CN108796109B

CN108796109B - 一种用于新疆葱蒜野生近缘种遗传多样性分析的trap标记引物组合及其应用

Info

Publication number: CN108796109B
Application number: CN201810505784.1A
Authority: CN
Inventors: 林辰壹; 王丹丹
Original assignee: Xinjiang Agricultural University
Current assignee: Xinjiang Agricultural University
Priority date: 2018-05-24
Filing date: 2018-05-24
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2038-05-24
Also published as: CN108796109A

Abstract

本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域。公开了一种用于新疆葱蒜野生近缘种遗传多样性分析的TRAP标记引物组合及其应用。本发明提供引物组合的核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.6所示。本发明提供TRAP‑PCR反应体系中dNTPs浓度为0.250 mmol/L、引物浓度为0.250μmol/L、Taq酶用量为0.750 U和模板DNA用量为75.000 ng，所得到的条带清晰、重复性好、多态性高的引物组合，能够准确可靠地进行遗传分析，本发明提供的引物组合的高效性及实用性弥补了TRAP标记在新疆葱蒜野生近缘种研究上的应用。

Description

一种用于新疆葱蒜野生近缘种遗传多样性分析的TRAP标记引物组合及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及一种用于新疆葱蒜野生近缘种遗传多样性分析的TRAP引物组合及其应用。

背景技术

葱蒜植物按照APG IV划分属于石蒜科（Amaryllidaceae）葱属（Allium L.）多年生草本植物。新疆境内的天山山脉以北、阿尔泰山脉以南、昆仑山脉以北的山地森林草原、山麓荒地、干旱荒漠和干旱草原灌丛等地蕴藏着大蒜、韭菜、大葱和洋葱等的野生近缘种，由于特殊的地理环境，有些葱蒜植物的野生近缘种国内仅分布于新疆，不仅是重要的观赏、食用、药用、蔬菜和饲养植物资源，而且是国内葱属植物种质创新的宝贵的基因材料，例如，实葶葱（A. galanthum）、新疆蒜（A. roborowskianum）、多籽蒜（A. fetisowii）、健蒜（A. robustum）、棱叶韭（A. caeruleum）、小山蒜（A. pallasii）等，具有较高的经济开发和利用价值。

开展新疆葱蒜野生近缘种的遗传多样性和亲缘关系分析，为揭示野生近缘种物种演化和系统关系、种质资源保护和生态安全尤为重要，目前对新疆野生葱蒜植物的种植资源遗传多样性和亲缘关系分析是基于生态适应性、形态特征、细胞学鉴定、ISSR标记等方面展开，随着遗传多样性分析技术的进步，种质资源的分类学鉴定和亲缘关系鉴定还需要开展更广泛、更深层次的分子生物学评价，需要新的分子标记引物组合的应用。表达序列标签（EST序列）是从随机选择的互补DNA（或cDNA）分子所获得的DNA（或cDNA）部分基因表达序列，代表着在特定的环境条件下，特定的组织细胞基因表达的序列。本发明提供了一种TRAP分子标记，且所述的TRAP标记是基于葱属植物的EST序列设计的引物，基于TRAP标记开展的葱蒜野生近缘种遗传多样性进行分析，为葱属野生种质资源验证基因在特定组织中的表达，推导全长基因序列，或作为标签标志基因组中的特殊位点以确定基因的位置等具有重要的指导意义。

基于分子标记的葱属植物遗传多样性研究主要集中在ISSR、SSR、RAPD等标记上，靶位区域扩增多态性（Target region amplified polymorphism, TRAP）分子标记与其他标记不同的是依据已知的目的基因的cDNA或EST基因序列设计固定引物，并结合随机引物对目标区域进行多态性扩增，从而产生围绕已知目的基因的多态性的分子标记。TRAP分子标记具有操作简单、重复性好、效率高、稳定性好等特点，已在洋葱遗传多样性分析（Anandhan S，Nair A，Kumkar DS，Gopal J. Retrotransposon based TRAP markerdisplays diversity among onion (Alliumcepa, L.) genotypes. Scientia Horticulturae，2015，190：123-127）、短日照洋葱种质鉴定得到成功运用（Kisha TJ，Cramer CS. Determining redundancy of Short-day Onion accessions in agermplasm collection using Microsatellite and Targeted Region AmplifiedPolymorphic Markers. Journal of the American Society for Horticultural Science American Society，2011，136(2)：129-134），但在葱属植物的遗传图谱构建、重要性状的标记、相关基因的克隆等其他研究上还未见报道，尤其是TRAP标记引物组合以及应用该技术在新疆葱蒜野生近缘种进行遗传多样性的分析尚未见报道。

发明内容

为填补在新疆葱蒜野生近缘种之间缺乏应用TRAP标记引物组合开展遗传多样性特征分析技术方法的空白，本发明公开了一种用于鉴定新疆葱蒜野生近缘种遗传多样性的特有的TRAP分子标记引物组合，其次，本发明还公开了应用TRAP分子标记引物组合开展新疆葱蒜野生近缘种遗传多样性分析的具体方法。

本发明所述的新疆葱蒜野生近缘种为阿尔泰蒜、奇台蒜、多籽蒜、健蒜、新疆蒜、喀纳斯蒜、乌鲁木齐蒜、棱叶蒜、小山蒜及实葶葱共计10种野生种。

本发明提供的用于分析新疆葱蒜野生近缘种遗传多样性分析的TRAP标记的3条固定引物（FY-F1、FS-F1、FS-F2）和3条随机引物（FY-R1、FS-R1、FS-R2）。

所述的TRAP标记引物FY-F1、FS-F1、FS-F2、FY-R1、FS-R1、FS-R2的命名如下所示：SEQ ID No.1的核苷酸序列被命名为FY-F1；SEQ ID No.2的核苷酸序列被命名为FS-F1；SEQID No.3的核苷酸序列被命名为FS-F2；SEQ ID No.4的核苷酸序列被命名为FY-R1；SEQ IDNo.5的核苷酸序列被命名为FS-R1；SEQ ID No.6的核苷酸序列被命名为FS-R2。

所述的引物组合包括如下a-i引物组合的至少一个组合：a. 引物组合FY-F1+FY-R1；b. 引物组合FY-F1+FS-R1；c. 引物组合FY-F1+FS-R2；d. 引物组合FS-F1+FY-R1；e. 引物组合FS-F1+FS-R1；f. 引物组合FS-F1+FS-R2；g. 引物组合FS-F2+FY-R1；h. 引物组合FS-F2+FS-R1；i. 引物组合FS-F2+FS-R2；

应用本发明用于新疆葱蒜野生近缘种遗传多样性分析的TRAP标记引物组合及其应用，具体方法包括：

（1）提取新疆葱蒜野生近缘种基因组DNA；

（2）以所述的基因组DNA为模板，使用权利5所述的引物组合进行PCR扩增；

（3）根据PCR扩增产物，鉴定所述的引物组合是否适于新疆葱蒜野生近缘种的遗传多样性分析。

优选的，FS-F1+FS-R2、FS-F2+FS-R2二对引物组合被最终确定为用于分析新疆葱蒜野生近缘种的TRAP-PCR引物组合。

优选的，所述的TRAP-PCR反应体系为：dNTPs浓度为0.250 mmol/L、引物浓度为0.250 μmol/L、Taq酶用量为0.750 U和模板DNA用量为75.000 ng。

进一步确定TRAP-PCR在进行35个循环阶段采用的退火温度在52.0℃~55.6℃之间，最优选的退火温度为53.2℃，TRAP-PCR具体步骤为：94℃预变性3min；94℃变性45s，37℃退火45s，72℃延伸1min，循环5次；94℃变性45s，53.2℃退火45s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸5min。

本发明所提供的TRAP分子标记引物实现对疆葱蒜野生近缘种遗传多样性分析，在葱属植物的遗传多样性研究方面具有一定的应用前景。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果为：

本发明弥补了目前TRAP分子标记在新疆葱蒜野生近缘种研究上的空白。TRAP分子标记进一步于新的分子标记方面对新疆葱蒜野生近缘种的遗传多样性进行更深一层的分析与评价，填补了新的分子标记在新疆葱蒜野生近缘种研究方面的不足。

TRAP分子标记是依据目标序列进行引物设计，对基因组DNA质量要求不高，检测结果重复性好，多态性高，能快速、准确、高效的完成新疆葱蒜野生近缘种的遗传多样性分析，进一步说明了TRAP引物的高效性和适用性为新疆葱蒜野生近缘种的遗传多样性分析评价和遗传育种等研究提供了参考依据。

附图说明

图1是10种新疆葱蒜野生近缘种叶片采集图。

图2是FS-F1+FS-R2引物组合在10种新疆葱蒜野生近缘种中的TRAP扩增图谱。

图3是FS-F2+FS-R2引物组合在10种新疆葱蒜野生近缘种中的TRAP扩增图谱。

图4是10种新疆葱蒜野生近缘种种群聚类分析图。

其中，图1中新疆野生葱蒜野生近缘种叶片序号代表的种类依次为：A 阿尔泰蒜、B奇台蒜、C 多籽蒜、D 健蒜、E 新疆蒜、F 喀纳斯蒜、G 乌鲁木齐蒜、H 棱叶蒜、I 小山蒜、J实葶葱。图2~3中PCR扩增泳道序号代表的种类依次为： 1~6 阿尔泰蒜、7~12 奇台蒜、13~21多籽蒜、22~28 健蒜、29~35 新疆蒜、36~41 喀纳斯蒜、42~51 乌鲁木齐蒜、52~58 棱叶蒜、59~64 小山蒜、65~70 实葶葱。图4中野生葱蒜近缘种种群聚类简称依次为：ALTS 阿尔泰蒜、QTS 奇台蒜、DZS 多籽蒜、JS 健蒜、XJS 新疆蒜、KNSS 喀纳斯蒜、WLMQS 乌鲁木齐蒜、LYS 棱叶蒜、XSS 小山蒜、STC 实葶葱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未无特殊说明的，均按照常规条件进行。实施例中，所用的dNTPs、Taq酶和10×Buffer由全式金生物技术有限公司生产，TRAP-PCR引物由华大基因合成。

实施例1. TRAP引物设计

从NCBI数据库搜索葱属植物的EST序列，通过其基因序列进行引物设计，设计出3条固定引物（FY-F1、FS-F1、FS-F2）和3条随机引物（FY-R1、FS-R1、FS-R2）。

实施例2 利用TRAP分子标记引物组合进行新疆葱蒜野生近缘种遗传多样性分析，包括以下步骤：

（1）材料

选用原生境下阿尔泰蒜、新疆蒜、健蒜、多籽蒜、奇台蒜、喀纳斯蒜、红旗达坂蒜、棱叶蒜、实葶葱和小山蒜共10个新疆葱蒜野生近缘种为实验材料，用于TRAP分析的样本材料取自新鲜叶片（图1），硅胶快速干燥样品。材料来源详细信息如表1所示。

（2）采用改良的SDS法对新疆葱蒜野生近缘种进行基因组DNA提取。

以不同种群的样本混合DNA为模板DNA，对随机组合的9对TRAP引物组合进行筛选，最终筛选出条带清晰、重复性好、多态性高的2对引物组合对供试样本进行TRAP-PCR扩增。

（3）TRAP-PCR反应体系

采用优化后的20 μL TRAP-PCR反应体系：dNTPs浓度为0.250 mmol/L、引物浓度为0.250 μmol/L、Taq酶用量为0.750 U和模板DNA用量为75.000 ng。

（4）TRAP-PCR反应程序

对TRAP-PCR反应程序进行优化，优化后的PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s，37℃退火45s，72℃延伸1min，循环5次；94℃变性45s，53.2℃退火45s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸5min。

取5 μl的6×Loading Buffer与PCR产物充分混匀，经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳在200 V、360 mA条件下电泳60~70 min，采用银染技术染色、显影后用于拍照并进行条带统计。

实施例2 种群聚类分析

根据2对引物组合所得到的扩增产物电泳条带，统计条带，在相同迁移位置有清晰带记为“1”，无条和不宜辨别的弱带标记为“0”，制成0-1数据矩阵。SPSS 19.0做基础统计分析。用Popgene 1.32软件计算其遗传指数。利用NTSYS-pc 2.1软件，基于UPGMA法对新疆葱蒜野生近缘种进行聚类分析。

实施例1 结果分析

随机组合的9对引物组合中，共筛选出2对引物组合作为新疆葱蒜野生近缘种TRAP-PCR扩增的引物组合。以10种新疆葱蒜野生近缘种为材料所得到的野生葱蒜植物的扩增条带，条带较为清晰，带型较为稳定，表现出了比较丰富多态性，基于FS-F1 + FS-R2引物的TRAP-PCR扩增产物出现在141bp~500bp范围内，FS-F2 + FS-R2引物的TRAP-PCR扩增产物出现在123bp~500bp范围内。

用NTSYS-pc 2.1软件对其距离矩阵进行UPGMA法聚类分析，获得10个种群的遗传相似性聚类图。结果表明，10种野生葱蒜植物种群间的遗传相似系数在0.70~0.94之间，具有丰富的遗传多样性；其中，乌鲁木齐蒜和棱叶蒜先聚在一起，说明其亲缘关系最近。在遗传相似系数为0.76时，10个种群供试样本可被分为3个类群：

第Ⅰ类包括2个种群，包括阿尔泰蒜（ALTS）、奇台蒜（QTS）；

第Ⅱ类包括4个种群，多籽蒜（DZS）、新疆蒜（XJS）健蒜（JS）、喀纳斯蒜（KNSS）；

第Ⅲ类包括4个种群，乌鲁木齐蒜（WLMQS）、棱叶蒜（LYS）、小山蒜（XSS）、实葶葱（STC）。

聚类分析的结果进一步证明本发明获得的用于新疆葱蒜野生近缘种遗传多样性分析的TRAP标记引物组合能够有效地评价新疆葱蒜野生近缘种，在新疆葱蒜野生近缘种的遗传多样性分析方面具有广泛的应用前景。

实验例2 总结

采用本发明所提供的引物组合，通过TRAP-PCR扩增实现了新疆葱蒜野生近缘种的遗传多样性分析，为实现新疆葱蒜野生近缘种基于TRAP分子标记的分类学鉴定和亲缘关系鉴定等提供技术支撑，进一步阐述了TRAP引物组合在新疆葱蒜野生近缘种研究方面的高效性与适用性。

序列表

<110> 新疆农业大学

<120> 一种用于新疆葱蒜野生近缘种遗传多样性分析的TRAP标记引物组合及其应用

<130> 2018

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 野生葱蒜(Wild Allium人工序列)

<400> 1

tcgcaagtct actccagc 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 野生葱蒜(Wild Allium人工序列)

<400> 2

gttcccttgg gttctttag 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 野生葱蒜(Wild Allium人工序列)

<400> 3

acttgggatt atcgtctgc 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 野生葱蒜(Wild Allium人工序列)

<400> 4

tgtcatccca caagtttca 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 野生葱蒜(Wild Allium人工序列)

<400> 5

tagttccttc gtatgagcag 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 野生葱蒜(Wild Allium人工序列)

<400> 6

agccctgggt gatttgta 18

Claims

1.一种TRAP分子标记，其特征在于，所述的分子标记用于新疆葱蒜野生近缘种遗传多样性分析；所述分子标记的引物组合为FS-F1+FS-R2或FS-F2+FS-R2；

所述FS-F1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述FS-F2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述FS-R2的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

2.根据权利要求1所述的TRAP分子标记，其特征在于，所述的新疆葱蒜野生近缘种为阿尔泰蒜、奇台蒜、多籽蒜、健蒜、新疆蒜、喀纳斯蒜、乌鲁木齐蒜、棱叶蒜、小山蒜及实葶葱。

3.一种权利要求1所述的TRAP分子标记用于新疆葱蒜野生近缘种遗传多样性分析的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提取新疆葱蒜野生近缘种基因组DNA；

(2)以所述的基因组DNA为模板，使用权利要求1所述的引物组合进行PCR扩增；

(3)根据PCR扩增产物，基于UPGMA法对新疆葱蒜野生近缘种进行聚类分析。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增的反应体系为：dNTPs浓度为0.250mmol/L、引物浓度为0.250μmol/L、Taq酶用量为0.750U和模板DNA用量为75.000ng；所述反应体系的总体积为20μL。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，进行所述PCR扩增反应时，其PCR反应程序具体为：

94℃预变性3min；94℃变性45s，37℃退火45s，72℃延伸1min，循环5次；94℃变性45s，53.2℃退火45s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸5min。