ES2287134T3 - Procedimiento para la deteccion y localizacion de genes in situ usando hibridacion de adn ramificado. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para la detección in situ de un analito de ácido nucleico dentro de una muestra de material biológico que comprende realizar la hibridación de ADNr que comprende las etapas de: (a) preparar una muestra de material biológico: (i) inmovilizando el material biológico sobre un sustrato; (ii) permeabilizando el material biológico unido a sustrato poniendo en contacto el material biológico unido a sustrato con una disolución que contiene Proteinasa K a una concentración de 0, 5 mig/ml a 50 mig/ml; (iii) tratando la muestra con ARNasa de manera que se elimine todo el ARN en la muestra; y (iv) calentando el material biológico permeabilizado hasta una temperatura y durante un periodo de tiempo eficaces para desnaturalizar cualquier ADN de cadena doble.
Description
Procedimiento para la detección y localización
de genes in situ usando hibridación de ADN ramificado.
Esta invención se refiere generalmente a la
química de ácidos nucleicos y ensayos bioquímicos. Más
particularmente, la invención se refiere a procedimientos sumamente
sensibles para la detección in situ de un analito de ácido
nucleico. El procedimiento emplea oligosondas de ADN ramificado y
técnicas de hibridación para detectar e identificar la ubicación de
un analito de ácido nucleico dentro de una muestra biológica.
Se ha usado la tecnología de amplificación de
señales de ADN ramificado (ADNr) extensamente en un formato de
micropocillos para detectar y cuantificar secuencias de ácido
nucleico específicas. Urdea et al. (2000)
Branched-DNA (bDNA) Technology. En Kessler C., ed.,
Nonradioactive Analysis of Biomolecules, Nueva York,
Springer-Verlag: 388-395. Puede
aplicarse un ADNr inherentemente cuantitativo y sumamente
reproducible a la detección de cualquier diana de ácido nucleico
para la que se conoce una secuencia sin el uso de sondas
radiactivas.
Se han desarrollado varios ensayos de ADNr para
la cuantificación de ácidos nucleicos virales. Estos incluyen: ARN
del virus de inmunodeficiencia humano tipo 1
(VIH-1), Kern et al. (1996) J Clin Microbiol
34:3196-3203; ARN del virus de inmunodeficiencia
del simio (VIS), Sodora et al. (1998) AIDS Res Hum
Retroviruses 14:171-181; ADN del virus de la
hepatitis B (VHB), Hendricks et al. (1995) Am J Clin Pathol
104:537-546; ARN del virus de la hepatitis C (VHC),
Detmer et al. (1996) J Clin Microbio
34:901-907; ARN del virus de la hepatitis G (VHG),
Brandhagen et al. (1999) Am J Gastroenterol
94:1000-1005; y ADN de citomegalovirus (CMV),
Chernoff et al. (1997) J Clin Microbiol
35:2740-2744.
Más recientemente, se ha usado la tecnología de
ADNr para detectar y medir la expresión de ARNm celulares,
incluyendo: citocinas, Breen et al. (1997) Cell Immunol
178:91-98 y Shen et al. (1998) J Immunol
Methods 215:123-134; receptores de progesterona y
estrógenos, Nargessi et al. (1998) Breast Cancer Res Treat
50:47-55 y Nargessi et al. (1998) Breast
Cancer Res Treat 50:57-62; insulina, Wang et
al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94:4360-4365;
glucoquinasa, Cabrera-Valladares et al.
(1999) Endocrinology 140:3091-3096;
c-fos, Shyamala et al. (1999) Anal Biochem
266:140-147; y aP2, Burris et al. (1999) Mol
Endocrinol 13:410-417. Todos estos ensayos de ADNr
se desarrollaron para medir ácidos nucleicos en suero, plasma o
lisados celulares. Sin embargo, ninguno de estos estudios sugiere
ni describe un ensayo de ADNr para la detección de ácidos nucleicos
en tejidos o células morfológicamente intactos.
En cambio, un ensayo de hibridación in
situ (HIS) tendría necesariamente la capacidad de detectar
secuencias de ácido nucleico específicas en tejidos o células
morfológicamente intactos. Los procedimientos de HIS han mejorado
desde que se introdujo el concepto general por Pardue y Gall hace
más de veinte años. Pardue et al. (1969) Proc Natl Acad Sci
USA 64:600-604. Por ejemplo, el uso de sondas no
isotópicas ha eliminado los problemas inherentes asociados con los
procedimientos de HIS radiactivos tales como largos tiempos de
respuesta, riesgos de exposición a radiactividad y eliminación de
los residuos. Además, la incorporación de diversas dianas y
sistemas de amplificación de señales ha mejorado la sensibilidad de
HIS. Sin embargo, a pesar de estos avances en los procedimientos de
HIS, todavía deben superarse varios retos. Estos retos incluyen
desarrollar una detección de dianas sensible y específica,
garantizar la localización conjunta precisa de la señal y la diana,
conservar las secuencias diana, y conservar la morfología celular y
tisular. Además, los procedimientos de HIS deben tratar varios
problemas prácticos, incluyendo la facilidad de uso,
reproducibilidad, y susceptibilidad de cuantificación,
susceptibilidad de automatización, versatilidad y terminación
oportuna.
La amplificación de señal de tiramida por
deposición de indicador catalizado (CARD/TSA) es un procedimiento
de HIS que se ha propuesto para tratar algunos de estos retos y
problemas. Algunos estudios han mostrado que el procedimiento de
HIS CARD/TSA puede detectar 1-2 copias de ADN de
VPH-16 en células SiHa.
Siadat-Pajouh et al. (1994) J Histochem
Cytochem 42: 1503-1512 y Adler et al. (1997)
Histochem Cell Biol 108:321-324.
Un estudio ha mostrado que es posible adaptar la
tecnología de ADNr a un formato de HIS para la detección de ARNm.
Cao et al. (1998) Proceedings of the American Association for
Cancer Research, 89ª reunión, Nueva Orleans, LA y Antao et
al. (1999) In Situ Hybridization Using the bDNA Technology. En
Patterson, B. K. ed., Techniques in Quantification and Localization
of Gene Expression, Boston, Birkhauser Press: 81-93.
Antao et al. describen el uso de la tecnología de ADNr para
la hibridación in situ a ARN en células individuales. Las
etapas principales en el ensayo de ADNr son la prehibridación, la
hibridación secuencial con sondas diana, sonda de preamplificador,
amplificador y marcador, y finalmente la generación y detección de
señales. Sin embargo, el ensayo descrito en este estudio tiene una
sensibilidad relativamente baja.
Por tanto, sigue habiendo una necesidad en la
técnica para proporcionar procedimientos sumamente sensibles, para
la detección in situ de analitos de ácido nucleico en
muestras biológicas. La presente invención satisface éstas y otras
necesidades en la técnica.
En consecuencia, es un objetivo principal de la
invención tratar las necesidades descritas anteriormente en la
técnica proporcionando un procedimiento para la detección in
situ de un analito de ácido nucleico dentro de una muestra de
material biológico basándose en la hibridación de ADNr, en el que el
procedimiento da como resultado un aumento de la sensibilidad.
El procedimiento de la invención puede usarse
para identificar la posición, es decir, ubicación subcelular, de un
analito de ácido nucleico dentro de una única célula basándose en
una técnica de hibridación de ADNr.
Se expondrán en parte objetivos, ventajas y
características novedosas adicionales de la invención en la
descripción siguiente, y en parte resultarán evidentes a los
expertos en la técnica al examinar lo siguiente, o pueden aprenderse
mediante la práctica de la invención.
Según la invención, se proporciona por tanto un
procedimiento para la detección in situ de un analito de
ácido nucleico dentro de una muestra de material biológico que
comprende realizar la hibridación de ADNr que comprende las etapas
de:
(a) preparar una muestra de material
biológico:
- (i)
- inmovilizando el material biológico sobre un sustrato;
- (ii)
- permeabilizando el material biológico unido al sustrato poniendo en contacto el material biológico unido al sustrato con una disolución que contiene Proteinasa K a una concentración de 0,5 \mug/ml a 50 \mug/ml;
- (iii)
- tratando la muestra con ARNasa de manera que se elimine todo el ARN en la muestra; y
- (iv)
- calentando el material biológico permeabilizado hasta una temperatura y durante un periodo de tiempo eficaces para desnaturalizar cualquier ADN de cadena doble;
(b) poner en contacto el material biológico con
un sonda de oligonucleótidos diana en condiciones de hibridación,
en el que al menos una parte de la sonda diana es complementaria a
al menos una parte del analito de ácido nucleico, de manera que se
forma el complejo analito-sonda diana cuando el
analito de ácido nucleico está presente en la muestra;
(c) lavar el material biológico con un fluido de
lavado que comprende un detergente, a una temperatura en el
intervalo de 21ºC a 60ºC; y
(d) detectar cualquier complejo de
analito-sonda diana sobre el sustrato
- (i)
- poniendo en contacto el sustrato lavado y el complejo analito-sonda diana con una sonda oligonucleotídica de preamplificador en condiciones de hibridación, en el que una primera parte de la sonda de preamplificador es complementaria a una parte de la sonda diana distinta de la parte de la sonda diana que es complementaria al analito de ácido nucleico, formando así un complejo analito-sonda diana-sonda de preamplificador cuando el analito de ácido nucleico está presente en la muestra;
- (ii)
- poniendo en contacto el producto de la etapa (d)(i) con una sonda oligonucleotídica de amplificador en condiciones de hibridación, en el que una primera parte de la sonda de amplificador es complementaria a una segunda parte de la sonda de preamplificador, formando así un complejo analito-sonda diana-sonda de preamplificador-sonda de amplificador cuando el analito de ácido nucleico está presente en la muestra;
- (iii)
- poniendo en contacto el producto de la etapa (d)(ii) con una sonda de marcador que comprende una sonda oligonucleotídica conjugada con fosfatasa alcalina en condiciones de hibridación, en el que una parte de la sonda de marcador se une a una segunda parte de la sonda de amplificador, formando así un complejo analito-sonda diana-sonda de preamplificador-sonda de amplificador-sonda de marcador cuando el analito de ácido nucleico está presente en la muestra;
- (iv)
- marcando el complejo analito-sonda diana-sonda de preamplificador-sonda de amplificador-sonda de marcador con un marcador detectable; y
- (v)
- detectando la presencia del marcador sobre el sustrato,
en el que el analito de ácido nucleico es ADN,
un gen endógeno o un segmento del mismo.
Se prefiere que el analito de ácido nucleico se
seleccione del grupo constituido por ADN de VIH, ADN de CMV, ADN de
VPH, LAP e IL-2.
En una segunda realización, se proporciona un
procedimiento para identificar la posición de un analito de ácido
nucleico dentro de una célula de una muestra de material biológico
basándose en la hibridación de ADNr. Este procedimiento para la
localización e identificación de la posición de un analito de ácido
nucleico comprende las mismas etapas que las descritas
anteriormente con respecto a la detección in situ de un
analito de ácido nucleico. Sin embargo, una vez detectado el
marcador, la identificación de la posición del complejo
analito-sonda diana dentro de una célula de la
muestra biológica es indicativa de la posición del analito de ácido
nucleico dentro de la célula.
La figura 1 es una representación esquemática de
un procedimiento de HIS de ADNr según la presente invención.
En otra realización, se proporciona un
procedimiento para detectar un analito de ácido nucleico dentro de
una muestra de material biológico, el procedimiento comprende
realizar la hibridación de ADNr para detectar el analito de ácido
nucleico in situ, en el que el procedimiento tiene una
sensibilidad suficiente para detectar desde aproximadamente 1 copia
hasta aproximadamente 10 copias del analito de ácido nucleico en el
material biológico.
La figura 1 es una representación esquemática de
un procedimiento de HIS de ADNr según la presente invención.
Las figuras 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G y 2H son
imágenes microscópicas (60X) de los resultados obtenidos en el
ejemplo 1.
Las figuras 3A, 3B, 3C y 3D son imágenes
microscópicas (60X) de los resultados obtenidos en el ejemplo 2.
Las figuras 4A, 4B, 4C y 4D son imágenes
microscópicas (60X) de los resultados obtenidos en el ejemplo 3.
Las figuras 5A, 5B, 5C, 4D y 5E son imágenes
microscópicas de los resultados obtenidos en el ejemplo 4.
Las figuras 6A, 6B y 6C son imágenes
microscópicas de los resultados obtenidos en el ejemplo 5.
Las figuras 7A, 7B, 7C, 7D, 7E, 7F y 7G son
imágenes microscópicas de los resultados obtenidos en el ejemplo
6.
Antes de describir en detalle la presente
invención, debe entenderse que esta invención no se limita a las
sondas, reactivos, formatos de ensayo o similares específicos, ya
que los mismos pueden variar. También debe entenderse que la
terminología usada en el presente documento es sólo para fines de
descripción de realizaciones particulares y no se pretende que sea
limitativa.
Debe observarse que, tal como se usa en esta
memoria descriptiva y reivindicaciones adjuntas, las formas
singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen
los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente
lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "un
complejo analito-sonda diana" incluye dos o más
de tales complejos, la referencia a una etapa de "lavado"
incluye dos o más de tales etapas, y similares.
En esta memoria descriptiva y las
reivindicaciones que siguen, se usará la siguiente terminología
según las definiciones expuestas a continuación.
"Oligonucleótido" será genérico para
polidesoxirribonucleótidos (que contienen
2'-desoxi-D-ribosa o
formas modificadas de la misma), para polirribonucleótidos (que
contienen D-ribosa o formas modificadas de la
misma), y para cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un
N-glucósido de una base de purina o pirimidina, o
de una base de purina o pirimidina modificada. Los oligonucleótidos
pueden ser de cadena sencilla o de cadena doble, normalmente de
cadena sencilla. Además, los oligonucleótidos usados en la presente
invención tienen normalmente desde aproximadamente 2 unidades de
monómero hasta aproximadamente 100 unidades de monómero, más
normalmente desde aproximadamente 2 unidades de monómero hasta
aproximadamente 80 unidades de monómero, y lo más normalmente desde
aproximadamente 2 unidades de monómero hasta aproximadamente 60
unidades de monómero.
La expresión "analito de ácido nucleico" se
refiere a una molécula de ácido nucleico de cadena sencilla o de
cadena doble que contiene una secuencia de nucleótidos diana. El
analito de ácido nucleico puede ser de una variedad de fuentes, por
ejemplo, sólidos o líquidos biológicos, productos alimenticios,
materiales medioambientales, etc. La expresión
"analito de ácido nucleico" se usa de manera intercambiable en el presente documento con el término "analito".
"analito de ácido nucleico" se usa de manera intercambiable en el presente documento con el término "analito".
Tal como se usan en el presente documento, las
expresiones "región diana" o "secuencia de nucleótidos
diana" se refieren a una región de unión a sonda contenida
dentro del analito de ácido nucleico. La región diana debe tener al
menos 400 bases de longitud. La expresión "secuencia diana" se
refiere a una secuencia con la que una sonda, es decir, una sonda
oligonucleotídica diana, formará un híbrido estable en las
condiciones deseadas.
Tal como se usan en el presente documento, las
expresiones "sonda" y "sonda oligonucleotídica" se
refieren a una estructura comprendida por un oligonucleótido tal
como se definió anteriormente que contiene una secuencia de ácido
nucleico complementaria a una parte de una secuencia de nucleótidos
diana, al menos otra sonda, o ambas. Las regiones
oligonucleotídicas de las sondas pueden estar compuestas por ADN,
y/o ARN, y/o análogos sintéticos de nucleótidos.
Se apreciará que las secuencias de unión no
necesitan tener una complementariedad perfecta para proporcionar
híbridos estables. En muchas situaciones, se formarán híbridos
estables cuando menos de aproximadamente el 10% de las bases sean
apareamientos erróneos, ignorando los bucles de cuatro o más
nucleótidos. En consecuencia, el término "complementario" se
refiere a un oligonucleótido que forma un dúplex estable con su
"complemento" en las condiciones del ensayo, generalmente
cuando hay una homología de aproximadamente el 90% o superior.
Tal como se usan en el presente documento, las
expresiones "muestra biológica" o "material biológico" se
usan de manera intercambiable y cada una se refiere a una muestra
de tejido, células o líquido aislada de un individuo, incluyendo,
pero sin limitarse a, por ejemplo, plasma, suero, líquido
cefalorraquídeo, semen, líquido linfático, las secciones externas
de la piel, secreciones de las vías respiratorias, secreciones del
tracto intestinal, secreciones del tracto genitourinario, lágrimas,
saliva, leche, células sanguíneas, tumores, órganos, y también
muestras de constituyentes de cultivo celular in vitro
(incluyendo, pero sin limitarse a, medio acondicionado resultante
del crecimiento de células en medio de cultivo celular, células
supuestamente infectadas por virus, células recombinantes, y
componentes celulares). Se prefiere que la muestra biológica esté en
forma de un líquido, por ejemplo, tejido o células en un líquido,
aunque también puede usarse tejido sólido. Los usos preferidos del
presente procedimiento son la detección y/o cuantificación de ácidos
nucleicos tal como sigue: (a) ácidos nucleicos virales, tales como
del virus de la hepatitis B ("VHB"), virus de la hepatitis C
("VHC"), virus de la hepatitis G ("VHG"), virus de
inmunodeficiencia humano ("VIH"), virus del papiloma humano
("VPH"), y la familia de virus del herpes, incluyendo herpes
zoster (varicela), virus del herpes simple tipos I y II,
citomegalovirus ("CMV"), y virus de
Epstein-Barr; (b) ácidos nucleicos bacterianos,
tales como clamidia, Mycobacterium tuberculosis, etc.; y (c)
numerosas secuencias humanas de interés, incluyendo fosfatasa ácida
lisosomal ("LAP"), interleucina-2
(IL-2), e interferón-gamma
(INF).
Se pretende que la expresión "condiciones de
hibridación" signifique aquellas condiciones de tiempo,
temperatura y pH y las cantidades y concentraciones necesarias de
reactantes y reactivos suficientes para permitir que al menos una
parte de una sonda se reasocie con su secuencia complementaria. Tal
como se sabe bien en la técnica, las condiciones de tiempo,
temperatura y pH requeridas para lograr la hibridación dependen del
tamaño de la sonda oligonucleotídica que va a hibridarse, el grado
de complementariedad entre la sonda oligonucleotídica y la diana, y
la presencia de otros materiales en la mezcla de reacción de
hibridación. Las condiciones reales necesarias para cada etapa de
hibridación se conocen bien en la técnica o pueden determinarse sin
experimentación excesiva.
Las condiciones de hibridación típicas incluyen
el uso de disoluciones tamponadas hasta un pH desde aproximadamente
7 hasta aproximadamente 8,5 y se llevan a cabo a temperaturas desde
aproximadamente 30ºC hasta aproximadamente 55ºC, preferiblemente
desde aproximadamente 37ºC hasta aproximadamente 55ºC durante un
periodo de tiempo desde aproximadamente 1 segundo hasta
aproximadamente 1 día, preferiblemente desde aproximadamente 15
minutos hasta aproximadamente 16 horas, y lo más preferiblemente
desde aproximadamente 15 minutos hasta aproximadamente 3 horas.
Las "condiciones de hibridación" también
requieren un tampón eficaz. Puede usarse cualquier tampón que sea
compatible, es decir, químicamente inerte, con respecto a las sondas
y otros componentes, pero todavía permita la hibridación entre
pares de bases complementarias. Un tampón particularmente preferido,
denominado a continuación en el presente documento "disolución de
hibridación A", comprende 3X SSC, formamida al 50%, sulfato de
dextrano al 10% (PM 500.000), caseína al 0,2%, poliA 10 \mug/ml,
ADN de esperma de salmón desnaturalizado 100 \mug/ml en el que 1X
SSC es cloruro de sodio 0,15 M y citrato de sodio 0,015 M. Otro
tampón particularmente preferido, denominado a continuación en el
presente documento "disolución de hibridación B", comprende 5X
SSC, dodecilsulfato de sodio a del 0,1 al 0,3%, sulfato de dextrano
al 10%, ZnCl_{2} 1 mM, y MgCl_{2} 10 mM en el que 1X SSC es tal
como se definió anteriormente.
"Opcional" u "opcionalmente" significa
que la circunstancia descrita posteriormente puede producirse o no,
de manera que la descripción incluye casos en los que la
circunstancia se produce y casos en los que no. Por ejemplo,
"calentar opcionalmente el material biológico permeabilizado"
incluye casos en los que se calienta el material biológico
permeabilizado y casos en los que no se calienta el material
biológico permeabilizado.
El procedimiento de la presente invención es un
ensayo de hibridación de ADNr in situ. Tal como se aprecia
en la técnica, los procedimientos basados en ADNr proveen
eficazmente la amplificación de una señal que de otro modo puede no
ser detectable con otras técnicas. Los expertos en la técnica están
familiarizados con las técnicas y materiales necesarios para llevar
a cabo ensayos basados en ADNr. Brevemente, en la amplificación de
ADNr, una sonda oligonucleotídica diana comprende dos sitios: uno
para hibridarse específicamente con una parte del analito de ácido
nucleico, y uno para hibridarse específicamente con al menos otra
sonda. Pueden usarse sondas oligonucleotídicas adicionales con
sitios únicos diseñados para hibridarse específicamente con
diferentes sondas, de manera que a medida que se producen fases
repetidas de hibridación, se forma una estructura de ADN
ramificado. La sonda oligonucleotídica final que va a reasociarse en
la estructura ramificada lleva al menos un marcador detectable. Por
tanto, la molécula diana original da lugar a una multitud de
señales, amplificando así la señal para una detección fácil.
Además, puede hacerse referencia a la bibliografía, textos y otras
referencias pertinentes para una descripción de técnicas de ADNr
convencionales. Véase, por ejemplo, Collins et al. (1997)
Nucleic Acid Res. 25(15):2979-2984.
La presente invención proporciona técnicas
sumamente sensibles para detectar un analito de ácido nucleico
basándose en la hibridación de ADNr in situ. Las técnicas de
hibridación de ADNr in situ anteriores han proporcionado
resultados relativamente no sensibles. Sin embargo, la presente
invención proporciona un procedimiento de ADNr in situ que
es sumamente sensible, por ejemplo, que tiene una sensibilidad
suficiente para detectar desde aproximadamente 1 hasta
aproximadamente 10 copias de un analito de ácido nucleico en un
material biológico.
En una primera realización, la invención
proporciona un procedimiento para la detección in situ de un
analito de ácido nucleico dentro de una muestra de material
biológico basándose en la hibridación de ADNr.
El procedimiento comprende las etapas de (a)
preparar la muestra de material biológico, (b) poner en contacto el
material biológico con una sonda oligonucleotídica diana en
condiciones de hibridación, (c) lavar el material biológico, y (d)
detectar cualquier complejo analito-sonda diana en
el sustrato.
La muestra de material biológico se obtiene
mediante procedimientos convencionales e incluye, por ejemplo,
biopsia y extracción de fluidos biológicos. Sin embargo, dado que la
técnica es para un análisis in situ, se analizan tejidos,
células u orgánulos en lugar de un lisado. Debe tenerse cuidado al
obtener y manejar el tejido, célula u orgánulo a lo largo del
ensayo para garantizar que el material permanece sustancialmente
intacto.
La muestra biológica para su uso en el presente
procedimiento, es decir, los tejidos o células que van a analizarse,
pueden tomarse de cualquier parte del cuerpo siempre que se
sospeche que el material biológico contiene el analito de interés.
Por ejemplo, los tejidos adecuados para su uso en el presente
procedimiento incluyen, sin limitación, tejido suprarrenal, de
vejiga, médula ósea, cerebro, mama, cardiaco, colon, esófago,
intestinal, renal, hepático, pulmonar, ganglios linfáticos,
nervios, ovarios, pancreático, prostático, músculo esquelético
(estriado), músculo liso, bazo, estómago, testículos, amígdalas,
traqueal y uterino. Además, las células tomadas de estos mismos
tejidos son apropiadas para las técnicas descritas en el presente
documento. Adicionalmente, las células pueden obtenerse a partir de
fluidos que contienen células tales como plasma, suero, líquido
cefalorraquídeo, etc., tal como se explicó anteriormente.
Inicialmente, el material biológico debe conservarse o
"fijarse". Aunque se conocen muchos procedimientos en la
técnica para fijar muestras biológicas, se prefiere que la muestra
biológica se fije con formaldehído. Por ejemplo, el material
biológico puede combinarse con una disolución de formaldehído al 4%
durante 30 minutos sobre hielo. Como alternativa, también pueden
emplearse otros agentes de fijación, por ejemplo alcohol. Una vez
fijado, el material biológico debe inmovilizarse sobre un sustrato.
Los sustratos adecuados están comprendidos por aquellos materiales
que permiten la inmovilización de un tejido, célula u orgánulo
mientras conservan la morfología de la muestra. El material de
sustrato también debe ser sólido además de ser resistente al calor.
Además, el sustrato debe ser inerte con respecto a los reactivos
usados. Los sustratos preferidos comprenden vidrio, por ejemplo, un
portaobjetos de vidrio, aunque también puede usarse un plástico
elástico.
El material biológico puede inmovilizarse sobre
el sustrato usando procedimientos convencionales. Para las células,
se prefiere que el material biológico se inmovilice usando una
centrifugadora. Generalmente, la fuerza requerida para inmovilizar
el material biológico sobre el sustrato es desde aproximadamente 200
x g hasta aproximadamente 500 x g (veces la fuerza de la gravedad).
Se prefiere que la fuerza usada sea de aproximadamente 300 x g.
La inmovilización de muestras de tejido se lleva
a cabo preferiblemente cortando secciones muy finas de la muestra
de tejido y colocándolas sobre un sustrato adecuado.
Preferiblemente, se coloca en primer lugar el tejido en un
criostato y se enfría hasta de aproximadamente -15ºC a
aproximadamente -20ºC con el fin de congelar el tejido. Luego, se
usa un micrótomo para cortar el tejido congelado en secciones.
Posteriormente, se coloca una única sección sobre un sustrato, por
ejemplo, portaobjetos de vidrio, y se deja "fundir" la sección
sobre el sustrato, inmovilizando así la muestra. Pueden usarse
tejidos con infusión de cera, por ejemplo, parafina, en lugar de
tejidos congelados. Tal como se apreciará, pueden usarse otros
procedimientos para inmovilizar la muestra de tejido.
Con el fin de garantizar que la sondas
oligonucleotídicas tengan acceso al medio interno, es necesario
hacer que el material biológico unido al sustrato sea permeable. Se
ha encontrado que poner en contacto el material biológico unido a
sustrato con una disolución que contiene proteinasa K a una
concentración de aproximadamente 0,5 \mug/ml a aproximadamente 50
\mug/ml, preferiblemente desde aproximadamente 5 \mug/ml hasta
aproximadamente 20 \mug/ml (a partir de una disolución madre que
tiene una actividad de 600 unidades por ml), hace que el material
biológico sea permeable hasta un grado suficiente de tal manera que
las sondas pasan libremente por las membranas biológicas mientras
se mantiene la morfología de la muestra. Los parámetros de tiempo y
temperatura para hacer que el material biológico sea permeable se
conocen bien o pueden determinarse experimentalmente. Se prefiere
un tiempo de reacción de aproximadamente 10 minutos a
aproximadamente 37ºC para permeabilizar con proteinasa K.
Cuando el analito de ácido nucleico comprende
ADN de cadena doble, es necesario desnaturalizar el ADN de tal
manera que puede tener lugar la hibridación con sondas exponiendo la
muestra a tratamiento térmico de una temperatura y durante un
periodo de tiempo eficaces para desnaturalizar cualquier ADN de
cadena doble. Sin embargo, se ha encontrado que el calentamiento
del ADN desde aproximadamente 1,5 minutos hasta aproximadamente 5
minutos es suficiente para desnaturalizar ADN de cadena doble
mientras se conservan los componentes celulares. La temperatura
puede ser cualquier temperatura conocida en la técnica suficiente
para desnaturalizar ADN. Sin embargo, se prefiere que la
temperatura sea desde aproximadamente 70ºC hasta aproximadamente
92ºC, preferiblemente de aproximadamente 80ºC a aproximadamente
92ºC, siendo lo más preferido una temperatura de
aproximadamente
92ºC.
92ºC.
Además, cuando el analito de ácido nucleico
comprende ADN, también es necesario digerir cualquier ARN que pueda
estar presente. Mediante la digestión del ARN, las sondas no pueden
hibridarse con ARN, minimizando así los posibles resultados falsos
positivos. Generalmente, puede usarse cualquier procedimiento
conocido en la técnica para digerir ARN. Sin embargo, se prefiere
usar ARNasa (disponible de Sigma, Fluka, etc.,). Puede añadirse
ARNasa a la muestra en una cantidad desde aproximadamente 25 \mug
hasta aproximadamente 100 \mug (por mancha sobre el portaobjetos)
y dejar incubar durante un periodo de tiempo y a una temperatura
suficientes para digerir el ARN. Sin embargo, se prefiere que se
añadan aproximadamente 40 \mug (por mancha sobre el portaobjetos)
de ARNasa a la muestra y se mantenga a 37ºC durante una hora.
Hay disponibles otros procedimientos para
preparar el material biológico. Por ejemplo, usando kits
comercialmente disponibles tales como el sistema de portaobjetos
THINPREP® (Cytyc Corporation, Boxborough, MA).
Una vez preparado, se coloca el material
biológico en contacto con una sonda oligonucleotídica diana en
condiciones de hibridación. La sonda diana tiene una parte que es
complementaria a al menos una parte de la secuencia diana del
analito de ácido nucleico. Cuando el analito de ácido nucleico de
interés está presente en la muestra, el analito de ácido nucleico y
la sonda diana se hibridan para formar un complejo
analito-sonda diana.
La cantidad de sondas diana añadida puede
determinarse experimentalmente, pero se prefiere que se añadan de
aproximadamente 0,1 pmoles a aproximadamente 10 pmoles (por mancha
sobre el portaobjetos) y se dejan incubar durante aproximadamente
tres horas a 40ºC. Un medio de reacción preferido para esta etapa de
hibridación es la disolución de hibridación A (definida
anteriormente).
Una vez que ha pasado un tiempo de incubación
suficiente, se lavan tanto el sustrato como el complejo
analito-sonda diana, si está presente, para
facilitar la eliminación de sondas diana no unidas. La etapa de
lavado requiere el uso de un fluido de lavado que comprende
generalmente un detergente y generalmente una disolución tampón.
La disolución tampón puede ser cualquier
disolución convencional conocida en la técnica adecuada para
eliminar sondas oligonucleotídicas no hibridadas. Las disoluciones
tampón preferidas comprenden las sales de metales alcalinos. Las
disoluciones tampón particularmente preferidas comprenden cloruro de
sodio, citrato de sodio y combinaciones de las mismas.
El detergente es preferiblemente un detergente
no iónico. Además, se prefiere que el detergente sea también un
tensioactivo hidrófilo. Detergentes a modo de ejemplo son
detergentes basados en polioxietileno, por ejemplo, BRIJ® y
TRITON®. Se venden detergentes similares también adecuados para su
uso en la presente invención con los nombres comerciales de TWEEN®,
GENAPOL®, IGEPAL CA®, THESIT®, y LUPROL® (todos disponibles de
proveedores comerciales).
Una vez determinado el fluido de lavado, se
lleva a cabo la etapa de lavado al menos una, preferiblemente dos,
y lo más preferiblemente tres veces. Se ha encontrado que la
temperatura de la etapa de lavado influye en la sensibilidad del
ensayo. Por tanto, para el presente procedimiento, las temperaturas
en el intervalo desde aproximadamente 21ºC hasta aproximadamente
60ºC funcionan bien y se usan. De manera óptima, la etapa de lavado
se lleva a cabo a temperatura ambiente.
Una vez completada la etapa de lavado, las
sondas diana no hibridadas están ausentes. Entonces se detectan
complejos analito-sonda diana sobre el sustrato para
determinar la presencia del analito de ácido nucleico. En
consecuencia, se añaden sondas oligonucleotídicas adicionales de tal
manera que se forma una red ramificada. Una vez formada una red
ramificada, se añade una pluralidad de marcadores detectables con el
efecto de "amplificar" la señal para una detección fácil. Por
tanto, la detección de un complejo analito-sonda
diana se logra mediante:
(d)(i) poner en contacto el sustrato y complejo
analito-sonda diana lavados con una sonda
oligonucleotídica de preamplificador en condiciones de hibridación,
en la que una primera parte de la sonda de preamplificador es
complementaria a una parte de la sonda diana distinta de la parte de
la sonda diana que es complementaria al analito de ácido nucleico,
formando así un complejo analito-sonda
diana-sonda de preamplificador cuando el analito de
ácido nucleico está presente en la muestra;
(d)(ii) poner en contacto el producto de la
etapa (d)(i) con una sonda oligonucleotídica de amplificador en
condiciones de hibridación, en la que una primera parte de la sonda
de amplificador es complementaria a una segunda parte de la sonda
de preamplificador, formando así un complejo
analito-sonda diana-sonda de
preamplificador-sonda de amplificador cuando el
analito de ácido nucleico está presente en la muestra;
(d)(iii) poner en contacto el producto de la
etapa (d)(ii) con una sonda de marcador que comprende una sonda
oligonucleotídica conjugada con fosfatasa alcalina en condiciones de
hibridación, en la que una parte de la sonda de marcador se une a
una segunda parte de la sonda de amplificador, formando así un
complejo analito-sonda diana-sonda
de preamplificador-sonda de
amplificador-sonda de marcador cuando el analito de
ácido nucleico está presente en la muestra;
(d)(iv) marcar el complejo
analito-sonda diana-sonda de
preamplificador-sonda de
amplificador-sonda de marcador con un marcador
detectable; y
(d)(v) detectar la presencia del marcador sobre
el sustrato.
Cada una de las etapas de hibridación de sondas,
es decir, las etapas (d)(i), (d)(ii) y (d)(iii), se lleva a cabo en
condiciones de hibridación convencionales tal como se trató
anteriormente. Sin embargo, para estas etapas de hibridación
particulares se prefiere que cada etapa tenga lugar a
aproximadamente 55ºC con un tiempo de incubación de aproximadamente
25 minutos. También se prefiere que cada sonda, es decir, sonda de
preamplificador, sonda de amplificador y sonda de marcador, se
mezcle por separado con la disolución de hibridación B (definida
anteriormente) para poner en contacto esa sonda con el complejo en
crecimiento. Por tanto, por ejemplo, se mezcla la sonda de
amplificador con disolución de hibridación B y se coloca en contacto
con el complejo de analito-sonda
diana-sonda de preamplificador para formar un
complejo analito-sonda diana-sonda
de preamplificador-sonda de amplificador.
Aunque puede determinarse la cantidad de sondas
añadidas usando técnicas conocidas en la técnica, se prefiere que
se añadan la sonda de preamplificador y sonda de amplificador cada
una en una cantidad de aproximadamente 1 fmol a aproximadamente 10
pmoles (por mancha sobre el portaobjetos). Lo más preferiblemente,
se añaden cada una de estas sondas en una cantidad de
aproximadamente 1 fmol a aproximadamente 100 fmoles (por mancha
sobre el portaobjetos).
El marcaje se logra cuando la sonda de marcador
se hibrida con el complejo analito-sonda
diana-sonda de preamplificador-sonda
de amplificador. La sonda de marcador incluye uno o más marcadores
detectables que proporcionan directa o indirectamente una señal
detectable. Los marcadores pueden unirse, de manera covalente o no
covalente, a la sonda de marcador como elementos individuales de la
secuencia complementaria, o pueden estar presentes como elemento
terminal o cola terminal que tienen una pluralidad de marcadores. Se
han notificado diversos medios para proporcionar marcadores unidos
a una sonda en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Leary et
al.(1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:4045; Renz et al.
(1984) Nucl Acids Res 12:3435; Richardson et al. (1983) Nucl
Acids Res 11:6167; Smith et al. Nucl Acids Res (1985)
13:2399; Meinkoth et al. (1984) Anal Biochem 138:267.
Los marcadores que pueden emplearse incluyen
agentes que pueden fluorescer, agentes que pueden quimioluminescer,
tintes, enzimas, sustratos de enzimas, cofactores de enzimas,
inhibidores de enzimas, subunidades de enzimas, iones metálicos y
similares. Los marcadores específicos ilustrativos incluyen
fluoresceína, rodamina, rojo de Texas, ficoeritrina, umbeliferona,
luminol, NADPH,
\alpha-\beta-galactosidasa,
peroxidasa del rábano blanco, y fosfatasa alcalina, entre otros. Se
usa al menos un marcador de fosfatasa alcalina.
La detección del marcador detectable puede
lograrse mediante cualquier medio conocido en la técnica y depende
de la naturaleza del marcador. Para los agentes que pueden
fluorescer, hay un gran número de fluorómetros disponibles. Para
los agentes que pueden quimioluminescer, hay luminómetros o
películas disponibles. Con las enzimas, puede proporcionarse un
producto fluorescente, quimioluminescente o coloreado y determinarse
fluorométricamente, luminométricamente, espectrofotométricamente o
visualmente (preferiblemente con ayuda de un microscopio). Para el
presente procedimiento, se prefiere que se añada el sustrato de
fosfatasa alcalina para detectar la presencia del marcador de
fosfatasa alcalina usando microscopía de fluorescencia o de campo
brillante.
Al contrario que los ensayos anteriores, el
presente procedimiento para detectar un analito de ácido nucleico
es sumamente sensible. Los ensayos anteriores se basaban en la
presencia de muchas copias (a menudo cientos) del analito de ácido
nucleico. El presente procedimiento se ha desarrollado para detectar
relativamente pocas copias. Por tanto, se prefiere que el
procedimiento tenga una sensibilidad suficiente para detectar desde
1 copia hasta aproximadamente 10 copias del analito de ácido
nucleico. Sin embargo, lo más preferido es que el procedimiento
tenga una sensibilidad suficiente para detectar desde 1 copia hasta
aproximadamente 2 copias del analito de ácido nucleico.
Las secuencias de las sondas se determinan
usando técnicas habituales conocidas en la técnica. Por tanto, por
ejemplo, la secuencia de sonda diana se determinará usando una
secuencia conocida del analito de interés específica para ese
analito. Aquellas regiones de las secuencias que se pretende que
estén implicadas en la unión (y por tanto son complementarias a
otra secuencia de oligonucleótidos, ya sea una sonda o analito)
tendrán cada una al menos 15 nucleótidos, normalmente al menos 20
nucleótidos, y no más de aproximadamente 100 nucleótidos.
Normalmente, las secuencias de unión tendrán una longitud de
aproximadamente 25 nucleótidos. Normalmente se elegirán para unirse
a diferentes secuencias del analito y/o a partes diferentes y
específicas de las diversas sondas. Además, los oligonucleótidos
para cualquier conjunto dado de sondas tendrán de manera óptima la
misma temperatura de fusión.
Se seleccionan sondas con una segunda secuencia
de unión para que sean sustancialmente complementarias a la parte
apropiada de la sonda. La segunda secuencia de unión puede ser
contigua a la primera secuencia de unión, o puede estar separada de
la misma por una secuencia intermedia no complementaria. Las sondas
pueden incluir otras secuencias no complementarias si se desea. Sin
embargo, estas secuencias no complementarias no deben dificultar la
unión de las secuencias de unión ni dar como resultado una unión no
específica.
Las sondas pueden prepararse mediante síntesis
oligonucleotídica o clonación, prefiriéndose lo primero. Tal como
se sabe bien en la técnica, los procedimientos para sintetizar
oligonucleótidos implican normalmente la adición secuencial de
monómeros de nucleótidos bloqueados en 3' y bloqueados en 5' al
grupo 5'-hidroxilo terminal de una cadena
oligonucleotídica en crecimiento, en el que cada adición se realiza
mediante ataque nucleófilo del grupo 5'-hidroxilo
terminal de la cadena en crecimiento sobre la posición en 3' del
monómero añadido, que es normalmente un derivado de fósforo tal
como fosfotriéster, fosforamidita, o similares.
La presente invención también proporciona un
procedimiento para determinar la ubicación o posición de un analito
de ácido nucleico en una célula. Tal como se indicó anteriormente,
este procedimiento comprende las mismas etapas que la detección
in situ pero añade una etapa adicional de (e) identificar la
posición del complejo analito-sonda diana dentro de
una célula de la muestra biológica como indicativo de la posición
del analito de ácido nucleico en la célula. Los ensayos de
detección in situ anteriores eran menos precisos para
demostrar la posición subcelular de la señal. Por ejemplo, la señal
de ensayos in situ anteriores podía no estar
"contenida" dentro del compartimiento subcelular. Como
alternativa, la señal de los ensayos in situ anteriores
podía estar difundida a lo largo de una parte relativamente grande
de la célula, haciendo por tanto imposible una conclusión
definitiva referente a la ubicación del analito de ácido nucleico.
Debido a que las temperaturas para la hibridación son bajas, es
decir, generalmente no superan 55ºC, y que el tratamiento de la
muestra no es duro, el presente procedimiento hace posible la
capacidad para determinar la ubicación de un único analito dentro
de una célula. Incluso cuando se aumenta la temperatura para ciertas
etapas, por ejemplo, hasta aproximadamente 92ºC cuando se
desnaturaliza el ADN mediante calentamiento, el presente
procedimiento todavía conserva la capacidad para determinar la
ubicación de un único analito dentro de
una célula.
una célula.
El presente procedimiento puede usarse para
detectar cualquier ADN, gen endógeno o segmento del mismo para el
que se conoce la secuencia. Los analitos preferidos para los que el
procedimiento es particularmente bien adecuado incluyen, pero no se
limitan a, ADN de VIH; ADN de CMV, ADN de VPH, LAP,
IL-2 y transcriptos de genes.
Teniendo en cuenta su sensibilidad, facilidad de
uso, versatilidad, fiabilidad y rapidez (los resultados se obtienen
en el plazo de un día), el presente procedimiento tiene una amplia
aplicación en la detección temprana de cánceres y enfermedades
infecciosas. La detección de una única copia es particularmente
ventajosa para las enfermedades virales, por ejemplo, VIH y muchas
otras, ya que el diagnóstico puede lograrse mucho antes (cuando las
cargas virales son relativamente bajas), permitiendo así una
intervención y tratamiento más tempranos. Además, el presente
procedimiento tiene aplicaciones en el campo de la selección de
tratamiento. Por ejemplo, el presente procedimiento puede adaptarse
para detectar rápidamente y con precisión el número de copias de
genes del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano
(HER2/neu). Esto es útil para decidir si iniciar o no el
tratamiento anti-HER2, por ejemplo, tratamiento con
anticuerpo monoclonal anti-HER2 (Herceptin®,
disponible de Genentech, Inc., South San Francisco, CA). Además,
modificando las condiciones de tratamiento previo de células o
tejidos, el presente procedimiento puede detectar ARNm o bien ADN
con el mismo conjunto de sondas.
El presente procedimiento es sumamente
específico y permite la localización precisa de la secuencia diana
dentro de la célula cuando se conoce una parte de la secuencia del
analito de ácido nucleico. Además, la localización es posible
incluso cuando sólo hay una única copia del analito de ácido
nucleico en la célula. Por tanto, un ensayo de este tipo tiene una
amplia aplicación y es particularmente útil en la investigación y en
la medicina. En tratamientos génicos, por ejemplo, ahora es posible
determinar si el medicamento entra en el citoplasma y/o núcleo.
Además de detectar cánceres y enfermedades
infecciosas y ayudar con la selección del tratamiento, la capacidad
de detectar ácidos nucleicos dentro de secciones de tejido usando
los presentes procedimientos tiene ventajas adicionales. Por
ejemplo, la detección in situ dentro de una muestra de tejido
demuestra el grado en el que se ha extendido un cáncer o agente
patógeno infeccioso a las zonas de alrededor del tejido. Una
información de este tipo sirve como indicador de pronóstico y
proporciona la capacidad para diseñar a medida un enfoque
terapéutico apropiado para la
enfermedad.
enfermedad.
El alcance de la invención se define por las
reivindicaciones adjuntas.
Los siguientes ejemplos se exponen de modo que
se proporcione a los expertos ordinarios en la técnica una
divulgación y descripción completas de cómo preparar y usar los
compuestos descritos y reivindicados en el presente documento. Se
han hecho esfuerzos para garantizar la exactitud con respecto a los
números (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero deben
tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones. A menos que se
indique lo contrario, la temperatura se expresa en ºC y la presión
es la presión atmosférica o cercana a ella al nivel del mar.
A menos que se indique lo contrario, todos los
materiales de partida y reactivos se obtuvieron comercialmente (por
ejemplo, de Aldrich, Sigma e ICN) y se usaron sin purificación
adicional. Se usaron procedimientos convencionales de cultivo
celular y recogida de células.
Debido a que contienen diferentes cepas y
cantidades del virus del papiloma humano (VPH), se usaron las líneas
celulares del carcinoma de cuello uterino humano de HeLa, CaSki y
SiHa para evaluar la presente invención. La tabla 1 describe cada
línea celular.
*Se obtuvieron todas las líneas celulares de la
Colección Americana de Cultivos Celulares Tipo (ATCC; Manassas, VA)
y se hicieron crecer en matraces en condiciones sugeridas
generalmente por la ATCC. Cuando se requería, se separaron las
células de los matraces usando un tratamiento suave con
tripsina.
Las sondas diana específicas para
VPH-16 estaban constituidas por un total de 26
sondas oligonucleotídicas de ADN que cubrían aproximadamente el 90%
de las regiones E6 y E7 del genoma de VPH. Se diseñaron estas sondas
creando en primer lugar una secuencia consenso degenerada basada en
23 secuencias para los genes E6 y E7 del genoma de
VPH-16, recuperadas de GenBank usando el software
Genetics Data Environment (Harvard Genome Laboratory, Cambridge,
MA). Entonces se generaron conjuntos de posibles sondas diana usando
el software ProbeDesigner® (Bayer Diagnostics, Emeryville, CA), que
permite el diseño flexible de conjuntos de sondas de ADNr con una
contribución mínima al fondo y designa una temperatura de fusión
constante de 63 \pm 2ºC. Se seleccionaron las sondas finales tras
explorar los conjuntos de sondas para detectar posibles
interacciones con los otros 39 genotipos de VPH usando
HybSimulator® (Advanced Gene Computing Technologies, Inc., Irvine,
CA) y secuencias de ADN genómico humano usando Blast2^{TM}
(National Institutes of Health, Bethesda, MD).
Las sondas diana específicas para
VPH-18 estaban constituidas por un total de 32
sondas oligonucleotídicas de ADN que cubrían el 90% de las regiones
E6 y E7 del genoma de VPH. Se diseñaron estas sondas tal como se
describió anteriormente usando una secuencia consenso degenerada
basada en cuatro secuencias para los genes E6 y E7 del genoma de
VPH-18 y una temperatura de fusión constante de 63
\pm 2ºC.
Se han descrito en detalle otras sondas
oligonucleotídicas de ADN, incluyendo sondas de preamplificador,
amplificador y marcador conjugado con fosfatasa alcalina (FA).
Collins et al. (1997) Nucleic Acids Res
25:2979-2984. Para reducir la hibridación no
específica, se incluyeron los nucleótidos no naturales
5-metil-2'-desoxiisocitidina
(isoC) y 2'-desoxiisoguanosina (isoG) en los sitios
de unión de las sondas diana, de preamplificador, amplificador y
marcador conjugado con FA.
Para la detección de ADN, se fijaron las células
recogidas con formaldehído al 4% en una disolución de tampón
fosfato (PBS; tampón fosfato 0,01 M, pH 7,5) durante 30 minutos en
hielo, se lavaron dos veces durante dos minutos cada una y se
resuspendieron en PBS. Se pipetearon alícuotas de 200 \mul de las
suspensiones de células fijadas en embudos de cytospin de doble
manchado (Shandon; Pittsburgh, PA) y se centrifugaron durante 6
minutos a 1500 rpm en una centrífuga cytospin (Shandon) usando una
fuerza calculada equivalente a 300 x g. Se deshidrataron las
células sobre portaobjetos mediante una serie graduada de etanol al
70%, 90% y 100% a temperatura ambiente (TA) durante 2 minutos cada
una, se secaron al aire a TA durante 10 minutos, y se almacenaron a
-80ºC durante hasta 2 semanas. Se rehidrataron las células sobre
portaobjetos mediante una serie graduada de etanol al 100%, 90% y
70% a TA durante 2 minutos cada una y se lavaron dos veces durante 2
minutos cada una en PBS. Se incubaron los portaobjetos a 37ºC
durante 1 hora en ARNasa 40 \mug/ml (Sigma) en 2X SSC (1X SSC es
NaCl 0,15 M, citrato de Na 0,015 M), se lavaron dos veces durante 2
minutos cada una en PBS y se sumergieron en una jarra calentada
previamente que contenía de 7,5 a 10 \mug/ml de Proteinasa K
(Boehringer Mannheim, Indianapolis, EN) en PBS a 37ºC durante 10
minutos. Tras lavar dos veces durante 2 minutos cada una en PBS, se
deshidrataron las células sobre portaobjetos mediante una serie
graduada de etanol al 70%, 90% y 100% a TA durante 2 minutos cada
una y se secaron al aire a TA durante 10 minutos.
Tras el tratamiento previo, se incubaron las
células con una disolución de prehibridación, se hibridaron con un
conjunto de sondas oligonucleotídicas diana (descritas
anteriormente), seguido por hibridación con una serie de sondas
oligonucleotídicas para la amplificación de la señal. Como una etapa
de prehibridación, se incubó cada mancha sobre el portaobjetos con
150 \mul de disolución de hibridación A (SSC 3X, formamida al
50%, sulfato de dextrano al 10% [PM de 500.000], caseína al 0,2%,
poli A 10 \mug/ml, ADN de esperma de salmón desnaturalizado 100
\mug/ml) a TA durante 30 minutos. Se transfirieron los
portaobjetos a una cámara de humedad (instrumento Hybaid Omnislide,
Phenix Research Productos, Hayward, CA), se incubaron a 92ºC durante
5 minutos y se sacaron entonces de la cámara y se enfriaron sobre
la mesa a TA durante 5 minutos. Se eliminó la disolución de
prehibridación y se incubó cada mancha sobre el portaobjetos con 100
\mul de disolución de hibridación A que contenía 0,6 pmol de
sondas diana específicas para VPH a 40ºC durante 3 horas en la
cámara de humedad. Tras la incubación con las sondas diana, se
lavaron los portaobjetos a TA con una serie decreciente de tampones
SSC que contenían detergente BRIJ®-35 al 0,0025%
(SURFACT-AMPS®35, 10%, Pierce, Rockford, IL) tal
como sigue: 3 veces durante 1-2 minutos con 2X SSC;
3 veces durante 1-2 minutos con 0,2X SSC; una vez
durante 5 minutos con 0,1X SSC; y una vez durante 2 minutos con 2X
SSC. Se incubó cada mancha sobre el portaobjetos con 100 \mul de
disolución de hibridación B (5X SSC, dodecilsulfato de sodio del
0,1% al 0,3% [SDS], sulfato de dextrano al 10%, ZnCl_{2} 1 mM,
MgCl_{2} 10 mM) que contenía 90 fmoles de preamplificador a 55ºC
durante 25 minutos en la cámara de humedad. Se lavaron los
portaobjetos dos veces en 0,1X SSC, EDTA 1 mM durante 1 minuto y 4
minutos, respectivamente, y se incubaron entonces en 100 \mul de
disolución de hibridación B que contenía 90 fmoles de amplificador
a 55ºC durante 25 minutos en la cámara de humedad. Se lavaron los
portaobjetos dos veces en 0,1X SSC, EDTA 1 mM durante 1 minutos y 4
minutos, respectivamente, y se incubaron entonces en 100 \mul de
disolución de hibridación B que contenía 90 fmoles de sonda de
marcador conjugada con FA a 55ºC durante 15 minutos en la cámara de
humedad. Tras lavar en lavado D
(tris-(hidroximetil)aminometano 100 mM, pH 8,0, BRIJ®-35 al
0,1%, ZnCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 10 mM) a TA durante 5 minutos, se
añadieron 50 \mul de sustrato de FA tamponado (Fast Red, Nº K597,
DAKO Corporation, Carpinteria, CA) y se incubaron los portaobjetos
a TA durante 10 minutos según las instrucciones del fabricante. Se
aclararon los portaobjetos con agua tres veces durante 3 minutos
cada una y entonces se tiñeron por contraste durante 40 segundos con
hematoxilina Gills 1 (American Histology Reagent Company, Inc.,
Modesto, CA) o bien bisbenzimida al 0,0001% (Nº B2883, Sigma). Se
montaron los portaobjetos con ULTRAMOUNT® (DAKO Corporation),
PERMOUNT® (Fisher Scientific) o glicerol al 75% y se almacenaron a
TA. Se visualizaron los portaobjetos usando un microscopio de
fluorescencia Nikon E800 con un filtro de paso de triple banda o
FITC (Nikon, Foster City, CA) o un objetivo de campo brillante 60X,
y se capturaron las imágenes usando una cámara CCD de color enfriada
de 3 chips de Optronics (Optronics Engineering, Goleta, CA). Se
capturaron las imágenes fluorescentes o cromogénicas usando el
software Image Probe (Media Cybernetics, Silver Springs, MA). La
figura 1 es un esquema del formato del ensayo para el ejemplo 1.
Los resultados de este estudio demuestran que
tras la hibridación con las sondas diana de VPH-16,
se observó una detección de señal positiva en células CaSki (figura
2A) y células SiHa (figura 2B). Tal como se esperaba, se detectó
una multitud de señales en las células CaSki, ya que contenían
aproximadamente 400-600 copias de
VPH-16. Sólo se detectaron una o dos señales en las
células SiHa, también tal como se esperaba, ya que sólo contenían
1-2 copias de ADN de VPH-16.
Finalmente, no se detectó señal con las sondas de
VPH-16 en las células que carecían de
VPH-16, es decir, células HeLa (figura 2C) y C33a
(figura 2D). Estos resultados demuestran tanto la capacidad
cuantitativa como la especificidad del presente procedimiento.
Tras la hibridación con sondas diana de
VPH-18, se observó una detección de señal positiva
en células HeLa (figura 2G), que contenían 10-50
copias de ADN de VPH-18. Sin embargo, no se detectó
señal con las sondas de VPH-18 en células que
carecían de VPH-18, incluyendo células CaSki (figura
2E), SiHa (figura 2F) y C33a (figura 2H). No se detectó señal con
las sondas diana de VPH-16 ni VPH-18
en la línea celular HT3 negativa para VPH ni la línea celular
ME180, que albergan una secuencia de ADN similar a
VPH-39 (no mostrado).
Se realizaron varios controles adicionales para
demostrar que las señales positivas observadas en estos experimentos
eran específicas para dianas de ADN de VPH. No se observó señal
positiva cuando se usaron sondas diana no específicas, ni cuando se
omitieron del procedimiento de HIS de ADNr las sondas diana de
VPH-16 o VPH-18, del amplificador o
del marcador conjugado con FA. La omisión de las etapas de digestión
con la proteinasa K o de desnaturalización del ADN, o el
tratamiento de las células con ADNasa también dio como resultado una
pérdida de señal. Como control adicional para los experimentos de
digestión con ADNasa, se omitió la etapa de tratamiento con ARNasa
para confirmar que esta pérdida de señal no se debía a la
degradación por la ADNasa de las sondas oligonucleotídicas. En
estas condiciones, se detectó de nuevo una señal positiva, indicando
que las sondas oligonucleotídicas de ADN no se degradaban y por lo
tanto podían unirse a las dianas de ARN de VPH.
Se usaron poblaciones celulares mixtas para
valorar adicionalmente la especificidad del presente procedimiento
para la detección de ADN de VPH. Las muestras celulares mixtas
estaban comprendidas por células CaSki no marcadas (que contenían
400-600 copias de VPH-16) y células
HeLa marcadas (que contenían 10-50 copias de ADN de
VPH-18). Se marcaron las células HeLa con el
trazador celular fluorescente CFDA SE (diacetato de
carboxifluoresceína, éster succinimidílico, Molecular Probes,
Eugene, OR) según las instrucciones del fabricante. Se sometieron a
ensayo ambos tipos celulares según el procedimiento del ejemplo
1.
Tal como se muestra en las figuras 3A y 3C, la
hibridación con las sondas diana de VPH-16 produjo
una detección de señal positiva sólo en células CaSki infectadas
con VPH-16 (flecha) y no en células HeLa (flecha).
Asimismo, tal como se muestra en las figuras 3B y 3D, la
hibridación con las sondas diana de VPH-18 produjo
una detección de señal positiva sólo en células HeLa infectadas con
VPH-18 (punta de flecha) y no en células CaSKi
(punta de flecha). Tal como se esperaba, se observó una mayor
intensidad de la señal (es decir, mayor número y tamaño de las
manchas) para la detección de ADN de VPH-16 en
células CaSki comparado con la detección de ADN de
VPH-18 en células HeLa. Esta diferencia en la
intensidad de la señal es un reflejo del mayor número de copias de
ADN de VPH presente en las células CaSki (400-600
copias de ADN de VPH-16/célula) comparado con las
células HeLa (10-50 copias de ADN de
VPH-18/célula).
Estos resultados demuestran que en una población
mixta de células, el presente procedimiento puede distinguir entre
células infectadas con ADN de VPH-16 y células
infectadas con ADN de VPH-18. Además, no hay
transferencia de señal desde un tipo celular hasta el otro dado que
las señales positivas se mantienen sólo dentro de los tipos
celulares apropiados. Además, pueden detectarse fácilmente dianas
incluso de baja abundancia con el presente procedimiento sin los
problemas de fondo y reactividad cruzada que podrían introducirse
mediante la presencia de otro genotipo de VPH.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la detección de ARN, se fijaron células
crecidas en portaobjetos de cámara (Nº
12-565-18, Fisher Scientific,
Pittsburgh, PA) con formaldehído al 4% en PBS durante 30 minutos a
TA, se trataron con 10 \mug/ml de proteinasa K en PBS durante 10
minutos a TA, y se lavaron entonces dos veces durante 5 minutos en
PBS. Se incubaron las muestras a 40ºC durante 3 horas con 1 pmol de
sondas diana específicas para VPH en un tampón de sonda diana (6X
SSC, formamida al 25%, BRIJ®-35 al 0,2%, caseína al 0,2%), y se
lavaron entonces siguiendo la misma serie decreciente de tampones
SSC tal como se describió en el ejemplo 1. Similarmente, las
condiciones de hibridación con sonda de preamplificador,
amplificador y conjugada con FA y de lavado fueron las mismas que
las descritas en el
ejemplo 1.
ejemplo 1.
Para la localización subcelular de las dianas de
ADN, se hicieron crecer células HeLa durante toda la noche sobre
portaobjetos de cámara recubiertos con
poli-D-lisina. La
poli-D-lisina está disponible de
Sigma (código de producto P7280). Al día siguiente, se retiró el
medio de cultivo celular; se lavaron las células con PBS, se
fijaron entonces con formaldehído al 4% en PBS durante 30 minutos a
TA, y se valoraron para detectar dianas de ADN mediante hibridación
con sondas diana de VPH-18 o, como control negativo,
sondas diana de VPH-16.
Se añadió un sustrato de FA (Fast Red, DAKO
Corporation) y se incubaron los portaobjetos a TA durante 4 minutos.
Tras parar la reacción lavando en PBS, se postfijaron las muestras
en formaldehído al 4% en PBS durante 5 minutos a TA y entonces se
tiñeron por contraste durante 40 segundos con hematoxilina o bien
bisbenzimida. Se visualizaron los portaobjetos y se generaron
imágenes y se imprimieron tal como se describe en el ejemplo 1.
La hibridación de células HeLa (preparadas para
la detección de ARN) con sondas diana de VPH-18 dio
como resultado la detección de ARNm de VPH-18,
principalmente en el citoplasma (punta de flecha, figura 4A). Sin
embargo, no se observó señal en estas mismas células incubadas con
sondas diana de VPH-16 (Figura 4B).
En cambio, la hibridación de células HeLa
(preparadas para la detección de ADN) con sondas diana de VPH18 dio
como resultado la detección de ADN de VPH-18 en los
núcleos de células HeLa (flecha, figura 4C). Sin embargo, no se
observó señal en estas mismas células incubadas con sondas diana de
VPH-16 (figura 4D).
Estos resultados muestran que el ARNm de VPH y
el ADN de VPH están ubicados en compartimentos diferentes dentro de
las células. En particular, el ARNm viral se ubica predominantemente
en el citoplasma, mientras que el ADN viral está limitado al
núcleo. Estos resultados también muestran que las señales positivas
se mantienen dentro del compartimiento de la célula en el que se
ubica el ácido nucleico diana. En otras palabras, la diana y la
señal se localizan conjuntamente.
\newpage
El presente procedimiento proporciona una
localización subcelular precisa, produciendo señales positivas
mantenidas dentro de los compartimentos subcelulares en los que se
ubican las secuencias de ácido nucleico diana.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó un protocolo similar al del ejemplo 1
para la hibridación in situ en tejidos, tal como sigue.
Brevemente, se eliminó la cera de secciones de parafina fijadas con
formalina de tejido de cuello uterino y se rehidrataron usando
histología convencional con xilenos y una serie graduada de alcohol.
Para la detección de ADN, se digirió el tejido con ARNasa a 100
\mug/ml de ARNasa en un tampón de ARNasa (NaCl 0,5M, Tris 10 mM pH
9,0, EDTA 1 mM) a 37ºC durante 1 hora, seguido por digestión con
proteinasa K (12 \mug/ml en tampón de proteinasa K o PBS) a 37ºC
durante 10 minutos. Se inactivó la proteinasa K mediante
postfijación en paraformaldehído al 4% en PBS a 4ºC durante 10
minutos. Tras varios lavados en PBS, se acetiló el tejido en TEA 1 M
tal como se describe en Angerer et al. (1987) In situ
Hybridization with RNA Probes-An Annotated Recipe.
En Valentine K. L. et al., eds., In situ
Hybridization-Applications to Neurobiology, Oxford,
Oxford University Press: 71-96. Se deshidrataron
secciones en una serie de etanol antes de la desnaturalización
durante 5 minutos a 92ºC en DB (formamida al 80%, 2 X SSC) sobre
Hybaid (Phenix), seguido por la inmersión en etanol al 70% frío y
deshidratación. Tras una incubación de 30 minutos en un tampón de
prehibridación, se añadieron sondas oligonucleotídicas diana en
tampón de prehibridación recién preparado a una concentración de 10
fmol/\mul y se cubrieron con el cubreobjetos. Se llevó a cabo la
hibridación en una cámara humidificada sobre un calentador de
portaobjetos Fischer a 37ºC durante 1-3
hora(s), con los mismos lavados y amplificación de la señal
descritos previamente en el ejemplo 1. Tras la hibridación, se
lavaron las secciones en una serie graduada de SSC hasta 0,1 X SSC
durante un total de 15 minutos de tiempo de lavado. A la hibridación
en 1 fmol/\mul de preamplificador en disolución de hibridación B
durante 25 minutos a 55ºC, le siguieron 3 lavados en 0,1 X SSC
durante 5 minutos de tiempo de lavado total. A la hibridación en 1
fmol/\mul de amplificador en disolución de hibridación B durante
25 minutos a 55ºC le siguieron varios lavados en 0,1 X SSC. A la
hibridación en 1 fmol/\mul de sonda de marcador en disolución de
hibridación B a 55ºC durante 15 minutos le siguieron lavados en 0,1
X SSC e incubación en lavado D. Se preparó Fast Red inmediatamente
antes de su aplicación a las secciones, y se paró el revelado del
color entre 4 y 10 minutos. Se tiñeron los núcleos con hematoxilina,
y se cubrieron los portaobjetos con cubreobjetos para la
microscopía. Se inactivó la fosfatasa alcalina endógena con
levamisol,
de 1 \muM a 5 \muM.
de 1 \muM a 5 \muM.
La hibridación in situ detectó
VPH-16 en CIN II (neoplasia intraepitelial cervical)
de tejido del cuello uterino que tiene cambios citopáticos
asociados con VPH (muestra Nº 00B01-627, Clinomics
BioSciences, Inc., Pittsfield MA). Se tiñeron los núcleos celulares
en cada una de las secciones con hematoxilina. La figura 5A
representa la distribución de la expresión génica de
VPH-16 (zonas teñidas) dentro del epitelio escamoso
del ectocérvix. Una mayor amplificación de la región en el recuadro
en la figura 5A muestra la presencia de ARNm de
VPH-16 en el citosol de algunas células epiteliales
escamosas (Figura 5B). La figura 5C muestra que se detectó el ADN
de VPH-16 en el núcleo de células escamosas en una
sección de tejido adyacente a la región en el recuadro en la figura
5A. Sin embargo, no se detectó ADN de VPH-18 en una
sección adyacente (figura 5D). Tal como se esperaba, se detectó
ARNm de GAPDH en todo el epitelio escamoso cerca de la zona de
transformación (figura E). Las figuras 5A y 5E tienen un aumento de
200 x mientras que las figuras 5B, 5C y 5D tienen un aumento de 600
x.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la hibridación in situ
usando el procedimiento similar al del ejemplo 4 para detectar ADN
de VPH-16 en regiones de cambios citopáticos
característicos de lesiones CIN II en tejido del cuello uterino que
tienen cambios citopáticos asociados con VPH (muestra Nº
00B01-624, Clinomics BioSciences, Inc., Pittsfield
MA), tal como sigue. Se tiñeron los núcleos celulares en secciones
con hematoxilina. Las puntas de flecha grandes indican células
basales contiguas a lo largo de la membrana basal que separa el
epitelio escamoso del estroma subyacente. En una región de
maduración escamosa aparentemente normal, no se detectó ADN de
VPH-16, las células basales estaban limitadas cerca
de la membrana basal, y la parte apical del epitelio estaba
comprendida principalmente por células escamosas diferenciadas con
un citosol característicamente grande (figura 6A). Una región
cercana de la misma sección de tejido mostró una maduración escamosa
anómala característica de la displasia moderada del cuello uterino
(CIN II) (figura 6B). Esta región diplásica mostró un
sobrecrecimiento de células basales, mezclas de células basales y
células escamosas diferenciadas en la región epitelial apical, y la
presencia de ADN de VPH-16 (zona teñida) (figura
6B). Un aumento mayor mostró la presencia de ADN de
VPH-16 en células basales, tal como se indica
mediante flechas más pequeñas (figura 6C). Las figuras 6A y 6B
tienen un aumento de 400x y la figura 6C tiene un aumento de
600x.
Se usó hibridación in situ usando sondas
de VPH específicas del genotipo y el procedimiento del ejemplo 4
para detectar ADN de VPH en secciones de tejido CIN II y en
secciones de cuello uterino normal. Se tiñeron por contraste los
núcleos celulares en las secciones con hematoxilina. Las zonas
teñidas indicaban la presencia del ácido nucleico diana, ADN viral
(figuras 7A, 7B, 7C, 7D, 7E y 7F) o bien ARNm endógeno (figura 7G).
Se detectó ADN de VPH-16 en el epitelio
ectocervical escamoso de tejido CIN II Nº 00B01-624
(figura 7A), pero no se detectó VPH-18 (figura 7B).
Se detectó ADN de VPH-18 en tejido CIN II que tenía
cambios citopáticos asociados con VPH (muestra Nº
00B01-625, Clinomics BioSciences, Inc., Pittsfield,
MA) tal como se muestra en la figura 7D, pero no se detectó
VPH-16 (figura 7C). Tal como se esperaba, no se
detectó ADN de VPH en el tejido de cuello uterino normal (muestra
Nº H-1188-88, Clinomics BioSciences,
Inc., Pittsfield MA) cuando se sometió a prueba con sondas de
VPH-18 (figura 7E) o VPH-16 (figura
7F). Tal como se esperaba, se detectó ARNm de GAPDH endógeno en el
tejido de cuello uterino normal (figura 7G).
Claims (21)
1. Un procedimiento para la detección in
situ de un analito de ácido nucleico dentro de una muestra de
material biológico que comprende realizar la hibridación de ADNr que
comprende las etapas de:
(a) preparar una muestra de material
biológico:
- (i)
- inmovilizando el material biológico sobre un sustrato;
- (ii)
- permeabilizando el material biológico unido a sustrato poniendo en contacto el material biológico unido a sustrato con una disolución que contiene Proteinasa K a una concentración de 0,5 \mug/ml a 50 \mug/ml;
- (iii)
- tratando la muestra con ARNasa de manera que se elimine todo el ARN en la muestra; y
- (iv)
- calentando el material biológico permeabilizado hasta una temperatura y durante un periodo de tiempo eficaces para desnaturalizar cualquier ADN de cadena doble;
(b) poner en contacto el material biológico con
un sonda oligonucleotídica diana en condiciones de hibridación, en
el que al menos una parte de la sonda diana es complementaria a al
menos una parte del analito de ácido nucleico, de manera que se
forma el complejo analito-sonda diana cuando el
analito de ácido nucleico está presente en la muestra;
(c) lavar el material biológico con un fluido de
lavado que comprende un detergente, a una temperatura en el
intervalo de 21ºC a 60ºC; y
(d) detectar cualquier complejo de
analito-sonda diana sobre el sustrato
- (i)
- poniendo en contacto el sustrato lavado y complejo analito-sonda diana con una sonda oligonucleotídica de preamplificador en condiciones de hibridación, en el que una primera parte de la sonda de preamplificador es complementaria a una parte de la sonda diana distinta de la parte de la sonda diana que es complementaria al analito de ácido nucleico, formando así un complejo analito-sonda diana-sonda de preamplificador cuando el analito de ácido nucleico está presente en la muestra;
- (ii)
- poniendo en contacto el producto de la etapa (d) (i) con una sonda oligonucleotídica de amplificador en condiciones de hibridación, en el que una primera parte de la sonda de amplificador es complementaria a una segunda parte de la sonda de preamplificador, formando así un complejo analito-sonda diana-sonda de preamplificador-sonda de amplificador cuando el analito de ácido nucleico está presente en la muestra;
- (iii)
- poniendo en contacto el producto de la etapa (d) (ii) con una sonda de marcador que comprende una sonda oligonucleotídica conjugada con fosfatasa alcalina en condiciones de hibridación, en el que una parte de la sonda de marcador se une a una segunda parte de la sonda de amplificador, formando así un complejo analito-sonda diana-sonda de preamplificador-sonda de amplificador-sonda de marcador cuando el analito de ácido nucleico está presente en la muestra;
- (iv)
- marcando el complejo analito-sonda diana-sonda de preamplificador-sonda de amplificador-sonda de marcador con un marcador detectable; y
- (v)
- detectando la presencia del marcador detectable sobre el sustrato,
en el que el analito de ácido nucleico es ADN,
un gen endógeno o un segmento del mismo.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el analito de ácido nucleico se selecciona del grupo
constituido por ADN de VIH, ADN de CMV, ADN de VPH, LAP e
IL-2.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1 ó
2, en el que el sustrato comprende vidrio o un plástico
elástico.
4. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la concentración de
Proteinasa K es desde 5 \mug/ml hasta 20 \mug/ml.
5. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que se usan de 0,1 pmoles a 10
pmoles de la sonda diana.
6. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el detergente en el fluido de
lavado es un tensioactivo hidrófilo.
7. Un procedimiento según la reivindicación 6,
en el que el tensioactivo hidrófilo es no iónico.
8. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el fluido de lavado es una
disolución tampón.
9. Un procedimiento según la reivindicación 8,
en el que la disolución tampón comprende las sales de metales
alcalinos.
10. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (c) se repite al
menos una vez.
11. Un procedimiento según la reivindicación 10,
en el que la etapa (c) se repite al menos dos veces.
12. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que (c) se lleva a cabo a desde
21ºC hasta 60ºC.
13. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que se usan aproximadamente de 1
fmol a 10 pmoles de la sonda oligonucleotídica de preamplificador y
aproximadamente de 1 fmol a 10 pmoles de la sonda oligonucleotídica
de amplificador.
14. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la muestra biológica
comprende una célula.
15. Un procedimiento según la reivindicación 14,
en el que la célula se aísla del grupo constituido por plasma,
suero, líquido cefalorraquídeo, semen, líquido linfático, las
secciones externas de la piel, secreciones de las vías
respiratorias, secreciones del tracto intestinal, secreciones del
tracto genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas,
tumores, órganos, y constituyentes de cultivo celular in
vitro.
16. Un procedimiento según la reivindicación 14,
en el que la célula se selecciona del grupo constituido por células
suprarrenales, de vejiga, médula ósea, cerebro, mama, cardíacas,
colon, esófago, intestinales, renales, hepáticas, pulmonares, de
ganglios linfáticos, nervios, ovarios, pancreáticas, prostáticas,
del músculo esquelético, músculo liso, bazo, estómago, testículos,
amígdalas, traqueales y uterinas.
17. Un procedimiento según la reivindicación 14,
en el que la muestra de material biológico se inmoviliza sobre un
sustrato usando una centrifugadora.
18. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que la muestra biológica comprende un
tejido.
19. Un procedimiento según la reivindicación 18,
en el que el tejido se selecciona del grupo constituido por tejido
suprarrenal, de vejiga, médula ósea, cerebro, mama, cardiaco, colon,
esófago, intestinal, renal, hepático, pulmonar, ganglios linfáticos,
nervios, ovarios, pancreático, prostático, músculo esquelético,
músculo liso, bazo, estómago, testículos, amígdalas, traqueal y
uterino.
20. Un procedimiento según la reivindicación 18
ó 19, en el que la muestra de material biológico se inmoviliza sobre
un sustrato usando secciones del tejido.
21. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en el que la identificación de la posición
del complejo analito-sonda diana dentro de una
célula de la muestra biológica es indicativa de la posición del
analito de ácido nucleico dentro de la célula.
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