CN110117674B - 一种与大豆植株分枝数显著相关的InDel标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与大豆植株分枝数显著相关的InDel标记及其应用，涉及遗传育种技术领域，通过SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所述的序列为引物对大豆基因组DNA进行PCR扩增，并对扩增产物判断，若扩增产物仅含1条主带，则对应待测大豆DNA没问题且植株分枝数多；若扩增产物包含两条主带，则对应待测大豆DNA没问题且植株分枝数少；本发明提供的方法能够有效、快速的刷选出大豆植株为分枝数多或少的品种，实现了筛选优异大豆植株材料的第一步，为深入开展基因功能研究和大豆分枝数分子改良提供了方法基础。
Description
技术领域
本发明涉及遗传育种技术领域，具体涉及一种与大豆植株分枝数显著相关的InDel标记以及鉴定大豆植株分枝数多少的方法。
背景技术
大豆是世界上最重要的一种油料经济作物，同时也是最大的食用油和蛋白的来源。随着对大豆需求的增长，利用大豆品种的遗传改良来提高大豆产量将变得越来越重要。优化植株形态结构、培育具有最优分枝的大豆品种是植物育种家一直追求的育种目标。
常规育种年限长、效率低且成本高，而分子标记反映生物个体基因组DNA片段的差异，直接反应种质资源本质，具有高效、准确以及经济等优点，大幅缩短育种周期，是传统育种技术的有力补充SNP分子标记具有数量多、遗传稳定等优点，基于酶切扩增多态性序列标记技术(CAPS)的SNP分子标记检测方法，主要是将PCR扩增产物中含SNP位点的DNA片段进行限制性酶切分析，是SNP分子标记的检测方法之一。InDel标记是由插入/缺失位点两侧的基因序列所设计的特异性引物，根据PCR产物片段大小可直接快速的进行检测，具有准确性高、稳定性好以及成本低等优势。InDel标记相比较与CAPS标记来说，耗时短、成本低及操作简便。目前已广泛应用于植物种质资源分析及分子标记辅助育种。
大豆植株分枝数是影响大豆品质的重要组分因素，而现有技术中并未见报道可对大豆植株分枝数多少进行有效判断的分子生物学方法；而现有技术中，虽然存在对大豆植株其它性状进行分子筛选的方法，但是多数存在筛选技术不稳定、时间长、技术繁琐等问题。
因此，如何避免上述风险，是急需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种与大豆植株分枝数显著相关的InDel标记及其应用，以解决现有技术中不存在对大豆植株分枝数多少有效筛选、筛选技术时间长等技术问题。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种与大豆植株分枝数显著相关的InDel标记，所述InDel标记的核苷酸序列具体如SEQ ID NO.1：TGTCTGTGAAGT。
本发明还提供一种上述的InDel标记在鉴定大豆植株分枝数中的应用。
本发明还提供一种用于扩增上述InDel标记的引物对，所述引物对的序列具体为：
1F：GCAAATCTGTCTGTGAAGTACG SEQ ID NO.2
1R：TATCCGAATTGCAAAAGCGCA SEQ ID NO.3。
本发明还提供一种上述的引物对在鉴定大豆植株分枝数中的应用。
本发明还提供一种双引物对快速鉴定大豆植株分枝数多少的方法，该方法包括以下步骤：
步骤1、设计鉴定待测大豆基因组DNA是否有缺陷的引物对
2F：GTGTCATTCCTGGCATACAAAAGT SEQ ID NO.4
2R：TAATGCCTCCTGCCCTGTTG SEQ ID NO.5
步骤2、提取待测大豆基因组DNA
步骤3、以SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所述的序列为引物，对步骤2提取的待测大豆基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物
步骤4、对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若扩增产物仅含1条主带，则对应待测大豆DNA没问题且植株分枝数多；若扩增产物包含两条主带，则对应待测大豆DNA没问题且植株分枝数少。
进一步，步骤3中PCR扩增体系为：2.0μL 100ng/μL的模板DNA、10μM的引物各1.0μL，1.0U Prime star Max酶12.5μL，ddH2O 8.5μL；反应条件为：94℃变性2min，98℃变性10s，62℃,降落-0.2℃，退火15s，72℃延伸19s，共循环38次；最后72℃延伸8min，4℃保存。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种与大豆植株分枝数显著相关的InDel标记及其应用，其中：
(1)本发明采用双引物对对待测大豆基因组DNA进行PCR扩增，实现了同步筛选无缺陷大豆基因组DNA和鉴定被测大豆分枝数多少的目的，降低了筛选时间，提高了筛选效率和筛选准确率；
(2)本发明的分子标记可以筛选分枝数多和分枝数少的大豆材料，为优化植株形态结构、培育最优分枝的大豆品种提高了方法基础，为了提高大豆产量，在大豆遗传改良中具有重要的作用。
附图说明
图1为实施例中扩增产物琼脂糖电泳图，M为2K Marker，编号1-12为分枝数少的材料，编号13-24为分枝数多的材料,第一条带为601bp,用来验证DNA的有效性，第二条带为401bp，是显性分子标记。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例中，选用1600份全国大豆种质资源精准鉴定(中国农业科学院作物科学研究所提供)中植株分枝数多的品种12份，植株分枝数少的品种12份，共24份材料，详细材料清单如附表1。
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 名称 | 黑河13 | Glacier | 黑河26 | 黑河23 | 垦丰20 | 黑河43号 | 永丰豆 | 黑生101 |
| 编号 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 |
| 名称 | MN0201 | 黑河9号 | 黑河13 | 哈13-2185 | 彭县绿豆 | 气死洼 | 华夏1号 | 崖州黑豆 |
| 编号 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 |
| 名称 | 湘春豆10 | 茶山黑豆 | Rhodes | 小黑豆 | 白荚子 | 古黄豆－4 | 82-16 | 六月忙-3 |
表1
本实施例中，对上述24份材料进行提取基因组DNA操作
针对本发明提出的InDel标记SEQ ID NO.1 TGTCTGTGAAGT，设计用于鉴定SEQ IDNO.1(本发明针对的InDel标记位于大豆基因组DNA启动子中，以起始密码子ATG为位置0，该InDel的位置是：-2743～-2732)的引物对
1F：GCAAATCTGTCTGTGAAGTACG SEQ ID NO.2
1R：TATCCGAATTGCAAAAGCGCA SEQ ID NO.3
为了避免在对待测大豆基因组DNA进行PCR扩增时，提取的待测大豆基因组DNA因存放时间久、提取过程被污染等因素导致提取的待测大豆基因组DNA存在问题，设计一对引物对，对其进行鉴定，该引物对如下：
2F：GTGTCATTCCTGGCATACAAAAGT SEQ ID NO.4
2R：TAATGCCTCCTGCCCTGTTG SEQ ID NO.5
为了实现快速检测与鉴定大豆分枝数的多少，本实施例中，采用上述两对引物对对提取的待测大豆基因组DNA进行PCR扩增；
PCR扩增体系为：2.0μL 100ng/μL的模板DNA、10μM的引物各1.0μL，1.0U Primestar Max酶12.5μL，ddH2O 8.5μL；反应条件为：94℃变性2min，98℃变性10s，62℃,降落-0.2℃，退火15s，72℃延伸19s，共循环38次；最后72℃延伸8min，4℃保存。
获得扩增产物
对扩增产物进行琼脂糖电泳，其结果如图1。
由图1，可得扩增产物仅含1条主带的(其核苷酸序列如SEQ ID NO 6，用于验证被测大豆基因组DNA是否存在缺陷，若能够扩增出该条主带，则对应被测大豆基因组DNA没问题)，对应的待测大豆DNA没问题且对应植株分枝数为多(结合图1，可以得出，扩增产物仅为一条主带的均为编号13-24分枝数多的材料)；扩增产物包含两条主带的(其序列分别为SEQID NO.6、SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.6可以验证待测大豆DNA没问题，SEQ ID NO.7则用于验证大豆分枝数的多少)，对应的待测大豆DNA没问题且对应植株分枝数少(结合图1，可以得出，扩增产物为两条主带的均为编号1-12分枝数少的材料)。
将表1中的大豆在2017年及2018年分别种植，并统计相应植株分枝数平均值，其结果如表2
表2选择的20份栽培大豆植株分枝数平均值
表2
对表2中选择的24份栽培大豆植株分枝数方差进行分析，分析结果如表3
表3
由表3可知，2017、2018年研究选用12份分枝数少的品种，Mean±SD分别为0.4208±0.30321％、0.4892±0.23693％，标准误(SE)分别为为0.08753、0.06840；12份分枝数多的品种Mean±SD分别为9.0083±2.30145％、8.1325±1.38772％，标准误(SE)分别为0.66437、0.40060。结合图1和表3中2017年、2018年P＝0.000方差分析结果表明，大豆植株分枝数多少与所述基因(SEQ ID NO.1所示核苷酸序列)表现为极显著相关，本发明提供的InDel标记为一种新的鉴定大豆分枝数多少的显性分子标记，能够方便、有效、稳定、准确的鉴定出大豆植株分枝数多与分枝数少，利用本发明的分子标记可以筛选分枝数多和分枝数少的大豆材料，为优化植株形态结构、培育最优分枝的大豆品种提高了方法基础，为了提高大豆产量，在大豆遗传改良中具有重要的作用。
序列表
<110> 安徽农业大学
<120> 一种与大豆植株分枝数显著相关的InDel标记及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 1
tgtctgtgaa gt 12
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 2
gcaaatctgt ctgtgaagta cg 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 3
tatccgaatt gcaaaagcgc a 21
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 4
gtgtcattcc tggcatacaa aagt 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 5
taatgcctcc tgccctgttg 20
<210> 6
<211> 601
<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 6
gtgtcattcc tggcatacaa aagtaaaaca aactctaatg tctggcactt ttattgacag 60
ataatagtgg cagaggtagc aactttctga tggaattgac ttcataccca aagcttagtc 120
tgagaaattc acttccaact cctagatcat ctgagctagc tcctggaaat caaacctcca 180
cacttagctg gaatggcaac tcagagacat catctgacct tttcttgcaa ggttcggtgg 240
gtgggacaag cttcgccagc ccgggacatc ctccagggga aagttacatt ggggtcaccg 300
acacgagctg tgctctctct cttctgtcaa atcaaacatg gggttctaga aacacagcac 360
caagtcttgg gttgagtaac atgataaatt tcaacgggac acccttgaca caacttgctg 420
catcatctca tggtgcatca atccatcaac ttccaaatac ctcgtggttt ttcaagggca 480
ttgattctgg taactgttcg cccgaggtgg tccctgatct aggtctcggt cagatttcac 540
agcctctcaa tagccaactt catggtgagc tggacctgtc ccaacagggc aggaggcatt 600
a 601
<210> 7
<211> 401
<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 7
gcaaatctgt ctgtgaagta cgtaaacttt gtggatatta agtctttttt taaagtttat 60
gtagttatat tgagtttttg agttcataaa ttcttgaatt tgattgactt tatttatgga 120
ctcgtaaatt atttatttaa attatttaag tttgatgtgt aagtaatttt aattgcttat 180
gttaagattt tgatttttaa tttaggttgt tatcgttaaa ttgtgatgtt taaaatattg 240
atatatttta gtgtgataga ttttagcttt aaaaatgaag ttaatttttc ttcttctaat 300
tttatacact ttttttactt ttttaaaaat attttttntt caaattacta cttaatttca 360
tggattgatt catttattca tgcgcttttg caattcggat a 401
Claims (7)
1.一种与大豆植株分枝数显著相关的InDel标记，其特征在于，所述InDel标记位于SEQID NO.7所示核苷酸序列的8-19位上，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1：TGTCTGTGAAGT。
2.权利要求1所述的InDel标记在鉴定大豆植株分枝数中的应用。
3.用于扩增权利要求1所述InDel标记的引物对，其特征在于，所述引物对的序列具体为：
1F：GCAAATCTGTCTGTGAAGTACG SEQ ID NO.2
1R：TATCCGAATTGCAAAAGCGCA SEQ ID NO.3。
4.权利要求3所述的引物对在鉴定大豆植株分枝数中的应用。
5.一种双引物对快速鉴定大豆植株分枝数多少的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤1、设计鉴定待测大豆基因组DNA是否有缺陷的引物对
2F：GTGTCATTCCTGGCATACAAAAGT SEQ ID NO.4
2R：TAATGCCTCCTGCCCTGTTG SEQ ID NO.5
步骤2、提取待测大豆基因组DNA
步骤3、以SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5构成的引物对组，对步骤2提取的待测大豆基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
步骤4、对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若扩增产物仅含1条主带，则对应待测大豆DNA没问题且植株分枝数多；若扩增产物包含两条主带，则对应待测大豆DNA没问题且植株分枝数少。
6.根据权利要求5所述的双引物对快速鉴定大豆植株分枝数多少的方法，其特征在于，步骤3中PCR扩增体系为：2.0μL 100ng/μL的模板DNA、10μM的引物各1.0μL，1.0U Primestar Max酶12.5μL，ddH2O 8.5μL；反应条件为：94℃变性2min，98℃变性10s，62℃,降落-0.2℃，退火15s，72℃延伸19s，共循环38次；最后72℃延伸8min，4℃保存。
7.含有权利要求3所述引物对的检测试剂或试剂盒。
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