5'-O-DMT-3'0-(BCE-디이소프로필포스포르아미다이트)-2'-데옥시크산토신)가 올리고뉴클레오티드 내로의 통합후 전환성 유도체로서 사용될 수 있다. 알킬디아민 또는 다른 작용화된 알킬아민에 의한 O²-(4-메틸티오페닐)-2'-데옥시크산토신으로부터 O²-(4-메틸티오페닐)의 합성후 치환은 N6(아미노알킬)-2'-데옥시-이소구아노신-함유 올리고뉴클레오티드를 생성한다. 유도체화된 이소구아노신은 작용화된 이소구아노신 잔기에 특이적으로 표지 또는 다른 리포트 분자의 도입부위로서 작용할 수 있다.
[합성법의 개요]
반등도 1에 도시되듯이, 2'-데옥시-이소구아노신의 합성은 다음과 같이 2'-데옥시구아노신으로부터 5단계로 성취되었다:
1) 재결정화에 의한 정제와 함께 2'-데옥시구아노신에서 3',5'-O-(t-부틸디메틸실릴)₂-2'-데옥시구아노신으로의 전환 (Ogilvie et al. (1973) Can. J. Chem. 51: 3799-3809);
2) O6-(4-톨루엔술포닐)-3',5'-O-TBDMS₂-2'-데옥시구아노신으로의 전환;
3) Reese 방법을 이용하여 적당한 페놀, 예컨대 4-(메틸티오)페놀 또는 펜타클로로페닐로 O6에 있는 4-톨루엔술포닐기를 치환하여 O6-(4-메틸티오)페닐)-3',5'-O-TMDMS₂-2'-데옥시구아노신을 얻음(Reese et al. (1984), 상기);
4) 중성 조건하에 아질산 tert-부틸로 2-아미노기를 옥시 작용기로 산화하여
O6-(4-(메틸티오)페닐)-3',5'-O-TBMDS₂-2'-데옥시크산토신을 얻음(Steinbrecher et al. (1993), 상기); 그리고
5) 상승된 온도에서 수산화암묘늄으로 O²-(4-메틸티오페닐)기를 치환하여 3',5'-O-TBMDS₂-2'-데옥시-이소구아노신을 얻음.
구아노신으로부터 이소구아노신의 합성은 유사한 반응도를 이용하여 실행될 수 있다.
Figure kpo00010
Figure kpo00011
Figure kpo00012
얻어진 물질은 모두 면에서 (TLC,HPLC,UV 및 NMR)공표된 광분해 경로(Switzer et al. (1993), 상기)에 의해 제조된 인증샘플과 동일하였다.
이소시티딘 또는 2'-데옥시-이소시티딘 유도체의 제조
올리고뉴클레오티드 합성동안 글리코시드 결합이 묽은 산에 노출에 대해 안정화된 이소시티딘 또는 2'-데옥시-이소시티딘의 유도체가 제조될 수 있다. 2'-데옥시아데노신에 대해 N²-아미딘 유도체가 예컨대 McBride et al. (1986) J. Am. Chem. Soc. 108: 2040-2048, Froehler et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 8031-8036 및 Pudlo et al. (1994) Biorg. Med. Chem. Lett. 4: 1025-1028에 기술되었다. N²-(N,N,-디(X)포름아미디노)-2'-데옥시-이소시티딘은 다음 방법에 의해 합성되었다. 여기에 예시된 바와 같이 X는 n-부틸이다. 그러나 X는 C₂-C10알킬, 아릴, 헤테로알킬, 헤테로아릴 등 일수도 있다.
N-디-n-부틸포름아미드디메틸아세탈은 McBride et al. (1986), 상기, Froehler et al. (1983), 상기 및 Pudlo et al. (1994), 상기 기술된 대로 디-n-부틸아민으로 N,N-메틸포름아미드디메틸아세탈의 아민기 전달반응에 의해 합성되었다. 10mmole의 2'-데옥시-5-메틸-이소시티딘을 100㎖ 메탄올에 현탁하고, 10mmole의 N,N-디-n-부틸포름아미드디메틸아세틸을 첨가했다. 실온에서 2시간 교반한후 청정용액얻었다. 염화메틸렌중 10% 메탄올을 사용하여 전개된 실리카 60H 상에서의 박층 크로마토그래피 분석을 출발물질이 완전히 소비된 것을 가리켰다. 물 (10㎖)을 첨가하여 과잉시약을 파괴하고, 용매를 진공에서 제거하여 3.8그램의 조(組) N²-(N,N-디부틸포름아미디노)-2'-데옥시-이소시티딘을 얻었다. 이 유도체는 올리고 뉴클레오티드내로의 통합을 위한 5'-O-DMT-N²(N,N-디부틸포름아미디노)-2'-데옥시-이소시티딘으로 직접 전환될 수 있다.
검출가능한 표지를 올리고뉴클레오티드의 특정위치에 통합시킬수 있는 작용화가능한 치환기를 제공하는 다른 이소시티딘 유도체가 제조될 수 있다. 예컨대 5-알킬화 2'-데옥시우리딘 유도체, 예컨대 5-[N-(6-트리플루오로아세틸아미노헥실)-3-(E)아크릴아미도]-2'-데옥시우리딘이 Ruth (1991) Oligodeoxynucleotides with Reporter Groups Attached to the Base, Eckstein(ed.) Oligo deoxyn ucleotides and Analogues, IRL 프레스, p. 255-282에 기술되었다. 그러한 5-위치 유도체는 기쌍 혼성화 패턴을 방해하지 않는 것으로 밝혀졌다. Ruth에 의해 기술된 화학을 사용하여 합성할 수 있으며, 5-[N-(6-트리플루오로아세틸아미노헥실)-3-(E)아크릴아미도]-2'-데옥시-이소시티딘을 합성할 수 있으며, 그로인해 선택된 이소구아노신*이소시티딘 염기쌍에서 검출가능하게 표지될 수 있는 작용화된 이소시티딘을 제공한다.
이들과 이소시티딘 및 2'-데옥시-이소시티딘의 5-위치 유도체는 염기쌍 형성을 위한 추가적 안정화를 제공한다. 그러한 유도체는 5-β-프로피닐(Froehler et al. (1993) Tetrahedron Lett. 34: 1003-1006 참조). 5-β-플로페닐 또는 다른 5-알킬이소시티딘 또는 2'-데옥시-이소시티딘 유도체를 포함한다.
본 발명에 따라 핵산 혼성화 측정법을 수행하기 위한 키트는 패키지 조합형태로 적어도 하나의 혼성화 올리고뉴클레오티드 프로브, 분석물과 혼성 복합체를 형성할 수 있는 절편과 혼성 복합체의 검출수단으로 이루어지며, 여기서 적어도 하나의 혼성화 올리고뉴클레오티드 프로브는 A-T 및 G-C 염기쌍이 형성되는 조건하에 아데노신(A), 티미딘(T), 시티딘(C), 구아노신(G) 또는 우리딘(U)과 효과적으로 염기쌍을 형성하지 않는 제1뉴클레오티드 단위체를 포함한다. 시약들은 전형적으로 키트내 별개용기에 있을 것이다. 또한 키트는 분석물을 변성시키기 위한 변성시약, 혼성화 버퍼, 세척용액, 효소기질, 음성 및 양성대조와 명기된 측정지시서를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 미국특허출원번호 07/813,588에 상세히 기술된 대로 고상 직접 올리고뉴클레오티드 합성법, 효소적 라이게이션법과 액상 화학 합성법을 병용하여 조립될 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 모든 화학 합성은 자동 DNA 합성기 (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division 모델 380B)상에서 수행될 수 있다. pHOSTELTm시약 (DMT-O-CH₂CH₂-(SO₂)-CH₂CH₂-O-P(N(iPr)₂)(-O-CH₂CH₂CN) 여기서 DMT는 디메톡시트리틸이고 iPr은 이소프로필이다)을 사용한 5'-인산화를 포함하여 β-시아노에틸 유형의 포스포르아미다이트 화학이 이용되었다. 다른 지시가 없는 한 표준 제조자의 프로토콜에 따랐다.
[실시예]
[실시예 1]
일반 측정 성분과 표적-특이적 확장서열의 비특이적 혼성화에 의해 유발되는 측정 백그라운드 노이즈
일반 측정 성분과 표적-특이적 확장 서열의 교차 혼성화에 의해 어떻게 측정 백그라운드 노이즈가 유발될 수 있는지를 결정하기 위해, 표 1,2 및 3에 보여진대로 포획 확장자 및 표지 확장자의 푸울을 사용하여 증폭된 DNA 혼성화 측정법을 수행하여 M13파지를 정량하였다.
Figure kpo00013
Figure kpo00014
Figure kpo00015
설명을 목적으로, 스페이스가 3'비표적 결합영역을 각 프로브의 표적-결합 영역으로부터 분리한다.
측정은 본질적으로 PCT 공개번호 WO 95/16055에 기술된 대로 진행하였다.요약하면, 표획 확장자의 비표적 결합영역에 상보적인 포획 프로브를 함유하는 미세적정 웰중 63℃에서 하룻밤 혼성화한 후, 플레이트를 10분간 실온에서 냉각하고, 0.1
Figure kpo00016
SSC (15mM Nacl; 1.5mM 시트르산나트륨; pH 7.0), 0.1% 황산도데실나트륨을 함유하는 버퍼로 2회 세척하였다. 표지 확장자의 3'비표적 결합영역에 상보적인 15
Figure kpo00017
3(각각 3 알칼리성 포스파타제프로브 결합부위를 갖는 15 "아암" ) 분지형 DNA 증폭자(100fm)를 웰에 첨가하고, 53℃에서 30분간 배양을 계속한후, 상기와 같이 플레이트를 냉각하고 세척하였다. 알칼리성 포스파타제 프로브(200fm)를 웰에 첨가하고 53℃에서 15분간 더 배양한 후, 상기와 같이 플레이트를 다시 냉각하고 세척하였다. 0.1
Figure kpo00018
SSC 버퍼로 3회의 추가적 세척을 행하였다. 디옥스에탄포스페이트 기질용액 LumipHos 530 (Lumigen)에서 20분후 Chiron 광도계에서 신호를 검출하였다. 그 결과는 표 4에 보여진다.
Figure kpo00019
푸울B 포획 확장자의 첨가는 순수신호를 증가시키지 않으나, 노이즈를 약 100배 증가시킨다. 관련 서열의 컴퓨터 분석의 푸울 B의 포획 확장자 #8이 분지형 DNA 증폭자의 T20--LLA2 서열 (9머 올리고(dA)--올리고(dT)를 포함)과 광범위한 상동송을 가지는 반면, 푸울 B의 포획 확장자 #9는 분지형 DNA 증폭자의 BLA 3C 서열과 광범위한 상동성을 가진다는 것을 보여주었다.
본 발명은 혼성화-의존성 분석 백그라운드 노이즈의 문제를 다룬다. 자연적 핵염기와 안정한 염기쌍을 형성하지 않아서 그러한 서열과 자연적 서열의 혼성화를 저해하는 뉴클레오티드에 의해 중단된 뉴클레오티드 서열이 구성된다. 이상적으로 범용 서열내 모든 3 또는 4번째 염기가 A,C,G 또는 T(U)와 쌍을 형성하지 않는 변형 뉴클레오티드일 것이다. CG 염기쌍과 등에너지인 염기쌍을 사용하면, 또한 범용서열의 길이를 줄일수 있다. 통계적 논의는 이것이 또한 범용서열들 사이와 범용서열 및 샘플중 비표적 서열사이와 범용서열 및 확장자 프로브중 표적-특이적 서열 사이의 바람직하지 않은 교차 혼성화 빈도를 감소시킨다는 것을 보여준다. 안정한 혼성체를 형성하는 다톱니형 결합에 의존하여 범용 서열의 길이를 더 줄일 수 있다(WO 95/16055 참조). 모든 범용 서열은 적어도 6, 바람직하게는 8 뉴클레오티드로 설계될 것이다: 포획 프로브, 포획 확장자 테일, 표지 확장자 테일, 증폭자, 표지 프로브 및 전치증폭자(사용가능시).
[실시예 2]
iso C-iso G 염기쌍의 특이성 및 강도
iso C-iso G 염기쌍의 특이성 및 강도를 결정하기 위해, 다음 올리고뉴클레오티드 상에서 열용융 분석을 행하였다:
1) 5'(L) CA CCA CTT TCT CC (T) 3' [SEQ ID NO: 25];
2) 5'(L) CA CFA CTT TCT CC (T) 3' [SEQ ID NO: 26]
3) 3'(T) GT GGT GAA AGA GG 5'[SEQ ID NO: 27];
4) 3'(T) GT GJT GAA AGA GG 5'[SEQ ID NO: 28]; 및
5) 5'CA CTA CTT TCT CC (T) 3'[SEQ ID NO: 29].
이들 올리고뉴클레오티드의 코어 혼성체는 13뉴클레오티드로 구성된다. 염기쌍에 관여하지 않은 뉴클레오티드는 괄호로 표시된다. L=1차아민, F=iso C, J=iso G. 열용융 분석은 3
Figure kpo00020
SSC (0.45M NaCl, 0.045M 시트르산나트륨), pH 7.9중 Cary 3E 분광광도계 상에서 수행하였다. 함께 배양된 두가지 올리고뉴클레오티드의 각각은 약 1.5μM로 존재하였다. Tm은 dA260/dT 대 온도의 좌표에서 최대값으로 계산되었다. 표 4에 보여진 결과는 iso C * iso G 염기쌍이 자연적 C*G 염기쌍과 등에너지인 것을 가리킨다.
Figure kpo00021
따라서 대략 등몰의 C,G, iso G,A 및 T를 함유하는 범용서열은 대략 동일 비율로 A,T,C,G만을 함유하는 서열보다 더 짧을 수 있다. 이것은 샘플중 자연적 비표적 서열과 그리고 A, T(u), C 및 C로 구성되도록 다소 구속된 LE 및 CE 표적-결합 서열과의 교차 서열과의 교차 반응성에 대한 잠재능을 제한한다.
데이터는 또한 iso C iso G 염기쌍의 특이성을 보여준다. iso C G 및 iso G C 쌍은 부정합처럼 행동한다. 고전적으로 ℃의 불안정화는 퍼센트 부정합에 의해 어림된다. 따라서 Tm의 약 7.5℃ 변화는 13뉴클레오티드중 1부정합(7.5%)에 대해 발생하리라 예상될 것이다. C G 또는 iso C iso G 정합을 부정합과 비교시 관찰된 8℃변화는 A,T,C 및 G코드로의 평균 부정합에서 발행하는 변화와 유사하다.
iso G는 적어도 두가지 토토머 형태, 케토 및 에놀형으로 존재한다. 케토형은 수성용매에서 우세하고, 에놀형은 유기용매에서 우세하다(Sepiol et al. (1976) Zeitschrift fuer Naturforschung 31C: 361-370). iso G 에놀 토토머는 원칙적으로 dT에 두 개의 수소결합을 형성할 수 있으며, 이는 A VT 염기쌍과 유사하다. 만약 에놀 토토머가 혼성화 버퍼중에 상당한 레벨로 존재한다면, iso C /iso G 염기쌍의 특이성은 제한될 것이다. 그러나 iso G T 부정합에서 관철된 Tm 은 53℃로서 다른 부정합과 본질적으로 동일하였다. 데이터는 에놀 토토머가 pH 7.9의 3
Figure kpo00022
SSC 중 매우 저농도로 존재하거나, 존재하면 iso C-iso G 혼성체 보다 7-8℃ 더 낮은 Tm으로 혼성체를 여전히 형성한다는 결론을 지지한다. G*T 부정합의 대조군은 약 49℃의 Tm을 가졌다. 이것은 평균 G*T 부정합에 대한 기대치보다 약간 더 낮으나, iso G-T 부정합에 가깝다.
당업계의 기술자는 또다른 염기쌍 조합 (즉 8염기, 4쌍)을 가지면 C*G와 등에너지 이든 아니든 범용 서열중 염기쌍의 특이성을 더욱 향상시킬 것이다는 것을 이해할 것이다. 이 경우에 범용서열로부터 A,T,C 및 G를 거의 제거할 수 있다. 그러나 이들 염기가 적게 나타나면 가능한 범용서열의 도서관의 다양성에 기여하고, 이는 그들 자신사이에 가능한 만큼 비상호작용하는 범용서열을 설계할 수 있도록 해준다.
예컨대 4염기 코드로 단 하나의 3머 교차 혼성체도 갖지 않는 두쌍의 범용 15머만을 설계할 수 있다. 즉, 15머 서열의 제3쌍의 첨가로 적어도 약간의 3뉴클레오티드 교차 혼성체가 존재할 것이다. 6염기 코드로 단 하나의 3머 Watson-Crick 형의 교차 혼성체도 없는 15머 서열의 8쌍을 설계할 수 있다. 8염기 코드로 15머의 19 그러한 쌍을 설계할 수 있다.
[실시예 3]
iso C*iso G 염기쌍에 대한 pH의 효과
pH의 함수로 iso C*iso G 염기쌍의 행위를 시험하기 위해, Tm 분석을 실시예 2에서 제공된 올리고뉴클레오티드 상에서 수행하였다. 상보적 iso C*iso G 염기쌍(각각 서열 2 및 4)과 C*G 염기쌍 (각각 서열 1 및 3)을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 Tm에 대한 pH의 효과는 0.5M과 약 1.5μM 올리고뉴클레오티드에서 결정하였으며 (n=2 또는 3), 그 결과는 표 5에 보여진다.
Figure kpo00023
일반적으로 올리고뉴클레오티드 혼성체는 pH 5 및 pH 10에서 안정하다. pH 5이하에서 C 및 A가 양성자화되는 반면, pH 10 이상에서는 G 및 T가 그들의 이미노 양성자를 잃기 시작한다. 따라서 pH 5 이하 pH 10이상에서는 핵산 혼성체가 감소된 안정성을 보인다. 표 2의 데이터는 iso C*iso G 염기쌍이 정상적인 산 안정성을 가진다는 것을 보여준다. 그러나 iso G iso C 혼성체 및 G VC 혼성체 둘다는 1.6 단위의 pH 증가에 따라 Tm 의 이상한 -9℃ 변화를 보인다. 이것은 아마도 그들의 매우 짧은 길이 때문일 것이다.
이론적으로 Gold et al의 미국특허번호 5,270,163, Tuerk et al. (1990) Science 249: 505-510, Szostak et al. (1990) Nature 346: 818-822 및 Joyce (1989) Gene 82: 83-87에 기술된 SELEX 프로토콜을 이용하여 더 큰 pH-감수성을 갖는 혼성체를 선택할 수 있으며, 여기서 DNA 또는 RNA 랜더머의 집단은 중성 pH에서 결합하고 중알칼리성 또는 중산성 pH에서 표적서열로부터 해리하는 것에 대해 선택될 것이다. 증폭후에 선택공정은 반복적으로 되풀이될 것이다. 최종 반복후에 원하는 pH 감수성을 갖는 올리고머를 클로닝하고 서열결정할 것이다. 그 서열을 합성하고, 직접 경쟁 측정법에서 최고 성능자를 선택할 것이다.
약염기의 불안정성은 측정 백그라운드 노이즈를 줄이기 위해 본 증폭 DNA 측 정법에서 이용될 수 있다. 최종단계에서 사용된 기질버퍼는 전형적으로 pH 9.5 내지 10.5이다. 적당한 염기 불안정성을 갖는 포획 프로브로 표적은 표면을 떠나서 또다른 웰에서 검출될 수 있다. 백그라운드는 뒤에 남을 것이다. WO 95/16055에 개시된 방법에 의해 지지체에 결합하는 포획 확장자를 최소화하면 포획 확장자를 통해 포획프로브에 비특이적으로 결합된 분자의 이탈에 의해 유발된 백그라운드 노이즈를 줄일 것이다.
비특이적으로 결합된 증폭자에 혼성화된 알칼리성 포스파타제프로브를 이탈시키는 것을 원치 않기 때문에, 바람직하게는 증폭자 및 표지 프로브와 증폭자 및 확장자 혼성체 보다 상당히 더 큰 염기 불안정성(즉, 주어진 pH에서 더 높은 Tm)을 갖는 포획 프로브-포획 확장자 혼성체가 선택될 것이다. 이와 선택적으로 제1도의 L-2/M-2 혼성체는 염기-불안정성 혼성체일 수 있다. 각 경우에 M-2/L-3 혼성체가 가장 안정할 것이고; 그렇지 않으면 비특이적으로 결합된 증폭자에 혼성화된 표지 프로브가 이탈될 것이다.
상기와 같이 생각컨대 판독을 위한 새로운 웰에 이탈 표적을 전달할 수도 있을 것이다. 그러나 그것이 발생된 웰에서 이탈용액을 판독하는 것이 바람직할 것이다. 이것은 축의 피펫팅 단계를 회피하고 추가적 액체 전달 단계와 관련된 부적확성을 제거할 것이다. 하기와 같이 웰 전달을 회피할 수 있는 여러 방법이 있다.
측정의 특이성을 더 향상시키기 위해, 표적의 특이적 이탈의 표면상의 백그라운드를 차폐하는 것과 커플링될 수 있다. 이 경우에 또다른 지지체로의 전달이 불필요할 것이다. 예컨대 고상 지지체의 표면은 표지 프로브의 저해제및/또는 다양한 발광 저해제, 흡광제또는 소멸제로 피복될 수 있다. 현재 사용중인 한 표면 피복은 폴리(pHe-lys)이다. 페닐알라닌은 특히 바람직한 효소표지인 알칼리성 포스파타제의 공지 저해제이다. 트립토판 및 시스테인과 같은 알칼리성 포스파타제의 다른 저해제를 피복하는 폴리머 펩티드에 포함할 수 있다. 발광 저해제의 예는 적은 양자수율은 갖는 화합물, 즉 탈인산화 디옥스에탄과의 충돌에 의해 여기된 후 빛 보다는 열을 우선적으로 방출하는 어떤 화합물도 포함한다.
또다른 웰로의 이탈 표적의 전달을 회피하기 위해 이탈용액의 검출을 더욱 선택적으로 만드는 적어도 두 개의 다른 편리한 방법이 있다. 고상을 가시화 시약에 접근할 수 없도록 함으로써 또는 고상 지지체상에서 일어나는 신호 발생 반응을 차폐함으로써 표적-관련 신호를 용액에서 판독할 수 있다. 후속 가시화 단계에서 고상을 분리하는 것은 물보다 무거운 불혼화성 오일을 반응 용기에 첨가함으로써 행할 수 있다. 이 오일은 관심의 용액을 정상에 띄우면서 용기의 바닥을 덮을 것이다. 가시광 또는 반사율 측정에 의한 단순 비색 검출을 위해, 불투명 물질을 오일에 첨가하여 가시화용 중성 백그라운드로서 작용시킬수 있다.
화학발광 검출을 위해 오일을 광학적 불투명 물질로 충전할 수 있다. 만약 이산화티타늄 같은 백색고체가 사용되면 부양 수층에서 방사된 빛이 검출용 용기로부터 상향 반사될 것이다. 오일중 용해된 흑색 고체 또는 염료분자도 또한 정지상을 차폐하기 위해 사용될 수 있다. 만약 오일 용액이 가시화 시약으로부터 고상을 완전히 분리하지 않더라도, 현탁고체 또는 용해염료는 표면으로부터 이러한 빛의 투과를 차단할 것이다.
또한 정지상은 그 표면 가까이에서 일어나는 반응으로부터 빛의 반사를 차단하는 염료로 착색될 수도 있다. 이것은 특히 불투명 웰내에 함유된 고상으로서의 착색 비드로 용이할 것이다.
[실시예 4]
중성 및 알칼리성 pH에서 iso C iso G 염기쌍에 대한 염의 효과
염농도의 함수로서 iso C iso G 염기쌍의 행위를 시험하기 위해 Tm 분석을 실시예 2에서 제공된 올리고뉴클레오티드로 수행하였다. 상보적 iso C iso G 염기쌍 (각각 서열 2 및 4)과 C G 염기쌍 (각각 서열 1 및 3)을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 Tm에 대한 염농도의 효과를 pH 7.9 또는 9.5 및 약 1.51M 올리고뉴클레오티드에서 결정했으며 (n=3), 그 결과는 표 6에 보여진다.
고전적으로 폴리뉴클레오티드는 염농도의 각 로그 변화에 대해 약 16-17℃의 Tm 변화를 보여준다. 올리고뉴클레오티드는 종종 약간 감소된 염 의존성을 보인다. iso C iso G 혼성체에 대해 계산된 pH 7.9에서의 염의 로그 변화당 Tm의 10-11℃ 변화는 13머에서 기대되는 값에 근사하다. 그러나 iso C iso G 혼성체에 대해 겨우 약 3℃의 pH 9.5에서의 변화와 로그 변화당 C G 혼성체에 대해 5도는 놀랄 만큼 낮았다.
이것은 또한 표적의 특이적 이탈에 이용될 수도 있다. 일반적으로 표적의 특이적 이탈을 위해서는 낮은 염이 사용된다. 불행하게도 가끔 상당한 분획의 백그라인드가 또한 이탈된다.
Figure kpo00024
중알칼리성 pH에서 iso C iso G 염기쌍의 용융의 염 의존성 때문에 낮아진 염 뿐만 아니라 증가된 pH로부터 얻어지는 추가적 이점은 없다. 따라서 이탈을 위한 높은 염(또한 알칼리성 포스파타제에도 바람직함)을 사용하여 백그라운드의 이탈을 최소화할 수 있다.
실시예 3에서 설명되듯이, 어떤 선택된 pH에서도 그들의 용융에 증강된 염의존성을 보이는 DNA 또는 RNA 서열을 발견하기 위해 SELEX 방법이 이용될 수 있다.
[실시예 5]
혼성화에 대한 염기쌍 부정합의 효과
상기 실시예는 iso G 염기쌍을 갖는 올리고머가 iso C를 함유하는 그것의 상보체와 특이적으로 쌍을 형성한다는 것을 보여주었다. iso G-함유 올리고머는 단일 iso G VT 또는 iso G VC 부정합을 함유하는 또다른 올리고머에 혼성화된 때 약 7-8℃로 불안정화된다. 전형적으로 각 10℃정도의 Tm 변화에 대해 약 10배 결합 감소가 있다.
13머 혼성체의 결합에 대한 두 개 염기의 부정합의 효과는 표 7에 보여진 프로브를 사용하여 평가하였다.
Figure kpo00025
표지된 프로브32, 알칼리성 포스파타제올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트는 Urdea et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16: 4937-4955에 기술된 대로 제조하였다. 표지된 프로브32를 대조 프로브30과 혼성화하여 알칼리성 포스파타제-프로브 30 32를 생성하였다. 표지된 프로브32를 변형 프로브31과 혼성화하여 isoC, isoG-알칼리성 포스파타제-프로브 31*32를 생성하였다.
프로브35, 포획 프로브를 여기에 참고문헌으로 포함된 PCT 공개번호 WO93/13244에 기술된 대로 미세적정 웰에 결합시켜 혼성화용 고상 지지체를 생성하였다. 프로브34, 포획 확장자를 프로브35에 혼성화하였다. 이 포획 확장자는 알칼리성 포스파타제-프로브 30 32에 상보적이고 알칼리성 포스파타제-프로브 31 32에 부분 상보적이다. 프로브 33은 포획 확장자에 결합하여 알칼리성 포스파타제프로브의 결합을 차단할 수 있는 콤페티머이다.
다음 배양을 약 1.0M NaCl중 53℃에서 30분간 행하였다:
(1) 1fmole의 고정 프로브 35를 함유하는 웰중 250fmole 프로브34;
(2) 1fmole의 고정 프로브 35를 함유하는 웰중 250fmole 프로브34+5fmole 프로브 33;
(3) 1fmole의 고정 프로브 35를 함유하는 웰중 5fmole 프로브33; 그리고
(4) 버퍼 단독
실시예 1에 정의된 대로 0.1
Figure kpo00026
SSC, 0.1% SDS로 2회 세척후, 각각의 상기 첫 번째 배양물을 다음으로 동일 조건하에 15분간의 두 번째 배양에 노출시켰다:
(1) 25fmole 프로브 30 + 500 attomole 프로브 32;
(2) 25fmole 프로브 31 + 500 attomole 프로브 32;
(3) 500 attomole 프로브 32; 그리고
(4) 버퍼 단독
플레이트를 상기와 같이 2회 그리고 10mM MaCl₂, 1mM ZnCl₂, 0.1% Brij-35로 보충된 동일 버퍼로 3회 세척하였다. 25분간의 LumipHos Plus (Lumigen) 배양후, 플레이트를 Chiron 광도계 상에 판독하였다.
형성가능한 혼성체는 제3도에 도시되며, 여기서 iso C 및 iso G로 예시된 Z는 비자연적 뉴클레오티드를 나타낸다. 프로브 33, 콤페티머는 포획 확장자가 21염기쌍을 형성할 수 있고, 이론상 둘다의 알칼리성 포스파타제프로브가 결합하는 것을 차단할 수 있다. 변형 프로브 *표지프로브(31*32)는 포획확장자에 혼성화하여 11염기쌍 및 2부정합(예컨대 G*iso C, isoG*T)형성할 수 있다. 대조 프로브*표지 프로브(30*32)는 포획 확장자와 13염기쌍을 형성할 수 있다.
표 8에 보여지듯이, 포획확장자(34)는 대조 프로브*표지프로브(30*32)와 강한 혼성체를 형성한다(샘플1=399 상대 광단위(RLU)). 20배 몰 과잉의 콤페티머, 샘플 2로 포획 확장자의 예비배양은 이 백그라운드 노이즈를 약 10배(30RLU) 감소시켰다. 변형 프로브*표지프로브(31*32)은 대조 프로브*지프로브(30*32)보다 포획 확장자에 40배 더 낮은 혼성화 ( 샘플3=9RLU)를 보였다. 두 개의 부정합이 혼성화의 40배 변화를 설명한다. 이것은 각각이 Tm을 7-8℃씩 불안정화시키는 2부정합에 대해 기대된 값과 같다. 콤페티머 및 부정합 알칼리성 포스파타제프로브(샘플4=0.4RLU)의 사용은 백그라운드 노이즈를 약 1000배 감소시켰다. 샘플 5는 대조이고 본질적으로 백그라운드 노이즈를 가지고 있지 않다(0.1 RLU). 이것은 표지 프로브 32가 포획 확장자와 검출가능한 상동성을 가지지 않기 때문에 기대된 것과 같다.
Figure kpo00027
혼성화 측정법에서 모든 포획 확장자에 대한 콤페티머를 사용하는 것은 전형적으로 측정당 5-10 포획 확장자가 있기 때문에 비실용적이다. 더욱이 이러한 예는 콤페티머에 의한 예비배양이 범용 서열중 15% 염기 치환(isoC, isoG로), 예컨대 13에서 2염기의 치환을 단순히 사용한 것 만큼 효율적이지 않다는 것을 보여준다. 30% 염기 치환(10에서 3)의 사용은 그렇지 않으면 완전히 염기쌍 형성되는 상보체의 비특이적 혼성화를 약 1000배 만큼 감소시킨다고 기대될 것이다(30% 부정합은 약 30℃ Tm 변환과 같고; Tm의 각 10℃ 변환에 대해 약 10배의 결합감소가 있다).
[실시예 6]
2'-데옥시-이소구아노신의 화학합성
2'-데옥시구아노신으로부터 2'-데옥시-이소구아노신의 합성은 다음 절차에 의해 성취되었다.
[단계 1]
2'-데옥시구아노신모노히드레이트(50mmole) 및 이미다졸(200mmole)을 500mL 디메틸포름아미드(DMF)로 공증발에 의해 건조시키고, 잔류물을 500mL DMF에 용해시켰다. 이 용액에 염화 t-부틸디메틸실릴(150mmole)을 첨가하고, 반응 혼합물을 18시간동안 실온에서 교반하면서 방치하였다. 메탄올(30mL)을 첨가하고, 25분후 용매를 진공에서 제거하였다. 용매를 증발에 의해 제거하고, 잔류물을 1L CH₂Cl₂에 용해하고, 1L 5% NaHCO₃ 및 1L 80% 포화 NaCl로 세척하고, 유기상을 Na₂SO₄상에서 건조하고, 여과 및 증발건조시켜 조 생성물(30그램)을 얻었으며, 이것을 2L 고온 에탄올에 직접 용해시켰다. 20℃로 서서히 냉각한후 20시간동안 4℃에서 저장하여 순수 3',5'-TBMDMS₂-2'-데옥시구아노신(65%수율)을 생성하였다.
[단계 2]
3',5'-TBMDMS₂-2'-데옥시구아노신(12mmole)을 트리에틸아민(150mmole) 및 N,N-디메틸아미노피리딘(100mg)을 함유하는 125mL CH₂Cl₂에 현탁시켰다. 염화 4-톨루엔술포닐(40mmole)은 0℃이였고, 반응 혼합물을 20시간동안 실온에서 교반하였다. 그때 모든 고체물질이 용해되어 담황색 용액을 초래한다. 반응을 1시간교반과 함께 50ml 5% NaHCO₃로 중단시켰다. 반응혼합물을 300mL CH₂Cl₂로 희석하고, 300mL 5% NaHCO₃ 및 300mL 80% 포화 NaCl로 세척하고, 유기상을 Na₂SO₄상에서 건조하고, 여과 및 증발건조시켜 조생성물(8.9그램)을 얻었다. 1% 내지 4% 메탄올/ CH₂Cl₂구배를 사용한 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피는 7.95그램의 순수 O -(4-톨루엔술포닐)-3',5'-O-TBDMS₂-2'-데옥시구아노신(11mmole)을 얻었다.
[단계 3]
12그램의 O -(4-톨루엔술포닐)-3',5'-O-TBDMS₂-2'-데옥시구아노신(17mmole)을 300mL CH₃CN에 현탁시켰다. 그다음 메틸피롤리딘(17mL)을 첨가하고, 현탁액을 1시간동안 교반하여 청정용액을 생성하였다. TLC 분석은 모든 출발물질이 기선 물질로 전환된 것을 보여주었다. 11그램의 4-(메틸티오)페놀 (85mmole)을 첨가하고, 용액을 60시간동안 교반시켰다. 적은 부피로 증발시킨후 600mL 아세트산에틸을 첨가시켰다. 이 용액을 3
Figure kpo00028
400mL의 0.3M NaOH 및 400mL 80% 포화 NaCl로 추출하고, 유기상을 Na₂SO₄상에서 건조하고, 여과 및 증발건조시켜 11.55그램의 조생성물을 얻었다. 4% 내지 5% 메탄올/CH₂Cl₂ 구배를 사용한 실리카겔 플래쉬 크로마토그리피에 의해 8.16그램의 O6-(4-메틸티오)-3',5'-O-TBDMS₂-2'-데옥시구아노신(11mmole)을 얻었다.
[단계 4]
4그램의 O6-(4-메틸티오)-3',5'-O-TBDMS₂-2'-데옥시구아노신(6.5mmole)을 0℃의 65mL CH₂Cl₂에 용해하고, 6.5mL의 아질산 tert-부틸을 적가하였다. 용액을 실온으로 가온시키고, 기체를 혼합물(N₂)로부터 방출시켰다. 40분후 TLC 분석이 출발물질의 완전소비와 새로운 느리게 이동하는 반점의 출현을 보여줄 때 진공에서 2
Figure kpo00029
100mL 톨루엔과의 공증발에 의해 과잉 아질산 t-부틸을 제거하였다. 4% 내지 5% 메탄올/CH₂Cl₂구배를 사용한 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 조 생성물의 잔류물을 정제하여, 2.75그램의 O6-(4-메틸티오)페닐-3',5'-O-TBDMS₂-2'-데옥시구아노신(4.45mmole)을 얻었다.
단계 5
모든 정제된 2.75그램의 O6-(4-메틸티오)페닐-3',5'-O-TBDMS₂-2'-데옥시크산토신(4.45mmole)을 50mL의 메탄올에 용해시켰다. 농축 수성 수산화암모늄(50mL)을 첨가하고 혼합물을 4시간동안 100℃의 견고히 밀봉된 용기(bomb)내에서 가열하였다. 냉각후에 진공에서 에탄올로 공중발에 의해 용매를 제거하여 1.8그램의 조생성물(3.6mmole)을 얻었다. 고온 에탄올로부터 재결정화로 정제하여 순수 3', 5'-O-TBDMS2-2'-이소구아노신의 샘플을 얻었다. 이 물질은 모든 면에서 (UV, TLC, NMR 및 MS) 공표된 광분해 경로(Switzer et al. (1993), 상기)에 제조된 샘플과 동일하였다.
[실시예 7]
포획 확장자에 대한 증폭자 및 알칼리성 포스파타제프로브의 비특이적 혼성화의 제어
A. isoC, isoG b DNA amp 및 isoC, isoG ap 프로브의 구성
15부위 빗-모양 증폭 멀티머(amp)는 PCT 공개번호 WO 92/02526에 이미 기술된 대로 구성하였다. 아암을 기술된 바와 같이 12 뉴클레오티드 링커 및 T4 DNA 리가제를 사용하여 빗상에 라이게이션시켰다. 알칼리성 포스포타제(ap) 프로브는 미국특허번호 5,124,246에 기술된 대로 아미노 작용성을 함유하는 올리고뉴클레오티드로부터 구성하였다. 사용된 서열은 다음과 같다:
Figure kpo00030
B. 포획 확장자(CE)서열의 제조
TNF-알파, 인터루킨-2(IL-2), IL-4, IL-6 및 감마 인터페론(IFN1-r) 표적에 대한 포획 확장자는 표준 포스포르아미다이트 방법에 의해 제조되었다. 시험된 포획 확장자 서열은 다음과 같다:
Figure kpo00031
Figure kpo00032
C. CE 및 amp와 CE 및 ap 사이의 비특이적 혼성화 (NSH)의 측정방법
총 100 femtomole의 개별 포획 확장자 프로브 또는 총 100 femtomole의 각포획 확장자로 구성된 푸울을 53도에서 1시간동안 미크로웰에서 배양하였다. 세척 A(0.1
Figure kpo00033
SSC, 0.1%SDS)로 2회 세척후, 웰을 30분동안 증폭자 희석제+/- 비 iso C, iso G amp(WO 95/16055에 기술) 또는 iso C, iso G amp(상기 실시예 7A에 기술)에서 배양하였다. 세척 A로 2회더 세척한후, 웰을 15분간 비 iso C, iso G ap 프로브(WO 95/16055에 기술) 또는 iso C, iso G ap 프로브(상기 실시예 7A에 기술)를 함유하는 amp 희석제(5
Figure kpo00034
SSC, 50% 프로테인아제K-분해된 말형정)에서 배양하였다.
다음 정의가 사용되었다: AP NSB=CE가 없을 때 ap 프로브의 백그라운드. Amp NSB=CE가 없고 더 적은 NSB 일 때 amp 및 ap 프로브의 백그라운드, AP NSH=amp가 없고 더 적은 ap NSB일 때 CE 샘플로부터의 RLU. AMP NSH=CE 샘플로부터의 RLU-AP NSH-AMP NSB-AP NSB.
D. 결과
5개의 개별 CE 프르브는 웰당 100fm을 사용하여 백그라운드 비특이적 혼성화에 대해 시험하였다. 그 결과는 하기 표에 보여진다.
Figure kpo00035
CE프로브 (AP-NSB 및 AMP-NSB)의 부재중 비특이적 결합 백그라운드는 모든 amp 및 ap프로브에 대해 무시할만하다(1RLU). 3개의 확정자는 isoC, isoG amp와는 보이지 않는 현재 amp프로브와 강한(10RLU)교차 반응성을 보인다. 한 프로브는 isoC, isoG AP프로브와는 보이지 않는 현재 AP프로브와 6RLU 교차반응성을 보인다. 모든 경우에 isoC, isoG 프로브에 의한 NSH는 무사할만하다. 1.0미만의 RLU값은 NSB에 비해 사소한 것으로 여겨진다.
5푸울의 CE프로브를 동일분자로 비특이적 혼성화 백그라운드에 대해 시험하였다. 그결과는 하기에 보여진다.
Figure kpo00036
다시 모든 amp 및 ap프로브의 NSB는 NSH에 비해 무시할만하다. 5개 푸울중 4개는 2.3내지 34.9RLU범위의 상당한 amp NSH를 보이는 반면, CE푸울증 어느 것도 isoC, isoG amp로 상당한 NSH(1)를 가지지 않는다. 푸울증 2개는 ap프로브로 상당한 NSH를 가지는 반면, 푸울중 어느 것도 isoC, isoG ap프로브와 상당한 상호작용을 가지지 않는다. 이 실험에서 총 30CE서열을 교차 반응성에 대해 스크리닝하였다.
신규 염기쌍을 혼성화 측정 포맷에 삽입할 수 있는 능력을 갖는 당업계의 기술자는 isoC, isoG리더 서열에 의한 amp리더서열의 치환이 여기 사용된 isoC, isoG amp에 대한 더 낮은 NSH값을 초래할 것을 이해할 것이다.
E. isoC, isoG amp 및 ap와 완전 1L-2 및 1L-6투여-응답-곡선
일련의 인간세포 희석액을 1L-2 및 1L-6mRNA에 대해 평가함으로써 완전투여응답곡선을 생성하였다.
검출한계는 델타=제로인 세포수로서 계산되었다.
델타는 posRLU-2표준편차-(negRLU+2표준편차)로서 정의된다.
그 결과는 하기표에 보여진다.
Figure kpo00037
자연서열을 갖는 종래분자 대신에 isoC/G amp 및 ap를 사용함으로써 감도는 1L-2측정으로 12.6배, 1L-6측정으로 3배 향상되었다.
자연서열로 노이즈가 클수록, 측정개선도 커진다.
따라서 액상 샌드위치 혼성화 측정법에서 더욱 표적-의존성 신호를 발생시키는 신규방법이 개시되었다. 더욱이 2'-데옥시-이소구아노신을 합성하는 신규방법이 개시되었다. 비록 본 발명의 바람직한 구체예가 약간 상세히 설명되었지만, 첨부된 청구항에 의해 한정되는 본 발명에 사상 및 범위를 벗어나지 않고 자명한 변이를 만들 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

Claims (13)

  1. 각각 적어도 하나의 혼성화 올리고뉴클레오티드 절편을 함유하는 복수의 측정성분을 사용하여 샘플중 핵산 분석물을 검출하기 위한 핵산 혼성화 측정법에 있어서, A-T 및 G-C 염기쌍의 형성되는 조건하에 아데노신(A),티미딘(T), 시티딘(C), 구아노신(G) 또는 우리딘(U)과 효과적으로 염기쌍을 형성하지 않는 제1뉴클레오티드 단위체를 적어도 하나의 혼성화 올리고뉴클레오티드 절편내로 통합시키는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제1뉴클레오티드 단위체는 제2상보적 뉴클레오티드 단위체와 염기쌍을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 제1 및 제2뉴클레오티드 단위체는 다음으로 구성된 상보적 염기쌍의 군에서 호환적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure kpo00038
    (상기식에서 R은 제1 및 제2뉴클레오티드 단위체가 폴리뉴클레오티드에 통합시 상보적 뉴클레오티드 단위체가 염기쌍을 형성하게 해주는 골격이고, R¹는 수소, 메틸, a 또는 b-프로피닐, 브롬, 플루오르 또는 요오드이다).
  4. 각각 적어도 하나의 혼성화 올리고뉴클레오티드 절편을 함유하는 복수의 측정성분을 사용하여 샘플중 핵산 분석물을 검출하기 위한 핵산 혼성화 측정법에 있어서, 측정 긴축성이 Tm₁혼성 복합체를 선택적으로 불안정화하게 제어될 수 있도록 Tm₁혼성 복합체 및 Tm₂혼성 복합체를 통합시키는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. (a) 분석물을 고상 지지체에 직접 또는 간접으로 결합시키고, (b) 분석물을 표지화하고, 그리고 (c) 분석물-연합된 표지의 존재를 검출하는 것으로 이루어지는 각각 적어도 하나의 혼성화 올리뉴클레오티드 절편을 함유하는 복수의 측정성분을 사용하여 샘플중 핵산 분석물을 검출하기 위한 액상 샌드위치 혼성화 측정법에 있어서, A-T 및 G-C 염기쌍이 형성되는 조건하에 아데노신(A), 티미신(T), 시티딘(C), 구아노신(G) 또는 우리딘(U)과 효과적으로 염기쌍을 형성하지 않는 제1뉴클레오티드 단위체를 적어도 하나의 혼성화 올리고뉴클레오티드 절편내로 통합시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. (a) 분석물을 고상 지지체에 직접 또는 간접으로 결합시키고, (b) 분석물을 표지화하고, 그리고 (c) 분석물-연합된 표지의 존재를 검출하는 것으로 이루어지는 각각 적어도 하나의 혼성화 올리뉴클레오티드 절편을 함유하는 복수의 측정성분을 사용하여 샘플중 핵산 분석물을 검출하기 위한 액상 샌드위치 혼성화 측정법에 있어서, 측정 긴축성이 Tm₁혼성 복합체를 선택적으로 불안정화하게 제어될 수 있도록 Tm₁혼성 복합체 및 Tm₂혼성 복합체를 통합시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 다음 구조식
    Figure kpo00039
    (상기식에서 R¹은 수소, 히드록실, 술프히드릴, 할로겐, 아미노, 알킬, 알릴 및 -OR²로 구성된 군에서 선택되고, R²는 알킬, 알릴, 실릴 또는 포스페이트이다)을 갖는 화합물의 합성방법에 있어서, a) 다음 구조식을 갖는 화합물을 적당한 시약과 반응시켜 3' 및 5'히드록실기 둘다를 보호하고;
    Figure kpo00040
    b) 단계(a)의 생성물을 적당한 시약과 반응시켜 O6-옥시 부분을 친핵성 치환에 민감한 작용기로 전환시킴으로써 작용화된 O6부분을 생성하고,; c) 단계(b)의 생성물의 2-아미노기를 산화하고; d) 단계(c)의 생성물을 친핵성 시약과 반응시켜 작용화된 O6부분을 제거하고; 그리고 e) 단계(d)의 생성물을 적당한 시약과 반응시켜 보호된 3' 및 5' 히드록실기를 탈보호시키는 것으로 이루어지는 방법.
  8. 2'-데옥시-이소구아노신의 합성방법에 있어서, a) 2'-데옥시-구아노신을 염화 t-부틸디메틸실릴(TBDMS)과 반응시킴으로써 2/-데옥시구아노신을 3',5'-O-(t-부틸디메틸실릴)₂-2'-데옥시구아노신으로 전환시키고; b) 3',5'-O-TBDMS₂-2'-데옥시구아노신을 염화 4-톨루엔술포닐과 반응시킴으로써 3',5'-O-TBDMS₂-2'-데옥시구아노신을 O6-(4-톨루엔술포닐)-3',5'-O-TBDMS₂-2'-데옥시구아노신으로 전환시키고; c) O6-(4-톨루엔술포닐)-3',5'-O-TBDMS₂-2'-데옥시구아노신을 페놀로 처리함으로써 O6-(4-톨루엔술포닐)기를 치환하여 O6-(4-(메틸티오)페닐)-3',5'-O-TBDMS₂-2'-데옥시구아노신을 얻고; d) 중성조건하에 O6-(4-(메틸티오)페닐)-3',5'-O-TBDMS₂-2'-데옥시구아노신을 아질산 t-부틸로 처리함으로써 O6-(4-(메틸티오)페닐)-3',5'-O-TBDMS₂-2'-데옥시구아노신의 2-아미노기를 옥시 작용기로 산화시켜 O6-(4-(메틸티오)페닐)-3',5'-O-TBDMS₂-2'-데옥시크산토신을 얻고; 그리고 e) 상승온도에서 O6-(4-(메틸티오)페닐)-3',5'-O-TBDMS₂-2'-데옥시크산토신의 O2-(4-(메틸티오)페닐)기를 수산화 암모늄으로 치환하여 3',5'-O-TBDMS₂-2'-데옥시-이소구아노신을 얻는 것으로 이루어지는 방법.
  9. 분석물과 혼성 복합체를 형성할 수 있는 절편을 함유하는 적어도 하나의 혼성화 올리고뉴클레오티드 프로브와 혼성 복합체의 검출수단으로 이루어지는 샘플중 핵산 분석물을 검출하기 위한 키트에 있어서, 적어도 하나의 혼성화 올리고뉴클레오티드 프로브는 A-T 및 G-C 염기쌍이 형성되는 조건하에 아데노신(A), 티미딘(T), 시티딘(C), 구아노신(G) 또는 우리딘(U)과 효과적으로 염기쌍을 형성하지 않는 제1뉴클레오티드 단위체를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  10. 제9항에 있어서, (a) A-T 및 G-C 염기쌍이 형성되는 조건하에 A, T, C, G 또는 U와 효과적으로 염기쌍을 형성하지 않는 제1뉴클레오티드 단위체를 포함하는 포획 프로브의 세트; (b) 제1혼성화 올리고뉴클레오티드 절편은 포획 프로브와 혼성 복합체를 형성할 수 있고 제2혼성화 올리고뉴클레오티드 절편은 핵산 분석물의 소정 절편과 혼성 복합체를 형성할 수 있는, 제1 및 제2혼성화 올리고뉴클레오티드 절편을 포함하는 포획 확장자 분자의 세트; (c) 제3혼성화 올리고뉴클레오티드 절편은 포획 확장자 분자의 세트가 결합하는 것 이외의 핵산 분석물의 절편과 혼성 복합체를 형성할 수 있는, 제3 및 제4혼성화 올리고뉴클레오티드 절편을 포함하는 포지 확장자 분자; (d) 혼성화 올리고뉴클레오티드 절편은 A-T 및 G-C 염기쌍이 형성되는 조건하에 A, T, C, G 또는 U와 효과적으로 염기쌍을 형성하지 않는 제1뉴클레오티드 단위체를 함유하고 전치증폭자 분자는 표지 확장자 분자 및 복수의 증폭 멀티머와 혼성 복합체를 형성할 수 있는, 제5 및 제6혼성화 올리고뉴클레오티드 절편을 포함하는 임의적 전치증폭자 분자; (e) 혼성화 올리고뉴클레오티드 절편은 A-T 및 G-C 염기쌍이 형성되는 조건하에 A, T, C, G 또는 U와 효과적으로 염기쌍을 형성하지 않는 제1뉴클레오티드 단위체를 함유하고 증폭 멀티머는 표지 확장자 분자 또는 전치증폭자 분자와 혼성 복합체를 형성할 수 있는, 제7 및 제6혼성화 올리고뉴클레오티드 절편과 복수의 동일 올리고뉴클레오티드 서브유니트를 포함하는 증폭 멀티머; 그리고 (f) 동일 올리고뉴클레오티드 서브유니트와 혼성 복합체를 형성하도록 고안되고 직접 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 제공하는 표지를 포함하는 표지 프로브로 이루어지는 것을 특징으로 하는 키트.
  11. 압타머로서 유용한 올리고뉴클리오티드에 있어서, 적어도 하나는 A-T 및 G-C 염기쌍이 형성되는 조건하에 아데노신(A), 티미딘(T), 시티딘(C), 구아노신(G) 또는 우리딘(U)과 효과적으로 염기쌍을 형성하지 않는 상보적 비자연적 뉴클레오티드 단위체를 포함하는 복수의 상보적 염기쌍을 함유하는 분자내 올리고뉴클레오티드 혼성 복합체로 이루어지고, 여기서 비자연적 뉴클레오티드 단위체는 압티머의 2차 구조를 유지하기 위해 염기쌍의 특이성을 필요로 하지 않는 올리고뉴클레오티드 절편내에 함유되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  12. 압타머의 제조방법에 있어서, (a) 표적 분자를 제공하고; (b) 올리고뉴클레오티드가 표적분자에 결합하기 유리한 조건하에 표적분자를 올리고뉴클레오티드의 랜더머 푸울과 접촉시키고; (c) 표적분자에 결합하여 올리고뉴클레티드-표적 복합체를 형성하는 올리고뉴클레티드를 표적분자에 결합하지 않은 올리고뉴클레오티드부터 분리하고; (d) 올리고뉴클레티드-표적 복합체로부터 올리고뉴클레오티드부터 분리하고; (e) 중합효소 연쇄반응을 이용하여 올리고뉴클레오티드부터 증폭하고; (f) 단계(b) 내지 (e)를 적어제1도회 반복하여 최종 압타머 구조물을 형성하고; 그리고 (g) 최종 압타머 구조물내 하나 이상의 뉴클레오티드 단위체를 A-T 및 G-C 염기쌍이 형성되는 조건하에 아데노신(A), 티미딘(T), 시티딘(C), 구아노신(G) 또는 우리딘(U)과 효과적으로 염기쌍을 형성하지 않는 비자연적 뉴클레오티드 단위체로 치환하는 것으로 이루어지는 방법.
  13. 제1 및 제2혼성화 절편으로 이루어지는 안티센스 분자에 있어서,제1혼성화 절편은 표적 올리고뉴클레오티드와 혼성 복합체를 형성할 수 있고 제2절편은 A-T 및 G-C 염기쌍이 형성되는 조건하에 아데노신(A), 티미딘(T), 시티딘(C), 구아노신(G) 또는 우리딘(U)과 효과적으로 염기쌍을 형성하지 않는 적어도 하나의 뉴클레오티드 단위체를 포함하고 제2안티센스 분자와 혼성 복합체를 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 안티센스 분자.
KR1019970701318A 1994-08-30 1995-08-30 신규 염기쌍 설계를 이용한 비특이적 혼성화의 감소방법 KR100218113B1 (ko)

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US08/298,073 US5681702A (en) 1994-08-30 1994-08-30 Reduction of nonspecific hybridization by using novel base-pairing schemes
US8/298,073 1994-08-30
PCT/US1995/011115 WO1996006950A1 (en) 1994-08-30 1995-08-30 Reduction of nonspecific hybridization by using novel base-pairing schemes

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KR970705644A KR970705644A (ko) 1997-10-09
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KR1019970701318A KR100218113B1 (ko) 1994-08-30 1995-08-30 신규 염기쌍 설계를 이용한 비특이적 혼성화의 감소방법

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WO (1) WO1996006950A1 (ko)

Families Citing this family (297)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4140463A1 (de) * 1991-12-09 1993-06-17 Boehringer Mannheim Gmbh 2'-desoxy-isoguanosin, dessen isostere analoge sowie anwendung derselben
US6033851A (en) * 1994-12-09 2000-03-07 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for suppressing nonspecific hybridization in primer extension method
US5631146A (en) * 1995-01-19 1997-05-20 The General Hospital Corporation DNA aptamers and catalysts that bind adenosine or adenosine-5'-phosphates and methods for isolation thereof
JP2000500342A (ja) 1995-11-15 2000-01-18 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド ヒトパピローマウイルス核酸に相補的な核酸プローブおよび関連する方法およびキット
ATE232559T1 (de) * 1996-07-12 2003-02-15 Tm Technologies Inc Verfahren zur signalverstärkung
ES2270467T3 (es) * 1996-07-16 2007-04-01 Gen-Probe Incorporated Metodos para detectar y amplificar secuencias de acido nucleico utilizando oligonucleotidos modificados que tienen una tm especifica de la diana mas elevada.
US7070925B1 (en) 1996-07-16 2006-07-04 Gen-Probe Incorporated Method for determining the presence of an RNA analyte in a sample using a modified oligonucleotide probe
US6009480A (en) * 1997-09-12 1999-12-28 Telxon Corporation Integrated device driver wherein the peripheral downloads the device driver via an I/O device after it is determined that the I/O device has the resources to support the peripheral device
US6518017B1 (en) * 1997-10-02 2003-02-11 Oasis Biosciences Incorporated Combinatorial antisense library
US20030165888A1 (en) * 2001-07-18 2003-09-04 Brown Bob D. Oligonucleotide probes and primers comprising universal bases for diagnostic purposes
DK1040202T3 (da) * 1997-10-28 2009-04-14 Los Alamos Nat Security Llc DNA-polymorfiidentitetsbestemmelse under anvendelse af flowcytometri
AU748022B2 (en) * 1997-12-12 2002-05-30 Digene Corporation Universal collection medium
US6242246B1 (en) * 1997-12-15 2001-06-05 Somalogic, Inc. Nucleic acid ligand diagnostic Biochip
US20070166741A1 (en) 1998-12-14 2007-07-19 Somalogic, Incorporated Multiplexed analyses of test samples
US6686150B1 (en) 1998-01-27 2004-02-03 Clinical Micro Sensors, Inc. Amplification of nucleic acids with electronic detection
CA2319170A1 (en) 1998-01-27 1999-07-29 Clinical Micro Sensors, Inc. Amplification of nucleic acids with electronic detection
US6458559B1 (en) 1998-04-22 2002-10-01 Cornell Research Foundation, Inc. Multivalent RNA aptamers and their expression in multicellular organisms
AU775179B2 (en) * 1999-03-15 2004-07-22 Applied Biosystems, Llc Probe/mobility modifier complexes for multiplex nucleic acid detection
US20080318889A1 (en) * 1999-04-08 2008-12-25 Antisoma Research Limited Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin
ES2296615T3 (es) * 1999-04-08 2008-05-01 Antisoma Research Limited Actividad antiproliferativa de oligonucleotidos ricos en g y procedimiento de uso de los mismos para su union a la nucleolina.
US7960540B2 (en) * 1999-04-08 2011-06-14 Advanced Cancer Therapeutics, Llc Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin
AU777499B2 (en) * 1999-04-08 2004-10-21 Gen-Probe Incorporated Antisense oligonucleotides comprising universal and/or degenerate bases
US8114850B2 (en) * 1999-04-08 2012-02-14 Advanced Cancer Therapeutics, Llc Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin
US20080318890A1 (en) * 1999-04-08 2008-12-25 Antisoma Research Limited Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin
US20060275782A1 (en) 1999-04-20 2006-12-07 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
EP1923471B1 (en) 1999-04-20 2012-12-19 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US8481268B2 (en) 1999-05-21 2013-07-09 Illumina, Inc. Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays
US8080380B2 (en) 1999-05-21 2011-12-20 Illumina, Inc. Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays
US20020045182A1 (en) * 1999-07-16 2002-04-18 Lynx Therapeutics, Inc. Multiplexed differential displacement for nucleic acid determinations
US7122303B2 (en) 1999-09-17 2006-10-17 Agilent Technologies, Inc. Arrays comprising background features that provide for a measure of a non-specific binding and methods for using the same
US7078167B2 (en) * 1999-09-17 2006-07-18 Agilent Technologies, Inc. Arrays having background features and methods for using the same
US6428957B1 (en) 1999-11-08 2002-08-06 Agilent Technologies, Inc. Systems tools and methods of assaying biological materials using spatially-addressable arrays
WO2003074738A1 (en) * 2000-01-18 2003-09-12 Quantom Dot Corporation Oligonucleotide-tagged semiconductor nanocrystals for microarray and fluorescence in situ hybridization
US6235483B1 (en) 2000-01-31 2001-05-22 Agilent Technologies, Inc. Methods and kits for indirect labeling of nucleic acids
ATE492652T1 (de) 2000-02-07 2011-01-15 Illumina Inc Nukleinsäuredetektionsverfahren mit universellem priming
EP1967595A3 (en) 2000-02-16 2008-12-03 Illumina, Inc. Parallel genotyping of multiple patient samples
WO2001071044A1 (en) 2000-03-22 2001-09-27 Quantum Dot Corporation Methods of using semiconductor nanocrystals in bead-based nucleic acid assays
CN1592792B (zh) * 2000-05-19 2010-12-01 伊拉根生物科学公司 检测核酸的材料和方法
US6977161B2 (en) * 2000-10-14 2005-12-20 Eragen Biosciences, Inc. Solid support assay systems and methods utilizing non-standard bases
JP2003535600A (ja) * 2000-06-02 2003-12-02 バイエル コーポレイション インサイチュ分枝ｄｎａハイブリダイゼーションを用いた高感度遺伝子検出および位置決定
US7230092B2 (en) 2000-06-06 2007-06-12 Luminex Molecular Diagnostics, Inc. Capture moieties for nucleic acids and uses thereof
US7439016B1 (en) * 2000-06-15 2008-10-21 Digene Corporation Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method
US7601497B2 (en) 2000-06-15 2009-10-13 Qiagen Gaithersburg, Inc. Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method
US6548251B1 (en) 2000-09-05 2003-04-15 Fidelity Systems, Inc. Inhibition of molecular and biological processes using modified oligonucleotides
US20030077590A1 (en) * 2000-09-22 2003-04-24 Pedersen Finn Skou Methods for diagnosis and treatment of diseases associated with altered expression of neurogranin
US20030044803A1 (en) * 2000-09-22 2003-03-06 Pedersen Finn Skou Methods for diagnosis and treatment of diseases associated with altered expression of JAK1
US20020115058A1 (en) * 2000-09-22 2002-08-22 Pedersen Finn Skou Methods for diagnosis and treatment of diseases associated with altered expression of Pik3r1
EP2351855A1 (en) 2000-09-26 2011-08-03 Duke University RNA aptamers and methods for identifying the same
CA2424817A1 (en) 2000-10-06 2002-04-11 Quantum Dot Corporation Cells having a spectral signature, and methods of preparation and use thereof
US20050059031A1 (en) 2000-10-06 2005-03-17 Quantum Dot Corporation Method for enhancing transport of semiconductor nanocrystals across biological membranes
EP1325457A4 (en) * 2000-10-10 2007-10-24 Genencor Int LIBRARIES RICH IN INFORMATION
US7374882B2 (en) * 2000-11-28 2008-05-20 Riken Method for base sequencing and biologically active nucleic acids
US7892730B2 (en) * 2000-12-22 2011-02-22 Sagres Discovery, Inc. Compositions and methods for cancer
US7645441B2 (en) * 2000-12-22 2010-01-12 Sagres Discovery Inc. Compositions and methods in cancer associated with altered expression of PRLR
US7700274B2 (en) * 2000-12-22 2010-04-20 Sagres Discovery, Inc. Compositions and methods in cancer associated with altered expression of KCNJ9
US20030087252A1 (en) * 2000-12-22 2003-05-08 Morris David W. Novel compositions and methods in cancer associated with altered expression of PRDM11
US7820447B2 (en) 2000-12-22 2010-10-26 Sagres Discovery Inc. Compositions and methods for cancer
US20030232334A1 (en) 2000-12-22 2003-12-18 Morris David W. Novel compositions and methods for cancer
US20030099963A1 (en) * 2000-12-22 2003-05-29 Morris David W. Novel compositions and methods in cancer associated with altered expression of TBX21
US20030165878A1 (en) * 2000-12-22 2003-09-04 Morris David W. Novel compositions and methods in cancer associated with altered expression of MCM3AP
GB0101397D0 (en) * 2001-01-19 2001-03-07 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd Suppression of non-specific nucleic acid amplication
US20030092157A1 (en) * 2001-03-16 2003-05-15 Hayden Michael R. Compositions, screening systems and methods for modulating HDL cholesterol and triglyceride levels
US20030191073A1 (en) 2001-11-07 2003-10-09 Challita-Eid Pia M. Nucleic acid and corresponding protein entitled 161P2F10B useful in treatment and detection of cancer
US20050003356A1 (en) * 2001-05-25 2005-01-06 Hayden Michael R. Diagnostic methods for cardiovascular disease, low hdl-cholesterol levels, and high triglyceride levels
JP4773684B2 (ja) * 2001-05-25 2011-09-14 デューク ユニバーシティ 薬物のモジュレータ
CA2348042A1 (en) 2001-06-04 2002-12-04 Ann Huletsky Sequences for detection and identification of methicillin-resistant staphylococcus aureus
EP1481076A4 (en) 2001-07-12 2005-05-11 Illumina Inc MULTIPLEX NUCLEIC REACTIONS
US20030129626A1 (en) * 2001-09-24 2003-07-10 Nielsen Kirsten Vang Methods, kits and compositions pertaining to the suppression of detectable probe binding to randomly distributed repeat sequences in genomic nucleic acid
US20070098728A1 (en) * 2001-09-24 2007-05-03 Pedersen Finn S Novel compositions and methods in cancer
US7070933B2 (en) * 2001-09-28 2006-07-04 Gen-Probe Incorporated Inversion probes
US20040166490A1 (en) * 2002-12-17 2004-08-26 Morris David W. Novel therapeutic targets in cancer
US20040126762A1 (en) * 2002-12-17 2004-07-01 Morris David W. Novel compositions and methods in cancer
WO2003040395A2 (en) * 2001-11-07 2003-05-15 Applera Corporation Universal nucleotides for nucleic acid analysis
US20060040262A1 (en) * 2002-12-27 2006-02-23 Morris David W Novel compositions and methods in cancer
US20040180344A1 (en) * 2003-03-14 2004-09-16 Morris David W. Novel therapeutic targets in cancer
US20040197778A1 (en) * 2002-12-26 2004-10-07 Sagres Discovery, Inc. Novel compositions and methods in cancer
CA2470774A1 (en) * 2001-12-19 2003-06-26 Hvidovre Hospital A method and a kit for determination of a microbial count
US20070184474A1 (en) * 2002-01-10 2007-08-09 Nichirei Corporation Process for amplifying DNA
AU2003217379A1 (en) 2002-02-15 2003-09-09 Somalogic, Inc. Methods and reagents for detecting target binding by nucleic acid ligands
US20030194705A1 (en) * 2002-03-01 2003-10-16 Schroth Gary P. Methods of using unnatural nucleobases for decoding
DE60325564D1 (de) 2002-03-05 2009-02-12 Univ Texas Biospezifische kontrastmittel
DE10211321A1 (de) * 2002-03-14 2003-09-25 Gnothis Holding Sa Ecublens Verwendung von Abfangsonden beim Nachweis von Nukleinsäuren
EP1501855A4 (en) 2002-03-21 2006-02-22 Sagres Discovery Inc NEW COMPOSITIONS AND METHODS FOR CANCER
WO2003083440A2 (en) * 2002-03-29 2003-10-09 Genentech, Inc. Methods and compositions for detection and quantitation of nucleic acid analytes
US7094537B2 (en) * 2002-04-30 2006-08-22 Agilent Technologies, Inc. Micro arrays with structured and unstructured probes
KR20050010956A (ko) 2002-06-20 2005-01-28 더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 집광 다발색단을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 검출 및분석하기 위한 방법 및 조성물
US7144950B2 (en) 2003-09-17 2006-12-05 The Regents Of The University Of California Conformationally flexible cationic conjugated polymers
WO2004001065A2 (en) * 2002-06-24 2003-12-31 Cornell Research Foundation, Inc. Exhaustive selection or rna aptamers against complex targets
WO2004016733A2 (en) 2002-08-16 2004-02-26 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 251p5g2 useful in treatment and detection of cancer
WO2004092324A2 (en) 2002-08-26 2004-10-28 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for detection and analysis of polynucleotides using light harvesting multichromophores
US20040157238A1 (en) * 2002-09-20 2004-08-12 Quinn John J. Method for detection of multiple nucleic acid sequence variations
US8394944B2 (en) * 2002-09-20 2013-03-12 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Dual-purpose primers and probes for providing enhanced hybridization assays by disruption of secondary structure formation
DE602004018270D1 (de) * 2003-01-17 2009-01-22 Eragen Biosciences Inc Nukleinsäureamplifikation mit nichtstandardbasen
AU2004210975B2 (en) 2003-02-10 2008-04-10 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein named 158P1D7 useful in the treatment and detection of bladder and other cancers
EP1599609B1 (en) 2003-02-13 2009-11-11 The Regents of The University of California Methods and compositions for detection and analysis of polynucleotide-binding protein interactions using light harvesting multichromophores
US20040170982A1 (en) 2003-02-14 2004-09-02 Morris David W. Novel therapeutic targets in cancer
US7767387B2 (en) * 2003-06-13 2010-08-03 Sagres Discovery, Inc. Therapeutic targets in cancer
EP1592708A2 (en) 2003-02-14 2005-11-09 Sagres Discovery, Inc. Therapeutic gpcr targets in cancer
US20070218071A1 (en) * 2003-09-15 2007-09-20 Morris David W Novel therapeutic targets in cancer
WO2004090153A2 (en) 2003-04-01 2004-10-21 Eragen Biosciences,Inc. Polymerase inhibitor and method of using same
US20040241661A1 (en) * 2003-05-29 2004-12-02 Arindam Bhattacharjee Pseudo single color method for array assays
JP2007525196A (ja) 2003-05-30 2007-09-06 アジェンシス， インコーポレイテッド 前立腺幹細胞抗原（ｐｓｃａ）変異体及びその部分配列
WO2005001129A2 (en) * 2003-06-06 2005-01-06 Applera Corporation Mobility cassettes
US20040259100A1 (en) 2003-06-20 2004-12-23 Illumina, Inc. Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping
DE20310332U1 (de) * 2003-07-04 2004-11-11 Mwg-Biotech Ag Vorrichtung zum automatischen Öffnen und Schließen von Reaktionsgefäßen
EP1939779A3 (en) 2003-08-01 2009-04-01 Dna Twopointo Inc. Systems and methods for biopolymer engineering
WO2005013090A2 (en) 2003-08-01 2005-02-10 Dna Twopointo Inc. Systems and methods for biopolymer engineering
US20090163375A1 (en) 2003-09-09 2009-06-25 Bowman Christopher N Use of Photopolymerization for Amplification and Detection of a Molecular Recognition Event
US7354706B2 (en) * 2003-09-09 2008-04-08 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Use of photopolymerization for amplification and detection of a molecular recognition event
US20070281896A1 (en) * 2003-09-30 2007-12-06 Morris David W Novel compositions and methods in cancer
US20050136414A1 (en) * 2003-12-23 2005-06-23 Kevin Gunderson Methods and compositions for making locus-specific arrays
WO2005081776A2 (en) * 2004-01-30 2005-09-09 Eragen Biosciences, Inc. Materials and methods for the detection of sars
ES2429442T3 (es) * 2004-02-12 2013-11-14 Archemix Llc Aptámeros terapéuticos útiles en el tratamiento de trastornos relacionados con complemento
US7803931B2 (en) 2004-02-12 2010-09-28 Archemix Corp. Aptamer therapeutics useful in the treatment of complement-related disorders
WO2005082110A2 (en) * 2004-02-26 2005-09-09 Illumina Inc. Haplotype markers for diagnosing susceptibility to immunological conditions
WO2005106035A2 (en) * 2004-04-09 2005-11-10 Cornell Research Foundation, Inc. Modular design and construction of nucleic acid molecules, aptamer-derived nucleic acid constructs, rna scaffolds, their expression, and methods of use
JP4718541B2 (ja) * 2004-04-22 2011-07-06 リガド・バイオサイエンシーズ・インコーポレーテツド 改良された凝固因子調節剤
EP2441769B1 (en) 2004-05-04 2014-05-07 Repligen Corporation Design, synthesis and assembly of synthetic nucleic acids
EP2322660A1 (en) 2004-05-14 2011-05-18 Rosetta Genomics Ltd MicroRNAs and uses thereof
WO2005111211A2 (en) 2004-05-14 2005-11-24 Rosetta Genomics Ltd. Micronas and uses thereof
US20060052947A1 (en) * 2004-05-17 2006-03-09 Evelyn Hu Biofabrication of transistors including field effect transistors
CA2566962A1 (en) 2004-05-21 2005-12-01 Atonomics A/S Surface acoustic wave sensor comprising a hydrogel
EP1753871B1 (en) 2004-05-28 2015-07-15 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to psca proteins
US7827558B2 (en) * 2004-06-30 2010-11-02 Devicevm, Inc. Mechanism for enabling a program to be executed while the execution of an operating system is suspended
KR100663992B1 (ko) 2004-07-05 2007-01-02 (주)바이오메드랩 인유두종 바이러스의 유전형을 분석하기 위한 특이도 높은 프로브 선택방법 및 그 선택된 프로브
US20060024677A1 (en) 2004-07-20 2006-02-02 Morris David W Novel therapeutic targets in cancer
WO2006074471A2 (en) 2005-01-10 2006-07-13 The Regents Of The University Of California Cationic conjugated polymers suitable for strand-specific polynucleotide detection in homogeneous and solid state assays
US8063196B2 (en) * 2005-02-01 2011-11-22 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Highly orthogonal universal sequences for use in nucleic acid assays
AU2006220201B8 (en) * 2005-03-03 2011-11-17 National Research Council Of Canada Methods and compositions for the detection and analysis of nucleic acids by signal amplification
US7498136B2 (en) * 2005-03-18 2009-03-03 Eragen Biosciences, Inc. Methods for detecting multiple species and subspecies of Neisseria
CA2603093A1 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to 161p2f10b proteins
AU2006235276A1 (en) 2005-04-07 2006-10-19 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. CACNA1E in cancer diagnosis, detection and treatment
EP1871911A2 (en) 2005-04-07 2008-01-02 Chiron Corporation Cancer-related genes (prlr)
US8632970B2 (en) 2005-05-09 2014-01-21 Affymetrix, Inc. Multiplex capture of nucleic acids
EP1880206B1 (en) * 2005-05-09 2012-11-14 Affymetrix, Inc. Multiplex capture of nucleic acids
EP1880025B1 (en) 2005-05-12 2011-03-16 Affymetrix, Inc. Multiplex branched-chain dna assays
CA2919210C (en) * 2005-06-07 2019-03-05 Luminex Corporation Methods for detection and typing of nucleic acids
US20070087360A1 (en) * 2005-06-20 2007-04-19 Boyd Victoria L Methods and compositions for detecting nucleotides
DK2500439T4 (da) * 2005-06-20 2017-11-13 Advanced Cell Diagnostics Inc Kits og produkter til detektering af nukleinsyrer i individuelle celler og til identifikation af sjældne celler fra store heterogene cellepopulationer
WO2007023390A2 (en) 2005-07-01 2007-03-01 Dako Denmark A/S Immunohistochemistry detection method
US7927798B2 (en) * 2005-10-05 2011-04-19 Panomics, Inc. Detection of nucleic acids from whole blood
US11834720B2 (en) 2005-10-11 2023-12-05 Geneohm Sciences, Inc. Sequences for detection and identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) of MREJ types xi to xx
US7838221B2 (en) 2005-10-11 2010-11-23 Geneohm Sciences, Inc. Sequences for detection and identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)
CA2627967A1 (en) * 2005-11-10 2007-05-24 Panomics, Inc. Detection of nucleic acids through amplification of surrogate nucleic acids
TWI507528B (zh) * 2006-01-17 2015-11-11 Somalogic Inc 測試樣品的多重分析方法
US20070264694A1 (en) * 2006-04-07 2007-11-15 Eragen Biosciences, Inc. Use of non-standard bases and proximity effects for gene assembly and conversion of non-standard bases to standard bases during dna synthesis
US8383338B2 (en) * 2006-04-24 2013-02-26 Roche Nimblegen, Inc. Methods and systems for uniform enrichment of genomic regions
US7833716B2 (en) 2006-06-06 2010-11-16 Gen-Probe Incorporated Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods
JP2010500867A (ja) * 2006-06-30 2010-01-14 ロゼッタ ジノミクス リミテッド 核酸の検出方法
JP2008043332A (ja) 2006-08-17 2008-02-28 Panomics Inc 組織スライドからの核酸定量
WO2009024834A2 (en) * 2006-12-05 2009-02-26 Rosetta Genomics Ltd Nucleic acids involved in viral infection
US8518646B2 (en) 2006-12-19 2013-08-27 Geneohm Sciences, Inc. Detection of Staphylococcus aureus and identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus
US7855054B2 (en) * 2007-01-16 2010-12-21 Somalogic, Inc. Multiplexed analyses of test samples
US8975026B2 (en) 2007-01-16 2015-03-10 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates
US20110136099A1 (en) 2007-01-16 2011-06-09 Somalogic, Inc. Multiplexed Analyses of Test Samples
US7964356B2 (en) * 2007-01-16 2011-06-21 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates
US7947447B2 (en) 2007-01-16 2011-05-24 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates
US20080241140A1 (en) 2007-02-12 2008-10-02 Medical College Of Georgia Gene amplification of coactivator coaa and uses thereof
EP2848252A3 (en) 2007-03-23 2015-06-17 The Board of Regents of the University of Texas System Aldose reductase inhibitors for use in treating uveitis
EP3136103B1 (en) 2007-10-05 2018-08-29 Affymetrix, Inc. Highly multiplexed assays
US8906700B2 (en) 2007-11-06 2014-12-09 Ambergen, Inc. Methods and compositions for phototransfer
US20090131351A1 (en) * 2007-11-16 2009-05-21 Antisoma Research Limited Methods, compositions, and kits for modulating tumor cell proliferation
US20090137405A1 (en) * 2007-11-16 2009-05-28 Christopher Bowman Detection of nucleic acid biomarkers using polymerization-based amplification
EP2268664B1 (en) * 2007-12-03 2017-05-24 The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Doc1 compositions and methods for treating cancer
EP4053546A1 (en) 2007-12-06 2022-09-07 Genalyte, Inc. Device and method for performing label-free monitoring of processes.
US20090215050A1 (en) * 2008-02-22 2009-08-27 Robert Delmar Jenison Systems and methods for point-of-care amplification and detection of polynucleotides
US9249455B2 (en) * 2008-04-18 2016-02-02 Luminex Corporation Methods for detection and quantification of small RNA
JP5733977B2 (ja) * 2008-05-19 2015-06-10 株式会社セリッシュエフディー ＲＮＡｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション
US20090298709A1 (en) * 2008-05-28 2009-12-03 Affymetrix, Inc. Assays for determining telomere length and repeated sequence copy number
US8703416B2 (en) 2008-07-17 2014-04-22 Somalogic, Inc. Method for purification and identification of sperm cells
WO2010062627A2 (en) 2008-10-27 2010-06-03 Genalyte Inc. Biosensors based on optical probing and sensing
ES2622062T3 (es) 2008-10-27 2017-07-05 Qiagen Gaithersburg, Inc. Ensayo y sistema de captura de híbrido de resultados rápidos
CN102257160A (zh) * 2008-12-18 2011-11-23 西门子医疗保健诊断公司 用于缩短杂交分析中的培养时间的方法和试剂
ES2644516T3 (es) * 2009-01-28 2017-11-29 Qiagen Gaithersburg, Inc. Método y ensayo de preparación de muestras de gran volumen específico de secuencia
CN102388150A (zh) 2009-02-19 2012-03-21 吉恩奥姆科技公司 用于检测和鉴定超广谱β-内酰胺酶的方法
US20120190565A1 (en) 2009-02-20 2012-07-26 Pangea Biosciences, Inc. Method Of Diagnosis Or Prognosis Of A Neoplasm Comprising Determining The Level Of Expression Of A Protein In Stromal Cells Adjacent To The Neoplasm
JP5419138B2 (ja) * 2009-03-27 2014-02-19 Ｎｅｃソフト株式会社 検出対象物の検出方法およびそれに用いる検出用キット
EP3495498B1 (en) 2009-03-30 2021-10-27 Illumina, Inc. Gene expression analysis in single cells
JP5738278B2 (ja) 2009-05-01 2015-06-24 キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド 試料中のｒｎａスプライシング形態を検出するための非標的増幅法
US20100291706A1 (en) 2009-05-15 2010-11-18 Millipore Corporation Dye conjugates and methods of use
EP2478087B1 (en) 2009-09-14 2017-01-18 QIAGEN Gaithersburg, Inc. Compositions and methods for recovery of nucleic acids or proteins from tissue samples fixed in cytology media
US20130023433A1 (en) 2009-09-28 2013-01-24 Yuling Luo Methods of detecting nucleic acid sequences with high specificity
CN102639712A (zh) * 2009-10-23 2012-08-15 卢米耐克斯公司 用于提高反应特异性的具有非标准碱基的扩增引物
US9605303B2 (en) 2010-01-29 2017-03-28 Qiagen Gaithersburg, Inc. Method of determining and confirming the presence of an HPV in a sample
JP6103941B2 (ja) * 2010-01-29 2017-03-29 キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド 核酸の配列特異的精製および多重分析のための方法および組成物
WO2011123246A2 (en) 2010-04-01 2011-10-06 Illumina, Inc. Solid-phase clonal amplification and related methods
CA2798123C (en) 2010-05-05 2020-06-23 The Governing Council Of The University Of Toronto Method of processing dried samples using digital microfluidic device
JP2013528049A (ja) 2010-05-19 2013-07-08 キアゲン ガイサーズバーグ アイエヌシー． 核酸の配列特異的な精製及び多重分析のための方法及び組成物
US20120003648A1 (en) * 2010-07-01 2012-01-05 Affymetrix, Inc. Signal Multiplexing and Signal Amplification
EP2601307A4 (en) 2010-08-06 2014-01-01 Capitalbio Corp MICROARRAY TEST WITH PARTICLES FOR THE ANALYSIS OF MOLECULAR INTERACTIONS
WO2012028719A2 (en) * 2010-09-02 2012-03-08 Heed Diagnostics Aps Electrochemical detection of analyte
EP3034625B1 (en) 2010-10-21 2017-10-04 Advanced Cell Diagnostics, Inc. An ultra sensitive method for in situ detection of nucleic acids
EP2633067B1 (en) 2010-10-27 2023-06-28 CapitalBio Technology Corporation Luminophore-labeled molecules coupled with particles for microarray-based assays
EP2635710B1 (en) 2010-11-05 2017-08-09 Genalyte, Inc. Optical analyte detection systems and methods of use
EP2481812A1 (en) 2011-01-31 2012-08-01 Westfälische Wilhelms-Universität Münster Molecular sexing of avian subjects
EP2670864B1 (en) 2011-01-31 2017-03-08 Illumina, Inc. Methods for reducing nucleic acid damage
JP2014511182A (ja) 2011-02-24 2014-05-15 キアゲン ガイサーズバーグ アイエヌシー． Ｈｐｖ核酸を検出するための材料及び方法
WO2012129363A2 (en) 2011-03-24 2012-09-27 President And Fellows Of Harvard College Single cell nucleic acid detection and analysis
EP2773650A1 (en) 2011-11-04 2014-09-10 Ohmx Corporation Novel chemistry used in biosensors
CN104040238B (zh) 2011-11-04 2017-06-27 汉迪拉布公司 多核苷酸样品制备装置
KR102031715B1 (ko) * 2011-11-18 2019-10-14 탁시스 바이오 가부시키가이샤 표적 단백질에 결합하는 핵산 단편
BR112014012288A2 (pt) 2011-11-22 2017-05-23 Intermune Inc métodos para diagnosticar e tratar fibrose pulmonar idiopática
WO2013112881A1 (en) 2012-01-27 2013-08-01 Thomas Jefferson University Mct protein inhibitor-related prognostic and therapeutic methods
EP2825885B1 (en) 2012-03-12 2021-05-12 The Board of Trustees of the University of Illinois Optical analyte detection systems with magnetic enhancement
ES2917400T3 (es) 2012-07-26 2022-07-08 Illumina Inc Composiciones y métodos para la amplificación de ácidos nucleicos
US9783841B2 (en) 2012-10-04 2017-10-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Detection of target nucleic acids in a cellular sample
CA2889415C (en) 2012-10-24 2020-06-02 Genmark Diagnostics, Inc. Integrated multiplex target analysis
US20140322706A1 (en) 2012-10-24 2014-10-30 Jon Faiz Kayyem Integrated multipelx target analysis
WO2014074785A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Methods of predicting outcome and treating breast cancer
US20140272959A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 President And Fellows Of Harvard College Methods of Hybridizing Probes to Genomic DNA
US20140274811A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 Lyle J. Arnold Methods for Amplifying a Complete Genome or Transcriptome
US9273349B2 (en) 2013-03-14 2016-03-01 Affymetrix, Inc. Detection of nucleic acids
US9983206B2 (en) 2013-03-15 2018-05-29 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Methods and compositions for enhancing immunoassays
AU2014235532B2 (en) 2013-03-15 2018-08-09 Genmark Diagnostics, Inc. Systems, methods, and apparatus for manipulating deformable fluid vessels
EP2986290A4 (en) 2013-04-19 2017-01-04 Thomas Jefferson University Caveolin-1 related methods for treating glioblastoma with temozolomide
US10510435B2 (en) 2013-04-30 2019-12-17 California Institute Of Technology Error correction of multiplex imaging analysis by sequential hybridization
WO2014182528A2 (en) 2013-04-30 2014-11-13 California Institute Of Technology Multiplex labeling of molecules by sequential hybridization barcoding
USD881409S1 (en) 2013-10-24 2020-04-14 Genmark Diagnostics, Inc. Biochip cartridge
US9498778B2 (en) 2014-11-11 2016-11-22 Genmark Diagnostics, Inc. Instrument for processing cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system
US9428767B2 (en) 2014-04-09 2016-08-30 Dna2.0, Inc. Enhanced nucleic acid constructs for eukaryotic gene expression
US20170362627A1 (en) 2014-11-10 2017-12-21 Modernatx, Inc. Multiparametric nucleic acid optimization
EP3218108B1 (en) 2014-11-11 2020-09-02 Genmark Diagnostics Inc. Fluid sample processing cartridge and use thereof
US10005080B2 (en) 2014-11-11 2018-06-26 Genmark Diagnostics, Inc. Instrument and cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system employing electrowetting fluid manipulation
US9598722B2 (en) 2014-11-11 2017-03-21 Genmark Diagnostics, Inc. Cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system
US10695762B2 (en) 2015-06-05 2020-06-30 Miroculus Inc. Evaporation management in digital microfluidic devices
CN108026494A (zh) 2015-06-05 2018-05-11 米罗库鲁斯公司 限制蒸发和表面结垢的空气基质数字微流控装置和方法
MX2018000729A (es) 2015-07-17 2018-09-06 Harvard College Métodos para amplificar las secuencias de ácido nucleico.
WO2017066211A1 (en) 2015-10-12 2017-04-20 Advanced Cell Diagnostics, Inc. In situ detection of nucleotide variants in high noise samples, and compositions and methods related thereto
HRP20220525T1 (hr) 2015-12-23 2022-05-27 Modernatx, Inc. Postupci uporabe polinukleotida koji kodiraju ligand ox40
EP3400023A1 (en) 2016-01-10 2018-11-14 ModernaTX, Inc. Therapeutic mrnas encoding anti ctla-4 antibodies
US10438662B2 (en) 2016-02-29 2019-10-08 Iridia, Inc. Methods, compositions, and devices for information storage
KR20180123062A (ko) * 2016-02-29 2018-11-14 이리디아, 인크. 정보 저장을 위한 방법, 조성물, 및 장치
US10859562B2 (en) 2016-02-29 2020-12-08 Iridia, Inc. Methods, compositions, and devices for information storage
US10640822B2 (en) 2016-02-29 2020-05-05 Iridia, Inc. Systems and methods for writing, reading, and controlling data stored in a polymer
EP3442590A2 (en) 2016-04-13 2019-02-20 Modernatx, Inc. Lipid compositions and their uses for intratumoral polynucleotide delivery
JP7194594B2 (ja) 2016-05-18 2022-12-22 モデルナティエックス インコーポレイテッド 免疫調節ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの組み合わせ及びその使用
IL263079B2 (en) 2016-05-18 2024-05-01 Modernatx Inc Relaxin-encoding polynucleotides
MA45037A (fr) 2016-05-18 2019-03-27 Modernatx Inc Polythérapie à base d'arnm pour le traitement du cancer
US10905710B2 (en) 2016-05-24 2021-02-02 Emory University Particles with RNA cleaving nucleobase polymers and uses for managing inflammatory disorders
AU2017291727B2 (en) 2016-07-05 2021-07-08 California Institute Of Technology Fractional initiator hybridization chain reaction
US10596572B2 (en) 2016-08-22 2020-03-24 Miroculus Inc. Feedback system for parallel droplet control in a digital microfluidic device
EP3516401A1 (en) 2016-09-19 2019-07-31 Genmark Diagnostics Inc. Instrument for processing cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system
MX2019005772A (es) 2016-11-23 2019-10-02 Bioverativ Therapeutics Inc Anticuerpos mono y biespecíficos que se unen al factor de coagulación ix y al factor de coagulación x.
CA3049416A1 (en) 2016-12-28 2018-07-05 Miroculus Inc. Digital microfluidic devices and methods
WO2018187476A1 (en) 2017-04-04 2018-10-11 Miroculus Inc. Digital microfluidic apparatuses and methods for manipulating and processing encapsulated droplets
EP3625246A1 (en) 2017-05-18 2020-03-25 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding tethered interleukin-12 (il12) polypeptides and uses thereof
US20200268666A1 (en) 2017-06-14 2020-08-27 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding coagulation factor viii
EP3658908A4 (en) 2017-07-24 2021-04-07 Miroculus Inc. DIGITAL MICROFLUIDIC SYSTEMS AND PROCESSES WITH INTEGRATED PLASMA COLLECTION DEVICE
EP3676009A4 (en) 2017-09-01 2021-06-16 Miroculus Inc. DIGITAL MICROFLUIDIC DEVICES AND THEIR METHODS OF USE
JP7423521B2 (ja) 2017-11-22 2024-01-29 モダーナティエックス・インコーポレイテッド フェニルケトン尿症の治療用のフェニルアラニンヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチド
MA50802A (fr) 2017-11-22 2020-09-30 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour des sous-unités alpha et bêta de propionyl-coa carboxylase pour le traitement de l'acidémie propionique
US11859215B2 (en) 2017-11-22 2024-01-02 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding ornithine transcarbamylase for the treatment of urea cycle disorders
WO2019226919A1 (en) 2018-05-23 2019-11-28 Miroculus Inc. Control of evaporation in digital microfluidics
CN110577981B (zh) * 2018-06-07 2023-04-07 北京福安华生物科技有限公司 一种基于人工模拟核酸的分子信标
US20220184185A1 (en) 2018-07-25 2022-06-16 Modernatx, Inc. Mrna based enzyme replacement therapy combined with a pharmacological chaperone for the treatment of lysosomal storage disorders
WO2020047201A1 (en) 2018-09-02 2020-03-05 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding very long-chain acyl-coa dehydrogenase for the treatment of very long-chain acyl-coa dehydrogenase deficiency
CA3112208A1 (en) 2018-09-13 2020-03-19 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding glucose-6-phosphatase for the treatment of glycogen storage disease
WO2020056155A2 (en) 2018-09-13 2020-03-19 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding branched-chain alpha-ketoacid dehydrogenase complex e1-alpha, e1-beta, and e2 subunits for the treatment of maple syrup urine disease
JP2022500444A (ja) 2018-09-14 2022-01-04 モダーナティエックス・インコーポレイテッドModernaTX, Inc. クリグラー−ナジャー症候群の治療のためのウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドａ１をコードするポリヌクレオチド
WO2020069169A1 (en) 2018-09-27 2020-04-02 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding arginase 1 for the treatment of arginase deficiency
JP2022511596A (ja) 2018-11-14 2022-02-01 ウロバント サイエンシズ ゲーエムベーハー 平滑筋機能障害の治療のための組成物及び方法
SG11202012748TA (en) 2018-12-14 2021-01-28 Illumina Cambridge Ltd Decreasing phasing with unlabeled nucleotides during sequencing
EP3899040A1 (en) 2018-12-17 2021-10-27 Illumina Cambridge Limited Compositions for use in polyunucleotide sequencing
AU2019411267A1 (en) 2018-12-17 2021-01-07 Illumina Cambridge Limited Primer oligonucleotide for sequencing
CN111378746A (zh) * 2018-12-27 2020-07-07 北京福安华生物科技有限公司 检测CASP7基因rs12415607位点多态性的人工模拟核酸分子信标与试剂盒
CN114206499A (zh) 2019-04-08 2022-03-18 米罗库鲁斯公司 多盒式数字微流控装置和使用方法
US11655465B1 (en) 2019-05-02 2023-05-23 Iridia, Inc. Enzymes and systems for synthesizing DNA
CN114375190A (zh) 2019-05-08 2022-04-19 阿斯利康(瑞典)有限公司 用于皮肤和伤口的组合物及其使用方法
US11524298B2 (en) 2019-07-25 2022-12-13 Miroculus Inc. Digital microfluidics devices and methods of use thereof
EP3859012A1 (en) 2020-02-03 2021-08-04 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Methods for amplification of genomic dna and preparation of sequencing libraries
US20230174567A1 (en) * 2020-05-22 2023-06-08 Merck Sharp & Dohme Llc Synthesis of fluorinated nucleotides
US20230235298A1 (en) 2020-06-01 2023-07-27 Modernatx, Inc. Phenylalanine hydroxylase variants and uses thereof
WO2022029159A1 (en) * 2020-08-04 2022-02-10 Theraxen S.A. Xeno-nucleotide based branched dna assay for the detection of nucleic acids
AU2021320426A1 (en) 2020-08-06 2023-03-23 Modernatx, Inc. Compositions for the delivery of payload molecules to airway epithelium
US11837302B1 (en) 2020-08-07 2023-12-05 Iridia, Inc. Systems and methods for writing and reading data stored in a polymer using nano-channels
WO2022164796A1 (en) 2021-01-26 2022-08-04 California Institute Of Technology Allosteric conditional guide rnas for cell-selective regulation of crispr/cas
US11524023B2 (en) 2021-02-19 2022-12-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same
US20240207444A1 (en) 2021-03-24 2024-06-27 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding phenylalanine hydroxylase and uses thereof
WO2022204380A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding propionyl-coa carboxylase alpha and beta subunits and uses thereof
WO2022204369A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase for the treatment of methylmalonic acidemia
EP4314260A1 (en) 2021-03-24 2024-02-07 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding ornithine transcarbamylase for the treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
US20240207374A1 (en) 2021-03-24 2024-06-27 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding glucose-6-phosphatase and uses thereof
BR112023019999A2 (pt) 2021-03-31 2023-11-14 Illumina Inc Métodos para depletar seletivamente fragmentos não desejáveis de bibliotecas amplificadas de dna ou cdna mediante o uso de um ou mais oligonucleotídeos bloqueadores e kits para a preparação de biblioteca baseada em rna-seq
WO2022271776A1 (en) 2021-06-22 2022-12-29 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding uridine diphosphate glycosyltransferase 1 family, polypeptide a1 for the treatment of crigler-najjar syndrome
CN118019526A (zh) 2021-07-26 2024-05-10 摩登纳特斯有限公司 用于制备将有效负载分子递送至气道上皮的脂质纳米颗粒组合物的方法
WO2023009421A1 (en) 2021-07-26 2023-02-02 Modernatx, Inc. Processes for preparing lipid nanoparticle compositions
US20230096386A1 (en) 2021-09-30 2023-03-30 Illumina Cambridge Limited Polynucleotide sequencing
WO2023056044A1 (en) 2021-10-01 2023-04-06 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding relaxin for the treatment of fibrosis and/or cardiovascular disease
WO2023076598A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Modernatx, Inc. Lipid amines
WO2023076605A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Modernatx, Inc. Lipid amines
WO2023086465A1 (en) 2021-11-12 2023-05-19 Modernatx, Inc. Compositions for the delivery of payload molecules to airway epithelium
WO2023126457A1 (en) 2021-12-29 2023-07-06 Illumina Cambridge Ltd. Methods of nucleic acid sequencing using surface-bound primers
US11772093B2 (en) 2022-01-12 2023-10-03 Miroculus Inc. Methods of mechanical microfluidic manipulation
TW202345863A (zh) 2022-02-09 2023-12-01 美商現代公司 黏膜投與方法及調配物
WO2023196399A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding argininosuccinate lyase for the treatment of argininosuccinic aciduria
CN115060912B (zh) * 2022-06-23 2024-02-02 南京浦光生物科技有限公司 检测目标抗体的试剂组合、试剂盒、检测系统及检测方法
WO2024130158A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding extended serum half-life interleukin-22 for the treatment of metabolic disease

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1190838A (en) * 1981-07-17 1985-07-23 Cavit Akin Homogeneous nucleic acid hybridization diagnostics by non-radiative energy transfer
US4868105A (en) * 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
US5124246A (en) * 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5270163A (en) * 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5135917A (en) * 1990-07-12 1992-08-04 Nova Pharmaceutical Corporation Interleukin receptor expression inhibiting antisense oligonucleotides
CA2104698A1 (en) * 1991-02-21 1992-08-22 John J. Toole Aptamers specific for biomolecules and methods of making
DE4140463A1 (de) * 1991-12-09 1993-06-17 Boehringer Mannheim Gmbh 2'-desoxy-isoguanosin, dessen isostere analoge sowie anwendung derselben
US5681697A (en) * 1993-12-08 1997-10-28 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assays having reduced background noise and kits therefor

Also Published As

Publication number Publication date
CZ58997A3 (en) 1997-07-16
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