BG60348B2 - Nаnв диагностика: полинуклеотиди, приложими за скрининг на вируса на хепатит с - Google Patents
Nаnв диагностика: полинуклеотиди, приложими за скрининг на вируса на хепатит с Download PDFInfo
- Publication number
- BG60348B2 BG60348B2 BG095495A BG9549591A BG60348B2 BG 60348 B2 BG60348 B2 BG 60348B2 BG 095495 A BG095495 A BG 095495A BG 9549591 A BG9549591 A BG 9549591A BG 60348 B2 BG60348 B2 BG 60348B2
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- sequence
- hcv
- oligomer
- target
- cdna
- Prior art date
Links
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 84
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims abstract description 84
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 84
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title description 27
- 238000012216 screening Methods 0.000 title description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 32
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 232
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 189
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 177
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 175
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 134
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 105
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 97
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 66
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 63
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 57
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 53
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 53
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 50
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 50
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 23
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 22
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 22
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 21
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 5
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 abstract description 514
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 29
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 19
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 abstract description 19
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 abstract description 18
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 10
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 229
- 239000000047 product Substances 0.000 description 69
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 54
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 51
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 49
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 49
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 38
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 37
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 35
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 35
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 33
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 32
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 32
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 32
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 30
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 25
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 24
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 24
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 21
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 21
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 21
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 21
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 19
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 18
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 17
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 17
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 16
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 14
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 13
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 13
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 13
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 13
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 13
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 11
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 10
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 10
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 9
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 9
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 9
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 9
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101710128560 Initiator protein NS1 Proteins 0.000 description 8
- 101710144127 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 7
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 7
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 7
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 7
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 description 7
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 7
- 238000012317 liver biopsy Methods 0.000 description 7
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 6
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 101710136739 Teichoic acid poly(glycerol phosphate) polymerase Proteins 0.000 description 5
- -1 antibodies Proteins 0.000 description 5
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 5
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 5
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 5
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 4
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 4
- 208000003152 Yellow Fever Diseases 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 4
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 3
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 3
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 3
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 3
- 101710141795 Ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 description 3
- 229940122208 Ribonuclease inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 102100037968 Ribonuclease inhibitor Human genes 0.000 description 3
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 3
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 3
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 102100031024 CCR4-NOT transcription complex subunit 1 Human genes 0.000 description 2
- 101000919674 Caenorhabditis elegans CCR4-NOT transcription complex subunit let-711 Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 2
- 101000919672 Homo sapiens CCR4-NOT transcription complex subunit 1 Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 2
- 241000282376 Panthera tigris Species 0.000 description 2
- 102000015623 Polynucleotide Adenylyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010024055 Polynucleotide adenylyltransferase Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 2
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 2
- ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N psoralen Chemical compound C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OC=C2 ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- HFKVKGYQGDZBTJ-UHFFFAOYSA-N 3-[4-[[bis[(1-tert-butyltriazol-4-yl)methyl]amino]methyl]triazol-1-yl]propan-1-ol Chemical compound N1=NN(C(C)(C)C)C=C1CN(CC=1N=NN(C=1)C(C)(C)C)CC1=CN(CCCO)N=N1 HFKVKGYQGDZBTJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 4',5'-Dihydropsoralen Natural products C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OCC2 VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000208140 Acer Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- AUIJUTGLPVHIRT-FXQIFTODSA-N Arg-Ser-Cys Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)CN=C(N)N AUIJUTGLPVHIRT-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCMYYKRYFNMIEC-UHFFFAOYSA-N COP(O)=O Chemical class COP(O)=O QCMYYKRYFNMIEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 1
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 1
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 1
- 241000710827 Dengue virus 1 Species 0.000 description 1
- 240000006497 Dianthus caryophyllus Species 0.000 description 1
- 235000009355 Dianthus caryophyllus Nutrition 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 1
- PYFIQROSWQERAS-LBPRGKRZSA-N Gly-Trp-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 PYFIQROSWQERAS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000003729 Neprilysin Human genes 0.000 description 1
- 108090000028 Neprilysin Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000710778 Pestivirus Species 0.000 description 1
- JEBWZLWTRPZQRX-QWRGUYRKSA-N Phe-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O JEBWZLWTRPZQRX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101800000684 Ribonuclease H Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- SPUUKOIOZNVGHK-UHFFFAOYSA-N SSSSSSSSSSSSSSS Chemical compound SSSSSSSSSSSSSSS SPUUKOIOZNVGHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000277331 Salmonidae Species 0.000 description 1
- 108091027568 Single-stranded nucleotide Proteins 0.000 description 1
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 description 1
- ODMZDQKUHYGKKN-UHFFFAOYSA-N TCA C Natural products CC(CCCC(C)C1=CCC2(C)OC3=C(CC12)C(=O)C(O)CC3)C(=O)O ODMZDQKUHYGKKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000000061 acid fraction Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 231100000354 acute hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004657 carbamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- VOAXAOULFRTTAM-UHFFFAOYSA-N chloroform phenol Chemical compound C1(=CC=CC=C1)O.C(Cl)(Cl)Cl.C1(=CC=CC=C1)O.C1(=CC=CC=C1)O VOAXAOULFRTTAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 230000002153 concerted effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- MCQILDHFZKTBOD-UHFFFAOYSA-N diethoxy-hydroxy-imino-$l^{5}-phosphane Chemical compound CCOP(N)(=O)OCC MCQILDHFZKTBOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N dithiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003949 imides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000011147 magnesium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000002445 nipple Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000000041 non-steroidal anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- XEBWQGVWTUSTLN-UHFFFAOYSA-M phenylmercury acetate Chemical compound CC(=O)O[Hg]C1=CC=CC=C1 XEBWQGVWTUSTLN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 239000012985 polymerization agent Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- MCJGNVYPOGVAJF-UHFFFAOYSA-N quinolin-8-ol Chemical compound C1=CN=C2C(O)=CC=CC2=C1 MCJGNVYPOGVAJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMXUWOKSQNHOCA-UKTHLTGXSA-N ranitidine Chemical compound [O-][N+](=O)\C=C(/NC)NCCSCC1=CC=C(CN(C)C)O1 VMXUWOKSQNHOCA-UKTHLTGXSA-N 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 102220284308 rs1555738085 Human genes 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000006490 viral transcription Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
- C12Q1/707—Specific hybridization probes for hepatitis non-A, non-B Hepatitis, excluding hepatitis D
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретението се отнася до нов вид вирус на болестта хепатит с, който е доказан като главен етиологичен агент на породен в кръвта nаnв хепатит. Предлагат се реактиви за изолиране, размножаване и установяване на нсv полинуклеотиди. Реактивите са олигомери, съставени от полинуклеотидни последователности, способни да образуват хибридни структури в нсv мишенни нуклеотидни последователности.
Description
Изобретението се отнася до материали и методи за регулиране разпространението на нито А, нито В хепатитни вирусни инфекция. По-специално, то се отнася до етиологичен агент на нито А, нито В хепатит /NANBH/, до хепатит С вирус /HCV/ и до полинуклеотиди и техни аналози, които са приложими в изследванията за откриване па HCV в биологични проби.
Нито А, нито В хепатита /NANBH/ е трансмисивно заболяване или семейство от заболявания, за които се счита, че са вирусноиндуцирани и които са ясно отличими от други форми на вирусно-асоциирани чернодробни заболявания, включително тези, причинени от познати хепатитни вируси A /HAV/, хепатит В вирус /HBV/ ибхепатиген вирус /HDV/, а така сьщр и хепатита, причинен от цитомегаловируса /CMV/ или вируса на Епщайн-Бар /EBV/. За първи път NANBH е установен у индивиди, на които е осъществено кръвопреливане. Последващите експерименти на трансмисия на шимпанзе от човек със серия от пасажи в шимпанзетата, показват, че NANBH се дължи на трансмисивен агент или агенти.
Епидемиологичните данни доказват, ме са налице три типа на NANBH: епидемиологичен тип от воден произход, кръвен или иглест асоциативен тип и спорагично проявяващ се /придобит при общуване/ тип. Но независимо от това, голям брой от агентите, които могат да са причина на NANBH, са непознати.
Известни са много кандидат NANBH вируси. Например в обзора на Prince /1983/, Feinstone и Hoofnagle /1984/ и Overby /1985, 1986, 1987/ и статиите на Iwarson /1987/. Няма доказателство, че който и да е от тези кандидати представя етиологичния агент на NANBH.
Откриването на чувствителни, специфични методи за скриниране и идентифициране на носители на NANBV и NANBV контаминирана кръв и кръвни продукти е от особено значение. Посттрансфузивен /т.е. след осъществяване на кръвопреливане /хепатит/РТН/ се проявява у приблизително 10% от пациентите, на които се е наложило кръвопреливане, като NANBH достига до 90% от тези случаи. Големият проблем в това заболяване е честотата на прогресиране на заболяването към хронично чернодробно увреждане /25-55%/.
Грижата за пациента, както и предотвратяването на трансмисията на NANBH чрез кръв и кръвни продукти или чрез тесен контакт на персонала, изисква надеждно скриниране, диагностика и прогностика посредством средства, способни да открият нуклеинови киселини, антигени и антитела, свързани с NANBV.
Методите за откриване на специфични полинуклеотиди посредством хибридизация са известни в конкретната област на науката. Например в Mattews и Kricka /1988/, Analytical Biochemistry 169:1, Landergren et al. /1988/, Science 242:229, и Mittlin /1989/, Clinical chem.35:1819. US патент № 4868105, изд.септ.9, 1989, и EPO Publ. № 225807 /публикувано на 16 юни 1987/.
Заявителят е открил нов вирус хепатит С вирус /HCV/, който е главният етиологичен агент за NANBH от кръвен произход /ВВNANBH/. Началната работа на заявителя, включваща частично геномно съгласуване на прототипния HCV изолат, СДС/HCVl, /наречен също HCV1, е описана в ЕРО публикация № 318216 /публ. на 31 май 1989/ и РСТ публикация, № WO 89/04669 /публикувана на 1 юни 1989/. Разкритото в тези патентни описания, както и което и да е съответно национално описание на патента, е включено подолу като литературна справка. Тези описания разкриват рекомбинантни ДНК методи за клониране на HCV последователности, HCV диагностични техники, анти HCV антитела и методи за изолиране на нови HCV последователности.
Настоящото изобретение се основана на HCV последователности, описани в РСТ публикации № WO 89/04669, както и на други HCV последователности, разкрити в цитираните по-горе описания. Методи за изолиране и/или откриване на аспецифични полинуклеотиди посредством хибридизиране не са могли да бъдат използвани за скрининг на HCV, докато заявителят не е открил HCV. Един от аспектите на изобретението е олигомер, способен да се хибридизира към HCV последователност към аналитична полинуклеотидна верига, където олигомерът е включен в HCV мишенна последователност, комплементарна на най-малко 4 прилежащи :1уклеотида от HCV сДНК, показана на фиг. 18.
Друг аспект на изобретението е метод за откриване на HCV последователност з аналитична верига, за която се предполага, че съдържа HCV полинуклеотид, където HCV полинуклеотида включва подбрана област, служеща за мишена, като цялостният процес включва:
а/ обезпечаване на олигомер, способен да хибридизира с HCV последователност в една аналитична полинуклеотидна верига, където олигомерът е включен в насочена към мишена последователност, комплементарна на наймалко 4 сДНК, показани на фиг. 18.
в/ инкубиране на аналитичната верига с олигомера от точка а, което позволява получаването на специфични хибридни дуплекси между насочената към мишената последователност и самата мишена.
с/ откриване на хибриди, формирани между мишенната област, и ако има, и олигомера.
Друг аспект на изобретението е метод за получаване на кръв, свободна от HCV, който включва:
а/ осигуряване на аналитични нуклеинови киселини от проби, за които се счита, че съдържат HCV мишенна последователност, в/ обезпечаване на олигомер, способен на хибридизация с HCV последователност в аналитична полинуклеотидна верига, ако има такава, където олигомерът е включен в HCV насочена към мишената последователност, комплементарна на последователност от наймалко 8 нуклеотида, представени в съхранена HCV нуклеотидна последователност в HCV РНК, с/ взаимодействие на описаното в точки а, с, в при условия, които позволяват формиране на полинуклеотиден дуплекс между насочената към мишената последователност и мишената, ако има такива, d/ откриване на дуплекс, формиран в т. с, ако има такова, е/ съхраняване на кръвта, в която такива комплекси не са установени в т. d.
Кратко описание на чертежите
Фигура 1 показва последователността от HCV сДНК в клона 12f и аминокиселините, кодирани в нея;
Фигура 2 показва HCV сДНК последователността в клона к9-1 и аминокиселините, кодирани в нея;
Фигура 3 показва последователността на клон 14 е и аминокиселините, кодирани в нея;
Фигура 4 показва нуклеотидната последователност на HCV сДНК в клон 13i, аминокиселините, кодирани в нея, и последователностите, съвпадащи /припокриващи се/ с клон 12f;
Фигура 5 показва нуклеотидната последователност на HCV сДНК в клон 26j, аминокиселините, кодирани в нея, и последователностите, припокриващи се в клон 13i;
Фигура 6 показва нуклеотидната последователност на HCV сДНК в клон СА59а, аминокиселините, кодирани в нея, и последователностите, които се припокриват с клонове 26j и К9-1;
Фигура 7 показва нуклеотидната последователност на HCV сДНК в клона СА84а, аминокиселините, кодирани в нея, и последователностите, които се припокриват с клон СА59 а;
Фигура 8 показва нуклеотидната последователност на HCV сДНК н клон СА156е, аминокиселините, кодирани в нея, както и последователностите, припокриващи се с СА84а;
Фигура 9 показва нуклеотидната последователност на HCV сДНК в клон СА167в, аминокиселините, кодирани в нея, и последователностите, припокриващи се с СА156е.
Фигура 10 показва нуклеотидната последователност на HCV сДНК в клон СА126в, аминокиселините, кодирани в нея и припокриването с клон СА167в.
Фигура 11 показва нуклеотидната последователност на HCV сДНК в клона СА290а, аминокиселините, кодирани в нея, и припокриването с СА216а.
Фигура 12 показва нуклеотидната последователност на HCV сДНК в клона ag30a и припокриването с клон СА290а.
Фигура 13 показва аминокиселинната последователност на HCV сДНК в клон СА205а, и припокриването с HCV сДНК последователността в клон СА290а.
Фигура 14 показва нуклеотидната последователност на HCV сДНК в клон 18g и припокриването с HCV сДНК последователността в клона ag30a.
Фигура 15. показва нуклеотидната последователност на HCV сДНК в клон 16jh, аминокиселините, кодирани в нея, и припокриването на нуклеотидите с HCV сДНК последователността в клон 15е.
Фигура 16 показва нуклеотидната последователност на HCV сДНК в блок 6к, аминокиселините, кодирани в нея, и припокриването на нуклеотидите с HCV сДНК в клон 16jh.
Фигура 17 показва нуклеотидната последователност на HCV сДНК в клон pl31jh, аминокиселините, кодирани в нея, и припокриването на нуклеотидите с HCV сДНК в клон 6к.
Фигура 18 показва сумарната НСV сДНК последователност, получена от клоновете, описани тук, и от сумарната HCV сДНК последователност, представена в ЕРО публикация № 318216. Клоновете, от ксито са получавани последователностите, са: 5'-клон32, в114а, ISg, ag30a, СА290а, СА216а, pl 14а, СА167Ь, СА156е, СА84а, СА59а, К9-1 /наричан също k9-lf, 26j, 13i, 12f, 14i, lib, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, 15e, b5e, 16jh, 6k, и pl31jh. Във фигурата трите хоризонтални черти над последователността показват позицията на предполагаемия инициаторен метионинов кодон. На фигурата е показана и аминокиселинната последователност на предполагаемия полипротеин, кодиран в HCV сДНК. Хетерогенността в клонираните ДНК на HCV( са означени чрез отбелязване на аминокиселините над предполагаемите кодирани последователности от големия ORF, кръглите скоби показват, че хетерогенността е открита при или близо до 5’ или 3' края от HCV сДНК в клона.
Фигура 19 показва последователността на добива и белязаните проби за откриване на HCV РНК в биологичните проби.
Фигура 20 показва схематично подравняване на флавивирусен полипротеин и предполагаем HCV полипротеин, кодиран в голямия ORF от HCF генома. Освен това на фигурата са показани възможните функции на флавивирусните полипептиди, отцепени от флавивирусния полипротеин. В допълнение, съответното поставяне на HCV полипептидите, NANBj и С100, по отношение на предполагаемия HCV полипротеин, също е отбелязано;
Фигура 22 показва двойноверижната нуклеотидна последователност от HCV с ДНК инсерта в клон 81 и вероятната аминокиселинна последователност от полипептида, кодиран тук.
Фигура 23 показва HCV с ДНК после дователността в клон 36, чийто сегмент препокрива NANBV с ДНК от клона 81 и полипептидната последователност, кодирана вътре в клон 36.
Фигура 24 показва HCV сДНК последователността в клон 37в, сегмента, който припокрива клон 35 и полипептида, който е кодиран е него.
Фигура 25 показва авторадиографиите на HCV cPCR проби на РНК от чернодробни проби на шимпанзе с NANBH /фиг. 25/ и италиански пациенти с NANBH /фиг. 25В/.
Фигура 26А и 26В са графиките, показващите временните взаимоотношения между проявленията на чернодробни увреждания, присъствието на HCV РНК и присъствието на анти HCV антитела за две шимпанзета с NANBH.
Фигура 27 показва нуклеотидната последователност на HCV сДНК в клон СА84а, аминокиселините, кодирани тук, и последователностите, които се припокриват с клон СА59а.
Фигура 28 показва HCV сДНК последователността в клон 40в, сегмента, който припокрива клон 37а, и полипептида, кодиран тук.
Фигура 29 е авторадиография, показваща белязан амплифициран продукт на приблизително 300, 30 и 3 С1Д от HCV геномите.
Фигура 32 показва нуклеотидната последователност на HCV сНДК в клона 40 а.
Фигура 33 е авторадиография, показваща амплифицирани продукти, разширени от праймерите, получени от съхранени области на HCV генома.
Фигура 34 показва HCV с ДНК последователността в клон 35, сегмента, който се припокрива с клон 36 и полипептида, кодиран в него.
Фигура 37 е диаграма, показваща взаимоотношенията на проби и праймери, получени от 5' - областта на HCV РНК, от която HCV сДНК в клоновете ag30 и к9-1 са получени.
Фигура 38 е авторадиография на амплификационни продукти, разширени от местата на праймерите, получени от ag30a и к9-1.
Фигура 39 показва подравнената нуклеотидна последователност на човешки изолати 23 и 27 и НСУ1.Хомоложните последователности са означени със символа /♦/. Нехомоложните последователности са с мал4 ки букви.
Фигура 40 показва подравнените аминокиселинни последователности на човешки изолати 23 и 27 и на HCVl-Хомоложните последователности са означени със символа /*/. Нехомоложните последователности са означени с малки букви.
Фигура 41 показва репродукция с половин тон на авторадиография на Northern блот на РНК,изолирана от черен дроб на ВВNANBV инфектирано шимпанзе, апробирано с BB-NANBV сДНК от клон 81.
Фиг. 43 показва полурепродукция на авторадиография на нуклеинови киселини, екстрахирани от NANBV частички, уловени от инфектирана плазма с анти ΝΑΝΒ3 ( ,, и апробирана с 32Р-белязана NANBV сДНК от клон 81.
Φππν,ά 44 показва репродукции на авторадиографии на филтри, съдържащи изолирани IIAI1BV нуклеинови киселини, апробирани с 32Р-белязана плюсова и минусова верижна ДНК, получена от NANBV сДНК в клон 81.
Фигура 46 показва съгласувана нуклеотидна последователност на изолат от човек23, вариантни последователности са показани под линията на последователността. Аминокиселините, кодирани в съгласуваната последователност, също са показани.
Фигура 47 показва съгласуваната нуклеотидна последователност на човешки изолат 27, вариантни последователности са показани под линията на последователността. Аминокиселините, кодирани в съгласуваната последователност, също са показани.
Фигура 48 е графика, показваща взаимоотношението на EnvL и EnvR праймерите спрямо моделен флавивирусен полипротеин и предполагаем HCV полипротеин.
Фигура 49 показва сравнение между съставена и подравнена нуклеотидна последователност от изолати Thom, ЕС1, НСТ 18 и HCV1.
Фигура50 показва сравнение на нуклеотидната последователност от ЕС 10 и композиция от HCV1 последователността, ЕС 10 последователността е на линията над пунктира, и НСVI последователността е на линията под пунктира.
Фигура 51 показва сравнението на аминокиселините последователности 117-308 / сродни на HCV1 /, кодирани в EnvL областите от съгласуваните последователности от чо вешки изолати НСТ18, JH23, JH27 Thome,ЕС! и от HCV,.
Фигура 52 показва сравнение на аминокиселинните последователности 330-360 /сродни на HCV!/,кодирани в EnvR области от съгласуваните последователности от човешки изолати НСТ18, JH23, JH23, Thorne,ЕС1 и HCV1.
Фигура 53 показва нуклеотидните последователности от индивидуалните праймери в праймерна смес 5'-3.
Терминът “ хепатит С вирус “ / HCV / е бил запазен от специалистите в областта за непознат етиологичен агент на ΝΑΝΒΗ.ΠροτοτΗΓΠ,τ е изолиран от HCV и е идентифициран в NSSN 122 714 / виж също ЕРО публикация № 318 216/. Термитът HCV също така включва нови изолати от същите вирусни видове. Като изключение от тази терминология, болестта, причинена от HCV, формално наричана ΝΑΝΒ хепатит от кръвен произход / ΒΒ-ΝΑΝΒΗ /, се нарича хепатит С. Термините ΝΑΝΒ Н и хепатит С могат да бъдат използвани взаимозаменяемо в случая.
HCV е вирусен вид, чийто патогенен щам причинява ΒΒ-ΝΑΝΒΗ. Такива могат да са и атенюирани щамове или дефективни влияещи частички, получени от тях. Както е показано по-долу, HCV генома е обхванат от РНК. Известно е, че РНК, съдържаща вируси, притежава сравнително високи степени на спонтанни мутации, т.е. от порядъка на 10 ’ до КГ* за инкорпориран нуклеотид / Field Knipe / 1986 /. Поради това, доколкото хетерогенността и флуидността на генатипа са присъщи за РНК вирусите, налице са мултиплени щамове/ изолати, които могат да са вирулентни или авирулентни, в рамките на HCV вида. Съставите и методите, описани в това изобретение, предвиждат размножаване, идентифициране, откриване и изолиране на вирусните HCV щамове или изолати.
Идентифицирани са няколко различни щамове/ изолати на HCV/виж по-долу/.Един такъв щам или изолат, който е прототип, е означен като СДС/HCVj / наречен също и НС V1. Информация за един щам или изолат, като например частична геномна последователност, е достатъчна да позволи на специалиста в областта, използващ стандартни техники да изолира нов щам/или изолат и да установи дали такъв щам или изолат е HCV.
Като пример по-нататък са описани няколко различни щама/изолата.Тези щамове, които са получени от различни човешки серуми / и от различни географски райони /, са изолирани като е използвана информацията за геномна последователност на HCVr
С помощта на техниките, описани в ЕРО публикация № 318 216 и по-нататък,геномната структура и нуклеотидната последователност на HCV( геномна РНК е логично изведена.Оказва се, че генома е едноверижна РНК, съдържаща приблизително 10 000 нуклеотида.Геномът е позитивно верижен и има непрекъсната отворена четяща рамка / ORF /, която кодира полипротеин от около 3000 аминокиселини.В ORF структурния протеин/ни/ очевидно са кодирани в приблизително първата четвъртина на N-крайния регион, с преобладаване на полипротеин, отговорен за неструктурните протеини. В сравнение с всички познати вирусни последователности, малко, но значителни ко-линеарни хомолсзи са наблюдавани с неструктурните протеини от семейството на флавивирусите, и с пестивирусите/като сега също се счита, че са част от семейството на флавивирусите/.
Схематичното подравняване на възможни региони от флавивирусният полипротеин /с помощта на вируса на жълтата треска като пример/ и от предполагаемия полипротеин, кодиран в повечето ORF от HCV генома, е показан на фиг.20. На фигурата са посочени възможните области на полипротеина. Флавивирусният полипротеин съдържа, от аминокрая към карбоксикрая нуклеокапсидиия протеин /С/,метричния протеин /М/, повърхностния протеин /Е/ и неструктурните протеини /NS/ 1,2 / а+в /, 3,4 / а+в / и 5. На базата на предполагаемата аминокиселинна последователност, кодирана в нуклеотидната последователност на HCV1, малък регион при екстремния N-край от HCV полипротеина се явява сходен както по дължина, така и по високо съдържание на остатъците от бази с нуклеокапсидиия полипротеин /С/, установен при N-края на флавивирусните полипротеини.Несгруктурните протеини 2, 3, 4, и 5 / NS 2-5 / от HCV и от вируса на жълтата треска / YFV/ очевидно притежава броими части с аналогичен размер и хидропатогенност, макар че е на лице дивергенция на аминокиселинните последователности. Независимо от това, областта от HCV,ко ято би кореспондирала на областите от YFV полипротеин, който съдържа М,Еи NSt протеин не само се отличава по последователноста, но също така явно е твърде различна едновременно по размер и по хидропатогенност.Докато същински области от HCV генома могат да бъдат отнесени например към NS1, или NS2, следва да се знае, че тези означения са предполагаеми, може би налице са значителни различия между HCV семейството и флавивирусите, които са предпочитани.
Различни щамове, изолати или подтипове от НСV се очаква да съдържат варианти на аминокиселините и нуклеиновите киселини в сравнение с HCVr Много изолати се очаква да покажат повече / не повече от 40% / хомология в общото количество аминокиселинна последователност в сравнение с НСУгМоже да се установи, че има други, по-малко хомоложни HCV изолати.Те биха били определени като HCV в съответствие с различни критерии, например ORF с приблизително 9000 нуклеотида до около 12000 нуклеотида, кодиращи полипротеин, сходен по размер с този на HCV1, кодиран полипротеин с аналогични хидрофобни и/или антигенни характеристики с тези на НСVI и присъствието на колинеарни пептидни последователности, които се съхраняват с HCV. В допълнение, счита се, че геномът би бил позитивно-верижна РНК.
Всички HCV изолати кодират поне един епитоп, който може да бъде имунологично / например с кръстосани имунологични реакции/ с епитоп, кодиран в HCV сДНКи, описани тук. За предпочитане, епитопът се съдържа в аминокиселинната последователност, описана тук и е уникална на HCV, когато се сравнява с известни от преди патогени. Уникалността на епитопа може да бъде детерминирана по неговата имунологична реактивност с анти-HCV антитела и отсъствието на имунологична реактивност с антитела от познати патогени.
HCV щамовете и изолатите са еволюционно свързани.Поради това се очаква, че хомологията на генома на нуклеотидно ниво може да е около 40% или повече, вероятно ще бъде около 50% или повече,вероятно 60% или повече и дори по-вероятно около 80% или повече, и в допълнение, че ще има кореспондиращи прилежащи последователности от около най-малко 13 нуклеотида.Следва да се отбележи, както е показано по-нататьк, че са налице вариабилни и хипервариабилни области в рамките на HCV генома.Поради това хомоложността на тези региони се очаква да бъде значително по-малка от тази в целия геном.Съответствието между предполагаемата HCV щамова геномна последователност и, например СДС/HCVl сДНК последователността, може да бъде детерминирана чрез иззестни в областта на техниката методики. Например, те могат да бъдат определени чрез пряко сравнение на секвенционната информация от полинуклеотида HCV и HCV сДНК последователности, описани тук.Те могат също така да бъдат определени чрез хибридизация на полинуклеотидите при условия, които формират стабилни дуплекси между хомоложните региони /например онези, които биха били използвани преди до S1 разграждането/, последвано от разграждането с едноверижни специфични нуклеази, последвано от определяне на размера на разградените фрагменти
Поради еволюционната връзка на щамовете или изолатите на HCV предполагаемите HCV щамове или изолати е възможно да бъдат идентифицирани чрез тяхната хомоложност на ниво полипептиди.Най-общо, HCV щамовете или изолатите се очаква да бъдат поне 40% хомоложни, повече от около 50% хомоложни, вероятно повече от около 70% и дори по-вероятно от около 80% хомоложни, и някои могат да бъдат дори повече от 90% хомоложни на полипептидно ниво.Техниките за определяне на аминокиселинната секвенционна хомология са познати в областта.Например, аминокиселинната последователност може да бъде определена директно и сравнена с последователностите, осигурени тук.Обратно, нуклеотидната последователност на геномния материал от предполагаемия HCV може да бъде определена / обикновено чрез сДНК посредничество/ може да бъде определена предполагаемата кодирана аминокиселинна последователност, и съответните региони да бъдат сравнени.
Както е употребено тук, полинуклеотид, “получен от“ обозначена последователност, се отнася до полинуклеотидна последователност, която е обхваната от последователност с приблизително 6 нуклеотида, за предпочитане поне 8 нуклеотида, а още по-предпочитано поне около 10-12 нуклеотида, и дори по-предпочи тано 15-20 нуклеотида, съответстващи на региона от обозначената нуклеотидна последователност.” Съответстващи “ означава хомология с или комплементарност с обозначената последователност.За предпочитане последователността от региона, от който е получен полинуклеотидът, е хомоложен или комплементарен на последователността, която е уникална за HCV генома.За предпочитане получената последователност е хомоложна или комплементарна на последователността, която е уникална за всички или за повечето изолати.Дали последователността е или не е уникална за HCV генома, тя може да бъде определена с известни на специалистите в областта техники. Например последователността може да бъде сравнена с базата данни, напр. с Генна банка, за определяне дали присъства в неинфектиран гостоприемник или други организми.Последователност може също така да бъде сравнена с други вирусни агенти, включително онези, които са известни да индуцират хепатит, като HAV.HBV и НДУ и като членовете на семейство Флавивириде. Съответствието или несъответствието на получената последователност с други такива, може също да бъде определена чрез хибридизация при подходящи ограничителни условия.Хибридизационните техники за определяне комплементарността на последователностите на аминокиселините са известни в областта и са дискутирани по-долу. Освен това може да се види публикацията на Maniatis et al. /1982/. Отсъствието на съответстващи двойки полинуклеотиди, формирани при хибридизацията, може да бъдат определени по известни техники, включително разграждане с нуклеази като 1, която специфично разгражда едноверижни области в дуплексни полинуклеотиди. Областите, от които могат да бъдат получени типични ДНК последователности, включват, но не се ограничават до, например, области, кодиращи специфични епитопи, като нетранскрипционни и/или нетранслационни региони.
Полученият полинуклеотид е незадължително физически получен от нуклеотидната последователност, която е показана, но може да бъде генерирана по който и да е друг начин, включително, химическа синтеза или обратна транскрипция или транскрипция.В допълнение, комбинирането на области, кореспондиращи на тези от разградената последо7 вателност,може да бъде модифицирано по начин, известен за нивото на техниката с оглед очакваната употреба.
Терминът “рекомбинантен г.олинуклеотид”, както е употребен тук, е з смисъл на полинуклеотид от геномна сДНК,чийто синтетичен или семисинтетичен произход се дължи на произхода или на специални манипулации : 1/ не е асоцииран с всички или част от полинуклеотида, с който се асоциира в природата, 2/ присъединен е към полинуклеотид, различен от този, с който е свързан в природата, или 3/ не се среща в природата.
Терминът “ полинуклеотид “, както е използван тук, се отнася до полимерна форма на нуклеотиди с каквато и да е дължина, независимо дали са рибонуклеотиди или дезсксирибонуклеотиди.Този термин сг отнася само до първични структури на молекулата.Терминът включва двойно- и едноверижна ДНК и РНК. Той включва също и известни типове на модификация, например маркиране, по известен за областта начин, метилиране, “капсулиране”, замествания на един или повече нуклеотиди с аналог, интернуклеотидни модификация, например, онези с незаредени връзки /като метил фосфонати, фосфотриестери, фосфоамидати, карбамати и др.подобни/ и със заредени връзки/ като фосфоротиоати, фосфородитиоати и др./, онези, съдържащи очаквани количества от протеини/като нуклеази, токсини, антитела, сигнални пептиди, поли-1-лизин и др./,онези, които притежават интеркалатори /като акридин, псорален и др./, онези, съдържащи хелатори / като метали, радиоактивни метали, бор, оксидиращи метали и др./ онези, съдържащи алкилатори, онези с модифицирани връзки / като алфа аномерни нуклеинови киселини /, а така също и немодифицирани форми на полинуклеотидите.
Според изобретението “ смислова верига” на нуклеинова киселина съдържа последователността, която притежава секвенционна хомоложност с тази на мРНК. “Ангисмисловата верига” съдържа последователност, която е комплементарна на онази от “смисловата верига”.
Както е употребено в текста на описанието, “позитивно верижен геном” на зируса е този, в който генома, независимо РНК или ДНК е едноверижен, и който кодира вирусен полипептид /и/. Пример за позитивно верижни РНК вируси са Тогавириде, Коронавириде,
Ретровириде, Пикорнавириде и Калицивириде. Тук могат да бъдат причислени и Флавириде, които формално се класифицират като Тогавириде./Виж Г1е10 Knlpe, 1986/.
Терминът “праймер”, както е употребен тук, се отнася до олигомер, който е способен да действа като пункт за иницииране синтезата на полинуклеотидната верига, когато е поставен при подходящи условия. Праймерът ще бъде напълно или съществено комплементарен на област от копирания полинуклеотид. Така, при условия на хибридизация праймерът ще се линеаризира към комплементарния регион от анализираната верига. При условията на добавяне на подходящи реагенти /като полимераза, нуклео фосфати и др.подобни/, праймерът се удължава от полимеризиращия агент за формиране на копие от аналитичната верига. Праймерът може да бъде едноверижен, или обратно, може да бъде частично или напълно двойноверижен.
Терминът “аналитичен полинуклеотид” или “аналитична верига” се отнася до едноили двуверижна молекула на нуклеинова киселина, която се очаква да съдържа мишенна последователност, и която може да присъства в биологична проба.
Както е употребено тук, терминът “олигомер” се отнася до праймери или проби.Терминът олигомер не включва размера на молекулата. Независимо от това, обикновено олигомерите не са по-големи от 1000 нуклеотида, а още по-характерно е, че те не са поголеми от 500 нуклеотида, дори не повече от 250 нуклеотида, те могат да бъдат не повече от 75 нуклеотида и също така могат да са не повече от 50 нуклеотида в дължина.
Както е употребено тук, терминът “проба” се отнася до структура, сравнена с полинуклеотид, който формира хибридна структура с мишенна структурна последователност, благодарение на комплементарността на поне една последователност в пробата с последователност в мишенната област.Полинуклеотидните региони от пробите могат да бъдат съставени от ДНК, и/или РНК, и/или синтетични нуклеотидни аналози.В пробите са включени “улавящи проби” и “белязани проби”. За предпочитане, пробата не съдържа последователност, комплементарна на последователностите, използвани да стартират полимеразната верижна реакция /PCR/.
Както е използван тук, терминът “мишенна област” се отнася до област от нуклеиновата киселина, която следва да бъде амплифицирана и /или открита.Терминът “мишенна последователност” се отнася до последователност, с която пробата или праймерът ще формират стабилен хибрид при желани условия.
Терминът “уловена проба”, както е използван тук, се отнася до полинуклеотид, включен в едноверижен полинуклеотид, присъединен към свързващ партньор.Едноверижният полинуклеотид е включен в насочена към мишената полинуклеотидна последователност, която е комплементарна на мишенна последователност в мишенна област за откриване в аналитичен полинуклеотид.Комплементарната област е със задоволителна дължина и комплементарност на мишенната област, така че да позволи на стабилен дуплекс да имобилизира аналитичния полинуклеотид към твърда повърхност /чрез свързващ партньор/.Свързващият партньор е специфичен за друг, втори свързващ партньор, а втория свързващ партньор може да бъде присъединен към повърхността на твърда основа, или може да бъде свързан индиректно чрез други структури или свързващи партньори към твърда повърхност.
Терминът “насочена към мишената полинуклеотидна последователност”, както е използван тук, се отнася до полинуклеотидна последователност, която е включена в полинуклеотиди, комплементарни на мишенната последователност.Последователиостта е със задоволителна дължина и комплементарност с мишенната последователност, за да формира дуплекс, който притежава задоволителна стабилност за необходимите цели.
Терминът “свързващ партньор”, както е използван тук, се отнася до молекула, способна да свърже съответната молекула с висока специфичност,например един антиген и едно специфично антитяло.Най-общо, специфичното свързване на партньори се осъществява със задоволителен афинитет, за да имобилизира аналитичното копие/ комплементната верига на дуплекса/ в случай на уловена проба/ при условията на изолиране.В дадената област са известни специфични свързващи партньори, напр. биотин и авидин или стрептовидин, 1оС и протеин А, многобройни познати рецепторсвързващи двойки, и комплементарни полинук леотидни вериги.В случаите на комплементарни полинуклеотидни свързващи партньори, партньорите са обикновено поне 15 бази в дължина, и могат да са поне 40 бази в дължина^ допълнение, те могат да бъдат със съдържание на Gs и Cs от поне 40% и дори повече от около 60%.Полинуклеотидите могат да са съставени от РНК, ДНК или синтетични нуклеотидни аналози.
Терминът “двоен” / или “удвоен”/, както е използван тук, се отнася до атакуване с ковалентни връзки или със силно нековалентни взаимодействия, водородни връзки идр./Ковалентите връзки могат да са, например естери, етери, фосфоестери, амиди, пептиди, имиди, карбо-сулфатни връзки и други подобни.
Терминът “повърхност”/или”твърда опора”/ се отнася до твърда или полутвърда повърхност, към която може да бъде привързан /или закотвен/ желаният свързващ партньор/. Подходящи за целта са стъкло, пластмаса, метал, полимерни гелове и други, и могат да приемат формата на легла, кладенци, плътни пръчици, мембрани и др.
Терминът “маркиране” означава, че всеки атом или количество, което може да бъде използвано, за да обезпечи откриваем/за предпочитане количествено/ сигнал, и който може да бъде приложен към полинуклеотид или полипептид.
Както се използва в описанието, терминът “белязана проба” се отнася до олигомер, който е включен в насочена към мишената последователност, която е комплементарна на мишенната последователност, така че да бъде открита в анализирания полинуклеотид.Този комлементарен регион е със задоволителна дължина и комплементарност спрямо мишенната последователност, така че да позволи откриването чрез маркировката на “белязаната проба” и на “мишенната последователност”.Олигомерът е присъединен към маркиращия елемент или директно, или индиректно чрез мрежа от свързващи молекули с висока специфичност за всеки от тях.Мрежата от свързващи молекули с висока специфичност е описана по-долу и включва също така мултимери.
Терминът “мултимер”, както е използван тук, се отнася до линеарни или разклонени полимери от същата повторяема едноверижна полинуклеотидна единица или различни едноверижни полинуклеотидни единици.Поне ед9 на от единиците притежават последователност, дължина и състав, които им позволяват да се хибридизират специфично към първата желана едноверижна нуклеотидна последователност, обикновено аналитична, или пък олигомер, свързан към аналитичната.За постигане на такава специфичност и стабилност, тази единица нормално е около 15 нуклеотида в дължина, обикновено не повече от около 50 нуклеотида и за предпочитане-30 в дължина. Нещо повече, съдържанието на Gs и Cs нормално е поне около 40% и най-много-60%.В допълнение към такива единици, мултимерът включва множество от единици, които са способни на специфична хибридизация и стабилност на връзката с втори желан едноверижен нуклеотид, за предпочитане белязан полинуклеогид или друг мултимер.Тези единици са обикновено със същия размер и състав както споменатия по-горе мултимер.Когато мултимерът е създаден с оглед хибридизация към друг мултимер, първата и втора олигонуклеотидна единица са хетерогенни и не се хибридизират с други при условията на подбрана проба.Така, мултимери могат да бъдат белязани проби, или лиганди. които присъединяват маркиращият елемент към пробата.
Както се употребява тук,терминът “вирусна РНК”, който включва HCV РНК, се отнася до РНК от вирусния геном,техни фрагменти, транскрипти и мутанти последователности, получени от тях.
Както се употребява тук, под “биологична проба” се разбира проба от тъканни или течностни изолати от даден индивид, включващ, но не ограничен, до напр. плазма, серум, гръбначномозъчни течности,лимфна течност, външни слоеве на кожата, респираторния, интестиналния и генитоуретралиия тракт, сълзи, слюнка,мляко, кръвни клетки, тумори, органи и също проби от in vitro клетъчни култури, включващи, но не ограничени до средата, получена в резултат на растежа на клетките в културната среда, вероятните инфектирани вирусни клетки, рекомбинантните клетки и клетъчни компоненти.
Съгласно настоящето изобретение са използвани конвенционални техники, използвани в химията, молекулярната биология, микробиологията, рекомбинантната ДНК и имунологията, които са във възможностите на специалиста в областта.Тези методики са подробно описани в литературата./Виж Maniatis, Fitsch & Sambrook, Mofecular cloning, A lab./1982/, ДНК cloning, Vol. I и II / Д-N. GloVer ed. 1985/, Oligonucleotide sinthesis /M.I.Gait ed., 1984/, Nucleic acid hybridi sation / B.D. Hames & SI Higgins eds.1984/, the series. Methods in Entymofogy / Academic Press,Inc./, particularly Vol.154 and Vol. 155 / Wu and Grossman, and Wu, eds.,resp./.
Използваемостта на материалите и методите по настоящето изобретение е станало възможно посредством идентифициране на HCV като етиологичен агент на BB-NANBV, и чрез осигуряването на семейство от нуклеотидни последователности, изолирани от сДНК библиотеки, които съдържат HCV сДНК последователности. Тези сДНК библиотеки са получени от последователностите на нуклеиновите киселини, присъстващи в плазмата на HCV-инфектирано шимпанзе.Създаването на една от тези библиотеки, с библиотеката / АТСС №40394 е описано в ЕРО публикация № 318 216.
Използването на описаните по-горе HCV сДНК последователности така, както са описани тук, дава възможност за конструиране на олигомери, които са приложими като реагенти за откриване на полинуклеотиди в биологични проби. Например, от последователността е възможно да се синтезират ДНК олигомери с около 8-10 нуклеотида, или подълги, които са приложими като хибридизационни проби за откриване присъствието на HCV РНК в, например, дарителска кръв, кръвни фракции, серум на предполагаеми носители на вируси или клетъчни културални системи, в които вирусът е репликиран.В допълнение, новите олигомери, които са описани тук, са подходящи за по-нататъшно охарактеризиране на HCV генома.
Полинуклеотидните проби и праймери, получени от тези последователности, могат да бъдат използвани за амплифициране на последователностите, присъстващи в сДНК библиотеки, и/или за скрининг на сДНК библиотеките, за допълнително припокриващи се сДНК последователности, които, обратно, могат да бъдат използвани за получаване на по-пълно припокриващи се последователности. Както е отбелязано по-нататък, в ЕРО публикация № 318 216, геномът на HCV е РНК, обхваната от голяма отворена четяща рамка /ORF/, която кодира голям по10 липротеин.
В допълнение към казаното, информацията, предоставена по-долу позволява идентифицирането на допълнителни HCV щамове или изолати.Изолирането и характеризирането на допълнителни HCV щамове или изолати може да бъде завършено с помощта на техники, познати за специалисти в областта, например, чрез изолиране на нуклеинови киселини от телесните компоненти, които съдържат вирусни частици и/или вирусна РНК, създавайки сДНК библиотеки с помощта на олигомерите, описани по-долу, за снрининг на библиотеките за клонове, съдържащи НСV сДНК последователности, описани по-долу, и за сравняване на HCV сДНК от новите изолати с сДНК-и, описани в ЕРО публикация № 318 216 и по-нататьк.Щамовете или изолатите, които са подходящи за параметрите на HCV, както са описани в сектора за дефинициите по-горе, са готови идентифицирани. Други методи за идентифициране на HCV щамове биха могли да бъдат получени от специалиста в областта , на базата на информацията, предоставена в описанието.
Изолирането на HCV сДНК последователности
Олигомерите съгласно изобретението съдържат области, които формират хибридни дуплексни структури с мишенни последователности в HCV полинуклеотиди HCV полинуклеотидните хибридизиращи региони от олигомерите могат да бъдат установени от HCV сДНК последователността /те/, предоставени тук, и описани в ЕРО публикация № 318 216.Състав на HCV сДНК от HCVp прототип на HCV, е показана на фиг. 18. Последователността се основава на секвенционната информация, получена от множество HCV сДНК клонове, които са изолирани от множество HCV сДНК библиотеки, включително с библиотеката, присъстваща в λ gtl 1 /АТСС № 40394/ и от човешки серум. HCV сДНК клоновете са изолирани по методите, описани в ЕРО публикация №318216. Повечето от клоновете, които са изолирани, съдържат последователности от HCV сДНК с библиотеката, която е създадена с помощта на серум от шимпанзе с хронична HCV инфекция и съдържащ висок титър на вируса, от порядъка на 106 инфекциозни дози за шимпанзе / мл / С1Д/мл/. Серумът е използван за изолиране на вирусни частици. Нуклеино-вите киселини, изолирани от тези частици, са използвани като матрица при конструирането на сДНК библиотеки за вирусния геном. Иницииращият клон, 5-1-1, е получен чрез скрининг на с библиотека със серум от инфектирани индивиди.След изолирането на иницииращия клон, остатъкът от последователността е получена чрез скрининг със синтетични полимерни проби, последователността на които е получена от 5'-региона и З-региона от познатите HCV сДНК последователности.
Описанието на методите за възстановяване на сДНК последователностите е повече за интересуващите се от историята на развитието на тази техника.Резултантните последователности /и техните комплементи/ са осигурени тук, и последователностите, или която и да е част от тях, могат да бъдат изготвени с помощта на синтетични методи, или чрез комбинация ст методи на синтез с възстановяване на частични последователности с помощта на методи, аналогични на онези, описани в ЕРО публикация № 318 216.
Олигомерни сонди и праймери
Използвайки като база HCV генома / както е илюстрирано с фиг. 18/, и/или съхранени области от HCV генома, олигомери с приблизително 8 нуклеотида или повече, могат да бъдат приготвени, така че да се хибридизират с позитивни вериги/а/ от HCV РНК или техни комплементи така, както и с HCV сДНК. Тези олигомери могат да служат като сонди за откриване/ включително изолиране и /или маркиране/ на полинуклеотиди, които съдържат HCV нуклеотидни последователности, и/или като праймери за транскрибиране и/или репликация на мишенните HCV последователности.Олигомерите съдържат насочена към мишената полинуклеотидна последователност, която е обхваната от нуклеотиди, комплементарни на мишенната HCV нуклеотидна последователност; последователността е със задоволителна дължина и комплементарност на HCV последователността за формиране на дуплекс, който притежава достатъчна стабилност на желаната цел.Например, ако целта е изолиране чрез имобилизация на аналитична, съдържаща мишеяна HCV последователност, олигомерите ще съдържат полинуклеотиден регион, който е с достатъчна дължина и комплементарност на насочената към мишената HCV последователност за постигане на дуплексна стабилност, така че да бъде имобилизирана към твърда повърхност посредством свързването с олигомери, при условията на изолация. Също, ако олигомерите следва да служат като праймери за транскрипция и/или репликация на ми- 5 шенни HCV последователности в аналитичен полинуклеотид, олигомерите биха съдържали полинуклеотиден регион със значителна дължина и комплементарност с оглед насочената към мишената последователност, така че да 10 позволи на полимеризиращия агент да продължи репликацията на праймерите, които са в стабилен дуплекс с мишеяната последователност, при условията на полимеризация. Също, ако полимерите бъдат използвани като беляза- 15 ни проби или за свързване към мултимери, насочените към мишена полинуклеотиден регион,биха били със задоволителна дължина и комплементарност за формиране на стабилни дуп лексни структури, с белязаните проби и/или мултимери с оглед възможност за откриване. Олигомерите могат да съдържат минимум от около 4 прилежащи нуклеотида, които са комлементарни на насочената към мишената структура; обикновено олигомерите биха съдържали минимум от около 8 прилежащи нуклеотида, които са комплементарни на насочената последователност и за предпочитане съдържат около 14 прилежащи нуклеотида, комплементарни на насочената към мишената последователност.Подходящи HCV нуклеотиднасочени последователности могат да бъдат включени в нуклеотиди, които са комплементарни на нуклеотиди, подбрани от следните HCV сДНК нуклеотиди, показани на фиг. 18 /ппх -ппу / маркира от около нуклеотиден номер х до около нуклеотиден номер у /.
| пп-340 | — | пп~ззо; | пп-ззо | пп-320' | ηη-320 | ·· | ηη-310; | |
| пп-310 | - | пп-300' | пп-300 | пп-290' | ηη-290 | — | ηη-280' | |
| пп-280 | - | пп-270; | пп-270 | - | ПП-260; | ηη-26Ο | — | ηη-250? |
| ПП-250 | пп-240' | ПП-240 | - | пп-230' | ПП-230 | — | ηπ-220' | |
| пп-220 | - | ПП-210' | ПП-21О | — | пп-200' | ηη-200 | • | πη-190; |
| nn-190 | — | ПП-130* | ПП-180 | — | ηη-170' | ηη-170 | ηη-160' | |
| пп-160 | * | пп-150; | ПП-150 | — | ПП-140? | ПП-140 | — | ηη-130; |
| ПП-130 | - | пп-120' | ПП-12О | — | nn-iio'· | ηη-110 | — | ηη-100? |
| пП-100 | - | пп-90' | пп-90 “ | ПГ | -80' ПП- | 80 ' ηη | 70' |
| ηη-70 | ~ πη-60; | ηη-60 | ·· | ηη-50' | ηη-50 | ηη-40; | ||
| ηη-40 | ηη_30; | ηη-30 | - | ηη-20' | ηη-20 | ηη_ιο; | ||
| ηη-10 | - ηη^; ηη | '1 ηη10' ηη10 | - ηη20; | ηη20 ~ | ηη30; | |||
| ηη30 ~ | ηη40* ηη40 | ηη | 50' ηη50 ” πη | 60; | ηη60 | ηη7 0' | ||
| ηη70 ~ | ηη80 * | ‘80 | ηη | 90' ηη9 | η - ηη | 100 | ι' πη100 | ηη110; |
| ηηιιο | ηη120; | ηη120 | — | ηπ130? | ηη130 | — | ηη140; | |
| ηη140 | “ ηη150' | ηη150 | — | ηη160; | ηη160 | - | ηη170; | |
| ПП170 | ηη180' | ηη180 | - | ηη190' | ηη190 | — | ηη200 ; | |
| nngoo | - ηη2ιο; | ηη210 | - | ПП220» | ПП220 | - | ПП230? |
| nn230 | - | nn240' | nn240 | - | nn250' | nn250 | - | nn26O' | |
| nn260 | - | nn27O' | nn270 | - | nn280' | nn280 | - | nn290' | |
| ПП290 | — | nn300' | nn300 | — | nn310? | nn310 | — | nn320' | |
| nn320 | - | nn330; | nn330 | - | nn 34O; | nn340 | - | nn350f | |
| nn350 | — | nn360; | nn36O | — | nn370' | nn370 | - | nn380* | |
| ПП380 | - | nn390’ | nn39Q | — | nn400' | nn400 | - | nn410' | |
| nn410 | — | nn420' | nn420 | nn430'’ | nn430 | • | nn440; | ||
| nn440 | - | nn450? | nn450 | - | nn460; | nn460 | - | nn470* | • ..5, |
| nn470 | - | nn480' | nn480 | nn490» | nn490 | nn50Q? | |||
| nn500 | - | nn5io; | nn510 | • | nn52O' | nn520 | • | nn530’ | |
| nn53O | - | nn540; | nn540 | — | nn550' | nn550 | nn560’ | ||
| nn560 | - | nn570' | nn570 | — | nn580' | nn580 | • | nn590’ | |
| nn590 | - | nn6Q0' | nn600 | nn610; | nn610 | nn620' | |||
| nn620 | - | nn630; | nn630 | nn640’’ | nn640 | ·· | ППб50; | ||
| nn650 | - | nn66O; | nn660 | nn67O? | nn670. | nn680' | |||
| nn680 | nn690* | nn690 | - | nn700* | nn700 | nn710f | |||
| nn710 | - | nn720' | nn720 | • | nn730' | nn730 | nn740; | ||
| nn740 | - | nn750; | nn750 | ·· | nn760? | ПП760 | • | nn770' | |
| nn770 | - | nn780’ | nn780 | • | nn79Q' | nn790 | ·“ | nn8oo’ | |
| nn800 | - | nn810' | nn810 | nnB20? | ftn820 | nn830/„ | - . . .‘j. | ||
| nn830 | * | пп840г | nn840 | * | nn850J | nn850 | • | ηη8ί0?^' · | |
| ПЛ860 | - | nn870' | nn870 | — | nn880' | nn880 | ^8901% /: | ||
| nn890 | - | nn900' | nn900 | nn91Q? | nn910 | • | nri920» | ||
| nn920 | — | nn930' | nn930 | • | nri94Q * | nn940 | • | nn950V | |
| nn950 | - | nn960' | nn960 | * | nn970J | nn970 | • | nn980* | |
| nn980 | - | nn99Qf | JUlggP | * | nniooo | ; nnlQQQ | nn1010J |
| nn1010 | - | пп1020; | nn1020 | • | nn1030; | nn1030 | — | nn1040; |
| nn1040 | nn1050; | nn1050 | — | nn1060? | nn1060 | • | nn1070J | |
| nn1070 | — | nni080; | nn1080 | * | nn1090’ | nnL090 | nn1100; | |
| nn1100 | «· | ηη111θ’ | nn1110 | - | nn1120; | nn1120 | nn1130; | |
| nn1130 | - | nn1140? | nn1140 | • | nn1150' | nn1150 | • | nnL160; |
| nn1160 | — | ^11707 | nn1170 | • | nn1180' | nn1180 | nn1190; | |
| nn1190 | - | nn1200; | nn1200 | nn1210; | nn1210 | • | nn1220' | |
| nn1220 | - | nn1230; | nn1230 | — | nn1240; | nn1240 | nn1250* | |
| nn1250 | - | nn1260; | nn1260 | - | nn1270' | nn1270 | nn1280* | |
| ПП128О | - | nn1290» | ПП1290 | - | nni3oo; | ПП1300 | — | nn13i0? |
| nni3io | nn1320' | nn1320 | nn1330; | nn1330 | nn1340; | |||
| ПП1340 | - | nni350; | nn1350 | - | nn1360; | ПП1360 | - | ПП1370' |
| ПП1370 | - | nn1380; | nn1380 | - | nn1390' | nn1390 | ПП1400' | |
| nn1400 | - | nn1410; | nn1410 | - | nn1420' | nn1420 | — | ПП1430? |
| nni430 | - | ПЛ1440? | nn1440 | - | nn1450' | nn1450 | ПП146О; | |
| nn146C | - | nn1470' | nn1470 | - | nn1480; | nn1480 | ПП1490; | |
| nn1430 | - | ПП1500; | nn1500 | - | nn1510; | ПП1510 | ПП1520 ' | |
| nn1520 | - | nn1530; | nn1530 | - | nn1540; | nn1540 | — | nn1550; |
| nnlS5O | - | nnlS60' | nn1560 | - | nn1570; | nn1570 | ПП1580' | |
| nn1580 | - | nni590; | nn1590 | nn1600; | nn1600 | — | nni6io; | |
| nn1610 | - | nni62O? | nn1620 | — | nn1630' | ПП1630 | — | nn1640; |
| nn1640 | nn1650: | nn1650 | nn166O; | ПП166О | — | nn1670' | ||
| nn1670 | - | nn1680; | nn1680 | - | nn1690; | nn169O | nn1700' | |
| nn17C0 | - | nn1710; | nnl710 | nn1720; | nn172 0 | — | nn17 30; | |
| nn1730 | • | nn1740; | nn1740 | — | nn1750; | nn1750 | — | nn1760; |
| nn1760 | - | nn1770; | nn1770 | nn1780; | nn1780 | * | nn1790' | |
| nn1790 | - | nn1800; | nn1800 | — | nn1810; | nn1810 | ·· | nn1820; |
| nn1320 | - | nn1830' | ПП1830 | - | nn1840; | nn1840 | nn1850? | |
| nn1850 | - | nnlS60' | nn1860 | — | nn1870; | nn1870 | ПП1880; | |
| nr,1880 | * | nn1890; | nn1890 | — | nn1900; | nn1900 | nn1910; | |
| nn19iG | - | nR1920; | nn1920 | — | nn193O; | nn1930 | ПП1940' | |
| nn1940 | - | nn1950' | nn1950 | — | nn1960' | nn1960 | nn1970; | |
| nn1970 | - | nn1980' | nn1980 | - | nn1990; | nn199Q | nn2000; | |
| nn2000 | - | nn2010' | nn2010 | — | nn2020; | nn2020 | nn2030; | |
| nn2030 | - | nn2040' | nn2040 | * | nn2050; | nn2050 | • | nn2060; |
| r,n2060 | - | nn2070* | nn2070 | nn2080' | nn2080 | nn2090' | ||
| nn2090 | - | nn2100' | nn2100 | - | nn2110; | nn2110 | — | nn212O; |
| nn2120 | - | nn230; | nn2130 | • | RR2’40' | nn2140 | — | ПП2150; |
| pn2150 | - | r,n2160; | nn2160 | - | ПГ,2 170' | nn2170 | nn2180; | |
| nr,2180 | - | nn2190; | nn2190 | - | nn2200' | nn2200 | nn2210; | |
| nn2210 | nn2220; | nn2220 | nn? 2 3 0' | nn2230 | “ | nn2240; | ||
| nn2240 | - | nn2250; | nn2250 | — | nr,2 260' | nn2260 | nn2270; | |
| nn2270 | - | nn223O' | nn2280 | nn229O; | nn2290 | nn2300; | ||
| nn23OO | - | nn2310; | nn2310 | - | nn2320; | nn2320 | nn2330' | |
| nn2330 | - | nn2340; | nn234O | - | nn2350; | nn2350 | — | ПП2360; |
| nn2360 | - | nn237C? | nri2 37O | - | nn2380' | nn2380 | - | ПП2390; |
| лп2390 | ηη2400; | ηη2400 | ’ лл2410' | ПЛ2410 | ηπ2420 | |||
| ηπ2420 | - | ЛЛ2430? | ηη2430 | ηη2440' | ηη2440 | - | ПП2450 | |
| nn2450 | - | ηπ246Ο; | ηη2460 | - | ηη2470' | Πη2470 | - | ηη2480 |
| ЛП24Б0 | - | Γ,η24 90' | ηη2490 | - | ηη2500? | ПП2500 | - | ηη25ΐο |
| ηη2510 | - | πη2520' | πη2520 | - | ηπ2530; | ΠΠ2530 | — | ηη2540 |
| ηη2540 | - | ηη2550' | ηη2550 | - | ηη2560; | ПП2560 | - | ηη2570 |
| ηη2570 | - | лл2580; | ηη2580 | — | ηη2590; | ПП2590 | — | ηη2600 |
| ПЯ2600 | - | ηη2ό10' | ηη2610 | - | ηη2620; | ПП2620 | — | ηη2630 |
| ηη2630 | ηη2640; | r*n2640 | — | ηη2650' | ηη2650 | — | ηη2660 | |
| ηη2660 | - | ππ2670' | ηη2670 | - | ηη2680' | Πη2680 | — | ηη2690 |
| nn26S0 | - | ηη2700' | ηη2700 | ηη2 710' | ηη2710 | ·“ | ηη2720 | |
| ηη2720 | - | ηη2730' | ηη2730 | — | ηη2740; | ηη2740 | ηη2750 | |
| ηη2750 | - | ηη2760; | ηη2760 | πη2 7 70' | ηη27 70 | ηη2780 | ||
| ηη2730 | - | ηη2790' | πη2790 | — | ηη2δ00; | ηη2800 | — | ηη2 810 |
| ηη23ϊ0 | - | Πη2320' | ηη2820 | — | ηη283Ο? | ηη2830 | — | ηη2θ40 |
| ηη2840 | - | ηη235Ο; | ηη2850 | - | ηη2860' | ηη2860 | - | ηη2870 |
| ηη2870 | - | ηη2880; | ηπ2880 | ηη2890' | ηη2890 | ηη2900 | ||
| ηη2900 | - | ПЛ2910' | ηη2910 | - | πη2920' | ηη2920 | ηη2930 | |
| ηη2930 | - | ηη2940; | ηη294Ο | ηη2950; | ηη2950 | ηπ296Ο | ||
| ηη2950 | - | ηη2970? | ηπ2970 | ηη2980; | ПП2980 | — | ηη2990 | |
| ηη2990 | - | ηη3000? | ηπ3000 | ·“ | ηη3010' | ηη3010 | ηη3Ο2Ο | |
| ηη3Ο2Ο | - | ηη3Ο3Οг | ηη3Ο3Ο | — | ηη3040' | ηη3040 | — | ηη3050 |
| ηπ3050 | - | пп30бС; | ηη3060 | — | ηη3070; | ηη3070 | ηη3080 | |
| ηπ3080 | - | лп3090' | ηη3090 | — | ηη3100; | ηη3100 | ПЛ3110 | |
| ηη3110 | - | Π Л ·» < λ f J xzU | ηη3120 | ηη3130; | ηη313Ο | ηη3140 | ||
| ηη3140 | * | πη3150' | ηη3150 | — | ηη3150' | ηη3160 | ПЛ3170 | |
| ηπ3170 | - | ηη3180; | ηη3180 | — | ηΠ3190; | ПП3190 | ηη3200 | |
| лл3200 | - | ηη3210; | ηπ3210 | — | ηΠ3220; | ηη3220 | ηη3230 | |
| ηη3230 | - | Лп3240' | ηη3240 | • | πη3250' | ηη3 250 | — | ηη326Ο |
| ηη3260 | - | ηπ3270' | ηη3270 | - | ηη 3 280' | ηη3280 | ηη3290 | |
| ηη3290 | * | ηπ3 300; | пЛ3300 | - | ηη 3 310' | ηπ 3 310 | — | ПП3320 |
| ηη3320 | - | ηη3330; | ηη3330 | - | ηη3340; | πη334Ο | ηη3350 | |
| ηη3350 | - | ηη3 360' | ηη3360 | — | ηπ3370; | ηη3370 | ηη3380 | |
| ηη33δΟ | - | ηη339Ο; | ηη3390 | ηη3400' | ηη3400 | Πη3410 | ||
| пп3ч 10 | - | ηη342Ο' | ηη3420 | - | ηΠ34 30' | ηη3430 | ηη3440 | |
| η,η 34 4 0 | - | ηη345Ο' | ΠΛ34 50 | - | ηη3460: | ηη3460 | — | ПП3470 |
| nn3470 | ηπ348ΰ? | nn3480 | ‘ nn3490; | nn3490 | ' nn35OO | |||
| nn3500 | - | nn3510; | nn3510 | - | nn3520' | nn3520 | ** | nn3530 |
| nn3530 | - | nn3540? | nn3540 | — | nn3550' | nn3550 | nn356O | |
| nn3560 | - | nn3570; | nn3570 | — | nn3580' | nn3580 | nn3590 | |
| nn35S0 | - | nn3600; | nn3600 | nn3610' | nn3610 | nn362O | ||
| nn3620 | · | nn3530; | nn3630 | - | nn3640; | nn364O | лп3650 | |
| nn3650 | - | nn3650; | nn3660 | nn3670; | nn367O | - | nn3680 | |
| nn3680 | - | nn3690' | nn3690 | — | nn3700' | nn3700 | nn3710 | |
| nn3710 | - | nn372G' | un3720 | ·“ | nn3730' | nn3730 | ·· | nn3740 |
| nn3740 | nr‘3750? | nn3750 | nn3760; | nn3760 | nn3770 | |||
| nn3770 | nn3780' | nn37S0 | — | nn3790; | nn3790 | - | nn3800 | |
| nn3800 | - | nn3810' | r,n3810 | - | nn3820; | nn3820 | “ | nn3830 |
| nn3830 | - | nn3840' | nn3840 | - | nn3850' | nn3850 | nn3860 | |
| nn3860 | - | nn3870' | nn3870 | — | nn3880' | nn3880 | nn3890 | |
| nn3890 | nn3S0C; | nn39OO | nn391O' | nn3910 | nn3920 | |||
| nn3920 | - | nn3930; | nn3930 | - | nn3940? | nn3940 | nn3950 | |
| nn3950 | - | nn3950' | nn3960 | - | nn3970; | nn3970 | nn3980 | |
| nn3980 | nn3990' | nn3990 | — | nn4000? | nn4000 | nn4010 | ||
| nn4010 | - | nn4O2O' | nn4020 | — | nn4030' | nn4030 | “* | nn4040 |
| nn4040 | - | nn4C50' | nn4050 | nn4060? | nn4060 | nn4070 | ||
| nn4070 | - | nn4080; | nn4080 | - | nn4090; | nn4090 | nn4100 | |
| nn4100 | - | nn4110' | ?-n4110 | - | nn4120; | ЛП4120 | nn4130 | |
| nn4130 | - | nn4110' | nn4140 | - | nn4150; | nn4150 | nn4160 | |
| nn4 160 | nn4170' | nn4170 | - | nn4180? | nn4180 | nn4190 | ||
| ПЛ4190 | - | ПП4200; | nn4200 | • | nn4 210? | nn4210 | nn4220 | |
| nn4220 | - | nn4230' | nn4230 | - | nn4240? | nn4240 | nn425O | |
| nn42S0 | nn42SO? | nn4260 | - | nn4270? | nn4270 | — | nn4280 | |
| nn428C | - | nn4290? | nn4290 | - | nn4300' | nn4300 | nn4310 | |
| nn4310 | - | n,l432C' | nn432O | — | nn4330; | nn4330 | nn4340 | |
| nn4340 | - | nn4350; | nn4350 | - | nn4360; | nn4360 | nn4370 | |
| nn4370 | - | nn4380' | nn4380 | - | nn4390' | nn4390 | nn4400 | |
| nn4400 | - | nn4410' | nn4410 | nn4420' | nn4420 | nn4430 | ||
| nn4430 | - | nn444C>' | nn4440 | - | nn4450' | nn4450 | nn4460 | |
| nn4460 | - | nn4470' | nn4470 | • | nn4430; | nn4480 | nn4490 | |
| nn4490 | - | nn4500; | nn4500 | - | nn4510; | nn4510 | nn4520 | |
| nn4520 | - | nn453O? | nn4530 | - | ПП4540; | ПП4540 | * | nn455Q |
| nn4550 | - nn4560’ | nn4560 | nn4570' | nn4570 | nn4580 | |||
| ПП458С | Г1 Л 4 5 9 0 ' | r,n4 590 | - | nn4600' | nn4600 | - | ПП4610 | |
| ПЛ4610 | - | ПЛ4620' | ПП4б20 | - | ПП4630; | ПП4630 | - | ПП4640 |
| nn4640 | - | ПП4650; | ПП4650 | nn4660; | nn4660 | - | ПП467О | |
| nn4670 | - | nn4680* | ПП4680 | - | nn469O' | nn4690 | - | ПП4700 |
| nn4700 | - | ПП4710: | nn4710 | - | nn4720; | ПП4720 | - | nn4730 |
| nn4730 | • | nn*740; | nfl4740 | — | ПЛ4750' | nn4750 | nn4760 | |
| nn4760 | - | nn4770? | nn4770 | * | nn4780? | nn4780 | - | nn4790 |
| nn4790 | - | nn48C0; | nn4800 | — | nn4810; | nn4810 | — | nn4820 |
| nn4820 | - | nn4830; | nn483O | - | nn484O' | ПП4840 | - | πη4850 |
| nn4850 | - | nn4860' | nn4860 | - | nn4870; | nn4870 | nn4880 | |
| nn488C | - | nn4890' | nn4890 | - | nn4900; | nn4900 | — | nn4910 |
| nn4910 | - | nn4920' | nn4920 | ·“ | nn4930; | nn4930 | *· | nn4940 |
| nn4940 | - | nn495C; | nn4950 | * | nn4960' | nn4960 | — | nn4970 |
| nn4970 | - | nn4980? | nn4980 | *· | nn499O; | nn4990 | nn5000 | |
| nn5000 | - | nn5010* | nn5010 | *· | nn5020; | nn5020 | — | nn5030 |
| nn5030 | - | nn504G; | nn5040 | - | nn5050' | nn5050 | nn5060 | |
| nn5060 | - | nn5070; | nn5070 | - | nn5080; | nn5080 | — | nn5090 |
| nn5090 | - | nn5100' | nR5100 | nn5U0; | nn5110 | nn5120 | ||
| nn512G | - | nn5130' | nn5130 | * | nn5140' | nn5140 | nn5150 | |
| nn5150 | * | nn5160' | ПП5160 | - | nn5170? | nn5170 | nn5180 | |
| nn51&0 | - | ΠΠ5190? | nn5190 | - | nn5200' | ПП5200 | nf15210 | |
| nn5210 | nn5220' | nn5220 | - | nn5230; | nn5230 | nn5240 | ||
| nn5240 | - | nn5250' | nn5250 | - | nn5260? | nn5260 | nn5270 | |
| nn527G | — | nn52S0' | nn5280 | — | nn5290; | nn5290 | nn5300 | |
| nn5300 | - | nn53J.C' | nn5310 | — | nn5320; | nn5320 | — | nn5330 |
| nn5330 | nn5340' | nn5340 | — | nn5350' | nn5350 | nn536O | ||
| nn5360 | - | nn537G; | nn5370 | - | nn5380' | nn5380 | nn5390 | |
| nn539O | * | nn54CG? | ПП5400 | - | nn5410; | ПП5410 | ПП5420 | |
| nn5420 | - | nnS43C; | лп5430 | - | nn5440; | nn5440 | - | nn5450 |
| nn5450 | - | nn54fG; | nn5460 | - | nn5470' | nn5470 | — | nn5480 |
| nn5480 | - | nn549Q' | nn5490 | nn5500' | nn5500 | — | nn5510 | |
| nn5510 | - | nn5520; | nn5520 | - | nn5530: | nn553O | - | nn5540 |
| nn5540 | - | nn5550' | nn5550 | - | ЛП5560' | nn5560 | — | nn5S70 |
| nn5570 | nn5580; | nn5580 | - | nn559O; | nn5590 | — | ЛП5600 | |
| nn5600 | - | nn5610<‘ | nn5610 | - | nn562O; | nn5620 | - | nn5630 |
| nn5630 | ~ nn564(j' | ПП5640 | nn5650; | ПП5650 | ПП5660' | |||
| nn5560 | - | nr,5670; | nn5670 | - | nn5680; | nn5680 | • | nn5690; |
| nn569O | - | nn57C0: | nn5700 | - | nn5710' | ПП5710 | - | nn5720; |
| nn5720 | — | nn573C; | nn5730 | - | nn5740; | nn5740 | - | nn5750; |
| nn5750 | - | nn5760? | nr‘57 60 | - | nn577O' | ПП5770 | nn5780; | |
| nn5780 | - | nn579J? | nn5790 | - | nn5800; | ПП5800 | - | nn5810; |
| nn5810 | - | nn562C‘‘ | nn582D | - | nn583O; | ПП5830 | nn5840' | |
| nn584C | — | nn5850; | nn5850 | ·· | nn5860? | nn5860 | - | nn5870; |
| nn5870 | - | r,n58o0; | nn5880 | - | nn5890; | RR5890 | - | nn5900; |
| nn5900 | - | nn5910; | пл5910 | — | nn5920; | nn5920 | nn593O' | |
| nn593C | - | nn5949' | nn5940 | — | nn5950; | nn5950 | — | nn5960' |
| nn5960 | - | nnS97O? | nn5970 | — | nn5980; | nn5980 | nn5990; | |
| nn 5990 | - | nn6OCO: | nn6000 | nR6010;' | nn6010 | nn6020' | ||
| nn6020 | * | nR6G30' | nn6O3O | nn6040; | nn6040 | nn6050' | ||
| nn6050 | - | nn6060; | nn6060 | nn6070; | nn6070 | nn6080? | ||
| nn6080 | - | nn6GSC; | nr,6090 | — | nn6100; | nn6100 | · | nn6110; |
| nn6110 | - | nn£120; | nn612O | - | nR6130' | ПП6130 | — | nn6140; |
| nn614C | - | nn6150; | ППб150 | - | nR6160; | nn6160 | nn6170; | |
| nn617C | - | nn6180? | ПЛ6180 | - | nn6190; | nn6190 | nn6200; | |
| nn6200 | - | nn6213? | ΠΠ6210 | - | nn6220; | nn6220 | nn6230; | |
| nn6230 | - | nne24C? | nn6240 | — | nn6250; | nn6250 | nn6260' | |
| nn6260 | - | ППб270; | ПЛ6270 | ·· | nn6280; | nn6280 | • | nn6290' |
| nn6290 | • | nn6300; | nn6300 | — | nn6310; | nn6310 | — | nn6320' |
| nn632C | - | RR6330' | nn6330 | nn6340' | nn6340 | • | nn6350; | |
| nn6350 | - | nn6360? | nn6360 | * | nn637O; | nn6370 | nn6380; | |
| nn636O | * | nn6390; | nn639O | nn6400; | nn6400 | nn6410? | ||
| nn64i0 | * | nR842C? | RR642O | - | nn6430; | nn6430 | * | nn6440' |
| nn6440 | - | nn£450' | nn6450 | nn6460; | nn6460 | nn6470; | ||
| nn647O | - | nn64S0? | nn5480 | nn6490; | nn6490 | ·“ | пл65ОО' | |
| ηηδ500 | - | nn65.l0; | Rn65i0 | - | nn6520: | nn6520 | - | nn6530' |
| nn653C | - | nn054C' | nn6540 | - | nn6550: | nn6550 | - | nn6 5 6 0' |
| nn6560 | - | nn6570: | nR657C | - | nn6580: | nn6580 | nn659O; | |
| ПП6590 | - | nn6600' | ПП66ОО | - | nn6610' | nn6€10 | — | nn6620: |
| nn6620 | - | nn6C 30' | ППб630 | nn6640' | nn664O | — | nn6650; | |
| ПП6650 | - | nn666G; | ПП6б60 | - | nn6670' | nn6670 | nn6680; | |
| nn6680 | - | ПП6690; | rn6690 | - | ПП6700? | nn6700 | - | ПП67Ю; |
| nnS710 | nnS720; | nn6720 | ' rn6730; | ЛЛ6730 | ~ nn6740; | |||
| ПП5740 | - | r,r‘S7 50; | ПП6750 | - | nn6760; | ЛЛб760 | - | ЛЛ6770’ |
| лл6?70 | - | nn5780? | пл6780 | nn6790' | ПП6790 | nn6800; | ||
| лп6800 | - | nn5810? | nnS810 | - | nn6820' | ПЛ6820 | ЛЛ6830' | |
| nn6830 | - | ηηδ340' | nn6840 | - | nn6850' | ПП6850 | - | ЛЛ6860; |
| nn6860 | - | плб870' | nn6870 | - | nn6880; | ЛЛб88О | - | ЛП6890? |
| nn6890 | - | an590Q' | nn6900 | nn6910; | ПЛ691О | nn6920? | ||
| nn6S2G | - | nr'693O' | nn6930 | - | nn6940' | nn6940 | — | ПЛ6950' |
| nn6950 | - | ЛЛ6960; | nn6960 | - | nn6970; | nn6970 | nn6980' | |
| nn6980 | - | nn6990' | nn6990 | nn7000' | nn7000 | η η 7 010' | ||
| nn7010 | - | nn702C; | nn7020 | ·“ | nn7G30? | nn7030 | — | πη7040' |
| nn7040 | - | nn7050' | nn7050 | nn7060' | nn7060 | ηη7070' | ||
| nn7G70 | - | nr,7 080' | nn7080 | • | nn7090' | nn7090 | ηη7100; | |
| nn710G | - | m H · • 7110' | nn7110 | - | nn7120' | nn7120 | - | ηη7130' |
| ЛЛ7130 | - | nn7140' | nn7140 | nn7150' | nn7150 | ηη7160' | ||
| ПП7160 | - | nn717Q' | nn7170 | - | nn7180; | nn7180 | ·“ | ПП7190; |
| nn7190 | - | nr,72O0? | nn7200 | nn7210’ | nn7210 | ·“ | ηη7220' | |
| nn7 2 2 0 | - | nn7230; | nn7230 | - | nn7240' | nn7240 | ηη7250; | |
| nn7250 | - | nr‘726C' | nn7260 | — | лл7 2 7 0' | nn7270 | πη7280' | |
| nn7280 | - | ЛЛ7290' | nn7290 | - | nn73OO' | nn7300 | — | ηη7310' |
| nn7310 | - | nn7320; | nn7320 | - | nn7330; | nn733O | — | ηη7340? |
| nn7340 | - | nil7 350' | ПП7350 | nn7 360' | ПП7360 | ηη7370? | ||
| nn7370 | - | nn7380; | nn7380 | “· | nn7390' | nn7390 | ηπ7400; | |
| nn7400 | * | nr‘741O' | nn7410 | - | nn7420' | nn7420 | ηη7430' | |
| nn7430 | • | nn7440' | na7440 | - | nn7450' | пл7450 | — | ηη7460; |
| nn7460 | - | ПЛ?470' | nn7470 | - | an7480' | nn7480 | ηπ7490; | |
| nn7490 | - | ЛЛ750С' | nn7500 | nn7510' | nn7510 | — | ηη7520; | |
| nn7520 | - | nn7530' | nn7530 | - | nn7540' | nn7540 | - | ηη7550' |
| ПЛ7550 | - | лл7560' | nn7560 | - | nn75 70; | nn7570 | ηη7560' | |
| nn7580 | - | n,’’-/590; | nn7S90 | - | nn7600' | nn7600 | ηηΊ610' | |
| nn7G10 | - | nn7620; | nn7620 | nn7630; | nn7630 | ПЛ7640' | ||
| nn764O | - | nn765G; | ЛП7650 | - | nn7650' | ЛЛ766О | “· | πη7610' |
| nn7670 | - | ar'7 68O' | nn7680 | - | nn7690; | ПП7б90 | - | ηΠ7?00' |
| nn7700 | - | nn7710; | nn7710 | - | nn7720; | nn7720 | — | ηη77 30; |
| nn7730 | nn?74C; | nn774O | - | nn775O; | nn7750 | - | ηη7760; | |
| nrl7 7 6O | - | •'‘П7770; | nn7770 | - | ПП7780; | nn770o | - | ηη7790» |
| nn7790 | nn7600; | nn7800 | nn7810' | nn7810 | ПП7820 | |||
| πη7820 | nn7830; | nn7830 | - | nn7840; | nn7840 | ·* | nn7850 | |
| nn7850 | - | nn7860; | nn7860 | - | nn7870; | nn7870 | nn7880 | |
| πη7880 | - | nn7890; | nn789O | nn7900; | nn7900 | “ | nn7910 | |
| nn7910 | - | nn?920; | nn7920 | - | nn7930' | nn7930 | nn7940 | |
| ηΠ7940 | - | nn7950? | nn7950 | - | nn7960; | nn7960 | — | nn7 9 7 0 |
| nn7970 | - | nn7980; | nn7980 | — | nn7990; | nn7990 | nn8000 | |
| nn8000 | - | nn8010' | nn8010 | - | nn8020; | nn8020 | -* | nn8030 |
| nn8030 | - | nn8040' | nn8040 | - | nn8050; | nn8050 | nn8060 | |
| nn8060 | - | nn8070' | nn8070 | - | nn8080; | nn8080 | nn8090 | |
| nn8090 | - | nn8100; | ПП8100 | nn8110; | nn8110 | nn8120 | ||
| nn8120 | nn8130; | nn813O | - | nn8140; | nn8140 | nnB150 | ||
| nn8150 | - | nn8160; | nn8160 | - | nn017O; | nn8170 | nn8180 | |
| nn8180 | - | nn8190' | nn8190 | - | nn8200' | nn8200 | nn8210 | |
| nn8210 | - | nn8220' | nn8220 | nn8230' | nn8230 | nn8240 | ||
| nn8240 | - | nn8250; | nn8250 | - | nn8260; | ПП82бО | nn8270 | |
| nn8270 | - | nn8280; | nn8280 | - | nn8290' | nn8290 | ПЛ8300 | |
| nn8300 | - | nn8310; | nn8310 | — | nn8320; | nn8320 | nn8330 | |
| nn8330 | - | nn8340' | nn8340 | - | nn8350; | nn8350 | nn8360 | |
| nn8360 | - | nn8370' | nn8370 | - | nn8380' | nn838O | — | nnB39O |
| nn8390 | - | nn8400; | nn8400 | - | nn8410; | nn8410 | “ | nn8420 |
| nn8420 | - | nn8430' | nn9430 | — | nn844O; | nn8440 | nn8450 | |
| nn845O | - | nn8460? | nn9460 | - | nnB470' | nn8470 | “· | nn8480 |
| nn848O | - | nn8490; | nn8490 | - | nn8500' | nn8500 | nn8510 | |
| nn8510 | - | nn8520; | nn8S20 | - | nn8530' | nn8530 | nn8540 | |
| nn8540 | - | nn8550; | nn8550 | — | nn8560; | nn856Q | nn8570 | |
| nn8570 | - | nn8580; | nn8580 | — | nn9590; | nn859O | nn8600 | |
| nn86OO | nn8610; | nn8610 | - | nn8620' | nn862O | nn8630 | ||
| nn8630 | - | nn8640; | nn8640 | • | nn8650' | nn8650 | nn8660 | |
| nn8660 | - | nn9670' | nn9670 | - | nn868O; | ПЛ8680 | nnS 6 9 0 | |
| nn8690 | - | nn8700; | nn8700 | nn87 10: | nn8710 | nn8720 | ||
| nn8720 | - | nn8730; | nn8730 | - | nn8740: | nn8740 | nnB750 | |
| nn8750 | - | ηη87δ0; | nn8760 | - | nn8770; | nn8770 | nn8780 | |
| nn8780 | - | nn8790' | nn8790 | - | nn8800; | nn8800 | nn8810 | |
| nn8810 | - | nn8820; | ПП8820 | - | nn8830; | ПП8830 | — | nn8840 |
| nn8840 | - | nn88SO? | nn8850 | - | nn8B60? | nn8B60 | nn8870 | |
| nn8870 | - | nn8880' | ΠΠ8880 | - | nn8890' | nn8890 | - | nn8900 |
| nn8900 | nn8910; | nn8910 | - | nn8920; | ПЛ892О | - | nn8930 | |
| nn893O | nn8940; | ПП8940 | * | ПП8950; | nn8950 | - | nn8960 | |
| nn8960 | nn8970' | nr‘8970 | - | nn8980; | nn8980 | - | nn8 9 9 0‘ | |
| nn899O | nn9000' | nn9000 | - | nn9010; | nn9010 | * | nn9020' | |
| nn9020 | nn9030' | ПП9030 | - | nn9Q40' | nn9040 | • | nn9050‘ | |
| nn9O5O | - | nn9060· |
Не е необходимо, олигомерът да се състои само от последователността, която е комплементарна на насочената към мишената последователност. Тя може да съдържа допълнително нуклеотидна последователност или други количества, които са подходящи за преследваните цели. Например, ако се използват като праймери за амплификацията на HCV последователностите чрез PCR, те могат да съдържат последователности, които, когато са в дуплекс, рестрикционни ензимни сайтове, улесняващи клонирането на амплифицираните последователности. Например, ако олигомерите бъдат използвани като “улавящи сонди” в изследванията за хибридизация /описани по-нататък/, те биха съдържали в допълнение свързващ партньор, който е присъединен към олигомер, съдържащ чуклеогидната последователност, която е комплементарна на насочената към мишената последователност. Други типове последователности, които могат да бъдат използвани, в рамките на които да са включени или да са присъединени, са онези, които са известни на специалистите в областта, че са приложими за различни цели, включително маркиране на нуклеотидни проби.
Получаването на олигсмерите е с известни за областта средства, включително методите на изрязване, транскрипция или химичен синтез.Мишенните последователности и/или области от генома, които са подбрани и към които насочените полинуклеотиди са комплементарни, са в зависимост от нуждите. Например, ако целта е скринипг за присъствие на HCV в биологични проби / като кръв /, предпочитаните олигомери биха били използвани като проби и/ или праймери и биха се хпбридизирали към запазени региони, от HCV генома.Някои от съхранените региони на HCV генома, към които могат да бъдат присъединени, са описани тук, например региона, който включва нуклестиди с размер от около 200, или от около 4000 до около 5000 от 5'-края, или от около 8000 до около 9040, както е показано на фиг. 18, или за предпочитане нуклеотиди -318 до 174, 4056 до 4448 и 4378 до 4902. Други области от генома, които са съхранени, са лесно доказуеми чрез сравняване на нуклеотидните последователности на различни изолати на BCV, включително прототипите HCV.HCV,. Методите за провеждане на сравнението между генотиповете за определяне на съхранените и несъхранени области са известни в областта и примерите от тези методи са описани тук.
В основните изследвания за хибридизация на нуклеиновите киселини /независимо дали ДНК или РНК /, едноверижна нуклеинова киселина се хибридизира към сонда от нуклеинова киселина и получените в резултат дуплекси лесно се откриват.Пробите за HCV полинуклеотиди/ природни или получени са с дължина, която позволява откриването на уникална вирусна последователност чрез хибридизиране. Докато 6-8 нуклеотида могат да бъдат работна дължина, то последователност от ΙΟΙ 2 нуклеотида се предпочита и около 20 нуклеотида или повече се явяват оптималния брой. За предпочитане, тези последователности се получават от области, които са нехетерогенни. Тези сонди могат да бъдат изготвени с помощта на рутинни методи, включително автоматизирани олигонуклеотидни синтетични методи. Измежду полезните сонди са тези, които са получени от новоизолирани клонове, разкрити в описанието, а така също и различни олигомери, приложими в пробните сДНК библиотеки, представени по-нататък.Комплект за всяка уникална част от HCV генома ще бъде достатъчен. За използване като проба е описана пълната комплементарност, макар че това може да не е необходимо, доколкото дължината на фрагмента се повишава.
За използването на такива сонди като агенти за откриване присъствието на HCV полинуклеотиди / например при скрининга на контаминирана кръв /, биологичната проба, която трябва да бъде изследвана, независимо дали кръв или серум, се третира по желание, за екстрахиране на съдържащите се нуклеинови киселини.Получените нуклеинови киселини от сондата могат да бъдат подложени на гел електрофореза или други разделения по размер; обратно, пробите от нуклеинови киселини могат да бъдат подложени на точково оцветяване без разделяне по размер. За да бъдат формирани хибридни дуплекси с последователността, насочена към мишената от дадената проба, тя трябва да бъде във форма на единична верига. Когато последователността е по природа едноверижна, не се изисква денатуриране. Но когато последователността е във двойно верижна форма, тя ще бъде денатурирана.Денатурирането може да бъде проведено чрез различни техники, познати в областта. След денатурацията ана21 лизираните нуклеинови киселини и сонди се подлагат на инкубация в условията, които да осигурят образуването на стабилен хибрид между мишенната последователност и последователността на пробата с предполагаемата насочена към мишената последователност, като получените в резултат дуплекси, съдържащи се в пробата, се откриват лесно.
Откриването на получените в резултат дуплекси, ако има такива, се доказват обикновено с помощта на белязани пробщобратоо, пробата може да не бъде белязана, но може да бъде установена чрез специфично свързване с лиганди, които от своя страна да бъдат белязани, независимо дали директно или индиректно. Подходящо маркери и методи за маркиране на пробите и връзките са известни в областга и включват, например, радиоактивни маркери, които могат да бъдат инкорпорирани по известни методи /напр. транслация или кинезияДбиотин, флуоресцентни групи, хемилуминесцентни групи /напр. диокситани,/ енземи, антитела и др.
Областта от ссндато, която се използва за свързване към анализираната, може да бъде направена напълно комплементарна на HCV генома. Поради това обикновено строго ограничителни условия са желателни за предотвратяване на фалшиви позитиви. Но строго специфичните условия могат да бъдат използвани само ако пробите са комплементарни на областите от вирусния геном, които не са хетерогенни.Ограничението на хибридизацията се определя от много фактори по време на хибридизацията и по време на процедурата на промиаане, включително температура, продължителност във времето и концентриране на формамида. Тези фактори са подчертани, напр. от Maniatis, Т.. /1982/.
Варианти на тази основна схема, които са познати в областта, включително онези, които улесняват отделянето на дуплексите с оглед откриването им в екстрахирания материал и /или които амплифицират сигнала ст белязаното количество, също могат да бъдат използвани.Много от тези варианти са представени е литературата, Hanp.:Matthews ahd Kricka /1988/, Analytical Biochemistry 169:1 ; Landergen et df. /1988/, Science 242 :229; and Mittlin /1989 /, Clinical cfem.35 : 1819. Пробите, подходящи за откриване на HCV в тези изследвания, са включени в последователностите, които се хибридизират с мишенната полинуклеотидна последователност за формиране на дуплекси, които са аналитична верига, където дуплексите са със задоволителна стабилност за откриване в специфични системи за изследване.
Подходящ вариант е описаният в NS патент № 4 868 105,публ. септ. 9,1989 и в ЕРО публ. № 225 807 /публ. юни 16, 1987/. Тези публикации описват хибридизационна проба на нуклеинова киселина в разтворима фаза, в която анализираната нуклеинова киселина се хибридизира към белязаната проба и към улавящата проба. Този аналитичен сондиращ комплекс се присъединява чрез хибридизация към твърдоповърхностната улавяща сонда.Това позволява анализираната нуклеинова киселина да бъде отстранена от разтвора като комплекс от твърда фаза.Притежавайки анализирания обект под формата на комплекс от твърда фазова, осъщесвяването на последващия етап на отделяне се улеснява.Бележещата пробата система е комплементарна на белязаната сонда, която се свързва чрез хибридизиране към твърдо фазния аналитичен комплекс.
Най-общо казано, очаква се, че HCV геномната последователност ще присъства в серума на инфектираните индивиди в сравнително ниски нива, т. е. приблизително 102 - 103 инфекциозни дози за шимпанзе / С1Д/ за мл. Това ниво може да изисква използване на амплификационни техники в хибридизационните сонди. Такива техники са известни в областта. Например, системата “Biobridge”- EnZo Biochemical Corporation използва терминална дезоксинуклеотид трансфераза за допълване на немодифицираните 3'- поли-dT - краища до ДНК пробата. Поли dT-крайната сонда се хибридизира с мишенната нуклеотидна последователност и след това с биотин-модифицираната поли-А. РСТ публикация 84/03520 и ЕР публикация №124221 описват ДНК хибридизиращо изследване, в което:
1/ анализираният обект се линеаризира до едноверижна ДНК проба, комплементарна на ензим-белязан олигонуклеотид
2/ полученият в резултат “опашат” дуплекс се хибридизира с ензим белязан олигонуклеотид.
Описание на ЕР 204510 хибридизиращо изследване, в което анализираната ДНК контактува със сонда, която има опашка, например поли-dT опашка, амплифицираща верига, притежаваща последователност, която се хибридизира с опашката от сондата, като поли-А
BAD ORIGINAL последователност, и която е способна да присъедини множество белязани вериги. Един тип хибридизиращо изследване, описано в ЕРО публикация №317 077 /публикувано на 24.05.1989/, което да открие последователности на ниво приблизително 106/мл, използва мултимери на нуклеинови киселини, кс-ито свързват еднозерижни нуклеинови киселини, които освен това се свързват към множество от еднозерижни белязани олигонуклеотиди. Желани техники в случая са тези, които включват амплифициране на мишенни HCV последователности в серум, приблизително 10 000 кратно/ т.е. до приблизително Ю6 последователности /мл/, като част от хибридизационната система. Амплификацчята може да бъде съпътствана например ст техника на полимеразните верижни реакции /PCR описани от Saiki et al. /1986/, от МиН:is,US патент № 4 683 195 и от Milliset al, US патент № 4 683 202. Амплификацията може да предшества или да е последваща след пречистването на HCV мишенна последователност.Например, амплификацията може да съвпада с методите за изпитване, описани в US патент №4 868 105, или дори ако е желана по-нататъшна амплификация може да съвпада с ЕРО публикация №317 077.
Предпочитани методи за откриване на HCV последователности в анализирана полинуклеотидна верига се оснозават на методите на хибридизационно откриване, описани в US патент № 4 868 105 и ЕРО публикация № 317 077. Тези методи са сандвичева хибридизация в разтворима фаза, които използват едновременно улавяща и белязана сочда, конте се хибридизират с мишенни последователности в анализираната нуклеинова киселина. Използването на тези изследвания за скрииинг на биологични проби за HCV, пробите биха се свързали към съхранени региони от HCV генома.Улазящите и белязани сонди могат да бъдат поставени в мястото на тяхното свързване към мишенната последователност.Обратно, в предпочитания начин, улавящата и белязаната сонда са в една система, и пробите от една система не се разпространяват върху пробите от друга система.В последните случаи, системите от мултиплени улавящи сонди се хибридизират с най-добре съхранените региони от генома, докато системите от мултиплените белязани проби могат да се хибридизират с области, които демонстрират слаба степен на дивергенция. Например с помощта на прототипна HCV, сДНК последователност, показана на фиг. 18, могат да бъдат използвани сонди,които се хибридизират с последователности в областта на нуклеотида от около -318 до около 174, и/или нуклеотиди в областта от около 4378 до около 4902,и/или нуклеотиди в областта от около 4056 до около 4448.Предпочитаните проби биха се хибридизирали към последователности в 5’- областта на HCV региона, от HCV генома, докато, както е показано по-долу, този регион се явява отлично съхранен.Така, предпочитаните проби могат да се хибридизират например към нуклеотиди от около -318 до около 174, както е показано на фиг. 18.Пробите биха могли да бъдат използвани както за хибридизиране в позитивната верига на съхранените региони, и/или техният комплемент, в зависимост от целта, например за откриване на вирусни геномни последователности, или за откриване на HCV сДНК последователности, получени в резултат от PCR амплификация, или за откриване на репликиращи междинни съединения за позитивни HCV РНК веригата.
Откриване на HCV РНК полинуклеотиди, получени от тях с помощта на HCV/cPCR метода.
Специално използван метод за установяване на HCV РНК или полинуклеотиди, получени от HCV РНК, е методът HCV/cPCP, който е обект на настоящето описание и който използва техниката на полимеразните верижни реакции /PCR/, която е описана от Saiki etal /1986/,от Mnllis в US патент № 4683 195 и от Mnllis ет al. в US патент №4 683 202.Методът HCV/PCR използва праймери и сонди, получени от информацията, предоставена тук и отнасяща се до природата на HCV генома.
В PCR техниката се изготвят къси олигонуклеотидни праймери, които съответстват на противоположните краища на желаната последователност. Последователността между праймерите не е необходимо да бъде позната. Проба от полинуклеотида се екстрахира и денатурира, за предпочитане чрез нагряване, и се хибридизира с олигонуклеотидни праймери, които са представени в моларен излишък. Полимеризацията се катализира от матрично- и праймерзависима полимераза в присъствието на дезоксинуклеотид трифосфат или нуклеотидни аналози /dNTPs/. Това води до получаване на два “ дълги продукта”, които съдържат респективно праймери в техния 5'-край, ковалентно присъединен към новосинтезирани комплементи от оригиu ... ........ 1AL ί ·Ι I - - ' ----60348 налните вериги. Репликираната ДНК отново се денатурира, хибридизиоа се с олигонуклеотидни праймери, отново се поставя в полимеризиращи условия и се инициира втори цикъл на репликация. Повторният цикъл предоставя двете оригинални вериги, двата дълги продукта от цикъл 1 и два къси продукта, репликирани от дългите продукти.Късите продукти съдържат последователности /смислови или ачтисмислсви/, получени от мишенната последователност, фланкирани на 5-края и 3'-края с праймер.чи последователности. При всеки допълнителен цикъл множество от късите продукти се репликираг експоненциално. Този процес причинява амплификация на специфични мишенхи последователности.
С метода се осигурява проба, l-.ояте би следвало да съдържа HCV РНК или фрагмент от нея.Обикновено тази проба се взима от индивид, който се подозира като носител ча ΝΑΝΒΗ,ηο възможно е да бъдат използвани н други източници като хранителна среда или клетки от инвитро системи, в които е репликиран вирусът. Пробите, обаче, могат да съдържат ьшшенна последователност /и/.
След това пробата се подлага на въздействието на условия, позволяващи обратно транскрибиране на HCV РНК сДНК .Тези условия за обратно транскрибиране па РНК са познати на специалистите в областта и са описани напр.от Maniatis ет al ./1982/ и Methods ir· EnZimology. Предпочитан метод за обратно транскрибиране е този, при който се използва обратна транскриптаза от най-различни източници, включително рекомбинантни молекули, и изолирана, например, от ретровирус, за предпочитане птичи миелобластозен вирус/ AMV/ при подходящи условия за транскрибиране.НСУ сДНК продуктът на обратната транскрибция е РНК:ДКК хибрид, който се получава в резултат на първия етап от обратното транскрибиране. Съответно, ДНК:ДНК хибридите се получават з резултат на два или повече цикъла на транскрибиране.
HCV сДНК, получена след обратната транскрипция, след това се подлага на PCR за амплификация на мишенна последователност. За осъществяването й отделните верига се хибридизират с праймери, които фланкират мишенната последователност.
Разделянето на веригите може да бъде осъществено по който и да е подходящ начин, включително с физични, химични или ензимни средства, които са познати на специалиста в областта.Предпочитан метод е физичният, включващ нагряване на нуклеиновата киселина до нейното пълно / >99%/ денатуриране.Типичното денатуриране предвижда интервал от около 80°С до около 105°С за време от около 1 до 10 минути.
След хибридизиране на HCV сДНК с праймерите, мишенните HCV последователности се репликират с полимеризиращи средства, които използват праймерен олигонуклеотид за иницииране на синтезата на репликиращата верига. Праймерите са подбрани така, че да са комплементарни на последователностите на HCV генома. Олигомерните праймери,които са комплементарни на области от смислови и антисмислови вериги на HCV сДНК, могат да бъдат конструирани от HCV сДНК последователности от съставната сДНК последователност, показана на фиг. 18.
Праймерите са подбрани така, че техните релативни позиции по продължение на дуплексната последователност са такива, че един разширен продукт, синтезиран от един праймер, когато е отделен от своята матрица/комплемент/, служи като матрица за увеличаване на друг праймер за добиване на репликираща верига с определена дължина.
Праймерът е за предпочитане едноверижен с оглед максимална ефективност при амплификация, но може и обратно- да бъде двойноверижен. В този случай праймерът найнапред се подлага на въздействие за разделяне на веригите, преди да се използва за получаване на екстензионни продукти. За предпочитане е праймерът да бъде олигодезоксирибонуклеотид. Праймерът може да бъде достатъчно дълъг, така че да инициира синтезата на екстензионните продукти в присъствието на агента за полимеризация. Точната дължина на праймерите би зависила от много фактори, включително от температурата и източника на праймера и съответно използвания метод. Например в зависимост от пълнотата на мишенната последователност, олигонуклеотидният праймер обикновено съдържа около 15-45 нуклеотида, макар че може да съдържа повече или по-малко нуклеотиди. Късите праймерни молекули изискват по-ниски температури за формиране на достатъчно стабилни хибридни комплекси с матрицата.
Използваните тук праймери са подбрани така, че да бъдат по същество комплементарни
BAD ORIGINAL на различните вериги ст всяка специфична последователност за амплифициране.Поради това праймеритс не е необходимо да отразяват точната последователност на матрицата, но трябва да бъдат достатъчно комплементарни за селективна хибридизация със съответните им вериги. Например некомплементарен нуклеотиден фрагмент може да бъде присъединен къ?и 5'-края на праймера, с остатъка на праймерната последователност, която е комплементарна на веригата. Обратно некомплементарни бази или по-дълги последователности могат да бъдат прехвърлени към праймера, като се осигурява по този начин достатъчна комплементар.чост с последователността на една от веригл ге за амплифиииране, с които трябва да се осъществи хибридизация и с която да се формира дуплексна структура, която може да бъде увеличена с полимеризиращи средства. Некомплементарната нуклеотидна структура на праймерите може да включва рестрикционни ензимни сайтове.Прибавяйки рестрикционния сайт към края на мишенната последователност, може да бъде особено полезно за клонирането на мишенната последователност.
Лесно може да се разбере, че “праймер”, както е използван тук този термин, може да се отнася до повече от един праймер, по-специално в случая, когато е налице известна двусмисленост на информацията, отнасяща се до терминалната последователност от мишенната област за амплифициране.Следователно “праймер” включва колекция от праймерни слигонуклеотиди, съдържащи последователности, представящи възможните варианти з последователността или включва нуКлеотиди, които позволяват типично удвояване на базите.Един от праймерните олигонуклеотиди ъ гази колекция ще бъде хомоложен с края на мишенната последователност. Специфичен случай е показан в примерите, където олигомерните системи от 44мери и 45-мери са използвани за инициираме амплификацията на потенциален вариантен регион от HCV генома.
Предвижда се, че ще се явят различни щамове или изолати на HCV с последователност, които произтичат от BCVp протстипнгят щам. Поради това, с оглед откриване ча различни щамове, за предпочитане е да бъдат конструирани праймери, които се хябридизират към съхранени области на HCV генома. Тези съхранени области могат да бъдат определени чрез сравня ване на нуклеотидните или аминокиселинните последователности на няколко HCV щама/ изолати. Очевидно има най-малко три области от съхранените аминокиселини в HCV генома, описан по-горе, от който могат да бъдат получени праймерите.Счита се, че такива области действително съществуват. Праймерите, описани понататък, в примерите са получени от областите HCV, за които се счита, че са съхранени, основаващи се на секвенционната хомоложност на тези от Флавивириде.
Олигонуклеотидните праймери могат да бъдат създадени по който и да е от подходящите методи.Такива методи за създаване на олигонуклеотиди със специфична последователност са известни в областта, и включват например клониране и рестрикция на подходяща последователност , и директен химичен синтез.Химичните методи на синтез могат да включват например фосфотриестерният метод, описан от Narang et al /1079/, фосфодиестерният метод, описан от Brown et al /1979/, диетилфосфорамидатният метод, описан от Beacaoe et а 1 /1981/, и твърдофазовият метод, описан в US патент № 4 458 066.
Праймерите могат да бъдат белязани по желание чрез инкорпориране на средства, които могат да бъдат открити спектрофотометрично, фотохимично, биохимично, имунохимично или химично.
Зависимото от матрицата увеличение на олигонуклеотидните праймери се катализира от полимеризиращи агенти в присъствието на съответни количества от четирите дезоксирибонуклеотид трифосфати / άΑΤΦ, άΓΤΦ, 6СТФ и бТТФ/ или техни аналози в реакционна среда, която включва подходящи соли, метални катиони и pH буферни системи. Подходящи полимеризиращи агенти са тези ензими, които са познати да катализират праймер- и матричнозависимата ДНК синтеза. Познатите ДНК полимерази включват например E.coli ДНК полимераза I или неговия Klenof фрагмент, Т4 ДНК полимераза и Tag ДНК полимеразата. Реакционните условия за катализиране на ДНК синтезата с тези ДНК полимерази са известни за специалистите в областта.
Продуктите на синтезата са дуплексни молекули, състоящи се от матричните вериги и праймерните увеличени вериги, които включват мишенната последователност. Тези продукти, обратно, служат като матрица за друг ци-
къл на репликация.Във втория цикъл на репликация праймерната верига от първия цикъл се линеализира с нейния комплементарен праймер: синтезира се добив от “къс” продукт, които е свързан и в двата - 5'-края и 3'- краищата от праймерни последователности или техни комплементи.Повторните цикли на дгиатуриране, праймерното линеализиране и екстензия води до експоненциално акумулиране иа мишенния регион, определен от праймера. Превеждат се толкова цикли, че да са достатъчни за получаване на желаното количество полинуклеотид, съдържащ мишенния регион на нуклеиновата киселина. Желаното количество меже да варира и се определя от функцията, кояте ще осъществява полинуклеотиднияг продукт.
РСР метода може да бъде осъществен за множество временни последователности.Например той може да бъде проведен поетапно,където след всеки нов етап се добавя нед реагент, или по начин, според който всички реагенти се добавят синхронно или на части поетапно, където свежите реагенти се добавят след даден брой етапи.
В предпочитания метод, PCR реакцията се провежда като автоматизиран процес, който използва термостабилен ензим. Ь тс-зи процес реакционната смес се провежда през денатуриращ регион, праймерно линеализиращ регион и реакционен регион.Може да бъде използвана машина, която е специфично адаптирана за употреба с термостабилен ензим, която нзползза температурно третиране без участието на течности, тъй като ензимът не се нуждае от добавяне във всеки цикъл. Този тип машина е търгозеки достъпна чрез Perkin Elmer Cetus Corp.
След аплифициране с PCR, мишенните полинуклеотиди се откриват чрез хибридизация с нуклеотидна сонда, която формира стабилен хибрид с този от мишенната последователност при ограничаване до умерени хьбридизационни и промивни условия. Ако се очаква, че сондите ще бъдат напълно комплементарни /т.е. около 99% или повече/ на мишенната последователност, ограничените условия ще бьдат използвани.Ако се очакват някои несъответствия, например, ако някои щамове се очаква да са със сонди, които не са напълно комплементарни, ограничаването на хибридизацията ще бъде намалено. Въпреки това условията се подбират, без да се счита неспецифичното /случайно/ свързване.Услсвиз, които предизвикват хибридизиране, и които под бират неспецифично свързване, са известни в областта, и са описани например от Maniatis et al. /1982/. По-ниски солеви концентрации и по-високи температури повишават степента на ограничаване на свързването.Например обикновено се счита, че ограничаването на условията е инкубиране в разтвори, които съдържат приблизително 0,1 х SSC, 0,1% SDS при около 65°С инкубационна/промивна температура, и умерено ограничени условия за инкубация в разтвори, които съдържат приблизително 1-2 х SSC,O,1 % SDS и около 50-65°С инкубационно/ промивна температура.По-ниски ограничителни условия са 2 xSSC и около 30-50°С.
Сонди за HCV мишенни последователности могат да бъдат получени от HCV сДНК последователността, показана на фиг. 18, или от нови изолати.НСУ сондите могат да бьдат с каквато и да е подходяща дължина, която покрива машинната област, но изключва праймерите и позволява специфична хибридизация към мишенната област.Ако е налице пълна комплементарност, т.е. ако щамът съдържа последователност, идентична на тази от сондата, доколкото дуплексът бъде релативно стабилен при дори ограничени условия, сондите могат да бъдат къси, т.е.в интервала от 10-30 двойки бази. Ако се очаква известна степен на несъответствие със сондата, т.е.ако се предполага, че сондата ще се хибридизира с различни региони, тази сонда може да бъде с по-голяма дължина, доколкото дължината би могла да балансира някои от ефектите на несъвпадение. Пример за това е даден в примерите, където сондата е конструирана така, че да свърже потенциални варианти на HCVrB този случай праймерите са конструирани да се свързват към HCV сДНК, пол^еяа от хипотетично съхранени региони на HCV генома, и мишенната област е една, която потенциално съдържа варианти /основани на модел на Флавивириде/. Сондите, използвани за откриване на HCV мишенната последователност, съдържа приблизително 268 двойки бази.
Сондите нуклеинови киселини, които притежават комплементарност на последователността спрямо мишенната последователност, могат да бъдат синтезирани с помощта на аналогични техники, описани по-нататък, за синтез на праймерни последователности.По желание сондата може да бъде белязана.Подходящите маркери са описани по-горе.
В някои случаи може да бъде желателно
да се определи дължината на PCR продукта, открит със сондата. Това може да бъде частична истина, ако се очаква, че варианти на HCV щамове може да съдържат делеции в рамките на мишенната област, или ако някой желае да потвърди дължината на PCR продукта. В такъв случай за предпочитане е продуктът да бъде подложен на анализ за размера така, както хибридизирането със сонда. Методи за определяне на размера на нуклеиновите киселини са познати в областта, и включват например гел електрофореза, седиментация в градиснти и гел ексклузивна хроматография.
Присъствието на мишенната последователност в биологична проба се установява чрез определяне дали е формиран хибрид между HCV полинуклеотидната сонда и нуклеиновата киселина, подложена на PCR амплификация.Методи за откриване на хибридите. формирани между сондата и последователност на нуклеинова киселина са известни в областта. Например за удобство една набелязана проба може да бъде прехвърлена върху твърда повърхност, към която тя се свързва, и свързаната проба д? се подложи на въздействие на условия, позволяващи специфично хибридизиране с белязана сонда. Твърдата повърхност след това се изпитва за присъствие на белязана сснда.
Ако пробата е белязана, небслязаната сонда се свързва с матрикс и след това се подлага на въздействие на подходящи хибрмднзацчонни условия с последващо изследване на маркировката. Други подходящи хибрндизационни изследвания са описани по-горе.
Определяне на варианти HCV последователности с помощта на PCR
С оглед идентифицирането на различни HCV щамове, и поради това-конструираие на сонди за тези варианти, описаният г.о-горе HCV/ cPCR метод се използва за амплифициране на варианти от различни региони на HCV генома, така че нуклеотидната последователност на тези вариантни мишенни региони да могат да бъдат определенй.Различни типове па HCV може да се очакват в различни географски райони, където HCVj щамът да е предомииантен, например Япония, Африка и др.;илп в различни гръбначни животни, които също са инфектирани с вируса. Различни HCV могат също така да възникнат по време на пасирансго на тьканни културални системи, или да са резултат от спонтанни или индуцирани мутации.
За амплифициране на различни мишенни региони, праймерите се конструират така, че да фланкират подозирания регион и за предпочитане са комплементарни на съхранените региони. Праймери за два региона от HCV, които са вероятно съхранени, основани на модела на Флавивириде, са описани в примерите. Тези праймери и сонди могат да бъдат конструирани с помощта на информацията за последователността на HCV1 щама, показана на фиг.18.
Анализът на нуклеотидната последователност на мишенния регион може да бъде директен анализ на PCR амплифицираните продукти. Метод за директен секвенционен анализ на PCR амплифицирани продукти е описан от Saiki et al./1988/.
Обратно, амплифицирана мишенна последователност/™/ може да бъде клонирана преди секвенционния анализ.Метод за директно клониране и секвенционен анализ на ензимно амплифицирани геномни сегменти е описан от Scharj /1986/.В метода използваните праймери в PCR техниката са модифицирани в близост до 5-краишата за получаване на подходящи рестрикционни сайтове за клониране директно в например М13 секвенционния вектор.След амплификацията, РСРпродуктите се разграждат с подходящи рестрикционни ензими. Рестрикционните фрагменти се лигатират в М13 вектора, и се трансформират в например 1М 103 гостоприемника, изваждат се и получените плаки се скринират чрез хибридизация с белязани олигонуклеотидни сонди.Известни са и други методи за клониране и секвенционен анализ.
Универсални праймери за флавивируси и.за HCV
Изследванията за природата на HCV генома с помощта на сонди, получени от HCV сДНК, както информацията за последователността,включена в рамките на HCV сДНК, водят до предположението, че HCV е вирус, подобен на Флавивируса. Тези изследвания са описани в ЕРО публикация №318 216, включена в литературата. Сравняването на НСУсДНК последователността, получена от HCV сДНК клонове с познати последователности от различни флавивируси, показват че HCV съдържа последователности, хомоложни на съхранените последователности у Флавивирусите.Тези съхранени последователности могат да позволят създаването на праймери, които да са универсални при използването им за ампли27 фикация на мишенни области от Флааивирусите и от HCV. Тези последователности са 16-мерни или по-малки последователности от З' края на праймерите, описани в тримерите. Идентифицирането на видовете след това се провеж да с помощта на сонда, специфична за вида. Гсномите на различни Флавиеируси са известни в областта и включват, например Японският вирус на енцефалита /Sumiyoshi et al./1987/ /, випуса на жълтата треска / Rice ет al ./1985/,,Деп^ае Type 2 вируса /Hahn et al./1985/, flengue Type 4 вирус / Москва 1987 /, West Nile вируса / Castle et ь1. /1986/. Идентифицирането на HCV PHK ce осъществява c помощта на сонди, специфични за HCV, последователността на които може да се определи HCV сДНК последователността, осигурена тук.
Обратно, използването на система от сонди, конструирани така, че да сгчете дегенерацията на кодоните и поради това- съдържаща общи последователности с Флавивирусите и с HCV, както е определено чрез сравняване на HCV аминокиселините последователности с познати последователности на Флавивирусите. позволява обща детекционна система за този вируси.
Конструиране на желани ДНК последователности
Синтетични олигонуклеотзди могат да бъдат създадени с помешта на автоматизиран олигонуклеотиден синтезатор, както е описано от Warner /1984/. По желание синтетичната верига/ги/ може да бъде белязана с 32Р чрез третиране с полинуклеотидкиназа в присъствието на 32Р-АТФ и в подходящите стандартни за провеждане на реакцията условия.
ДНК последователности,включително изолирани от сДНК библиотеки, могат да бодат модифицирани чрез познати техники, включително например, сайт-насочена мутагенеза, както е описано от Zoller/1982/. Накратко, за да бъде модифицирана, ДНК се зъвежда във фаг като едноверижна последователност, и се преаръща в двойноверижна ДНК сДНК пслимераза посредством участието в качеството на праймер на синтетичен олигонуклеотид, комплементарен на част от модифицираната ДНК, и при наличието на желаната модификация, включена в нейната собствена последователност. Получената з резултат двойноверижна ДНК след тоза се въвежда във фагподдържаща гостоприемникова бактерия. Културите от трансформираната бактерия, които съдържат репликация на всяка верига ст фага, се посяват в агарни пластинки за получаване на плаки.Теоритично, 50% от новите плаки съдържат фаг, притежаващ мутантната последователност, и останалите 50% притежават оригиналната последователност. Репликатите от плаките се хибридизират към белязани синтетични сонди при температури и условия, които позволяват хибридизиране с коректната верига, но не и с немодифицирана последователност. Последователностите, които са идентифицирани чрез хибридизация, се възстановяват и клонират.
Китове за скрининг от HCV полинуклеотиди
Олигомерите, които са сонди и/или праймери за амплификация и/или скрининг на проби от HCV, могат да бъдат оформени в китове.Китовете за скрининг на HCV последователности включват олигомерни сонди ДНК. Китовете за амплификация на HCV последователности могат да включват олигомерните праймери, използвани за амплификацията. Обикновено китовете съдържат сондите или праймерите в предварително измерени или предварително определени количества, кактои други подходящи реагенти и материали в отделни подходящи контейнери, необходими за специфичното хибридизиране и/или амплифициране. Например китът може да съдържа образци, буфери, носители, ензими, белязани сонди, субстрати, свързващи партньори и/или инструкции за провеждане на теста.
Следващите примери илюстрират изобретението, без да го ограничават.
Изолиране и съгласуване на припокриващите се HCV сДНК клонове 13 i,26j, СА59а, СА84а, СА156е, и СА167в
Клоновете 13i,26j, СА59а, СА84а, СА156е и СА167в, се изолират от λ gt 11 библиотека, която съдържа HCV сДНК /АТСС №40394/, получаването на които е описано в ЕРО публикация №318 216 /публ.31.05.1989/ и WO89 04669 /публ. 1.06.1989/. Скрининга на библиотеката се провежда със сондите, описани в статията на Ниупп /1985/. Честотата, с която се явяват позитивните клонове със съответните сонди, е около 1 на 50 000.
Изолирането на клон 131 се осъществява с участието на синтетична сонда, получена от последователността на клон 12/. Последователността на сондата е :
5’ С-АА CGT TGC GAT CTG GAA GAC
BAD ORIGINAL
AGG GAC AGG 3'
Изолирането на клона 26j се осъществява с участието на сонда, получена ст 5'-областта на клон К9-1. Последователността ча сондата е : 5' TAT CAG ΤΊΆ TGC CAA CGG AAG CGG ССС CGA 3'
Процедурата на изолиране за клон 12f и за клон к9-1/ наречен още К9-1/ е описана з ЕРО публикация N° 318 216 и техните последователности са показани на фигури 1 л 2. HCV сДНК последователностите от клоновете 13i и 26j, са показани на фчг.4 и 5. Показани са освен това аминокиселините, кодирани там, както и съвпадението на клон 13i с клон 12f, и съвпадането на клон 12j с клен 13i. Последователността на тези клонове потвърждава последователността на клона К9-1. Клонът К9-1 е изолиран от различни HCV сДНК библиотеки /ьиж ЕРО публикация №218 316/.
Клонът СА 59ъ е изолиран с участието на сонда, основана на последователността от 5'-о5ластта от клон 26].Тази последователност на сондата има вида:
5'-CTG GTT AGC AGG GCT ТТТ СТА ТСА CCA САА 3'
Сондата, получена от последователността на клон СА59а се използва за изолиране на клона СА84. Последователността на сондата, използвана за това изолиране, е :
5’ AAG GTC CTG GTA GTG CTG CTG СТА ТТТ GCC 3'
Клонът СА156е е изолиран с помощта на сонда, получена от последователността на клон СА84а. Последователността на тази сонда е :
5' ACT GGA CGA CGC AaG GTT GCA ATT GCT CTA 3'
Клонът CAI67в е изолиран е помощта на сонда, получена от последователността на клон СА156е. Последователността на гази сонда е :
5’ТТС GAC GTC АСА TCG ATC TGC TTG TCG GGA 3'.
Нуклеотидните последователности на HCV сДНК клоновете в клонове СА59а, СА84а, СА156е и СА167в са показани на фигури 6, 7, 8 и 9 съответно. Кодираните тук аминокиселини, както и припокриването с последователностите на релевантните клонове, също са показани на фигурите.
Създаване на “pi” HCV сДНК библиотека.
Библиотека от HCV сДНК, “pi” библиотеката, е създадена от сьщата инфектирана плаз ма на шимпанзе, която е използвана за създаване на λ- gt 11 HCV сДНК библиотеката /АТСС №40394/, описана в ЕРО публикация №318 216 и с помощта на същата техника. Обаче конструирането на pi библиотеката използва праймерекстензионен метод, в който праймерът за обратна транскриптаза се основава на последователността от клон СА59а. Последователността на праймера е : 5' GGT GAC GTG GGT ТТС 3'.
Изолиране и съгласуване на последователността на клон pi 14а
Скринингът на “pi” HCV сДНК библиотеката, описана по-горе, със сондата, използвана за изолирана на клон СА167в /виж погоре/, води до получаване на клон pi 14а. Клонът съдържа около 800 двойки бази от сДНК, които се припокриват с клоновете СА167в, СА156е, CAS4a и СА59а, които са изолирани от Xgt-ll HCV сДНК библиотеката /АТСС №40394/. Допълнително pi 14а съдържа също около 250 двойки бази от ДНК, които са нагоре от HCV сДНК клона СА167в.
Изолиране и последователност на клоновете СА216а, СА290а и ag 30а.
На базата на последователността от клон СА167в, една синтетична сонда е съгласувана по отношение на АК последователности така, че да добие вида :
5' GGC ТТТ ACC ACG ТСА CCA ATG ATT GCC СТА 3'
Тази сонда се използва за скрининг на продукта, получен от клон СА216а, чиято HCV последователност е показана на фиг. 10.
Конструирана е и друга сонда на базата на последователността на клон СА216а, притежаваща следната последователност :
5’ ТТТ GGG ТАА GGT CAT GGA ТАС ССТ ТАС GTG 3'
Скринингът на λ gt 11 библиотеката / АТСС №40394/ с тази сонда води до получаване на клон СА290а, HCV последователността на която е показана на фиг.11.
При паралелен подход е създадена праймерекстензиснна сДНК библиотека с помощта на нуклеинова киселина, екстрахирана от същата инфектирана плазма, използвана в оригиналната λ-gt 11 сДНК библиотека, описана погоре, Използваният праймер се основава на последсвателността на клоновете СА216а и СА290а:
5' GAA GCC GCA CGT AAG 3' сДНК библиотеката е създадена с помощта на методи, аналогични на тези, описани по-рано за библиотеките, използвани за изолиране на клонове pi 14а и к9-1. Използваната сонда за скриниране на тази библиотека се основава на последователността на клон СА290а
5’ CCG GCG ТлС GTC GCG CAA ТТТ GGG ТАА 3'
Клонът ag30a е изолиран от новата библиотека с описаната по-горе сонда и съдържа около 670 двойки бази от HCV последователността /фиг. 12/. Често от тази последователност съвпада с HCV последователността на кленозете СА216а и СА290а. Около 300 двойки бази от аоЗОо последователността, обаче, е нагоре ст последователността от клон СА 290а. Несъвпадащата последователност показва начален кедон /*/ и стоп кодони, които могат да индикират стартирането на HCV ORF.Ha фиг. 12 са показани и предполагаемите малки кодирани пептиди /#/, които могат да играят определена роля при регулиране на транслацията, така както предполагаемата първа аминокиселина ст предполагаемия полипептид [%], и аминокиселините, насочени надолу от последователността, кодирани тук.
Изолиране и последователност ча клон СА205а
Клонът СА205а е изс тиран от оригиналната λ gT-11 библиотека / АТСС № 40394 / с помощта на синтетична сонда, получена от HCV последователността на клона СА 290а /фнт.11/. Последователността на сондата с :
5' TCA GAT CGT TGG TGG AGT ТТА GTT GTT GCC 3'.
Последователността на HCV сДНК в СА205а, посочена на фигура 13, припокриза сДНК последователностите в двата клона ag 30а и СА290а. Припокриването на последователността с тази на СА290а е посочена с пунктирана линия над последователността /фигурата посочва също предполагаемите аминокиселини, кодирани в този фрагмент/.
Както се наблюдава от HCV сДНК последователностите в клонове СА2С5а и ag3Ga, предполагаемият HCV полипротеин изглежда започва в ATG началния кодон:НСУ последователностите в двата клона съдържат един зьтрешнорамков, непрекъснат двоен стоп кодон /TGATAG/ на четиридесет и втория нуклеотид над този ATG.HCV ORF изглежда започва след този стоп кодони и се разпростира за най-малко 8907 нуклеотида /виж съставната HCV сДНК,фиг. 18/.
Изолиране и последователност на клон 18
Въз основа на последователността на клон ag30a /виж фиг. 12/ и на припокриващия клон от оригиналната λ gt-11 библиотека /АТСС №40394/, се получава една синтетична сонда, която има следната последователност:
5’ CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA 3'
Скринингът на оригиналната λ gtll HCV сДНК библиотека със сондата дава клон 18g, като HCV сДНК последователността е посочена на фиг. 14. На фигурата са посочени също припокриването с клон ag30a и предполагаемите полипептиди, кодирани вътре в HCV сДНК.
сДНК в клон 18g/C18g или 18g/npnnokрива този в клонове ag30a и СА205а, описани по-горе. Последователността на C18g също съдържа двоен стоп кодонен регион, наблюдаван в клон ag30a. Полинуклеотидната зона над тези стоп кодони вероятно представлява част от 5'-областта на HCV генома, който може да съдържа къси ORF’S и който може да бъде потвърден чрез директно съгласуване на пречистения HCV геном. Тези предполагаеми малки кодирани пептиди може да играят роля на регулатор на транслацията. Областта на HCV генома нагоре от тази представена от C18g, може да бъде изолирана за секвензионен анализ при използване на методиката, описана в /121/ за изолиране на сДНК последователности нагоре от HCV последователност в клон 12f. По същество, малки синтетични олигонуклеотидни праймери за обратна транскриптаза, които са основани на последователността на C18g, се синтетизират и се използват за свързване към съответната последователност в HCV геномна ДНК. Праймерните последователности са проксимални на познатия 5'край на C18g, но достатъчно надолу, за да позволят конструирането на последователността на сондата нагоре от праймерните последователността. Използват се познатите стандартни методи за прайминг и клонинг. Получените в резултат сДНК библиотеки се скринират с последователности нагоре от праймерните сайтове /както е изведено от пояснената последователност C18g/. HCV геномната РНК се получава или от плазма или от пробни образци черен дроб от индивиди с нито А, нито В хепатит. Доколкото HCV изглежда да е подобен на флавивирус, 5'-края на генома може да бъде модифициран с една структура, означена като “тапа”. Известно е, че флавивирусните геноми съдържат 5'крайни такива структури/вирус на жълтата треска, виж /79/ и /32/.
Изолиране и последователност на клон от β-HCV сДНК библиотеката
Клонове, съдържащи сДНК представители на 3'-крайната област на HCV генома, се изолират от сДНК библиотеката, съставена от инфектирана плазма на шимпанзета, използвана за получаване на HCV с ДНК λ-gt 11 библиотека /АТСС №40394/, описана в /121/. С оглед получаване на ДНК библиотеката, RHK,екстрахирана от плазма, се прикачва към поли гА при използване на поли /гА/ полимераза и сДНК се синтезира при използване на олиго/бТ/1218 като праймер за обратна транскриптаза. Полученият РНК/сДНК хибрид се разгражда с РНК-аза Н и се превръща в двойноверижна HCV сДНК. Резултантната HCV сДНК се клонира в λ gt 10 при изпатзване на методиката, описана в /41/, като се получава β /или в/ HCV сДНК библиотека. Използваната последователност от операции е както следва.
Една аликвотна част /12 мл/ от плазмата се третира с протеиназа К и се екстрахира с равен обем фенол, наситен с 0,05 М трис-cl pH 7, 5, 0,05% /обем/обем/ β меркаптоетанол, 0,1%/тегло/обем/ хидроксихинолин, 1мМ ЕДТА. Получената водна фаза се екстрахира повторно с фенолна смес, последвано от три екстрахирания с 1:1 смес, съдържаща фенол и хлороформ: изоамил алкохол /24:1/, последвано от две екстрахирания със смес хлороформ и изоамил алкохол /1:1/. След довеждане на водната фаза до 200 мМ с оглед на натриев хлорид, нуклеиновата киселина във водната фаза се преципитира за една нощ при -20°С с 2,5 обема студен абсолютен етанол. Преципитатите се събират чрез центрофугиране при 10 000 об./мин за 40 мин, промива се с 70% етанол, съдържащ 20 мМ натриев хлорид и със 100% студен етанол, изсушава се пет минути в десикатор и се разтваря във вода.
Изолираните нуклеинови киселини от инфектирана плазма от шимпанзета се прикрепва с поли гА използувайки поли-А полимераза в присъствието на инхибитор от рибонуклеаза на човешка плацента /НРИ1//доставяна от Амершам корп./, като се използва като носител MS2 РНК.Изолираните нуклеинови киселини, еквивалентни на тази от 2 мл плазма, се инкубират в разтвор, съдържащ ΤΜΝ/50μΜ Трие солна киселина, pH 7,9, 10 мМ магнезиев двухлорид, 250 мМ натриев хлорид, 2,5 мМ манганов двухлорид, 2 мМ дитиотреитол /ДТТ/, 40 микромоларна α-/32 Р/АТФ 20 единици HPRI/Амершам Корп./ и около 9 до 10 единици рибонуклеаза, свободна от поли-А полимераза /BRL/. Инкубира се за 10 мин и реакцията се спира с ЕДТА /крайна концентрация около 250 мМ/. Разтворът се екстрахира с равен обем фенолхлороформ и с еднакъв обем хлороформ и нуклеиновите киселини се преципитират една нощ при -20°С с 2,5 обема етанол в присъствието на 200 мМ натриев хлорид.
Изолиране на клон в5а β HCV cDNA се разпределя чрез хибридизнране при използуване на синтетична сонда, която има последователност, базирана на HCV cDNA последователността в клон 15е.Изолирането на клон 15е е описано в /121/ и неговата последователност е посочена на фиг.З, последователността на синтетичната сонда е :
5ΆΤΤ GCG AGA ТСТ ACG GGG ССТ GCT ACT CCA 3'
Разпределянето на библиотеката дава клон β-Sa /в5а/, който съдържа една HCV сДНК зона с приблизително 1000 бази двойки.5'-областта на тази сДНК препокрива клонове 35f,19g, 26g 15е/описани по-горе/. Зоната между 3'-терминалната поли-А последователността и 3'последователността, която препокрива клон 15е, съдържа приблизително 200 базови двойки. Този клон позволява идентифицирането на област на 3'-терминалната последователност на HCV генома.
Последователността на в5а се съдържа в последователността на HCV сДНК в клона 16jh/ описан по-долу/.Освен това, последователността е представена в СС34а,изолирана от оригиналната λ gtll библиотека/АТСС №40394/. Оригиналната λ gtll библиотека се съобщава тук като “С” библиотека.
Изолиране и последователност на клонове, генерирани чрез PCR амплификация на 3'- областта на HCV генома.
Получени са мултиплени с ДНК клонове, които съдържат нуклеотидни последователности, произхоздащи от 3'- областта на HCV генома. Това се придружава от амплификация на мишенната област на генома чрез полимеразна верижна реакция, описана в /78/ и в /79/, която се модифицира, както е описано по-долу.Амплифицираната HCV ДНК е получена от сборна оригинална инфектирана плазма на шимпанзета, използвана за създаване на HCV сДНК λ gt 11-библиотека (АТСС №40394), описано в /121/. Изолирането на HCV РНК става, както е описано по-горе. Изолираната рибонуклеинова киселина се прикачва след 3'-края с АТФ чрез Е. coli поли-А полимераза, както е описано 5 в Sippel (1973), с изключение на това, че нуклеиновите киселини, изолирани от серум на шимпанзе, са заместени със субстрат нуклеинова киселина. Прикачената отзад рибонуклеинова киселина се транскрибира обратно към сДНК с обратна транскриптаза при използване на олиго а Т-праймерен адаптер, както е описано в (33), с изключение на това, че компонентите и последователността на праймерния адаптер са:
Пълнител Notl SP6 промотер Праймер
ААТТС GCGGCCGC CATACGATTTAGGTGacacTaTAGAA Т15
Резултантната сДНК се подлага на амплификация с PCR с използване на два праймера:
Праймер jH 32 (30-мерен) jHll (20-МЕРЕН) jH32 праймерът съдържа 20 нуклеотидни последователности, хибризируеми към 5'-края на мишенната област в сДНК, при изпитване на Тш на 66°С. аН се получава от част на олиго 'Tпраймерния адаптер. Това е специфично за S'края на сДНК‘при Тт на 64°С. Двата праймера са конструирани така, че да имат място за разпознаване за рестрикционния ензим, Notl на 3'края, за използване при последващото клониране на амплифицираната HCV сДНК.
PCR-реакцията се извършва чрез суспендиране на сДНК и праймерите в 100 МК реакционна смес, съдържаща четирите дезоксинуклеотид трифосфата, буферни соли и метални йони и една термостабилна ДНК полимераза, изолирана от Thermus aguaticus (TAg полимераза), които са Perkin Elmer Cetus PCR КИТ (N801-0043 или N801-0055). PCR-реакцията се осъщесвява в 35 цикъла в Perkin Elmer Cetus PCR ДНК термоциклизатор. Всеки цикъл се състои от 1,5 мин етап за денатуриране при 94°С, етап за темпе- 40 риране при 60”С за 2 мин и праймер екстензионен етап при 72°С за 3 мин. PCR продуктите се подлагат на Sonthem blot анализ с участието на 30 нуклеотидни сонди, уН34, последователността на които е основана на тази на 3'-крайната 45 област на клон 15е.Последователността на уН34 е :
5' СТТ GAT СТА ССТ CCA АТС АТТ CAA AGA СТС 3’.
PCR продуктите, откривани чрез HCV 50 сДНК сонда, са с големина от около 50 до около 400 бази двойки.
Последователност
ATAGCGGCCGCCCTCGATTGCGAGATCTAC
AATTCGGGCGGCCGCCATACGA
С оглед клониране амплифицираната HCV сДНК, PCR продуктите се разграждат с Notl и се подбират по големина чрез полиакриламидна гел електрофореза. ДНК, по-голяма от 300 бази двойки, се клонира в Notl мястото на pUC18S. Векторът pUC85S се конструира чрез включване на Notl полилинкер, клониран между EcoRI и Sall сайтовете на pUC18. Клоновете се скринират за HCV сДНК при използване на JH сонда. Получените позитивни клонове се подлагат на съгласуване на последователността. Нуклеотидната последователност на HCV ДНК инсерта в един от тези клонове, 16 yh, и аминокиселините, кодирани там, са показани на фигура 15. Нуклеотидната хетерогенност, установена в последователността на HCV сДНК в клона 16 jh в сравнение с друг клон от този регион, е показана във фигурата.
Изолиране и последователност на клон 6к. Въз основа на последователността на Клон 16jh и клон в5а (виж по-горе) се изработва синтетична сонда, имаща следната последователност:
5' ТСТ ТСА ACT GGG CAG TAA GAA CAA AGC ТСА 3'
Скрининга на оригиналната λ gt 11 сДНК библиотека (описана в /121/) със сондата дава клонове с честота приблизително 1 на 106; един от тях се нарича клон 6к (наричан също Сбк), HCV сДНК последователността на който е посочена на фиг. 16. На фигурата е посочено също препокриването с клон 16 jh, и предполагаемите полипептиди, кодирани в рамките на HCV сДНК. Информация за последователността на HCV сДНК в клон 6к се получава само от една лента.Информация относно депозиране на този клон е представена по-нататък, при което клонът се вписва като λ gtll Сбк. Потвърждаване на Сбк последователност като част от един ORF кодиращ HCV1 полипептид се получава чрез съгласуване на други препокриващи се клонове.
Изолиране и последователност на клон pl31jh.
Клон, съдържащ последователност от 3'областта на HCV генома, съдържащ един вътрешнорамков стоп кодон, се изолира, както е посочено по-горе за изолирането на клонове, получени чрез PCR амплификация на 3'-областта от генома, с изключение на това, че HCV1 рибонуклеиновата киселина се превръща в сДНК при използване на олигонуклеотида
5’ААТ TCG CGG CCA TAC GAT ТТА GGT GAC
ACT АТА GAA Т15 3’
Тогава cDNA се амплифицира чрез PCR реакцията при използване на праймерите:
5’ТТС GCG GCC GCT АСА GCG GGG GAG АСА Т 3' и
5' AAT TCG CGG CCG CCA TAC GA 3’ След амплификация PCR продуктите се преципитират със спермин, разграждат се с Notl и се екстрахират с фенол.Пречистените продукти се клонират в Notl сайта на PUC18S и HCV позитивни клонове се подбират, като се използва олигонуклеотида:
5' CGA TGA AGG TTG GGG ТАА АСА СТС CGG ССТ 3'
HCV сДНК в един клон, означен като pl31 jh, е показан на фиг.17. Този клон съдържа вътрсшнорамков стоп кодон за голямата ORF, съдържащ се в HCV генома.
Изолиране и последователност на клон 5'5 клон 32
Клон, съдържащ последователност от 5' областта на HCV генома нагоре от последователността в клон в 114а, се изолира и нуклеотидната му последователност се определя чрез една модификация на метода за изолиране и съгласуване на последователността на клоновете, генерирани чрез PCR амплификация на 3'областта на генома, описани в /122/, включен в литературната справка. Най-общо, една мишенна област на генома се амплифицира чрез PCR методиката, описана от Saikiefal /78/ и /79/. HCV амплифицирана РНК е получена чрез екстрахиране от човешки серум (САЩ клиничен изолат, HCV 27) с използването на студен гуанидин-тиоцианатният метод, описан от Han et al /33/.Екстрахираната РНК се превръща в едноверижна сДНК с обратна транскриптаза с помощта на паймер, който е комплементарен за нуклеотиди от -250 до -223 на HCV генома (виж фиг.18).Последователността на jH94 е :
5' CCT GCG GCC GCA CGA САС ТСА ТАС ТАА 3'
Превръщането на единично- в двойноверижна HCV сДНК се извършва чрез прикачване на ДНК с преблизително 20 до 50 dA остатъка, използвайки терминална дезоксинуклеотидил трансфераза /48/ и реплициране на така получената молекула с помощта на следния олигоdT праймерен адаптер, който включва NOtl сайт и един sp6 промотор:
Пълнител Notl sp6 промотор Праймер
ААТТС GCGGCCGC CATACGATTTAGGACACTATAGAA Т15
Получената ДНК се подлага на ампли- jH94 (описана по-горе) и jHll, който имаследфициране чрез PCR с помощта на два праймера, ната последователност:
Праймер Последователност jHl 1 (20гмерен)
AATTCGGGCGGCCGCCATACGA
PCR реакцията се извършва чрез суспензиране на сДНК и праймерите в 100 МКЛ от реакционната смес, съдържаща четири дезсинуклеозидтрифосфати, буферни соли и метални йони и една термостабилна ДНК полимераза, изолирана от Thermus aguaticus (Tag полимераза), които са в Perkin Elmer Cetus PCR Кит (N8010043 или N801-0055). PCR реакцията се извършва в 35 цикъла в Perkin Eimcr Cetus PCR ДНК термален циклизатор.Всеки цикъл се състой от 1,5-минутен етап на денатуриране при 94°С, етап на темпериране при 60°С за две мин и етап за праймерна екстензия при 72°С за три мин.
PCR продуктите се разграждат с Notl и се клонират в UC18S.Клоновете, съдържащи HCV нуклеотидни последователности, се получават чрез скрининг със сонда А1ех90, която произхожда от нуклеотиди -312 до -283 на HCV генома и която има последователност:
5' ACC ATG ААТ CAC TCC CCT GTG AGG AAC ТАС 3'
Последователноститте на HCV сДНК-те в изолираните клонове се съгласуват по дидеоксиверижния терминиращ метод /80/. Последователността на HCV сДНК в един от изолираните клонове-5'-клон 32 обхваща областта от нуклеотиди -224 до -341 във фигура 18.
Анализ на нуклеотидната последователност на HCV сДНК показва, че репликацията на HCV RNA веригата съдържа богата на GCверига, която е в състояние да образува стабилна нишковидна структура:
G - Т
I ; А 1
A C-C-C-C-C-G-C-C-G-5' ;·<<·><< ί
Т G G G G G С G-A-C-3'
В структурата пунктираните линии показват възможните водородни връзки между комплементарни нуклеотиди.
При проучване на компютърните бази-данни Генебанк потвърждава, че липсват хомоложни последователности от познатите вирусни последователности. Така тази последователност може да е уникална за 5'-края на HCV генома.
Нишковидната структура може да служи като сигнал за разпознаване на транскриптаза и/или може да допринася за стабилността на рибонуклеиновата киселина при 5'-края.
Обобщени HCV сДНК последователности. Една HCV сДНК последователност може да бъде обобщена от серия препокриващи клонове, получени от различни HCV сДНК библиотеки, описани тук и в /121/. Клоновете, от които е изведена фигура 18, са клон 5’-32, в114а, 18g, ag30a, СА205а, СА290а, СА216а, pi 14а, СА167в, СА156е, СА84а, СА59а, К9-1 (наречен също К9-1), 26j, 13i, 12f, 14i, 11 в, 7f, 7е 8h, ЗЗс 40в, 37в, 35, 81, 32, ЗЗв, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 15e, в5а, 16jh, Сбк и pil31jh. Методът за изолиране на тези клонове, както и техните последователности, са разгледани тук и в /121/. На фигура 18 трите чертички над последователността показват положението на предполагаемия иницииращ метионинов кодон.
Клон в114а препокрива клонове 18g, ag30a и СА205а, с изключение на това, че клон в114а съдържа още два нуклеотида нагоре в последователността в клон 18g (т.е. 5'- СА). Тези два допълнителни нуклеотида са включени в HCV геномната последователност, посочена на фиг. 18.
Трябва да се отбележи, че макар няколко от клоновете, описани по-горе, да са получени от библиотеки, различни от оргиналната HCV сДНК λ-gtl 1 С библиотека, тези клонове съдържат HCV сДНК последователности, които препокриват HCV сДНК последователности в изходната библиотека. По същество, всичките HCV последователности могат да бъдат извеждани от оригиналната λ-gtl 1С библиотека, която е използвана за изолиране на първия HCV сДНК клон (5-1-1). Изолирането на клон 5-1-1 е описано в /121/.
Предполагаемата последователност на главния HCV полипротеин, кодиран в състава НСVI сДНК, също е посочена. Първата аминокиселина в последователността е предполагаемият инициатор метионин на голямата ORF. Различните аминокиселини поради клоналната хетерогенност са посочени над последователността. Тъй като λ gtl 1 библиотеката е получена от серум, виж 121, резултатите показват, че в този индивид са налице различни вирусни последователности.
Едно изследване на съставната HCV сДНК последователност показва, че освен голямата ORF, има и известен брой ORF нагоре от тази, кодираща полипротеин, и в рамките на последователността, кодираща полипротеина, има голям брой по-малки ORF в другите две трансланционни рамки. ORF нагоре от HCV полипротеина са показани в следващата таблица.
Таблица
ORF нагоре от тази, която кодира големия HCV полипротеин
| Нукл. | Транслационна рамка | Аминокиселинна последователност |
| -310 | 1 | MNHSPVRNYCLHAESV |
| -329 | 3 | MGALLHHESLPCEELL |
| SSRRKRLAMALV | ||
| -246 | 2 | MSVVQPPGPPLPGEP |
| -127 | 1 | MPGDLGVPPQDC |
Четящата рамка, позицията и големина- полипротеина, са посочени в таблицата по-долу, та на ORF надолу’ от последователността, коди- Главният полипротеин е този, транслиран от чераща предполагаемия инициатор MET на тящата рамка.
Таблица
ORF,надолу от вероятната инициаторна MET кодираща последователност.
| Четяща рамка | Големина (аа) | Положение (вр) |
| 1 | 168 | 696 |
| 1 | 105 | 2343 |
| 1 | 119 | 5616 |
| 2 | 3025 | -42 |
| 3 | 160 | 5 |
| 3 | 111 | 1667 |
| 3 | 148 | 6893 |
I
В допълнение към горното, изследване на последователността която е комплементарна на геномната верига на HCV RNA показва, че също съдържа няколко малки ORF. Една от тези ORF, която е комплементарна на нуклеотиди 341 до + 837 в HCV RNA последователността, кодира един полипептид с 385 аминокиселини.
Сравняване на последователността на 5'областите, получени от HCV изолати от различни географски разположения.
Нуклеотидни последователности от 5'-зо ните на HCV изолати от САЩ (HCV18, HCV27), от Италия (HCVI 1,HCV124) и от Корея (HCVK1) са подложени на сравняване.
Изолирането на HCV сДНК последователности е по своята същност такава, както е описано по-горе, за изолирането на 5-клон 32, с изключение на следното. Ексрахираната RNA се транскрибира обратно в cDNA, като в качеството на праймери се използват или jH51 или г16, които са допълнителни към HCV нуклеотиди -90 до -73 и 366 до 383 съответно.
Последователността на тези праймери е както следва:
| Праймер | Последователност |
| jH51 Г16 | 5' ССС AAC ACT ACT CGG СТА 3' 5' CAC GTA AGGGTA TCG ATG 3' |
Амплификацията на HCV бсДНК става по PCR метода, като се използва jH93 и jH52 като 5' и 3' праймери съответно.HCV последователността в jH93 е изведена от HCV нуклеотиди 317 до -296, тази на jH52 е от HCV нуклеотиди
-93 до -117.Броят нуклеотиди е посочен в скоби под последователността.В jH52 подчертаният динуклеотид е подложен на мутация за създаване на Notl мястото.Последователностите на тези праймери са както следва:
| Праймер | Пълнител | Notl | HCV последователност |
| (jH93) | 5’TTC | GCGGCCGC | ACTCCATGAATCACTCCCC 3' |
| (-317) | (-296) | ||
| (jH52) | 5’AGTCTT | GCGGCCGC | ACGCCCAAATC 3' |
| (-93) | (-117) |
След амплифициране PCR продуктите се разграждат чрез Notl и се клонират в pUC18S. Последователностите на HCV сДНК се съгласуват в или директно след амплификацията с PCR или обратно- клонираните HCV сДНК се подреждат в последователност чрез праймерна екстензия и дидеокси метода. Праймерната екстензия и дидеокси метода на съгласуване се извършват, както е описано по-горе за последователността на 5'-клон 32.
Методът PCR за директно съгласуване използува А1ех90 (виж по-горе за съгласуване), като 5'-праймера и г25 като 3'-праймера. Alex 90 е получен от HCV нуклеотиди -312 до -283, а г25 се получава от нуклеотиди 365 до 342 (виж фиг. 18). Последователността на г25 е :
5' ACC ТТА ССС AAA TTG CGC GAC СТА 3’
Сравняване на последователностите от 5'областта на HCV27, HCVK1, HCV124 и HCV18 с последователностите на прототипа HCV, HCV1 показва следното. Изследванияа 5'-участьк е силно консервиран между пет HCV изолата. Последователностите изглежда да са идентични с изключение на един нуклеотид, който е делетиран в позиция -171 в HCV124, и за двусмисленост-в четири нуклеотида в позиции -222 до 219 в изолата HCVK1.
Високите нива на съхраняване на после25 дователността в тази област отразяват ролята на тази област във вирусната репликация и/ или транскрипция и/или транслация.
Варирания на последователностите в HCV изолати от различни индивиди.
Изолати от HCV, които съдържат последователности, произхождащи от СДС/НСВ1 са идентифицирани у хора, някои от които са серопозитивни за анти-С100-3 антитела (ЕС10 е отрицателно за антитяло). Идентифицирането на тези нови изолати се извършва чрез клониране и съгласуване сегментите на HCV генома, който е амплифициран чрез PCR методиката при използване на СДС/HCVl последователности. Амплифицирането става предимно на базата на HCV/cPCR метода. Последният включва използването на праймери и сонди на база на HCV сДНК последователностите, описани тук. Първият етап на метода е синтезата на сДНК към всеки HCV геном или неговия репликативен интермедиат при използване на обратна транскриптаза. След синтеза на HCV сДНК и преди амплификацията, РНК в пробния образец се разрушава чрез известните на специалистите методики. Един означен сегмент на HCV сДНК се амплифицира чрез използване на подходящи праймери. Амплифи36 циранитс сегменти се клонират и клоновете, съдържащи амплифицираните последователности, се откриват чрез сонда, която е комплементарна на последователността, лежаща между праймерите, но която не припокрива праймерите.
HCV изолати, изолирани от хора в САЩ.
Кръвните проби, използвани като източник на HCV вируси, са получени от Американския червен кръст в Шарлота, Нова Каролина и от Обществения кръвен център в Канзас, Канзас сити, Мисури.Пробните образци се проверяват за антитела за HCV С100-3 антиген при използване на методиката ELISA, както е описано в /121/ и се подлагат на Western Blot капков анализ с помощта на поликлонален кози античовешки HRP за измерване на антиHCV антитела. По този начин два пробни образеца, #23 и #27, от Американския червен кръст и от Обществения кръвен център в Канзас, съответно, се определят като HCV положителни.
Вирусните частици, присъстващи в серума на тези кръвни проби се изолират чрез ултрацентрофугиране при условията, описани в /За/. Рибонуклеиновата киселина се екстрахира от частиците чрез разграждане с протеиназа К и SDS при крайна концентрация от 10 МКГ/мл протеиназа К и 0,1% SDS; разграждането се провежда за 1 ч при 37°С. Вирусната рибонуклеинова киселина се пречиства чрез екстрахиране с хлороформ фенол, както е описано в /121/.
HCV RNA в препарата RNA се транскрибира обратно в ДНК по същество, както е описано в /121/, с изключение на това, че олигонуклеотидът jHC 7, който съответства на сДНК последователност 1958-1939 и който има следната последователност, се използва като праймер за обратно-транскриптазната реакция.
JHC 7:ССА GCG GTG GCC TGG ТАТ TG
След като се синтезират двете вериги на сДНК, получената сДНК се амплифицира по PCR метода, както е описано по-горе, за изолиране на клонове, генерирани след PCR амплификацията с изключение на това, че се използват олигонуклеотидни праймери, т.еЛНСб и ALX80, са конструирани за амплифициране на 1080 нуклеотидния сегмент на HCV генома от СДС/HCVl нуклеотидите от 673 до 1751. Праймерите освен това са конструирани за инкорпориране на NOT1 рестикционен сайт при
3'-края на PCR продукта и един сляп край на 5'-края.
Последователността на праймерите е :
ALX 80; ТТТ GGG TAA GGT CAT CGA ТАС ССТ ТАС GTG:
JHC 6; АТА TGC GGC CGC СТТ CCG TTG GCA ТАА.
ALX 80 съответства на нуклеотиди 673702 на СДС/HCVl последователността; JHC 6 съответства на нуклеотиди 1752-1738 на НСVI (има 12 екстра нуклеотиди, които кодират Notl сайта). Означаването на нуклеотиди в JHC 6, т.е. намаляващ брой, показва разполагането на антисмисловата верига.
След PCR амплифицирането с описаните по-горе праймери слепият край се превръща в NOT1 сайт както следва. Хомополимерна опашка от 15 des се прикачва към PCR продукта при използване на терминална деоксинуклеотидна трансфераза и продуктът се подлага отново на амплифициране с PCR като в качеството на праймери се използват JHC13 и JHC13. Последният праймер JHC 13, последователността на който следва, е конструиран така, че да съдържа NOT I място в допълнение към SP6 фагов промотор.
JHC 13;ААТ TCG CGG CCG ССА ТАС GAT ТТА GGT GAC
ACT АТА GAA ССС ССС ССС ССС ССС.
С оглед да се клонира амплифицираната HCV сДНК, PCR продуктите се разграждат с Notl, преципитират се с спермин за отстраняване на свободни олигонуклиотиди и се клонира в Notl мястото на PUC18S (виж раздел IV.A.34). HCV сДНК в три клона, получени от всеки HCV изолат, се подлагат на секвенционен анализ. Анализът по своята същност е метод, описан през 1985 година от Cheu and Seevurg.
Съвпадащи последователности на клоновете, произхождащи от HCV в пробните образци 23 и 27, са посочени съответно на фигури 46 и 47. Различните последователности също са посочени на тези фигури, както и аминокиселините, кодирани в съвпадащите последователности.
Фигури 39 и 40 посочват сравняване на линеализираните позитивни вериги на нуклеотидните последователности (фиг.39) и предполагаемите аминокиселинни последователности (фиг.40) на пробни образци 23, 27 и HCV1. Аминокиселинната последователност на HCV1 на фиг.39 представлява аминокиселина но37 мера 129 - 467 на HCV полипротеина, кодиран от големия ORF в HCV геномна RHK. Изследването на фигури 46 и 47 показва, че там има варирания в последователностите на трите изолирани клона. Вариранията на последователностите на нуклеотидно равнище и равнището на аминокиселина са обобщени в таблицата по-долу. В таблицата, полипептидите означени с S и NS1 представляват аминокиселина номера от 130 до-380 и от 180 до -470 съответно. Номерирането е от предполагаемия инициатор метионин. Тер10 минологията S и NS1 се базира на позиционирането на последователности, кодиращи полипептидите при използване на модела флавивирус. Както е посочено по-горе, според послед5 ните изследвания се предполага, че няма пълна корелация между HCV и флавивирус по отношение на вирусни полипептиди специално в предполагаемата област E/NS1. Фактически, HCV полипептидите и техните кодиращи области може да проявяват съществено отклонение от флавивирусния модел.
Таблица
| Общо | Нуклеотиди кодиращи | Кодирани амино киселини | ||||
| S % | NS1 % | Общо % | S % | NS % | У1 /о | |
| HCV1/HCV23 | 93 | 95 | 91 | 92 | 95 | 87 |
| HCV1/HCV27 | 89 | 93 | 84 | 89 | 95 | 82 |
| HCV23/HCV2789 | 93 | 85 | 90 | 93 | 84 |
Въпреки, че има варирания в новаизолираните HCV последователности, клонираните последователности от пробни образци 23 и 27 (наречени HCV23 и HCV27) съдържат всяка по 1019 нуклеотида, което показва липса на делеционни допълнителни мутанти в тази област на селекционираните клонове. Последователностите във фигури 39 и 40 показват също, че изолираните последователности не са преподредени в тази област.
Сравняване на съвпадащите последователности за HCV1 и за други изолати на HCV са обобщени в таблицата по-горе. Вариранията на последователността между изолати от шимпанзе HCV1 и изолати HCV от хора са приблизително същите като тези, наблюдавани между HCV с произход от хора.
Представлява интерес, че вариранията на последователности в две от предполагаемите области не са еднообразни. Последователността в една предполагаема S област изглежда да е сравнително константна и случайно разпостранена в областта. Обратно, предполагаемата NS1 зона има по-висока степен на вариабилност, отколкото общата последователност, и вариациите изглежда да са в един хипервариабилен пакет от около 28 аминокиселини, който е разположен на около 70 аминокиселини надолу от предполагаемия N-край на предполагаемия полипротеин.
Въпреки че може да се оспорва, че откритите варирания са въведени по време на амплификационния процес, е невероятно всичките вариации да са с този резултат. Определено е, че TAg полимеразата въвежда грешки в последователността от приблизително една база на 10 килобази от ДНК матрицата за един цикъл /79/. Въз основа на тази оценка са въведени до седем грешки по време на PCR амплификацията на 1019 вр ДНК фрагмента. Обаче трите субклона на HCV-23 и HCV-27 дават съответно 29 и 14 базови вариации. Това показва, че тези варирания се явяват естествено, а именно около 60% от базовите промени са тихи мутации, които не променят аминокиселинната последователност. Варирания, въведени чрез TAg полимеразата по време на PCR амплификацията би трябвало да се очаква да са случайни. Но резултатите посочват, че вариантните последователности се натрупват в най-малкото една специфична област. Освен това единна последователност се получава чрез подреждане на мултиплени раз38 лични клонове, получавани от PCR уголемените продукти.
HCV изолати от хора в Италия и в САЩ.
Сегменти на HCV РНК, намиращи се в различни изолати, се амплифицират по метода HCV/cPCR. Тези сегменти обхващат област от 0,6 кв до '1,6 кв надолу от метиониновия кодиращ старта кодон на предполагаемия HCV полипротеин. Изолатите са от биологични образци, инфектирани с HCV индивиди. Поспециално, изолотът НСТ #18 е от човешка плазма от индивид в САЩ, ЕС1 и ЕС 10 са от биопсия на черен дроб на италиански пациент, a Th е от периферни кръвни мононуклеоцитни фракции на американски пациент. Сравними сегменти на HCV РНК са изолирани от шимпанзе.
Рибонуклеинова киселина се екстрахира от човешка плазма с помощта на фенол: CHCL3: изоамил алкохол. 0,1 или 0,01 мл плазма се разрежда до краен обем от 1,0 мл с TENB/протеиназен К/SDS разтвор (0,05М трис-солна киселина, pH 8,0, 0,001 М ЕДТА, 0,1 М натриев хлорид, 1 мг/мл протеиназа К и 0,5 % SDS), съдържащ 10 до 40 мкг/мл полиаденилова киселина и се инкубира при 37°С за 60 мин. След това се разгражда с протеиназа К, получените плазмени фракции се депротеинизират чрез екстрахиране с ТЕ (50 мМ трие солна киселина, pH 8,0, 0,1 мМ ЕДТА) наситен фенол, pH 6,5. Фенолната фаза се отделя чрез центруфугиране и се екстрахира повторно с TENB, съдържащ 0,1 % SDS. Получените водни фази от всяко екстрахиране се събират на едно място и се екстрахират двукратно с равен обем от фенол/хлороформ/изоамил алкохол (1:1 (99:1)) и тогава два пъти с равен обем 99:1 смес от хлороформ:изоамилов алкохол.
След разделяне на фазите чрез центрофугиране, водната фаза се довежда до крайна концентрация от 0,2 М натриев ацетат и нуклеиновите киселини се преципитират чрез добавяне на два обема етанол. Преципитираните нуклеинови киселини се възстановяват чрез ултрацентрофугиране в SW 41 ротор при 18К за 60 мин при 4С, или в микрофуга за 10 мин при 10К, 4“С.
Рибонуклеиновата киселина, екстрахирана от чернодробна биоксия беше, доставена от д-р Ф.Бонино, Оспедале Мажоре ди С.Джиовани Батиста, Торино, Италия.
Мононуклеоцитната фракция се получава чрез седиментация на еднакви части кръв на индивид посредством Фикол-Пак ( Фармация Корп.)при използуване на указанията на производителя. Общата RHKce екстрахира от фракцията при използване на процедурата с гуанидинов тиоцианат, описана в /121 / (виж също /12/).
Синтезата на HCV ДНК от пробните образци се извършва с помощта на обратна транскриптаза и праймери, получени от клон 156е и от клон К91. Тези праймери, които са антисмислови по отношение на геномната РНК, имат следната последователност:
156е16В 5'CGA CAA GAA AGA CAG А 3'
К91/16В 5’CGT TGG CAT AAC TGA T 3'
След етанолна преципитация преципитираната рибонуклеинова киселина или фракция от нуклеинова киселина се изсушава и се ресуспензира в дестилирана вода, третирана с ДЕРС. Вторичните структури в нуклеиновите киселини се разрушават чрез загряване на 65°С за 10 мин. и образците се охлаждат незебавно върху лед. сДНК се синтезира при използване на от 1 до 3 микрограма от общата РНК на черен дроб или нуклеинови киселини (или РНК), екстрахирани от 10 до 100 мкл плазма. При синтезата се използва обратна транскриптаза в количество 25 мкл в последователност, препоръчана от производителя (BRL). Всички реакционни смеси за ДНК синтеза съдържат 23 единици инхибитор рибонуклеаза, β.ΝΑΞΙΗ*(ΦΗΐιιερ/ΠροΜεга). След cDNA синтеза реакционните смеси се разреждат с вода, кипват се за 10 мин и се охлаждат бързо върху лед.
Всеки комплект от проби се подлага на два рунда PCR амплификация. Праймерите за реакцията се подбират за уголемяване на зоните, означени с “EnvL” H”EnvR”. Зоната “EnvL” обхваща нуклеотиди 669 до 1243 и предполагаеми аминокиселини от 117 до 308. “EnvR” зоната обхваща нуклеотиди от 1215 до 1629 и кодира предполагаеми аминокиселини от 300 до 408 (предполагаемите аминокиселини се номерират, като се започне от предполагаемия метионинов инициаторен кодон). Взаимоотношението на тези зони по отношение на предполагаемия полипротеин, кодиран в HCV cDNA и до полипептидите, кодирани в модела флавивирус, е посочено на фиг.48.
Праймерите за първия етап на PCR реакцията се получават от HCV сДНК последователности или в клон ag30a, клон 156е или клон К9-1. Използвани праймери за амплифициране на EnvL зоната са 156е16В (посоче39 на по-горс) и ag30al6A за смисловата верига. Амплифицирансто на EnvR зоната използува праймера К91/16В(посочен по-горе) и 156е16а за смислова верига. Последователностите на смислово верижните праймери са както следва: За EnvL , ag30al6A: 5' СТС TAT GGC ААТ GAG G 3' и
За EnvR , 156е16А: 5' AGC TTC GAC
GTC АСА T 3'
PCR реакциите се извършват главно според указанията на производителя (ЦетусПеркин-Елмер) с изключение на добавянето на 1 мкг рибонуклеаза А. Реакциите се извършват в краен обем от 100 мкг. PCR се извършва за 30 цикъла, използувайки режим от 94°С(1мин), 37°С(2 мин) и 72°С(3 мин), при 7-минутна екстензия при 72°С за последния цикъл. Пробите се екстрахират с фенол: СНСЦ двукратно, етанол преципитиране, повторно суспендиране в 10 мМ трис-солна киселина при pH 8,0 и концентриране,като се използва ЦентриконЗО(Амиконово) филтриране. Тази процедура отстранява ефективно олигонуклеотиди с по-малко от 30 нуклеотида в големина. Праймерите от първия етап от PCR амплификацията се отстраняват.
Концентрираните с Центрикон-30 образци се подлагат тогава на повторно на PCR амплифициране с помощта на сонди, получени от клонове 202а и 156е за EnvL областта и от 156е и 59а за EnvR зоната. Праймерите за амплифициране на EnvL областта имат следните последователности: 202aEnv41a: 5’СТТ GAA TTC GCA ATT TGG GTA
AGG ТСА TCG АТА CCC TTA CG 3' и
156e38’: 5'CTT GAA TTC GAT AGA GCA
ATT
GCA ACC TTG CGT CGT CC 3'
Праймерите за амплифициране на EnvR областта в рибонуклеиновите киселини, произхождащи от хора, имат следните последователности:
156е18А’: 5’СТТ GAA TTC GGA CGA
CGC AAG
GTT GCA ATT GCT СТА ТС 3' и
59aEnv39C:5' СТТ GAA TTC CAG CCG
GTG TTG
AGG СТА ТСА TTG CAG ТТС 3'
Амплификацията чрез PCR се провежда за 15 цикъла, като се използва режим от 94°С(1 мин)60°С(1 мин) и 72°С(2 мин) със 7 минутна екстензия при 72°С за последния цикъл. Пробите се екстрахират тогава с феHoa:CHCL3, преципират се двукратно и се смилат с EcoRI. Продуктите на PCR реакцията се анализират чрез разделяне на продуктите с електрофореза върху 6%-ни полиамидни гелове.ДНК с приблизително определена големина на очаквания PCR продукт се електроелюира от теловете и се субклонира в pGEM-4 плазмен вектор или в λ gtl 1. Очакваните размери на продукта за EnvL и EnvR след първия етап на амплификация са 615 вр и 683 вр съответно. След втория етап очакваните размери на продукта за EnvL и EnvR са съответно 414 вр и 575 вр. Плазмидите, съдържащи амплифицираните продукти, се използват за трансформиране на гостоприемникови клетки. pGEM-4 плазмид се използва за трансформиране на Н5- а и Xgt 11 се използва за трансформиране на С600 6-HFL. Подбират се клонове на трансформираните клетки , които или са хибридизирани до подходящи HCV сонди (описани по-долу), или притежават инсерти с правилния размер. Тогава инсертите се клонират в М13 и последователностите се съгласуват.
Сондите за всичките HCV/cPCR продукти се състоят от 32р белязани отрязъци на HCV сДНК, които са получени чрез PCR амплификация на област от клон 216 (използва се СА216а16А и 216а16В като праймери) и на клон 84(използва се СА84а16А и СА84а16В или СА84а16С като праймери) 32р се въвежда в PCR продуктите чрез транслация. Сондите за първия и за втория етап на EnvL амплификацията са взети от клон 216. Тези за първия етап на EnvR амплификацията са взети от 84(т.е.СА84а16А и СА84а16В), за втория етап на EnvL амплификацията са СА84а16А и СА84а16С. Тези сонди не припокриват праймерите в HCV/cDNA реакциите. Последователността на праймерите за PCR амплифициране на сондите е посочена на следната таблица:
Таблица
Праймер
Клон Последователност
| СА216а16А | 216 | 5’TGA ACT ATG CAA CAG G 3’ |
| СА216а16В | 216 | 5’GGA GTG TGC AGG ATG G 3' |
| СА84а16А | 84 | 5’AAG GTT GCA ATT GTC C 3' |
| СА84а16В | 84 | 5’ACT AAC AGG ACC TTC G 3' |
| СА84а16С | 84 | 5’TAA CGG GTC ACC GCA T 3' |
Информация за последователността на варианти в EnvL областта се получава от три клона от НСТ #18, два клона от TH, три клона от ЕС1 и от HCV1 клонове, описани в /121/ и по-горе. На фигура 49 е посочена композираната нуклеотидна последователност на всеки изолат, получен от тези клонове. Във фигурата всяка последователност е посочена от 5' до З'края за смисловата верига на EnvL областта и последователностите са подредени. Отвесните линии и главните букви посочват хомоложност на последователността, липсата на линия и малките букви показват липса на хомоложност. Последователностите, посочени в линиите са както следва: линия 1 Thorn; линия #2, ЕС1; линия 3, НСТ 18; линия 4, HCV1.
Информация за последователността на варианти в EnvR областта се получава от два клона на ЕС 10 и от НС VI клоновете, описани в /121/ и по-горе. Двата ЕС10 клона се различават със само един нуклеотид. Едно сравнение за нуклеотидни последователности на ЕС10(клон 2) и композиция от HCV последователности е посочено на фиг.50. Всяка последователност е посочена от 5'до З'края за смисловата верига на EnvR областта и последователностите са подравнени. до
Двойните точки между последователнос15 тите посочват хомоложност на последователността.
Сравнението на аминокиселинните последователности, кодирани в EnvL (аминокиселини 117-308) и EnvR областта (аминокиселини 20 300 до 438) за всеки от изолатите е посочено на фиг.51 и фиг.52 съответно. Във фигурите са включени последователностите за изолатите jH23 и jH27, описани по-горе. Посочени са също последователностите от един японски изолат;
тези последователности са предложени от д-р Т.Миамура, Япония. На фигурите аминокиселинната последователност за зоната е дадена в нейната цялост за НСVI и са посочени нехомоложните аминокиселини в различните 3θ изолати.
Както се вижда на фиг.51, в EnvL областта има общо около 93 % хомоложност между HCV1 и другите изолати. НСТ18, Th, и ЕС1 имат около 97 % хомоложности с HCV1; jH23 и 35 jH27 имат около 96 % и около 95 % хомоложност съответно с HCV1. Фиг.52 посочва, че хомоложностите в EnvR областта са значимо помалко, отколкото в EnvL областта. Освен това, един субрегион изглежда да е хипервариабилна (т.е. от аминокиселина от 383 до 405). Тези данни са обобщени в следващата таблица.
Таблица
Хомология на EnvL областта
Изолат Процент хомоложност с HCV1
АА330-АА438 АА383-АА405
| jH23 (САЩ) | 83 | 57 |
| JH27 (САЩ) | 80 | 39 |
| Японски | 73 | 48 |
| EC10 (Италия) | 84 | 48 |
Откриване на позитивни и негативни вериги 5'-HCV РНК в серум.
РНК киселина в HCV27, изолирана от серумч се анализира при използване на PCR метода.PCR методът се осъщсствявац както е описано по-горе, с изключение на следното. Екстрахираната HCV27 РНК се транскрибира обратно в едноверижна cDNA при използване като праймер или А1ех90 или jH52 (виж по-горе за последователностите). Последователността на А1ех90 съвпада с тази в нуклеотиди от -312 до 283 на позитивната верига на HCV РНК, докато jH52 съвпада с тази на нуклеотиди -117 до -93 на негативната верига. Резултиращата едноверижна HCV сДНК се амплифицира чрез PCR с помощта на А1ех90 и jH52. Откриването на амплифицираните продукти се извършва чрез оцветяване по Southern и при използуване на А1ех89 като сонда. А1ех89 съвпада с нуклеотиди -203 до -175 на HCV RNA. Последователността на Alex 89 е:
5' CCA TAG TGG ТСТ GCG GAA CCG GTG AGT АСА 3'
Анализът показва, че чрез този метод сигналите на амплифицираните продукти на двете РНК вериги са с еднаква интензивност. Тези резултати подсказват, че HCV РНК в 5'-областта може да съществуват като двойноверижна ДНК.
Сонди за сандвично хибридизиране за HCV
Този пример изтъква комплексите от бе20 лязани и улавящи сонди, които могат да се използуват за откриване на HCV РНК в биологични проби, с помощта главно на изпитването, описано в /110/. Методът е изпитване в разт5 ворима фаза на сандвично хибридизиране, при което се използуват улавящи и белязани сонди, които се хибридизират към мишенни последователности в анализираната нуклеинова киселина. При скрининга на биологични проби 10 за HCV, използуваните сонди се свързват към консервирани области на HCV-генома и свързващите HCV области се подбират с оглед тяхната уникалност за HCV-генома. Зоните, които се присъединяват към свързващия парт15 ньор на улавящата сонда или частта от белязаната сонда, която се свързва към белязаното количество (или към амплифициран мултимер, ако се използува метода, описан в /123/), се подбират така, че те да не се свързват към никоя от познатите последователности в базата данни или в HCV и които имат подходящо съдържание на GS и CS, така че да позволи оформяне на стабилен дуплекс с техните комплементи при избраните условия. Улавящите и белязаните сонди са в комплекси и сондите от един комплекс не взаимодействат със сондите от друг комплекс. Тези сонди се състоят от последователности, които са допълнителни към следващите нуклеотидни последователности в кодиращата лента на прототипната HCV сДНК последователност, посочва на фиг. 18.
Комплект 1
| Тип сонда | Номер сонда | Комплемент на нуклеотидни номера |
| Улавяща | 42.ХТ1.1 | -318 да -289 |
| Улавяща | 42.ХТ1.2 | -285 до -256 |
| Улавяща | 42.ХТ1.3 | -252 до -223 |
| Улавяща | 42.ХТ1.4 | -219 до -190 |
| Белязана | 42.LLA2C.5 | -186 до -157 |
| Белязана | 42.LLA2C.6 | -153 до -124 |
| Белязана | 42.LLA2C.7 | -120 до -91 |
| Белязяна | 42.LLA2C.8 | -87 до -58 |
| Белязана | 42.LLA2C.9 | -54 до -25 |
| Белязана | 42.LLA2C.10 | -21 до 9 |
| Белязана | 42.LLA2C.il | 13 до 42 |
| Белязана | 42.LLA2C.12 | 46 до 75 |
| Белязана | 42.LLA2C.13 | 79 до 108 |
| Белязана | 42.LLA2C.14 | 112 до 141 |
| Белязана | 42.LLA2C.15 | 145 до 174 |
| Комплект 2 | ||
| Тип сонда | Сонда номер | Комплемент на нуклеотидни номера |
| Улавяща | 42.16.ХТ1 | 4378 до 4407 |
| Улавяща | 42.17.ХТ1 | 4411 до 4440 |
| Улавяща | 42.18.ХТ1 | 4444 до 4473 |
| Улавяща | 42.19.ХТ1 | 4477 до 4506 |
| Улавяща | 42.20.ХТ1 | 4510 до 4539 |
| Белязана | 42.21.LLA2C | 4543 до 4572 |
| Белязана | 42.22.LLA2C | 4576 до 4605 |
| Белязана | 42.23.LLA2C | 4609 до 4638 |
| Белязана | 42.24.LLA2C | 4642 до 4671 |
| Белязана | 42.25.LLA2C | 4675 до 4704 |
| Белязана | 42.26.LLA2C | 4708 до 4737 |
| Белязана | 42.27.LLA2C | 4771 до 4770 |
| Белязана | 42.28.LLA2C | 4774 до 4803 |
| Белязана | 42.29.LLA2C | 4807 до 4836 |
| Белязана | 42.30.LLA2C | 4840 до 4869 |
| Белязана | 42.31.LLA2C | 4873 до 4902 |
Комплект 3
| Тип сонда | Сонда номер | Комплемент на нуклеотидни номера |
| Улавяща | 42.32.ХТ1 | 40,56 до 4085 |
| Улавяща | 42.33.ХТ1 | 4089 до 4085 |
| Улавяща | 42.34.ХТ1 | 4122 до 4151 |
| Улавяща | 42.35.ХТ1 | 4155 до 4184 |
| Белязана | 42.36.LLA2C | 4188 до 4217 |
| Белязана | 42.37.LLA2C | 4221 до 4250 |
| Белязана | 42.38.LLA2C | 4254 до 4283 |
| Белязана | 42.39.LLA2C | 4287 до 4316 |
| Белязана | 42,40.LLA2C | 4230 до 4349 |
| Белязана | 42.41.LLA2C | 4353 до 4382 |
| Белязана | 42.42.LLA2C | 4386 до 4415 |
| Белязана | 42.43. А2С | 4419 до 4448 |
В горните комплекси всяка улавяща сонда съдържа в допълнение към последователностите, комплементарни на HCV последователностите, следната последователност надолу от HCV последователността (например в 3'края):
5' СТТ СТТ TGG AGA AAG TGG TG 3' Последователността, обща за всяка улавяща сонда, е допълнителна към една последователност в свързващия партньор (и), така че след хибридизиране, дуплексът може да бъде хванат по пътя на фиксиране към твърда фаза.
Освен това във всеки комплекс всяка белязана сонда съдържа в допълнение към последователностите, комплементарни на HCV последователностите, следната последователност надолу от HCV последователността:
5' ТТА GGC АТА GGA ССС GTG ТС 3'
Ако методът, описан в /123/, бъде използуван, последователността, обща за всяка белязана сонда, е комплементарна на последователност в мултимер, за да стане възможно образуването на хибриден дуплекс с мултимера.
Последователностите на сондите в горните комплекси са посочени на фиг. 19.
Откриване на HCV полинуклеотидни последователности с помощта на PCR амплификация.
В генерализирания метод за амплификация на HCV РНК чрез cPCR трябва да се има предвид, че един вирион или тРНК верига е “смислова” верига. Възможно е също репликативните интермедианти да оформят и също да откриват това,- което би било “антисмислово; в този случай праймерът би бил “смислов”. Една РНК смислова верига, съдържаща мишенната област, се хибридизира с антисмислов праймер, който дава начало на синтезата на реплициращата верига, съдържаща мищената. сДНК за РНК матрица се синтезира праймерзависеща и матричнозависеща обратна транскриптаза. сДНК в получения РНК : сДНК хибрид се освобождава чрез денатуриране и обработване с рибонуклеаза. Праймери се ренатурират до сДНК и се амплифицират с праймер- и матричнозависеща ДНК полимераза.Продуктите се денатурират, ренатурират се повторно до праймери и се извършва втори етап на синтезиране. Провежда се известен брой цикли, докато амплифицираният продукт, съдържащ мишенната област, достигне желаното количество, което да е най-малкото, възможно за откриване.
Откриване на амплифицирани HCV нуклеиново-киселинни последователности, получени от HCV нуклеиново-киселинни последователности, в черен дроб и плазма от шимпанзета с NANBH.
HCV нуклеинови киселини, намиращи се в черен дроб и плазма на шимпанзета с NANBH, и ненамиращи се при контролни шимпанзета, се амплифицират при използване на техниката на полимеразни верижни реакции (PCR), описана в /78/. Праймерните олигонуклеотиди се получават от HCV сДНК последователности в клон 81 (фиг. 22) или клонове 36 (фиг.23) и 37в (фиг.24). Амплифицираните последователности се откриват чрез гел електрофореза и Southern blott метод при използване на сонди с подходящ сДНК олигомер или транслирана сДНК последователност с последователност от областта между, но не включително, двата праймера.
Пробни образци от РНК, съдържащи HCV последователности, които трябва да бъдат изследвани чрез амплификационна система, се изолират от чернодробни биопсии на три шимпанзета с NANBH и от две контролни шимпанзета. Изолирането на поли А+ РНК фракция става чрез гуанидинтиоцианатна процедура, описана в /48/.
Пробни образци от РНК, които трябва да бъдат изследвани чрез амплификационната система, се изолират също от плазми на две шимпанзета с NANBH и от едно контролно шимпанзе, както и от сборни плазми на контролни шимпанзета. Едно инфектирано шимпанзе има тигър, равен или по-голям от 106 CID/мл, а другото инфектирано шимпанзе има титър, равен или по-голям от 10s CID/мл.
Нуклеиновите киселини се екстрахират от плазмата както следва.0,1 или 0,01 мл плазма се разрежда до краен обем от 1,0 мл с TENB/ протеиназа К/SDS разтвор (0,05 триссолна киселина, pH 8,0, 0,001 М ЕДТА, 0,1 М натриев хлорид, 1 мг/мл протеиназа К и 0,5 процента SDS), съдържащ 10 мкг/мл полиаденилова киселина и се инкубира при 37°С за 60 мин. След това разграждане с протеиназа К получената плазмена фракция се депротеинизира чрез екстрахиране с ТЕ (10 мМ триссолна киселина, pH 8,0, 1 мМ ЕДТА) наситен фенол. Фенолната фаза се сепарира чрез центрофугиране и се екстрахира повторно с TENB, съдържащ 0,1 % SDS, получените водни фази от всяко екстрахираме се събират на едно място и се екстрахират двукратно с еднакъв обем фенол/ хлороформ/изоамил алкохол (1:1(99:1) и два пъти с равен обем 99:1 смес от хлороформ/ изоамил алкохол. Следващата фаза на сепариране се осъществява да крайна концентрация 0,2 М натриев ацетат и нуклеиновите киселини се преципитират чрез добавяне на два обема етанол. Преципитираните нуклеинови киселини се възстановяват чрез ултрацентрофугирене в SW 41 ротор при 38 К за 60 мин при 4°С.
В допълнение към горното плазмата от шимпанзе с висок титър и събраната на едно място плазма се екстрахират с 50 мкг поли А носител чрез процедурата, описана в /16/. Тази процедура използва за екстрахиране с кисел гуанидинов тиоцианат. РНК се възстановява чрез центрофугиране при 10 000 об./мин за 10 мин при 4°С в микрофужна епруветка на Епендорф.
В два случая, преди синтезирането на сДНК при PCR реакцията нуклеиновите киселини, екстрахирани от плазма чрез протеиназния K/SDS фенолен метър, се пречиства по-нататьк чрез свързване към и елюиране от S и S Елютип-Я-колони. Следващата процедура е съгласно указанията на производителя.
Използваната сДНК като матрица за PCR реакцията е получена от нуклеиновите киселини (или тотални нуклеинови киселини или RNA), получени, както е описано по-горе. След преципитиране с етанол преципитираните нуклеинови киселини се изсушават и се суспензират повторно в ДЕРС третирана дестилирана вода. Вторични структури в нуклеиновите киселини се разрушават чрез загряване до 65°С за 10 мин и пробите се охлаждат незабавно върху лед. сДНК се синтезира при използуване на от 1 до 3 мкг обща РНК от черен дроб на шимпанзе или от нуклеинови киселини (или РНК, екстрахирана от 10 до 100 мкг плазма). При синтезата се използва обратна транкриптаза в 25 мл обем по указание на производителя (BRL). Праймерите за синтеза на сДНК са тези, използвани при PCR реакцията, описана по-долу. Всичките реакционни смеси за сДНК синтезата съдържат 23 единици инхибитор за рибонуклеаза, RNASlN*(<I>Hiiiep/npoMera). След синтезата на сДНК реакционните смеси се разреждат с вода, кипват се за 10 мин и се охлаждат бързо върху лед.
PCR реакциите се извършват главно според указанията на производителя (Perkin Elmer
Cetus) с изключение на това, че се забавя 1 мкг рибонуклеаза А. Реакциите се извършват в краен обем от 100 мкг. PCR се провежда в 35 цикъла при режим от 37°С(2 минути), 72°С(3 минути) и 94°С(1 минута).
Праймерите за сДНК синтезата и за PCR реакциите произхождат от HCV сДНК последователности или в клон 81, клон 36, или в клон 37B.HCV сДНК последователностите на клонове 81, 36 37в са посочени съответно на фигури 22, 23 и 24. Последователностите на двата 16-мерни праймера, произхождащи от клон 81 са:
5' CAA TCA TAC CTG АСА G 3' и
5' GAT AAC СТС TGC CTG А 3'
Последователността на праймера от клон 36 е
5' GCA TGT CAT GAT GTA Т 3'
Последователността на праймера от клон 37в е
5' АСА АТА CGT GTG TCA С 3’
При PCR реакциите праймерните двойки се състоят или от двата 16-мера, произхождащи от клон 81 или от 16-мерите на клон 36 и 16-мерите от клон 37в.
Продуктите от PCR реакцията се анализират чрез сепариране на продуктите чрез алкална гел електрофореза, последвана от оцветяване по Sonthem и откриване на амплифицирани HCV сДНК последователности с 32Р -белязана вътрешна олигонуклеотидна сонда, произхождаща от една област на HCV сДНК, която не препокрива праймерите. PCR реакционните смеси се екстрахират с фенол/ хлороформ и нуклеиновите киселини се преципитират от водната фаза със сол и етанол. Преципитираните нуклеинови киселини се събират чрез центрофугиране и се разтварят в дестилирана вода. Еднакви части от пробите се подлагат на електрофореза върху 1,8 % алкални агарозни гелове. Едноверижната ДНК 60, 108 и 161 нуклеотида дължина се ко-електрофорезират върху гелове като маркери за молекулно тегло. След електрофорезата ДНК от гела се пренасят върху хартия Biorad Zeta Prove. Прехибридизиране и хибридизиране, както и условията за промиване са тези, посочени от производителя (Biorad).
Използваните сонди за откриване на амплифицирани HCV сДНК последователности чрез хибридизация са следните. Когато двойка45 та PCR-праймсри произхожда от клон 81, сондата е 108-мерна с последователност отговаряща на тази, която е разположена между последователностите в зоната на двата праймера. Когато двойката PCR-праймери произхожда от клонове 36 и 37в, сондата в транслираната HCV сДНК инсерция, произхождаща от клон 35, нуклеотидната последователност на която е посочена на фиг.34. Праймерите са получени от нуклеотиди 155 до 170 на клон 37в инсерт, и 206 до 268 на клон 36 инсерт.3'-края на HCV сДНК инсерта в клон 35 препокрива нуклеотиди от 1 до 186 от инсерта в клон 36; а 5'-края на клон 35 инсерт препокрива нуклеотиди от 207 до 269 от инсерта в клон 37в (сравни фигури 23, 34 и 24). Така сДНК инсерта в клон 35 обхваща областта между последователностите в клон 36 и 37в, от които произхождат праймерите, и е приложима като сонда за амплифициране на последователностите, които включват тези праймери.
Анализът на РНК от чернодробни образци става по горната процедура, като се използват двата комплекса праймери и сонди. РНК от черен дроб на трите шимпанзета с NANB хепатит дава положителни хибридазиционни резултати за уголемяване на последователностите с очакваната големина (161 и586 нуклеотида за съответно 81 и 37в, докато контролните шимпанзета дават отрицателни хибридизационни резултати. Същите резултати се получават, когато експериментът бъде повторен три пъти.
Анализът на нуклеиновите киселини и РНК от плазма се осъществява също с използването на праймери и сонди от клон 81. Плазмите са от две шимпанзета, от едно контролно шимпанзе и сборна плазма от контролни шимпанзета. И двете NANB хепатитни плазми съдържат нуклеинови киселини/РНК, които дават положителни резултати при PCR изследването за амплифициране, докато двете контролни плазми дават отрицателни резултати. Едни и същи резултати се получават, когато експериментът се провежда няколко пъти.
Известно е, че дефектни вируси се явяват в РНК вирусите. Чрез използване на методиката PCR е възможно да се конструират праймери за амплифициране последователностите на HCV генома. Чрез анализ на амплифицираните продукти става възможно иден тифицирането както на дефектни варианти на вирусния геном, така и на дивия тип вируси. Съответно на това, използвайки два праймера, основаващи се на позната HCV последователност, може да се предскаже точно очакваната големина на PCR продукта. Всеки поголям вид, наблюдаван чрез гелелектрофореза и хибридизационен анализ, би могъл да представлява потенциален вариант на геном. Обратно, всеки по-малък вид, наблюдаван по този начин, може да представлява дефектни агенти. Анализите на тези типове биха били полезни за потвърждаване на точния произход на познатите HCV последователности, независимо дали това е фактически див тип вирусна последователност или дефектен геном. Методиките и методите за тези анализи са добре известни от литературата и са описани порано. Тази методология позволява на специалиста да получава сходни форми (див тип или дефектни) на вирусния геном.
Откриване на последователности в уловени частици, които, когато са амплифицирани с PCR, се хибридизират с HCV сДНК, произхождаща от клон 81.
РНК в уловени частици се получава, както е описано по-нататък.
Анализът за последователности, които хибридизират до HCV сДНК, получена от клон 81, се извършва при използване на процедурата за PCR амплифициране, както е описано погоре, с изключение на това, че хибридизационната сонда е обработена с киназа олигонуклеотид, получен от клон 81 сДНК последователност. Резултатите показват, че амплифицираните последователности се хибридизират с HCV сДНК сондата.
Частици биват улавяни от инфектирана с HCV плазма на шимпанзета чрез използване на полистиренови зърна, покрити с имунопречистено антитяло, насочено срещу полипептидите, кодирани в клон 5-1-1. Процедурата за получаване имунопречистено антитяло е описана в /121/и включена в литературата. HCV полипептидът,кодиран в клон 5-1 -1, се изразява като фузионен полипептид със супероксид дисматаза (SDS). Това се придружава със субклониране на клон 5-1-1 сДНК инсерта в експресионния вектор pSODcfl/87/. ДНК, изолирана от pSODcfl, се обработва с BamHI и EcoRI и последващия линкер се лигатира в линейна ДНК, получена с рестрикционните ензими:
5' GAT ССТ GGA ATT CTG АТА AGA ССТ ТАА CAC GAC TAT ТТТ АА 3'
След клониране плазмидът, съдържащ инсерта, се изолира, подлага се на рестрикция с EcoRl. HCV сДНК инсерта в клон 5-1-1 се изрязва с EcoRl и се лигатира в тази EcoRl линеаризирана плазмидна ДНК. ДНК сместта се използва за трансформиране на E.coli щам Д12Ю (виж/76/). Рекомбинанти с 5-1-1 сДНК в правилна ориентация за експресия на ORF се идентифицират чрез рестрикционните им карти и нуклеотидно съгласуване.Рекомбинантните бактерии от един клон се въвеждат за експресиране на SOD-NANB d полипептид чрез култивиране на бактерии в присъствие на PTG. Фузионният полипептид се пречиства от рекомбинантните E.coli чрез диферанциално екстрахиране на клетъчни екстракти с уреа, последвано от хроматография върху анионнои катионно-обменни колони. Пречистеният SOD NANBS j полипептид се прикрепва към нитроцелулозна мембрана. Антитела в проби от инфектиран c.HCV серум се абсорбират към свързан към матрицата полипептид. След промиване за отстраняване на неспецифично свързани материали и несвързани материали, свързаното антитяло се освобождава от свързания полипептид.
cPCR метод за откриване на HCV РНК в черен дроб и серум от индивиди с NANBH
Надежността и използваемостта на дадена модифицирана форма на PCR изследването, т.е. cPCR изследване за откриване на инфекция с HCV се определя чрез извършване на изследване върху обща чернодробна РНК и върху серум от инфектирани индивиди. При cPCR изследването предполагаемата РНК в пробата се транскрибира обратно в сДНК с обратна транскриптаза, един сегмент от получената сДНК се амплифицира при използване на една модификация на PCR методиката, описана в /78/. Праймерите за cPCR техниката са получени от HCV РНК, която може да бъде идентифицирана чрез семейството HCV сДНК, използвана тук. Амплифицираният продукт, отговарящ за HCV сДНК, се открива с помощта на сонда, получена от семейството HCV сДНК, посочено тук.
Изследването cPCR/HCV,използвано при тези проучвания, се осъществява с помощта на следните методи за получаване на РНК, об ратна транскрипция на РНК в сДНК, амплифициране на специфичните сегменти на сДНК чрез PCR и анализ на PCR продуктите.
РНК се екстрахира от черен дроб с помощта на гуанидин изотиоцианат за получаване на обща РНК, описан в /42/.
С оглед изолиране на общата РНК от плазма, последната се разрежда пет до десет пъти с ΤΕΝΒ(0,1 М натриев хлорид, 50 мМ трис-солна киселина, pH 8,0, 1 мМ ЕДТА) и се инкубира в разтвор на проетиназа К със SDS(0,5 % SDS, 1 мг/мл протеиназа К, 20 мкг/мл поли-А носител) за от 60 до 90 мин при 37°С. Пробите се екстрахират еднократно с фенол (pH 6,5), получената органична фаза се екстрахира повторно един път с TENB, съдържащ 0,1 % SDS, след което и водните фази от двете екстрахирания се събират на едно място и се екстрахират двукратно с равен обем фенол/СНСЦ/ изоамил алкохол (1:1(99:1)). Получените водни фази се екстрахират с равен обем СНСЦ/ изоамил алкохол(99:1), два пъти и се преципитират с етанол при използване на 0,2 М натриев ацетат, pH 6,5 и 2,5 обема 100%-ен етанол за една нощ при 20°С.
Използваната сДНК като матрица за PCR реакцията се получава като се използват определените проби за получаването на съответните сДНК. Всяка проба РНК, съдържаща или два микрограма термично денатурирана обща РНК киселина от черен дроб на шимпанзе, РНК от 2 мкл плазма или 10 % РНК, екстрахирана от 10 ммХ 4 мм цилиндрични чернодробни биопсии, се инкубира в 25 мкл реакция, съдържаща 1 мкмола от всеки праймер, 1 мкмола от всеки деоксирибонуклеотиден трифосфат (dNTP), 50 мкмола трис-HCL, pH 8,3, 5 мкмола MgCL, 5 мкмола дитиотреитол (DTT), 73 мкмола калиев хлорид, 40 единици рибонуклеазен инхибитор (RNASIN) и 5 единици AMV обратна транскриптаза. Инкубирането е за 60 мин при 37°С. След сДНК синтезата, реакцията се разрежда с 50 мкл дейонизирана вода (DJW), кипва се за 10 мин и се охлажда върху лед.
Амплифицирането на един сегмент от HCV сДНК се извършва при използване на два синтетични олигомерни 16-мерни праймери, чиито последователности са получени от HCV сДНК клонове 36 (безсмислови) и 37в (смислови). Последователностите на праймера от клон 36 е:
5' GCA TGT CAT GAT GTA T 3'
Последователността на праймера от клон 37в е:
5' АСА АТА CGT GTG ТСА С 3'
Праймерите се използват при крайна концентрация 1 мкмол всеки. С оглед амплифициране сегментът на HCV сДНК, който е фланкиран чрез праймерите, сДНК пробите се инкубират с 0,1 мкг рибонуклеаза А и PCR реагентите от Perkin Elmer Cetus PCR кит (N801 - 0043 или N 801 - 0055) според инструкциите на производителя. PCR реакцията се извършва за 30 или за 60 цикъла в Perkin Elmer Cetus термален циклизатор. Всеки цикъл се състои от едноминутен етап за денатуриране при 94°С, един етап ренатурация от 2 мин при 37°С и един екстензивен етап от 3 мин при 72°С. Обаче екстензионният етап в крайния цикъл ( 30 или 60) е 7 мин вместо 3 мин. След амплифициране пробите се екстрахират с равен обем фенол:хлороформ (1:1), последвано от екстрахиране с равен обем хлороформ и тогава образците се преципитират с етанол, съдържащ 0,2 М натриев ацетат.
cPCR продуктите се анализират, както следва. Продуктите се подлагат на електрофореза върху 1,8-процентов агарозен гел според /61/ и се прехвърлят върху Зета* хартия (Biorad Corp) посредством адсорбиращи телове за едно денонощие в натриева основа. Петната се неутрализират в 2XSSC (1 X SSC съдържа 0,15 М натриев хлорид, 0,015 М натриев цитрат), прехибридизират се в 0,3 М натриев хлорид, 15 мМ натриев фосфатен буфер, pH 6,8, 15 мМ ЕДТА, 1,0 % SDS, 0,5 % обезмаслено мляко (Карнацион Кс.) и 0,5 мг/мл денатурирана с ултразвук спермална ДНК от пъстърва. Петната, които се анализират за HCV сДНК фрагменти, се хибридизират към 32р-белязана сонда, получена чрез транслиране на HCV сДНК инсерционна последователност в клон 35, описана в /121/. След хибридизиране петната се промиват в 0,1 X SEC (1 XSEC съдържа 0,15 М натриев хлорид, 0,01 М натриев цитрат) при 65°С, изсушават се и се авторадиографират. Очакваният размер на продукта е 586 нуклеотида в дължина; продуктите, който са хибридизирани със сондата и мигрирали в теловете в този размер, се маркират като положителни за вирусна RNA.
Като контрола cPCR праймери, конструирани да амплифицират а -1 антитрипси нова /тРНК, се използват за потвърждаване присъствието на РНК във всяка анализирана проба. Кодиращата област на а-1 антитрипсиновия ген е описана в /75/. Синтетични олигомерни 16-мерни праймери, създадени за амплифициране на 365-нуклеотидния фрагмент на кодиращата област на α -1 антитрипсиновия ген, се получават от нуклеотиди от 22 до 37 (смислови) и нуклеотиди 372 до 387 (антисмислови). PCR продуктите се откриват при използване на 32Р транслационна сонда, която лежи между, но не включва сДНК/PCR праймерни последователности.
Поради изключителната чувствителност на PCR реакцията всички проби се обработват най-малко три пъти. Всичките фалшиви положителни сигнали се елиминират като се взимат следните предпазни мерки:елиминиране на аерозоли при използване на епруветки с винтови капачки и с гумено уплътнение с форма на пръстен;пипетиране с Ранин Микроман - позитивно разместващи пипетиращи устройства с бутални капиляри;и селектиране на олигонуклеотидни последователности за сДНК и PCR праймери от два непродължителни клона.
Откриване на HCV РНК проби от черен дроб чрез cPCR метода.
cPCR изследването се извършва върху обща РНК, изолирана от черен дроб на три шимпанзета, експериментално инфектирани с NANB хепатит, и от чернодробни биопсии на италиански пациенти, диагностицирани като страдащи от NANB хепатит.
Фигура 25А показва резултатите от cPCR изследването при използването на 1 мкг от всеки препарат от обща чернодробна РНК. РНК е изолирана от чернодробни образци от шимпанзета в хронична фаза на NANB хепатит (910) (ивица 1), две шимпанзета в острата фаза на инфекцията (1028 и 508) (ивици 2 и 3 съответно). PCR се извършва върху образци от ивици 1-3 за 30 цикъла и авторадиограмата на петната, съдържащи тези ивици, се експонира 5 ч. сДНК от 1 мкг обща РНК от силно инфектираното животно (1028) (ивица 4) и три неифектирани шимпанзета (ивици 5-7) се амплифицират за 60 цикъла и авторадиограмите, съдържащи тези ивици, се експонират за 7 дни. Белязана с 32 PMsp и разградена с рВР322 ДНК служи като маркери за всичките радиограми. От резултатите може да се види, че сДНК отговаряща за HCV РНК, се наблюдава само в пробите от шимпанзета с ΝΑΝΒ хепатит, независимо дали са остри или хронични (ивици 1, 3 и 4). PCR продуктите в тези ивици мигрират между маркираните фрагменти 527 и 622 нуклеотиди (не е посочено).
Фиг.25 В показва резултатите от cPCR изследването при използване на 10 % от РНК, екстрахирана от 10 мм X 4 мм цилиндри от биопсия на черен дроб на 15 пациента с ΝΑΝΒ (ивици 1-15), един пациент с криптогенно чернодробно заболяване (ред 16) и един контролен образец от пациент с хроничен хепатит В (ивица 17). Амплифицирането чрез PCR е за 30 цикъла и авторадиограмата за петната се експонират за 4 дни, с изключение на това, че ивица 1 се експонира 15 ч. Както се вижда от резултатите 9/15 (60 %) от образците от човек са положителни за HCV РНК (редове 1, 2, 4, 6, 7, 10 - 13). Един пациент с диагностицирано криптогенно чернодробно заболяване (ивица 16) и един пациент с хронична инфекция с HCV (ивица 17) са повторно отрицателни при cPCR изследването.
Сравняване на изследването HCV/cPCR от човешка чернодробна биопсия и PIA от серум с помощта на HCV С100-3 полипептид.
Полиптид SOD/HCV С100-3 (наричан също С100) е рекомбинантен фузионен полипептид, който съдържа 363 вирусни аминокиселини. Полипептидът се използва за откриване на антитяло за HCV (виж /45/). Методът за получаване на С100 е описан в /121/.
Извършва се радиоимунно изследване при използване на С100 със серуми, събрани от същите 17. пациента, чиито чернодробни проби са подлагани на HCV/PCR изследване, както е описано по-горе. Серумите са събирани на същия ден, както чернодробните биопсии. Изследването е извършено, както е описано в /121/, включено в литературата. Микротитрационни пластинки (Jmmulon 2, Removeawell Stvipa) се покриват с 0,1 мкг пречистена С100. Покритите пластинки се инкубират за 1 ч при 37°С със серумните проби (100 микролитра от 1 : 100 разреждане) или с подходящи контроли. След инкубиране несвързаният материал се отстранява, пластинките се промиват и комплексите , образувани от човешко антитяло и С100 се откриват чрез инкубиран с белязан 125j овчи античовешки имуноглоболин. Несвързаното белязано антитяло се отстранява чрез аспириране и пластинките се промиват.
Определя се радиоактивността в отделните кладенчета.
Резултатите от R1A показват, че 67 % от тези проби са положителни за анти-СЮО антитела. Серуми от пациенти, диагнозирани с криптогенно чернодробно заболяване, са положителни за анти-СЮО антитела, въпреки че нивото на вирусната РНК е неоткриваемо в черния дроб на пациентите. Равнището на корелация между наличността на анти-СЮО антителата и HCV РНК е 70 %; Двама пациенти, които са отрицателни за антитела чрез RIA, имат значително ниво на HCV РНК в техния черен дроб (данните не са посочени).
Резултатите показват, че вирусът е налице често в черния дроб на пациенти с циркулиращи анти-СЮО антитела и потвърждават претенцията, че наличността на анти-СЮО антитела отразява точно излагането на HCV. Освен това резултатите посочват, че HCV от този тип е причина за ΝΑΝΒ хепатит при наймалко 75 % от пациентите при това проучване и че преобладаващият щам на HCV в Италия изглежда да е близко родствен с щама, преобладаващ в Съединените щати.
HCV/cPCR изследване на серуми :откриване на вирусна РНК в острата фаза на инфекция при шимпанзета.
Съотношението по време между проявата на чернодробно увреждане, наличието на HCV РНК и присъствието на анти-HCV антитела се следи в серум от експериментално инфектирани шимпанзета с ΝΑΝΒ хипатит (номера 721 и 910). Чернодробното увреждане се определя по съдържанието на аланин аминотрансфераза (ALT). Присъствието на HCV РНК се определя чрез HCV ДНК изследването, описано по-горе, анти-HCV антитела се откриват чрез използването на СЮ0 RIA.
Анализът HCV/cPCR се извършва за РНК, екстрахиране от 1 мкл плазма на шимпанзе. Серумът се взима от шимпанзе 771 в 25-шия, 32-рия, 70-тия и 88-мия ден след инфектирането;сРСЯ се извършва за 30 цикъла и авторадиограмата се експонира 18 дни. Серум се взима и от шимпанзе 910 в 11-ия, 28-ия и 67- ия ден след инфектирането;сРСК се извършва за 60 цикъла и авторадиограмата се експонира за 5 дни.
Резултатите от изследванията са посочени на фиг.26А за шимпанзе 771 и на фигура 26В за шимпанзе 910. От сравняването на фигури 26А и 26В се вижда един ранен, добре изразен връх за ALT стойности по време на острия хепатит при корелация с наличността на вирусна RNA при инфектирания индивид.
Данните показват също, че наличността на HCV РНК, която е показателна за състоянието на виремия, предхожда наличността на анти-HCV антитела. Шимпанзе 771 (фиг.26А) проявява ясно изразен остър епизод на посттрансфузионен NANB хепатит за 28, както се характеризира чрез начален пик на ALT равнището. HCV РНК се открива в серум, взет на 25-ия ден и на 32-ия ден. Но по време на тази остра фаза анти-HCV антитела липсват. Обратно, на 70-ия ден HCV РНК е под експерименталното равнище на откриване и антиHCV антитела се повишават. На 88-ия ден HCV РНК остава неоткриваема, докато антиHCV антителата са значително повишени над тези от 70-ия ден.
Получените резултати от серуми от шимпанзета 910 донякъде сходни по картина, обаче времето за HCV-антитела, индуцирани от инфекцията, не се откриват по време на острата фаза, която се разширява до най-малко 67-ия ден; анти-HCV антителата, открити чрез R1A на 11-ия ден, се дължат на пасивно имунизиране на животно 910 с антитела от плазмата, използвана за инокулиране на животното. Анти-HCV антитела се установяват в шимпанзе 910 в серум през последната, хронична фаза на инфекцията (данните не са посочени) .
Трябва да бъде отбелязано, че ниски ALT стойности в плазма от индивиди с хроничен NANB хепатит не корелират наложително със слабата продукция на вирус. Събрани на едно място различни проби от плазма на шимпанзе 910, взети през период от две до три и половина години след инокулирането, се следят за съдържание на ALT и за HCV РНК. Стойностите за ALT в образците не надхвърлят 45 мили I единици/мл. Независимо от това, титрационните изследвания показват високи титри за HCV (ЗХ106 CID/мл). cPCR се провежда за 30 цикъла и авторадиограмата се експонира за 15 ч, анализът cPCR показва ясно наличността на вирусна РНК (данните не се приведени) .
HCV/cPCR изследване на серуми: откриване на вирусна РНК в острата фаза на инфекция при хора
Плазма от пациенти след хирургическа намеса, събирана по време на остър NANB хепатит, се изследва за HCV РНК и за антиHCV антитела, като се използва HCV/cPCR изследването и съответно C100-RIA. Изследването HCV/cPCR се извършва, като се използва 1 мкл плазма от пациента и от четири души контроли с познат произход; cPCR се извършва за 30 цикъла и след хибридизиране и промиване радиограмата се експонира за осем часа.
Резултатите посочват, че серумът, събран от хирургическите пациенти по време на острата фаза на инфекция, имат високо съдържание на вирусна РНК и че анти-HCV антителата са неоткриваеми чрез C100-R1A (данните не са посочени). За плазмата от острата фаза на пациентите е известно, че има висок тигър за NANB хепатитен инфекциозен агент (106·5 CID/мл, както е описано в/20/; и /21/. Следва да се отбележи обаче, че този пациент не отговаря на анти-HCV антитела чрез С100RIA за приблизително 9 месеца след инфекцията. Серумът от контролните плазми на хора с известен произход са отрицателни както по HCV/PCR така и по C100-RIA.
Чувствителност на изследването HCV/ cPCR
Чувствителностт на HCV/cPCR изследването се определя чрез анализиране на десеткратни серийни разреждания на сборна плазма с познат титър. Плазмата от шимпанзе има титър от -Зх105 CID/мл и РНК се екстрахира от десеткратните разреждания на 1 мкл от плазмата. cPCR се извършва за 30 цикъла и след хибридизиране и промиване авторадиограмата се експонира за 15 ч. Полученият cPCR продукт след амплифицирането от -300, -30 и -3 CID на HCV генома е показан на ивиците 1-3 съответно от фиг.29. Пробите в ивици 1 и 2 са откриваеми на авторадиограми, експонирани за 2 ч.
Тъй като средният титър за HCV при инфектирани индивиди се приема да е приблизително между 100 до 10000 CID/мл плазма, тези данни подсказват че HCV/cPCR изследването може да е клинично приложимо.
HCV/cPCR изследване на различни HCV щамове
Праймери, съдържащи комплекс от олигомерни, 44-мсри и комплекс олигомерни/45мери, са конструирани за амплифициранс на щамове HCV, които са сходни или идентични с HCV изолат, от който произхожда сДНК пое- 5 ледователността от фиг. 18. Предпоставка в основата на конструирането на тези праймери е нашето откритие, че HCV е флавиподобен вирус. Членовете на фамилията флавивируси, когато се сравняват с HCV, имат два главни комплек- 10 са аминокиселинни последователности, TATPPG и ORRGR, в предполагаемия NS3 участък на тези вируси. Няколко друга по-малки комплек са може да бъдат наблюдавани, например GDD в предполагаемата NS5 зона. Други комплекси са определими чрез сравняване с познати аминокиселинни последователности с тази на HCV. Тази информация е изведена от последователностите за няколко члена на флавивирусите, които са били описани, включително Японския енцефалитен вирус (виж /89/), вируса на жълтата треска (виж /72/), тип 1 Денга вирус (виж / 32/), тип 4 Денга вирус (виж /53/) и вируса Западен Нил (виж /9/). Съхранените аминокиселинни последователности и използваните кодони са посочени в непосредствено следващата таблица.
Съхранени последователността на аминокиселини (А.А.) измежду флавивируси и HCV
| Вирус | № на първата А.А. | Т | А | Т | Р А.А. | Р | G |
| HCV | 1348 | 5’АСС | GCC | АСС | ССТ | ССС | GCC 3' |
| Жълта треска | 1805 | АСА | GCC | АСА | CCG | ССТ | GGG |
| Западен Нил | 1818 | AGG | GCA | ACG | ССА | ССС | GGG |
| Денпо-4 | 1788 | АСС | GCA | АСС | ССТ | ССС | GGA |
| jEV | 1957 | АСА | GCG | ОСС | CCG | ССТ | GGA |
| HCV смислен паймер (44 мерен) | |||||||
| 5' АСС GCC ACC ССХ СС 3 | |||||||
| Х-А, Т, | С или G |
| Вирус | Номер на първата А.А. | Q | R | R | G А.А. | R | ||
| HCV | 1486 | 5' | САА | CGT | CGG | GGC | AGG | 3' |
| Жълта треска | 1946 | САА | AGG | AGG | GGG | CGC | ||
| Западен Нил | 1959 | CAG | CGG | AGA | GGA | CGC | ||
| Денгю-4 | 1929 | CAG | AGA | AGA | GGG | CGA | ||
| jEV | 1820 | САА | CGG | AGG | GGC | AGA |
HCV безсмислен праймер (45-мерен),3’СТХ GCA GCC CCG ТСС 5' (X = Т или С)
Забележка:Праймерната последователност е избрана за свеждане до минимум броя на нуклеотидните дегенерации на 3’-края на праймерната последователност и за максимализиране броя на нуклеотидите на 3’-края на всеки праймер, който съвпада точно на всяка от възможните последователност или на комплемента към тях, кодиращ консервираните аминокиселини, посочени по-горе.
44-мерните и 45-мерните олигамерни праймери са проектирани така, че последователностите, кодиращи тези аминокиселини се инкорпорират в праймсра. Освен това те съдържат дегенерации на 3'-края на всеки праймер и са изведени от две различни зони на HCVгенома, които са налични в клон 40 в (виж фиг.28) и които са получени от зони, кодиращи вероятни NS3 или HCV. Формулите за олигонуклеотидни праймери в комплексите са
5’GAC TGC GGG GGC GAG ACT GGT TGT GCT CGC
ACC GCC ACC CCX CC 3' 10 където X е A, T, G или C и
5' TCT GTA GAT GCC TGG CTT CCC GCC AGT
CCT GCC CCG ACT YTG 3' където У е T или C. 15
Изследването HCV/cPCR се извършва при използване на тези праймери за амплифициране на HCV РНК в плазма от шимпанзета. Методът за изследване е по същество като описания в раздела по-горе, с изключение на това, 20 че 44-мерния и 45-мерния комплекс от олигомерни праймери е заместен от праймери, получени от клон 36 и от клон 37в. Освен това откриването на амплифицирана HCV сДНК е хибридизирана със сонда, получена от клон 40а, 25 последователността на която е посочена на фиг. 32.
Сондата е приготвена чрез амплифициране на един сегмент на клон 40а, като се използва метода, описан по-горе, и 18-мерен 30 праймер, съдържащ следните последователности:
и 5' GAG АСА TCT CAT CTT CTG 3' 5' GAG CGT GAT TGT СТС ААТ 3'.
След амплифициране получената сонда се маркира с 32Р чрез транслиране.
На фиг.ЗЗ е показана авторадиограма на Soufheru blofs, сондирано с последователността, получена от клон 40а. Белязаните с 32р Map! и разградени с pBR322 ДНК фрагменти служат 40 като маркер (ред 1). Предсказаният размер на PCR продукта, получен след амплифицирането при използване на тези праймери е 490 нуклеотида (ht). Дупликатните реакции са показани в редове 2 и 3.
Анализи за варианти на 3'-областта на
HCV
Въз основа на модела флавивирус, 5'- зоната HCV сДНК, която е прикачена от страна на областите, представени в клонове ag30a и к9-1 кодира един сегмент на предполагаеми повърхностни и/или матрични протеини(Е/М). Серум, получен от шимпанзето, от което е конструирана HCV сДНК “с” библиотека, се анализира чрез HCV/PCR за определяне дали вариантите в тази мишенна зона са налице. Изследването HCV/cPCR се осъществява, както е описано по-горе за изолирането на клон 5'-32, с изключение на това, че се използват праймери и сонди. Фиг.37 показва съотношението на праймери и сонди (и клоновете, от които те произхождат) към мишенната зона на HCV сДНК. Един комплекс праймери, ag30a06A и Κ91Επν16Β са изведени от клонове ag30a и к9-1, които са съответно нагоре и надолу на мишенната последователност. Очакваният размер на cPCR продукт, иницииран чрез ag30al6A и K91Envl6B е 1,145 кв, въз осново на потвърдената последователност на HCV сДНК. Двата други комплекса PCR праймери, покриващи зоната, амплифицирана при използване на ag30al6A и K91Envl6B и препокриващи се взаимно, се използват също за PCR амплифициране на HCV РНК в серума. В този случай PCR реакциите се извършват при използване на един комп35 леке праймери ag30al6A и СА156е16В и като втори комплекс праймери СА156е16А и k91Envl6B. Очакваните размери на PCR продукта за тези двойки е 615 нуклеотида (NT) и 683 NT съответно.Следващата непосредствено таблица посочва праймерите, клоновете от които произхождат и праймерните последователности.
Таблица
| Праймер | Клон | Последователност |
| ag30al6A | ag30a | 5’CTC TAT GGC AAT GAG G 3' |
| K91Envl6B | k9-l | 5' CGT TGG CAT AAC TGA T 3' |
| СА156е16В | 156 | 5’CGA CAA GAA AGA CAG A 3' |
| СА156е16А | 156 | 5’AGC TTC GAC GTC АСА T 3' |
| CA216al6A | 216 | 5' TGA ACT ATC CAA CAG G 3' |
5’GGA GTG TGC AGG ATG G 3'
5' AAG GTT GCA ATT GCT C 3’
5' ACT AAC AGG ACC TTC G 3'
СА216а16В216
CA84al6A84
CA84al6B84
Сондите за всички HCV/сДНК продукти, състоящи се от белязани с 32р сектори на HCV сДНК, които са получени чрез PCR амплифициране на зона от клон 216 (използвайки СА216а16А и 216а16В праймери), и клон 84 (използвайки СА84а16А и СА84а16В); 32р се въвежда в PCR продукти чрез транслиране. Тези сонди не препокриват праймерите, използвани за HCV/cPCR реакциите.
Фиг.38 показва Southern Blott авторадиограма HCV/cPCR продуктите са хибридизирани с белязаната с32Р сонда. Продуктът HCV/ cPCR, амплифициран спраймерите ag30al6A и K91Envl6B (ред 1) е приблизително 1,1 Кв. Не са наблюдавани никакви други продукти при експониране за 15 ч. HCV продуктите, амплифицирани с праймерите, а 30а16А/ СА156е16В (ред 2) и CA156el6A/K91Envl6B (ред 3) са приблизително 625 NT и съответно 700 Ντ. Размерът на PCR продуктите, определя чрез сравняване на относителните миграции на фрагментите , резултат от разграждането pBR322 с MapI и на Phix 174, разграден с НаеП! (ред 5).
Горното изследване открива инсерции и делеции толкова малки, колкото приблизително 20 NT до 50 NT и преподреждания на ДНК, изменящи размера на мишенната ДНК. Резултатите на фиг.38 потвърждават, че има само 1 голям вид сДНК, получен от Е/М областта на HCV в серума на шимпанзето.
Амплифициране за клониране на HCV сДНК последователности с помощта на PCR и праймери, получени от съхранени области на флавивирусни геномни последователности
Нашето откритие, че HCV е флавиподобен вирус, позволява провеждане на клониране на неохарактеризирани HCV сДНК последователности с помощта на PCR методиката и праймери, получени от областти, кодиращи съхранени аминокиселинни последователности във флавивирусите. Обикновено един от праймерите е получен от определена HCV геномна последователност, а другият праймер, който фланкира област с несъгласуван HCV 10 полинуклеотид, е получен от съхранен регион на флавивирусен геном. Флавивирусните геноми са познати като съдържащи съхранени последователности в NS1, и Е-полипептиди, които са кодирани в 5’-областта на флавиви15 русния геном. Така, за изолиране на сДНК последователности, произхождащи от предполагаеми сравними зони на HCV генома, се приготвят праймери, насочващи нагоре, които са получени от съхранени последователности в 20 тези флавивирусни полипептиди. Насочващите надолу праймери се получават от насочените нагоре краища на познати части на HCV сДНК.
Поради дегенерацията на кода е вероятно да има несъвпадение между флавивирус25 ните сонди и съответните HCV геномни последователности. Поради това се използва една методика, която е подобна на тази, описана в /51/. Процедурата в /51/ използва смесени олигонуклеотидни праймери, комплемен30 тарни на обратно транслационните продукти на една аминокиселинна последователност; последователностите в смесени праймери взимат предвид всяка кодонна дегенерация за съхранената аминокиселинна последователност.
Генерират се три комплекса праймерни смеси, основани на аминокиселинните хомоложности, установени в няколко флавивируса, включително Денго-2,4 (D-2,4), японския енцефалитен вирус (jEv),жълтата треска 40 (YF) и вируса Западен нил (WN). Праймерната смес, получавана от най-нагоре съхранената последователност (5'-1), се основава на аминокиселинна последователност gly-trp-gly, която е част от съхранената последователност 45 asp-arg-gly-trp-gly-aspN, установена в Е-протеина на D-2, jEv, YF и WN. Следващата праймерна смес (5'-2) се основава на съхранената надолу последователност в Е-протеин, phe-asp-gly-asp-sertyv-ileu-phe-gly-asp-ser-tyr50 ileu и произхожда от phe-gly-asp. Консервираната последователност присъства в D-2, jEv, YF и WN. Третата праймерна смес (5'-3) се основава на аминокиселинната последователност arg-ser-cys, която е част от съхранената последователност cys-arg-ser-cys в NS1 протеина на D-2, D-4 Ev, YF и WN. Отделните праймери, които оформят сместа в 5'-3, са посочени на фиг.53. Освен това при различните последователности, произхождащи от съхранена област, всеки праймер във всяка смес съдържа също един постоянен участък в 5'-края, който съдържа последователност, кодираща местата на ограничителни ензими Hindlll, Мво1 и EcoRI.
Насоченият надолу праймер ss c5h20A е получен от една нуклеотидна последователност в клон 5h, който съдържа HCV сДНК с последователност, препокриваща онези в клонове 14i и 11в. Последователността на ss c5h20A е
5’GTA АТА TGG TGA CAG AGT CA 3'
Един алтернативен праймер-ss c5h34A, може също да бъде използван. Този праймер се получава от една последователност в клон 5h и съдържа -допълнително нуклеотиди в 5'края, които създават място за ограничителен ензим, като с това улесняват клонирането.
Последователността на ss c5h34A е
5' GAT СТС TAG AGA AAT CAA TAT GC GAC AGA GTC A 3'
PCR реакцията, която е описана найнапред в /78/, се извършва, главно както е описана в /51/, с изключение на това, че матрицата за сДНК е РНК изолирана от черен дроб на инфектирано с HCV шимпанзе или от вирусни частици, изолирани от серум на инфектирани с HCV шимпанзета. Освен това, условията на ренатуриране са по-малко строги в първия етап на амплифициране (0,6 М натриев хлорид и 25°С), тъй като частта от праймера, който ще се ренатурира до HCV последователността, е само 9 нуклеотида и там може да има несъвпадение. Освен това, ако се използва ss c5h34A, допълнителните последователности, непроизхождащи от HCV генома, имат тенденцията да дестабилизират хибрида праймер-матрица. След първия етап на амплификация условията на ренатуриране може да са по-строги (0,066М натриев хлорид и 32°С до 37°С), тъй като амплифицираната последователност съдържа области, които са допълнителни към или дуплициращи за праймерите. Освен това първите 10 цикъла от амплифицирането се извършват с Кленов ензим I при подходящи PCR условия за този ензим. След завършване на тези цикли пробите се екстрахират и се обработват с Tag полимераза според указанията за кита, както предлага Percin
Elmer Cetus.
След амплифициране HCV сДНК последователности се откриват чрез хибридизиране при използване на една сонда, получена от клон 5h. Тази сонда се получава от последователност, нагоре от тази, използвана за получаване на праймера, и не препокрива последователностите на клон 5h получаваните праймери.
Последователността на сондата е 5’ССС AGC GGC GTA CGC GCT GGA
CAC GGA GGT GGC CGC GTC
GTC TGG CGG TGT TGT ТСТ CGT CGG GTT GAT GGC СС 3'
Индустриална приложимост Описаните тук методи, както и олигомерите, сондите и праймерите, получавани от HCV сДНК и китовете , които ги съдържат, са полезни за точно, сравнително просто и икономично определяне присъствието на HCV в биологични проби, по-специално в кръв, която може да бъде използвана за транефузия и при индивиди, за които се подозира , че притежават HCV. Освен това, тези методи и олигомери може да бъдат използвани за откриване на по-ранните стадии на инфекция с HCV, в сравнение с имунологичните изследвания чрез използване на рекомбинантни HCV полипептиди. Също така, изпитване на амплифицирана полинуклеотидна хибридизационна проба открива HCV РНК в случайни проби, които са анти-HCV антитяло негативни. Сондите и праймерите, описани тук може да бъдат използвани за подсилено хибридизационно изследване във връзка с имунно изследване на база на HCV полипептиди за по-точно идентифициране на инфекция, дължаща се на HCV и на инфектирани с HCV биологични проби, включително кръв.
Предложената тук информация позволява създаването на праймери и/или сонди, които произхождат от съхранени области на HCV генома. Наличността на тези праймери и сонди прави възможно създаването на общ метод, с който да се откриват различни HCV щамове и който е от полза за различаване на кръв и кръвни продукти.
Ако използваните праймери в метода произхождат от тези консервирани зони на HCV генома, методът става средство за откриване и/или идентифициране на различни щамове на HCV.Обратно, това трябва да води до разработването на допълнителни имунология- 5 ни реагенти за откриване и диагностициране на HCV, както и за разработване на допълнителни полинуклеотидни реагенти за откриване и/или третиране на HCV.
Освен това, комплекси от праймери и сонди, конструирани от съхранени аминокиселинни последователности на флавивируси и на HCV позволява един универсален метод за откриване на тези инфекциозни агенти.
Посочените по нататък материали са депозирани съгласно Будапещенският договор в Американската колекция от типови култури (АТСС), 12301 Parldwn Dr, Rocrville Meriland 20852 и са регистрирани под следните номера
| λ-gt 11 | АТСС | Дата на депозиране |
| HCV cDNA списък | 40394 | 1.12.1987 |
| Клон 81 | 40388 | 17.11.1987 |
| Клон 91 | 40389 | 17.11.1987 |
| Клон 1-2 | 40390 | 17.11.1987 |
| Клон 5-1-1 | 40391 | 18.11.1987 |
| Клон 12 f | 40514 | 10.11.1988 |
| Клон 35 f | 40511 | 10.11.1988 |
| Клон 15е | 40513 | 10.11,1988 |
| Клон К9-1 | 40512 | 10.11.1988 |
| JSC308 | 20879 | 5.05.1988 |
| pS 356 | 67683 | 29.04.1988 |
Освен това следните депозити са направени на 11.05.1989
| Щам | Линкери | ATCC № |
| D1210 (Cfl/5-l-I) | EF | 67967 |
| D1210 (Cfl/81) | EF | 67968 |
| D1210 (Cfl/CA74a) | EF | 67969 |
| DI210 (Cfl/35f) | AB | 67970 |
| D1210 (Cfl/279a) | EF | 67971 |
| D1210 (Cfl/СЗб) | CD | 67972 |
| D1210 (Cfl/13i) | AB | 67973 |
| D1210 (Cfl/СЗЗв) | EF | 67974 |
| D1210 (Cfl/CA290a) | AB | 67975 |
НВ101 (АВ24/С100 # 3R 67976
Следните производни на щам 1210 са депозирани на 3.05.1989 г
| Щам производно | ATCC |
| pCFCS/C8f | 67956 |
| pCFlC12f | 67952 |
| pCFlEF/14c | 67949 |
| pCFlEF/15e | 67954 |
| pCFlAB/C25c | 67958 |
| pCFlEF/C33c | 67953 |
Следните щамове са депозирани на 17.05.1989 г.
| pCFlEF/c33f | 67050 |
| PCFlCD/33g | 67951 |
| pCFlCD/C39c | 67955 |
| PCF1EF/C40B | 67957 |
| PCF1EF/CA167b | 67959 |
Щам
АТСС
| Xgtll(C53) λ gtlO ф-5а№ D1210 (С40в) | 40603 40602 67980 |
D1210 (М16)
67981
Следните биологични материали са депозирани на 23.03.1990 г.
Материал
АТСС
5' (клон 32 (pUC18S)
Claims (23)
1. Олигомер, пригоден за хибридизиране с HCV последователност в аналитична полинуклеотидна верига, в която този олигомер е включен в HCV насочваща мишенна последователност, комплементарна на най-малкото 4 непрекъснати нуклеотида от HCV сДНК, характеризиращ се с това, че HCV сДНК е от една последователност, определена от номера от -140 до -320 или от 8867 до 9060, както е показано на фиг. 18, или комплементите на тези последователности.
ПП8980*ПП8990’ ПП8990_ПП9000’ ПП9<ЮО*ПП9О1О’ ^^9010*^^9020’ ^^9020*^^9030’ ^^9030*^^9040’
9040 9030 9050 9060'
3. Олигомер, пригоден за хибридизиране с HCV последователност в аналитична полинуклеотидна верига, където този олигомер е включен в HCV насочваща мишенна последователност, комплементарна на последователност от най-малко 8 нуклеотида, намиращи се в една съхранена HCV последователност на HCV РНК, характеризиращ се с това, че съхранената последователност е локализи2. Олигомер съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че насочващата мишенна последователност е включена в нуклеотиди, които са комплементарни на нуклеотиди, подбрани от следващите HCV сДНК нуклеотиди, показани на фиг. 18 (ппх-ппу означава нуклеотиден номер х до нуклеотиден номер у):
340 -330 330 320’ рана в последователността от нуклеотидни номера от 5'-края до около 200 или от около 4000 до около 5000 или от около 8000 до около 9040, или от -318 до около 174, или от около 4056 до около 4448, или от около 4378 до около 4902, или от около 4042 до около 4059, или от 4456 до около 4470, или от около 8209 до около 8217, при което нуклеотидите са номерирани, както е посочено на фиг. 18.
4.Олигомер съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че съхранената посПП889О*ПП89ОО’ ПП8900ПП8910’ ПП88910*ПП8920’ Г'^88920*ПП8930’ ПП8930*ПП8940’ ПП8940*ПП8930 ПП895О*ПП896О’ Г 1896О*ПП897О’ ПП897О*ПГ'898О’ ледователност е разположена в последователността от нуклеотиди номера от 5'-края до около 200 във фиг. 18.
5. Олигомер съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че съхранената последователност е разположена в последователността от нуклеотидни номера от около 4000 до около 5000 на фиг. 18.
6. Олигомер съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че съхранената последователност е разположена в последователността от нуклеотидни номера от около 8000 до около 9040, както е посочено на фиг. 18.
7. Олигомер съгласно претенция 3, характеризиращ се е това, че съхранената последователност е разположена в последователността от нуклеотидни номера от около -318 до около 174, както е посочено на фиг.18.
8. Олигомер съгл. претенция 3, характеризиращ се с това, че съхранената последователност е разположена в последавателността от нуклеотидни номера от около 4056 до около 4448, както е посочено на фиг. 18.
9. Олигомер съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че съхранената последователност е разположена в последователността от нуклеотидни номера от около 4378 до около 4902, както е посочено на фиг. 18.
10. Олигомер съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че съхранената последователност е разположена в последователността от нуклеотидни номера от около 4042 до около 4059, както е посочено на фиг. 18.
11. Олигомер съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че съхранената последователност е разположена в последователността от нуклеотидни номера от около 4456 до около 4470, както е посочено на фиг. 18.
12. Олигомер съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че съхранената последователност е разположена в последавателността от нуклеотидни номера от около 8209 до около 8217, както е посочено на фиг. 18.
13. Олигомер съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че той е улавяща сонда.
14. Олигомер съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че той е белязана сонда.
15. Олигомер съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че той е праймер.
16. Олигомер съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че се хибридизира с последователността с нуклеотидни номера от около -313 до около -282 на фиг. 18.
17. Олигомер съгласно претенция 3, характеризиращ сс с това, че се хибридизира с последователността с нуклеотидни номера от около -203 до около -173 на фиг.18.
18. Олигомер съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че се хибридизира с последователността с нуклеотидни номера от около -252 до около -221 на фиг.18.
19. Метод за откриване на HCV последователност в анализираната верига, за която се предполага, че съдържа HCV полинуклеотид, характеризиращ се с това, че HCV полинуклеотидът съдържа подбрана мишенна област и включва:
(а) осигуряване на олигомер, пригоден за хибридизиране с HCV последователност в аналитичната полинуклеотидна верига, характеризиращ се с това, че олигомерът е съставен от HCV формираща мищенна последователност, комплементарна на най-малко четири съседни нуклеотида на HCV сДНК, при което HCV сДНК е с последователност, обозначена с номера от -340 до -320 или 8867 до 9060, посочени на фиг.18, или комплементите на тези последователности;
(в) инкубиране на аналитичната верига с олигомера от подточка (а), което позволява образуване на специфични хибридни деплекси между насочващата мишенна последователност и мишенната последователност;
(с) откриване на хибриди, формирани между мишенната зона, ако има такава, и олигомера.
20. Метод за откриване на HCV последователност в аналитична верига, за която се счита, че съдържа HCV полинуклеотид, характеризиращ се с това, че HCV полинуклеотидът съдържа подбрана мишенна област, а методът включва:
(а) осигуряване на олигомер, способен да се хибридизира с HCV последователност в аналитична полинуклеотидна верига, характеризиращ се с това, че олигомерът е съставен от насочваща мишенна последователност, която е комплементарна на последователност от най-малко осем нуклеотида, намираща се в съхранена нуклеотидна последователност от HCV РНК, при което съхранената последователност е разположена в последователността с нуклеотидни номера от 5' края до около 200 или от около 4000 до около 5000, или от около 8000 до около 9040, или от около -318 до около 174, или от около 4056 до около 4448, или от около 4378 до около 4902, или от около 4042 до около 4059, или от около 4456 до около 4470, или от около 8209 до около 8217, при което нуклеотидите са номерирани, както е посочено на фиг. 18;
(в) инкубиране на аналитичната вирига с олигомера от (а), което позволява да се оформят спецефични дуплекси между насочващата мишенна последователност и мишенната по- 10 следователност;
(с) откриване хибриди, оформени между мишенната област, ако има такава, и олигомера.
21. Метод съгласнопретенция 20, който 15 по-нататък включва:
(а) осигуряване на комплекс олигомери, които са праймери в полимеразно верижните реакции и които фланкират мишенната област;
(в) амплифициране на мишенната област 20 посредством метода на полимеразните верижни реакции.
22. Кит за откриване на HCV мишенна последователност в аналитична верига, характеризиращ се с това, че олигомерът от претен- 25 ция 1 или претенция 3 е опакован в подходящ контейнер.
23. Методи за получаване на кръв, свободна от HCV, характеризиращ се с:
(а) осигуряване на аналитични нукле- 30 инови киселини от проба кръв, за която се счита, че съдържа HCV мишенна последователност;
(в) осигуряване на олигомер, пригоден да хибридизира с HCV последователност в ана- 35 литична полинуклеотидна верига, ако има такава, характеризиращ се с това, че олигомерът е съставен от една HCV насочваща последователност, комплементарна на последователност от най-малкото осем нуклеотида, 40 намиращи се в съхранената HCV нуклеотидна последователност на HCV РНК, при което тази съхранена последователност е разположена в последователността с нуклеотидни номера от 5'-края до около 200 или от около 4000 до около 5000, или от около 8000 до около 9040, или от около -318 до около 174, или от около 4056 до около 4448, или от около 4378 до около 4902, или от около 4042 до около 4059, или от 5 около 4456 до около 4470, или от около 8209 до около 8217, при което нуклеотидите са номерирани, както е посочено на фиг. 18.
(c) взаимодействие на нуклеиновите киселини от подточка а) с олигомера от подточка в) при условия, които позволяват образуването на полинуклеотиден дуплекс между насочващата мишенна последователност и мишенната последователност, ако има такава;
(d) откриване на дуплекс, формиран в подточка с, ако има такъв;
(e) съхраняване на кръв, в която не са открити дуплекси в (d).
24. Метод за получаване на кръв, свободна от HCV, който включва :
(а) предоставяне на аналитични нуклеинови киселини от проби кръв, за която се счита че, съдържа HCV мишенна последователност;
(в) предоставяне на олигомер, пригоден за хибридизиране до HCV последователност в аналитична полинуклеотидна верига, характеризираща се с това, че олигомерът е съставен от HCV насочваща мишенна последователност, комплементарна на най-малкото четири съседни нуклеотида на HCV сДНК, при което HCV сДНК е с последователност, означена с номера от -340 до -320 или 8867 до 9060, както е посочено на фиг. 18 или комплементите на тези последователности;
(c) взаимодействие на нуклеиновите киселини съгласно подточка а) с олигомер от подточка в) при условия, които позволяват образуването на полинуклеотиден дуплекс между насочващата мишенна последователност и мишенната последователност, ако има такава;
(d) откриване на дуплекс, формиран в подточка (с), ако има такъв;
(e) съхраняване на кръв, в която не са били открити дуплекси в подточка (d).
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US35596189A | 1989-05-18 | 1989-05-18 | |
| US45663789A | 1989-12-21 | 1989-12-21 | |
| US50543590A | 1990-04-04 | 1990-04-04 | |
| PCT/US1990/002853 WO1990014436A1 (en) | 1989-05-18 | 1990-05-18 | Nanbv diagnostics: polynucleotides useful for screening for hepatitis c virus |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG60348B2 true BG60348B2 (bg) | 1994-09-30 |
Family
ID=27408242
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG095495A BG60348B2 (bg) | 1989-05-18 | 1991-11-18 | Nаnв диагностика: полинуклеотиди, приложими за скрининг на вируса на хепатит с |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0398748B1 (bg) |
| JP (3) | JP2656996B2 (bg) |
| AT (1) | ATE211772T1 (bg) |
| AU (1) | AU638719B2 (bg) |
| BG (1) | BG60348B2 (bg) |
| CA (1) | CA2017157C (bg) |
| DE (1) | DE69033891T2 (bg) |
| DK (1) | DK0398748T3 (bg) |
| ES (1) | ES2166749T3 (bg) |
| FI (1) | FI105279B (bg) |
| GE (1) | GEP20002164B (bg) |
| HU (1) | HUT59964A (bg) |
| LV (1) | LV10729B (bg) |
| MC (1) | MC2188A1 (bg) |
| NO (1) | NO303503B1 (bg) |
| RO (1) | RO113059B1 (bg) |
| WO (1) | WO1990014436A1 (bg) |
Families Citing this family (67)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6489246A (en) * | 1987-09-30 | 1989-04-03 | Sony Corp | Fixing method for color sorting mechanism of color cathode-ray tube |
| US6861212B1 (en) | 1987-11-18 | 2005-03-01 | Chiron Corporation | NANBV diagnostics and vaccines |
| US6171782B1 (en) | 1987-11-18 | 2001-01-09 | Chiron Corporation | Antibody compositions to HCV and uses thereof |
| US5698390A (en) * | 1987-11-18 | 1997-12-16 | Chiron Corporation | Hepatitis C immunoassays |
| US5714596A (en) * | 1987-11-18 | 1998-02-03 | Chiron Corporation | NANBV diagnostics: polynucleotides useful for screening for hepatitis C virus |
| US5712088A (en) * | 1987-11-18 | 1998-01-27 | Chiron Corporation | Methods for detecting Hepatitis C virus using polynucleotides specific for same |
| US6027729A (en) * | 1989-04-20 | 2000-02-22 | Chiron Corporation | NANBV Diagnostics and vaccines |
| GB2239245B (en) * | 1989-12-18 | 1993-11-10 | Wellcome Found | Post-transfusional non-A non-B hepatitis viral polypeptides |
| US7166287B1 (en) | 1989-12-18 | 2007-01-23 | Glaxo Wellcome Inc. | Viral agent |
| JP3268502B2 (ja) | 1990-06-12 | 2002-03-25 | 徹雄 中村 | 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス関連ポリヌクレオチド、ポリペプ タイド |
| CA2044296A1 (en) * | 1990-06-12 | 1991-12-13 | Hiroaki Okamoto | Oligonucleotide primers, and their application for high-fidelity detection of non-a, non-b hepatitis virus |
| US5747339A (en) | 1990-06-25 | 1998-05-05 | Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka | Non-A, non-B hepatitis virus genomic CDNA and antigen polypeptide |
| JPH05508318A (ja) * | 1990-06-30 | 1993-11-25 | アクゾ・エヌ・ヴエー | 非―ａ非―ｂ配列 |
| DK0469348T3 (da) * | 1990-07-11 | 1997-04-01 | Shionogi & Co | cDNA-sekvens og detektering af hepatitis C-virus |
| WO1992001714A1 (en) * | 1990-07-24 | 1992-02-06 | Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. | Non-a non-b hepatitis virus antigen |
| HUT69140A (en) * | 1990-08-10 | 1995-08-28 | Chiron Corp | Nanbv diagnostics: polynucleotides useful for screening for hepatitis c virus |
| WO1992009634A1 (en) * | 1990-11-29 | 1992-06-11 | Toray Industries, Incorporated | Non-a non-b hepatitis virus antigen protein |
| EP0571554A1 (en) * | 1991-01-14 | 1993-12-01 | James N. Gamble Institute Of Medical Research | Basic structural immunogenic polypeptides having epitopes for hcv, antibodies, polynucleotide sequences, vaccines and methods |
| IE65424B1 (en) * | 1991-03-01 | 1995-10-18 | Akzo Nv | Peptides immunochemically reactive with antibodies directed against hepatitis non-A non-B virus |
| US5574132A (en) * | 1991-04-05 | 1996-11-12 | Biochem Immunosystems Inc. | Peptides and mixtures thereof for detecting antibodies to hepatitis C virus (HCV) |
| EP0510952A1 (en) * | 1991-04-26 | 1992-10-28 | Immuno Japan Inc. | Oligonucleotide primers and their application for high-fidelity detection of non-a, non-b hepatitis virus |
| FR2677372B1 (fr) | 1991-06-06 | 1994-11-10 | Pasteur Institut | Sequences nucleotidiques et peptidiques d'un isolat de virus de l'hepatite c, applications diagnostiques et therapeutiques. |
| IT1249684B (it) * | 1991-07-19 | 1995-03-09 | Sorin Biomedica Spa | Epitopi della proteina env del virus dell'epatite c. |
| ES2111589T3 (es) * | 1991-08-27 | 1998-03-16 | Hoffmann La Roche | Metodos y reactivos para la deteccion de la hepatitis c. |
| JPH06502770A (ja) * | 1991-09-12 | 1994-03-31 | シーダーズ−サイナイ・メディカル・センター | Ｃ型肝炎ウイルスｒｎａの直接検出法 |
| RO116199B1 (ro) | 1991-09-13 | 2000-11-30 | Chiron Corp | Compozitie polipeptidica hcv imunogena |
| EP0573624A4 (en) * | 1991-11-07 | 1997-09-17 | Baxter Diagnostics Inc | Epitope mapping ot the c33c region of hcv |
| WO1993010239A2 (en) | 1991-11-21 | 1993-05-27 | Common Services Agency | Hepatitis-c virus testing |
| GB9204274D0 (en) * | 1992-02-28 | 1992-04-08 | Wellcome Found | Novel peptides |
| US5866139A (en) * | 1992-06-04 | 1999-02-02 | Institut Pasteur | Nucleotide and peptide sequences of a hepatitis C virus isolate, diagnostic and therapeutic applications |
| US6057093A (en) * | 1992-09-28 | 2000-05-02 | Chiron Corporation | Methods and compositions for controlling translation of HCV proteins |
| JPH06153961A (ja) * | 1992-11-27 | 1994-06-03 | Imuno Japan:Kk | Ｃ型肝炎ウイルス部分遺伝子、ならびにｃ型肝炎ウイルス遺 伝子の高感度検出法 |
| EP1421951A3 (en) | 1993-05-12 | 2005-10-05 | Chiron Corporation | Conserved motif of hepatitis C virus E2/NS1 region |
| CA2195312A1 (en) | 1994-07-29 | 1996-02-15 | Mark Selby | Novel hepatitis c e1 and e2 truncated polypeptides and methods of obtaining the same |
| AU3241095A (en) * | 1994-07-29 | 1996-03-04 | Chiron Corporation | Novel hepatitis c e1 and e2 truncated polypeptides and methods of obtaining the same |
| US5837442A (en) | 1995-11-29 | 1998-11-17 | Roche Molecular Systems, Inc. | Oligonucleotide primers for amplifying HCV nucleic acid |
| AU7471698A (en) | 1997-05-06 | 1998-11-27 | Chiron Corporation | Intracellular production of hepatitis c e1 and e2 truncated polypeptides |
| DE19832050C2 (de) * | 1998-07-16 | 2002-10-10 | Biotest Pharma Gmbh | Verfahren zum Nachweis von Hepatitis B- bzw. Hepatitis C-Virusgenomen in Plasmaproben und spezifische Primer |
| EP1154793B1 (en) | 1999-02-26 | 2010-09-15 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Use of bioadhesives and adjuvants for the mucosal delivery of antigens |
| JP2002537102A (ja) | 1999-02-26 | 2002-11-05 | カイロン コーポレイション | 吸着された高分子および微粒子を有するミクロエマルジョン |
| US7196066B1 (en) | 1999-11-03 | 2007-03-27 | Powderject Vaccines, Inc. | DNA-vaccines based on constructs derived from the genomes of human and animal pathogens |
| ES2277932T5 (es) * | 2000-06-15 | 2010-06-28 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Ensayo de combinacion de antigeno/anticuerpo del vhc. |
| US6858590B2 (en) | 2000-08-17 | 2005-02-22 | Tripep Ab | Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof |
| US6960569B2 (en) | 2000-08-17 | 2005-11-01 | Tripep Ab | Hepatitis C virus non-structural NS3/4A fusion gene |
| US6680059B2 (en) | 2000-08-29 | 2004-01-20 | Tripep Ab | Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof |
| US7022830B2 (en) | 2000-08-17 | 2006-04-04 | Tripep Ab | Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene |
| US6586584B2 (en) | 2001-01-29 | 2003-07-01 | Becton, Dickinson And Company | Sequences and methods for detection of Hepatitis C virus |
| JP4608210B2 (ja) | 2001-05-31 | 2011-01-12 | ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド | キメラアルファウイルスレプリコン粒子 |
| AR045702A1 (es) | 2001-10-03 | 2005-11-09 | Chiron Corp | Composiciones de adyuvantes. |
| CA2476626A1 (en) | 2002-02-20 | 2003-08-28 | Chiron Corporation | Microparticles with adsorbed polypeptide-containing molecules |
| US7598421B2 (en) | 2002-05-08 | 2009-10-06 | Ucl Biomedica Plc | Materials for the delivery of biologically-active material to cells |
| CA2511512C (en) | 2002-12-27 | 2013-10-29 | Chiron Corporation | Immunogenic compositions containing phospholipid |
| KR101173871B1 (ko) | 2003-02-06 | 2012-08-16 | 앤저 테라퓨틱스 인코퍼레이티드 | 변형된 독립생존 미생물, 백신 조성물 및 그것의 사용방법 |
| US7695725B2 (en) | 2003-02-06 | 2010-04-13 | Aduro Biotech | Modified free-living microbes, vaccine compositions and methods of use thereof |
| CA2515369C (en) | 2003-02-06 | 2015-03-31 | Cerus Corporation | Listeria attenuated for entry into non-phagocytic cells, vaccines comprising the listeria, and methods of use thereof |
| US7731967B2 (en) | 2003-04-30 | 2010-06-08 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Compositions for inducing immune responses |
| US7842289B2 (en) | 2003-12-24 | 2010-11-30 | Aduro Biotech | Recombinant nucleic acid molecules, expression cassettes, and bacteria, and methods of use thereof |
| EP1784211A4 (en) | 2004-07-29 | 2010-06-30 | Novartis Vaccines & Diagnostic | IMMUNOGENIC COMPOSITIONS FOR GRAMPOSITIVE BACTERIA SUCH AS STREPTOCOCCUS AGALACTIAE |
| JP5070055B2 (ja) | 2004-08-27 | 2012-11-07 | ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド | 改変タンパク分解性切断部位を有するｈｃｖ多エピトープ融合抗原およびその使用 |
| CA2618429A1 (en) | 2005-05-25 | 2007-03-22 | Tripep Ab | A hepatitis c virus non-structural ns3/4a fusion gene |
| WO2008046923A2 (en) * | 2006-10-20 | 2008-04-24 | Innogenetics N.V. | Methodology for analysis of sequence variations within the hcv ns3/4a genomic region |
| US20090214593A1 (en) | 2007-08-16 | 2009-08-27 | Tripep Ab | Immunogen platform |
| EP2185195A2 (en) | 2007-08-16 | 2010-05-19 | Tripep Ab | Immunogen platform |
| ES2664753T3 (es) | 2007-12-07 | 2018-04-23 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Composiciones de inducción de respuestas inmunes |
| AU2009249273A1 (en) | 2008-05-19 | 2009-11-26 | Aduro Biotech | Compositions comprising PrfA*mutant listeria and methods of use thereof |
| EP2405943A2 (en) | 2009-03-09 | 2012-01-18 | William Henry | Hapten-carrier conjugates with bacterial toxins having a signal peptide as carrier and their use in immunogenic compositions |
| FI122954B (fi) | 2011-01-31 | 2012-09-14 | Teknoware Oy | LED-putkilamppu ja valaisinjärjestely |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| WO1989004669A1 (en) * | 1987-11-18 | 1989-06-01 | Chiron Corporation | Nanbv diagnostics and vaccines |
| US5191064A (en) * | 1988-09-30 | 1993-03-02 | The Research Foundation For Microbial Diseases (Osaka University) | Non-a, non-b hepatitis virus antigen peptide |
| UA50829C2 (uk) * | 1989-03-17 | 2002-11-15 | Чірон Корпорейшн | Очищений поліпептид, що містить антиген вірусу гепатиту с, полінуклеотид, вектор, клітини, система експресії, моноклональне антитіло, препарат поліклональних антитіл, нуклеотидна проба, аналітичні набори, спосіб виявлення нуклеїнових кислот, способи імуноаналізу, вакцина, спосіб одержання антитіл |
| AU638304B2 (en) * | 1989-12-22 | 1993-06-24 | Abbott Laboratories | Hepatitis c assay |
| JPH05508762A (ja) * | 1990-04-03 | 1993-12-09 | サウスウエスト・ファウンデイション・フォー・バイオメディカル・リサーチ | 精製されたｈｃｖならびにｈｃｖタンパク質およびペプチド |
-
1990
- 1990-05-18 AU AU58123/90A patent/AU638719B2/en not_active Expired
- 1990-05-18 HU HU904754A patent/HUT59964A/hu unknown
- 1990-05-18 DK DK90305421T patent/DK0398748T3/da active
- 1990-05-18 MC MC@@@@@@@@@@@@D patent/MC2188A1/xx unknown
- 1990-05-18 WO PCT/US1990/002853 patent/WO1990014436A1/en active IP Right Grant
- 1990-05-18 GE GE1876A patent/GEP20002164B/en unknown
- 1990-05-18 AT AT90305421T patent/ATE211772T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-05-18 CA CA002017157A patent/CA2017157C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-05-18 DE DE69033891T patent/DE69033891T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-05-18 RO RO149205A patent/RO113059B1/ro unknown
- 1990-05-18 JP JP2508534A patent/JP2656996B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-05-18 ES ES90305421T patent/ES2166749T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-05-18 EP EP90305421A patent/EP0398748B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-11-18 FI FI915443A patent/FI105279B/fi active
- 1991-11-18 NO NO914517A patent/NO303503B1/no not_active IP Right Cessation
- 1991-11-18 BG BG095495A patent/BG60348B2/bg unknown
-
1993
- 1993-06-01 LV LVP-93-456A patent/LV10729B/en unknown
-
1996
- 1996-10-30 JP JP30570796A patent/JP3701754B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-05-19 JP JP14598597A patent/JP3698520B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| LV10729A (lv) | 1995-06-20 |
| NO914517L (no) | 1992-01-16 |
| NO303503B1 (no) | 1998-07-20 |
| DK0398748T3 (da) | 2002-03-18 |
| JP3698520B2 (ja) | 2005-09-21 |
| ES2166749T3 (es) | 2002-05-01 |
| RO113059B1 (ro) | 1998-03-30 |
| MC2188A1 (fr) | 1992-09-16 |
| GEP20002164B (en) | 2000-07-10 |
| AU638719B2 (en) | 1993-07-08 |
| FI915443A0 (fi) | 1991-11-18 |
| EP0398748B1 (en) | 2002-01-09 |
| JP2656996B2 (ja) | 1997-09-24 |
| DE69033891T2 (de) | 2002-08-29 |
| EP0398748A3 (en) | 1991-10-23 |
| CA2017157C (en) | 2003-07-29 |
| JPH10113176A (ja) | 1998-05-06 |
| AU5812390A (en) | 1990-12-18 |
| DE69033891D1 (de) | 2002-02-21 |
| EP0398748A2 (en) | 1990-11-22 |
| NO914517D0 (no) | 1991-11-18 |
| WO1990014436A1 (en) | 1990-11-29 |
| CA2017157A1 (en) | 1990-11-18 |
| LV10729B (en) | 1995-12-20 |
| JPH1089A (ja) | 1998-01-06 |
| JPH05500155A (ja) | 1993-01-21 |
| ATE211772T1 (de) | 2002-01-15 |
| JP3701754B2 (ja) | 2005-10-05 |
| FI105279B (fi) | 2000-07-14 |
| HUT59964A (en) | 1992-07-28 |
| HU904754D0 (en) | 1992-01-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BG60348B2 (bg) | Nаnв диагностика: полинуклеотиди, приложими за скрининг на вируса на хепатит с | |
| US5714596A (en) | NANBV diagnostics: polynucleotides useful for screening for hepatitis C virus | |
| US5863719A (en) | Methods for detecting hepatitis C virus using polynucleotides specific for same | |
| JP2714255B2 (ja) | Ｎａｎｂｖ診断法：ｃ型肝炎ウイルスのスクリーニングに有用なポリヌクレオチド | |
| AU2008249300B2 (en) | Methods and compositions for identifying and characterizing hepatitis C | |
| JPH10309197A (ja) | Ｎａｎｂｖの診断用薬およびワクチン | |
| RU2145635C1 (ru) | Олигомер (варианты), способ обнаружения последовательности hcv (варианты), набор для обнаружения, способ получения крови | |
| JP2000508907A (ja) | Ｈｃｖを遺伝子型分類するためのヘテロ二本鎖トラッキングアッセイ（ｈｔａ） | |
| Petrik et al. | High throughput PCR detection of HCV based on semiautomated multisample RNA capture | |
| PT94081B (pt) | Diagnosticos para o nambv: polinucleotidos uteis na deteccao do virus da hepatite c | |
| KR20070037228A (ko) | Ｈｃｖ 특이 유전자 검출키트 | |
| KR20070037231A (ko) | Ｈｃｖ 특이 유전자 정량키트 |