JP3174751B2 - リアルタイム検出ｐｃｒ法によるｈｃｖ遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブ - Google Patents
リアルタイム検出ｐｃｒ法によるｈｃｖ遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、リアルタイム検出
ＰＣＲ法によるＣ型肝炎ウイルス（本願明細書において
「ＨＣＶ」という）の測定方法並びにそれに用いられる
プライマー及びプローブに関する。
ＰＣＲ法によるＣ型肝炎ウイルス（本願明細書において
「ＨＣＶ」という）の測定方法並びにそれに用いられる
プライマー及びプローブに関する。
【０００２】
【従来の技術】従来より、血清等の試料中のＨＣＶの検
出は、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法により行なわれ
ている。この方法は、(1) 血清からのＲＮＡ（ＨＣＶ遺
伝子はＲＮＡである）の抽出、(2) 抽出したＲＮＡを鋳
型とするｃＤＮＡ合成、(3)1stＰＣＲによる増幅、(4)2
ndＰＣＲによる増幅（感度を上げるために増幅は２回行
なう（nested PCR) ）、(5) アガロースゲル電気泳動、
(6) データ処理という、６工程により行なわれている。
また、このＲＴ−ＰＣＲ法とSouthern分析を組み合わせ
たＲＴ−ＰＣＲSouthern法で被検ＲＮＡを定量すること
も可能である。
出は、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法により行なわれ
ている。この方法は、(1) 血清からのＲＮＡ（ＨＣＶ遺
伝子はＲＮＡである）の抽出、(2) 抽出したＲＮＡを鋳
型とするｃＤＮＡ合成、(3)1stＰＣＲによる増幅、(4)2
ndＰＣＲによる増幅（感度を上げるために増幅は２回行
なう（nested PCR) ）、(5) アガロースゲル電気泳動、
(6) データ処理という、６工程により行なわれている。
また、このＲＴ−ＰＣＲ法とSouthern分析を組み合わせ
たＲＴ−ＰＣＲSouthern法で被検ＲＮＡを定量すること
も可能である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ＨＣＶのウイルス量を
定量的に高感度で測定することは、単にウイルス感染の
程度を知る以外にも治療経過のモニタリングを行なう上
で重要である。しかしながら、上記のＲＴ−ＰＣＲ法で
は、被検試料中のＨＣＶを検出できるものの定量するこ
とはできない。また、ＲＴ−ＰＣＲSouthern法は、工程
が複雑で手間及び時間がかかる。ＨＣＶの測定は、主と
して臨床検査センター等で行なわれており、一定の時間
内に多数の検体を処理する必要があることから、検査を
効率化して検査時間を短縮することができれば非常に有
利である。
定量的に高感度で測定することは、単にウイルス感染の
程度を知る以外にも治療経過のモニタリングを行なう上
で重要である。しかしながら、上記のＲＴ−ＰＣＲ法で
は、被検試料中のＨＣＶを検出できるものの定量するこ
とはできない。また、ＲＴ−ＰＣＲSouthern法は、工程
が複雑で手間及び時間がかかる。ＨＣＶの測定は、主と
して臨床検査センター等で行なわれており、一定の時間
内に多数の検体を処理する必要があることから、検査を
効率化して検査時間を短縮することができれば非常に有
利である。
【０００４】従って、本発明の目的は、ＨＣＶを高感度
で正確に、かつ、簡便に測定する手段を提供することで
ある。
で正確に、かつ、簡便に測定する手段を提供することで
ある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、いわゆ
るリアルタイム検出ＰＣＲ法（Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, Vol. 88, pp.7276-7280, August 1991, Biochemi
stry; 特表平６−５０００２１号公報）を用いてＨＣＶ
の測定を行なうことにより上記目的を達成できるのでは
ないかと考えた。しかしながら、用いるプライマー及び
プローブの設定いかんによっては、測定の感度及び／又
は再現性について必ずしも満足できない。そこで、鋭意
研究の結果、特定のプライマー及びプローブを用いるこ
とによりリアルタイム検出ＰＣＲ法を用いて非常に高感
度に、高い再現性をもってＨＣＶを正確に定量すること
ができることを見出し、本発明を完成した。
るリアルタイム検出ＰＣＲ法（Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, Vol. 88, pp.7276-7280, August 1991, Biochemi
stry; 特表平６−５０００２１号公報）を用いてＨＣＶ
の測定を行なうことにより上記目的を達成できるのでは
ないかと考えた。しかしながら、用いるプライマー及び
プローブの設定いかんによっては、測定の感度及び／又
は再現性について必ずしも満足できない。そこで、鋭意
研究の結果、特定のプライマー及びプローブを用いるこ
とによりリアルタイム検出ＰＣＲ法を用いて非常に高感
度に、高い再現性をもってＨＣＶを正確に定量すること
ができることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】すなわち、本発明は、配列表の配列番号１
で示される塩基配列の第９番目から第２９番目の塩基か
ら成る配列のうち連続する１５塩基ないし１９塩基から
成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから成るフォ
ワード側プライマーと、配列表の配列番号３で示される
塩基配列の第９番目から第３１番目の塩基から成る配列
のうち連続する１７塩基ないし２１塩基から成る塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドから成るリバース側プラ
イマーと、配列表の配列番号５で示される塩基配列の第
９番目から第３３番目の塩基から成る配列のうち連続す
る１９塩基ないし２３塩基から成る塩基配列を有するオ
リゴヌクレオチドに、レポーター蛍光色素と、クエンチ
ャー蛍光色素とが結合されており、前記レポーター蛍光
色素は、該レポーター蛍光色素が前記クエンチャー蛍光
色素と同一のプローブに結合されている場合には蛍光共
鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑制され、前記
クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されてい
ない状態では蛍光強度が抑制されないものであるプロー
ブとを用い、被検試料中の測定すべきＨＣＶ遺伝子を鋳
型として逆転写ＰＣＲを行ない、反応液からの蛍光をリ
アルタイムに測定することから成る、被検試料中のＨＣ
Ｖ遺伝子の測定方法を提供する。
で示される塩基配列の第９番目から第２９番目の塩基か
ら成る配列のうち連続する１５塩基ないし１９塩基から
成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから成るフォ
ワード側プライマーと、配列表の配列番号３で示される
塩基配列の第９番目から第３１番目の塩基から成る配列
のうち連続する１７塩基ないし２１塩基から成る塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドから成るリバース側プラ
イマーと、配列表の配列番号５で示される塩基配列の第
９番目から第３３番目の塩基から成る配列のうち連続す
る１９塩基ないし２３塩基から成る塩基配列を有するオ
リゴヌクレオチドに、レポーター蛍光色素と、クエンチ
ャー蛍光色素とが結合されており、前記レポーター蛍光
色素は、該レポーター蛍光色素が前記クエンチャー蛍光
色素と同一のプローブに結合されている場合には蛍光共
鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑制され、前記
クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されてい
ない状態では蛍光強度が抑制されないものであるプロー
ブとを用い、被検試料中の測定すべきＨＣＶ遺伝子を鋳
型として逆転写ＰＣＲを行ない、反応液からの蛍光をリ
アルタイムに測定することから成る、被検試料中のＨＣ
Ｖ遺伝子の測定方法を提供する。
【０００７】本発明の方法に用いられるフォワード側プ
ライマーは、配列番号１に示される第９番目から第２９
番目の塩基から成る配列のうち連続する１５塩基ないし
１９塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
であり、特に、配列番号２に示される、１７塩基から成
る塩基配列を有するものが好ましい。なお、配列番号２
で示される塩基配列は、ＨＣＶゲノムの第１３０番目の
ヌクレオチド（以下、「１３０ｎｔ」のように記載）〜
１４６ｎｔに相当するものである。なお、ＨＣＶゲノム
の全塩基配列は公知であり、Kato N. et al., Proc. Na
tl. Acad. Sci.USA 1990; 87:9524-9528に記載されてい
る。
ライマーは、配列番号１に示される第９番目から第２９
番目の塩基から成る配列のうち連続する１５塩基ないし
１９塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
であり、特に、配列番号２に示される、１７塩基から成
る塩基配列を有するものが好ましい。なお、配列番号２
で示される塩基配列は、ＨＣＶゲノムの第１３０番目の
ヌクレオチド（以下、「１３０ｎｔ」のように記載）〜
１４６ｎｔに相当するものである。なお、ＨＣＶゲノム
の全塩基配列は公知であり、Kato N. et al., Proc. Na
tl. Acad. Sci.USA 1990; 87:9524-9528に記載されてい
る。
【０００８】本発明の方法に用いられるリバース側プラ
イマーは、配列番号３に示される第９番目から第３１番
目の塩基から成る配列のうち連続する１７塩基ないし２
１塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで
あり、特に、配列番号４に示される、１９塩基から成る
塩基配列を有するものが好ましい。なお、配列番号４で
示される塩基配列は、ＨＣＶゲノムの２７２〜２９０ｎ
ｔにハイブリダイズするものである。
イマーは、配列番号３に示される第９番目から第３１番
目の塩基から成る配列のうち連続する１７塩基ないし２
１塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで
あり、特に、配列番号４に示される、１９塩基から成る
塩基配列を有するものが好ましい。なお、配列番号４で
示される塩基配列は、ＨＣＶゲノムの２７２〜２９０ｎ
ｔにハイブリダイズするものである。
【０００９】本発明の方法に用いられるプローブは、オ
リゴヌクレオチドに後述するレポーター蛍光色素とクエ
ンチャー蛍光色素が結合したものである。該オリゴヌク
レオチドは、配列番号５に示される第９番目から第３３
番目の塩基から成る配列のうち連続する１９塩基ないし
２３塩基から成る塩基配列を有するものであり、特に、
配列番号６で示される２１塩基から成るものが好まし
い。なお、配列番号６で示される塩基配列はＨＣＶゲノ
ムの１４８ｎｔ〜１６８ｎｔに相当するものである。な
お、プローブのオリゴヌクレオチド部分がハイブリダイ
ズするＨＣＶ遺伝子の領域は、上記フォワード側プライ
マーがハイブリダイズする領域と近接して一部重複して
いるが、実際に反応を行なう場合には、フォワード側プ
ライマーとプローブのハイブリダイズする領域が互いに
重複することがない組み合わせを選択する必要がある。
リゴヌクレオチドに後述するレポーター蛍光色素とクエ
ンチャー蛍光色素が結合したものである。該オリゴヌク
レオチドは、配列番号５に示される第９番目から第３３
番目の塩基から成る配列のうち連続する１９塩基ないし
２３塩基から成る塩基配列を有するものであり、特に、
配列番号６で示される２１塩基から成るものが好まし
い。なお、配列番号６で示される塩基配列はＨＣＶゲノ
ムの１４８ｎｔ〜１６８ｎｔに相当するものである。な
お、プローブのオリゴヌクレオチド部分がハイブリダイ
ズするＨＣＶ遺伝子の領域は、上記フォワード側プライ
マーがハイブリダイズする領域と近接して一部重複して
いるが、実際に反応を行なう場合には、フォワード側プ
ライマーとプローブのハイブリダイズする領域が互いに
重複することがない組み合わせを選択する必要がある。
【００１０】前記レポーター蛍光色素は、該レポーター
蛍光色素が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブ
に結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によ
りその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光色素
と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度
が抑制されないものである。レポーター蛍光色素として
は、ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレッセイン）のよ
うなフルオレッセイン系蛍光色素が好ましく、クエンチ
ャー蛍光色素としては、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−
テトラメチル−ローダミン）のようなローダミン系蛍光
色素が好ましい。これらの蛍光色素は公知であり、市販
のリアルタイム検出ＰＣＲ用キットに含まれているので
それを用いることができる。レポーター蛍光色素及びク
エンチャー蛍光色素の結合位置は特に限定されないが、
通常、プローブのオリゴヌクレオチド部の一端（好まし
くは５’末端）にレポーター蛍光色素が、他端にクエン
チャー蛍光色素が結合される。なお、オリゴヌクレオチ
ドに蛍光色素を結合する方法は公知であり、例えばNobl
e et al., (1984) Nuc. Acids Res. 12:3387-3403及びI
yer et al., (1990) J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254
に記載されている。
蛍光色素が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブ
に結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によ
りその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光色素
と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度
が抑制されないものである。レポーター蛍光色素として
は、ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレッセイン）のよ
うなフルオレッセイン系蛍光色素が好ましく、クエンチ
ャー蛍光色素としては、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−
テトラメチル−ローダミン）のようなローダミン系蛍光
色素が好ましい。これらの蛍光色素は公知であり、市販
のリアルタイム検出ＰＣＲ用キットに含まれているので
それを用いることができる。レポーター蛍光色素及びク
エンチャー蛍光色素の結合位置は特に限定されないが、
通常、プローブのオリゴヌクレオチド部の一端（好まし
くは５’末端）にレポーター蛍光色素が、他端にクエン
チャー蛍光色素が結合される。なお、オリゴヌクレオチ
ドに蛍光色素を結合する方法は公知であり、例えばNobl
e et al., (1984) Nuc. Acids Res. 12:3387-3403及びI
yer et al., (1990) J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254
に記載されている。
【００１１】本発明の方法では、上記本発明のフォワー
ド側プライマーと、上記本発明のリバース側プライマー
と、上記本発明のプローブとを用い、被検試料中の測定
すべきＨＣＶ遺伝子を鋳型として逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−
ＰＣＲ）を行ない、反応液からの蛍光をリアルタイムに
測定する。このリアルタイム検出ＰＣＲ法自体は公知で
あり、そのための装置及びキットも市販されているの
で、このような市販の装置及びキットを用いて行なうこ
とができる。
ド側プライマーと、上記本発明のリバース側プライマー
と、上記本発明のプローブとを用い、被検試料中の測定
すべきＨＣＶ遺伝子を鋳型として逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−
ＰＣＲ）を行ない、反応液からの蛍光をリアルタイムに
測定する。このリアルタイム検出ＰＣＲ法自体は公知で
あり、そのための装置及びキットも市販されているの
で、このような市販の装置及びキットを用いて行なうこ
とができる。
【００１２】反応は、被検ＨＣＶのＲＮＡ、上記フォワ
ード側プライマー、リバース側プライマー及び上記プロ
ーブ並びに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素活性
をも有するもの）、dATP, dGTP, dCTP, dTTPを含む溶液
を調製して行なう。dTTPに代えて、dUTPを用い、ウラシ
ル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）を加えることによ
り、前回のＰＣＲ産物からの混入ＤＮＡを分解すること
ができるので好ましい。反応の具体的な条件は下記実施
例に詳述されている。なお、被検試料としては、ＨＣＶ
を含有する疑いのあるいずれのものであってもよく、例
えば血清等の体液である。ＨＣＶのＲＮＡの調製は、従
来のＲＴ−ＰＣＲの場合と同様に行なうことができ、下
記実施例にも具体的に記載されている。
ード側プライマー、リバース側プライマー及び上記プロ
ーブ並びに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素活性
をも有するもの）、dATP, dGTP, dCTP, dTTPを含む溶液
を調製して行なう。dTTPに代えて、dUTPを用い、ウラシ
ル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）を加えることによ
り、前回のＰＣＲ産物からの混入ＤＮＡを分解すること
ができるので好ましい。反応の具体的な条件は下記実施
例に詳述されている。なお、被検試料としては、ＨＣＶ
を含有する疑いのあるいずれのものであってもよく、例
えば血清等の体液である。ＨＣＶのＲＮＡの調製は、従
来のＲＴ−ＰＣＲの場合と同様に行なうことができ、下
記実施例にも具体的に記載されている。
【００１３】反応では、まず、ＨＣＶのＲＮＡを鋳型と
してｃＤＮＡが合成され、次いで、このｃＤＮＡを鋳型
としてＰＣＲによりＤＮＡの増幅が起きる。増幅ＤＮＡ
は、上記プローブと相補的な領域を含んでいるので、プ
ローブは一本鎖状態の増幅ＤＮＡにハイブリダイズす
る。プローブが完全にハイブリダイズした状態で、プロ
ーブがハイブリダイズしている一本鎖ＤＮＡを鋳型とす
る伸長が起きると、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレ
アーゼ活性によりプローブが５’末端側から加水分解さ
れる。この分解の結果、プローブのオリゴヌクレオチド
部分に結合されているレポーター蛍光色素とクエンチャ
ー蛍光色素とがバラバラになり、クエンチャー蛍光色素
に起因する蛍光共鳴エネルギー転移により抑制されてい
たレポーター蛍光色素からの蛍光強度が増加する。一
方、被検試料中にＨＣＶのＲＮＡが存在しない場合に
は、ＤＮＡの増幅が起きないので、プローブはＤＮＡに
ハイブリダイズせず、従ってＤＮＡポリメラーゼによっ
て加水分解されることもない。このため、レポーター蛍
光色素からの蛍光は、クエンチャー蛍光色素により抑制
されたままであり、蛍光強度は増加しない。従って、蛍
光強度を測定することにより、被検試料中にＨＣＶのＲ
ＮＡを検出することが可能である。
してｃＤＮＡが合成され、次いで、このｃＤＮＡを鋳型
としてＰＣＲによりＤＮＡの増幅が起きる。増幅ＤＮＡ
は、上記プローブと相補的な領域を含んでいるので、プ
ローブは一本鎖状態の増幅ＤＮＡにハイブリダイズす
る。プローブが完全にハイブリダイズした状態で、プロ
ーブがハイブリダイズしている一本鎖ＤＮＡを鋳型とす
る伸長が起きると、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレ
アーゼ活性によりプローブが５’末端側から加水分解さ
れる。この分解の結果、プローブのオリゴヌクレオチド
部分に結合されているレポーター蛍光色素とクエンチャ
ー蛍光色素とがバラバラになり、クエンチャー蛍光色素
に起因する蛍光共鳴エネルギー転移により抑制されてい
たレポーター蛍光色素からの蛍光強度が増加する。一
方、被検試料中にＨＣＶのＲＮＡが存在しない場合に
は、ＤＮＡの増幅が起きないので、プローブはＤＮＡに
ハイブリダイズせず、従ってＤＮＡポリメラーゼによっ
て加水分解されることもない。このため、レポーター蛍
光色素からの蛍光は、クエンチャー蛍光色素により抑制
されたままであり、蛍光強度は増加しない。従って、蛍
光強度を測定することにより、被検試料中にＨＣＶのＲ
ＮＡを検出することが可能である。
【００１４】本発明の方法では、蛍光強度をリアルタイ
ムに測定する。すなわち、蛍光強度を測定しながらＰＣ
Ｒ反応を行なう。測定される蛍光強度は、あるサイクル
数を過ぎると検出限界を超え、急激に増加する。そし
て、被検試料中のＨＣＶＲＮＡの量が多いほど、少ない
サイクル数で蛍光強度が急に増加する。従って、何サイ
クルを過ぎた時に蛍光強度の急激な増加が始まるかを調
べることにより、被検試料中のＨＣＶＲＮＡの定量測定
を行なうことができる。より具体的には、例えば、ＨＣ
ＶＲＮＡを含まないネガティブコントロールにおける各
サイクル（例えば３〜１５サイクル）の蛍光強度の標準
偏差の１０倍を閾値として設定し、蛍光強度がこの閾値
を超えるサイクル数を調べることにより、正確に被検試
料中のＨＣＶＲＮＡを定量測定することができる。すな
わち、被検試料中のＨＣＶのＲＮＡ数の常用対数を横軸
に、上記閾値を超えた時のサイクル数を縦軸にとると、
測定結果はほぼ完全に直線上にのるので、検量線を作成
しておけば、何サイクルで閾値を超えるかを調べること
により被検試料中のＨＣＶＲＮＡの量を定量測定するこ
とができる。従って、本発明の方法によれば、従来のＲ
Ｔ−ＰＣＲのように、ＰＣＲ後に電気泳動を行なって増
幅を調べる操作が不要であり、非常に簡便である。
ムに測定する。すなわち、蛍光強度を測定しながらＰＣ
Ｒ反応を行なう。測定される蛍光強度は、あるサイクル
数を過ぎると検出限界を超え、急激に増加する。そし
て、被検試料中のＨＣＶＲＮＡの量が多いほど、少ない
サイクル数で蛍光強度が急に増加する。従って、何サイ
クルを過ぎた時に蛍光強度の急激な増加が始まるかを調
べることにより、被検試料中のＨＣＶＲＮＡの定量測定
を行なうことができる。より具体的には、例えば、ＨＣ
ＶＲＮＡを含まないネガティブコントロールにおける各
サイクル（例えば３〜１５サイクル）の蛍光強度の標準
偏差の１０倍を閾値として設定し、蛍光強度がこの閾値
を超えるサイクル数を調べることにより、正確に被検試
料中のＨＣＶＲＮＡを定量測定することができる。すな
わち、被検試料中のＨＣＶのＲＮＡ数の常用対数を横軸
に、上記閾値を超えた時のサイクル数を縦軸にとると、
測定結果はほぼ完全に直線上にのるので、検量線を作成
しておけば、何サイクルで閾値を超えるかを調べること
により被検試料中のＨＣＶＲＮＡの量を定量測定するこ
とができる。従って、本発明の方法によれば、従来のＲ
Ｔ−ＰＣＲのように、ＰＣＲ後に電気泳動を行なって増
幅を調べる操作が不要であり、非常に簡便である。
【００１５】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【００１６】実施例１ (1) プライマーの合成 配列番号２に示される１７塩基から成る塩基配列を有す
る１７ｍｅｒのオリゴＤＮＡを化学合成し、フォワード
側プライマーとした。また、配列番号４に示される１９
塩基から成る塩基配列を有する１９ｍｅｒのオリゴＤＮ
Ａを化学合成し、リバース側プライマーとした。
る１７ｍｅｒのオリゴＤＮＡを化学合成し、フォワード
側プライマーとした。また、配列番号４に示される１９
塩基から成る塩基配列を有する１９ｍｅｒのオリゴＤＮ
Ａを化学合成し、リバース側プライマーとした。
【００１７】(2) プローブの調製 配列番号６に示される２１塩基から成る塩基配列を有す
る２１ｍｅｒのオリゴＤＮＡを化学合成した。このオリ
ゴＤＮＡの５’末端にＦＡＭを、３’末端にＴＡＭＲＡ
を上記文献記載の方法により結合し、プローブとした。
る２１ｍｅｒのオリゴＤＮＡを化学合成した。このオリ
ゴＤＮＡの５’末端にＦＡＭを、３’末端にＴＡＭＲＡ
を上記文献記載の方法により結合し、プローブとした。
【００１８】(3) 合成ＲＮＡの調製 ＨＣＶ遺伝子の５’側領域を含むプラスミドであるpCII
5(J. Virol. Vol. 66,p.1476-1483, 1992) を鋳型とし
てＴ７ポリメラーゼにより１７６２塩基のＲＮＡを合成
し、5.04 x 108から5.04 x 100コピー／μｌまで１０倍
希釈系列を作製した。
5(J. Virol. Vol. 66,p.1476-1483, 1992) を鋳型とし
てＴ７ポリメラーゼにより１７６２塩基のＲＮＡを合成
し、5.04 x 108から5.04 x 100コピー／μｌまで１０倍
希釈系列を作製した。
【００１９】(4) 反応液の調製 上記プライマー、プローブ及びPerkin Elmer TaqMan EZ
RT-PCR Core Kit（商品名、Perkin Elmer社製）を用い
て、反応チューブ１本あたり、下記表１に示す反応液を
調製した。
RT-PCR Core Kit（商品名、Perkin Elmer社製）を用い
て、反応チューブ１本あたり、下記表１に示す反応液を
調製した。
【００２０】
【表１】
【００２１】(5) リアルタイム検出ＰＣＲ Perkin Elmer MicroAmp Optical Tube（商品名、Perkin
Elmer社製）１本あたり、上記反応液を４８μｌ加え、
そこに上記被検血清由来ＲＮＡ溶液２μｌを添加した。
キャップ（Perkin Elmer Optical Cap) をした後、ABI
PRISM 7700 Sequence Detection System（商品名、Perk
in Elmer社製）にセットし、以下の条件で反応を行なっ
た。ＰＣＲの各サイクル毎に蛍光強度を測定しデータを
収集した。 混入ＤＮＡのＵＮＧによる分解反応 ５０℃、２分間 逆転写工程 ６０℃、３０分間 ＵＮＧの失活 ９５℃、５分間 ＰＣＲ ９５℃、２０秒間 ６２℃、１分間 このＰＣＲサイクルは５３回繰り返した。
Elmer社製）１本あたり、上記反応液を４８μｌ加え、
そこに上記被検血清由来ＲＮＡ溶液２μｌを添加した。
キャップ（Perkin Elmer Optical Cap) をした後、ABI
PRISM 7700 Sequence Detection System（商品名、Perk
in Elmer社製）にセットし、以下の条件で反応を行なっ
た。ＰＣＲの各サイクル毎に蛍光強度を測定しデータを
収集した。 混入ＤＮＡのＵＮＧによる分解反応 ５０℃、２分間 逆転写工程 ６０℃、３０分間 ＵＮＧの失活 ９５℃、５分間 ＰＣＲ ９５℃、２０秒間 ６２℃、１分間 このＰＣＲサイクルは５３回繰り返した。
【００２２】(6) 結果 サイクル数を横軸に、蛍光強度の変化を縦軸にとってプ
ロットした結果を図１に示す。図１中、各線の近傍に
は、試料中のＨＣＶのＲＮＡのコピー数（試料は上記の
ように２μｌ用いたので、上記濃度（コピー／μｌ）の
２倍）の指数部分を示す。図１より、それぞれの被検試
料について、ある一定のサイクル数を過ぎるまでは蛍光
強度に変化は見られないが、あるサイクル数を過ぎると
蛍光強度が急に増加することがわかる。そして、この蛍
光強度の急激な増加が始まるサイクル数は被検試料中の
ＨＣＶのＲＮＡコピー数が大きいほど小さいことがわか
る。また、上記リアルタイムＰＣＲにおいて、ＨＣＶの
ＲＮＡを含まない試料について行なったネガティブコン
トロールの３〜１５サイクルにおける蛍光強度の標準偏
差の１０倍を閾値とし、この閾値を超えたサイクル数
（すなわち、蛍光強度が急激に増加し始めた時のサイク
ル数）を求めた。ＲＮＡコピー数の常用対数を横軸に、
上記閾値を超えたサイクル数を縦軸にとってプロットし
た図を図２に示す。図２に示すように、ＲＮＡコピー数
の常用対数と上記閾値を超えたサイクル数との間には直
線関係があり（相関係数0.990)、上記サイクル数を測定
することにより被検試料中のＨＣＶのＲＮＡを定量測定
できることが明らかになった。
ロットした結果を図１に示す。図１中、各線の近傍に
は、試料中のＨＣＶのＲＮＡのコピー数（試料は上記の
ように２μｌ用いたので、上記濃度（コピー／μｌ）の
２倍）の指数部分を示す。図１より、それぞれの被検試
料について、ある一定のサイクル数を過ぎるまでは蛍光
強度に変化は見られないが、あるサイクル数を過ぎると
蛍光強度が急に増加することがわかる。そして、この蛍
光強度の急激な増加が始まるサイクル数は被検試料中の
ＨＣＶのＲＮＡコピー数が大きいほど小さいことがわか
る。また、上記リアルタイムＰＣＲにおいて、ＨＣＶの
ＲＮＡを含まない試料について行なったネガティブコン
トロールの３〜１５サイクルにおける蛍光強度の標準偏
差の１０倍を閾値とし、この閾値を超えたサイクル数
（すなわち、蛍光強度が急激に増加し始めた時のサイク
ル数）を求めた。ＲＮＡコピー数の常用対数を横軸に、
上記閾値を超えたサイクル数を縦軸にとってプロットし
た図を図２に示す。図２に示すように、ＲＮＡコピー数
の常用対数と上記閾値を超えたサイクル数との間には直
線関係があり（相関係数0.990)、上記サイクル数を測定
することにより被検試料中のＨＣＶのＲＮＡを定量測定
できることが明らかになった。
【００２３】実施例２ (1) 被検ＨＣＶＲＮＡの調製 Ｃ型肝炎患者の血清各２００μｌに、SepaGene RV-R(商
品名、三光純薬社製核酸抽出用試薬）１液（蛋白質変性
液）３００μｌ、２液（緩衝液）３００μｌを加え撹拌
し、３液（抽出剤）６００μｌを加え１０分間撹拌後−
２０℃で１０分間静置した。12000 x g で１５分間遠心
し、水相に等量のイソプロパノールを加え、４℃で５分
間静置後、12000 x g で２０分間遠心した。次いで、１
ｍｌの７５％エタノールで２回洗浄し、２０μｌのDTT
、RNase 阻害剤加ＤＥＰＣ処理水で溶解し、測定まで
−８０℃で保存した。
品名、三光純薬社製核酸抽出用試薬）１液（蛋白質変性
液）３００μｌ、２液（緩衝液）３００μｌを加え撹拌
し、３液（抽出剤）６００μｌを加え１０分間撹拌後−
２０℃で１０分間静置した。12000 x g で１５分間遠心
し、水相に等量のイソプロパノールを加え、４℃で５分
間静置後、12000 x g で２０分間遠心した。次いで、１
ｍｌの７５％エタノールで２回洗浄し、２０μｌのDTT
、RNase 阻害剤加ＤＥＰＣ処理水で溶解し、測定まで
−８０℃で保存した。
【００２４】実施例１と同じプローブ、プライマーを用
い、実施例１と同じ組成の反応液を調製した。Perkin E
lmer MicroAmp Optical tube１本あたり、この反応液を
45.5μｌ加え、そこに上記被検血清由来ＲＮＡ溶液4.5
μｌを加え、実施例１と同様に反応を行ない、各サイク
ル毎に蛍光を測定した。一方、従来の競合的ＲＴ−ＰＣ
Ｒ法（向出他、「検査と技術」1997, Vol.25, No.6, 51
3-519)により、同じ被検試料についてＨＣＶＲＮＡのコ
ピー数を測定した。両法による測定値の相関関係を図３
に示す。なお、図３中、１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、１ｂ
＋２ａは、各検体中のＨＣＶのジェノタイプを示し、ｎ
は検体数を示す。
い、実施例１と同じ組成の反応液を調製した。Perkin E
lmer MicroAmp Optical tube１本あたり、この反応液を
45.5μｌ加え、そこに上記被検血清由来ＲＮＡ溶液4.5
μｌを加え、実施例１と同様に反応を行ない、各サイク
ル毎に蛍光を測定した。一方、従来の競合的ＲＴ−ＰＣ
Ｒ法（向出他、「検査と技術」1997, Vol.25, No.6, 51
3-519)により、同じ被検試料についてＨＣＶＲＮＡのコ
ピー数を測定した。両法による測定値の相関関係を図３
に示す。なお、図３中、１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、１ｂ
＋２ａは、各検体中のＨＣＶのジェノタイプを示し、ｎ
は検体数を示す。
【００２５】図３に示されるように、本発明の方法によ
る測定結果は従来法で得られた成績とよく相関し、高感
度に測定できることが明かとなった。
る測定結果は従来法で得られた成績とよく相関し、高感
度に測定できることが明かとなった。
【００２６】
【発明の効果】本発明により、ＨＣＶを高感度で正確
に、かつ、簡便に測定することが可能になった。
に、かつ、簡便に測定することが可能になった。
【００２７】
配列番号：１ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 配列 CCCCCCCTCC CGGGAGAGCC ATAGTGGTCT GCGGAAC 37
【００２８】配列番号：２ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 配列 CGGGAGAGCC ATAGTGG 17
【００２９】配列番号：３ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 配列 CCTATCAGGC AGTACCACAA GGCCTTTCGC GACCCAACA 39
【００３０】配列番号：４ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 配列 AGTACCACAA GGCCTTTCG 19
【００３１】配列番号：５ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 配列 CCATAGTGGT CTGCGGAACC GGTGAGTACA CCGGAATTGC C 41
【００３２】配列番号：６ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 配列 CTGCGGAACC GGTGAGTACA C 21
【図１】本発明の方法により、各種被検試料中のＨＣＶ
のＲＮＡを測定した場合の、ＰＣＲのサイクル数と蛍光
強度の変化の関係を示す図である。
のＲＮＡを測定した場合の、ＰＣＲのサイクル数と蛍光
強度の変化の関係を示す図である。
【図２】各種被検試料についてＨＣＶのＲＮＡのコピー
数の常用対数と、本発明の方法により被検試料中のＨＣ
ＶのＲＮＡを測定した場合における、蛍光強度の変化が
閾値を超えたサイクル数との関係を示す図である。
数の常用対数と、本発明の方法により被検試料中のＨＣ
ＶのＲＮＡを測定した場合における、蛍光強度の変化が
閾値を超えたサイクル数との関係を示す図である。
【図３】本発明の方法及び従来の競合的ＲＴ−ＰＣＲ法
により測定したＨＣＶのＲＮＡのコピー数の相関関係を
示す図である。
により測定したＨＣＶのＲＮＡのコピー数の相関関係を
示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 阿部 亜紀 東京都八王子市小宮町51 株式会社エス アールエル八王子ラボラトリー内 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/70 C12N 15/09 ZNA ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (5)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１で示される塩基配列
の第９番目から第２９番目の塩基から成る配列のうち連
続する１５塩基ないし１９塩基から成る塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドから成るフォワード側プライマー
と、配列表の配列番号３で示される塩基配列の第９番目
から第３１番目の塩基から成る配列のうち連続する１７
塩基ないし２１塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチドから成るリバース側プライマーと、配列表の
配列番号５で示される塩基配列の第９番目から第３３番
目の塩基から成る配列のうち連続する１９塩基ないし２
３塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
に、レポーター蛍光色素と、クエンチャー蛍光色素とが
結合されており、前記レポーター蛍光色素は、該レポー
ター蛍光色素が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプロ
ーブに結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移
によりその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光
色素と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光
強度が抑制されないものであるプローブとを用い、被検
試料中の測定すべきＨＣＶ遺伝子を鋳型として逆転写Ｐ
ＣＲを行ない、反応液からの蛍光をリアルタイムに測定
することから成る、被検試料中のＨＣＶ遺伝子の測定方
法。 - 【請求項２】 前記フォワード側プライマーを構成する
オリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２で示される
塩基配列を有する１７塩基から成る請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】 前記リバース側プライマーを構成するオ
リゴヌクレオチドは、配列表の配列番号４で示される塩
基配列を有する１９塩基から成る請求項１又は２記載の
方法。 - 【請求項４】 前記プローブを構成するオリゴヌクレオ
チドは、配列表の配列番号６で示される塩基配列を有す
る２１塩基から成る請求項１ないし３のいずれか１項に
記載の方法。 - 【請求項５】 前記レポーター蛍光色素はフルオレッセ
イン系蛍光色素であり、前記クエンチャー蛍光色素はロ
ーダミン系蛍光色素である請求項１ないし４のいずれか
１項に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28304297A JP3174751B2 (ja) | 1997-09-30 | 1997-09-30 | リアルタイム検出ｐｃｒ法によるｈｃｖ遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28304297A JP3174751B2 (ja) | 1997-09-30 | 1997-09-30 | リアルタイム検出ｐｃｒ法によるｈｃｖ遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11103899A JPH11103899A (ja) | 1999-04-20 |
| JP3174751B2 true JP3174751B2 (ja) | 2001-06-11 |
Family
ID=17660467
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28304297A Expired - Lifetime JP3174751B2 (ja) | 1997-09-30 | 1997-09-30 | リアルタイム検出ｐｃｒ法によるｈｃｖ遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3174751B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001046469A1 (fr) * | 1999-12-22 | 2001-06-28 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Procede d'etude du genotype du virus de l'hepatite c |
| US6946245B2 (en) * | 2001-12-04 | 2005-09-20 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Oligonucleotides and methods for detecting hepatitis C viral nucleic acids |
| US6635428B2 (en) | 2001-12-04 | 2003-10-21 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Oligonucleotides and methods for detecting hepatitis B viral nucleic acids |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04262784A (ja) * | 1991-02-14 | 1992-09-18 | Shionogi & Co Ltd | Ｃ型肝炎ウイルスのｃＤＮＡ配列および検出方法 |
| US5210015A (en) * | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
| JP3349731B2 (ja) * | 1992-10-13 | 2002-11-25 | 中外製薬株式会社 | Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子の検出方法 |
| JPH06153961A (ja) * | 1992-11-27 | 1994-06-03 | Imuno Japan:Kk | Ｃ型肝炎ウイルス部分遺伝子、ならびにｃ型肝炎ウイルス遺 伝子の高感度検出法 |
-
1997
- 1997-09-30 JP JP28304297A patent/JP3174751B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH11103899A (ja) | 1999-04-20 |
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