CN112831599B - 一种基于信号放大技术的CoVID-19病毒检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种基于信号放大技术的CoVID‑19病毒检测试剂盒。本发明通过捕获探针与新冠病毒的RNA特定区域杂交后被微孔板上固定的通用引物捕获住，标记探针与新冠病毒的RNA特定区域杂交后留下初级放大探针接头，初级放大探针接头与预放大探针杂交并留下次级放大接头，次级放大接头与放大探针杂交留下报告探针接头，报告探针接头与报告探针杂交留下被标记上的碱性磷酸酶，碱性磷酸酶催化底物发光形成光信号被超敏PMT检测系统检测到。本方案采用了级联探针杂交逐级杂交的办法将检测信号放大至仪器可测定的范围内，基于上述，本发明提供了一种1600X的信号放大方案极大的增强了信号放大倍数，提升检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种基于信号放大技术的CoVID-19病毒检测试剂盒。
背景技术
新冠肺炎是一种高致病性的下呼吸道病毒感染疾病，引起疾病的病原体为Sars-cov2 冠状病毒，冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS) 和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现 的冠状病毒新毒株。感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸 困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法。但许多症状是可以处理的，因此需根据患者临床情况进行治疗。此外，对感染者的辅助护理可能非常有效。统一分为“疑似病例”和“确诊病例”两类。
疑似病例判定分两种情形。一是“有流行病学史中的任何一条，且符合临床表现中任意2条(发热 和/或呼吸道症状；具有上述肺炎影像学特征；发病早期白细胞总数正常或降低，淋巴细胞计数减少)。 二是“无明确流行病学史的，且符合临床表现中的3条(发热和/或呼吸道症状；具有上述肺炎影像学特 征；发病早期白细胞总数正常或降低，淋巴细胞计数减少)。
确诊病例需有病原学证据阳性结果(实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性；或病毒基因测 序，与已知的新型冠状病毒高度同源)。
早期有些应急审批的核酸检测试剂厂家采用了生理盐水保存运输拭子样本，这种非灭活的病毒保存 方式往往给实验室操作者带来了巨大的操作风险，为了降低直接接触病毒风险，操作者都是将样本置入 56度水浴锅中灭活30分钟，这种常规操作可以有效灭活病毒，但是也给病毒本来脆弱的病毒单链RNA 造成了极大的破坏，造成了可检测的靶标物急剧减少。
现有技术中，实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸假阴性问题来源主要包括：
第一、不合理的取样方式；
第二、没有明确的样本保存液方案；
第三、抽提带来的样本耗损过大；
第四、RT-PCR技术本身的缺陷，检测扩增区域有限，通常只有200bp左右，比如不能克服病毒变 异导致的假阴性结果。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种基于信号放大技术的CoVID-19病毒检测试剂盒。相对于传统的 RT-PCR检测技术，本发明采用了分支链DNA信号放大技术检测新新冠状病毒，方法学上 属于独创，能够避免核酸扩增过程中产生的气溶胶带来的污染，以及节省大量的样本制备 时间，不受场地限制，可以在普通P2以下级别实验室操作。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了探针组合，包括捕获探针，所述捕获探针具有：
(I)、如SEQ ID No.1～395任一项所示的核苷酸序列；
(II)、如(I)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(III)、与(I)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的探针组合还包括预放大探针、放大探针和/ 或探针标记物。
基于上述研究，本发明还提供了所述的探针组合在制备病毒检测试剂或试剂盒中的应 用。
基于上述研究，本发明还提供了所述的探针组合在级联信号放大中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述捕获探针杂交的温度为55℃±3℃，时间为150min±15min。
在本发明的一些具体实施方案中，所述预放大探针杂交的温度为55℃±3℃，时间为 50±15min。
在本发明的一些具体实施方案中，所述放大探针杂交的温度为55℃±3℃，时间为50 ±15min。
在本发明的一些具体实施方案中，所述探针标记物的报告探针标记温度为50℃±3℃， 时间为50±15min。
在本发明的一些具体实施方案中，底物发光的温度为30℃±7℃，时间为30±5min。
本发明还提供了样本保存液，以重量含量计，包括如下组分：
基于上述，本发明还提供了所述的样本保存液在制备病毒检测试剂或试剂盒中的应 用。
泵重要的是，本发明还提供了病毒检测的试剂或试剂盒，其特征在于，包括所述的探 针组合和/或所述的样本保存液以及可接受的助剂。
此外，本发明还提供了病毒检测的方法，以所述的样本保存液提取保存病毒核酸，经 所述的探针组合级联放大检测。
本发明针对性开发了样本保存液，病毒保存液采用高浓度的胍盐将拭子采集的病毒蛋白质一次破 裂灭活变性，同时高浓度的胍盐有效的抑制了样本中Rnase酶活性，使得的病毒RNA能够极大程度保 持完整。
针对病毒抽RNA提过程，目前两家商业化试剂盒厂家的产品对比，通过我们的对国产T厂家 (DP315)、进口K厂家的病毒核酸提取试剂盒(52906)的提取效率对比表明，国产T厂家的提取效 率只有进口K厂家试剂盒的一半，二者使用的硅胶吸附柱有很大的区别，我们团队采用的E厂家提取 柱，提取效率与进口K厂家接近，可最大程度保证核酸的回收率，降低使用成本。
本发明的探针检测覆盖区域达到了12.2K，基本上覆盖了病毒29.6K基因组的大部分区域，特异 性的针对ORF1ab(8.3K)、S(2.6K)、N(1.3K)区域设计了针对性的引物序列，不会因为像PCR 技术因为单位点或多位点SNP突变导致检测漏诊，覆盖区域详见图1。
本发明还提供了一种增强型的1600X信号放大方案，传统分支链信号放大技术，由于技术限制， 只能制备出来256X(Siemens)左右的放大系统，本发明突变现有技术瓶颈，提供了一种1600X的信 号放大方案极大的增强了信号放大倍数，提升检测灵敏度。检测原理如图2所示。
综上，相对于传统的RT-PCR检测技术，本发明采用了分支链DNA信号放大技术检测新新冠状 病毒，方法学上属于独创，能够避免核酸扩增过程中产生的气溶胶带来的污染，以及节省大量的样本制 备时间，不受场地限制，可以在普通P2以下级别实验室操作。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需 要使用的附图作简单地介绍。
图1示本发明提供的探针检测覆盖区域；
图2示增强型的1600X信号放大方案的基本原理；
图3示样本处理流程；
图4示检测流程图；
图5示全自动检测仪。
具体实施方式
本发明公开了一种基于信号放大技术的CoVID-19病毒检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文 内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显 而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人 员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来 实现和应用本发明技术。
针对性开发了样本保存液，病毒保存液采用高浓度的胍盐将拭子采集的病毒蛋白质一次破裂灭活变 性，同时高浓度的胍盐有效的抑制了样本中Rnase酶活性，使得的病毒RNA能够极大程度保持完整。
样本保存液包括如下质量百分含量的组分：
| 试剂名称 | 硫氰酸胍 | 三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐 | 月桂酰基肌氨酸钠 | 消泡剂浓缩液 |
| 试剂加量 | 30％-40％ | 0.2‰-0.5‰ | 4‰-6‰ | 0.00‰-0.005‰ |
| 试剂名称 | 三(羟甲基)氨基甲烷 | 乙二胺四乙酸二钠盐二水 | 乙醇(无水) | 纯化水 |
| 试剂加量 | 1％-3％ | 1％-3％ | 10％-20％ | 40％-50％ |
本发明还提供了探针序列。探针检测覆盖区域达到了12.2K，基本上覆盖了病毒29.6K基因组的大 部分区域，特异性的针对ORF1ab(8.3K)、S(2.6K)、N(1.3K)区域设计了针对性的引物序列，不 会因为像PCR技术因为单位点或多位点SNP突变导致检测漏诊，覆盖区域详见图1。
本发明还提供了一种增强型的1600X信号放大方案，传统分支链信号放大技术，由于技术限制， 只能制备出来256X(Siemens)左右的放大系统，本发明突变现有技术瓶颈，提供了一种1600X的信 号放大方案极大的增强了信号放大倍数，提升检测灵敏度。具体原理如下：
1.杂交捕获目的RNA：检测探针主要是由CP、BP、BL三个探针组成。检测探针(Target Probe) 中CPs和BPs杂交结合在目的RNA上。通过包被探针杂交捕获结合了目的RNA的CPs，使之固定在 96孔平板底部。BL用于降低非特异性结合。
2.预放大分子结合：加入预放大分子(Pre-Amplifier)后，每个预放大分子杂交结合两个相邻的BPs 检测探针(Target Probe)，形成双Z结构。预放大分子只有和两个相近的BP杂交，才能形成稳定的杂 交结构。每个病毒RNA上可以结合若干个预放大分子，信号被放大。
3.放大分子结合：加入放大分子(Amplifier)，放大分子选择性的杂交结合预放大分子 (Pre-Amplifier)，形成分枝状结构。每一条预放大分子上可以结合40个放大分子，信号得到进一步 的放大。
4.探针标记物结合：加入含碱性磷酸酶的探针标记物(Label Probe)，连接了碱性磷酸酶的探针标 记物(Label Probe)杂交结合放大分子(Amplifier)。每一个放大分子上可以结合40个探针标记物， 使信号更进一步被放大。
5.生成化学发光信号：添加底物，与探针标记物(Label Probe)上的碱性磷酸酶反应，产生化学发 光信号，光的强弱与目的RNA(Target RNA)的量成正相关，通过化学发光检测仪光信号强弱可以反 应捕获目的RNA(Target RNA)的量，光信号以相对光子数(RLU)表示。
基本原理如图2所示。
本发明通过设计与新型冠状病毒基因组互补的探针序列，捕获探针与新冠病毒的RNA特定区域杂 交后被微孔板上固定的通用引物捕获住，标记探针与新冠病毒的RNA特定区域杂交后留下初级放大探 针接头，初级放大探针接头与预放大探针杂交并留下次级放大接头，次级放大接头与放大探针杂交留下 报告探针接头，报告探针接头与报告探针杂交留下被标记上的碱性磷酸酶，碱性磷酸酶催化底物发光形 成光信号被超敏PMT检测系统检测到。本方案采用了级联探针杂交逐级杂交的办法将检测信号放大至 仪器可测定的范围内。此外，针对性开发了样本保存液，病毒保存液采用高浓度的胍盐将拭子采集的病 毒蛋白质一次破裂灭活变性，同时高浓度的胍盐有效的抑制了样本中Rnase酶活性，使得的病毒RNA 能够极大程度保持完整。
本发明提供的探针组合、样本保存液以及试剂盒中，所用的原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1样本保存液
实施例2样本保存液
| 硫氰酸胍 | 39％ |
| 三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐 | 0.35‰ |
| 月桂酰基肌氨酸钠 | 5.6‰ |
| 消泡剂浓缩液 | 0.045‰ |
| 三(羟甲基)氨基甲烷 | 2.3％ |
| 乙二胺四乙酸二钠盐二水 | 2.6％ |
| 乙醇(无水) | 18％ |
| 纯化水 | 48％ |
实施例3样本保存液
| 硫氰酸胍 | 40％ |
| 三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐 | 0.5‰ |
| 月桂酰基肌氨酸钠 | 6‰ |
| 消泡剂浓缩液 | 0.005‰ |
| 三(羟甲基)氨基甲烷 | 3％ |
| 乙二胺四乙酸二钠盐二水 | 3％ |
| 乙醇(无水) | 20％ |
| 纯化水 | 50％ |
实施例4样本处理
1、使用实施例1～3提供的的样本保存液将采集到样本的拭子浸没折断，样本运到试验后进行表面 消毒处理，通风放置30min后进行下一步实验；
2、取300μl样本与等体积乙醇混合，再加入3μg的carrier RNA，旋涡震荡；
3、将全部的样本混合物加载到提取柱上，然后进行6000g离心1min左右；
4、干燥柱子，并再次使用13400g离心3min左右；
5、使用100μl的样品加载溶液洗脱柱子，然后室温放置5min，左后6000g离心1min后收集样品 待用。
实施例5探针设计
注：CP，英文全称为capture extender，LP又名BP，标记探针的缩写(biaojiprobe)。
预放大序列：5-AAAACGGTAACTTCTGTACGTAGCTAGGT-TGTGTG(间
隔)-GAACGTACGTACTACGACGACTTG(20次重复)-3；
放大序列：5-CAAGTCGTCGTAGTACGTACGTTC-TGTGTG(间隔)-AGGTCTGTGTACGTATTGCTT(20 次重复)-3；
探针标记物序列：5-AAGCAATACGTACACAGACCTL(氨基修饰)T-3。
实施例6检测
试剂盒内组分：
包被板:
将包被探针使用DNA coating Solution(pH6.1)和1×TE缓冲液(pH8.0)1:1混合后稀释至3μg/μL 后120μL包被后18-30℃包被18-24h，洗板4次后干燥过夜，装袋。
预放大/放大分子:
利用Exonuclease III(E.coli)不能切割硫代磷酸酯键，将目的序列的一端通过DNA聚合酶I(Klenow) 引入硫代磷酸核苷酸保护起来，进行单向酶切，从而得到单链目的序列，使用TE稀释到合适浓度。
探针标记物:
将1,4-亚苯基二硫代异氰酸酯/N,N-二甲基甲酰胺活化后的引物与符合纯度且达到活性要求的碱性 磷酸酶避光过夜进行链接反应，次日用阴离子交换柱将链接成功的混合物部分分离出来，再用保存液稀 释到所需要的浓度进行保存。
裂解液:
裂解液由Hepes钠盐1％-2％,hepes酸1％-2％，十二烷基硫酸锂5％-10％，乙二胺四乙酸0.1％-0.3％， 氯化锂5％-6％，Proclin 3000.02％等配制而成。
蛋白酶K:
蛋白酶K由甘油50％-70％，1M Tris-HCl 1％-3％,氯化钙二水0.1％-0.5％，蛋白酶K冻干粉1％-3％， Proclin 3000.02％等配制而成。
封闭反应液:
由含5％封闭阻断剂的马来酸溶液等配制而成。
2019-nCoV捕获探针:
将引物用TE稀释至0.1nmol/μL后按照一定比例混合而成。
2019-nCoV标记探针:
将引物用TE稀释至0.1nmol/μL后按照一定比例混合而成。
放大/探标稀释液:
Hepes钠盐1％-3％，hepes酸1％-5％，氯化锂2％-5％，十二烷基硫酸锂1％-2％，
L23溶液 5％-10％，1M氯化镁溶液0.1％-0.5％,封闭阻断剂1‰-5‰，Proclin3000.02％等配制而成。
洗脱液:
洗脱液由十二烷基硫酸锂0.1‰-0.5‰，氯化钠0.5‰-1‰，柠檬酸三钠二水0.2‰-0.4‰，Proclin300 0.02％等配制而成。
样品加载缓冲液:
50mM PH 7.5的Tris-Hcl。
各步骤反应条件如下(每孔)：
捕获探针杂交反应体系设置如下：
| 试剂组分 | 体积 |
| 样本 | 45±5ul |
| 捕获探针(CP、BP、BL) | 1ul |
| 封闭反应液 | 1ul |
| 裂解液 | 34±5ul |
| 蛋白酶K | 3±2ul |
| Tris | 11ul±5ul |
预放大探针杂交反应体系设置如下：
| 试剂组分 | 体积 |
| 放大/探标稀释液 | 100ul |
| 预放大探针 | 1ul |
放大探针杂交反应体系设置如下：
标记探针杂交反应体系设置如下：
| 试剂组分 | 体积 |
| 放大/探标稀释液 | 100ul |
| 标记探针 | 1ul |
底物反应体系设置如下：
| 试剂组分 | 体积 |
| 底物液(购自lumigen，CAT#P7001) | 100ul |
反应步骤设置：
操作步骤：
样本采集：参见《新冠肺炎诊疗指南》样本取样规范的部分内容。
使用本公司核酸提取试剂盒(豫郑械备20200211号)进行样本处理：①从样本保存液样本中取 300uL，加3uL carrier RNA，300uL无水乙醇(自备)，充分混匀。简短离心后全部转移至吸附柱(放 在收集管上)，盖上管盖，离心力在6000g左右1min。②干燥吸附柱，离心力在13400g左右3min，弃 废液。④室温干燥3min。③洗脱，用样品加载缓冲液洗脱离心柱，室温放置5min，离心6000xg 1min。 收集样品待用。
使用其他厂家病毒保存液的样本处理：按照郑州科蒂亚生物的核酸提取试剂(豫郑械备20200228 号)、天根生化科技(北京)有限公司的核酸提取或纯化试剂(京昌械备20200005号)进行提取后待 用。
反应体系样本工作缓冲液配制：
表1
| 2019-nCoV捕获探针 | 1μL |
| 2019-nCoV标记探针 | 1μL |
| 封闭反应液 | 1μL |
| 蛋白酶K | 3μL |
| 裂解液 | 34μL |
| 样品加载缓冲液 | 10μL |
1.加样：
样本孔用微量移液器依次加入50μL体积的样本处理步骤中的样本，留8孔分别做空白对照6孔(每 孔加入50μL样本加载缓冲液)，阳性质控2孔(各加入50μL以每孔10uL阳性质控品+40uL样品加载 缓冲液稀释的阳性质控品)。随即每孔分别加入样本工作缓冲液50μl。轻轻振荡混匀，加样完成后用 封板贴纸(或石蜡油)密封包被板，再55℃(振荡)温育2.5小时。
2.信号放大：
2.1预放大分子工作液配制：
取出预放大分子冰上融解，混匀、离心；取预放大分子与放大探标稀释液按照体积比1：100混匀 后备用(放大分子工作液和探针标记物工作液配制同此方法)。整个实验每人份需预放大分子工作液 100μL。配制方法见表2：
表2预放大分子/放大分子/探针标记物工作液配制表
注：额外量*(例)包括实验正常试剂损耗量(如移液器枪头试剂残留、配制过程中产生的泡沫等)以 及6孔空白孔和各2孔阳性质控孔用量。
2.2洗板：将包被板从恒温箱中取出，快速弃去板内液体，用洗脱液洗板，200μL/孔，重复洗3次。 洗板后在干净的吸水纸上拍干(洗板过程可选用洗板机洗板)。
2.2加入预放大分子工作液(配制方法见表2)：每孔加入100μL，用封板贴纸(或石蜡油)密封， 放置恒温箱55℃，温育50分钟。
2.4洗板：将包被板从恒温箱中取出，快速弃去板内液体，用洗脱液洗板，200μL/孔，重复洗3次。 洗板后在干净的吸水纸上拍干(洗板过程可选用洗板机洗板)。
2.5加入放大分子工作液(配制方法见表2)：每孔加入100μL，用封板贴纸(或石蜡油)密封， 放置恒温箱55℃，温育50分钟。
2.6洗板：将包被板从恒温箱中取出，快速弃去板内液体，用洗脱液洗板，200μL/孔，重复洗3次。 洗板后在干净的吸水纸上拍干(洗板过程可选用洗板机洗板)。
2.7加入探针标记物工作液(配制方法见表2)：每孔加入100μL，用封板贴纸(或石蜡油)密封， 放置恒温箱50℃，温育30分钟。
2.8底物工作液配制：
底物工作液配制：取出底物常温复温备用。整个实验每人份需底物工作液100μL。
2.9洗板：将包被板从恒温箱中取出，快速弃去板内液体，用洗脱液洗板，200μL/孔，重复洗5次。 洗板后在干净的吸水纸上拍干(洗板过程可选用洗板机洗板)。
2.10加入底物工作液：每孔加入100μL，用封板贴纸密封，放置恒温箱37℃，温育20分钟。
2.11化学发光免疫分析仪读数：将包被板从恒温箱取出，室温放置5min。揭开封板贴纸，放入化 学发光免疫分析仪读数，计算结果(检测结果RLU取LOG运算/空白RLU取LOG运算的平均值)。
效果例1
实验组(QuantiMAT组)选用本发明实施例1制备的样本保存液按照实施例4的样本处理方法和 实施例5提供的探针，根据实施例6记载的检测条件进行检测。
对照组：QPCR组。
实验组与对照组均按照说明书严格操作。具体步骤详见使用说明书
QuantiMAT与qPCR方法的数据对比：
表3
结果统计分析：
表4
| 统计分析 | 金标准 | QuantiMAT2.0 | QPCR | 小结 |
| 临床阳性 | 16 | 12 | 14 | 灵敏度75％，特异性100％ |
| 临床阴性 | 4 | 8 | 6 | 灵敏度87.5％，特异性67％ |
QuantiMAT组
| X2 | 0.317460 | 校正X2 | 0.044643 | |
| P | 0.573138 | P | 0.832662 |
QPCR组
| X2 | 0.134680 | 校正X2 | 0.000000 | |
| P | 0.713628 | P | 1.000000 |
由于QuantiMAT技术无扩增，不会造成假阳性，特异性明显优于QPCR组。
效果例2在高通量设备QM500的实验数据
实验方法同效果例1。本案例采用临床已知结果的样本作为全自动与手动实验的对比(<1.1作为阈 值)：
表5
表6
| (全自动与手工对比) | 40 |
| 符合个数 | 38 |
| 不符合数 | 1 |
| 符合率 | 98％ |
| 不符合率 | 2％ |
全自动完全可以替代手动实验，提高筛查效率，提升检测通量。
效果例3
针对病毒抽RNA提过程，目前两家商业化试剂盒厂家的产品对比，通过我们的对国产T厂家 (DP315)、进口K厂家的病毒核酸提取试剂盒(52906)的提取效率对比表明，国产T厂家的提取效 率只有进口K厂家试剂盒的一半，二者使用的硅胶吸附柱有很大的区别，我们团队采用的E厂家提取 柱，提取效率与进口K厂家接近，可最大程度保证核酸的回收率，降低使用成本。
提取试剂盒厂家对比验证
表7
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离 本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 郑州科蒂亚生物技术有限公司
<120> 一种基于信号放大技术的CoVID-19病毒检测试剂盒
<130> MP2006836
<160> 395
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 1
gcacttacac cgcaaacccg tttttatcga gcagcgagct a 41
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<212> DNA
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<400> 2
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
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<211> 54
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 17
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<210> 18
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 18
gaattcatcc atagctaatt ctaagaaatc aattttttta tcgagcagcg agcta 55
<210> 19
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 19
caacaaaatc atcaagtaat aaatcaataa catttttatc gagcagcgag cta 53
<210> 20
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 20
cagagacaaa gtcattaaga tctgaatctt tttatcgagc agcgagcta 49
<210> 21
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 21
cctttactaa gaagagataa aatcatatct ttttatcgag cagcgagcta 50
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 22
cgcacggtgt aagacgggct tttttaccta gctacgtaca 40
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 23
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<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 25
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
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<211> 44
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
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<210> 30
<211> 44
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
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gacgaggtct gccattgtgt atttattttt gaagttaccg tttt 44
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<400> 31
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<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 32
ttgtatgtga caagtatttc ttttaatgtg tcatttttga agttaccgtt tt 52
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<211> 52
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<210> 40
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cccaatattt aaaataacgg tcaaagagtt ttatttttga agttaccgtt tt 52
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<210> 50
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<400> 52
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 59
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 61
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 63
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<400> 68
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 72
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<400> 73
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
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<400> 97
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 99
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<211> 47
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 100
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 101
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 102
gccaatgtac acatagtgct tagcattttt gaagttaccg tttt 44
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 103
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<211> 42
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<400> 104
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<400> 107
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<400> 108
gtcaacaatt tcagcaggac aacgtttttg aagttaccgt ttt 43
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
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<211> 44
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 113
ccaagcaggg ttacgtgtaa ggaattttta cctagctacg taca 44
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 114
taaggtgaaa taaagacagc ttttcttttt tacctagcta cgtaca 46
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<211> 48
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caacagtttg agttggtagt cccaaaattt tttacctagc tacgtaca 48
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<211> 46
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 117
gtcatattct gagccctgtg atgaattttt tacctagcta cgtaca 46
<210> 118
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 118
gtttcagtgg tttgagtgaa tatgacatat ttttgaagtt accgtttt 48
<210> 119
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 119
cattaaatct gtttacatta caagagtgag cttttttacc tagctacgta ca 52
<210> 120
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 120
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<210> 121
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 121
ggtctctatc agacattatg caaagtattt tttacctagc tacgtaca 48
<210> 122
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 122
tttcaagact tgtaaattgc aacttgtcat aaatttttga agttaccgtt tt 52
<210> 123
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 123
gtcctgttac attttcagct tgtattttta cctagctacg taca 44
<210> 124
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 124
ccagtgatta ccttactaca atctttaaag atttttgaag ttaccgtttt 50
<210> 125
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 125
gtaggtgcct gtgtaggatg taacttttta cctagctacg taca 44
<210> 126
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 126
tttgaattta gtgtcaacac tgaggtgttt tttacctagc tacgtaca 48
<210> 127
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 127
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<211> 39
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<211> 48
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
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<211> 49
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 130
ggtaaccatt aacttgataa ttcattttaa tttttgaagt taccgtttt 49
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<211> 44
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 165
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<211> 44
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 166
ctcacatgga ctgtcagagt aatagttttt gaagttaccg tttt 44
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
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<211> 48
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 176
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<400> 177
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
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gcaaccactg tcttaaaaca gctgtttttt acctagctac gtaca 45
<210> 210
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
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gacaagcagc gtacccgtag tttttgaagt taccgtttt 39
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
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<210> 212
<211> 47
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 212
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<211> 48
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
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<210> 214
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
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<210> 215
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 215
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<210> 216
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 216
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<211> 49
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catccaatta aaaatgcttc agatgatgac tttttgaagt taccgtttt 49
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<211> 46
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 221
gttcgcgtgg tttgccaaga taattatttt tacctagcta cgtaca 46
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<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 222
gtaatttgca tgcatgacat aaccatctat tttttttacc tagctacgta ca 52
<210> 223
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 223
cagcagtacc ccttaattta agggttttta cctagctacg taca 44
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<211> 48
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cttcttgggt gtttttgtct t 21
Claims (1)
1.一种基于信号放大技术的COVID-19病毒检测的试剂或试剂盒，其特征在于，包括探针组合、裂解液、蛋白酶K和样本保存液以及可接受的助剂；
所述探针组合包括捕获探针，所述捕获探针为如SEQ ID No.1~395所示的核苷酸序列；
所述样本保存液，以重量含量计，包括如下组分：
硫氰酸胍 30%~40%；
三-（2-甲酰乙基）膦盐酸盐 0.2‰~0.5‰；
月桂酰基肌氨酸钠 4‰~6‰；
消泡剂浓缩液 0.00‰~0.005‰；
三(羟甲基)氨基甲烷 1%~3%；
乙二胺四乙酸二钠盐二水 1%~3%；
无水乙醇 10%~20%；
纯化水 40%~50%；
所述裂解液包括：Hepes钠盐1%-2%,hepes酸1%-2%，十二烷基硫酸锂5%-10%，乙二胺四乙酸0.1%-0.3%，氯化锂5%-6%，Proclin 300 0.02%；
所述蛋白酶K包括甘油50%-70%，1M Tris-HCl 1%-3%，氯化钙二水0.1%-0.5%，蛋白酶K冻干粉1%-3%，Proclin 300 0.02%；
还包括预放大探针、放大探针和探针标记物；
所述预放大探针序列为：5-AAAACGGTAACTTCTGTACGTAGCTAGGT-TGTGTG间隔-GAACGTACGTACTACGACGACTTG20次重复-3；
所述放大探针序列为：5-CAAGTCGTCGTAGTACGTACGTTC-TGTGTG间隔-AGGTCTGTGTACGTATTGCTT20次重复-3；
所述探针标记物序列：5-AAGCAATACGTACACAGACCTL氨基修饰T-3。
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| 王传新 等.第十章.《现代检验医学技术及质量控制》.山东科学技术出版社,2004,第113-114页. * |
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