ES2209033T5 - Oligonucleotidos marcados. - Google Patents

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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A OLIGONUCLEOTIDOS MARCADOS, BLOQUEADOS EN EL EXTREMO 3'', PARA IMPEDIR LA INCORPORACION DE DICHO OLIGONUCLEOTIDO MARCADO A UN PRODUCTO DE EXTENSION DE UN CEBADOR. DICHOS OLIGONUCLEOTIDOS SE PUEDEN INCORPORAR COMO SONDA EN EL MODELO DE ENSAYO DE LA NUCLEASA 5'' A 3''.

Description

Oligonucleótidos marcados.
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Esta invención se refiere en general al campo de la química del ácido nucleico. Más específicamente se refiere al empleo de la actividad nucleasa 5' a 3' de una polimerasa de ácido nucleico para degradar un oligonucleótido marcado en un dúplex hibridado, compuesto del oligonucleótido marcado y una secuencia diana de oligonucleótidos y formar fragmentos marcados detectables.
En los ensayos de diagnóstico se aplican rutinariamente técnicas microbiológicas de investigación. Por ejemplo, la patente U.S. nº 4.358.535 describe un método para la detección de patógenos salpicando una muestra (p. ej., sangre, células, saliva, etc.) sobre un filtro (p. ej., de nitrocelulosa), lisando las células, y fijando el ADN mediante una desnaturalización química y calentando. A continuación se añaden sondas de ADN marcadas y se deja que hibriden con la muestra de ADN fijada, indicando la hibridación, la presencia de ADN patógeno. La muestra de ADN puede ser amplificada en este caso cultivando las células u organismos colocados sobre el filtro.
Un importante perfeccionamiento en la amplificación del ADN, a saber, la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se describe en las patentes U.S. 4.683.202; 4.683.195, 4.800.159 y 4.965.188. En su forma más simple, la PCR es un método in vitro para la síntesis enzimática de secuencias específicas de ADN, empleando dos cebadores oligonucleótidos que hibridan las cadenas opuestas y flanquean la región de interés del ADN diana. Series repetitivas de pasos de reacción que comprenden la desnaturalización de un molde, la reasociación de los cebadores, y la extensión de los cebadores reasociados mediante la ADN polimerasa, da como resultado la acumulación exponencial de un fragmento específico cuyos términos están definidos por los extremos 5' de los cebadores. La PCR es capaz de producir un enriquecimiento selectivo de una secuencia específica de ADN por un factor de 10^{9}. El método PCR está también descrito en Saiki y col., 1985, Science 230:1350.
Los métodos de detección generalmente empleados en las técnicas estándar de la PCR emplean una sonda marcada con el ADN amplificado en un ensayo de hibridación. Por ejemplo, la publicación de la patente EO nº 237.362 y la publicación de la PCT nº 89/11548, describen métodos de ensayo en donde el ADN amplificado por PCR se fija primero en un filtro y a continuación se añade una sonda específica de oligonucleótidos y se deja hibridar. De preferencia la sonda se marca p. ej., con biotina ^{32}P, peroxidasa de rábano silvestre (HRP), etc. para permitir la detección de hibridación. También se sugiere lo inverso, es decir, la sonda se une en cambio a la membrana, y se añade el ADN de muestra amplificado con PCR.
Las patentes US-A-4876395, EP-A-0.252.683, EP-A-0.334.694 y US-A-478.405 describen ácidos nucleicos marcados, que son complementarios a un ácido nucleico diana y que están bloqueados en su terminal 3'. Sin embargo, en ninguna de estas referencias se describen oligonucleótidos que comprenden dos sondasen donde las marcas están separadas por un sitio susceptible de escisión por una nucleasa.
Otros medios de detección incluyen el empleo de polimorfismo de longitud fragmentada (PCR-FLP), hibridación a sondas de oligonucleótidos específicos a alelos (ASO) (Saki y col., 1986, Nature 324:163), o secuenciado directo mediante el método de didesoxi empleando ADN amplificado mejor que el ADN clonado. La técnica estándar de la PCR opera esencialmente mediante la replicación de una secuencia de ADN posicionada entre dos cebadores, proporcionando como producto principal de la reacción una secuencia de ADN de longitud discreta terminando con el cebador en el extremo 5' de cada cadena. Así las inserciones y deleciones entre los cebadores dan como resultado secuencias del producto de longitudes diferentes, las cuales pueden ser detectadas calibrando el producto mediante una PCR-FLP. En un ejemplo de hibridación ASO el ADN amplificado se fija a un filtro de nylon (mediante, por ejemplo, irradiación UV) en una serie de "dot blots", a continuación se deja hibridar con una sonda de oligonucleótidos marcada con HRP en condiciones restrictivas. Después de lavar, se añaden tetrametilbencidina (TMB) y peróxido de hidrógeno. La HRP cataliza la oxidación por el peróxido de hidrógeno de la TMB formándose un colorante de color azul soluble que puede ser precipitado, lo cual indica que la sonda ha hibridado.
Aunque la técnica de la PCR como se practica en la actualidad es un método extremadamente poderoso para la amplificación de secuencias de ácido nucleico, la detección del material amplificado requiere una manipulación adicional y el subsiguiente manejo de los productos de la PCR para determinar si el ADN diana está presente. Sería deseable disminuir el número de pasos subsiguientes de manipulación habitualmente necesarios para la detección del material amplificado. Sería ideal un sistema de ensayo "homogéneo" o sea un ensayo que generase la señal mientras la secuencia diana es amplificada, y que necesitara una mínima manipulación después de la amplificación.
La presente invención proporciona un procedimiento para la detección de una secuencia diana de ácido nucleico en una muestra, el cual procedimiento comprende:
(a) puesta en contacto de la muestra que comprende los ácidos nucleicos monocatenarios, con un oligonucleótido que contiene una secuencia complementaria a una región del ácido nucleico diana y otro oligonucleótido marcado que contiene una secuencia complementaria a una segunda región de la misma cadena de ácido nucleico diana, pero que no incluye la secuencia de ácido nucleico definida por el primer oligonucleótido, creando así una mezcla de varios dúplex durante las condiciones de hibridación, en donde los varios dúplex comprenden el ácido nucleico diana reasociado al primer oligonucleótido y al oligonucleótido marcado, de forma que el extremo 3' del primer oligonucleótido es adyacente al extremo 5' del oligonucleótido marcado.
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(b) tratando la mezcla del paso (a) con una polimerasa de ácido nucleico dependiente del molde, que tiene una actividad nucleasa de 5' a 3' en condiciones suficientes para permitir que la actividad nucleasa de 5' a 3' de la polimerasa, escinda el oligonucleótido marcado asociado y libere fragmentos marcados; y
(c) detectando y/o midiendo la liberación de los fragmentos marcados.
Este procedimiento es especialmente adecuado para el análisis de ácido nucleico amplificado mediante la PCR. El procedimiento es un perfeccionamiento de los métodos de detección por PCR conocidos, puesto que permite tanto la amplificación de una diana como la liberación de una marca para que la detección se efectúe en un sistema de reacción sin recurrir a múltiples pasos de manipulación del producto amplificado. Así, en otra versión, se proporciona un método de amplificación a la reacción en cadena de la polimerasa para la simultánea amplificación y detección de una secuencia de ácido nucleico diana de una muestra. Este método comprende:
(a) incorporación a un ensayo PCR que contiene dicha muestra, de por lo menos un oligonucleótido marcado que contiene una secuencia complementaria a una región del ácido nucleico diana, en donde dicho oligonucleótido marcado se asocia dentro de la secuencia de ácido nucleico diana unida mediante los cebadores oligonucleótidos del paso (b);
(b) incorporación de un juego de cebadores oligonucleótidos, en donde un primer cebador contiene una secuencia complementaria a una región en una cadena de la secuencia del ácido nucleico diana y ceba la síntesis de una cadena de ADN complementario, y un segundo cebador contiene una secuencia complementaria a una región de una segunda cadena de la secuencia de ácido nucleico diana y ceba la síntesis de una cadena de ADN complementario; y en donde dicho cebador oligonucleótido se selecciona para reasociar a su molde complementario en dirección aguas arriba, de cualquier oligonucleótido marcado reasociado a la misma cadena de ácido nucleico;
(c) amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana empleando una polimerasa de ácido nucleico que tiene actividad 5' a 3' nucleasa como un agente polimerizante en función del molde, en condiciones que permiten los pasos de ciclación de la PCR, de (i) reasociación de los cebadores y oligonucleótidos marcados a una secuencia de ácido nucleico molde contenida dentro de la región diana y (ii) extensión del cebador en donde dicha polimerasa de ácido nucleico sintetiza un producto de extensión del cebador, mientras la actividad 5' a 3' nucleasa de la polimerasa de ácido nucleico libera simultáneamente fragmentos marcados a partir de los varios dúplex reasociados que comprenden oligonucleótidos marcados y sus secuencias de ácido nucleico molde complementario, creando con ello fragmentos marcados susceptibles de ser detectados.
(d) detección y/o medición de la liberación de fragmentos marcados para dictaminar la presencia o ausencia de la secuencia diana en la muestra.
La figura 1 es una autorradiografía de una placa de cromatografía en capa fina (TLC) de celulosa DEAF, que ilustra la liberación de fragmentos marcados de una sonda escindida.
La figura 2 es una autorradiografía de placas de TLC de celulosa DEAF, que ilustra la termoestabilidad de la sonda marcada.
Las figuras 3A y 3B son autorradiografías de placas de TLC de celulosa DEAE mostrando que la cantidad liberada de fragmentos de sonda marcados es correlativa con un aumento del número de ciclos de la PCR y el comienzo de la concentración del ADN molde.
La figura 4 ilustra la actividad 5'-3' nucleasa de la Taq ADN polimerasa, independientemente de la polimerización, mostrada en la autorradiografía empleando una serie de cebadores que se asocian desde 0 a 20 nucleótidos en dirección aguas arriba de la sonda.
La figura 5 es una autorradiografía que muestra la liberación de fragmentos de la sonda marcada, bajo crecientes temperaturas y tiempos de incubación, en donde la composición en el extremo 5' de la sonda es rica en GC.
La figura 6 es una autorradiografía que muestra la liberación de fragmentos de sonda marcada bajo crecientes temperaturas y tiempos de incubación, en donde la composición en el extremo 5' de a sonda es rica por AT.
La figura 7 muestra el análisis por electroforesis en gel de 5% de acrilamida, de un producto HIV de 142 pares de bases, amplificado en presencia o ausencia de una sonda marcada.
La figura 8 es una composición de dos autorradiografías de análisis TLC de alícuotas de productos de amplificación PCR, que muestra que tiene lugar la liberación de la radiomarca y que ésta aumenta en cantidad tanto con un aumento del molde inicial como con un termociclado más largo.
La figura 9 es un esquema de una reacción en la que un éster NHS-activo derivado de la biotina se añade a la 3'-amina de una sonda de oligonucleótidos.
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La figura 10 es un esquema de una reacción en la cual se emplea una hidracida de biotina para marcar una sonda de oligonucleótidos que tiene un 3'-ribonucleótido.
La figura 11 es un esquema para el marcado de una sonda de oligonucleótidos con biotina empleando una fosforamidita de biotina.
La figura 12 muestra unos reactivos para el marcado de sondas de oligonucleótidos con biotina.
La figura 13 muestra una sonda de oligonucleótidos marcada con rodamina-X-590 y violeta cristal.
La figura 14 muestra un esquema de una reacción para generar una acil azida activa de violeta cristal.
La figura 15 muestra un esquema de una reacción para añadir una amina a una timidina para emplear en la conjugación de una marca a una sonda de oligonucleótidos.
La figura 16 muestra los resultados típicos y la relación de la señal al número de dianas de entrada para el presente método empleando el extractante de fase sólida Bakerbond^{TM} PEI.
Como se utiliza en la presente, una "muestra" se refiere a cualquier sustancia que contiene o se sospecha que contiene ácido nucleico, e incluye una muestra de tejido o fluido aislado de un individuo o individuos, incluyendo aunque sin limitarlo a, por ejemplo, la piel, plasma, suero, fluido espinal, fluido linfático, fluido sinovial, orina, lágrimas, células sanguíneas, órganos, tumores y también muestras de constituyentes de cultivos celulares in vitro (incluyendo pero sin limitar a, un medio condicional que da como resultado el crecimiento de células en medios de cultivos celulares, células recombinantes y componentes celulares).
Como se emplean en la presente, los términos "ácido nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido" se refieren a cebadores, sondas, fragmentos de oligómeros que hay que detectar, controles de oligómeros y oligómeros de bloqueo sin marcar y son genéricos a polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), a polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa), y a cualquier otro tipo de poli-nucleótido que sea un N-glicósido de una base purínica o pirimidínica, o de bases purínicas o pirimidínicas modificadas. No existe ninguna diferencia prevista en longitud entre el término "ácido nucleico" "polinucleótido" y "oligonucleótido" y estos términos se usarán intercambiablemente. Estos términos se refieren solamente a la estructura primaria de la molécula. Así, estos términos incluyen ADN de cadena doble y ADN de cadena sencilla, así como ARN de cadena doble y ARN de cadena sencilla. Un oligonucleótido está compuesto de una secuencia de aproximadamente por lo menos de 6 nucleótidos, de preferencia por lo menos aproximadamente 10-12 nucleótidos y con mayor preferencia, por lo menos aproximadamente 15-20 nucleótidos correspondientes a una región de la secuencia de nucleótidos designada. "Correspondientes" significa idén-ticos a, o complementarios a la secuencia designada.
El oligonucleótido no es necesariamente físicamente derivado de alguna secuencia existente o natural sino que puede ser generada de cualquier manera, incluyendo la síntesis química, la replicación del ADN, transcripción inversa o una combinación de las mismas. Los términos "oligonucleótido" o "ácido nucleico" se refieren a un polinucleótido de ADN o ARN genómico, semisintético o de origen sintético, el cual en virtud de su origen o manipulación: (1) no está asociado con todo o parte del polinucleótido con el cual está asociado en la naturaleza; y/o (2) está unido a un polinucleótido distinto al que está unido en la naturaleza; y (3) no se encuentra en la naturaleza.
Debido a que los mononucleótidos se hacen reaccionar para formar los oligonucleótidos de manera que el 5' fosfato de un anillo de pentosa del mononucleótido se une al 3' oxígeno de su vecino en una dirección mediante una unión fosfodiéster, un extremo de un oligonucleótido recibe el nombre de "extremo 5'" si su 5' fosfato no está unido a un 3' oxígeno de un anillo de pentosa del mononucleótido, y el nombre de "extremo 3'" si su 3' oxígeno no está unido a un 5' fosfato de un subsiguiente anillo de pentosa del mononucleótido. Como se emplea en la presente, una secuencia de ácido nucleico incluso si está en el interior de un oligonucleótido más largo, también puede decirse que tiene extremos 5' y 3'.
Cuando dos diferentes oligonucleótidos que no se solapan se reasocian a diferentes regiones de la misma secuencia lineal complementaria de ácido nucleico, y el extremo 3' de un oligonucleótido apunta hacia el extremo 5' del otro, el primero puede llamarse el oligonucleótido "en dirección aguas arriba", y el último, el oligonucleótido en dirección aguas abajo.
El término "cebador" puede referirse a más de un cebador y se refiere a un oligonucleótido, tanto si se encuentra en la naturaleza como si es un digesto de restricción purificado o producido sintéticamente, el cual es capaz de actuar como un punto de iniciación de una síntesis a lo largo de una cadena complementaria cuando se le coloca bajo condiciones en las cuales se cataliza la síntesis de un producto de extensión del cebador, el cual producto es complementario a la cadena de ácido nucleico. Tales condiciones incluyen la presencia de cuatro diferentes desoxirribonucleósido trifosfatos y un agente inductor dela polimerización tal como la ADN polimerasa o transcriptasa inversa, en un tampón adecuado ("tampón" incluye sustituyentes que son cofactores, o que afectan al pH, a la fuerza iónica, etc.) y a una temperatura adecuada. El cebador es de preferencia monocatenario para su próxima eficiencia de la
amplificación.
El complemento de una secuencia de ácido nucleico como se emplea en la presente, se refiere a un oligonucleótido que ha sido alineado con la secuencia de ácido nucleico de tal forma que el extremo 5' de una secuencia se empareja con el extremo 3' de la otra, es una "asociación antiparalela". Ciertas bases que no se encuentran corrientemente en los ácidos nucleicos naturales pueden ser incluidos en los ácidos nucleicos de la presente invención, e incluyen por ejemplo, la inosina y la 7-desazaguanina. No necesitan ser complementariamente perfectos; los varios dúplex pueden contener pares de bases mal emparejadas o bases sin emparejar. Los expertos en la técnica de la tecnología de ácidos nucleicos pueden determinar la estabilidad de un dúplex empíricamente tomando en consideración un número de variables incluyendo, por ejemplo, la longitud del oligonucleótido, la composición de bases y la secuencia de oligonucleótidos, la fuerza iónica y la incidencia de los pares de bases mal emparejados.
La estabilidad de un dúplex de un ácido nucleico se mide mediante la temperatura de fusión o "T_{m}". La T_{m} de un dúplex de un ácido nucleico particular en condiciones especificadas es la temperatura a la cual la mitad de los pares de bases de han disociado.
Como se emplea en la presente, el término "secuencia diana" o "secuencia diana de un ácido nucleico" se refiere a una región del oligonucleótido que va a ser amplificada, detectada, o ambas cosas. La secuencia diana reside entre las secuencias de los dos cebadores empleados para la ampliación.
Como se emplea en la presente, el término "sonda" se refiere a un oligonucleótido marcado que forma una estructura dúplex con una secuencia del ácido nucleico diana debido a la complementariedad de por lo menos una secuencia de la sonda con una secuencia de la región diana. La sonda de preferencia no contiene una secuencia complementaria a la(s) secuencia(s) empleada(s) para cebar la reacción en cadena de la polimerasa. Generalmente el terminal 3' de la sonda estará "bloqueado" para evitar la incorporación de la sonda en el producto de extensión del cebador. El "bloqueo" puede lograrse empleando bases no complementarias o añadiendo un grupo químico tal como la biotina o un grupo fosfato al hidroxilo 3' del último nucleótido, el cual puede en función del grupo seleccionado, servir a un doble propósito actuando también como una marca para la subsiguiente detección o captura del ácido nucleico unido a la marca. El bloqueo puede también lograrse eliminando el 3'-OH, o mediante el empleo de un nucleótido que carezca de 3'-OH tal como un didesoxinucleótido.
El término "marca" como se emplea en la presente, se refiere a cualquier átomo o molécula que pueda emplearse para proporcionar una señal detectable (de preferencia cuantificable), y que pueda unirse a un ácido nucleico o proteína. Las marcas pueden proporcionar señales por fluorescencia, radioactividad, colorimetría, gravimetría, difracción o absorción con rayos X, magnetismo, actividad enzimática y similares.
Como se define en la presente, la "actividad nucleasa 5'\rightarrow 3'" o la "actividad nucleasa 5' a 3" se refiere a que la actividad de una polimerasa de ácido nucleico específico de un molde que incluye o bien una actividad exonucleasa 5'\rightarrow 3' tradicionalmente asociada con algunas ADN polimerasas, mediante lo cual los nucleótidos se eliminar a partir del extremo 5' de un oligonucleótido de una manera secuencial (Le., la ADN polimerasa I de E. coli tiene esta actividad, mientras que el fragmento Klenow no la tiene), o bien incluye una actividad endonucleasa 5'\rightarrow 3' en donde la escisión tiene lugar en más de una unión fosfodiéster (nucleótido) a partir del extremo 5', o en ambos.
El término "adyacente" como se emplea en la presente, se refiere a la posición del cebados respecto a la sonda sobre su cadena complementaria del ácido nucleico molde. El cebador y la sonda pueden tener por separado de 1 a aproximadamente 20 nucleótidos, con mayor preferencia aproximadamente de 1 a 10 nucleótidos, o pueden ser contiguos entre sí, como puede ser deseable para la detección con un procedimiento independiente de la polimerización. Alternativamente, para emplear en el procedimiento dependiente de la polimerización, como cuando el presente método se emplea en la amplificación por PCR y métodos de detección como se han descrito en la presente, la "adyacencia" puede ser en cualquier parte dentro de la secuencia que se va a amplificar, en cualquier parte en dirección aguas abajo de un cebador
tal que la extensión del cebador posicionará la polimerasa de forma que tenga lugar la escisión de la sonda.
Como se emplea en la presente, el término "ácido nucleico polimerasa termoestable", se refiere a una enzima que es relativamente estable al calor cuando se compara por ejemplo con los nucleósido polimerasa de E. coli y que catalizan la polimerización de los nucleósidos trifosfatos. Generalmente la enzima iniciará la síntesis en el extremo 3' del cebador asociado a la secuencia diana y continuará en la dirección 5' a lo largo del molde, y si posee una actividad nucleasa 5' a 3' al intervenir en la hidrólisis, la sonda asociada liberará tanto los fragmentos de sonda marcados como los sin marcar, hasta que la síntesis termine. Una enzima termoestable representativa aislada del Thermus aquaticus (Taq) se describe en la patente U.S. nº 4.889.818 y un método para emplearlo en la PCR convencional se describe en Saiki y col., 1988, Science 239:487.
La Taq ADN polimerasa tiene una actividad exonucleasa de reposición 5'-3' de la cadena, dependiente de la síntesis del ADN (ver Gelfand, "Taq DNA Polymerase" en PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification ("Tecnología dela PCR: Fundamentos y aplicaciones de la amplificación de ADN") Ehrlich, Ed., Stokton Press, N.Y. (1989), capítulo 2). En solución, hay una pequeña degradación, si es que hay alguna, de los oligonucleótidos marcados.
La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y técnicas de ADN recombinante que están dentro del dominio de la especialidad. Dichas técnicas están plenamente descritas en la literatura. Ver p. ej., Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning. A Laboratory Manual ("Clonación molecular. Un manual de laboratorio"), segunda edición (1989); Oligonucleotide Synthesis ("Síntesis de oligonucleótidos") (M.J. Gait, ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization ("Hibridación de ácidos nucleicos") (B.D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning ("Una guía práctica para la clonación molecular") (B. Perbal, 1984); y una serie Methods in Enzymology ("Métodos de enzimología") (Academic Press, Inc). Todas las patentes, solicitudes de patentes y publicaciones mencionadas en la presente tanto anterior como posteriormente, se incorporan a la presente como referencia.
Los varios aspectos de la invención se basan en una propiedad especial de las ácido nucleico polimerasas. Las ácido nucleico polimerasas pueden poseer varias actividades, entre ellas, una actividad nucleasa 5' a 3' en donde la ácido nucleico polimerasa puede escindir mononucleótidos o pequeños oligonucleótidos de un oligonucleótido asociado a su polinucleótido más largo, complementario. Con el fin de que la escisión tenga lugar eficientemente, un oligonucleótido en dirección aguas arriba debe estar también asociado al mismo polinucleótido más largo.
El extremo 3' de este oligonucleótido en dirección aguas arriba proporciona el sitio de unión inicial para la ácido nucleico polimerasa. Tan pronto como la polimerasa unida encuentra el extremo 5' del oligonucleótido en dirección aguas abajo, la polimerasa puede escindir los mononucleótidos o pequeños oligonucleótidos del mismo.
Los dos oligonucleótidos pueden designarse de manera que se asocien próximos al ácido nucleico diana complementario de forma que la unión de la ácido nucleico polimerasa al extremo 3' del oligonucleótido en dirección aguas arriba se pone automáticamente en contacto con el extremo 5' del oligonucleótido en dirección aguas abajo. Este procedimiento, debido a que no es necesaria la polimerización para llevar la ácido nucleico polimerasa en posición para que tenga lugar la escisión recibe el nombre de "escisión independiente de la polimerización".
Alternativamente, si los dos oligonucleótidos asocian en regiones situadas a mayor distancia del ácido nucleico molde diana, la polimerización debe tener lugar antes de que el ácido nucleico polimerasa encuentre el extremo 5' del oligonucleótido en dirección aguas abajo. Como la polimerización continua, la polimerasa escinde progresiva-mente mononucleótidos o pequeños oligonucleótidos del extremo 5' del oligonucleótido en dirección aguas abajo. Esta escisión continúa hasta que el oligonucleótido en dirección aguas abajo restante, ha sido desestabilizado en una extensión tal que se disocia de la molécula del molde. Este procedimiento recibe el nombre de "escisión dependiente de la polimerización".
En la presente invención, una marca se une al oligonucleótido en dirección aguas abajo. De esta forma, los mononucleótidos escindidos o los pequeños oligonucleótidos escindidos por la actividad 5'-3' nucleasa de la polimerasa pueden ser detectados.
A continuación, puede emplearse una cualquiera de las varias estrategias posibles para distinguir los oligonucleótidos marcados que no se ha escindido, de los fragmentos escindidos de los mismos. De esta manera, la presente invención permite la identificación de aquellas muestras de ácidos nucleicos que contienen secuencias complementarias a los oligonucleótidos en dirección aguas arriba y en dirección aguas abajo.
La presente invención aprovecha la actividad 5' a 3' nucleasa de la polimerasa cuando se usa juntamente con la PCR. Esto difiere de la amplificación por PCR previamente descrita, en donde se detectan los oligonucleótidos diana amplificados, después de la PCR, por ejemplo mediante hibridación con una sonda que forma un dúplex estable con el de la secuencia diana en condiciones restrictivas a moderadamente restrictivas de hibridación y lavado. En contraste con los métodos conocidos de detección empleados a continuación de las amplificaciones PCR, la presente invención permite la detección de una secuencia de ácido nucleico diana durante la amplificación de este ácido nucleico diana. En la presente invención, se añade simultáneamente un oligonucleótido marcado, con el cebador al principio de la PCR, y la señal generada a partir de la hidrólisis del (de los) nucleótido(s) marcado(s) de la sonda, proporciona un medio para la detección de la secuencia diana durante su amplificación.
Los oligonucleótidos de la presente invención son compatibles sin embargo, con otros sistemas de amplificación tales como el sistema de amplificación de la transcripción, en el cual uno de los cebadores de la PCR codifica un promotor que se emplea para hacer copias del ARN de la secuencia diana. De manera similar, la presente invención puede emplearse en un sistema auto-sustanciado de replicación de la secuencia (3SR), en el cual se emplean una gran variedad de enzimas para hacer transcriptos de ARN que se emplean a continuación para hacer copias de ADN, todas ellas a una única temperatura. Mediante la incorporación de una polimerasa con actividad 5' \rightarrow 3' exonucleasa en un sistema de reacción en cadena de la ligasa (LCR), juntamente con oligonucleótidos apropiados, se puede emplear también la presente invención para detectar productos de la LCR.
Por supuesto, los oligonucleótidos de la presente invención pueden aplicarse a sistemas que no implican una amplificación. De hecho, los oligonucleótidos de la presente invención no necesitan siquiera que tenga lugar la polimerización. Una ventaja del proceso independiente de la polimerización reside en la eliminación de la necesidad de una amplificación de la secuencia diana. En ausencia de la extensión del cebador, el ácido nucleico diana es sustancialmente monocatenario. A continuación de que el cebador y el oligonucleótido marcado se unan adyacentes al ácido nucleico diana, pueden tener lugar etapas secuenciales de asociación de oligonucleótidos y escisión de fragmentos marcados. De esta forma puede generarse, una cantidad suficiente de fragmentos marcados, haciendo posible la detección en ausencia de polimerización. Como apreciarán los expertos en la técnica, la señal generada durante la amplificación PCR podría ser aumentada mediante esta actividad independiente de la polimerización.
En cualquiera de los procesos que aquí se describen, se proporciona una muestra de la cual se sospecha que contiene la particular secuencia de oligonucleótidos de interés, el "ácido nucleico diana". El ácido nucleico diana contenido en la muestra puede ser en primer lugar inversamente trascrito en ADNc, si es necesario, y a continuación se desnaturaliza, empleando cualquier método adecuado de desnaturalización incluyendo medios físicos, químicos o enzimáticos, los cuales son ya conocidos por los expertos en la técnica. Un medio físico preferido para la separación de las cadenas consiste en el calentamiento del ácido nucleico hasta que está completamente (> 99%) desnaturalizado. Una desnaturalización térmica típica implica temperaturas que oscilan desde aproximadamente 80ºC hasta aproximadamente 105ºC, durante tiempos que oscilan desde unos pocos segundos hasta minutos. Como una alternativa a la desnaturalización, el ácido nucleico diana puede estar en forma monocatenaria en la muestra, como ocurre por ejemplo, en los virus de ARN o ADN monocatenario.
Las cadenas de ácido nucleico desnaturalizado, se incuban a continuación con cebadores oligonucleótidos pre-seleccionados y oligonucleótidos marcados (llamados también aquí "sondas") en determinadas condiciones de hibridación, condiciones que permiten la unión de los cebadores y sondas a las cadenas individuales de ácido nucleico. Como ya es conocido en la técnica, los cebadores se seleccionan de forma que las posiciones relativas a lo largo de una secuencia dúplex son tales que un producto de extensión sintetizado a partir de un cebador cuando el producto de la extensión se separa de su molde (complemento), sirve de molde para la extensión de otro cebador para dar una cadena replicada de una longitud definida.
Debido a que las cadenas complementarias son más largas que, o bien la sonda o bien el cebador, las cadenas tienen más puntos de contacto y así tienen una gran probabilidad de encontrarse entre sí durante un determinado período de tiempo. Un elevado exceso molar de la sonda, más el cebador, ayuda a inclinar el equilibrio hacia la asociación del cebador y la sonda más que hacia la reasociación del molde.
El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de productos de extensión en presencia del agente para la polimerización. La longitud exacta de la composición del cebador dependerá de muchos factores, incluyendo la temperatura dela reacción de asociación, fuente y composición del cebador, proximidad del sitio de asociación de la sonda al sitio de asociación del cebador, y ratio de la concentración de la sonda del cebador. Por ejemplo en función de la complejidad de la secuencia diana, el cebador oligonucleótido contiene típicamente aproximadamente 15-30 nucleótidos, aunque un cebador puede contener más o menos nucleótidos. Los cebadores deben ser suficientemente complementarios para asociarse a sus respectivas cadenas selectivamente y formar varios dúplex estables.
Los cebadores empleados aquí se seleccionan de forma que sean "sustancialmente" complementarios a las diferentes cadenas de cada secuencia específica que hay que amplificar. Los cebadores no necesitan reflejar la secuencia exacta del molde, pero deben ser lo suficientemente complementarios para hibridar selectivamente a sus respectivas cadenas. Las bases no complementarias o secuencias más largas pueden ser intercaladas dentro del cebador o pueden localizarse en los extremos del cebador con la condición de que el cebador retenga suficiente complementariedad con una cadena del molde para formar un dúplex estable con él. Las secuencias de nucleótidos no complementarias de los cebadores pueden incluir sitios de enzimas de restricción.
En la práctica de la invención, la sonda de oligonucleótidos marcada debe ser primeramente asociada a un ácido nucleico complementario antes de que la ácido nucleico polimerasa encuentra esta región dúplex, permitiendo con ello que la actividad nucleasa 5' a 3' escinda y libera fragmentos marcados de oligonucleótidos.
Para aumentar la probabilidad de que el oligonucleótido marcado se haya asociado al ácido nucleico complementario antes de que la polimerización de la extensión del cebador alcance esta región dúplex, o antes de que la polimerasa se una al oligonucleótido en dirección aguas arriba en el proceso independiente de la polimerización, pueden emplearse una gran variedad de técnicas. Durante el proceso dependiente de la polimerización se puede posicionar la sonda de forma que el extremo 5' de la sonda esté relativamente lejos del extremo 3' del cebador, con lo que se da más tiempo a la sonda para asociarse antes de que la extensión del cebador bloquee el sitio de unión de la sonda. Cortas moléculas del cebador requieren generalmente temperaturas más bajas para formas complejos de híbridos suficientemente estables con el ácido nucleico diana. Por lo tanto, puede programarse que el oligonucleótido marcado sea más largo que el cebador, de forma que el oligonucleótido marcado se asocie de preferencia a la diana a temperaturas más altas relativamente a la asociación del cebador.
Se pueden también utilizar cebadores y oligonucleótidos marcados que tengan diferentes estabilidades térmicas. Por ejemplo, la composición de nucleótidos del oligonucleótido marcado, puede escogerse de forma que tenga mayor contenido G/C y en consecuencia una mayor estabilidad térmica que el cebador. De manera similar, se pueden incorporar nucleótidos modificados dentro de la sonda, los cuales nucleótidos modificados contienen análogos de bases que forman pares de bases más estables que las bases típicamente presentes en los ácidos nucleicos que se encuentran en la naturaleza.
Las modificaciones de la sonda que pueden facilitar la unión de la sonda antes que la unión del cebador para maximizar la eficiencia del presente ensayo, incluyen la incorporación de uniones fosfodiéster positivamente cargadas o neutras en la sonda para disminuir la repulsión de las estructuras de la sonda y la diana (ver Letsinger y col., 1988, J. Amer. Chem. Soc., 110: 4470); la incorporación de bases alquiladas o halogenadas, tales como la 5-bromouridina, en la sonda para incrementar la acumulación de bases; la incorporación de ribonucleótidos dentro de la sonda para forzar el dúplex sonda:diana dentro de una estructura "A" la cual ha incrementado la acumulación de bases; y la sustitución de la 2,6-diaminopurina (aminiadenosina) en alguna o todas las adenosinas de la sonda. Al preparar dichas sondas modificadas de la invención, debe reconocerse que el paso que limita la velocidad de la formación del dúplex es la "nucleación", es decir, la formación de un solo para de bases y por lo tanto, la alteración de las características biofísicas de una porción de la sonda, por ejemplo, solamente de la porción terminal 3' o 5', puede ser suficiente para lograr el resultado deseado. Además, debido a que la porción terminal 3' de la sonda (terminal 3, de 8 a 12 nucleótidos) se disocia después de la degradación de la exonucleasa del término 5' mediante la polimerasa, pueden hacerse modificaciones del término 3', prescindiendo de la interferencia con la actividad polimerasa/nucleasa.
Los parámetros del termociclado pueden también variar para aprovechar la estabilidad del diferencial térmico del oligonucleótido marcado y el cebador. Por ejemplo, después del paso de desnaturalización en el termociclado, puede introducirse una temperatura intermedia que permite la unión del oligonucleótido marcado pero no la unión del cebador, y a continuación la temperatura se reduce para permitir la asociación y extensión del cebador. Debe hacerse notar, sin embargo, que la escisión de la sonda necesita solamente realizarse en los últimos ciclos del proceso de la PCR para obtener resultados adecuados. Así, se podría ajustar la mezcla de reacción de forma que aunque los cebadores se unen inicialmente de preferencia a las sondas, se reduce la concentración del cebador a través de la extensión del cebador, de forma que en los últimos ciclos, las sondas se unen de preferencia a los cebadores.
Para favorecer la unión del oligonucleótido marcado antes que el cebador, puede también emplearse un elevado exceso molar del oligonucleótido arcado a la concentración del cebador. En esta versión, las concentraciones del oligonucleótido marcado están típicamente en el margen de aproximadamente 2 a 20 veces mayores que la concentración del cebador respectivo, la cual es generalmente 0,5 - 5 x 10^{-7} M. Los expertos reconocen que la concentración de oligonucleótidos, su longitud, y la composición de las bases son cada uno de ellos, factores importantes que afectan el T_{m} de cualquier oligonucleótido en particular en una mezcla de reacción. Cada uno de estos factores puede ser manipulado para crear una propensión termodinámica para favorecer la asociación de la sonda antes que la asociación del cebador.
Los cebadores oligonucleótidos y los oligonucleótidos marcados pueden prepararse mediante cualquier método apropiado. Los métodos para la preparación de oligonucleótidos de secuencias específicas ya son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, la clonación y la restricción de secuencias apropiadas y síntesis químicas directas. Los métodos de síntesis químicas pueden incluir por ejemplo, el método del fosfotriéster descrito por Narang y col., 1979, Methods in Enzymology ("Métodos de Enzimología"), 68: 90, el método del fosfotriéster descrito por Brown y col. 1979, Methods in Enzymology ("Métodos de Enzimología") 68: 109, el método del fosforamidato de dietilo descrito en Beaucage y col., 1981, Tetrahedron Letters 22: 1859, y el método del soporte sólido descrito en la patente U.S. nº 4.458.066.
La composición del oligonucleótido marcado puede diseñarse para favorecer la actividad de la nucleasa sobre el desplazamiento de la cadena (fragmentos de mono y dinucleótido sobre oligonucleótido) por medio de seleccionar las secuencias que son ricas en GC o que evitan los A's y T's secuenciales, y mediante la selección de la posición de la marca en la sonda. En presencia de secuencias ricas en AT en la región de la sonda complementaria de 5', tiene lugar la escisión después de aproximadamente el cuarto, quinto o sexto nucleótido. Sin embargo, en una región rica en GC de la sonda complementaria de 5', la escisión tiene lugar generalmente después del primer o segundo nucleótido. Alternativamente la incorporación de las uniones fosfodiéster modificadas (p. ej., fosforotioatos o metilfosfonatos) en la sonda marcada durante la síntesis química (Noble y col., 1984, Nuc. Acids Res 12:3387-3403: Iyer y col., 1990, J. Am. Chem. Soc., 112: 1253-1254) puede emplearse para prevenir la escisión en un sitio seleccionado. En función de la longitud de la sonda, la composición de la región complementaria en 5' de la sonda, y la posición de la marca, se puede diseñar una sonda para favorecer preferentemente la generación de fragmentos cortos o largos de la sonda marcados, para emplear en la práctica de la invención.
El oligonucleótido se marca como se describe más adelante mediante la incorporación de grupos detectables con medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. El método de unir o conjugar la marca a una sonda de oligonucleótidos depende, por supuesto, del tipo de marca(s) empleada(s) y la posición de la marca sobre la sonda.
Una gran variedad de marcas que podrían ser apropiadas para emplear en la invención, así como también métodos para su inclusión en la sonda, e incluyen, pero no están limitados a, las enzimas (p. ej., fosfatasa alcalina y peroxidasa de rábano silvestre) y sustratos de enzimas, átomos radioactivos, colorantes fluorescentes, cromóferos, marcas quimioluminiscentes, marcas electroquimioluminiscentes, tales como Origen^{TM} (Igen), ligandos con socios específicos de unión, o cualesquiera otras marcas que pueden interactuar entre sí para aumentar, alterar o disminuir una señal. Por supuesto, la PCR debe practicarse empleando un instrumento ciclador térmico, y la marca debe ser capaz de resistir la temperatura de ciclado requerida en este proceso automatizado.
Entre los átomos reactivos el preferido es el ^{32}P. Los métodos para la introducción del ^{32}P en los ácidos nucleicos son ya conocidos en la técnica, e incluyen por ejemplo, el marcado en 5', con una quinasa, o una inserción al azar mediante el método de "nick translation" ("desplazamiento de la mella"). Las enzimas son típicamente detectadas por su actividad. "Socio específico de unión" se refiere a una proteína capaz de unirse a una molécula ligando con una alta especificidad como por ejemplo, el caso de un antígeno y un anticuerpo monoclonal específico para dicho antígeno. Otros socios de unión específica incluyen la biotina y la avidina o estreptavidina, IgG y la proteína A, y los numerosos pares receptor-ligando conocidos en la técnica. La descripción anterior no se menciona para categorizar las varias marcas en distintas clases, puesto que la misma marca puede servir en varias modalidades diferentes. Por ejemplo el ^{125}I puede servir como una marca radioactiva o como un reactivo denso en electrones. La HRP puede servir como enzima o como antígeno para un anticuerpo monoclonal. Además se pueden combinar varias marcas para lograr el efecto deseado. Por ejemplo se podría marcar una sonda con biotina, y detectar la presencia de una sonda con avidina marcada con ^{125}I, o con un anticuerpo monoclonal anti-biotina marcado con HRP. Otras permutaciones y posibilidades serán fácilmente evidentes a aquellos normalmente expertos en la técnica, y se consideran como equivalentes dentro del ámbito de la presente invención.
Los fluoróforos para emplear como marcas en la construcción de sondas marcadas de la invención, incluyen la rodamina y derivados como el rojo Texas, fluoresceína y derivados tales como la 5-bromometilfluoresceína, el amarillo Lucifer, IAEDANS, 7-Me_{2}N-cumarin-4-acetato, 7-OH-4-CH_{3}-cumarin-3-acetato, 7-NH_{2}-4-CH_{3}-cumarin-3-acetato (AMCA), monobromobimano, trisulfonatos de pireno tales como el azul Cascada y monobromotrimetil-amoniobimano. En general se prefieren los fluoróforos con una amplia variación de stokes, para permitir el uso de fluorímetros con filtros más bien que usar un monocromómetro, y para aumentar la eficiencia de la detección.
Las marcas son dos marcas interactivas sobre un único oligonucleótido con la debida consideración dada para el mantenimiento de una distancia apropiada de las marcas sobre el oligonucleótido para permitir la separación de las marcas durante la hidrólisis del oligonucleótido. La rodamina y el violeta cristal son las marcas interactivas
preferidas.
En otra versión, la detección de la sonda marcada hidrolizada puede lograrse empleando por ejemplo, la polarización por fluorescencia, una técnica para diferenciar entre grandes y pequeñas moléculas basadas en el movimiento molecular. Grandes moléculas (p. ej., sondas marcadas intactas) se mueven en solución mucho más lentamente que las moléculas pequeñas. Después de la unión de un grupo fluorescente a la molécula de interés (p. ej., el extremo 5', de una muestra marcada), este grupo fluorescente puede medirse (y diferenciarse) en base al movimiento molecular, diferenciándose así entre sonda intacta y digerida. La detección puede medirse directamente durante la PCR o puede efectuarse después de la PCR.
Todavía en otra versión, se emplean los oligo-nucleótidos marcados cada uno complementariamente a separar regiones de cadenas separadas de una región diana de doble cadena, pero no entre sí, de forma que un oligonucleótido se asocia en dirección aguas abajo, de cada cebador. Por ejemplo, la presencia de dos sondas puede potencialmente doblar la intensidad de la señal generada por una marca única y puede además servir para reducir la asociación de una cadena del producto, como sucede a menudo durante la amplificación por PCR. Las sondas se seleccionan de forma que las sondas se unan en posiciones adyacentes (en dirección aguas abajo) a las posiciones en las cuales se unen los cebadores.
Se pueden también emplear sondas múltiples para lograr otras ventajas. Por ejemplo, se podría ensayar un número cualquiera de patógenos de una muestra simple poniendo tantas sondas como se deseen en la mezcla de reacción, las sondas podrían contener cada una de ellas, una marca diferente para facilitar la detección.
Se puede también lograr una discriminación alelo-específica o especies-específica (p. ej., específica para las diferentes especies de Borrelia, el agente causante de la enfermedad de Lyme), empleando múltiples sondas por ejemplo, empleando sondas que tienen diferentes T_{m}s y efectuando la reacción asociación/escisión a una temperatura específica para solamente un dúplex sonda/alelo. Por ejemplo, se puede escoger un par de cebadores que amplifican tanto el HTLVI y el HTLVOO y emplear dos sondas cada una de ellas marcada inequívocamente y específicamente, o bien para HTLVI o bien para HTLVII. Se puede también lograr una discriminación específica de los alelos empleando solamente una sonda única y examinando los tipos de productos de escisión generados. En esta versión, la sonda se diseña para que sea exactamente complementaria por lo menos en la región terminal 5', para un alelo pero no para el(los) otro(s)
alelo(s). Con respecto al(a los) otro(s) alelo(s), la sonda se emparejará mal en la región terminal 5' de la sonda de forma que se generará un producto de escisión diferente si se le compara con el producto de escisión generado cuando la sonda se hibrida al alelo exactamente complementario.
Aunque la secuencia de la sonda puede seleccionarse para lograr importantes ventajas, pueden obtenerse también importantes ventajas seleccionando la(s) marca(s) de la sonda. Las marcas pueden estar unidas al oligonucleótido directa o indirectamente mediante una gran variedad de técnicas. En función del tipo preciso de marca empleada, la marca puede estar localizada en el extremo 5' o 3' de la sonda, puede estar situada internamente en la sonda o puede estar unida a los brazos espaciadores de varios tamaños y composiciones para facilitar las interacciones de las señales. Empleando los reactivos de fosforamidita comercial-mente adquiribles, se pueden obtener oligómeros que contienen grupos funcionales (p. ej., tioles o aminas primarias) en el término 5' o en el término 3' mediante una fosforamidita adecuadamente protegida, y se pueden marcar empleando protocolos descritos en por ejemplo, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications ("Protocolos de PCR: una guía para métodos y aplicaciones") (Innis y col., eds. Academic Press, Inc., 1990).
Métodos para la introducción de reactivos funcionalizando oligonucleótidos para introducir uno o más grupos sulfhidrilo, amino o hidroxilo, dentro de la secuencia de la sonda de oligonucleótidos, típicamente en el terminal 5', están descritos en la patente U.S. nº 4.914.210. Un grupo fosfato 5' puede ser introducido como un radioisótopo empleando una polinucleótido quinasa y gamma-^{32}P-ATP para proporcionar un grupo informador. Puede añadirse biotina al extremo 5' haciendo reaccionar un radical aminotimidina o un radical 6-amino hexilo, introducirla durante la síntesis con un éster N-hidroxi-succinimida de biotina. Marcas en el terminal 3' pueden emplear polinucleótido terminal transferasa para añadir el grupo deseado tal como por ejemplo, cordicepina ^{35}S-dATP y dUTP biotinilada.
Los derivados de oligonucleótidos son también marcas adquiribles. Por ejemplo, el eteno-dA y eteno-A son conocidos adenina nucleótidos fluorescentes que pueden ser incorporados dentro de una sonda de oligonucleótidos. Similarmente el eteno-dC o el 2-aminopurina desoxirribósido es otro análogo que podría emplearse en la síntesis de la sonda. Las sondas que contienen tales derivados de nucleótidos pueden ser hidrolizados para liberar mononucleótidos mucho más fuertemente fluorescentes mediante la actividad 5' a 3' nucleasa a medida que la ADN polimerasa ocasiona la extensión de un cebador durante la PCR.
La extensión dependiente del molde, del (de los) cebador(es) oligonucleótido(s) se cataliza mediante un agente de polimerización en presencia de cantidades adecuadas de los cuatro desoxirribonucleósido trifosfatos (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) o análogos como se ha descrito más arriba, en un medio de reacción que comprende sales apropiadas, cationes metálicos y un sistema tampón para el pH. Agentes de polimerización adecuados son enzimas conocidas por catalizar la síntesis del ADN dependiente del cebador y del molde, y posee actividad 5' a 3' nucleasa. ADN polimerasas conocidas incluyendo por ejemplo, la ADN polimerasa I de E. coli, la ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth), la ADN polimerasa de Bacillus stearothermophilus, la ADN polimerasa de Termococcus litoralis, y la ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq). Las condiciones de reacción para catalizar la síntesis del ADN con estas ADN polimerasas con ya bien conocidas en la técnica. Para ser de utilidad en la presente invención, el agente de polimerización debe escindir eficientemente el oligonucleótido y liberar fragmentos marcados de forma que la señal sea directamente o indirectamente generada.
Los productos de la síntesis son moléculas dúplex que constan de las cadenas del molde y las cadenas de extensión del cebador, las cuales incluyen la secuencia diana. Productos secundarios de esta síntesis son fragmentos de oligonucleótidos marcados que constan de una mezcla de mono, di y mayores fragmentos de nucleótido. Ciclos repetidos de desnaturalización, oligonucleótidos marcados y asociación del cebador y extensión del cebador y escisión del oligonucleótido marcado, dan como resultado la acumulación exponencial de la región diana definida por los cebadores y la generación exponencial de fragmentos marcados. Se efectúan suficientes ciclos para lograr una especie detectable de marca, la cual puede ser varios órdenes de magnitud mayor que la señal original, aunque en la práctica ordinaria dichos altos ratios entre la señal y el ruido pueden no lograrse o pueden no ser deseados.
En un método preferido, el proceso PCR se efectúa como un proceso automatizado que utiliza una enzima termostable. En este proceso la mezcla de reacción se cicla a través de un paso de desnaturalización, un paso de asociación de la sonda y el cebador, y un paso de síntesis con lo cual la escisión y el desplazamiento tienen lugar simultáneamente con la extensión del molde dependiente del cebador. Puede emplearse un ciclador térmico de ADN, tal como la máquina comercialmente adquirible de Perkin Elmer Cetus Instruments, la cual está específicamente diseñada para emplear con una enzima termoestable.
Las polimerasas estables a la temperatura son las preferidas en este proceso automatizado debido a que la vía preferida de desnaturalización de los productos de extensión con cadena doble, es por exposición de los mismos a alta temperatura (aproximadamente 95ºC) durante el ciclo de la PCR. Por ejemplo la patente U.S. nº 4.889.818 describe una enzima termoestable representativa aislada de Thermus aquaticus. Polimerasas representativas adicionales, estables a la temperatura, incluyen p. ej., las polimerasas extraídas de la bacteria termoestable Thermus flavus, Thermus ruber, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus (la cual tiene una temperatura óptima algo más bajo que las otras de la lista), Thermus lacteus, Thermus rubens, Thermotoga marítima, Thermococcus litoralis y Methanothermus fervidus.
La detección o verificación de los fragmentos de oligonucleótido marcados, puede lograrse mediante una gran variedad de métodos y pueden depender de la fuente de la marca o de las marcas empleadas. Una versión conveniente consiste en someter los productos de la reacción, incluyendo los fragmentos marcados escindidos, a un análisis de tamaños. Los métodos para determinar el tamaño de los fragmentos de ácido nucleico marcados son ya conocidos en la técnica e incluyen por ejemplo, la electroforesis sobre gel, sedimentación en gradientes, cromatografía del gel exclusión y homocromatografía.
Durante o después de la amplificación, puede lograrse la separación de los fragmentos marcados de la mezcla de PCR, por ejemplo, poniendo en contacto la mezcla de PCR con una fase sólida extractante (SPE). Por ejemplo, los materiales que tienen una capacidad para unirse a oligonucleótidos sobre la base del tamaño, carga o interacción con las bases de los oligonucleótidos pueden añadirse a la mezcla de PCR, en ciertas condiciones en las que los oligonucleótidos marcados sin escindir, se unen y los fragmentos cortos marcados, no se unen. Estos materiales SPE incluyen las resinas o perlas de intercambio iónico tales como las partículas de unión Nensorb comercialmente adquiribles (DuPont Chemical Co), Nucleogen (The Nest Group), PEI, BakerBond^{TM} PEI, Amicon PAE 1.000, Selectacel^{TM} PEI, Boronate SPE con una sonda 3'-ribosa, secuencias que contienen SPE complementarias al extremo 3' de la sonda, e hidroxiapatita. En una versión específica, si un oligonucleótido marcado doble que comprende una marca 3' biotina separada de una marca 5' por una nucleasa susceptible de un sitio de escisión, se emplea como medio señalizador, la mezcla amplificada de la PCR puede ponerse en contacto con materiales que contengan un socio de unión específico tal como la avidina o la estreptavidina, o un anticuerpo o un anticuerpo monoclonal para la biotina. Estos materiales pueden incluir perlas y partículas recubiertas con socios específicos de unión y pueden incluir también, partículas magnéticas.
Después del paso en el cual la mezcla de PCR ha sido puesta en contacto con una SPE, el material de la SPE puede eliminarse por filtración, sedimentación o atracción magnética, dejando los fragmentos marcados libres de oligonucleótidos marcados sin escindir, y disponibles para la detección.
Los reactivos empleados en los métodos descritos pueden envasarse y constituir kits de diagnóstico. Los kits de diagnóstico incluyen los oligonucleótidos marcados y los cebadores en envases separados. Si el oligonucleótido está sin marcar, los reactivos específicos del marcado deben estar también incluidos en el kit. El kit puede contener también otros reactivos adecuados envasados y materiales necesarios para la amplificación, por ejemplo, tampones, dNTPs, y/o medios para la polimerización y para la detección, análisis, por ejemplo, enzimas y extractantes de fase sólida, así como también instrucciones para efectuar el ensayo.
Los ejemplos que se exponen a continuación pretenden ser ilustrativos de los diferentes métodos y compuestos de la invención.
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Ejemplo 1 Liberación de la marca de la sonda de la PCR
Se efectuó una amplificación PCR la cual liberó el extremo 5' marcado con ^{32}P de una sonda complementaria cuando se sintetizó el producto específico deseado.
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A. Marcado de la sonda con gamma-^{32}P-ATP y polinucleótido quinasa
Diez pmoles de cada sonda (secuencias BW31, BW33, BW35, descritas más adelante) se mezclaron individualmente con quince unidades de T4 polinucleótido quinasa (New England Biolabs) y 15,3 pmoles de gamma-^{32}P-ATP (New England Nuclear, 3000 Ci(moles) en un volumen de reacción de 50 \mul que contenía 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM de MgCl_{2}, 5 mM de ditiotreitol, 0,1 mM de espermidina y 0,1 mM de EDTA durante 60 minutos a 37ºC. El volumen total se extrajo a continuación con fenol/cloroformo, se precipitó con etanol como describe Sambrook y col., Molecular Cloning ("Clonado molecular") segunda edición (1989). Se resuspendieron sondas en 100 \mul de tampón TE y se pasaron por una columna de diálisis centrífuga Sephadex G-50 para eliminar los gamma-^{32}^-ATP como describe Sambrook y col., ver más arriba. La precipitación con TCA de los productos de reacción indicó las siguientes actividades específicas:
BW31: 1,98 x 10^{6} cpm/pmoles
BW31: 2,54 x 10^{6} cpm/pmoles
Bw35: 1,77 x 10^{6} cpm/pmoles
La concentración final de las tres sondas fue de 0,10 pmoles/\mul.
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B. Amplificación
La región amplificada fue un producto de 350 pares de bases del bacteriófago M13mp10w inducida por los cebadores BW36 y BW42. La región de cada secuencia del cebador numerada designado aquí, sigue la costumbre de la secuencia de nucleótidos M13 estándar.
1
Se emplearon tres diferentes sondas: cada una contenía la secuencia de 30 b ases exactamente complementaria al M13mp10w pero diferentes en las longitudes de las regiones con la cola 5' no complementarias. Las sondas fueron sintetizadas de forma que tuvieran un 3'-PO_{4} en lugar de un 3'-OH para bloquear cualquier extensión por la Taq-polimerasa.
2
Para la amplificación del fragmento de 350 bp, se añadieron 10^{-3} pmoles de la secuencia diana M13mp10w a 50 \mul de un volumen de reacción que contenía 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl, pH 8,3, 3 mM de MgCl_{2}, 10 pmoles de cada uno de los cebadores BW36 y BW42, 200 \muM de cada uno de los cuatro desoxirribonucleósido trifosfatos, 1,25 unidades de Taq ADN polimerasa y o bien 1, 10 ó 20 pmoles de las sondas BW31, BW33 o BW35 isotópicamente diluidas. La cantidad de sonda radiomarcada se mantuvo constante a 0,4 pmoles por reacción y diluida a 1, 10 ó 20 pmoles con sonda no radioactiva. Se añadió Taq-polimerasa a 4 \mul por reacción a 0,3125 U/\mul y se diluyó en 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM de KCl, 0,1 mM de EDTA, 0,5% de NP40, 0,5% de Tween 20 y 500 \mug/ml de gelatina.
Se preparó una mezcla de reacción, de stock, que contenía cantidades apropiadas de tampón de reacción, nucleósido trifosfatos, tanto cebadores como enzimas. A partir de esta mezcla de stock se tomaron alícuotas y se añadieron a las mismas, el molde y varias concentraciones de cada sonda. Las reacciones de control consistieron en la adición de todos los componentes de la reacción excepto el molde, y todos los componentes de la reacción excepto la sonda. Cada mezcla de reacción se cubrió con 50 \mul de aceite mineral para impedir la evaporación, se microcentrifugó durante 45 segundos, y a continuación se introdujo en un ciclador térmico. Las mezclas de reacción se sometieron al siguiente esquema de amplificación.
3
Después de la ciclación, se extrajo el aceite mineral con 50 \mul de cloroformo, se guardaron las mezclas a 4ºC y se efectuaron los siguientes ensayos:
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C. Análisis
Para el análisis de gel de acrilamida, se mezclaron 4 \mul de cada reacción de amplificación, con 3 \mul de mezcla con la carga de gel 5X (0,125% de azul de bromofenol, 12,5% de Ficoll 400 en H_{2}O) y se aplicaron sobre un gel de acrilamida al 4% (10 ml de 10X tampón TBE, 1 ml de persulfato de amonio al 10%, 10 ml de bis acrilamida al 40%, 19:1, 50 \mul de TEMED, y 79 ml de H_{2}O) en 1X tampón TBE (0,089 M de Tris, 0,089 M de ácido bórico y 2 mM de EDTA) y se efectuó una electroforesis durante 90 minutos a 200 voltios. Después de pulverizar con bromuro de etidio, se visualizó el ADN mediante UV fluorescente.
Los resultados mostraron que la presencia de cada una de estas tres sondas a las diferentes concentraciones no tenía ningún efecto sobre la cantidad de producto amplificado generado. Las calles de la muestra que no contenían ninguna sonda mostraron una intensidad alta discreta de bandas de 350 pares de bases correspondientes a la secuencia deseada. Todas las calles que contenían una sonda mostraron la misma así como unas bandas un poco débiles en un peso molecular ligeramente alto. Las calles de control sin el molde añadido, no mostraron ninguna banda en absoluto a 350 bases, solamente bandas de más baja intensidad representando el cebador a 30-40 bases.
Después de fotografiar el gel se transfirió sobre papel Whatman, se cubrió con Saran Wrap y se autorradiografió. Una exposición durante la noche reveló que el 90-95% del radiomarcado estaba cerca del fondo del gel, donde la sonda o la sonda parcialmente degradada habría actuado.
Para el análisis del gel de desnaturalización, se mezclaron 2 \mul de cada reacción de amplificación con 2 \mul del tampón con adición de formamida (0,2 ml de 0,5 M de EDTA pH 8, 10 mg de azul de bromofenol, 10 mg de xileno cianol y 10 ml de formamida), a continuación se calentó a 96ºC durante 3-5 minutos y se colocó sobre hielo. Las muestras se aplicaron a un gradiente de gel de poliacrilamida desnatura-lizante al 6,2% (7M de urea tanto con un gradiente de sucrosa como un gradiente de tampón) de acuerdo con el procedimiento de Sambrook y col., ver más arriba. El gel se sometió a una electroforesis durante 90 minutos a 2000 V, 45 W, a continuación se transfirió sobre un papel Whatman y se autorradiografió.
Los resultados del gel de desnaturalización indicaron que aproximadamente el 50% de cada sonda se degradó en fragmentos marcados más pequeños. Aproximadamente el 50%-60% de los recuentos cayó dentro del margen de 30-40 bases, correspondientes a la sonda degradada.
Puede visualizarse una banda muy débil de 300 bases para todas las reacciones de amplificación, lo cual sugiere que un muy pequeño porcentaje de las sondas han perdido o no han tenido nunca un grupo 3'-PO y han sido extendidas. El resto de los recuentos están en el margen de cero a quince bases. La resolución de dicho gel no revela el tamaño exacto de los productos, los cuales pueden determinarse mejor mediante el análisis homocromatográfico.
Para un análisis homocromatográfico, se aplicó 1 \mul de cada muestra con separaciones de 1,2 cm, sobre una placa de capa fina de celulosa Polygram CEL 300 DEAE 20 x 20 cm, a la cual había sido aplicada previamente 5 \mul de ADN de esperma de arenque cortada (150 \mug/ml) y se dejó secar. Una vez la muestra estuvo seca, la placa se colocó en una artesa con H_{2}O y se dejó migrar el agua justo encima del área de carga de la muestra. A continuación se colocó la placa en un depósito de vidrio de desarrollo que contenía Homo-mix III filtrado (Jay y col., 1979, Nuc. Acid res 1(3):331-353), una solución de ARN parcialmente hidrolizado que contenía 7 M de urea, en un horno a 70ºC. La Homo-Mix se dejó migrar por acción capilar hasta la parte superior de la placa en cuyo momento se retiró la placa, dejándola secar cubierta con un Saran Wrap, y a continuación se autorradiografió.
Una exposición durante toda la noche de la placa de homocromatografía indicó también que aproximadamente el 40% de las sondas habían sido degradadas en fragmentos más pequeños. Estos fragmentos fueron muy específicos en tamaño, dependiendo de la longitud de la cola 5' no complementaria de cada sonda. La figura 1 muestra una autorradiografía de la placa TLC. La sonda BW31 (calles 1-3), que fue totalmente complementaria al molde M13mp10w, generó fragmentos marcados predominantemente de una a dos bases de longitud. La sonda BW33 (calles 4-6) conteniendo una región 5' no complementaria de 3 bases, liberó productos predominante-mente de cuatro a seis bases de longitud. La sonda BW35 (calles 7-9) tenía una cola 5' de 10 bases no complementaria y liberó productos predominantemente de 12 a 13 bases de longitud. Las calles 10-12 son las reacciones de control que contenían o bien la BW31, BW33 o BW35 y todos los componentes de la PCR excepto el molde después de 15 ciclos. Durante la síntesis del ADN la enzima desplazó la primera o las dos bases emparejadas encontradas y a continuación cortó en dicho sitio, indicando una actividad similar a una endonucleasa. Los resultados muestran que se libera una sonda específica coordinadamente con la acumulación de producto en la PCR.
Ejemplo 2 Especificidad de la liberación de la marca de la sonda
Se examinó la especificidad de la liberación de sondas marcadas, efectuando una amplificación PCR empleando el ADN del bacteriófago landa y cebadores y una serie de sondas quinasadas no complementarias.
La región a amplificar era una región de 500 nucleótidos del ADN del bacteriófago landa a partir del kit de reactivos para amplificación de ADN, GeneAmp® (Perkin-Elmer Cetus), flanqueado por los cebadores PCR01 y PCR02, también a partir del kit GeneAmp® para ADN.
4
Se emplearon alícuotas de las mismas tres sondas marcadas BW31, BW33 y BW35 identificadas en el ejemplo 1, todas las cuales fueron completamente no complementarias a la secuencia diana.
Para la amplificación de la región de 500 pares de bases, 0,5 ng de la secuencia de ADN landa diana (molde de control, lote #3269, 1 \mug/ml diluido 1:10 en 10 mM de Tris-HCl pH 8,0, 1 mM de EDTA y 10 mM de NaCl para stock) se añadieron a 50 \mul de volumen de reacción que contenía 50 mM de KCl, 10 mM de tris-HCl, pH 8,3, mM de MgCl_{2}, 1 \muM de cada uno de los cebadores PCR01 (lote #3355) y PCR02 (lote #3268), 200 \muM de cada uno de los cuatro desoxinucleósido trifosfatos, 1,25 unidades de Taq ADN polimerasa, y o bien 2, 10 ó 20 pmoles de las sondas BW31, BW33 o BW35 isotópicamente diluidas. La cantidad de sonda radiomarcada se mantuvo constante a 0,4 pmoles por reacción y se diluyó a 1, 10 ó 20 pmoles con sonda no radioactiva. Se añadió Taq ADN polimerasa a 4 \mul por reacción a 0,3125 unidades/\mul y se diluyó en 10 mM de Tris-HCl pH 8,0, 50 mM de KCl, 0,1 mM de EDTA, 0,5% de NP40, 0,5% de Tween 20 y 500 \mug/ml de gelatina.
La mezcla de reacción de stock se preparó como anteriormente junto con las reacciones de control pero sin la sonda o sin la enzima. Las mezclas de reacción se amplificaron siguiendo las condiciones de ciclación descritas en el ejemplo 1B y a continuación se analizó como sigue. Para el análisis en gel de acrilamida, se aplicaron 4 \mul de cada mezcla de reacción de amplificación con 3 \mul de mezcla de carga 5X, sobre un gel de acrilamida al 4% en tampón TBE 1X y se sometió a una electroforesis durante 90 minutos a 200 voltios. Después de pulverizar con bromuro de etidio, el ADN se visualizó mediante fluorescencia UV.
Los resultados muestran que la presencia de cualquier sonda a cualquier concentración no tiene ningún efecto sobre la cantidad de producto amplificado generado. Las calles de control de la muestra que no contenía ninguna sonda, y todas las calles que contenían una sonda, mostraron una banda de discreta alta intensidad de 500 pares de bases correspondientes a la secuencia deseada. Las calles de control sin ninguna enzima añadida no mostraron ninguna banda del producto, mostrando solamente bandas de baja intensidad representando el cebador y la sonda de aproximadamente 30-40 nucleótidos.
El análisis por homocromatografía de la figura 2 muestra una exposición durante toda la noche de la placa en la cual no se ha observado ninguna degradación de las sondas. Todos los contajes se localizaron en el punto de origen no mostrando ninguna liberación de fragmentos marcados. Las calles 1-3 son reacciones que contienen la sonda BW31. Las calles 4-6 incluyen la sonda BW33. Las calles 7-9 incluyen la sonda BW35; y las calles 10-12 son reacciones del control sin el molde. Los resultados muestran que la sonda no es degradada a no ser que esté específicamente unida a la diana y sea capaz de resistir las condiciones del ciclado de la PCR.
En el análisis de desnaturalización sobre gel, se mezclaron 2 \mul de cada reacción de amplificación con 2 \mul de tampón con adición de formamida (descrito en el ejemplo 1) y se colocaron en un bloque calefactor a 96ºC durante 3-5 minutos. Las muestras se colocaron inmediatamente sobre hielo y se aplicaron sobre un gel de acrilamida al 6,2% de un gradiente de desnaturalización, y se sometieron a una electroforesis durante 90 minutos a 2000 voltios. Después de la electroforesis, el gel se transfirió sobre papel Whatman, se cubrió con Sara Wrap y se autorradiografió.
Una exposición durante toda la noche reveló todas las cuentas en el margen de 30-40 pares de bases, correspon-dientes a los tamaños de las sondas. Una vez más, no hubo aparentemente ninguna degradación de la sonda, confirmando además que la sonda debía estar específicamente unida al molde antes de producirse cualquier degradación.
Ejemplo 3 Especificidad de la liberación de la marca de la sonda en presencia de ADN genómico
En este ejemplo, se examinó la especificidad de la liberación de la marca de la sonda, efectuando una amplificación PCR en presencia de ADN genómico humano degradado y sin degradar.
La sonda BW33 quinasada empleada en este experimento tenía una actividad específica de 5,28 x 10^{6} cpm/pmol determinada mediante precipitación TCA después de la reacción de quinasado. La región amplificada fue la región de 350 pares de bases del M13mp10w, flanqueada por los cebadores BW36 y BW42. Las secuencias de los cebadores y su situación están relacionadas en el ejemplo 1. El ADN genómico humano fue obtenido de la línea celular HL60 y se empleó sin degradar o degradado cortando en una prensa francesa a un tamaño medio de 800 pares de bases.
Cada reacción de amplificación de 50 \mul, consistió en 10^{-2} ó 10^{-3} pmoles de M13mp10w de secuencia diana, 1 \mug de ADN genómico de HL60, degradado o bien sin degradar, añadidos a una mezcla que contenía 50 mMM de KCl, 10 mM de Tris HCl pH 8,3, mM de MgCl_{2}, 10pmoles de cada uno de los cebadores BW36 y BW42 \muM de cada uno de los cuatro desoxirribonucleósido trifosfatos, 1,25 unidades de Taq ADN polimerasa y 10 pmoles de la sonda NW33 isotópicamente diluida.
Se preparó una mezcla de stock que contenía cantidades apropiadas de tampón de reacción, nucleósido trifosfatos, cebadores, sonda y enzima. Se prepararon alícuotas y a los mismos se añadió el molde M13mp10w y/o ADN genómico. Las reacciones de control incluían todos los compuestos de reacción excepto el ADN diana de M13mp10w o todos los componentes de reacción excepto el ADN genómico.
Cada mezcla de reacción se cubrió con 50 \mul de aceite mineral, se microcentrifugó y se introdujo en un ciclador térmico. Las mezclas de reacción fueron sometidas al siguiente esquema de amplificación.
5
Después del ciclado, se extrajo el aceite mineral empleando 50 \mul de cloroformo y las muestras se guardaron a 4ºC. Las muestras se analizaron a continuación mediante electroforesis sobre gel de acrilamida al 4%, y un análisis homocromatográfico.
Para el análisis en gel de acrilamida, se mezclaron 4 \mul de cada mezcla de reacción, con 3 \mul de mezcla con el gel 5X, se añadieron sobre un gel de acrilamida al 4% en tampón 1X de TBW, y se sometió a una electroforesis durante 90 minutos a 220 voltios. El ADN se visualizó mediante fluorescencia de UV después de pulverizar con bromuro de etidio.
En las calles correspondientes a las muestras de control que no contenían ningún ADN diana de M13mp10w, no había ninguna banda visible del producto, indicando la ausencia de alguna contaminación cruzada de M13mp10w. Todas las calles siguientes mostraron una banda de 350 bases correspondientes a la secuencia esperada. La intensidad de la banda fue mayor cuando estuvo presente 10^{-2} pmoles de ADN diana de M13mp10w sobre 10^{-3} pmoles en ausencia o presencia de ADN genómico (degradado o sin degradar). La intensidad de la banda del producto aumentó al aumentar el número de ciclos de la amplificación. Veinte ciclos produjeron una banda con dos veces la intensidad de la que se vio con diez ciclos, y quince ciclos generaron una banda de intensidad intermedia. La cantidad de producto PCR presente varió con la cantidad del molde diana de partida y el número de ciclos, y la presencia de 1 \mug de ADN genómico humano, degradado o sin degradar, no mostró ningún efecto en la formación de este producto.
En el análisis por homocromatografía, se aplicó 1 \mul de cada mezcla de reacción sobre una placa de capa fina DEAE, y se colocó en una cámara de desarrollo que contenía Homo-Mix III a 70ºC. Después de 90 minutos, se retiró la placa, se dejó secar, se cubrió con Saran Wrap, y se autorradiografió. Una exposición durante toda la noche se muestra en la figura 3; en la figura 3A, las calles 1 a 6 muestran los ciclos de la reacción PCR en ausencia de ADN del molde M13mp10w conteniendo alternativamente, ADN de HL60 degradado y sin degradar, a 10, 15 y 20 ciclos; y las calles 7-12 son reacciones de control aplicadas por duplicado conteniendo ADN del molde M13mp10w sin ningún ADN genómico a 10, 15 y 20 ciclos. En la figura 3B, se amplifican reacciones aumentando incrementos de 5 ciclos partiendo de 10 ciclos. La concentración de ADN del molde M13mp10w en las reacciones mostradas en las calles 1, 2, 5, 6, 9 y 100 es de 10^{-2} pmoles, mientras en las calles 3, 4, 7, 8, 11 y 12 es de 10^{-3} pmoles. Las reacciones muestran que las calles impares numeradas del 1 a 11, contienen ADN genómico humano degradado, y las calles con números pares contienen ADN genómico humano no degradado. Fueron vistos fragmentos de sonda marcados como dos manchas bien definidas migrando a aproximadamente 4 y 5 bases en longitud sobre la placa en capa fina. Cuando la concentración del molde de partida aumenta y/o el número de ciclos aumenta, la cantidad de fragmentos de la sonda marcada liberados también aumenta. La presencia o ausencia de ADN genómico humano degradado o sin degradar no interfirió ni potenció la hibridación y la degradación.
Los resultados muestran que se forman cantidades crecientes de pequeños fragmentos liberados de la sonda, coordinada y simultáneamente con la acumulación específica del producto durante el curso de un ensayo PCR. La presencia o ausencia de o bien una gran cantidad de ADN genómico humano de gran complejidad o bien de un gran número de "extremos" de ADN al azar, no tiene ningún efecto sobre la acumulación específica del producto o grado de liberación de la sonda. Finalmente, la presencia de una gran cantidad de ADN genómico humano de alta complejidad no conduce a ninguna liberación detectable de la sonda en ausencia de acumulación específica del producto.
\newpage
Ejemplo 4 PCR con la sonda marcada en 3'
Se efectuó una amplificación PCR la cual liberó una sonda radiomarcada en 3' hibridada, en fragmentos más pequeños cuando la sonda se asoció con el molde. Las secuencias de las sondas fueron como sigue:
6 
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A. Marcado de las sondas con ^{32}P-cordicepina y transferasa terminal
Se mezclaron individualmente cinco pmoles de cada sonda (DG46, BW32 y BW34) con 17,4 unidades de terminal transferasa (Strategene) y 10 pmoles de [\alpha-^{32}P]-cordicepina (cordicepina: 3'-desoxiadenosin-5' trifosfato, New England Nuclear, 5000 Ci/mmoles, diluido 3X con ddATP (Pharmacia) en un volumen de reacción de 17,5 \mul conteniendo 100 mM de cacodilato de potasio, 25 mM de Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM de CoCl_{2}, y 0,2 mM de ditiotreitol durante 60 minutos a 37ºC. El volumen total fue extraído a continuación con fenol/cloroformo y precipitado con etanol. Se resuspendieron las sondas en 50 \mul de tampón TE y se trataron en una columna de diálisis rotativa Sephadex G-50 de acuerdo con el procedimiento de Sambrook y col., Molecular Cloning ("Clonación molecular"), ver más arriba. La concentración final de las sondas fue de 0,1 pmol/\mul. La precipitación con TCA de los productos de la reacción indicó las siguientes actividades específicas.
DG46: 2,13 x 10^{6} cpm/pmol
BW32: 1,78 x 10^{6} cpm/pmol
BW34: 5,02 x 10^{6} cpm/pmol
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La comparación mediante análisis de desnaturalización en gradiente de gel, de las sondas BW31, BW33 y BW35 radiomarcadas en 3' con las mismas sondas quinasadas en 5', demostró que las sondas radiomarcadas en 3' actuaban de manera similar a las sondas radiomarcadas en 5'.
Una vez más la región amplificada fue la región de 350 bases en el M13mp10w definida por los cebadores BW36 y BW42. Las secuencias y localizaciones de los cebadores están relacionadas en el ejemplo 1. Cada mezcla de amplificación se preparó añadiendo 10^{-3} pmoles del ADN del M13mp10w diana, a un volumen de reacción de 50 \mul que contenía 50 mM de KCl, 10 mM de Tris HCl, pH 8,3, 3 mM de MgCl_{2}, 10 pmoles de cada uno de los cebadores BW36 y BW42, 200 \muM de cada uno de los cuatro desoxinucleósidos trifosfatos, 1,25 unidades de Taw ADN polimerasa y, o bien 2, 10 ó 20 pmoles de las sondas DG46, BW32 o BW34 isotópicamente diluidas.
Se preparó una mezcla de reacción de stock que contenía cantidades apropiadas de tampón de reacción, nucleósido trifosfatos, molde y enzima. Se prepararon alícuotas y a los mismos se añadió la cantidad apropiada de cebadores y sondas. Las reacciones de control incluían todos los componentes de reacción excepto los cebadores, y todos los componentes de la reacción excepto la sonda.
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Las mezclas de reacción se cubrieron con 50 \mul de aceite mineral, se microcentrifugaron y se introdujeron en un ciclador térmico. El esquema de la amplificación fue como sigue:
7
Después del ciclado, se extrajo el aceite mineral empleando 50 \mul de cloroformo y las muestras se guardaron a 4ºC.
Se analizaron las muestras con un gel de acrilamida al 4%, un gradiente de gel de acrilamida desnaturalizante al 8%, y por homocromatografía. Para los tres análisis, la manipulación de las mezclas de reacción fue como se ha descrito anteriormente.
En el análisis en un gel de acrilamida al 4%, fue visible una banda nítida correspondiente al producto deseado de 350 bases en todas las mezclas de reacción excepto las reacciones de control sin los cebadores. En todas las mezclas de reacción que contenían tanto cebadores como la sonda, fue visible una segunda banda a aproximadamente 300 bases. Esta segunda banda se convirtió en más intensa con un aumento de la concentración de la sonda, y probablemente correspondía a la sonda que, o bien no fue eficientemente radiomarcada en 3' o bien había perdido la marca en 3', permitiendo la extensión de la sonda y generando un producto.
Una exposición del gel de acrilamida en un gradiente desnaturalizante al 8% durante la noche, demostró una distribución de productos que oscilaban desde la sonda de tamaño completo hasta la de menos de 15 bases con todas las tres sondas aplicadas. Como era de esperar, la actividad 5'-3' nucleasa de la Taq ADN polimerasa degradó la sonda hasta un punto en el que la sonda degradada se disoció del molde.
La amplia distribución por tamaños de los productos fue ilustrativa del continuo cambio de las concentraciones de reactantes y cambios de temperaturas durante el ciclado de la PCR. Estas variaciones conducirían a cambios en la cinética de la asociación de la sonda y la enzima, permitiendo que la sonda se disocie en gran variedad de tamaños a diferentes tiempos en la rutina de los ciclos.
La plaza de homocromatografía reveló el producto más pequeño de aproximadamente 10 a 12 bases de longitud para todas las sondas examinadas. Puesto que las tres sondas tenían una secuencia idéntica excepto que en la región de la cola 5', este resultado muestra que para la secuencia particular de la sonda a una temperatura de asociación/extensión de 60ºC, la sonda se degradó hasta aproximadamente 10 bases y a continuación se disoció del molde.
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Ejemplo 5 Polimerización independiente de la actividad 5'-3' nucleasa, de la Taq ADN polimerasa
La Taq ADN polimerasa fue capaz de liberar el extremo 5' marcado ^{32}P de una sonda hibridada cuando se posicionó en la proximidad de dicha sonda mediante un cebador en dirección aguas arriba. Se diseñaron una serie de cebadores que contenían desde cero hasta veinte bases en dirección aguas arriba de la sonda BW33 quinasada hibridada. Estos cebadores se muestran a continuación.
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80
Se asociaron aproximadamente 0,5 pmoles de la sonda BW33 y 0,5 pmoles de cada uno de los cebadores, a 0,5pmoles de M13mp10w en un volumen de reacción de 10,5 \mul que contenía 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl, p 8,3 y 3 mM de MgCl_{2}. Las mezclas de reacción de control contenían o bien 20 \muM o 200 \muM cada uno de los cuatro desoxinucleósidos trifosfatos. Se empleó un cebador adicional DG47, situado 530 bases en dirección aguas arriba de la sonda.
100
Las mezclas de reacción se calentaron a 98ºC durante 1 minuto y se asociación a 60ºC durante 30 minutos. A continuación, se microcentrifugaron los tubos y se colocaron en un baño maría a 70ºC. Después de un amplio tiempo para que las mezclas de reacción se equilibren a esta temperatura, se añadieron 10, 5, 2,5, 1,25 ó 0,3125 unidades de Taq ADN polimerasa, y se extrajeron alícuotas de 4 \mul a los 2, 5 y 10 minutos. La enzima se desactivó añadiendo 4 \mul de EDTA 10 mM a cada alícuota y colocando a 4ºC. Las mezclas de reacción se examinaron mediante análisis homo-cromatográfico.
En el análisis homocromatográfico, se aplicó 1 \mul de cada muestra sobre placas de capa fina de celulosa DEAE y se colocaron en una cámara de desarrollo que contenía Homo-Mix III a 70ºC. Se dejó que el Homo-Mix migrara a la parte superior de cada placa, en cuyo momento las placas se retiraron, se secaron, se cubrieron con Saran Wrap y se autorradiografiaron. La figura 4 muestra los resultados de este experimento.
En la figura 4, las calles 1 a 3 contienen marcadores de tamaño molecular de oligonucleótidos radiomarcados, de 6, 8, 9, 10, 11, 12 y 13 nucleótidos. Las calles 4-10 muestran las reacciones de los cebadores BW37, BW38, BW39, BW40, BW41, BW42 y DG47 respectivamente en ausencia de dNTPs. Las calles 11-24 muestran las reacciones de control para todos los cebadores en presencia de 20 mM o 200 mM de dNTP.
En ausencia de dNTPs, la Taq ADN polimerasa generó fragmentos de la sonda marcada empleando todos los cebadores, produciéndose una liberación de la marca mucho menos considerable a medida que la distancia cebador-sonda aumentaba. Este efecto se vio en todas las concentraciones de enzima examinadas (0,3125 U hasta 10 U/reacción) en todos los tiempos de control. Los tamaños de los fragmentos liberados fueron los mismos, aproximadamente dos y tres bases en longitud, sin embargo las especies primarias variaron en función de cuál cebador había sido añadido. La especie mayoritaria liberada por los cebadores delta cero y delta dos, fue una base más pequeña que la liberada por los cebadores delta uno, cinco, diez y veinte. La actividad nucleasa fue independiente de la polimerización y dependiente de la proximidad.
En presencia de nucleósido trifosfatos, los tamaños de los fragmentos de la sonda marcada, liberados, y las proporciones relativas de cada uno de ellos, fueron idénticas para todos los cebadores examinados. Asimismo, los tamaños de los productos fueron mayores en una o dos bases cuando los dNTPs estuvieron presentes. Puede ser que, mientras la enzima estaba polimerizando, tuvo lugar una "puesta en marcha" y a medida que encontraba la sonda hibridada, iba desplazando simultáneamente una o dos bases, y a continuación cortando, generando de esta forma un fragmento más grande.
No se encontró ninguna diferencia detectable en la cantidad de producto liberado cuando los dNTPs fueron de 20 \muM a 200 \muM cada uno, y no se apreciaron diferencias significativas debidas a los tiempos de extinción o concentraciones de enzima en presencia de dNTPs.
Ejemplo 6 Ejemplo para ilustrar la naturaleza del producto liberado basado en la secuencia de la sonda en el extremo 5'
Se dictaminó el efecto de emparejamiento de una base fuerte o débil en la región complementaria 5' de una sonda sobre el tamaño del producto liberado. Se diseñaron dos sondas BW50 y BW51 para contener una región 5' complementaria rica en GC- o AT. Las BW50 y BW51 se compararon con la sonda BW33 empleada en el ejemplo V.
9
a,t,g,c = bases que no son complementarias a la cadena del cebador
BW50, BW51 y BW33 fueron marcadas con ^{32}P-ATP empleando polinucleótido quinada y tenían las siguientes actividades específicas:
BW50: 1,70 x 10^{8} cpm/pmol
BW51: 2,22 x 10^{6} cpm/pmol
BW33: 1,44 x 10^{6} cpm/pmol
La concentración final de las tres sondas fue de 0,10 \mumol/\mul.
Se asociaron individualmente 0,5 pmoles de una de las sondas BW50, BW51 o BW33, y 0,5 pmoles del cebador BW42, a 0,5 pmoles de M13mp10w en un volumen de reacción de 10,5 \mul conteniendo 50 mM de KCl, 10 mM de Tris CHl, pH 8,3, 3 mM de MgCl_{2} y 200 \muM de cada uno de los cuatro desoxinucleósido trifosfatos. Las muestras de control contenían todo los componentes de la reacción excepto el molde. Para el paso de asociación, las mezclas de reacción se calentaron a 98ºC durante 1 minuto y se asociaron a 60ºC durante 30 minutos. Los tubos fueron microcentrifugados a continuación y colocados en un baño maría a 50ºC, 60ºC ó 70ºC. Después de un tiempo suficientemente amplio para que las mezclas de reacción equilibraran su temperatura, se añadieron 0,3125 unidades de Taq ADN polimerasa. Se retiraron cuatro alícuotas de \mul a 1, 2 y 5 minutos. Las reacciones fueron inactivadas añadiendo 4 \mul de EDTA 10 mM a cada alícuota y colocando a 4ºC. Las muestras fueron examinadas mediante análisis homocromatográfico, y los resultados se muestran en las figuras 5 y 6.
La figura 5 muestra las reacciones que contenían la sonda BW50 rica en GC. Las calles 1-3 contienen marcadores oligonucleótidos de tamaño molecular, de 6, 8, 9, 10, 11, 12 y 13 nucleótidos. Las calles 4-6 muestran reacciones de extensión realizadas a 50ºC durante 1, 2 y 5 minutos. Las calles 7-9 muestran reacciones de extensión a 60ºC durante 1, 2 y 5 minutos. Las calles 10-12 muestran reacciones a 70ºC durante 1, 2 y 5 minutos. Las calles 13-15 son reacciones de control que contenían todos los componentes excepto el molde, incubadas a 70ºC durante 1, 2 y 5 minutos.
La figura 6 muestra las reacciones que contienen la sonda BW51 rica en AT. Como en la figura 5, las calles 1-3 son oligonucleótidos marcadores de tamaño molecular de 6, 8, 9, 10, 11, 12 y 13 nucleótidos. Las calles 4-6 son reacciones de extensión realizadas a 50ºC durante 1, 2 y 5 minutos. Las calles 7-9 son reacciones a 60ºC a 1, 2 y 5 minutos. Las calles 10-12 son reacciones a 70ºC a 1, 2 y 5 minutos. Las calles 13-15 son reacciones de control que contienen todos los componentes excepto el molde, incubadas a 70ºC durante 1, 2 y 5 minutos.
Los resultados demuestran que la naturaleza de la liberación de la marca de la sonda fue dependiente de la temperatura y de la composición de las bases en el extremo 5'. La sonda más estable BW50 rica en GC mostró una pequeña liberación de la marca a 50ºC (figura 5, calles 4-6) que iba aumentando al crecer la temperatura a 60ºC (figura 5, calles 7-9) y 70ºC (figura 5, calles 10-12). Los productos principales liberados fueron aproximadamente de 3-5 bases en longitud. La BW51 que era rica en AT en el extremo 5', mostró tanta liberación de la marca a 50ºC (figura 6, calles 4-6) como la que se observó a temperaturas más altas. Asimismo, la sonda rica en AT generó productos de tamaño más grande que la sonda rica en GC. La composición de las bases de la sonda rica en AT puede dar la oportunidad para una mayor capacidad de "respiro", y permitir así más desplazamiento de la sonda antes de cortar, y a menores temperaturas de la sonda rica en GC.
Ejemplo 7 Ensayo de captura del HIV
El siguiente es un ejemplo del empleo de una sonda doblemente marcada que contiene biotina en una PCR para detectar la presencia de una secuencia diana. Se sintetizaron dos oligonucleótidos, BW73 y BW74, cada uno complementario de una porción del genoma del HIV, con una molécula de biotina unida al extremo 3' del oligonucleótido. El extremo 5' de cada oligonucleótido se marcó adicionalmente con ^{32}P empleando polinucleótido quinasa y gamma-^{32}P-ATP. Los dos oligonucleótidos PH7 y PH8 son también complementarios al genoma del HIV, flanquean la región que contiene homología a los dos oligonucleótidos de la sonda, y pueden servir como cebadores de la PCR definiendo un producto de 142 bases. Las secuencias de estos oligonucleótidos se indican a continuación.
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En las secuencias "Y" es una biotina, y las letras en formato más pequeño indican bases que no son complementarias a la cadena del molde.
Se efectuaron un conjunto de reacciones en cadena de la polimerasa de 50 \mul, que contenían o bien BW73 ó bien BW74, cada una doblemente marcada, como oligonucleótidos de sonda, a 2nM. Adicionalmente, se añadió un molde de HIV en forma del clon de un plásmido, bien a 10^{2} o bien a 10^{3} copias por reacción, y se añadieron los oligonucleótidos de los cebadores PH7 y PH8 a 0,4 \muM cada uno. Se añadió Taq polimerasa a 1,25 U por reacción y dNTPs a 200 \muM cada uno. Cada reacción se cubrió con 50 \mul de aceite, se centrífugo por breve tiempo en una microcentrífuga para reunir todos los líquidos en el fondo del tubo, y se termociclaron entre 95ºC y 60ºC haciendo una pausa de 60 segundos en cada temperatura, durante 30, 35 ó 40 ciclos. Al final del termociclado, se extrajo cada reacción con 50 \mul de CHCl_{3} y se recogió la fase acuosa.
Cada reacción se analizó para detectar la amplificación aplicando 3 \mul sobre el gel de electroforesis de acrilamida al 5% y se examinó para detectar el esperado producto de 142 pares de base. Adicionalmente se examinó 1 \mul de cada reacción mediante homocromografía TLC sobre placas de celulosa DEAE. Finalmente cada reacción se analizó además poniendo en contacto el volumen restante con \mul de una suspensión 10 mg/ml de DYNABEADS M-280, a saber, perlas de poliestireno superparamagnético marcado con estreptavidina. Después de la reacción con las perlas, la mezcla se separó por filtración a través de un filtro de centrífuga Costar Spin X, se recogió el filtrado y se determinó la presencia de la radiomarca liberada.
La figura 7 contiene imágenes de los dos geles empleados y demuestra que el producto de 142 pares de bases se forma en todas las reacciones, con y sin la sonda, y aumenta en cantidad tanto cuando el molde de partida se incrementa de 10^{2} a 10^{3} copias, como cuando el termociclado se prolonga de 30 a 35 y a 40 ciclos.
La figura 8 es un compuesto de dos autorradiografías del análisis TLC de alícuotas de los PCRs y muestra que la liberación de la radiomarca tiene lugar y aumenta en cantidad tanto cuando se aumenta el molde de partida como cuando se efectúa un termociclado más largo. En la primera TLC de las PCR empleado BW73, las calles 1 y 3 contienen oligonucleótidos radiomarcados de 2 y 3 bases de longitud como estándares de tamaño. Las calles 4, 5 y 6 contienen muestras de PCRs con 10^{2} copias de partida del molde y las calles 7, 8 y 9 con 10^{3} copias de partida. Las muestras de las calles 4 y 7 se termociclaron durante 30 ciclos; en las calles 5 y 8 durante 35 ciclos; y en las calles 6 y 9 durante 40 ciclos. En la segunda TLC de las PCRs empleando la BW74, las calles 1 y 2 son as radiomarcadas 2 mer y 3 mer, las calles 4, 5 y 6 contienen muestras de las PCRs con 10^{2} copias de partida del molde termociclado durante 30, 35, y 40 ciclos respectivamente y las calles 7, 8 y 9 con 10^{3} copias del molde de partida termociclado durante 30, 35 y 40 ciclos respectivamente. El tamaño de la marca liberada es menor con BW73 la cual no tiene ninguna base no complementaria en 5' y es mayor con BW74 la cual tiene una extensión no complementaria en tres bases de 5'.
Cada cromatograma se analizó adicionalmente mediante dos imágenes de radioisótopos bidimensionales, empleando un contador Ambis. Los resultados del contador Ambis y el contaje de capturas de perlas, están mostrados en la tabla 1. La buena concordancia de los dos métodos de medición de la liberación de la marca demuestra la practicidad del empleo de sondas marcadas biotiniladas y perlas avidiniladas en las PCRs para determinar la formación del producto.
TABLA 1
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Ejemplo 8 Marcado de sondas y metodología de extracción de fases sólidas
En una versión de la presente invención, se empleo un paso de separación después de la escisión de la sonda pero antes de la determinación de la cantidad de sonda escindida, para separar los productos escindidos de la sonda no escindida. Se prefieren dos métodos de separación alternativos, (1) el empleo de partículas magnéticas avidiniladas o estreptovidiniladas para unirse a las sondas marcadas en el extremo 3' con biotina y en el extremo 5' con un fluoróforo; las partículas magnéticas se unen tanto a la sonda sin escindir como al fragmento 3' es decir el producto de la escisión de la sonda, y (2) el empleo de partículas magnéticas de intercambio iónico que se unen a los oligonucleótidos pero no a los mono o dinucleótidos que están típicamente marcados en el extremo 5' con un fluoróforo ó ^{32}P. A continuación se describen varios aspectos de estar estrategias alternativas.
A. Partículas magnéticas avidiniladas
El sistema de separación que implica sondas 3'-biotiniladas y perlas magnéticas avidiniladas (o estreptavidiniladas se efectúa la preferencia con perlas tales como las Dynabeads^{TM} de Dynal; estas perlas tienen una capacidad de unirse a la biotina de aproximadamente 200 pmoles de 50 \mul de perlas. La absorción no específica está minimizada tratando primeramente las perlas tanto con solución de Denhardt como con ADN soporte.
La sonda para los métodos de separación estreptavidinabiotina requieren un grupo biotina en el terminal 3' y un fluoróforo en el terminal 5'. La 3' biotina funciona tanto como un ligando para la separación mediante perlas estreptavidiniladas (o avidiniladas), como un bloque para prevenir la extensión de la sonda durante la amplificación. Pueden simplificarse las modificaciones post-síntesis extendiendo cada extremo de la sonda con un diferente nucleófilo, por ejemplo, se puede añadir una amina al extremo 3' durante la adición de la biotina y un tilo bloqueado en el extremo 5' durante la última edición del fluoróforo. Las sondas 3-biotiniladas pueden prepararse de muy diferentes maneras, algunas de las cuales se ilustran a continuación.
Puede añadirse un derivado éster NHS-activo de la biotina, a la 3'-amina de la sonda mediante el mecanismo de reacción mostrado en la figura 9. La unión resultante crea un hidroxilo gamma secundario a la carbonil amida que puede dar como resultado la inestabilidad durante el ciclo térmico repetido de una PCR típica. Por ejemplo, el ciclado térmico durante 40 ciclos puede rendir hasta un 6% de la sonda inicial añadida incapaz de unirse a partículas magnéticas avidiniladas. Cuando la unión entre la sonda y la biotina unida se rompe como resultado de un ciclo térmico, la sonda puede no seguir separándose de los productos escindidos y contribuye al efecto de fondo. Aunque se puede ayudar a solventar este problema, uniendo más de una biotina a la sonda, varios métodos alternativos para unir la biotina a un oligonucleótido pueden dar productos más estables.
Se puede hacer reaccionar la hidracina de biotina con aldehídos generados de una 3'-ribosa de la sonda para dar un oligonucleótido biotinilado. Para esta estrategia el 3'- nucleótido de la sonda contiene un azúcar ribosa en lugar del azúcar desoxirribosa. Durante la síntesis, la 3'-ribosa se une al soporte sólido mediante o bien su 2' ó 3'-OH. Después de la síntesis el oligonucleótido completo se libera del soporte sólido y los dioles vecinos de la ribosa se oxidan mediante peryodato de sodio (NaIO_{4}) para dar aldehídos que a continuación se hacen reaccionar con la hidracina de biotina como se muestra en la figura 10 y el producto se reduce mediante borohidruro de sodio (NaBH_{4}). Sin embargo, la sonda biotinilada resultante no se une eficientemente a las partículas magnéticas avidiniladas. El empleo de la hidracina de biotina de cadena larga, un compuesto mostrado también en la figura 10 puede resolver este problema.
Se puede unir la biotina a la sonda durante la síntesis de la sonda empleando una biotina fosforamidita soluble como se muestra en la figura 11. La síntesis empieza con una base unida a vidrio poroso controlado (CPG) el cual se desecha al final. Se añade una fosforamidita que permite la generación de un 3'-fosfato en una desprotección de hidróxido de amonio del oligonucleótido sintético. La biotina fosforamidita se añade a continuación y el oligonucleótido sintetizado es como se muestra en la figura 11, que muestra también el producto final. Este método de unión permite el empleo de oligonucleótidos terminados en 5'-amina para la unión de un fluoróforo. El empleo de una 3'-amina para la unión de la biotina limita la química de la unión del fluoróforo a los 5'-tioles. La utilización de una biotina fosforamidita en donde uno de los nitrógenos de la biotina está bloqueado puede mejorar la síntesis de la sonda marcada con biotina.
Se puede también emplear una reactivo comercial que consiste en biotina directamente unida al vidrio poroso; el reactivo es el substrato de la partida para la síntesis de la sonda y está mostrado en la figura 12. Este método de unión permite el empleo de oligonucleótidos terminados en 5'-amina para la unión de un fluoróforo. El empleo de una 3'-amina para la unión de la biotina limita la química de unión de un fluoróforo a los 5'-tioles. Existen también métodos enzimáticos de unión de nucleótidos modificados a los extremos 5' de oligonucleótidos, aunque están limitados en su generalidad y en la práctica de los mismos.
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B. Matrices magnéticas de intercambio iónico
Se pueden emplear partículas de matrices de polietilenimina (PEI) (basadas en polímeros de celulosa, sílice, y poliol), comercialmente adquiribles, para separar la sonda escindida de la no escindida. Por ejemplo, la Hydrophase PEI, Selectacel^{TM} PEI, Bakerbond^{TM} PEI, y Amicon PAE 300, 1000 y 1000L, son todas ellas matrices PEI comercialmente adquiribles, que ocasionan la separación de la sonda no escindida de los productos de la sonda escindida.
Partículas magnéticas de celulosa activada comercialmente adquiribles, tales como Cortex MagaCell^{TM} pueden ser derivatizadas con PEIs de varias longitudes tales como PEI600, PEI1800 y PEI10.000 y a diferentes ratios molares de PEI por gramo de matriz. Sin embargo, todo los tamaños de oligonucleótidos y oligonucleótidos marcados con cumarina se unen a perlas magnéticas de celulosa y agarosa tanto si han sido derivadas o no con PEI (la especificidad vista con los oligonucleótidos sobre matrices PEI comercialmente adquiribles, se pierde cuando los oligo-nucleótidos se marcan con cumarina). La adición de altas concentraciones de sal (NaCl 2,0 M) ó N-metil pirrolidona (10 a 20%) aumenta parcialmente la especificidad y otros cosolventes tales como el SDS, Brij 35, guanidina y urea pueden también emplearse para aumentar la especificidad de la unión. Sin embargo, la urea 8 M proporciona un bloqueo eficiente de la unión no específica de los di y trinucleótidos marcados con cumarina, a partículas derivatizadas tanto con Bakerbond^{TM}PEI como con Cortex^{TM} PEI magnético, aunque puede preferirse el empleo de las ureas N-substituidas.
Como se ha indicado más arriba, la firma Cortex Biochem vende diferentes partículas magnéticas revestidas de celulosa activada, que pueden ser unidas a PEI. La más conveniente de éstas es la matriz peryodada activada. Sin embargo, el protocolo recomendado por el fabricante para la unión de aminas a la matriz peryodada activada, tiene varios problemas: la reacción de una amina con un aldehído da como resultado iminas que son lábiles y que pueden ser hidrolizadas o puestas en reacción además con aminas, durante un paso para bloquear los aldehídos restantes mediante la adición de un exceso de etanolamina, el PEI puede desplazarse con etanolamina, eliminando de esta forma el PEI de la matriz, durante la reacción de conjugación bajo condiciones básicas, la condensación del aldol puede conducir a la reacción entre grupos aldehído, dando como resultado la agregación de las partículas y la reacción de los aldehídos bajo condiciones básicas puede dar como resultado radicales libres que pueden atacar la celulosa y participar en diferentes reacciones.
Para estabilizar la imina, puede incluirse un paso de reducción (con NaBH_{4} y NaBH_{3}CN); sin embargo, este paso de reducción puede dar como resultado la producción de gas, una disminución en la masa de las partículas y la aglutinación de partículas. Estos efectos no deseados dan como resultado la producción de radicales libres. Las complicaciones que resultan de la conjugación en aldehídos activos puede evitarse mediante el empleo de la química de los epóxidos. Las betahidroxiaminas resultantes son estables y no requieren reducción. Además, debido a que el oxígeno puede participar en la generación de radicales libres, la eliminación del oxígeno del sistema minimizaría la formación de radicales libres, especialmente durante el paso de reducción. En una síntesis de partículas magnéticas revestidas de celulosa derivatizada con PEI, el paso de bloqueo de la etanolamina se eliminó y la preparación se purgó durante toda la noche con helio antes y durante la reducción con cianoborohidruro de sodio. En la preparación final tuvo lugar una pequeña agregación.
Las partículas magnéticas de poliacroleína pueden derivatizarse tanto con PE1600 como con etileno diamina y la unión no específica de los di y trinucleótidos marcados con cumarina puede inhibirse mediante altas concentraciones de NMP. El empleo de polímeros de PEI de larga cadena puede enmascarar la interacción de estructuras no específicas con pequeños oligonucleótidos marcados con cumarina.
Un factor importante en la selección de una matriz magnética para emplear en el presente método es la cantidad de fluorescencia de fondo aportada por la matriz. Una estrategia para minimizar esta fluorescencia de fondo es la selección de los fluoróforos con excitación y emisión máximas que sobrepasen los espectros de fluorescencia de fondo del tampón, matriz y muestras clínicas. Además, el fondo fluorescente puede resultar de la presencia de contaminantes en la matriz que podrían ser eliminados mediante un pretratamiento extensivo antes de la unión.
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C. Química de la unión del fluoróforo a la sonda
Como se ha indicado más arriba, la marca preferida para la sonda, independientemente de la estrategia de separación, es un fluoróforo. Parece ser que hay una interacción entre la sonda de oligonucleótidos y el fluoróforo unido. Esta interacción puede ser la causa de la indicada extinción observada cuando los fluoróforos han sido unidos a los oligonucleótidos. Se deben seleccionar los fluoróforos que interaccionan mínimamente con el ADN cuando se unen al terminal 5' de un ácido nucleico.
Tres fluoróforos preferidos son la 7-dietilamino-3-(4'-maleimidilfenil)-4-metil cumarina (CPM), 6-(bromometil) fluoresceína (BMF), amarillo Lucifer yodoacetamida (LYIA) y el éster succinimidilo de 5-(y 6-)carboxi-X-rodamina, de los cuales se prefiere el CPM debido a sus varias propiedades: alto coeficiente de excitación, gran rendimiento en cuanto a cantidad, baja decoloración, y una gran variación de Stokes. El fluoróforo puede estar unido a través de un tilo unido al grupo 5'-fosfato de la sonda, pero en el caso del CPM, este proceso suministra un aril maleimida, la cual puede ser inestable en las condiciones del termociclado.
Pueden adquirirse un número de instrumentos comerciales para el análisis de materiales marcados con fluorescencia. Por ejemplo, puede emplearse el ABI Gene Analyzer para analizar cantidades de átomo moles de ADN marcado con fluoróforos tales como el ROX (6-carboxi-X-rodamina), rodamina-NHS, TAMRA (5/6.carboxitetrametil rodamina NHS), y FAM (5'-carboxifluoresceína NSH). Estos compuestos están unidos a la sonda mediante una unión amida a través de una 5'-alquilamina sobre la sonda. Otros fluoróforos útiles incluyen el CNHS (éster succinimidilo del ácido 7-amino-4-metil-cumarin-3-acético) el cual puede también unirse a través de un enlace amida.
Pueden ser necesarias modificaciones en el proceso de marcado para lograr una unión eficiente de un fluoróforo dado a una sonda de oligonucleótidos particular. Por ejemplo la reacción inicial entre una sonda terminada en 5'-amina y el éster 7-dietilaminocumarin-3-carboxilato de NHS fue muy ineficiente. La sonda que había sido fosforilada en el extremo 3' para evitar la extensión de la sonda durante la amplificación tenía una estructura secundaria significativa, una conformación de la cual colocaba la 5'-amina y el 3'-fosfato en una proximidad lo suficientemente grande para formar una punte de sal. Esta estructura puede haber evitado que la 5'-amina está disponible para la reacción con el éster NHS, ocasionando así el bajo rendimiento del producto. La adición de N-metilpirrolidinona (NMP) al 25% mejoró notablemente la eficiencia de la reacción.
Se puede ampliar también tanto un fluoróforo como un agente de extinción para marcar la sonda. Cuando la sonda está intacta, la fluorescencia del fluoróforo se extingue mediante el agente extintor. Durante el presente método, la sonda se escinde entre el fluoróforo y el agente extintor, permitiendo la completa expresión de la fluorescencia fluorófora. La extinción implica la transferencia de energía entre el fluoróforo y el agente extintor; el especto de emisión del fluoróforo y el espectro de absorción del agente extintor deben superponerse. Una combinación preferida para este aspecto de la invención es el fluoróforo rodamina 590 y el agente extintor violeta cristal.
Una sonda de este tipo se muestra en la figura 13. La síntesis de esta construcción requiere la unión de un derivado de la rodamina a través del 5'-tiol y la unión del violeta cristal a través de una amina extendiéndose desde una timidina dos bases más allá. La separación de los dos grupos mediante dos enlaces fosfodiéster aumenta las oportunidades para la escisión mediante la DNA polimerasa entre los mismos.
Las tentativas iniciales para unir el violeta cristal mediante la reacción entre una lactona y una amina no tuvieron éxito. El violeta cristal se modificó para generar una acil azida activa mostrada en la figura 14. Esta forma de violeta cristal se hizo reaccionar con ADN modificado con amina, y el producto deseado se purificó mediante HPLC de fase invertida.
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Las tentativas para hacer reaccionar el grupo rodamina-X-maleimida con el 5'-tiol no tuvieron éxito. Este fue también el caso cuando la rodamina-X-maleimida se hizo reaccionar antes de la adición del violeta cristal. Esto puede ser debido a que el 5'-tiol desbloqueado reacciona con la acrilamida de doble enlace en el brazo espaciador de la timidina (ver figura 13). Un método alternativo para la adición de una amina a la timidina se muestra en la figura 15.
Este ejemplo proporciona una guía general para la unión de la biotina al extremo 3' de una sonda de oligonucleótidos y un fluoróforo al extremo 5' de una sonda de oligonucleótidos.
Los expertos en la técnica reconocerán que un buen número de métodos para estas uniones son ya conocidos en la técnica y que la presente invención no está limitada por el método particular escogido para marcar la sonda.
Ejemplo 9 Protocolo para la PCR mediada por el AmpliWax^{TM} con UNG y dUTP
El proceso de la PCR puede mejorarse con respecto a la especificidad de la amplificación mediante procesos y reactivos descritos más extensamente en la solicitud de patente PCT serie nº 91/01039 registrada el 15 de Febrero de 1991, solicitud de patente U.S. serie nº 481.501, registrada el 16 de Febrero de 1991; solicitud de patente PCT serie nº PCT/US 91/05210, registrada el 23 de Julio de 1991, solicitud de patente U.S. serie nº 609.157 registrada el 2 de Noviembre de 1990 y la solicitud de patente U.S. serie nº 557.517, registrada el 24 de Julio de 1990. Las descripciones de estas solicitudes de patente se incorporan a la presente como referencia, y el siguiente protocolo demuestra como estos métodos PCR mejorados pueden emplearse conjuntamente con el presente método para conseguir superiores resultados. Todos los reactivos pueden adquirirse en Perkin-Elmer Cetus Instruments, Norwalk, CT).
Este protocolo implica esencialmente tres componentes: los tubos MicroAmp^{TM} conteniendo los dNTPs, los cebadores, magnesio y el Tris, que han sido cubiertos con cera; Premix B al cual se ha añadido AmpliTaq® ADN polimerasa y UNG (por lo cual se le llama también "mezcla de enzimas"), y el Premix C al cual se ha añadido la muestra de ensayo y la sonda. Se preparan la "mezcla de enzimas" y la muestra problema con la sonda y se añade encima la capa de cera. A continuación se colocan los tubos en un termociclador TC9600 y se termociclan. El protocolo que se describe más adelante implica una reacción de 50 \mul, con muestras problema no superiores a 27 \mul, y la diana es el HIV.
Los reactivos se suministran de preferencia como sigue. Se preparan tubos MicroAmp^{TM} conteniendo 12,5 \mul de Premix A y una píldora de 12 mg Ampli/Wax^{TM}PCR por tubo. El Premix A contiene 1 \muM de cebador SK145 y 1 \muM de cebador SK431 (ninguno de los cebadores está biotinilado), 800 \muM dATP, 800 \muM dGTP, 800 \muM dCTP, 800 \mu dUTP, 15 mM de MgCl_{2}, y 10 mM de Tris-HCl, pH 8,3. La píldora de AmpliWax^{TM} consiste en parafina que funde a 55ºC (Aldrich Chemical Co.) que contiene 0,15% de Tween 65, y la píldora de cera y la capa del fondo del Premix A se añaden conjuntamente en una campana de extracción exenta de ADN. La píldora de cera se funde a continuación para formar una barrera de vapor en la parte superior. Esta barrera mantendrá su integridad cuando los tubos se guarden de 4 a 25ºC y loa reactivos de la PCR debajo de la barrera sean estables al almacenamiento durante meses a 4ºC. No se efectúa ninguna mezcla de material añadido encima de la barrera hasta que la cera se funde durante los pasos iniciales del ciclado térmico. Los tubos de control son idénticos pero no contienen ningún cebador.
El tampón Premix B contiene 10 mM de Tris-HCl, pH 8,3, y se emplean 50 mM de KCl para la dilución de las enzimas AmpliTaq® ADN polimerasa y UNG. Se emplean aproximadamente 2,6 \mul de tampón Premix B por reacción.
Se prepara el tampón Premix C como un concentrado 10X, el cual contiene 105 mM de Tris HCl. pH 8,3 y 715 mM de KCl, y se añade a la muestra de ensayo de ADN de forma que las concentraciones finales de Tris y KCl en la reacción final son 10 mM y 50 mM respectivamente. La sonda se añade también en esta capa así como el ADN soporte, si es que lo hay. Si se han preparado controles de plásmido, se añaden habitualmente aproximadamente 1 \mug de ADN de placenta humana (1 \mug/\mul en 10 mM de Tris, pH 8, 1 mM de EDTA y 10 mM de NaCl, la cual ha sido cortada, extraída con fenol/cloroformo, extraída con cloroformo y precipitada con etanol) por reacción como ADN de soporte. Se añaden por reacción aproximadamente 3,3 \mul del stock 10X de Premix C.
La sonda se prepara como un stock 5 \muM y recibe el nombre de LG101C. La sonda LG101C tiene un 3'-fosfato para evitar la extensión de la sonda y un 7-dietilaminocumarin-3-carboxilato unido al grupo alifático 5'-amino del oligonucleótido mediante un enlace amida. La secuencia de nucleótidos de la sonda es como sigue:
SEQ ID NO: 24 LG101c: 5'-GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT 
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Esta sonda debe almacenarse a -20ºC en la oscuridad.
Se prepara AmpliTaq® ADN polimerasa a una concentración de stock de 5 U/\mul de PECI, y se prepara UNG a una concentración de stock de 1 U/\mul del mismo proveedor. Se pueden también preparar muestras de calibración del plásmido, y para ello, es útil la preparación de diluciones de stock (copias/ml) de 300, 1.000, 3.000, 10.000, 30.000, 100.000, y 1.000.000 con GeneAmplimer^{TM} Positive Control DNA. Este ADN consiste en el genoma de HIVZ6 adaptado para interrumpir la región pol, y de esta forma bloquear la actividad infecciosa, insertado en al plásmido pBR322.
Cada reacción final constará de 12,5 \mul de Premix A; 2,6 \mul de Premix B; 3,3 \mul de Premix C; 2 \mul de la sonda LG101C; 27 \mul de la muestra de ensayo; 0,4 \mul de AmpliTaq® ADN polimerasa, y 2 \mul de UNG proporcionando un volumen final de 49,8 \mul. Esta mezcla comprende 250 nM de cada cebador; 200 \muM de cada uno de los dHTP; 3,75 mM de MgCl_{2}; 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl, pH 8,3; 200 nM de la sonda; 2 unidades de UNG; y 2 unidades de polimerasa.
Para efectuar la reacción se prepara en primer lugar la "mezcla de enzimas" en una cámara o campana extractora exenta de ADN mezclando por cada reacción, 2,6 \mul de tampón de Premix B, 0,4 \mul de AmpliTaq® ADN polimerasa y 2 \mul de UNG. Para cada 16 reacciones que tienen lugar, debe prepararse suficiente "mezcla de enzimas" para 18 reacciones para asegurar el material suficiente. La "mezcla de enzimas" se añade a continuación a cada tubo MicroAmp^{TM} que contiene el Premix A cubierto de cera, sobre la cera de la campana extractora o cámara exenta de ADN. Puede ser suficiente una única punta de muestreador para todas las transferencias, y se añaden 5 \mul de "mezcla de enzimas" a cada tubo.
En el área de preparación de la muestra, se prepara la "mezcla de muestras", mezclando por cada reacción, 3,3 \mul de tampón 10X Premix C, de muestra (para controles de cuantificación, añadiendo 10 \mul de dilución de control y 17 \mul de agua) y 2 \mul de sonda (ADN del soporte, si es que hay alguno presente, se mezclan con la muestra). A continuación, empleando una punta de muestreador distinta para cada transferencia, se añaden 32,3 \mul de "mezcla de muestras" a cada tubo, el desequilibrio de volumen entre la "mezcla de enzimas" y la "mezcla de muestras" asegura un mezclado completo. Deben también prepararse dos tubos de control a los que faltan los cebadores para servir como una medida de la escisión de la sonda resultante del ciclado térmico. Este control contiene típicamente 1.000 copias del molde de control. Además, debe prepararse una serie de disoluciones del plásmido para calibrar el ensayo. Esta calibración está típicamente en el margen de 3 a 10.000 copias de HIV diana por muestra. Después de completar los pasos descritos más arriba, se tapan los tubos y se reúnen en la bandeja TC9600.
El perfil del ciclador térmico es como sigue: 1 ciclo de 50ºC durante 2 minutos; 5 ciclos de 95ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 10 segundos, y 72ºC durante 10 segundos, y 35 ciclos de 90ºC durante 10 segundos, 60ºC durante 10 segundos y 72ºC durante 10 segundos. Cuando la ciclación térmica es competa, se retiran los tubos del TC9600 y se guardan a -20ºC si es necesario. No se recomienda una inmersión prolongada de los tunos por encima de los 70ºC, y la desnaturalización alcalina no debe emplearse.
Es útil un cierto número de controles, incluyendo un control sin ningún molde, para determinar la contaminación de las mezclas de reacción, así como la amplificación de productos no específicos que puedan dar como resultado la escisión de la sonda y dar señales no específicas; un control sin ningún cebador para probar una medida de escisión relacionada con la no amplificación, de la sonda que podría contribuir a la señal de fondo (podría también incluir algunas muestras clínicas en los ensayos para detectar la presencia de componentes que podrían dar por resultado la escisión de la sonda); y controles cuantitativos.
Para retirar el producto de la PCR de debajo de la capa de cera, que se formará después de la amplificación empleando el protocolo anterior, se puede retirar la muestra después de empujar la punta del muestreador a través del centro de la capa de cera avanzando la punta lentamente por una suave presión para minimizar la posibilidad de que la mezcla de reacción llegue a salpicar más allá de la punta y contamine el laboratorio. Sujetando firmemente el muestreador con un dedo de la mano manteniendo el tubo de reacción, se aumenta mucho el control. Las delgadas puntas de los muestreadores (gelloading) penetran la cera especialmente bien. Un movimiento de cortar más que un movimiento de apretar facilita también la penetración y ayuda a asegurar que la punta no se obstruirá con la cera. Si la punta coge un trozo de cera, ésta puede normalmente apartarse frotando suavemente contra la cera restante.
Se pueden también congelar los tubos de reacción (p. ej., el hielo seco de etanol o durante la noche en u n congelador), descongelándolos y centrifugando brevemente en una microcentrífuga (rotor en ángulo). La capa de cera se fragmentará intensamente lo cual permitirá la inserción del muestreador sin ninguna posibilidad de atascarse. Los fragmentos de cera pueden ser limpiados de la punta del muestreador frotando contra la pared interna del tuno. Este método es especialmente conveniente para muestreadores con desplazamiento positivo, los cuales tienen a menudo puntas tan gruesas que es difícil la penetración directa dejando intacta la capa de cera. Cualquiera de los dos métodos anteriores debe eliminar la cera de la muestra retirada, tan completamente que la extracción con cloroformo sea innecesaria.
Aunque la precedente inversión ha sido descrita con algún detalle con el propósito de ilustrar, es obvio que se pueden introducir cambios y modificaciones dentro del ámbito de las reivindicaciones del apéndice por aquellos normalmente expertos en la técnica.
Ejemplo 10 Extracción en fase sólida con Bakerbond^{TM} PEI
Este ejemplo proporciona un protocolo para el muestreado de una mezcla de PCR en la cual la amplificación se efectúa en presencia de una sonda marcada fluorescentemente (un derivado de cumarina) de acuerdo con el método de la presente invención.
La preparación de ciertos reactivos en stock facilita la práctica de este protocolo. Un reactivo de este tipo son los tubos Eppendorf conteniendo 50 mg de una matriz prelavada de Bakerbond PEI. El Bakerbond^{TM} PEI puede obtenerse en J.T. Baker (producto nº 7264-00) y es una partícula base de sílice de 40 \mum de tamaño, y con un tamaño de poro de 275 angstroms. La matriz se prepara mediante un primer lavado con agua, a continuación etanol, a continuación agua y a continuación una mezcla de 10 mM de Tris pH 8,3 50 mM de KCl, 1 mM de EDTA, 2 M de NaCl y 8 M de urea y a continuación equilibrada en 10 mM de Tris, pH 8,3, 50 mM de KCl, 1 mM de EDTA, 500 mM de NaCl y 8 M de urea. Después de la distribución, se añaden 15 \mul de agua a cada tubo para mantener la matriz hidratada. Los tubos deben guardarse a 4ºC.
Puede prepararse también un tampón de unión como solución en stock, y la composición es de 10 mM de Tris, pH 8, 500 mM de NaCl, 50 mM de KCl, mM de EDTA y 8 M de urea. El tampón de unión debe guardarse a 4ºC aunque la urea puede precipitar a esta temperatura. El tampón de unión puede calentarse brevemente antes de emplear para resuspender la urea.
Es de utilidad cierto equipo para efectuar este protocolo. Durante el paso de unión, los tubos deben mezclarse para mantener la matriz en suspensión y un mezclador Vortex Genie 2 (adquirible en Fischer Scientific, cat. nº 12-812 con un soporte para 60 microtubos, cat. nº 12-812-B) es útil para esta finalidad. Además, una microcentrífuga Eppendorf, un espectrofluorómetro Hitachi modelo 2000 y cubetas de cuarzo de microfluorímetro con un ancho interno de 2 mm y una longitud de base de 2,5 mm (adquirible en Starna Cells, Inc., nº 18F Q 10 mm 5) son también de utilidad para efectuar este protocolo.
Deben realizarse también controles apropiados y el paso de unión requiere tres controles. El control para la fluorescencia de fondo implica la preparación de una muestra que contiene todos los componentes de la amplificación PCR excepto la sonda. La muestra de control debe ser procesada idénticamente a las muestras de ensayo actuales en que 20 \mul se añadirán a la matriz y se medirá la fluorescencia presente en el sobrenadante. Este control proporciona un camino para medir la fluorescencia de fondo presente en la matriz, tampón y cualquiera de los componentes en la mezcla de amplificación PCR y también proporciona una medida de la cantidad de fluorescencia presente en las muestras clínicas.
El segundo control proporciona una medida para la descomposición accidental de la sonda y para la reacción de unión, y consiste en una mezcla de amplificación PCR simulada que contiene todos los componentes incluyendo la sonda pero no está sujeta a la ciclación térmica. La muestra de control debe estar procesada idénticamente a las muestras de ensayo verdaderas de forma que 20 \mul se añadirán a la matriz y se medirá la fluorescencia presente en el sobrenadante. Este control proporciona un camino para medir la presencia de descomposición de la sonda durante el almacenamiento así como la eficiencia de la reacción de unión. Si no existe descomposición y si la reacción de unión es completa, la fluorescencia del sobrenadante después de la unión al Bakerbond^{TM} PEI debe ser similar a la descomposición medida en el primer control.
El tercer control proporciona un camino para medir la cantidad de entrada de la sonda. La muestra preparada para el segundo control puede emplearse para la medición. Sin embargo, en este caso, se añaden 20 \mul a un tubo conteniendo 290 \mul de tampón de unión sin matriz. Este control puede utilizarse para determinar la cantidad de sonda empleada.
Para empezar el protocolo, se determina en primer lugar el número de tubos de unión necesarios; este número es la suma de las muestras de ensayo y los controles. Los controles son un control sin molde, un control sin cebador, controles de calibración y el primer y segundo control descritos más arriba. Los controles pueden hacerse por triplicado. A cada tubo se añaden 235 \mul de tampón de unión.
Se prepara también un tubo para medir la entrada, añadiendo un tupo Eppendorf vacío, 290 \mul de tampón de unión el cual es equivalente al volumen en los tubos con matriz (235 \mul de tampón de unión, 15 \mul de agua, y 40 \mul que corresponden al volumen de la matriz). La determinación de la cantidad entrada puede hacerse por triplicado.
A los tubos que contienen la matriz (muestras de ensayo y primer y segundo controles) se añaden 20 \mul de la muestra. A los tubos que contienen tampón (el tercer control) se añaden 20 \mul de mezcla de amplificación PCR simulada. Los tubos se agitan a continuación en un mezclador Vortex Genie 2 con un ajuste de 4, a temperatura durante 30 minutos. A continuación se centrifugan los tubos en una microcentrífuga Eppendorf (16.000 X g) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se eliminan los 200 \mul más superiores del sobrenadante de cada tubo, sin estropear la píldora del sedimento o la matriz presente sobre la pared del tubo y se colocan en un tubo Eppendorf limpio.
La fluorescencia del sobrenadante se mide en un aparato Hitachi modelo 2000 en las cubetas indicadas más arriba. Para las sondas marcadas con 7-dietilamino-3 (4'-maleimidofenil)-4-metil-cumarina, el espectrofluorómetro se ajusta como sigue: el voltaje PM es de 700 V; la longitud de onda de excitación es de 432 nm; la longitud de onda de emisión es de 480 nm; el ancho de la rendija de excitación es de 10 nm y el ancho de la rendija de emisión es de 20 nm. Se debe minimizar la exposición de la muestra a la luz de excitación; si la muestra ha de permanecer en el espectrofluorómetro durante un período prolongado, el obturador ha de estar cerrado.
El número de pmoles de la sonda escindidos es el camino más conveniente para dictaminar la cantidad de la señal. Para dictaminar la cantidad de señal, a continuación se determina en primer lugar la señal de entrada desde el tercer control, mediante el siguiente cálculo:
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En esta fórmula, la diferencia corrige de cualquier fluorescencia de fondo en la muestra de ensayo; 310/20 es el factor de dilución, y 10 pmoles es la cantidad de sonda añadida a las amplificaciones PCR.
La cantidad de señal de la muestra ensayo se calcula mediante la siguiente fórmula:
120 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El protocolo anterior puede ser modificado de acuerdo con el fluoróforo particular empleado para el marcado de la muestra, y es meramente ilustrativo de la invención.
La figura 16 muestra los resultado típicos y la relación de la señal al número de dianas de entrada, para el presente método empleado al extractante Bakerbond^{TM} de fase sólida.
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: F. HOFFMANN - LA ROCHE A.G.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Grenzacherstrasse 124
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Basilea
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: BS
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Suiza
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): CH-4070
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: 061 - 688 25 11
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
FAX: 061 - 688 13 95
\vskip0.500000\baselineskip
(I)
TELEX: 962292/965542 hlr ch
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: oligonucleótidos marcados
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 24
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMATO LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO MEDIO: disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.800000\baselineskip
NÚMERO DE LA SOLICITUD: 563.758
\vskip0.800000\baselineskip
FECHA DE REGISTRO: 6 de Agosto de 1990
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:0
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCGATAGTTT GAGTTCTTCT ACTCAGGC 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAAGAAAGCG AAAGGAGCGG GCGCTAGGGC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCTGCGCGT AACCACCACA CCCGCCGCGC X 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 37 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCGCTGCG CGTAACCACC ACACCCGCCG CCGCGCX 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGTCACCGAT CGCTGCGCGT AACCACCACA CCCGCCGCGC 
\hfill
41 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATGAGTTCG TGTCCGTACA ACTGG 
\hfill
25 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTTATCGAA ATCAGCCACA GCGCC 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCTGCGCGGT AACCACCCACA CCCGCCGCGC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCGCTGCG CGTAACCACC ACACCCGCCG CGC 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 40 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGTCACCGAT CGCTGCGCGT AACCACCACA CCCGCCGCGC 
\hfill
40 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGCTAGGGC GCTGGCAAGT GTAGCGGTCA 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCGCCTAGGG CGCTGGCAAG TGTAGCGGTC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGCGCTAGG GCGCTGGCAA GTGTAGCGGT 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCGGGCGCT AGGGCGCTGG CAAGTGTAGC 
\hfill
30 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAAGGAGCGG GCGCTAGGGC GCTGGCAAGT 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAAGAAAGCG AAAGGAGCGG GCGCTAGGGC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGCCAACGC GCGGGGAGAG GCGGTTTGCG 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATCCCGCCG CGCTTAATGC GCCGCTACA 
\hfill
29 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCATTAATGC GCCGCTACAG GGCGCGTACT AYGG 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGACCATCA ATGAGGAAGC TGCAGAATGG GAT 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGGAGACCA TCAATGAGGA AGCTGCAGAA TGGGAT 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAAAT 
\hfill
30 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGCTATGTCA GTTCCCCTTG GTTCTCT 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGACCATCA ATGAGGAAGC TGCAGAATGG GAT 
\hfill
33

Claims (7)

1. Un oligonucleótido marcado que contiene una secuencia complementaria a una región de una secuencia diana de ácido nucleido, en donde dicho oligonucleótido marcado tiene por los menos 12 nucleotidos y está bloqueado en el extremo terminal 3' para impedir la incorporación de dicho oligonucleótido marcado en un producto de extensión de un cebador, y en donde dicho oligonucleótido comprende dos marcas en donde dichas marcas están separadas por un sitio susceptible de escisión por una nucleasa, y en donde las dos marcas son un par de marcas interactivas que generan una señal posicionador sobre el oligonucleótido para extinguir la generación de una señal detectable.
2. Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el bloqueo se consigue por adición de un grupo químico en el hidroxilo 3' del último nucleótido.
3. Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el grupo químico no sirve tampoco de marca para una subsiguiente detección.
4. Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el bloqueo se consigue por eliminación del 3'-OH del último nucleótido o mediante el empleo de un nucleótido al que falta un 3'-OH.
5. Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la marca se selecciona entre los colorantes fluorescentes.
6. Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde una de las marcas es un fluoróforo y la otra marca es un extintor.
7. Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el fluoróforo incluye la rodamina o un derivado de la misma.
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