JPH06153961A - Ｃ型肝炎ウイルス部分遺伝子、ならびにｃ型肝炎ウイルス遺 伝子の高感度検出法 - Google Patents
Ｃ型肝炎ウイルス部分遺伝子、ならびにｃ型肝炎ウイルス遺 伝子の高感度検出法Info
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- JPH06153961A JPH06153961A JP4354370A JP35437092A JPH06153961A JP H06153961 A JPH06153961 A JP H06153961A JP 4354370 A JP4354370 A JP 4354370A JP 35437092 A JP35437092 A JP 35437092A JP H06153961 A JPH06153961 A JP H06153961A
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- polynucleotide
- virus
- seq
- hepatitis
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
- C12Q1/707—Specific hybridization probes for hepatitis non-A, non-B Hepatitis, excluding hepatitis D
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を高感度に特
異的に検出することを目的とする。 【構成】 ＨＣＶの５′−ＮＣ領域および／またはこ
れに続く一部の構造蛋白質コード領域を構成する部分遺
伝子、特異的ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチ
ド、また、該オリゴヌクレオチドからなるプライマー、
プローブ並びにこれらを用いるＨＣＶの高感度検出法の
発明である。
異的に検出することを目的とする。 【構成】 ＨＣＶの５′−ＮＣ領域および／またはこ
れに続く一部の構造蛋白質コード領域を構成する部分遺
伝子、特異的ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチ
ド、また、該オリゴヌクレオチドからなるプライマー、
プローブ並びにこれらを用いるＨＣＶの高感度検出法の
発明である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（以
下「ＨＣＶ」と略記する）の部分遺伝子、これを構成す
る特異的オリゴヌクレオチド、ならびにこれらを用いる
ＨＣＶ遺伝子の高感度検出法に関する。
下「ＨＣＶ」と略記する）の部分遺伝子、これを構成す
る特異的オリゴヌクレオチド、ならびにこれらを用いる
ＨＣＶ遺伝子の高感度検出法に関する。
【０００２】
【従来の技術】１９８８年カイロン社によって、ＨＣＶ
遺伝子の一部塩基配列が発表され以来、この配列をもと
に作製された遺伝子組替え対抗原、または合成ペプチド
抗原を用いた抗体測定系が開発され、現在では輸血の血
液スクリーニングや患者の診断に実用化されている。し
かしながら、抗体検査だけではＨＣＶ感染例を完全に検
出することができない。また急性期や慢性期等の臨床経
過の判断や治療方針の確立、治療効果の判定にも不十分
であった。このため、抗体検査以外の方法でＨＣＶ感染
を正確に、そして高感度に検出する診断法が探求され、
ＨＣＶ遺伝子を検出する方法が幾つか発表されている。
ＨＣＶは非常に変異に富むウイルスであることから、こ
れらの遺伝子検出法はいずれも、これまでに解明されて
いるＨＣＶ株間の配列に共通して保存されている領域を
検出することによって、特異的にＨＣＶ遺伝子の存在を
判定することを意図している。しかし、これらのＨＣＶ
遺伝子検出法は、抗体検査法に比べて臨床経過や治療判
定について有用な情報をもたらす利点があるものの、他
方、遺伝子が検出されないＨＣＶ感染例もあることが報
告されており、その特異性ならびに感度の面で未だ十分
とは言えない。したがって、更に広範囲のＨＣＶ株の遺
伝子を検出できる方法の確立が望まれていた。
遺伝子の一部塩基配列が発表され以来、この配列をもと
に作製された遺伝子組替え対抗原、または合成ペプチド
抗原を用いた抗体測定系が開発され、現在では輸血の血
液スクリーニングや患者の診断に実用化されている。し
かしながら、抗体検査だけではＨＣＶ感染例を完全に検
出することができない。また急性期や慢性期等の臨床経
過の判断や治療方針の確立、治療効果の判定にも不十分
であった。このため、抗体検査以外の方法でＨＣＶ感染
を正確に、そして高感度に検出する診断法が探求され、
ＨＣＶ遺伝子を検出する方法が幾つか発表されている。
ＨＣＶは非常に変異に富むウイルスであることから、こ
れらの遺伝子検出法はいずれも、これまでに解明されて
いるＨＣＶ株間の配列に共通して保存されている領域を
検出することによって、特異的にＨＣＶ遺伝子の存在を
判定することを意図している。しかし、これらのＨＣＶ
遺伝子検出法は、抗体検査法に比べて臨床経過や治療判
定について有用な情報をもたらす利点があるものの、他
方、遺伝子が検出されないＨＣＶ感染例もあることが報
告されており、その特異性ならびに感度の面で未だ十分
とは言えない。したがって、更に広範囲のＨＣＶ株の遺
伝子を検出できる方法の確立が望まれていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、これまでの
ＨＣＶ遺伝子検出法では検出できなかったＨＣＶ株の
５′非翻訳領域（以下「５ＮＣ領域」という）、ならび
にそれに続く構造蛋白質コード領域の塩基配列を解明
し、その一部を構成するオリゴヌクレオチドを得るこ
と、ならびにこれらをプライマーまたはプローブとして
用いることによって、広範囲のＨＣＶを遺伝子レベルに
おいて高感度に特異的に検出する方法を提供しようとす
るのである。
ＨＣＶ遺伝子検出法では検出できなかったＨＣＶ株の
５′非翻訳領域（以下「５ＮＣ領域」という）、ならび
にそれに続く構造蛋白質コード領域の塩基配列を解明
し、その一部を構成するオリゴヌクレオチドを得るこ
と、ならびにこれらをプライマーまたはプローブとして
用いることによって、広範囲のＨＣＶを遺伝子レベルに
おいて高感度に特異的に検出する方法を提供しようとす
るのである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、従来のＨ
ＣＶ遺伝子検出法（ポリメラーゼチェインリアクション
法、ＰＣＲ法。Ｊｐｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６０：１
６７−１７７，１９９０）によって検出することができ
る十分量のＨＣＶ−ＲＮＡが存在するにもかかわらず、
従来のコア領域を用いた遺伝子型判定法（Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｖｉｒｏｌ．７３：６７３−６７９，１９９２）によっ
ては遺伝子型を特定することができなかった検体につい
て、非構造５′領域（以下「ＮＳ５領域」という）の塩
基配列を決定した。その結果、これらの検体のＨＣＶ
は、従来報告されている（文献上記）Ｉ〜ＩＶ型のいず
れでもなく、暫定的にＶ型またはＶＩ型と云われる遺伝
型に最も相同性が高いことを見い出した。ついで、これ
ら検対について５′−ＮＣ領域ならびにそれに続く一部
の構造蛋白質コード領域の配列、すなわち５′末端より
４５番目から８４７番目までの塩基配列（８０３塩基
長）を決定した。その結果、この領域は非常によく保存
されていることが見い出された。他方、従来から知られ
ている各遺伝子型においては塩基配列が共通に保存さ
れ、したがって遺伝子増幅のプライマーとして最適と考
えられていた領域には、逆に変異があることも新たに見
い出された。これらの知見から、公知のＩ〜ＩＶ型ＨＣ
Ｖウイルスにも共通であるとともに、暫定的にＶ〜ＶＩ
型と命名されたＨＣＶウイルスにも共通なプライマーを
使用すれば、広範囲のＨＣＶウイルス株を極めて高感度
に、かつ特異的に検出できることを見い出し、本発明を
完成した。
ＣＶ遺伝子検出法（ポリメラーゼチェインリアクション
法、ＰＣＲ法。Ｊｐｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６０：１
６７−１７７，１９９０）によって検出することができ
る十分量のＨＣＶ−ＲＮＡが存在するにもかかわらず、
従来のコア領域を用いた遺伝子型判定法（Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｖｉｒｏｌ．７３：６７３−６７９，１９９２）によっ
ては遺伝子型を特定することができなかった検体につい
て、非構造５′領域（以下「ＮＳ５領域」という）の塩
基配列を決定した。その結果、これらの検体のＨＣＶ
は、従来報告されている（文献上記）Ｉ〜ＩＶ型のいず
れでもなく、暫定的にＶ型またはＶＩ型と云われる遺伝
型に最も相同性が高いことを見い出した。ついで、これ
ら検対について５′−ＮＣ領域ならびにそれに続く一部
の構造蛋白質コード領域の配列、すなわち５′末端より
４５番目から８４７番目までの塩基配列（８０３塩基
長）を決定した。その結果、この領域は非常によく保存
されていることが見い出された。他方、従来から知られ
ている各遺伝子型においては塩基配列が共通に保存さ
れ、したがって遺伝子増幅のプライマーとして最適と考
えられていた領域には、逆に変異があることも新たに見
い出された。これらの知見から、公知のＩ〜ＩＶ型ＨＣ
Ｖウイルスにも共通であるとともに、暫定的にＶ〜ＶＩ
型と命名されたＨＣＶウイルスにも共通なプライマーを
使用すれば、広範囲のＨＣＶウイルス株を極めて高感度
に、かつ特異的に検出できることを見い出し、本発明を
完成した。
【０００５】すなわち、本発明はＨＣＶ−リボ核酸（Ｒ
ＮＡ）の５′末端の非翻訳領域および／または構造蛋白
質コード領域の５′端側部分領域の全部または一部を構
成し、またはこれらと相補的な塩基配列を有する特異的
ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの発明であ
り、配列番号１ないし７記載の塩基配列を有するポリヌ
クレオチドの全部または一部、またはこれらと相補的な
塩基配列を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレ
オチドの発明である。また、本発明は、上記オリゴヌク
レオチドからなるプライマーまたはプローブ、標識され
たプローブの発明であり、これらプライマー、あるいは
配列番号７ないし１０のプライマーまたはこれらプロー
ブを使用するＣ型肝炎ウイルスの高感度検出法の発明で
ある。
ＮＡ）の５′末端の非翻訳領域および／または構造蛋白
質コード領域の５′端側部分領域の全部または一部を構
成し、またはこれらと相補的な塩基配列を有する特異的
ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの発明であ
り、配列番号１ないし７記載の塩基配列を有するポリヌ
クレオチドの全部または一部、またはこれらと相補的な
塩基配列を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレ
オチドの発明である。また、本発明は、上記オリゴヌク
レオチドからなるプライマーまたはプローブ、標識され
たプローブの発明であり、これらプライマー、あるいは
配列番号７ないし１０のプライマーまたはこれらプロー
ブを使用するＣ型肝炎ウイルスの高感度検出法の発明で
ある。
【０００６】配列表において、配列番号１ないし６は各
々Ｍｉｔ／９２、Ｈｉｒ／９２、Ｔｈ−８５、ＮＺＬ−
１、ＵＳ−１１４、Ｔｈ−１０３各株の５′−ＮＣ領域
側４５番目から８４７番目まで８０３塩基長における塩
基配列を示す。
々Ｍｉｔ／９２、Ｈｉｒ／９２、Ｔｈ−８５、ＮＺＬ−
１、ＵＳ−１１４、Ｔｈ−１０３各株の５′−ＮＣ領域
側４５番目から８４７番目まで８０３塩基長における塩
基配列を示す。
【０００７】また、配列番号７ないし１０は、本発明者
らが上記の知見にもとづいて合成して得たものであり、
ＨＣＶにおける５′末端からの通算塩基番号は後記のと
おりである。
らが上記の知見にもとづいて合成して得たものであり、
ＨＣＶにおける５′末端からの通算塩基番号は後記のと
おりである。
【０００８】本発明者らは、上記各株の５′−ＮＣ領域
ならびにこれに続く構造蛋白質コード領域の上流領域の
塩基配列を解明した。その結果を既に本発明者らが解明
した遺伝子型Ｉ型〜ＩＶ型のＨＣＶ株の該領域と対比し
たところ、この領域が極めて保存性に富んでいることが
判明した。このことから、該領域がＨＣＶの各遺伝子型
に共通する塩基配列を有し、したがって、該領域のポリ
ヌクレオチドを利用して、Ｉ型〜ＩＶ型のみならず、Ｖ
型およびＩＶ型のＨＣＶをも検出可能なプライマーとし
て利用できるオリゴヌクレオチドを選別できることを見
い出した。また、上記プライマーを使用することによっ
て、ＨＣＶの遺伝子型に左右されることなく、各型のＨ
ＣＶの遺伝子を高感度に検出できる方法を発明したので
ある。本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオ
チドは、５′−ＮＣ領域およびこれに続く構造蛋白質コ
ード領域の一部を構成することを特徴とするものである
から、株間の差異に由来する若干の置換があっても本発
明に含まれる。
ならびにこれに続く構造蛋白質コード領域の上流領域の
塩基配列を解明した。その結果を既に本発明者らが解明
した遺伝子型Ｉ型〜ＩＶ型のＨＣＶ株の該領域と対比し
たところ、この領域が極めて保存性に富んでいることが
判明した。このことから、該領域がＨＣＶの各遺伝子型
に共通する塩基配列を有し、したがって、該領域のポリ
ヌクレオチドを利用して、Ｉ型〜ＩＶ型のみならず、Ｖ
型およびＩＶ型のＨＣＶをも検出可能なプライマーとし
て利用できるオリゴヌクレオチドを選別できることを見
い出した。また、上記プライマーを使用することによっ
て、ＨＣＶの遺伝子型に左右されることなく、各型のＨ
ＣＶの遺伝子を高感度に検出できる方法を発明したので
ある。本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオ
チドは、５′−ＮＣ領域およびこれに続く構造蛋白質コ
ード領域の一部を構成することを特徴とするものである
から、株間の差異に由来する若干の置換があっても本発
明に含まれる。
【０００９】本発明について、ＨＣＶの検出はオリゴヌ
クレオチドプライマーのペアーを用いて、相補的ＤＮＡ
（ｃＤＮＡ）を増幅させることにより行うことができ、
好適にはＰＣＲ法を利用することができる。好適な態様
としては、まず第１段階ＰＣＲにおいてｃＤＮＡを増幅
させた後、得られたＰＣＲ産物に対して更に第２段階Ｐ
ＣＲによる増幅を行う。第２段階ＰＣＲでは、第１段階
ＰＣＲに使用した１組のプライマーよりも内側にアニー
ルしうるもう１組のプライマーを用いる。
クレオチドプライマーのペアーを用いて、相補的ＤＮＡ
（ｃＤＮＡ）を増幅させることにより行うことができ、
好適にはＰＣＲ法を利用することができる。好適な態様
としては、まず第１段階ＰＣＲにおいてｃＤＮＡを増幅
させた後、得られたＰＣＲ産物に対して更に第２段階Ｐ
ＣＲによる増幅を行う。第２段階ＰＣＲでは、第１段階
ＰＣＲに使用した１組のプライマーよりも内側にアニー
ルしうるもう１組のプライマーを用いる。
【００１０】本発明のポリヌクレオチドまたはオリゴヌ
クレオチドは、ＨＣＶ−ＲＮＡゲノムの５′−ＮＣ領域
および／または構造蛋白質コード領域上流域の全部また
は一部に特異的なポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレ
オチドである。これらから選定されたオリゴヌクレオチ
ドは、プライマーまたはプローブとして使用することが
できる。
クレオチドは、ＨＣＶ−ＲＮＡゲノムの５′−ＮＣ領域
および／または構造蛋白質コード領域上流域の全部また
は一部に特異的なポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレ
オチドである。これらから選定されたオリゴヌクレオチ
ドは、プライマーまたはプローブとして使用することが
できる。
【００１１】本発明で使用する好適なプライマーとして
は、＃３２ａ（４５−６４）、＃３３（６３−８２）、
＃４８（１８８−２０７）、＃２９９（２５０−２６
９）があり、その塩基配列は配列番号７〜１０に記載さ
れている。（カッコ内は、ＨＣ−ＪＩ株の５′末端から
の通算塩基番号を示す）
は、＃３２ａ（４５−６４）、＃３３（６３−８２）、
＃４８（１８８−２０７）、＃２９９（２５０−２６
９）があり、その塩基配列は配列番号７〜１０に記載さ
れている。（カッコ内は、ＨＣ−ＪＩ株の５′末端から
の通算塩基番号を示す）
【００１２】本発明のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ以
外の方法によってもＨＣＶの検出に使用することができ
る。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドはプローブと
しても使用することができ、これを酵素、放射性、同位
元素、蛍光物質等により、標識して使用すれば一層効果
的である。
外の方法によってもＨＣＶの検出に使用することができ
る。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドはプローブと
しても使用することができ、これを酵素、放射性、同位
元素、蛍光物質等により、標識して使用すれば一層効果
的である。
【００１３】表１は各検対のＮＳ５領域３３７ｂｐ配列
と既報の各遺伝子型株の配列との相同性の比較を示す。
と既報の各遺伝子型株の配列との相同性の比較を示す。
【００１４】
【表１】
【００１５】表２はＨＣＶ遺伝子陽性供血者におけるＨ
ＣＶ関連マーカーを示す。
ＣＶ関連マーカーを示す。
【００１６】
【表２】
【００１７】表３は遺伝子型Ｉ〜ＩＶ型の各株につい
て、プライマー＃３６相当領域（５′端より塩基番号２
４６より２６５まで）の塩基配列を示す。配列はセンス
鎖側で記載
て、プライマー＃３６相当領域（５′端より塩基番号２
４６より２６５まで）の塩基配列を示す。配列はセンス
鎖側で記載
【００１８】
【表３】
【００１９】表４は遺伝子型Ｉ〜ＶＩ型の各株につい
て、プライマー＃２９９相当領域（５′端より塩基番号
２５０より２６９まで）の塩基配列を示す。配列はセン
ス鎖側で記載。
て、プライマー＃２９９相当領域（５′端より塩基番号
２５０より２６９まで）の塩基配列を示す。配列はセン
ス鎖側で記載。
【００２０】
【表４】
【００２１】
【作用】本発明の検出法は、Ｃ型肝炎ウイルスを高感度
に検出することができ、本発明のプライマーまたはプロ
ーブはＣ型肝炎ウイルスの高感度検出法に供することが
できる。また、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴ
ヌクレオチドは、これにもとづいて本発明のプライマー
またはプローブを得ることができる。
に検出することができ、本発明のプライマーまたはプロ
ーブはＣ型肝炎ウイルスの高感度検出法に供することが
できる。また、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴ
ヌクレオチドは、これにもとづいて本発明のプライマー
またはプローブを得ることができる。
【００２２】
【実施例】以下、本発明の実施例について述べるが、も
とより本発明がこれらの実施例に限定されるものではな
い。
とより本発明がこれらの実施例に限定されるものではな
い。
【００２３】実施例１ ５′−ＮＣ領域を増幅する、従来のＨＣＶ検出法により
十分なＨＣＶ−ＲＮＡレベルがあることがしめされたに
もかかわらず、コア領域の遺伝子型判定が不能であった
検体の遺伝子型の判定と、その５′−ＮＣ領域塩基配列
の決定を行った。
十分なＨＣＶ−ＲＮＡレベルがあることがしめされたに
もかかわらず、コア領域の遺伝子型判定が不能であった
検体の遺伝子型の判定と、その５′−ＮＣ領域塩基配列
の決定を行った。
【００２４】（１）ＲＮＡ抽出 従来、ＨＣＶ検出に用いられている５′−ＮＣ領域を増
幅する方法にて十分に検出可能なレベルのＨＣＶ−ＲＮ
Ａを有しながら、コア領域配列に基づく遺伝子型判定法
にてその遺伝子型の判定ができなかった検体（Ｍｉｔ／
９２，Ｈｉｒ／９２，Ｔｈ−８５，ＮＺＬ−１，ＵＳ−
１１４，ならびにＴｈ−１０３）より次のようにしてＲ
ＮＡを抽出した。血清５０μｌに適当量のトリス緩衡液
（１０ｍＭ、ｐＨ８．０）を加え、９０×１０３ｒｐｍ
で１５分間遠心分離した。得られたペレットに２００ｍ
ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ，２％（Ｗ／Ｖ）ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と１ｍｇ／ｍｌのプロテ
ナーゼＫを含むトリス緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８．０）
を加え，６０℃で１時間加温し、フェノール／クロロホ
ルムで抽出した後、エタノール沈澱を行いＲＮＡを得
た。
幅する方法にて十分に検出可能なレベルのＨＣＶ−ＲＮ
Ａを有しながら、コア領域配列に基づく遺伝子型判定法
にてその遺伝子型の判定ができなかった検体（Ｍｉｔ／
９２，Ｈｉｒ／９２，Ｔｈ−８５，ＮＺＬ−１，ＵＳ−
１１４，ならびにＴｈ−１０３）より次のようにしてＲ
ＮＡを抽出した。血清５０μｌに適当量のトリス緩衡液
（１０ｍＭ、ｐＨ８．０）を加え、９０×１０３ｒｐｍ
で１５分間遠心分離した。得られたペレットに２００ｍ
ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ，２％（Ｗ／Ｖ）ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と１ｍｇ／ｍｌのプロテ
ナーゼＫを含むトリス緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８．０）
を加え，６０℃で１時間加温し、フェノール／クロロホ
ルムで抽出した後、エタノール沈澱を行いＲＮＡを得
た。
【００２５】（２）ｃＤＮＡ作製 各検体血清より得られたＲＮＡを７０℃で１分間加温
し、急冷後、これを鋳型として用い１００ユニットの逆
転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ；ＧＩＢＣＯ−ＢＲ
Ｌ）およびオリゴヌクレオチドプライマー２０ｐｍｏｌ
を加え４２℃，１時間反応させｃＤＮＡを得た。プライ
マーとしては＃８１（５′−ＧＡＣＡＣＣＣＣＧＣＴＧ
ＴＴＴＴＧＡＣＴＣ−３′；５′端からの通算塩基数と
して８６１３−８６３２番目）を用いた。
し、急冷後、これを鋳型として用い１００ユニットの逆
転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ；ＧＩＢＣＯ−ＢＲ
Ｌ）およびオリゴヌクレオチドプライマー２０ｐｍｏｌ
を加え４２℃，１時間反応させｃＤＮＡを得た。プライ
マーとしては＃８１（５′−ＧＡＣＡＣＣＣＣＧＣＴＧ
ＴＴＴＴＧＡＣＴＣ−３′；５′端からの通算塩基数と
して８６１３−８６３２番目）を用いた。
【００２６】（３）ＮＳ５領域遺伝子のＰＣＲによる増
幅 得られたｃＤＮＡを鋳型として用い、ＮＳ５特異プライ
マーを用いてＰＣＲにてＮＳ５領域、５′端からの通算
塩基番号８２５６から８６３２までの３７７塩基長の領
域を増幅した。プライマーはセンスプライマー＃８０
（５′−ＧＡＣＡＣＣＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＣＴＣ−
３′；５′端からの通算塩基数として８２５６−８２７
５番目）とアンチセンスプライマー＃８１を使用した。
ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉ
ｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）ＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅ
ｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を用いて、３５サ
イクルの増幅を行った。ＰＣＲ条件は各サイクル９４℃
で１分、５５℃で１．５分、７２℃で２分である。
幅 得られたｃＤＮＡを鋳型として用い、ＮＳ５特異プライ
マーを用いてＰＣＲにてＮＳ５領域、５′端からの通算
塩基番号８２５６から８６３２までの３７７塩基長の領
域を増幅した。プライマーはセンスプライマー＃８０
（５′−ＧＡＣＡＣＣＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＣＴＣ−
３′；５′端からの通算塩基数として８２５６−８２７
５番目）とアンチセンスプライマー＃８１を使用した。
ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉ
ｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）ＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅ
ｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を用いて、３５サ
イクルの増幅を行った。ＰＣＲ条件は各サイクル９４℃
で１分、５５℃で１．５分、７２℃で２分である。
【００２７】（４）ＮＳ５領域遺伝子の配列決定 ＰＣＲにて増幅しＮＳ５領域の遺伝子をＴ４ポリヌクレ
オチドカイネース（Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａ
ｂｓ），Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で処理後、Ｍ１３ファージベ
クターに挿入し，クローン化した。塩基配列決定はｄｉ
ｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法に
より、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋ
ｉｔ ｖｅｒ．２．０ （Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ），あるいはＡｕｔｏＲｅ
ａｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ−ＬＫＢ）を用いて行った。表１に６検体のＮＳ５
領域３３７ｂｐ（プライマー配列を除く）の塩基配列
の、各遺伝子型の塩基配列との相同性を％で示す。その
結果、Ｍｉｔ／９２，Ｈｉｒ／９２，Ｔｈ−８５，ＮＺ
Ｌ−１，ならびにＵＳ−１１４は暫定的にＶ型と呼ばれ
る遺伝子型ＨＣＶの配列に最も相同性が高く、Ｔｈ−１
０３は暫定的にＶＩ型と呼ばれる遺伝子型ＨＣＶの配列
に最も相同性が高いことが判明した。以上の結果より、
本発明者らは、従来の５′ＮＣ領域を対象とするＨＣＶ
検出方にて検出可能の十分なレベルのＲＮＡ量が存在す
るにもかかわらず、コア領域を対象とした遺伝子型判定
法ではその遺伝子型が判定できなかった検体の遺伝子型
は、従来より報告されているＩ型〜ＩＶ型ではなく、最
近報告され、暫定的にＶ型ならびにＶＩ型と呼ばれる遺
伝子型であることを見い出した。
オチドカイネース（Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａ
ｂｓ），Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で処理後、Ｍ１３ファージベ
クターに挿入し，クローン化した。塩基配列決定はｄｉ
ｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法に
より、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋ
ｉｔ ｖｅｒ．２．０ （Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ），あるいはＡｕｔｏＲｅ
ａｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ−ＬＫＢ）を用いて行った。表１に６検体のＮＳ５
領域３３７ｂｐ（プライマー配列を除く）の塩基配列
の、各遺伝子型の塩基配列との相同性を％で示す。その
結果、Ｍｉｔ／９２，Ｈｉｒ／９２，Ｔｈ−８５，ＮＺ
Ｌ−１，ならびにＵＳ−１１４は暫定的にＶ型と呼ばれ
る遺伝子型ＨＣＶの配列に最も相同性が高く、Ｔｈ−１
０３は暫定的にＶＩ型と呼ばれる遺伝子型ＨＣＶの配列
に最も相同性が高いことが判明した。以上の結果より、
本発明者らは、従来の５′ＮＣ領域を対象とするＨＣＶ
検出方にて検出可能の十分なレベルのＲＮＡ量が存在す
るにもかかわらず、コア領域を対象とした遺伝子型判定
法ではその遺伝子型が判定できなかった検体の遺伝子型
は、従来より報告されているＩ型〜ＩＶ型ではなく、最
近報告され、暫定的にＶ型ならびにＶＩ型と呼ばれる遺
伝子型であることを見い出した。
【００２８】実施例２ 暫定的にＶ型ならびにＶＩ型と呼ばれる遺伝子型検体の
５′ＮＣ領域およびそれに続く構造蛋白質コード領域の
一部の遺伝子配列の決定を行った。
５′ＮＣ領域およびそれに続く構造蛋白質コード領域の
一部の遺伝子配列の決定を行った。
【００２９】（１）配列決定 実施例１に開示した方法を用い、ＨＣＶ ＲＮＡを抽出
し、ｃＤＮＡを合成した。但し、ｃＤＮＡ合成は、５′
ＮＣ領域に続く構造蛋白質コード領域特異的プライマ
−、＃１２２（５′−ＡＧＧＴＴＣＣＣＴＧＴＴＧＣＡ
ＴＡＧＴＴ−３′５′端からの通算塩基数として８２８
−８４７番目）を用い実施した。ｃＤＮＡ合成後、プラ
イマーセット＃３２ａ／＃１２２を用いて、実施例１に
同じ条件にてＰＣＲを行い、５′ＮＣ−構造蛋白質コー
ド領域遺伝子の増幅を行った。ただし、ＰＣＲに於いて
はプライマー伸長時間を３分に変更した。ＰＣＲにて増
幅された上記領域の遺伝子（８０３塩基長）を、実施例
１の方法にてＭ１３ファージベクターにクローニング
し、実施例１に同じ方法にて配列を決定した。配列番号
１〜６に、各検体の該領域の配列を示した。
し、ｃＤＮＡを合成した。但し、ｃＤＮＡ合成は、５′
ＮＣ領域に続く構造蛋白質コード領域特異的プライマ
−、＃１２２（５′−ＡＧＧＴＴＣＣＣＴＧＴＴＧＣＡ
ＴＡＧＴＴ−３′５′端からの通算塩基数として８２８
−８４７番目）を用い実施した。ｃＤＮＡ合成後、プラ
イマーセット＃３２ａ／＃１２２を用いて、実施例１に
同じ条件にてＰＣＲを行い、５′ＮＣ−構造蛋白質コー
ド領域遺伝子の増幅を行った。ただし、ＰＣＲに於いて
はプライマー伸長時間を３分に変更した。ＰＣＲにて増
幅された上記領域の遺伝子（８０３塩基長）を、実施例
１の方法にてＭ１３ファージベクターにクローニング
し、実施例１に同じ方法にて配列を決定した。配列番号
１〜６に、各検体の該領域の配列を示した。
【００３０】実施例３ 暫定的にＶ型ならびにＶＩ型と呼ばれる遺伝子型ＨＣＶ
のゲノムＲＮＡ検出に適したプライマーの選定実施例２
にて明らかになった配列を用い、新たに見いだされたＶ
型ならびにＶＩ型と呼ばれる遺伝子型ＨＣＶの５′ＮＣ
領域、ならびにそれに続く構造蛋白質コード領域内に於
て、従来より報告されているＩ〜ＩＶ型に加え新たに見
いだされたＶ型ならびにＶＩ型にも共通する、特異ヌク
レオチド配列を検索し、全ての遺伝子型ＨＣＶのゲノム
ＲＮＡ検出に適したプライマーの選定を行った。もとよ
り、該領域は高い保存性を有することから、まず従来の
ＨＣＶ遺伝子検出法にて使用しているオリゴヌクレオチ
ドプライマーが、本発明の目的にも使用できるかを検索
した。従来のＨＣＶ検出法（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．６０：１６７−１７７，１９９０）において１ｓｔ
ＰＣＲのセンスプライマーとして使用されるプライマー
＃３２ａは、実施例２に於て該遺伝子領域の増幅に十分
使用できることが示されたことから、本発明に於いても
利用可能であると判断した。また、２ｎｄＰＣＲのセン
スプライマーとして利用される＃３３は、２０塩基中、
中央部分の２塩基のみの変異であることから、プライマ
ーとしての特異性は保持されると判断した。また、２ｎ
ｄＰＣＲのアンチセンスプライマーとして使用されるプ
ライマー＃４８は、５′末端より４番目、ならびに５番
目に位置する２塩基のみの変異であることから、同様に
プライマーとしての特異性は保持されていると判断され
た。しかし、１ｓｔＰＣＲのアンチセンスプライマーと
して利用されるプライマー＃３６は、３′末端より２番
目から４番目までの連続した３塩基について変異がみら
れ、プライマーとしての特異性に劣ることが予想され
た。この知見に基づき、プライマー＃３６の近傍におい
て、Ｉ〜ＩＶ型ならびにＶ型およびＶＩ型にも共通し、
プライマーとして利用可能な配列を検索した。その結
果、配列番号８に示す塩基配列、５′−ＡＣＣＣＡＡＣ
ＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧ−３′からなる＃２９９を
見いだした。この配列は５′末端より２５０番目から２
６９番目までの塩基配列に相当する。このプライマー
は、Ｖ型ならびにＶＩ型に於いて、該塩基配列中に１な
いし２塩基の非相補部分があるが、プライマーの特異性
を損なうものではないと判断される。
のゲノムＲＮＡ検出に適したプライマーの選定実施例２
にて明らかになった配列を用い、新たに見いだされたＶ
型ならびにＶＩ型と呼ばれる遺伝子型ＨＣＶの５′ＮＣ
領域、ならびにそれに続く構造蛋白質コード領域内に於
て、従来より報告されているＩ〜ＩＶ型に加え新たに見
いだされたＶ型ならびにＶＩ型にも共通する、特異ヌク
レオチド配列を検索し、全ての遺伝子型ＨＣＶのゲノム
ＲＮＡ検出に適したプライマーの選定を行った。もとよ
り、該領域は高い保存性を有することから、まず従来の
ＨＣＶ遺伝子検出法にて使用しているオリゴヌクレオチ
ドプライマーが、本発明の目的にも使用できるかを検索
した。従来のＨＣＶ検出法（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．６０：１６７−１７７，１９９０）において１ｓｔ
ＰＣＲのセンスプライマーとして使用されるプライマー
＃３２ａは、実施例２に於て該遺伝子領域の増幅に十分
使用できることが示されたことから、本発明に於いても
利用可能であると判断した。また、２ｎｄＰＣＲのセン
スプライマーとして利用される＃３３は、２０塩基中、
中央部分の２塩基のみの変異であることから、プライマ
ーとしての特異性は保持されると判断した。また、２ｎ
ｄＰＣＲのアンチセンスプライマーとして使用されるプ
ライマー＃４８は、５′末端より４番目、ならびに５番
目に位置する２塩基のみの変異であることから、同様に
プライマーとしての特異性は保持されていると判断され
た。しかし、１ｓｔＰＣＲのアンチセンスプライマーと
して利用されるプライマー＃３６は、３′末端より２番
目から４番目までの連続した３塩基について変異がみら
れ、プライマーとしての特異性に劣ることが予想され
た。この知見に基づき、プライマー＃３６の近傍におい
て、Ｉ〜ＩＶ型ならびにＶ型およびＶＩ型にも共通し、
プライマーとして利用可能な配列を検索した。その結
果、配列番号８に示す塩基配列、５′−ＡＣＣＣＡＡＣ
ＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧ−３′からなる＃２９９を
見いだした。この配列は５′末端より２５０番目から２
６９番目までの塩基配列に相当する。このプライマー
は、Ｖ型ならびにＶＩ型に於いて、該塩基配列中に１な
いし２塩基の非相補部分があるが、プライマーの特異性
を損なうものではないと判断される。
【００３１】実施例４ ＃３６と＃２９９を用いた場合の、ＨＣＶ遺伝子の検出
感度の比較 従来より報告されている遺伝子型であるＩＩ型のＨＣＶ
−ＲＮＡで、その感染価が１０７である血清を順次希釈
したものを用意し、従来のＨＣＶ遺伝子検出法と、従来
のＨＣＶ遺伝子検出法に於いてプライマー＃３６を＃２
９９に変えた方法にて検出を行い、検出可能な希釈血清
を求め、これより両検出法のＩＩ型に於ける検出感度を
比較した。その結果、両検出法とも１０７倍希釈まで検
出可能であった。ー方、新たに発見されたＶ型の血清
（ＮＺＬ一１）についても同様の希釈実験を実施した。
その結果、そのＶ型ＨＣＶに関しては、プライマー＃３
６を使用した時の検出感度は１０４であるのに対し、＃
２９９では１０５であり、＃２９９を用いた場合の方が
１０倍の感度を有することが判明した。本発明に使用し
た検体は、いずれも５０μｌあたり１０４以上の力価を
有しており、従って従来のプライマー＃３６を使用した
場合でも検出可能であった。
感度の比較 従来より報告されている遺伝子型であるＩＩ型のＨＣＶ
−ＲＮＡで、その感染価が１０７である血清を順次希釈
したものを用意し、従来のＨＣＶ遺伝子検出法と、従来
のＨＣＶ遺伝子検出法に於いてプライマー＃３６を＃２
９９に変えた方法にて検出を行い、検出可能な希釈血清
を求め、これより両検出法のＩＩ型に於ける検出感度を
比較した。その結果、両検出法とも１０７倍希釈まで検
出可能であった。ー方、新たに発見されたＶ型の血清
（ＮＺＬ一１）についても同様の希釈実験を実施した。
その結果、そのＶ型ＨＣＶに関しては、プライマー＃３
６を使用した時の検出感度は１０４であるのに対し、＃
２９９では１０５であり、＃２９９を用いた場合の方が
１０倍の感度を有することが判明した。本発明に使用し
た検体は、いずれも５０μｌあたり１０４以上の力価を
有しており、従って従来のプライマー＃３６を使用した
場合でも検出可能であった。
【００３２】実施例５ 供血検体におけるＨＣＶ遺伝子の検出を行った。日本人
の健常供血者３３８３名を対象に、第二世代ＨＣＶ抗体
検査薬（ＰＨＡ法：ダイナボット）陽性、ＨＣＶコア抗
体（ＣＰ９抗体あるいはＣＰ１０抗体の少なくともいず
れか一方がＯＤ１、００以上）陽性、あるいはＧＰＴが
３６Ｋａｒｍｅｎ Ｕｎｉｔｓ以上の検休について、プ
ライマー＃２９９を用いてＨＣＶ遺伝子を検出した。結
果は表２に示した。ＨＣＶ還伝子陽性は２１検体（０．
６％）であることが判明した。この内、第二世代抗体陽
性は１９検体で、コア抗体陽性も１９検体であった。両
抗体陽性は１７例であった。またＧＰＴ異常高値は５例
であった。
の健常供血者３３８３名を対象に、第二世代ＨＣＶ抗体
検査薬（ＰＨＡ法：ダイナボット）陽性、ＨＣＶコア抗
体（ＣＰ９抗体あるいはＣＰ１０抗体の少なくともいず
れか一方がＯＤ１、００以上）陽性、あるいはＧＰＴが
３６Ｋａｒｍｅｎ Ｕｎｉｔｓ以上の検休について、プ
ライマー＃２９９を用いてＨＣＶ遺伝子を検出した。結
果は表２に示した。ＨＣＶ還伝子陽性は２１検体（０．
６％）であることが判明した。この内、第二世代抗体陽
性は１９検体で、コア抗体陽性も１９検体であった。両
抗体陽性は１７例であった。またＧＰＴ異常高値は５例
であった。
【００３３】
【発明の効果】本発明の検出法は、Ｃ型肝炎ウイルスを
高感度に検出することができ、本発明のプライマーまた
はプローブはＣ型肝炎ウイルスの高感度検出法に供する
ことができる。また、本発明のポリヌクレオチドおよび
オリゴヌクレオチドは、これにもとづいて本発明のプラ
イマーまたはプローブを得ることができる。
高感度に検出することができ、本発明のプライマーまた
はプローブはＣ型肝炎ウイルスの高感度検出法に供する
ことができる。また、本発明のポリヌクレオチドおよび
オリゴヌクレオチドは、これにもとづいて本発明のプラ
イマーまたはプローブを得ることができる。
【００３４】
【００３５】
【００３６】
【００３７】
【００３８】
【００３９】
【００４０】配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 配列（＃２９９） ＡＣＣＣＡＡＣＡＣＴ ＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧ ２０
【００４１】配列番号：８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 配列（＃３２ａ） ＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡ ＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴ ２０
【００４２】配列番号：９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 配列（＃３３） ＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡ ＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ ２０
【００４３】配列番号：１０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 配列（＃４８） ＧＴＴＧＡＴＣＣＡＡ ＧＡＡＡＧＧＡＣＣＣ ２０
Claims (17)
- 【請求項１】Ｖ型およびＶＩ型であるＣ型肝炎ウイルス
遺伝子の５′非翻訳領域および／または構造蛋白質コー
ド領域５′端側領域の全部または一部に特異的な、また
はこれらと相補的な塩基配列を有する特異的ポリヌクレ
オチドまたはオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】配列番号１記載の塩基配列を有するポリヌ
クレオチドＮ−８０３／Ｍｉｔ／９２の全部または一
部、またはこれらと相補的な塩基配列を有するポリヌク
レオチドまたはオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】配列番号２記載の塩基配列を有するポリヌ
クレオチドＮ−８０３／Ｈｉｒ／９２の全部または一
部、またはこれらと相補的な塩基配列を有するポリヌク
レオチドまたはオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４】配列番号３記載の塩基配列を有するポリヌ
クレオチドＮ−８０３／Ｔｈ−８５の全部または一部、
またはこれらと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオ
チドまたはオリゴヌクレオチド。 - 【請求項５】配列番号４記載の塩基配列を有するポリヌ
クレオチドＮ−８０３／ＮＺＬ−１の全部または一部、
またはこれらと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオ
チドまたはオリゴヌクレオチド。 - 【請求項６】配列番号５記載の塩基配列を有するポリヌ
クレオチドＮ−８０３／ＵＳ−１１４の全部または一
部、またはこれらと相補的な塩基配列を有するポリヌク
レオチドまたはオリゴヌクレオチド。 - 【請求項７】配列番号６記載の塩基配列を有するポリヌ
クレオチドＮ−８０３／Ｔｈ−１０３の全部または一
部，またはこれらと相補的な塩基配列を有するポリヌク
レオチドまたはオリゴヌクレオチド。 - 【請求項８】配列番号７記載の塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチド＃２９９の全部または一部、またはこれら
と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項９】請求項１ないし８記載のオリゴヌクレオチ
ドからなるプライマー。 - 【請求項１０】請求項９記載のオリゴヌクレオチドプラ
イマーを使用するＣ型肝炎ウイルスの高感度検出法。 - 【請求項１１】オリゴヌクレオチドプライマーをペアー
として使用し、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子のｃＤＮＡをポ
リメラーゼチエインリアクション法により増幅する請求
項１０記載のＣ型肝炎ウイルスの高感度検出法。 - 【請求項１２】オリゴヌクレオチドプライマーのペアー
を複数組使用しｃＤＮＡ増幅を複数回行う請求項１０ま
たは１１記載のＣ型肝炎ウイルスの高感度検出法。 - 【請求項１３】配列番号８記載の塩基配列を有するオリ
ゴヌクレオチド＃３２ａまたは配列番号９記載の塩基配
列を有するオリゴヌクレオチド＃３３をセンスプライマ
ーとして使用し、配列番号７記載の塩基配列を有するオ
リゴヌクレオチド＃２９９または配列番号１０記載の塩
基配列を有するオリゴヌクレオチド＃４８をアンチセン
スプライマーとして使用するＣ型肝炎ウイルスの高感度
検出法。 - 【請求項１４】＃３２ａと＃２９９からなるプライマー
ペアーを第１段階増幅に、＃３３と＃４８からなるプラ
イマーペアーを第２段階増幅に使用するＣ型肝炎ウイル
スの高感度検出法。 - 【請求項１５】請求項１ないし８記載のオリゴヌクレオ
チドからなるプローブ。 - 【請求項１６】酵素、放射性同位元素、蛍光物質のいず
れかにより標識された請求項１５記載のプローブ。 - 【請求項１７】請求項１５または１６記載のプローブを
使用するＣ型肝炎ウイルスの高感度検出法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4354370A JPH06153961A (ja) | 1992-11-27 | 1992-11-27 | Ｃ型肝炎ウイルス部分遺伝子、ならびにｃ型肝炎ウイルス遺 伝子の高感度検出法 |
| US08/157,235 US5550016A (en) | 1992-11-27 | 1993-11-24 | Oligonucleotides of HCV, primers and probes therefrom, method of determining HCV genotypes and method of detecting HCV in samples |
| EP93309395A EP0633320A1 (en) | 1992-11-27 | 1993-11-25 | Oligonucleotides of HCV, primers ND probes therefrom, method of determining HCV genotypes and method of detecting HVC in samples |
| CA002110141A CA2110141A1 (en) | 1992-11-27 | 1993-11-26 | Oligonucleotides of hcv, primers and probes therefrom, method of determining hcv genotypes, and method of detecting hcv in samples |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4354370A JPH06153961A (ja) | 1992-11-27 | 1992-11-27 | Ｃ型肝炎ウイルス部分遺伝子、ならびにｃ型肝炎ウイルス遺 伝子の高感度検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06153961A true JPH06153961A (ja) | 1994-06-03 |
Family
ID=18437101
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4354370A Pending JPH06153961A (ja) | 1992-11-27 | 1992-11-27 | Ｃ型肝炎ウイルス部分遺伝子、ならびにｃ型肝炎ウイルス遺 伝子の高感度検出法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5550016A (ja) |
| EP (1) | EP0633320A1 (ja) |
| JP (1) | JPH06153961A (ja) |
| CA (1) | CA2110141A1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4900963A (en) * | 1987-09-30 | 1990-02-13 | Aisin Seiki Kabushiki Kaisha | D.C. motor |
| JPH11103899A (ja) * | 1997-09-30 | 1999-04-20 | Tokyoto Rinshou Igaku Sogo Kenkyusho | リアルタイム検出ｐｃｒ法によるｈｃｖ遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブ |
| JP2000279200A (ja) * | 1999-02-03 | 2000-10-10 | Ortho Clinical Diagnostics Inc | Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）の効率的検出のためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびそれの使用 |
Families Citing this family (17)
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|---|---|---|---|---|
| ATE179459T1 (de) * | 1992-11-27 | 1999-05-15 | Innogenetics Nv | Verfahren zur typisierung von hcv-isolaten |
| US7258977B1 (en) | 1992-11-27 | 2007-08-21 | Innogenetics N.V. | Process for typing of HCV isolates |
| US7235394B1 (en) | 1995-08-29 | 2007-06-26 | Washington University | Functional DNA clone for hepatitis C virus (HCV) and uses thereof |
| US6127116A (en) | 1995-08-29 | 2000-10-03 | Washington University | Functional DNA clone for hepatitis C virus (HCV) and uses thereof |
| CU22642A1 (es) * | 1996-12-12 | 2000-12-22 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Secuencia de adnc derivadas del genoma del virus de la hepatitis c y su uso |
| US7338759B1 (en) | 1997-03-04 | 2008-03-04 | Washington University | HCV variants |
| US7049428B1 (en) * | 1998-03-04 | 2006-05-23 | Washington University | HCV variants |
| DE19832050C2 (de) * | 1998-07-16 | 2002-10-10 | Biotest Pharma Gmbh | Verfahren zum Nachweis von Hepatitis B- bzw. Hepatitis C-Virusgenomen in Plasmaproben und spezifische Primer |
| CA2245039A1 (en) * | 1998-08-13 | 2000-02-13 | Vito Scalia | Primer-specific and mispair extension assay for identifying gene variation |
| EP1036847B1 (en) * | 1999-02-03 | 2004-10-27 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Oligonucleotide primers for efficient reverse transcription of Hepatitis C Virus (HCV) RNA and methods of use thereof |
| US6586584B2 (en) | 2001-01-29 | 2003-07-01 | Becton, Dickinson And Company | Sequences and methods for detection of Hepatitis C virus |
| CN1262672C (zh) * | 2001-04-12 | 2006-07-05 | 株式会社生物核心 | 用于分析丙型肝炎病毒(hcv)基因型的寡核苷酸芯片组合物及其检测方法 |
| KR100451049B1 (ko) * | 2001-04-12 | 2004-10-02 | 바이오코아 주식회사 | Ｃ형 간염 바이러스 (ｈｃｖ) 유전자형 분석을 위한올리고뉴크레오티드 칩 조성물 및 그 검사 방법 |
| WO2002090572A2 (en) * | 2001-05-09 | 2002-11-14 | Third Wave Technologies, Inc. | Nucleic acid detection in pooled samples |
| US7196183B2 (en) * | 2001-08-31 | 2007-03-27 | Innogenetics N.V. | Hepatitis C virus genotype, and its use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agent |
| US8124747B2 (en) * | 2003-08-29 | 2012-02-28 | Innogenetics | HCV clade and prototype sequences thereof |
| WO2006085328A2 (en) * | 2005-02-14 | 2006-08-17 | Mor Research Applications Ltd. | Method and kit for diagnosing and predicting hepatitis c virus-related neoplastic transformation |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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