JP2542994B2 - オリゴヌクレオチド、並びにｃ型肝炎ウイルスのジェノタイプ鑑別方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、オリゴヌクレオチド、
ならびにこれをプライマーとして使用する、ポリメラー
ゼチエインリアクション法（以下「ＰＣＲ法」と略記す
る）を利用したＣ型肝炎ウイルス（以下「ＨＣＶ」と略
記する）のジェノタイプ鑑別方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ウイルスに由来する肝炎には、既に病原
体が解明されその診断法や予防法が確立したものとして
Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎がある。これ以外は一括して、非Ａ
非Ｂ型肝炎（以下「ＮＡＮＢ肝炎」という）と呼ばれて
きた。日本における輸血後肝炎は、Ｂ型肝炎の検出法が
輸血血液のスクリーニングに導入された後は格段に減少
したが、なお、年間推定２８万例が、ＮＡＮＢ肝炎ウイ
ルスにより発症していると考えられてきた。

【０００３】近年、ＮＡＮＢ肝炎は、タイプ別にＣ型、
Ｄ型、Ｅ型と命名され、その病原体についての研究が進
展し、撲滅に向けての努力が世界的に進められるように
なった。輸血後肝炎に関して、１９８８年アメリカのカ
イロン社がＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡウイルスゲノムの
クローン化に成功したと発表し、これを基に組換え体を
用いたＨＣＶ（Ｃ１００−３）抗体のＥＬＩＳＡ法測定
系を開発した。現在、Ｃ１００−３抗体測定系は、輸血
血液のスクリーニングや肝疾患患者の診断に、日本を始
めとして各国で用いられている。このＣ１００−３抗体
は急性および慢性ＮＡＮＢ肝炎の多くの症例との間に関
連性が認められる。しかし、キャリアや慢性肝炎の捕捉
率は約７０％にすぎず、また急性ＮＡＮＢ肝炎の急性期
における抗体検出ができない等重大な問題点が残されて
いる。したがって、カイロン社の前記開発によってもＮ
ＡＮＢ肝炎への対処は依然として解決されていない。

【０００４】Ｃ１００−３抗体に関連するＮＡＮＢ肝炎
ウイルス、すなわちＨＣＶはプラスの一本鎖ＲＮＡを持
ち、その遺伝子構造からフラビウイルスやペスティウイ
ルスとの関連性が推定されている。それらウイルスのゲ
ノム構造比較により、コア（核）蛋白、エンベロープ
（外殻）蛋白、非構造蛋白のそれぞれをコードすると推
定される領域がＨＣＶにも認められ、ＨＣＶ抗体ＥＬＩ
ＳＡはこのうち非構造蛋白の一部（ＮＳ３／ＮＳ４境界
領域）に対する抗体を検出していると考えられている。

【０００５】ＮＡＮＢ肝炎の経過は不良であり、水平感
染によっても持続感染化（キャリア化）し、慢性肝炎に
進展することが確認されている。また、肝硬変、肝がん
へ進展するケースも多いと予想され、一日も早く、診断
法、治療法、予防法を確立することが望まれている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記のようにカイロン
社のＨＣＶ抗体検出キット（Ｃ１００−３抗体検出系）
では捕捉されないＮＡＮＢ肝炎が多数存在する。このこ
とから、ＨＣＶ感染の判別診断には、カイロン社の前記
検出キットのような非構造蛋白に対する抗体ではなく、
コア蛋白に対する抗体を検出する事が重要であるとの考
え方があり、コア領域の遺伝子、およびこれにコードさ
れる蛋白質の研究が盛んに行われている。

【０００７】ところが、種々のＨＣＶ−ＲＮＡを単離
し、その塩基配列を比較すると、保存性の高いといわれ
るコア領域においてすら相同性が９０％以下である場合
が見いだされた。

【０００８】また、ワクチン開発に重要なエンベロープ
領域ではさらに変異が激しく、塩基の相同性が６０％以
下を示す株も少なからず存在する事が明らかになった。
これら株間の変異の原因はＨＣＶがＲＮＡウイルスであ
るためと考えられる。

【０００９】したがって、ＨＣＶをいくつかのジェノタ
イプに、簡易、迅速に分類することができるならば、診
断、治療、予防のうえで極めて有益である。すなわち、
ＨＣＶをジェノタイプに分類することにより、 垂直感染（母児間感染）、水平感染における感染経路
を解明できる、 ジェノタイプ別に進行状況、症状の特色等を追跡する
ことができ、予後を予測したり、治療の指針とすること
ができる、 ジェノタイプ間の塩基配列、アミノ酸配列の異同を解
明し、核酸検出系または抗体検出系によるＨＣＶの検出
率を高める、 変異の著しいエンベロープ領域中に、ジェノタイプに
特異的な共通配列を見いだすことにより、ジェノタイプ
に特異的な免疫グロブリン（ｌｇＧ）やワクチンを製造
することができる。 投与対象のジェノタイプを迅速に判別することによ
り、これに投与すべきｌｇＧやワクチンを選択でき、効
果的な予防手段を直ちに講ずることができる、 等の応用を行うことができるので、その医学的、社会的
意義はきわめて大きい。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＮＡＮＢ
型肝炎の検出、治療、予防、感染経路判定ならびに疫学
調査に有用なＨＣＶのジェノタイプ鑑別方法、ならびに
これに用いるオリゴヌクレオチドプライマーを見いだす
ために、ヒト及びチンパンジーキャリアの血清より種々
のＨＣＶゲノムのＲＮＡを単離し、非コード領域及びコ
ア蛋白質、エンベロープ蛋白質をコードする領域を含む
遺伝子のｃＤＮＡをクローン化してその塩基配列を決定
した（特願平３−１９６１７５号、特願平３−２８７４
０２号、特願平３−３６０４４１号）。その結果、ＨＣ
Ｖゲノムは、比較的保存性の高いと考えられてきたコア
領域においてもあるグループに特徴的な塩基配列の変異
が認められ、さらにエンベロープ領域では変異が著しい
事が明らかとなった。

【００１１】本発明者らは、数多くのＨＣＶゲノムにつ
いて研究を進めることにより、コア領域における塩基配
列を基準として分類することにより、ＨＣＶをいくつか
のグループに分別しうるとの見解に達した。

【００１２】本発明者らは、上記の見解にもとづいてＨ
ＣＶのジェノタイプに関して更なる研究を進めた結果、
ＨＣＶが塩基配列の相同性から４種のジェノタイプに分
類しうることを解明し、各ジェノタイプに共通のオリゴ
ヌクレオチド、および各ジェノタイプ毎に特異的なオリ
ゴヌクレオチドを各々特定し、これを合成した。

【００１３】さらに、本発明者らは、上記オリゴヌクレ
オチドの全部または１種以上をプライマーとして使用
し、ＰＣＲ法によりｃＤＮＡを増幅することによりＨＣ
Ｖゲノムを簡便、迅速かつ確実に鑑別する方法を確立し
た。

【００１４】ＨＣＶゲノムのジェノタイプ鑑別は、上記
ＰＣＲ法により増幅したｃＤＮＡの分子長を測定するこ
とによっても行うことができる。

【００１５】本発明の鑑定方法を使用することにより、
Ｃ型肝炎に対する薬物治療適性を判定することができ
る。

【００１６】本発明者らは、配列番号１ないし９記載の
オリゴヌクレオチド＃１３２、＃１３３、＃１３４、＃
１３５、＃１０４、＃２３、＃２５６、＃１８６、＃２
９６を合成した。

【００１７】上記各オリゴヌクレオチドを特定した経緯
は次のとおりである。本発明者らはヒト及びチンバンジ
ーより得た血清、血漿３９検体よりＨＣＶ−ＲＮＡを単
離し、そのｃＤＮＡのコア領域の塩基配列を決定した。
それらの配列の中から連続する２０塩基で、全てのＨＣ
Ｖ−ＲＮＡにおいて保存性の高い領域として、ｎｔ１４
８〜１６７、ｎｔ１２６〜１４５、ｎｔ１３９〜１５８
およびｎｔ３９１〜４１０の各オリゴヌクレオチドを特
定した。

【００１８】本発明者らは、さらに数株のゲノムでは保
存性がきわめて高く（塩基の変異が、原則として２塩基
以下）、他の株では保存性が低い（塩基の変異が、原則
として３塩基以上で、特に５′末端に変異が多い）領域
を見い出し、ｎｔ１８５〜２０４、ｎｔ２７２〜２９
１、ｎｔ３０２〜３２１、ｎｔ２５１〜２７０、ｎｔ１
７７〜１９６の各オリゴヌクレオチドを特定した。

【００１９】本発明者らは、前項に記載した５領域のオ
リゴヌクレオチドの保存性の程度にもとづいてＨＣＶを
グループ分けすることにより、全てのＨＣＶ−ＲＮＡ
を、重複することなく４種のジェノタイプに分類できる
ことを解明した。

【００２０】本発明者らは、保存性の高い前記４領域の
配列を有するオリゴヌクレオチド＃１０４（ｎｔ１４８
〜１６７）、＃２３（ｎｔ１２６〜１４５）、＃２５６
（ｎｔ１３９〜１５８）、＃１８６（ｎｔ３９１〜４１
０）、ならびにジェノタイプに特異的な前記５領域のオ
リゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌクレ
オチド＃１３２（ｎｔ１８５〜２０４）、＃１３３（ｎ
ｔ２７２〜２９１）、＃１３４（ｎｔ３０２〜３２
１）、＃１３５（ｎｔ２５１〜２７０）、＃２９６（ｎ
ｔ１７７〜１９６）をＣｙｃｌｏｎｅ Ｐｌｕｓ ＤＮ
Ａ合成機を使用して、常法により化学合成した。

【００２１】つぎに、本発明者らは、前記オリゴヌクレ
オチド＃１３２、＃２９６、＃１３３、＃１３４、＃１
３５をアンチセンスプライマーとして使用し、ＰＣＲ法
によりｃＤＮＡを増幅することによりＨＣＶゲノムのジ
ェノタイプを鑑別する方法を発明した。

【００２２】上記ＰＣＲ法では、センスプライマーとし
ては、保存性の高いオリゴヌクレオチド＃２３、＃１０
４または＃２５６を使用するのが好適である。

【００２３】また、第１段階のＰＣＲとして保存性の高
いオリゴヌクレオチド＃２３または＃２５６をセンスプ
ライマー、＃１８６をアンチセンスプライマーとして使
用し、ｃＤＮＡを増幅させたのちに、第２段階として、
前記ＰＣＲ法を実施するのも望ましい。

【００２４】ＰＣＲ法による反応生成物は、電気泳動法
により分離し、その分子長を測定することによりＨＣＶ
−ＲＮＡゲノムを鑑別することができる。

【００２５】現在までに判明しているＨＣＶについて、
本発明の方法を適用して分類すると、ＨＣＶゲノムは、
Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型の４種に重複なく分類
されることが解明された。

【００２６】上記において、オリゴヌクレオチド＃１３
２または＃２９６をアンチセンスプライマーに使用して
ｃＤＮＡが増幅されるタイプをＩ型、同様に＃１３３で
増殖されるタイプをＩＩ型、＃１３４で増殖されるタイ
プをＩＩＩ型、＃１３５で増殖されるタイプをＩＶ型と
した。

【００２７】本発明者らによる前記各特許出願によって
既に開示されたＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４、ＨＣ−Ｊ５、
ＨＣ−Ｊ６、ＨＣ−Ｊ７、ＨＣ−Ｊ８について、本発明
の方法を適用して分類すると、ＨＣ−Ｊ１はＩ型に、Ｈ
Ｃ−Ｊ４はＩＩ型に、ＨＣ−Ｊ５とＨＣ−Ｊ６はＩＩＩ
型に、ＨＣ−Ｊ７、ＨＣ−Ｊ８はＩＶ型に分類されるこ
とが解明された。

【００２８】また、実施例に示すように、ヒトおよびチ
ンバンジーから得た血清、血漿３９検体よりＨＣＶ−Ｒ
ＮＡを単離し、本発明の鑑別方法を適用したところ、重
複なく全てＩ〜ＩＶ型の４タイプに分類された。

【００２９】さらに、上記３９検体について、ＨＣＶゲ
ノムのコア領域ｎｔ１４６〜４８６における塩基配列の
相同性を調べた。その結果、同一の型に属する株同士の
相同性は９５．１〜９７．５％であるのに対し、異なる
型に属する株同士の相同性は７７．９〜９１．０％であ
った。このことから本発明の鑑別方法によって、ＨＣＶ
のジェノタイプを適確に分類できることが裏付けられた
（表１）。

【００３０】

【表１】

【００３１】本明細書において、ｎｔはオープンリーデ
ィングフレーム開始（ＡＴＧのＡを１とする）からの塩
基番号を、ｎｃ−ｎｔは、非コード領域を含む５′末端
からの塩基番号を各々示す。

【００３２】本発明の鑑別方法にもとづいて日本人のＨ
ＣＶ陽性血清を測定した。その結果は、無症候性キャリ
ア（健常人）群では、ＩＩ型が８２％と圧倒的に多く、
ついでＩＩＩ型が１０％、Ｉ型４％、ＩＶ型４％であっ
た。これに反し、肝疾患患者群ではＩＩ型が６０％、Ｉ
ＩＩ型が２３％であった（表２）。このように肝炎発症
の危険性がＨＣＶジェノタイプにより有意に異なること
が解明された。この例に示されるように、本発明の鑑別
方法は、肝炎の予防、予後予測のうえでも有用であるこ
とが示された。

【００３３】

【表２】

【００３４】さらに、本発明のジェノタイプ鑑別方法を
用いることにより、ＨＣＶ重複感染の確認やＨＣＶ感染
経路の追跡を行うこともできる。また、実施例５に示す
ように、本発明の方法によりＨＣＶジェノタイプ鑑別を
経たＣ型慢性肝炎患者に対するＩＦＮ投与による治療効
果の検査結果から、ＩＩ型とＩＩＩ型の間には有意な差
が認められた。これにより、本発明の方法がＣ型肝炎に
対する薬物治療効果の適性を事前に判定できることが明
らかとなった。

【００３５】本発明の鑑別方法がＨＣＶゲノムを確実に
ジェノタイプに分類することから、ヌクレオチド検出
系、抗体検出系の感度を向上させ、またジェノタイプ特
異性の高いＩｇＧ、ワクチンの開発、およびその投与手
法の確立等への応用範囲がきわめて広い。

【００３６】

【作用】本発明の鑑別方法は、ＨＣＶゲノムを簡易、迅
速かつ確実にジェノタイプへ分類することができる。本
発明の鑑別方法は、Ｃ型肝炎に対する薬物治療効果を事
前に判定することができる。また、本発明のオリゴヌク
レオチドは、本発明の鑑別方法において、アンチセンス
プライマーまたはセンスプライマーとして使用すること
ができる。

【００３７】

【実施例】以下、本発明の実施例について述べるが、も
とより本発明がこれら実施例に限定されるものではな
い。

【００３８】実施例１ 本発明のオリゴヌクレオチド＃１３２、＃１３３、＃１
３４、＃１３５、＃１０４、＃２３、＃２５６、＃１８
６、＃２９６を次のように特定した。 （１）ＲＮＡの抽出 オーソＨＣＶＡｂＥＬＩＳＡキット（オーソ・ダイアグ
ノスティック・システムズ社）によりＨＣＶ抗体陽性と
判定されたヒト血清および血漿、並びに上記ＨＣＶ抗体
は陰性であるが、非Ａ非Ｂ型肝炎の感染を確認したチン
パンジーから得た血漿から各々次のようにしてＲＮＡを
抽出した。血清または血漿に１５０ｍＭＮａＣｌ、１０
ｍＭ ＥＰＴＡを含むトリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐ
Ｈ８．０）を等量加え、９０×１０^３ｒｐｍで１５分間
遠心した。得られたペレットに２００ｍＭ ＮａＣｌ、
１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）、および１ｍｇ／ｍｌのプロテナーゼ
Ｋを含むトリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）を
加え、６０℃で１時間加温し、フェノール／クロロホル
ムで抽出した後、エタノール沈澱を行い、ＲＮＡを得
た。

【００３９】（２）ポリメラーゼチェインリアクション
（ＰＣＲ）法による５′非コード領域ＲＮＡおよびコア
領域ＲＮＡの検出 上記（１）で得られたＲＮＡを７０℃で１分間加熱変性
させ、これを鋳型として合成プライマー＃３６（５′−
ＡＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧＣＡＧＴ−３′、ｎ
ｃ−ｎｔ２４６−２６５：アンチセンス）と逆転写酵素
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（ＢＲＬ社；アメリカ）とを用
いてｃＤＮＡを合成しＰＣＲに供した。Ｇｅｎｅ Ａｍ
ｐ ＤＮＡ増幅試薬キット（パーキンエルマー・シータ
ス社）を用いたＳａｉｋｉらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３９，４８７−４９１，１９８８）により、ＤＮＡサ
ーマルサイクラー（パーキンエルマー・シータス社）に
て遺伝子の増幅を行った。５′非コード領域に特異的な
プライマーとして１段階目に＃３２Ａ（５′−ＣＴＧＴ
ＧＡＧＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴ−３′、ｎｃ−ｎｔ
４５−６４：センス）と＃３６の組み合わせを、２段階
目にはその内側の＃３３（５′−ＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡ
ＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ−３′、ｎｃ−ｎｔ６３−８２：
センス）と＃４８（５−ＧＴＴＧＡＴＣＣＡＡＧＡＡＡ
ＧＧＡＣＣＣ−３′、ｎｃ−ｎｔ１８８−２０７：アン
チセンス）の組み合わせを用いて、２段階のＰＣＲを行
った。ＰＣＲ法により５′非のコード領域ＨＣＶ−ＲＮ
Ａの存在が確認された、日本人供血者の血奨から得た２
８検体、および慢性ＮＡＮＢ肝炎患者から得た１０検体
およびＮＡＮＢ型肝炎の感染を確認したチンパンジーか
ら得た１検体の合計３９検体について、さらにコア領域
の遺伝子増幅を行った。各検体からオリゴヌクレオチド
＃１２２（５′−ＡＧＧＴＴＣＣＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡ
ＡＴＴ−３′、ｎｔ４８７−５０６：アンチセンス）を
プライマーとして合成したｃＤＮＡについてプライマー
＃２３と＃１２２を用いたＰＣＲによりコア領域の約３
分の２に相当するｎｔ１２６−５０６部分（３８１ｂ
ｐ）を増幅し、それらの塩基配列を決定した。反応サイ
クルは、変性（９４℃ １分間）、プライマーのアニー
ル（５５℃１分３０秒）プライマーの伸長（７２℃ ２
分間）の工程で行った。得られた反応生成物をＴ_４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）で処理し、Ｍ１３ｍｐ
１９ファージベクターのＨｉｎｃＩＩサイトにクローニ
ングした。ｃＤＮＡクローンの塩基配列はＳｅｑｕｅｎ
ａｓｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（ユナイテッドステー
ツ・バイオケミカル社）を用いて両方向からジデオキシ
ターミネーション法により決定した。

【００４０】（３）各ジェノタイプに共通するプライマ
ー、ならびにジェノタイプに特異的なプライマーを次の
ように特定した。得られた塩基配列から連続した２０塩
基で、プライマーとして好適な、比較的保存性の高い部
分（２０塩基中、置換が２塩基以下）を選びだした。こ
のうち全株共通の部分はｎｔ１２６−１４５、ｎｔ１３
９−１５８、ｎｔ１４８−１６７、ｎｔ３９１−４１０
に存在した。他方ｎｔ１７７−１９６、ｎｔ１８５−２
０４、ｎｔ２５１−２７０、ｎｔ２７２−２９１、ｎｔ
３０２−３２１はそれぞれ数株で良く保存されていなが
ら、それ以外の株では共通性が認められず、ジェノタイ
プ特異的な部分であることが解明された（図１、図
６）。各領域におけるコンセンサスシークエンスをもと
にして各ジェノタイプに共通するプライマーとなるオリ
ゴヌクレオチド＃１０４（配列番号５、ｎｔ１４８−１
６７：センス）、＃２３（配列番号６、ｎｔ１２６−１
４５：センス）、＃２５６（配列番号７、ｎｔ１３９−
１５８：センス）および＃１８６（配列番号８、ｎｔ３
９１−４１０：アンチセンス）が特定された。次に、ジ
ェノタイプに特異的なプライマーとなるオリゴヌクレオ
チド＃１３２（配列番号１、ｎｔ１８５−２０４：アン
チセンス）、＃１３３（配列番号２、ｎｔ２７２−２９
１：アンチセンス）、＃１３４（配列番号３、ｎｔ３０
２−３２１：アンチセンス）、＃１３５（配列番号４、
ｎｔ２５１−２７０：アンチセンス）および＃２９６
（配列番号９、ｎｔ１７７−１９６：アンチセンス）が
特定された。

【００４１】各オリゴヌクレオチドの合成。上記特定さ
れたオリゴヌクレオチド＃１０４、＃２３、＃２５６、
＃１８６、＃１３２、＃１３３、＃１３４、＃１３５な
らびに＃２９６を、ＣｙｃｌｏｎｅＰｌｕｓ ＤＮＡ合
成機を用いて常法により合成した。

【００４２】実施例２ 本発明のジェノタイプ鑑別方法 （１）ＨＣＶ−ＲＮＡ陽性検体におけるジェノタイプ判
別 実施例１で得られた各プライマーを用いてＨＣＶジェノ
タイプ判別を行った。実施例１に用いた血清、血漿３９
検体からプイラマー＃１８６によりｃＤＮＡを合成し
た。反応サイクルは変性（９４℃ １分間）、プライマ
ーのアニール（５５℃ １分間３０秒）、およびプライ
マーの伸長（７２℃ ２分間）の工程で３５サイクル繰
り返した。第１段階ＰＣＲはジェノタイプ共通のプライ
マー＃２５６と＃１８６を用いてｃＤＮＡ合成と同じ条
件で３５サイクル繰り返し、ｎｔ１３９−４１０の２７
２塩基を増幅した。反応生成物の５０分の１量を第２段
階ＰＣＲにかけた。センスプライマーとして共通プライ
マー＃１０４を、アンチセンスプライマーとしてジェノ
タイプ特異プライマーの＃１３２、＃１３３、＃１３
４、＃１３５の等量混合物を用い、変性（９４℃ １分
間）、プライマーのアニール（６０℃ １分間）、およ
びプライマーの伸長（７２℃ １分３０秒）の工程で３
５サイクル繰り返した。得られた反応生成物について
１．５％ＮｕＳｉｅｖｅ、１．５％ＳｅａＫｅｍ（いず
れもＦＭＣ社、ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社 アメリカ）
の混合アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウム染
色の後、紫外線照射下でバンドを確認し、上記のいずれ
のプライマーによって増幅されたものであるかを判定し
た。すなわち、＃１３２をアンチセンスに用いて増幅し
た場合、ＰＣＲ産物の塩基数は５７ｂｐであり、同様に
＃１３３、＃１３４、＃１３５ではそれぞれ１４４ｂ
ｐ、１７４ｂｐ、１２３ｂｐとなり（図２）、電気泳動
における泳動距離から何れのプライマーによる増副産物
であるかが判定できる（図３）。その結果、３９検体の
ＨＣＶジェノタイプ判定結果は実施例１−（３）におい
て分類した結果（図１）と全く一致し、本発明のジェノ
タイプ判別に用いるプライマーの特異性が証明された。
以下ジェノタイプ名は、使用したアンチセンスプライマ
ー＃１３２、＃１３３、＃１３４、＃１３５によってそ
れぞれＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型とした。

【００４３】第１段階ＰＣＲにおけるセンスプライマー
として、＃２５６にかえて、＃２３を使用したほかは、
上記（１）と同様にしてＰＣＲ産物を得た。結果は上記
（１）と同様であった。

【００４４】（２）第２段階ＰＣＲにおけるセンスプラ
イマーとして、＃１０４にかえて、＃２３を使用したほ
かは、上記（１）と同様にしてＰＣＲ産物を得た。結果
は上記（１）と同様であった。

【００４５】第２段階ＰＣＲにおけるセンスプライマー
として、＃１０４にかえて、＃２５６を使用したほか
は、上記（１）と同様にしてＰＣＲ産物を得た。結果は
上記（１）と同様であった。

【００４６】（３）実施例２−（１）でジェノタイプに
分類された３９検体についてコア領域のｎｔ１４６−４
８６の塩基配列の相同性を比較した。その結果を表１に
示す。同じジェノタイプに分類されたグループ、すなわ
ち同じプライマーによって増幅される検体間は９５．１
〜９７．５％と非常に高い相同性を示すのに対し、異な
るジェノタイプに分類されるグループ、すなわち異なる
プライマーによって増幅される検体間は７７．９〜９
１．０％と低い相同性を示すにすぎなかった（表１）。

【００４７】（４）本発明者らの出願にかかる前記各特
許出願に開示されたＨＣＶゲノムである、ＨＣ−Ｊ１、
ＨＣ−Ｊ４、ＨＣ−Ｊ５、ＨＣ−Ｊ６、ＨＣ−Ｊ７のｃ
ＤＮＡについて本発明の鑑別方法を実施した。実施に際
しては、＃１３２、＃１３３、＃１３４、＃１３５をア
ンチセンスプライマーとして使用した。その結果、ＨＣ
−Ｊ１がＩ型、ＨＣ−Ｊ４がＩＩ型、ＨＣ−Ｊ５とＨＣ
−Ｊ６がＩＩＩ型、ＨＣ−Ｊ７がＩＶ型に分類されるこ
とが解明された。

【００４８】実施例３ 実施例２（１）の方法によりそれぞれＩ型、ＩＩ型、Ｉ
ＩＩ型、ＩＶ型と判定された血清検体Ｎｏ．１、２、
３、４について、アンチセンスプライマーとして＃２９
６、＃１３３、＃１３４、＃１３５の等量混合物を用い
たＰＣＲ法によりジェノタイプ鑑別を行った。ｃＤＮＡ
合成および２段階ＰＣＲは、第２段階ＰＣＲのアンチセ
ンスプライマーの＃１３２を＃２９６に換えた他は実施
例２（１）の方法に従って行った。得られた反応生成物
を２％ＮｕＳｉｅｖｅ、２％ＳｅａＫｅｍの混合アガロ
ースゲルで電気泳動し、臭化エチジウム染色後紫外線照
射下でバンドを確認した（図８）。その結果、検体Ｎ
ｏ．１では＃２９６により増幅させたＰＣＲ産物（塩基
数４９ｂｐ）が確認され、また、Ｎｏ．２〜３について
もそれぞれ＃１３３、＃１３４、＃１３５により増幅さ
せたバンドが確認され、＃２９６を用いた方法でも＃１
３２の場合と同様にＨＣＶのジェノタイプを鑑別できる
（Ｉ型）ことが明らかとなった。

【００４９】実施例４ （１）日本におけるＨＣＶのジェノタイプ分類 本発明のジェノタイプ鑑別法を用いて、日本におけるＨ
ＣＶジェノタイプ分布を調べるため、供血者１５９例、
ＮＡＮＢ肝炎患者８０例、および血友病患者１１例につ
いて、実施例１の方法に従ってサンプル血漿からＨＣＶ
−ＲＮＡを抽出した後、実施例２の方法に従ってｃＤＮ
Ａを合成し、ジェノタイプ鑑別のＰＣＲを行った。その
結果、表２に示す如く供血者群に於いては８割以上がＩ
Ｉ型であった。これに対し、ＮＡＮＢ肝炎患者群ではＩ
Ｉ型が８０例中４８例、６０％と少なく、有意差が認め
られた（Ｐ＜０．０１）。特に肝ガンでは、ＩＩ型は４
８％のみであり、供血者に少ないＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ
型がそれぞれ１１％、１８％、１８％と多くを占めてい
た。ＩＩＩ型について供血者群とＮＡＮＢ肝炎患者群で
比較しても、前者で１５９例中１６例、１０％であるの
に対し、後者では８０例中１８例、２３％で同じく有意
差があった（Ｐ＜０．０１）。有意差の検定はＸ^２法に
より行った。血友病患者群では重複感染と見られる例を
含めて、Ｉ型が５例、ＩＩ型が４例見いだされ、感染源
が輸入血液製剤であることが示唆される結果となった。
以上の結果により、本発明のジェノタイプ鑑別方法によ
りＨＣＶゲノムのジェノタイプ鑑定が非常に簡便かつ確
実に行えることが明らかとなると共に、ジェノタイプの
違いにより感染後の肝炎予後に差があることが示され、
ＮＡＮＢ肝炎の治療、予防に本発明のジェノタイプ鑑別
方法が有用であることが明らかとなった。

【００５０】（２）重複感染の鑑別 重複感染については図４に電気泳動パターンを示すよう
に、合計４例に認められた。その内訳は、前記血友病患
者２例（Ｉ型とＩＩ型：レーン３、およびＩ型とＩＩＩ
型：レーン４）のほかに慢性肝炎患者１例（Ｉ型とＩＩ
型：レーン１）、肝ガン患者１例（ＩＩ型とＩＩＩ型：
レーン２）であった。これらが異なるジェノタイプのＨ
ＣＶ重複感染であることを証明するため、各検体より複
数個のＨＣＶゲノムのｃＤＮＡを釣り上げ、ｎｔ１４６
−４８６のコア領域３４１ｂｐの配列の相同性を確認し
た。血友病患者の１例（レーン３）から得られたクロー
ンは塩基配列の相同性からＩ型に近い群とＩＩ型に近い
群に分類され、それらの相同性は同一群内では９９％以
上であったのに対し、２群間では８８．８％と低値であ
った。同様に血友病患者の他の１例（レーン４）、慢性
肝炎患者例、肝ガン患者例でも、得られたクローンは２
群に分類され、異なる群間の相同性は各々７９．４％、
９０．１％、８０．３％であった。以上の結果、実施例
２−（２）、表１に示す結果と比較しても、２クローン
が異なるジェノタイプに分類されることが明らかとなっ
た。従来の技術では１検体から複数のｃＤＮＡをクロー
ニングしてそれぞれ塩基配列を決定した上、それらの配
列の相同性を計算しなければジェノタイプが異なるゲノ
ムの存在を確認することができなかったが、本発明によ
り簡便かつ確実にジェノタイプの異なるＨＣＶの重複感
染を検出することが可能となった。

【００５１】 （３）垂直感染および水平感染における感染経路の鑑別 垂直感染（母児感染）による感染と見られる症例２例、
および水平感染（針刺し事故）による感染と見られる症
例１例について、それぞれ被感染者と感染源と推定され
る人の血清を採取し、ＨＣＶゲノムのジェノタイプを鑑
別した。実施例２の方法に従ってｃＤＮＡを合成し、ジ
ェノタイプ鑑別のＰＣＲ産物を電気泳動にかけた結果を
図５に示す。レーン１〜４は垂直感染と見られる２例
で、レーン１、２およびレーン３、４がそれぞれの同一
家系の母と児の血清より得られたＨＣＶゲノムであり、
そのジェノタイプはＩＩ型およびＩＩＩ型で母児間の一
致を見た。レーン５、６は水平感染が疑われた例で、感
染源（レーン５）被感染者（レーン６）共にＩＶ型であ
り、ジェノタイプの一致をみた。以上の結果により、本
発明のジェノタイプ鑑別法がＮＡＮＢ肝炎の感染経路追
跡に有用であることが明らかとなった。

【００５２】実施例５ 本発明者らが先に解明した日本人由来のＨＣＶ株である
ＨＣ−Ｊ２、ＨＣ−Ｊ３（Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．６０：１６７−１７７，１９９０）およびＨＣ−
Ｊ８（特願平３−３６０４４１号）について、本発明の
ジェノタイプ鑑別法を実施した。実施に際しては第１段
階ＰＣＲは＃２５６をセンスプライマーとして、＃１８
６をアンチセンスプライマーとして使用し、第２段階Ｐ
ＣＲは＃１０４をセンスプライマーとして、＃１３２、
＃１３３、＃１３４、＃１３５をアンチセンスプライマ
ーとして使用した他は実施例２−（１）の方法に従って
行った。また、前記ＨＣＶ株ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４、
ＨＣ−Ｊ６を比較のために同時に測定に供した。その結
果、図７に示す電気泳動パターンが得られ、これよりＨ
Ｃ−Ｊ２とＨＣ−Ｊ３がＨＣ−Ｊ４と同じＩＩ型、ＨＣ
−Ｊ８がＩＶ型と分類されることが解明された。

【００５３】なお、本実施例においては、まず、＃１３
２に関しＹはＴ、ＲはＧとし、＃１３３に関しＲはＧ、
ＷはＴ、ＹはＣとし、＃１３４に関し５塩基目のＲは
Ｇ、１６塩基目のＲはＡとし、＃１３５に関し１塩基目
および１９塩基目のＲはＡ、１３塩基目のＲはＧ、Ｙは
Ｃとし、＃１０４に関し３塩基目、６塩基目、１８塩基
目のＲはＧ、７塩基目のＲはＡ、ＳはＣとし、＃２５６
に関してはＭはＡ、ＮはＴ、１５塩基目のＲはＧ、１６
塩基目のＲはＡとし、＃１８６に関し、ＹはＴ、ＲはＧ
を各々選択したものについて実験し、上記の結果を得
た。つぎに、配列表記載のもう１つの塩基を選択した場
合についても、実質的に同一の結果を得た。

【００５４】実施例６ 実施例１（２）の方法により５′非コード領域を検出す
るＰＣＲ法によってＨＣＶ−ＲＮＡの存在が確認され、
かつ肝生検で組織学的に診断されたＣ型慢性肝炎患者９
６名について、実施例２（１）の方法に従ってジェノタ
イプ鑑別を行った。その結果は、ＩＩ型：６９名（７２
％）、ＩＩＩ型：２１名（２２％）、ＩＶ型：６名（６
％）の内訳となりＩ型は見出されなかった。上記９６名
の全員に対して、インターフェロンα投与による治療を
行った。組換えＩＦＮ−α２ａ（商品名「ロフェロン
Ａ」、日本ロシュ社製）を皮下注射により６ＭＵ×７日
間連続投与し、続いて３ＭＵ×週３回×２３週間投与し
た。投与終了直後、５′非コード領域のプライマーを用
いたＰＣＲ法によりＨＣＶ−ＲＮＡを測定したところ、
ＩＩ型の１４名（２０％）、ＩＩＩ型の１４名（６７
％）、ＩＶ型の２名（３３％）の患者でＲＮＡが陰性化
していることがわかった。このＨＣＶ−ＲＮＡ陰性化率
を比較すると、ＩＩＩ型はＩＩ型よりも統計的に有意に
高かった（ｐ＜０．００１、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ′ｓ ｔ
ｅｓｔによる）。また、表３に示すとおり、ＨＣＶ−Ｒ
ＮＡ定量値（表中、定量値１、２、、、はそれぞれ１０
^０、１０^１、、、ＣＩＵ（チンパンジー感染価）／ｍｌ
を表す）を比較した場合も、ＩＩ型、ＩＶ型に比してＩ
ＩＩ型においてはＩＦＮ投与終了後に著しく低い値とな
ったことが明らかとなった。この結果より、本発明のＨ
ＣＶジェノタイプ鑑別方法により分類されたタイプ間で
ＩＦＮ投与に対する感受性が異なることが確認され、本
発明の鑑別方法がＣ型肝炎に対する薬物治療の適性を予
め判定するためにも有用であることが明らかとなった。

【００５５】

【表３】

【００５６】

【発明の効果】本発明の鑑別方法は、ＨＣＶゲノムを簡
易、迅速かつ確実にジェノタイプへ分類することができ
る。このため、ヌクレオチド検出系、抗体検出系の感度
を向上させ、またジェノタイプ特異性の高いＩｇＧ、ワ
クチンの開発、およびその投与手段、治療指針の確立等
への応用範囲がきわめて広い。さらに、本発明のジェノ
タイプ鑑別方法を用いることにより、ＨＣＶ重複惑染の
確認やＨＣＶ感染経路の追跡を行うことができ、ＨＣＶ
の研究、ＨＣＶ肝炎の診断、予防、治療に広く応用する
ことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＣＶ３９検体に関するジェノタイプ判定結
果。

【図２】本発明で使用するＰＣＲ法の説明図。

【図３】ジェノタイプＩ〜ＩＶ型の電気泳動図。

【図４】重複惑染の電気泳動図。

【図５】感染経路を鑑別した電気泳動図。

【図６】プライマー＃２５６領域および＃２９６領域に
おけるＨＣＶ３９検体の塩基配列。

【図７】ＨＣＶ６検体を鑑別した電気泳動図。

【図８】ＨＣＶ４検体を鑑別した電気泳動図。

【符号の説明】

図３〜図５、図７および図８において、Ｉ、ＩＩ、ＩＩ
Ｉ、ＩＶはＨＣＶのジェノタイプＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ
型、ＩＶ型を示す。１，２，３，４，５，６は電気泳動
におけるレーンを示す。

【００５７】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃１３２） ＹＲＣＣＴＴＧＧＧＧ ＡＴＡＧＧＣＴＧＡＣ ２０ （ＹはＴまたはＣ。ＲはＧまたはＡ。）

【００５８】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃１３３） ＧＡＲＣＣＡＷＣＣＴ ＧＣＣＣＡＹＣＣＹＡ ２０ （ＲはＧまたはＡ。ＷはＴまたはＡ。ＹはＣまたは
Ｔ。）

【００５９】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃１３４） ＣＣＡＡＲＡＧＧＧＡ ＣＧＧＧＡＲＣＣＴＣ ２０ （ＲはＧまたはＡ。）

【００６０】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃１３５） ＲＣＣＹＴＣＧＴＴＴ ＣＣＲＴＡＣＡＧＲＧ ２０ （ＲはＧまたはＡ。ＹはＣまたはＴ。）

【００６１】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃１０４） ＡＧＲＡＡＲＲＣＴＴ ＣＳＧＡＧＣＧＲＴＣ ２０ （ＲはＧまたはＡ。ＳはＣまたはＧ。）

【００６２】配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃２３） ＴＡＧＡＴＴＧＧＧＴ ＧＴＧＣＧＣＧＣＧＡ ２０

【００６３】配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃２５６） ＣＧＣＧＣＧＭＣＮＡ ＧＧＡＡＲＲＣＴＴＣ （ＭはＡまたはＣ。ＮはＡ，Ｔ，ＣまたはＧ。ＲはＡま
たはＧ）

【００６４】配列番号：８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃１８６） ＡＹＧＴＡＣＣＣＣＡ ＹＧＡＧＲＴＣＧＧＣ ２０ （ＹはＴまたはＣ。ＲはＧまたはＡ。）

【００６５】配列番号：９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃２９６） ＧＧＡＴＡＧＧＣＴＧ ＡＣＧＴＣＴＡＣＣＴ ２０

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号１記載の塩基配列を有するオリゴ
   ヌクレオチド＃１３２、配列番号２記載の塩基配列を有
   するオリゴヌクレオチド＃１３３、配列番号３記載の塩
   基配列を有するオリゴヌクレオチド＃１３４、配列番号
   ４記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド＃１３
   ５、配列番号９記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
   チド＃２９６から選ばれた１種以上をアンチセンスプラ
   イマーとし、配列番号５記載の塩基配列を有するオリゴ
   ヌクレオチド＃１０４、配列番号６記載の塩基配列を有
   するオリゴヌクレオチド＃２３、配列番号７記載の塩基
   配列を有するオリゴヌクレオチド＃２５６から選ばれた
   １種以上をセンスプライマーとして使用し、ポリメラー
   ゼチェインリアクション法によりｃＤＮＡを増幅するこ
   とを特徴とするＣ型肝炎ウイルスゲノムのジェノタイプ
   鑑別方法。
2. 【請求項２】配列番号６記載の塩基配列を有するオリゴ
   ヌクレオチド＃２３、または配列番号７記載の塩基配列
   を有するオリゴヌクレオチド＃２５６をセンスプライマ
   ー、配列番号８記載のオリゴヌクレオチド＃１８６をア
   ンチセンスプライマーとして使用して第１次ポリメラー
   ゼチェインリアクション法によりｃＤＮＡを増幅したの
   ち、請求項１記載の増幅を行うジエノタイプ鑑別方法。
3. 【請求項３】増幅されたｃＤＮＡの分子長を測定する請
   求項１または２記載のジェノタイプ鑑別方法。
4. 【請求項４】請求項１ないし３記載の鑑別方法を使用す
   るＣ型肝炎の薬物治療適性判定方法。
5. 【請求項５】配列番号１記載の塩基配列を有するオリゴ
   ヌクレオチドから成り、請求項１ないし３記載の鑑別方
   法に用いるアンチセンスプライマー＃１３２。
6. 【請求項６】配列番号２記載の塩基配列を有するオリゴ
   ヌクレオチドから成り、請求項１ないし３記載の鑑別方
   法に用いるアンチセンスプライマー＃１３３。
7. 【請求項７】配列番号９記載の塩基配列を有するオリゴ
   ヌクレオチドから成り、請求項１ないし３記載の鑑別方
   法に用いるアンチセンスプライマー＃２９６。
8. 【請求項８】配列番号５記載の塩基配列を有するオリゴ
   ヌクレオチドから成り、請求項１ないし３記載の鑑別方
   法に用いるセンスプライマー＃１０４。
9. 【請求項９】配列番号６記載の塩基配列を有するオリゴ
   ヌクレオチドから成り、請求項１ないし３記載の鑑別方
   法に用いるセンスプライマー＃２３。
10. 【請求項１０】配列番号７記載の塩基配列を有するオリ
    ゴヌクレオチドから成り、請求項１ないし３記載の鑑別
    方法に用いるセンスプライマー＃２５６。
11. 【請求項１１】請求項１ないし３記載の鑑別方法にアン
    チセンスプライマーとして使用可能な配列番号３記載の
    塩基配列を有するオリゴヌクレオチド＃１３４。
12. 【請求項１２】請求項１ないし３記載の鑑別方法にアン
    チセンスプライマーとして使用可能な配列番号４記載の
    塩基配列を有するオリゴヌクレオチド＃１３５。