JPH06125777A - オリゴヌクレオチドプライマー、およびこれを用いた非ａ非 ｂ型肝炎ウイルスの高感度検出方法 - Google Patents
オリゴヌクレオチドプライマー、およびこれを用いた非ａ非 ｂ型肝炎ウイルスの高感度検出方法Info
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- JPH06125777A JPH06125777A JP3247120A JP24712091A JPH06125777A JP H06125777 A JPH06125777 A JP H06125777A JP 3247120 A JP3247120 A JP 3247120A JP 24712091 A JP24712091 A JP 24712091A JP H06125777 A JPH06125777 A JP H06125777A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】本発明は、非Ａ非Ｂ型（ＮＡＮＢ）肝炎ウイル
スを遺伝子レベルで高感度に検出する方法と、これに用
いるオリゴヌクレオチドプライマーを提供することを目
的とする。 【構成】本発明は、ＮＡＮＢ肝炎ウイルスＲＮＡに特異
的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド＃３２Ａおよ
び／または＃３６をプライマーとして用いてＮＡＮＢ肝
炎ウイルスを高感度に検出する方法であり、オリゴヌク
レオチドプライマーのペアを用い、ＮＡＮＢ肝炎ウイル
スＲＮＡのｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅させて該ウイル
スＲＮＡを検出し、あるいは該ペアを２組用いてｃＤＮ
Ａの増幅を２回行うことによっても行うことができる。
さらに、本発明はＮＡＮＢ肝炎ウイルスの検出に供する
ことのできる上記オリゴヌクレオチドプライマーの発明
である。 【効果】本発明の方法は、ＮＡＮＢ肝炎ウイルスを遺伝
子レベルで高感度に検出することができ、また、本発明
のオリゴヌクレオチドプライマーは、ＮＡＮＢ肝炎ウイ
ルスの高感度検出に供することができる。
スを遺伝子レベルで高感度に検出する方法と、これに用
いるオリゴヌクレオチドプライマーを提供することを目
的とする。 【構成】本発明は、ＮＡＮＢ肝炎ウイルスＲＮＡに特異
的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド＃３２Ａおよ
び／または＃３６をプライマーとして用いてＮＡＮＢ肝
炎ウイルスを高感度に検出する方法であり、オリゴヌク
レオチドプライマーのペアを用い、ＮＡＮＢ肝炎ウイル
スＲＮＡのｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅させて該ウイル
スＲＮＡを検出し、あるいは該ペアを２組用いてｃＤＮ
Ａの増幅を２回行うことによっても行うことができる。
さらに、本発明はＮＡＮＢ肝炎ウイルスの検出に供する
ことのできる上記オリゴヌクレオチドプライマーの発明
である。 【効果】本発明の方法は、ＮＡＮＢ肝炎ウイルスを遺伝
子レベルで高感度に検出することができ、また、本発明
のオリゴヌクレオチドプライマーは、ＮＡＮＢ肝炎ウイ
ルスの高感度検出に供することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、オリゴヌクレオチド
と、これを用いて非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス（以下「ＮＡ
ＮＢ肝炎ウイルス」と略記する）を遺伝子レベルで高感
度に検出する方法に関する。
と、これを用いて非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス（以下「ＮＡ
ＮＢ肝炎ウイルス」と略記する）を遺伝子レベルで高感
度に検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ウイルスに由来する肝炎には、既にウイ
ルス本体のＤＮＡやＲＮＡがつきとめられ、その診断法
や予防法が確立したものとしてＢ型肝炎、Ａ型肝炎、Ｄ
型肝炎、Ｅ型肝炎がある。しかし、主として血液を介し
て感染する肝炎で上記の分類に属さない、非Ａ非Ｂ型肝
炎（以下「ＮＡＮＢ肝炎」という）については、世界の
多くの研究者がその原因ウィルスを捜してきたにもかか
わらずウイルス本体の解明はなされていなかった。
ルス本体のＤＮＡやＲＮＡがつきとめられ、その診断法
や予防法が確立したものとしてＢ型肝炎、Ａ型肝炎、Ｄ
型肝炎、Ｅ型肝炎がある。しかし、主として血液を介し
て感染する肝炎で上記の分類に属さない、非Ａ非Ｂ型肝
炎（以下「ＮＡＮＢ肝炎」という）については、世界の
多くの研究者がその原因ウィルスを捜してきたにもかか
わらずウイルス本体の解明はなされていなかった。
【０００３】１９８８年になってカイロン社は、ＮＡＮ
Ｂ型肝炎の原因ウイルスとして、Ｃ型肝炎ウイルス（以
下「ＨＣＶ」と略記する）と命名したＲＮＡウイルスゲ
ノムのクローン化に成功したとして、その塩基配列を発
表した。そしてこれを基にＨＣＶ抗体の測定系を開発
し、現在輸血血液のスクリーニングや患者の診断に用い
られ始めている。このＨＣＶ抗体の測定系はＮＡＮＢ肝
炎との関連性がたしかに一部認められる。しかし、キャ
リアや慢性肝炎の捕捉率が約７０％にすぎないこと、ま
た急性期の抗体検出ができないこと等の重大な問題点が
残されており、カイロン社の前記開発によってもＮＡＮ
Ｂ肝炎への対処は依然として解決されていない。 他
方、Ｂ型肝炎ウイルスの検出法は既に確立されている。
このため日本においては輸血後肝炎の９５％以上がＮＡ
ＮＢ肝炎であり、年間約２８万例の発症が推定されてい
る。ＮＡＮＢ肝炎の経過は不良であり、大部分の例はキ
ャリア化して慢性肝炎に進展すると予測される。又、か
なり高率に１０〜２０数年にかけて肝硬変へ、さらに肝
癌へ進むことから、一日も早いウイルス本体の解明及び
診断薬の開発が望まれている。
Ｂ型肝炎の原因ウイルスとして、Ｃ型肝炎ウイルス（以
下「ＨＣＶ」と略記する）と命名したＲＮＡウイルスゲ
ノムのクローン化に成功したとして、その塩基配列を発
表した。そしてこれを基にＨＣＶ抗体の測定系を開発
し、現在輸血血液のスクリーニングや患者の診断に用い
られ始めている。このＨＣＶ抗体の測定系はＮＡＮＢ肝
炎との関連性がたしかに一部認められる。しかし、キャ
リアや慢性肝炎の捕捉率が約７０％にすぎないこと、ま
た急性期の抗体検出ができないこと等の重大な問題点が
残されており、カイロン社の前記開発によってもＮＡＮ
Ｂ肝炎への対処は依然として解決されていない。 他
方、Ｂ型肝炎ウイルスの検出法は既に確立されている。
このため日本においては輸血後肝炎の９５％以上がＮＡ
ＮＢ肝炎であり、年間約２８万例の発症が推定されてい
る。ＮＡＮＢ肝炎の経過は不良であり、大部分の例はキ
ャリア化して慢性肝炎に進展すると予測される。又、か
なり高率に１０〜２０数年にかけて肝硬変へ、さらに肝
癌へ進むことから、一日も早いウイルス本体の解明及び
診断薬の開発が望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上記カイロン社のＨＣ
Ｖ抗体検出キットでは診断できないＮＡＮＢ肝炎が多数
存在すること、さらに本発明者らの研究により日本のＮ
ＡＮＢ肝炎ウイルスがカイロン社の解明したＨＣＶとは
塩基配列において相当異なることが明らかになったこと
から、特異性、感度においてさらに優れたＮＡＮＢ肝炎
診断法の開発が不可欠である。 本発明の目的は、ＮＡ
ＮＢ肝炎ウイルスを遺伝子レベルで高感度に検出する方
法と、これに用いるオリゴヌクレオチドプライマーを提
供することである。
Ｖ抗体検出キットでは診断できないＮＡＮＢ肝炎が多数
存在すること、さらに本発明者らの研究により日本のＮ
ＡＮＢ肝炎ウイルスがカイロン社の解明したＨＣＶとは
塩基配列において相当異なることが明らかになったこと
から、特異性、感度においてさらに優れたＮＡＮＢ肝炎
診断法の開発が不可欠である。 本発明の目的は、ＮＡ
ＮＢ肝炎ウイルスを遺伝子レベルで高感度に検出する方
法と、これに用いるオリゴヌクレオチドプライマーを提
供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＮＡＮＢ
肝炎ウイルスの遺伝子本体の解明を目的として、ヒトお
よびチンパンジーキャリアの血清より、ＮＡＮＢ肝炎ウ
イルスのＲＮＡを単離し、ウイルスの非コード領域を含
む遺伝子領域全体をカバーするｃＤＮＡをクローン化し
てその塩基配列を決定した。その結果、本発明者らは、
ＮＡＮＢ肝炎ウイルスのうち非常に保存性の高い領域
と、ウイルス株間で変異が多い領域とが存在することを
解明し、これにもとづいて本発明を完成した。
肝炎ウイルスの遺伝子本体の解明を目的として、ヒトお
よびチンパンジーキャリアの血清より、ＮＡＮＢ肝炎ウ
イルスのＲＮＡを単離し、ウイルスの非コード領域を含
む遺伝子領域全体をカバーするｃＤＮＡをクローン化し
てその塩基配列を決定した。その結果、本発明者らは、
ＮＡＮＢ肝炎ウイルスのうち非常に保存性の高い領域
と、ウイルス株間で変異が多い領域とが存在することを
解明し、これにもとづいて本発明を完成した。
【０００６】本発明の要旨は次の通りである。本発明の
ＮＡＮＢ肝炎ウイルスＲＮＡは次のようにして得て、そ
の塩基配列を決定した。ヒト及びチンパンジー血漿より
２種の検体を得た。ＨＣ−Ｊ１は日本人供血者に由来
し、ＨＣＶ抗体陽性と判定された検体より得られた。他
方、ＨＣ−Ｊ４はＮＡＮＢ肝炎の感染性を確認したチン
パンジーから得た検体に由来するが、しかしこれはカイ
ロン社の前記ＨＣＶ抗体では（−）のものであった。こ
の２種の検体血漿よりＲＮＡを抽出した。さらに各ＲＮ
Ａ間の塩基配列の相同性を調べ、実施例に示すように抽
出ＲＮＡの５′末側の約２５００の塩基配列、これらの
非コード領域、および構造蛋白質をコードする領域に関
して研究を成就し、本発明を完成するに至った。
ＮＡＮＢ肝炎ウイルスＲＮＡは次のようにして得て、そ
の塩基配列を決定した。ヒト及びチンパンジー血漿より
２種の検体を得た。ＨＣ−Ｊ１は日本人供血者に由来
し、ＨＣＶ抗体陽性と判定された検体より得られた。他
方、ＨＣ−Ｊ４はＮＡＮＢ肝炎の感染性を確認したチン
パンジーから得た検体に由来するが、しかしこれはカイ
ロン社の前記ＨＣＶ抗体では（−）のものであった。こ
の２種の検体血漿よりＲＮＡを抽出した。さらに各ＲＮ
Ａ間の塩基配列の相同性を調べ、実施例に示すように抽
出ＲＮＡの５′末側の約２５００の塩基配列、これらの
非コード領域、および構造蛋白質をコードする領域に関
して研究を成就し、本発明を完成するに至った。
【０００７】実施例１に示すように、ＨＣ−Ｊ１株、Ｈ
Ｃ−Ｊ４株由来のＲＮＡはいずれも５′末端より３４１
個のヌクレオチドよりなる５′非翻訳領域を有し、これ
に続いて構造蛋白質をコードする領域（１１４９塩基）
が続き、さらに非構造蛋白質をコードする領域を含め、
２５４０箇のヌクレオチドを有する。この知見にもとづ
き、配列番号３および４記載のポリヌクレオチドを得
た。
Ｃ−Ｊ４株由来のＲＮＡはいずれも５′末端より３４１
個のヌクレオチドよりなる５′非翻訳領域を有し、これ
に続いて構造蛋白質をコードする領域（１１４９塩基）
が続き、さらに非構造蛋白質をコードする領域を含め、
２５４０箇のヌクレオチドを有する。この知見にもとづ
き、配列番号３および４記載のポリヌクレオチドを得
た。
【０００８】ヨーロッパ公開特許第３８８２３２号（カ
イロン社）に示されたＨＣＶの配列と比較すると、本発
明者が解明した上記ヌクレオチド配列は、非コード領域
を含む５′末端側２４７７塩基に関してＪ１、Ｊ４の各
株ではそれぞれ９５．２％、８０．５％の相同性を有す
る。このことより、ＨＣ−Ｊ１株はカイロン社が同定し
たウイルス株に比較的近縁でアメリカ型ウイルスである
のに対して、Ｊ４株はこれとはやや異なり、日本型ウイ
ルスであることが示唆された。
イロン社）に示されたＨＣＶの配列と比較すると、本発
明者が解明した上記ヌクレオチド配列は、非コード領域
を含む５′末端側２４７７塩基に関してＪ１、Ｊ４の各
株ではそれぞれ９５．２％、８０．５％の相同性を有す
る。このことより、ＨＣ−Ｊ１株はカイロン社が同定し
たウイルス株に比較的近縁でアメリカ型ウイルスである
のに対して、Ｊ４株はこれとはやや異なり、日本型ウイ
ルスであることが示唆された。
【０００９】本発明者らはウイルスを、特異性、感度と
もに高い検出能力を示すポリメラーゼチェインリアクシ
ョンより検出するために、配列番号３および４記載のｃ
ＤＮＡに基づくプライマー、および配列番号１および２
記載のプライマーを用いる非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス検出
方法を確立した。本発明者らが解明した２株のウイルス
ＲＮＡの５′非コード領域はいずれも３４１塩基からな
り、塩基配列の保存性が非常に高い。例えば、塩基配列
の差異は、ＨＣ−Ｊ１とＨＣ−Ｊ４では８塩基のみであ
った。２株のウイルスＲＮＡは、上記以外の領域におい
ては株種間の変異が激しいことを考慮すると、５′非コ
ード領域において塩基配列が非常によく保存されている
ことは驚くべきことである。またコード領域の中でもＡ
ＴＧに続く上流部分では比較的変異が少ない。したがっ
て、これらの領域に由来する配列番号１（＃３２Ａ）お
よび／または配列番号２（＃３６）のオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして使用すれば、ＮＡＮＢ肝炎ウイル
スＲＮＡをその株間によって左右されることなく、すな
わち株種をとわずに高感度に検出できることを見いだし
た。
もに高い検出能力を示すポリメラーゼチェインリアクシ
ョンより検出するために、配列番号３および４記載のｃ
ＤＮＡに基づくプライマー、および配列番号１および２
記載のプライマーを用いる非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス検出
方法を確立した。本発明者らが解明した２株のウイルス
ＲＮＡの５′非コード領域はいずれも３４１塩基からな
り、塩基配列の保存性が非常に高い。例えば、塩基配列
の差異は、ＨＣ−Ｊ１とＨＣ−Ｊ４では８塩基のみであ
った。２株のウイルスＲＮＡは、上記以外の領域におい
ては株種間の変異が激しいことを考慮すると、５′非コ
ード領域において塩基配列が非常によく保存されている
ことは驚くべきことである。またコード領域の中でもＡ
ＴＧに続く上流部分では比較的変異が少ない。したがっ
て、これらの領域に由来する配列番号１（＃３２Ａ）お
よび／または配列番号２（＃３６）のオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして使用すれば、ＮＡＮＢ肝炎ウイル
スＲＮＡをその株間によって左右されることなく、すな
わち株種をとわずに高感度に検出できることを見いだし
た。
【００１０】前記各知見にもとづいて、本発明者らはＮ
ＡＮＢ肝炎ウイルスを遺伝子レベルで高感度に検出する
のに用いる好適なオリゴヌクレオチドプライマーとし
て、配列番号１および２記載の塩基配列を有する下記オ
リゴヌクレオチドを見出し、これらを全て合成して本発
明を完成した。これら各オリゴヌクレオチドは、いずれ
もプライマーとして用いることができる。本発明のオリ
ゴヌクレオチドプライマーの塩基配列、センス：アンチ
センスの別は次のとおりである。 ＃３２Ａ（配列番号１；＋） ＃３６（配列番号２；−） 本発明においては、＃３２Ａ、＃３６ともプライマーと
してＮＡＮＢ肝炎ウイルスの検出のために用いることが
できる（請求項第１項）。
ＡＮＢ肝炎ウイルスを遺伝子レベルで高感度に検出する
のに用いる好適なオリゴヌクレオチドプライマーとし
て、配列番号１および２記載の塩基配列を有する下記オ
リゴヌクレオチドを見出し、これらを全て合成して本発
明を完成した。これら各オリゴヌクレオチドは、いずれ
もプライマーとして用いることができる。本発明のオリ
ゴヌクレオチドプライマーの塩基配列、センス：アンチ
センスの別は次のとおりである。 ＃３２Ａ（配列番号１；＋） ＃３６（配列番号２；−） 本発明においては、＃３２Ａ、＃３６ともプライマーと
してＮＡＮＢ肝炎ウイルスの検出のために用いることが
できる（請求項第１項）。
【００１１】本発明は、ＮＡＮＢ肝炎ウイルスＲＮＡに
特異的なオリゴヌクレオチドを使用する限り、株間の変
異に由来する少数の置換を含むオリゴヌクレオチドに対
しても適用され、これらもまた本発明の範囲に包含され
る。
特異的なオリゴヌクレオチドを使用する限り、株間の変
異に由来する少数の置換を含むオリゴヌクレオチドに対
しても適用され、これらもまた本発明の範囲に包含され
る。
【００１２】ＰＣＲ法を利用してＮＡＮＢ肝炎ウイルス
を検出するのに際し、本発明のプライマーペア＃３２Ａ
と＃３６とを組み合わせて使用することにより、さらに
好ましい効果を得ることができる（請求項第２項）。
を検出するのに際し、本発明のプライマーペア＃３２Ａ
と＃３６とを組み合わせて使用することにより、さらに
好ましい効果を得ることができる（請求項第２項）。
【００１３】また、本発明は、オリゴヌクレオチドプラ
イマー＃３２Ａを用いてＮＡＮＢ肝炎ウイルスを高感度
に検出する方法の発明である（請求項第３項）。
イマー＃３２Ａを用いてＮＡＮＢ肝炎ウイルスを高感度
に検出する方法の発明である（請求項第３項）。
【００１４】さらに、本発明は、オリゴヌクレオチドプ
ライマーのペア＃３２Ａと＃３６を用いて、ＮＡＮＢ肝
炎ウイルスＲＮＡのｃＤＮＡをポリメラーゼチエインリ
アクションにより増幅させて該ウイルスＲＮＡを高感度
に検出する方法ならびにその検出系の発明である（請求
項第４項）。
ライマーのペア＃３２Ａと＃３６を用いて、ＮＡＮＢ肝
炎ウイルスＲＮＡのｃＤＮＡをポリメラーゼチエインリ
アクションにより増幅させて該ウイルスＲＮＡを高感度
に検出する方法ならびにその検出系の発明である（請求
項第４項）。
【００１５】その際、オリゴヌクレチオドペアを２組用
いてｃＤＮＡの増幅を２回行うことはＮＡＮＢ肝炎ウイ
ルスの検出を高感度に行うために好適である。
いてｃＤＮＡの増幅を２回行うことはＮＡＮＢ肝炎ウイ
ルスの検出を高感度に行うために好適である。
【００１６】
【作用】上記したように、本発明の方法はＮＡＮＢ肝炎
ウイルスを遺伝子レベルで高感度に検出することがで
き、また、本発明のオリゴヌクレチオドプライマーはＮ
ＡＮＢ肝炎ウイルスの高感度検出に供することができ
る。
ウイルスを遺伝子レベルで高感度に検出することがで
き、また、本発明のオリゴヌクレチオドプライマーはＮ
ＡＮＢ肝炎ウイルスの高感度検出に供することができ
る。
【００１７】
【実施例】以下、本発明の実施例について述べるが、も
とより本発明がこれらの実施例に限定されるものではな
い。
とより本発明がこれらの実施例に限定されるものではな
い。
【００１８】実施例１ ＮＡＮＢ型肝炎ウイルスの５′末端塩基配列及びアミノ
酸配列を次のようにして決定した。 （１）ＲＮＡ抽出 日本人供血者の血漿から得た、ＨＣＶ抗体陽性（オーソ
・ダイアグノスティック・システムズ株式会社のオーソ
ＨＣＶＡｂＥＬＩＳＡテストによる）と判定された検体
（ＨＣ−Ｊ１）およびＮＡＮＢ型肝炎の感染性を確認し
たチンパンジーから得た、ＨＣＶ抗体（−）の検体（Ｈ
Ｃ−Ｊ４）より、次のようにしてＲＮＡを抽出した。
１．８ｍｌの血漿に１ｍｌのトリス塩酸緩衝液（１０ｍ
Ｍ、ｐＨ８．０）を加え、６８×１０３ｒｐｍで１時間
遠心した。得られたペレットに２００ｍＭ ＮａＣｌ、
１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）と１ｍｇ／ｍｌのプロテナーゼＫを含
むトリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）を加え、
６０℃１時間加温し、フェノール／クロロホルムで抽出
した後、エタノール沈殿を行い、ＲＮＡを得た。
酸配列を次のようにして決定した。 （１）ＲＮＡ抽出 日本人供血者の血漿から得た、ＨＣＶ抗体陽性（オーソ
・ダイアグノスティック・システムズ株式会社のオーソ
ＨＣＶＡｂＥＬＩＳＡテストによる）と判定された検体
（ＨＣ−Ｊ１）およびＮＡＮＢ型肝炎の感染性を確認し
たチンパンジーから得た、ＨＣＶ抗体（−）の検体（Ｈ
Ｃ−Ｊ４）より、次のようにしてＲＮＡを抽出した。
１．８ｍｌの血漿に１ｍｌのトリス塩酸緩衝液（１０ｍ
Ｍ、ｐＨ８．０）を加え、６８×１０３ｒｐｍで１時間
遠心した。得られたペレットに２００ｍＭ ＮａＣｌ、
１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）と１ｍｇ／ｍｌのプロテナーゼＫを含
むトリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）を加え、
６０℃１時間加温し、フェノール／クロロホルムで抽出
した後、エタノール沈殿を行い、ＲＮＡを得た。
【００１９】（２）ｃＤＮＡ合成 ＨＣ−Ｊ１血漿より抽出したＲＮＡを７０℃で１分間加
温し、これを鋳型として１０ユニットの逆転写酵素（ｃ
ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｙｓｔｅｍＰｌｕｓ，
Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｊａｐａｎ）及びオリゴヌクレオチ
ドプライマー（２０マー）２０ｐｍｏｌを加えて４２
℃、１．５時間反応させｃＤＮＡを得た。プライマーと
してはヨーロッパ特許出願第８８３１０２２．５号に示
されたＨＣＶの塩基配列を参照して合成した＃８（５′
−ＧＡＴＧＣＴＴＧＣＧＧＡＡＧＣＡＡＴＣＡ−３′）
を用いた。
温し、これを鋳型として１０ユニットの逆転写酵素（ｃ
ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｙｓｔｅｍＰｌｕｓ，
Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｊａｐａｎ）及びオリゴヌクレオチ
ドプライマー（２０マー）２０ｐｍｏｌを加えて４２
℃、１．５時間反応させｃＤＮＡを得た。プライマーと
してはヨーロッパ特許出願第８８３１０２２．５号に示
されたＨＣＶの塩基配列を参照して合成した＃８（５′
−ＧＡＴＧＣＴＴＧＣＧＧＡＡＧＣＡＡＴＣＡ−３′）
を用いた。
【００２０】（３）ポリメラーゼチェインリアクション
（ＰＣＲ）によるｃＤＮＡの増幅は次のように行った。
ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
・Ｃｅｔｕｓ）に、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＤＮＡ増幅試薬
キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ・Ｃｅｔｕｓ）を用
い、Ｓａｉｋｉらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９、４
８７−４９１．１９８８）によって３５サイクルのｃＤ
ＮＡ増幅を行った。
（ＰＣＲ）によるｃＤＮＡの増幅は次のように行った。
ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
・Ｃｅｔｕｓ）に、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＤＮＡ増幅試薬
キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ・Ｃｅｔｕｓ）を用
い、Ｓａｉｋｉらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９、４
８７−４９１．１９８８）によって３５サイクルのｃＤ
ＮＡ増幅を行った。
【００２１】（４）ｃＤＮＡライブラリーの構築による
Ｊ１、Ｊ４、各５′末端側塩基配列の決定 ｃＤＮＡライブラリーを用いたＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４
ゲノムの５′末端側の塩基配列解析は図１、図２に示す
ように、ｃＤＮＡをバクテリオファージλｇｔ１０に挿
入して得たクローンの解析及びｃＤＮＡをＰＣＲにて増
幅して得られたクローンの解析結果の両者を併せて決定
した。図１、図２はＮＡＮＢ型肝炎ウイルスゲノムの
５′末端を制限酵素切断部位とともに示し、使用するプ
ライマーの位置も示す。図中、実線はバクテリオファー
ジλｇｔ１０のライブラリーによるクローンで塩基配列
を決定した範囲を、点線はＰＣＲによるクローンで塩基
配列を決定した範囲を示す。ＨＣ−Ｊ１のｎｔ４５４〜
２１０９の１６５６塩基は前記プライマー＃８から得た
ｃＤＮＡをλｇｔ１０ファージベクター（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ）に挿入して得られたクローンφ４１により決定し
た。つぎにこのシークエンスをもとに合成した、ｎｔ８
２４〜８４３の新しいプライマー＃２５（５′−ＴＣＣ
ＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡＧＴＴＣＡＣＧ−３′）を用い
て、ＨＣ−Ｊ４のｃＤＮＡライブラリーから順次４つの
ｃＤＮＡクローンφ６０、φ６１、φ６６、φ７５を得
て、上流のｎｔ１８〜８４３の塩基配列を決めた。ＨＣ
−Ｊ４について、さらに上流の５′末端を特定するため
にｎｔ２４６〜２６５のアンチセンスプライマー＃３６
（５′−ＡＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧＣＡＧＴ−
３′）を用いてｃＤＮＡを合成したのち、ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによりｃＤＮ
Ａの５′末端にｄＡ付加を行い、２段階のｏｎｅ−Ｓｉ
ｄｅｄＰＣＲ増幅を行った、すなわち、１回目はオリゴ
ｄＴプライマー（２０−ｍｅｒ）とｎｔ１８８〜２０７
のアンチセンスプライマー＃４８（５′−ＧＴＴＧＡＴ
ＣＣＡＡＧＡＡＡＧＧＡＣＣＣ−３′）を用いて３５サ
イクルのＰＣＲ増幅を行い、２回目はそのＰＣＲ産物を
鋳型にしてオリゴｄＴプライマー（２０−ｍｅｒ）とｎ
ｔ１４０〜１６０のアンチセンスプライマー＃１０９
（２１−ｍｅｒ；５′−ＡＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＧＡ
ＣＣＡＣＴＡＴ−３′）を用いて３０サイクルのＰＣＲ
を行った。得られたＰＣＲ産物をＭ１３ファージベクタ
ーにサブクローニングした。完全長の５′末端配列を有
すると考えられる６個の独立したクローン、Ｃ８９６
２、Ｃ８９６８、Ｃ８９７０、Ｃ８９７４、Ｃ９０３
４、Ｃ９０３６が得られ、ｎｔ１〜１７の塩基配列を決
定した。
Ｊ１、Ｊ４、各５′末端側塩基配列の決定 ｃＤＮＡライブラリーを用いたＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４
ゲノムの５′末端側の塩基配列解析は図１、図２に示す
ように、ｃＤＮＡをバクテリオファージλｇｔ１０に挿
入して得たクローンの解析及びｃＤＮＡをＰＣＲにて増
幅して得られたクローンの解析結果の両者を併せて決定
した。図１、図２はＮＡＮＢ型肝炎ウイルスゲノムの
５′末端を制限酵素切断部位とともに示し、使用するプ
ライマーの位置も示す。図中、実線はバクテリオファー
ジλｇｔ１０のライブラリーによるクローンで塩基配列
を決定した範囲を、点線はＰＣＲによるクローンで塩基
配列を決定した範囲を示す。ＨＣ−Ｊ１のｎｔ４５４〜
２１０９の１６５６塩基は前記プライマー＃８から得た
ｃＤＮＡをλｇｔ１０ファージベクター（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ）に挿入して得られたクローンφ４１により決定し
た。つぎにこのシークエンスをもとに合成した、ｎｔ８
２４〜８４３の新しいプライマー＃２５（５′−ＴＣＣ
ＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡＧＴＴＣＡＣＧ−３′）を用い
て、ＨＣ−Ｊ４のｃＤＮＡライブラリーから順次４つの
ｃＤＮＡクローンφ６０、φ６１、φ６６、φ７５を得
て、上流のｎｔ１８〜８４３の塩基配列を決めた。ＨＣ
−Ｊ４について、さらに上流の５′末端を特定するため
にｎｔ２４６〜２６５のアンチセンスプライマー＃３６
（５′−ＡＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧＣＡＧＴ−
３′）を用いてｃＤＮＡを合成したのち、ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによりｃＤＮ
Ａの５′末端にｄＡ付加を行い、２段階のｏｎｅ−Ｓｉ
ｄｅｄＰＣＲ増幅を行った、すなわち、１回目はオリゴ
ｄＴプライマー（２０−ｍｅｒ）とｎｔ１８８〜２０７
のアンチセンスプライマー＃４８（５′−ＧＴＴＧＡＴ
ＣＣＡＡＧＡＡＡＧＧＡＣＣＣ−３′）を用いて３５サ
イクルのＰＣＲ増幅を行い、２回目はそのＰＣＲ産物を
鋳型にしてオリゴｄＴプライマー（２０−ｍｅｒ）とｎ
ｔ１４０〜１６０のアンチセンスプライマー＃１０９
（２１−ｍｅｒ；５′−ＡＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＧＡ
ＣＣＡＣＴＡＴ−３′）を用いて３０サイクルのＰＣＲ
を行った。得られたＰＣＲ産物をＭ１３ファージベクタ
ーにサブクローニングした。完全長の５′末端配列を有
すると考えられる６個の独立したクローン、Ｃ８９６
２、Ｃ８９６８、Ｃ８９７０、Ｃ８９７４、Ｃ９０３
４、Ｃ９０３６が得られ、ｎｔ１〜１７の塩基配列を決
定した。
【００２２】一方ＨＣ−Ｊ１の上流のシークエンスは、
ｎｔ１８〜８４３についてはプライマー＃４４（５′−
ＧＧＣＧＡＣＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴ−３′）と
＃２５（５′−ＴＣＣＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡＧＴＴＣＡ
ＣＧ−３′）を用いたＰＣＲによって得られたクローン
Ｃ２５０３、Ｃ２５０８、及びＣ２５１０によって決め
られた。さらに上流の５′末端は、ＨＣ−Ｊ４と同様の
方法により得られた１６個のクローン、Ｃ８９３１、Ｃ
８９３２、Ｃ８９３５、Ｃ８９３７、Ｃ８９４２、Ｃ８
９４４、Ｃ８９４９、Ｃ８９５０、Ｃ８９５１、Ｃ８９
５４、Ｃ８９５５、Ｃ９０２３、Ｃ９０２６、Ｃ９０３
０、Ｃ９０３１、Ｃ９０３２を用いて、ｎｔ１〜３７の
塩基配列を決めた。次にＨＣ−Ｊ１の５′末端側下流の
塩基配列を決定するため、プライマー＃１４８（５′−
ＴＧＣＡＣＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＴＣＡＡＣ−３′）と
＃１４６（５′−ＡＧＴＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡ
ＧＣＡ−３′）を用いて３０サイクルのＰＣＲを行っ
た。得られたクローンのＣ１１４４４、Ｃ１１４５０、
Ｃ１１４５１によりｎｔ１９８４〜２５６０の塩基配列
を決定した。一方、ＨＣ−Ｊ４のｎｔ７３８〜１９００
までの下流シークエンス１１６３塩基はプライマー＃３
０（５′−ＣＴＣＡＴＧＧＧＧＴＡＣＡＴＴＣＣＧＣＴ
−３′）と＃４２（５′−ＴＣＧＧＴＣＧＴＣＣＣＣＡ
ＣＣＡＣＡＡＣ−３′）を用いたＰＣＲによって得られ
た３つのクローンＣ２８２１、Ｃ３１７３、Ｃ３１９２
によって決められた。さらにＨＣ−Ｊ４の下流の塩基配
列を決定するため、プライマー＃５７（５′−ＴＡＴＴ
ＧＣＴＴＣＡＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣ−３′）と＃１４６
（５′−ＡＧＴＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡＧＣＡ−
３′）を用いて３０サイクルのＰＣＲを行った。得られ
たクローンＣ１１４６２、Ｃ１１４６３、Ｃ１１４６４
によりｎｔ１８６０〜２５６０の塩基配列を決定した。
以上の解析結果により、ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４は５′
末端側にそれぞれ配列番号３、４に示す塩基配列を有す
るものと決定した。
ｎｔ１８〜８４３についてはプライマー＃４４（５′−
ＧＧＣＧＡＣＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴ−３′）と
＃２５（５′−ＴＣＣＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡＧＴＴＣＡ
ＣＧ−３′）を用いたＰＣＲによって得られたクローン
Ｃ２５０３、Ｃ２５０８、及びＣ２５１０によって決め
られた。さらに上流の５′末端は、ＨＣ−Ｊ４と同様の
方法により得られた１６個のクローン、Ｃ８９３１、Ｃ
８９３２、Ｃ８９３５、Ｃ８９３７、Ｃ８９４２、Ｃ８
９４４、Ｃ８９４９、Ｃ８９５０、Ｃ８９５１、Ｃ８９
５４、Ｃ８９５５、Ｃ９０２３、Ｃ９０２６、Ｃ９０３
０、Ｃ９０３１、Ｃ９０３２を用いて、ｎｔ１〜３７の
塩基配列を決めた。次にＨＣ−Ｊ１の５′末端側下流の
塩基配列を決定するため、プライマー＃１４８（５′−
ＴＧＣＡＣＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＴＣＡＡＣ−３′）と
＃１４６（５′−ＡＧＴＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡ
ＧＣＡ−３′）を用いて３０サイクルのＰＣＲを行っ
た。得られたクローンのＣ１１４４４、Ｃ１１４５０、
Ｃ１１４５１によりｎｔ１９８４〜２５６０の塩基配列
を決定した。一方、ＨＣ−Ｊ４のｎｔ７３８〜１９００
までの下流シークエンス１１６３塩基はプライマー＃３
０（５′−ＣＴＣＡＴＧＧＧＧＴＡＣＡＴＴＣＣＧＣＴ
−３′）と＃４２（５′−ＴＣＧＧＴＣＧＴＣＣＣＣＡ
ＣＣＡＣＡＡＣ−３′）を用いたＰＣＲによって得られ
た３つのクローンＣ２８２１、Ｃ３１７３、Ｃ３１９２
によって決められた。さらにＨＣ−Ｊ４の下流の塩基配
列を決定するため、プライマー＃５７（５′−ＴＡＴＴ
ＧＣＴＴＣＡＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣ−３′）と＃１４６
（５′−ＡＧＴＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡＧＣＡ−
３′）を用いて３０サイクルのＰＣＲを行った。得られ
たクローンＣ１１４６２、Ｃ１１４６３、Ｃ１１４６４
によりｎｔ１８６０〜２５６０の塩基配列を決定した。
以上の解析結果により、ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４は５′
末端側にそれぞれ配列番号３、４に示す塩基配列を有す
るものと決定した。
【００２３】実施例２ ５′非翻訳領域及びコア蛋白質コード領域に基づいたプ
ライマーの合成及び測定系の確立 （１）オリゴヌクレオチドプライマーの合成 実施例１で決定したＨＣ−Ｊ１とＨＣ−Ｊ４株の５′翻
訳領域及びコア蛋白質コード領域の塩基配列に基づき、
オリコヌクレオチドプライマー（２０マー）を合成し
た。また、ヨーロッパ特許出願第８８３１０９２２．５
号に示されたＨＣＶの塩基配列を参照してオリゴヌクレ
オチドプライマーも合成した。合成は３８０ＢＤＮＡ合
成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｊａｐ
ａｎ）を用いて行った。合成したプライマーは＃３、
４、５、６、９、１０、１１、１２、１６、１７、２
１、２２、２３、２５、３２Ａ、３３、３４、３５、３
６、４８であり、各プライマーについて、５′−末端よ
りの位置、塩基配列を表１に示す。
ライマーの合成及び測定系の確立 （１）オリゴヌクレオチドプライマーの合成 実施例１で決定したＨＣ−Ｊ１とＨＣ−Ｊ４株の５′翻
訳領域及びコア蛋白質コード領域の塩基配列に基づき、
オリコヌクレオチドプライマー（２０マー）を合成し
た。また、ヨーロッパ特許出願第８８３１０９２２．５
号に示されたＨＣＶの塩基配列を参照してオリゴヌクレ
オチドプライマーも合成した。合成は３８０ＢＤＮＡ合
成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｊａｐ
ａｎ）を用いて行った。合成したプライマーは＃３、
４、５、６、９、１０、１１、１２、１６、１７、２
１、２２、２３、２５、３２Ａ、３３、３４、３５、３
６、４８であり、各プライマーについて、５′−末端よ
りの位置、塩基配列を表１に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】（２）検体からのＮＡＮＢ肝炎ウイルスＲ
ＮＡの抽出 血漿１ｍｌをＴＬ−１００（ベックマン）遠心機で９０
Ｋｒｐｍ１５分遠心分離し、得られたペレットを、２０
０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、２％（Ｗ／Ｖ）
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリス塩酸（５０
ｍＭ、ｐＨ８．０）、１ｍｇ／ｍｌプロティンナーゼＫ
を含む溶液に溶解し、６０℃で１時間加温した。等量の
フェノール／クロロホルム溶液を用いて２回抽出後、エ
タノール沈澱を−２０℃で３時間以上かけて行った。沈
澱物は、７０％エタノールで遠心洗浄し、真空乾燥の後
５μｌの蒸留水に溶解した
ＮＡの抽出 血漿１ｍｌをＴＬ−１００（ベックマン）遠心機で９０
Ｋｒｐｍ１５分遠心分離し、得られたペレットを、２０
０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、２％（Ｗ／Ｖ）
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリス塩酸（５０
ｍＭ、ｐＨ８．０）、１ｍｇ／ｍｌプロティンナーゼＫ
を含む溶液に溶解し、６０℃で１時間加温した。等量の
フェノール／クロロホルム溶液を用いて２回抽出後、エ
タノール沈澱を−２０℃で３時間以上かけて行った。沈
澱物は、７０％エタノールで遠心洗浄し、真空乾燥の後
５μｌの蒸留水に溶解した
【００２６】（３）ｃＤＮＡの合成 （２）において１ｍｌの血漿から抽出したＲＮＡを、７
０℃で１分間変性させ、氷上で急冷し、ｃＤＮＡ合成に
供した。逆転写は、各々１００ｐｍｏｌのアンチセンス
プライマー＃５、６、１１、１２、１６、１７、２５、
３５、３６、４８に１０ｎｍｏｌの４種のデオキシリボ
ヌクレオチド３リン酸（Ｔａｋａｒａ）、１０ｕｎｉｔ
のＲＮａｓｅ阻害剤（Ｔａｋａｒａ）、１０ｕｎｉｔの
Ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕ
ｓ逆転写酵素（ベーリンガーマンハイム）を加え、１０
ｕｌのトリス−塩酸（５０ｍＭｐＨ８．４）、８ｍＭ
ＭｇＣｌ２、３０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭｄｉｔｈｉｏｔ
ｈｒｅｉｔｏｌ溶液中で、４２℃９０分反応させてｃＤ
ＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡは、フェノール／ク
ロロホルムで抽出により精製した。
０℃で１分間変性させ、氷上で急冷し、ｃＤＮＡ合成に
供した。逆転写は、各々１００ｐｍｏｌのアンチセンス
プライマー＃５、６、１１、１２、１６、１７、２５、
３５、３６、４８に１０ｎｍｏｌの４種のデオキシリボ
ヌクレオチド３リン酸（Ｔａｋａｒａ）、１０ｕｎｉｔ
のＲＮａｓｅ阻害剤（Ｔａｋａｒａ）、１０ｕｎｉｔの
Ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕ
ｓ逆転写酵素（ベーリンガーマンハイム）を加え、１０
ｕｌのトリス−塩酸（５０ｍＭｐＨ８．４）、８ｍＭ
ＭｇＣｌ２、３０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭｄｉｔｈｉｏｔ
ｈｒｅｉｔｏｌ溶液中で、４２℃９０分反応させてｃＤ
ＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡは、フェノール／ク
ロロホルムで抽出により精製した。
【００２７】（４）ＰＣＲによる増幅 ＤＮＡ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ
−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）とＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔキット（Ｐｅｒｋｉｎ−
Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を用い、通常の方法（Ｓａｉ
ｋｉ ｅｔ ａｌ １９８８）でＰＣＲによる増幅を行
った。反応サイクルは、変性（９４℃１分間）、プライ
マーのアニール（５５℃１分３０秒）および、プライマ
ーの伸長（７２℃３分間）の工程であり、これを３５回
繰り返した。反応生成物を１−１、５％Ｎｕｓｉｅｖｅ
と１−１、５％Ｓｅａｋｅｍの混合アガロースゲル（Ｆ
ＭＣ社）で電気泳動し。臭化エチジウムの染色の後、紫
外線照射でバンドを確認した。
−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）とＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔキット（Ｐｅｒｋｉｎ−
Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を用い、通常の方法（Ｓａｉ
ｋｉ ｅｔ ａｌ １９８８）でＰＣＲによる増幅を行
った。反応サイクルは、変性（９４℃１分間）、プライ
マーのアニール（５５℃１分３０秒）および、プライマ
ーの伸長（７２℃３分間）の工程であり、これを３５回
繰り返した。反応生成物を１−１、５％Ｎｕｓｉｅｖｅ
と１−１、５％Ｓｅａｋｅｍの混合アガロースゲル（Ｆ
ＭＣ社）で電気泳動し。臭化エチジウムの染色の後、紫
外線照射でバンドを確認した。
【００２８】（５）２次ＰＣＲによる増幅 最初の１組のプライマー（＃３２Ａと＃３６）によるＰ
ＣＲで得たＰＣＲ産物を、必要に応じさらに２回目のＰ
ＣＲ増幅にかける。プライマーとしては、最初の１組の
プライマーの内側プライマー（たとえば＃３３と＃４
８）を選択し、ＰＣＲ産物５μｌについて、３０サイク
ル繰り返した。＃３３、＃４８の塩基配列は表１に示す
とおりである。反応条件は変性（９４℃、１分）アニー
ル（５５℃、１．５分）及び伸長（７２℃、２分）であ
り、得られたＰＣＲ産物を電気泳動にかけ、（４）と同
様にして解析した。
ＣＲで得たＰＣＲ産物を、必要に応じさらに２回目のＰ
ＣＲ増幅にかける。プライマーとしては、最初の１組の
プライマーの内側プライマー（たとえば＃３３と＃４
８）を選択し、ＰＣＲ産物５μｌについて、３０サイク
ル繰り返した。＃３３、＃４８の塩基配列は表１に示す
とおりである。反応条件は変性（９４℃、１分）アニー
ル（５５℃、１．５分）及び伸長（７２℃、２分）であ
り、得られたＰＣＲ産物を電気泳動にかけ、（４）と同
様にして解析した。
【００２９】実施例４ ＰＣＲによるＮＡＮＢ型肝炎ウイルスの検出系に用いる
のに有効なプライマー対の選択 既に、ａｎｔｉ−ＨＣＶ陽性と判定された１０検体、す
なわち日本人供血者の血漿検体Ｎｏ、１，３，５，７，
９及びＮＡＮＢ肝炎患者の血清検体Ｎｏ２，４，６，
８，１０に対して、１対のプライマーを用いたＰＣＲの
結果を表２に示す。
のに有効なプライマー対の選択 既に、ａｎｔｉ−ＨＣＶ陽性と判定された１０検体、す
なわち日本人供血者の血漿検体Ｎｏ、１，３，５，７，
９及びＮＡＮＢ肝炎患者の血清検体Ｎｏ２，４，６，
８，１０に対して、１対のプライマーを用いたＰＣＲの
結果を表２に示す。
【００３０】
【表２】
【００３１】ターゲットとする塩基配列領域は、ヨーロ
ッパ特許出願第８８３１０９２２．５号に示されたＨＣ
Ｖ非構造蛋白質ＮＳ５から２領域、ＮＳ３から２領域、
ＮＳ１から上流にまたがる領域の２領域、そして、本発
明者らが明らかにしたコア領域の２領域、５′非翻訳領
域から２領域の計１０領域に対してＰＣＲ増幅を試み
た。その結果、５′非翻訳領域よりのプライマー対であ
る＃３２Ａ／＃３６，＃３３／＃４８及びコア領域より
のプライマー対である＃２３／＃２５を用いた場合、１
０サンプル全てについて、それぞれ３領域の２４２ｂ
ｐ、１４５ｂｐ、そして３７７ｂｐの予測されたサイズ
のＮＡＮＢ ｃＤＮＡバンドを検出できた。しかし、他
の７領域では、ＨＣＶ ＲＮＡの存在が確認されていな
がら、１０サンプル中２〜９検体が、増幅されたのみで
あった。このことから、広範囲なＨＣＶのＲＮＡ検出を
行うプライマーの対として、本発明のプライマーである
５′非翻訳領域からの＃３２Ａ／＃３６及び＃３３／＃
４８と、コア領域の＃２３／＃２５が効率的であると結
論づけられた。ＮＡＮＢ肝炎ウイルスＲＮＡの検出に
は、１次ＰＣＲのみで十分な場合もあるが、より感度を
上げるにはさらに２次ＰＣＲを行うのが好ましい。例え
ば＃３６プライマーでｃＤＮＡ合成を行った後、＃３６
と＃３２ＡによるＰＣＲ増幅（１次ＰＣＲ）を行い、２
４２ｂｐの予想バンドが認められない検体については、
ＰＣＲ増幅ＲＮＡを鋳型として＃３３と＃４８のプライ
マーで再増幅（２次ＰＣＲ）を行った。（ダブルＰＣ
Ｒ）
ッパ特許出願第８８３１０９２２．５号に示されたＨＣ
Ｖ非構造蛋白質ＮＳ５から２領域、ＮＳ３から２領域、
ＮＳ１から上流にまたがる領域の２領域、そして、本発
明者らが明らかにしたコア領域の２領域、５′非翻訳領
域から２領域の計１０領域に対してＰＣＲ増幅を試み
た。その結果、５′非翻訳領域よりのプライマー対であ
る＃３２Ａ／＃３６，＃３３／＃４８及びコア領域より
のプライマー対である＃２３／＃２５を用いた場合、１
０サンプル全てについて、それぞれ３領域の２４２ｂ
ｐ、１４５ｂｐ、そして３７７ｂｐの予測されたサイズ
のＮＡＮＢ ｃＤＮＡバンドを検出できた。しかし、他
の７領域では、ＨＣＶ ＲＮＡの存在が確認されていな
がら、１０サンプル中２〜９検体が、増幅されたのみで
あった。このことから、広範囲なＨＣＶのＲＮＡ検出を
行うプライマーの対として、本発明のプライマーである
５′非翻訳領域からの＃３２Ａ／＃３６及び＃３３／＃
４８と、コア領域の＃２３／＃２５が効率的であると結
論づけられた。ＮＡＮＢ肝炎ウイルスＲＮＡの検出に
は、１次ＰＣＲのみで十分な場合もあるが、より感度を
上げるにはさらに２次ＰＣＲを行うのが好ましい。例え
ば＃３６プライマーでｃＤＮＡ合成を行った後、＃３６
と＃３２ＡによるＰＣＲ増幅（１次ＰＣＲ）を行い、２
４２ｂｐの予想バンドが認められない検体については、
ＰＣＲ増幅ＲＮＡを鋳型として＃３３と＃４８のプライ
マーで再増幅（２次ＰＣＲ）を行った。（ダブルＰＣ
Ｒ）
【００３２】実施例４ 慢性肝炎患者１０検体とＡＬＴの正常な供血者血清１２
検体について、ＰＣＲによるＲＮＡ検出を実施した。結
果は、表３に示す。
検体について、ＰＣＲによるＲＮＡ検出を実施した。結
果は、表３に示す。
【００３３】
【表３】
【００３４】ＮＡＮＢ型３２検体はあらかじめａｎｔｉ
−ＨＣＶを測定した結果、陽性２０検体、陰性１２検体
であった。Ｂ型患者１０検体と正常な供血者１２検体は
いずれもａｎｔｉ−ＨＣＶ陰性であった。ＮＡＮＢ型３
２検体のうち、ａｎｔｉ−ＨＣＶ（＋）の２０検体は、
１次ＰＣＲで１５例、２次ＰＣＲで５例と１００％ＲＮ
Ａ検出ができた。ａｎｔｉ−ＨＣＶ（−）とされた１２
例についても１次ＰＣＲで７例、２次ＰＣＲで４例と、
９２％ＲＮＡ検出が可能であった。また、Ｂ型の１０例
及び供血者１２例はいずれも２次ＰＣＲまで行ったが、
陰性であった。このデータより、ＮＡＮＢ型ウイルスＲ
ＮＡ検出系として、オリゴヌクレオチドプライマー＃３
２Ａおよび／または＃３６を用いた本発明のＰＣＲ法が
すぐれており、特に２次ＰＣＲまで行うダブルＰＣＲ法
によれば、非常に高感度（ＮＡＮＢ検体のほぼ全部にあ
たる９６．９％を検出）で特異性の高い検出法となるこ
とが確認された。
−ＨＣＶを測定した結果、陽性２０検体、陰性１２検体
であった。Ｂ型患者１０検体と正常な供血者１２検体は
いずれもａｎｔｉ−ＨＣＶ陰性であった。ＮＡＮＢ型３
２検体のうち、ａｎｔｉ−ＨＣＶ（＋）の２０検体は、
１次ＰＣＲで１５例、２次ＰＣＲで５例と１００％ＲＮ
Ａ検出ができた。ａｎｔｉ−ＨＣＶ（−）とされた１２
例についても１次ＰＣＲで７例、２次ＰＣＲで４例と、
９２％ＲＮＡ検出が可能であった。また、Ｂ型の１０例
及び供血者１２例はいずれも２次ＰＣＲまで行ったが、
陰性であった。このデータより、ＮＡＮＢ型ウイルスＲ
ＮＡ検出系として、オリゴヌクレオチドプライマー＃３
２Ａおよび／または＃３６を用いた本発明のＰＣＲ法が
すぐれており、特に２次ＰＣＲまで行うダブルＰＣＲ法
によれば、非常に高感度（ＮＡＮＢ検体のほぼ全部にあ
たる９６．９％を検出）で特異性の高い検出法となるこ
とが確認された。
【００３５】実施例５ ｃＤＮＡ／ダブルＰＣＲ法によるＮＡＮＢ肝炎ウイルス
の検出感度 本発明のｃＤＮＡ／ダブルＰＣＲ法による、ＮＡＮＢ型
肝炎ウイルスＲＮＡの検出感度について以下に述べる。
結果は表４に示す。
の検出感度 本発明のｃＤＮＡ／ダブルＰＣＲ法による、ＮＡＮＢ型
肝炎ウイルスＲＮＡの検出感度について以下に述べる。
結果は表４に示す。
【００３６】
【表４】
【００３７】感染価のわかっている血漿１０７ＣＩＤ／
ｍｌを用い、１０倍希釈列を作製し、同じ測定をそれぞ
れ３回行った。１次ＰＣＲでは３回の測定中２回で１０
０ＣＩＤ／ｍｌまで、残りの１回で１０ＣＩＤ／ｍｌま
で予測される２４２ｂｐのバンドの検出が確認された。
２次ＰＣＲを行うことにより、２回の測定で１０ＣＩＤ
／ｍｌまで、１回の測定で１ＣＩＤ／ｍｌまで予測され
た１４５ｂｐのバンドが認められた。又、１ＣＩＤ／ｍ
ｌ以下の希釈及び陰性血漿では、全くバンドは観察され
なかった。ＮＡＮＢ型肝炎患者の平均力価は、血漿当た
り１０２〜４ＣＩＤ／ｍｌと考えられており、ＮＡＮＢ
型肝炎患者の診断の上で、臨床上有効な検出感度をもっ
ていると確認された。
ｍｌを用い、１０倍希釈列を作製し、同じ測定をそれぞ
れ３回行った。１次ＰＣＲでは３回の測定中２回で１０
０ＣＩＤ／ｍｌまで、残りの１回で１０ＣＩＤ／ｍｌま
で予測される２４２ｂｐのバンドの検出が確認された。
２次ＰＣＲを行うことにより、２回の測定で１０ＣＩＤ
／ｍｌまで、１回の測定で１ＣＩＤ／ｍｌまで予測され
た１４５ｂｐのバンドが認められた。又、１ＣＩＤ／ｍ
ｌ以下の希釈及び陰性血漿では、全くバンドは観察され
なかった。ＮＡＮＢ型肝炎患者の平均力価は、血漿当た
り１０２〜４ＣＩＤ／ｍｌと考えられており、ＮＡＮＢ
型肝炎患者の診断の上で、臨床上有効な検出感度をもっ
ていると確認された。
【００３８】
【発明の効果】本発明によれば、ＮＡＮＢ肝炎ウイルス
に特異的で高感度の検出法に提供できる。したがって、
肝炎患者の正確な診断あるいは供血のスクリーニングに
よる輸血後肝炎の防止に重要な役割を果たすことができ
る。
に特異的で高感度の検出法に提供できる。したがって、
肝炎患者の正確な診断あるいは供血のスクリーニングに
よる輸血後肝炎の防止に重要な役割を果たすことができ
る。
ＮＡＮＢ肝炎ウイルスの塩基配列決定の方法を示す図。
【図１】は、ＨＣ−Ｊ１株。
【図２】は、ＨＣ−Ｊ４株。図中、実線はバクテリオフ
ァージλｇｔ１０のライブラリーによるクローンで塩基
配列を決定した範囲、点線はＰＣＲによるクローンで塩
基配列を決定した範囲を示し、クローン名を線の横に示
した。
ァージλｇｔ１０のライブラリーによるクローンで塩基
配列を決定した範囲、点線はＰＣＲによるクローンで塩
基配列を決定した範囲を示し、クローン名を線の横に示
した。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年８月２６日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、オリゴヌクレオチド
と、これを用いて非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス（以下「ＮＡ
ＮＢ肝炎ウイルス」と略記する）を遺伝子レベルで高感
度に検出する方法に関する。
と、これを用いて非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス（以下「ＮＡ
ＮＢ肝炎ウイルス」と略記する）を遺伝子レベルで高感
度に検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ウイルスに由来する肝炎には、既にウイ
ルス本体のＤＮＡやＲＮＡがつきとめられ、その診断法
や予防法が確立したものとしてＢ型肝炎、Ａ型肝炎、Ｄ
型肝炎、Ｅ型肝炎がある。しかし、主として血液を介し
て感染する肝炎で上記の分類に属さない、非Ａ非Ｂ型肝
炎（以下「ＮＡＮＢ肝炎」という）については、世界の
多くの研究者がその原因ウィルスを捜してきたにもかか
わらずウイルス本体の解明はなされていなかった。
ルス本体のＤＮＡやＲＮＡがつきとめられ、その診断法
や予防法が確立したものとしてＢ型肝炎、Ａ型肝炎、Ｄ
型肝炎、Ｅ型肝炎がある。しかし、主として血液を介し
て感染する肝炎で上記の分類に属さない、非Ａ非Ｂ型肝
炎（以下「ＮＡＮＢ肝炎」という）については、世界の
多くの研究者がその原因ウィルスを捜してきたにもかか
わらずウイルス本体の解明はなされていなかった。
【０００３】１９８８年になってカイロン社は、ＮＡＮ
Ｂ型肝炎の原因ウイルスとして、Ｃ型肝炎ウイルス（以
下「ＨＣＶ」と略記する）と命名したＲＮＡウイルスゲ
ノムのクローン化に成功したとして、その塩基配列を発
表した。そしてこれを基にＨＣＶ抗体の測定系を開発
し、現在輸血血液のスクリーニングや患者の診断に用い
られ始めている。このＨＣＶ抗体の測定系はＮＡＮＢ肝
炎との関連性がたしかに一部認められる。しかし、キャ
リアや慢性肝炎の捕捉率が約７０％にすぎないこと、ま
た急性期の抗体検出ができないこと等の重大な問題点が
残されており、カイロン社の前記開発によってもＮＡＮ
Ｂ肝炎への対処は依然として解決されていない。他方、
Ｂ型肝炎ウイルスの検出法は既に確立されている。この
ため日本においては輸血後肝炎の９５％以上がＮＡＮＢ
肝炎であり、年間約２８万例の発症が推定されている。
ＮＡＮＢ肝炎の経過は不良であり、大部分の例はキャリ
ア化して慢性肝炎に進展すると予測される。又、かなり
高率に１０〜２０数年にかけて肝硬変へ、さらに肝癌へ
進むことから、一日も早いウイルス本体の解明及び診断
薬の開発が望まれている。
Ｂ型肝炎の原因ウイルスとして、Ｃ型肝炎ウイルス（以
下「ＨＣＶ」と略記する）と命名したＲＮＡウイルスゲ
ノムのクローン化に成功したとして、その塩基配列を発
表した。そしてこれを基にＨＣＶ抗体の測定系を開発
し、現在輸血血液のスクリーニングや患者の診断に用い
られ始めている。このＨＣＶ抗体の測定系はＮＡＮＢ肝
炎との関連性がたしかに一部認められる。しかし、キャ
リアや慢性肝炎の捕捉率が約７０％にすぎないこと、ま
た急性期の抗体検出ができないこと等の重大な問題点が
残されており、カイロン社の前記開発によってもＮＡＮ
Ｂ肝炎への対処は依然として解決されていない。他方、
Ｂ型肝炎ウイルスの検出法は既に確立されている。この
ため日本においては輸血後肝炎の９５％以上がＮＡＮＢ
肝炎であり、年間約２８万例の発症が推定されている。
ＮＡＮＢ肝炎の経過は不良であり、大部分の例はキャリ
ア化して慢性肝炎に進展すると予測される。又、かなり
高率に１０〜２０数年にかけて肝硬変へ、さらに肝癌へ
進むことから、一日も早いウイルス本体の解明及び診断
薬の開発が望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上記カイロン社のＨＣ
Ｖ抗体検出キットでは診断できないＮＡＮＢ肝炎が多数
存在すること、さらに本発明者らの研究により日本のＮ
ＡＮＢ肝炎ウイルスがカイロン社の解明したＨＣＶとは
塩基配列において相当異なることが明らかになったこと
から、特異性、感度においてさらに優れたＮＡＮＢ肝炎
診断法の開発が不可欠である。 本発明の目的は、ＮＡ
ＮＢ肝炎ウイルスを遺伝子レベルで高感度に検出する方
法と、これに用いるオリゴヌクレオチドプライマーを提
供することである。
Ｖ抗体検出キットでは診断できないＮＡＮＢ肝炎が多数
存在すること、さらに本発明者らの研究により日本のＮ
ＡＮＢ肝炎ウイルスがカイロン社の解明したＨＣＶとは
塩基配列において相当異なることが明らかになったこと
から、特異性、感度においてさらに優れたＮＡＮＢ肝炎
診断法の開発が不可欠である。 本発明の目的は、ＮＡ
ＮＢ肝炎ウイルスを遺伝子レベルで高感度に検出する方
法と、これに用いるオリゴヌクレオチドプライマーを提
供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＮＡＮＢ
肝炎ウイルスの遺伝子本体の解明を目的として、ヒトお
よびチンパンジーキャリアの血清より、ＮＡＮＢ肝炎ウ
イルスのＲＮＡを単離し、ウイルスの非コード領域を含
む遺伝子領域全体をカバーするｃＤＮＡをクローン化し
てその塩基配列を決定した。その結果、本発明者らは、
ＮＡＮＢ肝炎ウイルスのうち非常に保存性の高い領域
と、ウイルス株間で変異が多い領域とが存在することを
解明し、これにもとづいて本発明を完成した。
肝炎ウイルスの遺伝子本体の解明を目的として、ヒトお
よびチンパンジーキャリアの血清より、ＮＡＮＢ肝炎ウ
イルスのＲＮＡを単離し、ウイルスの非コード領域を含
む遺伝子領域全体をカバーするｃＤＮＡをクローン化し
てその塩基配列を決定した。その結果、本発明者らは、
ＮＡＮＢ肝炎ウイルスのうち非常に保存性の高い領域
と、ウイルス株間で変異が多い領域とが存在することを
解明し、これにもとづいて本発明を完成した。
【０００６】本発明の要旨は次の通りである。本発明の
ＮＡＮＢ肝炎ウイルスＲＮＡは次のようにして得て、そ
の塩基配列を決定した。ヒト及びチンパンジー血漿より
２種の検体を得た。ＨＣ−Ｊ１は日本人供血者に由来
し、ＨＣＶ抗体陽性と判定された検体より得られた。他
方、ＨＣ−Ｊ４はＮＡＮＢ肝炎の感染性を確認したチン
パンジーから得た検体に由来するが、しかしこれはカイ
ロン社の前記ＨＣＶ抗体では（−）のものであった。こ
の２種の検体血漿よりＲＮＡを抽出した。さらに各ＲＮ
Ａ間の塩基配列の相同性を調べ、実施例に示すように抽
出ＲＮＡの５′末側の約２５００の塩基配列、これらの
非コード領域、および構造蛋白質をコードする領域に関
して研究を成就し、本発明を完成するに至った。
ＮＡＮＢ肝炎ウイルスＲＮＡは次のようにして得て、そ
の塩基配列を決定した。ヒト及びチンパンジー血漿より
２種の検体を得た。ＨＣ−Ｊ１は日本人供血者に由来
し、ＨＣＶ抗体陽性と判定された検体より得られた。他
方、ＨＣ−Ｊ４はＮＡＮＢ肝炎の感染性を確認したチン
パンジーから得た検体に由来するが、しかしこれはカイ
ロン社の前記ＨＣＶ抗体では（−）のものであった。こ
の２種の検体血漿よりＲＮＡを抽出した。さらに各ＲＮ
Ａ間の塩基配列の相同性を調べ、実施例に示すように抽
出ＲＮＡの５′末側の約２５００の塩基配列、これらの
非コード領域、および構造蛋白質をコードする領域に関
して研究を成就し、本発明を完成するに至った。
【０００７】実施例１に示すように、ＨＣ−Ｊ１株、Ｈ
Ｃ−Ｊ４株由来のＲＮＡはいずれも５′末端より３４１
個のヌクレオチドよりなる５′非翻訳領域を有し、これ
に続いて構造蛋白質をコードする領域（１１４９塩基）
が続き、さらに非構造蛋白質をコードする領域を含め、
２５４０箇のヌクレオチドを有する。この知見にもとづ
き、配列番号３および４記載のポリヌクレオチドを得
た。
Ｃ−Ｊ４株由来のＲＮＡはいずれも５′末端より３４１
個のヌクレオチドよりなる５′非翻訳領域を有し、これ
に続いて構造蛋白質をコードする領域（１１４９塩基）
が続き、さらに非構造蛋白質をコードする領域を含め、
２５４０箇のヌクレオチドを有する。この知見にもとづ
き、配列番号３および４記載のポリヌクレオチドを得
た。
【０００８】ヨーロッパ公開特許第３８８２３２号（カ
イロン社）に示されたＨＣＶの配列と比較すると、本発
明者が解明した上記ヌクレオチド配列は、非コード領域
を含む５′末端側２４７７塩基に関してＪ１、Ｊ４の各
株ではそれぞれ９５．２％、８０．５％の相同性を有す
る。このことより、ＨＣ−Ｊ１株はカイロン社が同定し
たウイルス株に比較的近縁でアメリカ型ウイルスである
のに対して、Ｊ４株はこれとはやや異なり、日本型ウイ
ルスであることが示唆された。
イロン社）に示されたＨＣＶの配列と比較すると、本発
明者が解明した上記ヌクレオチド配列は、非コード領域
を含む５′末端側２４７７塩基に関してＪ１、Ｊ４の各
株ではそれぞれ９５．２％、８０．５％の相同性を有す
る。このことより、ＨＣ−Ｊ１株はカイロン社が同定し
たウイルス株に比較的近縁でアメリカ型ウイルスである
のに対して、Ｊ４株はこれとはやや異なり、日本型ウイ
ルスであることが示唆された。
【０００９】本発明者らはウイルスを、特異性、感度と
もに高い検出能力を示すポリメラーゼチェインリアクシ
ョンより検出するために、配列番号３および４記載のｃ
ＤＮＡに基づくプライマー、および配列番号１および２
記載のプライマーを用いる非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス検出
方法を確立した。本発明者らが解明した２株のウイルス
ＲＮＡの５′非コード領域はいずれも３４１塩基からな
り、塩基配列の保存性が非常に高い。例えば、塩基配列
の差異は、ＨＣ−Ｊ１とＨＣ−Ｊ４では８塩基のみであ
った。２株のウイルスＲＮＡは、上記以外の領域におい
ては株種間の変異が激しいことを考慮すると、５′非コ
ード領域において塩基配列が非常によく保存されている
ことは驚くべきことである。またコード領域の中でもＡ
ＴＧに続く上流部分では比較的変異が少ない。したがっ
て、これらの領域に由来する配列番号１（＃３２Ａ）お
よび／または配列番号２（＃３６）のオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして使用すれば、ＮＡＮＢ肝炎ウイル
スＲＮＡをその株間によって左右されることなく、すな
わち株種をとわずに高感度に検出できることを見いだし
た。
もに高い検出能力を示すポリメラーゼチェインリアクシ
ョンより検出するために、配列番号３および４記載のｃ
ＤＮＡに基づくプライマー、および配列番号１および２
記載のプライマーを用いる非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス検出
方法を確立した。本発明者らが解明した２株のウイルス
ＲＮＡの５′非コード領域はいずれも３４１塩基からな
り、塩基配列の保存性が非常に高い。例えば、塩基配列
の差異は、ＨＣ−Ｊ１とＨＣ−Ｊ４では８塩基のみであ
った。２株のウイルスＲＮＡは、上記以外の領域におい
ては株種間の変異が激しいことを考慮すると、５′非コ
ード領域において塩基配列が非常によく保存されている
ことは驚くべきことである。またコード領域の中でもＡ
ＴＧに続く上流部分では比較的変異が少ない。したがっ
て、これらの領域に由来する配列番号１（＃３２Ａ）お
よび／または配列番号２（＃３６）のオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして使用すれば、ＮＡＮＢ肝炎ウイル
スＲＮＡをその株間によって左右されることなく、すな
わち株種をとわずに高感度に検出できることを見いだし
た。
【００１０】前記各知見にもとづいて、本発明者らはＮ
ＡＮＢ肝炎ウイルスを遺伝子レベルで高感度に検出する
のに用いる好適なオリゴヌクレオチドプライマーとし
て、配列番号１および２記載の塩基配列を有する下記オ
リゴヌクレオチドを見出し、これらを全て合成して本発
明を完成した。これら各オリゴヌクレオチドは、いずれ
もプライマーとして用いることができる。本発明のオリ
ゴヌクレオチドプライマーの塩基配列、センス：アンチ
センスの別は次のとおりである。 ＃３２Ａ（配列番号１；＋） ＃３６（配列番号２；−） 本発明においては、＃３２Ａ、＃３６ともプライマーと
してＮＡＮＢ肝炎ウイルスの検出のために用いることが
できる（請求項第１項）。
ＡＮＢ肝炎ウイルスを遺伝子レベルで高感度に検出する
のに用いる好適なオリゴヌクレオチドプライマーとし
て、配列番号１および２記載の塩基配列を有する下記オ
リゴヌクレオチドを見出し、これらを全て合成して本発
明を完成した。これら各オリゴヌクレオチドは、いずれ
もプライマーとして用いることができる。本発明のオリ
ゴヌクレオチドプライマーの塩基配列、センス：アンチ
センスの別は次のとおりである。 ＃３２Ａ（配列番号１；＋） ＃３６（配列番号２；−） 本発明においては、＃３２Ａ、＃３６ともプライマーと
してＮＡＮＢ肝炎ウイルスの検出のために用いることが
できる（請求項第１項）。
【００１１】本発明は、ＮＡＮＢ肝炎ウイルスＲＮＡに
特異的なオリゴヌクレオチドを使用する限り、株間の変
異に由来する少数の置換を含むオリゴヌクレオチドに対
しても適用され、これらもまた本発明の範囲に包含され
る。
特異的なオリゴヌクレオチドを使用する限り、株間の変
異に由来する少数の置換を含むオリゴヌクレオチドに対
しても適用され、これらもまた本発明の範囲に包含され
る。
【００１２】ＰＣＲ法を利用してＮＡＮＢ肝炎ウイルス
を検出するのに際し、本発明のプライマーペア＃３２Ａ
と＃３６とを組み合わせて使用することにより、さらに
好ましい効果を得ることができる（請求項第２項）。
を検出するのに際し、本発明のプライマーペア＃３２Ａ
と＃３６とを組み合わせて使用することにより、さらに
好ましい効果を得ることができる（請求項第２項）。
【００１３】また、本発明は、オリゴヌクレオチドプラ
イマー＃３２Ａを用いてＮＡＮＢ肝炎ウイルスを高感度
に検出する方法の発明である（請求項第３項）。
イマー＃３２Ａを用いてＮＡＮＢ肝炎ウイルスを高感度
に検出する方法の発明である（請求項第３項）。
【００１４】さらに、本発明は、オリゴヌクレオチドプ
ライマーのペア＃３２Ａと＃３６を用いて、ＮＡＮＢ肝
炎ウイルスＲＮＡのｃＤＮＡをポリメラーゼチエインリ
アクションにより増幅させて該ウイルスＲＮＡを高感度
に検出する方法ならびにその検出系の発明である（請求
項第４項）。
ライマーのペア＃３２Ａと＃３６を用いて、ＮＡＮＢ肝
炎ウイルスＲＮＡのｃＤＮＡをポリメラーゼチエインリ
アクションにより増幅させて該ウイルスＲＮＡを高感度
に検出する方法ならびにその検出系の発明である（請求
項第４項）。
【００１５】その際、オリゴヌクレチオドペアを２組用
いてｃＤＮＡの増幅を２回行うことはＮＡＮＢ肝炎ウイ
ルスの検出を高感度に行うために好適である。
いてｃＤＮＡの増幅を２回行うことはＮＡＮＢ肝炎ウイ
ルスの検出を高感度に行うために好適である。
【００１６】
【作用】上記したように、本発明の方法はＮＡＮＢ肝炎
ウイルスを遺伝子レベルで高感度に検出することがで
き、また、本発明のオリゴヌクレチオドプライマーはＮ
ＡＮＢ肝炎ウイルスの高感度検出に供することができ
る。
ウイルスを遺伝子レベルで高感度に検出することがで
き、また、本発明のオリゴヌクレチオドプライマーはＮ
ＡＮＢ肝炎ウイルスの高感度検出に供することができ
る。
【００１７】
【実施例】以下、本発明の実施例について述べるが、も
とより本発明がこれらの実施例に限定されるものではな
い。
とより本発明がこれらの実施例に限定されるものではな
い。
【００１８】実施例１ ＮＡＮＢ型肝炎ウイルスの５′末端塩基配列及びアミノ
酸配列を次のようにして決定した。 （１）ＲＮＡ抽出 日本人供血者の血漿から得た、ＨＣＶ抗体陽性（オーソ
・ダイアグノスティック・システムズ株式会社のオーソ
ＨＣＶＡｂＥＬＩＳＡテストによる）と判定された検体
（ＨＣ−Ｊ１）およびＮＡＮＢ型肝炎の感染性を確認し
たチンパンジーから得た、ＨＣＶ抗体（−）の検体（Ｈ
Ｃ−Ｊ４）より、次のようにしてＲＮＡを抽出した。
１．８ｍｌの血漿に１ｍｌのトリス塩酸緩衝液（１０ｍ
Ｍ、ｐＨ８．０）を加え、６８×１０３ｒｐｍで１時間
遠心した。得られたペレットに２００ｍＭ ＮａＣｌ、
１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）と１ｍｇ／ｍｌのプロテナーゼＫを含
むトリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）を加え、
６０℃１時間加温し、フェノール／クロロホルムで抽出
した後、エタノール沈殿を行い、ＲＮＡを得た。
酸配列を次のようにして決定した。 （１）ＲＮＡ抽出 日本人供血者の血漿から得た、ＨＣＶ抗体陽性（オーソ
・ダイアグノスティック・システムズ株式会社のオーソ
ＨＣＶＡｂＥＬＩＳＡテストによる）と判定された検体
（ＨＣ−Ｊ１）およびＮＡＮＢ型肝炎の感染性を確認し
たチンパンジーから得た、ＨＣＶ抗体（−）の検体（Ｈ
Ｃ−Ｊ４）より、次のようにしてＲＮＡを抽出した。
１．８ｍｌの血漿に１ｍｌのトリス塩酸緩衝液（１０ｍ
Ｍ、ｐＨ８．０）を加え、６８×１０３ｒｐｍで１時間
遠心した。得られたペレットに２００ｍＭ ＮａＣｌ、
１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）と１ｍｇ／ｍｌのプロテナーゼＫを含
むトリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）を加え、
６０℃１時間加温し、フェノール／クロロホルムで抽出
した後、エタノール沈殿を行い、ＲＮＡを得た。
【００１９】（２）ｃＤＮＡ合成 ＨＣ−Ｊ１血漿より抽出したＲＮＡを７０℃で１分間加
温し、これを鋳型として１０ユニットの逆転写酵素（ｃ
ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｙｓｔｅｍＰｌｕｓ，
Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｊａｐａｎ）及びオリゴヌクレオチ
ドプライマー（２０マー）２０ｐｍｏｌを加えて４２
℃、１．５時間反応させｃＤＮＡを得た。プライマーと
してはヨーロッパ特許出願第８８３１０２２．５号に示
されたＨＣＶの塩基配列を参照して合成した＃８（５′
−ＧＡＴＧＣＴＴＧＣＧＧＡＡＧＣＡＡＴＣＡ−３′）
を用いた。
温し、これを鋳型として１０ユニットの逆転写酵素（ｃ
ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｙｓｔｅｍＰｌｕｓ，
Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｊａｐａｎ）及びオリゴヌクレオチ
ドプライマー（２０マー）２０ｐｍｏｌを加えて４２
℃、１．５時間反応させｃＤＮＡを得た。プライマーと
してはヨーロッパ特許出願第８８３１０２２．５号に示
されたＨＣＶの塩基配列を参照して合成した＃８（５′
−ＧＡＴＧＣＴＴＧＣＧＧＡＡＧＣＡＡＴＣＡ−３′）
を用いた。
【００２０】（３）ポリメラーゼチェインリアクション
（ＰＣＲ）によるｃＤＮＡの増幅は次のように行った。
ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
・Ｃｅｔｕｓ）に、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＤＮＡ増幅試薬
キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ・Ｃｅｔｕｓ）を用
い、Ｓａｉｋｉらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９、４
８７−４９１．１９８８）によって３５サイクルのｃＤ
ＮＡ増幅を行った。
（ＰＣＲ）によるｃＤＮＡの増幅は次のように行った。
ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
・Ｃｅｔｕｓ）に、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＤＮＡ増幅試薬
キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ・Ｃｅｔｕｓ）を用
い、Ｓａｉｋｉらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９、４
８７−４９１．１９８８）によって３５サイクルのｃＤ
ＮＡ増幅を行った。
【００２１】（４）ｃＤＮＡライブラリーの構築による
Ｊ１、Ｊ４、各５′末端側塩基配列の決定 ｃＤＮＡライブラリーを用いたＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４
ゲノムの５′末端側の塩基配列解析は図１、図２に示す
ように、ｃＤＮＡをバクテリオファージλｇｔ１０に挿
入して得たクローンの解析及びｃＤＮＡをＰＣＲにて増
幅して得られたクローンの解析結果の両者を併せて決定
した。図１、図２はＮＡＮＢ型肝炎ウイルスゲノムの
５′末端を制限酵素切断部位とともに示し、使用するプ
ライマーの位置も示す。図中、実線はバクテリオファー
ジλｇｔ１０のライブラリーによるクローンで塩基配列
を決定した範囲を、点線はＰＣＲによるクローンで塩基
配列を決定した範囲を示す。ＨＣ−Ｊ１のｎｔ４５４〜
２１０９の１６５６塩基は前記プライマー＃８から得た
ｃＤＮＡをλｇｔ１０ファージベクター（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ）に挿入して得られたクローンφ４１により決定し
た。つぎにこのシークエンスをもとに合成した、ｎｔ８
２４〜８４３の新しいプライマー＃２５（５′−ＴＣＣ
ＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡＧＴＴＣＡＣＧ−３′）を用い
て、ＨＣ−Ｊ４のｃＤＮＡライブラリーから順次４つの
ｃＤＮＡクローンφ６０、φ６１、φ６６、φ７５を得
て、上流のｎｔ１８〜８４３の塩基配列を決めた。ＨＣ
−Ｊ４について、さらに上流の５′末端を特定するため
にｎｔ２４６〜２６５のアンチセンスプライマー＃３６
（５′−ＡＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧＣＡＧＴ−
３′）を用いてｃＤＮＡを合成したのち、ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによりｃＤＮ
Ａの５′末端にｄＡ付加を行い、２段階のｏｎｅ−ｓｉ
ｄｅｄＰＣＲ増幅を行った、すなわち、１回目はオリゴ
ｄＴプライマー（２０−ｍｅｒ）とｎｔ１８８〜２０７
のアンチセンスプライマー＃４８（５′−ＧＴＴＧＡＴ
ＣＣＡＡＧＡＡＡＧＧＡＣＣＣ−３′）を用いて３５サ
イクルのＰＣＲ増幅を行い、２回目はそのＰＣＲ産物を
鋳型にしてオリゴｄＴプライマー（２０−ｍｅｒ）とｎ
ｔ１４０〜１６０のアンチセンスプライマー＃１０９
（２１−ｍｅｒ；５′−ＡＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＧＡ
ＣＣＡＣＴＡＴ−３′）を用いて３０サイクルのＰＣＲ
を行った。得られたＰＣＲ産物をＭ１３ファージベクタ
ーにサブクローニングした。完全長の５′末端配列を有
すると考えられる６個の独立したクローン、Ｃ８９６
２、Ｃ８９６８、Ｃ８９７０、Ｃ８９７４、Ｃ９０３
４、Ｃ９０３６が得られ、ｎｔ１〜１７の塩基配列を決
定した。
Ｊ１、Ｊ４、各５′末端側塩基配列の決定 ｃＤＮＡライブラリーを用いたＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４
ゲノムの５′末端側の塩基配列解析は図１、図２に示す
ように、ｃＤＮＡをバクテリオファージλｇｔ１０に挿
入して得たクローンの解析及びｃＤＮＡをＰＣＲにて増
幅して得られたクローンの解析結果の両者を併せて決定
した。図１、図２はＮＡＮＢ型肝炎ウイルスゲノムの
５′末端を制限酵素切断部位とともに示し、使用するプ
ライマーの位置も示す。図中、実線はバクテリオファー
ジλｇｔ１０のライブラリーによるクローンで塩基配列
を決定した範囲を、点線はＰＣＲによるクローンで塩基
配列を決定した範囲を示す。ＨＣ−Ｊ１のｎｔ４５４〜
２１０９の１６５６塩基は前記プライマー＃８から得た
ｃＤＮＡをλｇｔ１０ファージベクター（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ）に挿入して得られたクローンφ４１により決定し
た。つぎにこのシークエンスをもとに合成した、ｎｔ８
２４〜８４３の新しいプライマー＃２５（５′−ＴＣＣ
ＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡＧＴＴＣＡＣＧ−３′）を用い
て、ＨＣ−Ｊ４のｃＤＮＡライブラリーから順次４つの
ｃＤＮＡクローンφ６０、φ６１、φ６６、φ７５を得
て、上流のｎｔ１８〜８４３の塩基配列を決めた。ＨＣ
−Ｊ４について、さらに上流の５′末端を特定するため
にｎｔ２４６〜２６５のアンチセンスプライマー＃３６
（５′−ＡＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧＣＡＧＴ−
３′）を用いてｃＤＮＡを合成したのち、ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによりｃＤＮ
Ａの５′末端にｄＡ付加を行い、２段階のｏｎｅ−ｓｉ
ｄｅｄＰＣＲ増幅を行った、すなわち、１回目はオリゴ
ｄＴプライマー（２０−ｍｅｒ）とｎｔ１８８〜２０７
のアンチセンスプライマー＃４８（５′−ＧＴＴＧＡＴ
ＣＣＡＡＧＡＡＡＧＧＡＣＣＣ−３′）を用いて３５サ
イクルのＰＣＲ増幅を行い、２回目はそのＰＣＲ産物を
鋳型にしてオリゴｄＴプライマー（２０−ｍｅｒ）とｎ
ｔ１４０〜１６０のアンチセンスプライマー＃１０９
（２１−ｍｅｒ；５′−ＡＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＧＡ
ＣＣＡＣＴＡＴ−３′）を用いて３０サイクルのＰＣＲ
を行った。得られたＰＣＲ産物をＭ１３ファージベクタ
ーにサブクローニングした。完全長の５′末端配列を有
すると考えられる６個の独立したクローン、Ｃ８９６
２、Ｃ８９６８、Ｃ８９７０、Ｃ８９７４、Ｃ９０３
４、Ｃ９０３６が得られ、ｎｔ１〜１７の塩基配列を決
定した。
【００２２】一方ＨＣ−Ｊ１の上流のシークエンスは、
ｎｔ１８〜８４３についてはプライマー＃４４（５′−
ＧＧＣＧＡＣＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴ−３′）と
＃２５（５′−ＴＣＣＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡＧＴＴＣＡ
ＣＧ−３′）を用いたＰＣＲによって得られたクローン
Ｃ２５０３、Ｃ２５０８、及びＣ２５１０によって決め
られた。さらに上流の５′末端は、ＨＣ−Ｊ４と同様の
方法により得られた１６個のクローン、Ｃ８９３１、Ｃ
８９３２、Ｃ８９３５、Ｃ８９３７、Ｃ８９４２、Ｃ８
９４４、Ｃ８９４９、Ｃ８９５０、Ｃ８９５１、Ｃ８９
５４、Ｃ８９５５、Ｃ９０２３、Ｃ９０２６、Ｃ９０３
０、Ｃ９０３１、Ｃ９０３２を用いて、ｎｔ１〜３７の
塩基配列を決めた。次にＨＣ−Ｊ１の５′末端側下流の
塩基配列を決定するため、プライマー＃１４８（５′−
ＴＧＣＡＣＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＴＣＡＡＣ−３′）と
＃１４６（５′−ＡＧＴＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡ
ＧＣＡ−３′）を用いて３０サイクルのＰＣＲを行っ
た。得られたクローンのＣ１１４４４、Ｃ１１４５０、
Ｃ１１４５１によりｎｔ１９８４〜２５６０の塩基配列
を決定した。一方、ＨＣ−Ｊ４のｎｔ７３８〜１９００
までの下流シークエンス１１６３塩基はプライマー＃３
０（５′−ＣＴＣＡＴＧＧＧＧＴＡＣＡＴＴＣＣＧＣＴ
−３′）と＃４２（５′−ＴＣＧＧＴＣＧＴＣＣＣＣＡ
ＣＣＡＣＡＡＣ−３′）を用いたＰＣＲによって得られ
た３つのクローンＣ２８２１、Ｃ３１７３、Ｃ３１９２
によって決められた。さらにＨＣ−Ｊ４の下流の塩基配
列を決定するため、プライマー＃５７（５′−ＴＡＴＴ
ＧＣＴＴＣＡＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣ−３′）と＃１４６
（５′−ＡＧＴＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡＧＣＡ−
３′）を用いて３０サイクルのＰＣＲを行った。得られ
たクローンＣ１１４６２、Ｃ１１４６３、Ｃ１１４６４
によりｎｔ１８６０〜２５６０の塩基配列を決定した。
以上の解析結果により、ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４は５′
末端側にそれそれ配列番号３、４に示す塩基配列を有す
るものと決定した。
ｎｔ１８〜８４３についてはプライマー＃４４（５′−
ＧＧＣＧＡＣＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴ−３′）と
＃２５（５′−ＴＣＣＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡＧＴＴＣＡ
ＣＧ−３′）を用いたＰＣＲによって得られたクローン
Ｃ２５０３、Ｃ２５０８、及びＣ２５１０によって決め
られた。さらに上流の５′末端は、ＨＣ−Ｊ４と同様の
方法により得られた１６個のクローン、Ｃ８９３１、Ｃ
８９３２、Ｃ８９３５、Ｃ８９３７、Ｃ８９４２、Ｃ８
９４４、Ｃ８９４９、Ｃ８９５０、Ｃ８９５１、Ｃ８９
５４、Ｃ８９５５、Ｃ９０２３、Ｃ９０２６、Ｃ９０３
０、Ｃ９０３１、Ｃ９０３２を用いて、ｎｔ１〜３７の
塩基配列を決めた。次にＨＣ−Ｊ１の５′末端側下流の
塩基配列を決定するため、プライマー＃１４８（５′−
ＴＧＣＡＣＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＴＣＡＡＣ−３′）と
＃１４６（５′−ＡＧＴＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡ
ＧＣＡ−３′）を用いて３０サイクルのＰＣＲを行っ
た。得られたクローンのＣ１１４４４、Ｃ１１４５０、
Ｃ１１４５１によりｎｔ１９８４〜２５６０の塩基配列
を決定した。一方、ＨＣ−Ｊ４のｎｔ７３８〜１９００
までの下流シークエンス１１６３塩基はプライマー＃３
０（５′−ＣＴＣＡＴＧＧＧＧＴＡＣＡＴＴＣＣＧＣＴ
−３′）と＃４２（５′−ＴＣＧＧＴＣＧＴＣＣＣＣＡ
ＣＣＡＣＡＡＣ−３′）を用いたＰＣＲによって得られ
た３つのクローンＣ２８２１、Ｃ３１７３、Ｃ３１９２
によって決められた。さらにＨＣ−Ｊ４の下流の塩基配
列を決定するため、プライマー＃５７（５′−ＴＡＴＴ
ＧＣＴＴＣＡＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣ−３′）と＃１４６
（５′−ＡＧＴＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡＧＣＡ−
３′）を用いて３０サイクルのＰＣＲを行った。得られ
たクローンＣ１１４６２、Ｃ１１４６３、Ｃ１１４６４
によりｎｔ１８６０〜２５６０の塩基配列を決定した。
以上の解析結果により、ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４は５′
末端側にそれそれ配列番号３、４に示す塩基配列を有す
るものと決定した。
【００２３】実施例２ ５′非翻訳領域及びコア蛋白質コード領域に基づいたプ
ライマーの合成及び測定系の確立 （１）オリゴヌクレオチドプライマーの合成 実施例１で決定したＨＣ−Ｊ１とＨＣ−Ｊ４株の５′翻
訳領域及びコア蛋白質コード領域の塩基配列に基づき、
オリコヌクレオチドプライマー（２０マー）を合成し
た。また、ヨーロッパ特許出願第８８３１０９２２．５
号に示されたＨＣＶの塩基配列を参照してオリゴヌクレ
オチドプライマーも合成した。合成は３８０ＢＤＮＡ合
成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｊａｐ
ａｎ）を用いて行った。合成したプライマーは＃３、
４、５、６、９、１０、１１、１２、１６、１７、２
１、２２、２３、２５、３２Ａ、３３、３４、３５、３
６、４８であり、各プライマーについて、５′−末端よ
りの位置、塩基配列を表１に示す。
ライマーの合成及び測定系の確立 （１）オリゴヌクレオチドプライマーの合成 実施例１で決定したＨＣ−Ｊ１とＨＣ−Ｊ４株の５′翻
訳領域及びコア蛋白質コード領域の塩基配列に基づき、
オリコヌクレオチドプライマー（２０マー）を合成し
た。また、ヨーロッパ特許出願第８８３１０９２２．５
号に示されたＨＣＶの塩基配列を参照してオリゴヌクレ
オチドプライマーも合成した。合成は３８０ＢＤＮＡ合
成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｊａｐ
ａｎ）を用いて行った。合成したプライマーは＃３、
４、５、６、９、１０、１１、１２、１６、１７、２
１、２２、２３、２５、３２Ａ、３３、３４、３５、３
６、４８であり、各プライマーについて、５′−末端よ
りの位置、塩基配列を表１に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】（２）検体からのＮＡＮＢ肝炎ウイルスＲ
ＮＡの抽出 血漿１ｍｌをＴＬ−１００（ベックマン）遠心機で９０
Ｋｒｐｍ１５分遠心分離し、得られたペレットを、２０
０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、２％（Ｗ／Ｖ）
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリス塩酸（５０
ｍＭ、ｐＨ８．０）、１ｍｇ／ｍｌプロティンナーゼＫ
を含む溶液に溶解し、６０℃で１時間加温した。等量の
フェノール／クロロホルム溶液を用いて２回抽出後、エ
タノール沈澱を−２０℃で３時間以上かけて行った。沈
澱物は、７０％エタノールで遠心洗浄し、真空乾燥の後
５μｌの蒸留水に溶解した。
ＮＡの抽出 血漿１ｍｌをＴＬ−１００（ベックマン）遠心機で９０
Ｋｒｐｍ１５分遠心分離し、得られたペレットを、２０
０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、２％（Ｗ／Ｖ）
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリス塩酸（５０
ｍＭ、ｐＨ８．０）、１ｍｇ／ｍｌプロティンナーゼＫ
を含む溶液に溶解し、６０℃で１時間加温した。等量の
フェノール／クロロホルム溶液を用いて２回抽出後、エ
タノール沈澱を−２０℃で３時間以上かけて行った。沈
澱物は、７０％エタノールで遠心洗浄し、真空乾燥の後
５μｌの蒸留水に溶解した。
【００２６】（３）ｃＤＮＡの合成 （２）において１ｍｌの血漿から抽出したＲＮＡを、７
０℃で１分間変性させ、氷上で急冷し、ｃＤＮＡ合成に
供した。逆転写は、各々１００ｐｍｏｌのアンチセンス
プライマー＃５、６、１１、１２、１６、１７、２５、
３５、３６、４８に１０ｎｍｏｌの４種のデオキシリボ
ヌクレオチド３リン酸（Ｔａｋａｒａ）、１０ｕｎｉｔ
のＲＮａｓｅ阻害剤（Ｔａｋａｒａ）、１０ｕｎｉｔの
Ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕ
ｓ逆転写酵素（ベーリンガーマンハイム）を加え、１０
ｇのトリス−塩酸（５０ｍＭｐＨ８．４）、８ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２、３０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔ
ｈｒｅｉｔｏｌ溶液中で、４２℃９０分反応させてｃＤ
ＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡは、フェノール／ク
ロロホルムで抽出により精製した。
０℃で１分間変性させ、氷上で急冷し、ｃＤＮＡ合成に
供した。逆転写は、各々１００ｐｍｏｌのアンチセンス
プライマー＃５、６、１１、１２、１６、１７、２５、
３５、３６、４８に１０ｎｍｏｌの４種のデオキシリボ
ヌクレオチド３リン酸（Ｔａｋａｒａ）、１０ｕｎｉｔ
のＲＮａｓｅ阻害剤（Ｔａｋａｒａ）、１０ｕｎｉｔの
Ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕ
ｓ逆転写酵素（ベーリンガーマンハイム）を加え、１０
ｇのトリス−塩酸（５０ｍＭｐＨ８．４）、８ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２、３０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔ
ｈｒｅｉｔｏｌ溶液中で、４２℃９０分反応させてｃＤ
ＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡは、フェノール／ク
ロロホルムで抽出により精製した。
【００２７】（４）ＰＣＲによる増幅 ＤＮＡ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ
−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）とＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ キット（Ｐｅｒｋｉｎ
−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を用い、通常の方法（Ｓａ
ｉｋｉ ｅｔａｌ １９８８）でＰＣＲによる増幅を行
った。反応サイクルは、変性（９４℃１分間）、プライ
マーのアニール（５５℃１分３０秒）および、プライマ
ーの伸長（７２℃３分間）の工程であり、これを３５回
繰り返した。反応生成物を１−１、５％Ｎｕｓｉｅｖｅ
と１−１、５％Ｓｅａｋｅｍの混合アガロースゲル（Ｆ
ＭＣ社）で電気泳動し。臭化エチジウムの染色の後、紫
外線照射でバンドを確認した。
−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）とＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ キット（Ｐｅｒｋｉｎ
−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を用い、通常の方法（Ｓａ
ｉｋｉ ｅｔａｌ １９８８）でＰＣＲによる増幅を行
った。反応サイクルは、変性（９４℃１分間）、プライ
マーのアニール（５５℃１分３０秒）および、プライマ
ーの伸長（７２℃３分間）の工程であり、これを３５回
繰り返した。反応生成物を１−１、５％Ｎｕｓｉｅｖｅ
と１−１、５％Ｓｅａｋｅｍの混合アガロースゲル（Ｆ
ＭＣ社）で電気泳動し。臭化エチジウムの染色の後、紫
外線照射でバンドを確認した。
【００２８】（５）２次ＰＣＲによる増幅 最初の１組のプライマー（＃３２Ａと＃３６）によるＰ
ＣＲで得たＰＣＲ産物を、必要に応じさらに２回目のＰ
ＣＲ増幅にかける。プライマーとしては、最初の１組の
プライマーの内側プライマー（たとえば＃３３と＃４
８）を選択し、ＰＣＲ産物５ｇについて、３０サイクル
繰り返した。＃３３、＃４８の塩基配列は表１に示すと
おりである。反応条件は変性（９４℃、１分）アニール
（５５℃、１．５分）及び伸長（７２℃、２分）であ
り、得られたＰＣＲ産物を電気泳動にかけ、（４）と同
様にして解析した。
ＣＲで得たＰＣＲ産物を、必要に応じさらに２回目のＰ
ＣＲ増幅にかける。プライマーとしては、最初の１組の
プライマーの内側プライマー（たとえば＃３３と＃４
８）を選択し、ＰＣＲ産物５ｇについて、３０サイクル
繰り返した。＃３３、＃４８の塩基配列は表１に示すと
おりである。反応条件は変性（９４℃、１分）アニール
（５５℃、１．５分）及び伸長（７２℃、２分）であ
り、得られたＰＣＲ産物を電気泳動にかけ、（４）と同
様にして解析した。
【００２９】実施例４ ＰＣＲによるＮＡＮＢ型肝炎ウイルスの検出系に用いる
のに有効なプライマー対の選択 既に、ａｎｔｉ−ＨＣＶ陽性と判定された１０検体、す
なわち日本人供血者の血漿検体Ｎｏ．１，３，５，７，
９及びＮＡＮＢ肝炎患者の血清検体Ｎｏ．２，４，６，
８，１０に対して、１対のプライマーを用いたＰＣＲの
結果を表２に示す。
のに有効なプライマー対の選択 既に、ａｎｔｉ−ＨＣＶ陽性と判定された１０検体、す
なわち日本人供血者の血漿検体Ｎｏ．１，３，５，７，
９及びＮＡＮＢ肝炎患者の血清検体Ｎｏ．２，４，６，
８，１０に対して、１対のプライマーを用いたＰＣＲの
結果を表２に示す。
【００３０】
【表２】
【００３１】ターゲットとする塩基配列領域は、ヨーロ
ッパ特許出願第８８３１０９２２．５号に示されたＨＣ
Ｖ非構造蛋白質ＮＳ５から２領域、ＮＳ３から２領域、
ＮＳ１から上流にまたがる領域の２領域、そして、本発
明者らが明らかにしたコア領域の２領域、５′非翻訳領
域から２領域の計１０領域に対してＰＣＲ増幅を試み
た。その結果、５′非翻訳領域よりのプライマー対であ
る＃３２Ａ／＃３６，＃３３／＃４８及びコア領域より
のプライマー対である＃２３／＃２５を用いた場合、１
０サンプル全てについて、それぞれ３領域の２４２ｂ
ｐ、１４５ｂｐ、そして３７７ｂｐの予測されたサイズ
のＮＡＮＢ ｃＤＮＡバンドを検出できた。しかし、他
の７領域では、ＨＣＶ ＲＮＡの存在が確認されていな
がら、１０サンプル中２〜９検体が、増幅されたのみで
あった。このことから、広範囲なＨＣＶのＲＮＡ検出を
行うプライマーの対として、本発明のプライマーである
５′非翻訳領域からの＃３２Ａ／＃３６及び＃３３／＃
４８と、コア領域の＃２３／＃２５が効率的であると結
論づけられた。ＮＡＮＢ肝炎ウイルスＲＮＡの検出に
は、１次ＰＣＲのみで十分な場合もあるが、より感度を
上げるにはさらに２次ＰＣＲを行うのが好ましい。例え
ば＃３６プライマーでｃＤＮＡ合成を行った後、＃３６
と＃３２ＡによるＰＣＲ増幅（１次ＰＣＲ）を行い、２
４２ｂｐの予想バンドが認められない検体については、
ＰＣＲ増幅ＲＮＡを鋳型として＃３３と＃４８のプライ
マーで再増幅（２次ＰＣＲ）を行った。（ダブルＰＣ
Ｒ）
ッパ特許出願第８８３１０９２２．５号に示されたＨＣ
Ｖ非構造蛋白質ＮＳ５から２領域、ＮＳ３から２領域、
ＮＳ１から上流にまたがる領域の２領域、そして、本発
明者らが明らかにしたコア領域の２領域、５′非翻訳領
域から２領域の計１０領域に対してＰＣＲ増幅を試み
た。その結果、５′非翻訳領域よりのプライマー対であ
る＃３２Ａ／＃３６，＃３３／＃４８及びコア領域より
のプライマー対である＃２３／＃２５を用いた場合、１
０サンプル全てについて、それぞれ３領域の２４２ｂ
ｐ、１４５ｂｐ、そして３７７ｂｐの予測されたサイズ
のＮＡＮＢ ｃＤＮＡバンドを検出できた。しかし、他
の７領域では、ＨＣＶ ＲＮＡの存在が確認されていな
がら、１０サンプル中２〜９検体が、増幅されたのみで
あった。このことから、広範囲なＨＣＶのＲＮＡ検出を
行うプライマーの対として、本発明のプライマーである
５′非翻訳領域からの＃３２Ａ／＃３６及び＃３３／＃
４８と、コア領域の＃２３／＃２５が効率的であると結
論づけられた。ＮＡＮＢ肝炎ウイルスＲＮＡの検出に
は、１次ＰＣＲのみで十分な場合もあるが、より感度を
上げるにはさらに２次ＰＣＲを行うのが好ましい。例え
ば＃３６プライマーでｃＤＮＡ合成を行った後、＃３６
と＃３２ＡによるＰＣＲ増幅（１次ＰＣＲ）を行い、２
４２ｂｐの予想バンドが認められない検体については、
ＰＣＲ増幅ＲＮＡを鋳型として＃３３と＃４８のプライ
マーで再増幅（２次ＰＣＲ）を行った。（ダブルＰＣ
Ｒ）
【００３２】実施例４ 慢性肝炎患者１０検体とＡＬＴの正常な供血者血清１２
検体について、ＰＣＲによるＲＮＡ検出を実施した。結
果は、表３に示す。
検体について、ＰＣＲによるＲＮＡ検出を実施した。結
果は、表３に示す。
【００３３】
【表３】
【００３４】ＮＡＮＢ型３２検体はあらかじめａｎｔｉ
−ＨＣＶを測定した結果、陽性２０検体、陰性１２検体
であった。Ｂ型患者１０検体と正常な供血者１２検体は
いずれもａｎｔｉ−ＨＣＶ陰性であった。ＮＡＮＢ型３
２検体のうち、ａｎｔｉ−ＨＣＶ（＋）の２０検体は、
１次ＰＣＲで１５例、２次ＰＣＲで５例と１００％ＲＮ
Ａ検出ができた。ａｎｔｉ−ＨＣＶ（−）とされた１２
例についても１次ＰＣＲで７例、２次ＰＣＲで４例と、
９２％ＲＮＡ検出が可能であった。また、Ｂ型の１０例
及び供血者１２例はいずれも２次ＰＣＲまで行ったが、
陰性であった。このデータより、ＮＡＮＢ型ウイルスＲ
ＮＡ検出系として、オリゴヌクレオチドプライマー＃３
２Ａおよび／または＃３６を用いた本発明のＰＣＲ法が
すぐれており、特に２次ＰＣＲまで行うダブルＰＣＲ法
によれば、非常に高感度（ＮＡＮＢ検体のほぼ全部にあ
たる９６．９％を検出）で特異性の高い検出法となるこ
とが確認された。
−ＨＣＶを測定した結果、陽性２０検体、陰性１２検体
であった。Ｂ型患者１０検体と正常な供血者１２検体は
いずれもａｎｔｉ−ＨＣＶ陰性であった。ＮＡＮＢ型３
２検体のうち、ａｎｔｉ−ＨＣＶ（＋）の２０検体は、
１次ＰＣＲで１５例、２次ＰＣＲで５例と１００％ＲＮ
Ａ検出ができた。ａｎｔｉ−ＨＣＶ（−）とされた１２
例についても１次ＰＣＲで７例、２次ＰＣＲで４例と、
９２％ＲＮＡ検出が可能であった。また、Ｂ型の１０例
及び供血者１２例はいずれも２次ＰＣＲまで行ったが、
陰性であった。このデータより、ＮＡＮＢ型ウイルスＲ
ＮＡ検出系として、オリゴヌクレオチドプライマー＃３
２Ａおよび／または＃３６を用いた本発明のＰＣＲ法が
すぐれており、特に２次ＰＣＲまで行うダブルＰＣＲ法
によれば、非常に高感度（ＮＡＮＢ検体のほぼ全部にあ
たる９６．９％を検出）で特異性の高い検出法となるこ
とが確認された。
【００３５】実施例５ ｃＤＮＡ／ダブルＰＣＲ法によるＮＡＮＢ肝炎ウイルス
の検出感度 本発明のｃＤＮＡ／ダブルＰＣＲ法による、ＮＡＮＢ型
肝炎ウイルスＲＮＡの検出感度について以下に述べる。
結果は表４に示す。
の検出感度 本発明のｃＤＮＡ／ダブルＰＣＲ法による、ＮＡＮＢ型
肝炎ウイルスＲＮＡの検出感度について以下に述べる。
結果は表４に示す。
【００３６】
【表４】
【００３７】感染価のわかっている血漿１０７ＣＩＤ／
ｍｌを用い、１０倍希釈列を作製し、同じ測定をそれぞ
れ３回行った。１次ＰＣＲでは３回の測定中２回で１０
０ＣＩＤ／ｍｌまで、残りの１回で１０ＣＩＤ／ｍｌま
で予測される２４２ｂｐのバンドの検出が確認された。
２次ＰＣＲを行うことにより、２回の測定で１０ＣＩＤ
／ｍｌまで、１回の測定で１ＣＩＤ／ｍｌまで予測され
た１４５ｂｐのバンドが認められた。又、１ＣＩＤ／ｍ
ｌ以下の希釈及び陰性血漿では、全くバンドは観察され
なかった。ＮＡＮＢ型肝炎患者の平均力価は、血漿当た
り１０２〜４ ＣＩＤ／ｍｌと考えられており、ＮＡＮ
Ｂ型肝炎患者の診断の上で、臨床上有効な検出感度をも
っていると確認された。
ｍｌを用い、１０倍希釈列を作製し、同じ測定をそれぞ
れ３回行った。１次ＰＣＲでは３回の測定中２回で１０
０ＣＩＤ／ｍｌまで、残りの１回で１０ＣＩＤ／ｍｌま
で予測される２４２ｂｐのバンドの検出が確認された。
２次ＰＣＲを行うことにより、２回の測定で１０ＣＩＤ
／ｍｌまで、１回の測定で１ＣＩＤ／ｍｌまで予測され
た１４５ｂｐのバンドが認められた。又、１ＣＩＤ／ｍ
ｌ以下の希釈及び陰性血漿では、全くバンドは観察され
なかった。ＮＡＮＢ型肝炎患者の平均力価は、血漿当た
り１０２〜４ ＣＩＤ／ｍｌと考えられており、ＮＡＮ
Ｂ型肝炎患者の診断の上で、臨床上有効な検出感度をも
っていると確認された。
【００３８】
【発明の効果】本発明によれば、ＮＡＮＢ肝炎ウイルス
に特異的で高感度の検出法に提供できる。したがって、
肝炎患者の正確な診断あるいは供血のスクリーニングに
よる輸血後肝炎の防止に重要な役割を果たすことができ
る。
に特異的で高感度の検出法に提供できる。したがって、
肝炎患者の正確な診断あるいは供血のスクリーニングに
よる輸血後肝炎の防止に重要な役割を果たすことができ
る。
【００３９】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃３２Ａ） ＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡ ＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴ
【００４０】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃３６） ＡＡＣＡＣＴＡＣＴＣ ＧＧＣＴＡＧＣＡＧＴ
【００４１】配列番号：３ 配列の長さ：２５４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列
【００４２】配列番号：４ 配列の長さ：２５４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＮＡＮＢ肝炎ウイルスの塩基配列決定の方法を
示す図。ＨＣ−Ｊ１株。
示す図。ＨＣ−Ｊ１株。
【図２】ＮＡＮＢ肝炎ウイルスの塩基配列決定の方法を
示す図。ＨＣ−Ｊ４株。図中、実線はバクテリオファー
ジλｇｔ１０のライブラリーによるクローンで塩基配列
を決定した範囲、点線はＰＣＲによるクローンで塩基配
列を決定した範囲を示し、クローン名を線の横に示し
た。
示す図。ＨＣ−Ｊ４株。図中、実線はバクテリオファー
ジλｇｔ１０のライブラリーによるクローンで塩基配列
を決定した範囲、点線はＰＣＲによるクローンで塩基配
列を決定した範囲を示し、クローン名を線の横に示し
た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/569 Ｌ 9015−2Ｊ 33/576 Ｚ 9015−2Ｊ
Claims (4)
- 【請求項１】配列番号１記載の塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドプライマー＃３２Ａ - 【請求項２】配列番号１記載のオリゴヌクレオチドプラ
イマー＃３２Ａと配列番号２記載のオリゴヌクレオチド
プライマー＃３６からなるプライマーペア。 - 【請求項３】配列番号１記載のオリゴヌクレオチドプラ
イマー＃３２Ａを用いて非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスを高感
度に検出する方法。 - 【請求項４】配列番号１および配列番号２記載のプライ
マーペア＃３２Ａ・＃３６を有する非Ａ非Ｂ型肝炎ウイ
ルス検出系。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3247120A JPH06125777A (ja) | 1991-06-20 | 1991-06-20 | オリゴヌクレオチドプライマー、およびこれを用いた非ａ非 ｂ型肝炎ウイルスの高感度検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3247120A JPH06125777A (ja) | 1991-06-20 | 1991-06-20 | オリゴヌクレオチドプライマー、およびこれを用いた非ａ非 ｂ型肝炎ウイルスの高感度検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06125777A true JPH06125777A (ja) | 1994-05-10 |
Family
ID=17158734
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3247120A Pending JPH06125777A (ja) | 1991-06-20 | 1991-06-20 | オリゴヌクレオチドプライマー、およびこれを用いた非ａ非 ｂ型肝炎ウイルスの高感度検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06125777A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002083948A1 (en) * | 2001-04-12 | 2002-10-24 | Biocore Co., Ltd. | Oligonucleotide chip composition for analyzing hepatitis c virus (hcv) genotype and detecting method thereof |
-
1991
- 1991-06-20 JP JP3247120A patent/JPH06125777A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002083948A1 (en) * | 2001-04-12 | 2002-10-24 | Biocore Co., Ltd. | Oligonucleotide chip composition for analyzing hepatitis c virus (hcv) genotype and detecting method thereof |
| US7179600B2 (en) | 2001-04-12 | 2007-02-20 | Biocore Co., Ltd. | Oligonucleotide chip composition and a method for analyzing a hepatitis C virus genotype using the composition |
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