JPH10113176A - Ｎａｎｂｖの診断法：ｃ型肝炎ウイルスのスクリーニングに有用なポリヌクレオチド - Google Patents

Ｎａｎｂｖの診断法：ｃ型肝炎ウイルスのスクリーニングに有用なポリヌクレオチド

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 Ｃ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチドを検出
または増幅するために有用なポリヌクレオチドを提供す
る。 【解決手段】 Ｃ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチドを
検出するためのポリヌクレオチドプローブ、およびこの
ポリヌクレオチドを増幅させるためのPCRプライマー。
このプローブおよびPCRプライマーは、少なくとも１５
個のヌクレオチドの連続する配列を含み、この少なくと
も１５個のヌクレオチドの連続する配列は、Ｃ型肝炎ウ
イルスのポリヌクレオチド配列と選択的にハイブリダイ
ズし得、そして、本願明細書において開示されたＣ型肝
炎ウイルスのポリヌクレオチド配列のいずれか一方の鎖
から得られる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は非Ａ非Ｂ型肝炎ウイ
ルス(NANBV)感染の蔓延を管理するための材料および方
法に関する。より詳細には、生物学的試料中のＣ型肝炎
ウイルス(HCV)の検出のためのアッセイに有用な、非Ａ
非Ｂ型肝炎(NANBH)の病原体であるHCV、およびそのポリ
ヌクレオチドおよび誘導体に関する。
【０００２】本出願に引用される参考文献 Barrら、 (1986), Biotechniques 4: 428 Beaucageら、 (1981), Tetrahedron Letters 22: 1859 Botstein (1979), Gene 8: 17 Brinton, M.A. (1986) in THE VIRUSES: THE TOGAVIRID
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【０００３】引用される特許 米国特許第4,341,761号 米国特許第4,399,121号 米国特許第4,427,783号 米国特許第4,444,887号 米国特許第4,466,917号 米国特許第4,472,500号 米国特許第4,491,632号 米国特許第4,493,890号 米国特許第4,683,202号 米国特許第4,458,066号 米国特許第4,868,105号
【０００４】
【従来技術】非Ａ非Ｂ型肝炎(NANBH)は、ウイルスによ
り引き起こされると考えられる伝染性あるいは家族性疾
病であり、既知の肝炎ウイルス、例えばＡ型肝炎ウイル
ス(HAV)、Ｂ型肝炎ウイルス(HBV)、デルタ肝炎ウイルス
(HDV)およびサイトメガロウイルス(CMV)、エプスタイン
・バーウイルス(EBV)により引き起こされる肝炎を含
む、他のウイルス性肝炎と区別がつかない。NANBHは最
初、輸血を受けた個体に同定された。ヒトからチンパン
ジーへの伝染、およびチンパンジーでの連続継代は、NA
NBHが伝染性の病原体あるいは複数の病原体によること
の証拠を提供した。
【０００５】疫学的証拠は、NANBHには次の３つのタイ
プがあることを提示する。すなわち、水伝播性流行型；
血液あるいは針に関連する型；および散発的に起こる
(集団性)型である。しかし、NANBHの原因となり得る病
因の数は不明である。
【０００６】これまでに多数のNANBVの候補が挙げられ
ている。例えば、Prince(1983)、FeinstoneおよびHoofn
gle(1984)、およびOverby(1985，1986，1987)による総
説およびIwarson(1987)による文献を参照のこと。しか
し、これらのどの候補も、NANBHの病原体であることを
示す証拠はない。
【０００７】NANBVのキャリヤーおよびNANBVに汚染され
た血液あるいは血液製剤をスクリーニング、および同定
するための、感度が高く特異的な方法の必要性は重大で
ある。輸血後肝炎(PTH)は輸血された患者の約10％に起
こり、NANBHはこれらの90％を占める。この疾病の主要
な問題は、慢性的な肝臓の損傷(25〜55％)にしばしば進
行することである。
【０００８】患者の処置、および血液および血液製剤に
よるNANBHの伝染、あるいは密接な個体間の接触によるN
ANBHの伝染は信頼性のある、スクリーニング、診断およ
び予後診断のための、NANBVに関連する核酸、抗原およ
び抗体の検出の道具を必要とする。
【０００９】ハイブリダイゼーションアッセイにより特
異的ポリヌクレオチドを検出する方法は当該分野で知ら
れている。例えば、MatthewsおよびKricka(1988), Anal
ytical Biochemistry 169:1；Landegreら(1988), Scien
ce 242:229；およびMittlin(1989), Clinical Chem. 3
5:1819、1989年９月発行の米国特許第4,868,105号およ
び欧州特許公開第225807号(1987年６月16日公開)を参照
のこと。
【００１０】出願人は新たなウイルス、Ｃ型肝炎ウイル
スを発見し、これが血液伝播性NANBH(BB-NANBH)の主要
な病原体であることを証明した。プロトタイプHCV株CDC
/HCV1(HCV1とも呼ばれる)のゲノムの部分配列を含む、
出願人の最初の仕事は欧州特許公開第318216号(1989年
５月31日公開)およびPCT公開第WO89/04669号(1989年６
月１日公開)に記載されている。これらの特許出願の開
示およびすべてのこれらに対応する国内出願を本願明細
書に参考として援用する。これらの出願は、とりわけ、
HCV配列をクローニングする組換えDNA法、HCVプローブ
による診断法、および新しいHCV配列の単離法を教示す
る。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】NANBHのスクリーニン
グ、診断および予後診断のための、NANBVに関連する核
酸、抗原および抗体の検出の道具を提供する。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明は、欧州特許公開
第318216号およびPCT公開第WO89/04669号に記載のHCV配
列および本文に記載の他のHCV配列に基づく。ハイブリ
ダイゼーションによる特異的ポリヌクレオチドの単離法
および/または検出法は、出願人によってHCVが発見され
るまで、HCVのスクリーニングに用いることはできなか
った。従って、本発明の１つの観点は、分析物であるヌ
クレオチド鎖中のHCV配列にハイブリダイズすることが
できるオリゴマーであり、ここで、オリゴマーは図２３
〜４７に示すHCV cDNAの少なくとも４個の連続するヌク
レオチドに相補する、HCVを標的とする配列を包含す
る。
【００１３】本発明の他の観点は、HCVポリヌクレオチ
ドを含むと考えられる分析物である鎖中のHCV配列を検
出する過程であり、ここでHCVポリヌクレオチドは選択
された標的部分を包含し、上記過程は以下の過程を包含
する。 (ａ)分析物ポリヌクレオチド鎖中のHCV配列にハイブリ
ダイズ可能なオリゴマーを提供する過程であり、ここ
で、オリゴマーは図２３〜４７に示すHCV cDNAの少なく
とも４個の連続するヌクレオチドに相補する、HCVを標
的とする配列を包含する過程、 (ｂ)標的する配列と標的される配列との間の特異的ハイ
ブリッド二重鎖を形成させる、分析鎖を(ａ)のオリゴマ
ーとともにインキュベートする過程、および (ｃ)標的部分および前記オリゴマーとの間に形成された
ハイブリッドを、もし存在するならば、これを検出する
過程。
【００１４】さらに本発明の他の観点はHCVに汚染され
ていない血液を調製する方法であり： (ａ)HCV標的配列を含むと疑われる血液試料からの、分
析する核酸を提供する方法； (ｂ)分析ポリヌクレオチド鎖中のHCV配列に、もし存在
するならば、ハイブリダイズ可能なオリゴマーを提供す
る方法であり、ここで、オリゴマーは、HCV RNAに保持
されるHCVヌクレオチド中に存在する、少なくとも８個
のヌクレオチド配列に相補するHCVを標的する配列に含
まれる、方法； (ｃ)標的する配列と、もし存在するならば、標的される
配列との間のポリヌクレオチド二重鎖を形成させる条件
下で(ａ)を(ｂ)に反応させる方法； (ｄ)もし存在するならば、(ｃ)で形成された二重鎖を検
出する方法；および (ｅ)(ｄ)で二重鎖が検出されなかった血液を貯蔵する方
法； を包含する。
【００１５】
【発明の実施の形態】用語「Ｃ型肝炎ウイルス」(HCV)
は、非Ａ非Ｂ型肝炎(NANBH)の従来未知であった病原性
物質に対して、当業者が保留していたものである。HCV
のプロトタイプ単離株は、米国特許出願第122,714号に
同定されている(欧州特許公開第318,216号も参照のこ
と)。用語HCVは、それと同じウイルス種の新しい単離株
もまた包含する。この用語の延長として、HCVによって
引き起こされ、以前には血液伝播性NANB肝炎(BB-NANBH)
と呼ばれていた疾病は、現在Ｃ型肝炎と呼ばれている。
用語NANBHおよびＣ型肝炎は、本明細書では互換可能に
用いられ得る。
【００１６】HCVは、その病原性株がBB-NANBHを引き起
こす、ウイルス種である。それから誘導された弱毒化株
あるいは欠損干渉粒子でもあり得る。以下に示すよう
に、HCVゲノムはRNAから構成される。RNAを含むウイル
スは、比較的高い割合で突然変異を有することが知られ
ている。すなわち、取り込まれるヌクレオチド当り、10
-3から10-4オーダーと報告されている(Fields & Knipe
(1986))。従って、RNAウイルス中では遺伝子型の異質性
や流動性が受け継がれるため、HCVの種の中には毒性あ
るいは無毒性などの多数の株/単離株がある。本明細書
に記載の組成物および方法によって、種々のHCV株ある
いは単離株の、増殖、同定、検出、および単離が可能と
なる。
【００１７】HCVの幾種類かの異なる株/単離株が同定さ
れている(以下参照)。プロトタイプであるこのような株
あるいは単離株の１つは、CDC/HCV1と呼ばれている(HCV
1とも呼ばれている)。ゲノムの部分配列のような、１つ
の株あるいは単離株から得られる情報は、当業者が標準
法を用いて新しい株/単離株を単離し、そしてそのよう
な新しい株/単離株がHCVであるかどうかを同定するのに
十分に役立つ。例えば、いくつかの異なった株/単離株
が以下に示してある。数多くのヒト血清(そして異なる
地理的地域)から得られたこれらの株は、HCV1のゲノム
の配列から得られた情報を利用して単離された。
【００１８】欧州特許公開第318,216号および以下に記
載の技術を用いて、HCV1ゲノムのRNAのゲノムの構造お
よびヌクレオチド配列が予想された。このゲノムは、1
0,000ヌクレオチドを含む一本鎖のRNAであることが判っ
ている。このゲノムは、正鎖であり、そして約3,000ア
ミノ酸のポリタンパク質をコードする、連続する翻訳オ
ープンリーディングフレーム(ORF)を有している。ORF中
では、大部分のポリペプチドタンパク質が非構造タンパ
ク質を担っており、構造タンパク質(単数あるいは複数)
は、Ｎ末端領域の最初の約1/4にコードされているよう
に見える。全ての既知のウイルスの配列と比較した場
合、フラビウイルスのファミリーの非構造タンパク質、
そしてペスチウイルス(これはいまではフラビウイルス
のファミリーであると考えられている)と、小さいが十
分なコリニアーの相同性が観察される。
【００１９】フラビウイルスのポリペプチドタンパク質
(例として黄熱ウイルス)の可能な領域の概略図およびHC
Vゲノムの主要なORFにコードされる、推定のポリペプチ
ドタンパク質を図５１に示す。この図では、HCVポリタ
ンパク質の考えられるドメインを示してある。フラビウ
イルスポリタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端方向へ、ヌ
クレオキャプシドタンパク質(Ｃ)、マトリックスタンパ
ク質(Ｍ)、エンベロープタンパク質(Ｅ)、および非構造
タンパク質(NS)１、２(a+b)、３、４(a+b)、および５を
含む。HCV1のヌクレオチド配列中にコードされる推定の
アミノ酸に基づいて、HCVポリタンパク質のＮ末端にあ
る小さなドメインは、フラビウイルスポリタンパク質の
Ｎ末端に見出されるヌクレオキャプシドタンパク質(Ｃ)
と、大きさおよび塩基性残基の高い含有率が類似してい
るように見える。HCVおよび黄熱ウイルス(YFV)の非構造
タンパク質２、３、４、および５(NS2〜NS5)は、アミノ
酸配列は異なっているが、類似の大きさおよび親水性の
相手を有しているようである。しかし、Ｍ、Ｅ、および
NS1タンパク質を含むYFVポリタンパク質の領域に対応す
るHCVの領域は、配列が異なるだけでなく、大きさおよ
び親水性の両方もまた全く異なっている。従って、HCV
ゲノムの特定のドメインが本明細書では、例えばNS1あ
るいはNS2のように呼ばれ得るが、この命名は推定であ
ることに留意するべきである。HCVファミリーとフラビ
ウイルスとの間には、これから認識されるべき多くの違
いが存在し得る。
【００２０】HCVの異なる株、単離株、あるいはサブタ
イプは、HCV1と比較して、アミノ酸および核酸に改変が
含まれると予想される。多くの単離株は、HCV1と比較し
た場合、全アミノ酸配列において相当(すなわち約40％
より多い)相同性を示すと予想される。しかしながら、
他のあまり相同性のないHCV単離株も見出され得る。こ
れらは、例えば、HCV1と類似の大きさのポリタンパク質
をコードする約9,000個から約12,000個のヌクレオチド
のORF、HCV1と類似の疎水性および/または免疫原性の性
質を有するコードされたポリタンパク質、およびHCV1に
保存されているコリニアーペプチド配列の存在などの種
々の基準によって、HCVであると定義される。さらに、
ゲノムは正鎖RNAであると思われる。
【００２１】全てのHCV単離株は、本明細書に記載のHCV
cDNAにコードされるエピトープと免疫学的に同一(すな
わち免疫学的に交差反応し得る)と見なし得る、少なく
とも１つのエピトープをコードする。好ましくは、この
エピトープは、本明細書に記載のアミノ酸配列中に含ま
れ、そして既に知られている病原体と比べた場合、HCV
に特異である。エピトープの特異性は、抗HCV抗体と免
疫反応性があって、そして既知の病原体に対する抗体と
の免疫反応性がないことで決定される。
【００２２】HCV株および単離株は、進化論的に関連し
ている。従って、ヌクレオチドレベルでのゲノムの全体
的な相同性は、約40％以上であり得、おそらく50％以上
であり、おそらくは60％以上であり、そしてより一般的
には80％である。そして更に、少なくとも約13ヌクレオ
チドの連続する配列に対応する。以下に示すように、HC
Vゲノム中には、可変領域および超過変領域が存在する
ことに留意すべきである。従って、これらの領域の相同
性は、全体的なゲノムのそれより十分に低いことが予想
される。HCV株のゲノムの推定の配列と、例えばCDC/HCV
1 cDNAとの間の対応は、当業者の技術によって決定され
得る。例えば、推定のHCVからのポリヌクレオチドの配
列と本明細書に記載のHCV cDNA配列の情報とを直接比較
することによって、決定され得る。あるいは、相同な領
域で安定した二本鎖を形成する条件下(例えば、Ｓ1消化
に先立って用いられる)で、ポリヌクレオチドとハイブ
リダイズさせ、一本鎖に特異的なヌクレアーゼで消化
し、そして消化された断片の大きさを決めることによっ
ても決定され得る。
【００２３】HCVの株あるいは単離株の進化学的な関連
により、推定のHCV株あるいは単離株は、ポリペプチド
レベルでの相同性によって同定し得る。一般的に、HCV
株あるいは単離株は、ポリペプチドレベルで、少なくと
も40％相同であると予想されており、約50％より高く、
おそらくは70％より高く、そしてより一般的には80％相
同であり、およびある場合には90％より高く相同であ
る。アミノ酸配列の相同性を決定する技術は当該分野で
公知である。例えば、アミノ酸配列は、直接決定し得、
そして本明細書に提供されている配列と比較し得る。あ
るいは推定のHCVのゲノムのヌクレオチド配列が決定さ
れ得(普通はcDNAを介して)、そこにコードされる推定ア
ミノ酸が決定され得、そして対応する領域が比較され
る。
【００２４】本明細書で、ある配列から「誘導された」
ポリヌクレオチドとは、ある配列のヌクレオチド配列中
の１つの領域と少なくとも約６個のヌクレオチド、好ま
しくは少なくとも約８個のヌクレオチド、より好ましく
は少なくとも約10から12個のヌクレオチド、そしてさら
により好ましくは少なくとも約15から20個のヌクレオチ
ドが対応しているポリヌクレオチド配列を言う。「対応
している」とは、ある配列と相同であるかあるいは相補
的であることを意味する。好ましくは、ポリヌクレオチ
ドが誘導された元の領域の配列は、HCVゲノムに特異的
な配列と相同であるかあるいは相補的である。より好ま
しくは、誘導された配列は、HCV単離株のすべてあるい
は大部分に特異的である配列に相同であるか相補的であ
る。配列がHCVゲノムに特異的であるか否かは、当業者
に公知の方法で決定され得る。例えば配列は、感染して
ない宿主あるいは他の生物に存在しているかどうかを決
定するために、例えばジーンバンク(Genebank)のような
データバンク中の配列と比較し得る。配列はまた、例え
ばHAV、HBV、およびHDVの様に肝炎を引き起こすウイル
ス物質、およびフラビウイルスのメンバーの様なウイル
ス物質の配列とも比較し得る。誘導された配列の他の配
列に対する対応あるいは非対応は、適当にストリンジェ
ントな条件下でのハイブリダイゼーションによって決定
され得る。核酸配列の相補性を決定するためのハイブリ
ダイゼーション技術は当該分野で公知であり、以下に述
べられている。例えば、Maniatis(1982)らの文献を参照
のこと。更に、ハイブリダイゼーションによって形成さ
れる二本鎖ポリヌクレオチドのミスマッチは、公知の方
法で決定され得る。例えば、二本鎖ポリヌクレオチド中
の一本鎖領域を特異的に消化するS1の様なヌクレアーゼ
による消化が含まれる。典型的なDNA配列がそこから
「誘導」され得る領域には、例えば、特異的なエピトー
プをコードする領域および非転写および/または非翻訳
領域が含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】誘導されたポリヌクレオチドは、示された
ヌクレオチド配列から必ずしも自然に誘導されたもので
なくてもよく、例えば、化学合成あるいはDNA複製ある
いは逆転写あるいは転写を含むあらゆる方法から作成さ
れ得る。更に、明示された配列に対応する領域の組み合
せを意図する用途に合うように、当該分野に公知の方法
で改変し得る。
【００２６】本明細書の用語「組換えポリヌクレオチ
ド」は、ゲノム、cDNA、半合成、あるいは合成に起源を
持つポリヌクレオチドを指す。このヌクレオチドは、そ
の起源あるいは操作によって、(１)天然では結び付いて
いるポリヌクレオチドのすべてあるいは一部と結び付い
ていない、(２)天然に連結しているものとは別のポリヌ
クレオチドと連結しており、あるいは(３)天然には存在
しない。
【００２７】本明細書の用語「ポリヌクレオチド」は、
任意の長さのポリマー型のヌクレオチドで、リボヌクレ
オチドとデオキシリボヌクレオチドの両方を指す。この
用語は、分子の一次構造のみを指していう。従って、こ
の用語は、二本鎖あるいは一本鎖のDNAおよびRNAを包含
する。この用語はまた、例えば、当該分野に既知のラベ
ル、メチル化、「キャップス」、天然のヌクレオチドの
１あるいはそれ以上のヌクレオチドのアナログによる置
換、などの既知のタイプの改変、例えば、非荷電の連結
(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、
ホスホアミデート、カルバミン酸塩など)および荷電の
連結(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエ
ートなど)の様なヌクレオチド間での改変、例えば、タ
ンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナル
ペプチド、ポリＬリシンなど)の様な修飾部分を含むも
の、インターカレター(例えば、アクリジン、ソラレン
など)と共にあるもの、キレート剤(例えば、金属、放射
性金属、ホウ素、酸化力のある金属など)を含むもの、
アルキル化剤を含むもの、修飾された連結(例えばαア
ノマー核酸など)、および非修飾型のポリヌクレオチド
などが含まれる。
【００２８】本明細書の用語、核酸の「センス鎖」は、
mRNAと配列上の相同性を有する配列を含む。「アンチセ
ンス鎖」は、「センス鎖」と相補的な配列を含む。
【００２９】本明細書の用語、ウイルスの「正鎖ゲノ
ム」は、RNAであってもDNAであっても、一本鎖で、ウイ
ルスのポリペプチド(単数あるいは複数)をコードするゲ
ノムを指す。正鎖RNAウイルスの例には、トガウイルス
科、コロナウイルス科、レトロウイルス科、ピコルナウ
イルス科、およびカリチウイルス科が含まれる。あるい
は以前はトガウイルス科にクラス分けされていたフラビ
ウイルス科もまた含まれる。Fields & Knipe(1986)を参
照のこと。
【００３０】本明細書の用語「プライマー」は、適当な
条件下におかれたとき、ポリヌクレオチド鎖の合成開始
点として機能し得るオリゴマーのことを指す。プライマ
ーは、完全に、あるいは実質的に、コピーされるポリヌ
クレオチドの領域と相補的である。従って、ハイブリダ
イゼーションを行い得る条件下で、プライマーは、分析
物鎖の相補的な領域にアニールする。適当な反応剤(例
えばポリメラーゼ、ヌクレオチドトリホスフェート、な
ど)の添加によって、プライマーは、重合剤によって伸
長し、分析物鎖のコピーを形成する。プライマーは、一
本鎖、あるいは代わりに一部あるいは全部が二本鎖であ
り得る。
【００３１】用語「ポリヌクレオチド分析物」および
「分析物鎖」とは、標的の配列を含んでいると思われる
一本鎖あるいは二本鎖の核酸分子をいい、そして生物学
的試料の中に存在し得る。
【００３２】本明細書の用語「オリゴマー」とは、プラ
イマーおよびプローブをさす。用語オリゴマーは、分子
の大きさを意味しない。しかし、典型的にはオリゴマー
は、長さが1000ヌクレオチドより大きくなく、より典型
的には、500ヌクレオチドより大きくなく、さらにより
典型的には、250ヌクレオチドより大きくない。それは1
00ヌクレオチドより大きくなくそして75ヌクレオチドよ
り大きくなく、そして50ヌクレオチドより大きくない。
【００３３】本明細書の用語「プローブ」とは、プロー
ブ中の少なくとも１つの標的の領域の配列との相補性に
よって、標的の配列とハイブリッド構造を形成するポリ
ヌクレオチドを含む構造を言う。プローブのポリヌクレ
オチドの領域は、DNA、および/またはRNA、および/また
は合成ヌクレオチドアナログを含み得る。プローブに
は、「カプチャープローブ」および「ラベルプローブ」
が含まれる。好ましくは、プローブには、ポリメラーゼ
連鎖反応(PCR)のプライムに使用された配列と相補的な
配列は含まない。
【００３４】本明細書の用語「標的領域」は、増幅およ
び/または検知される核酸の領域をいう。用語「標的の
配列」は、所望の条件下でプローブまたはプライマーが
安定なハイブリッドを形成する配列をいう。
【００３５】本明細書の用語「カプチャープローブ」
は、結合パートナーと結合する一本鎖ポリヌクレオチド
を含むポリヌクレオチドをいう。一本鎖ポリヌクレオチ
ドは標的のポリヌクレオチド配列からなり、それは分析
物であるポリヌクレオチド中で見出される標的領域中の
標的配列に相補的である。この相補的な領域は、分析物
であるポリヌクレオチドを固体表面に固定するのに充分
安定な二本鎖を与えるのに、充分に長く、標的配列に相
補的である(結合パートナを介して)。
【００３６】結合パートナーは、第２の結合パートナー
に特有であり、その第２の結合パートナーは固体支持体
の表面に結合し得るか、もしくは他の構造体または結合
パートナーを介して固体支持体に直接に結合し得る。
【００３７】本明細書で使用される、用語「標的づける
ポリヌクレオチド配列」は、標的ポリヌクレオチド配列
に相補的であるヌクレオチドからなるポリヌクレオチド
配列をいう。その配列は充分に長く、かつ標的配列に相
補的であって所望とする充分な安定性を有する二本鎖を
形成する。
【００３８】本明細書で用いられる用語「結合パートナ
ー」は、リガンド分子に高い特異性で、例えば抗原およ
びそれに特異的な抗体として、結合可能な分子のことを
言う。一般に、特異的な結合パートナーは、単離条件下
に分析物コピー/相補鎖の二本鎖(カプチャープローブの
場合)を不動化するのに充分なアフィニティーで結合し
なければならない。特異的結合パートナーは当該分野に
公知であり、例えばビオチンおよびアビジンまたはスト
レプトアビジン、IgGおよびプロテインＡ、多くの既知
のレセプター−リガンドの組合せ、および相補的なポリ
ヌクレオチド鎖が含まれる。相補的なポリヌクレオチド
結合パートナーの場合、パートナーは通常少なくとも約
15塩基対の長さであり、少なくとも40塩基対の長さであ
り得る；それに加えて、ＧおよびＣの含有量が少なくと
も約40％であり、約60％程度である。ポリヌクレオチド
は、DNA、RNAまたは合成ヌクレオチドアナログを含み得
る。
【００３９】本明細書で用いられる用語「結合」は、共
有結合または強い非共有性相互作用による結合について
言う(例えば、疎水性相互作用、水素結合等)。共有結合
は、例えば、エステル、エーテル、リン酸エステル、ア
ミド、ペプチド、イミド、炭素−硫黄の結合等であり得
る。
【００４０】本明細書で用いられる用語「支持体」は、
所望の結合パートナーがアンカーし得るあらゆる固体ま
たは半固体の表面について言う。適当な支持体には、ガ
ラス、プラスチック、金属、ポリマーゲル等が含まれ、
ビーズ、ウェル、ディップスティック、膜等の形態をと
り得る。
【００４１】本明細書で用いられる用語「ラベル」は、
検出可能な(好ましくは定量可能な)信号を与えるために
用いられ得、そして、ポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドに結合可能な、あらゆる原子または部分のことを言
う。
【００４２】本明細書で用いられる用語「ラベルプロー
ブ」は、分析物ポリヌクレオチド中の検出すべき標的配
列に対して相補的な、標的付けポリヌクレオチド配列を
含むオリゴマーについて言う。この相補領域は、ラベル
により検出される、「ラベルプローブ」と「標的配列」
とを含む二本鎖が与えられるように、標的配列に対し充
分な長さおよび相補性を有する。オリゴマーはラベルに
直接に、または互いに高い特異性を有する一組のリガン
ド分子により間接的に、結合する。高い特異性を有する
一組のリガンド分子については、前述したが、多量体も
含む。
【００４３】本明細書で用いられる用語「多量体」は、
同一の反復一本鎖ポリヌクレオチド単位の、あるいは異
なる一本鎖ポリヌクレオチド単位の、直鎖または分枝状
ポリマーのことを言う。この単位のうちの少なくとも１
つは、第一の目的の一本鎖ヌクレオチド配列、典型的に
は分析物または分析物に結合するオリゴマー(例えばラ
ベルプローブ)に、特異的にハイブリダイズすることを
可能にする配列、長さ、および組成を有する。このよう
な特異性および安定性を達成するために、単位は通常少
なくとも約15ヌクレオチドの長さであり、典型的には約
50ヌクレオチド以下の長さであり、好ましくは約30ヌク
レオチドの長さである；さらに、ＧおよびＣの含有量
は、通常少なくとも約40％であり、せいぜい約60％であ
る。このような単位に加えて、この多量体は、第二の目
的の一本鎖ヌクレオチド、典型的にはラベルされたポリ
ヌクレオチドまたは他の多量体に、特異的に、また、安
定にハイブリダイズ可能な、多数の単位を含有する。こ
れらの単位は一般に、前述の多量体とほぼ同じサイズお
よび組成である。多量体がもう一つの多量体にハイブリ
ダイズするように設計されている場合、第一の、および
第二のオリゴヌクレオチド単位はヘテロロガスであり
(相違し)、選択されたアッセイ条件下では互いにハイブ
リダイズしない。従って、多量体は、ラベルリガンドで
あり得、あるいはプローブにラベルを結合させるリガン
ドであり得る。
【００４４】本明細書で用いられる用語「ウイルスのRN
A」にはHCV RNAが含まれるが、ウイルスゲノム由来のRN
A、その断片、その転写物、およびそれに由来する変異
体配列のことを言う。
【００４５】本明細書で用いられる用語「生物学的試
料」は、個体から単離された組織または液体試料のこと
を言い、例えば血漿、血清、骨髄液、リンパ液、皮膚の
外部断片、呼吸管、腸管および性尿器管、涙、唾液、
乳、血液細胞、腫瘍および器官を含み、インビトロ細胞
培養物成分の試料(ウイルスに感染していると見られる
細胞、組換え細胞、および細胞成分、細胞培養培地中で
細胞を生育させて得られる馴化培地が含まれるが、これ
らに限定されない)も含むが、これらに限定されない。
【００４６】発明の詳細な説明 本発明の実施には、他に指示がなければ、当該分野の技
術に含まれる化学、分子生物学、微生物学、組換えDN
A、および免疫学の通常の技術が用いられる。このよう
な技術は文献に充分に説明されている。例えば、Maniat
is、FitschおよびSambrook、MOLECULAR CLONING；A LAB
OLATORY MANUAL(1982)；DNA CLONING、第１巻および第
２巻(D.N. Glover編、1985)；OLIGONUCLEOTIDE SYNTHES
IS(M.J. Gait編、1984)；NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION
(B.D. HamesおよびS.J. Higgins編、1984)；the serie
s、METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press, Inc.)。特
に第154巻および第155巻(それぞれ、WuおよびGrossma
n、およびWu編))。前述および後述の、本明細書で述べ
られている全ての特許、特許出願、および刊行物は、本
明細書中に参考文献として援用される。
【００４７】本発明に有用な物質および方法は、BB-NAN
BVの病因因子としてのHCVの同定により、そしてHCV cDN
A配列を含有するcDNAライブラリーから単離される、ヌ
クレオチド配列ファミリーが与えられることにより、可
能となる。これらのcDNAライブラリーは、HCV感染した
チンパンジーの血漿中に存在する核酸配列に由来する。
これらのライブラリーの一つである「ｃ」ライブラリー
(ATCC第40394号)の構築は、欧州特許公開第318,216号に
記載されている。
【００４８】本明細書に記載の配列と共に上記のHCV cD
NA配列を用いることにより、生物学的試料中のウイルス
のポリヌクレオチドを検出する試薬として有用な、オリ
ゴマーが構築され得る。例えば、これらの配列から約８
から10ヌクレオチドのDNAオリゴマーを合成することが
可能である。このオリゴマーは、例えばウイルスを有す
ると思われる対象の供血、血液製剤、血清、またはウイ
ルスが複製している細胞培養系の中の、HCV RNAの存在
を検出するためのハイブリダイゼーションプローブとし
て有用である。さらに、本明細書に記載の新規なオリゴ
マーは、HCVゲノムを更に特徴付けることを可能にす
る。これらの配列に由来するポリヌクレオチドプローブ
およびプライマーは、cDNAライブラリー中に存在する配
列を増幅させるために、および/またはオーバーラップ
する他のcDNA配列のcDNA配列をスクリーニングするため
に用いられ得、これに続いて、さらにオーバーラップす
る配列を得るために使用され得る。前述、および欧州特
許公開第318,216号に示された通り、HCVゲノムは、大き
なポリタンパク質をコードする大きなオープンリーディ
ングフレーム(ORF)を主として含むRNAのようである。
【００４９】前述に加えて、後述の情報は、さらなるHC
V株および分離株の同定を可能にする。さらなるHCV株お
よび分離株の単離と特徴付けは、当業者に公知の技術を
用いて行われ得る。例えば、ウイルス粒子および/また
はウイルスRNAを含有するウイルス体構成成分から核酸
を単離し、前述のHCV cDNA配列を含むクローンライブラ
リーをスクリーニングするために前述のオリゴマーを用
いて、cDNAライブラリーを作成し、そして欧州特許公開
第318,216号および前記のcDNAと新規分離株由来のHCV c
DNAとを比較することにより、行われ得る。前述の定義
部分に記載した、HCVのパラメーター内に適合する株ま
たは分離株は、容易に同定できる。HCV株を同定する他
の方法は、本明細書中に示された情報に基づき、当業者
に自明である。
【００５０】HCV cDNA配列の単離 本発明のオリゴマーは、HCVポリヌクレオチド中の標的
となる配列と、ハイブリッド二本鎖構造を形成する領域
を含有する。オリゴマーの、HCVポリヌクレオチドがハ
イブリダイズする領域は、本明細書中に与えられ、欧州
特許公開第318,216号に記載されたHCV cDNAから確認さ
れ得る。プロトタイプHCVであるHCV1由来のHCV cDNAの
複合物を、図２３〜４７に示す。この複合配列は、λgt
11(ATCC第40394号)中に存在する「ｃ」ライブラリーに
含まれる多数のHCV cDNAライブラリーから、およびヒト
血清から単離された、多数のHCV cDNAクローンからの配
列情報に基づく。HCV cDNAクローンは、欧州特許公開第
318,216号に記載の方法により単離された。簡単に述べ
ると、単離されたほとんどのクローンは、慢性HCV感染
を伴い、ウイルスの高力価、即ち、少なくとも106チン
パンジー感染用量/ml(CID/ml)を含有するチンパンジー
からプールした血清を用いて構築されたHCV cDNA「ｃ」
ライブラリーに由来する配列を含んでいた。プールされ
た血清は、ウイルス粒子を単離するために用いられた；
これらの粒子から単離された核酸は、ウイルスゲノムに
対するcDNAライブラリーを構築するための鋳型として用
いられた。最初のクローンである5-1-1は「ｃ」ライブ
ラリーを感染個体の血清でスクリーニングすることによ
り得られた。最初のクローンの単離の後、配列の残りの
部分が、既知のHCV cDNA配列の５'領域および３'領域に
由来する合成ポリヌクレオチドプローブを用いてスクリ
ーニングすることにより得られた。
【００５１】cDNA配列を繕う方法の記載は、殆ど歴史的
な興味がある。得られた配列(およびその相補鎖)は本明
細書に提供されており、この配列またはその任意の部分
が、欧州特許公開第318,216号に記載の方法と同様の方
法を用いて部分配列を繕うことにより、合成法、あるい
は合成法の組合せにより製造され得る。
【００５２】オリゴマープローブおよびプライマー HCVゲノム(図２３〜４７に示す)および/または好ましく
はHCVゲノムの保存領域を用いて、HCV RNAの正鎖、およ
びHCV cDNAにハイブリダイズする約８ヌクレオチドまた
はそれ以上のオリゴマーが調製され得る。これらのオリ
ゴマーは、HCVヌクレオチド配列を含有するポリヌクレ
オチドを検出(単離および/またはラベルすることを含
む)ためのプローブとして、および/または標的HCV配列
の転写および/または複製のためのプライマーとして機
能する。このオリゴマーは、標的となるHCVヌクレオチ
ド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、標的付けら
れたポリヌクレオチド配列を含有する；この配列は、意
図する目的のために充分な安定性を有する二本鎖を、HC
V配列とハイブリダイズするのに充分な長さおよび相補
性を有する。例えば、意図する目的が、固定化により、
標的HCV配列を含む分析物を単離することである場合、
オリゴマーは、単離条件下でオリゴマーと結合して固相
表面上に分析物が不動化されるに充分な二本鎖安定性を
与えるように、充分な長さと標的HCV配列に対する相補
性を有するポリヌクレオチド領域を含有するであろう。
また、例えば、オリゴマーが、分析物のポリヌクレオチ
ド中の標的HCV配列を転写および/または複製するための
プライマーとして機能する場合、オリゴマーは、ポリメ
ライズ条件下で標的配列と安定な二本鎖をつくっている
プライマーからポリメライズ試薬が、連続して複製する
ことを可能にするために、充分な長さと標的HCV配列に
対する相補性を有するポリヌクレオチド領域を含有す
る。また、例えば、オリゴマーがラベルプローブとして
用いられ、あるいは多量体に結合する場合、標的ポリヌ
クレオチド領域は、ラベルプローブおよび/または多量
体と安定なハイブリッド二本鎖を形成するために充分な
長さと相補性を有する。オリゴマーは最小約４個の連続
したHCV配列に相補的なヌクレオチドを含有する；通常
オリゴマーは、標的HCV配列に相補的な、連続した最小
約８個のヌクレオチド配列を含有し、好ましくは、標的
HCV配列に相補的な連続した最小約14個のヌクレオチド
配列を含有する。
【００５３】適切なHCVヌクレオチド標的付け配列は、
図２３〜４７に示された以下のHCV cDNAヌクレオチドか
ら選択される相補ヌクレオチドであるヌクレオチドを包
含し得る(nnx-nnyは、およその番号ｘのヌクレオチドか
らおよその番号ｙのヌクレオチドまでを示す〉：nn-340
- nn-330；nn-330 - nn-320；nn-320 - nn-310；nn
-310 - nn-300；nn-300 - nn-290；nn-290 - nn-280；n
n-280 - nn-270；nn-270 - nn-260；nn-260 -nn-250；n
n-250 - nn-240；nn-240 - nn-230；nn-230 - nn-220；
nn-220 - nn-210；nn-210 - nn-200；nn-200 - n
n-190；nn-190 - nn-180；nn-180 - nn-170；nn-170 -
nn-160；nn-160 - nn-150；nn-150 - nn-140；nn-140 -
nn-130；nn-130 - nn-120；nn-120 - nn-110；nn-110
- nn-100；nn-100 - nn-90；nn-90 -nn-80；nn-80 - nn
-70；nn-70 - nn-60；nn-60 - nn-50；nn-50 - nn-40；
nn-40 - nn-30；nn-30 - nn-20；nn-20 - nn-10；nn-10
- nn1；nn1 - nn10；nn10 -nn20；nn20 - nn30；nn30
- nn40；nn40 - nn50；nn50 - nn60；nn60 - nn70；nn
70- nn80；nn80 - nn90；nn90 - nn100；nn100 - n
n110；nn110 - nn120；nn120 - nn130；nn130 - n
n140；nn140 - nn150；nn150 - nn160；nn160 - n
n170；nn170 - nn180；nn180 - nn190；nn190 - n
n200；nn200 - nn210；nn210 - nn220；nn220 - n
n230；nn230 - nn240；nn240 - nn250；nn250 - n
n260；nn260 - nn270；nn270 - nn280；nn280 - n
n290；nn290 - nn300；nn300 - nn310；nn310- nn320；
nn320 - nn330；nn330 - nn340；nn340 - nn350；nn350
- nn360；nn360 - nn370；nn370 - nn380；nn380 - nn
390；nn390 - nn400；nn400 - nn410；nn410 - nn420；
nn420 - nn430；nn430 - nn440；nn440 - nn450；nn450
- nn460；nn460 - nn470；nn470 - nn480；nn480 - nn
490；nn490 - nn500；nn500 - nn510；nn510 - nn520；
nn520 - nn530；nn530 - nn540；nn540 - nn550；nn550
- nn560；nn560 - nn570；nn570 - nn580；nn580 - nn
590；nn590 - nn600；nn600 - nn610；nn610 - nn620；
nn620 - nn630；nn630 - nn640；nn640 - nn650；nn650
- nn660；nn660 - nn670；nn670 - nn680；nn680 - nn
690；nn690 - nn700；nn700 - nn710；nn710 - nn720；
nn720 - nn730；nn730 - nn740；nn740 - nn750；nn750
- nn760；nn760 - nn770；nn770 - nn780；nn780 - nn
790；nn790- nn800；nn800 - nn810；nn810 - nn820；n
n820 - nn830；nn830 - nn840；nn840 - nn850；nn850
- nn860；nn860 - nn870；nn870 - nn880；nn880 - nn
890；nn890 - nn900；nn900 - nn910；nn910 - nn920；
nn920 - nn930；nn930 - nn940；nn940 - nn950；nn950
- nn960；nn960 - nn970；nn970 - nn980；nn980 - nn
990；nn990 - nn1000；nn1000 - nn1010；nn1010 - nn
1020；nn1020 - nn1030；nn1030 - nn1040；nn1040 - n
n1050；nn1050 - nn1060；nn1060 - nn1070；nn1070 -
nn1080；nn1080 - nn1090；nn1090 - nn1100；nn1100 -
nn1110；nn1110- nn1120；nn1120 - nn1130；nn1130 -
nn1140；nn1140 - nn1150；nn1150 - nn1160；nn1160
- nn1170；nn1170 - nn1180；nn1180 - nn1190；nn1190
- nn1200；nn1200 - nn1210；nn1210 - nn1220；nn
1220 - nn1230；nn1230 - nn1240；nn1240 - nn1250；n
n1250 - nn1260；nn1260 - nn1270；nn1270 - nn1280；
nn1280 - nn1290；nn1290 - nn1300；nn1300 - n
n1310；nn1310 - nn1320；nn1320 -nn1330；nn1330 - n
n1340；nn1340 - nn1350；nn1350 - nn1360；nn1360 -
nn1370；nn1370 - nn1380；nn1380 - nn1390；nn1390 -
nn1400；nn1400 - nn1410；nn1410 - nn1420；nn1420
- nn1430；nn1430 - nn1440；nn1440 - nn1450；nn1450
- nn1460；nn1460 - nn1470；nn1470 - nn1480；nn
1480 - nn1490；nn1490 -nn1500；nn1500 - nn1510；nn
1510 - nn1520；nn1520 - nn1530；nn1530 - nn1540；n
n1540 - nn1550；nn1550 - nn1560；nn1560 - nn1570；
nn1570 - nn1580；nn1580 - nn1590；nn1590 - n
n1600；nn1600 - nn1610；nn1610 - nn1620；nn1620 -
nn1630；nn1630 - nn1640；nn1640 - nn1650；nn1650 -
nn1660；nn1660- nn1670；nn1670 - nn1680；nn1680 -
nn1690；nn1690 - nn1700；nn1700 - nn1710；nn1710
- nn1720；nn1720 - nn1730；nn1730 - nn1740；nn1740
- nn1750；nn1750 - nn1760；nn1760 - nn1770；nn
1770 - nn1780；nn1780 - nn1790；nn1790 - nn1800；n
n1800 - nn1810；nn1810 - nn1820；nn1820 - nn1830；
nn1830 - nn1840；nn1840 - nn1850；nn1850 - n
n1860；nn1860 - nn1870；nn1870 -nn1880；nn1880 - n
n1890；nn1890 - nn1900；nn1900 - nn1910；nn1910 -
nn1920；nn1920 - nn1930；nn1930 - nn1940；nn1940 -
nn1950；nn1950 - nn1960；nn1960 - nn1970；nn1970
- nn1980；nn1980 - nn1990；nn1990 - nn2000；nn2000
- nn2010；nn2010 - nn2020；nn2020 - nn2030；nn
2030 - nn2040；nn2040 -nn2050；nn2050 - nn2060；nn
2060 - nn2070；nn2070 - nn2080；nn2080 - nn2090；n
n2090 - nn2100；nn2100 - nn2110；nn2110 - nn2120；
nn2120 - nn2130；nn2130 - nn2140；nn2140 - n
n2150；nn2150 - nn2160；nn2160 - nn2170；nn2170 -
nn2180；nn2180 - nn2190；nn2190 - nn2200；nn2200 -
nn2210；nn2210- nn2220；nn2220 - nn2230；nn2230 -
nn2240；nn2240 - nn2250；nn2250 - nn2260；nn2260
- nn2270；nn2270 - nn2280；nn2280 - nn2290；nn2290
- nn2300；nn2300 - nn2310；nn2310 - nn2320；nn
2320 - nn2330；nn2330 - nn2340；nn2340 - nn2350；n
n2350 - nn2360；nn2360 - nn2370；nn2370 - nn2380；
nn2380 - nn2390；nn2390 - nn2400；nn2400 - n
n2410；nn2410 - nn2420；nn2420 -nn2430；nn2430 - n
n2440；nn2440 - nn2450；nn2450 - nn2460；nn2460 -
nn2470；nn2470 - nn2480；nn2480 - nn2490；nn2490 -
nn2500；nn2500 - nn2510；nn2510 - nn2520；nn2520
- nn2530；nn2530 - nn2540；nn2540 - nn2550；nn2550
- nn2560；nn2560 - nn2570；nn2570 - nn2580；nn
2580 - nn2590；nn2590 -nn2600；nn2600 - nn2610；nn
2610 - nn2620；nn2620 - nn2630；nn2630 - nn2640；n
n2640 - nn2650；nn2650 - nn2660；nn2660 - nn2670；
nn2670 - nn2680；nn2680 - nn2690；nn2690 - n
n2700；nn2700 - nn2710；nn2710 - nn2720；nn2720 -
nn2730；nn2730 - nn2740；nn2740 - nn2750；nn2750 -
nn2760；nn2760- nn2770；nn2770 - nn2780；nn2780 -
nn2790；nn2790 - nn2800；nn2800 - nn2810；nn2810
- nn2820；nn2820 - nn2830；nn2830 - nn2840；nn2840
- nn2850；nn2850 - nn2860；nn2860 - nn2870；nn
2870 - nn2880；nn2880 - nn2890；nn2890 - nn2900；n
n2900 - nn2910；nn2910 - nn2920；nn2920 - nn2930；
nn2930 - nn2940；nn2940 - nn2950；nn2950 - n
n2960；nn2960 - nn2970；nn2970 -nn2980；nn2980 - n
n2990；nn2990 - nn3000；nn3000 - nn3010；nn3010 -
nn3020；nn3020 - nn3030；nn3030 - nn3040；nn3040 -
nn3050；nn3050 - nn3060；nn3060 - nn3070；nn3070
- nn3080；nn3080 - nn3090；nn3090 - nn3100；nn3100
- nn3110；nn3110 - nn3120；nn3120 - nn3130；nn
3130 - nn3140；nn3140 -nn3150；nn3150 - nn3160；nn
3160 - nn3170；nn3170 - nn3180；nn3180 - nn3190；n
n3190 - nn3200；nn3200 - nn3210；nn3210 - nn3220；
nn3220 - nn3230；nn3230 - nn3240；nn3240 - n
n3250；nn3250 - nn3260；nn3260 - nn3270；nn3270 -
nn3280；nn3280 - nn3290；nn3290 - nn3300；nn3300 -
nn3310；nn3310- nn3320；nn3320 - nn3330；nn3330 -
nn3340；nn3340 - nn3350；nn3350 - nn3360；nn3360
- nn3370；nn3370 - nn3380；nn3380 - nn3390；nn3390
- nn3400；nn3400 - nn3410；nn3410 - nn3420；nn
3420 - nn3430；nn3430 - nn3440；nn3440 - nn3450；n
n3450 - nn3460；nn3460 - nn3470；nn3470 - nn3480；
nn3480 - nn3490；nn3490 - nn3500；nn3500 - n
n3510；nn3510 - nn3520；nn3520 -nn3530；nn3530 - n
n3540；nn3540 - nn3550；nn3550 - nn3560；nn3560 -
nn3570；nn3570 - nn3580；nn3580 - nn3590；nn3590 -
nn3600；nn3600 - nn3610；nn3610 - nn3620；nn3620
- nn3630；nn3630 - nn3640；nn3640 - nn3650；nn3650
- nn3660；nn3660 - nn3670；nn3670 - nn3680；nn
3680 - nn3690；nn3690 -nn3700；nn3700 - nn3710；nn
3710 - nn3720；nn3720 - nn3730；nn3730 - nn3740；n
n3740 - nn3750；nn3750 - nn3760；nn3760 - nn3770；
nn3770 - nn3780；nn3780 - nn3790；nn3790 - n
n3800；nn3800 - nn3810；nn3810 - nn3820；nn3820 -
nn3830；nn3830 - nn3840；nn3840 - nn3850；nn3850 -
nn3860；nn3860- nn3870；nn3870 - nn3880；nn3880 -
nn3890；nn3890 - nn3900；nn3900 - nn3910；nn3910
- nn3920；nn3920 - nn3930；nn3930 - nn3940；nn3940
- nn3950；nn3950 - nn3960；nn3960 - nn3970；nn
3970 - nn3980；nn3980 - nn3990；nn3990 - nn4000；n
n4000 - nn4010；nn4010 - nn4020；nn4020 - nn4030；
nn4030 - nn4040；nn4040 - nn4050；nn4050 - n
n4060；nn4060 - nn4070；nn4070 -nn4080；nn4080 - n
n4090；nn4090 - nn4100；nn4100 - nn4110；nn4110 -
nn4120；nn4120 - nn4130；nn4130 - nn4140；nn4140 -
nn4150；nn4150 - nn4160；nn4160 - nn4170；nn4170
- nn4180；nn4180 - nn4190；nn4190 - nn4200；nn4200
- nn4210；nn4210 - nn4220；nn4220 - nn4230；nn
4230 - nn4240；nn4240 -nn4250；nn4250 - nn4260；nn
4260 - nn4270；nn4270 - nn4280；nn4280 - nn4290；n
n4290 - nn4300；nn4300 - nn4310；nn4310 - nn4320；
nn4320 - nn4330；nn4330 - nn4340；nn4340 - n
n4350；nn4350 - nn4360；nn4360 - nn4370；nn4370 -
nn4380；nn4380 - nn4390；nn4390 - nn4400；nn4400 -
nn4410；nn4410- nn4420；nn4420 - nn4430；nn4430 -
nn4440；nn4440 - nn4450；nn4450 - nn4460；nn4460
- nn4470；nn4470 - nn4480；nn4480 - nn4490；nn4490
- nn4500；nn4500 - nn4510；nn4510 - nn4520；nn
4520 - nn4530；nn4530 - nn4540；nn4540 - nn4550；n
n4550 - nn4560；nn4560 - nn4570；nn4570 - nn4580；
nn458 ０ − ｎｎ４５９０；nn4590 - nn4600；nn4600
- nn4610；nn4610 - nn4620；nn4620 -nn4630；nn4630
- nn4640；nn4640 - nn4650；nn4650 - nn4660；nn
4660 - nn4670；nn4670 - nn4680；nn4680 - nn4690；n
n4690 - nn4700；nn4700 - nn4710；nn4710 - nn4720；
nn4720 - nn4730；nn4730 - nn4740；nn4740 - n
n4750；nn4750 - nn4760；nn4760 - nn4770；nn4770 -
nn4780；nn4780 - nn4790；nn4790 -nn4800；nn4800 -
nn4810；nn4810 - nn4820；nn4820 - nn4830；nn4830 -
nn4840；nn4840 - nn4850；nn4850 - nn4860；nn4860
- nn4870；nn4870 - nn4880；nn4880 - nn4890；nn4890
- nn4900；nn4900 - nn4910；nn4910 - nn4920；nn
4920 - nn4930；nn4930 - nn4940；nn4940 - nn4950；n
n4950 - nn4960；nn4960- nn4970；nn4970 - nn4980；n
n4980 - nn4990；nn4990 - nn5000；nn5000 - nn5010；
nn5010 - nn5020；nn5020 - nn5030；nn5030 - n
n5040；nn5040 - nn5050；nn5050 - nn5060；nn5060 -
nn5070；nn5070 - nn5080；nn5080 - nn5090；nn5090 -
nn5100；nn5100 - nn5110；nn5110 - nn5120；nn5120
- nn5130；nn5130 - nn5140；nn5140 - nn5150；nn5150
- nn5160；nn5160 - nn5170；nn5170 -nn5180；nn5180
- nn5190；nn5190 - nn5200；nn5200 - nn5210；nn
5210 - nn5220；nn5220 - nn5230；nn5230 - nn5240；n
n5240 - nn5250；nn5250 - nn5260；nn5260 - nn5270；
nn5270 - nn5280；nn5280 - nn5290；nn5290 - n
n5300；nn5300 - nn5310；nn5310 - nn5320；nn5320 -
nn5330；nn5330 - nn5340；nn5340 -nn5350；nn5350 -
nn5360；nn5360 - nn5370；nn5370 - nn5380；nn5380 -
nn5390；nn5390 - nn5400；nn5400 - nn5410；nn5410
- nn5420；nn5420 - nn5430；nn5430 - nn5440；nn5440
- nn5450；nn5450 - nn5460；nn5460 - nn5470；nn
5470 - nn5480；nn5480 - nn5490；nn5490 - nn5500；n
n5500 - nn5510；nn5510- nn5520；nn5520 - nn5530；n
n5530 - nn5540；nn5540 - nn5550；nn5550 - nn5560；
nn5560 - nn5570；nn5570 - nn5580；nn5580 - n
n5590；nn5590 - nn5600；nn5600 - nn5610；nn5610 -
nn5620；nn5620 - nn5630；nn5630 - nn5640；nn5640 -
nn5650；nn5650 - nn5660；nn5660 - nn5670；nn5670
- nn5680；nn5680 - nn5690；nn5690 - nn5700；nn5700
- nn5710；nn5710 - nn5720；nn5720 -nn5730；nn5730
- nn5740；nn5740 - nn5750；nn5750 - nn5760；nn
5760 - nn5770；nn5770 - nn5780；nn5780 - nn5790；n
n5790 - nn5800；nn5800 - nn5810；nn5810 - nn5820；
nn5820 - nn5830；nn5830 - nn5840；nn5840 - n
n5850；nn5850 - nn5860；nn5860 - nn5870；nn5870 -
nn5880；nn5880 - nn5890；nn5890 -nn5900；nn5900 -
nn5910；nn5910 - nn5920；nn5920 - nn5930；nn5930 -
nn5940；nn5940 - nn5950；nn5950 - nn5960；nn5960
- nn5970；nn5970 - nn5980；nn5980 - nn5990；nn5990
- nn6000；nn6000 - nn6010；nn6010 - nn6020；nn
6020 - nn6030；nn6030 - nn6040；nn6040 - nn6050；n
n6050 - nn6060；nn6060- nn6070；nn6070 - nn6080；n
n6080 - nn6090；nn6090 - nn6100；nn6100 - nn6110；
nn6110 - nn6120；nn6120 - nn6130；nn6130 - n
n6140；nn6140 - nn6150；nn6150 - nn6160；nn6160 -
nn6170；nn6170 - nn6180；nn6180 - nn6190；nn6190 -
nn6200；nn6200 - nn6210；nn6210 - nn6220；nn6220
- nn6230；nn6230 - nn6240；nn6240 - nn6250；nn6250
- nn6260；nn6260 - nn6270；nn6270 -nn6280；nn6280
- nn6290；nn6290 - nn6300；nn6300 - nn6310；nn
6310 - nn6320；nn6320 - nn6330；nn6330 - nn6340；n
n6340 - nn6350；nn6350 - nn6360；nn6360 - nn6370；
nn6370 - nn6380；nn6380 - nn6390；nn6390 - n
n6400；nn6400 - nn6410；nn6410 - nn6420；nn6420 -
nn6430；nn6430 - nn6440；nn6440 -nn6450；nn6450 -
nn6460；nn6460 - nn6470；nn6470 - nn6480；nn6480 -
nn6490；nn6490 - nn6500；nn6500 - nn6510；nn6510
- nn6520；nn6520 - nn6530；nn6530 - nn6540；nn6540
- nn6550；nn6550 - nn6560；nn6560 - nn6570；nn
6570 - nn6580；nn6580 - nn6590；nn6590 - nn6600；n
n6600 - nn6610；nn6610- nn6620；nn6620 - nn6630；n
n6630 - nn6640；nn6640 - nn6650；nn6650 - nn6660；
nn6660 - nn6670；nn6670 - nn6680；nn6680 - n
n6690；nn6690 - nn6700；nn6700 - nn6710；nn6710 -
nn6720；nn6720 - nn6730；nn6730 - nn6740；nn6740 -
nn6750；nn6750 - nn6760；nn6760 - nn6770；nn6770
- nn6780；nn6780 - nn6790；nn6790 - nn6800；nn6800
- nn6810；nn6810 - nn6820；nn6820 -nn6830；nn6830
- nn6840；nn6840 - nn6850；nn6850 - nn6860；nn
6860 - nn6870；nn6870 - nn6880；nn6880 - nn6890；n
n6890 - nn6900；nn6900 - nn6910；nn6910 - nn6920；
nn6920 - nn6930；nn6930 - nn6940；nn6940 - n
n6950；nn6950 - nn6960；nn6960 - nn6970；nn6970 -
nn6980；nn6980 - nn6990；nn6990 -nn7000；nn7000 -
nn7010；nn7010 - nn7020；nn7020 - nn7030；nn7030 -
nn7 040；nn7040 - nn7050；nn7050 - nn7060；nn7060
- nn7070；nn7070 - nn7080；nn7080 - nn7090；nn7090
- nn7100；nn7100 - nn7110；nn7110 - nn7120；nn
7120 - nn7130；nn7130 - nn7140；nn7140 - nn7150；n
n7150 - nn7160；nn7160- nn7170；nn7170 - nn7180；n
n7180 - nn7190；nn7190 - nn7200；nn7200 - nn7210；
nn7210 - nn7220；nn7220 - nn7230；nn7230 - n
n7240；nn7240 - nn7250；nn7250 - nn7260；nn7260 -
nn7270；nn7270 - nn7280；nn7280 - nn7290；nn7290 -
nn7300；nn7300 - nn7310；nn7310 - nn7320；nn7320
- nn7330；nn7330 - nn7340；nn7340 - nn7350；nn7350
- nn7360；nn7360 - nn7370；nn7370 -nn7380；nn7380
- nn7390；nn7390 - nn7400；nn7400 - nn7410；nn
7410 - nn7420；nn7420 - nn7430；nn7430 - nn7440；n
n7440 - nn7450；nn7450 - nn7460；nn7460 - nn7470；
nn7470 - nn7480；nn7480 - nn7490；nn7490 - n
n7500；nn7500 - nn7510；nn7510 - nn7520；nn7520 -
nn7530；nn7530 - nn7540；nn7540 -nn7550；nn7550 -
nn7560；nn7560 - nn7570；nn7570 - nn7580；nn7580 -
nn7590；nn7590 - nn7600；nn7600 - nn7610；nn7610
- nn7620；nn7620 - nn7630；nn7630 - nn7640；nn7640
- nn7650；nn7650 - nn7660；nn7660 - nn7670；nn
7670 - nn7680；nn7680 - nn7690；nn7690 - nn7700；n
n7700 - nn7710；nn7710- nn7720；nn7720 - nn7730；n
n7730 - nn7740；nn7740 - nn7750；nn7750 - nn7760；
nn7760 - nn7770；nn7770 - nn7780；nn7780 - n
n7790；nn7790 - nn7800；nn7800 - nn7810；nn7810 -
nn7820；nn7820 - nn7830；nn7830 - nn7840；nn7840 -
nn7850；nn7850 - nn7860；nn7860 - nn7870；nn7870
- nn7880；nn7880 - nn7890；nn7890 - nn7900；nn7900
- nn7910；nn7910 - nn7920；nn7920 -nn7930；nn7930
- nn7940；nn7940 - nn7950；nn7950 - nn7960；nn
7960 - nn7970；nn7970 - nn7980；nn7980 - nn7990；n
n7990 - nn8000；nn8000 - nn8010；nn8010 - nn8020；
nn8020 - nn8030；nn8030 - nn8040；nn8040 - n
n8050；nn8050 - nn8060；nn8060 - nn8070；nn8070 -
nn8080；nn8080 - nn8090；nn8090 -nn8100；nn8100 -
nn8110；nn8110 - nn8120；nn8120 - nn8130；nn8130 -
nn8140；nn8140 - nn8150；nn8150 - nn8160；nn8160
- nn8170；nn8170 - nn8180；nn8180 - nn8190；nn8190
- nn8200；nn8200 - nn8210；nn8210 - nn8220；nn
8220 - nn8230；nn8230 - nn8240；nn8240 - nn8250；n
n8250 - nn8260；nn8260− ｎｎ８２７０；nn8270 - n
n8280；nn8280 - nn8290；nn8290 - nn8300；nn8300 -
nn8310；nn8310 - nn8320；nn8320 - nn8330；nn8330 -
nn8340；nn8340 - nn8350；nn8350 - nn8360；nn8360
- nn8370；nn8370 - nn838 0；nn8380 - nn8390；nn8390
- nn8400；nn8400 - nn8410；nn8410 - nn8420；nn
8420 - nn8430；nn8430 - nn8440；nn8440 - nn8450；n
n8450 - nn8460；nn8460 - nn8470；nn8470 -nn8480；n
n8480 - nn8490；nn8490 - nn8500；nn8500 - nn8510；
nn8510 - nn8520；nn8520 - nn8530；nn8530 - n
n8540；nn8540 - nn8550；nn8550 - nn8560；nn8560 -
nn8570；nn8570 - nn8580；nn8580 - nn8590；nn8590 -
nn8600；nn8600 - nn8610；nn8610 - nn8620；nn8620
- nn8630；nn8630 - nn8640；nn8640 -nn8650；nn8650
- nn8660；nn8660 - nn8670；nn8670 - nn8680；nn8680
- nn8690；nn8690 - nn8700；nn8700 - nn8710；nn
8710 - nn8720；nn8720 - nn8730；nn8730 - nn8740；n
n8740 - nn8750；nn8750 - nn8760；nn8760 - nn8770；
nn8770 - nn8780；nn8780 - nn8790；nn8790 - n
n8800；nn8800 - nn8810；nn8810- nn8820；nn8820 - n
n8830；nn8830 - nn8840；nn8840 - nn8850；nn8850 -
nn8860；nn8860 - nn8870；nn8870 - nn8880；nn8880 -
nn8890；nn8890 - nn8900；nn8900 - nn8910；nn8910
- nn8920；nn8920 - nn8930；nn8930 - nn8940；nn8940
- nn8950；nn8950 - nn8960；nn8960 - nn8970；nn
8970 - nn8980；nn8980 - nn8990；nn8990 - nn9000；n
n9000 - nn9010；nn9010 - nn9020；nn9020 -nn9030；n
n9030 - nn9040；nn9040 - nn9050；nn9050 - nn9060。
【００５４】しかしながら、オリゴマーは、標的のHCV
配列に相補的である配列のみからなる必要はない。さら
に、ヌクレオチド配列あるいはオリゴマーが用いられる
標的物に適切な他の部分を含み得る。例えば、HCV配列
のPCRによる増幅のためのプライマーとしてそのオリゴ
マーが用いられる場合、それらには、二本鎖のとき、増
幅される配列のクローニングを促進する制限酵素部位を
形成する配列を含み得る。例えば、さらに、オリゴマー
をハイブリダイゼーションアッセイ(下記)の「カプチャ
ープローブ」として用いられる場合に、標的のHCV配列
に相補的なヌクレオチド配列を含有するオリゴマーにカ
ップルされる結合パートナーをさらに含む。オリゴマー
が含まれ得る、あるいはカップルされ得るのに有用な他
の型の部分あるいは配列は、ヌクレオチドプローブのラ
ベル化を含む、種々の目的に適切であることは当該分野
では公知である。
【００５５】オリゴマーの調製は、例えば、削除、転写
あるいは化学合成法を含む当該分野において公知の方法
によってなされる。標的のゲノムの配列および/または
領域は、オリゴマーの標的づけるポリヌクレオチドが標
的に依存して相補的であるように選択される。例えば、
最終目的が、生物学的サンプル(例えば、血液)中のHCV
の存在をスクリーニングすることである場合、好ましい
オリゴマーは、プローブおよび/またはプライマーとし
て用いられ、そしてHCVゲノムの保存領域にハイブリダ
イズされる。オリゴマーが結合し得るHCVゲノムの保存
領域のいくつかは、本明細書に記載されている。例え
ば、図２３〜４７に示されているように、ヌクレオチド
番号が、末端から約５から約200、あるいは約4000から
約5000、あるいは8000から約9040、あるいは好ましく
は、ヌクレオチド−318から174、4056から4448および43
78から4902を含む領域である。保存されているゲノムの
他の領域は、プロトタイプHCV、すなわちHCV1を含む種
々のHCVの単離株のヌクレオチド配列の比較によって、
容易に確定し得る。保存領域および非保存領域を決定す
るための遺伝子型間の比較をする方法は、当該分野にお
いて公知であり、このような方法の例は、本明細書に記
載されている。
【００５６】基本的な核酸ハイブリダイゼーションアッ
セイにおいて、一本鎖の分析物核酸(DNAあるいはRNA)
は、核酸プローブとハイブリダイズされ、そして生じた
二本鎖が検出される。HCVポリヌクレオチドのプローブ
(天然のあるいは誘導された)は、ハイブリダイゼーショ
ンによる新しいウイルス配列の検出を可能とする長さで
ある。６〜８ヌクレオチドが働き得る長さであるが、10
〜12のヌクレオチドの配列が好ましく、そして約20ヌク
レオチドあるいはそれ以上が最も好ましい。好ましく
は、これらの配列は、異種性を欠く領域に由来する。こ
れらのプローブは、自動オリゴヌクレオチド合成法を含
む、定法を用いて調製され得る。有用なプローブのなか
には、例えば、本明細書に開示されている新しく単離さ
れたクローン由来のもの、および下記に示すcDNAライブ
ラリーをプローブするのに有用な種々のオリゴマーがあ
る。HCVゲノムの任意の新しい部分への相補体は納得さ
れる。プローブとして用いるために、フラグメントの長
さが増される必要はないが、完全な相補性が望まれる。
【００５７】HCVポリヌクレオチドの存在を検出するた
めの因子としてのこのようなプローブの使用(例えば、
汚染血液のスクリーニングで)のために、血液あるいは
血清のような、分析される生物学的サンプルが、必要に
応じて、含有される核酸の抽出のために、処理される。
サンプルから得られた核酸は、ゲル電気泳動、あるいは
他のサイズ分離技術に供せられ得、あるいは核酸サンプ
ルは、サイズ分離しないでドットブロットされ得る。プ
ローブの標的づける配列に二本鎖にハイブリダイズを形
成するのに、分析物核酸の標的の領域が一本鎖にされ
る。配列が天然に一本鎖である場合、変性は要求されな
い。しかし、配列が二本鎖である場合、配列は変性され
る。変性は、当該分野で公知の種々の技術により実施さ
れ得る。変性に続いて、分析物核酸およびプローブは、
プローブ中の標的の配列の、分析物の推定上の標的の配
列とのハイブリッド形成をなすのに適し、そして検出さ
れるプローブを含む二本鎖を得る条件下に、インキュベ
ートする。
【００５８】得られた二本鎖の検出は、もしあれば、通
常、ラベルプローブの使用で達成される：あるいは直接
的にあるいは間接的に、ラベルされたリガンドへの特異
的結合によって検出され得れば、プローブはラベルされ
得ない。適切なラベル、およびプローブおよびリガンド
のラベル方法は当該分野において公知であり、例えば、
公知の方法(例えば、ニックトランスレーションあるい
はキナーゼ処理(kinasing))を用い得る放射活性ラベ
ル、ビオチン、蛍光基、化学発光基(例えば、ジオキシ
ニタン、特に誘起ジオキセタン)、酵素、抗体などを含
む。
【００５９】分析物に結合されるのに用いられるプロー
ブの領域は、HCVゲノムに完全に相補的に作成され得
る。従って、通常、不正確さを避けるために、高いスト
リンジェンシーの条件が望まれる。しかし、高いストリ
ンジェンシーの条件は、プローブが異種性を欠くウイル
スゲノムの領域に相補的である場合にのみ、用いられる
べきである。ハイブリダーゼーションのストリンジェン
シーは、温度、イオン強度、時間の長さおよびホルムア
ミドの濃度を含み、ハイブリダイゼーションの間、およ
び洗浄の工程の間の多くの因子によって決定される。こ
れらの因子は、例えば、Maniatis,T.(1982)に概説され
ている。
【００６０】当該分野において公知のこの基本的な方法
の変法もまた、外来物質からの検出されるべき二本鎖の
促進された分離および/またはラベル部分からのシグナ
ルの増幅の方法を含んで、用いられ得る。これらの変法
の多くは、例えば、MatthewsおよびKricka(1988)、Anal
ytical Biochemistry 169：1；Landegrenら(1988)、Sci
ence 242：229；およびMittlin(1989)、Clinical chem.
35：1819に総説されている。これらおよびアッセイの
形態が記載されている次の刊行物は、本明細書に引用文
献として援用されている。これらのアッセイでHCVを検
出するために適したプローブは、標的のHCVポリヌクレ
オチド配列にハイブリダイズして分析物鎖と二本鎖を形
成する配列を含有する。ここで、この二本鎖は、特定の
アッセイ系における検出のために十分に安定である。
【００６１】適切な変法は、例えば、1989年9月9日発行
の米国特許第4,868,105号、および欧州特許公開第225,8
07号(1987年6月16日公開)に記載されている。これらの
刊行物には、分析物核酸が、ラベルプローブセットおよ
びカプチャープローブセットにハイブリダイズされる、
液相核酸ハイブリダイゼーションアッセイが記載されて
いる。プローブ−分析物複合体は、カプチャープローブ
セットと相補的である、固体に固定されたカプチャープ
ローブとのハイブリダイゼーションによりカップルされ
る。分析物アミノ酸は、固相複合体として溶液から除去
される。分析物を固相複合体の形態で有することは、ア
ッセイでの次の分離工程を促進にする。ラベルプローブ
セットは、ハイブリダイゼーションを介しての固相/分
析物複合体に結合されるラベルされたプローブと相補的
である。
【００６２】一般に、HCVゲノム配列は、感染患者には
比較的低レベル、すなわち、１ml当たり約102〜103のチ
ンパンジー感染用量(CID)で血清中に存在する。このレ
ベルは、ハイブリダイゼーションアッセイで増幅法が用
いられるのに要求され得る。このような技術は当該分野
において公知である。例えば、Enzo Biochemical Copor
ationの「Bio-Brige」システムでは、DNAプローブに非
修飾の３'-ポリ-dT-末端を付加するために末端デオキシ
ヌクレオチドトランスフェラーゼが用いられる。このポ
リdT末端付加プローブは、標的のヌクレオチド配列にハ
イブリダイズされて、次いで、ビオチン修飾されたポリ
Ａにハイブリダイズされる。PCT公開84/03520および欧
州特許公開第124221号には、(１)分析物が、酵素ラベル
されたオリゴヌクレオチドに相補的である一本鎖DNAプ
ローブにアニールされ；そして(２)得られた末端付加さ
れた二本鎖が、酵素ラベルされたオリゴヌクレオチドに
ハイブリダイズされる、DNAハイブリダイゼーションア
ッセイが記載されている。欧州特許出願第204510号に
は、分析物DNAが、ポリ-dT末端のような末端を有するプ
ローブ、ポリＡ配列のようなプローブ末端にハイブリダ
イズする配列を有する増幅鎖に結合し、およびラベルさ
れた鎖の大部分に結合し得るDNAハイブリダイゼーショ
ンアッセイが記載されている。欧州特許公開第317,077
号(1989年5月24日公開)に記載されているハイブリダイ
ゼーションアッセイは、約106/mlのレベルで配列を検出
し、一本鎖分析物核酸に結合し、さらに、多くの一本鎖
ラベルオリゴヌクレオチドに結合する核酸マルチマーを
用いている。とくに記載されている技術には、ハイブリ
ダイゼーション系の一部として、血清中に約10,000倍
(すなわち、約106配列/ml)標的のHCV配列の増幅物が含
有される。増幅は、例えば、Saikiら(1986)、Mullis、
米国特許第4,683,196号、およびMullisら米国特許第4,6
83,202号に記載のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法により
達成される。増幅は、HCVの標的配列の精製の前、ある
いは好ましくは、精製に引き続いてなされ得る。例え
ば、増幅は、米国特許第4,868,105号に記載のアッセイ
法とともに用いられ得るし、あるいは、さらに増幅が望
まれる場合には、欧州特許公開第317,077号に記載のハ
イブリダイゼーション系とともに用いられ得る。
【００６３】分析物ポリヌクレオチド鎖中のHCV配列を
検出するための好ましい方法は、米国特許第4,868,105
号および欧州特許公開第317,077号に記載のハイブリダ
イゼーション検出法に基づく。これらの方法は、分析物
の核酸中の標的の配列にハイブリダイズするカプチャー
プローブおよびラベルプローブを用いる、液相サンドイ
ッチハイブリダイゼーションアッセイである。生物学的
サンプルのHCVをスクリーニングするアッセイの使用に
おいて、用いられるプローブは、HCVゲノムの保存領域
に結合される。カプチャープローブおよびラベルプロー
ブは、標的の配列への結合に配置され得る。あるいは、
好ましいモードのカプチャープローブおよびラベルプロ
ーブはセットで存在し、そして１つのセットのプローブ
他のセットのプローブとともに配置されない。後者のモ
ードにおいて、好ましくは、複数のカプチャープローブ
のセットがゲノムの最も保存された領域にハイブリダイ
ズし、一方、複数のラベルプローブのセットは、少しの
相違を示す領域にハイブリダイズし得る。例えば、図２
３〜４７に示されるプロトタイプHCV1 cDNA配列を用い
て、約−318から約174のヌクレオチドの領域および/ま
たは約4378から4902の領域のヌクレオチド、および/ま
たは約4056から約4448の領域のヌクレオチドの配列にハ
イブリダイズするプローブが用いられた。好ましいプロ
ーブは、HCVゲノムの５'領域の配列にハイブリダイズす
る。なぜなら、下記に示すように、この領域は、高度に
保存されるようであるからである。従って、好ましいプ
ローブは、例えば、図２３〜４７に示されているよう
に、約−318から約174のヌクレオチドにハイブリダイズ
し得る。例えば、ウイルスゲノム配列の検出、あるいは
PCR増幅により生じたHCV cDNA配列の検出、あるいは、H
CV RNA正鎖に対する複製中間生成物の検出の目的に応じ
て、保存領域の正鎖および/またはその相補体にハイブ
リダイズするプローブが用いられる。
【００６４】HCV/cPCR法を用いた、HCV RNAおよびその
由来のポリヌクレオチドの検出 HCV RNAまたはHCV RNAに由来するポリヌクレオチドの特
に好ましい検出法は、この出願の主題であるHCV/cPCR法
であり、Saiki等(1986)、Mullisによる米国特許第4,68
3,195号およびMullis等による米国特許第4,683,202号に
より述べられている、ポリメラーゼ連鎖反応技術(PCR)
を利用する。HCV/cPCR法はHCVゲノムの性質に関し、本
明細書で与えられる情報に由来するプライマーとプロー
ブを利用する。
【００６５】一般に、PCR技術では、短いオリゴヌクレ
オチドプライマーが準備され、所望の配列の反対の末端
に合う。プライマー間の配列は知られる必要はない。ポ
リヌクレオチドのサンプルは好ましくは熱により抽出さ
れ、変性され、超過モルに存在するオリゴヌクレオチド
プライマーとともにハイブリッドされる。ポリメライゼ
ーションは、三リン酸デオキシヌクレオチドまたはアナ
ログヌクレオチド(dNTP)の存在する時に鋳型およびプラ
イマー依存的なポリメラーゼにより触媒作用される。こ
のことは、５'基のそれぞれのプライマーを含む２つの
「長い生成物」に帰着し、元の鎖の新しく合成された補
足に共有結合される。複製されたDNAは再び変性され、
オリゴヌクレオチドプライマーとともにハイブリッドさ
れ、重合条件にもどされ、２回目の複製回路が始められ
る。２回目の回路は２つの元の鎖、回路１からの２つの
長い生成物、および長い生成物から複製された２つの
「短い生成物」を供給する。短い生成物は標的配列に由
来する配列(センスまたはアンチノーゼ)をふくみ、プラ
イマー配列のある５'および３'基に側面をもつ。各追加
の回路では、短い生成物の数が指数関数的に複製され
る。従って、このプロセスは特別な標的配列の増幅の原
因となる。この方法では、HCV RNA、またはその断片を
含むと推測されるサンプルが準備される。このサンプル
は通常はNANBHを持つと推測される独立したものから取
り出される。しかしながら、サンプルの他の源は例え
ば、ウイルスが複製されるvitroシステムからのならし
培地または細胞が含まれる。サンプルは、しかしなが
ら、標的核酸配列を含まなければならない。
【００６６】サンプルはそれからHCV RNAの逆転写であ
るHCV cDNAにする条件が行われる。RNAの逆転写は当業
者には公知であり、例えば、Maniatis等(1982)および酵
素学法に述べられている。逆転写の好ましい方法は例え
ば、レトロウイルス、好ましくはトリ骨髄芽球ウイルス
(AMV)から分離され、組換え分子を含む、様々な源から
の逆転写酵素と、転写に適した条件を利用する。逆転写
のHCV cDNA生成物はRNA、逆転写の一回目の結果であ
る、DNAハイブリッド、それ以降のDNA、および２回目以
上の転写の結果であるDNAハイブリッド内にある。
【００６７】逆転写酵素により得られたこのHCVのcDNA
を、次に標的配列を増幅するためにPCRした。これを実
施するために、このHCVのcDNAを変性し、分離された両
鎖は、標的配列に隣接したプライマーとともにハイブリ
ッドした。
【００６８】鎖の分離は、適切な変性手段ならば、当業
者に知られた、物理的、化学的、あるいは酵素的な手段
の何によってでもよい。推奨方法は、物理的方法で、完
全に(99％)変性するまで核酸を加熱する工程を含む。典
型的な熱変性は、約80℃から100℃の間の温度で、約１
分から10分間の間行った。HCVのcDNAをプライマーとと
もにハイブリッドした後、標的のHCV配列は、プライマ
ーのオリゴヌクレオチドにより複製鎖の合成を開始させ
るという、ポリマー化手段によって複製した。プライマ
ーは、HCVのゲノムの配列に相補的である様に選ばれ
た。HCVのcDNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖の領域
に相補的なオリゴマー性のプライマーは、図２３〜４７
に与えられたcomposite cDNA配列からのHCVのcDNA配列
から設計された。
【００６９】プライマーは、一つのプライマーから合成
され、テンプレート(相補鎖)から分離した、伸長産物
が、他のプライマーの伸長用テンプレートとして、定義
された長さの複製鎖を与えることができる様に、二重鎖
配列の上の相対的位置がなる様に選択した。
【００７０】最高効率の増幅のためには、プライマーは
一本鎖であるのが好適であるが、二重鎖であっても構わ
ない。二重鎖の場合には、伸長産物を生成するために用
いる前に、先ず、両鎖を分離するために処理しなければ
ならない。プライマーは、オリゴデオキシヌクレオチド
が好適である。プライマーは、ポリマー化用の試薬の存
在下で伸長産物の合成の開始をするためには、十分長く
なくてはならない。プライマーの適切な長さは、温度、
およびプライマーの由来、および使用法等を含む、多く
の因子に依存する。例えば、標的配列のcomplexityに依
存して、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には
約15から45のヌクレオチドを含むが、場合によってはこ
れより多いことも少ないこともある。短いプライマー分
子で、テンプレートと十分安定なハイブリッド複合体を
形成するには、一般により低い温度が要求される。
【００７１】本明細書に用いたプライマーは、増幅され
るべき各特異的な異なる鎖に「実質的に」相補的な様に
選択されている。そのためプライマーは、テンプレート
の正確な配列を反映する必要はなく、それらの対応する
鎖に選択的にハイブリッドするのに十分な相補性を持た
なければならない。例えば、非相補的なヌクレオチド断
片は、プライマー配列の鎖に相補的な残りの部分で、プ
ライマーの５'-末端に結合することもある。あるいは、
非相補的な塩基あるいはより長い配列が、プライマーの
中に点在し、そのため、増幅されるべき片方の鎖の配列
に対し十分なだけ相補的となり、それとハイブリダイズ
し、ポリマー化手段により伸長された、二重鎖構造を形
成する。プライマー中の非相補的なヌクレオチド配列
は、制限酵素部位を含むことがある。標的配列の(両)末
端に制限酵素部位を加えることは、標的配列をクローニ
ングする際に特に有用である。
【００７２】本明細書で用いる用語「プライマー」は、
特に増幅されるべき標的領域の(両)末端配列に関する情
報に幾分かの暖昧さがある場合に、一つ以上のプライマ
ーを指すことがあることは理解されたい。「プライマ
ー」は、配列中の可能な変化を表す配列を含むプライマ
ーオリゴヌクレオチドの集合を包含する、あるいは、典
型的な塩基対形成をするヌクレオチドを含むことが許さ
れるためである。この集合中の、プライマーオリゴヌク
レオチドの一つが、標的配列の末端と相同的である。実
施例にはこの特殊な例を示してあり、44-mersと45-mers
のオリゴマーの組を、HCVゲノムの潜在的可変領域の増
幅を開始するのに用いている。
【００７３】プロトタイプ株であるHCV1から誘導された
配列を持つHCVの種々の株あるいは単離株があることは
予期されていた。そのため、変種株を検出するために、
HCVゲノムの保存領域とハイブリッドするプライマーを
構成することが好ましい。保存領域は、数種のHCVの株/
単離株ヌクレオチドあるいはアミノ酸配列を比較するこ
とによって決定される。前出の文献の記述によると、HC
Vゲノム中には、少なくとも三つのアミノ酸の保存領域
があり、プライマーはその中から由来させている。これ
らの領域は、信じられているものである。後に実施例中
で記述されるプライマーは、Flavivirusesの保存領域と
の配列相同性に基づいて、HCVの保存領域と信じられて
いる部位から由来したものである。
【００７４】オリゴヌクレオチドプライマーは、適切な
方法ならば、如何なる方法で調製してもよい。特定の配
列を有するオリゴヌクレオチドの調製方法は、当該分野
では公知であり、例えば、適切な配列のクローニングお
よび制限酵素切断による、および、直接の化学的合成に
よる、方法を含む方法で調製できる。化学的合成法に
は、例えば、Narangらの(1979)記述したフォスフォトリ
エステル法、Brownらの(1979)開示したフォスフォジエ
ステル法、Beaucageらの(1981)開示したジエチルフォス
フォアミデート法、および米国特許第4,458,066号の固
体担体法がある。
【００７５】所望するならば、分光学的に、光化学的
に、微生物学的に、免疫化学的に、あるいは化学的に検
出可能な手段を組み込むことにより、プライマーはラベ
ルしてもよい。
【００７６】テンプレート依存性のオリゴヌクレオチド
プライマーの伸長反応は、ポリマー化薬剤により触媒さ
れ、適切な量の四種のデオキシリボヌクレオチドトリフ
ォスフェート(dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP)あるいはそ
の類似物の存在下で、適切な、塩類、金属カチオン、お
よびpH緩衝系からなる反応溶媒中で行われる。適切なポ
リマー化薬剤は、プライマー依存性およびテンプレート
依存性のDNA合成を触媒する酵素である。知られているD
NAポリメラーゼには、例えば、E. coliのDNAポリメラー
ゼＩあるいはそのKlenow断片、T4 DNAポリメラーゼ、お
よびTaq DNAポリメラーゼがある。これらのDNAポリメラ
ーゼを用いてDNA合成を触媒する反応条件は公知であ
る。
【００７７】この合成の産物は、テンプレート鎖および
プライマー伸長鎖から構成される二重鎖の分子であり、
その中に標的配列を包含している。これらの産物は、次
には、以降の複製の段階ではテンプレートとして機能す
る。複製の第２段階では、第１サイクルのプライマー伸
長鎖は、その相補的なプライマーとアニールする；この
合成は、５'-末端および３'-末端の両方にプライマー配
列あるいはその相補体が結合した、「短い」産物を生成
する。変性、プライマーのアニーリング、および伸長の
繰り返されるサイクルは、プライマーによって定義され
る標的領域の指数的な蓄積をもたらす。核酸からなる標
的領域を包含する、所望する量のポリヌクレオチドを得
るために十分なサイクル数が行われる。所望する量は、
変化し、ポリヌクレオチド産物の果たす機能によって決
定される。
【００７８】PCR法は、多くの一時的な配列に対して行
うことができる。例えば、PCRは、各段階の終わりに新
しく試薬を加え、あるいは、予め決めた段階数の後に新
鮮な試薬を加えることにより、全ての試薬を同時に入れ
るような様式で、段階的に行うこともできる。
【００７９】推奨する方法においては、PCR反応は熱安
定性酵素を利用して、自動化された工程として行った。
この工程では、反応混合物は、変性過程、プライマーの
アニーリング過程、および反応過程をサイクルさせられ
る。熱安定性酵素を用いた使用法に特に適合した酵素を
各サイクル毎に加える必要がないので、液体制御システ
ムを持たない装置を用いてもよい。この種の装置は、Pe
rkin Elmer Cetus Corp.から市販されている。
【００８０】PCRによる増幅の後、標的ポリヌクレオチ
ドは、かなりストリンジェントから適切にストリンジェ
ントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、標
的配列と安定にハイブリッドを形成するプローブポリヌ
クレオチドとのハイブリダイゼーションにより検出され
る。もしも、プローブが標的配列と完全に相補的(即
ち、約99％あるいはそれ以上)であると期待できるなら
ば、かなりストリンジェントな条件が用いられる。もし
も、幾らかのミスマッチが予想されるならば、例えば、
プローブが完全に相補的ではない変異株が結果として予
想されるならば、ハイブリダイゼーションのストリンジ
ェンシーは減じられる。しかしながら、条件は非特異的
/偶発的結合の排除を目的に選択される。ハイブリダイ
ゼーションに影響を与える条件、および、非特異的結合
を選別するための条件は公知であり、例えば、Maniatis
らにより(1982)記述されている。一般的に、低い塩濃度
および高温は結合のストリンジェンシーを増す。例え
ば、ストリンジェントな条件とは、約0.1×SSCと、0.1
％SDSを含む溶液中でインキュベートし、約65℃のイン
キュベーション/洗浄温度、適度にストリンジェントな
条件とは、約１から2×SSCと、0.1％SDSで、約50から65
℃のインキュベーション/洗浄温度と考えられている。
低いストリンジェンシー条件は、2×SSCで、約30から50
℃である。
【００８１】HCV標的配列のプローブは、図２３〜４７
に示したHCVのcDNA配列から、あるいは新しいHCV分離株
から、由来したものでよい。HCVプローブは、標的領域
を覆うならば、そしてプライマー部分が排除されている
ならば、そして標的領域と特異的にハイブリダイゼーシ
ョンするならば、如何なる長さでもよい。もしも、完全
な相補性があるならば、すなわち、その株がプローブと
同じ配列を含有するならば、二重鎖はストリンジェント
な条件下でさえ相対的に安定であり、プローブは短くと
も、すなわち約10から30塩基対の長さでも構わない。も
しも、プローブにある程度のミスマッチが予想されるな
らば、すなわち、プローブが変異した領域とハイブリダ
イズすることが疑われるならば、長さはミスマッチの効
果の幾分かを補償する様に考えられているため、プロー
ブはより長くされる。この例は、プローブをHCVの潜在
的な変異株に結合させようと設計した実施例に見られ
る。この場合、プライマーは、HCVゲノムの仮想的な保
存領域に由来したHCV cDNAに結合する様に設計され、標
的領域は潜在的に変異(Flavivirusのモデルに基づく)を
含む部位である。HCV標的配列を検出するために用いた
このプローブは、およそ268塩基対であった。
【００８２】標的配列に相補的なプローブの核酸は、以
前にプライマー配列の合成用に記述したのと同様な技術
を用いて合成できる。所望するならば、プローブはラベ
ルしてもよい。適切なラベルは、以前に記述してある。
【００８３】時として、プローブにより検出された、PC
R産物の長さを決定したいことがある。これは、もし変
異したHCV株が標的領域に欠損を有している場合、ある
いは、PCR産物の長さを確認したいと望む場合に起こ
る。この様な場合、プローブとハイブリダイズすると同
時に、この産物をサイズ分析に付することが望ましい。
核酸のサイズを決定する方法は、公知であり、たとえ
ば、ゲル電気泳動、グラジエント中での沈降、およびゲ
ル排除クロマトグラフィーが含まれる。
【００８４】生物学的試料中の標的配列の存在は、HCV
ポリヌクレオチドプローブとPCR増幅技術にかけたその
核酸とが、ハイブリッドするかどうかを調べることによ
り検出される。プローブと核酸配列との間で形成された
ハイブリッドを検出する方法は、公知である。簡単に
は、たとえば、ラベルしていない試料をそれが結合でき
る固相マトリックスに移し、そして結合した試料をラベ
ルしたプロープと特異的なハイブリダイゼーションが起
こる条件に置き；次に、固相マトリックスにラベルプロ
ーブが存在しているかどうか調べる。あるいは、試料が
ラベルされている場合、未ラベルのプローブはこのマト
リックスに結合し、適切なハイブリダイゼーション条件
下に曝すことで、マトリックスはラベルが存在するかど
うかを試験される。他の適切なハイブリダイゼーション
アッセイについては以前に記述してある。
【００８５】PCRを用いるHCV変異株の配列決定 HCV変異株を同定するために、およびそれによってこれ
らの変異株のプローブを設計するために、上記のHCV/cP
CRの方法がHCVゲノムの変異領域を増幅するのに用いら
れ、それによってこれらの変異した標的領域のヌクレオ
チド配列が決定され得る。一般に、HCVの変異型は、HCV
1株が主(predominant)である地域、例えば、日本、アフ
リカなどの地域とは異なる地域に存在すること；あるい
はウイルスにも感染される異なる脊髄動物種に存在する
ことが予想され得るだろう。HCV変異株は、組織培養系
の継代にも現れ得るし、あるいは突然変異あるいは誘導
された変異の結果として現れ得る。
【００８６】変異した標的領域を増幅するのに、疑わし
い領域をフランキングするように、プライマーが設計さ
れ、好ましくは保存領域に相補的である。HCVの２つの
領域(これらの領域はフラビウイルスモデルに基づき、
おそらく保存されている)に対するプライマーは実施例
に記述される。図２３〜４７に示されるHCV1株の配列の
情報を用いて、これらのプライマーおよびプローブを設
計し得る。
【００８７】標的領域のヌクレオチド配列決定はPCRで
増幅された生成物を直接分析することによって行われ得
る。PCRで増幅された生成物の配列を直接分析する方法
がSaikiら(1988)に記述されている。
【００８８】一方、増幅された標的配列は配列決定の前
にクローンされ得る。酵素的に増幅されたゲノム断片の
直接クローニングおよび配列分析の方法がScharf(1986)
によって述べられた。この方法において、例えば、M13
シークエンシングベクターに直接クローニングできるよ
うに便利な制限酵素の切断部位を与えるため、PCR技術
に用いられるプライマーにはプライマーの５'末端の近
傍に改変される。増幅後、PCR生成物が適切な制限酵素
で開裂される。制限酵素で切断された断片をM13ベクタ
ーに組み込み、そして例えば、JM103宿主に形質転換し
て、プレートにまき、そしてこのように得られたプラー
クがラベルしたオリゴポリヌクレオチドプローブでハイ
ブリダイゼーションによってスクリーニングされる。ク
ローニングおよび配列分析の他の方法は当該分野で公知
である。
【００８９】フラビウイルスのおよびHCVのユニバーサ
ルプライマー HCVのcDNA由来のプローブを用いて、HCVのゲノムの性質
を調べた結果によって、およびHCVのcDNA内に含有され
る配列情報によって、HCVがフラビ様ウイルス(Flavi-li
ke virus)であることが推定される。これらの研究は、
この明細書の譲受人が所有する欧州特許出願公開第318,
216号に記述されている。これの全文は本明細書に援用
されている。HCVのcDNAクローン由来のHCVのcDNA配列と
多数のフラビウイルスの公知の配列との比較から、HCV
が、フラビウイルスの保存配列と相同である配列を含有
することが分かった。これらの保存配列によって、フラ
ビウイルスの標的領域の増幅、およびHCVに適用するの
に、ユニバーサルであり得るプライマーが作製され得
る。これらの配列は、実施例に記述されるプライマーの
３'末端由来の16-merあるいはそれより小さい配列であ
る。次いで、種特異的プローブを用いて、種の同定は達
成される。多数のフラビウイルスのゲノムは当該分野に
公知であり、それらには、例えば、日本脳炎ウイルス(S
umiyoshiら(1987))、黄熱ウイルス(Riceら(1985))、デ
ング２型ウイルス(Hahnら(1988)、デング４型ウイルス
(Mackow(1987))、および西ナイルウイルス(Castleら(19
86))が含まれる。HCV特異的なプローブを用いて、HCVの
RNAの同定は達成され、そしてこの配列が本明細書に提
供されているHCVのcDNAによって決定され得る。
【００９０】一方、コドン縮退(codon degeneracy)のた
めに設計されるプローブであって、そして、フラビウイ
ルスおよびHCVの共通配列（フラビウイルスの公知の配
列とHCVのアミノ酸配列との比較によって決定される）
を含有するプローブのセットの使用は、これらのウイル
スを一般の検出システムで検出され得る。
【００９１】所望のDNA配列の構築 Warner(1984)の方法に従って、自動オリゴヌクレオチド
合成機を用いて、合成オリゴヌクレオチドが調製され得
る。所望ならば、反応の標準の条件下で、32Ｐ-ATPの存
在下で、ポリヌクレオチドキナーゼの処理によって、合
成鎖が32Ｐでラベルされ得る。
【００９２】cDNAライブラリーから単離されたものを含
むDNA配列が、Zoller(1982)に記載の部位特異的突然変
異誘発のような公知の技術によって改変され得る。要す
るに、改変されようとするDNAを単鎖配列として、ファ
ージにパッケージし、そしてプライマー(改変されるDNA
の部分に相補的である合成オリゴヌクレオチドであり、
自分自身の配列内に所望な改変を有する)を用いて、DNA
ポリメラーゼで２重鎖DNAに変換する。このように得ら
れた２重鎖DNAを、ファージを維持できる宿主バクテリ
ウムに形質転換する。ファージの各鎖の複製を含有す
る、形質転換したバクテリアの培養物を寒天にプレート
して、プラークを得る。理論的に、50％の新しいプラー
クは変異した配列を有するプラークを含有し、そして残
りの50％は現型の配列を有する。正しい鎖とハイブリダ
イズするが、改変されない配列とハイブリダイズしない
ようなハイブリダイゼーションの温度および条件下で、
これらのプラークの複製物をラベルした合成プローブと
ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションによって
同定された配列を回収し、クローン化する。
【００９３】HCV由来のポリヌクレオチドをスクリーニ
ングするためのキットHCVのサンプルの増幅および/また
はスクリーニングのための、プローブおよび/またはプ
ライマーであるオリゴマーがキット内にパッケージされ
得る。HCV配列のスクリーニングのためのキットには、
オリゴマーのプローブDNAが含まれる。HCV配列の増幅の
ためのキットには、増幅に用いられるオリゴマーのプラ
イマーが含まれ得る。このキットは通常、特定のハイブ
リダイゼーションおよび/または増幅のプロトコールで
必要とされる、前もって測定したあるいは前もって決め
た量のプローブあるいはプライマーを含有し、そして他
の適切な包装された試薬および材料をも、別々の適当な
容器に入れられていて、含有する。例えば、キットは標
準物、緩衝剤、支持体、酵素、基質、ラベルプローブ、
結合対、および/またはテストを行うための説明書を含
有する。
【００９４】
【実施例】以下、本発明の実施例が述べられている。こ
れらの実施例は本発明について説明するものであって、
本発明を制限するものではない。
【００９５】オーバーラップしているHCVのcDNAクロー
ン13i、26j、CA59a、CA84a、CA156eおよびCA167bの単離
および配列 13i、26j、CA59a、CA84a、CA156eおよびCA167bのこれら
のクローンを、HCVのcDNAを有するラムダ−gt11ライブ
ラリー(ATCC第40394号)から単離した。このライブラリ
ーの調製は、欧州特許出願公開第318,216号(1989年5月3
1日公開)およびWO89/04669(1989年6月1日公開)に記載さ
れている。Huynh(1985)が述べられた方法を用いて、下
記のプローブで、このライブラリーをスクリーニングし
た。それぞれのプローブに対するポジティブのクローン
の検出する頻度は50,000個に約１個であった。
【００９６】クローン12fの配列由来の合成プローブを
用いて、クローン13iを単離した。このプローブの配列
は以下である： 5' GAA CGT TGC GAT CTG GAA GAC AGG GAC AGG 3'
【００９７】クローンK9-1の５'領域由来のプローブを
用いて、クローン26jを単離した。このプローブの配列
は以下である： 5' TAT CAG TTA TGC CAA CGG AAG CGG CCC CGA 3'
【００９８】クローン12fおよびクローンk9-1(K9-1とも
呼ばれる)の単離の方法が欧州特許出願公開第318,216号
に記載されている。これらのクローンの配列は図１およ
び図２〜５それぞれに示されている。クローン13iおよ
び26jのHCVのcDNA配列は図７および図８にそれぞれ示さ
れている。これらの図には、これらの配列にコードされ
るアミノ酸、およびクローン13iのクローン12fとのオー
バーラップ、およびクローン26jのクローン13iとのオー
バーラップも示されている。これらのクローンの配列は
クローンK9-1の配列を確認した。クローンK9-1を別のHC
VのcDNAライブラリーから単離した(欧州特許出願公開第
218,316号参照)。
【００９９】クローン26jの５'領域の配列に基づくプロ
ーブを用いて、クローンCA59aを単離した。このプロー
ブの配列は以下である： 5' CTG GTT AGC AGG GCT TTT CTA TCA CCA CAA 3'
【０１００】クローンCA59aの配列由来のプローブが、
クローンCA84aの単離に用いられた。この単離に用いら
れるプローブの配列は以下である： 5' AAG GTC CTG GTA GTG CTG CTG CTA TTT GCC 3'
【０１０１】クローンCA84aの配列由来のプローブを用
いて、クローンCA156eを単離した。このプローブの配列
は以下のとおりであった。： 5' ACT GGA CGA CGC AAG GTT GCA ATT GCT CTA 3'
【０１０２】クローンCA156eの配列由来のプローブを用
いてクローンCA167bを単離した。このプローブの配列は
以下のとおりであった。： 5' TTC GAC GTC ACA TCG ATC TGC TTG TCG GGA 3'
【０１０３】クローンCA59a、CA84a、CA156e、およびCA
167bにおけるHCV cDNAのヌクレオチド配列は図９、図１
０、図１１、および図１２に、それぞれ示されている。
ここにコードされているアミノ酸、および関連したクロ
ーンの配列を有するオーバーラップもまた、これらの図
に示されている。
【０１０４】「pi」HCV cDNAライブラリーの創製 欧州特許公開第318,216号に記載されているラムダ-gt11
HCV cDNAライブラリーを構築するために用いられる感
染チンパンジーの血漿の同一のバッチから、本質的に同
様の方法を用いて、HCV cDNAのライブラリー、すなわち
「pi」ライブラリーを構築した。しかし、「pi」ライブ
ラリーの構築には、プライマー延長法を用いた。この方
法において、逆転写酵素のプライマーはクローンCA59a
の配列に基づいている。このプライマーの配列は、以下
のとおりである。：5'GGT GAC GTG GGT TTC 3'
【０１０５】クローンpi14aの単離および配列 クローンCA167b(上記を参照のこと)を単離するのに用い
たプローブによる上記の「pi」HCV cDNAライブラリーの
スクリーニングにより、クローンpi14aが得られた。こ
のクローンは、ラムダgt-11 HCV cDNAライブラリー(ATC
C第40394号)から単離されたクローンCA167b、CA156e、C
A84aおよびCA59aとオーバーラップしている約800塩基対
のcDNAを含有している。さらに、pi14aはまた、約250塩
基対のDNAを含有しており、その塩基対は、クローンCA1
67bにおけるHCV cDNAの上流に存在している。
【０１０６】クローンCA216a、CA290aおよびag30aの単
離および配列クローンCA167bの配列に基づいて、以下の
配列を有する合成プローブを製造した。： 5' GGC TTT ACC ACG TCA CCA ATG ATT GCC CTA 3'
【０１０７】上記プローブを、スクリーニングするため
に用い、クローンCA216aを得た。そのHCV配列は図１３
に示されている。
【０１０８】以下の配列を有するクローンCA216aの配列
に基づいて、他のプローブを製造した。： 5' TTT GGG TAA GGT CAT CGA TAC CCT TAC GTG 3'
【０１０９】このプローブでラムダ-gt11ライブラリー
(ATCC第40394号)をスクリーニングすることにより、ク
ローンCA290aが得られた。その中のHCV配列は図１４に
示されている。
【０１１０】パラレルアプローチ(parallel approach)
では、上記のオリジナルのラムダ-gt11 cDNAライブラリ
ーにおいて用いた同様の感染血漿から抽出された核酸を
用いて、プライマー延長cDNAライブラリーを製造した。
用いたプライマーはクローンCA216aおよびCA290aの配列
に基づいていた。： 5' GAA GCC GCA CGT AAG 3'
【０１１１】クローンpi14aおよびk9-1の単離において
用いられるライブラリーの上記で記載された方法と同様
の方法を用いて、このcDNAライブラリーを製造した。こ
のライブラリーをスクリーニングするのに用いたプロー
ブはクローンCA290aの配列に基づいていた。： 5' CCG GCG TAG GTC GCG CAA TTT GGG TAA 3'
【０１１２】クローンag30aを上記のプローブを用いて
新しいライブラリーから単離した。それは、約670塩基
対のHCV配列を含んでいる。図１５〜１７を参照のこ
と。この配列の一部は、クローンCA216aおよびCA290aの
HCV配列とオーバーラップしている。しかし、約300塩基
対のag30a配列は、クローンCA290a由来の配列の上流に
存在する。オーバーラップしていない配列はHCV ORFの
開始を示し得る開始コドン(＊)および終止コドンを示
す。図１５〜１７には以下のものも含まれる：翻訳を制
御する役割を果たし得るコードされた推定される小さい
ペプチド(#)、および推定されるポリペプチドの推定さ
れる最初のアミノ酸(/)、およびその下流でコードされ
たアミノ酸。
【０１１３】クローンCA205aの単離および配列 クローンCA290a(図１４)におけるHCV配列由来の合成プ
ローブを用いて、オリジナルのラムダgt-11ライブラリ
ー(ATCC第40394号)からクローンCA205aを単離した。こ
のプローブの配列は以下のとおりであった。： 5' TCA GAT CGT TGG TGG AGT TTA CTT GTT GCC 3'
【０１１４】図１８に示されるCA205aにおけるHCV cDNA
の配列は、クローンag30aおよびCA290aの両方におけるc
DNA配列とオーバーラップしている。CA290aの配列とオ
ーバーラップしている配列はその配列の上に点線で示さ
れている(この図はまた、この断片においてコードされ
た推定されるアミノ酸を示す)。
【０１１５】クローンCA205aおよびag30aにおけるHCV c
DNA配列から明らかなように、この推定されるHCVポリタ
ンパク質はATG開始コドンで始まると思われる；両クロ
ーンにおけるHCV配列は、このATGから42ヌクレオチド上
流に、フレーム内の連続するダブルストップコドン(TGA
TAG)を含有する。このHCV ORFはこれらの終止コドンの
後で開始し、そして、少なくとも8907ヌクレオチド延長
すると考えられる(図２３〜４７において示されるコン
ポジット(composite) HCV cDNAを参照のこと)。
【０１１６】クローン18gの単離および配列 クローンag30a(図１５〜１７を参照のこと)およびオリ
ジナルのラムダgt-11ライブラリー(ATCC第40394号)由来
のオーバーラップしているクローンの配列に基づいて、
CA230a、すなわち、以下の配列を有する合成プローブを
製造した。： 5' CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA 3'
【０１１７】プローブでオリジナルのラムダ-gt11 HCV
cDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、ク
ローン18gが得られ、そのHCV cDNA配列は図１９に示さ
れている。この図には以下のものもまた示されている：
クローンag30aとのオーバーラップ、およびHCV cDNA中
でコードされた推定されるポリペプチド。
【０１１８】クローン18g(C18gまたは18g)におけるcDNA
は、クローンag30aおよびCA205aにおけるcDNAとオーバ
ーラップしており、そのことは上記で記載されている。
C18gの配列はまた、クローンag30aにおいて見られるダ
ブルストップコドン領域を含む。これらの終止コドンの
上流のポリヌクレオチド領域は、おそらくHCVゲノムの
５'領域の一部を表す。これは、短いORFを有し得、そし
て精製HCVゲノムの直接配列決定法により確認され得
る。これらのコードされた推定される小さいペプチド
は、翻訳において制御する役割を果たし得る。C18gで表
される領域の上流のHCVゲノムの領域は、本質的に欧州
特許公開第318,216号に記載された方法(これは、クロー
ン12fにおけるHCV cDNA配列の上流のcDNA配列を単離す
る方法である。)を用いて、配列決定のために単離され
得る。本質的にC18gの配列に基づく逆転写酵素の小さい
合成オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、そしてHC
VゲノムRNAにおいて相当する配列と結合するために用い
られる。このプライマー配列は既知のC18gの５'末端に
近いが、プライマー配列の上流のプローブ配列の設計を
可能にするのに十分なだけ下流に存在する。周知のプラ
イミング(priming)およびクローニングの標準法が用い
られる。得られたcDNAライブラリーをプライミング部位
の上流の配列でスクリーニングする(C18gの明らかにさ
れた配列から推測される)。NANBHを有する個体由来の血
漿または肝臓のサンプルのいずれかからHCVゲノムRNAを
得る。HCVはフラビ様ウイルスであると考えられるの
で、このゲノムの５'末端は「cap」構造で修飾され得
る。フラビウイルスゲノムが５'末端「cap」構造を含ん
でいるということは知られている。(黄熱病ウイルス、
ライス(Rice)ら、(1988)；デング熱ウイルス、ハーン(H
ahn)ら、(1988)；日本脳炎ウイルス(1987))。
【０１１９】β-HCV cDNAライブラリー由来のクローン
の単離および配列 HCVゲノムの３'末端領域を代表するcDNAを含むクローン
をオリジナルの感染チンパンジー血漿プール(HCV cDNA
ラムダ-gt11ライブラリー(ATCC第40394号)の創製のため
にもちいられ、欧州特許公開第318,216号に記載されて
いる)から構築したcDNAライブラリーから単離した。DNA
ライブラリーを創製するために、血漿から抽出されたRN
Aをポリ(rA)ポリメラーゼを用いてポリrAで付加(taile
d)し、そして、cDNAを逆転写酵素のプライマーとしてオ
リゴ(dT)12 -18を用いて合成した。得られたDNA：cDNAハ
イブリッドをRNAase Hで分解し、そして二本鎖HCV cDNA
に変換した。この得られたHCV cDNAを、本質的にヒュー
ン(Huynh)(1985)において記載された方法を用いて、ラ
ムダ-gt10にクローン化し、β(またはｂ)HCV cDNAライ
ブラリーを得た。用いられた方法は以下のとおりであっ
た。
【０１２０】血漿のアリコート(12ml)をプロティナーゼ
Ｋで処理し、0.05MのトリスCl(pH7.5)、0.05％(v/v)β-
メルカプトエタノール、0.1％(w/v)ヒドロキシキノロ
ン、１mM EDTAで飽和させた同量のフェノールで抽出し
た。得られた水相をフェノール混合物で再抽出し、次い
で、フェノールおよびクロロホルム：イソアミルアルコ
ール(24：１)を１：１で含有する混合物で３回抽出し、
次いで、クロロホルム：イソアミルアルコール(１：１)
で２回抽出した。NaClについて水相を200mMに調製した
後、水相における核酸を−20℃で一晩、2.5容量の冷却
した無水エタノールで沈澱させた。この沈澱物を遠心分
離(10,000RPM、40分間)により集め、20mMのNaClを含有
する70％エタノール、そして100％冷却したエタノール
で洗浄し、デシケーター中で５分間乾燥し、そして、水
で溶解した。
【０１２１】感染チンパンジー血漿プール由来の単離し
た核酸に、ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター(HPR
I)(Amersham Corp.から購入)の存在下でポリ-Aポリメラ
ーゼを用い、担体としてMS2 RNAを用いて、ポリrAを付
加した。２mlの血漿中の核酸と等量の単離された核酸を
TMN(50mMのトリスHCl(pH7.9)、10mMのMgC12、250mMのNa
Cl、2.5mMのMnCl2、２mMのジチオスレイトール(DDT)、4
0マイクロモルのα−[32Ｐ]ATP、20単位のHPRI(Amersha
m Corp.)、および約９から10単位のRNaseを含まないポ
リ-Aポリメラーゼ(BRL)を含有する溶液中でインキュベ
ートした。37℃で10分間、インキュベートを行い、この
反応をEDTAで終了させた(最終濃度約250mM)。この溶液
を同量のフェノール−クロロホルムで抽出し、そして、
同量のクロロホルムで抽出し、そして、核酸を200mMのN
aClの存在下で2.5容量のエタノールで−20℃で一晩、沈
澱させた。
【０１２２】クローンb5aの単離 βHCV cDNAライブラリーを、クローン15e中のHCV cDNA
配列に基づいた配列を有した合成プローブを使用するハ
イブリダイゼーションによってスクリーニングした。ク
ローン15eの単離は、欧州特許公開第318,216号に記載さ
れており、その配列は、図６に示されている。合成プロ
ーブの配列は、以下の通りであった。5' ATT GCG AGA T
CT ACG GGG CCT GCT ACT CCA 3'
【０１２３】ライブラリーのスクリーニングによって、
約1,000個の塩基対のHCV cDNA領域を有するクローンβ-
5a(b5a)が生産された。このcDNAの５'領域は、クローン
35f、19g、26gおよび15eと重複している(これらのクロ
ーンは、前述されている)。
【０１２４】３'末端ポリＡ配列とクローン15eに重複す
る３'配列との間の領域は、約200個の塩基対を含んでい
る。このクローンによって、３'末端配列の領域がHCVゲ
ノムであると同定され得る。
【０１２５】b5aの配列は、クローン16jh(以下に記載さ
れている)中のHCV cDNAの配列内に含まれている。さら
に、配列はまた、オリジナルのλ-gt11ライブラリー(AT
CC第40394号)から単離された、CC34a中に存在してい
る。(オリジナルのλ-gt11ライブラリーは、本願では、
「C」ライブラリーと呼ばれる)。
【０１２６】HCVゲノムの３'領域のPCR増幅によって生
成されたクローンの単離と配列 HCVゲノムの３'領域由来のヌクレオチド配列を有する複
数のcDNAクローンを生成した。これは、以下に記載のよ
うに改変された、Saikiら(1986)およびSaikiら(1988)に
記載のポリメラーゼ連鎖反応技術によって、ゲノムの標
的領域を増幅させることによって成し遂げられた。増幅
されたHCV RNAを、欧州特許公開第318,216号に記載のHC
V cDNAλ-gt11ライブラリー(ATCC第40394号)の生産に使
用されたオリジナルの感染性チンパンジープラズマプー
ルから得た。HCV DNAの単離については、前述した。チ
ンパンジー血清から単離された核酸を核酸基質の代わり
に用いたこと以外は、Sippel(1973)に記載されるよう
に、E.coliポリＡポリメラーゼによって単離されたRNA
の３'末端にATPを付加した。ついで、プライマー−アダ
プターの成分および配列が以下の通りであったこと以外
は、実質的にHan(1987)によって記載されるように、付
加されたRNAを、オリゴdT-プライマーアダプターを使用
して、逆転写酵素によってcDNAに逆転写した。 スタッファー NotI SP6プロモーター プライマー AATTC GCGGCCGC CATACGATTTAGGTGACACTATAGAA T15
【０１２７】得られたcDNAを、２つのプライマーを使用
するPCRによって増幅にかけた。プライマー 配列 JH32 (30mer) ATAGCGGCCGCCCTCGATTGCGAGATCTAC JH11 (20mer) AATTCGGGCGGCCGCCATACGA
【０１２８】JH32プライマーは、66℃の算出されたTm
で、ｃDNA中の標的領域の５'末端にハイブリダイズ可能
な20個のヌクレオチド配列を有していた。JH11は、オリ
ゴdT-プライマーアダプターの一部から由来したもので
あるため、64℃のTmで、cDNAの３'末端に特異的であ
る。両方のプライマーは、増幅されたHCV cDNAの配列ク
ローニングに使用される、５'末端における制限酵素で
ある、NotIのための認識部位を有するように設計され
た。
【０１２９】Perkin Elmer Cetus PCRキット(N801-0043
またはN801-0055)中にある、４つのデオキシリボヌクレ
オシドトリホスフェート、緩衝塩、金属イオン、および
Thermus aquaticus(Taqポリメラーゼ)から単離された熱
安定性DNAポリメラーゼを含む100マイクロリットルの反
応混合液中でcDNAおよびプライマーを懸濁させることに
よって、PCR反応を行った。PCR反応は、Perkin Elmer C
etus DNA熱循環器中で、35サイクル行った。各サイクル
は、94℃における1.5分間の変性工程、60℃における２
分間のアニーリング工程、および72℃における３分間の
プライマー延長工程から構成された。PCR生産物を、ク
ローン15eの３'末端領域の配列に基づいた配列である、
30個のヌクレオチドプローブ、JH34を使用するサザンブ
ロット分析にかけた。JH34の配列は、以下の通りであ
る。 5' CTT GAT CTA CCT CCA ATC ATT CAA AGA CTC 3'
【０１３０】HCV cDNAプローブによって検出されたPCR
生産物のサイズは、約50個から約400個の塩基対の範囲
であった。
【０１３１】増幅されたHCV cDNAをクローン化するため
に、PCR生産物は、NotIで消化されポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法によってサイズをした。300個の塩基対
よりも大きなDNAは、pUC18SのNotI部位にクローン化さ
れた。ベクターpUC18Sは、pUC18のEcoRIとSalI部位との
間にクローン化されたNotIポリリンカーを含ませること
によって構築される。クローンのHCV cDNAの存在を、JH
34プローブを使用して、スクリーニングした。陽性クロ
ーンの数を得て、配列決定した。これらのクローンの１
つである16jh中の、HCV cDNA挿入部のヌクレオチド配
列、およびそこにコードされたアミノ酸を、図２０に示
す。クローン16jhにおけるHCV cDNAの配列中に検出され
たヌクレオチド異変性を、この領域のもう一つのクロー
ンと比較したものを、この図に示す。
【０１３２】クローン6kの単離および配列 クローン16jhおよびクローンb5a(上記を参照)の配列に
基づいて、以下の配列を有する合成プローブを生産し
た。 5' TCT TCA ACT GGG CAG TAA GAA CAA AGC TCA 3'
【０１３３】オリジナルのλ-gt11HCV cDNAライブラリ
ーをプローブを用いて(欧州特許公開第318,216号に記載
されるように)スクリーニングすることによって、106中
約１の頻度でクローンを生産した。これらの一つをクロ
ーン6kと名付け(また、C6kとも名付け)、そのHCV cDNA
配列を図２１中に示す。また、この図に示されているの
は、クローン16jhと重複しているものと、HCV cDNA内に
コードされた推定ポリペプチドである。クローン6k中の
HCV cDNA上の配列情報を、１本鎖のみから得た。クロー
ンが、λgt11 c6kとして名付けられている、寄託された
このクローン情報は、以下に記載している。C6K配列
が、HCV1ポリペプチドをコードするORFの一部であると
いう確認は、他の重複クローンを配列決定することによ
って得られた。
【０１３４】クローンp131jhの単離および配列 HCVゲノムの３'領域からの配列を含み、インフレーム終
止コドンを含むクローンを、実質的に以下に記載される
ように単離した。すなわち、以下のオリゴヌクレオチド
を使用して、HCV1 RNAをcDNAに変換したこと以外は、ゲ
ノムの３'領域のPCR増幅によって生成されたクローンを
単離した。5' AAT TCG CGG CCG CCA TAC GAT TTA GGT G
AC ACT ATA GAA T15 3'
【０１３５】次いで、ｃDNAを、以下のプライマーを使
用して、PCR反応によって増幅させた。 5' TTC GCG GCC GCT ACA GCG GGG GAC ACA T 3' および 5' AAT TCG CGG CCG CCA TAC GA 3'
【０１３６】増幅後、PCR生産物を、スペルミンで沈澱
させ、NotIで消化し、フェノールで抽出した。精製され
た生産物を、pUC18SのNotI部位にクローン化し、HCV陽
性クローンを以下のオリゴヌクレオチドを使用して選択
した。 5' CGA TGA AGG TTG GGG TAA ACA CTC CGG CCT 3'
【０１３７】p131jhとして名付けられた１つのクローン
中のHCV cDNAは、図２２に示される。このクローンは、
HCVゲノム中に含まれる大きなORFのインフレーム終止コ
ドンを含んでいる。
【０１３８】クローン５'-クローン32の単離および配列 クローンb114a中の配列の上流側である、HCVゲノムの
５'領域からの配列を含むクローンを単離し、本願に参
考のために取り入れた米国特許出願第456,637号に記載
される、ゲノムの３'領域のPCR増幅によって生成された
クローン単離と配列のための方法を改変したものによっ
て、ヌクレオチド配列を決定した。一般に、ゲノムの標
的領域を、Saikiら(1986)およびSaikiら(1988)に記載の
PCR法によって増幅させた。増幅されたHCV RNAを、Han
ら(1987)によって記載されるコールドグアニジニウムチ
オシアネート法を使用して、ヒト血清(米国臨床単離
株、HCV27)を抽出することによって得た。抽出されたRN
Aを、HCVゲノムのヌクレオチド−250から−223に相補的
なプライマーJH94を使用して、逆転写酵素を用いて、一
本鎖cDNAに変換した(図２３〜４７を参照)。JH94の配列
は、以下の通りである。 5' CCT GCG GCC GCA CGA CAC TCA TAC TAA 3'
【０１３９】一本鎖から二本鎖HCV cDNAへの変換を、末
端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用し
て、約20から50個のdA残基をDNAに付加(Sambrookら(198
9),MOLECULAR CLONING)、NotI部位およびsp6プロモータ
ーを有する以下のオリゴdTプライマー−アダプターを使
用して、この付加された分子を複製することによって成
し遂げた。 スタッファー NotI SP6プロモーター プライマー AATTC GCGGCCGC CATACGATTTAGGTGACACTATAGAA T15
【０１４０】得られたcDNAを、JH94(上記に記載されて
いる)および以下の配列を有しているJH11の２つのプラ
イマーを使用して、PCRによって増幅にかけた。プライマー 配列 JH11(20mer) AATTCGGGCGGCCGCCATACGA
【０１４１】Perkin Elmer Cetus PCRキット(N801-0043
またはN801-0055)中にある、４つのデオキシリボヌクレ
オシドトリホスフェート、緩衝塩、金属イオン、および
Thermus aquaticus(Taqポリメラーゼ)から単離された熱
安定性DNAポリメラーゼを含む100マイクロリットルの反
応混合液中でcDNAおよびプライマーを懸濁させることに
よって、PCR反応を行った。PCR反応は、Perkin Elmer C
etus DNA熱循環器中で、35サイクル行った。各サイクル
は、94℃における1.5分間の変性工程、60℃における２
分間のアニーリング工程、および72℃における３分間の
プライマー延長工程から構成された。
【０１４２】PCR生産物を、NotIで消化し、pUC185にク
ローン化した。HCVヌクレオチド配列を含むクローン
を、以下の配列を有する、HCV1ゲノムのヌクレオチド−
312から−283由来のプローブであるAlex90でスクリーニ
ングすることによって得た。 5' ACC ATG AAT CAC TCC CCT GTG AGG AAC TAC 3'
【０１４３】単離されたクローン中のHCV cDNAを、ジデ
オキシチェーンターミネーション法(Sangerら(1977))に
よって配列決定した。単離されたクローンの１つである
５'-クローン32中のHCV cDNAの配列は、図２３〜４７の
ヌクレオチド−224から−341までの領域に至っている。
【０１４４】HCV cDNAのヌクレオチド配列を分析する
と、HCV RNAストランドの複製物が、安定したヘアピン
構造を形成し得るGCが豊富な配列を含んでいるのが示さ
れた。
【０１４５】
【化１０】
【０１４６】この構造において、ダッシュ線は、相補的
なヌクレオチド間の可能な水素結合を示す。
【０１４７】コンピューターデータベースである遺伝子
バンク(Genebank)をサーチして、相同な配列が、既知の
ウイルス配列には見られないことが示された。従って、
この配列は、HCVゲノムの５'末端に特有のものであり得
る。
【０１４８】ヘアピン構造は、転写酵素の認識信号とし
ての役割を果たし得、および/または５'末端におけるRN
Aの安定性に貢献し得る。
【０１４９】編集されたHCV cDNA配列 本願および欧州特許公開第318,216号に記載の様々なHCV
cDNAライブラリー由来の一連の重複クローンから、HCV
cDNAを編集した。図２３〜４７が由来するところのク
ローンは、5'-32、b114a、18g、ag30a、CA205a、CA290
a、CA216a、pi14a、CA167b、CA156e、CA84a、CA59a、K9
-1(またK9-1とも名付けられている)、26j、13i、12f、1
4i、11b、7f、7e、8h、33c、40b、37b、35、36、81、3
2、33b、25c、14c、8f、33f、33g、39c、35f、19g、26
g、15e、b5a、16jh、C6kおよびp131jhである。これらの
クローンの単離方法および配列は、本願および本願に参
考のために取り入れられた欧州特許公開第318,216号に
記載されている。図２３〜４７において、配列の上にあ
る３つのダッシュは、推定開始メチオニンコドンの位置
を示す。
【０１５０】クローンb114aが、クローン18g(すなわ
ち、5'-CA)における配列の上流側にさらに２つヌクレオ
チドを含んでいること以外は、クローンb114aは、クロ
ーン18g、ag30aおよびCA205aと重複している。これらの
余分な二つのヌクレオチドは、図２３〜４７に示される
ように、HCVゲノム配列中に含まれている。
【０１５１】上記に記載のクローンのいくつかは、オリ
ジナルのHCV cDNAλ-gt11 Cライブラリー(ATCC第40394
号)以外のライブラリーから得られたが、これらのクロ
ーンは、オリジナルのライブラリー中のHCV cDNA配列と
重複するHCV cDNA配列を含んでいる。従って、実質的に
すべてのHCV配列が、第１HCV cDNAクローン(5-1-1)を単
離するのに使用されたオリジナルのλ-gt11 Cライブラ
リー(ATCC第40394号)から抽出できる。クローン5-1-1の
単離については、本願で参考のために取り入れた欧州特
許公開第318,216号に記載されている。
【０１５２】HCV cDNAの複合体(composite)中にコード
された主要なHCVポリタンパク質の推定配列をまた示
す。この配列中の第１アミノ酸は、大きなORFの推定開
始メチオニンである。クローナル不均一性による、変異
アミノ酸は、配列の上に示されている。λgt11ライブラ
リーは、１つの個体から得られた血清から生産された
(欧州特許公開第318,216号)ため、この結果は、変異型
ウイルス配列(ヌクレオチドおよびアミノ酸)が、この個
体中に存在していることを示唆している。
【０１５３】複合(composite)HCV cDNA配列を調べる
と、大きなORFの他に、ポリタンパク質をコードする配
列の上流側に、多数のORFが存在し、ポリタンパク質を
コードする配列内においては、他の２つの翻訳フレーム
中に多数の小さなORFが存在していることが示される。H
CVポリタンパク質の上流側にあるORFは、表１に示され
ている。
【０１５４】
【表１】
【０１５５】ポリタンパク質の推定イニシエータMETを
コード化する配列より下流側のORFのリーディングフレ
ーム、位置およびサイズを表２に示す。主要なポリタン
パク質はリーディングフレーム２から翻訳されるもので
ある。
【０１５６】
【表２】
【０１５７】上記に加えて、HCV RNAのゲノムストラン
ドと相補する配列の試験もまたいくつかの小さなORFを
含有する。HCV RNA配列の−341から＋837のヌクレオチ
ドと相補するこれらORFの１つは、385アミノ酸のポリペ
プチドをコード化する。
【０１５８】異なる地理的場所からのHCV単離株から得
られる５'領域の配列の比較 米国(HCV18、HCV27)、イタリア(HCVI1、HCVI24)および
韓国(HCVK1)のそれぞれからのHCV単離株の５'領域から
のヌクレオチド配列を比較した。
【０１５９】HCV cDNA配列の単離は、以下の点を除いて
は、本質的には上述の５'クローン32の単離に対してと
同様に行われた。HCVヌクレオチド−90から−73および3
66から383にそれぞれ相補するJH51またはr16のいずれか
をプライマーとして使用して、抽出されたRNAをcDNAへ
と逆転写した。これらのプライマーの配列は以下の通り
である。 プライマー 配列 JH51 5' CCC AAC ACT ACT CGG CTA 3' r16 5' CAC GTA AGG GTA TCG ATG 3'
【０１６０】HCV dsDNAの増幅は、５'および３'プライ
マーとしてそれぞれJH93およびJH52を使用してPCR方法
により行なわれた。JH92におけるHCV配列は−317から−
296のHCVヌクレオチド由来であり、JH52における配列は
−93から−117のHCVヌクレオチドに由来する。ヌクレオ
チド番号は配列の下の括弧内に示す。JH52では下線を引
いたジヌクレオチドが突然変異してNotIサイトを生成し
た。これらのプライマーの配列は以下の通りである。 (プライマー) スタッファー NotI HCV配列 (JH93) 5' TTC GCGGCCGC ACTCCATGAATCACTCCCC 3' (-317) (-296) (JH52) 5' AGTCTT GCGGCCGC ACGCCCAAATC 3' (-93) (-117)
【０１６１】増幅の後、PCR生成物はNotIにより分裂しp
UC18Sへとクローン化された。HCV cDNAは、PCRによる増
幅のあと直接配列決定により、またはクローン化された
HCVcDNAがプライマーの延長およびジデオキシ法により
配列決定された。配列決定のプライマーの延長およびジ
デオキシ法は、上述の５'クローン32に対してと同様に
行われた。
【０１６２】直接配列決定のためのPCR法は５'プライマ
ーとしてAlex90(上記の該配列について参照)を使用し、
また３'プライマーとしてr25を使用した。Alex90は−31
2から−283のHCVヌクレオチドに由来し、r25は365から3
42のヌクレオチドに由来する(図２３〜４７参照)。r25
の配列は以下の通りである。 5' ACC TTA CCC AAA TTG CGC GAC CTA 3'
【０１６３】HCV27、HCVK1、HCVI1、HCVI24、およびHCV
18の５'領域の配列と、プロトタイプHCV、HCV1の配列と
の比較は以下のことを示した。試験された５'領域は５
つのHCV単離株の間に高度に保存される。配列は、HCVI2
4の位置−171で削除された１つのヌクレオチド、および
単離株HCVK1の位置−222から−219の４個のヌクレオチ
ドが不明瞭である以外は同じであるように見えた。
【０１６４】この領域での高レベルの配列保持はウイル
スの複製および/または転写および/または翻訳における
この領域の役割を反映し得る。
【０１６５】異なる個体からのHCV単離株における配列
変異 CDC/HCV1から逸脱する配列を含むHCVの単離株がヒトの
個体において同定された。これらのいくつかは抗C100-3
抗体に対して血清学的にポジティブであった(EC10は抗
体に対してネガティブであった)。これらの新しい単離
株の同定は、CDC/HCV1配列を使用するPCR法により増幅
されたHCVゲノムのクローン化および配列決定セグメン
トにより行われた。増幅は本質的にはHCV/cPCR法に基づ
いて行われた。この方法は本明細書にて述べたHCV cDNA
に基づいてプライマーおよびプローブを使用する。この
方法の第１段階は、逆転転写酵素を使用してcDNAをHCV
ゲノムまたはその複製中間物のいずれかへと合成するこ
とである。HCV cDNAの合成後、および増幅の前にサンプ
ルのRNAは当該分野において既知の方法により減退され
る。HCV cDNAの特定のセグメントは次に適切なプライマ
ーを使用して増幅される。増幅された配列はクローン化
され、増幅した配列を含むクローンが、プライマーの間
に存在するがプライマーとは重複しない配列に相補する
プローブにより探知される。
【０１６６】米国のヒトから単離されたHCV単離株 HCVビリオンの源として使用された血液サンプルがノー
スカロライナ州シャーロットの米国赤十字社およびミズ
ーリ州カンサスシティのCommunity Blood Center of Ka
nsasから得られた。サンプルは、欧州特許公開第318,21
6号にて述べられているELISAアッセイを使用してHCV C1
00-3抗原に対する抗体を求めてスクリーニングされ、ま
たポリクローナルヤギ抗ヒトHRPを使用して相補するWes
ternブロット分析を行って抗HCV抗体を測定した。それ
ぞれ米国赤十字社およびCommunity Blood Center of Ka
nsasからの２つのサンプル、#23および#27がこれらのア
ッセイによりHCVポジティブであると決定された。
【０１６７】これらのサンプルの血清中に存在するウイ
ルス粒子が、Bradleyら(1985)の述べた条件の下で超遠
心分離法により単離された。10マイクログラム/mlのプ
ロティナーゼＫおよび0.l％のSDSという最終濃度でプロ
ティナーゼＫおよびSDSによる消化によりRNAが粒子から
抽出された。消化は37℃で１時間の間行われた。ウイル
スRNAは、欧州特許公開第318,216号にて述べられている
ようにクロロホルム−フェノールによる抽出によりさら
に精製された。
【０１６８】RNAの調製においてHCV RNAはcDNA配列1958
〜1939に対応し、また次の配列をもつオリゴヌクレオチ
ドJHC7が逆転写酵素の反応のためのプライマーとして使
用されたということ以外は、本質的には欧州特許公開第
318,216号にて述べられているように、cDNAへと逆転写
された。 JHC7： CCA GCG GTG GCC TGG TAT TG
【０１６９】cDNAの両ストランドが合成された後、結果
として得られたcDNAは次に、使用したオリゴヌクレオチ
ドプライマー、すなわちJHC6およびALX80が、673から17
51のCDC/HCV1ヌクレオチドからのHCVゲノムの1080ヌク
レオチドセグメントを増幅するように設計されていると
いう点以外は、本質的にはPCR増幅により生成されたク
ローンの単離に対して上述したPCR法により増幅され
た。さらに、プライマーはPCR生成物の３'末端でNOTI制
限サイトを、および５'終端でブラント末端を組み込む
ように設計されている。プライマーの配列は次の通りで
ある。 ALX80： TTT GGG TAA GGT CAT CGA TAC CCT TAC GTG および JHC6： ATA TGC GGC CGC CTT CCG TTG GCA TAA
【０１７０】ALX80はCDC/HCV1配列のヌクレオチド673〜
702に対応する。JHC6はHCV1のヌクレオチド1752〜1738
に対応する。(さらにNotIサイトをコード化する12個の
余分のヌクレオチドがある)。JHC6におけるヌクレオチ
ドの命名、すなわち下降番号はアンチセンス鎖における
配置を示している。
【０１７１】PCRの上述のプライマーとの増幅の後、ブ
ラントエンドテルミヌスは次のようにNOTIサイトに変換
された。15DgSのホモポリマーテイルが最後のデオキシ
ヌクレオチド転写酵素を使用してPCR生成品に接着さ
れ、この生成品はJHC6およびJHC13をプライマーとして
使用してPCRにより再び増幅された。下記の配列をもつ
後者のプライマー、JHC13は、SP6ファージプロモータに
加えてNOTIサイトを含有するように設計されている。(S
P6プロモータについてはJ.Setlow編のGENETIC ENGINEER
ING(1988)に述べられている。) JHC13： AAT TCG CGG CCG CCA TAC GAT TTA GGT GAC ACT ATA GAA CCC CCC CCC CCC CCC
【０１７２】増幅されたHCV cDNAをクローン化するため
に、PCR生成品がNotIにより分裂され、スペルミンによ
り沈澱して遊離オリゴヌクレオチドを除去(Hoopesら(19
81))、次いでpUC18SのNotIサイトヘとクローン化された
(第IV.A.34参照)。各HCV単離株に由来する３個のクロー
ンにおけるHCV cDNAに対して配列分析が行われた。分析
は本質的にはChenおよびSeeburg(1985)により述べられ
た方法により行われた。
【０１７３】サンプル23および27においてHCVに由来す
るクローンのコンセンサス配列をそれぞれ図７４、およ
び図７５および７６に示す。これらの図には、コンセン
サス配列においてコード化されたアミノ酸と同様、変異
配列もまた示されている。
【０１７４】図６７〜６９および図７０は、サンプル2
3、27およびHCV1の整合したポジティブストランドのヌ
クレオチド配列(図６７〜６９)および推定のアミノ酸配
列(図７０)の比較を示す。図６７〜６９のHCV1のアミノ
酸配列は、HCVゲノムRNAの中の大きなORFによりコード
化されたHCVポリタンパクのアミノ酸番号129〜467を表
わす。図７４、および図７５および７６の試験は３個の
単離クローンの配列において変異が存在することを示
す。ヌクレオチドレベルおよびアミノ酸レベルでの配列
変異を表３にて要約する。表３において、ＳおよびNS1
と命名されたポリペプチドはそれぞれアミノ酸番号130
から約380、および380から約470を表す。番号付けは推
定イニシエータメチオニンからのものである。Ｓおよび
NS1という用語はFlavivirusモデルを使用してポリペプ
チドをコード化する配列の位置決めに基づくものであ
る。しかし上述のように、ウイルスのポリペプチド領
域、特に推定のE/NS1領域に関してはHCVとFlavivirusと
の間には全体的な相関関係はないことが最近明らかとな
っている。実際には、HCVポリペプチドおよびそれらの
コーディング領域はFlavivirusモデルからの実質的な由
来を示し得る。
【０１７５】
【表３】
【０１７６】新たに単離されたHCV配列においては変異
は存在しないが、サンプル23および27(HCV23およびHCV2
7と呼ばれる)からクローン化された配列はそれぞれ1019
ヌクレオチドを含有し、選択されたクローンにおけるこ
の領域の削除および追加ミュータントの欠如を示してい
る。図６７〜６９および図７０における配列はまた単離
配列がこの領域で再配列されていないことを示す。
【０１７７】HCV1のための同意配列とHCVのその他の単
離株のための同意配列との比較を上の表に要約する。チ
ンパンジーの単離HCV1とヒトから単離されたHCVとの間
の配列変異は、ヒト起源のHCVの間に見られるものとほ
とんど同じであった。
【０１７８】２つの推定領域における配列変異が均一で
はないということは興味深い。推定Ｓ領域における配列
は比較的一定しているように見え、領域を通じて不規則
に分散されている。これに対して、推定NS1領域は全体
の配列より変異程度が高く、変異は推定ポリタンパク質
の推定N-テルミヌスから約70個のアミノ酸だけ下流に位
置する約28個よりなる高可変ポケット内にあるように見
える。
【０１７９】探知された変異は、増幅プロセスの間に導
入されたと論じられ得るが、変異のすべてはこの結果か
らであるとは思われない。Taqポリメラーゼがサイクル
当りのDNAテンプレート10キロベース当り約１ベースで
配列にエラーを導入することが概算されている(Saikiら
(1988))。この概算に基づけば、1019bp DNAフラグメン
トのPCR増幅の間に最大７個のエラーが導入されたであ
ろうことになる。しかし、HCV-23およびHCV-27の３個の
サブクローンはそれぞれ29および14のベース変異を生じ
た。次のことはこれらの変異が自然に発生することを示
唆する。ベース変化の約60％はアミノ酸配列を変化させ
ない静かな突然変異である。Taqポリメラーゼにより導
入された変異は無作為に起こることが予想される。しか
し結果は、変異配列が少なくとも１つの特定の領域に密
集する。さらに、PCR増幅生成品から由来する多数の異
なるクローンを配列決定することにより、コンセンサス
配列が由来する。
【０１８０】イタリアおよび米国に於けるヒトからのHC
V分離株 異なった分離株に存在するHCV RNAのセグメントはHCV/c
PCR法により拡大された。これらのセグメントは推定HCV
ポリタンパク質のメチオニンコード開始コドンから下流
の〜0.6kbから〜1.6kbの領域を作り出す。分離株はHCV
感染の個体から得られる生物学的標本からのものであ
る。より詳細には、分離株HCT#18は米国に於ける個体の
ヒトプラズマから、EC1およびEC10はイタリアの患者の
肝臓の生検から、そしてThはアメリカ人の患者の末梢血
単核球分画からのものである。HCV RNAの比較できるセ
グメントはチンパンジーから単離された。
【０１８１】RNAはヒトプラズマの標本からフェノー
ル：クロロホルム：イソアミルアルコール抽出液を使用
して抽出された。0.1mlまたは0.01mlのプラズマを10か
ら40μg/mlのポリアデニル酸を含むTENB/プロテアーゼ
Ｋ/SDS溶液(0.05Mトリス-HCL(pH8.0)、0.001M EDTA、0.
1M NaCl、１mg/mlプロテアーゼＫ、および0.5％SDS)で
最終容量の1.0mlに希釈し、37℃で60分間培養した。こ
のプロテアーゼＫの消化の後、得られたプラズマ分画を
TE(50mMトリス-HCl(pH8.0)、１mM EDTA)飽和フェノール
で、pH6.5で抽出することによって除タンパクした。フ
ェノール相を遠心分離によって分離し、0.1％SDSを含む
TENBで再抽出した。得られた各抽出からの水相を集め、
等容量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコー
ル/［１：１(99：１)］で二度抽出し、次いで等容量の
クロロホルム/イソアミルアルコールの99：１混合液で
二度抽出した。遠心分離により相分離をし、水相を0.2M
酢酸ナトリウムの最終濃度にし、二容量のエタノールを
加えて核酸を沈澱させた。沈澱した核酸をSW41 38Kのロ
ーター中で４℃で60分間超遠心分離により、または10K
のマイクロフェージ中で４℃で10分間超遠心分離した。
【０１８２】肝臓の生検から抽出されたRNAが、Ospedal
e Maggiore di S. Giovanni Battista, Torino, Italy
のF. Bonino博士により提供された。
【０１８３】単核球分画がメーカーの指示を用いてFico
ll-PaqueTM(ファルマシア社)を通して得られる個体の血
の部分標本の沈澱によって得られた。全RNAを分画から
欧州特許公開第318,216号(Chooら(1989)をも参照)に記
載のグアニジンチオシアネート法を用いて抽出した。サ
ンプルからのHCV cDNAの合成を逆転写酵素と、クローン
156eおよびクローンK91由来のプライマーを使用して行
った。ゲノムRNAに相対的なアンチセンスであるこれら
のプライマーは次の様な配列を有する。 156e16B： 5' CGA CAA GAA AGA CAG A 3'、 および K91/16B 5' CGT TGG CAT AAC TGA T 3'。
【０１８４】エタノール沈澱に続いて沈澱したRNAまた
は核酸分画を乾燥し、DEPC処理された希釈水中に再懸濁
した。核酸中の二次構造を65℃で10分間加熱して壊し、
そのサンプルを直ちに氷上で冷却した。cDNAを１から３
μgの肝臓から全RNA、または10から100μlのプラズマか
ら抽出された核酸(またはRNA)を使用して合成した。そ
の合成には逆転写酵素が用いられ、メーカーにより特定
されたプロトコールのBRLを用いて25μlの反応であっ
た。cDNA合成のためのすべての反応混合物はRNAase阻害
剤、RNASIN(Fisher/Promega)の23単位を含んでいた。cD
NA合成に続いて、その反応混合物を水で希釈し、10分間
ボイルし、そして速やかに氷上で冷却した。
【０１８５】各サンプルは２周のPCR増幅を受けた。反
応のためのプライマーを「EnvL」および「EnvR」と示さ
れた領域を増幅するために選択した。「EnvL」領域はヌ
クレオチド669〜1243、および推定アミノ酸117〜308を
包含しており；「EnvR」領域はヌクレオチド1215〜1629
を包含し、推定アミノ酸300〜408(推定アミノ酸は推定
メチオニン開始コドンから始めて番号づけられる)をコ
ードする。これらの領域のHCV cDNAにコードされた推定
ポリタンパク質に対する相対的な関係、そしてFlavirus
モデルにコードされたポリペプチドに対する相対的な関
係を図７７に示す。
【０１８６】第１ラウンドのPCR反応のためのプライマ
ーはクローンag30a、クローン156e、またはクローンK9-
1のいずれかのHCV cDNA配列から誘導された。EnvL領域
の増幅のために用いられるプライマーは156e16B(上出
の)、およびセンス鎖のためのag30a16Aであった；EnvR
の増幅にはプライマーK91/16B(上出の)が使用され、セ
ンス鎖のためには156e16aが用いられた。センス鎖プラ
イマーの配列は次の様である。 For EnvR, ag30a16A: 5' CTC TAT GGC AAT GAG G 3' および For Envr, 156e16A: 5' AGC TTC GAC GTC ACA T 3'。
【０１８７】PCR反応は、１μgのRNaseAを加えること以
外は本質的にメーカーの指示(Cetus-Perkin-Elmer)に従
って行われた。反応は最終容量が100μlになるように行
われた。PCRを、94℃(１分)、37℃(２分)、および72℃
(３分)、そして最終サイクルの72℃では７分間延長する
方式を利用して30サイクル行った。次いで、サンプルを
フェノール：クロロホルムで抽出し、エタノールで２回
沈澱させ、10mMトリス塩酸中にpH8.0で再懸濁させ、Cen
tricon-30(Amicon)濾過を用いて濃縮した。この方法は
効率的に30ヌクレチドより小さなオリゴヌクレオチドを
除去する；このようにして、PCR増幅の第１ラウンドか
らのプライマーを除去する。
【０１８８】Centricon-30で濃縮されたサンプルは、次
いで、EnvL領域のためにクローン202aおよび156eから、
そしてEnvR領域のために156eおよび59aから設けられた
プローブを用いるPCR増幅の第２ラウンドにかけられ
た。EnvL領域の増幅のためのプライマーは次の様な配列
を有する。 および
【０１８９】ヒト由来のRNAのEnvR領域の増幅のための
プライマーは次の様な配列を有する。 および
【０１９０】PCRによる増幅は、94℃(１分)、60℃(１
分)、および72℃(２分)で、最後のサイクルでは72℃で
７分間延長する方式を用いた35サイクルであった。その
サンプルを、次いで、フェノール：クロロホルムで抽出
し、２回沈澱させ、そしてEcoRIで消化した。PCR反応生
成物を６％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動により生
成物を分析した。ほぼ推定された大きさの期待されたPC
R生成物のDNAがゲルから電気溶出され、pGEM-4プラスミ
ドベクターまたはλgt11のいずれかにサブクローンされ
た。増幅の第一ラウンドの後、EnvLおよびEnvRに期待さ
れる生成物の大きさはそれぞれ615bpおよび683bpであ
り；増幅の第二ラウンドの後、EnvLおよびEnvRに期待さ
れる生成物の大きさはそれぞれ414bpおよび575bpであ
る。増幅された生成物を含むプラスミドを宿主細胞を形
質転換するために用いた；pGEM-4プラスミドをDH5-アル
ファを形質転換するために使用し、λgt11をc600デルタ
-HFLを形質転換するために使用した。適当なHCVプロー
ブ(以下に記述される)にハイブリダイズするかまたは正
しい大きさの挿入物を有するプローブにハイブリダイズ
した形質転換された細胞のクローンを選択した。次い
で、挿入物をM13にクローンし、配列した。
【０１９１】すべてのHCV/cPCR生成物のためのプローブ
は、HCV cDNAの32Ｐラベル化セクションから成り、この
cDNAはクローン216(プライマーとしてCA216a16Aおよび2
16a16Bを使用する)、およびクローン84(プライマーとし
てCA84a16AおよびCA84a16BまたはCA84a16cを使用する)
の領域のPCR増幅によって調製された；32Ｐはニッケル
翻訳によりPCR生成物の中に導入された。EnvL増幅の第
一および第二ラウンドのプローブはクローン216からの
ものであった。EnvR増幅の第一ラウンドのためのプロー
ブは84(すなわち、CA84a16AおよびCA84a16B)からのもの
であり、EnvL増幅の第二ラウンドのためのプローブはCA
84a16AおよびCA84a16Cであった。これらのプローブはHC
V/cPCR反応に用いられるプライマーとオーバーラップし
なかった。プローブのPCR増幅のためのプライマー配列
は表４のようである。
【０１９２】
【表４】
【０１９３】EnvL領域の変位体(Variants)についての配
列情報はHCT#18からの３クローン、THからの２クロー
ン、EC1からの３クローンから得られ、そして前出の欧
州特許公開第318,216号に記載のHCV1クローンから得ら
れた。図７８〜８０には、これらのクローン由来の各々
の分離株の複合のヌクレオチド配列の比較が示されてい
る。この図では、各配列がEnvL領域のセンス鎖のために
５'から３'に示され、そしてその配列が並べられてい
る。垂直線および大文字は配列相同性を示し、線がなく
て大文字化されていない文字は相同性がないことを示し
ている。
【０１９４】線で示されている配列は次の様である： 線１，Thorn；線２，EC1；線３，HCT#18；線４，HCV1。
【０１９５】EnvR領域の変位体についての配列情報はEC
10の２つのクローンから、そして前出の欧州特許公開第
318,216号に記載されているHCV1クローンから得られ
た。二つのEC10クローンは一つのヌクレオチドだけ異な
っていた。図８１に、EC10(クローン２)のヌクレオチド
配列と複合物のHCV1配列との比較が示されている：各々
の配列をEnvR領域のセンス鎖に対して５'から３'と示さ
れており、その配列が並べられている。配列間のタブル
ドットは配列相同性を示している。
【０１９６】EnvL(アミノ酸#117〜308)にコードされた
アミノ酸配列と各々の単離株のEnvR領域(アミノ酸#300
〜438)との比較が図８２および図８３にそれぞれ示され
ている。これらの図に前述の分離株JH23およびJH27の配
列が含まれている。日本人の分離株からの配列もまた示
されている；これらの配列は日本のT.Miyamuraによって
提供された。図には、その領域のアミノ酸がHCV1に対し
てそっくりそのまま与えられており、種々の分離株の非
相同アミノ酸が示されている。
【０１９７】図８２からわかるように、EnvL領域ではHC
V1と他の分離株との間に全体でおよそ93％の相同性があ
る。HCT18、Th、およびEC1はHCV1とおよそ97％の相同性
があり；JH23およびJH27はHCV1と、それぞれおよそ96％
および95％の相同性を有する。図８３はEnvR領域の相同
性がEnvL領域よりも有意に少なくて；さらに、一つの副
領域は超可変性(すなわちアミノ酸383〜405から)のよう
に見える。このデータを表５に要約する。
【０１９８】
【表５】
【０１９９】ポジティブおよびネガティブストランドの
検出 血清中の５'HCV RNA 血清から単離された、HCV27のRNAは、PCR法を用いてポ
ジティブおよびネガティブストランドの存在について分
析した。PCR法については、次の事柄を除いて、基本的
に上述のように実施した。抽出したHCV27 RNAは、Alex9
0またはJH52(配列については前出参照)をプライマーと
して用いて、一本鎖cDNAに逆転写した。Alex90の配列は
HCV RNAのポジティブストランドの−312から−283位の
ヌクレオチドに一致している。これに対して、JH52は、
ネガティブストランドの−117から−93位のヌクレオチ
ドに一致している。得られた一本鎖HCV cDNAは、各々Al
ex90およびJH52を用いたPCRにより増幅を行った。増幅
された生産物はAlex89をプローブとしてサザンブロッテ
ィングにより行われた。Alex89はHCV RNAの−203から−
175位のヌクレオチドに一致する。Alex89の配列は次の
とおりである。 5' CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA 3'
【０２００】この方法によると、分析により、RNAの両
ストランドの増幅生産物のシグナルは同等の強度を有す
ることが示された。このことにより、HCVのRNAの５'領
域は二本鎖RNAとして存在し得ることが示唆された。
【０２０１】HCVのサンドイッチハイブリダイゼーショ
ンのためのプローブ 本実施例は、米国特許第4,868,105号に記載の分析方法
を基本的に用いて生物学的試料中のHCV RNAを検出する
のに有用な一対のラベルおよびカプチャープローブを例
示する。この方法は、溶液相サンドイッチハイブリダイ
ゼーションアッセイであり、このアッセイにおいては、
分析物である核酸において標的の配列にハイブリダイズ
する、カプチャーおよびラベルプローブを用いる。生物
学的試料のスクリーニングにおいて使用されたプローブ
は、HCVゲノムの保存領域(conserved regions)に結合
し、HCV結合領域はHCVゲノムに対するユニーク性につい
て選択される。カプチャープローブの結合パートナーに
結合する領域、またはラベル部分(あるいは、欧州特許
公開第317,077号に開示の方法が用いられるのであれ
ば、増幅多量体)に結合するラベルプローブの部分は、
次のように選択される。つまり、それらはデータバンク
またはHCVの既知の配列のいずれにも結合しないよう
に、そしてそれらは選択条件下において、それらの相補
体と安定な二本鎖を形成するようにＧおよびＣの適切な
量を有するように選択される。カプチャーおよびラベル
プローブはセットであり、一組のプローブは他の組のプ
ローブに変化を与えない。これらのプローブは、図２３
〜４７に示されるプロトタイプHCV cDNA配列のコード鎖
の中の表６〜表８中のヌクレオチド配列に相補的な配列
を含む。
【０２０２】
【表６】
【０２０３】
【表７】
【０２０４】
【表８】
【０２０５】上記表中のセットにおいて、各々のカプチ
ャープローブは、HCV配列に相補的な配列に加えて、次
の配列をHCV配列の下流(つまり、３'末端)に有する： 5' CTT CTT TGG AGA AAG TGG TG 3'
【０２０６】各々のカプチャープローブに共通の配列は
結合パートナーの配列に相補的であり、従って、ハイブ
リダイゼーションの後、二本鎖は固相に固定することに
より捕捉され得る。
【０２０７】各セットにおいてまた、各ラベルプローブ
はHCV配列の相補的な配列に加えて、次の配列をHCV配列
の下流に有する： 5' TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC 3'
【０２０８】欧州特許公開第317,007号に記載の方法が
用いられる場合には、各ラベルプローブに共通の配列
は、多量体(multimer)の配列に相補的であり、この多量
体とのハイブリッド二本鎖の形成を可能とする。
【０２０９】上記セット中のプローブの配列を図４８〜
５０に示す。
【０２１０】PCR増幅を用いたHCVポリヌクレオチド配列
の検出 cPCRによるHCV RNAの増幅の一般化された方法におい
て、RNA鎖はビリオンまたはmRNA鎖であり、これは「セ
ンス」鎖である。しかし、中間体の複製型がまた、「ア
ンチセンス」であるとして検出されることも可能であ
る。この場合には、プライマーが「センス」である。標
的領域を含むRNAセンス鎖がアンチセンスプライマーと
ハイブリダイズし、このアンチセンスプライマーは、標
的を含む複製ストランドの合成をプライムする。RNA鋳
型に対するcDNAは、プライマーおよび鋳型依存性逆転写
酵素を用いて合成される。得られたRNA：cDNAハイブリ
ッドのcDNAは変性およびRNAseによる処理により放出さ
れる。プライマーはcDNAにアニールし、プライマーおよ
び鋳型依存DNAポリメラーゼにより伸長する。生産物は
変性され、プライマーに再びアニールされ、２回目の合
成が続けられる。標的領域を含む増幅された生産物が所
望の量(これは少なくとも検知し得るレベルである)に達
するまで、何度も繰り返して行われる。
【０２１１】NANBHを有するチンパンジー由来の肝臓お
よび血漿標品におけるHCV核酸配列由来の、増幅されたH
CV核酸配列の検出 NANBHを有するチンパンジーの肝臓および血漿に存在
し、コントロールのチンパンジーには存在しないHCV核
酸は、基本的にSaikiら(1986)に記載されたポリメラー
ゼ連鎖反応により増幅された。プライマーオリゴヌクレ
オチドは、クローン81(図５２)、またはクローン36(図
５３)およびクローン37b(図５４)中のHCV cDNA配列に由
来する。増幅された配列は、ゲル電気泳動および改変さ
れたサザンブロッティング法を用いて決定された。この
方法においては、２つのプライマー間の配列であってプ
ライマーを含まない配列により適当なcDNAオリゴマーま
たはニック翻訳されたcDNA配列をプローブすることによ
り、決定された。
【０２１２】増幅システムにより調べられるHCV配列を
含むRNAのサンプルが、NANBHを有する３匹のチンパンジ
ーおよび２匹のコントロールのチンパンジーの肝臓生検
材料から単離された、poly A+ RNAフラクションの単離
は、Maniatisら(1982)に記載のグアニジンチオシアネー
ト法により行われた。
【０２１３】増幅システムにより調べられたRNAのサン
プルはまた、NANBHを有する２匹のチンパンジーおよび
一匹のコントロールのチンパンジー、さらにコントロー
ルのチンパンジーの血漿のプールから単離された、一匹
の感染したチンパンジーは106CID/ml以上の力価を有
し、もう一匹の感染したチンパンジーは105CID/ml以上
の力価を有していた。
【０２１４】核酸を血漿から次のように抽出した。0.1m
lまたは0.01mlの血漿を、10μg/mlのポリアデニル酸を
含むTENB/プロティナーゼＫ/SDS溶液(0.05MトリスHCl、
pH8.0、0.001M EDTA、0.1M NaCl、１mg/mlプロティナー
ゼＫ、および0.5％SDS)で希釈して、最終容量を1.0mlと
して、37℃で60分間インキュベートした。このプロティ
ナーゼＫでの消化の後、得られた血漿画分は、TE(10.0m
MトリスHCl、pH8.0、１mM EDTA)で飽和したフェノール
により抽出することにより除タンパクを行った。フェノ
ール相を遠心分離により分離し、0.1％SDSを含むTENBで
再抽出した。各抽出物から得られた水相をプールし、等
量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール
［１：１(99：１)］で抽出し、次いでクロロホルム/イ
ソアミルアルコールの99：１の混合物等量により２度抽
出した。遠心分離による相分離に続き、水相を酢酸ナト
リウムが0.2Mの濃度となるようにし、そしてエタノール
２倍容量を加えて核酸を沈澱させた。沈澱した核酸はSW
41ローターを用い、38Kで４℃にて60分間超遠心分離に
より回収した。
【０２１５】上記に加えて、高力価のチンパンジー血漿
およびプールされたコントロール血漿を、それぞれ、Ch
omcyzskiおよびSacchi(1987)の方法により50μgのポリ
Ａキャリアを用いて抽出した。この方法においては、酸
性グアニジンチオシアネート抽出(acid guanidinium th
iocyanate extraction)を用いる。RNAを、10,000RPMで
４℃にて10分間、エッペンドルフマイクロチューブによ
り遠心分離することにより回収した。
【０２１６】２つの場合において、PCR反応にてcDNAの
合成に先立ち、プロティナーゼＫ/SDS/フェノール法に
より血漿から抽出された核酸は、さらに、ＳおよびS El
utip-Rカラムに結合および溶出させることにより精製さ
れる。製造者の指示による方法が、それに続いて行われ
る。
【０２１７】PCR反応に鋳型として用いられるcDNAは、
上記のようにして調製された核酸(総核酸またはRNA)由
来である。エタノール沈澱に続き、沈澱した核酸を乾燥
し、DEPC処理された蒸留水に再懸濁する。核酸の２次構
造を、65℃で10分間加熱することにより破壊し、サンプ
ルを直ちに氷上で冷却した。チンパンジーの肝臓由来、
または10〜100μlの血漿から抽出した核酸(またはRNA)
由来の、チンパンジーの総RNA１〜３μgを用いて合成さ
れた。合成には逆転写酵素を用い、製造業者であるBRL
により決められたプロトコルにより25μlで反応を行っ
た。cDNAの合成に用いたプライマーはまた、PCR反応に
用いたそれである。cDNA合成のためのすべての反応混合
物は、RNAaseインヒビター、RNASINTM(Fisher/Promega)
23単位を含有していた。cDNAの合成に続き、反応混合物
を水で希釈し、10分間煮沸し、そして、速やかに氷上で
冷却した。
【０２１８】PCR反応は、RNaseAを１μg加えたことを除
いては、基本的には製造業者であるCetus-Perkin-Elmer
の指示書に従って行った。反応は、最終容量100μlで行
った。PCR反応は37℃(２分)、72℃(３分)および94℃(１
分)で35サイクル行った。
【０２１９】cDNA合成のためのプライマーおよびPCR反
応のためのプライマーはクローン81、クローン36または
クローン37bのHCV cDNA配列に由来していた。(クローン
81、36および37bのHCV cDNAの配列を、各々図５２、図
５３および図５４にそれぞれ示す。)クローン81由来の
２種の16量体の配列は次のとおりである。 5' CAA TCA TAC CTG ACA G 3' および 5' GAT AAC CTC TGC CTG A 3'
【０２２０】クローン36由来のプライマーの配列は次の
とおりである： 5' GCA TGT CAT GAT GTA T 3'
【０２２１】クローン37b由来のプライマーの配列は次
のとおりである： 5' ACA ATA CGT GTG TCA C 3'
【０２２２】PCR反応において、プライマー対を、クロ
ーン81由来の２つの16-mer、またはクローン36由来の16
-merおよびクローン37b由来の16-merから構成した。
【０２２３】PCR反応生産物を、アルカリゲル電気泳動
法による生産物の分離に次いで、サザンブロットおよび
プライマーに重複しないHCV cDNAの領域由来の32Ｐでラ
ベルされた内部オリゴヌクレオチドプローブで、増幅さ
れたHCV-cDNA配列を検出することによって分析した。PC
R反応混合液を、フェノール/クロロホルムで抽出し、核
酸を塩およびエタノールを用いて水溶相から沈澱させ
た。沈澱させた核酸を、遠心分離によって収集し、蒸留
水中に溶解させた。サンプルの一部を、1.8％のアルカ
リアガロースゲル上で電気泳動にかけた。長さが60、10
8および161のヌクレオチドの一本鎖DNAを、分子量マー
カーとしてゲル上で共電気泳動にかけた。電気泳動の
後、ゲル中のDNAを、Biorad Zeta ProbeTM紙上に移し
た。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼ
ーション、ならびに洗浄条件は、製造業者(Biorad)によ
って規定されたものであった。
【０２２４】増幅されたHCV cDNA配列のハイブリダイゼ
ーション検出に使用されたプローブは、以下の通りであ
った。一対のPCRプライマーをクローン81から得たと
き、プローブは、２つのプライマーの配列間の領域中に
配置されている配列に対応する配列を有する108-merで
あった。一対のPCRプライマーをクローン36および37bか
ら得たとき、プローブは、そのヌクレオチド配列が図６
２および６３に示されるクローン35由来のニックトラン
スレートされたHCV cDNAインサートであった。プライマ
ーを、クローン37bインサートのヌクレオチド155〜170
およびクローン36インサートのヌクレオチド206〜268か
ら得る。クローン35中のHCV cDNAインサートの３'末端
は、クローン36中のインサートのヌクレオチド１〜186
に重複し、クローン35インサートの５'末端は、クロー
ン37b中のインサートのヌクレオチド207〜269に重複す
る。(図５３、図６２および６３、および図５４を比較
すること)。従って、クローン35中のcDNAインサート
は、クローン36および37b由来のプライマーの配列間の
領域の一部に延長し、これらのプライマーを含む増幅さ
れた配列のプローブとして有用である。
【０２２５】肝臓検体からのRNAの分析は、プライマー
およびプローブの両方を使用して、上記の手法に従っ
た。NANBHを有する３匹のチンパンジーの肝臓からのRNA
は、予想されたサイズ(81および36および37bのそれぞれ
に対する161および586のヌクレオチド)の増幅配列に対
して陽性のハイブリダイゼーション結果を生み出したの
に対して、対照群のチンパンジーは、陰性のハイブリダ
イゼーション結果を生み出した。実験を３回繰り返す
と、同一の結果が得られた。
【０２２６】核酸およびプラズマからのRNAの分析はま
た、プライマーおよびクローン81からのプローブを使用
して、上記の手法に従った。プラズマは、NANBHを有す
る２匹のチンパンジー、対照群のチンパンジーおよび対
照群のチンパンジーからプールされたプラズマから得
た。NANBHプラズマの両方は、PCR増幅されたアッセイに
おいて陽性の結果を生み出したのに対して、対照群のプ
ラズマの両方は、陰性の結果を生み出した。これらの結
果は、繰り返して何度も得られた。
【０２２７】欠陥ウイルスは、RNAウイルス中に発生す
ることが知られている。PCR技術を使用することによっ
て、HCVゲノムの配列を増幅させるためにプライマーを
設計することが可能である。増幅された生産物を分析す
ることによって、ウイルスゲノムの欠陥および野生型の
ウイルス種の両方を同定することが可能であると予想さ
れる。従って、既知のHCV配列に基づいて２つのプライ
マーを使用すると、PCR生産物の予想サイズが正確に予
想され得る。ゲル電気泳動法およびハイブリダイゼーシ
ョン分析によって観察された大きな種はいずれも、潜在
的に異型のゲノムを示し得た。あるいは、このように観
察された小さな種のいずれもが、欠陥作用因を示し得
た。これらの型の分析は、それが本当に野生型ウイルス
配列であるかまたは欠陥ゲノムであるか、既知のHCV配
列の正確な起源を確認するのに有用であり得る。これら
の分析の技術および方法は、当該技術分野において既知
であり、前述されている。この方法によって、当業者
は、ウイルスゲノムの関連した(野生または欠陥)型を得
ることが可能となる。
【０２２８】PCRで増幅されたときにクローン81の由来
のHCV cDNAと雑種形成する、捕捉粒子の配列の検出 捕捉粒子のRNAは下記のようにして得た。クローン81由
来のHCV cDNAと雑種成形する配列の分析は、雑種形成プ
ローブが、クローン81のcDNA配列由来のキナーゼ処理を
行ったオリゴヌクレオチドであることを除いて、先に述
べたのと同様のPCR増幅法を利用して実施した。試験結
果は、増幅された配列が、HCV cDNAプローブと雑種形成
したことを示している。
【０２２９】粒子は、クローン5-1-1にコードされてい
るポリペプチドに対する免疫精製抗体でコードされたポ
リスチレンビーズを用いて、HCVを感染させたチンパン
ジーの血漿から捕捉された。免疫精製された抗体の製剤
の製造方法は、本願出願人が権利を有する欧州特許公開
第318,216号に記載されているが、この特許出願は本願
に援用するものとする。簡単に述べれば、クローン5-1-
1内にクローン化されたHCVポリペプチドは、スーパーオ
キシドジムスターゼ(SOD)によって融合ポリペプチドと
して発現された。これは、クローン5-1-1 cDNA挿入断片
を発現ベクターpSODcf1にサブクローン化することによ
って行った(Steimerらの1986年の文献)。pSODcf1から単
離したDNAをBamIとEcoRIで処理し、これら制限酵素によ
って生成した線状DNAに下記のリンカーを連結させた。 5' GAT CCT GGA ATT CTG ATA AGA CCT TAA GAC TAT TTT AA 3'
【０２３０】クローン化した後、上記挿入断片を含有す
るプラスミドを単離した。この挿入断片を含有するプラ
スミドをEcoRIで切断した。クローン5-1-1中のHCV cDNA
挿入断片をEcoRIで切取り、上記のEcoRIで線状にしたDN
Aに連結させた。得られたDNA混合物を用いて、イーコリ
(E.Coli)菌株D1210(Sadlerらの1980年の文献)を形質転
換させた。ORFを発現するのに正しい配向の5-1-1 cDNA
を有する組換え体を、制限地図を作成し、ヌクレオチド
の配列を決定することによって同定した。１つのクロー
ン由来の組換え体細菌を、IFTGの存在下、増殖させるこ
とによって、SOD-NANB5-1-1ポリペプチドを発現するよ
う誘導した。生成した融合ポリペプチドを、細胞抽出液
を尿素で分画抽出し次いでアニオン交換カラムとカチオ
ン交換カラムのクロマトグラフィを行うことによって、
組換え体イー・コリから精製した。精製されたSOD-NANB
5-1-1ポリペプチドをニトロセルロース膜に結合させ
た。HCV感染血漿の試料中の抗体を、前記のマトリック
スに結合させたポリペプチドに吸収させた。洗浄して、
非特異的に結合した物質と未結合の物質を除去した後、
結合した抗体を結合したポリペプチドから放出させた。
【０２３１】NANBHを有する個体由来の肝臓と血清中のH
CV RNAを検出するcPCR法 HCVの感染を検出する、PCR検定法すなわちcPCR検定法の
改変法の信頼性と有用性を、感染個体由来の全肝臓RNA
と血漿について検定することによって試験した。cPCR検
定法では、試料中の推定ウイルスRNAは、逆転写酵素に
よってcDNAに逆転写され、得られたcDNAのセグメント
は、次に、Saikiらの1986年の文献に記載されたPCR法の
改変法を利用して増幅される。このcPCR法のプライマー
は、HCV RNAから誘導され、本願発明で提供されるHCV c
DNAのファミリーによって同定することができる。HCV-R
NAに対応する増幅生成物は本願発明のファミリー由来で
提供されるHCV cDNAのプローブを利用して検定される。
【０２３２】これらの試験に用いられるcPCR/HCV検定法
は、次のような方法を使って行った。すなわち、RNAを
製造し、得られたRNAをcDNAに逆転写し、得られたcDNA
の特異的セグメントをPCRで増幅し、次いでPCR産生物を
分析する方法である。
【０２３３】RNAは、Maniatisらの1982年の文献に記載
されている、全RNAの製造法のグアニジウムイソシアネ
ート法を利用して肝臓から抽出した。
【０２３４】血漿から全RNAを単離するために、血漿をT
ENS［0.1M NaCL、50mMトリス-HCl(pH8.0)，１mM EDTA］
で５倍〜10倍希釈し、プロティナーゼＫ/SDS溶液(0.5％
のSDS、１mg/mlのプロティナーゼ、20μg/mlのポリＡキ
ャリアー)中で37℃にて60〜90分間インキュベートし
た。得られた試料をフェノール(pH6.5)で１回抽出し、
生成した有機相を、0.1％SDS含有TENSで１回再抽出し、
両抽出の水性相をプールして、同容積のフェノール/CHC
l3/イソアミルアルコール［１：１(99：１)］で２回抽
出した。生成した水性相を同容積のCHCl3/イソアミルア
ルコール(99：１)で２回抽出し、0.2M酢酸ナトリウム(p
H6.5)と2.5倍容積の100％エタノールを使用してエタノ
ール沈澱を行い、20℃で一夜沈澱させた。
【０２３５】PCR反応の鋳型として用いられるcDNAは、
対応するcDNAを製造するための指定の試料を利用して製
造した。各RNA試料(2μgの熱変性させた全チンパンジー
肝臓RNA、2μlの血漿由来のRNAまたは10mm×4mmの円筒
形のヒト肝臓生検品から抽出したRNAを100％含有してい
る)を、１μMの各プライマー、１mMの各デオキシリボヌ
クレオチド３リン酸(dNTP)，50mMトリス-HCl(pH8.3)，5
mM MgCl2、5mMジチオトレイトール(DTT)、73mM KCl、40
単位のRNアーゼ阻害剤(RNASiN)および５単位のAMV逆転
写酵素を含有する25μlの反応物中でインキュベートし
た。このインキュベーションは、37℃で60分間行った。
cDNAの合成に続いて、得られた反応混合物を、50μlの
脱イオン水(DIW)で希釈し、10分間沸騰させてから氷上
で冷却した。
【０２３６】HCV cDNAのセグメントの増幅は、２つの合
成オリゴマーすなわち、HCV cDNAクローン36(アンチセ
ンスクローン)と同クローン37b(センスクローン)由来の
配列を有する16マーのプライマーを利用して行った。
【０２３７】クローン36由来のプライマーの配列は、 5' GCA TGT CAT GAT GTA T 3'であり、クローン37b由来
のプライマーの配列は、 5' ACA ATA CGT GTG TCA C 3'であった。
【０２３８】これらのプライマーは、各々１mMの最終の
濃度で使用した。プライマーが隣接しているHCV cDNAの
セグメントを増幅するために、cDNA試料を、0.1μgのRN
アーゼAと、Perkin Elmer Cetus PCRキット(N801-0043
もしくはN801-0055)のPCR反応物質とともに、このメー
カーの説明書に従って、インキュベートした。PCR反応
は、Perkin Elmer Cetus DNA Thermal cycler中で30サ
イクルまたは60サイクル行った。各サイクルは、94℃で
１分間の変性工程、37℃で２分間のアニール工程および
72℃で３分間の伸長工程で構成されている。しかし最終
サイクル(30もしくは60サイクル)は、３分間ではなくて
７分間にした。増幅後、試料を、同容積のフェノール：
クロロホルム(１：１)で抽出し、次に同容量のクロロホ
ルムで抽出し、得られた試料を0.2Mの酢酸ナトリウムを
含有するエタノールで沈澱させた。
【０２３９】CPCR生成物は次のようにして分析した。生
成物を、Murakawaらの1988年の文献に記載されている方
法に従って、1.8％のアルカリ性アガロースゲル上で電
気泳動させ、ゲルを0.4M NaOH中で一夜ブロットさせる
ことによって、ゼータTMプローブ紙(BioRad Corp.社)に
転移させた。得られたブロットを２×SSC(１×SSCは0.1
5M NaClと0.015Mクエン酸ナトリウムを含有している)で
中和し、0.3M NaCl、15mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.
8)、15mM EDTA、1.0％SDS、0.5％脱脂牛乳(Carnation C
o.社)、および0.5mg/mlの音波処理を行った変性サケ精
子DNAを含有する液中で予備雑種形成を行った。HCV cDN
A断片について分析すべきブロットを、欧州特許公開第3
18,216号に記載されている。クローン35のHCV cDNA挿入
断片配列のニックトランスレーションによって作成し
た、32Ｐでラベルを受けたプローブと雑種形成させた。
雑種形成を行った後、ブロットを0.1×SSC(１×SSCは0.
15MのNaClと0.01Mのクエン酸ナトリウムを含有してい
る)中で65℃にて洗浄し、乾燥し、オートラジオグラフ
にかけた。予想生成物の大きさは長さが586ヌクレオチ
ドであり、プローブと雑種形成し、この大きさの範囲で
ゲル中に移動する生成物は、ウイルスRNAに対して陽性
であった。
【０２４０】対照として、α-1抗トリプシンmRNAを増幅
するよう設計されたcPCRプライマーを、各被分析試料中
にRNAが存在することを確認するために用いた。α-1抗
トリプシン遺伝子のコーディング領域は、Rosenbergら
の1984年の文献に記載されている。α-1抗トリプシン遺
伝子のコーディング領域の365ヌクレオチドの断片を増
幅するように設計された合成オリゴマーの16マープライ
マーは、ヌクレオチド22〜37(センス)およびヌクレオチ
ド372〜387(アンチセンス)から誘導した。cDNA/PCRプラ
イマーの配列の間に存在してその配列を含有せず、ニッ
クトランスレーションを行い、32Ｐでラベルをつけたプ
ローブを用いて、PCR産生物を検出した。
【０２４１】PCR反応は高度に感受性なために、全試料
について少なくとも３回試験した。次のような注意、す
なわち、１)ゴム製Ｏリング密閉具を備えた、ねじぶた
付きチューブを用いてエーロゾルをなくし、２)使い捨
てピストン/キャピラリーを有するRanin MicromanTM容
量ピペットでピペット採取し、および３)非隣接cDNAク
ローンから、cDNAとPCRプライマーのオリゴヌクレオチ
ド配列を選択することによって、すべての偽陽性がなく
なった。
【０２４２】cPCR法により肝臓サンプルのＣ型肝炎ウイ
ルスHCV RNAの検出 実験的に非Ａ非Ｂウイルス性肝炎因子に感染させたチン
パンジー３頭の肝臓および、慢性非Ａ非Ｂウイルス性肝
炎と診断されたイタリア人患者の肝臓生検から分離した
総RNAのcPCR検定を実施した。
【０２４３】図５５Ａは、肝臓総RNAの各標本から１μg
を用いたcPCR検定の結果を表している。このRNAは、非
Ａ非Ｂウイルス性肝炎慢性期のチンパンジー１頭(910)
(レーン１)および、感染急性期のチンパンジー２頭(102
8および508)(それぞれレーン２および３)の肝臓サンプ
ルから分離したものである。30サイクル用レーン１〜３
のサンプルについてPCRを実施し、これらのレーンを含
むプロットのオートラジオグラムを５時間曝露した。急
性感染動物1028(レーン４)および非感染チンパンジー３
頭(レーン５〜７)の総RNA １μgから得られたcDNAを60
サイクル用に増幅し、これらのレーンを含むオートラジ
オグラムを７日間曝露した。32ＰラべルしたMspI-同化p
BR322 DNAをオートラジオグラム全てのマーカーとして
用いた。結果からわかるように、HCV RNAに相当するcDN
Aは、急性・慢性を問わず、非Ａ非Ｂウイルス性肝炎チ
ンパンジーのサンプルにのみ認められた(レーン１、
３、４)。これらのレーンにおけるcPCR産物は527から62
2ヌクレオチドまでのマーカーフラグメントを移動した
(表示せず)。
【０２４４】図５５Ｂは、慢性非Ａ非Ｂウイルス性肝炎
患者15例の10mm×４mmの肝臓生検シリンダーから抽出し
たRNAの10％を使用して検定したcPCRの結果を表すもの
で(レーン１〜15)、１症例は細胞発生性肝臓疾患患者
(レーン16)、もう１症例は慢性Ｂ型肝炎患者のコントロ
ールサンプル(レーン17)である。PCRによる増幅は30サ
イクル用とし、ブロット用オートラジオグラムはレーン
１の15時間曝露を除き、４日間曝露した。結果からわか
るように、ヒトサンプルの9/15(60％)はHCV RNA陽性で
あった(レーン１，２，４，６，７，10〜13)。細胞発生
性肝臓疾患と診断された１症例(レーン16)および慢性HB
V感染患者１症例(レーン17)はcPCR検定を繰り返しても
陰性であった。
【０２４５】ヒト肝臓生検のHCV/cPCR検定とHCV C100-3
ポリペプチドを用いた血清のラジオイムノアッセイとの
比較 SOD/HCV C100-3ポリペプチド(C100とも呼ぶ)は、ウイル
スのアミノ酸363個を含む組み換え型融合ポリペプチド
である。本ペプチドはHCVに対する抗体の検出に有用で
ある(Kuoら(1989)参照)。C100の調製法はB.P.O 318,216
号公報に記述されている。
【０２４６】上記肝臓サンプルのHCV/PCR検定を行った
患者と同じ患者17例から採取した血清について、C100を
使用したラジオイムノアッセイを実施した。肝臓生検と
同じ日に血清を採取した。一般に所有され、参考文献に
よりここに組み込まれているB.P.O 318,216号公報の記
述に本質的に従って検定した。簡潔に言うと、Microtit
erプレート(Immunol 2, Removeawell Strips)を0.1μg
の純粋なC100でコーティングした。コーティングしたプ
レートを、血清サンプル(１：100希釈液100μl)または
適切なコントロールと共に37℃で１時間インキュベート
した。インキュベート後、非結合物質を除去し、このプ
レートを洗浄してから125Ｉラベルしたヒツジ抗ヒト免
疫グロブリンとインキュベートしてヒト抗体-C100複合
体を検出した。結合していないラベルした抗体を吸引で
除去し、プレートを洗浄した。ウェルごとの放射能を測
定した。
【０２４７】イムノラジオアッセイの結果から、これら
のサンプルの67パーセットが抗C100抗体陽性であった。
細胞発生性肝臓疾患と診断された患者の血清は抗C100抗
体陽性であったが、本症例の肝臓サンプル中のウイルス
RNAレベルは検出不可能であった。抗C100抗体の存在とH
CV RNAとの相関水準は70％であった。ラジオイムノアッ
セイで抗体陰性であった症例の肝臓HCV RNAレベルは有
意であった(データは示さず)。
【０２４８】循環性抗C100抗体を有する患者の肝臓には
往々にしてウイルスが存在していることをこの結果は示
しており、抗C100抗体の存在がHCV被曝を正確に表すこ
とが確証により明白である。さらに、これらを組み合わ
せると、本研究の症例では、このタイプのHCVが非Ａ非
Ｂウイルス性肝炎の少なくとも75％の原因であり、イタ
リアで優勢のHCV菌株が合衆国で流行するHCV菌株と密接
な関係があると考えられる。
【０２４９】血清のHCV/cPCR検定：チンパンジーにおけ
る急性期感染症のウイルスRNAの検出 肝障害の発症、HCV RNAの存在、抗HCV抗体の存在との間
の一般的な関係を、実験的に非Ａ非Ｂウイルス性肝炎を
感染させたチンパンジー２頭の血清でモニターした(No.
771および910)。アラニンアミノトランスフェラーゼ(al
anine amino transferase；ALT)レベルにより肝障害を
測定し、また上述のHCV cPCR検定でHCV RNAの存在を決
定し、さらに抗HCV抗体はC100ラジオイムノアッセイを
用いて検出した。
【０２５０】チンパンジーの血漿１μgから抽出したRNA
のHCV/cPCR分析を実施した。注射後25、32、70、88日に
チンパンジー771から血清を採取し、30サイクル用cPCR
を実施してオートラジオグラムを18日間曝露した。注射
後11、28、67日にチンパンジー910から血清を採取し、6
0サイクル用cPCRを実施してオートラジオグラムを５日
間曝露した。
【０２５１】アッセイの結果は、チンパンジー771は、
図５６Ａに、そしてチンパンジー910については図５６
Ｂに示している。図５６Ａと図５６Ｂとの比較から、急
性肝炎間の初期のよく特徴づけられたALT値は、感染し
た個体中のウイルスRNAの存在に相関するようである。
【０２５２】データは、HCVのRNAの存在をも示唆してお
り、そのことは抗HCV抗体の存在に先立つウイルス血症
の状態を示している。チンパンジー771(図５６Ａ)は、2
8日目に輸血後のNANBHのはっきり特徴づけられた急性の
症状を示す。これは、ALTレベルの初期のピークに特徴
的である。HCVのRNAは、25日目および32日目に集められ
た血清中に検出された。しかしながら、この急性の時期
に、抗HCV抗体は、存在しない。反対に、70日目のHCVの
RNAは、実験で検出するレベルを下回っていた。そして
抗HCV抗体は上昇していた。88日目に、HCVのRNAは検出
されないままで、一方抗HCV抗体は、70日目の値より有
意に上昇していた。
【０２５３】チンパンジー910の血清から得られた結果
は、パターンとだいたい同様であったが、感染によって
誘導されたHCV抗体の時間は、疾病の急性の時期では検
出されず、少なくとも67日目まで伸びた。11日目にRIA
によって検出された抗HCV抗体は、動物の接種に用いた
プラズマ由来の抗体で個体910を受動免疫したことによ
った。抗HCV抗体は、感染の後期の慢性期のチンパンジ
ー910の血清に見いだされた(データは示さない)。
【０２５４】慢性のNANBHにかかっている個体由来のプ
ラズマ中の低いALT値は、必ずしも弱いウイルスの生産
と相関しているわけではない。接種後２年から３年およ
び１年半にわたって、チンパンジー910から取った17の
異なるプラズマ試料のプールのALTレベルおよびHCVのRN
Aをモニターした。試料のALT値は45mU/mlを越えず、力
価研究は、HCVの高い力価を示した(3×106CID/ml)。cPC
Rは、30サイクル行い、そしてオートラジオグラムを15
時間でとった。cPCR分析で、ウイルスRNAの存在がはっ
きりと示された(データは示していない)。
【０２５５】血清のHCV/cPCRアッセイ：ヒトの急性期の
感染でのウイルスRNAの発見 早期の急性NANBHの間収集された人の外科患者からの血
清が、それぞれHCV/cPCRアッセイおよびC100-RIAを利用
して、HCV RNAおよび抗HCV抗体を試験した。
【０２５６】HCV/cPCRアッセイは、その患者からの１マ
イクロリッターの血漿を用いて行われ、そして、知られ
た血統の４人から行われた。cPCRは13回行われ、そし
て、ハイブリダイゼーションと洗浄の後、オートラジオ
グラムが８時間曝露された。
【０２５７】感染の急性期の間、外科患者から収集され
た血清は高い値のウイルスRNAを含み、そして抗HCV抗体
はC100-RIAによって検出されなかった結果を示した(デ
ータは現在示されない)。(外科患者からの急性期の血漿
は、NANBH感染試薬の高い力価を有していることが知ら
れた。［106.5CID/ml、フェインストーン(Feinstone)ら
により決定された(1981)：フェインストーン(Feinston
e)ら(1981)])。しかしながら、この患者は感染後ほぼ９
カ月、C100/RIAにより抗HCV抗体にセロ変換されたこと
は注意すべきである。
【０２５８】人制御血漿の血統からの血清は、HCV/cPCR
アッセイとC100-RIAに対してともに否定的であった。
【０２５９】HCV/cPCRアッセイの感度 HCV/cPCRアッセイの感度は、既知の力価の血清の10倍連
続希釈の分析によって決定された。チンパンジーの血漿
は〜３×105CIDの力価を持っていた。そしてRNAはその
血漿１マイクロリッターの10倍希釈から抽出されたcPCR
は30回なされた。そしてハイブリダイゼーションと洗浄
の後、オートラジオグラムが15時間曝露された。300、3
0および３倍のHCVのCIDゲノム増幅から得られたcPCR生
成物は、図５９のコース１〜３に示す。
【０２６０】コース１と２は２時間曝露されたオートグ
ラムに検知されたものである。
【０２６１】感染されたHCVの力価の平均は、ほぼ100と
10,000CID/ml血清の間であるので、このデータはHCV/cP
CRアッセイは臨床的に有用であると思われる。
【０２６２】種々のHCV株のためのHCV/cPCRアッセイ オリゴマー44-merのセットとオリゴマー45-merのセット
からなるプライマーはHCV株を増幅するために設計され
た。その株は図２３〜４７の中のcDNA配列が導かれてい
るHCVから分離されたHCVに類似または同一である。
【０２６３】これらのプライマーの設計の土台となる前
提は、我々の発見であり、HCVはフラビ様(Flavi-like)
ウイルスである。
【０２６４】フラビウイルス科ファミリーのメンバー
は、HCVと比較されるとき、二つの主に保存されたアミ
ノ酸配列セットを有する。それはTATPPGとQRRGRであ
り、これらのウイルスのNS3の中にある。他の少量のセ
ットのいくつかは、例えば、推定上のNS5領域中のGDOで
ある。他のセットは既知のアミノ酸配列のHCVとの比較
によって決定される。この情報はいくつかのフラビウイ
ルス科のメンバーの配列から推論される。そのフラビウ
イルス科は、日本脳炎ウイルス(Sumiyoshiら(1987))、
黄熱ウイルス(Riceら(1985))、デング熱２型ウイルス(M
ackow(1987))、および西ナイルウイルス(Castleら(198
6))らによって開示されている。変換されたアミノ酸配
列とコドン利用は表９にある。
【０２６５】
【表９】
【０２６６】注：プライマー配列の３'末端におけるヌ
クレオチド縮退性の数を最低限にし、上記に示した保存
されたアミノ酸をコードする可能なヌクレオチド配列ま
たはその相補体のいずれかに、正確に適合する、それぞ
れのプライマーの３'末端におけるヌクレオチド数を最
高にするように、プライマー配列を選択した。
【０２６７】44-merおよび45-merのオリゴマープライマ
ーは、これらのアミノ酸をコードした配列がプライマー
内に組み込まれるように明示された。さらに、それら
は、それぞれのプライマーの３'末端における縮退を含
有し、クローン40b(図５８参照)に存在し、HCVの推定NS
3をコードする領域から誘導されるHCVゲノムの異なった
２つの領域から誘導される。組になったオリゴヌクレオ
チドプライマーの配列式は、XがA、T、GまたはCの時、 5' GAC TGC GGG GGC GAG ACT GGT TGT GCT CGC ACC GCC ACC CCX CC 3' であり、YがTまたはCの時 5' TCT GTA GAT GCC TGG CTT CCC CCT GCC AGT CCT GCC CCG ACT YTG 3' である。
【０２６８】HCV/cPCRアッセイが、チンパンジー910プ
ラズマにおけるHCV RNAを増幅するために、これらのプ
ライマーを用いて実施された。アッセイ方法は、オリゴ
マープライマーの44-merおよび45-merの組が、クローン
36およびクローン37bより誘導されたプライマーに代換
される以外は、本質的に前述部分で説明した通りであ
る。加えて、増幅されたHCV cDNAの検出がクローン40a
から誘導されたプローブとのハイブリッド形成によって
行われ、その配列は図６０に示されている。
【０２６９】該プローブは、前述のPCR法を用いて、ク
ローン40aのセグメントを増幅することによって準備さ
れ、18-merのプライマーは以下の配列を含有していた。 5' GAG ACA TCT CAT CTT CTG 3' と 5' GAG CGT GAT TGT CTC AAT 3'
【０２７０】増幅の後、プローブの準備はニックトラン
スレーションにより32Ｐでラベルされた。
【０２７１】図６１は、クローン40aから誘導された配
列でプローブされたサザンブロットの放射線写真を示し
ている。32ＰでラベルされたMspI消化pBR322 DNAの断片
がマーカーとして使われた(レーン１)。これらのプライ
マーを用いて増幅した結果のPCR産物の予想される大き
さは、490ヌクレオチド(nt)である。複製反応がレーン
２および３に示されている。
【０２７２】HCVの５'領域における変形の分析 フラビウイルスモデルに基づいて、クローンag30aおよ
びk9-1に標本された領域に隣接する５'領域のHCV cDNA
は、推定容器および/またはマトリックスプロテインの
セグメントをコードする(E/M)。「ｃ」ライブラリーが
構成されるチンパンジーから得た血清が、この標的領域
に変形が存在するか否かを判断するためにHCV/cPCRによ
って分析された。
【０２７３】HCV/cPCRアッセイが、クローン5'-32の単
離に対して、使用されるプライマーとプローブ以外は、
前述と本質的には同様に行われる。図６５は、プライマ
ーおよびプローブ(およびその誘導されたクローン)の関
係とHCV cDNAの標的領域の関係とを示している。PCRプ
ライマーの１組である、ag30a16AおよびK91Env16Bは、
クローンag30aおよびk9-1から誘導されたが、これらは
それぞれ標的配列の上流および下流にある。ag30a16Aお
よびK91Env16BによりプライムされたcPCR産物の期待さ
れる大きさは、HCV cDNAの確認された配列に基づいて1.
145kbである。ag30a16AおよびK91Env16Bを用いて増幅さ
れた領域におよび、互いに重複しているPCRプライマー
の他の２組もまた、血清中のHCV RNAのPCR増幅のために
用いられる。このように、この場合には、プライマーag
30a16AおよびCA156e16Bを１つの組として、プライマーC
A156e16Aおよびk91Env16Bをもう１つの組として用いる
ことによって、PCR反応が起こされる。これらの組に対
する予測されるPCR産物の大きさは、それぞれ615ヌクレ
オチド(NT)および683ヌクレオチドであった。表１０
は、プライマーおよびそれが誘導されたクローンおよび
プライマー配列を記載している。
【０２７４】
【表１０】
【０２７５】すべてのHCV/cPCR産物のためのプローブ
が、クローン216(CA216a16Aおよび216a16Bをプライマー
として用いて)およびクローン84(CA84a16AおよびCA84a1
6Bをプライマーとして用いて)の領域をPCR増幅して準備
された、HCV cDNAの32Ｐでラベルされた部分から成り、
32ＰはニックトランスレーションによりPCR産物に導入
された。これらのプローブは、HCV/cPCR反応に用いられ
たプライマーには重複しなかった。
【０２７６】図６６は、HCV/cPCR産物が32Ｐでラベルさ
れたプローブとハイブリッド形成されたサザンブロット
の放射線写真を示している。プライマーag30a16Aおよび
K91Env16B(レーン１)から伸びたHCV/cPCR産物は、約1.1
kbであった。15時間放射の間に、他のPCR産物は観察さ
れなかった。プライマーの組ag30a15A/CA156e16B(レー
ン２)およびCA156e16A/K91Env16B(レーン３)から伸びた
HCV産物は、それぞれ約625NTおよび約700NTであった。P
CR産物の大きさは、MspIでのpBR322の消化およびHaeIII
で消化されたPhiX174の消化の結果としての相対的な断
片移動に比較して決定される(レーン５)。
【０２７７】上記の研究は、約20NTから50NTの小ささの
挿入または欠失、および標的DNAの大きさを変化させるD
NAの再配列を検出する。
【０２７８】図６６の結果により、チンパンジー血清内
のHCVのE/M領域から誘導されたcDNAの唯一の主要種が存
在することが確信できる。
【０２７９】フラビウイルスゲノム配列の保存された領
域から誘導されたプライマーおよびPCRを使用したHCV c
DNA配列のクローニングのための増幅 HCVがフラビ様ウイルスであるという我々の発見によ
り、PCR技術を用いての、特徴づけされていないHCV cDN
A配列のクローニングのための戦略、およびフラビウイ
ルスにおいて保存されたアミノ酸配列をコードする領域
から誘導されたプライマーが可能になる。一般に、プラ
イマーの１つが、定義されたHCVゲノム配列から誘導さ
れ、そして配列されていないHCVポリヌクレオチドの領
域に隣接する他のプライマーが、フラビウイルスゲノム
の保存された領域から誘導される。フラビウイルスゲノ
ムは、NS1およびフラビウイルスゲノムの５'末端にコー
ドされたＥポリペプチドに保存された配列を包含するこ
とは公知である。このように、HCVゲノムの推定比較領
域から誘導されたcDNA配列を単離するためには、これら
のフラビウイルスポリペプチドに保存された配列から誘
導された上流プライマーが明示される。下流プライマー
は、HCV cDNAの公知の上流末端から誘導される。
【０２８０】コードの変性のため、フラビウイルスプロ
ーブおよび対応するHCVゲノム配列の間に適合間違いが
起こり得る。ゆえに、Lee(1988)によって説明されてい
るものに類似した戦略が用いられる。Leeの手順は、ア
ミノ酸配列の逆トランスレーション産物に相補的な混合
オリゴヌクレオチドプライマーを用いる。混合プライマ
ー内の配列は、保存されたアミノ酸配列のそれぞれのコ
ドン変性を考慮に入れている。
【０２８１】３組のプライマー混合物が、デング熱-2，
4(D-2，4)、日本脳炎ウイルス(JEV)、黄熱病(YF)および
西ナイルウイルス(WN)を含むいくつかのフラビウイルス
内に見られるアミノ酸同族に基づいて発生させられる。
最上流に保存された配列(5'-1)から誘導されるプライマ
ー混合物は、アミノ酸配列gly-trp-glyに基づいてお
り、これは、D-2、JEV、YFおよびWNのＥタンパク質に見
られる保存された配列asp-arg-gly-trp-gly-aspNの一部
である。その次のプライマー混合物(5'-2)は、Ｅタンパ
ク質内の下流に保存された配列phe-asp-gly-asp-ser-ty
r-ileu-phe-gly-asp-ser-tyr-ileuに基づいており、phe
-gly-aspから誘導される。保存された配列はD-2、JEV、
YFおよびWNに存在する。三番目のプライマー混合物(5'-
3)は、アミノ酸配列arg-ser-cysに基づいており、これ
は、D-2、D-4、JEV、YFおよびWNのNS1タンパク質に保存
された配列cys-cys-arg-ser-cysの一部である。5'-3の
混合物を形成する個別のプライマーは図８４に示されて
いる。保存された領域から誘導された変性配列に加え
て、それぞれの混合物内のそれぞれのプライマーは、酵
素、HindIII、MboI、およびEcoRIを制限するためにコー
ドする配列位置を含有する、５'末端において不変領域
をも包含する。
【０２８２】下流プライマーssc5h20Aは、クローン14i
および11bの配列とオーバーラップする配列を有するHCV
cDNAを含有し、クローン5h中のヌクレオチド配列から
誘導される。ssc5h20Aの配列は、 5' GTA ATA TGG TGA CAG AGT CA 3' である。
【０２８３】これに代わるプライマーssc5h34Aも使用さ
れ得る。このプライマーは、クローン5h中の配列から誘
導される。そしてさらに制限酵素部位をつくるヌクレオ
チドを５'末端に持ち、そのためクローン化を促してい
る。この配列ssc5h34Aは、 5' GAT CTC TAG AGA AAT CAA TAT GGT GAC AGA GTC A 3' である。
【０２８４】はじめにSaikiらによって開示された(198
6)PCR反応は、cDNAのためのテンプレートがHCVに感染し
たチンパンジーの肝臓から分離されたRNAである点、ま
たはHCVに感染したチンパンジーの血清から分離された
ウイルス粒子からなる点を除いて、Leeらに開示された
(1988)ように、本質的に行われた。さらに、HVC配列に
アニーリングするプライマーの一部は、ヌクレオチドが
９しかなく、そしてミスマッチし得るので、アニーリン
グ条件は増幅の一回目において緩和されている(0.6M Na
Cl，25℃)。さらに、もし、ssc5h34Aが使用されるなら
ば、HCVゲノムから誘導されていない付加的な配列は、
プライマー−テンプレートハイブリッドを不安定にする
傾向がある。一回目の増幅の後、アニーリング条件はよ
りストリンジェントになり得る(0.066M NaCl，32℃〜37
℃)。なぜなら増幅された配列は、このときプライマー
と相補的なまたは重複する領域を持っているからであ
る。加えて、増幅のはじめの10サイクルは、Klenow酵素
Ｉと共に、その酵素に適したPCR条件の下で行われる。
これらのサイクルが終了すると、サンプルは抽出され、
Kit方向に沿って、Cetus/Perkin-Elmerにより供給され
るように、Taqポリメラーゼと共に使用される。
【０２８５】増幅の後、増幅されたHVC cDNA配列は、ク
ローン5hから誘導されるプローブを使用して交雑される
ことにより、検知される。このプローブは、プライマー
を誘導するために使用される配列の上方の配列から誘導
され、プライマーを誘導したクローン5hの配列とオーバ
ーラップしない。このプローブの配列は、 5' CCC AGC GGC GTA CGC GCT GGA CAC GGA GGT GGC CGC GTC GTG TGG CGG TGT TGT TCT CGT CGG GTT GAT GGC GC 3' である。
【０２８６】
【発明の効果】ここに記載される方法、オリゴマー、HC
V cDNAから誘導されたプローブとプライマーの両方、そ
してそれらを含むキットは、正確で、比較的簡単で、経
済的に、生物学的なサンプル中、(さらに詳細には、輸
血に使用され得る血液、およびHCV感染を持つ疑いのあ
る人の中に)HCVが存在することを決定するために有用で
ある。さらにまた、これらの方法とオリゴマーは、再結
合HCVポリペプチドの使用に基づく免疫学的分析法より
も早い段階でのHCV感染を検知するために有用である。
また、増幅されたポリヌクレオチド交雑分析法は、抗HC
V抗体を持たない場合のサンプルにおいてHCV RNAを検知
する。このようにして、本明細書に記述されたプローブ
とプライマーは、HCV、および血液を含むHCV感染された
生物的検体による感染を一層完全に同定するためにHCV
ポリペプチドに基づく免疫学を利用して、増幅交雑分析
法に使用され得る。
【０２８７】本明細書で提供される情報により、HCVゲ
ノムの保存領域から誘導されたプライマーそして/また
はプローブが明示できる。これらのプライマーとプロー
ブを提供することで、種々のHCV株を検知し且つ血液と
血液製剤をスクリーニングする際に使用される一般的な
方法が利用可能になる。
【０２８８】もし、この方法で使用されるプライマー
が、HCVゲノムの保存領域から誘導されると、この方法
は種々のHCV株の検知そして/または同定に有用である。
これは、換言すると、HCVの検知と分析のさらなる免疫
学的な試薬の開発、およびHCVの検知そして/または処理
のためのさらなるポリヌクレオチド試薬の開発を可能に
する。
【０２８９】加えて、FlavivirusesおよびHCVの保存さ
れたアミノ酸配列から示されたプライマーおよびプロー
ブの組は、これらの感染性薬剤の万能な検知法を与え
る。
【０２９０】以下に挙げられた素材は、American Type
Culture Collection(ATCC), 12301Parklawn Dr.,Rockvi
lle, Maryland 20852に、ブダペスト条約に基づいて寄
託されており、以下の受託番号が付与されている。
【０２９１】
【表１１】
【０２９２】さらに、以下の寄託が1989年5月11日にな
された。
【０２９３】
【表１２】
【０２９４】以下の株D1210は、1989年5月3日に寄託さ
れた。
【０２９５】
【表１３】
【０２９６】以下の株は、1989年5月12目に寄託され
た。
【０２９７】
【表１４】
【０２９８】以下の生物的素材は、1990年3月23日に寄
託された。
【０２９９】
【表１５】
【図面の簡単な説明】
【図１】クローン12f中のHCV cDNAの配列およびそれに
コードされるアミノ酸を示す。
【図２】クローンk9-1中のHCV cDNA配列およびそれにコ
ードされるアミノ酸を示す。
【図３】図２の続きである。
【図４】図３の続きである。
【図５】図４の続きである。
【図６】クローン15eの配列およびそれにコードされる
アミノ酸を示す。
【図７】クローン13i中のHCV cDNAのヌクレオチド配
列、それにコードされるアミノ酸およびクローン12fと
オーバーラップする配列を示す。
【図８】クローン26j中のHCV cDNAのヌクレオチド配
列、それにコードされるアミノ酸およびクローン13iと
オーバーラップする配列を示す。
【図９】クローンCA59a中のHCV cDNAのヌクレオチド配
列、それにコードされるアミノ酸およびクローン26jお
よびK9-1の配列とオーバーラップする配列を示す。
【図１０】クローンCA84a中のHCV cDNAのヌクレオチド
配列、それにコードされるアミノ酸およびクローンCA59
aとオーバーラップする配列を示す。
【図１１】クローンCA156e中のHCV cDNAの配列、および
クローンCA84aとオーバーラップする配列を示す。
【図１２】クローンCA167b中のHCV cDNAの配列、および
クローンCA156eとオーバーラップする配列を示す。
【図１３】クローンCA167b中のHCV cDNAの配列、および
クローンCA156eとオーバーラップする配列を示す。
【図１４】クローンCA290a中のHCV cDNAの配列、および
クローンCA216aとオーバーラップする配列を示す。
【図１５】クローンag30a中のHCV cDNAの配列、および
クローンCA290aとオーバーラップする配列を示す。
【図１６】図１５の続きである。
【図１７】図１６の続きである。
【図１８】クローンCA205a中のHCV cDNAの配列、および
クローンCA290a中のHCV cDNA配列とオーバーラップする
配列を示す。
【図１９】クローン18g中のHCV cDNAの配列、およびク
ローンag30a中のHCV cDNA配列とオーバーラップする配
列を示す。
【図２０】クローン16jh中のHCV cDNAの配列、それにコ
ードされるアミノ酸およびクローン15e中のHCV cDNAの
配列とオーバーラップするヌクレオチドを示す。
【図２１】クローン6k中のHCV cDNAの配列、それにコー
ドされるアミノ酸およびクローン16jh中のHCV cDNA配列
とオーバーラップするヌクレオチドを示す。
【図２２】クローンp131jh中のHCV cDNAの配列、それに
コードされるアミノ酸およびクローン6k中のHCV cDNA配
列とオーバーラップするヌクレオチドを示す。
【図２３】本明細書中に記載されているクローンおよび
欧州特許公開第318,216号に示されているコンパイルさ
れたHCV cDNA配列由来のコンパイルされたHCV cDNAを示
している。配列が由来するクローンは、５'−クローン3
2、b114a、18g、ag30a、CA205a、CA290a、CA216a、pi14
a、CA167b、CA156e、CA84a、CA59a、K9-1(k9-1とも呼ば
れる)、26j、13i、12f、14i、11b、7f、7e、8h、33c、4
0b、37b、35、36、81、320、33b、25c、14c、8f、33f、
33g、39c、35f、19g、26g、15e、b5a、16jh、6k、およ
びp131jhである。図中で、配列上部の３つの水平なダッ
シュは推定開始因子のメチオニンコドンの位置を示して
いる。この図の中には、HCV cDNAにコードされた推定ポ
リタンパク質のアミノ酸配列もまた示されている。HCV1
のクローン化されたDNAの異質性(heterogeneities)は、
大きなORFの推定的にコードされた配列の上部に示され
たアミノ酸によって示されている；括弧は、クローン中
のHCV cDNAの５'-または３'-末端部あるいはそれらの近
傍で異質性が検出されたことを示している。
【図２４】図２３の続きである。
【図２５】図２４の続きである。
【図２６】図２５の続きである。
【図２７】図２６の続きである。
【図２８】図２７の続きである。
【図２９】図２８の続きである。
【図３０】図２９の続きである。
【図３１】図３０の続きである。
【図３２】図３１の続きである。
【図３３】図３２の続きである。
【図３４】図３３の続きである。
【図３５】図３４の続きである。
【図３６】図３５の続きである。
【図３７】図３６の続きである。
【図３８】図３７の続きである。
【図３９】図３８の続きである。
【図４０】図３９の続きである。
【図４１】図４０の続きである。
【図４２】図４１の続きである。
【図４３】図４２の続きである。
【図４４】図４３の続きである。
【図４５】図４４の続きである。
【図４６】図４５の続きである。
【図４７】図４６の続きである。
【図４８】生物学的サンプルのHCV RNAの検出のための
カプチャープローブおよびラベルプローブの配列を示し
ている。
【図４９】図４８の続きである。
【図５０】図４９の続きである。
【図５１】フラビウイルスポリタンパク質とHCVゲノム
の主要なORFにコードされた推定HCVポリタンパク質の模
式的な配列を示している。図には、また、フラビウイス
ルポリタンパク質から切断されたフラビウイルスポリペ
プチドの可能な機能が示されている。加えて、HCVポリ
ペプチド、NANB5-1-1およびC100の、推定HCVポリタンパ
ク質に対して相対的な位置が示されている。
【図５２】クローン81中のHCV cDNA挿入物の二本鎖ヌク
レオチド配列、およびそこにコードされたポリペプチド
の推定アミノ酸配列を示している。
【図５３】クローン36中のHCV cDNA配列、クローン81の
NANBV cDNAとオーバーラップするセグメント、およびク
ローン36の中にコードされたポリペプチド配列を示して
いる。
【図５４】クローン37b中のHCV cDNA配列、クローン35
とオーバーラップするセグメント、およびそこにコード
されたポリペプチドを示している。
【図５５】NANBHを有するチンパンジーの肝臓サンプル
由来のRNA(Ａ)およびNANBHを有するイタリア人の患者
(Ｂ)に関するHCV cPCRアッセイのオートラジオグラフの
写真を示している。
【図５６】肝臓の損傷の表示、HCV RNAの存在と、NANBH
を有する２匹のチンパンジーに対する抗HCV抗体の存在
との間の一時的な関係を示すグラフである。
【図５７】クローンCA84a中のHCV cDNAのヌクレオチド
配列、そこにコードされたアミノ酸、およびクローンCA
59aとオーバーラップする配列を示している。
【図５８】クローン40b中のHCV cDNA配列、クローン37b
にオーバーラップするセグメント、およびそこにコード
されたポリペプチドを示している。
【図５９】HCVゲノムの、約300、30、および３CIDのラ
ベルされ増幅された生成物を示すオートラジオグラフの
写真である。
【図６０】クローン40a中のHCV cDNAのヌクレオチド配
列を示している。
【図６１】HCVゲノムの保存領域由来のプライマーから
伸長された増幅された生成物を示すオートラジオグラフ
の写真である。
【図６２】クローン35中のHCV cDNA配列、クローン36と
オーバーラップするセグメント、およびそこにコードさ
れたポリペプチドを示している。
【図６３】図６２の続きである。
【図６４】診断結果とALTレベルとの関係を示す。
【図６５】プローブとクローンag30aとk9-1中のHCV cDN
A由来のHCV RNAの５'-領域由来のプライマーとの関係を
示す図表である。
【図６６】ag30aおよびk9-1由来のプライマーのセット
から伸張され増幅された生成物のオートラジオグラフの
写真である。
【図６７】ヒト単離株23および27ならびにHCV1の整列さ
れたヌクレオチド配列を示している。相同な配列は符号
(＊)で示されている。非相同配列は小文字である。
【図６８】図６７の続きである。
【図６９】図６８の続きである。
【図７０】ヒト単離株23および27ならびにHCV1の整列さ
れたアミノ酸配列を示している。相同な配列は符号(＊)
で示され、非相同配列は小文字である。
【図７１】BB-NANBV感染チンパンジーの肝臓から単離さ
れ、クローン81のBB-NANBV cDNAでプローブされたRNAの
ノーザンブロットのオートラジオグラフの写真を示して
いる。
【図７２】抗NANAB5-1-1で、感染されたプラズマから捕
捉されたNANBV粒子から抽出されクローン81由来の32Ｐ
ラベルNANBV cDNAでプローブされた核酸のオートラジオ
グラフの写真を示している。
【図７３】単離されたNANBV核酸、クローン81中のNANBV
cDNA由来の32Ｐラベルされた正鎖および負鎖DNAプロー
ブでプローブされた核酸を含有するフィルターのオート
ラジオグラフの写真を示している。
【図７４】ヒト単離株23のヌクレオチドコンセンサス配
列を示し、変位体配列が配列ラインの下に示されてい
る。コンセンサス配列中にコードされたアミノ酸もまた
示されている。
【図７５】ヒト単離株27のヌクレオチドコンセンサス配
列を示し、変位体配列が配列ラインの下に示されてい
る。コンセンサス配列中にコードされたアミノ酸もまた
示されている。
【図７６】図７５の続きである。
【図７７】フラビウイスルポリタンパク質および推定HC
Vポリタンパク質に対するEnvLとEnvRプローブとの関係
を示すグラフである。
【図７８】単離株Thorn、EC1、HCT#18、およびHCV1の複
合整列させたヌクレオチド配列の比較を示している。
【図７９】図７８の続きである。
【図８０】図７９の続きである。
【図８１】EC10のヌクレオチド配列とHCV1配列の複合体
との比較を示している；このEC10配列はドットの上部に
あり、そしてHCV1配列はドットの下部にある。
【図８２】ヒト単離株HCT#18、JH23、JH27、Thorne、EC
1、およびHCV1のコンセンサス配列の「EnvL」領域にコ
ードされたアミノ酸配列117〜308(HCV1に相対的に)の比
較を示している。
【図８３】ヒト単離株HCT#18、JH23、JH27、Thorne、EC
1、およびHCV1のコンセンサス配列の「EnvR」領域にコ
ードされたアミノ酸配列330〜360(HCV1に相対的に)の比
較を示している。
【図８４】プライマー混合物5'-3の個々のプライマーの
ヌクレオチド配列を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョージ クオ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94112 サンフランシスコ，シックスス アベニ ュー 1370 (72)発明者 ジャン ハン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94549 ラファイエット，デル マール 3238 (72)発明者 マイケル エス． アーディア アメリカ合衆国 カリフォルニア 94501 アラモ，バンス ミドウ ロード 100 (72)発明者 エミイ ジェイ． ワイナー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94611 オークランド，インディアン ウェイ 1766

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも１５個のヌクレオチドの連続
    する配列を含む、ハイブリダイゼーションのためのポリ
    ヌクレオチドプローブまたはＤＮＡ合成のためのポリヌ
    クレオチドプライマーであって、 （ｉ）該少なくとも１５個のヌクレオチドの連続する配
    列が、ＨＣＶのゲノムまたはそのｃＤＮＡコピーのいず
    れか一方の鎖と選択的にハイブリダイズし得、そして、 (ii)該少なくとも１５個のヌクレオチドの連続する配列
    が、以下に示すＨＣＶヌクレオチドの保存配列のいずれ
    か一方の鎖から得られる、 ポリヌクレオチドプローブまたはプライマー： 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】 【化５】 【化６】 【化７】 または 【化８】
  2. 【請求項２】 請求項１に示されるヌクレオチド配列の
    ヌクレオチド番号-318〜-289、-285〜-256、-252〜-22
    3、-219〜-190、-186〜-157、-153〜-124、-120〜-91、
    -87〜-58、-54〜-25、-21〜９、13〜42、46〜75、79〜1
    08、112〜141、または145〜174の配列を有する、請求項
    １に記載のポリヌクレオチドプローブまたはプライマ
    ー。
  3. 【請求項３】 請求項１に示されるヌクレオチド配列の
    ヌクレオチド番号4378〜4407、4411〜4440、4444〜447
    3、4477〜4506、4510〜4539、4543〜4572、4576〜460
    5、4609〜4638、4642〜4671、4675〜4704、4708〜473
    7、4741〜4770、4774〜4803、4807〜4836、4840〜486
    9、または4873〜4902の配列を有する、請求項１に記載
    のポリヌクレオチドプローブまたはプライマー。
  4. 【請求項４】 請求項１に示されるヌクレオチド配列の
    ヌクレオチド番号4056〜4085、4089〜4118、4122〜415
    1、4155〜4184、4188〜4217、4221〜4250、4254〜428
    3、4287〜4316、4230〜4349、4353〜4382、4386〜441
    5、または4419〜4448の配列を有する、請求項１に記載
    のポリヌクレオチドプローブまたはプライマー。
  5. 【請求項５】 以下の配列からなる群より選択される配
    列を含む、ハイブリダイゼーションのためのポリヌクレ
    オチドプローブまたはＤＮＡ合成のためのポリヌクレオ
    チドプライマー： 【化９】
  6. 【請求項６】 カプチャープローブである、請求項２か
    ら５までのいずれかに記載のポリヌクレオチドプロー
    ブ。
  7. 【請求項７】 ラベルプローブである、請求項２から５
    までのいずれかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
  8. 【請求項８】 プライマーである、請求項２から５まで
    のいずれかに記載のポリヌクレオチドプライマー。
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