ES2256984T3 - Deteccion de adn mediante un complejo de reasociacion de hebras. - Google Patents
Deteccion de adn mediante un complejo de reasociacion de hebras.Info
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Abstract
MEDIANTE LA COMBINACION DE INICIADORES MARCADOS PARA LA PREPARACION DE AMPLIFICADORES DE UNA CADENA DE UN ACIDO NUCLEICO CON UNA SONDA DE CAPTURA, QUE ES COMPLEMENTARIA A LA MISMA CADENA DEL ACIDO NUCLEICO, SE CONSIGUE UNA ELEVACION DE LA CAPACIDAD DE DISCRIMINACION EN LOS ENSAYOS DE HIBRIDACION.
Description
Detección de ADN mediante un complejo de
reasociación de hebras.
El objeto de la presente invención es un método
para detectar ácidos nucleicos, empleando la amplificación del
ácido nucleico con la ayuda de cebadores marcados, así como la
detección del producto amplificado mediante una sonda de
captura.
Desde el punto de vista diagnóstico y
bioanalítico ya no se puede prescindir de los ensayos de fijación
bioespecíficos que permiten detectar determinados analitos o
características de analitos mediante mecanismos de reconocimiento
molecular. Por ello en los últimos años, junto a los
inmuno-ensayos y los ensayos de
receptor-ligando, se han establecido firmemente los
ensayos de hibridación. En dichos ensayos se aprovecha el principio
de apareamiento de las bases nucleicas (A::T; G:::C), para el
reconocimiento molecular de ciertos ácidos nucleicos de los
analitos (p.ej. ADN, ARN) mediante el empleo de sondas que poseen la
especificidad requerida. Así p.ej. mediante sondas formadas por una
secuencia escogida de 18 - 20 nucleótidos pueden efectuarse
reconocimientos inequívocos incluso más allá del genoma humano.
Los ensayos de hibridación (= ensayos basados en
sondas) están experimentando una interesante y prometedora
ampliación mediante las denominadas tecnologías de chips NA. En este
caso hay al menos 2, mayormente varias hasta muchas, sondas con
distintas secuencias, y por lo tanto con distinta especificidad, en
zonas separadas de una muestra geométrica, de modo que puedan
efectuarse paralelamente muchas reacciones de hibridación entre las
correspondientes sondas y segmentos de analitos de ácido nucleico o
diferentes analitos de ácido nucleico. Solo en condiciones de
reacción apropiadas - p.ej. selección de secuencias, medio
tamponado, contenido salino y, sobre todo, temperatura de
incubación y lavado - se consigue mantener estos complejos de
hibridación unidos en fase sólida de tal modo, que todos los
nucleótidos contenidos en la sonda oligonucleótida sean
complementarios de los correspondientes nucleótidos en la molécula
de analito, dando como resultado el refuerzo de toda la fijación.
Entonces se habla de apareamiento completo de las bases ("perfect
match", PM).
En estas condiciones, los complejos de
hibridación que contienen malos apareamientos ("mismatches",
MM) se desprenden. Bajo condiciones óptimas, los complejos con
apareamiento completo de bases pueden llegar a distinguirse
claramente de los complejos con un solo mal apareamiento
(transiciones de una sola base). Como esto ocurre en paralelo sobre
la fase sólida, empleando una muestra geométrica de sondas de
captura (matriz), se habla de ensayos con matriz de sondas.
Todas las sondas de captura pueden tener una
longitud (número de nucleótidos) constante, o la longitud de los
oligos puede estar adaptada de modo inversamente proporcional al
contenido de GC. En el primer caso se puede alcanzar una
temperatura de fusión común Tm para todos los complejos de
hibridación totalmente apareados, usando aditivos tampón que
refuercen p.ej. los enlaces AT de tal modo, que Tm sea independiente
de la secuencia de bases nucleicas y solo dependa de la longitud de
los oligos. Son ejemplos de tales aditivos el cloruro de
tetrametilamonio (TMAC) y el bromuro de
tetra-etilamonio. En el segundo caso, la adaptación
de longitud indicada produce una nivelación de la Tm. Las sondas de
captura pueden tener esqueletos químicamente distintos, con las
bases nucleicas que proporcionan la especificidad; p.ej. cadenas de
desoxirribosil-fosfato (=> ADN), cadenas de
ribosil-fosfato (=> ARN) o pertenecientes a una
clase de sustancias no naturales, como p.ej. las cadenas de
N-(2-aminoetil)glicilo o de
N-(2-aminoetil)glutamilo (=> PNA, patente
WO 92/20702).
Los ensayos con matrices de sondas son
interesantes para muchas aplicaciones de tipo diagnóstico o de
biología molecular. Entre ellas figura el ensayo
multi-patógeno (identificación simultánea de
diversos agentes patológicos a nivel genético), (sub-)tipificación
de organismos, análisis de la diversidad genética (polimorfismos,
mutaciones), secuenciación de genes o de genomas, etc.
Los ácidos nucleicos son analitos relativamente
complejos que - por regla general - primero deben aislarse, luego
amplificarse y, en el caso del ADN, desdoblarse en sus hebras
(desnaturalización), antes de que puedan emplearse en una matriz a
base de sondas o en los ensayos con matrices de sondas. Esta etapa
de preparación y el hecho de que las bases nucleicas
complementarias también tienden a aparearse dentro de una misma
hebra son la causa de algunas dificultades típicas, como p.ej.
títulos de analito variables en la solución reactiva, debido a la
eficiencia fluctuante del aislamiento o de la amplificación;
eficiencia subóptima de la desnaturalización; reasociación de las
hebras sueltas de un ADN formando la doble hélice inicial, en
competencia con la hibridación de una hebra individual con la
sonda; hibridación en las propias hebras (formación de estructuras
secundarias, p.ej. curvas de herradura o formaciones cruzadas),
compitiendo con la hibridación a las sondas. Ésta es tanto más
fuerte, cuanto mayor es el índice palindrómico, es decir la
autocomplementariedad de una cadena de ADN o de ARN.
Especialmente los dos últimos fenómenos
determinan de modo esencial la accesibilidad de la región
secuencial del analito en que se basa el ensayo y limitan así el
rendimiento global más allá de una matriz de sondas de captura.
Para amplificar el ácido nucleico del analito
casi siempre se usa el método PCR (reacción en cadena de la
polimerasa, patente US-A-4,683,202).
Aquí cabe la posibilidad de incorporar durante la amplificación un
grupo detectable, como p.ej. un derivado de digoxigenina (marcaje
con DIG, patente EP-B-0 324 474), lo
cual puede tener lugar sustituyendo en la mezcla de
nucleósido-trifosfato parte del dTTP por
DIG-dUTP.
En la patente
DE-A-3807994
(US-A-5,476,769) se describe un
método, en el cual unas cadenas de amplicón marcadas para la
detección se hibridan a una sonda de captura inmovilizable y se
identifican los híbridos resultantes.
En la patente
EP-A-0 079 139 se describe el
llamado método de hibridación sándwich, por el cual un ácido
nucleico diana se identifica hibridándolo con una sonda de captura y
una sonda de detección, que son complementarias de distintas
regiones del ácido nucleico.
La patente WO 95/25538 revela métodos y kits para
generar y detectar sitios de restricción polimórficos en los ácidos
nucleicos, de tal modo que, una vez amplificados, los ácidos
nucleicos se fragmentan con una endonucleasa de restricción y se
fijan a una fase sólida.
El objeto de la presente invención era mejorar
los ensayos de hibridación basados en una reacción de captura de
productos amplificados y en la incorporación de un marcador, sobre
todo en cuanto a su capacidad de discriminar entre dos o más ácidos
nucleicos de secuencias muy parecidas.
Uno de los objetos de la presente invención es un
método para la identificación selectiva de un ácido nucleico según
la reivindicación 1, que comprende las etapas de amplificación del
ácido nucleico o de una parte del mismo mediante dos cebadores, de
los cuales uno se puede hibridar con una cadena del ácido nucleico
diana y el otro con una cadena complementaria de la anterior, y uno
de los cuales contiene un marcador detectable, con la respectiva
formación de un producto de prolongación de este cebador en una
mezcla reactiva; fijación de una sonda de captura a uno de dichos
productos de prolongación, formando un complejo de hibridación que
lleva la sonda de captura y al menos este producto de prolongación;
separación de los componentes de la mezcla reactiva que no están
unidos al producto de prolongación fijado a la sonda de captura, y
determinación del marcador detectable fijado a la sonda de captura,
la cual se escoge de tal modo, que se pueda fijar a la cadena del
producto de prolongación que asimismo puede hibridarse con el
producto de prolongación formado por el alargamiento del cebador
marcado.
En la Fig. 1 se indica esquemáticamente la
denominación de cada uno de los componentes de la amplificación en
el sentido de la presente invención. Aquí significan:
- P1
- cebador directo
- P2
- cebador inverso
- T1
- cadena hija homosentido (producto de prolongación homosentido)
- T2
- cadena hija antisentido (producto de prolongación antisentido)
- M1
- cadena madre antisentido (molde); cadena del ácido nucleico diana
- M2
- cadena madre homosentido (molde); cadena complementaria del ácido nucleico diana
En la Fig. 2 se representa esquemáticamente un
complejo ya fijado a la fase sólida, con las cadenas T1 (no
marcada), T2 (marcada en el extremo 5') y la sonda P fijada a la
fase sólida. El rectángulo es un marcador detectable.
En la Fig. 3 se indica la situación de las
regiones que tienen mutaciones en el segmento.
En la Fig. 4 se muestra una propuesta de plegado
para el segmento genético rpo-\beta.
En la Fig. 5 se representa una comparación entre
la situación ideal (ADN en forma de bacilos) y la situación real
(plegado). Es evidente que el acceso al marcador terminal es muy
restringido en la situación real. Esta limitación se reduce o evita
según el procedimiento de la presente invención.
Un punto esencial de la presente invención es la
observación sorprendente de que la mayor precisión discriminativa
(distinción entre PM y MM) se logra cuando las sondas de captura
fijadas a la fase sólida se conciben como complemento antiparalelo
de la cadena homosentido sintetizada en la PCR partiendo de un
cebador directo no marcado, mientras que la reacción de detección
tiene lugar sobre la cadena antisentido sintetizada en la PCR
partiendo de un cebador inverso marcado con un grupo detectable, de
manera que el complejo de hibridación de sondas que determina la
especificidad (precisión discriminativa) se identifica y, dado el
caso, se cuantifica indirectamente mediante el complejo de
reasociación de cadenas de ADN.
Esto también tiene repercusión en las
hibridaciones individuales, pero de manera especialmente positiva
en relación con los ensayos de hibridación realizados en paralelo,
es decir, pruebas de A(D)N con matrices de sondas.
Por identificación selectiva se entiende un tipo
de detección que selecciona y fija un ácido nucleico que posee una
secuencia diana muy poco diferente de una secuencia
no-diana, en una muestra que contiene un gran
número de ácidos nucleicos sin la secuencia diana, y entre los
cuales también se puede hallar o se halla la secuencia diana. La
fijación ocurre por apareamiento de bases complementarias, como A y
T o G y U, de una sonda y del ácido nucleico objeto de la
identificación. Para ello la secuencia de la sonda es altamente
complementaria, preferentemente 100% complementaria de la secuencia
diana del ácido nucleico, sobre todo respecto de las bases en que
la secuencia diana se diferencia de la secuencia
no-diana. La secuencia de la sonda tiene una
longitud preferente de 8 a 36 nt, con especial preferencia de 16 a
20 nt. La estructura química de la sonda, especialmente fuera de la
parte de las bases nucleicas, p.ej. en el llamado esqueleto, puede
escogerse de manera bastante libre, suponiendo que la fijación a la
secuencia diana todavía sea posible. Recientemente, junto a los
oligonucleótidos (preferidos) (como esqueleto sirve la estructura
azúcar-fosfato natural o modificada por la adición
de grupos) también han dado buen resultado los llamados ácidos
nucleicos peptídicos (APN, según la patente WO 92/20702, esqueleto
formado por la incorporación de amino-ácidos artificiales). Como
sondas también son apropiadas las moléculas con unidades
estructurales mixtas (véase la patente WO 95/14706 o
EP-A-0 672 700).
Una sonda de captura, cuya función consiste en
inmovilizar el complejo de reacción a la fase sólida de manera
específica según la secuencia, puede unirse luego por ejemplo a la
cadena del producto de prolongación, que a su vez puede hibridarse
con el producto de prolongación formado por alargamiento del cebador
marcado, cuando es complementaria de una secuencia de este producto
de prolongación. Esta secuencia es luego la secuencia diana. Si al
identificar el ácido nucleico es conocida podrá determinarse por
secuenciación, de lo contrario hay que fijarla primero a una o más
sondas de captura según la presente invención y luego
determinarla.
La secuencia diana se elige preferentemente de
modo que se encuentre entre los extremos "internos" de
asignación sucesiva de los cebadores. La secuencia de la secuencia
diana se elige de manera que se diferencie de las secuencias de los
ácidos nucleicos no asignadores, sobre todo respecto al orden
sucesivo de las bases. Las diferencias pueden ser debidas por
ejemplo a mutaciones (intercambios simples de bases, aunque también
múltiples), deleciones, inserciones o polimorfismos.
El especialista puede hallar las secuencias diana
apropiadas, por ejemplo, buscando y comparando secuencias en los
bancos de secuencias conocidos. En una forma de ejecución preferida
de la presente invención, según la cual se detectan varias
secuencias, diferencias entre secuencias, mutaciones, polimorfismos
o similares, las secuencias diana se encuentran preferentemente
dentro de una región que se puede amplificar con la ayuda de un
solo par de cebadores (un cebador inverso y un cebador directo). En
principio también pueden usarse más cebadores, especialmente si
todos ellos dan lugar a productos amplificados que llevan, entre
otras, las regiones correspondientes a las demás secuencias diana.
El ácido nucleico sometido a identificación puede ser ARN o ADN de
cualquier procedencia. Se prefiere el ADN genómico.
Por ácido nucleico, o secuencia, complementario
de otro ácido nucleico, o secuencia, se entiende aquí un ácido
nucleico o secuencia que contiene una serie ininterrumpida de bases
capaces de formar apareamientos de bases
Watson-Crick o/y Hoogsteen con una serie
ininterrumpida de bases del otro ácido nucleico o secuencia. Esta
serie tiene preferentemente una longitud superior a 10 bases.
Como ácido nucleico, o secuencia, homólogo de
otro ácido nucleico o secuencia se designa aquí un ácido nucleico,
o secuencia, complementario de un ácido nucleico o secuencia, que su
vez es complementario del otro ácido nucleico. En tal caso se
comparan las respectivas secuencias ininterrumpidas de bases.
Para el especialista resulta evidente que además
de las bases naturales hay bases sintéticas que no se distinguen
mucho de las naturales en cuanto a la capacidad de fijación a otras
bases. Cuando se utilizan oligonucleótidos como sondas, también se
habla de hibridación. El especialista ya conoce a fondo en qué
condiciones tiene lugar una hibridación óptima. Por ejemplo, la
temperatura, la longitud de sonda y el contenido de sal dependen
asimismo del contenido de GC del ácido nucleico objeto de
identificación.
El presente método tiene la ventaja de permitir
una mayor selectividad de identificación cuando las demás
condiciones son iguales. Y viceversa, a igual selectividad puede
reducirse el rigor de los parámetros del proceso (como p.ej. la
temperatura de lavado). Por selectividad se entiende la hibridación
específica de las sondas a ácidos nucleicos con una secuencia de
bases exactamente complementaria, discriminando todos los ácidos
nucleicos con secuencia no exactamente complementaria.
Las muestras, conforme a la presente invención,
son líquidos, por ejemplo líquidos corporales, medios de cultivo o
tejidos, o sus productos elaborados, por ejemplo lisados, extractos
o aislados como suero, plasma o productos derivados de ellos.
En principio, el especialista ya conoce métodos
de amplificación. Como ejemplos de amplificaciones cabe citar la
NASBA (véase patente EP-B-0 329 822
o US-A-5,130,238), la LCR (patente
EP-B-0 320 208) y la PCR (patente
WO 90/01069). No obstante, en la presente invención se prefiere la
amplificación según el principio de la PCR (patente
EP-B-0 200 362 o
US-A-4,683,202). En tal caso se
emplean al menos 2 cebadores, cuyas secuencias se escogen de modo
que uno de ellos se pueda hibridar con una cadena del ácido nucleico
investigado, formando con ella como molde un producto prolongado
mediante una polimerasa y otros reactivos necesarios para ello,
como tampones, mononucleósido-trifosfatos, etc. El
molde empleado es un resto de ácido nucleico situado detrás del
extremo 3' del cebador. Dicho producto de prolongación puede servir
a su vez de molde para la hibridación con el otro cebador y para
alargarlo. Cuanto más selectiva sea la fijación del cebador al ácido
nucleico o a su cadena complementaria, mayor será la amplificación.
Realizando varias veces las etapas de reacción correspondientes a
la hibridación de un cebador con su molde, alargamiento del cebador
y separación del producto alargado de su molde, se pueden preparar
muchas copias del fragmento de ácido nucleico, situado entre los
extremos exteriores del cebador, que contiene la(s)
secuen-
cia(s) diana(s).
cia(s) diana(s).
Por cebador directo se entiende un cebador que se
puede hibridar o se hibrida con una secuencia de la cadena de ácido
nucleico investigado. La cadena se puede escoger entre las dos que
forman una doble hélice, pero también puede ser propiamente un
ácido nucleico de una sola hebra, p.ej. ARN, con preferencia ARNm o
ARNr. El cebador inverso es un cebador que se puede hibridar o se
hibrida con el producto de prolongación formado a partir del
cebador directo.
En el caso del cebador directo se trata
preferentemente de un cebador que puede hibridarse con la cadena
antisentido del ácido nucleico investigado, y el cebador inverso con
la cadena homosentido. Por lo tanto, a partir del cebador directo
se forma un producto de prolongación homosentido (la cadena hija
homosentido), Fig. 1.
Además de una secuencia dirigida al punto de
unión del cebador, los cebadores pueden contener otras secuencias
que no pueden hibridarse directamente con el ácido nucleico
investigado, p.ej. extremos oligo T, que, preferentemente en el
extremo 5', sirven como distanciadores de un marcador. Las sondas de
captura también pueden estar modificadas así.
Los cebadores usuales tienen una longitud
comprendida entre 12 y 30 nucleótidos/bases. Estos están incluidos,
conforme a la presente invención, en el subsiguiente proceso de
detección, que es una prueba de la presencia (identificación
cualitativa) o de la cantidad (identificación cuantitativa) del
analito de ácido nucleico.
Según la presente invención, uno de los
cebadores, escogido del grupo de los cebadores directos e inversos,
con especial preferencia el inverso, está marcado para detección.
Como marcador se entiende un grupo químico que se diferencia de los
del ácido nucleico por unas propiedades que lo hacen detectable. Tal
propiedad puede consistir p.ej. en una absorción a una determinada
longitud de onda, fluorescencia, dispersión, reflexión o capacidad
de fijarse a otras sustancias. También puede distinguirse entre
marcadores directos e inversos. Los marcadores directos se pueden
detectar por su capacidad de producir señales, sin necesidad de
incorporar otros componentes ligados. A tal grupo pertenecen por
ejemplo enzimas como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa (POD),
que se pueden detectar mediante el seguimiento de la reacción
catalizada enzimáticamente de un substrato coloreado. Sin embargo
los grupos que cumplen estas condiciones solo se prefieren en la
presente invención cuando el substrato permanece cerca del complejo
durante la medición, como ocurre p.ej. en el caso de la ecuorina.
Pero también hay que incluir los grupos emisores de señales
detectables por su comportamiento espectral, como la
fluoresceína.
Los marcadores indirectos son los que aún
necesitan una fijación a otro reactivo provisto de un componente al
que poder unirse, el cual a su vez puede estar marcado directa o
indirectamente. A este grupo pertenecen por ejemplo haptenos como
la biotina o la digoxigenina. Pueden detectarse mediante la reacción
con un reactivo de identificación que contenga su par de fijación,
p.ej. estreptavidina o un anticuerpo. A tal fin estos van marcados
con un grupo capaz de dar o producir señal, p.ej. con ecuorina o con
un fluoróforo. Como grupos emisores de señales se prefieren sobre
todo componentes corpusculares, p.ej. perlas o microesferas de látex
que llevan un colorante detectable. La presente invención resulta
especialmente positiva en el caso de partículas de tamaño grande,
que debido a la situación estérica mostrada en la Fig. 5, no pueden
fijarse realmente al marcador (ahí digoxigenina), a no ser que se
excluya la reasociación dentro de las cadenas. El marcador se fija
naturalmente al cebador de manera apropiada, a fin de que obstruya
lo menos posible la hibridación y el alargamiento del cebador. Para
ello se prefiere incorporarlo al extremo 5’, en el caso de un
nucleótido, p.ej. durante la síntesis química, empleando una
fosforamidita modificada con el grupo marcador. No obstante, el
marcador también puede ir fijado a una base (patente WO 93/05060).
En el caso de un ANP el marcador se fija preferentemente al extremo
amino (patente 92/20703).
Como sonda de captura se entiende una unidad
fijadora de ácido nucleico, capaz de fijar selectivamente una de
las cadenas de ácido nucleico construidas por amplificación
(productos de alargamiento). Puede fijarse a una fase sólida
(inmovilizable) o estar fijada a ella (inmovilizada). En este
contexto, por fijación directa se entiende la fijación de dos bases
mediante puentes de hidrógeno. La fijación a una fase sólida puede
ser covalente o no. Las uniones covalentes pueden estar aseguradas
mediante enlaces fosfodiéster (patente
EP-B-0 386 229) y amida
(EP-B-0 562 025 o
US-A-5,242,974), o también por
activación de restos fotosensibles (p.ej. grupos diazoicos) y
puesta en contacto con una solución en una sonda que contiene un
grupo reactivo (p.ej. PCT/EP 96/00893).
Las uniones no covalentes son, por ejemplo,
enlaces bioespecíficos como los contenidos en los pares
interactivos tipo (estrept)avidina-biotina,
hapteno-anticuerpo,
vitamina-receptor, etc. Se prefiere la sonda de
captura marcada con biotina, p.ej. mediante un grupo fosfato en 5',
con la ayuda de un ligador aminoalquilo y la fase sólida va
recubierta de estreptavidina. Sin embargo se prefiere especialmente
que la sonda de captura ya esté fijada a la fase sólida, por enlace
covalente o mediante un enlace bioespecífico estable (p.ej.
(estrept)avidina-biotina), antes de la
puesta en contacto con la mezcla reactiva de la amplificación. La
constitución de la fase sólida no es fundamental para la presente
invención. Sin embargo debería ser insoluble en la mezcla de
amplificación. Son especialmente adecuadas, p.ej., las fases de
plástico con o sin parte metálica, p.ej. en forma de perlas, pero
también un velo poroso o un soporte de ensayo no poroso más o menos
plano. Una propiedad esencial del soporte es la construcción de un
sitio al que las sondas de captura se pueden fijar o se fijan, y al
que, en caso de estar presente, se puede fijar el ácido nucleico
investigado. Es preferible no usar simultáneamente con una sonda de
captura de una determinada secuencia otra sonda de captura que sea
100% complementaria de aquella.
La identificación potencial (múltiple) de una
gran cantidad de ácidos nucleicos de diversas secuencias es
posible. Se puede lograr utilizando una sonda de captura exactamente
selectiva para cada ácido nucleico o secuencia investigados. Las
sondas de captura pueden estar fijadas a distintas fases sólidas,
pero con especial preferencia a distintos sitios, sobre todo a
sitios geométricos definidos y mensurablemente diferenciables sobre
la misma fase sólida, preferentemente según el tipo de matriz de
ácidos nucleicos, tal como se describe por ejemplo en la patente WO
92/10588. Para ello se pueden elegir ciertos patrones geométricos,
p.ej. matrices rectangulares, hexagonales o cruciformes, que
facilitan la evaluación. Así se puede analizar la presencia o
ausencia de grupos enteros de secuencias diana en una muestra. La
presente invención utiliza la formación de un complejo de fijación
(híbrido), que contiene el producto de prolongación tanto del
cebador inverso como del directo, y asimismo la sonda de captura.
En lo sucesivo, se habla del producto prolongado como el producto
de prolongación directo formado por alargamiento del cebador
directo. En los métodos conocidos del estado técnico no se cumplían
las condiciones necesarias para la formación medible de tal híbrido.
En general se prefiere la formación de un complejo de este tipo,
cuando la sonda de captura tiene oportunidad suficiente de
hibridarse con una cadena del producto amplificado, antes de que
éste pueda hibridarse con su cadena complementaria (del
amplificado), formando un producto de (re)asociación. Si no
es así, la sonda de captura ya no puede hibridarse con el producto
de prolongación deseado, debido a la gran tendencia de los ácidos
nucleicos analizados a formar híbridos dentro de la cadena, lo cual
dificulta o impide la detección, porque entonces la señal es muy
débil.
Esto puede lograrse del siguiente modo: una
cantidad adecuada de solución de hibridación, así como un alícuota
de la mezcla reactiva procedente de la amplificación - en que los
productos de prolongación existentes en forma de dobles hélices se
desdoblaron en hebras individuales por desnaturalización de las
bases - se toman separada o/y sucesivamente en una pipeta, con
preferencia en la misma pipeta, separados físicamente entre sí
(para excluir básicamente que se mezclen en la pipeta) y luego se
soplan en un recipiente que contiene la fase sólida.
Primero la solución de hibridación, luego una
burbuja de aire y después la mezcla reactiva se aspiran con una
pipeta o con una aguja, procurando que ambos líquidos no se mezclen.
Luego ambos líquidos se soplan rápidamente, es decir en tiempo
inferior a 5 seg., con preferencia menor de 1 seg., en un
recipiente. Se consigue un pronto mezclado, sobre todo, mediante la
rapidez del soplado y, si se quiere, aspirando y expulsando
repetidamente el líquido con la pipeta. La rapidez del soplado debe
ajustarse aquí a la geometría del recipiente de reacción, para
evitar p.ej. salpicaduras. La mezcla rápida asegura que la
hibridación de una cadena del producto de prolongación con una
sonda de captura pueda tener lugar casi al mismo tiempo que la
hibridación con la cadena complementaria o que la hibridación
interna de la cadena. El tiempo inicial de la hibridación se designa
como t_{0} y corresponde al punto en que se establecen las
condiciones de reacción que permiten una hibridación.
En cuanto a la temperatura de incubación, es
preferible escoger una que permita la hibridación de la sonda de
captura con la cadena homosentido, preferentemente \geq 5ºC por
debajo del punto de fusión de este híbrido y \geq 2ºC por encima
del punto de congelación de la mezcla.
La incubación de la(s) sonda(s) con
la mezcla reactiva tiene lugar, preferentemente, en un tiempo
comprendido entre 45 y 180 minutos. A continuación se separa la
fracción de cebadores (especialmente del cebador marcado) y
productos de amplificación marcados no fijada a la fase sólida, con
lo cual, los marcadores no fijados selectivamente, es decir los
sobrantes, no perturban esencialmente la determinación de la
fracción fijada selectivamente. Esto puede realizarse extrayendo el
líquido con una pipeta y, si se desea, ayudando con una o más
etapas de lavado.
En una forma de ejecución ventajosa de la
presente invención se eligen condiciones de hibridación poco
rigurosas para la incubación de la sonda de captura con los
productos amplificados, es decir, de tal manera que aún no se
produzca ninguna hibridación selectiva, sino que se fije una
cantidad bastante elevada de ácido nucleico con una selectividad
relativa. En cambio para una o varias de las subsiguientes etapas de
lavado se eligen unas condiciones de hibridación relativamente
rigurosas. En tal caso se redisuelven aquellos híbridos en los
cuales la sonda de captura es bastante poco complementaria respecto
a la secuencia diana, mientras que los híbridos más estrictamente
complementarios permanecen fijados.
Para ello, el tampón de lavado se selecciona de
la manera siguiente. Contiene de 2 a 5 moles/l de TMAC, 0,1 - 5
mmoles/l de un agente formador de quelatos (p.ej. EDTA), 0,1 hasta
5% en peso de un detergente preferiblemente aniónico y 1 hasta 100
mM de una base orgánica tamponada.
El presente método resulta especialmente
apropiado para detectar mutaciones, sobre todo en muestras
complejas, p.ej. en casos de resistencia de organismos a los
antibióticos o en caso de polimorfismos como los del p53. Se
caracteriza por ser especialmente selectivo, es decir, porque puede
discernir o discriminar muy bien secuencias de ácido nucleico muy
parecidas.
La muestra, p.ej. un suero, puede tratarse
mediante reactivos, de tal modo que los ácidos nucleicos
investigados queden en forma accesible para la hibridación. Esto se
puede llevar a cabo, por ejemplo, añadiendo reactivos que provoquen
el lisado de las paredes celulares de organismos, como p.ej. virus o
bacterias. Si se quiere, los ácidos nucleicos pueden purificarse con
antelación, p.ej. inmovilizándolos sobre una fase sólida, como por
ejemplo partículas de vidrio, mediante la adición de sales
caotrópicas. Estas purificaciones previas están descritas por
ejemplo en la patente EP-A-0 389 063
o en la patente US-A-5,234,809. La
solución que contiene los ácidos nucleicos se somete después a una
amplificación de ácidos nucleicos por PCR, donde el cebador inverso
está marcado con un grupo detectable, pero el cebador directo no. La
región de los ácidos nucleicos investigados comprendida entre los
cebadores es la que contiene la secuencia diana. La solución que
lleva los amplificados se introduce, al mismo tiempo que una
solución de hibridación, en un recipiente de reacción plano, sobre
cuya superficie se han fijado, en zonas discretas, unas sondas de
captura de distinta secuencia, que son respectivamente
complementarias de una secuencia diana sobre la cadena homosentido
no marcada de uno de los ácidos nucleicos investigados. Cuando, por
el contrario, las sondas de captura se conciben de manera que sean
antiparalelamente complementarias de la cadena antisentido, se usa
como corresponde el cebador directo en forma marcada.
Entonces se forman según la presente invención
los híbridos deseados entre la sonda de captura y ambas cadenas,
siempre que la muestra original contenga el ácido nucleico
investigado. La formación de los híbridos se puede comprobar
mediante el marcador incorporado a los amplificados, p.ej. de manera
directa con un microscopio (de fluorescencia). En caso de
marcadores indirectos, p.ej. un hapteno, primero se transforma con
un anticuerpo marcado contra el hapteno, de manera que el anticuerpo
y, por tanto, el (segundo) marcador se fije al (primer) marcador.
Después ya se puede medir el (segundo) marcador.
La medición se evalúa comprobando en qué sitios
se detecta un marcaje. La secuencia complementaria respecto a la
secuencia (conocida) de la sonda de captura allí fijada está, por lo
tanto, en la muestra. Normalmente, para decidir si la señal medida
debe valorarse positivamente, se define un valor umbral, por encima
del cual se acepta que el ácido nucleico se hallaba presente. Sin
embargo - teniendo en cuenta que las señales de medición pueden
oscilar para secuencias diferentes y análogas y que la sensibilidad
de la medición suele ser tan grande que incluso podrían evaluarse
las señales de fondo - el elevado grado de discriminación alcanzable
con la presente invención es de extraordinaria importancia para
evitar falsas valoraciones. Permite diferenciar mucho mejor entre
las señales en caso de presencia o ausencia de la secuencia
diana.
Estos ensayos múltiples permiten, por una parte,
la detección conjunta de los analitos más diversos, p.ej. virus como
HBV, HGV, HCV y HIV, empleando distintos pares de cebadores o la
identificación de secuencias parciales de un ácido nucleico
determinado, p.ej. polimorfismos en genomas humanos, pero también es
posible secuenciar fragmentos según el método de "secuenciación
por hibridación" (SBH), bien sea de nuevo (secuencias
desconocidas hasta ahora) o también para hallar anomalías de una
secuencia normal. En Khrapko y otros, FEBS Letters 250, 118 - 122
(1989) o en Khrapko y otros, J. DNA Sequencing and Mapping 1, 375 -
388 (1991), por ejemplo, se describen métodos SBH. Para ello se
usan normalmente sondas de captura de igual longitud, cuyas
secuencias se solapan de manera que en un extremo son más cortas y
en el otro extremo más largas que la secuencia más parecida. Sucede
lo contrario para cualquier otra secuencia, que en la misma
dirección es más larga en un extremo, pero más corta en el otro. El
desfase así formado es de 1 hasta 5 nucleótidos, según las
necesidades. La secuencia del ácido nucleico objeto de
secuenciación puede determinarse reuniendo las informaciones
obtenidas mediante la hibridación.
Para los análisis de mutaciones se pueden emplear
sondas de captura específicas de alelos o mutaciones.
Por lo tanto también figura como objetivo un
método para la detección selectiva de un ácido nucleico, incluyendo
las etapas de amplificación del ácido nucleico o de una parte del
mismo mediante dos cebadores - uno de los cuales se puede hibridar
con una cadena del ácido nucleico investigado y el otro con una
cadena complementaria de aquél, y al menos uno de ellos lleva
fijado un marcador detectable - con la formación, respectivamente,
de un producto de prolongación de este cebador en una mezcla
reactiva; la fijación de una sonda de captura a uno de estos
productos de prolongación, formando un complejo de hibridación que
contiene la sonda de captura y al menos dicho producto de
prolongación; la separación de los componentes de la mezcla reactiva
no fijados, del producto de prolongación fijado a la sonda de
captura, y la determinación del marcador detectable unido a la
sonda de captura; caracterizado porque la sonda de captura se escoge
de tal modo, que pueda hibridarse con la cadena del producto de
prolongación capaz de hibridarse también con el producto de
prolongación formado por alargamiento del cebador marcado.
La presente invención se ilustra mediante los
ejemplos siguientes:
Unos plásmidos estándar de ADN clonados en E.
coli, que contienen el gen para la subunidad \beta de la
ARN-polimerasa (rpo-\beta) del
Mycobacterium tuberculosis (de tipo salvaje WT y mutantes
MX), se aislaron tras la lisis celular y se purificaron en pequeñas
columnas Qiagen. El segmento genético rpo-\beta
relevante para la resistencia a la rifampicina se amplificó por
PCR, con un marcador DIG en el extremo 5' del cebador directo o del
cebador inverso. Los oligonucleótidos cebadores se sintetizaron
según la química estándar de las fosforamiditas (Caruthers, M.H.,
Barone A.D., Beaucage, S.L., Dodds, D.R., Fisher, E.F., McBride,
L.J., Matteucci, M., Stabinsky, Z., Tang, J.Y., Chemical synthesis
of deoxyribonucleotides, Methods in Enzymology 154,
287-313 (1987)) y, dado el caso, se funcionalizaron
en el extremo 5' mediante la incorporación de
N-trifluoroacetamido-(3-oxa)pentil-N,N-diisopropil-metil-fosforamidita
(de la firma Boehringer Mannheim GmbH (BM), con el nº de catálogo
1480863), seguido de la separación en medio básico del grupo
protector trifluoroacetilo con una solución acuosa de amoniaco y de
la reacción con el
digoxigenin-3-O-metilcarbonil-6-amidocaproíl-NHS-éster
(de la firma BM, nº de catálogo 1333054).
El perfil de temperatura de la PCR, realizada en
un aparato Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 9600
mediante el uso de 1 \mul de extracto celular purificado por 100
\mul de solución reactiva, fue el siguiente:
Iniciación 3' 94ºC; 10 ciclos 15'' 95ºC/30''
68ºC/30'' 72ºC; 20 ciclos 15'' 94ºC/30'' 68ºC/30'' + adicionalmente
20'' con cada nuevo ciclo a 72ºC; 5' 70ºC. Equilibración \geq 30'
4ºC.
Tampón PCR: 10 mM de Tris/HCl, 1,5 mM de
MgCl_{2}, 50 mM de KCl, pH 8,3, cebadores (respectivamente
directos e inversos, véase abajo).
Polimerasa y dNTPs según el kit PCR Core (de BM,
nº de catálogo 1578553).
Cebadores de la PCR (R = inverso; F =
directo):
- Cebador 55 F: 5'-TCG CCG CGA TCA AGG AGT-3'
- (SEQ.ID.NO. 1)
- Cebador 55 R: 5'-TGC ACG TCG CGG ACC TCC A-3'
- (SEQ.ID.NO.2)
- Cebador 56 F: 5'-DIG-TCG CCG CGA TCA AGG AGT-3'
- (SEQ.ID.NO.3)
- Cebador 56 R: 5'-DIG-TGC ACG TCG CGG ACC TCC A-3'
- (SEQ.ID.NO.4)
Amplicón rpo-\beta del MTB
(cadena homosentido; 157 nt):
Los plásmidos estándar amplificados, del tipo
salvaje (WT) o mutantes (MX), tras el control por electroforesis de
gel y la tinción con bromuro de etidio, se alicuotaron y se
conservaron congelados hasta el uso.
Primero se mezclan 5 \mul de disolución del
producto amplificado marcado con DIG y 5 \mul de una solución de
desnaturalización (50 mM de NaOH, 2 mM de EDTA) en un recipiente de
reacción inerte (p.ej. de la firma Eppendorf) y se incuban \geq
10 minutos a temperatura ambiente.
Se sintetizaron sondas de captura
antiparalelamente complementarias respecto a la cadena de amplicón
homosentido, empleando también la química estándar de las
fosforamiditas, en la forma 18-mera con el extremo
5' biotinilizado. El grupo biotina se incorporó directamente en la
síntesis por medio de la
biotinoíl-6-amidohexil-N,N-diisopropil-\beta-cianoetil-fosfor-amidita,
en la que el nitrógeno reactivo del imidazolilo está protegido con
dimetoxitritilo (de la firma Perkin-Elmer ABI, nº de
catálogo 401396).
c = complementario de la cadena
homosentido; S = sensible (al tratamiento con rifampicina (= sondas
que comprenden el tipo salvaje); R = resistente al tratamiento con
rifampicina (= sondas que comprenden diversos
mutantes)
- cS1-18/2-BIO 5'-BIO-T_{20}-ATT GGC TCA GCT GGC TGG-3' (Tab. 4)
- SEQ.ID.NO.6
- cR1a-18-BIO 5'-BIO-T_{20}-TTG GCT CGG CTG GCT GGT-3' (Tab. 4)
- SEQ.ID.NO.7
- cS2-18-BIO 5'-BIO-T_{20}-GTT GTT CTG GTC CAT GAA-3' (Tab. 4)
- SEQ.ID.NO.8
- cR2-18-BIO 5'-BIO-T_{20}-GTT GTT CTG GAG CAT GAA-3' (Tab. 4)
- SEQ.ID.NO.9
- cS3-18/1-BIO 5'-BIO-T_{20}-CAA CCC CGA CAG CGG GTT-3' (Tab.1-3)
- SEQ.ID.NO.10
- cS3-18/2-BIO 5'-BIO-T_{20}-TCA ACC CCG ACA GCG GGT-3' (Tab.4)
- SEQ.ID.NO.11
- cS4-18-BIO 5'-BIO-T_{20}-TCG GCG CTT GTG GGT CAA-3'
- SEQ.ID.NO.12
- cR4a-18-BIO 5'-BIO-T_{20}-TCG GCG CTT GTA GGT CAA-3'
- SEQ.ID.NO.13
- cR4b-18-BIO 5'-BIO-T_{20}-TCG GCG CTT GTC GGT CAA-3'
- SEQ.ID.NO.14
- cdS4-18-BIO 5'-BIO-T_{20}-TCG GCG CTT GCG GGT CAA-3' (Tab. 4)
- SEQ.ID.NO.15
- cS5-18-BIO 5'-BIO-T_{20}-CCC CAG CGC CGA CAG TCG-3'
- SEQ.ID.NO.16
- cR5-18-BIO 5'-BIO-T_{20}-CCC CAG CGC CAA CAG TCG-3' (Tab. 4)
- SEQ.ID.NO. 17
MBD
5'-BIO-T_{25}-
\delm{Y}{\delm{\para}{DIG}}-T-3'
(Tab. 4) \hskip7.3cmSEQ.ID.NO. 18
- BIO
- = monobiotinilización mediante la incorporación en línea de biotinoíl-6-amidohexil-fosforamidita
- Y
- = incorporación en línea de 3-trifluoacetamido-1,2-propano-diolfosforamidita, seguido de desbloqueo bá-{}\hskip0.2cm sico, alargamiento con el 6-aminocaproíl NHS-éster y marcaje por reacción con el DIG-3-O-carboxi-{}\hskip0.2cm metil-NHS-éster (estable en medio básico) (véase arriba).
Como soportes desechables se utilizaron unas
piezas de poliestireno coloreadas con un pigmento negro de carbono
(patente DE-19707204.6), con un hueco circular en la
masa de 0,7 cm (diámetro) x 0,15 cm (profundidad), activadas con
una capa de
termo-RSA-biotina/estreptavidina
(PCT/EP 89/00195). Las sondas de captura funcionalizadas con
biotina se inmovilizaron sobre estos desechables por un proceso de
impresión con chorro de tinta análogo al de la patente
EP-A-0 268 237. Cada boquilla del
cabezal de impresión se llenó con una solución de sonda de captura
de diferente especificidad, con lo cual se imprimieron sobre el
soporte de ensayo unas pequeñas áreas de reacción circulares,
aisladas entre sí, de aproximadamente 100 \mum de diámetro, en
forma de muestras geométricas que, una vez secas, generaron una
matriz de diferentes sondas de captura (fase sólida C2a).
Solución de impresión (solución de impresión por
chorro de tinta): 5 mM Mes/5 mM Tris-HCl, pH 7,4,
1% (p/v) de sacarosa, 0,5 mg/ml de RSA-Res
(dializado), concentración de las sondas 1 \muM.
Luego, p.ej. con un dispensador Hamilton
MicroLab, se aspiran sucesivamente, separados por una burbuja de
aire, 40 \mul de tampón de hibridación (= de neutralización) y 10
\mul de producto amplificado por PCR, desnaturalizado, y a
continuación, de una sola vez, se dispensan a presión dentro del
soporte desechable, con lo cual se produce un rápido mezclado y se
parte de un t_{0} idéntico para todos las hibridaciones. La mezcla
se incubó durante 90 minutos a temperatura ambiente (tablas 1 a 3)
o a 37ºC (tabla 4), con (tablas 1 a 3) o sin (tabla 4) agitación
(E. Bühler Swip, 250 rpm lineales).
10 mM de Tris/HCl, 4 M de TMAC (cloruro de
tetrametilamonio), 1 mM de EDTA, 0,1% de Tween-20
[en el ejemplo 4: Zwittergent 3-12] (p/v), 0,013% de
oxypyrion, 0,01% de metil-isotiazolona, pH 6,3.
Primero 20 segundos de separación b/f a
59(61)ºC (temperatura de consigna ajustada en el dispositivo
manual de lavado de ADN) o a 60ºC (temperatura real en el aparato
semiautomático incubador/agitador/módulo de lavado) con solución de
lavado 1 (caudal de 14,4 ó 12 ml/minuto); inmediatamente después 20
segundos más de lavado a temperatura ambiente con tampón de bajo
contenido salino (solución de lavado 2, caudal 12 ml/minuto).
Solución de lavado 1 (para la etapa de lavado
rigurosa tras la hibridación):
- 10 mM de Tris/HCl, 4 M de TMAC, 1 mM de EDTA, 0,1% de Tween-20 [en la tabla 4: Zwittergent 3-12] (p/v), 0,013% de oxypyrion, 0,01% de metilisotiazolona, pH 8,0.
Solución de lavado 2 (para lavar durante la
separación de la fracción unida/libre tras la hibridación y también
para la separación de la fracción unida/libre después de la reacción
del conjugado):
- 15 mM de NaCl/1,5 mM de Na_{3}-citrato/0,1% de solución SDS, pH 7,0.
Se pipetearon 30 \mul de suspensión del
conjugado (Fluorobeads con funcionalización anti-DIG
en una suspensión estable al 0,01% en peso) en la cavidad y la
mezcla se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente (60
minutos a 37ºC en la tabla 3), para la inmunorreacción final DIG:
anti-DIG con (tablas 1 a 3) o sin (tabla 4)
agitación (E. Bühler Swip, 250 rpm lineales).
A continuación se lavó durante 8 segundos con un
tampón de bajo contenido salino (solución de lavado 2) a temperatura
ambiente y a un caudal de 12 ml/minuto.
Se prepara una suspensión al 0,1% en peso de
sólidos de MAK<DIG>(IgG)-110 nm
COOH-Latex-Fluorobead (elaborada
partiendo de BM-Biochemicals Beads, nº de catálogo
1742582, y empleada conforme a la patente
US-A-5,516,635), disolviendo un
frasquito del conjugado liofilizado con 200 \mul de agua
bidestilada. Las necesidades diarias se preparan por dilución 1:10
hasta 0,01% de sólidos en tampón de conjugado.
50 mM de Tris/HCl, pH 8,5, 150 mM de NaCl, 0,5%
de RPLA-IV, 10 \mug/ml de
M-IgG-1 (poly-Fab,
BM, productos bioquímicos para la industria diagnóstica, nº de
catálogo 1368388), 10 \mug/ml de
M-IgG-2a (poly-Fab,
BM, productos bioquímicos para la industria diagnóstica, nº de
catálogo 1866729), 0,05% (p/v) de Tween-20, 0,095%
de NaN_{3}.
La detección se realizó con un dispositivo
formado por un microscopio/cámara CCD, de la firma Leica
(Heidelberg, Alemania).
En las tablas 1-3 están resumidos
los resultados de las mediciones obtenidos con la matriz inicial 5X
(5 sondas), valorando comparativamente los amplicones F (= cadenas
homosentido marcadas mediante el cebador directo) y R (= cadenas
antisentido marcadas mediante el cebador inverso) del ensayo
realizado manualmente. Se varió la temperatura en la etapa de
lavado riguroso después de la hibridación y la temperatura o el
tiempo de incubación para la reacción de conjugación.
\vskip1.000000\baselineskip
- Característica:
- lavado con tampón 1; 59ºC, (20 segundos de aporte de tampón de lavado)
- \quad
- Conjugado 30 minutos de agitación a temperatura ambiente
\vskip1.000000\baselineskip
| Fase sólida con distintas sondas en puntos separados | ||||||||||
| Muestra | cS3 | VK(2) | cS4 | VK(2) | cR4a | VK(2) | cR4b | VK(2) | cS5 | VK(2) |
| R-WT | 163 | 12,5% | 4267 | 7,3% | 94 | 9,8% | 44 | 8,6% | 1838 | 6,1% |
| R-dS4 | 121 | 13,6% | 95 | 34,4% | 29 | 9,5% | 2399 | 12,5% | ||
| R-R4a | 236 | 15,3% | 321 | 22,8% | 7870 | 5,9% | 130 | 5,8% | 4346 | 4,2% |
| R-R4b | 147 | 15,5% | 118 | 8,1% | 199 | 8,4% | 3374 | 4,8% | 6333 | 3,5% |
| R-R5 | 133 | 14,0% | 5366 | 13,0% | 72 | 10,3% | 38 | 7,3% | 165 | 6,3% |
| F-/R-WT | 440 | 7,1% | 5642 | 8,8% | 145 | 12,0% | 65 | 10,3% | 4002 | 9,8% |
| F-WT | 296 | 13,8% | 4570 | 22,9% | 117 | 23,1% | 57 | 19,6% | 3333 | 19,1% |
| F-dS4 | 382 | 5,5% | 237 | 22,3% | 45 | 8,1% | 43 | 5,0% | 5792 | 10,6% |
TABLA 1
(continuación)
| Fase sólida con distintas sondas en puntos separados | ||||||||||
| Muestra | cS3 | VK(2) | cS4 | VK(2) | cR4a | VK(2) | cR4b | VK(2) | cS5 | VK(2) |
| F-R4a | 272 | 12,6% | 419 | 4,8% | 5357 | 2,7% | 89 | 5,8% | 5375 | 1,4% |
| F-R4b | 258 | 12,3% | 103 | 21,6% | 260 | 22,1% | 2601 | 21,9% | 7805 | 15,8% |
| F-R5 | 533 | 4,9% | 7850 | 8,8% | 109 | 7,8% | 54 | 6,6% | 631 | 10,8% |
\vskip1.000000\baselineskip
| Fase sólida | ||||
| Muestra | cS4 | cR4a | cR4b | cS5 |
| R-WT | 100,0% | 2,2% | 1,0% | aprox. 72 x BG |
| R-dS4 | 2,2% | 0,7% | 0,5% | |
| R-R4a | 4,1% | 100,0% | 1,7% | |
| R-R4b | 3,5% | 5,9% | 100,0% | |
| R-R5 | 100,0% | 1,3% | 0,7% | aprox. 0,09 x WT |
| F-/R-WT | 100,0% | 2,6% | 1,1% | aprox. 125 x BG |
| F-WT | 100,0% | 2,6% | 1,2% | aprox. 100 x BG |
| F-dS4 | 5,2% | 1,0% | 0,9% | |
| F-R4a | 7,8% | 100,0% | 1,7% | |
| F-R4b | 4,0% | 10,0% | 100,0% | |
| F-R5 | 100,0% | 1,4% | 0,7% | aprox. 0,09 x WT |
Los espacios en blanco indican una hibridación
con una sonda exactamente complementaria.
\vskip1.000000\baselineskip
- Característica:
- lavado con tampón 1; 61ºC, (20 segundos de aporte de tampón de lavado)
- \quad
- 30 minutos de agitación a temperatura ambiente
\vskip1.000000\baselineskip
| Fase sólida con distintas sondas en puntos separados | ||||||||||
| Muestra | cS3 | VK(2) | cS4 | VK(2) | cR4a | VK(2) | cR4b | VK(2) | cS5 | VK(2) |
| R-WT | 300 | 16,5% | 5863 | 9,3% | 140 | 18,5% | 62 | 12,2% | 3281 | 3,2% |
| R-dS4 | 175 | 9,2% | 215 | 15,4% | 32 | 9,1% | 30 | 8,9% | 3813 | 8,0% |
| R-R4a | 242 | 19,7% | 423 | 7,6% | 8493 | 7,6% | 136 | 13,7% | 5086 | 5,7% |
| Fase sólida con distintas sondas en puntos separados | ||||||||||
| Muestra | cS3 | VK(2) | cS4 | VK(2) | cR4a | VK(2) | cR4b | VK(2) | cS5 | VK(2) |
| R-R4b | 189 | 15,5% | 154 | 18,1% | 238 | 13,7% | 4510 | 4,7% | 8192 | 2,8% |
| R-R5 | 121 | 26,0% | 5826 | 12,8% | 77 | 10,5% | 37 | 8,4% | 127 | 7,0% |
| F-/R-WT | 206 | 19,3% | 3552 | 8,2% | 115 | 8,3% | 52 | 9,4% | 4046 | 10,1% |
| F-WT | 107 | 14,8% | 2152 | 7,2% | 87 | 10,0% | 44 | 6,8% | 3428 | 3,3% |
| F-dS4 | 135 | 14,6% | 167 | 6,8% | 39 | 9,5% | 42 | 4,7% | 6959 | 6,5% |
| F-R4a | 104 | 9,5% | 349 | 13,0% | 3199 | 4,6% | 76 | 6,6% | 7290 | 6,5% |
| F-R4b | 62 | 13,3% | 85 | 32,8% | 155 | 27,2% | 1668 | 22,1% | 8038 | 12,8% |
| F-R5 | 158 | 22,8% | 7286 | 5,7% | 108 | 7,8% | 45 | 6,0% | 256 | 10,4% |
\vskip1.000000\baselineskip
| Fase sólida | ||||
| Muestra | cS4 | cR4a | cR4b | cS5 |
| R-WT | 100,0% | 2,4% | 1,1% | aprox. 150 x BG |
| R-dS4 | 3,7% | 0,5% | 0,5% | |
| R-R4a | 5,0% | 100,0% | 1,6% | |
| R-R4b | 1,8% | 5,3% | 100,0% | |
| R-R5 | 100,0% | 1,3% | 0,6% | aprox. 0,04 x WT |
| F-/R-WT | 100,0% | 3,2% | 1,5% | aprox. 160 x BG |
| F-WT | 100,0% | 4,0% | 2,0% | aprox. 140 x BG |
| F-dS4 | 7,8% | 1,8% | 2,0% | |
| F-R4a | 10,9% | 100,0% | 2,4% | |
| F-R4b | 5,1% | 9,3% | 100,0% | |
| F-R5 | 100,0% | 1,5% | 0,6% | aprox. 0,07 x WT |
\newpage
- Característica:
- lavado con tampón 1; 61ºC, (20 segundos de aporte de tampón de lavado)
- \quad
- 60 minutos de agitación a 37ºC
| Fase sólida con distintas sondas en puntos separados | ||||||||||
| Muestra | cS3 | VK | cS4 | VK | cR4a | VK | cR4b | VK | cS5 | VK |
| R-WT | 378 | 2,1% | 2797 | 9,3% | 382 | 3,0% | 354 | 1770 | 2,5% | |
| R-dS4 | 381 | 4,5% | 428 | 6,4% | 378 | 378 | 2651 | 13,9% | ||
| R-R4a | 455 | 2,2% | 581 | 8,4% | 10154 | 5,9% | 464 | 2,5% | 6959 | 2,6% |
| R-R4b | 422 | 462 | 3,9% | 498 | 1,7% | 3761 | 4,1% | 6833 | 5,0% | |
| R-R5 | 380 | 2,6% | 8289 | 9,4% | 399 | 3,0% | 354 | 410 | 1,5% | |
| F-/R-WT | 581 | 4,2% | 7890 | 4,8% | 515 | 4,0% | 429 | 9,2% | 6138 | 1,3% |
| F-WT | 356 | 809 | 36,4% | 356 | 356 | 1511 | 57,9% | |||
| F-dS4 | 404 | 5,4% | 481 | 6,7% | 348 | 348 | 7349 | 4,0% | ||
| F-R4a | 414 | 3,4% | 574 | 7,5% | 3014 | 7,4% | 391 | 6856 | 4,0% | |
| F-R4b | 385 | 2,8% | 430 | 4,3% | 464 | 1,9% | 2633 | 4,4% | 9879 | 2,9% |
| F-R5 | 393 | 2,4% | 11210 | 6,2% | 421 | 1,9% | 366 | 520 | 2,3% |
\vskip1.000000\baselineskip
| Fase sólida | ||||
| Muestra | cS4 | cR4a | cR4b | cS5 |
| R-WT | 100,0% | 13,7% | 12,7% | 100,0% |
| R-dS4 | 15,3% | 13,5% | 13,5% | |
| R-R4a | 5,7% | 100,0% | 4,6% | |
| R-R4b | 12,3% | 13,2% | 100,0% | |
| R-R5 | 100,0% | 4,8% | 4,3% | 23,2% |
| F-/R-WT | 100,0% | 6,5% | 5,4% | |
| F-WT | 100,0% | 44,0% | 44,0% | 100,0% |
| F-dS4 | 59,5% | 43,0% | 43,0% | |
| F-R4a | 19,0% | 100,0% | 13,0% | |
| F-R4b | 16,3% | 17,6% | 100,0% | |
| F-R5 | 100,0% | 3,8% | 3,3% | 34,4% |
\newpage
La tabla 4 indica lo mismo para la matriz
ampliada 12X (de 12 sondas) en las siguientes condiciones: 90
minutos de hibridación a 37ºC, 30 minutos de reacción de conjugación
a temperatura ambiente y una etapa de lavado de la muestra a 60ºC
durante 20 segundos, todo ello efectuado en el aparato
semiautomático incubador/agitador/módulo de lavado. En este momento
el ensayo aún no estaba optimizado para las regiones 1 y 2 recién
incorporadas, de manera que hay que tomar principalmente las
regiones 4 y 5 (al igual que en la matriz inicial más pequeña). La
posición de las regiones está indicada en la Fig. 3.
\vskip1.000000\baselineskip
| Fase sólida con distintas sondas en puntos separados | ||||||||
| Muestra nº | cS3 | cS4 | cR4a | cR4b | cdS4 | cS5 | cR5 | |
| 3 | WT 3.11 | 100,0% | 2,1% | 0,5% | 7,1% | 100,0% | 0,8% | |
| 4 | WT 3.11 | 100,0% | 2,4% | 0,3% | 5,2% | 100,0% | 1,2% | |
| 5 | R1a | 100,0% | 0,5% | 0,2% | 1,2% | 100,0% | 2,1% | |
| 6 | R1a | 100,0% | 0,4% | 0,2% | 2,6% | 100,0% | 2,8% | |
| 7 | R2 | 100,0% | 0,4% | 0,1% | 0,4% | 100,0% | 1,1% | |
| 8 | R2 | 100,0% | 0,4% | 0,1% | 0,8% | 100,0% | 1,5% | |
| 9 | R4a | 12,9% | 100,0% | 1,5% | 2,0% | 100,0% | 0,9% | |
| 10 | R4a | 13,1% | 100,0% | 3,3% | 5,3% | 100,0% | 3,1% | |
| 11 | R4b | 14,3% | 7,9% | 100,0% | 9,6% | 100,0% | 2,7% | |
| 12 | R4b | 7,4% | 4,2% | 100,0% | 5,2% | 100,0% | 0,8% | |
| 13 | dS4 | 19,1% | 0,5% | 0,2% | 100,0% | 100,0% | 1,3% | |
| 14 | dS4 | 15,5% | 0,4% | 0,1% | 100,0% | 100,0% | 0,6% | |
| 15 | R5 | 100,0% | 2,5% | 2,3% | 14,2% | 0,4% | 100,0% | |
| 16 | R5 | 100,0% | 1,5% | 0,7% | 9,0% | 1,4% | 100,0% | |
| 17 | WT F/R-Amp. | 100,0% | 6,8% | 1,2% | 10,4% | 100,0% | 3,2% | |
| 18 | WT F/R-Amp. | 100,0% | 4,9% | 1,1% | 22,1% | 100,0% | 1,8% | |
| 19 | WT 3.11 | 100,0% | 3,0% | 0,3% | 8,2% | 100,0% | 1,0% | |
| 20 | WT 3.11 | 100,0% | 3,0% | 0,6% | 20,4% | 100,0% | 0,65 |
| Fase sólida con distintas sondas en puntos separados | ||||||||
| Muestra nº | cS3 | cS4 | cR4a | cR4b | cdS4 | cS5 | cR5 | |
| 3 | WT 3.11 | 100,0% | 4,6% | 1,0% | 20,3% | 100,0% | 3,4% | |
| 4 | WT 3.11 | 100,0% | 7,6% | 2,6% | 18,2% | 100,0% | 2,8% | |
| 5 | R1a | 100,0% | 0,5% | 0,2% | 1,7% | 100,0% | 1,5% | |
| 6 | R1a | 100,0% | 0,8% | 0,5% | 0,9% | 100,0% | 3,4% | |
| 7 | R2 | 100,0% | 1,7% | 0,1% | 5,3% | 100,0% | 3,6% | |
| 8 | R2 | 100,0% | 3,4% | 0,6% | 2,6% | 100,0% | 5,8% | |
| 9 | R4a | 53,6% | 100,0% | 2,4% | 1,4% | 100,0% | 4,1% | |
| 10 | R4a | 90,4% | 100,0% | 1,2% | 5,8% | 100,0% | 2,4% | |
| 11 | R4b | 29,3% | 15,5% | 100,0% | 15,3% | 100,0% | 8,3% | |
| 12 | R4b | 54,7% | 25,9% | 100,0% | 16,6% | 100,0% | 8,9% | |
| 13 | dS4 | 50,4% | 1,8% | 0,7% | 100,0% | 100,0% | 1,8% | |
| 14 | dS4 | 51,0% | 2,3% | 0,5% | 100,0% | 100,0% | 0,3% | |
| 15 | R5 | 100,0% | 10,9% | 12,3% | 5,6% | 6,2% | 100,0% | |
| 16 | R5 | 100,0% | 1,9% | 0,4% | 3,6% | 2,4% | 100,0% | |
| 17 | WT F/R-Amp. | 100,0% | 5,8% | 2,8% | 17,8% | 100,0% | 1,8% | |
| 18 | WT F/R-Amp. | 100,0% | 5,5% | 0,7% | 24,65 | 100,0% | 2,3% | |
| 19 | WT 3.11 | 100,0% | 6,4% | 2,6% | 6,4% | 100,0% | 3,3% | |
| 20 | WT 3.11 | 100,0% | 4,5% | 0,6% | 21,9% | 100,0% | 1,1% |
En todos los casos es evidente que mediante el
uso de amplicones-R, es decir con la detección
indirecta mediante el complejo de reasociación de cadenas, se podía
conseguir sorprendentemente una discriminación mucho mejor que con
la detección directa de amplicones-F fijados a las
sondas.
Este efecto sorprendente tiene lugar, sobre todo,
cuando en los analitos hay ARN o hebras individuales de ADN con
fuerte tendencia a la formación de estructuras secundarias dentro de
la cadena, dando lugar a procesos de reorientación que influyen en
la accesibilidad de los grupos objeto de la detección. Este es el
caso del segmento genético rpo-\beta amplificado
(véase Fig. 4: propuesta de plegado 2D según un algoritmo del Dr.
Zuker, Washington University, Institute for Biomedical Computing).
En la Fig. 5 se intentó ilustrar gráficamente la situación para el
caso en que (a diferencia de la presente invención) la sonda de
captura se hibridara directamente con la cadena marcada, en
presencia (situación A) o ausencia (situación B) de reasociación
dentro de la cadena.
Claims (7)
1. Método para la identificación selectiva de un
ácido nucleico, que comprende las etapas de
- -
- amplificación del ácido nucleico o de una parte del mismo mediante dos cebadores, de los cuales uno puede hibridarse con una cadena del ácido nucleico diana y el otro con una cadena complementaria de la anterior, y uno de los cuales contiene un marcador detectable, con la respectiva formación de un producto de prolongación de este cebador en una mezcla reactiva,
- -
- fijación de una sonda de captura a uno de dichos productos de prolongación, formando un complejo de hibridación que lleva la sonda de captura y al menos este producto de prolongación, y escogiendo la sonda de captura de tal modo, que se pueda fijar a la cadena del producto de prolongación que asimismo puede hibridarse con el producto de prolongación formado por el alargamiento del cebador marcado,
- -
- separación de los componentes de la mezcla reactiva que no están unidos al producto de prolongación fijado a la sonda de captura, y
- -
- determinación del marcador detectable fijado a la sonda de captura,
caracterizado porque el
cebador que lleva el marcador detectable genera el producto de
prolongación paralelo que no se puede hibridar directamente con la
sonda de
captura.
2. Método según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque la sonda de captura está
fijada a una fase sólida.
3. Método según la reivindicación 2,
caracterizado porque el complejo de hibridación formado y
fijado a una fase sólida se hace visible mediante un reactivo de
identificación que da o emite una señal y contiene un componente
capaz de unirse al marcador del cebador.
4. Método según la reivindicación 3,
caracterizado porque el reactivo de identificación contiene
un componente corpuscular generador o emisor de señal.
5. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque los productos de prolongación se
preparan primero en forma de hebras individuales y luego se ponen
en contacto con la sonda de captura, estableciendo las condiciones
adecuadas para que la sonda de captura se pueda fijar a la cadena
del producto de prolongación.
6. Método según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque la puesta en contacto con
la sonda de captura y el ajuste de las condiciones de fijación se
produce prácticamente al mismo tiempo, de tal modo que el arranque
de la reacción para la fijación de la sonda de captura al producto
de prolongación es prácticamente idéntico al arranque de la
reacción para una reasociación de las cadenas del producto de
prolongación.
7. Método según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque los productos de
prolongación se convierten en hebras individuales por
desnaturalización alcalina y porque el ajuste de las condiciones de
fijación incluye una neutralización.
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