JP2003535600A

JP2003535600A - インサイチュ分枝ｄｎａハイブリダイゼーションを用いた高感度遺伝子検出および位置決定

Info

Publication number: JP2003535600A
Application number: JP2002502172A
Authority: JP
Inventors: ダリンケニー，; ルピンシェン，; ビンセントピー．アンタオ，; オードリーエヌ．プレイヤー，; ウェイカオ，
Original assignee: Bayer Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 2000-06-02
Filing date: 2001-06-01
Publication date: 2003-12-02
Also published as: ATE364722T1; US20020172950A1; DE60128908D1; EP1287165B1; DE60128908T2; US7033758B2; EP1287165A2; WO2001094632A3; WO2001094632A2; ES2287134T3

Abstract

(57)【要約】既知の配列を有する核酸分析物の高感度および高速のインサイチュ検出のための方法を提供する。この方法は、シグナルを増幅し、そしてバックグラウンドを減少させるための一連の最適化された工程においてオリゴヌクレオチドプローブを用いる。感度が増幅され、その結果、この方法は、１サンプル（細胞、組織、または類似の生物学的物質を含むサンプル）当たりわずか１〜２コピーの核酸分析物を検出し得る。細胞中での核酸分析物の位置を検出および同定する方法もまた、提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は一般に、核酸化学および生化学的アッセイに関する。より具体的には
、本発明は、核酸分析物のインサイチュ検出のための高感度の方法に関する。こ
の方法は、生物学的サンプル中の核酸分析物の位置を検出および同定するために
、分枝ＤＮＡオリゴプローブおよびハイブリダイゼーション技術を使用する。

【０００２】（背景技術）分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）シグナル増幅技術は、特定の核酸配列を検出および定
量するために、マイクロウェル形式で広く使用されてきた。Ｕｒｄｅａら（２０
００）Ｂｒａｎｃｈｅｄ−ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｋｅｓｓ
ｌｅｒＣ．、編、ＮｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆ
Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ：３８８−３９５。固有に定量的および高度な再現性で、ｂＤＮＡは、放射性
プローブを使用せずに、配列が公知の任意の核酸標的の検出に適用され得る。

【０００３】ｂＤＮＡアッセイの多くは、ウイルス核酸の定量のために開発されてきた。こ
れらとしては、１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）ＲＮＡ、Ｋｅｒｎら（
１９９６）ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ３４：３１９６−３２０３；サ
ル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）ＲＮＡ、Ｓｏｄｏｒａら（１９９８）ＡＩＤＳ
ＲｅｓＨｕｍＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ１４：１７１−１８１；Ｂ型肝炎
ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡ、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓら（１９９５）ＡｍＪＣｌ
ｉｎＰａｔｈｏｌ１０４：５３７−５４６；Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｒ
ＮＡ、Ｄｅｔｍｅｒら（１９９６）ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏ３４：９
０１−９０７；Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）ＲＮＡ、Ｂｒａｎｄｈａｇｅｎら（
１９９９）ＡｍＪＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ９４：１０００−１００５
；およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＤＮＡ、Ｃｈｅｒｎｏｆｆら（１９９
７）ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ３５：２７４０−２７４４が挙げられ
る。

【０００４】より最近、ｂＤＮＡ技術は、細胞性ｍＲＮＡ（サイトカイン、Ｂｒｅｅｎら（
１９９７）ＣｅｌｌＩｍｍｕｎｏｌ１７８：９１−９８およびＳｈｅｎら（
１９９８）ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ２１５：１２３−１３４；プ
ロゲステロンおよびエストロゲンレセプター、Ｎａｒｇｅｓｓｉら（１９９８）
ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＲｅｓＴｒｅａｔ５０：４７−５５およびＮ
ａｒｇｅｓｓｉら（１９９８）ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＲｅｓＴｒｅａ
ｔ５０：５７−６２；インスリン、Ｗａｎｇら（１９９７）ＰｒｏｃＮａｔ
ｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９４：４３６０−４３６５；グルコキナーゼ、
Ｃａｂｒｅｒａ−Ｖａｌｌａｄａｒｅｓら（１９９９）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ
ｇｙ１４０：３０９１−３０９６；ｃ−ｆｏｓ、Ｓｈｙａｍａｌａら（１９９
９）ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ２６６：１４０−１４７；ならびにａＰ２、Ｂ
ｕｒｒｉｓら（１９９９）ＭｏｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ１３：４１０−４１
７を含む）の発現を検出および測定するために使用されてきた。これらのｂＤＮ
Ａアッセイの全ては、血清、血漿または細胞溶解物中の核酸を測定するために開
発された。しかし、これらの研究はいずれも、形態的にインタクトな細胞または
組織中の核酸の検出のためのｂＤＮＡアッセイを示唆も開示もしない。

【０００５】対照的に、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）アッセイは、形態
的にインタクトな細胞または組織中の、特定の核酸配列を検出する能力を必然的
に有する。ＩＳＨ法は、一般的な概念がＰａｒｄｕｅおよびＧａｌｌによって２
０年以上前に紹介されて以降、改善されてきた。Ｐａｒｄｕｅら（１９６９）Ｐ
ｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ６４：６００−６０４。例えば
、非アイソトーププローブの使用は、放射性ＩＳＨ法に関連する固有の問題（例
えば、長い所要時間、放射能に対する被曝の危険性および廃棄物処理）を排除し
た。さらに、種々の標的の取り込みおよびシグナル増幅システムは、ＩＳＨの感
度を改善している。しかし、ＩＳＨ法におけるこれらの利点にもかかわらず、多
くの難問がいまだ克服されなければならない。これらの難問としては、高感度か
つ特異的な標的検出の開発、シグナルおよび標的の正確な共局在の確認、標的配
列の保存、ならびに細胞形態および組織形態の保存が挙げられる。さらに、ＩＳ
Ｈ法は、多くの実際的な懸念（使いやすさ、定量に対する再現性および従順さ、
自動化に対する従順さ、汎用性ならびに時宜にかなった完了を含む）を解決しな
ければならない。

【０００６】触媒化レポーター沈着チラミドシグナル増幅（Ｃａｔａｌｙｚｅｄｒｅｐｏ
ｒｔｅｒｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎｔｙｒａｍｉｄｅｓｉｇｎａｌａｍｐｌ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＣＡＲＤ／ＴＳＡ）は、これらの難問および懸念のいく
つかを解決するために提案された１つのＩＳＨ法である。いくつかの研究は、Ｃ
ＡＲＤ／ＴＳＡＩＳＨ法がＳｉＨａ細胞中で１〜２コピーのＨＰＶ−１６Ｄ
ＮＡを検出し得ることを示した。Ｓｉａｄａｔ−Ｐａｊｏｕｈら（１９９４）ＪＨｉｓｔｏｃｈｅｍＣｙｔｏｃｈｅｍ４２：１５０３−１５１２およびＡ
ｄｌｅｒら（１９９７）ＨｉｓｔｏｃｈｅｍＣｅｌｌＢｉｏｌ１０８：３
２１−３２４。

【０００７】１つの研究は、ｂＤＮＡ技術をｍＲＮＡの検出のためにＩＳＨ形式に適合させ
ることが可能であることを示した。Ｃａｏら（１９９８）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ
ｓｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｆｏｒＣａ
ｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、第８９回ミーティング、ＮｅｗＯｒｌｅａｎｓ
，ＬＡおよびＡｎｔａｏら（１９９９）ＩｎＳｉｔｕＨｙｂｒｉｄｉｚａｔ
ｉｏｎＵｓｉｎｇｔｈｅｂＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｔｔｅｒ
ｓｏｎ，Ｂ．Ｋ．編、ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎａｎｄＬｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＢｉｒｋｈａｕｓｅｒＰｒｅｓｓ：８１−９３。しかし
、この研究において記載されるアッセイは、比較的感度が低い。

【０００８】従って、生物学的サンプル中の核酸分析物のインサイチュ検出のための高感度
の方法を提供する必要性が、当該分野に存在したままである。本発明は、当該分
野におけるこれらの必要性および他の必要性を満足させる。

【０００９】（発明の開示）従って、本発明の主な目的は、ｂＤＮＡハイブリダイゼーションに基づく生物
学的物質のサンプル内の核酸分析物のインサイチュ検出のための方法を提供する
ことによって上記の当該分野における必要性を解決することであり、ここで、こ
の方法は、感度の増大を生じる。

【００１０】本発明の別の目的は、１細胞当たり１〜約１０コピーの核酸分析物を検出する
ために十分な感度を有する、ｂＤＮＡハイブリダイゼーションに基づくインサイ
チュ検出のための方法を提供することである。

【００１１】本発明のなお別の目的は、１細胞当たり１〜約２コピーの核酸分析物を検出す
るために十分な感度を有する、ｂＤＮＡハイブリダイゼーションに基づくインサ
イチュ検出のための方法を提供することである。

【００１２】本発明のなお別の目的は、ｂＤＮＡハイブリダイゼーション技術に基づいて、
単一の細胞内の核酸分析物の位置（すなわち、細胞下の局在）を同定するための
方法を提供することである。

【００１３】本発明のさらなる目的、利点、および新規の特徴は、以下の記載に部分的に示
され、そして、一部は、以下の実施例によって当業者に明らかとなるかまたは本
発明の実行によって学習され得る。

【００１４】従って、第一の実施形態において、ｂＤＮＡハイブリダイゼーションに基づい
て、生物学的物質のサンプル内の核酸分析物のインサイチュ検出のための方法が
、提供され、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）以下：（ｉ）基材上に生物学的物質を固定化する工程；（ｉｉ）基材結合生物学的物質を、約０．５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ
の濃度でプロテイナーゼＫを含む溶液に接触させることによって、基材結合生物
学的物質を浸透処理する工程；および（ｉｉｉ）必要に応じて、浸透処理された生物学的物質を、いずれの二重鎖
ＤＮＡをも変性させるために有効な温度かつ有効な時間にわたって加熱する工程
；によって、生物学的物質のサンプルを調製する工程；（ｂ）ハイブリダイズする条件下で、この生物学的物質を標的オリゴヌクレオ
チドプローブと接触させる工程であって、ここで、この標的プローブの少なくと
も一部は、核酸分析物の少なくとも一部に相補的であり、その結果、サンプル中
に核酸分析物が存在する場合に、分析物−標的プローブ複合体が形成される、工
程；（ｃ）この生物学的物質を、およそ２１〜６０℃の範囲の温度で、界面活性剤
を含む洗浄流体で洗浄する工程；ならびに（ｄ）基材上の任意の分析物−標的プローブ複合体を検出する工程。

【００１５】さらに、本発明は、好ましくは以下を包含する、上記の方法における工程（ｄ
）（すなわち、検出工程）を提供する：（ｄ）（ｉ）洗浄された基材および分析物−標的プローブ複合体を、ハイブリ
ダイズする条件下で前増幅剤（ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｒ）オリゴヌクレオチド
プローブと接触させる工程であって、ここで、前増幅剤プローブの第一の部分は
、この核酸分析物に相補的な標的プローブの部分以外の標的プローブの部分に相
補的であり、それによって、サンプル中に核酸分析物が存在する場合に、分析物
−標的プローブ−前増幅剤プローブ複合体を形成する、工程；（ｄ）（ｉｉ）工程（ｄ）（ｉ）の産物をハイブリダイズする条件下で増幅剤
（ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）オリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程であって
、ここで、増幅剤プローブの第一の部分は、前増幅剤プローブの第二の部分に相
補的であり、それによって、サンプル中に核酸分析物が存在する場合に、分析物
−標的プローブ−前増幅剤プローブ−増幅剤プローブ複合体を形成する、工程；（ｄ）（ｉｉｉ）工程（ｄ）（ｉｉ）の産物をハイブリダイズする条件下で標
識オリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程であって、ここで、標識プロー
ブの一部は、増幅剤プローブの第二の部分に結合し、これによって、サンプル中
に核酸分析物が存在する場合に、分析物−標的プローブ−前増幅剤プローブ−増
幅剤プローブ−標識プローブ複合体を形成する、工程；（ｄ）（ｉｖ）分析物−標的プローブ−前増幅剤プローブ−増幅剤プローブ−
標識プローブ複合体を、検出可能な標識で標識する工程；ならびに（ｄ）（ｖ）基材上の標識の存在を検出する工程。

【００１６】核酸分析物が、ＨＩＶＲＮＡ、ＨＩＶＤＮＡ、ＨＣＶＲＮＡ、ＣＭＶ
ＲＮＡ、ＣＭＶＤＮＡ、ＨＰＶＲＮＡ、ＨＰＶＤＮＡ、ＬＡＰ、ＩＬ−２
、内因性遺伝子およびこれらのセグメントからなる群より選択されることが好ま
しい。

【００１７】好ましくは、この方法は、１〜約１０コピーの核酸分析物を検出するために十
分な感度を有し、１〜約２コピーの感度が最も好ましい。

【００１８】第二の実施形態において、ｂＤＮＡハイブリダイゼーションに基づいて、生物
学的物質のサンプルの細胞内の核酸分析物の位置を同定するための方法が、提供
される。核酸分析物の位置を位置決定または同定するためのこの方法は、核酸分
析物のインサイチュ検出に関して上記の工程と同じ工程を包含する。しかし、一
旦標識が検出されると、位置決定のためのこの方法は、さらに以下の工程を包含
する：（ｅ）生物学的サンプルの細胞内で、細胞中の核酸分析物の位置を示すよ
うな、分析物−標的プローブ複合体の位置を同定する工程。

【００１９】別の実施形態において、生物学的物質のサンプル内の核酸分析物を検出するた
めの方法が、提供され、この方法は、インサイチュで核酸分析物を検出するため
にｂＤＮＡハイブリダイゼーションを実行する工程を包含し、ここで、この方法
は、生物学的物質中の約１〜約１０コピーの核酸分析物を検出するために十分な
感度を有する。

【００２０】（発明を実行するための様式）（Ｉ．定義および概要）本発明を詳細に記載する前に、本発明が特定のプローブ、試薬、アッセイ形式
などに限定されず、それ自体変化し得ることが理解されるべきである。本明細書
中で使用される専門用語が、特定の実施形態のみを記載する目的であり、限定を
意図しないこともまた、理解されるべきである。

【００２１】本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つ
の（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、その文脈が明ら
かに他を指示しない限り、複数形の言及を含むことに注意しなければならない。
従って、例えば、「（１つの（ａｎ））分析物−標的プローブ複合体」に対する
言及は、２以上のこのような複合体を含み、（１つの（ａ））「洗浄」工程に対
する言及は、２以上のこのような洗浄工程を含む、など。

【００２２】本明細書および上記の特許請求の範囲において、以下の専門用語は、以下に示
す定義に従って使用される。

【００２３】「オリゴヌクレオチド」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２’−デオキシ
−Ｄ−リボースまたはその改変形態を含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボ
ースまたはその改変形態を含む）および任意の他の型のポリヌクレオチド（プリ
ン塩基またはピリミジン塩基のＮ−グリコシド、あるいは改変プリン塩基または
改変ピリミジン塩基のＮ−グリコシド）に総称的であるべきである。オリゴヌク
レオチドは、一本鎖または二本鎖であり得るが、代表的には一本鎖であり得る。
また、本発明において使用されるオリゴヌクレオチドは、通常は、約２〜約１０
０モノマー単位、より代表的には約２〜約８０モノマー単位、そして最も代表的
には約２〜約６０モノマー単位である。

【００２４】用語「核酸分析物」は、標的ヌクレオチド配列を含む一本鎖または二本鎖の核
酸分子をいう。核酸分析物は、種々の供給源（例えば、生物学的流体または固体
、食材、環境材料など）由来であり得る。用語「核酸分析物」は、本明細書中で
、用語「分析物」と相互変換可能に使用される。

【００２５】本明細書中で使用される場合、用語「標的領域」または「標的ヌクレオチド配
列」は、核酸分析物に含まれるプローブ結合領域をいう。標的領域は、少なくと
も４００塩基長でなければならない。用語「標的配列」は、プローブ（すなわち
、標的オリゴヌクレオチドプローブ）が、所望の条件下において安定なハイブリ
ッドを形成する配列をいう。

【００２６】本明細書中で使用される場合、用語「プローブ」および「オリゴヌクレオチド
プローブ」は、標的ヌクレオチド配列の一部（少なくとも１つの他のプローブま
たは両方）に相補的な核酸配列を含む、上で定義されるようなオリゴヌクレオチ
ドから構成される構造体をいう。プローブのオリゴヌクレオチド領域は、ＤＮＡ
および／またはＲＮＡならびに／あるいは合成ヌクレオチドアナログから構成さ
れ得る。

【００２７】結合配列が、安定なハイブリッドを提供するために完全な相補性を有する必要
がないことは明白である。多くの場合において、約１０％より少ない塩基が、不
一致である場合、４以上のヌクレオチドのループを無視して、安定したハイブリ
ッドが形成される。従って、用語「相補的な」は、アッセイ条件下においてその
「相補体」と安定した二重鎖を形成する（一般的には、ここでは約９０％または
それより高い相同性がある）、オリゴヌクレオチドをいう。

【００２８】本明細書中で使用される場合、用語「生物学的サンプル」または「生物学的物
質」は、交換可能に使用され、そしてそれぞれは、個体からの単離された組織、
細胞または流体のサンプル（例えば、以下が挙げられるがこれらに限定されない
：血漿、血清、脊髄液、精液、リンパ液、皮膚の外切片、気道の分泌物、腸管の
分泌物、尿生殖管の分泌物、涙、唾液、乳汁、血液細胞、腫瘍、器官およびまた
インビトロ細胞培養構成成分のサンプル（細胞培養培地中での細胞の増殖によっ
て生じた馴化培地、推定のウイルス性の感染細胞、組換え細胞および細胞成分が
挙げられるが、これらに限定されない））をいう。生物学的サンプルは、流体の
形態（例えば、液体中の組織または細胞）であることが好ましいが、固体組織も
また、使用され得る。本発明の方法の好ましい使用は、以下のような核酸を検出
および／または定量することである：（ａ）ウイルスの核酸（例えば、Ｂ型肝炎
ウイルス（「ＨＢＶ」）、Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）、Ｇ型肝炎ウイルス
（「ＨＧＶ」）、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）、ヒト乳頭腫ウイルス（
「ＨＰＶ」）およびヘルペス科のウイルス（帯状疱疹（水疱瘡）、Ｉ型単純疱疹
ウイルスおよびＩＩ型単純疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）
ならびにエプスタイン−バーウイルス由来のウイルス核酸を含む）；（ｂ）細菌
の核酸（例えば、クラミジア属、ヒト結核菌など）；ならびに（ｃ）目的の多数
のヒト配列（リソソームの酸性ホスファターゼ（「ＬＡＰ」）、インターロイキ
ン−２（ＩＬ−２）およびインターフェロン−γ（ＩＮＦ）が含まれる）。

【００２９】用語「ハイブリダイズする条件」は、プローブの少なくとも一部が、相補的な
配列とアニールするのを可能にするに十分な時間、温度およびｐＨならびに反応
物および試薬の必要量および必要濃度条件を意味することを意図する。当該分野
で周知のように、ハイブリダイゼーションを達成するのに必要とされる、時間、
温度およびｐＨ条件は、ハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドプローブのサ
イズ、オリゴヌクレオチドプローブと標的との間の相補性の程度およびハイブリ
ダイゼーション反応混合物中の他の材料の存在に依存する。各ハイブリダイゼー
ション工程に必要とされる実際の条件は、当該分野で周知であるか、または過度
の実験なしに決定され得る。

【００３０】典型的なハイブリダイズする条件としては、約７〜約８．５のｐＨに緩衝化さ
れた溶液の使用が挙げられ、そして約１秒間〜約１日間、好ましくは、約１５分
間〜約１６時間そして最も好ましくは、約１５分間〜約３時間の時間にわたって
、約３０℃〜約５５℃、好ましくは、約３７℃〜約５５℃の範囲の温度で実行さ
れる。

【００３１】「ハイブリダイゼーションの条件」はまた、有効な緩衝液を必要とする。プロ
ーブおよび他の成分に関して適合性（すなわち、化学的に不活性）であり、相補
的な塩基対間のハイブリダイゼーションをなお可能にする任意の緩衝液が、使用
され得る。１つの特に好ましい緩衝液（「ハイブリダイゼーション溶液Ａ」とし
て本明細書中で称される）は、３×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１０％デキス
トラン硫酸（ＭＷ５００，０００）、０．２％カゼイン、１０μｇ／ｍｌポリ
Ａ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含み、ここで１×ＳＳＣは、０．
１５Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウムである。別の
特に好ましい緩衝液（「ハイブリダイゼーション溶液Ｂ」として本明細書中で称
される）は、５×ＳＳＣ、０．１〜０．３％ドデシル硫酸ナトリウム、１０％デ
キストラン硫酸、１ｍＭＺｎＣｌ_２および１０ｍＭＭｇＣｌ_２を含み、ここ
で１×ＳＳＣは、上記で定義される通りである。

【００３２】「任意の」または「必要に応じて」は、説明が、状況が起こる例および状況が
起こらない例を含むように、続いて記載される状況が、起こってもよく、起こら
なくてもよいことを意味する。例えば、「浸透させた生物学的物質を、必要に応
じて加熱する」は、浸透させた生物学的物質を加熱する例、および浸透させた生
物学的物質を加熱しない例を含む。

【００３３】本発明の方法は、インサイチュｂＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイであ
る。当該分野で明白なように、ｂＤＮＡベース法は、他の技術を用いて検出不可
能であり得るシグナルの増幅を有効に提供する。当業者は、ｂＤＮＡベースアッ
セイを実行するために必要な技術および材料に精通している。簡潔には、ｂＤＮ
Ａ増幅において、標的オリゴヌクレオチドプローブは、２つの部位を含む：核酸
分析物の一部に特異的にハイブリダイズするための部位および少なくとも１つの
他のプローブと特異的にハイブリダイズするための部位。異なるプローブと特異
的にハイブリダイズするように設計された固有の部位を有するさらなるオリゴヌ
クレオチドプローブが、使用され得、その結果、ハイブリダイゼーションが生じ
る段階が繰り返されるにつれて、分枝したＤＮＡ構造が、形成される。分枝した
構造にアニールされる最終のオリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも１つの
検出可能な標識を有する。従って、本来の標的分子は、多数のシグナルを生じ、
それによって、容易な検出のためにシグナルを増幅する。さらに、従来のｂＤＮ
Ａ技術の説明について適切な文献、教科書および他の参考文献を参照し得る。例
えば、Ｃｏｌｌｉｎｓら（１９９７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．２５
（１５）：２９７９−２９８４を参照のこと。

【００３４】本発明は、インサイチュｂＤＮＡハイブリダイゼーションに基づいて核酸分析
物を検出するための非常に高感度の技術を提供した。以前のインサイチュｂＤＮ
Ａハイブリダイゼーション技術は、相対的に感度の低い結果を提供した。しかし
、本発明は、非常に高感度（例えば、生物学的物質中の核酸分析物の約１コピー
から約１０コピーまでを検出するのに十分な感度を有する）のインサイチュｂＤ
ＮＡ法を提供する。

【００３５】（ＩＩ．検出方法）第１の実施形態において、本発明は、ｂＤＮＡハイブリダイゼーションに基づ
く生物学的物質中の核酸分析物のインサイチュ検出のための方法を提供する。

【００３６】この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）生物学的物質のサンプルを調製す
る工程、（ｂ）ハイブリダイズする条件下で標的オリゴヌクレオチドプローブと
生物学的物質とを接触させる工程、（ｃ）生物学材料を洗浄する工程および（ｄ
）基材上の任意の分析物−標的プローブ複合体を検出する工程。

【００３７】生物学的物質のサンプルは、従来のプロセスを介して得られ、そして例えば、
生検および生物学的流体抽出物を含む。しかし、この技術は、インサイチュ分析
のための技術なので、溶解物ではなくて、組織、細胞またはオルガネラを分析す
る。材料が、実質的にインタクトなままであることを保証するために、アッセイ
の間中組織、細胞またはオルガネラの入手および扱いにおいて注意を払わなけれ
ばならない。

【００３８】本発明における使用のための生物学的サンプル（すなわち、分析される組織ま
た細胞）は、生物学的物質が、目的の分析物を含むことが疑わしい限りは、体の
任意の部分から採取され得る。例えば、本発明における使用のための適切な組織
としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：副腎組織、膀胱組織、骨
髄組織、脳組織、乳房組織、心臓組織、結腸組織、食道組織、腸組織、腎臓組織
、肝臓組織、肺組織、リンパ節組織、神経組織、卵巣組織、膵臓組織、前立腺組
織、骨格（横紋）筋組織、平滑筋組織、脾臓組織、胃組織、精巣組織、扁桃組織
お、気管組織および子宮組織。さらにこれらと同じ組織から採取された細胞は、
本明細書中に記載される技術に関して適切である。さらに、細胞は、細胞含有流
体（例えば、上で例示されるような、血漿、血清、脊髄液など）から得られ得る
。最初に、生物学材料は、保存または「固定」されなければならない。多くの方
法が、生物学サンプルを固定することについて当該分野で公知であるが、生物学
的サンプルは、ホルムアルデヒドで固定することが好ましい。例えば、生物学的
物質は、氷上で３０分間、４％のホルムアルデヒド溶液と混合され得る。あるい
は、他の固定剤（例えば、アルコール）もまた、使用され得る。一旦固定される
と、生物学的物質は、基材に固定されなければならない。適切な基材は、サンプ
ルの形態を、保存をしながら、組織、細胞またはオルガネラの固定化を可能にす
る材料から構成される。この基材材料はまた、熱に耐性であることに加えて、固
体でなければならない。さらに、基材は、使用される試薬に関して不活性でなけ
ればならない。好ましい基材は、ガラス（例えば、ガラススライド）を含むが、
弾性性プラスチックもまた使用され得る。

【００３９】生物学的物質は、従来の方法を使用して基材に固定され得る。細胞に関して、
生物学的物質が、遠心分離機を使用して固定されることが好ましい。一般に、基
材に生物学的物質を固定するために必要な力は、約２００×ｇ〜約５００×ｇ（
重力の倍数）である。使用される力は、約３００×ｇであることが好ましい。

【００４０】好ましくは、組織サンプルの固定化は、組織サンプルを、非常に薄い切片に切
断して、そして適切な基材にそれらを置くことによって実施される。好ましくは
、組織は、最初にクリオスタットに置かれ、そして組織を凍結するために、約−
１５℃〜約−２０℃に冷却される。次いで、ミクロトームを使用して、凍結組織
を切片にスライスする。その後、１枚の切片は、基材（例えば、ガラススライド
）に置かれ、そして切片を、基材上で「溶かし」、それによってサンプルを固定
する。ワックス（例えば、パラフィン）を注入された組織は、凍結組織の代わり
に使用され得る。明白なように、組織サンプルを固定する他の方法は、使用され
得る。

【００４１】オリゴヌクレオチドプローブが、内部環境に接近することを保証するために、
基材に結合した生物学的物質を浸透可能にする必要がある。約０．５μｇ／ｍｌ
〜約５０μｇ／ｍｌ、好ましくは、約５μｇ／ｍｌ〜約２０μｇ／ｍｌの濃度の
プロテイナーゼＫ（１ｍｌあたり６００ユニットの活性を有するストック溶液由
来）を含む溶液と基材に結合した生物学的物質との接触は、サンプルの形態は維
持しながら、プローブが生物学的な膜を自由に浸透するのに十分な程度に、生物
学的物質を通過可能にすることが見出された。生物学的物質を浸透可能にするた
めの時間パラメーターおよび温度パラメーターは、周知であるか、または実験的
に決定され得る。約３７℃における約１０分間の反応時間は、プロテイナーゼＫ
を用いた浸透に好ましい。

【００４２】核酸分析物が、二本鎖ＤＮＡを含む場合、プローブハイブリダイゼーションが
、起き得るようにＤＮＡを変性する必要がある。適切な変性工程は、アルカリ処
理または熱処理にサンプルを曝露することを含む。しかし、約１．５分間から約
５分間までのＤＮＡの加熱は、細胞の成分を保存しながら、二本鎖ＤＮＡを変性
するのに十分であることが見出されている。この温度は、ＤＮＡを変性させるの
に十分な、当該分野で公知の任意の温度であり得る。しかし、この温度は、約７
０℃〜約９２℃でありことが好ましく、好ましくは、約８０℃〜約９２℃であり
、約９２℃の温度が、最も好ましい。

【００４３】さらに、核酸分析物が、ＤＮＡを含む場合、存在し得る任意のＲＮＡを消化す
ることもまた必要である。ＲＮＡを消化することによって、プローブは、ＲＮＡ
にハイブリダイズできず、それによって潜在的な偽の陽性の結果を最小化する。
一般に、ＲＮＡの消化について当該分野で公知の任意の方法が、使用され得る。
しかし、ＲＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ、Ｆｌｕｋａなどから入手可能である）が、使
用されることが好ましい。ＲＮａｓｅは、約２５μｇ〜約１００μｇ（スライド
の１スポットあたり）の量でサンプルに添加され得、そしてＲＮＡを消化するの
に十分な時間および温度でインキュベートされ得る。しかし、約４０μｇ（スラ
イドの１スポットあたり）のＲＮａｓｅが、サンプルに添加され、そして３７℃
で１時間維持されることが好ましい。

【００４４】あるいは、核酸分析物が、ＲＮＡを含む場合、ＲＮＡの消化は、実施されない
。しかし、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の加熱は、二次構造を除去するの
に必要であり得る。

【００４５】生物学的物質の調製の他の方法もまた、使用され得る。例えば、幾つかの調製
工程は、ＴＨＩＮＰＲＥＰ（登録商標）スライドシステム（ＣｙｔｙｃＣｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｏｘｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）のような市販のキットを使用
して実施され得る。

【００４６】一旦調製されると、生物学材料は、ハイブリダイズする条件下で標的オリゴヌ
クレオチドプローブと接触するように配置される。標的プローブは、核酸分析物
の標的配列の少なくとも一部に相補的である部分を有する。目的の核酸分析物が
サンプル中に存在する場合、核酸分析物および標的プローブは、ハイブリダイズ
して、分析物−標的プローブ複合体を形成する。

【００４７】添加された標的プローブの量は、実験的に決定され得るが、約０．１ｐｍｏｌ
ｅ〜約１０ｐｍｏｌｅ（スライド上の１スポットあたり）が、添加され、そして
４０℃で約３時間インキュベートされることが好ましい。このハイブリダイゼー
ション工程のための好ましい反応媒体は、ハイブリダイゼーション溶液Ａ（上で
定義される）である。

【００４８】一旦、十分なインキュベーション時間が経過したら、基材と分析物−標的プロ
ーブ複合体（存在している場合）の両方を、洗浄して、結合していない標的プロ
ーブの除去を容易にする。洗浄工程は、一般に緩衝溶液および特に、界面活性剤
を含む洗浄液の使用を必要とする。

【００４９】緩衝溶液は、ハイブリダイズしていないオリゴヌクレオチドプローブの除去の
ために適切な当該分野で公知の任意の従来の溶液であり得る。好ましい緩衝溶液
は、アルカリ金属の塩を含む。特に好ましい緩衝溶液は、塩化ナトリウム、クエ
ン酸ナトリウムおよびそれらの組み合わせを含む。

【００５０】好ましくは、界面活性剤は、非イオン性の界面活性剤である。さらに、界面活
性剤はまた、親水性のサーファクタントであることが好ましい。例示的な界面活
性剤は、ポリオキシエチレンベースの界面活性剤（例えば、、ＢＲＩＪ（登録商
標）およびＴＲＩＴＯＮ（登録商標））である。本発明における使用にまた適切
な類似の界面活性剤は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＧＥＮＡＰＯＬ（登録商標）
、ＩＧＥＰＡＬＣＡ（登録商標）、ＴＨＥＳＩＴ（登録商標）およびＬＵＰＲ
ＯＬ（登録商標）（商業的な供給者から全て入手可能である）の商標名下で販売
されている。

【００５１】一旦、洗浄液が、決定されたら、洗浄工程は、少なくとも１回、好ましくは２
回、そして最も好ましくは、３回実施される。洗浄工程の温度は、アッセイの感
度に影響を与えることが見出されている。従って、本発明に関して、約２１℃か
ら約６０℃の範囲の温度は、上手く作用し、そして好ましい。必要に応じて、洗
浄工程は、室温で実施される。

【００５２】一旦洗浄工程が完了すると、ハイブリダイズしていない標的プローブは存在し
ない。従って、基質上の分析物−標的プローブ複合体を検出し得る任意の方法を
使用して、核酸分析物の存在を検出し得る。しかし、分枝したネットワークを形
成するようなさらなるオリゴヌクレオチドプローブを添加するのが好ましい。一
旦分枝したネットワークが形成されると、複数の検出可能な標識は、容易な検出
のためにシグナルを「増幅」するための効果を伴って付加される。従って、分析
物−標的プローブ複合体を検出することは、以下の工程に従って達成され得る：（ｄ）（ｉ）洗浄した基質および分析物−標的プローブ複合体を、前増幅オリ
ゴヌクレオチドプローブと、ハイブリダイゼーション条件で接触させる工程であ
って、ここで、この前増幅プローブの第１部分は、核酸分析物に相補的な標的プ
ローブの部分以外の標的プローブの一部に相補的であり、これにより、核酸分析
物がサンプル中に存在する場合、分析物−標的プローブ−前増幅プローブ複合体
が形成する工程；（ｄ）（ｉｉ）工程（ｄ）（ｉ）の生成物を、増幅オリゴヌクレオチドプロ
ーブと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、ここで、増
幅プローブの第１部分は、前増幅プローブの第２部分と相補的であり、これによ
って、核酸分析物がサンプル中に存在する場合、分析物−標的プローブ−前増幅
プローブ−増幅プローブ複合体が形成される工程；（ｄ）（ｉｉｉ）工程（ｄ）（ｉｉ）の生成物を、標識オリゴヌクレオチドプ
ローブと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させ、ここで、標識プローブの
一部は、この増幅プローブの第２部分に結合し、これによって、核酸分析物がサ
ンプル中に存在する場合、分析物−標的プローブ−前増幅プローブ−増幅プロー
ブ−標識プローブ複合体が形成される工程；（ｄ）（ｉｖ）分析物−標的プローブ−前増幅プローブ−増幅プローブ−標識
プローブ複合体を、検出可能な標識で標識する工程；および（ｄ）（ｖ）基質上の標識の存在を検出する工程。

【００５３】それぞれのプローブハイブリダーゼーション工程（すなわち、工程（ｄ）（ｉ
）、（ｄ）（ｉｉ）および（ｄ）（ｉｉｉ）は、上記の従来のハイブリダーゼー
ション条件下で実行される。しかし、これらの特定のハイブリダーゼーション工
程について、それぞれの工程は約２５分間のインキュベーション時間で約５５℃
で起こることが好ましい。それぞれのプローブ（すなわち、前増幅プローブ、増
幅プローブおよび標識プローブ）は、増殖する複合体とそのプローブとの接触の
ために、ハイブリダーゼーション溶液Ｂ（上記で規定）と別々に混合されること
がまた好ましい。従って、例えば、増幅プローブをハイブリダーゼーション溶液
Ｂと混合し、分析物−標的プローブ−前増幅プローブ複合体に接触するように配
置して分析物−標的プローブ−前増幅プローブ−増幅プローブ複合体を形成する
。

【００５４】混合されるプローブの量は当該分野で公知の技術を使用して決定され得るが、
前増幅プローブおよび増幅プローブはそれぞれ約１ｆモルから約１０ｐモル（ス
ライドのスポットあたり）の量で添加されることが好ましい。もっとも好ましく
は、これらのプローブはそれぞれ約１ｆモルから約１００ｆモル（スライドのス
ポットあたり）の量で添加される。

【００５５】標識プローブが分析物−標的プローブ−前増幅プローブ−増幅プローブ複合体
にハイブリダイズする場合、標識が達成される。この標識プローブは、標識可能
なシグナルを直接的または間接的に提供する１つ以上の検出可能な標識を含む。
この標識は、相補的な配列の個々のメンバーとして標識プローブに、共有結合的
または非共有結合的に結合しても良いし、または複数の標識を有する末端メンバ
ーもしくは末端テイルとして存在しても良い。プローブに結合する標識を提供す
るための種々の手段が文献において報告されている。例えば、Ｌｅａｒｙら、（
１９８３）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８０：４０４５；
Ｒｅｎｚら、（１９８４）ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ１２：３４３５；Ｒ
ｉｃｈａｒｄｓｏｎら、（１９８３）ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ１１：６
１６７；Ｓｍｉｔｈら、ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ（１９８５）１３：２
３９９；Ｍｅｉｎｋｏｔｈら、（１９８４）ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ１３８
：２６７を参照のこと。

【００５６】使用され得る標識としては、蛍光剤、化学発光剤、色素、酵素、酵素基質、酵
素補因子、酵素インヒビター、酵素サブユニット、金属イオンなどが挙げられ得
る。例示的な特定の標識としては、とりわけ、フルオレセイン、ローダミン、テ
キサスレッド、フィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ウンベリフ
ェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、ルミノール、ＮＡＤＰＨ，、α−β−
ガラクトシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファター
ゼなど，が挙げられる。アルカリホスファターゼ標識は特に好ましい。

【００５７】検出可能な標識の検出は、任意の公知の手段によって達成され得、そして標識
の性質に依存する。蛍光剤について、多くの蛍光メーターが利用可能である。化
学発光剤について、発光メーターまたはフィルムが利用可能である。酵素を用い
て、蛍光生成物、化学発光生成物または比色生成物が提供され得、そして蛍光測
量的、化学発光測量的、分光光度測量的または視覚的（好ましくは顕微鏡の補助
によって）に検出される。本方法について、アルカリホスファターゼ基質を添加
して、明視野顕微鏡または蛍光顕微鏡を使用してアルカリホスファターゼ標識の
存在を検出することが好ましい。

【００５８】以前のアッセイと対比して、核酸分析物を検出する本方法は、より感受性が高
い。以前のアッセイは、多くの（しばしば数百もの）核酸分析物コピーの存在に
依存した。本方法は、比較的少ないコピーを検出するように開発された。従って
、この方法は、１から約１０コピーの核酸分析物を検出するのに十分感受性を有
することが好ましい。しかし、この方法は１から約２コピーの核酸分析物を検出
するのに十分な感受性を有することが最も好ましい。

【００５９】（ＩＩＩ．プローブの合成）プローブの配列は、当該分野で公知の標準的技術を使用して決定される。従っ
て、例えば、標的プローブ配列は、その分析物に特異的な、目的の分析物の既知
の配列を使用して決定される。結合を伴うことが意図される（そして従ってプロ
ーブまたは分析物のいずれかのオリゴヌクレオチドの別の配列に相補的である）
配列のこれらの領域は、それぞれ少なくとも１５ヌクレオチド、通常は少なくと
も２０ヌクレオチド、そしてもっとも好ましくは１００ヌクレオチド以下である
。代表的に、結合配列は、約２５ヌクレオチド長である。これらを、分析物の異
なる配列および／または種々のプローブの特異的でかつ異なる部分に結合するよ
うに、通常選択する。さらに、所定の任意のプローブのセットのためのオリゴヌ
クレオチドは、必要に応じて同じ融点を有する。

【００６０】第２の結合配列を有するプローブを、プローブの適切な部分に実質的に相補的
であるように選択する。この第２の結合配列は、第１の結合配列に連続しても良
いし、または中間の非相補的な配列によって第１の結合配列から間隔が開いてい
ても良い。このプローブは、所望の場合、他の非相補的な配列を含んでも良い。
しかし、これらの非相補的な配列は、結合配列の結合を妨げてもいけないし、非
特異的な結合を生じてもいけない。

【００６１】このプローブは、オリゴヌクレオチド合成またはクローニングによって調製さ
れ得、前者が好ましい。現在当業者に周知であるように、オリゴヌクレオチドを
合成するための方法は、代表的に３’−ブロックヌクレオチドモノマーおよび５
’−ブロックヌクレオチドモノマーを、成長するオリゴヌクレオチド鎖の末端５
’−ヒドロキシル基に連続的に付加する工程を包含し、ここで、それぞれの付加
は、付加されるモノマーの３’位の成長する鎖の、末端５’ヒドロキシル基の求
核攻撃によって実施され、これは、代表的に、ホスホトリエステル、ホスホール
アミダイトなどのリン酸誘導体である。

【００６２】（ＩＶ．位置決定）本発明はまた、細胞における核酸分析物の局在または位置を決定するための方
法を提供する。上記のように、この方法は、インサイチュ工程と同じ工程を包含
するが、細胞における核酸分析物の部分の標識として、生物学的サンプルの細胞
中の分析物−標的プローブ複合体の部分を同定するさらなる工程（ｅ）を、追加
する。以前のインサイチュ検出アッセイは、シグナルの非細胞部分の明示におい
てあまり正確ではない。例えば、以前のインサイチュアッセイのシグナルは、非
細胞成分中に「含まれ」得ない。あるいは、以前のインサイチュアッセイのシグ
ナルは、細胞の広い範囲にわたって拡散し得、従って核酸分析物の位置に関して
明確な終結を生成し得ない。ハイブリダイゼーションのための温度が低く（すな
わち、通常５５℃を超えない）、サンプル処理が荒くないので、本方法は細胞中
の分析物のシグナルの位置を決定する能力を可能にする。特定の工程について温
度が上昇する場合、例えば、加熱を介してＤＮＡを変性する場合に約９２℃まで
上昇する場合でさえ、この方法は、細胞中の単一の分析物の位置を決定する能力
をまだ維持している。

【００６３】（Ｖ．利用性）本方法は、配列が既知である任意の核酸を検出するために使用され得る。この
方法が特に適した分析物としては、ＨＩＶＲＮＡ、ＨＩＶＤＮＡ、ＨＣ
ＶＲＮＡ、ＣＭＶＲＮＡ、ＣＭＶＤＮＡ、ＨＰＶＲＮＡ、ＨＰ
ＶＤＮＡ、ＬＡＰ、ＩＬ−２、内因性遺伝子、遺伝子転写物、およびそれ
らのセグメントが挙げられるがそれらに限定されない。

【００６４】その感受性、使用のし易さ、多能性、信頼性および敏捷性（結果が１日で得ら
れる）を得るために、本方法は、癌および炎症性疾患の初期検出において、広範
な適用を有する。単一コピー検出は、ウイルス疾患（例えば、ＨＩＶおよび多く
の他のもの）のために特に有利である。なぜなら、診断がより初期に達成され得
（ウイルス付加が比較的低い場合）、これによってより初期に介入および処置が
可能になるからである。さらに、本方法は、治療選択の分野において適用を有す
る。例えば、本方法は、素早く順応し、そして正確にヒト上皮増殖因子レセプタ
ー２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）の遺伝子コピー数を検出するように適応され得る。こ
れは、抗−ＨＥＲ２治療（例えば、モノクローナル抗−ＨＥＲ２抗体治療（Ｈｅ
ｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，ＳｏｕｔｈＳ
ａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡから入手可能）を始めるか否かを決定するため
に有用である。さらに、細胞前処理状態または組織前処理状態を改変することに
よって、本方法は、プローブの同じセットを用いてｍＲＮＡまたはＤＮＡのいず
れかを検出し得る。

【００６５】本方法は、高度に特異的であり、そして核酸分析物配列の一部が既知である場
合、細胞中での標的配列の正確な位置決定を可能にする。さらに、細胞において
核酸分析物の単一のコピーしか存在しない場合でさえも、位置決定は可能である
。従って、このようなアッセイは、広範な適用を有し、そして研究および医学に
おいて特に有用である。遺伝子治療において、例えば、薬効が細胞質および／ま
たは核に入るか否かを決定することが今や可能である。

【００６６】癌および炎症性疾患の検出ならびに治療選択の補助に加えて、組織切片中の核
酸を本方法を使用して検出する能力は、さらなる利点を有する。例えば、組織サ
ンプル中のインサイチュ検出は、癌または感染性病原体が組織の周辺領域に広が
る程度を示す。このような情報は、予後指標として役立ち、そして疾患に対する
適切な治療的アプローチをあつらえる能力を提供する。

【００６７】本発明は、それらの好ましい特定の実施形態に関連して記載されているが、前
述の説明および以下の実施例は例示を意図し、本発明の範囲を限定しないことが
理解される。他の局面では、本発明の範囲内の利用および改変は、本発明が属す
る当業者に明らかである。

【００６８】（実験）以下の実施例は、完全な開示、および本明細書中に記載されそして特許請求さ
れる化合物をどのようにして調製および使用するのかという説明を、当業者に提
供するように提案される。数（例えば、量、温度など）に関して正確にする努力
をしたが、いくつかの誤差および偏差が計上されるべきである。他に指示されな
い限り、温度を℃で表し、そして圧力は海面上大気圧でまたは海面上大気圧付近
である。

【００６９】他に指示されない限り、全ての出発材料および試薬は市販のものを得（例えば
、Ａｌｄｒｉｃｈ，ＳｉｇｍａおよびＩＣＮから）そしてさらなる精製をせずに
使用した。標準的な細胞培養手順および細胞収集手順を使用した。

【００７０】（実施例１）（細胞におけるＨＰＶＤＮＡのＢＤＮＡＩＳＨによる検出）（Ａ．材料および方法）（ｉ．細胞培養）これらは異なる株および多くのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を含むので
、ヒト子宮頚癌腫細胞株のＨｅＬａ、ＣａＳｋｉおよびＳｉＨａを使用して、本
発明を評価した。表１は、それぞれの細胞株を記載する。

【００７１】

【表１】＊全ての細胞株を、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒ
ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、
そして一般にＡＴＣＣによって示される条件下でフラスコ中で増殖させた。必要
な場合、細胞を、マイルドなトリプシン処理を使用してフラスコからはがした。

【００７２】（ｉｉ．オリゴヌクレオチドプローブ）ＨＰＶ−１６−特異的標的プローブは、総量２６ＤＮＡオリゴヌクレオチドプロ
ーブから構成され、このプローブは、ＨＰＶゲノムのＥ６領域およびＥ７領域の
約９０％をカバーする。これらのプローブを、ＨＰＶ−１６ゲノムのＥ６遺伝子
およびＥ７遺伝子について、２３配列に基づく変性コンセンサス配列を最初に作
製することによって設計し、ＧｅｎｅｔｉｃｓＤａｔａＥｎｖｉｒｏｎｍｅ
ｎｔソフトウェア（ＨａｒｖａｒｄＧｅｎｏｍｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，
Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用して、ＧｅｎＢａｎｋから検索した。次いで
、可能性のある標的プローブセットを、ＰｒｏｂｅＤｅｓｉｇｎｅｒ（登録商標
）ソフトウェア（ＢａｙｅｒＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌ
ｅ，ＣＡ）を使用して生成し、これが、バックグラウンドに対する寄与が最小で
あるｂＤＮＡプローブセットの可撓性のある設計を可能にし、６３±２℃の一定
の融点を示す。最終プローブを、プローブセットのスクリーニングの後に、Ｈｙ
ｂＳｉｍｕｌａｔｏｒ（登録商標）（ＡｄｖａｎｃｅｄＧｅｎｅＣｏｍｐｕ
ｔｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）
を使用して他の３９ＨＰＶ遺伝子型との、そしてＢｌａｓｔ２^ＴＭ（Ｎａｔ
ｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ
，ＭＤ）を使用してヒトゲノムＤＮＡ配列との潜在的な相互作用について選択し
た。

【００７３】ＨＰＶ−１８特異的標的プローブは、ＨＰＶゲノムのＥ６領域およびＥ７領域
の９０％を覆う全部で３２個のＤＮＡオリゴヌレクオチドのプローブからなって
いた。これらのプローブを、ＨＰＶ−１８ゲノムのＥ６遺伝子およびＥ７遺伝子
についての４つの配列に基づいた縮重したコンセンサス配列および６３±２℃の
一定の融解温度を使用して上記のように設計した。

【００７４】他のＤＮＡオリゴヌレクオチドプローブ（前増幅剤（ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｅ
ｒ）、増幅剤（ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）結
合体化標識プローブを含む）は、詳細に記載されてきた。Ｃｏｌｌｉｎｓら（１
９９７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ２５：２９７９−２９８４。非
特異的ハイブリダイゼーションを減少させるために、非天然ヌクレオチドである
、５−メチル−２’−デオキシイソシチジン（ｉｓｏＣ）および２’−デオキシ
イソグアノシン（ｉｓｏＧ）を、標的、前増幅子剤、増幅剤およびＡＰ−結合体
化標識プローブの結合部位に含めた。

【００７５】（Ｂ．ＤＮＡ検出）ＤＮＡ検出のために、収集した細胞を、３０分間、氷上でリン酸緩衝溶液（Ｐ
ＢＳ；０．０１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５）中の４％ホルムアルデヒドを用い
て固定し、それぞれに対して２分間２回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁した。固定し
た細胞の懸濁液の２００μｌのアリコートを、２重スポットＣｙｔｏｓｐｉｎフ
ァネル（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｐｏｔｔｅｄｃｙｔｏｓｐｉｎｆｕｎｎｅｌｓ）
（Ｓｈａｎｄｏｎ；Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）中へピペットで取り、そして
３００×ｇに等価であると計算された力を使用してｃｙｔｏｓｐｉｎｃｅｎｔ
ｒｉｆｕｇｅ（Ｓｈａｎｄｏｎ）中で、１５００ｒｐｍにて６分間遠心分離した
。この細胞を、段階的な一連の７０％、９０％および１００％のエタノールを介
して、それぞれ２分間、室温でスライド上において脱水を行い、室温で１０分間
風乾し、そして−８０℃で最高２週間まで貯蔵した。細胞を、段階的な一連の１
００％、９０％および７０％のエタノールを介して、それぞれ室温で、２０分間
、スライド上における再水和を行い、ＰＢＳで各々２分間で２回洗浄した。スラ
イドを、２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエ
ン酸ナトリウムである）中の４０μｇ／ｍｌＲＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）の中で
３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ中で、各々２分間で２回洗浄し、そし
て、ＰＢＳ中の７．５〜１０μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含む予
め暖めておいたジャーの中に３７℃で、１０分間浸した。それぞれについて２分
間で２回、ＰＢＳ中で洗浄した後、この細胞を、段階的な一連の７０％、９０％
および１００％のエタノールを介して、それぞれ２分間、室温でスライド上にお
ける脱水を行い、室温で１０分間風乾した。

【００７６】前処理後、細胞を、プレハイブリダイゼーション溶液と共にインキュベートし
、１組のオリゴヌレクオチド標的プローブ（上述）とハイブリダイズさせ、その
後、シグナル増幅のために一連のオリゴヌレクオチドプローブでハイブリダイゼ
ーションした。プレハイブリダイゼーション工程として、スライド上の各スポッ
トを、１５０μｌのハイブリダイゼーション溶液Ａ（３×ＳＳＣ、５０％ホル
ムアミド、１０％硫酸デキストラン［ＭＷ５００，０００］、０．２％ガゼイ
ン、１０μｇ／ｍｌポリＡ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）と共に室温
で３０分間インキュベートした。スライドを、加湿（ｈｕｍｉｄｉｔｙ）チャン
バ（ＨｙｂａｉｄＯｍｎｉｓｌｉｄｅｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，ＰｈｅｎｉｘＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）に移し、９２
℃で、５分間インキュベートし、次いで、チャンバから取り出して、ベンチトッ
プにて、室温で、５分間冷却した。このプレハイブリダイゼーション溶液を取り
除き、そしてスライド上の各スポットを、０．６ｐｍｏｌｅのＨＰＶ−特異的標
的プローブを含む、１００μｌのハイブリダイゼーション溶液Ａと共に、４０℃
で３時間、加湿チャンバ中でインキュベートした。標的プローブと共にインキュ
ベーションした後、スライドを、減少性の一連のＳＳＣ緩衝液０．００２５％Ｂ
ＲＩＪ（登録商標）−３５界面活性剤（ＳＵＲＦＡＣＴＡＭＰＳ（登録商標）
３５、１０％、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を以下のように用いて
室温で洗浄した：２×ＳＳＣを用いて１〜２分間にて３回；０．２×ＳＳＣを用
いて１〜２分間にて３回；０．１×ＳＳＣを用いて、５分間にて１回；そして２
×ＳＳＣを用いて２分間にて１回。スライド上の各スポットを、加湿チャンバ中
で、９０ｆｍｏｌｅの前増幅剤を含む１００μｌのハイブリダイゼーション溶液
Ｂ（５×ＳＳＣ、０．１〜０．３％のドデシル硫酸ナトリウム［ＳＤＳ］、１０
％硫酸デキストラン、１ｍＭＺｎＣｌ_２、１０ｍＭＭｇＣｌ_２）と共に、５
５℃にて、２５分間インキュベートした。スライドを、０．１×ＳＳＣ、１ｍＭＥＤＴＡ中でそれぞれ１分間および４分間の２回洗浄し、次いで、加湿チャン
バ内で９０ｆｍｏｌｅの増幅剤を含んだ１００μｌのハイブリダイゼーション溶
液Ｂの中で、５５℃にて、２５分間インキュベートした。スライドを、０．１×
ＳＳＣ、１ｍＭＥＤＴＡ中でそれぞれ１分間および４分間の２回洗浄をし、次
いで、加湿チャンバ内で、９０ｆｍｏｌｅのＡＰ結合体化標識プローブを含んだ
１００μｌのハイブリダイゼーション溶液Ｂで、５５℃で１５分間インキュベー
トした。ＷａｓｈＤ（１００ｍＭｔｒｉｓ−（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン、ｐＨ８．０、０．１％ＢＲＩＪＳ（登録商標）−３５、１ｍＭＺｎＣ
ｌ_２、１０ｍＭＭｇＣｌ_２）で、室温にて５分間洗浄した後に、５０μｌの緩
衝化ＡＰ基質（ＦａｓｔＲｅｄ，＃Ｋ５９７，ＤＡＫＯＣｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を添加し、そしてスライドを、製造者の
指示書に従って、室温で１０分間インキュベートした。スライドを、それぞれ３
分間、水で３回リンスし、次いで４０秒間、Ｇｉｌｌｓ１ヘマトキシリン（
ＡｍｅｒｉｃａｎＨｉｓｔｏｌｏｇｙＲｅａｇｅｎｔＣｏｍｐａｎｙ，Ｉ
ｎｃ．，Ｍｏｄｅｓｔｏ，ＣＡ）または０．０００１％ｂｉｓＢｅｎｚｉｍｉ
ｄｅ（＃Ｂ２８８３，Ｓｉｇｍａ）のいずれかで対比染色した。スライドをＵＬ
ＴＲＡＭＯＵＮＴ（登録商標）（ＤＡＫＯＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＰＥＲ
ＭＯＵＮＴＳ（登録商標）（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）または７５
％グリセロールでマウントして、そして室温で貯蔵した。スライドを、ＦＩＴＣ
または３重バンドパスフィルター（ｔｒｉｐｌｅ−ｂａｎｄｐａｓｓｆｉｌ
ｔｅｒ）（Ｎｉｋｏｎ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）または６０×明視野対
物レンズを有するＮｉｋｏｎＥ８００蛍光顕微鏡を使用して観察し、そして、
Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓｃｏｏｌｅｄ３−ｃｈｉｐｃｏｌｏｒＣＣＤカメラ
（ＯｐｔｒｏｎｉｃｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｇｏｌｅｔａ，ＣＡ）を用い
て画像を取り込んだ。蛍光画像または色素画像を、ＩｍａｇｅＰｒｏｂｅＳ
ｏｆｔｗａｒｅ（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，ＳｉｌｖｅｒＳｐｒ
ｉｎｇｓ，ＭＡ）を使用して取りこんだ。図１は、実施例１のためのアッセイ形
式の概略図である。

【００７７】（Ｃ．結果）本研究結果によって、ＨＰＶ−１６標的プローブとのハイブリダイゼーション
の際に、ポジティブシグナル検出をＣａＳｋｉ細胞（図２Ａ）およびＳｉＨａ細
胞（図２Ｂ）中で観察されたことが示される。予測されたように、ＣａＳｋｉ細
胞で多くのシグナルを検出した。なぜならば、これらは約４００−６００コピー
のＨＰＶ−１６を有するからである。１個または２個のみのシグナルを、ＳｉＨ
ａ細胞の中で検出し、また予測されたように、これらは１〜２個のみのＨＰＶ−
１６のＤＮＡコピーを有する。最終的には、シグナルは、ＨＰＶ−１６を持たな
いこれらの細胞（すなわち、ＨｅＬａ（図２Ｃ）細胞およびＣ３３ａ（図２Ｄ）
細胞）中で、ＨＰＶ−１６プローブの使用により検出されなかった。これらの結
果によって、本発明の方法の定量能力および特異性の両方は実証される。

【００７８】ＨＰＶ−１８標的プローブを使用したハイブリダイゼーション際に、ポジテ
ィブシグナル検出をＨｅＬａ細胞（図２Ｇ）中で観察した。このＨｅＬａ細胞は
、１０〜５０個のＨＰＶ−１８のＤＮＡコピーを含んでいる。しかし、シグナル
は、ＨＰＶ−１８を欠く細胞（ＣａＳｋｉ細胞（図２Ｅ）、ＳｉＨａ細胞（図２
Ｆ）およびＣ３３ａ細胞（図２Ｈ））中のＨＰＶ−１８プローブにおいて検出さ
れなかった。シグナルは、ＨＰＶネガティブＨＴ３細胞株またはＭＥ１８０細胞
株において、ＨＰＶ−１６標的プローブまたはＨＰＶ−１８標的プローブのいず
れを用いても検出されなかった。これらの細胞株は、ＨＰＶ−３９（表示せず）
類似のＤＮＡ配列を保有する。

【００７９】多くのさらなるコントロールを実施し、これらの実験で観察されたポジティブ
シグナルは、ＨＰＶＤＮＡ標的に対して特異的であることを実証した。非特異
的標的プローブを使用した場合、あるいはｂＤＮＡＩＳＨ法からＨＰＶ−１６
標的プローブもしくはＨＰＶ１８標的プローブ、増幅剤、またはＡＰ−結合体化
標的プローブを省略した場合に、ポジティブシグナルは観察されなかった。また
、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ消化工程もしくはＤＮＡ変性工程、または細胞をＤＮ
ａｓｅで処理の省略によってもまた、シグナルが消失した。ＤＮａｓｅ消化実験
についてのさらなるコントロールとして、ＲＮａｓｅ処理工程を省略して、この
シグナルの消失が、このオリゴヌレクオチドプローブのＤＮａｓｅ分解に起因し
ないことを確認した。これらの条件下で、ポジティブシグナルを再度検出し、Ｄ
ＮＡオリゴヌレクオチドプローブが分解されず、従って、ＨＰＶＲＮＡ標的に
結合し得ることを示した。

【００８０】（実施例２）（細胞における特異性の評価）混合した細胞集団を使用して、ＨＰＶＤＮＡ検出についての本発明の方法の
特異性をさらに評価した。混合した細胞サンプルは、（４００〜６００のＨＰＶ
−１６のＤＮＡコピーを含む）非標識ＣａＳｋｉ細胞および標識化したＨｅＬａ
細胞（１０５０のＨＰＶ−１８のＤＮＡコピーを含む）を含んだ。このＨｅＬａ
細胞を、蛍光細胞トレイサーＣＦＤＡＳＥ（Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃ
ｅｉｎｄｉａｃｅｔａｔｅ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒ、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒプローブ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で、製造者の指示書に従って標識
した。両方の細胞型を、実施例１の手順に従ってアッセイした。

【００８１】図３Ａおよび図３Ｃにおいて示されたように、ＨＰＶ−１６標的プローブを用
いるハイブリダイゼーションによって、ＨＰＶ−１６に感染したＣａＳｋｉ細胞
（矢印）おいてのみポジティブシグナル検出は生じたが、ＨｅＬａ細胞（矢印）
においては生じなかった。同様に、図３Ｂおよび図３Ｄに示したように、ＨＰＶ
−１８標的プローブを用いたハイブリダイゼーションは、ＨＰＶ−１８に感染し
たＨｅＬａ細胞（矢じり）おいてのみポジティブシグナル検出を生じるが、Ｃａ
Ｓｋｉ細胞（矢じり）においては生じない。予測されるように、より大きなシグ
ナル強度（すなわちより多くのスポットかつより大きなサイズのスポット）を、
ＨｅＬａ細胞でのＨＰＶ−１８ＤＮＡ検出と比較して、ＣａＳｋｉ細胞におけ
るＨＰＶ−１６ＤＮＡ検出について観察した。シグナル強度におけるこの差異は
、ＨｅＬａ細胞（１０−５０ＨＰＶ−１８ＤＮＡコピー／細胞）と比較し
て、ＣａＳｋｉ細胞に存在するより多い数のＨＰＶＤＮＡコピー（４００〜６
００のＨＰＶ−１６ＤＮＡコピー／細胞）の反映である。

【００８２】これらの結果によって、細胞の混合された集団において、本発明の方法はＨＰ
Ｖ−１６に感染した細胞とＨＰＶ−１８ＤＮＡに感染した細胞とを区別し得るこ
とが実証される。さらに、１つの細胞型から他の細胞型へのシグナルの移行は存
在しない。なぜならば、ポジティブシグナルは、適切な細胞型においてのみ保持
されるからである。さらに、低い発生量の標的でさえ、他のＨＰＶ遺伝子型の存
在によって導入され得るバックグラウンドまたは交差反応性の問題なしに、本発
明を用いて容易に検出され得る。

【００８３】（実施例３）（ＨＰＶＲＮＡの検出および細胞内におけるＲＮＡ／ＤＮＡの位置決定）ＲＮＡ検出について、チャンバスライド（＃１２−５６５−１８、Ｆｉｓｈｅ
ｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）上で増殖した細胞を
、３０分間、室温にてＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中の１
０μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫで１０分間、室温で処理し、次いでＰ
ＢＳ中で、５分間で２回洗浄した。サンプルを、４０℃で、３時間、標的プロー
ブ緩衝液（６×ＳＳＣ、２５％ホルムアミド、０．２％ＢＲＩＪ（登録商標）Ｓ
−３５、０．２％ガゼイン）中の１ｐｍｏｌｅのＨＰＶ−特異的標的プローブと
共にインキュベートし、次いで、実施例１に記載したものと同じ減少性の一連の
ＳＳＣ緩衝液に従って洗浄した。同様に、前増幅剤、増幅剤、およびＡＰ−結合
体化プローブハイブリダイゼーションならびに洗浄条件は、実施例１と同じであ
った。

【００８４】ＤＮＡ標的の細胞内位置決定のために、ＨｅＬａ細胞を、ポリ−Ｄ−リジン被
覆したチャンバスライド上で一晩増殖した。ポリ−Ｄ−リジンは、Ｓｉｇｍａ（
製品コードＰ７２８０）から入手可能である。次の日、この細胞培養培地を取
り出し；この細胞をＰＢＳで洗浄し、次いでＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで
３０分間、室温で固定し、そして、ＨＰＶ−１８標的プローブまたは（ネガティ
ブコントロールとして）ＨＰＶ１６標的プローブを用いたハイブリダイゼーショ
ンによってＤＮＡ標的について評価した。

【００８５】ＡＰ基質（ＦａｓｔＲｅｄ，ＤＡＫＯＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を添加
し、そしてスライドを、室温、４℃でインキュベートした。ＰＢＳ中で洗浄する
ことによって反応を停止した後、サンプルを、ＰＢＳ中の４％のホルムアルデヒ
ドで、５分間、室温において後固定（ｐｏｓｔｆｉｘ）し、次いでヘマトキシリ
ンまたはｂｉｓＢｅｎｚｉｍｉｄｅのいずれかを用いて４０秒間、対比染色した
。スライドを観察し、画像を作製し、そして実施例１に記載のようにプリントし
た。

【００８６】ＨＰＶ−１８標的プローブとの、（ＲＮＡ検出のために調製した）ＨｅＬａ細
胞のハイブリダイゼーションによって、主に細胞質においてＨＰＶ−１８のｍＲ
ＮＡ検出（矢じり、図４Ａ）を生じた。しかし、ＨＰＶ−１６標的プローブと
共にインキュベートしたこれらの同じ細胞において、シグナルは観察されなかっ
た（図４Ｂ）。

【００８７】対照的に、ＨＰＶ−１８標的プローブとの（ＤＮＡ検出にために調製した）Ｈ
ｅＬａ細胞のハイブリダイゼーションによって、ＨｅＬａ細胞核（矢印、図４Ｃ
）中のＨＰＶ−１８ＤＮＡの検出を生じた。しかし、ＨＰＶ−１６標的プロ
ーブとインキュベートしたこれらの同じ細胞においてシグナルは観察されなかっ
た（図４Ｄ）。

【００８８】これらの結果は、ＨＰＶｍＲＮＡおよびＨＰＶＤＮＡが、細胞中の異なっ
た区画に対して局在していることを示す。特に、ウイルスｍＲＮＡは、主に細胞
質に対して局在しているが、一方ＤＮＡは、核に束縛されている。これらの結果
はまた、ポジティブシグナルが、標的核酸が局在する細胞の区画に保持されてい
ることを示す。換言すると、この標的およびシグナルは共局在（ｃｏ−ｌｏｃａ
ｌｉｚｅｄ）している。

【００８９】本発明の方法は、正確な細胞内位置決定を提供し、標的核酸配列が局在する細
胞の区画に保持されたポジティブシグナルを生じる。

【００９０】（実施例４）（ＣＩＮＩＩ標本中のｂＤＮＡＩＳＨによるＨＰＶ−１６の検出）実施例１のプロトコルに類似のプロトコルを、以下のように、組織についての
インサイチュハイブリダイゼーションのために使用した。簡潔には、頸部組織の
ホルマリン固定したパラフィン切片を、脱ワックスして、キシレンおよび段階的
な一連のアルコールを用いる標準的組織学を使用して再水和した。ＤＮＡ検出に
ために、この組織を、３７℃において１時間、Ｒｎａｓｅ緩衝液（０．５ＭＮ
ａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ９．０、１ｍＭＥＤＴＡ）中の１００μｇ
／ｍｌのＲＮａｓｅでＲＮａｓｅ消化した後、３７℃において１０分間、Ｐｒｏ
ｔｅｉｎａｓｅＫ消化（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ緩衝液またはＰＢＳ中の１
２μｇ／ｍｌ）した。ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを、４℃において１０分間、Ｐ
ＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで後固定（ｐｏｓｔｆｉｘａｔｉｏｎ）する
ことによって不活性化した。ＰＢＳ中で数回洗浄した後、Ａｎｇｅｒｅｒら（１
９８７）（ＩｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈＲＮＡ
ｐｒｏｂｅ−ＡｎＡｎｎｏｔａｔｅｄＲｅｃｉｐｅ．ＩｎＶａｌｅｎｔ
ｉｎｅＫ．Ｌ．ら編，Ｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｔｏＮｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘ
ｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ：７１−９６）によって記載され
ているように、１ＭＴＥＡ中でこの組織をアセチル化した。切片を一連のエタ
ノールで脱水して、その後、５分間、９２℃で、Ｈｙｂａｉｄ（Ｐｈｅｎｉｘ）
上でＤＢ（８０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ）で変性させた。その後、これを冷
７０％エタノールに浸し、そして脱水した。プレハイブリダイゼーション緩衝液
中での３０分間のインキュベーション後、標的オリゴヌレクオチドプローブを、
１０ｆｍｏｌ／μｌの濃度で新鮮なプレハイブリダイゼーション緩衝液中に加え
、カバースリップ（ｃｏｖｅｒｓｌｉｐ）した。ハイブリダイゼーションを、加
湿チャンバ内のフィッシャースライド（Ｆｉｓｈｅｒｓｌｉｄｅ）ウォーマー
上で３７℃、１〜３時間実施し、洗浄とシグナル増幅は実施冷１に記載のものと
同じであった。ハイブリダイゼーション後、０．１×ＳＳＣまでの段階的な一連
のＳＳＣで、合計して１５分間の洗浄時間にて切片を洗浄した。ハイブリダイゼ
ーション溶液Ｂ中の１ｆｍｏｌ／μｌの前増幅剤で、２５分間、５５℃にてハイ
ブリダイゼーションを行い、その後０．１×ＳＳＣで総洗浄時間５分間にて３回
の洗浄を行った。ハイブリダイゼーション溶液Ｂ中の１ｆｍｏｌ／μ１の増幅剤
で、２５分間、５５℃にてハイブリダイゼーションを行い、その後０．１×ＳＳ
Ｃにより数回の洗浄を行った。ハイブリダイゼーション溶液Ｂ中の１ｆｍｏｌ／
μｌ標識プローブで、５５℃、１５分間でハイブリダイゼーションを行い、その
後０．１×ＳＳＣ洗浄およびｗａｓｈＤでのインキュベーションを行った。Ｆ
ａｓｔＲｅｄを調製して、その直後、切片に塗布し、そして発色を４分と１０
分との間で止めた。核をヘマトキシリンで染色し、そしてスライドを、顕微鏡の
ためにカバースリップ（ｃｏｖｅｒｓｌｉｐ）した。内因性アルカリホスファタ
ーゼを、１μＭ〜５μＭのレバミゾールを用いて不活性化した。

【００９１】インサイチュハイブリダイゼーションによって、ＨＰＶ−関連細胞変性変化を
有するＣＩＮＩＩ（頚部上皮内の新生物形成）子宮頚部組織（標本番号００Ｂ
０１−６２７，ＣｌｉｎｏｍｉｃｓＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｉ
ｔｔｓｆｉｅｌｄＭＡ）中でＨＰＶ−１６を検出した。各切片における細胞核
をヘマトキシリンで染色した。図５Ａは、子宮頸内膜の扁平上皮中のＨＰＶ−１
６遺伝子発現（染色された領域）の分布を示す。図５Ａ中で囲まれた領域を高倍
率でみると、幾つかの扁平上皮細胞（図５Ｂ）の細胞ゾル中のｔＨＰＶ−１６
ｍＲＮＡの存在が示される。図５Ｃは、図５Ａにおいて囲まれた領域に隣接する
組織切片中の扁平上皮細胞の核の中にＨＰＶ−１６ＤＮＡが検出されたことを
示す。しかし、ＨＰＶ−１８ＤＮＡは隣接する切片で検出されなかった（図５
Ｄ）。予測されたように、ＧＡＰＤＨｍＲＮＡは形質転換領域近くの扁平上皮
全体にわたって検出されなかった（図Ｅ）。図５Ａおよび図５Ｅは、倍率２００
×であるが、図５Ｂ、５Ｃおよび５Ｄは、倍率６００×である。

【００９２】（実施例５：組織病理が保存されるＨＰＶＤＮＡのｂＤＮＡＩＳＨ）実施例４と同様の方法を用いてインサイチュハイブリダイゼーションを実施し
、以下のように、ＨＰＶ関連細胞障害性変化を有する子宮頸組織（標本＃００Ｂ
０１−６２４、ＣｌｉｎｏｍｉｃｓＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｉ
ｔｔｓｆｉｅｌｄＭＡ）におけるＣＩＮＩＩ病変に特有の細胞障害性変化の
領域にＨＰＶ−１６ＤＮＡを検出した。切片中の細胞核を、ヘマトキシリンを
用いて染色した。大きな矢印は、扁平上皮とその下にある支質を分離する基底膜
に沿った連続的な基底細胞を示す。明らかに正常な扁平成熟の領域において、Ｈ
ＰＶ−１６ＤＮＡは検出されず、基底細胞は、基底膜付近に限定され、そして
上皮の先端部分は、特徴的な大きなサイトゾルを有する分化した扁平細胞を主に
含んだ（図６Ａ）。同じ組織切片の付近の領域は、頸部の中程度の形成異常（Ｃ
ＩＮＩＩ）に特有の異常な扁平成熟を示した（図６Ｂ）。この形成異常領域は
、基底細胞の過剰増殖、先端上皮領域における基底細胞と分化した扁平細胞の混
合、ならびにＨＰＶ−１６ＤＮＡの存在（染色された領域）を示した（図６Ｂ
）。より高い倍率は、小さな矢印により示されるように、基底細胞におけるＨＰ
Ｖ−１６ＤＮＡの存在を示した（図６Ｃ）。図６Ａおよび図６Ｂは４００×の
倍率であり、そして図６Ｃは６００×の倍率である。

【００９３】（実施例６：組織における特異性の評価）遺伝子型特異的ＨＰＶプローブおよび実施例４の方法を用いたインサイチュハ
イブリダイゼーションを用いて、ＣＩＮＩＩ組織切片および正常頸部切片にお
いてＨＰＶＤＮＡを検出した。切片中の細胞核をヘマトキシリンを用いて対染
色（ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ）した。染色された領域は、標的核酸（ウイルス
ＤＮＡ（図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｅ、および７Ｆ）または内因性ｍＲＮＡ
（図７Ｇ）のいずれか）の存在を示した。ＨＰＶ−１６ＤＮＡは、ＣＩＮＩ
Ｉ組織＃００Ｂ０１−６２４の扁平子宮頸部上皮において検出された（図７Ａ）
が、ＨＰＶ−１８は検出されなかった。ＨＰＶ−１８ＤＮＡは、図７Ｄに示さ
れるように、ＨＰＶ関連細胞障害性変化を有するＣＩＮＩＩ組織（標本＃００
Ｂ０１−６２５、ＣｌｉｎｏｍｉｃｓＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐ
ｉｔｔｓｆｉｅｌｄＭＡ）において検出されたが、ＨＰＶ−１６は検出されな
かった（図７Ｃ）。予想通り、ＨＰＶ−１８プローブ（図７Ｅ）またはＨＰＶ−
１６プローブ（図７Ｆ）を用いて試験した場合、ＨＰＶＤＮＡは正常な頸部組
織（標本＃Ｈ−１１８８−８８、ＣｌｉｎｏｍｉｃｓＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ
，Ｉｎｃ．，ＰｉｔｔｓｆｉｅｌｄＭＡ）において検出されなかった。予想通
り、内因性ＧＡＰＤＨｍＲＮＡは、正常な頸部組織において検出された（図７
Ｇ）。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明に従うｂＤＮＡＩＳＨ法の模式図である。

【図２】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇおよび２Ｈは、実施例１で得ら
れた結果の顕微鏡画像である（６０×）。

【図３】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄは、実施例２で得られた結果の顕微鏡画像であ
る（６０×）。

【図４】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄは、実施例３で得られた結果の顕微鏡画像であ
る（６０×）。

【図５】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄおよび５Ｅは、実施例４で得られた結果の顕微鏡画
像である。

【図６】図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、実施例５で得られた結果の顕微鏡画像である。

【図７】図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｅ、７Ｆおよび７Ｇは、実施例６で得られた結
果の顕微鏡画像である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者アンタオ，ビンセントピー．アメリカ合衆国カリフォルニア 94704，バークレー，バークレーウェイ 2017 ナンバー11 (72)発明者プレイヤー，オードリーエヌ．アメリカ合衆国メリーランド 20901，シルバースプリングス，ヘロンドライブ 805 (72)発明者カオ，ウェイ中華人民共和国 201103 シャンハイ，グベイニューディストリクト，ロンハーウエストアベニュー，レーン 79，ナンバー11 ジンルハウス，アパートメント 501 Ｆターム(参考） 4B063 QA08 QA19 QA20 QQ03 QQ08 QQ42 QQ53 QR08 QR42 QR56 QS03 QS25 QS34 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】生物学的物質のサンプル中の核酸分析物を検出するための方
法であって、該方法は、インサイチュで該核酸分析物を検出するためにｂＤＮＡ
ハイブリダイゼーションを実施する工程を包含し、ここで、該方法は、該生物学
的物質中の約１〜約１０コピーの該核酸分析物を検出するのに十分な感度を有し
、必要に応じて、細胞中の該核酸分析物の位置の指標として、該生物学的物質の
細胞中での検出された該核酸分析物の位置を同定する工程を包含する、方法。
【請求項２】請求項１に記載の方法であって、以下：（ａ）以下の工程により生物学的物質のサンプルを調製する工程：（ｉ）基質上に前記生物学的物質を固定する工程；（ｉｉ）プロテイナーゼＫを約０．５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌの濃度で
含む溶液に、該基質に結合した生物学的物質を接触させることにより、該基質に
結合した生物学的物質を浸透させる工程；および（ｉｉｉ）必要に応じて、該浸透させた生物学的物質を、任意の二本鎖ＤＮＡ
を変性させるのに効果的な温度に、効果的な時間、加熱する工程；（ｂ）該生物学的物質と標的オリゴヌクレオチドプローブを、ハイブリダイズす
る条件下で接触させる工程であって、ここで、該標的プローブの少なくとも一部
が、前記核酸分析物の少なくとも一部に相補的であり、その結果、該核酸分析物
が該サンプル中に存在する場合、分析物−標的プローブ複合体が形成される、工
程；（ｃ）界面活性剤を含む洗浄液を用いて、約２１℃〜６０℃の範囲の温度で該生
物学的物質を洗浄する工程；および（ｄ）該基質上の任意の分析物−標的プローブ複合体を検出する工程、を包含する、方法。
【請求項３】請求項２に記載の方法であって、ここで、前記工程（ｄ）が
以下：（ｄ）（ｉ）前記洗浄した基質および分析物−標的プローブ複合体を前増幅オリ
ゴヌクレオチドプローブと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程であっ
て、ここで、該前増幅プローブの第１の部分が、前記核酸分析物に相補的である
前記標的プローブの一部以外の該標的プローブの一部と相補的であり、それによ
って、該核酸分析物が前記サンプル中に存在する場合、分析物−標的プローブ−
前増幅プローブ複合体を形成する、工程；（ｄ）（ｉｉ）該工程（ｄ）（ｉ）の生成物と増幅オリゴヌクレオチドプローブ
を、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程であって、ここで、該増幅プロ
ーブの第１の部分が該前増幅プローブの第２の部分と相補的であり、それによっ
て、該核酸分析物が該サンプル中に存在する場合、分析物−標的プローブ−前増
幅プローブ−増幅プローブ複合体を形成する、工程；（ｄ）（ｉｉｉ）該工程（ｄ）（ｉｉ）の生成物と標識オリゴヌクレオチドプロ
ーブを、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程であって、ここで、該標識
プローブの一部が該増幅プローブの第２の部分に結合し、それによって、該核酸
分析物が該サンプル中に存在する場合、分析物−標的プローブ−前増幅プローブ
−増幅プローブ−標識プローブ複合体を形成する、工程；（ｄ）（ｉｖ）該分析物−標的プローブ−前増幅プローブ−増幅プローブ−標識
プローブ複合体を検出可能な標識で標識する工程；および（ｄ）（ｖ）該基質上の該標識の存在を検出する工程、を包含する、方法。
【請求項４】前記核酸分析物が、ＨＩＶＲＮＡ、ＨＩＶＤＮＡ、ＨＣ
ＶＲＮＡ、ＣＭＶＲＮＡ、ＣＭＶＤＮＡ、ＨＰＶＲＮＡ、ＨＰＶＤＮ
Ａ、ＬＡＰ、ＩＬ−２、それらの内因性遺伝子およびセグメントからなる群より
選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】前記基質が、ガラスまたは弾力性プラスチックからなる、請
求項２に記載の方法。
【請求項６】前記プロテイナーゼＫの濃度が約５μｇ／ｍｌ〜約２０μｇ
／ｍｌである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】約０．１ｐｍｏｌ〜１０ｐｍｏｌの前記標的プローブが使用
される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】前記洗浄液中の前記界面活性剤が、親水性界面活性剤である
、請求項２に記載の方法。
【請求項９】前記親水性界面活性剤が非イオン性である、請求項８に記載
の方法。
【請求項１０】前記洗浄液が緩衝溶液である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】前記緩衝溶液が、アルカリ金属の塩を含む、請求項１０に
記載の方法。
【請求項１２】前記工程（ｃ）が、少なくとも１回繰り返される、請求項
２に記載の方法。
【請求項１３】前記工程（ｃ）が、少なくとも２回繰り返される、請求項
１２に記載の方法。
【請求項１４】前記工程（ｃ）が、約２１℃〜約６０℃で実施される、請
求項２に記載の方法。
【請求項１５】約１ｆｍｏｌ〜約１０ｐｍｏｌの前記前増幅オリゴヌクレ
オチドプローブが使用される、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】約１ｆｍｏｌ〜約１０ｐｍｏｌの前記増幅オリゴヌクレオ
チドプローブが使用される、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】前記標識オリゴヌクレオチドプローブが、アルカリホスフ
ァターゼを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１８】アルカリホスファターゼ基質が、前記標識の存在を検出す
るために添加される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】１〜約１０コピーの前記核酸分析物を検出するのに十分な
感度を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】１〜約２コピーの前記核酸分析物を検出するのに十分な感
度を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】前記生物学的サンプルが、細胞を含む、請求項２に記載の
方法。
【請求項２２】前記細胞が、血漿、血清、脊脊髄液、精液、リンパ液、皮
膚の外側切片、気道の分泌物、腸管の分泌物、尿生殖器管の分泌物、涙、唾液、
乳汁、血液細胞、腫瘍、器官、およびインビトロ細胞培養構成成分からなる群よ
り単離される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】前記細胞が、副腎細胞、膀胱細胞、骨髄細胞、脳細胞、乳
房細胞、心臓細胞、結腸細胞、食道細胞、腸細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、肺細胞
、リンパ節細胞、神経細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、前立腺細胞、骨格筋細胞、平
滑筋細胞、脾臓細胞、胃細胞、精巣細胞、扁桃細胞、気管細胞、および子宮細胞
からなる群より選択される請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】前記工程（ａ）（ｉ）が、遠心分離機を用いて実施される
、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】前記生物学的サンプルが、組織を含む、請求項２に記載の
方法。
【請求項２６】前記組織が、副腎組織、膀胱組織、骨髄組織、脳組織、乳
房組織、心臓組織、結腸組織、食道組織、腸組織、腎臓組織、肝臓組織、肺組織
、リンパ節組織、神経組織、卵巣組織、膵臓組織、前立腺組織、骨格筋組織、平
滑筋組織、脾臓組織、胃組織、精巣組織、扁桃組織、気管組織、および子宮組織
からなる群より選択される請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】前記工程（ａ）（ｉ）が、組織切片を用いて実施される、
請求項２５記載の方法。
【請求項２８】請求項１に記載の方法であって、ここで、前記核酸分析物
の位置が同定され、該方法は、以下：（ａ）以下の工程により生物学的物質のサンプルを調製する工程：（ｉ）基質上に前記生物学的物質を固定する工程；（ｉｉ）プロテイナーゼＫを約０．５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌの濃度で
含む溶液に、該基質に結合した生物学的物質を接触させることにより、該基質に
結合した生物学的物質を浸透させる工程；および（ｉｉｉ）必要に応じて、該浸透させた生物学的物質を、任意の二本鎖ＤＮＡ
を変性させるのに効果的な温度に、効果的な時間、加熱する工程；（ｂ）該生物学的物質と標的オリゴヌクレオチドプローブを、ハイブリダイズす
る条件下で接触させる工程であって、ここで、該標的プローブの少なくとも一部
が、該核酸分析物の少なくとも一部に相補的であり、その結果、該核酸分析物が
該サンプル中に存在する場合、分析物−標的プローブ複合体が形成される、工程
；（ｃ）界面活性剤を含む洗浄液を用いて、約２１℃〜６０℃の範囲の温度で該生
物学的物質を洗浄する工程；（ｄ）該基質上の任意の分析物−標的プローブ複合体を検出する工程；および（ｅ）前記細胞中の該核酸分析物の位置の指標として、該生物学的サンプルの細
胞中での該分析物−標的プローブ複合体の位置を同定する工程、を包含する、方法
【請求項２９】前記核酸分析物が、ＨＩＶＲＮＡ、ＨＩＶＤＮＡ、Ｈ
ＣＶＲＮＡ、ＣＭＶＲＮＡ、ＣＭＶＤＮＡ、ＨＰＶＲＮＡ、ＨＰＶＤ
ＮＡ、ＬＡＰ、ＩＬ−２、それらの内因性遺伝子およびセグメントからなる群よ
り選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】前記感度が、１〜約２コピーの前記核酸分析物を検出する
のに十分である、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】前記生物学的物質が、細胞を含む、請求項１に記載の方法
。
【請求項３２】前記細胞が、血漿、血清、脊脊髄液、精液、リンパ液、皮
膚の外側切片、気道の分泌物、腸管の分泌物、尿生殖器管の分泌物、涙、唾液、
乳汁、血液細胞、腫瘍、器官、およびインビトロ細胞培養構成成分からなる群よ
り単離される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】前記細胞が、副腎細胞、膀胱細胞、骨髄細胞、脳細胞、乳
房細胞、心臓細胞、結腸細胞、食道細胞、腸細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、肺細胞
、リンパ節細胞、神経細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、前立腺細胞、骨格筋細胞、平
滑筋細胞、脾臓細胞、胃細胞、精巣細胞、扁桃細胞、気管細胞、および子宮細胞
からなる群より選択される請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】前記生物学的サンプルが、組織を含む、請求項１に記載の
方法。
【請求項３５】前記組織が、副腎組織、膀胱組織、骨髄組織、脳組織、乳
房組織、心臓組織、結腸組織、食道組織、腸組織、腎臓組織、肝臓組織、肺組織
、リンパ節組織、神経組織、卵巣組織、膵臓組織、前立腺組織、骨格筋組織、平
滑筋組織、脾臓組織、胃組織、精巣組織、扁桃組織、気管組織、および子宮組織
からなる群より選択される請求項３４に記載の方法。