상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 미리 정해진 범위 내의 염기 서열에 있어서,
상기 염기 서열 중 분석 대상 염기 서열군을 설정하는 단계;
상기 염기 서열군에서 선택할 프로브의 염기 서열 범위를 설정하는 단계;
상기 염기 서열 범위 내에서 프로브 후보를 선택하되, 상기 프로브 후보의 길이가 20 내지 50 mer 인 프로브 후보를 선택하는 단계;
상기 프로브 후보 중에서, 프로브 후보에 대한 타겟 핵산과 프로브 후보 간의 융해 온도가 50 내지 80℃인 프로브 후보를 선택하는 단계;
상기 선택된 프로브 후보 중에서, 상기 분석 대상 염기 서열군의 각 염기 서열 중에서 타겟 핵산의 염기 서열을 제외한 다른 염기 서열과, 상기 선택된 프로브 후보와의 융해 온도가, 하이브리디제이션 조건의 온도 이하인 프로브 후보를 선택하는 단계; 및
상기 선택된 프로브 후보 중에서 2차 구조의 융해 온도가, 하이브리디제이션 조건의 온도보다 5 내지 10℃ 낮은 온도 및 그 이상의 온도인 프로브 후보를 선택하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 특이도(specificity) 높는 프로브 선택방법을 제공한다.
상기 염기 서열 범위 내에서 선택된 프로브 후보의 길이는 30 내지 35 mer인 것이 더욱 바람직하고, 상기 프로브 후보에 대한 타겟 핵산과 프로브 후보 간의 융해 온도는 65 내지 75℃인 것이 더욱 바람직하다.
상기 분석 대상 염기 서열군의 각 염기 서열 중에서 타겟 핵산의 염기 서열을 제외한 다른 염기 서열과, 상기 선택된 프로브 후보와의 융해 온도가, 하이브리디제이션 조건의 온도보다 5 내지 10℃ 낮은 온도 및 그 이하의 온도인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 선택된 프로브 후보 중에서 2차 구조의 융해 온도가, 하이브리디제이션 조건의 온도 이상인 프로브 후보를 선택하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명은 인유두종 바이러스(HPV)의 각 유전형에 따른 L1 유전자, E6 유전자 및 E1 유전자의 염기 서열군으로 이루어진 군중에서 1종 이상의 서열군을 선택하는 단계;
상기 선택된 염기 서열군내에서 프로브 후보를 선택하되, 상기 프로브 후보의 길이가 20 내지 50 mer 인 프로브 후보를 선택하는 단계;
상기 프로브 후보 중에서, 프로브 후보에 대한 타겟 핵산과 프로브 후보 간의 융해 온도가 50 내지 80℃인 프로브 후보를 선택하는 단계;
상기 선택된 프로브 후보 중에서, 상기 분석 대상 염기 서열군의 각 염기 서열 중에서 타겟 핵산의 염기 서열을 제외한 다른 염기 서열과, 상기 선택된 프로브 후보와의 융해 온도가, 하이브리디제이션 조건의 온도 이하인 프로브 후보를 선택하는 단계; 및
상기 선택된 프로브 후보 중에서 2차 구조의 융해 온도가, 하이브리디제이션 조건의 온도보다 5 내지 10℃ 낮은 온도 및 그 이상의 온도인 프로브 후보를 선택하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 인유두종 바이러스의 유전형을 분석하기 위한 특이도(specificity) 높는 프로브 선택방법을 제공한다.
상기 인유두종 바이러스(HPV)의 각 유전형에 있어서, L1 유전자의 염기 서열군을 선택하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 선택된 염기 서열군내에서 프로브 후보를 선택하되, 상기 프로브 후보의 길이가 30 내지 35 mer 인 프로브 후보를 선택하는 것이 더욱 바람직하고, 상기 프로브 후보에 대한 타겟 핵산과 프로브 후보 간의 융해 온도는 65 내지 75℃인 것이 더욱 바람직하다.
상기 분석 대상 염기 서열군의 각 염기 서열 중에서 타겟 핵산의 염기 서열 을 제외한 다른 염기 서열과, 상기 선택된 프로브 후보와의 융해 온도가, 하이브리디제이션 조건의 온도보다 5 내지 10℃ 낮은 온도 및 그 이하의 온도인 프로브 후보를 선택하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 선택된 프로브 후보 중에서 2차 구조의 융해 온도가, 하이브리디제이션 조건의 온도 이상인 프로브 후보를 선택하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명은 인유두종 바이러스(HPV)에 대한 프라이머 중 염기 서열 목록 서열 번호 301 및 302, 303 및 304 두 쌍의 프라이머 중 한 쌍 이상을 선택하고, 상기 선택된 프라이머에 의해 증폭되는 인유두종 바이러스(HPV)의 각 유전형에 따른 유전자 부위에 있어서,
상기 유전자 부위에서 프로브 후보를 선택하되, 상기 프로브 후보의 길이가 20 내지 50 mer 인 프로브 후보를 선택하는 단계;
상기 프로브 후보 중에서, 프로브 후보에 대한 타겟 핵산과 프로브 후보 간의 융해 온도가 50 내지 80℃인 프로브 후보를 선택하는 단계;
상기 선택된 프로브 후보 중에서, 상기 분석 대상 염기 서열군의 각 염기 서열 중에서 타겟 핵산의 염기 서열을 제외한 다른 염기 서열과, 상기 선택된 프로브 후보와의 융해 온도가, 하이브리디제이션 조건의 온도 이하인 프로브 후보를 선택하는 단계; 및
상기 선택된 프로브 후보 중에서 2차 구조의 융해 온도가, 하이브리디제이션 조건의 온도보다 5 내지 10℃ 낮은 온도 및 그 이상의 온도인 프로브 후보를 선택하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 인유두종 바이러스의 유전형을 분석하기 위한 특이도(specificity) 높는 프로브 선택방법을 제공한다.
상기 선택된 염기 서열군내에서 프로브 후보를 선택하되, 상기 프로브 후보의 길이가 30 내지 35 mer 인 프로브 후보를 선택하는 것이 더욱 바람직하고, 상기 프로브 후보에 대한 타겟 핵산과 프로브 후보 간의 융해 온도는 65 내지 75℃가 더욱 바람직하다.
상기 분석 대상 염기 서열군의 각 염기 서열 중에서 타겟 핵산의 염기 서열을 제외한 다른 염기 서열과, 상기 선택된 프로브 후보와의 융해 온도가, 하이브리디제이션 조건의 온도보다 5 내지 10℃ 낮은 온도 및 그 이하의 온도인 프로브 후보를 선택하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 선택된 프로브 후보 중에서 2차 구조의 융해 온도가, 하이브리디제이션 조건의 온도 이상인 프로브 후보를 선택하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 방법들에 의해 선택된 프로브로서, 서열 번호 1 내지 286의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군중에서 선택된 인유두종바이러스의 DNA 및 RNA와 상보적으로 결합하는 프로브를 제공한다.
상기 프로브는 상기 서열 번호 중 1, 7, 14, 26, 27, 34, 41, 50, 54, 59, 61, 66, 75, 80, 83, 89, 97, 109, 113, 125, 140, 151, 166, 172, 184, 189, 207, 213, 217, 228, 236, 249, 264, 270, 276, 283의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군중에서 선택된 것이 더욱 바람직하고, 상기 서열 번호 중 1, 7, 26, 27, 34, 41, 50, 54, 59, 61, 66, 75, 80, 83, 89, 97, 109, 113, 125, 140의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군중에서 선택된 것이 가장 바람직하다.
본 발명은 또한 상기 선택된 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 인유두종 바이러스 DNA 칩을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명자들은 핵산(nucleic acid)으로 이루어진 특이도(specificity) 높은 프로브를 미리 정해진 범위 내의 염기 서열로부터 선택하기 위한 방법의 확립에 대한 연구를 하였다.
본 발명에서 핵산(nucleic acid)이라 함은, DNA 또는 RNA와 같이 자연적으로 세포 내에 존재하는 핵산뿐만 아니라, PNA(peptide nucleic acid) 또는 LNA (locked nucleic acid) 등과 같이 인위적으로 합성한 핵산을 포함한다. 또한 DNA의 길이가 100 mer 미만으로 짧은 경우에, 올리고뉴클레오티드라고 한다.
본 발명에서 프로브(probe)라 함은, 시료 내에서 검출하고자 하는 미리 정해진 한 가지 염기 서열의 핵산과 강한 결합력을 형성하는 핵산 분자를 말한다. 이 때 미리 정해진 한 가지 염기 서열을 프로브에 대한 타겟(target) 핵산이라 한다. 또한 상기 강한 결합력은 프로브의 염기 서열과 그와 결합하는 핵산의 서열이 완전히 상보적인 경우 형성되는 결합이다. 또한 프로브 후보라 함은, 프로브로써 선택될 가능성이 있는 핵산 분자를 말한다.
본 발명에서 특이도(specificity)라 함은, 하나의 프로브가 미리 정해진 하나의 염기 서열의 핵산과만 결합하며, 다른 염기 서열을 가지는 핵산과는 결합하지 않는 정도를 말한다. 즉, 특이도가 높은 프로브일수록 정해진 하나의 염기 서열을 가지는 핵산 이외의 다른 서열을 가지는 핵산과 결합할 확률이 낮아진다.
본 발명에서 시료라 함은, 임상적으로 의의를 가지는 인체 내에서 채취한 액상 또는 고체상의 물질 또는 액상과 고체상 물질의 조합으로, 세포 조직, 조직에서 떼어낸 세포, 고정화된 세포, 혈액 등의 각종 체액을 포함한다.
본 발명에서 하이브리디제이션 반응(hybridization reaction) 또는 하이브리디제이션이라 함은, 프로브와 임의의 시료 또는 시료로부터 추출된 물질을 접촉시킴으로써 시료 내의 타겟 핵산 또는 타겟 핵산의 증폭 산물과 프로브의 결합을 일으키는 과정을 의미한다. 또한 하이브리디제이션 온도라 함은, 하이브리디제이션 반응이 일어나는 온도를 말한다. 또한 하이브리디제이션 조건이라 함은, 하이브리디제이션 반응이 일어나는 온도 및 용액의 이온 농도의 요소를 포함한다.
본 발명에서 핵산의 2차 구조라 함은, 단일 가닥으로 이루어진 핵산 분자가 염기 서열의 변화 없이 자체적으로 가지는 구조의 변형에 의해서 핵산의 일부분이 다른 부분과 결합하여 부분적으로 이중 나선을 이루고 또 다른 부분에서는 단일 가닥의 형태로 존재하는 분자의 형태를 의미한다. 본 발명에서 핵산의 2차 구조는 도 1에 나타난 다양한 형태의 분자 구조를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 제공하는 높은 특이도(specificity)를 가지는 프로브를 선택하기 위한 방법은 컴퓨터 시뮬레이션에 의해 다음과 같은 과정으로 이루어진다.
(1) 분석 대상 염기 서열군을 설정하는 단계,
(2) 상기 선택된 염기 서열군에서 프로브를 선택할 염기 서열 범위를 설정 하는 단계,
(3) 상기 서열 범위 내에서 정해진 길이의 프로브 후보를 선택하는 단계,
(4) 상기 단계에서 선택된 프로브 후보와 그에 대한 타겟 핵산 간의 융해 온도가 적정 범위 내에 있는 프로브 후보를 선택하는 단계,
(5) 상기 단계에서 선택된 프로브 후보와 상기 분석 대상 염기 서열군의 각 염기 서열 중에서 타겟 핵산의 염기 서열을 제외한 다른 염기 서열과의 융해 온도가 적정 온도 이하인 프로브 후보를 선택하는 단계, 및
(6) 상기 단계에서 선택된 프로브 후보의 2차 구조의 융해 온도가 적정 온도 이상인 프로브 후보를 선택하는 단계를 포함한다.
상기 방법의 바람직한 예에서 (1)의 분석 대상 염기 서열군은 분석하고자 하는 유전자 또는 기타 염기 서열 부위 및 그와 상보적인 염기 서열을 포함하는 염기 서열의 집합이다. 상기 분석대상의 염기 서열군 중 프로브로 탐색할 염기서열의 범위를 선택하여 상기 범위로부터 프로브 후보를 선택한다. 이 때, 프로브 후보를 선택하는 방법을 예를 들어 설명하면 다음과 같다.
예를 들어, HPV의 유전형을 탐색한다면 각 HPV 유전형에서 L1 유전자를 탐색할 염기 서열 범위로 선택할 수 있다. 그런 다음, 서열번호 301 및 302 프라이머로 증폭되는 L1 유전자의 염기서열에서 프로브 후보를 선택한다. 상기 프로브 후보의 선택방법은 다음과 같다. 즉, PCR과정으로 증폭되는 상기 L1 유전자의 염기서열이 약 100mer이고 프로브를 약 30mer의 길이로 만든다면, 상기 L1 유전자의 염기서열을 첫 번째 염기로부터 30mer씩 잘라 프로브 후보를 만들고, 다음은 상기 L1 유 전자의 두 번째 염기로부터 30mer 씩 잘라 프로브 후보를 만든다. 이러한 방법으로 계속 염기서열을 잘라 프로브 후보를 만들어 낸 후, 그로부터 융해온도 등을 고려하여 프로브를 선택하게 된다.
상기 방법에서 (3)의 정해진 길이는 바람직하게는 20 내지 50 mer이며, 더욱 바람직하게는 30 내지 35 mer이다. 상기 길이가 20mer 미만이면 결합력이 약해 감도(sensitivity)가 낮아지게 될 수 있고, 50mer를 초과하면 다른 프로브와 교차반응을 하는 등 비특이적인 결합이 많아질 우려가 있다.
상기 방법에서 (4)의 융해 온도를 계산하는 일예로, SantaLucia에 의해 알려져 있는(John SantaLucia, Jr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1460-1465 (1998)) Nearest-Neighbor 방법이 있다. 또한 상기 (4)에서 적정 범위는 바람직하게는 50 내지 80℃의 범위이며, 더욱 바람직하게는 65 내지 75℃의 범위이다.
융해온도는 프로브와 시료 내의 타겟 핵산의 염기서열의 상보성이 높아 매치(matching)가 잘 될 수록, 또한 상기 염기서열에 GC 결합이 많을수록 높아진다. 예를들면, HPV의 타입중 HPV16의 프로브와 그 타겟 핵산의 융해온도가 75℃ 정도라 할 때, HPV18과 HPV16에 해당하는 프로브와의 융해온도는 상기 프로브의 특이도가 높을수록 75℃보다 낮아지게 된다. 이렇게 결정된 융해온도의 범위가 50 내지 80℃이며, 이 때 50℃보다 융해온도가 낮으면 결합력이 떨어질 우려가 있고, 통상적인 융해온도는 80℃ 이하이다.
상기 방법에서 (5)의 적정 온도는 바람직하게는 하이브리디제이션 조건의 온도이며, 더욱 바람직하게는 하이브리디제이션 조건의 온도보다 5 내지 10℃ 낮은 온도이다. 즉, 상기 적정 온도는 프로브의 특이도가 높을수록 프로브와 타겟 핵산의 융해온도보다 낮아질 것이고, 이러한 특이도를 유지하기 위해서 (4)의 최저 융해온도 범위인 50℃ 보다 낮은 하이브리디제이션 조건의 온도가 (5)의 적정온도로서 바람직하다. 통상적으로 하이브리디제이션 조건의 온도는 약 40℃이다.
또한 상기 방법에서 (6)의 2차 구조의 융해 온도를 계산하는 일예로, Zuker에 의해 알려져 있는(M. Zuker, Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-15, (2003)) 핵산의 2차 구조의 융해 온도를 계산하는 방법이 있다. 또한 상기 (6)의 적정 온도는 바람직하게는 하이브리디제이션 조건의 온도보다 5 내지 10℃ 낮은 온도이며, 더욱 바람직하게는 하이브리디제이션 조건의 온도이다.
안정적인 2차구조를 가진 프로브는 민감도가 떨어지고 타겟 핵산 및 그 이외의 염기서열과의 융해온도가 낮아진다. 또한, 상기 타겟 핵산과 프로브의 융해온도가 타겟 핵산이 아닌 다른 염기서열과 프로브의 융해온도보다 높아야 프로브의 특이도를 유지시킬 수 있으므로, 상기 (6)의 융해온도가 상기 (5)의 적정 온도보다 높다면 프로브의 특이도를 유지시킬 수 있다. 따라서, 상기 (6)의 융해온도는 하이브리디제이션 조것의 온도보다 5 내지 10℃ 낮은 온도보다 높아야 바람직하다.
본 발명에서 제공하는 프로브의 선택 방법은 프로브를 선택할 염기 서열군이 미리 정해진 경우에 가능하며, 이러한 염기 서열군의 일 예로서 HPV의 유전형에 따른 L1 유전자, E1 유전자, E6 유전자 등이 있다. 또한, 다른 예로는 다음 표1의 프라이머(primer)를 사용하여 증폭되는 HPV의 유전형별 유전자 부위가 있다.
SEQ. ID No. |
프라이머 명칭 |
서열 (5 3) |
염기수 |
301 |
Gp5d+ |
TTTKTTACHGTKGTDGATACYAC |
23 |
302 |
Gp6d+ |
GAAAHATAAAYTGYAADTCATAYTC |
25 |
303 |
Gp5d2 |
TTTKTWACHGTKGTDGAYACHWC |
23 |
304 |
Gp6d2 |
GAAAHAYAAAYTGYAADTCAWAYTC |
25 |
상기 표 1에서 R(A, G): Y(C,T): M(A,C): K(G,T): S(G, C): W(A, T): V(A, C, G): H(A, C, T): B(G, T, C): D(A, G, T)를 의미하며, 이는 본 기술 분야의 전문가에게 널리 알려져 있다.
본 발명에서 제공하는 HPV의 유전형을 분석하기 위한 높은 특이도를 가지는 프로브를 효과적으로 선택하기 위한 방법은 HPV의 각 유전형에 따른 L1 유전자 또는 E6 유전자 또는 E1 유전자의 염기 서열군에서
(1) 정해진 길이의 프로브 후보를 선택하는 단계,
(2) 상기 단계에서 선택된 프로브 후보와 그에 대한 타겟 핵산 간의 융해 온도가 적정 범위 내에 있는 프로브 후보를 선택하는 단계,
(3) 상기 단계에서 선택된 프로브 후보와 상기 분석 대상 염기 서열군의 각 염기 서열 중에서 타겟 핵산의 염기 서열을 제외한 다른 염기 서열과의 융해 온도가 적정 온도 이하인 프로브 후보를 선택하는 단계, 및
(4) 상기 단계에서 선택된 프로브 후보의 2차 구조의 융해 온도가 적정 온도 이상인 프로브 후보를 선택하는 단계를 포함한다.
또한 본 발명에서 제공하는 HPV의 유전형을 분석하기 위한 프로브를 선택하는 방법은 인유두종 바이러스(HPV)에 대한 프라이머 중 염기 서열 목록 서열 번호 301과 302, 또는 303과 304 두 쌍 중 한 쌍이상의 프라이머를 이용하여 증폭되는 HPV의 각 유전형에 따른 유전자 부위에서
(1) 정해진 길이의 프로브 후보를 선택하는 단계,
(2) 상기 단계에서 선택된 프로브 후보와 그에 대한 타겟 핵산 간의 융해 온도가 적정 범위 내에 있는 프로브 후보를 선택하는 단계,
(3) 상기 단계에서 선택된 프로브 후보와 상기 분석 대상 염기 서열군의 각 염기 서열 중에서 타겟 핵산의 염기 서열을 제외한 다른 염기 서열과의 융해 온도가 적정 온도 이하인 프로브 후보를 선택하는 단계, 및
(4) 상기 단계에서 선택된 프로브 후보의 2차 구조의 융해 온도가 적정 온도 이상인 프로브 후보를 선택하는 단계를 포함한다.
본 발명에서는 상기 방법을 이용하여, 서열 목록 서열 번호 1 내지 286에 기재된 프로브와 타겟 핵산간의 융해 온도 및 2차 구조의 융해 온도를 얻었으며, HPV의 DNA 또는 RNA와 결합할 수 있고 하이브리디제이션 반응의 조건에서 안정한 2차 구조를 가지는 신규한 프로브를 선택하였다.
본 발명은 상기 방법에 의해 선택된 프로브로서, 서열 번호 1 내지 286에 표시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군중에서 선택된 인유두종 바이러스의 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합하는 신규한 프로브를 제공한다.
상기 본 발명에 따른 신규한 프로브 중 서열 번호 1, 7, 14, 26, 27, 34, 41, 50, 54, 59, 61, 66, 75, 80, 83, 89, 97, 109, 113, 125, 140, 151, 166, 172, 184, 189, 207, 213, 217, 228, 236, 249, 264, 270, 276, 283에 기재된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 인유두종바이러스의 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합하는 프로브가 더욱 바람직하고, 서열 번호 1, 7, 26, 27, 34, 41, 50, 54, 59, 61, 66, 75, 80, 83, 89, 97, 109, 113, 125, 140에 기재된 염기서열을 갖는 올리고뉴클오티드로 이루어진 군에서 선택된 인유두종바이러스의 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합하는 프로브가 가장 바람직하다.
이하 구체적인 실시예를 들어 본 발명을 설명하나 본 발명이 이들 예에만 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] HPV 67번 유전형에 대한 프로브의 선택
제 1단계: 분석 대상 염기 서열군을 설정
분석하고자 하는 염기 서열군을 각 HPV의 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, 69, 6, 11, 34, 40, 42, 43, 44, 26, 30, 54, 70, 72, 82, 53, 61, 62, 67, 71, 74, 83, 84, 85, 89, 90, 91, CP8304, 73, MM4, MM7, MM8, MM9, CP6108, IS039, 55, 57의 유전자형의 L1 유전자의 염기 서열 및 그와 상보적인 염기 서열의 집합으로 정하였다.
제 2단계: 프로브를 선택할 염기 서열 범위 설정
상기 선택한 염기 서열군 중 HPV 67번 유전형의 염기 서열에 대해 서열 목록 번호 301 및 302, 또는 303 및 304의 프라이머를 사용하여 증폭할 수 있는 염기 서열 부위를 선택하였다.
제 3단계: 정해진 길이의 프로브 후보의 선택
상기 선택한 염기 서열 범위 내에서 길이가 30 mer인 프로브 후보 110개를 선택하였다.
제 4단계: 프로브 후보와 그에 대한 타겟 핵산 간의 융해 온도의 계산
상기 선택한 프로브 후보 110개 중 타겟 핵산과의 융해 온도가 SantaLucia의 Nearest Neighbor method로 계산하였을 때 하이브리디제이션 조건에서 65 ℃ 내지 75 ℃인 프로브를 선택하였다.
제 5단계: 프로브 후보와 상기 분석 대상 염기 서열군의 각 염기 서열 중에서 타겟 핵산의 염기 서열을 제외한 다른 염기 서열과의 융해 온도의 계산
상기 선택한 프로브 후보 중 분석 대상 염기 서열군의 각 염기 서열 중에서 타겟 핵산의 염기 서열을 제외한 다른 염기 서열과의 융해 온도가 하이브리디제이션 조건에서 35 ℃ 이하인 것을 선택하여 표2와 같이 21 개의 프로브 후보를 선택하였다.
프로브 이름
|
염기 서열 (5' - 3')
|
타겟과의 Tm (℃)
|
다른 염기 서열과의 Tm (타입, Tm(℃))
|
67_41 |
TTTATGTTCTGAGGAAAAATCAGAGGCTAC |
65.8 |
52 (19.8) |
67_42 |
TTATGTTCTGAGGAAAAATCAGAGGCTACA |
67.5 |
52 (19.6) |
67_44 |
ATGTTCTGAGGAAAAATCAGAGGCTACATA |
66.2 |
52 (20.1) |
67_45 |
TGTTCTGAGGAAAAATCAGAGGCTACATAC |
66.8 |
52 (15.7) |
67_46 |
GTTCTGAGGAAAAATCAGAGGCTACATACA |
67.8 |
52 (13.7) |
67_47 |
TTCTGAGGAAAAATCAGAGGCTACATACAA |
67.5 |
52 (7.8) 16 (6.9) |
67_48 |
TCTGAGGAAAAATCAGAGGCTACATACAAA |
67.3 |
16 (13.9) |
67_49 |
CTGAGGAAAAATCAGAGGCTACATACAAAA |
67.6 |
16 (19.6) |
67_50 |
TGAGGAAAAATCAGAGGCTACATACAAAAA |
65.9 |
16 (26.0) |
67_51 |
GAGGAAAAATCAGAGGCTACATACAAAAAT |
66.4 |
16 (30.3) |
67_52 |
AGGAAAAATCAGAGGCTACATACAAAAATG |
66.7 |
16 (27.6) |
67_53 |
GGAAAAATCAGAGGCTACATACAAAAATGA |
65.6 |
16 (27.6) |
67_54 |
GAAAAATCAGAGGCTACATACAAAAATGAA |
64.4 |
16 (27.6) |
67_55 |
AAAAATCAGAGGCTACATACAAAAATGAAA |
65.1 |
16 (27.6) |
67_56 |
AAAATCAGAGGCTACATACAAAAATGAAAA |
63.5 |
16 (21.0) |
67_57 |
AAATCAGAGGCTACATACAAAAATGAAAAC |
65.6 |
16 (28.1) |
67_58 |
AATCAGAGGCTACATACAAAAATGAAAACT |
66.8 |
16 (30.8) |
67_59 |
ATCAGAGGCTACATACAAAAATGAAAACTT |
66.8 |
16 (33.4) |
67_60 |
TCAGAGGCTACATACAAAAATGAAAACTTT |
|
16 (35.0) |
67_61 |
CAGAGGCTACATACAAAAATGAAAACTTTA |
65.1 |
16 (34.0) |
제 6단계: 프로브 후보의 2차 구조의 융해 온도의 계산
상기 단계에서 선택된 프로브 후보의 2차 구조의 융해 온도를 Zuker의 방법으로 계산하였을 때 하이브리디제이션 조건의 온도인 40 ℃ 이상인 것을 선택하여 표3과 같이 10 개의 프로브를 선택하였다.
프로브 이름
|
염기 서열 (5' - 3')
|
타겟과의 Tm (℃)
|
2차 구조의 Tm (℃)
|
67_41 |
TTTATGTTCTGAGGAAAAATCAGAGGCTAC |
65.8 |
54.8 |
67_42 |
TTATGTTCTGAGGAAAAATCAGAGGCTACA |
67.5 |
54.8 |
67_44 |
ATGTTCTGAGGAAAAATCAGAGGCTACATA |
66.2 |
52.1 |
67_45 |
TGTTCTGAGGAAAAATCAGAGGCTACATAC |
66.8 |
54.8 |
67_46 |
GTTCTGAGGAAAAATCAGAGGCTACATACA |
67.8 |
54.8 |
67_47 |
TTCTGAGGAAAAATCAGAGGCTACATACAA |
67.5 |
54.8 |
67_48 |
TCTGAGGAAAAATCAGAGGCTACATACAAA |
67.3 |
54.8 |
67_49 |
CTGAGGAAAAATCAGAGGCTACATACAAAA |
67.6 |
51.1 |
67_53 |
GGAAAAATCAGAGGCTACATACAAAAATGA |
65.6 |
47.2 |
이상과 같은 방법으로 선택한 프로브를 HPV 유전형 67에 대한 프로브로 결정하였다.
[시험예1] 본 발명에서 제공하는 방법으로 선택된 프로브의 특이도 비교 실험
SEQ. ID No. |
HPV 유전형 |
서열 (5' - 3') |
305 |
16 |
TATGTGCTGCCATATCTACTTCAGAAACTACATA |
306 |
18 |
TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA |
307 |
31 |
TGTTTGTGCTGCAATTGCAAACAGTGATAC |
308 |
33 |
TTTATGCACACAAGTAACTAGTGACAGTAC |
309 |
35 |
TTCTGCTGTGTCTTCTAGTGACAGTACATA |
310 |
39 |
TCTACCTCTATAGAGTCTTCCATACCTTCT |
311 |
45 |
ACACAAAATCCTGTGCCAAGTACATATGAC |
312 |
51 |
AGCACTGCCACTGCTGCGGTTTCCCCAACA |
313 |
52 |
TGCTGAGGTTAAAAAGGAAAGCACATATAA |
314 |
56 |
TATTAGTACTGCTACAGAACAGTTAAGTAA |
315 |
58 |
CACTGAAGTAACTAAGGAAGGTACATATAA |
316 |
59 |
TCTACTACTTCTTCTATTCCTAATGTATAC |
317 |
66 |
CTAAAAGCACATTAACTAAATATGATGCCC |
318 |
6 |
ATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAA |
319 |
11 |
ATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAA |
320 |
34 |
GGTACACAATCCACAAGTACAACTGCACCA |
321 |
40 |
CTTATGTGCTGCCACACAGTCCCCCACACC |
322 |
42 |
CTGCAACATCTGGTGATACATATACAGCTG |
323 |
44 |
GCCACTACACAGTCCCCTCCGTCTACATAT |
324 |
68 |
TTTGTCTACTACTACTGAATCAGCTGTACCAAA |
325 |
69 |
AATCTGCATCTGCCACTTTTAAACCATCAGATT |
326 |
43 |
CCTCTACTGACCCTACTGTGCCCAGTACAT |
한국 특허 2003-0027178에 알려져 있던 서열 목록 서열 번호 305 내지 326에 기재된 염기 서열(표4)로부터 선택된 프로브를 갖는 DNA 칩(도 2)과 본 발명의 염기 서열 목록 서열 번호 1, 7, 26, 27, 34, 41, 50, 54, 59, 61, 66, 75, 80, 83, 89, 97, 109, 113, 125, 140에 기재된 염기 서열의 프로브를 갖는 DNA 칩(도 3)을 제조하였다.
HPV의 26번 유전형에 해당하는 플라스미드 DNA를 염기 서열 번호 301 및 302의 프라이머를 이용하여 중합 효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)으로 증폭한 후(94℃ 에서 5분간 변성 후, 94 ℃ 에서 1분간 변성, 50 ℃ 에서 2분간 프라이머 결합(primer annealing), 72 ℃ 에서 30 초간 연장(extension) 과정을 5회 반복 후, 94 ℃ 에서 1분간 변성, 50 ℃ 에서 2분간 프라이머 결합, 72 ℃ 에서 15 초간 연장 과정을 35회 반복한 뒤 72 ℃ 에서 2 분간 더 연장 반응을 하여 증폭함, 이 때 Cy5-dUTP 첨가), 상기 두 가지의 DNA 칩 위에서 하이브리디제이션을 수행하였다. 하이브리디제이션은 40℃에서 수행하였으며, 플라스미드 증폭 산물 10 uL, 글로빈 증폭 산물 5 uL의 혼합물을 반응시료로서 사용하였다. 전기 반응시료에 3 M 수산화나트륨 수용액을 10 % (v/v) 첨가하여 실온에서 5분간 변성시키고, 1M Tris-HCl (pH 7.2)을 5 % (v/v) 첨가하여 중화시켰다. 그런 후에, 상기 결과물에 3 M 염산을 10 % (v/v) 첨가한 후, 얼음에서 5분간 방치하였다. 이어서, 하이브리디제이션 용액 (6X SSPE, Sigma, Co.)을 사용하여 하이브리디제이션을 수행하였다. 이후, 3X SSPE로 2분, 1X SSPE로 2분간 DNA 칩을 세척하여 스핀 건조기(spin dryer)를 사용하여 건조하였다.
이를 콘포칼 레이져 스캐너(confocal LASER scanner, GSI Luminomics, Germany)를 이용하여 형광 신호를 분석하였다(excitation 650 nm, emission 668 nm)(도 4).
도 4에서 69번 프로브의 신호를 비교한 결과, 기존에 알려진 프로브보다 본 발명의 HPV 69에 대한 프로브가 높은 특이도를 보임을 확인하였다. 즉, 도 4a에서 HPV 69 프로브는 시료 내의 HPV 26 유전자와 비특이적(non-specific)하게 반응하여 강한 신호를 나타낸 반면, 도 4b의 HPV 69 프로브는 시료 내의 HPV 26 프로브와 거의 반응을 하지 않았다. 이를 표5에서 수치화하여 나타냈다.
SEQ. ID No. |
Signal to Background ratio |
116 |
1.56 |
325 |
7.25 |
표5에서 Signal to Background ration라 함은, 각 프로브에서 얻은 신호의 평균값을 배경 신호의 평균값으로 나눈 것이다