KR20010022220A - 비-ｂ형 비-ｃ형 비-ｇ형 간염 바이러스 유전자,폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 바이러스 입자, 바이러스입자의 분리 방법, 및 바이러스의 검출 방법 - Google Patents

비-ｂ형 비-ｃ형 비-ｇ형 간염 바이러스 유전자,폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 바이러스 입자, 바이러스입자의 분리 방법, 및 바이러스의 검출 방법 Download PDF

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다무라 료지
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Abstract

신규한 간염 바이러스를 분리하고 이의 유전자 서열을 결정함으로써 수득되는 진단 및 치료에 유용한 유전자가 기술되어 있다. 당해 유전자는, 프라이머로서 서열 57에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열 60에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 이용하는 PCR, 또는 프라이머로서 서열 57에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열 61에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 이용하는 PCR에 의해 약 3500개 뉴클레오티드 내지 약 4000개 뉴클레오티드 길이로 이루어진 서열이 증폭될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자이다. 이러한 유전자의 뉴클레오티드 서열을 기준으로 하여, 폴리펩티드 등이 제공된다.

Description

비-Ｂ형 비-Ｃ형 비-Ｇ형 간염 바이러스 유전자, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 바이러스 입자, 바이러스 입자의 분리 방법, 및 바이러스의 검출 방법 {Non-B non-C non-G hepatitis virus gene, polynucleotide, polypeptide, virion, method for separating virion, and method for detecting virus}
B형 간염 바이러스("HBV"로서 후술됨) 및 C형 간염 바이러스("HCV"로서 후술됨)는 지금까지 혈액-기인된 감염성 간염의 병인성 바이러스인 것으로 밝혀져 왔다. 양 바이러스에 대한 진단 방법은 이미 확립되었으며, 이들 방법은 초기에, 본 국가에서 수혈용 혈액을 스크리닝하는데 도입되었다. 그 결과, 수혈자가 상기 간염 바이러스 모두에 새로이 감염되는 사례를 거의 완벽하게 방지하는 것이 가능하였다.
그러나, HBV 및 HCV에 대한 진단 방법이 확립된 이후에도, 특발성 바이러스성 간염으로 추정되는 사례가 전체 간염의 5 내지 10%를 차지한다. 이러한 사례는 혈액-기인된 것이 아닌 감염성 유형의 간염 바이러스인 A형 간염 바이러스; 인도에서만 보고된 바 있고 그 존재 자체도 의심스러운 E형 간염 바이러스, F형 간염 바이러스; 및 결함있는 간염 바이러스인 D형 간염 바이러스에 의해 야기된 것으로 간주되지 않았으며, 밝혀지지 않은 또 다른 간염 바이러스의 존재 가능성이 제시되었다.
이들 간염 사례의 병인제인 것으로 간주되는 바이러스의 유전자 서열이 1995년 미국 애보트(Abbott), 그리고 1996년 진랩 테크놀로지(Genelabs Technologies)에 의해 연달아 보고되었으며, 각각 GBV-C 및 HGV로 명명되었다. 그러나, 이들 바이러스는 나중에 이들의 서열 비교를 근거로 하여 동일한 것으로 간주되었다("GBV-C/HGV"로 후술됨). 특발성 바이러스성 간염에 있어서의 GBV-C/HGV의 연관성에 관한 연구가 또한 본 국가에서 활발하게 수행되고 있다. 그 결과, 적어도, GBV-C/HGV가 공지되지 않은 병인론의 비-B형, 비-C형 간염 사례 모두에 대한 원인이 되지는 않는다는 사실이 상당 부분 받아들여지고 있는데, 이는 간염 증상의 발현이 이의 간염 사례에는 약하긴 하지만 이것이 헤마틴 경로를 통하여 전염될 수 있기 때문이다. 따라서, 공지되지 않은 바이러스가 상기 특발성 간염에 관여하는 것으로 생각된다.
혈액-기인된 감염성 간염을 유발하는 공지되지 않은 간염 바이러스의 존재가 앞서 기재된 바와 같이 제안되었으며, 이러한 공지되지 않은 간염 바이러스를 발견하고, 이러한 바이러스의 유전적, 분자생물학적 및 역학적 특징을 밝혀냄으로써 간염에 대한 예방법, 진단법 및 치료법을 보다 완벽하게 실현하는 것이 요망되었다.
달리 언급하면, 확인되지 않은 바이러스에 의해 유발된 간염의 진단 방법 및 치료 방법을 개발하기 위해서는, 이러한 바이러스의 유전 정보를 수득하고; 바이러스-특이적 유전자 서열 및 아미노산 서열을 결정하며; 에피토프의 위치를 결정하고; 이러한 에피토프를 함유하는 생물학적 물질의 생성 방법을 확립하며; 항바이러스성 항체와 특이적으로 반응하는 항원의 생성 방법을 확립하고; 이러한 바이러스에 대해 특이적인 항체를 제공하며; 바이러스 입자의 분리 및 수집 방법을 확립하고; 면역학적 활성은 유지시키면서 이들의 생물학적 활성을 약독화시키기 위해 상기 바이러스 입자를 처리하는 방법을 확립하며; 유전자, 항체 및 항원의 검정 방법 및 수득될 바이러스로부터 유도된 전술된 생물학적 물질을 이용하여 중화 항체-유도된 백신을 제조하는 방법을 개발하는 것이 요망된다.
본 발명은 병인론이 통상적인 진단 방법에 의해서는 확인될 수 없었던 혈액-기인된 감염성 간염의 병인성 바이러스를 발견함으로써 이용가능하게 된, 유전자, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 항체 및 항원 뿐만 아니라, 이와 같이 이용가능하게 된 유전자, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 항체 및 항원을 이용하여 바이러스 유전자, 항체 및 항원을 생산, 검출 및 검정하는 방법, 바이러스 입자 및 이러한 바이러스 입자의 분리 방법에 관한 것이다.
도 1 내지 5는 75개의 HNT22 양성 샘플로부터 수득된 유전자의 NG001(서열 40)과 RD052(서열 5)에 상보적인 서열 간의 396개 뉴클레오티드의 서열(서열 1에서 nt1862-2257에 상응함)을 비교한 것을 도시한 것이다.
#22의 상응하는 영역(nt78-299)의 완전한 서열(서열 11)이 샘플 서열의 상단에 제시되어 있고, 그 밑에 #22와 상이한 샘플 1 내지 75의 뉴클레오티드 알파벳으로 제시되며, 동일한 뉴클레오티드의 위치는 점(·)으로 제시된다. 서열(서열 1에서의 nt1939-2160, 서열 11에서의 nt78-299에 상응함)의 상동성을 기준으로 하여, 이들을 4가지 그룹, 즉 샘플 1 내지 49의 그룹(인자형 I로서 명명됨), 샘플 50 내지 73의 그룹(인자형 II로서 명명됨), 샘플 74 및 샘플 75로 분류할 수 있다.
실시예 2 및 3에서 사용된 프라이머의 위치 설정이 상단 열에 제시되어 있다. 인자형 II 및 샘플 74 및 75에서는 RD037(서열 2) 및 RD051(서열 4)의 프라이머의 3' 말단 측에 미스매치가 통상 존재하는 것을 알 수 있다.
도 6은 유전자 워킹을 이용한 #22 클론 서열의 확장을 나타낸 것이다(실시예 4).
도 7은 수혈에 의해 유발된 HNT22 감염 사례에 대해,
(1) 수혈용 혈액 중의 HNT22 유전자 서열(서열 11),
(2) 수혈한지 2주가 지난 환자로부터 유도된 HNT22 유전자 서열, 및
(3) 수혈한지 4주가 지난 환자로부터 유도된 HNT22 유전자 서열을 비교한 것을 나타낸다(실시예 7). 이와 같이 비교된 서열은 서로 완전하게 일치한다.
도 8은 HNT22 유전자의 개방 판독 프레임(ORF)을 조사한 결과를 나타낸 것이다(실시예 10).
상단 3개 프레임: 서열 1에 제시된 뉴클레오티드 서열에 있어서의 개시 코돈 및 종결 코돈의 후보 위치 설정. 짧은 수직 바는 개시 코돈을 지시하고, 긴 수직 바는 종결 코돈을 지시한다. 상기 프레임은 각각의 개방 판독 프레임이 매 서열마다 하나의 뉴클레오티드에 의해 이동되는 서열을 나타낸다. 긴 ORF가 제1 및 제2 프레임에서 발견되었다.
하단 3개 프레임: 서열 1에 제시된 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열에 있어서의 개시 코돈 및 종결 코돈의 후보 위치 설정. 긴 ORF는 상기 프레임 중의 어느 것에서도 인식되지 않았다.
도 9는 개방 판독 프레임 1 및 2에 의해 암호화된 아미노산 서열을 기준으로 한 폴리펩티드의 친수성/소수성 스코어를 나타낸 것이다.
도 10은 실시예 12에서 수득된 HNT22 양성 사례로부터의 유전자의 뉴클레오티드 서열을 기준으로 한 분자 계통발생도를 나타낸 것이다.
도 11 및 12는 실시예 12에서 수득된 HNT22 양성 사례로부터의 유전자의 뉴클레오티드 서열 비교를 나타낸 것이다.
도 13은 완전한 길이의 TUS01 유전자의 서열 분석에 사용된 클론과 프라이머의 위치상 관계를 나타낸 것이다. 이의 서열을 결정하는 클론의 명칭이 박스에 지시되어 있다. 증폭에 사용된 프라이머의 명칭이 상기 박스의 좌측 상단과 우측 상단에 지시되어 있으며, 5' 말단의 첫 번째 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 1로서 규정하는 경우의 뉴클레오티드 번호가 괄호안에 지시되어 있다.
도 14는 TUS01 유전자의 개방 판독 프레임(ORF)에 대한 조사 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 HNT22 유전자와 TUS01 유전자의 5' 말단 영역 서열을 비교한 것이다.
도 16은 HNT22 유전자와 TUS01 유전자의 3' 말단 영역 서열을 비교한 것이다.
본 발명의 목적은 지금까지 이의 병인성 바이러스가 동정된 바 없었기 때문에 이에 대한 진단법, 예방법 및 치료법도 개발되지 못하였던, 확인되지 않은 바이러스성 간염의 진단 방법 및 치료 방법을 새로이 확립하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 확인되지 않은 신규의 간염 바이러스 유전자를 분리하여 이의 유전자 서열을 결정함으로써, 유전자, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 바이러스 입자의 분리 방법, 진단 및 치료에 이용될 수 있는 바이러스 입자, 바이러스성 항원 및 항바이러스성 항체, 및 이러한 바이러스의 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 통상적인 바이러스성 간염의 진단 방법에 의해서는 원인을 밝혀낼 수 없는 간염에 걸린 환자의 혈액에는, 공지되지 않은 간염 바이러스 입자 또는 이의 일부가 존재해야 한다고 가정하였다. 이러한 가정을 근거로 하여, 본 발명자들은 상기 혈액으로부터 바이러스성 유전자를 분리하고자 하였다. 구체적으로 언급하면, 본 발명자들은 상기 바이러스성 유전자가 간염 환자의 혈액에는 존재하지만, 사람 게놈에는 존재하지 않고 대부분의 정상인의 혈액에는 존재하지 않거나, 또는 간염 발증(crisis) 전에는 존재하지 않지만 발증 후에는 존재할 수 있다는 가설을 세우고, 이러한 가설을 기준으로 하여 간염 환자의 혈액에서 후보 유전자를 조사하여 이를 분리하였다. 추가로, 이러한 후보 유전자를 대상으로 하여 다음 기준에 따라 조사하고, 이러한 기준 모두를 충족시키는 유전자가 궁극적으로 신규한 바이러스성 유전자로 간주되었다:
(1) 유전자가 원인이 밝혀지지 않은, 다수의 간염 환자의 혈액에 존재하고,
(2) 수혈자가 당해 유전자에 대해 양성인 혈액의 주입으로 인해 상기 유전자에 대해 양성이 되는 반면 이러한 유전자가 수혈 전에는 이들의 혈액 내에 존재하지 않고 수혈 후에 이들에게서 간염 발증이 관찰되는 사례가 있으며,
(3) 이와 같이 수득된 유전자 서열이 공지된 간염 바이러스 또는 기타 공지된 바이러스의 유전자 서열과 상동성이 아니고,
(4) 상기 유전자에 대해 양성인 혈액을, 바이러스 입자 분리 및 수집 방법으로서 광범위하게 사용되고 있는 밀도 구배 원심분리 기술에 의해 분석한 경우에, 이러한 유전자에 대해 양성인 분획이 통상적인 바이러스 입자 분획에서 발견된다.
무증후성 보균자, 즉 간염 바이러스에 대해서는 양성이지만 간염 증상을 나타내지 않고 건강한 것으로 보이는 감염 사례는 공지된 간염 바이러스의 감염 사례로 공지되어 있으며, 이러한 사례가 관심있는 바이러스의 감염 사례에 널리 가능한 것으로 간주되었다. 따라서, 상기 기준은 "당해 유전자가 정상인에게서는 발견되지 않는다"라는 기준을 포함하지는 않는다.
전술된 기준에 따라, 본 발명의 유전자를 분리하고, 이와 같이 분리된 유전자의 서열을 결정하며, PCR 프라이머로서 이용될 수 있는 올리고뉴클레오티드 서열을 조사한다.
상기와 같이 수득된 프라이머를 이용함으로써, 당해 유전자의 검출 방법을 확립한다. 추가로, 이러한 유전자 서열에 존재하는 개방 판독 프레임을 동정하고, 아미노산 서열을 구체화한다. 밀도 구배 원심분리에 의해 밀도를 또한 결정하고, 상기 바이러스를 수집하는 방법을 확립한다. 이로써, 본 발명이 완성되었다.
즉, 본 발명은 프라이머로서 서열 57에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열 60에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 이용하는 PCR, 또는 프라이머로서 서열 57에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열 61에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 이용하는 PCR에 의해 약 3500개 뉴클레오티드 내지 약 4000개 뉴클레오티드 길이의 서열이 증폭될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자를 제공한다(또한, 본 발명의 유전자로서 후술됨).
본 발명의 유전자는 바람직하게는, 상기 PCR에 의해 약 3600개 뉴클레오티드 내지 3900개 뉴클레오티드 길이의 서열이 증폭될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
바람직하게는, 본 발명의 유전자의 경우, 상기 PCR에 의해 증폭된 단편의 5' 말단 및 3' 말단에서의 뉴클레오티드 서열이 각각 서열 1에 제시된 뉴클레오티드 서열의 3 내지 300번 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 및 2402 내지 3789번 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열과 70% 이상의 상동성을 나타낸다. 더욱 바람직하게는, 이러한 상동성은 80% 이상이다.
본 발명은 추가로, 다음 (a) 또는 (b)의 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자를 제공한다:
(a) 프라이머로서 서열 6에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열 8에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 이용하는 PCR에 의해 약 200개 뉴클레오티드 내지 약 350개 뉴클레오티드 길이의 서열이 증폭될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자, 또는
(b) 프라이머로서 서열 7에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열 8에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 이용하는 PCR에 의해 약 200개 뉴클레오티드 내지 약 350개 뉴클레오티드 길이의 서열이 증폭될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자.
본 발명의 유전자는 바람직하게는 서열 1에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자, 또는 이의 동종이인자형 변이체 유전자이다. 이러한 유전자의 예로는, 서열 45에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자(인자형 1), 서열 46에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자(인자형 2), 서열 47에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자(인자형 3), 서열 48에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자(인자형 4), 서열 49에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자(인자형 5), 서열 50에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자(인자형 6), 서열 51에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자(인자형 7), 서열 52에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자(인자형 8), 서열 53에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자(인자형 9), 및 서열 54에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자(인자형 10)가 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 유전자에서 인식되고 이러한 유전자에 특이적인 뉴클레오티드 서열 또는 이러한 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다(이는 또한, 본 발명의 올리고뉴클레오티드로 후술됨). 이러한 올리고뉴클레오티드의 구체적인 예로는 서열 2에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드(RD037), 서열 3에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드(RD038), 서열 4에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드(RD051), 서열 5에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드(RD052), 서열 6에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드(NG059), 서열 7에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드(NG061) 및 서열 8에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드(NG063)이 있다.
본 발명은 또한, 프라이머로서 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 수행하는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자의 검출 방법을 제공한다.
이러한 검출 방법의 구체적인 예로는 프라이머로서 서열 2에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열 3에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하거나, 또는 서열 4에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열 5에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 수행하는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자의 검출 방법(제1 검출 방법), 및 프라이머로서 서열 6에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열 8에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하거나, 또는 서열 7에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열 8에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 수행하는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자의 검출 방법(제2 검출 방법)이 있다.
본 발명은 또한, 전술한 제1 검출 방법과 제2 검출 방법 모두를 하나의 샘플에 대해 수행한 다음 이러한 두 유전자 검출 방법 모두로부터 수득된 결과를 비교하는, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 인자형들의 구별 방법, 및 인자형 1 내지 6 중의 어느 하나에 존재하고 이러한 인자형 중의 어느 하나에 특이적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 하이브리드화를 수행하는, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 인자형들의 구별 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로, 본 발명의 유전자의 뉴클레오티드 서열에 존재하는 개방 판독 프레임 내에서 암호화된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 제공한다(이는 또한, 본 발명의 폴리펩티드로 후술됨).
본 발명의 폴리펩티드의 구체적인 예로는 서열 9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 서열 10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 있다. 본 발명의 폴리펩티드에는 서열 9 또는 10에 제시된 아미노산 서열에서 발견되고 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스에 특이적인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스-특이적 에피토프를 함유한다.
더우기, 본 발명은 또한, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 입자의 밀도를 기준으로 하여 바이러스 입자를 분리시키는, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 입자의 분리 방법; 이러한 방법에 의해 분리된 바이러스 입자; 및 상기 바이러스 입자로부터 수득된 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 펩티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 추가로, 서열 9 또는 10에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 재조합 유전자 발현 벡터; 서열 9 또는 10에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 함유하는 형질전환체 세포; 이러한 형질전환체 세포에 의해 발현된 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 항원 펩티드 또는 이의 단편; 및 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 항원 펩티드를 발현시키는 조건하에서 상기 형질전환체 세포를 배양하고 이와 같이 발현된 펩티드를 수집하는 것을 포함하는, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 항원 펩티드의 제조 방법을 제공한다.
추가로, 본 발명은 항원으로서 본 발명의 폴리펩티드(바이러스 입자로부터 수득 가능한 것을 포함함) 또는 전술한 바이러스 입자를 사용하여, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 항체를 면역학적으로 검출하는 방법; 면역원으로서 본 발명의 폴리펩티드(바이러스 입자로부터 수득 가능한 것을 포함함) 또는 전술한 바이러스 입자를 사용하여 동물을 면역시키는 것을 포함하여, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스에 대한 항체를 생산하는 방법; 이러한 방법에 의해 수득된 항체; 및 전술된 항체를 사용하여, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 항원을 면역학적으로 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로, 서열 1에 제시된 뉴클레오티드 서열에 존재하는 개방 판독 프레임에 의해 암호화된 아미노산 서열 내에 함유된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 함유하고 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 중화 항체의 에피토프 서열을 함유하는 백신; 및 전술한 바이러스 입자를 함유하는 백신을 제공한다.
본 발명의 유전자는 바람직하게는 또한, 서열 62에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자 또는 이의 동종이인자형 변이체 유전자이다.
또한, 이러한 본 발명의 유전자의 경우, 본 발명의 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드; 본 발명의 유전자에서 인식되고 이러한 유전자에 특이적인 뉴클레오티드 서열 또는 이에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드; 프라이머로서 전술된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 수행하는, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자의 검출 방법, 본 발명의 유전자의 뉴클레오티드 서열에 존재하는 개방 판독 프레임 내에 암호화된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드; 재조합 유전자 발현 벡터; 형질전환체 세포; 이러한 형질전환체 세포에 의해 발현된 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 항원 펩티드 또는 이의 단편; 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 항원 펩티드의 제조 방법; 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 항체의 면역학적 검출 방법; 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 항체의 생산 방법; 항체; 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 항원의 면역학적 검출 방법; 및 백신이 제공된다.
본 발명은 다음에 보다 상세히 설명될 것이다.
본 발명은 이미 공지된 어떠한 바이러스와도 상이한, 지금까지 공지되지 않은 바이러스에 관한 것이다. 본 발명에서 사용된 "비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스"란 용어는 혈액-기인된 감염을 통하여 전염되어 간염 증상을 유발시키는 병인성 바이러스를 의미하며, 유사하게 혈액-기인된 감염성 바이러스인 B형, C형 및 G형 바이러스와는 상이한, 지금까지 공지되지 않은 바이러스이다. 추가로, 이는 또한, 혈액-기인된 것이 아닌 감염성 유형의 것인 A형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스 및 F형 간염 바이러스, 및 결함있는 바이러스인 D형 간염 바이러스와는 상이하므로, 이는 결국 비-B형, 비-C형, 비-D형, 비-E형, 비-F형, 비-G형 간염 바이러스와 동일한 의미를 갖는다.
간염 증상은 일반적으로, 비정상적인 간 기능 수치 및 황달 외관과 같은 간염 증상을 의미한다.
본 발명에서는, 본 발명의 바이러스가 본 발명의 바이러스의 발견 맥락을 근거로 하여 간염 바이러스로 규정되지만, 본 발명의 바이러스에 의해 유발된 주요 질환이 간염이어야 한다는 것을 반드시 의미하지는 않는다.
본 발명자들은 서열 1에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자 또는 이의 동종이인자형 변이체로서 간주된 유전자를 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스를, 본 발명의 유전자에 포함되는 "HNT22" 바이러스("HNT22"로서 후술됨)로 명명하였다. HNT22는 또한, 다음 (a) 또는 (b)의 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자를 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스로서 정의될 수 있다:
(a) 프라이머로서 서열 6에 제시된 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열 8에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 이용하는 PCR에 의해 약 200개 뉴클레오티드 내지 약 350개 뉴클레오티드 길이의 서열이 증폭될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자, 또는
(b) 프라이머로서 서열 7에 제시된 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열 8에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 이용하는 PCR에 의해 약 200개 뉴클레오티드 내지 약 350개 뉴클레오티드 길이의 서열이 증폭될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자.
추가로, 전술된 유전자에 포함되지 않는 유전자를 갖는, 즉 서열 62에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 또는 이의 동종이인자형 변이체로서 간주되는 유전자를 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스를 "TUS01" 바이러스("TUS01"로서 후술됨)로 명명한다.
즉, HNT22 및 TUS01은 비-A형, 비-B형, 비-C형, 비-D형, 비-E형, 비-F형, 비-G형 간염 환자로부터 분리된 지금까지 공지되지 않은 바이러스이고, 이들은, 병인론이 지금까지 공지되지 않았고 공지된 어떠한 바이러스와도 바이러스학적 및 분자생물학적으로 상이한 간염 환자로부터 분리한 것이다.
HNT22 및 TUS01은 유전적으로, 이의 5'말단부에서 서열 1에 제시된 뉴클레오티드 서열의 3 내지 300번 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 또는 이와 고도로 상동성인 뉴클레오티드 서열, 및 이의 3'말단부에서 서열 1에 제시된 뉴클레오티드 서열의 2902 내지 3738번 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 또는 이와 고도로 상동성인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 약 3500개 뉴클레오티드 내지 약 4000개 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 3600개 뉴클레오티드 내지 약 3900개 뉴클레오티드의 5'말단 뉴클레오티드 서열 및 3'말단 뉴클레오티드 서열을 포함하는 길이를 갖는 유전자를 갖는 바이러스로서 정의될 수 있다.
본 발명에서는, HNT22에 대해 양성인 간염이 "HNT22형 간염"으로 칭해지고, TUS01에 대해 양성인 간염이 "TUS01형 간염"으로 칭해진다.
바이러스가 일반적으로 더욱 더 잘 돌연변이를 진행하며, 이러한 돌연변이가 다른 고등 유기체와 비교해서 이들의 유전자내에 보다 잘 고정된다는 것은 공지되어 있다. 따라서, 수 많은 균주(동종이인자형 변이체)가 동일한 종 내에 존재할 수 있으며, 실재적인 유전자 서열을 공유하고 있는 인자형이 또한 존재한다. 용어 HNT22 및 TUS01는 가능한 상당수의 상기 균주 및 인자형을 포함하는 바이러스의 유전적 명칭으로서 본 발명에 사용된다.
바이러스가 앞서 기재된 바와 같이 돌연변이 빈도수가 높고 유전자에 이러한 돌연변이를 고정시키는 것으로 공지되었기 때문에, 이의 유전자 서열 또는 아미노산 서열에 의한 바이러스의 정의는 구체적으로 예시된 서열을 함유하는 바이러스 뿐만 아니라 실질적으로 상동성인 것으로 간주된 범위 내의 유전자 서열 또는 아미노산 서열을 갖는 바이러스를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 실질적으로 상동성인 범위는 이들의 유전자 서열 또는 아미노산 서열을 비교함으로써 하나의 바이러스를 다른 바이러스와 명백하게 구별시켜줄 수 있는 상동성 비율을 기준으로 하여 규정될 수 있다. 이러한 실질적으로 상동성인 범위는 또한, 공지된 유사한 바이러스의 종 내의 서열 다양성을 참조로 하여 규정될 수 있다.
전술된 기준에 따르면, HNT22 유전자 또는 TUS01 유전자의 뉴클레오티드 서열과의 상동성이 55% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 특히 바람직하게는 80% 이상인 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자가 본 발명의 유전자와 실질적으로 상동성인 것으로 간주될 수 있으며, 이는 본 발명의 범주 내에 속한다.
본 발명의 HNT22 유전자를 대상으로 하여 HNT22 유전자 내에서의 유전적 보존율과 다른 바이러스와의 상동성을 실제적으로 결정한 경우, HNT22 유전자 내에서의 상동성(보존성)은 55% 이상이고, 다른 바이러스와의 가장 높은 상동성은 60% 미만이다.
본 발명에서 사용된 상동성은 뉴클레오티드 서열과 아미노산 서열의 상동성을 의미하고, 이는 구체적으로, 비교될 서열이 필수의 결실과 가장 잘 일치하도록 정렬되는 경우에 전체 서열 내에 함유된 뉴클레오티드 또는 아미노산 수에 대한 일치된 뉴클레오티드 또는 아미노산 수의 비율(%로 표현됨)을 의미한다.
본 발명의 바이러스처럼 혈액-기인된 감염성 간염을 유발시키는 C형 간염 바이러스(HCV)는 종 내에서 60% 이상의 상동성을 나타내었다. 추가로, 동일한 인자형의 HCV는 부분적인 높은 돌연변이 영역을 제외하고는 80% 이상의 상동성을 나타낸 것으로 보고되었다. 이들 사실로부터, 본 발명의 유전자 범위가 전술된 상동성 관점에서 규정되어야 하는 것이 적절한 것으로 여겨진다.
유사하게, 암호화된 아미노산 서열의 상동성에 관해서는, 본 발명의 바이러스와의 상동성이 통상적으로 65% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상인 것이 본 발명의 바이러스와 실질적으로 상동성이며, 본 발명의 바이러스에 포함된다.
HNT22 유전자에 존재하는 인자형은 다양하게 분류될 수 있지만, 서열 1에서의 1939 내지 2160번 뉴클레오티드 서열(nt1939-2160으로 후술됨)을 기준으로 하는 경우에는, 서열 45에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HNT22 유전자(인자형 1), 서열 46에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HNT22 유전자(인자형 2), 서열 47에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HNT22 유전자(인자형 3), 서열 48에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HNT22 유전자(인자형 4), 서열 49에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HNT22 유전자(인자형 5), 서열 50에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HNT22 유전자(인자형 6) 및 서열 51에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HNT22 유전자(인자형 7)이 언급될 수 있다.
이들 뉴클레오티드 서열을 이용함으로써, 특이적 인자형의 HNT22 바이러스를 검출 또는 구별할 수 있다. 구별 방법으로서, 다음의 실시예에서 언급된 바와 같은 방법에 의한 증폭 및 서열 분석을 이용하는 방법 뿐만 아니라 프라이머로서 상기 인자형 중의 어느 하나에 특이적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 상응하는 인자형의 유전자 서열만을 증폭시키는 방법, 프로브로서 이러한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 상응하는 유전자 서열을 선택적으로 검출하는 방법, 및 이들 방법의 조합을 언급할 수 있다. 이들 방법에 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드, 반응 조건 등은 당해 분야의 숙련인에게 공지된 방법에 따라서 선택할 수 있다. 예를 들면, 인자형의 부분 서열 특징(인자형-특이적 서열로서 후술됨)은 이러한 인자형 서열들을 서로 비교함으로써 선택할 수 있다. 당해 분야의 숙련인이 인자형-특이적 서열 또는 이에 상보적인 서열을 갖고 다른 HNT22 인자형을 하이브리드화하지 않은 올리고뉴클레오티드를 선택하거나, 또는 인자형-특이적 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드가 다른 인자형 서열(단백질, 핵산, 효소, PCR의 프론트-라인, 1996, Kyoritsu Shuppan)과 실질적으로 하이브리드화할 수 없는 조건을 선택하는 것은 용이한 일이다. 상기 언급된 바와 같이 선택된 올리고뉴클레오티드를 프라이머 또는 프로브로서 이용하여 HNT22 인자형-특이적 증폭 또는 검출을 수행할 수 있다.
전술된 HNT22 유전자는 프라이머로서 서열 6에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(NG059) 및 서열 8에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를(NG063) 사용하는 PCR, 및/또는 프라이머로서 서열 7에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(NG061) 및 서열 8에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(NG063)를 사용하는 PCR에 의해 증폭될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로서 검출될 수 있다.
특히, 서열 1에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HNT22 유전자는 프라이머로서 서열 2에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(RD037) 및 서열 3에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(RD038)를 사용하는 PCR, 및/또는 프라이머로서 서열 4에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(RD051) 및 서열 5에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(RD052)를 사용하는 PCR에 의해 증폭될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로서 검출될 수 있다.
본 발명의 HNT22 유전자는 다음 과정에 따라서 본 발명자들에 의해 수득된 것이다.
명백하게 간염 증상을 나타내긴 하지만 공지된 어떠한 간염 바이러스 마커에 대해서는 음성인 사례가 있는 것으로 인식되어 왔다. 이러한 사례는 공지되지 않고 명료하게 확인되지 않은 간염 바이러스에 의해 감염된 것으로 추정된다.
한편, 이러한 바이러스가 원칙상 건강한 사람에게는 존재하지 않는 것으로 사료될 수 있다. 그러나, 간염 바이러스-감염된 환자 중에는, 이들의 간 기능면에서는 전혀 이상하지 않고 외관상으로 건강해 보이는 무증후성 보균자가 있을 수도 있다.
따라서, 본 발명자들은 공지되지 않은 간염 바이러스를 조사하기 위하여, 원인이 불분명한 간염 사례에서는 존재하지만, 간염 발증 전에는 환자나 건강한 사람에게서 존재하지 않는 유전자의 스크리닝을 수행하였다. 상기 언급된 바와 같이 비교될 그룹 중의 하나에 존재하는 유전자 검출 방법으로서, 공지된 RDA 분석법[Representational Difference Analysis: Science 259, 946-950, 1993; "RDA 방법"으로 후술됨]을 이용한다.
RDA 방법에 의해 수득된 후보 유전자의 서열을 결정함으로써, 본 발명자들은 이러한 서열이 공지된 바이러스의 서열과 상동성이지 않다는 것을 확인하였다.
연속하여, 유전자 서열의 일부를 구성하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 유전자 검출 시스템을 작제하고, 이러한 유전자가 원인이 밝혀지지 않은 다른 간염 사례에서 검출되었다는 것을 확인하였다.
추가로, 상기 유전자에 대해 양성인 사례로부터의 다수의 서열을 분석하고 비교한 결과, 인자형들이 바이러스 내에 존재한다는 것을 나타내고, 이러한 인자형들에 특이적인 서열을 이용하여 상기 인자형들을 구별하는 방법을 작제하였다.
더우기, 상기 유전자는 대부분의 건강한 사람에게서는 발견되지 않는 것으로 확인되었다. 당해 유전자에 대해 양성인 사례 중에서는, 수혈 전에는 이러한 유전자에 대해 음성이었지만, 유전자에 대해 양성인 혈액 주입으로 인해 감염되어 그 후로는 양성인 채로 유지되는 몇몇 사례가 있는 것으로 또한 확인되었다.
또한, 상기 유전자가 숙주로부터 유도된 것이 아닌 것으로 확인되었다.
밀도 구배 원심분리를 이용한 분석으로부터, 당해 유전자에 양성인 분획이 다른 바이러스 입자에서 관찰되는 바와 같이 특정한 밀도로 국재되어 있다.
당해 바이러스는 역 전사효소 반응 단계의 존재 또는 부재를 기준으로 한 분석, 데옥시리보뉴클레아제를 이용한 분석 및 제한 엔도뉴클레아제를 이용한 실험에 의해 일본쇄 DNA 바이러스인 것으로 또한 확인되었다.
상기 결과 모두를 분석한 결과, 상기 유전자는 수혈에 의해 전달되어 유지되고, 감염 사례에서 간염 증상이 관찰되며, 건강한 사람 중에서는 양성인 사람이 그리 많지 않으며, 유전자 서열이 이미 공지된 바이러스 유전자 서열과 상동성이지 않다는 사실이 확인되었다. 이러한 결과를 조합하여, 본 발명자들은 상기 바이러스가 지금까지 공지되지 않은 간염 바이러스 유전자를 함유하고 있다고 결론지었다.
전술된 유전자는 이들의 구조 측면에서 바이러스 유전자의 일부인 것으로 추정된다. 본 발명자들은 전술된 유전자 서열을 기준으로 하여 공지된 유전자 워킹법에 의해 본 발명의 유전자를 수득하였다.
본 발명의 양태들은 HNT22 유전자를 참조로 하여 다음에 설명될 것이지만, TUS01 유전자도 유사하게 사용될 수 있다는 것을 용이하게 이해할 것이다.
본 발명은 HNT22 유전자에 특이적인 서열을 갖고 엄격한 조건하에서 HNT22 유전자와 상보적으로 하이브리드화될 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이러한 올리고뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드의 특징으로 인해, 이를 HNT22 유전자 증폭용 프라이머로서 또는 샘플 내에서 HNT22 유전자를 포획 또는 검출하기 위한 프로브로서 유효하게 사용할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "특이적 서열"은 관심있는 유전자의 뉴클레오티드 서열 또는 이러한 뉴클레오티드 서열로부터 추론된 아미노산 서열에 존재하고 관심있는 특정 서열 이외의 서열과는 구별될 수 있는 특징적인 서열 부분을 의미한다. 한 서열이 이러한 특징적인 서열인지 아닌지의 여부는 서열 상동성을 기준으로 하여 결정할 수 있다. 구체적으로 언급하면, 이는, 특정 서열을 통상적인 방식, 예를 들면, 데이타베이스를 조사하여 공지된 서열과 비교하는 경우, 동일한 길이를 갖는 관심있는 유전자 이외의 공지된 서열에 대해서 10% 이하의 상동성을 나타내는 서열을 의미할 수 있다. 또 다른 방법으로는, 관심있는 유전자가 이러한 서열을 이용함으로써 검출, 동정 및 증폭될 수 있는지를 결정함으로써 결정할 수 있다. 구체적으로 언급하면, 뉴클레오티드 서열에 관해서는, 상기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 이러한 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 프라이머 또는 프로브로서 당해 분야의 숙련인에게 공지된 유전자의 검출 또는 증폭 방법에 사용되는 경우, 이러한 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 통계적 유의를 갖는 다른 유전자와 구별 가능한 방식으로 관심있는 유전자를 검출, 동정 또는 증폭시킬 수 있다면, 이러한 서열은 관심있는 유전자에 특이적인 것으로 결정되어야 한다. 아미노산 서열에 관해서는, 한 서열이 특이적 서열인지 아닌지의 여부는 서열을 상동성을 기준으로 하여 유사하게 결정될 수 있다. 구체적으로 언급하면, 특이적 아미노산 서열은 공지된 서열과 비교할 때 약 10% 이하의 상동성을 나타내어야 하는 길이를 갖는 아미노산 서열이다. 또 다르게는, 항원으로서 관심있는 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열로 구성되거나 이를 함유하는 펩티드를 사용함으로써 발생되고 상기 아미노산 서열에 연결된 것으로 입증된 항체가, 상기 아미노산 서열로부터 유도되지 않은 기타 항원에 결합되지 않거나 통계적 유의를 갖는 보다 약한 정도로 상기 항원에 결합되는 경우에는, 이러한 아미노산 서열을 관심있는 유전자에 특이적인 서열로서 결정할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 임의의 길이를 갖는 뉴클레오티드 폴리머이고 이에는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드, 예를 들면, 일본쇄 및 이본쇄 DNA, 및 일본쇄 및 이본쇄 RNA가 포함된다. 이들 용어에는 변형되지 않은 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라, 예를 들면, 메틸화, 캡핑, 효소 표지화, 형광성 표지화 등에 의한 변형을 지닌 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드가 포함된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드에는 게놈성 DNA로부터 유도된 것 뿐만 아니라 통상적인 방법에 따르는 합성, 복제, 전사 또는 증폭에 의해 수득된 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드가 포함된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드에는 상기와 같이 예시된 서열, 이에 실질적으로 상동성인 서열, 및 이에 상보적인 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드는 PCR에 의한 HNT22 유전자 증폭용 프라이머로서 사용될 수 있다. 이러한 방법에서는, 이들 프라이머 사이의 HNT22 유전자의 일정 부분을 증폭시킴으로써, 이러한 HNT22 유전자 일부분이, 즉 HNT22가 시험된 샘플에 존재한다는 것을 확인할 수 있다.
본 발명은 또한, 하이브리드화에 의해 HNT22 유전자를 포획하고 HNT22 유전자를 검출하는데 유용한 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 폴리뉴클레오티드 프로브를 제공한다.
이러한 포획 또는 검출에 사용된 적합한 프로브는 상기 언급된 프라이머의 선별과 동일한 방식으로 유전자 서열로부터 선별할 수 있고, 선별된 프로브는 통상적인 방식으로 표지시킬 수 있다. 상기 언급된 프라이머로 증폭된 유전자를, 상기 언급된 프로브를 이용하여 포획함으로써 유전자를 검출하는 것이 또한 가능하며, 특히 인자형-특이적 서열을 포함하는 프로브를 이용함으로써 HNT 인자형을 구별하는 것이 가능해진다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 통상적으로, 폴리뉴클레오티드에 연속적으로 존재하는 비교적 짧은 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드이고, 이에는 상동성이거나 상보적인 폴리뉴클레오티드 중의 서열을 갖는 것이 포함된다. 이의 길이는 일반적으로 6 내지 50개 뉴클레오티드, 바람직하게는 10 내지 30개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 15 내지 20개 뉴클레오티드이다.
HNT22 유전자가 상기 언급된 바와 같이 다양성을 나타내기 때문에, 뉴클레오티드 서열이 바이러스 균주 중에 비교적 잘 보존되어 있는 영역 중의 뉴클레오티드 서열이 상기 유전자에 특이적인 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 당해 분야의 숙련인은 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열을 기준으로 하여 이러한 뉴클레오티드 서열을 선별하는 것이 용이하다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 구체적인 예로는, 서열 2에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드(RD037), 서열 3에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드(RD038), 서열 4에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드(RD051), 서열 5에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드(RD052), 서열 6에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드(NG059), 서열 7에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드(NG061), 서열 8에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드(NG063) 등이 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 이용하여 PCR을 수행하는, HNT22 유전자의 검출 방법을 제공한다.
이러한 검출 방법의 구체적인 예로는 프라이머로서 서열 2에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(RD037) 및 서열 3에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(RD038)를 사용하거나, 또는 서열 4에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(RD051) 및 서열 5에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(RD052)를 사용하여 PCR을 수행하는 HNT22 유전자의 검출 방법(제1 검출 방법), 및 프라이머로서 서열 6에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(NG059) 및 서열 8에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(NG063)를 사용하거나, 또는 서열 7에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(NG061) 및 서열 8에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(NG063)를 사용하여 PCR을 수행하는 HNT22 유전자의 검출 방법(제2 검출 방법)이 있다.
PCR에 사용된 샘플은 공지된 방법에 의해 표본으로부터 수집된 혈장 또는 혈청 등의 생물학적 샘플로부터 핵산 또는 DNA를 추출함으로써 제조한다. 이러한 제조는 시판되고 있는 추출용 키트를 사용하여 수행할 수 있다.
PCR 조건은 열안정성 DNA 폴리머라제를 이용하는 공지된 PCR 방법에 따라서 적합하게 선택한다.
PCR로부터 생성된 증폭 생성물은 전기영동과 같은 공지된 방법에 의해 검출할 수 있고 HNT22 유전자는 이러한 증폭 생성물의 존재를 근거로 하여 검출할 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 제1 검출 방법과 제2 검출 방법 모두를 하나의 샘플에 대해 수행한 다음 이러한 두 유전자 검출 방법 모두로부터 수득된 결과를 비교하는, HNT22 인자형들의 구별 방법, 및 인자형 1 내지 6의 유전자에 존재하고 상응하는 인자형에 특이적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 하이브리드화를 수행하는, HNT22 인자형들의 구별 방법을 제공한다.
각 인자형에 특이적인 서열은 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열을 기준으로 하거나, 또는 상기 언급된 유전자의 검출 방법에 의해 검출된 유전자의 뉴클레오티드 서열을 기준으로 하여 당해 분야의 숙련인에 의해 선별될 수 있다. 하이브리드화는 공지된 방법에 따라서 수행할 수 있다. 구체적으로 언급하면, 생물학적 샘플로부터 핵산을 제조하고, 이와 같이 제조된 핵산과 올리고뉴클레오티드를 엄격한 조건하에서 하이브리드화시킨 다음, 상기 올리고뉴클레오티드를 함유하는 하이브리드화된 생성물을 검출한다.
상기 언급된 특정한 올리고뉴클레오티드는 물론 한 예이며, 상기 언급된 바와 동일한 목적을 달성시키는 다른 올리고뉴클레오티드도 당해 분야의 숙련인에게 공지된 기술을 이용하여 본원에 기재된 HNT22 유전자를 기준으로 하여 용이하게 선별할 수 있다. 본원에 기재된 두 유전자의 뉴클레오티드 서열을 조합하고 당해 분야의 숙련인에게 공지된 기술을 사용함으로써 HNT22 유전자와 TUS01 유전자 모두를 검출하는데 이용될 수 있는 올리고뉴클레오티드를 선별하는 것도 또한 용이하다. 예를 들면, 서열 57에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(NG054) 및 서열 60에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(NG065), 또는 서열 57에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(NG054) 및 서열 61에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(NG021)가 이러한 올리고뉴클레오티드로서 언급될 수 있으며, 이들을 프라이머로서 사용하여 PCR을 수행함으로써, HNT22 유전자 및 TUS01 유전자를 검출할 수 있다. 유사하게, 당해 분야의 숙련인은 HNT22 유전자만 검출하거나, 또는 TUS01 유전자만을 검출하는데 이용될 수 있는 올리고뉴클레오티드를 선별하는 것이 용이하게 가능할 것이다.
본 발명은 추가로, 본 발명의 유전자의 뉴클레오티드 서열에서 발견된 개방 판독 프레임내에서 암호화된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 제공한다(본 발명의 폴리펩티드로서 후술됨).
본원에서의 용어 "폴리펩티드"는 선형으로 연결된 아미노산의 폴리머를 의미하고, 이의 길이는 특별히 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드에는 통상적으로 올리고펩티드, 단백질 및 펩티드로서 지칭된 것들이 모두 포함되며, 이의 기원에 관해서는, 천연의 것 뿐만 아니라 천연 것의 단편 및 화학적 합성과 재조합 발현 기술 등의 각종 방법에 의해 제조된 것이 포함된다. 앞서 기재된 바와 같이, 바이러스가 동일한 종 내에서 조차도 유전자 서열의 차이를 나타내므로, 유사하게 아미노산 서열의 차이를 나타내는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 본 발명의 바이러스 중의 하나로서 상기 서열을 결정하는데 필요한 아미노산 서열의 상동성은 65% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상이다.
본 발명에 사용된 용어 "개방 판독 프레임"("ORF"로 후술됨)은 특정 폴리펩티드 또는 이의 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 영역을 의미한다. 이러한 서열은 이것이 적합한 조건하에 놓여졌을 경우에 전사되어 폴리펩티드로 해독된다. 암호화 서열의 경계는 5'말단에서의 개시 코돈이고 3'말단에서의 종결 코돈이다.
유전자 서열로부터 암호화된 아미노산 서열을 추론하는 것은 당해 분야에 공지되어 있기 때문에, 중요한 것은 유전자 서열에서 ORF를 규정하는 것이다. ORF는 다음과 같이 결정할 수 있다.
아미노산으로의 해독이 시작되는 개시 코돈일 수 있는 삼중 뉴클레오티드 서열이 수득된 유전자 서열에서 동정되어야 한다. 이러한 위치는 개시 코돈으로 추정되며, 특정 크기의 폴리펩티드를 암호화하는 ORF는 종결 코돈이 나타나지 않은 영역 내에서 결정한다. 이러한 방식으로 수득되는 아미노산 서열의 예로는 서열 9 및 10에 제시된 아미노산 서열이 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는, HNT22에 특이적인 아미노산 서열을 포함한다. HNT22에 특이적인 아미노산 서열은 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열, 또는 전술된 유전자 검출 방법에 의해 검출된 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 기준으로 하여 당해 분야의 숙련인에 의해 선별될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 더욱 바람직하게는, HNT22-특이적 에피토프를 함유한다.
본 발명에 사용된 용어 "에피토프"는 항원 결정기를 의미한다. 이러한 항원 결정기는 항원 분자 내에 존재하여 항체에 직접적으로 결합되는 특정 부위이고 입체 형태에서 3개 이상의 아미노산, 통상적으로는 5 내지 10개의 아미노산으로 구성된다. 펩티드의 입체적 구조내에서 에피토프의 위치와 이의 형태를 결정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 당해 분야의 숙련인에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "HNT22-특이적 에피토프"는 HNT22에 특이적인 항원 결정기를 의미하며, 이는 HNT22에 특이적인 아미노산 서열로 구성된 에피토프이다. 이러한 에피토프는 통상적으로 8개 이상의 연속적인 아미노산으로 구성된다.
본 발명에서 사용된 "에피토프를 함유하는"이란 표현은 상기 정의된 바와 같은 에피토프 서열이 폴리펩티드의 일부분으로서 함유된다는 것을 의미하며, 에피토프를 함유하는 상기 폴리펩티드의 구체적인 예에는 캐리어 펩티드 또는 링커 펩티드에 결합된 에피토프 서열로 구성된 것이 포함된다.
본 발명의 폴리펩티드는 항체 시험용 항원으로서 또는 항바이러스성 항체 제조용 면역원으로서 효과적으로 사용될 수 있다. 바이러스성 폴리펩티드에는 상기 바이러스에 특이적인 아미노산 서열을 갖지 않고 이러한 부분이 항원으로서 사용되는 경우에 비-특이적 항체 반응을 유발시킬 수 있는 아미노산 서열이 포함되는 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명에서는, 완전한 아미노산 서열로부터 항체 시험에 적합한 서열을 구체화하는 것이 중요하다. 이러한 특이적 서열, 즉 에피토프 서열을 동정하는 방법으로서, 완전한 서열을 포괄하는 특정 길이를 각각 갖는 펩티드를 합성하고, 각 펩티드와 항바이러스성 항체, 즉 바이러스로 감염된 환자의 혈청과의 반응 존재 또는 부재 여부, 또는 반응 정도를 이용하는 방법이 이용될 수 있다. 합성을 포함하는 상기 방법 대신, λgt11을 이용하여 파아지 라이브러리를 제조하고 환자의 혈청을 이용하여 스크리닝한다.
본 발명은 또한, 입자의 밀도를 근거로 하여 입자를 분리시키는, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 입자의 분리 방법; 이러한 방법에 의해 분리된 바이러스 입자; 및 전술된 바이러스 입자로부터 수득된 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 펩티드를 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어 "바이러스 입자"는 바이러스 입자의 통상적인 분리 방법으로서 사용되는 밀도 구배 원심분리에 의해 특정한 밀도의 분획으로서 수집된, 본 발명의 유전자에 대해 양성인 분획을 의미하고, 형태학적 의미에서 입자 구조나 감염성 입자를 갖는 것으로 한정되지 않는다.
바이러스는 이들의 입자 구조에 상응하는 밀도를 가지며, 이들은 밀도를 기준으로 하여 공존하는 기타 물질로부터 분리시킬 수 있다. 밀도를 기준으로 한 대부분의 통상적인 바이러스 입자 분리 방법은 밀도 구배 원심분리를 이용하는 방법이다. 이러한 방법에서는, 슈크로즈 등을 사용하여 원심분리용 튜브에 구배 밀도 캐리어 층을 형성시킨 다음, 바이러스를 함유하는 분획을 상기 층 위에 놓아두고, 초원심분리를 수행한다. 이러한 기술은 원심력에 의해 이동된 바이러스가 이러한 바이러스와 동일한 밀도를 갖는 층에 도달하게 되면, 원심력과 부력이 평형에 도달하게 되고 바이러스가 이동을 중단함으로써 바이러스가 상기 분획에 집중된다는 사실에 근거한 것이다.
당해 폴리펩티드는 공지된 방법에 의해 상기 언급된 방법에 의해 수득된 바이러스 입자로부터 수득될 수 있다. 예를 들면, 바이러스 입자를 변성제로 처리하고, 폴리펩티드를 다른 성분으로부터 분리시킨다.
본 발명은 또한, HNT22 유전자 또는 이의 부분 서열이 통합되어 있는 유전자 발현 벡터를 제공한다. 본원에서 사용된 용어 "재조합 발현 벡터"는 외인성 폴리펩티드를 숙주 세포의 유전자 내로 삽입시켜 이러한 폴리펩티드가 발현될 수 있도록 해주는 벡터를 의미한다. 구체적으로 언급하면, 이는 상기 폴리뉴클레오티드의 통합을 가능하게 해주는 조절 서열을 갖는 벡터이다. 용어 "부분적인"은 상기 서열이 항원성을 나타내기에 충분한 펩티드를 암호화하는 유전자의 일부로 구성되는 것을 의미한다.
이러한 발현 벡터는 면역학적 활성이나 생물학적 활성을 지닌 바이러스성 펩티드를 수득하는데 효과적으로 사용될 수 있다. 발현시키고자 하는 유전자를 통합시키기 위한 각종 벡터가 현재 공지되어 있고, 이러한 벡터를 통합시켜 결과적으로 펩티드를 발현시키기 위한 각종 숙주 세포도 또한 공지되어 있다.
본 발명에 의해 제공된 유전자 발현 벡터는 ORF가 목적하는 숙주와 상용성인 조절 서열에 작동적으로 연결되어 있는, HNT22 게놈 또는 이의 ORF를 갖는 재조합 발현 벡터이다. 재조합 유전자 발현 시스템은 상기 발현 벡터를 사용하여 작제할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "형질전환체 세포"는 이의 유전자가 본 발명의 유전자의 전부 또는 일부와 통합되고, 본 발명의 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 발현할 수 있는 세포를 의미한다.
본 발명에 의해 제공된 형질전환체 세포는 본 발명의 유전자의 전부 또는 일부를 함유하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 직접적으로 도입하거나, 또는 이러한 폴리펩티드와 통합된 재조합 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하여 숙주 세포를 형질전환시킴으로써 수득될 수 있다. 본 발명에서는, 공지된 전이 벡터와 숙주 세포를 사용할 수 있다.
이러한 형질전환체 세포에 의해 생성된 폴리펩티드(HNT22 바이러스 항원 펩티드)는 HNT22 바이러스 항원 펩티드를 발현시킬 수 있는 조건하에서 상기 형질전환체 세포를 배양한 다음, 발현된 폴리펩티드를 수집함으로써 수득될 수 있다.
본 발명은 HNT22 입자, HNT22 폴리펩티드, HNT22 에피토프, 또는 항원으로서 HNT22 에피토프를 함유하는 폴리펩티드를 사용함으로써 HNT22 항체를 면역학적으로 검출하는 방법을 제공한다. 펩티드 항원을 사용하여 항체를 검출하는 방법으로는, 면역비탁법, 효소 면역검정, 방사성측정 면역검정, 응집 방법 등이 언급될 수 있으며, 이들 방법을 본 발명에 사용할 수 있다.
본 발명은 또한, HNT22 입자, HNT22 폴리펩티드, HNT22 에피토프, 또는 면역원으로서, 정제되거나 부분적으로 정제된, HNT22 에피토프를 함유하는 폴리펩티드를 이용하여 HNT22 항체를 제조하는 방법; 및 이러한 HNT22 항체를 제공한다. 정제되거나 부분적으로 정제된 바이러스 입자 또는 폴리펩티드를 이용하여 상기 항체를 제조하는 방법으로서, 통상적인 방법이 사용될 수 있다.
본 발명은 HNT22에 특이적으로 결합되는 항체를 사용함으로써 HNT22 항원을 면역검정하는 방법, 및 이에 대한 키트를 제공한다. 항체를 사용하여 항원을 검정하는 방법의 한 예로서,
(1) 반응 용기 또는 반응 캐리어의 고체 상에 고정화된 HNT22에 결합될 수 있는 항체를 특정 샘플 중의 항원과 반응시켜, 이러한 샘플 중의 항원이 항원-항체 반응을 통하여 상기 고체 상에 결합된 항체에 의해 포획되도록 하는 단계;
(2) 상기와 같이 포획된 항원을 적절한 세척 단계 후에, HNT22에 결합될 수 있고 HNT22에 대한 특이성을 지닌, 적절하게 표지된 항체와 추가로 반응시키는 단계; 및
(3) 적절한 세척 단계 후, 상기 표지된 항체의 기능을 이용함으로써 결합성 항체를 검출하는 단계를 포함하는 방법이 언급될 수 있다.
또 다른 방법으로서,
(1) 검정하고자 하는 샘플을, 규정된 농도의 HNT22 에피토프를 갖는 적절하게 표지된 폴리펩티드와 특정 시간 동안 반응시키는 단계;
(2) 단계 (1)이 진행된 샘플을, 반응 용기 또는 반응 캐리어의 고체 상에 고정화된 HNT22 항체와 반응시켜, 상기 샘플 중의 항원이 고체 상 위의 항체와 충분히 결합하도록 하는 단계; 및
(3) 반응 용기 또는 반응 캐리어에 결합된 표지와 결합되지 않은 표지를 분리시키고, 결합된 표지 또는 결합되지 않은 표지를 측정하는 단계를 포함하는 방법이 언급될 수 있다.
응집 방법, 전위된 수동 응집 방법, 효소 면역검정, 방사성측정 면역검정 및 형광성 편광법 등과 같이, 바이러스성 항원을 검정하는데 이용된 기타 방법이 본 발명에 사용될 수도 있다.
본 발명은 정제된 HNT22 입자를 포함하는 백신, 이러한 정제된 바이러스 입자로부터 수득된 중화 항체 에피토프를 함유하는 폴리펩티드, HNT22 입자 및 재조합 발현을 이용함으로써 수득된 중화 항체 에피토프를 함유하는 폴리펩티드, 정제된 폴리펩티드 및 상기 발현된 바이러스 입자나 발현된 폴리펩티드로부터 수득된 중화 항체 에피토프를 함유하는 단편, 또는 상기 바이러스의 유전자 서열을 기준으로 하여 화학적으로 합성된 중화 항체 에피토프를 함유하는 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 백신을 제조하기 위하여, 본원에 기재된 유전자를 기준으로 한 전술된 합성법 또는 재조합 발현에 의해 수득된 HNT22의 항원적으로 활성인 영역을 보유하고 있는 단백질을 사용할 수 있다. 공지된 바이러스에 관해서는, 외막 항원의 에피토프를 함유하는 재조합 항원 및 펩티드 항원이 이러한 활성을 지니고 있다. 기타 구조 단백질 항원이 또한 자체적으로 또는 다른 항원과 조합될 때 상기 활성을 지닐 수 있다. 구체적으로 언급하면, 외막 항원의 에피토프를 함유하는 재조합 항원 또는 펩티드 항원이 상기 에피토프를 함유한다. 기타 구조 단백질 항원은 자체적으로 또는 다른 항원과 조합될 때 중화 항체 에피토프를 함유할 수도 있다.
본 발명의 유전자를 이용함으로써 발현되는 항원, 또는 본 발명의 분리 방법에 의해 정제된 HNT22 입자를 사용함으로써, 수 많은 종류의 중화 항체 에피토프를 함유하는 다가 백신을 수득할 수 있다. 분리 및 정제된 입자를 사용하는 경우, 바이러스는 불활성화되어야 하고, 이는 포르말린으로의 처리와 같은 공지된 방법에 의해 실현될 수 있다.
활성 성분으로서 면역원성 폴리펩티드를 함유하는 백신의 제조 방법 또한 공지된 것을 이용할 수 있다. 즉, 이는 액상 제제로서, 또는 주사 용제로서의 현탁제로서, 또는 주사되기 전에 액체에 용해되거나 현탁되기에 적합한 고체 제제로서 제조된다. 면역학적으로 활성인 성분을 적합한 부형제와 혼합한다. 부형제로서, 물, 생리 식염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등을 언급할 수 있다. 필요에 따라, 소량의 보조제를 가할 수도 있다. 보조제로서, 보습제, 유화제, pH 완충제, 보강제 등을 언급할 수 있다. 이러한 보강제의 예로는, 예를 들면, 수산화알루미늄, N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민, N-아세틸-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 등이 있다.
목적하는 효과를 부여하는 이들 백신의 투여 공식을 적절하게 규정할 수 있다. 1회 투여당 투여량은 일반적으로 5 내지 250㎍이고, 이는 투여될 개개인의 체중 및 면역학적 반응 능력, 목적하는 항체 유도율 등에 따라서 결정된다. 투여 횟수는 유사한 표준에 따라서 선택할 수 있다.
본 발명은 다음 실시예를 참조로 하여 보다 상세히 설명될 것이지만, 물론 본 발명이 이들 실시예로 제한되지는 않는다.
실시예 1: 클론 #22의 분리
수혈-후의 비-A형, 비-B형, 비-C형, 비-D형, 비-G형 간염으로서 임상적으로 확인된 3가지 사례(사례 1 내지 3)에 대해서는, 샘플로서 수혈-후 간염 발증시 또는 발증 후의 환자 혈액 및 수혈 전이거나 발증 전의 동일한 환자 혈액을 이용하는 RDA법(공제)에 의해 수혈-후 간염 발증 후의 환자 혈액 샘플에서만 유전자가 존재한다. RDA법은 상기 언급된 바와 같이 비교 그룹의 한 파트에서만 존재하는 유전자를 검출하기 위한 방법이고, 이는 샘플인 테스터와 대조군인 드라이버 간에 상이한 유전자를 효과적으로 조사하는 방법이다.
본 실시예에서는, 원인이 불분명한 수혈-후 간염으로서 임상적으로 진단된 상기 언급된 3가지 사례(실시예 6에서 보다 상세히 기재됨) 중에서 사례 2의 간염 발증 후의 샘플을 테스터(A)로서 사용하고, 수혈 후 간염 발증 이전의 동일한 사례의 샘플(B1)과 다른 급성 B형 간염 환자의 샘플(B2)을 드라이버로서 사용하며, 수혈-후 간염 발증 이후의 환자 혈액에서 처음으로 나타난 유전자를 발견하였다.
이러한 과정은 다음에 보다 상세히 설명될 것이다.
(1) 핵산의 추출
상기 수혈-후 간염 사례(사례 2)는 공지된 간염 바이러스 마커 어느 것에 대해서도 음성이다. 이의 혈청(수혈한 지 8주 및 10주 후의 사례 2의 혈청 각 50㎕의 혼합물)을 공지되지 않은 간염 바이러스 양성 테스터(A)로서 사용한다.
공지되지 않은 바이러스에 대해 음성인 대조군으로서, (A)를 채취한 바와 동일한 환자의 혈청을 사용하고, 간염 발증 전의 동일한 환자의 혈청(수혈한지 2주 후의 혈청, B1)과 또 다른 급성 B형 간염 환자의 혈청(B2)을 드라이버로서 사용한다. 먼저, 핵산 추출용으로 시판중인 키트(ISOGEN-LS, Nippon Gene)를 사용하여 상기 테스터 및 드라이버의 혈청 각각 100㎕으로부터 핵산을 추출한다. 즉, 각 혈청(100㎕)과 핵산 추출 용액(300㎕)을 1.5ml용 에펜도르프 튜브에 취하고, 1분 동안 혼합 교반시킨 다음, 실온에서 5분 동안 정치시킨다. 상기 튜브의 벽 위에 남아있는 혼합물을 원심분리시켜 떨어지게 한 후, 상기 혼합물에 클로로포름(80㎕)을 가하고, 1분 동안 교반시킨 다음, 실온에서 5분 동안 정치시킨다. 이러한 반응을 완료한 후, 상기 혼합물을 12000rpm으로 15분 동안 원심분리시켜 상등액을 수득한다. 이러한 상등액(210㎕)을 또 다른 에펜도르프 튜브에 취하고, 글리코겐(20mg/ml, 1㎕, Boehringer Mannheim) 및 이소프로판올(200㎕, Wako Pure Chemicals Industries)을 가한 다음 혼합한다. 이 혼합물을 실온에서 10분 동안 반응을 위해 정치시켜둔 후, 12000rpm(4℃)으로 10분 동안 냉각 원심분리시켜 침전물을 수득하고, 이를 70% 에탄올(Wako Pure Chemicals Industries)로 세척한 다음 공기 중에서 건조시킨다.
(2) cDNA의 합성
상기 과정에 의해 수득된 핵산을 DEPC-물(10㎕, 디에틸 피로카보네이트로 처리된 탈이온수, Sigma)에 용해시킨다. 이 용액에 랜덤화 헥사머 용액(50ng/㎕, 1㎕)을 가하고, 70℃에서 5분 동안 가온시킨 다음, 즉시 얼음 냉각시킨다. 냉각 후, 5배 농도의 제1 쇄 완충액(4㎕), 0.1M DTT(2㎕), 10mM dNTP(1㎕), RNase 억제제(1㎕, 40U/㎕, RNasin, PROMEGA) 및 역전사효소(1㎕, 200U/㎕, SuperScript II, GIBCO-BRL)를 상기 용액에 가하고, 상기 제1 쇄의 cDNA의 합성을 위해 37℃에서 60분 동안 반응시킨다. 이어서, 상기 cDNA를 함유하는 튜브에, DEPC-물(91㎕), 5배 농도의 제2 쇄 완충액(30㎕), 10mM dNTP(3㎕), 이. 콜라이 DNA 리가제(1㎕, 10U/㎕), 이. 콜라이 DNA 폴리머라제(4㎕, 10U/㎕) 및 이. 콜라이 RNaseH(1㎕, 20U/㎕)을 가하고 혼합하며, 16℃에서 2시간 동안 반응시킨다. 이어서, 상기 반응 혼합물에 T4 DNA 폴리머라제(2㎕, 5U/㎕)를 가하고, 16℃에서 5분 동안 반응시켜 제2 쇄 cDNA를 합성한다. EDTA(5㎕, 0.5M)를 가함으로써 상기 반응을 중지시킨다. 연속적으로, 페놀과 클로로포름의 혼합물(150㎕, 1:1)을 튜브 중의 상기 혼합물에 가하고 혼합한 다음, 실온에서 15000rpm으로 5분 동안 원심분리시켜 단백질을 침전물로서 분리시킨다. 이와 같이 수득된 상등액(156㎕)에 글리코겐(1㎕, 20mg/ml), 7.5M 암모늄 아세테이트(78㎕, Wako, Pure Chemicals Industries) 및 찬 에탄올(562㎕, Wako Pure Chemicals Industries)을 가하고, 실온에서 20분 동안 15000rpm으로 즉시 원심분리시켜 침전 분획으로서 핵산을 수득한다. 이러한 침전물을 찬 70% 에탄올(600㎕)로 세척하고, 공기 중에서 건조시킨 다음, TE 완충액(50㎕, 10mM 트리스-HCl, pH 7.5, 1mM EDTA)에 용해시킨다. 이어서, 상기 용액을 마이크로스핀 S-400 HR 칼럼(Pharmacia)을 사용하여 겔 여과시킨다. 수득된 용출액(50㎕)에 1/10 용적의 3M 나트륨 아세테이트(pH 5.2)와 2.5 용적의 에탄올을 가하고, -80℃에서 20분 동안 정치시켜 두고, 4℃에서 20분 동안 15000rpm으로 원심분리시켜 침전물로서 cDNA/DNA 분획을 수집한다.
(3) Sau3AI 절단
상기 과정에 의해 수집된 cDNA/DNA 분획을 물(45㎕)에 용해시키고, 10배 농도의 H 완충액(5㎕, 제한 엔도뉴클레아제 Sau3AI에 부속된 완충제, Takara Shuzo) 및 Sau3AI(4㎕, 12U/㎕, Takara Shuzo)을 가하고 혼합한 다음, 37℃에서 1.5시간 동안 반응시킨다. 이러한 반응을 완료한 후, 상기 반응 혼합물에 페놀과 클로로포름의 혼합물(40㎕, 1:1)을 가하고, 교반시킨 다음, 실온에서 15분 동안 15000rpm으로 원심분리시킨다. 상등액(60㎕)에 1/10 용적의 3M 암모늄 아세테이트, pH 5.2와 2.5 용적의 에탄올을 가하고, -80℃에서 20분 동안 정치시켜둔 후, 4℃에서 20분 동안 15000rpm으로 원심분리시켜 침전물로서 핵산을 수집한다.
(4) 어댑터의 연결
제한 효소 Sau3AI로 절단된 양 말단의 뉴클레오티드 서열과 상용성인 어댑터 R-Bam24 및 R-Bam12를 연결함으로써 어댑터를 상기 단편의 양 말단에 도입한다. 즉, 상기 과정에 의해 수득된 핵산 분획 침전물을 물(16.1㎕)에 용해시키고, 10배 농도의 T4 리가제 완충액(3㎕, NEB), 어댑터 R-Bam24(6.0㎕, 10 OD/ml) 및 어댑터 R-Bam12(3.0㎕, 10 OD/ml)를 가한 다음, 주위 온도를 1시간에 걸쳐 50℃에서 10℃로 낮추고, 혼합물에 T4 리가제(1.5㎕, 400U/㎕, NEB)을 가한 다음, 16℃에서 밤새 반응시킨다.
(5) PCR 증폭
이어서, 상기 유전자 단편을 DNA 폴리머라제로 처리하여 완전한 길이 전반에 걸쳐 완벽하게 이본쇄인 유전자 단편을 수득하고, 이들 유전자 단편을 다음과 같이, 프라이머로서 R-Bam24를 사용하여 PCR에 의해 증폭시킨다. 상기 과정에 의해 어댑터를 이용하여 도입된 핵산 분획을 70℃에서 15분 동안 가온시켜 반응 혼합물 중의 T4 리가제를 불활성화시킨다. 이어서, 10배 농도의 TaKaRa EX Taq 폴리머라제 완충액(20㎕, Takara Shuzo), 2.5mM dNTP(24㎕), 물(149.3㎕) 및 R-Bam24(5.2㎕, 10 OD/ml)을 상기 혼합물에 가하고, 70℃에서 3분 동안 반응시킨 다음, TaKaRa EX Taq 폴리머라제(1㎕)를 가하여 다음 조건을 이용하여 PCR을 수행한다. 즉, 72℃에서 5분 동안 처리한 후, 95℃에서 1분 동안 및 72℃에서 3분 동안의 처리 주기를 30회 동안 반복한 다음, 72℃에서 7분 동안 처리하고 4℃로 냉각시킨다. 반응을 완료한 후, 핵산을 상기 언급된 바와 동일한 방식으로 페놀 및 클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시킨다. 8개 튜브로부터 수득된 PCR 생성물의 침전물을 합하고 TE 완충액(100㎕)에 용해시킨 다음, 상기 언급된 바와 동일한 방식으로 겔 여과시켜 용출된 용액을 수득하고, 이를 에탄올로 침전시킨다.
(6) 어댑터의 제거
겔 여과시킨 후에 에탄올로 침전된 PCR 생성물을 물(90㎕)에 용해시킨다. 이 용액에 10배 농도의 H 완충액(10㎕)을 가한 다음 Sau3AI(7㎕)을 가하고, 37℃에서 15분 동안 반응시킨다. 이어서, 상기 언급된 바와 동일한 방식으로 핵산을 침전물로서 수집한 다음, 상기 언급된 바와 같이 마이크로스핀 S-400 HR 칼럼을 사용하여 겔 여과시키고, 에탄올로 침전시킨 다음 수집한다. 상기 생성물을 다시 용해시키고, 이의 260nm에서의 흡광도를 측정하여 수율을 확인한다.
(7) 테스터에 어댑터(J-Bam24/J-Bam12)를 연결시킴
이어서, Sau3AI 서열과 상용성인 어댑터 J-Bam24 및 J-Bam12를 다음과 같이 테스터 증폭된 유전자 단편에만 연결한다. 즉, J-Bam24 및 J-Bam12 테스터를 제거시킨 증폭 생성물 중에서, 상기 테스터로부터 유도된 것에 10배 농도의 T4 리가제 완충액(PCR 생성물 1.0㎍당 3㎕)을 가하고, 어댑터 J-Bam24(13.2㎕) 및 J-Bam12(6.6㎕)과 물(4.9㎕)을 추가로 가한다. 주위 온도를 1시간에 걸쳐 50℃에서 10℃로 낮추어 이들을 어닐링시킨다. 이러한 반응 혼합물에 T4 DNA 리가제(400U/㎕, NEB, 1.0㎕)을 가하고, 16℃에서 밤새 반응시켜 어댑터를 Sau3AI 절단된 말단에 연결시킨다. 이어서, 상기 혼합물을 70℃에서 10분 동안 처리하여 상기 리가제를 불활성화시킨다.
(8) 테스터 증폭된 유전자 단편의 어댑터를 사용하지 않고 어댑터 및 드라이버 증폭된 유전자 단편과의 하이브리드화
어댑터가 연결되어 있는 테스터로부터 유도된 증폭 생성물과 상기 언급된 과정에 의해 어댑터를 제거시킨 드라이버로부터 유도된 증폭 생성물을 열에 의해 변성시킴으로써, 완전하게 일본쇄 DNA로 만든 다음, 다음과 같이 재결합시킨다. 먼저, 페놀과 클로로포름의 혼합물(1:1, 30㎕)을 상기 반응 혼합물에 가하여 단백질을 제거한다. 수득된 상등액(17㎕)에, 이의 어댑터를 제거시킨 드라이버 유전자 증폭 생성물(40㎍)을 가하고, 에탄올로 침전시킨다. 이 침전물에 3배 농도의 EE 완충액(4㎕)을 가하고, 이에 용해시킨 다음, 광유(30㎕, Sigma)를 덧바른 다음, 98℃에서 10분 동안 처리하여 DNA를 변성시킨다. 변성 후, 상기 혼합물을 얼음으로 즉시 냉각시키고 5M 염화나트륨(Wako Pure Chemicals Industries, 1㎕)을 가한다. 이어서, 67℃에서 약 22시간 동안 하이브리드화를 수행한다.
상기 과정 동안, 테스터와 드라이버에 공통으로 존재하는 유전자의 경우, 사람으로부터 유도된 유전자처럼, DNA, 즉 테스터로부터 유도된 재결합된 2개의 DNA 쇄 또는 드라이버로부터 유도된 2개의 DNA 쇄로 구성된 이본쇄 DNA(동종-이본쇄 DNA)와, 테스터로부터 유도된 하나의 DNA 쇄와 드라이버로부터 유도된 하나의 DNA 쇄로 구성된 이본쇄 DNA(이종-이본쇄 DNA)의 본래의 조합물을 형성한다. 이와는 달리, 테스터에만 존재하는 DNA의 경우에는(외인성 유전자인 것으로 간주됨), 이종-이본쇄 DNA가 형성되지 않고 테스터로부터 유도된 동종-이본쇄 DNA 만이 형성되는데, 이는 상응하는 동종이인자형 유전자가 드라이버에는 존재하지 않기 때문이다. 추가로, 테스터로부터 유도된 유전자 서열을 갖는 이본쇄 DNA만이 양 쇄에 어댑터 서열을 갖는다.
(9) 증폭
상기 과정에서 하이브리드화가 진행된 샘플에 물(15㎕)을 가한 다음, 이러한 샘플 중의 핵산을 상기 언급된 바와 동일한 방식으로 에탄올로 침전시킨다. 이 침전물에 1/2 농도의 TE 완충액(20㎕, 5mM 트리스-HCl, pH 7.5, 1.5mM EDTA)를 가하고 이에 용해시킨다. 이 용액(2㎕)에, 10배 농도의 Ex Taq 폴리머라제 완충액(20㎕), 2.5mM dNTP(240㎕), 물(147.7㎕) 및 TaKaRa EX Taq 폴리머라제(1㎕)를 가하고, 72℃에서 5분 동안 반응시킨다. 이러한 반응 동안, 상기 작동시 형성된 이본쇄 DNA 중의 단일쇄로서 잔존하는 부분에 대해 DNA를 합성하고 말단은 평활-말단화된 것이다. 이 샘플에 프라이머로서 J-Bam24(5.3㎕, 10 OD/ml)을 가하고; 95℃에서 1분 동안 및 70℃에서 3분 동안의 주기를 30회 반복하고 상기 혼합물을 70℃에서 7분 동안 정치시킨 다음 4℃에서 정치시킴으로써 PCR을 수행한다. 페놀과 클로로포름의 혼합물을 사용하여 상기 언급된 바와 동일한 방식으로 상기 증폭된 샘플로부터 핵산을 추출하고 공침전제로서 글리코겐을 사용하여 에탄올로 침전시킨다. 이러한 조건하에서, J-Bam24를 어댑터로서 연결시킨 테스터로부터 유도된 유전자만이, 프라이머로서 가해진 J-Bam24를 이용하여 증폭시킬 수 있다. 그 결과, 테스터 특이적 유전자의 동종-이본쇄 DNA로부터 유도된 DNA를 양 DNA 쇄에 대해 증폭시킬 수 있으므로, 지수적으로 증폭시킬 수 있다. 한편, 테스터와 드라이버에 공통으로 존재하는 유전자로써 구성된 이종-이본쇄 DNA는 이의 주형이 테스터인 드라이버 유전자 서열을 갖는 DNA 쇄에 대해서만 단지 배수적으로 증폭된다. 드라이버 유전자로만 구성된 동종-이본쇄 DNA로부터 유도된 DNA 쇄는 증폭시킬 수 없는데, 이는 부가된 프라이머가 이들과 하이브리드화될 수 없기 때문이다. 따라서, 테스터 특이적 유전자 서열을 갖는 동종-이본쇄 DNA가 증폭 후의 반응 혼합물에 우세하게 존재한다.
(10) 녹두 뉴클레아제 처리
반응 혼합물에 존재하는 단일쇄 드라이버 유전자 서열 DNA를 제외한 테스터 특이적 유전자만을 수득하기 위하여(정확하게는, 드라이버로부터 유도된 소수의 이본쇄 DNA가 잔존할 것이다), 녹두 뉴클레아제("MBN"으로 후술됨) 처리를 다음과 같이 수행한다. 테스터 A와 드라이버 B1의 하이브리드화 샘플 또는 테스터 A와 드라이버 B2의 하이브리드화 샘플로부터 침전시켜 수득된 핵산 분획에 각각 1/2 농도의 TE 완충액(10㎕)을 가하고 이에 용해시킨다. 각 용액으로부터 5㎕를 취하고, 10배 농도의 MBN 완충액(2㎕), 물(13㎕) 및 MBN(0.5㎕, 300U/㎕, Takara Shuzo)르 가하고, 37℃에서 30분 동안 반응시킨다. 반응을 완료한 후, 50mM 트리스-HCl, pH 8.9(80㎕)을 상기 반응 혼합물에 가하고 95℃에서 5분 동안 반응시켜 뉴클레아제를 불활성화시킨다. 상기 반응 혼합물로부터 취한 5㎕ 및 10㎕의 등취량, 및 뉴클레아제 처리시키지 않은 상기 하이브리드화 샘플(1㎕) 각각에 10배 농도의 Ex Taq 폴리머라제 완충액(20㎕), 2.5mM dNTP(24㎕), 프라이머 J-Bam24 및 TaKaRa Ex Taq DNA 폴리머라제(1㎕)를 가하고, 추가로 물을 가하여 총 용적이 200㎕이 되도록 하며, PCR을 다음 조건을 이용하여 수행한다. 즉, 95℃에서 1분 동안 및 70℃에서 3분 동안의 반응 주기를 20회 반복한 다음, 70℃에서 7분 동안 처리하고 4℃로 냉각시킨다. 상기 PCR 생성물로부터 10㎕를 취하고, 2.5% NuSieve 3:1 아가로즈(FMC BioProducts, USA) 상에서 겔 전기영동(1 x TBE 완충액)시킨다. A와 B1의 조합물 및 A와 B2의 조합물에 대한 결과가 동일하기 때문에, A와 B1의 조합물만이 후술될 것이다.
페놀과 클로로포름의 혼합물을 사용하여 상기 언급된 추출 방법에 의해 잔여 증폭 생성물로부터 핵산을 추출하고, 에탄올로 침전시킨 다음 수집한다. 이러한 침전물에 TE 완충액(45㎕)을 가하고 이에 용해시킨다. 이 용액을 상기 언급된 마이크로스핀 S-400 HR 칼럼을 사용하여 겔 여과시키고, 용출된 용액을 에탄올 침전시킨다.
(11) 어댑터의 제거
상기 수득된 침전물을 물(63㎕)에 용해시키고, 10배 농도의 H 완충액(7㎕) 및 Sau3AI(6㎕, 12U/㎕)을 가한 다음 37℃에서 1.5시간 동안 반응시켜 J-Bam24 및 J-Bam12 어댑터 잔기를 절단한다. 상기 언급된 바와 같이 페놀과 클로로포름의 혼합물을 사용하여 상기 반응 혼합물로부터 단백질을 제거하고, 핵산을 에탄올로 침전시킨다. 이 침전물을 TE 완충액(90㎕)에 용해시키고, 마이크로스핀 S-400 HR 칼럼을 사용하여 겔 여과시켜, 절단된 어댑터를 제거한다. 어답터를 제거시킨 증폭 생성물을 함유하고 있는, 상기와 같이 용출된 용액을 에탄올로 침전시키고, 이 침전물을 1/2 농도의 TE 완충액(10㎕, 5mM 트리스-HCl, pH 7.5, 1.5mM DETA)에 용해시킨다. 이 용액의 260nm에서의 흡광도를 측정하여 수율을 결정한다. 테스터 특이적 유전자가 이 분획에 함유되어 있는 것으로 사료된다.
(12) 재-공제
상기 과정에서 수득된 테스터 특이적 유전자의 후보 DNA 분획(1㎍)에 10배 농도의 T4 DNA 리가제 완충액 (3㎕), 어댑터 N-Bam24(13.2㎕) 및 N-Bam12(6.6㎕)을 가하고, 28.5㎕의 최종 용적까지 채운 다음, 이의 온도를 1시간에 걸쳐 50℃에서 10℃로 낮춘다. 이어서, 상기 혼합물에 T4 DNA 리가제(1.5㎕, 400U/㎕)을 가하고, 16℃에서 밤새 반응시켜 어댑터를 연결시킨다. 이어서, 이 혼합물을 70℃에서 10분 동안 처리하여 T4 DNA 리가제를 불활성화시키고, 페놀과 클로로포름의 혼합물을 사용하여 통상적인 방식으로 단백질을 제거한 후, 에탄올로 침전시킨다. 상등액(17㎕, DNA로서 약 0.5㎍)에 드라이버 B1 DNA(40㎍)을 가하고 혼합한 다음, 에탄올로 침전시킨다. 이 침전물에 3배 농도의 TE 완충액(4㎕)을 가하고 이 안에 용해시키고, 광유(30㎕, Sigma)로 덧바른 다음, 98℃에서 1분 동안 열처리하여 상기 DNA를 변성시킨다. 이러한 변성 후, 상기 혼합물을 얼음으로 즉시 냉각시키고 5M 염화나트륨(Wako Pure Chemicals Industries, 1㎕)을 가하여 67℃에서 약 21시간 동안 하이브리드화를 수행한다. 이러한 하이브리드화 후의 샘플로부터, 핵산을 상기 언급된 바와 동일한 방식으로 에탄올로 침전시킨다. 이 침전물에 1/2 농도의 TE 완충액(20㎕)를 가하고 이에 용해시킨다. 이 용액(2㎕)에, 10배 농도의 Ex Taq DNA 폴리머라제 완충액(20㎕), 2.5mM dNTP(240㎕), 물(147㎕) 및 TaKaRa EX Taq 폴리머라제(1㎕)를 가하고, 72℃에서 5분 동안 반응시켜 핵산이 평활-말단되도록 한다. 이 샘플에 프라이머로서 N-Bam24(5.8㎕, 10 OD/ml)을 가하고; 95℃에서 3분 동안 및 70℃에서 3분 동안의 주기를 10회 반복하고 상기 혼합물을 70℃에서 7분 동안 정치시킨 다음 4℃에서 정치시킴으로써 PCR을 수행한다. 이와 같이 증폭시킨 샘플로부터, 페놀과 클로로포름의 혼합물을 사용하여 상기 언급된 바와 동일한 방식으로 핵산을 추출하고, 글리코겐을 가한 다음, 에탄올로 침전시킨다. 이러한 핵산 분획에 1/2 농도의 TE 완충액(10㎕)를 가하고 이에 용해시킨다. 이 용액으로부터 1㎕를 취하고, 10배 농도의 TaKaRa Ex Taq DNA 폴리머라제(1㎕)를 가하고; 95℃에서 1분 동안 및 70℃에서 3분 동안의 주기를 20회 반복한 다음, 70℃에서 7분 동안 처리하고 4℃로 냉각시킴으로써 PCR을 수행한다. 상기 과정에 의해, 테스터 특이적 유전자를 추가로 스크리닝한다. 이러한 과정으로부터 수득된 DNA 분획으로부터 어댑터를 다시 제거하고, 어댑터로서 J-Bam24 및 J-Bam12를 이용하여 동일한 과정을 1회 이상 반복하여 테스터 특이적 유전자의 최종 후보, 즉 클론 #22를 수득한다.
(13) 클론 #22의 분리
상기 과정에 의해 수득된 테스터 특이적 유전자 후보의 뉴클레오티드 서열을 다음과 같이 결정하여 신규의 바이러스성 유전자 클론 #22를 분리한다. 이러한 #22는 양 말단에 Sau3AI 절단된 서열을 갖는다. 이들 서열을 이용함으로써, 이를 pT7BlueT 벡터(Navagen) 내로 클로닝시킨다. 이 클론을 이. 콜라이 TG-1에 형질감염시키고 형질전환체 세포를 스크리닝한다. 이와 같이 수득된 형질전환체의 플라스미드 DNA를 분석한다. 즉, 총 60개 클론에 대해, 플라스미드 DNA를 제조하고, 열 서열 분석기 형광성-표지된 프라이머 사이클 서열 분석 키트(Amersham International plc. Buckinghamshire, England)를 사용하여 이들의 뉴클레오티드 서열을 본래의 방향 및 역방향으로 결정한다. 이들 서열을 기준으로 하여, 클론을 분류한다. 그 결과, 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 13개 클론을 수득한다. 이들 클론의 서열을 정렬시킴으로써 컨센서스 서열을 조사하고, 서열 11에 제시된 서열을 수득한다. 이러한 서열을 갖는 클론을 클론 #22로 명명하였다. 완전한 길이의 클론 #22는 500개 뉴클레오티드 길이이다.
실시예 2: HNT22 유전자 검출 방법(1)
실시예 1에서 수득된 HNT22 클론 #22의 뉴클레오티드 서열을 구성하고 있는 20개 뉴클레오티드 길이의 다수의 올리고뉴클레오티드를 제조하고, 유전자 증폭용 프라이머로서의 이들의 유용성을 알아보기 위하여 이들의 각종 조합물을 검사하였다. 즉, 상기 유전자를 효과적으로 증폭시킬 수 있는 서열 및 이의 조합물을 조사하기 위하여, 상기 유전자에 대해 양성이고 이들 유전자를 분리시킨 샘플을 대상으로 하여 PCR을 수행한다. 그 결과, 서열 2(프라이머명: RD037) 및 서열 3(프라이머명: RD038)에 제시된 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라 서열 4(RD051) 및 서열 5(RD052)에 제시된 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드가 유전자 증폭용 프라이머로서 효과적으로 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. RD037 및 RD051은 센스 프라이머이고, RD038 및 RD052는 안티-센스 프라이머이다. 한 쌍의 센스 프라이머와 안티-센스 프라이머를 사용하여 증폭을 수행한다.
유전자 검출에 사용된 방법에 관한 상세한 내역은 다음과 같다.
시판되고 있는 핵산 추출용 키트(EX R&D, Sumitomo Metal Industries)를 사용하여 혈청 또는 혈장(100㎕)으로부터 핵산을 추출한다. HNT22 바이러스가 후술되는 바와 같이(실시예 8) DNA 바이러스인 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 과정에서는 바이러스성 유전자를 DNA로서 처리한다. 상기와 같이 추출된 DNA를 TE 완충액(10㎕)에 용해시키고, 전체 용적을 샘플로서 사용한다. 10배 농도의 AmpliTaq DNA 폴리머라제(5.0㎕, Perkin Elmer), 10mM dNTP(1.0㎕), 프라이머 RD037 및 RD038(각각에 대해 0.5㎕, 10 OD/ml), 및 열안정성 DNA 폴리머라제(0.25㎕, AmpliTaq DNA 폴리머라제, Perkin Elmer)를 PCR 전용 튜브에 도입하고, 증류수를 가하여 총 용적이 50㎕가 되도록 한다. 이러한 반응 혼합물을 사용시 제조한다.
상기 반응 혼합물을 함유하는 튜브에, 상기 추출된 DNA 샘플(10㎕)을 가하고, 광유(50㎕)를 덧바른 다음, 교반시키고, 이어서 냉동 원심분리형 분리기에서 6000rpm으로 30초 동안 원심분리시킨다. 원심분리 후, 상기 튜브를 열 사이클러에 놓아두고 PCR을 수행한다. 95℃에서 2분 및 30초 동안 처리한 다음, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 45초 동안의 주기를 35회 반복한 다음, 마지막 주기 후에 72℃에서 7분 동안 처리함으로써 PCR을 수행한다.
추가의 증폭을 수행하는 경우, 10배 농도의 AmpliTaq DNA 폴리머라제(5.0㎕, Perkin Elmer), 10mM dNTP(1.0㎕), 전술된 RD037 및 RD038 보다 내부에 위치된 뉴클레오티드 서열로부터 선별되는 프라이머 RD051 및 RD052(각각에 대해 0.5㎕, 10 OD/ml), 및 열안정성 DNA 폴리머라제(0.25㎕, AmpliTaq DNA 폴리머라제, Perkin Elmer)를 또 다른 PCR 전용 튜브에 도입하고, 증류수(37.5㎕)를 추가로 가하여 총 용적이 약 45㎕가 되도록 한다. 이 혼합물에, 전술된 증폭 생성물(5㎕)을 가하여 반응 혼합물을 수득한다. 이러한 반응 혼합물은 사용시 제조한다.
상기 반응 혼합물을 제조한 후, 이 혼합물에 광유(50㎕)를 덧바른 다음, 혼합하고, 이어서 냉동 원심분리형 분리기에서 6000rpm으로 30초 동안 원심분리시킨다. 이어서, 상기 튜브를 열 사이클러에 놓아두고 PCR을 수행한다. 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 30초 동안의 주기를 25회 반복한 다음, 마지막 주기 후에 72℃에서 7분 동안 처리함으로써 PCR을 수행한다.
이와 같이 증폭된 유전자를 전기영동시켜 검출한다. 즉, 상기 조건을 이용한 증폭에 의해 수득된 증폭 생성물 10㎕을 취하고, 이를 대상으로 하여 아가로즈 겔 전기영동(2.5% NuSieve; 아가로즈 EP=3:1)시킨다. 전기영동 후의 아가로즈 겔을 에티듐 브로마이드로 염색시키고, 증폭 생성물의 존재 또는 부재 여부를 자외선으로 확인한다. 증폭 생성물은 프라이머 RD037 및 RD038만을 사용하는 경우에는 270bp의 밴드로서 검출되거나, 또는 프라이머 RD051 및 RD052을 사용하여 증폭을 1회 수행하거나 부가로 증폭시킨 경우에는 197bp의 밴드로서 검출되었다.
실시예 3: HNT22 유전자 검출 방법(2)
일본인 환자 중의 HNT22 바이러스 감염 사례는 실시예 2의 HNT22 유전자 검출 방법에 의해서 충분히 검출될 수 있었지만, 증폭된 영역의 보존율을 추가로 검사하기 위해서, 실시예 7에 후술되는 프라이머 NG001/RD038(제1 PCR)와 NG001/RD052(제2 PCR)을 이용하는 방법에 의해, 다수의 샘플 영역을 함유하는 범위 내의 서열을 증폭시키고 이를 검사하였다. 그 결과, 2가지 주요 인자형 I 및 II(실시예 12에서 후술되는 바와 같이 본 발명에 의해 결정된 명칭)를 포함한 다수의 인자형이 HNT22 바이러스에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 미스매치가 인자형 II로서 명명된 인자형에서 프라이머 RD037 및 RD051의 서열, 특히 3' 말단측에 산재해 있는 것으로 추가로 밝혀졌다(도 1 내지 도 5). 이러한 미스매치 서열을 피함으로써 보다 특이적이고 보다 민감한 유전자 검출 방법이 개발될 수 있다는 가정을 근거로 하여, 추가의 고도로 보존된 서열을 조사하였다. 그 결과, 서열 6(프라이머명: NG059), 서열 7(NG061) 및 서열 8(NG063)에 제시된 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드가 유전자 증폭용 프라이머로서 이용될 수 있다는 것을 밝혀내고(도 1 내지 도 5) 이들을 이용하는 신규의 HNT22 유전자 검출 방법을 완성하였다.
이러한 유전자 검출에 사용된 방법에 관한 상세한 내역은 다음과 같다.
실시예 2에서와 동일한 방식으로 혈청 또는 혈장(50㎕)으로부터 DNA를 추출한다. 이와 같이 추출된 DNA를 증류수(20㎕)에 용해시키고, 95℃에서 15분 동안 처리한 다음, 즉시 얼음에서 2분 동안 냉각시켜 측정용 샘플을 수득한다. 10배 농도의 AmpliTaq DNA 폴리머라제 완충액(5.0㎕, Perkin Elmer), 2.5mM dNTP(4㎕), 프라이머 NG059 및 NG063(각각에 대해 0.5㎕, 10 OD/ml), 및 열안정성 DNA 폴리머라제(0.25㎕, AmpliTaq DNA 폴리머라제, Perkin Elmer)를 PCR 전용 튜브에 도입하고, 증류수(28.75㎕)를 추가로 가하여 총 용적이 40㎕가 되도록 한다. 상기 반응 혼합물을 함유하는 튜브에, 상기 추출된 DNA 샘플(10㎕)을 가하고, 광유(50㎕)를 덧바른 다음, 교반시키고, 이어서 냉동 원심분리형 분리기에서 6000rpm으로 30초 동안 원심분리시킨다. 원심분리 후, 상기 튜브를 열 사이클러에 놓아두고 PCR을 수행한다. 94℃에서 30초, 60℃에서 45초 및 72℃에서 45초 동안의 주기를 35회 반복한 다음, 마지막 주기 후에 72℃에서 7분 동안 반응을 진행함으로써 PCR을 수행한다.
추가의 증폭을 수행하는 경우, 10배 농도의 AmpliTaq DNA 폴리머라제(5.0㎕, Perkin Elmer), 2.5mM dNTP(4㎕), 프라이머 NG061 및 NG063(각각에 대해 0.5㎕, 10 OD/ml), 및 열안정성 DNA 폴리머라제(0.25㎕, AmpliTaq DNA 폴리머라제, Perkin Elmer)를 또 다른 PCR 전용 튜브에 도입하고, 증류수(37.5㎕)를 추가로 가하여 총 용적이 약 48㎕가 되도록 한다. 이 혼합물에, 전술된 증폭 생성물(2㎕)을 가하고, 광유(50㎕)를 덧바른 다음, 교반시키고, 이어서 냉동 원심분리형 분리기에서 6000rpm으로 30초 동안 원심분리시킨다. 이어서, 상기 튜브를 열 사이클러에 놓아두고 PCR을 수행한다. 94℃에서 30초, 60℃에서 45초 및 72℃에서 15초 동안의 주기를 25회 반복한 다음, 마지막 주기 후에 72℃에서 7분 동안 처리함으로써 PCR을 수행한다. 이와 같이 증폭된 유전자를 실시예 2에서와 동일한 방식으로 아가로즈 겔 전기영동시켜 검출한다. 본 실시예에서는, 증폭 생성물이, 첫 번째 프라이머 NG059 및 NG063을 사용하여 PCR에 의해 증폭된 경우에는 236bp의 밴드로서 검출되거나, 또는 프라이머 NG061 및 NG063을 사용하여 PCR에 의해 증폭된 경우에는 271bp의 밴드로서 검출되었다.
본 실시예에서 수행된 2-단계 PCR을 구성하고 있는 각각의 PCR은 물론 단독으로 수행할 수도 있다.
추가로, 실시예 3의 유전자 검출 방법은 인자형 I 및 II를 포함한 HNT22 유전자의 수 많은 상이한 유전자의 증폭에 이용될 수 있고 인자형 I에 특이한 증폭이 실시예 2의 유전자 증폭 방법에 의해 실현될 수 있기 때문에, 각 하나의 샘플을 대상으로 하여 실시예 2 및 3에 따르는 유전자 검출 방법을 수행하고 이로써 발생되는 검출 패턴을 조사함으로써 이들의 인자형에 대해 샘플을 분류하는 것이 가능하다(도 1 내지 도 5).
실시예 4: 동정된 유전자 서열의 연장
클론 #22를 기준으로 하여, 동정된 유전자 서열을 연장시킨다. 즉, 실시예 2 및 3에서 확립시킨, RD037과 RD038의 프라이머 쌍을 이용하는 PCR과 RD051과 RD052의 프라이머 쌍을 이용하는 PCR의 조합으로 이루어진 2-단계 PCR, 및 NG059와 NG063의 프라이머 쌍을 이용하는 PCR과 NG061과 NG063의 프라이머 쌍을 이용하는 PCR의 조합으로 이루어진 2-단계 PCR에 의해 결정되는 바와 같이 높은 HNT22 바이러스 역가치(HNT22 유전자는 심지어 104-5배 희석율에서도 검출될 수 있었다)를 나타내는 샘플인, 비정상적인 간 기능을 나타내는 혈액 공여자[34세 남성, ALT(알라닌 아미노트랜스퍼라제)값: 106IU]의 샘플(혈청)으르 사용함으로써, 상기 워킹 기술에 의해 #22 서열을 5' 방향 및 3' 방향으로 연장시킨다. 수득된 뉴클레오티드 서열(서열 1)을 갖는 바이러스 균주를 T278로 명명하였다.
본 실시예에서 수행된 워킹 방법의 내역은 다음과 같다(도 6).
(1) 클론 T4 및 T6의 서열 분석
클론 #22의 뉴클레오티드 서열에 특이적인 센스 및 안티-센스 프라이머, 및 서열 12 내지 16(SSP-G, SSP-A, SSP-T 및 SSP-C)에 제시된 41개 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-특이적 프라이머를 사용하여, 2-단계 한쪽측 PCR을 수행한다.
5' 말단을 연장하기 위하여, 특이적 안티-센스 프라이머 RD038이나 RD052 중의 어느 하나와 상기 언급된 비-특이적 프라이머 중의 하나의 조합물을 이용하는 2-단계 한쪽측 PCR을 수행한다. 제1 단계의 PCR(첫 번째 PCR)에서는, 94℃에서 30초, 42℃에서 45초 및 72℃에서 2분 동안의 주기를 5회 반복하고, 반응 생성물을 SizeSep-400 칼럼(Pharmacia Biotechnology)에 의해 정제하며, 증폭을 위해 94℃에서 30초, 55℃에서 45초 및 72℃에서 2분 동안의 주기를 35회 반복한다. 제2 단계 의 PCR(두 번째 PCR)에서는, 첫 번째 PCR의 생성물의 1/10 용적을 사용하고, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 2분 동안의 주기를 30회 반복한다. TaKaRa Ex Taq DNA 폴리머라제(Takara Shuzo)를 사용하여 PCR을 수행한다. 상기 생성물을 실시예 1에서와 동일한 방식으로 pT7Blue T 벡터 내로 클로닝하고, 양 쇄의 뉴클레오티드 서열을 3개 이상의 클론에 대해 결정하여 서열 16에 제시된 서열(서열 1에 제시된 nt1455-2257에 상응함, 클론 T4); 및 서열 17에 제시된 서열(서열 1의 nt2061-3265에 상응함, 클론 T6)을 수득한다. 프라이머 SSP-A와 RD052의 조합물을 이용하는 PCR의 증폭 생성물로부터 서열 16에 제시된 서열을 수득하고, 프라이머 RD051과 SSP-C의 조합물을 이용하는 PCR의 증폭 생성물로부터 서열 17에 제시된 서열을 수득한다.
(2) 클론 T7, T9, T11 및 T13의 서열 분석
새로이 동정된 클론 T6과 T4를 사용하여, 상기 (1)과 동일한 방식으로, 클론 T4로부터 5' 뉴클레오티드 서열을 동정하고 클론 T6으로부터 3' 뉴클레오티드 서열을 동정한다. 즉, 5' 서열에 대해서는, 클론 T4의 5' 말단에 특이적인 서열을 갖는 서열 18 및 19의 서열(NG012 및 NG013)을 갖는 특이적 안티-센스 프라이머 및 서열 12 내지 15 및 20의 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-특이적 프라이머를 사용하여, 2-단계 한쪽측 PCR을 수행하고, 이로써 생성된 증폭 생성물을 클로닝시키며, 실시예 1에 기재된 방법에 의해 서열 분석한다. 구체적으로 언급하면, 제1 단계의 PCR은, 안티센스 프라이머 NG012와 전술된 비-특이적 프라이머 중의 어느 하나의 조합물을 사용하여 수행한다. PCR의 경우, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 2분 동안의 주기를 5회 반복하고, 반응 생성물을 SizeSep-400 칼럼(Pharmacia Biotechnology)에 의해 정제하며, 94℃에서 30초, 55℃에서 45초 및 72℃에서 2분 동안의 반응 주기를 추가로 35회 반복한다. 제2 단계의 PCR은, 제1 단계의 PCR의 생성물의 1/10 용적을 사용하고, 특이적 안티-센스 프라이머로서 NG013을 사용하며, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 2분 동안의 주기를 30회 반복함으로써 수행한다. 상기 증폭 생성물을 실시예 1에서와 동일한 방식으로 pT7Blue T 벡터 내로 클로닝하고, 양 쇄의 뉴클레오티드 서열을 3개 이상의 클론에 대해 결정하여 서열 21에 제시된 서열(서열 1의 nt945-1575에 상응함, 클론 T9)을 수득한다(도 6).
3' 서열에 대해서는, 클론 T6의 3' 말단에 특이적인 서열을 갖는 서열 22 및 23의 서열을 갖는 특이적 센스 프라이머 NG066 및 NG010과, 서열 12 내지 15 및 20의 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-특이적 프라이머를 사용하여 상기 것과 유사한 2-단계 한쪽측 PCR을 이용하여 서열 증폭시키고, pT7Blue T 벡터 내로 클로닝시킨 다음, 서열 분석으르 수행하여 서열 24에 제시된 서열(서열 1의 nt3126-3739에 상응함, 클론 T7)을 수득한다(도 6).
5' 서열에 대해서는, 동일한 과정을 추가로 반복하여, 전술된 클론 T9의 서열을 이용해서는 서열 25에 제시된 서열(서열 1의 nt723-1024에 상응함, 클론 T11)을 수득하고 클론 T11의 서열을 이용해서는 서열 26에 제시된 서열(서열 1의 nt1-831에 상응함, 클론 T13)을 수득한다. 이들 클론의 서열들을 정렬함으로써, 서열 1에 제시된 HNT22의 서열을 수득한다. 클론 T11을 수득하기 위하여, 서열 27(프라이머명: NG031)에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 제1 단계의 한쪽측 PCR에 대한 안티-센스 프라이머로서 사용하고, 서열 28(프라이머명: NG032)에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 제2 단계의 한쪽측 PCR에 대한 안티-센스 프라이머로서 사용한다. 클론 T13을 수득하기 위하여, 서열 29에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(프라이머명: NG045)를 제1 단계의 한쪽측 PCR에 대한 안티-센스 프라이머로서 사용하고, 서열 30에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(프라이머명: NG030)를 제2 단계의 한쪽측 PCR에 대한 안티-센스 프라이머로서 사용한다. 비-특이적 프라이머로서, 서열 12 내지 15 및 20의 뉴클레오티드 서열을 상기로서 사용한다(도 6).
이들 서열을 확립하기 위해서, 프라이머 쌍으로서, 각각 서열 34(프라이머명: NG013)에 제시된 뉴클레오티드 서열과 서열 35(프라이머명: NG025)에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드, 각각 서열 36(프라이머명: NG040)에 제시된 뉴클레오티드 서열과 서열 37(프라이머명: NG046)에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드, 및 각각 서열 38(프라이머명: RD0573)에 제시된 뉴클레오티드 서열과 서열 39(프라이머명: RD058)에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여, nt1109-1575에 상응하는 서열(서열 31, 클론 T10), nt12-759에 상응하는 서열(서열 32, 클론 T14) 및 nt3119-3315에 상응하는 서열(서열 33, 클론 T8)을 각각 증폭시키고, 증폭 생성물을 상기와 같이 클로닝시킨 다음, 서열을 분석한다(도 6).
이와 같이 수득된 클론의 서열을 합하여 서열 1에 제시된 완전한 길이의 3739bp 서열을 수득한다. 상기 서열의 작제시, 클론들 간에 중첩된 서열(클론들 간에 상이함)에서 돌연변이가 관찰되는 경우에는, 가장 빈번한 뉴클레오티드가 바람직하다.
수득된 서열 중의 nt1455-3054의 서열에 대해서, 데이타베이스(DDBJ, National Genetics Institutes, 조사 프로그램: BLAST 및 FASTA)를 사용하여 상동성을 기준으로 하여 공지된 유전자 서열을 조사한다. 가장 높은 상동성을 나타내는 20개 유전자 중에서, 원숭이의 사이토메갈로바이러스 주요 즉시 초기 전사 단위 IE94 만이 바이러스로부터 유도된 것이며, 이의 상동성은 가장 높은 상동성을 나타낸 383개 뉴클레오티드 길이의 단편에 대해서 조차도 50.7%이다.
상기 사실로부터, 완전한 길이에 걸쳐 본 발명에 따르는 유전자 서열과 높은 상동성을 나타내는 어떠한 바이러스성 유전자도 공지된 바 없으며, 본 발명에 따라서 밝혀진 유전자가 신규의 서열을 갖는다는 것이 확인되었다.
실시예 5: 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 마커에 대해 음성이고 비정상적인 알라닌 아미노트랜스퍼라제 수치를 나타내는 혈액 공여자 및 만성 간염 환자에서의 HNT22 유전자의 검출
공지된 간염 바이러스 마커에 대해 음성이고 알라닌 트랜스퍼라제(ALT) 활성치가 100국제 단위(IU/l) 이상인 207명, λ-글루타밀 트랜스펩티다제(λ-GTP) 활성치가 500IU/l 이상인 26명, 및 모두 일본인 혈액 공여자에게서 발견된 비-B형, 비-C형 만성 간염의 15가지 사례를 대상으로 하여, 실시예 2의 유전자 검출 방법을 사용하여 HNT22 유전자의 존재 여부를 검사하였다.
대조군으로서, 정상적인 간 기능을 나타낸 88명 혈액 공여자와 만성 C형 간염 환자 22명을 또한 검사하였다.
그 결과, HNT22 유전자가 비정상적으로 높은 ALT 수치를 나타낸 207명 중에서 16명(7.7%), 비정상적으로 높은 λ-GTP 수치를 나타낸 26명 중에서 4명(15.4%), 그리고 만성적 비-B형, 비-C형 간염 환자 15명 중에서 3명(20%)에게 발견되었다.
한편, HNT22 유전자는, 정상적인 간 기능을 나타낸 88명 혈액 공여자 중에서 3명(3.4%), 그리고 만성 C형 간염 환자 22명 중에서 2명(9.1%)에게 발견되었다.
실시예 6: 수혈-후 간염 사례에서의 HNT22 유전자의 검출
공지된 간염 바이러스 마커에 대해 음성인 수혈-후 간염 사례의 경우, 실시예 2의 방법에 의해 수혈 전의 환자 혈액, 수혈 후 및 간염 발증 전의 환자 혈액, 간염 발증 후의 환자 혈액, 및 수혈용 혈액(가능한 경우)을 대상으로 하여, HNT22 유전자의 존재 여부와 발현 시기를 검사한다.
(1) 사례 1: 수혈-후 간염 사례, 63세 남성
본 사례는 검사 기간 내내 HBV, HCV 및 GBV-C/HGV의 어떠한 마커에 대해서도 음성이다. 간 기능 마커인 ALT 수치는 수혈전에는 정상이었지만, 수혈한지 8주 및 9주 후에는 비정상적인 수치가 관찰되었다. 이러한 사례의 혈액을 대상으로 하여, 수혈 전(수혈한지 0주 후로서 표현됨)의 HNT22 유전자와 수혈한지 6, 8, 9, 10, 11, 12, 15 및 24주 후의 HNT22 유전자에 대해 검정하였다. 그 결과, HNT22 유전자가 심지어 수혈 전의 환자 혈청으로부터 검출되었다(표 1). 본 사례에 주입된 혈액은 4단위로 이루어졌다. 이들 수혈 단위에서의 HNT22 유전자의 존재 여부를 검사해 보면, HNT22 유전자가 1단위에서 검출되었다.
혈액수집주식회사 ALT(IU/L) HCV 항체 GBV-C/HGV RNA HNT22 유전자1번째 PCR 2번째 PCR
0 11 - - + +
6 62 - - NT NT
8 109 - - NT NT
9 443 - - + +
10 148 - - + +
11 41 - - - +
12 20 - - - +
15 33 - - + +
24 19 - - - +
NT: 시험 안함
(2) 사례 2
수혈-후 간염 사례, 58세 남성
본 사례는 검사 기간 내내 HBV, HCV 및 GBV-C/HGV의 어떠한 마커에 대해서도 음성이다. 간 기능 마커인 ALT 수치는 수혈 전에는 정상이었지만, 수혈한지 약 10주 후에는 비정상적인 수치가 관찰되었다. 이러한 사례의 환자 혈액을 대상으로 하여, 수혈한지 2, 6, 8 및 10주 후의 HNT22 유전자에 대해 검정하였다. 그 결과, HNT22 유전자가 제1 증폭 단계의 첫 번째 PCR에서 수혈한지 6, 8 및 10주 후의 환자 혈청으로부터 검출되었다(표 2). 이와는 달리, 2주 째에는, 역가치가 낮고, 단지 두번째 PCR에서만 검출되었다. 본 사례에 주입된 혈액은 보존되지 않았기 때문에, 주입된 혈액에서의 HNT22 유전자의 존재 여부는 확인할 수 없었다.
본 실시예는 HNT22의 클론 #22를 분리시키는 사례이다. 상기 바이러스가 분리용 드라이버로서 사용되는 2주째의 혈액 내에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 고도로 민감한 제2 단계의 증폭에서만 검출될 수 있기 때문에, 상기 시점에서의 바이러스의 양은 다소 적으므로, 이는 실질적으로 드라이버로서 작용한다.
혈액수집주식회사 ALT(IU/L) HCV 항체 GBV-C/HGV RNA HNT22 유전자1번째 PCR 2번째 PCR
2 36 - - - +
6 37 - - + +
8 55 - - ++ +
10 180 - - ++ +
(3) 사례 3
수혈-후 간염 사례, 56세 남성
본 사례는 또한 검사 기간 내내 HBV, HCV 및 GBV-C/HGV의 어떠한 마커에 대해서도 음성이다. 간 기능 마커인 ALT 수치는 수혈 전에는 정상이었지만, 수혈한지 약 6주 후에는 비정상적인 수치가 관찰되었다. 이러한 사례의 환자 혈액을 대상으로 하여, 실시예 2의 방법에 따라서 2-단계 증폭을 포함하는 PCR을 이용함으로써 수혈 전(수혈한지 0주 후로서 표현됨)의 HNT22 유전자와 수혈한지 2, 4, 6, 8, 12, 13주, 및 4개월 및 5개월 후의 HNT22 유전자의 존재 여부에 대해 검정하였다. 상기 샘플의 일련의 10배 희석물을 또한 제조하고 동일한 방식으로 검정함으로써, 상기 유전자가 검출되는 최대 혼합비로부터 상기 바이러스성 유전자의 역가(바이러스의 양인 것으로 간주됨)를 결정한다. 그 결과, 수혈한지 2주 후의 혈액은 음성이었지만, 수혈한지 6주 내지 4개월 후의 각 혈액에서는 HNT22 유전자가 검출되었다(표 3). 한편, 간 기능 이상이 수혈한지 6주 후부터는 심각해지고 점차적으로 악화되는데, 이러한 과정은 바이러스성 양의 편차와 잘 일치된다. 본 사례에 주입된 혈액은 보존되지 않았기 때문에, 주입된 혈액에서의 HNT22 유전자의 존재 여부는 확인할 수 없었다.
혈액수집주식회사 ALT(IU/L) HCV 항체 GBV-C/HGV RNA HNT22 유전자1번째 PCR 2번째 PCR
0 17 - - - -
2 36 - - - -
4 34 - - - +
6 192 - - - +
8 172 - - - +
(4) 사례 4
수혈-후 간염 사례, 70세 여성
본 사례는 또한 검사 기간 내내 HBV, HCV 및 GBV-C/HGV의 어떠한 마커에 대해서도 음성이다. 간 기능 마커인 ALT 수치는 수혈 전에는 정상이었지만, 수혈한지 약 6주 후에는 비정상적인 수치가 관찰되었다. 이러한 사례의 환자 혈액을 대상으로 하여, 실시예 2 및 3의 방법에 따라서 2-단계 증폭을 포함하는 PCR을 이용함으로써 수혈한지 4, 6, 8, 11, 12, 15, 16, 17 및 21주 후의 HNT22 유전자의 존재 여부에 대해 검정하고, HNT22 유전자의 존재 여부와 바이러스성 유전자의 역가를 또한, 사례 3에서와 같이 결정한다(유사한 결과가 실시예 2 및 3의 방법에 의해 수득된다). 그 결과, 수혈한지 4주 후의 혈액은 음성이고, 수혈한지 6주 후부터 역가가 증가하였으며, 간 기능 이상이 가장 심각해진 11주 후에 가장 높은 역가가 관찰되었다. 이어서, 상기 바이러스가 소멸됨에 따라, 간 기능이 정상적으로 되므로, 바이러스성 양의 편차와 간 기능이 서로 잘 일치된다(표 4). 본 사례에 주입된 혈액은 보존되지 않았기 때문에, 주입된 혈액에서의 HNT22 유전자의 존재 여부는 확인할 수 없었다. HNT 항체의 존재 여부를 실시예 13에 기재된 방법에 의해 검정하는 경우, 이는 발증 후에 양성이었다.
혈액수집주식회사 ALT(IU/L) HCV 항체 GBV-C/HGV RNA HNT22 유전자1번째 PCR 2번째 PCR HNT 항체
4 14 - - - - -
6 15 - - - + NT
8 10 - - + + NT
11 140 - - ++ + NT
12 36 - - - + NT
15 16 - - - - NT
16 7 - - - - NT
17 4 - - - - NT
21 7 - - - - +
NT: 시험 안함
실시예 7: 수혈 감염 사례 분석
공지된 간염 마커에 대해 음성이고 이의 원인이 불분명한 수술-후 간염 사례의 실시예 6에서 본 발명의 HNT22 유전자가 검출되었다는 사실과 간 기능 마커의 비정상적인 수치 편차가 바이러스 양 편차와 잘 일치된다는 사실은 HNT22가 상기 간염의 원인이라는 것을 강력히 시사하고 있다. 본 실시예에서는 HNT22가 수혈에 의해 전염된다는 사실을 명백히 입증하고자 한다. 즉, HNT22 유전자가 수혈 후의 혈액에서 검출되고 수혈에 사용된 수혈 파일롯 모두가 보존된 수혈력을 지닌 사례의 경우, 수혈 후의 혈액과 혈액 파이롯을 대상으로 하여, 상기 유전자에 대해 양성이고 감염원인 것으로 간주되는 수혈 파일롯을 동정하기 위하여 후술되는 방법에 의해 상기 유전자를 검정한다. 추가로, 환자 혈액과 파일롯으로부터 수득된 유전자의 서열을 결정하고 이를 비교하여 이들의 서열 상동성을 검사한다.
수혈 후 실시예 2에 기재된 방법에 의해 HNT22 유전자에 대해 양성인 것으로 결정된 사례에 대해서는, HNT22 유전자가 수혈 전의 혈액 및 수혈에 사용된 혈액 파일롯에서 검출되었는지를 결정한다. 그 결과, HNT22 유전자는 수혈 전의 혈액 샘플에서 검출되지 않았지만, 수혈한지 2주 후부터는 모든 샘플에서 검출되었다. 따라서, 이러한 감염이 수혈에 의한 것임을 강력히 제시하고 있다.
추가로, 사용된 10개의 혈액 파일롯 모두를 대상으로 하여, HNT22 유전자를 검정한 결과, HNT22 유전자는 이들 중에서 하나의 파일롯에서 검출되었다. 실시예 2에 기재된 방법에 따라서 HNT22에 대해 양성인 샘플 모두로부터 핵산을 추출한다. 이어서, 실시예 2의 첫 번째 PCR에서 센스 프라이머 RD037을 실시예 40에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 NG001로 대체하고 PCR 조건을 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분 동안의 주기 35회로 변화시킴으로써, 이들을 실시예 2에서와 같이 증폭시킨다. 상기 조건하에서 증폭된 경우, 415bp의 DNA 단편이 양성 사례에 제공된다. 센스 프라이머 RD051을 NG001로 대체하고 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분 동안의 반응 주기를 25회 사용한 PCR 조건을 이용함으로써, 실시예 2에서의 증폭의 제2 단계를 수행한다. 이들 조건 하에서 증폭된 경우, 396bp의 DNA 단편이 양성 사례에 제공된다. 이러한 396bp 증폭 생성물을 실시예 1에서와 같이 플라스미드 벡터에 삽입함으로써 클로닝시키고, 뉴클레오티드 서열을 결정하며, 각 증폭에 대해 3개 클론을 비교하여 상동성을 검사한다.
그 결과, HNT22에 대해 양성인 수혈용 혈액 파일롯으로부터 수득된 클론의 서열이 상기 파일롯을 이용하여 수혈받은 환자로부터 수득된 HNT22 유전자 서열과 완전하게 일치하였다(도 7). 이는 HNT22 바이러스가 수혈에 의해 전염되어 잠복된다는 것을 입증해준다. 이러한 유전 서열을 클론 #22의 서열과 비교한 경우, 뉴클레오티드가 양 말단에 대한 프라이머로부터 유도된 것 이외의 356개 뉴클레오티드와 상이하였다.
실시예 8: 본 발명의 바이러스가 DNA 바이러스란 사실 입증
간염 바이러스로는, HBV와 같은 DNA 바이러스와 HCV와 같은 RNA 바이러스가 있다. 본 발명의 바이러스가 속하는 바이러스 종류가 무엇인지는 다음 과정으로 결정한다.
(1) 역 전사 반응 단계를 생략한 PCR
실시예 1에 기재된 바와 같이, 본 발명의 분리된 유전자 샘플에서는, 핵산 추출 이후에 역 전사 반응 단계가 진행되었다. 따라서, 이러한 역 전사 반응 후의 샘플은 본래 존재하였던 DNA와, 반응 전에는 RNA로서 존재하였고 역 전사 반응에 의해 DNA로 전환된 DNA를 함유하고 있다. 따라서, 본 발명의 바이러스가 RNA 바이러스라면, 역 전사 반응을 생략한 경우에는 상기 바이러스의 유전자 검출이 불가능해지거나 다소 어려워져야 한다.
이를 근거로 하여, 본 발명자들은 상기 확률을 검사하기 위하여 역 전사 반응을 생략한, 실시예 2의 과정에 따르는 PCR을 수행하였다. 그 결과, 역 전사 반응을 이용하지 않는 경우라도 HNT22 유전자가 유사한 수준으로 검출될 수 있는 것으로 확인되었다.
이러한 사실로부터, HNT22가 DNA 바이러스인 것으로 입증되었다.
(2) 데옥시리보뉴클레아제 처리에 의한 입증
상기 (1)의 분석에 덧붙여, 본 발명자들은 실시예 2의 방법에 의해 HNT22 유전자를 함유하는 것으로 확인된 샘플로부터 추출된 핵산 분획을 데옥시리보뉴클레아제로 처리한 다음 이를 역 전사 반응시키고, 이로써 생성된 생성물을 실시예 2의 방법에 의해 HNT22 유전자에 대한 샘플로서 검정하였다.
구체적으로 언급하면, 실시예 2와 동일한 시판용 키트(EX R&D, Sumitomo Metal)를 사용하여 추출된 핵산 분획을 37℃에서 30분 동안 DNase I(Takara Shuzo)로 처리한 다음, DNase I의 활성을 억제한다. 이 샘플을 대상으로 하여, 동일한 조건 하에 역 전사시킨 후에 실시예 1의 과정을 수행하여 HNT22 유전자 검출을 시도한다. 그 결과, HNT22 유전자가 DNase I의 처리 후에 검출될 수 없는 것으로 밝혀졌다.
상기 (1) 및 (2)의 결과는 본 발명의 HNT22 바이러스가 DNA 바이러스라는 것을 입증해준다.
실시예 9: 본 발명의 바이러스가 일본쇄 DNA 바이러스란 사실 입증
(1) 제한 엔도뉴클레아제를 이용한 입증
DNA 바이러스 중에는 상이한 유전자 구조를 갖는 2종류의 바이러스, 즉 일본쇄 DNA를 갖는 바이러스와 이본쇄 DNA를 갖는 바이러스가 있는 것으로 공지되어 있다. 본 발명자들은 HNT22 바이러스의 정체를 명백히 밝히는 관점에서는, 본 발명의 바이러스가 속하는 바이러스 종류가 무엇인지를 결정하는 것이 중요하다고 간주하고, 다음 실험을 수행하였다.
HNT22 바이러스가 본래 이본쇄 상태로 존재한다고 가정하면, 이의 서열 내에 제한 엔도뉴클레아제에 특이적인 몇몇 부위가 존재할 것이다. 그러나, 이러한 바이러스 유전자가 일본쇄인 경우에는, 이러한 제한 엔도뉴클레아제 특이적 서열이 존재하지 않을 것이다. 역으로 말하면, 추출된 유전자가 상기 서열에 특이적인 제한 엔도뉴클레아제에 민감한 경우(이에 의해 절단된 경우), 본 발명의 바이러스 유전자는 이본쇄 구조를 갖는다.
상기 사상을 기준으로 하여, 본 발명자들은 상기 유전자가 이본쇄인 것으ㅗ 추정되는 경우에 이에 대한 특이적 서열이 HNT22 유전자의 서열이 존재할 수 있는 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI로의 절단이나, 또는 이에 대한 특이적 서열이 대조군으로서 인식되지 않는 제한 엔도뉴클레아제 BglII로의 절단이 있는지를 검사한다.
실시예 1에 기재된 방법을 사용하여, 실시예 2 및 3의 방법에 의해 HNT22 바이러스에 대해 양성인 것으로 확인된 환자로부터 수득된 혈장(800㎕)으로부터 DNA(90㎕)를 수득한다. 각 DNA의 15㎕ 등취량을 취하고, EcoRI(Takara Shuzo) 또는 BglII(Takara Shuzo) 2㎕를 가한 다음, 37℃에서 2.5시간 동안 배양한다. 이와 병행해서, 제한 엔도뉴클레아제 대신 인산염 완충액을 가함으로써 동일한 반응을 수행한다. 상기 제한 엔도뉴클레아제로 처리한 후, 3㎕ 등취량을 각 샘플로부터 취하고, 이로부터 10배 및 100배 희석된 샘플을 제조하며, 이들 내에 EcoRI 제한 엔도뉴클레아제 특이적 서열이 함유된 프라이머 NG001 및 RD038을 사용함으로써 각 샘플에 대한 EcoRI 제한 엔도뉴클레아제 특이적 서열을 함유하는 HNT22 유전자 영역을 증폭시키고자 하였다. 그 결과, 어떠한 샘플에서도 제한 엔도뉴클레아제에 의한 절단이 인식되지 않았다.
(2) 녹두 뉴클레아제 처리에 의한 입증
녹두 뉴클레아제는 일본쇄 DNA를 특이적으로 절단하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, HNT22가 일본쇄로서 존재한다면, 이는 녹두 뉴클레아제에 민감할 것이다.
이러한 사상을 기초로 하여, 본 발명자들은 제한 엔도뉴클레아제 처리 실험에 사용된 바와 동일한 환자로부터 동일한 방식으로 DNA를 수득하고, 이를 녹두 뉴클레아제로 처리하였다. 대조군으로서, 실시예 2의 방법에 의해 증폭된 HNT22의 부분 영역을 파아지 M18에 도입하고, 이본쇄인 것과 일본쇄인 것을 제조하며, 이를 녹두 뉴클레아제 처리한다. 이어서, 실시예 2의 방법에 따라서 HNT22 유전자를 증폭시킨다. 그 결과, HNT22 양성 환자로부터 수득된 DNA와 상기 파아지로부터 유도된 일본쇄 DNA는 증폭시킬 수 없으므로, 이들은 녹두 뉴클레아제에 민감하다.
상기 (1) 및 (2)의 결과로부터, HNT22 유전자가 일본쇄 DNA로서 존재하고 HNT22 바이러스가 일본쇄 DNA 바이러스라는 사실을 확인하였다.
실시예 10: HNT22 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열
실시예 4에서 확인된 HNT22 유전자 서열을 기준으로 하여, HNT22 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열을 분석한다. 수득된 뉴클레오티드 서열에서 개시 코돈과 종결 코돈을 조사하고, 이의 조합물이 결정 기준으로서 통상적으로 예상되는 크기의 개방 판독 프레임(ORF)를 제공할 수 있다는 것을 고려하여 HNT22 유전자의 ORF를 조사한다. 그 결과, 2개의 ORF, 즉 ORF 1: nt589-nt2898(770개 아미노산 잔기) 및 ORF2: nt107-nt712(202개 아미노산 잔기)가 있는 것으로 밝혀졌다(도 6 및 도 8). 이로부터, HNT22 유전자가 서열 9 및 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 것으로 추정할 수 있다.
이들 아미노산 서열을 기준으로 하여, 상기 암호화된 폴리펩티드의 소수성/친수성 특징을 통상적인 방식으로 분석한다(도 9).
실시예 11: 바이러스 입자의 분리
실시예 2의 방법에 의해 HNT22 유전자에 대해 양성인 것으로 밝혀진 혈액을, 슈크로즈 밀도 구배 원심분리를 이용하여 분획화하여 HNT22 유전자의 밀도 분포도를 분석하고, 이러한 밀도 분포도 분석을 기준으로 하여 바이러스 입자일 확률을 조사한다.
(1) 대조군으로서 HBV에 대해 양성인 혈장(5㎕)과 HNT22 유전자에 대해 양성인 혈액(250㎕)을 혼합하고, 냉동 미소원심분리형 분리기를 이용하여 15000rpm으로 5분 동안 원심분리시켜 불순물을 침전시킨 다음, 이를 제거한다.
(2) 상기 (1)의 과정에서 수득된 상등액(0.2ml)을, 바닥으로부터 60중량%(0.7ml), 50중량%, 40중량%, 30중량%, 20중량% 및 10중량%(각각에 대해 0.2ml) 순으로 구배 농도를 갖는 슈크로즈 용액 층을 적층시키고, 그 위에 TEN 완충액(2.3ml, 10mM 트리스-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA, 0.5M NaCl)을 적층시킴으로써 벡크만(Beckman) SW60 회전자에 대해 원심분리형 튜브에 형성된 밀도 구배 캐리어에 가한다.
(3) 10℃에서 40000rpm으로 45시간 동안 원심분리시킨 후, 각 튜브의 바닥으로부터 300㎕ 분획을 수집하고, 굴절계를 사용하여 밀도 측정을 수행한다.
(4) 각 밀도 분획으로부터 100㎕ 부분을 수집하고, 프로테이나제 K(Boehringer Mannheim) 및 나트륨 도데실설페이트(SDS, Wako Pure Chemicals Industries)를 함유하는 추출 시약(300㎕, Okamoto H. et al., J. Virol. 64:1298-1303, 1990)과 혼합한 다음, 70℃에서 3시간 동안 반응시킨다. 핵산 분획을 페놀을 가함으로써 추출하고, 페놀과 클로로포름으로 추가로 추출한다. 최종적으로, 상기 핵산을 에탄올을 가함으로써 침전시킨 다음, 수집하고, 이를 적합한 농도가 되도록 TE 완충액(10mM 트리스-HCl, pH 8.0, 1.0mM EDTA)에 용해시킨다.
(5) 상기와 같이 수득된 DNA를 샘플로서 사용함으로써, 실시예 2의 방법에 의해 HNT22 유전자를 증폭시키고, 다음과 같이 HBV 유전자를 증폭시킨 다음 검출한다.
HBV의 표면 항원 유전자 영역 내의 서열로부터 선별되는, 서열 41에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 S1-2와 서열 42에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 S2-1(각 0.5㎕, 10 OD/ml)을 포함하는 증폭 반응 혼합물, 2.5mM dNTP(4㎕), 10배 농도의 열안정성 DNA 폴리머라제에 대한 완충제(5.0㎕, AmpliTaq DNA 폴리머라제에 부착된 완충제, Perkin Elmer), 열안정성 DNA 폴리머라제(0.25㎕, AmpliTaq DNA 폴리머라제, Perkin Elmer) 및 증류수(34.75㎕)를 함유하는 PCR 튜브에 DNA 샘플(5㎕)을 가하고, 광유(50㎕)를 덧바르고, 교반시킨 다음, 5000rpm으로 30초 동안 원심분리시키며, 상기 튜브를 열 사이클러 위에 놓아두어 PCR을 수행한다. 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 75초 동안의 반응 주기를 35회 반복하여 PCR을 수행한다. 이러한 방법에서는, HBV 유전자가 전기영동 겔에서 250bp 길이의 밴드로서 검출되었다. 보다 민감한 검출이 요구되는 경우에는, 상기 증폭 생성물의 일정 부분을 사용함으로써 두 번째 PCR을 다음과 같이 수행한다. 즉, 상기에서 사용된 프라이머를 서열 43에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 $088 및 서열 44에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 S2-2로 대체하는 것을 제외하고는 상기와 동일한 반응 용액에 상기 증폭 생성물(5㎕)을 가하고, 상기와 동일한 방식으로 시험한다. 이어서, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 60초 동안의 반응 주기를 25회 반복하여 PCR을 수행한다. 두 번째 PCR에 의해 제공된 증폭 생성물을 전기영동 겔에서 228bp의 밴드로서 검출하였다.
상기 검정 결과, HNT22 유전자는 슈크로즈 농도 54.5% 및 밀도 1.26g/㎤에서 피크로 존재한 반면, 대조군으로서의 HBV는 앞서 보고된 바와 같이 1.26 내지 1.20g/㎤의 밀도에서 피크로 존재하였다(표 5). 이러한 밀도 분석은 HNT22 유전자가 바이러스 입자 분획에 존재한다는 것을 지시해주며, 이들이 밀도 구배 원심분리에 의해 상기 언급된 밀도 분획으로 수집될 수 있다는 것이 입증되었다.
슈크로즈 밀도 구배 원심분리 분획에서의 HNT22 유전자의 분포도
슈크로즈 밀도(%) 밀도(g/㎖) HNT22-DNA1번째 PCR 2번째 PCR HBV-DNA1번째 PCR 2번째 PCR
60.7 1.29 + + - +
54.5 1.26 ++ + +++ +
45.2 1.20 ± + +++ +
30.9 1.13 ± + ++ +
19.5 1.08 - + + +
12.0 1.05 - - + +
-: 네가티브, ±: 약한 포지티브, +: 포지티브, ++: 상당히 포지티브, +++: 매우 포지티브
실시예 12: HNT22 인자형 서열
HNT22는 실시예 3에서 언급된 바와 같이 몇몇 인자형을 가지는 것으로 제안되었기 때문에, 본 발명자들은 실시예 3의 유전자 검출 방법에 의해 양성인 것으로 결정된 22가지 HNT22 양성 사례의 증폭된 유전자를 분석하고 유전자 서열을 기준으로 하여 분자 계통발생도를 제조함으로써 HNT22의 인자형을 조사하였다.
본 발명자들은 실시예 3에 기재된 방법에 의해 HNT22 유전자의 존재 여부를 알아보기 위하여 일본인, 미국인 및 프랑스인을 조사하였고, 그 결과, 199명의 양성 사례(일본인 187명, 미국인 8명, 프랑스인 4명)를 수득하였다. 이들 양성 사례의 증폭된 유전자를 실시예 1에 기재된 방법에 따라서 클로닝시키고, 각각에 대해 3개 이상의 클론에 대해 스크리닝하며, 시판용 소프트웨어를 사용하여 계통발생도를 제조한다(도 10, 서열은 도 11 내지 12에 제시되어 있다). 그 결과, HNT22 유전자를 서열 45 내지 54에 제시된 서열(서열 1의 nt1939-2160에 상응함)을 갖는 10가지 유형으로 분류하였다. 본 발명자들은 이들을 각각 인자형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 명명하였다.
실시예 13: 분리된 HNT22 바이러스 입자를 이용하는 면역침전에 의한 항-HNT22 항체 검출 방법
HNT22 입자를 실시예 11의 방법에 의해 분리 및 수집할 수 있는 것으로 입증되었다. 본 발명자들은 이러한 발견을 근거로 하여 면역침전에 의한 항체의 검출에 관해 연구하였다.
먼저, 혈액 내에 HNT22 유전자가 존재하는 것으로 밝혀진 HNT22 감염 환자로부터 배설물을 수집하고, 이를 적절한 용매에 현탁시켜 샘플을 제조하며, 실시예 3의 방법에 따라서 상기 배설물에 HNT22 유전자가 존재하는지를 검사한다. 그 결과, HNT22 유전자가 상기 배설물에 존재하며, 이들의 부력 밀도가 1.35g/㎤이며, 유전자 서열이 동일한 환자의 혈액으로부터 수득된 HNT22의 유전자 서열과 동일한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 배설물로부터 HNT22 입자를 수집하기로 결정하였다.
특정 환자로부터 수득된 배설물에 증류수를 가하여 15%(중량 농도) 현탁액을 제조한다. 냉동 원심분리형 분리기(Hitachi)를 사용하여 상기 현탁액을 3000rpm으로 30분 동안 원심분리시켜 상등액을 수득한다. 이러한 상등액을, 냉동 미소원심분리형 분리기(고속 마이크로 냉동 원심분리기, Tomy Seikou)를 사용하여 10000rpm으로 5분 동안 추가로 원심분리시킨다. 이 상등액을 HNT22 입자 현탁액으로서 수집한다. 이러한 입자 현탁액에 대한 DNA 역가는 105/ml이다.
상기 HNT22 입자 현탁액(10㎕)을 혈청 또는 혈장(50㎕)에 가하고, 37℃에서 24시간 동안 반응시킨다. 이 반응 후, 고우트 항-사람 IgG(50㎕, #46340, Cappel)을 이의 원액으로서 제2 항체로 가하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 이러한 반응 완료 후, 상기 혼합물을, 냉동 미소원심분리형 분리기(고속 마이크로 냉동 원심분리기, Tomy Seikou)를 사용하여 10000rpm으로 5분 동안 원심분리시켜 상등액과 침전물로 분리되도록 한다. 이 상등액을 분리형 에펜도르프 튜브에 옮기고, 시판되고 있는 핵산 추출용 키트(EX R&D, Sumitomo Metal)를 사용하여 DNA를 추출한다. 한편, 생리 식염수(110㎕)를 상기 침전물에 조심스럽게 가하고, 10000rpm으로 5분 동안 원심분리시킨다. 상등액을 경사 제거하고, 잔사를 적가된 생리 식염수(110㎕)에 현탁시킨다. 이 현탁액으로부터 상기와 동일한 방식으로 DNA를 추출한다. 수득된 DNA 분획을 증류수(20㎕)에 용해시키고, 95℃에서 5분 동안 처리한 다음, 수득된 용액의 절반 양을 HNT22 유전자 검출용 샘플로서 사용한다. HNT22 유전자의 검출은 실시예 3에서와 동일한 방식으로 수행한다. 동일한 혈청 또는 혈장을 HNT22 입자를 가하지 않으면서 동일한 방식으로 처리하고, 상기와 동일한 방식으로 처리된 HNT22에 대해 음성인 혈청 또는 혈장을 대조군으로서 사용한다.
그 결과, HNT22 유전자가 HNT22 유전자 양성 혈청 또는 혈장의 침전물 분획에서 발견된 반면, 상기 입자 현탁액이 가해지지 않았거나 HNT22 음성 혈청 또는 혈장이 사용된 경우에는, HNT22 유전자가 상기 침전물 분획에서 발견되지 않았다. 이들 결과로부터, HNT22 항체가 존재하는 경우에만 HNT22 입자가 이들 항체 및 항-사람 IgG 항체와 응집되어 침전물 분획을 형성하는 것으로 여겨지며, 이와 반대로, HNT 유전자가 이들 침전물 분획에 존재하는 경우에는 항-HNT 항체가 존재하는 것으로 간주된다.
실시예 14: HNT 입자 서열을 이용하는 항-HNT22 항체 검출 방법에 의한 수혈-후 간염 사례 및 돌발성 간 기능 저하 사례에서의 항-HNT22 항체 측정
본 발명자들은 실시예 13의 방법을 사용하여, 수혈 후에 HNT22에 의해 일시적으로 감염된 실시예 6에서 언급된 사례 4와, 공지된 간염 바이러스의 감염으로 인정되지 않은, 산발성의 돌발성 비-A-G형 간 기능 부전증이 회복되어 가는 사례를 대상으로 하여 항-HNT22 항체의 존재 또는 부재 여부를 검사하였다(표 4 및 6).
그 결과, 항-HNT22 항체가 양 사례에 대해 바이러스의 소멸 후에 나타났고, 바이러스성 감염에서 관찰된 중화 항체의 것과 유사한 출현과 소멸 패턴을 나타내는 것으로 입증되었다.
산발성의 돌발성 비-A-G 간 기능 부전증이 회복되어 가는 환자에 있어서의 HNT22 유전자 및 항-HNT22 항체의 출현 및 소멸
혈액수집(일) ALT(IU/L) HCV 항체 GBV-C/HGV RNA HNT22 유전자1번째 PCR 2번째 PCR HNT 항체
0 2568 - - + - -
2 523 - - + + NT
7 152 - - ++ + NT
18 28 - - + + NT
31 16 - - - + NT
38 9 - - - - +
NT: 시험 안함허가후 ALT HCV GBV-C/HGV혈액수집일 (IU/L) 항체 RNA
실시예 15: HNT22 유전자 아종의 검출 및 서열 분석
HNT22 바이러스에 대해 존재하는 다수의 인자형(실시예 12), 및 B형 및 C형 간염 바이러스와 같은 기타 바이러스가 인자형의 부위적 바이어스를 나타내는 것으로 입증되었기 때문에, 미국인의 주요 HNT22 인자형은 일본인의 주요 유형과 상이할 수 있다. 따라서, 미국인으로부터 수득된 HNT22 양성 샘플을 검사한다.
첨부된 샘플 제조 지시 사항에 따라서 시판용 핵산 추출용 키트(고순도 바이러스성 핵산 키트, Boehringer Mannheim)를 사용하여, 실시예 3에 기재된 방법에 의해 HNT22 바이러스 양성인 것으로 밝혀진 미국인으로부터의 각각의 혈청(각각 UM3-17, UM3-34, UM3-56 및 UM3-73으로 명명됨) 100㎕으로부터 핵산을 추출한다.
프라이머로서, HNT22 바이러스의 동정된 서열을 기준으로 하여 선별된 서열 55에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(NG055) 및 서열 8에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(NG063)을 사용하고, 주형으로서 상기 수득된 샘플을 사용하며 다음 조건에 따라서 PCR을 수행한다. 사용된 프라이머의 국재적 관계는 도 13에 제시되어 있다.
PCR 조건
(1) 반응 혼합물 조성
주형 핵산 용액 10㎕
10 x Ex. Taq 완충액 5㎕
2.5mM dNTP 4㎕
프라이머(NG055: 10 OD/ml) 1㎕(280nm에서의 OD,
동일하게 나중에 적용되어야 한다)
프라이머(NG063: 10 OD/ml) 1㎕
증류수 29.5㎕
Ex.Taq DNA 폴리머라제 1㎕
----------------------------------------------
총 50㎕
(2) 반응 조건
95℃ 2분
95℃ 45초 ┐
55℃ 30초 │ 35주기
72℃ 90초 ┘
72℃ 7분
그 결과, 샘플 모두에 대한 유전자 증폭을 획득한다. 다수의 증폭 단편을 각 샘플에 대해 실시예 1에서와 동일한 방식으로 T 벡터에 클로닝시키고, 유전자 서열을 결정한다. 그 결과, UM3-17 및 UM3-73으로부터, 이미 동정된 뉴클레오티드 서열과 높은 상동성을 나타내는 클론, 및 또한 이들 서열과 낮은 상동성을 나타내는 서열을 갖는 클론을 수득한다(각각 U17-2 및 U73-2로 지칭됨). 이들 양 서열은 지금까지 동정된 뉴클레오티드 서열의 상응하는 영역과 30%의 상동성을 나타낸다. UM3-56 및 UM3-34로부터, 이미 동정된 뉴클레오티드 서열과 높은 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열만이 수득되었다.
상기 수득된 U17-2 클론과 지금까지 동정된 HNT22 바이러스 간의 서열 비교와 고도로 보존된 영역의 선별을 기준으로 하여, 상기 클론의 5' 말단의 뉴클레오티드 서열을 추가로 증폭시키기 위하여 프라이머로서, 서열 56에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(NT01)를 제조한다. 프라이머로서, 상기 올리고뉴클레오티드 NT01과, 이미 동정된 HNT22 바이러스의 서열을 기준으로 하여 제조된 서열 57에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(NG054)를 사용하고, 주형으로서 UM3-17로부터 유도된 핵산을 사용하며 다음 조건에 따라서 PCR을 수행한다. 이로써 수득된 증폭 단편을 상기 언급된 바와 동일한 방식으로 서열 분석한다. 사용된 프라이머의 국재적 관계는 도 13에 제시되어 있다.
PCR 조건
(1) 반응 혼합물 조성
주형 핵산 용액 10㎕
10 x Ex. Taq 완충액 5㎕
2.5mM dNTP 4㎕
프라이머(NT01: 10 OD/ml) 1㎕
프라이머(NG054: 10 OD/ml) 1㎕
증류수 29.5㎕
Ex.Taq DNA 폴리머라제 1㎕
-----------------------------------------
총 50㎕
(2) 반응 조건
95℃ 2분
95℃ 45초 ┐
55℃ 30초 │ 35주기
72℃ 90초 ┘
72℃ 7분
한편, U17-2의 3' 말단 뉴클레오티드 서열과 이미 동정된 HNT22 바이러스의 서열을 기준으로 하여, 상기 클론의 3' 말단의 서열을 추가로 증폭시키기 위한 프라이머로서, 서열 58 및 59에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(각각 프라이머 NT03 및 NT04)를 제조하고; HNT22 바이러스의 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 근처의 이미 동정된 서열을 기준으로 하여, 증폭용 프라이머로서, 서열 60 및 61에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(각각 프라이머 NG065 및 NG021)를 제조한다. 먼저, NT03 및 NG065를 사용하여 3' 말단의 유전자를 증폭시키고, NT04 및 NG065 또는 NG021을 사용하여 상기 수득된 증폭 단편 일부를 증폭시킨다. 사용된 프라이머의 국재적 관계는 도 13에 제시되어 있다. 주형으로서 UM3-17로부터 유도된 핵산을 사용하여 다음 조건에 따라서 증폭을 수행한다. 증폭 단편의 뉴클레오티드 서열을 상기 언급된 바와 동일한 방식으로 결정한다.
PCR 조건
제1 단계 PCR
(1) 반응 혼합물 조성
주형 핵산 용액 10㎕
10 x Ex. Taq 완충액 5㎕
2.5mM dNTP 4㎕
프라이머(NG03: 10 OD/ml) 1㎕
프라이머(NG065: 10 OD/ml) 1㎕
증류수 29.5㎕
Ex.Taq DNA 폴리머라제 1㎕
-----------------------------------------
총 50㎕
(2) 반응 조건
95℃ 2분
95℃ 45초 ┐
55℃ 30초 │ 35주기
72℃ 90초 ┘
72℃ 7분
제2 단계 PCR
(1) 반응 혼합물 조성
주형 핵산 용액 5㎕
10 x Ex. Taq 완충액 5㎕
2.5mM dNTP 4㎕
프라이머(NT04: 10 OD/ml) 0.5㎕
프라이머(NG065: 10 OD/ml) 또는
프라이머(NG021: 10 OD/ml) 0.5㎕
증류수 34.5㎕
Ex.Taq DNA 폴리머라제 0.5㎕
----------------------------------------
총 50㎕
(2) 반응 조건
95℃ 2분
95℃ 45초 ┐
55℃ 30초 │ 20주기
72℃ 90초 ┘
72℃ 7분
상기 과정으로부터, (제2 단계 PCR에서의 프라이머가 NT04/NG065의 조합물인 경우) U17-2 및 2A-3의 5' 말단 서열로서 클론 1-1, 1-9 및 1-10을 수득하고, (제2 단계 PCR에서의 프라이머가 NT04/NG021의 조합물인 경우) 3' 말단 서열 클론으로서 2B-1 및 2B-3을 수득한다. 이들 클론의 뉴클레오티드 서열을 상기와 동일한 방식으로 결정하고, 연결하여 미국인으로부터 유도된 혈청으로부터 검출된 바이러스 유전자의 뉴클레오티드 서열(서열 62)을 수득한다.
이 서열을 HNT22 유전자의 뉴클레오티드 서열과 비교한 결과, 5' 말단과 3' 말단 서열에 대해 극도로 높은 상동성이 관찰될 수 있는 반면 다른 서열의 상동성은 약 30% 정도로 낮으며, 이러한 서열은 실시예 2 및 3의 검출 방법에 의해 검출될 수 없는 것으로 밝혀졌다. 이러한 유전자를 갖는 바이러스를 TUS01로 명명하였다.
상기 TUS01 유전자의 뉴클레오티드 서열을 대상으로 하여, 실시예 20에서와 동일한 방식으로 ORF에 대해 조사하였다. 그 결과, 2개의 ORF, 즉 ORF1: nt590-2872(761개 아미노산 잔기) 및 ORF2: nt258-nt725(156개 아미노산 잔기)가 존재하는 것으로 밝혀졌다(도 15). 이들은 HNT22 유전자의 뉴클레오티드 서열에서 ORF1 및 ORF2의 것에 상응하는 위치에 존재한다.
각 영역의 상동성이 표 7에 요약되어 있다.
HNT22 유전자와 TUS01 유전자의 상동성
HNT222) TUS01 서열 상동성
전체 길이 3739 nt 3722 nt 63.7%
5' 비해독 영역 262 nt 257 nt 90.3%
해독 영역 2636 nt 2615 nt 54.7%
ORF1 2310 nt 2283 nt 54.8%
(아미노산 서열) 770 aa 761 aa 37.0%
ORF21) 450 nt 468 nt 55.5%
(아미노산 서열) 150 aa 156 aa 38.8%
3' 비해독 영역 841 nt 850 nt 84.2%
1) ORF2의 경우, TUS01을 기준으로 하여 비교하기 위해,두 번째 ATG 코돈으로부터의 프레임을 HNT22에 이용한다.2) HNT22로서 사용된 서열은 TA278의 것이다.
고도로 상동성인 5' 비해독 영역(5' 말단 영역)과 3' 비해독 영역(3' 말단 영역)의 뉴클레오티드 서열 비교 결과가 도 15 및 16에 제시되어 있다.
공지된 서열과 TUS01 유전자의 뉴클레오티드 서열과의 상동성을 실시예 4에서와 동일한 방식으로 FAST 및 BLAST를 이용하여 결정하는 경우, 높은 상동성을 나타내는 것 모두는 HNT22 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.
상기 언급된 특징들로부터 판단하건대, TUS01 바이러스는 HNT22 바이러스의 아종인 것으로 추정된다.
실시예 16: HNT22 유전자와 TUS01 유전자의 동시 검출
실시예 2 및 3의 방법에 의해서는 검출될 수 없는 TUS01 유전자를 동시에 검출할 수 있는 방법이 연구되었다.
양 서열을 비교함으로써, 공통의 서열을 함유하고 PCR 프라이머로서 적합한 것으로 간주된 올리고뉴클레오티드로서, NG054 및 NG065을 선별한다. 실시예 2에 기재된 방법에 따라서 혈청(100㎕)으로부터 핵산을 추출한다. 이와 같이 추출된 핵산을 증류수(10㎕)에 용해시킨다. 이러한 용해된 핵산(10㎕)을, NG054 및 NG065(각각에 대해 1㎕, 10 OD/ml), 10배 농도의 Ex. Taq 완충액(5㎕, TaKaRa Shuzo), 2.5mM dNTP(4㎕) 및 증류수(29.5㎕)의 용액을 함유하는 PCR 전용 튜브에 가하고, 열안정성 DNA 폴리머라제(Ex. Taq 폴리머라제: TaKaRa Shuzo)을 즉시 가한 다음; 95℃에서 2분 동안 처리한 후, 95℃에서 45초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 7분 동안의 주기를 35회 반복하고, 최종적으로 72℃에서 7분 동안 반응시킴으로써 증폭시킨다. 이 증폭 생성물을 아가로즈 겔 전기영동시켜 분리하고, 뉴클레오티드 서열로부터 예상된 길이의 밴드 존재 여부를 확인한다. 밴드가 확인된 증폭 생성물을 서열 분석한다. 그 결과, HNT22 유전자와 TUS01 유전자가 상기 방법에 의해 동시에 검출될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 따라서, 지금까지 공지되지 않은, 원인이 불분명하였던 혈액-기인된 감염성 간염의 병인성 바이러스를 동정하였다. 이로써, 유전자 검정, 항원 검정 및 항체 검정 방법을 확립할 수 있고, 간염 시험용 키트 및 이의 예방용 백신을 제공할 수 있게 된다.

Claims (58)

  1. 프라이머로서서열 57에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열 60에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 이용하는 PCR, 또는 프라이머로서 서열 57에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열 61에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 이용하는 PCR에 의해 약 3500개 뉴클레오티드 내지 약 4000개 뉴클레오티드 길이의 서열이 증폭될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자.
  2. 제1항에 있어서, PCR에 의해 약 3600개 뉴클레오티드 내지 약 3900개 뉴클레오티드 길이의 서열이 증폭될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 바이러스 유전자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, PCR에 의해 증폭된 단편의 5' 말단 및 3' 말단에서의 뉴클레오티드 서열이 각각 서열 1에 제시된 뉴클레오티드 서열의 3 내지 300번 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 및 2402 내지 3739번 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열과 70% 이상의 상동성을 나타내는 바이러스 유전자.
  4. 제3항에 있어서, 상동성이 80% 이상인 바이러스 유전자.
  5. 프라이머로서 서열 6에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열 8에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 이용하는 PCR에 의해 약 200개 뉴클레오티드 내지 약 350개 뉴클레오티드 길이의 서열이 증폭될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자.
  6. 프라이머로서 서열 7에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열 8에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 이용하는 PCR에 의해 약 200개 뉴클레오티드 내지 약 350개 뉴클레오티드 길이의 서열이 증폭될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자.
  7. 서열 1에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자, 또는 이의 동종이인자형 변이체 유전자.
  8. 제5항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 서열 45에 제시된 뉴클레오티드 서열, 서열 46에 제시된 뉴클레오티드 서열, 서열 47에 제시된 뉴클레오티드 서열, 서열 48에 제시된 뉴클레오티드 서열, 서열 49에 제시된 뉴클레오티드 서열, 서열 50에 제시된 뉴클레오티드 서열, 서열 51에 제시된 뉴클레오티드 서열, 서열 52에 제시된 뉴클레오티드 서열, 서열 53에 제시된 뉴클레오티드 서열 및 서열 54에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 바이러스 유전자.
  9. 서열 1에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 정의된 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
  11. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 정의된 유전자에서 인식되고 이러한 유전자에 특이적인 뉴클레오티드 서열 또는 이러한 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  12. 제11항에 있어서, 서열 2에 제시된 뉴클레오티드 서열, 서열 3에 제시된 뉴클레오티드 서열, 서열 4에 제시된 뉴클레오티드 서열, 서열 5에 제시된 뉴클레오티드 서열, 서열 6에 제시된 뉴클레오티드 서열, 서열 7에 제시된 뉴클레오티드 서열 및 서열 8에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드.
  13. 프라이머로서 제11항에 정의된 바와 같은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 수행하는, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자의 검출 방법.
  14. 프라이머로서 서열 2에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열 3에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하거나, 또는 서열 4에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열 5에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 수행하는, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자의 검출 방법.
  15. 프라이머로서 서열 6에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열 8에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하거나, 또는 서열 7에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열 8에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 수행하는, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자의 검출 방법.
  16. 제14항 및 제15항에서 정의된 바와 같은 검출 방법 모두를 하나의 샘플에 대해 수행한 다음, 이러한 두 방법으로부터 수득된 결과를 비교하는, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 인자형들의 구별 방법.
  17. 제8항에 정의된 바와 같은 유전자에 존재하고 이러한 유전자의 인자형에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드를 사용하여 하이브리드화를 수행하는, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 인자형들의 구별 방법.
  18. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 정의된 유전자의 뉴클레오티드 서열에서 인식된 개방 판독 프레임 내에서 암호화된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
  19. 제18항에 있어서, 서열 1에 제시된 뉴클레오티드 서열에서 인식된 개방 판독 프레임에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
  20. 제18항에 있어서, 서열 9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
  21. 제18항에 있어서, 서열 10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
  22. 서열 9 또는 10의 아미노산 서열에서 인식되고 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스에 특이적인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  23. 제18항에 있어서, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스에 특이적인 에피토프를 함유하는 폴리펩티드.
  24. 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 입자의 밀도를 기준으로 하여 상기 간염 바이러스 입자를 분리시키는, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 입자의 분리 방법.
  25. 제24항에 정의된 바와 같은 방법에 의해 분리된 바이러스 입자.
  26. 제25항에 정의된 바와 같은 바이러스 입자로부터 수득된 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 펩티드.
  27. 서열 9 또는 10에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 재조합 유전자 발현 벡터.
  28. 서열 9 또는 10에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 함유하는 형질전환체 세포.
  29. 제28항에 정의된 바와 같은 형질전환체 세포에 의해 발현된 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 항원 펩티드 또는 이의 단편.
  30. 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 항원 펩티드를 발현시키는 조건하에서 제28항에 정의된 바와 같은 형질전환체 세포를 배양하고, 발현된 펩티드를 수집하는 것을 포함하는, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 항원 펩티드의 제조 방법.
  31. 항원으로서 제18항 내지 제23항 및 제26항 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 폴리펩티드 또는 제25항에 정의된 바와 같은 바이러스 입자를 사용하여, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 항체를 면역학적으로 검출하는 방법.
  32. 면역원으로서 제18항 내지 제23항 및 제26항 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 폴리펩티드 또는 제25항에 정의된 바와 같은 바이러스 입자를 사용하여 동물을 면역시키는 것을 포함하여, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스에 대한 항체를 생산하는 방법.
  33. 제32항에 정의된 바와 같은 방법에 의해 수득될 수 있는 항체.
  34. 제33항에 정의된 바와 같은 항체를 사용하여, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 항원을 면역학적으로 검출하는 방법.
  35. 서열 1에 제시된 뉴클레오티드 서열에 존재하는 개방 판독 프레임에 의해 암호화된 아미노산 서열 내에 함유된 아미노산 서열을 갖고 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 중화 항체의 에피토프 서열을 함유하는 폴리펩티드를 함유하는 백신.
  36. 제25항에 정의된 바와 같은 바이러스 입자를 함유하는 백신.
  37. 서열 62에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자 또는 이의 동종이인자형 변이체 유전자.
  38. 서열 62에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자.
  39. 제37항 또는 제38항에 정의된 바와 같은 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
  40. 제37항 또는 제38항에 정의된 바와 같은 유전자의 뉴클레오티드 서열에서 인식되고 이러한 유전자에 특이적인 뉴클레오티드 서열 또는 이에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  41. 제40항에 있어서, 서열 57에 제시된 뉴클레오티드 서열, 서열 60에 제시된 뉴클레오티드 서열 및 서열 61에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드.
  42. 프라이머로서 제41항에 정의된 바와 같은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 수행하는, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자의 검출 방법.
  43. 프라이머로서 서열 57에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열 60에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하거나, 서열 57에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 서열 61에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 수행하는, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 유전자의 검출 방법.
  44. 제37항 또는 제38항에 정의된 바와 같은 유전자의 뉴클레오티드 서열에서 인식된 개방 판독 프레임 내에서 암호화된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
  45. 제44항에 있어서, 서열 62에 제시된 뉴클레오티드 서열에서 인식된 개방 판독 프레임에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
  46. 제44항에 있어서, 서열 63에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
  47. 제44항에 있어서, 서열 64에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
  48. 서열 63 또는 64의 아미노산 서열에서 인식되고 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스에 특이적인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  49. 제44항에 있어서, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스에 특이적인 에피토프를 함유하는 폴리펩티드.
  50. 서열 63 또는 64에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 재조합 유전자 발현 벡터.
  51. 서열 63 또는 64에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 함유하는 형질전환체 세포.
  52. 제51항에 정의된 바와 같은 형질전환체 세포에 의해 발현된 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 항원 펩티드 또는 이의 단편.
  53. 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 항원 펩티드를 발현시키는 조건하에서 제51항에 정의된 바와 같은 형질전환체 세포를 배양하고, 발현된 펩티드를 수집하는 것을 포함하는, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 항원 펩티드의 제조 방법.
  54. 항원으로서 제44항 내지 제49항 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 폴리펩티드를 사용하여, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 항체를 면역학적으로 검출하는 방법.
  55. 면역원으로서 제44항 내지 제49항 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 폴리펩티드를 사용하여 동물을 면역시키는 것을 포함하여, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스에 대한 항체를 생산하는 방법.
  56. 제55항에 정의된 바와 같은 방법에 의해 수득될 수 있는 항체.
  57. 제56항에 정의된 바와 같은 항체를 사용하여, 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 항원을 면역학적으로 검출하는 방법.
  58. 서열 62에 제시된 뉴클레오티드 서열에 존재하는 개방 판독 프레임에 의해 암호화된 아미노산 서열 내에 함유된 아미노산 서열을 갖고 비-B형, 비-C형, 비-G형 간염 바이러스 중화 항체의 에피토프 서열을 함유하는 폴리펩티드를 함유하는 백신.
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