JPH05500155A

JPH05500155A - Ｎａｎｂｖの診断用薬

Info

Publication number: JPH05500155A
Application number: JP2508534A
Authority: JP
Inventors: ホートン，マイケル; チョー，クイ―リム; クオ，ジョージ; ハン，ジャン; アーディア，マイケル　エス．; ワイナー，エミイ　ジェイ．
Original assignee: カイロン　コーポレイション
Priority date: 1989-05-18
Filing date: 1990-05-18
Publication date: 1993-01-21
Anticipated expiration: 2012-09-24
Also published as: LV10729B; GEP20002164B; NO303503B1; JPH10113176A; DK0398748T3; WO1990014436A1; BG60348B2; EP0398748B1; JP3698520B2; JPH1089A; MC2188A1; DE69033891T2; EP0398748A2; FI915443A0; HUT59964A; AU638719B2; LV10729A; DE69033891D1; JP2656996B2; RO113059B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＮＡＮＢＶの診断法：Ｃ型肝炎ウイルスのスクリーニングに有用なポリヌクレオチド技術分野本発明は非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス（ＮＡＮＢＶ）感染の蔓延を管理するための材料および方法に関する。より詳細には、生物学的試料中のＨＣＶの検出のためのアッセイに有用な、非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）の病原体であるＣ型肝炎ウイノレス（ＨＣＶ）、およびそのポリヌクレオチドおよび誘導体に関する。

本出願書に引用される参考文献Ｂａｒｒ　ｅｔ．　ａｌ．　（１９８６１，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｇ　４：４２８．Ｂｅａｕｃａｇｅ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８１），　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｓｔ−ｔｅｒｓ　２２：ｌ日５９．Ｂｏｔｓｔｅｉｎ　（１９７９），Ｇｅｎｅ旦：１７．Ｂｒｉｎｕｏｎ，　Ｍ．Ａ．　（ｌタ８６）　ｉｎ　ＴＨＥ　ＶＴＲＵＳＥＳ：　ＴＨＥ　ＴＯＧＡ’ＶＩ工ＤＡＥ　ＡＮＤＦＬＡＶ工 ’ｔ／ｉｌＤＡＥ　（Ｓｅｒｉｅｓ　ｅｄｓ．　Ｆｒａｅｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔ　ａｎｄ　Ｗａｇｎｅｒ，ｖｏｌ．　ｅｄｓ．　Ｓａｈｌｅｓｉｎｇｅｒ　ａｎｄ　Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ），９．３２７− ３７４．ｓｒｏａｃｈ　（１９８１）　ｉｎ：　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＹｅａｓｔＳａｃｃｈａｒｏｑｃｅｓ，　Ｖｏｌ．　ｌ，　ｐ．４４５，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｉ｛ａｒｂｏｒ　Ｐｗｅｓｓ．Ｂｒｏａｃｈ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８３），　Ｍｅｅｈ．　Ｅｎｚ．　１１＋１：コ０７．Ｂｒｏｗｎ　ｅｔ　ａｌ．　（１９７９），　Ｍｅ＋：ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６８：ｌ０９．Ｂｙｒｎｅ　ｅｔ：　ａｌ．　（１９８８），　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、１６：４１６５．Ｃａｓｔｌｅ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８６），　ＶｉｒｏＬｏｇｙ　ｌＬ９：１０．Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．　（１９７７），　Ｎａｔｕｒｅ　１９８：１０５６．Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ．　（１９７９），　Ｂｉｏｃｈｅｍ工ｓｔｒｙ　１８：５２９４．Ｃｈｏｏ　ら　−（１９８９）＋　５ｃｉｅｎｃ＠　２４４：３５９゜２　、（１９８１）、　Ｊ、　Ｉｎｆ、　Ｄｉｓ、１４４：　５ＢＢ。

Ｍａｄ、３１ｉ：１８５゜Ｆｉｅｌｄｓ　＆　Ｋｎ工ｐ＠　（１９８６）、　ＦＴＪＮＤＡＭＥＮＴＡＬ　 ’／ＩＲＯＬＯＧＹ　（Ｒａｖｅｎ　？ｒ＠５ＳｒＧｅｒｅｔｙ、Ｐ、、Ｊ、　ら　、、ｉｒ＋　ＶＩＲＡＬ　）ｉＥＰＡ’ｒ：ＴＩｓ　ＡＮＤ　Ｌ：ＶΣＲＭＳＥＡＳＥ（ｖｙａｓ　Ｔ　Ｂ　−Ｎ　−ＨＤ’１ｆａｎＳ　ｔａｑ　ＨＪ　− Ｌ　−ｇ　／ＡＶ−Ｈｏｏ　ｆｎａｇｌｅ　ｌ　Ｊ　−Ｈ，１８０５（Ｇｒｕｎｅ　；（−Ｐ−５ｅｒａＣｔＯｎ、　釦Ｃ，，１９８４）　ｐｐ　２３−４７゜Ｃミニ＋ｅｄｄｅＬ　ら　、（Ｌ９ＢＯ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　λｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、旦＋４０５７゜Ｇｒａｈａｍ　Ｈ，ｈｆ　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ　（１９７Ｂ）、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：５４６゜Ｇｒｕｎｓｚｅｉｎ　ｆｉＡＶ’ＨＯＱｎｅｓｓ　（１９）５）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｉ、入ｃａｄ、５ｃｉ−、υＳ入二す３９６１゜Ｇｒｙｃｈ　ら　、　（１９８５）、　Ｎａｔｕｒｅ　３１６：７４゜Ｇｕｂｌｅｒ　；ｒｊ〆Ｈｏｆｆｆｉｍａｎ　（１９８３）、Ｇｅｎｅ　２５＋２６３゜Ｈａｈｎ　弓、　（１９８８）、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６２：１６７゜Ｈａｎ　（１９８７）、　Ｂｉｏｃｈａｒｎｉｓｔｑ　２６：１６１７゜ＨａＪｌｖｒＩｅｒｌｉｎｇ　ら　、　（１９８１１，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴ’より０ＤＩＥＳ　ＡＮＤ　Ｔ−ＣＥＬＬＨＹＢＲよりＯＭＡＳ。

Ｈｅ５ｓ　ら　、（１９６Ｅり、；、Ａｄｖ、Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ　ヱ：１４９゜）１ｉｎｎｅｎ　ｉ、　、（１９７Ｂ）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ’、１互：　ｘｑ２９゜Ｈｉ：ｚｅｒｎａｎ　ら　、　（１９８０１，Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５５．：２０７３゜Ｈｏ１ｉａｎｄ　弓、　（１９７８）、　Ｑｉｏ：ｈ＠ｍｉｓ画ｙ　１７：４９００゜ＰＲＡＣ″ｒＩＣＡＬ　ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｄ、Ｇｌｏｖ＠ニー、Ｅｄ、、工ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ。

ｔＪ、に、）　ｐｐ、　４９−７８゜工ｍｍｕｎ、　Ｒｅｖ、（１９８２）　６２＋１８５゜Ｉｗａｒｓｏｎ　（１９８７）、　Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊ、　２９５＋９４６゜Ｋｅｎｎｅｔｔ　ら　、（１９８０１ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ。

Ｋｕｏ　；＞　、（１９８９）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４４：３６２゜Ｍａｎｉａｔｉｇ、　Ｔ、、Ｉ；、（１９８２１ＭＯＬＥＣＵＬＡＪｔ　ＣＬＯＮ工ＮＧ；　ＡＬＡＢＯＦＬ入τＯＲＹ　ＭＡＮＵ入Ｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎ、Ｙ、）。

Ｍａｔｚｈｅｗｓ　；、ｈ＞−Ｋｒｉｃｋａ　（１９８８１，Ａｎａｌｙｔｉｅａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１６９：ｌ。

とτＨＯＤＳ　工Ｎ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　（ＡｃａｄｅｍＩＣｐｒｅｓｓ）。

Ｍｌ：ｌｉｎ　（１９８９）、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ｃｈｅｍ、　３５：１８１９゜Ｌａｅｒ＋ｖｎユＬ　（ＬＰ０１）、Ｎａｔｕｒｅ　ヱ２７．　６８０゜Ｌｅｅ　Ｉ；　、　（１９８Ｂ）、５ｃｉｅｎｃｅ　２旦９ｉ　１２８８゜Ｍａｙｅｒ　、Ｗａユｋｅｒ、ｅａｓ、（１９８７）、工％−ＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ　ＫＥＴＨＯＤＳ　工ＮＭａＣＮａｍ１：ｌ！　ら　、（１９８４）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２６＋１３２５゜Ｍｅｓｓｉｎｇ　５　、（１９８Ｌ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、旦＋３０９゜Ｍｅｓｓｉｎｇ　（１９８３）、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｉｏｎ：２０−３７゜とτ１（ＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　（入ｃａｄａｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）。

Ｍｉｃｈｅｉｌｅ　’ｔ　、ｒ　釦ｔ、　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｖｉｒａｌ　！（ｅｐａｔｉｔｉｓ。

Ｍｏｎａｔｈ　（ｉ９８６）　ｉｎ　ＴＨＥ　ＶＸＲＴＪＳＥＳ二　ＴＨＥ　ＴＯ（−入Ｖ工ＲＡＤ）−Ｅ　ＡＮＤＴ　ＬＡｖＸＶＸＲよりＡＥ　（Ｓｅｒｉｅｓ　ｅｄｓ、Ｆｒａｅｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔ　ａｎｄ　Ｗａｇｎｅｒ。

ｖｏｌ、ａｄｓ、Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ　ｋ♂＋ｚ−５ｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）。

ｐ、３７５−４４０゜Ｍｕｒａｋａｗａ　ら　−（Ｌ９Ｂ８１．　ＤＮＡ　：：２８７゜Ｎａｇａｈｕｙｎａ　ｉ　、（１９８４）、Ａｎａｌ、Ｂｉつｃｈ＝ｍ、Ｌ４１ニア４゜Ｎａｒａｎｑ　ら　（１９７９）、　Ｍｅ：ｈｏｃｉｓ　ｉｎ　窮：ｙｍｏｌｏｇｙ　６Ｂ：９０゜Ｎｅｕｒａｔｈ　％　、（１９６４１，５ｃｉｅｎｃｓ　２２４：３９２゜Ｎ１５ｏｎｏｆｆ　５　、（ＬＰ０１）、　Ｃ１１ｎ、工ｎｖｎｕｎｏ１．　工ｍｍｕｎｏｏａｔｈｏｌ。

Ｑｖｅｒｂｙ、　Ｌ、Ｒ，（１９８５１，Ｃｕｒｒ、　Ｈｅｐａｔｏｌ、　５＋４９゜ｏｖｅｒｂｙ、　Ｌ、Ｒ，（１９８６１，Ｃｕｒｒ、Ｈｅｐａｔｏｌ、　６：６５゜０ｖｅｒｂｙ＋　Ｌ、Ｒ，（１９８７１，Ｃｕ＝、　ＨｅｐａｔＯｌ、　７：３５゜Ｐ＠ｌｅ９　（１９６９）、　Ｎａｔｕｒ＠２２１：１９３゜Ｐｆｅｆｆｅｒｋｏｒｎ　ａｎｄ　５ｈａｐｉｒｏ　（１９７４）、　ｉｎ　Ｃ０ＫＰＲＥＨＥＮＳＩＶｒ：　ＶＩＲＯＬＯＣ；Ｙ。

Ｖｏｌ、　２　（Ｆｒａｅｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔ　＆　Ｉ−１ａｌ−１ａ、　ｅｄｓ、、　Ｐｌｅｎｕｍ、　Ｎ、Ｙ、１ｐｐ、１７１−２３０゜Ｒｌｃｅ　ら　、（１９８６）　ｉｎ　ＴＨＥ　ＶＺＲ１ＪＳＥＳ＋　ＴＨＥ　ＴＯＧＡＶ：［ＩＤＡＥ　ＡＮＤＦＬＡＶＩＶＴＲＪＤＡＥ　（Ｓｅｒｉｅｓ　ｅｄｓ、Ｆｒａｅｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔ　ＡｊｇＷａｇｎｅｒ。

ｖｏｌ、　ｅｄｓ、　Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇａｒ　％Ｊｖ−５ｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓｌ。

ｐ、２７９−３２８゜Ｒｏｅｈｒｉｇ　（１９８６）　ｉｎ　ＴＨＥ　Ｖ工ＲＵＳｒ＋Ｓ：　ＴＨＥ　ＴＯＧＡＶＨＬよりＡｊ：　ＡＮＤＦＬＡＶ工Ｖ工ＲよりＡＥ　（Ｓｅｒｉｅｓ　ａｄｓ、ＦｒａｅｒＬｋｅ、１−Ｃｏｎｒａｔ　、７１Ｊひ−Ｗａｇｎｅｒ。

ｖｏｌ、ｅｃｉｓ、Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ　；ｙよひＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、Ｐｌｅｎｕｒｎ　Ｐｒｅｓｓ）Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　；　、（１９８４１，Ｎａｔｕｒ＠＋　３１２ニア。

５ａｄｌｅｒ　’）　、（１９８０）、Ｇ＠ｎｅ旦、２７９゜Ｓとｉｋｉ　＞　、　（１９８５）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３０：１３５０゜５ａｉｋｉ　ら　、　（１９８６）、　Ｎａｔｕｒｅ　３２４：　１６３゜５ａｉｋｉ　；　、（１９８Ｂ）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３９＋４８７゜Ｓａｎｇｅ＝　弓、　（Ｌ９７７）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４：５４６３゜５ｃｈａｒ：　ら　、（ｉ９８６）、５ｃｉｅｎｃｅ　３≦３３＋１０７６゜５ｃｈｌｅｓよｎｇｅｒ　ら　、（１り８６）、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６０：１１５３゜５ｃｈｒｅｉｅｒ、　Ｍ、、；　、（１９８０）　ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＴＥＣＨＮ工ＱυＥＳＳｃｏｐｅｓ　（１９［］４）、ＰＲＯＴＥ工Ｎ　ＰＵＲＩｒ工ＣＡＴＩＯＮ、　ＰＲＩＮＣ工ＰＬＥＳ　ＡＮＤＰＲＡＣτ工ＣＥ、５ＥＣＯＮＤ　ＥＤＩＴＩＯＮ　（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ、Ｙ、）。

５ｈｉｕａｚａｋｅ　Ｉ；、（ＬＰ０１）、　Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１２Ｂ。

Ｓｈｉｇｅｋａｗａ　Ｈ２ｉ’　Ｄｏｗｅｒ　（１９８８）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：７４２゜Ｓｔａｉｍｅｒ　５　；　（１９８６）、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　５Ｅｌ：９゜５ｔｏＬｌａｒ　（１９８０）、　ｉｎ　ＴＨＥ　ＴＯＧＡＶτＲｔＪＳＥＳ−（Ｒ，Ｗ、　Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、　ｅｄ、。

τロｗｂ工ｎ　＞　、（Ｌ９７９１＋　Ｐ：ＯＣｏ　ＮａＺｌ−ＡＣａＣｌ、　ＳＣＬ、　υＳＡ　ヱ旦、　４コ５０゜Ｔｓｕ、ＱＩｅＬＧ’）ｌｅｒ：ｅｎｂｅｒｇ　（１９８０）、ｉｎ　５ＥＬＥＣτＥＤ　！’ＪＴ）ＩＯＤｓ　工Ｎ　ＣΣＬＬυＬＡ只工Ｆ、ＭＵＮＯＬＯＧＹ　（Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ、）　ｐｐ、３７３−３９１゜ｖｙｔｄｅｈａａｇ　ｉ　、　（１９［１５）、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１１４：１２２５゜Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ＋　Ｐ−ｔ　Ｉ、、（１９Ｅ１２）、　５ａｔｕｒｅ　２５但！３４４゜Ｖ６１ｅａｎＺｕｔａ１６ｊ　ｐ、、５　、（１９Ｅ１４１．　ｉｎ）［ＥＰＡτ工τＩｓ　Ｂ　［Ｍｉｌｌｍａｎ。

工３．ら　、、　ｅｄ、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒａｓｓｌ　ｐｐ、　２２５−２３６゜Ｗａｒｎｅｒ　（１９８４）、ＤＮＡ　３：４０１゜Ｗｕ　ｋ！ｕ’Ｇｘ：ｏｓｓｍａｎ　（１９１１１７）、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、　１５４゜ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ　ＤＮＡ、Ｐａｒｔ　Ｅ。

Ｗｕ　（１９１３７）、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ　１５５．　ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ　ＤＮＡ。

（ＬＸＴ−来由り引用される特許 υ、５．Ｐａｔｅｒ＋ｅ　Ｎｏ、４，３４１，７６１υ、５．　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、４，３９９，１２１Ｕ、Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、　４，４２７，７Ｅ！３σ、５．Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、４，４４４，８８７Ｕ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、４，４６６．９１７υ、５．Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、４，４７２，５００υ 、５．Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、４，４９１，６３２Ｕ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、４，４９３，８９０Ｕ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、４，６８３，２０２υ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、４，４５８，０６６υ、５．Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、４，９６８ＪＯ５発明の背景非Ａ非Ｂ肝炎（ＮＡＮＢ）Ｉ）は、ウィルスにより引き起こされると考えられる伝染性あるいは家族性疾病であり、既知の肝炎ウィルス、例えばＡ型肝炎ウィルス（ＨＡＹ）、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）　、デルタ肝炎ウィルス（ＨＤＶ）およびサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）　、エプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）により引き起こされる肝炎を含む、他のウィルス性肝炎と区別がかつかない。ＮＡＮＢＨは最初に輸血を受けた個体に同定された。

ヒトからチンパンジーへの伝染、およびチンパンジーでの連続継代は、ＮＡＮＢＨが伝染性の病原体あるいは複数の病原体によることの証拠を提供した。

疫学的証拠は、ＮＡＮＢＨには次の３つのタイプがあることを提示する。すなわち、水伝播性流行型；血液あるいは針に関連する型；および散発的に起こる（集団性）型である。しかし、ＮＡＮＢ）Ｉの原因となり得る病因の数は不明である。

これまでに多数のＮＡＮＢＶの候補が挙げられている。例えばＰｒ１ｎｃｅ（１９８３）、　Ｆｅ１ｎｓｔｏｎｅおよびＨｏｏｆｎｇｌｅ（１９８４）および０ｖｅｒｂｙ（１９１１５，１９８６，１９ａ７＞による総説および１ｗａｒｓｏｎ（１！１８７）による文献を参照のこと。しかし、これらのどの候補も、ＮＡＮＢＨの病原体であることを示す証拠はない。

ＮＡＮＢＶのキャリヤーおよびＮＡＮＢＶに汚染された血液あるいは血液製剤をスクリーニング、および同定するための、感度が高く特異的な方法の必要性は重大である。輸血後肝炎（ＰＴＨ）は輸血された患者の約ｌＯ％に起こり、ＮＡＮＢＩ（はこれらの９０％を占める。この疾病の主要な問題は、慢性的な肝臓の損傷（２５−５５％）にしばしば進行することである。

患者の処置、および血液および血液製剤によるＮＡＮＢＨの伝染、あるいは密接な個体間の接触によるＮＡＮＢＨの伝染は信頼性のある、スクリーニング、診断および予後診断のための、　ＮＡＮＢｖに関連する核酸、抗原および抗体の検出の道具を必要とする。

ハイブリダイゼーションアッセイにより特異的ポリヌクレオチドを検出する方法は当該分野で知られている。例えば、ＭａｔｔｈｅＷＳおよびＫｒ１ｃｋａ８１９８８）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１６９：１；　Ｌａｎｄｅｇｒｅら（１９８１１）、５ｃｉｅｎｃｅ　２４２：２２９；およびＭｉｔｔｌｉｎ（１９８９）、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｌｌ、　３５：１８１９．１９８９年９月に発行されたアメリカ合衆国特許Ｎｏ、　４８６８１０５およびＥ、　Ｐ、　Ｏ，公開Ｎｏ、　２２５８０７　（１９８７年６月１６日に公開）を参照のこと。

出願人は新しいウィルス、ＣＭ肝炎ウィルスを発見し、これが血液伝播性ＮＡＮＢＨ（ＢＢＩＪＡＮＢＨ）の主要な病原体であることを証明した。基本型ＨＣＶ株、ＣＤＣ？ＨＣＶ１　（ＨＣＶＩとも呼ばれル）ノゲ／ムの部分配列を含む、出願人の最初の仕事はＥ、　Ｐ、　Ｏ公開Ｎｏ。

３１８２１６　（１９８９１年５月３１日に公開）およびＰＣＴ公開Ｎｏ、　Ｗｏ８９１０４６６９　（１９８９年６月１日に公開）に記載されている。これらの特許室願書の開示およびすべてのこれらに相当する国内出願書をここに参考文献として引用する。これらの出願書は、とりわけ、ＨＣＶ配列をフローニングする組み換えＤＮＡ法、ＨＣＶプローブによる診断法、および新しいＨＣｖ配列の単離法を教示する。

ｌ匪二！丞本発明は、Ｅ、　Ｐ、　０．公開Ｎｏ、３１８２１６およびＰＣＴ公開Ｎｏ、　［０８９１０４６６９に記載のＨＣ■配列および本文に記載の他のＨＣＶ配列に基づく。

ハイブリダイゼーションのよる特異的ポリヌクレオチドの単離法および／あるいは検出法は、出願人によってＨＣＶが発見されるまで、ＨＣＶのスクリーニングに用いることはできなかった。

従って、本発明の１つの観点は、分析物であるヌクレオチド鎖中のＨＣｖ配列にハイブリダイズすることができるオリゴマーであり、ここで、オリゴマーは図１８に示すＨＣＶ　ｃＤＮＡの少なくとも４個の連続するヌクレオチドに相補する、ＨＣＶを標的とする配列を包含する。

本発明の他の観点は、ＨＣＶポリヌクレオチドを含むと考えられる分析物である鎖中のＨＣＶ配列を検出する過程であり、ここでＨＣｖポリヌクレオチドは選択された標的部分を包含し、該過程は以下の過程を包含する。

（ａ）分析物ポリヌクレオチド鎖中のＨＣＶ配列にハイブリダイズ可能なオリゴマーを提供する過程であり、ここで、オリゴマーは図１８に示すＨＣＶ　ｃＤＮＡの少なくとも４個の連続するヌクレオチドに相補する、ＨＣＶを標的とする配列を包含する過程。

（ｂ）標的する配列と標的される配列との間の特異的ハイブリッド２重鎖を形成させる、分析鎖を（ａ）のオリゴマーとともにインキュベートする過程。および（Ｃ）標的部分および前記オリゴマーとの間に形成されたハイブリッドを、もし存在するならば、これを検出する過程。

さらに本発明の他の観点はＨＣＶに汚染されていない血液を調製する方法であり：（ａ）ＨＣＶ標的配列を含むと疑われる血液試料からの、分析する核酸を提供する方法；（ｂ）分析ポリヌクレオチド鎖中のＨＣＶ配列に、もし存在するならば、ハイブリダイズ可能なオリゴマーを提供する方法であり、ここで、オリゴマーは、ＨＣ ’／　ＲＮＡに保持されるＩ（ＣＶヌクレオチド中に存在する、少なくとも８個のヌクレオチド配列に相補するＨＣＶを標的する配列に含まれる、方法；（Ｃ）標的する配列と、もし存在するならば、標的される配列との間のポリヌクレオチド２重鎖を形成させる条件下で（ａ）を（１））に反応させる方法；（（１）もし存在するならば、（Ｃ）で形成された２重鎖を検出する方法；および（ｅ）（ｄ）で２重鎖が検出されなかった血液を貯蓄する方法；を包含する。

図の簡単な説明図１はクローン１２ｆ中のＨＣＶｃＤＮＡの配列およびそれにコードされるアミノ酸を示す。

図２はクローンに９−１中のＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列およびそれにコードされるアミノ酸を示す。

図３はクローン１５ｅの配列およびそれにコードされるアミノ酸を示す。

図４はクローン１３ｉ中のＨＣ’／　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、それにコードされるアミノ酸およびクローン１２ｆとオーバーラツプする配列を示す。

図５はクローン２６ｊ中のＨＣＶ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、それにコードされるアミノ酸およびクローン１３ｉとオーバーラツプする配列を示す。

図６はクローンＣＡ３９ａ中のＨＣＶ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、それにコードされるアミノ酸およびクローン２６ｊおよびに９−１の配列とオーバーラツプする配列を示す。

図７はクローンＣＡ３４ａ中のＨＣＶ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、それにコードされるアミノ酸およびクローンＣＡ３９ａとオーバーラツプする配列を示す。

図８はクローンＣＡ１５６ｅ中のＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列、およびクローンＣＡ３４ａとオーバーラツプする配列を示す。

図９はクローンＣＡ１６７ｂ中のＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列、およびクローンＣＡ１５５ｅとオーバーラツプする配列を示す。

図１０はクローンＣＡ１６７ｂ中のＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列、およびクローンＣＡ１５６ｅとオーバーラツプする配列を示す。

図１１はクローンＣＡ２９０ａ中のＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列、およびクローンＣＡ２１６ａとオーバーラツプする配列を示す。

図１２はクローンａｇ３０ａ中のＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列、およびクローンＣＡ２９０ａとオーバーラツプする配列を示す。

図１３はクローンＣＡ２０５ａ中のＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列、およびクローンＣＡ２９Ｏａ中のＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列とオーバーラツプする配列を示す。

図１４はクローン１８ｇ中のＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列、およびクローンａｇ３０ａ中のＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列とオーバーラツプする配列を示す。

図１５はクローン１６ｊｈ中のＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列、それにコードされるアミノ酸およびクローン１５ｅ中のＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列とオーバーラツプするヌクレオチドを示す。

図１６はクローン６に中のＨＣｖｃＤＮＡの配列、それにコードされるアミノ酸およびクローン１６ｊｈ中のＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列とオーバーラツプするヌクレオチドを示す。

図１７はクローンｐ１３１ｊｈ中のＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列、それにコードされるアミノ酸およびクローン６に中のＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列とオーバーラツプするヌクレオチドを示す。

図１８はクローンｐ１３１ｊｈ中のＨＣｖｃＤＮＡの配列、それニコードされるアミノ酸およびクローン６に中のＨＣＶ　ｅＤＮＡ配列とオーバーラツプするヌクレオチドを示す。図１８はここに記載されているクローンおよび欧州特許第３１８．２１６号に示されているコンパイルされたＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列由来のコンパイルされたＨＣＶ　ｃＤＮＡを示している。配列が由来するクローンは５′ 　−クローン３２゜ｂｌ１４ａ、　１８ｇ、　ａｇ３０ａ、ＣＡ２０５ａ、　ＣＡ２９０ａ、　ＣＡ２１６ａ、　ｐｉ１４ａ、　ＣＡ１６７ｂ。

ＣＡ１５６ｅ、　ＣＡ３４ａ、　ＣＡ３９ａ、　Ｋ９−１（ｋｇ−１とも呼ばれる）、　２６ｊ、　１３＋。

１２ｆ、　１４ｉ、　ｌｌｂ、　７ｆ、　７ｅ、　８ｈ、　３３ｃ、　４０ｂ、３７ｂ、　３５．３６．８１．３２０．３３ｂ。

２５ｃ、　１４ｃ、８ｆ、　３３ｆ、　３３ｇ、３９ｃ、　３５ｆ、　１９ｇ、　２６ｇ、　１５ｅ、　ｂ５ａ、　１５ｊｈ、　６におよびｐ１３１ｊｈ、である。

図の中で、配列の上の三つの水平のダッシュは推定の開始剤メチオニレフトンの位置を示している。この図の中にはＨＣＶ　ｃＤＮＡにコードされた推定ポリ蛋白のアミノ酸配列もまた示されている。ＨＣＶＩのクローン化されたＤＮＡの異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｉｅｓ）が大きなＯＲＦの推定的にコードされた配列の上に示されたアミノ酸によって示されている；かっこはクローン中のＨＣＶ　ｃＤＮＡの５′−または３″−末端に、あるいはそれらの近くで異質性が検出されたことを示している。

図１９は、生物学的サンプルのＨＣＶ　ＲＮＡの検出のための捕捉プローブおよびラベルプローブの配列を示している。

図２０は、ワラビウイルス　ポリ蛋白とＨＣＶゲノムの主要なＯＲＦにコードされた推定ＨＣＶポリ蛋白の模式的な配列を示している。図には、また、フラピウィスル　ポリ蛋白から裂かれたフラビウィルス　ポリペプチドの可能な機能が示されている。加えて、ＨＣＶポリペプチド、Ｎ　Ａ　Ｎ　Ｂ　ｓ−＋　−１およびＣ１００の、推定ＨＣＶポリ蛋白に対して相対的な位置が示されている。

図２２は、クローン８１中のＨＣＶ　ｃＤＮＡ挿入物のダブル−スラント　ヌクレオチド配列、およびそこにコードされたポリペプチドの推定アミノ酸配列を示している。

図２３は、り０−７３６中のＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列、／７゜−ン８１のＮＡＮＢＶ　ｃＤＮＡとオーバーラツプするセグメント、およびクローン３６の中にコードされたポリペプチド配列を示している。

図２４は、りｏ−ン３７ｂ中（ＤＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列、クローン３５とオーバーラツプするセグメント、およびそこにコードされたポリペプチドを示している。

図２５は、ＮＡＮＢＨ（図２５Ａ）を有するチンパンジーの肝のサンプル由来のＲＮＡおよびＮＡＮＢＨ（図２５Ｂ）を有するイタリア人の患者に関するＨＣＶ　ｃＰｃＲのオートラジオグラフを示している。

図２６Ａおよび図２６Ｂは肝の損傷の表示、ＨＣＶ　ＲＮＡの存在と、Ｎ５ＮＢＨを有する１匹のチンパンジーに対するアンチ−ＨＣＶ抗体の存在との間の一時的な関係を示すグラフである。

図２７は、り’　７ＣＡ８４ａ中のＨＣＶ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、そこにコードされたアミノ酸、およびクローンＣＡ３９ａとオーバーラツプする配列を示している。

図２８は、りｏ−７４０ｂ中のＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列、クローン３７ｂにオーバラップするセグメント、およびそこにコードされたポリペプチドを示している。

図２９は、ＨＣＶゲ／ム（７）、はぼ３００，３０．　および３ＣＩＤのラベル化され増幅された生成物を示すオートラジオグラフである。

図３２は、クローン４０ａ中のＨＣＶ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示している。

図３３は、ＨＣＶゲノムの保持領域由来のプライマーから伸長された増幅された生成物を示すオートラジオグラフである。

図３４は、りｅｌ−７３５中のＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列、クローン３６とオーパーラ・Ｉブするセグメント、およびそこにコードされたポリペプチドを示している。

図３７は、プローブとクローンａｇ３０ａとに９−１中のＨＣＶ　ｃＤＮＡ由来の）（ＣＶ　ＲＮＡの５１−領域由来のプライマーとの関係を示す図表である。

図３８は、ａｇ３０ａおよびに９−１由来のプライマーから伸俵された増幅された生成物のオートラジオグラフである。

図３９は、ヒト分離株２３および２７とＨＣＶＩの並べられたヌクレオチド配列を示している。ホモロガスな配列は（５印によって示されている。ノンーホモロガスな配列は小文字である。

図４０は、ヒト分離株２３および２７とＨＣＶＩの並べられたアミノ酸配列を示している。ホモロガスな配列は（寓）印によって示され、ノンーホモロガスな配列は小文字である。

図４１は、ＢＢ−ＮＡＮＢＶ感染チンパンジーの肝から単離され、クローン８１のＢＢ−ＮＡＮＢＶ　ｃＤＮＡでプローブされたＲＮＡのノーザーンブロノトのオートラジオグラフの網版再現性を示している。

図４３は、アンチ−ＮＡＮＡＢｓ−＋−＋・で感染されたプラズマから捕捉されたＮＡＮＢＶ粒子から抽出されクローン８１からの３２ｐ−ラベルＮＡＮＢＶ　ｃＤＮＡでプローブさレタ核酸のオートラジオグラフの網版再現性を示している。

図４４は、単離されたＮＡＮＢＶ核酸、クローン８１中のＮＡＮＢＶ　ｃＤＮＡ由来の３２ｐラベル化されたプラスとマイナスストランドＤＮＡプローブでプローブされた核酸を含有するフィルターのオートラジオグラフの再現性を示している。

図４６は、ヒト単離株２３のヌクレオチドコンセンサス配列を示し、変位体配列が配列ラインの下に示されている。コンセンサス配列中にフードされたアミノ酸もまた示されている。

図４７は、ヒト単離株２７のヌクレオチドコンセンサス配列を示し、変位体配列が配列ラインの下に示されている。コンセンサス配列中にコードされたアミノ酸もまた示されてい図４８は、フラビウイスルポリ蛋白および推定ＨＣＶポリ蛋白に対するＥｎｖＬとＥｎｖＲプローブとの関係を示すグラフである。

図４９は、単離株Ｔｈｏｒｍ、ＥＣ１，ＨＣＴ＃１８．　およびＨＣＶＩの複合配列ヌクレオチド配列の比較を示している。

図５０は、ＥＣｌ０のヌクレオチド配列とのＨＣＶＩ配列の複合体との比較を示している；このＥＣＩ　Ｏ配列はドツトの上のライン上にあり、モしてＨＣＶＩ配列はドツトの下のライン上にある。

図５１は、ヒト単離株ＨＣＴ＃１８．ＪＨ２３，ＪＨ２７゜Ｔｈｏｒｎｅ、ＥＣＩ、およびＨＣＶＩのコンセンサス配列の″ＥｎｖＬ″領域にコードされたアミノ酸配列１１７−３０８（ＨＣＶＩに相対的に）の比較を示している。

図５２は、ヒト単離株ＨＣＴ＃１８．ＪＨ２３，ＪＨ２７゜Ｔｈｏｒｍｅ、ＥＣＩ、およびＨＣＶＩのコンセンサス配列の’ＥｎｖＲ”領域にコードされたアミノ酸配列３３０−３６０　（ＨＣＶＩに相対的に）の比較を示している。

図５３は、プライマー混合物５′　−３の個々のプライマーのヌクレオチド配列を示している。

（以下余白）本発Ｂを　るためのり態用語「Ｃ型肝炎つィルスＪ　（ＨＣＶ）は、非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）の従来未知であった病原性物質に対して、当業者が保留していたものである。ＨＣＶの原型の単離物は、Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、１２２．　７１４　（Ｅ、Ｐ、Ｏ，公開第３１８．２１６号も参照のこと）。用ａＷ　ＨＣＶは、それと同じウィルスの種の新しい単離物もまた包含する。この用語の延長として、ＨＣＶによって引き起こされ、以前には血液性ＮＡＮＢ肝炎（ＢＢ−ＮＡＮＢＨ）と呼ばれていた疾病は、現在Ｃ型肝炎と呼ばれている。用語ＮＡＮＢＨおよびＣ型肝炎は、本明細書では互換可能に用いられ得る。

ＨＣＶは、その病原性の株はＢＢ−ＮＡＮＢＨを引き起こす、ウィルスの種である。それから誘導された弱毒化株あるいは欠損干渉粒子でもあり得る。以下に示すように、ＨＣＶゲノムはＲＮＡから構成される。ＲＮＡを含むウィルスは、比較的高い割合で突然変異を有することが知られている。すなわち、取り込まれるヌクレオチド当り、１０−３から１０”’オーダーと報告されている（Ｆｉｅｌｄｓ　＆　Ｋｎｉｐｅ（１９８６））　ｏ　従って、ＲＮＡウィルス中では遺伝子型の異質性や流動性が受け継がれるため、ＨＣＶの種の中には毒性あるいは無毒性などの多数の株／単難物がある。本明細書に記載の組成物および方法によって、種々のＨＣＶ株あるいは単離物の、増殖、同定、検出、および単離が可能となる。

ＨＣＶの幾種類かの異なる株／単離物が同定されている（以下寥照）。プロトタイプであるこのような株あるいは単離物の１つは、ＣＤＣ／ＨＣＶＩと呼ばれている（ＨＣＶＩとも呼ばれている）。ゲノムの部分配列のような、１つの株あるいは単離物から得られる情報は、当業者が標準法を用いて新しい株／単離物を単離し、そしてそのような新しい株／単離物がＨＣＶであるかどうかを同定のに十分に役立つ。例えば、いくつかの異なった株／単離物が以下に示しである。数多くのヒト血清（そして異なる地理的地域）から得られたこれらの株は、ＨＣＶＩのゲノムの配列から得られた情報を利用して単離された。

Ｅ、Ｐ、Ｏ，公開第３１８．２１６号および以下に記載の技術を用いて、ＨＣＶＩゲノムのＲＮＡのゲノムの構造およびヌクレオチド配列が予想された。このゲノムは、　１０，０００ヌクレオチドを含む一本鎖のＲＮＡであることが判っている。このゲノムは、正の鎖であり、そして約３，０００アミノ酸のポリタンパク質をコードする、連続の翻訳オーブンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有している。ＯＲＦ中では、大部分のポリペプチドタンパク質が非構造タンパク質を担っており、構造タンパク質（単数あるいは複数）は、Ｎ末端領域の最初のおよそ１／４にコードされているように見える。全ての既知のウィルスの配列と比較した場合、フラビウイルスのファミリーの非構造タンパク質、そしてペスチウイルス（これはいまではワラビウイルスのファミリーであると考えられている）と、小さいが十分なコリニア−のホモロジーが観察される。

ワラビウイルスのポリペプチドタンパク質（例としてヤローフィーバーウイルス）の可能な領域の概略図およびＨＣＶゲノムの主要なＯＲＦにコードされる、推定のポリペプチドタンパク質を図２０に示す。この図では、ＨＣＶポリタンパク質の考えられるドメインを示しである。フラビウイルスポリタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端方向へ、ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｃ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）、および非構造タンパク質（ＮＳ）ｌ、２　（ａ＋ｂ）、３．　４　（ａ＋ｂ）、および５を含む。

ＨＣＶＬのヌクレオチド配列中にコードされる推定のアミノ酸に基づいて、ＨＣＶポリタンパク質のＮ末端にある小さなドメインは、ワラビウイルスポリタンパク質のＮ末端に見いだされるヌクレオキャプシドタンパク質（Ｃ）と、大きさおよび塩基性残基の高い含有率が類似しているように見える。

ＨＣＶおよびヤローフィーバーウイルス（ＹＦＶ）の非構造タンパク質２．３．４、および５’　（ＮＳ　２−５）は、アミノ酸はいれつは異なっているが、類似の大きさおよび親水性の相手を有しているようである。しかし、Ｍ、Ｅ、およびＮＳ１タンパク質を含むＹＦＶポリタンパク質の領域に対応するＨＣＶの領域は、配列が異なるだけでな（、大きさ及び親水性の両方もまた全く異なっている。従って、ＨＣＶゲ／ムの特定のドメインが本明細書では、例えばＮＳＩあるいはＮＳ２のように呼ばれ得るが、この命名は推定であることを留意するべきである。ＨＣＶファミリーとワラビウイルスとの間には、これから２議されるべき多くの違いが存在し得る。

ＨＣＶの異なる株、単離体、あるいはサブタイプは、ＨＣＶ１と比較して、アミノ酸および核酸に改変が含まれると予想される。多（の単離体は、ＨＣＶ　１と比較した場合、全アミノ酸配列において相当（すなわち約４０％より多い）ホモロジーを示すと予想される。しかしながら、他のあまりホモロジーのないＨＣＶ単離体も見いだされ得る。これらは、例えば、ＨＣＶＩと類似の大きさのポリタンパク質をコードする約９，０００個から約１２，０００個のヌクレオチドのＯＲＦ、ＨＣＶＩと類似の疎水性および／あるいは免疫原性の性質を宵するコードされたポリタンパク質、およびＨＣＶｌに保存されているコリニアーボブチド配列の存在などの種々の基準によって、ＨＣＶであると定義される。さらに、ゲノムは正の鎖のＲＮＡであると思われる。

全てのＨＣＶ単離体は、本明細書に記載のＨＣＶｃＤＮＡにコードされるエピトープと免疫学的に同一（すなわち免疫学的に交差反応し得る）と見なし得る、少なくとも１つのエピトープをコードする。好ましくは、このエピトープは、本明細書に記載のアミノ酸配列中に含まれ、そして既に知られている病原体と比べた場合、ＨＣＶに特異である。エピトープの特異性は、抗ＨＣＶ抗体と免疫反応性があって、そして既知の病原体に対する抗体との免疫反応性がないことで決定される。

ＨＣＶ株および単離体は、進化論的に関連している。従つて、ヌクレオチドレベルでのゲノムの全体的なホモロジーは、約４０％以上であり得、おそらく５０％以上であり、おそらくは６０％以上であり、そしてより一般的には８０％である。

そして更に、少なくとも約１３ヌクレオチドの連続する配列に対応する。以下に示すように、ＨＣＶゲノム中には、可変領域及び超過変領域が存在することを留意すべきである。従って、これらの領域のホモロジーは、全体的なゲノムのそれより十分に少ないことが予想される。ＨＣＶ株のゲノムの推定の配列と、例えばＣＤＣ／ＨＣＶＩ　ｃＤＮＡとの間の対応は、当業者の技術によって決定され得る。例えば、推定のＨＣｖからのポリヌクレオチドの配列と本明細書に記載のＨＣＶｃＤＮＡ配列の情報とを直接比較することによって、決定され得る。あるいは、ホモロジーのある領域で安定した二本鎖を形成する条件下（例えば、Ｓ１消化に先立って用いられる）で、ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせ、一本鎖に特異的なヌクレアーゼで消化し、そして消化された断片の大きさを決めることによっても決定され得る。

ＨＣＶの株あるいは単離体の進化学的な関連により、推定のＨＣＶ株あるいは単離体は、ポリペプチドレベルでのホモロジーによって同定し得る。一般的に、ＨＣＶ株あるいは単離体は、ポリペプチドレベルで、少なくとも４０％ホモロジーがあると予想されており、約５０％より多く、おそらくは７０％より多く、そしてより一般的には８０％ホモロジーがあり、およびある場合には９０％より多くホモロジーがある◎アミノ酸配列のホモロジーを決定する技術は当分野では公知である。例えば、アミノ酸配列は、直接決定し得、そして本明細書に提供されている配列と比較し得る。あるいは推定のＨＣＶのゲノムのヌクレオチド配列が決定され得（普通はＣＤＮＡを介して）、そこにフードされる推定アミノ酸が決定され得、そして対応する領域が比較される。

本明細書で、ある配列から「誘導された」ポリヌクレオチドとは、ある配列のヌクレオチド配列中の１つの領域と少なくとも約６個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０から１２個のヌクレオチド、そしてさらにより好ましくは少なくとも約１５から２０個のヌクレオチドが対応しているポリヌクレオチド配列を言う。「対応している」とは、ある配列とホモロジーがあるかあるいは相補的であることを意味する。好ましくは、ポリヌクレオチドが誘導されたもとの領域の配列は、ＨＣＶゲノムに特異的な配列とホモロジーがあるかあるいは相補的である。より好ましくは、誘導された配列は、ＨＣＶ単離体のすべであるいは大部分に特異的である配列にホモロジーがあるか相補的である。配列がＨＣＶゲ／ムに特異的であるか否かは、当業者には公知の方法で決定され得る。例えば配列は、感染してない宿主あるいは他の生物に存在しているかどうかを決定するために、例えばシーンバンク（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）のようなデータバンク中の配列と比較し得る。配列はまた、例えばＨＡＶ、ＨＢＶ、およびＨＤＶの様に肝炎を引き起こすウィルス物質、およびワラビウイルスのメンバーの様なウィルス物質の配列とも比較し得る。誘導された配列の他の配列に対する対応あるいは非対応は、適当な緊縮の条件下でのハイブリダイゼーションによって決定され得る。核酸配列の相補性を決定するためのハイブリダイゼーション技術は当分野では公知であり、以下に述べられている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８２）らの文献を参照のこと。更に、ハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖ポリヌクレオチドのミスマツチは、公知の方法で決定され得る。例えば、二本鎖ポリヌクレオチド中の一本鎖領域を特異的に消化するＳｌの様なヌクレアーゼによる消化が含まれる。典型的なりＮＡ配列がそこから「誘導」され得る領域には、例えば、特異的なエピトープをフードする領域及び非転写及び／あるいは非翻訳領域が含まれるが、これらに限定されない。

誘導されたポリヌクレオチドは、示されたヌクレオチド配列から必ずしも自然に誘導されたものでなくてもよ（、例えば、化学合成あるいはＤＮＡ複製あるいは逆転写あるいは転写を含むあらゆる方法から作成され得る。更に、明示された配列に対応する領域の組み合せを意図する用途に合うように、当分野に公知の方法で改変し得る。

本明細書の用語「組換えポリヌクレオチド」は、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、あるいは合成に起源を持つポリヌクレオチドを指す。このヌクレオチドは、その起源あるいは操作によって、　（１）天然では結び付いているポリヌクレオチドのすべであるいは一部と結び付いていない、（２）天然に連結しているものとは別のポリヌクレオチドと連結しており、あるいは（３）天然には存在しない。

本明細書の用語「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのポリマー型のヌクレオチドで、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの両方を指す。この用語は、分子の一次構造のみを指していう。従って、この用語は、二本鎖あるいは一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。この用語はまた、例えば、当分野には既知の標識、メチル化、「キャソブス」、天然のヌクレオチドの１あるいはそれ以上のヌクレオチドのアナログによる置換、などの既知のタイプの改変、例えば、非荷電の連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバミン酸塩など）及び荷電の連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロチオエートなど）の様なヌクレオチド間での改変、例えば、タンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ上リシンなど）の様な修飾部分を含むもの、インター力レター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）と共にあるもの、牛レータ−（例えば、メタル、ラジオアクティブメタル、ホウ素、酸化力のあるメタルなど）を含むもの、アル牛レータ−を含むもの、修飾された連結（例えばアルファアノメリック核酸など）、および非修飾型のポリヌクレオチドなどが含まれる。

本明細書の用語、核酸の「センス鎖」は、ｍＲＮＡと配列上のホモロジーを有する配列を含む。「アンチセンス鎖」は、「センス鎖」と相補的な配列を含む。

本明細書の用語、ウィルスの「正の鎖のゲノム」は、ＲＮＡであってもＤＮＡであっても、一本鎖で、ウィルスのポリペプチド（単数あるいは複数）をフードするゲノムをｉｔ。

正の鎖のＲＮＡウィルスの例には、トガウィルス科、コロナウィルス科、レトロウィルス科、ピコルナウィルス科、およびカリチウイルス科が含まれる。あるいは以前はトガウィルス科にクラス分けされていたフラビウイルス科もまた含まれる。Ｆｉｅｌｄｓ　＆　Ｋｎｉｐｅ　（１９８６＞を参照のこと。

本明細書の用語「プライマー」は、適当な条件下におかれたとき、ポリヌクレオチド鎖の合成開始の点として機能し得るオリゴマーのことを指す。プライマーは、完全に、あるいは実質的に、コピーされるポリヌクレオチドの領域と相補的である。従って、ハイブリダイゼーションを行い得る条件下で、プライマーは、分析物の鎖の相補的な領域にアニールする。適当な反応剤（例えばポリメラーゼ、ヌクレオチドトリホスフェート、など）の添加によって、プライマーは、重合剤によって伸長し、分析物の鎖のコピーを形成する。プライマーは、一本鎖、あるいは代わりに一部あるいは全部が二本鎖であり得る。

用語「ポリヌクレオチド分析物」および「分析物鎖」とは、標的の配列を含んでいると思われる一本鎖あるいは二本鎖の核酸分子をいい、そして生物学的試料の中に存在し得る。

本明細書の用語「オリゴマー」とは、プライマーおよびプローブをさす。用語オリゴマーは、分子の大きさを意味しない。しかし、典型的にはオリゴマーは、長さが１０００ヌクレオチドより大きくなく、より典型的には、５００ヌクレオチドより大きくなく、さらにより典型的には、２５０ヌクレオチドより大きくない。それはｌＯｏヌクレオチドより大きくなくそして７５ヌクレオチドより大きくなく、そして５０ヌクレオチドより大きくない。

本明細書の用語「プローブ」とは、プローブ中の少なくとも１つの標的の領域の配列との相補性によって、標的の配列とハイブリッド構造を形成するポリヌクレオチドを含む構造を言う。プローブのポリヌクレオチドの領域は、ＤＮＡ、および／あるいはＲＮＡ、および／あるいは合成ヌクレオチドアナログを含み得る。

プローブには、「キャプチャープローブ」および「標識プローブ」が含まれる。

好ましくは、プローブには、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライムに使用された配列と相補的な配列は含まない。

本明細書の用語「標的領域」は、増幅および／または検知される核酸の領域をいう。用語「標的の配列」は、所望とする条件下でプローブまたはプライマーが安定なハイブリ、ドを形成する配列をいう。

本明細書の用語「キャプチャープローブ」は、結合パートナ−と結合する一本鎖ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドをいう。一本鎖ポリヌクレオチドは標的のポリヌクレオチド配列からなり、それは分析物であるポリヌクレオチド中で見い出される標的領域中の標的配列に相補的である。この相補的な領域は、分析物であるポリヌクレオチドを固形表面に固定するのに充分安定な二本鎖を与えるのに、充分に長く、標的配列に相補的である（結合パートナを介して）。

結合パートナ−は、第２の結合パートナ−に特有であり、その第２の結合パートナは固形支持体の表面に結合されることができるか、もしくは他の構造または結合パートナ−を介して固定支持体に直接に結合し得る。

ここで使用される、用語「標的づけるポリヌクレオチド配列」は、標的ポリヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列をいう。その配列は充分に長（、かつ標的配列に相補的であって所望とする充分な安ここで用いられている用語「結合パートナ−」は、リガンド分子に高い特異性で、例えば抗原およびそれに特異的な抗体として、結合可能な分子のことを言う。一般に、特異的な結合パートナ−は、単離条件下にアナライトコピー／相補鎖の二本鎖（捕捉プローブの場合）を不動化するのに充分なアフィニティーで、結合しなければならない。特異的結合パートナ−は当該分野に知られており、例えばビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびプロティンＡ、多くの知られたレセプターリガンドの組合せ、および相補ポリヌクレオチド鎖が含まれる。相補ポリヌクレオチド結合パートナ−の場合、パートナ−は通常少なくとも約１５塩基対の長さであり、少なくとも４０塩基対の長さであり得るフそれに加えて、ＧおよびＣ含有量が少なくとも約４０％であり、約６０％と同じくらいである。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成ヌクレオチドアナログを含み得る。

ここで用いられている用語「結合」は、共有結合または強い非共有性相互作用による結合について言う（例えば、疎水性相互作用、水素結合等）。共有結合は、例えば、エステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−硫黄の結合等であり得る。

ここで用いられている用語「支持体」は、所望の結合パートナ−がアンカーし得るあらゆる固体または半固体の表面について言う。適当な支持体には、ガラス、プラスチック、金属、ポリマーゲル等が含まれ、ビーズ、ウェル、ディツプスティック、膜等の形態をとり得る。

ここで用いられている用語「ラベル」は、検出可能な（好ましくは定量可能な）信号を与えるために用いられ得る、そして、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに結合可能な、あらゆる原子または部分のことを言う。

ここで用いられている用語「ラベルプローブ」は、アナライトポリヌクレオチド中の検出すべき標的配列に対して相補的な、標的付はポリヌクレオチド配列を含むオリゴマーについて言う。この相補領域は、ラベルにより横比される、「ラベルプローブ」と「標的配列」とを含む二本鎖が与えられるように、標的配列に対し充分な長さおよび相補性を有する。

オリゴマーはラベルに直接に、または互いに高い特異性を有する一組のリガンド分子により間接的に、結合する。高い特異性を有する一組のリガンド分子については、前述したが、多量体も含む。

ここで用いられている用語「多量体」は、同一の反復一本鎖ポリヌクレオチド単位の、あるいは異なる一本鎖ポリヌクレオチド単位の、直鎖または分枝のポリマーのことを言う。

この単位のうちの少なくとも１つは、第一の目的の一本鎖ヌクレオチド配列、典型的にはアナライトまたはアナライトに結合するオリゴマー（例えばラベルプローブ）に、特異的にハイブリダイズすることを可能にする配列、長さ、および組成を有する。このような特異性および安定性を達成するために、単位は通常少な（とも約１５ヌクレオチドの長さであり、典型的には約５０ヌクレオチド以下の長さであり、好ましくは約３０ヌクレオチドの長さである；さらに、ＧおよびＣ含有量は、通常少な（とも約４０％であり、せいぜい約６０％である。このような単位に加えて、この多量体は、策二の目的の一本鎖ヌクレオチド、典型的にはラベル化されたポリヌクレオチドまたは他の多量体に、特異的に、また、安定にハイブリダイズ可能な、多数の単位を含有する。これらの単位は一般に、前述の多量体とおよそ同じサイズおよび組成である。多量体がもう一つの多量体にハイブリダイズするように設計されている場合、第一の、および第二のオリゴヌクレオチド単位はへテロロガスであり（相違し）、選択されたアッセイ条件下では互いにハイブリダイズしない。従って、多量体は、ラベルリガンドであり得、あるいはプローブにラベルを結合させるリガンドであり得る。

ここで用いられている用語「ウィルスのＲＮＡＪにはＨＣＶ　ＲＮＡが含まれるが、ウィルスのゲノム由来のＲＮＡ。

その断片、その転写物、およびそれから由来する変異体配列のことを言う。

ここで用いられている用語「生物学的試料」は、個体から単離された組織または液体試料のことを言い、例えば血漿、血清、骨髄液、リンパ液、皮膚の外部断片、呼吸、腸および性尿器管、涙、唾液、乳、血液細胞、腫瘍および器官を含み１、インビトロ細胞培養物成分の試料（ウィルスに感染していると見られる細胞、組換え細胞、および細胞成分、細胞培養培地中で細胞を生育させて得られる馴化培地が含まれるが、これらに限定されない）も含むが、これらに限定されない。

１皿μＪす１障匠匪本発明の実施には、池に指示がなければ、当業者の中に入る化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の通常の技術が用いられる。このような技術は文献に充分に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｆｉｔｓｃｈ　＆　Ｓａｍｂｒｏｏｋ。

ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ＋　Ａ　ＬＡＢＯＬＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ　（１９ｇ２）；　ＤＮＡ　ＣＬＯＮＩＮＧ、第１および２巻（Ｄ、　Ｎ、　Ｇｌｏｖｅｒｇ、　１９８５）：　０ＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ　５ＹＮＴＨＥＳＩＳ　（Ｍ、　Ｊ、　Ｇａｌｔ編、　１９８４）；　ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤ　ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ　（Ｂ、　Ｄ、　Ｈａｉｅｓ　＆　Ｓ、　Ｊ、　ＨｉｇｇｉｎＪ：、　１９８４）：　ｔｈｅｓｅｒｉｅｓ、　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、）。

特に第１５４巻および第１５５巻くそれぞれ、ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎｓおよびｌｌ’ｕ編））。前述および後述の、ここで述べられている全ての特許、特許出願、および刊行物は、ここに参考文献として援用される。

本発明に有用な物質および方法は、ＢＢ−ＮＡＮＢＶの病因因子としてのＨＣＶの同定により、そしてＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列を含有するｃＤＮＡライブラリーから単離される、ヌクレオチド配列ファミリーが与えられることにより、可能となる。これらのｃＤＮＡライブラリーは、ＨＣＶ感染したチンパンジーの血漿中に存在する核酸配列に由来する。これらのライブラリーの一つであるｒｃＪ　ライブラリー（ＡＴＣＣ番号４０３９４）の構築は、Ｅ、Ｐ、Ｏ，公開第３１８．２１６号に記載されている。

ここに記載の配列と共に上記記載のＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列を用いることにより、生物学的試料中のウィルスのポリヌクレオチドを検出する試薬として有用な、オリゴマーが構築され得る。例えば、これらの配列から約８から１０ヌクレオチドのＤＮＡオリゴマーを合成することが可能である。このオリゴマーは、例えばウィルスを有すると思われる対象の供血、血液製剤、血清、またはウィルスが複製している細胞培養系の中の、ＨＣＶ　ＲＮＡの存在を検出するためのノ＼イブリグイゼーションブローブとして有用である。さらに、ここに記載の新規なオリゴマーは、ＨＣＶゲノムを更に特徴付けることを可能にする。これらの配列に由来するホゾヌクレオチドプローブおよびプライマーは、ｃＤＮＡライブラリー中に存在する配列を増幅させるために、および／またはオーバーラツプする他のｃＤＮＡ配列のｃＤＮＡ配列をスクリーニングするために用いられ得、これに続いて、さらにオーバーラツプ配列を得るために使用され得る。前述、およびＥ、Ｐ、Ｏ。

公開第３１８．２１６号に示された通り、ＨＣＶゲノムは、大きなポリタンパク質をコードする大きなオーブンリーディングフレーム（ＯＦ　Ｆ）を主として含むＲＮＡのようである。

前述に加えて、後述の情報は、さらなるＨＣＶ株および分離株の同定を可能にする。さらなるＨＣＶ株および分離株の単離と特徴付けは、当業者に知られた技術を用いて行われ得る。例えば、ウィルス粒子および／またはウィルスＲＮＡを含有するウィルス体構成成分から核酸を単離し、前述のＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列を含むクローンライブラリーをスクリーニングするために前述のオリゴマーを用いて、ｃＤＮＡライブラリーを作成し、モしてＥ、Ｐ、Ｏ，公開第３１８２１６号および前記記載のｃＤＮＡと新規分離株由来のＨＣＶ　ｃＤＮＡとを比較することにより、行われ得る。前述の定義部分に記載した、ＨＣＶのパラメーター内に適合する株または分離株は、容易に同定できる。ＨＣＶ株を同定する他の方法は、ここに示された情報に基づき、当業者に自明である。

ＨＣＶ　ｃＤＮＡ配Ｆ＋の単離本発明のオリゴマーは、ＨＣＶポリヌクレオチド中の標的となる配列と、ハイブリッド二本鎖構造を形成する領域を含有スる。オリゴマーの、ＨＣＶポリヌクレオチドノ〜イブリダイジング領域は、ここに与えられ、ＥＰＯ公開第３１８２１６号に記載されたＨＣＶ　ｃＤＮＡから確認され得る。プロトタイプＨＣＶｔ” あるＨＣＶＩ由来（７）ＨＣＶ　ｃＤＮＡの複合物を、図１８に示す。この複合配列は、λｇ　ｔ　ｌ　１　（ＡＴＣＣ番号第４０３９４号）中に存在するｒｃＪライブラリーに含まれる多数のＨＣＶ　ｃＤＮＡライブラリーから、およびヒト血清から単離された、多数のＨＣＶ　ｅＤＮＡクローンからの配列情報に基づ＜ｏ　ＨＣＶ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンは、ＥＰＯ公開第３１８２１６号に記載の方法により単離された。簡単に述べると、単離されたほとんどのクローンは、慢性ＨＬＶｇ染を伴い、ウィルスの高タイター、即ち、少な（とも１０’ｃｈｉｍｐ感染ｄｏｓｅ／＋ｏｌ（ＣＩＤ／■ｌ）を含有するチンパンジーからプールした血清を用いて構築されたＨＣＶ　ｃＤＮＡ　ｒｃＪライブラリーに由来する配列を含んでいた。プールされた血清は、ウィルス粒子を単離するために用いられた；これらの粒子から単離された核酸は、ウィルスゲノムに対するｃＤＮＡライブラリーを構築するための鋳型として用いられた。最初のクローンである５− １−１はｒｃＪライブラリーを感染個体の血清でスクリーニングすることにより得られた。最初のクローンの単離の後、配列の残りの部分が、既知のＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列の５′領域および３′領域に由来する合成ポリヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングすることにより得られた。

ｃＤＮＡ配列を繕う方法の記載は、殆ど歴史的な興味がある。得られた配列（およびその相補鎖）はここに提供されており、この配列またはその任意の部分が、ＥＰＯ公開第３１８２１６号に記載の方法と同様の方法を用いて部分配列を繕うことにより、合成法、あるいは合成法の組合せにより製造され得る。

オリゴマープローブおよびプライマーＨＣＶゲノム（図１８に示す）および／または好ましくはＨＣ■ゲノムの保存領域を用いて、ＨＣＶ　ＲＮＡのポジティブストランド、およびＨＣＶ　ｃＤＮＡにハイブリダイズするおよそ８ヌクレオチドまたはそれ以上のオリゴマーが調製され得る。これらのオリゴマーは、ＨＣＶヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを検出（単離および／またはラベル化を含む）ためのプローブとして、および／または標的ＨＣＶ配列の転写および／または複製の為のプライマーとして機能する。このオリゴマーは、標的となるＨＣＶヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、標的付けられたポリヌクレオチド配列を含有する；この配列は、意図する目的のために充分な安定性を有する二本鎖を、゛ＨＣＶ配列とハイブリダイズするのに充分な長さおよび相補性を有する。

例えば、意図する目的が、固定化により、標的ＨＣＶ配列を含むアナライトを単離することである場合、オリゴマーは、単離条件下でオリゴマーと結合して固相表面上にアナライトが不動化されるに充分な二本鎖安定性を与えるように、充分な長さと標的ＨＣＶ配列に対する相補性を有するポリヌクレオチド領域を含有するであろう。また、例えば、オリゴマーが、アナライトのポリヌクレオチド中の標的ＨＣＶ配列を転写および／または複製するためのプライマーとして機能する場合、オリゴマーは、ポリメライズ条件化で標的配列と安定な二本鎖をつくっているプライマーからポリメライズ試薬が、連続して複製することを可能にするために、充分な長さと標的ＨＣＶ配列に対する相補性を有するポリヌクレオチド領域を含有する。また、例えば、オリゴマーがラベルプローブとして用いられ、あるいは多量体に結合する場合、標的ポリヌクレオチド領域は、ラベルプローブおよび／または多量体と安定なハイブリッド二本鎖を形成するための充分な長さと相補性を有する。オリゴマーは最小約４個の連続したＨＣＶ配列に相補的なヌクレオチドを含有する；通常オリゴマーは、標的ＨＣＶ配列に相補的な、連続した最小約８個のヌクレオチド配列を含有し、好ましくは、標的ＨＣＶ配列に相補的な連続した最小約１４個のヌクレオチド配列を含有する。

適切なＨＣＶヌクレオチド標的付は配列は、図１８に示された以下のＨＣＶ　ｃＤＮＡヌクレオチドから選択される相補ヌクレオチドであるヌクレオチドを包含し得る（ｎｎ、−ｎｎ、は、約番号Ｘのヌクレオチドから約番号ｙのヌクレオチドまでを示す）：（以下余白）ｎｎ　−ｎｎ−’ｎｎ　−ｎｎ　Ｈｎｎ−−ｎｎ　’−３４０−ｊ３０’　−３３０−３２０−ｊ２０　−３１０’−３１０−３００’　−３００−２９０’　ｎｎ−２９０”’　ｎｎ−２８０’ｎｎ　−ｎｎ　’ｎｎ　−ｎｎ ”−２８０−ｎｎ−２７０’　ｎｎ−２７０−ｎｎ−２６０’　”−２６０−ｎｎ−２５０’ｎｎ−２５０−ｎｎ−２４０’　ｎｎ−２４０−ｎｎ−２３０’　 ”−２３０−ｎｎ−２２０７”−２２０−ｎｎ−２１０’　ｎｎ−２１０−ｎｎ −２００’　ｎｎ−２００−”−１９０’’ｎｎ　−ｎｎ　’ｎｎ　−ｎｎ　’ ｎｎ−１９０−ｎｎ−１８０’　−１８０−１７０’　−１７０−１６０’−１６０−１５０’　−１５０−１４０’　ｎｎ−１４０−”−１３０’ｎｎ　−ｎｎ　’ｎｎ　−市 −１３０−１２０’　−１２０−１１０’　ｎｎ−１１０−ｎｎ−１００’ｎｎ　−ｎｎ　’ｎｎ　−ｎｎｎ　ｎ−１００−ｎｎ　−９０ｒ　ｎｎ　−９ｏ　”’　ｎｎ　−ｅ　ｏ　ｒ　ｎｎ　−８ｏ　−ｎｎ−７０１ｎ％７ｏ　−ｎｎ−６０，ｎｎ−６ｏ　−ｎｎ− ５ａｔ　ｎｎ−５ｏ　−ｎｎ−４ｏｒｎｎ−４０”’　ｎ”−３ｏ　ｒ　ｎｎ− ３０”’　ｎ　ｎ−２０ｒ　ｎ　ｎ−２０−ｎｎ−１０：”−１０−ｎｎ１ｉ　ｎｎ１−　ｎｎ１ｏ；　ｎｎ１ｏ−ｎｎ２０；　ｎｎ２ｏ−ｎｎ３ｏ；ｎｎ３ｏ　−ｎｎ４ｏｇ　ｎｎ４ｏ　−ｎｎ５ｏ；　ｎｎ５ｏ　−ｎｎＩ）ｏ；　ｎｎ６ｏ　−ｎｎ、ｏ；””　７　Ｑ　＋”ｎ８Ｑ　ｌ　”ｎｅ　ｏ−ｎｎＱ　０１　ｎｎ　ａ　ｎ−ｎｎ　１ｏ　ｎ　；　ｎｎ　１ｏ　ｏ−ｎｎ　１１０＋ｎｎ１！Ｏ−ｎｎ１２０’　ｎｎ１２０　−　ｎｎ１３０’　”［０−”１４０’”１４０−　ｎｎ１２０’　ｎｎ１５０−　ｎｎ１６０’　ｎｎ１６０−０ｎ１７０’ ｎｎ１７０−　ｎｎ１８０’　ｎｎ１８０−　ｎｎ１２０’　ｎｎ１９０−　” ２００’ｎｎ１３１０　″　ｎｎ１３２０’　ｎｎ１３２０　−　ｎｎ１３１０ ’　ｎｎｌコ３０　−　”１３４０’ｎｎ１３４０−　ｎｎ１３５０’　ｎｎ１３５０−　ｎｎ１３６０；ｎｎ１３６０　”　ｎｎ１３７０；ｎｎ１３７０　− 　ｎｎ１３８０’　ｎｎ１３８０　−　”１３９０’　ｒ１ｎ１３９０　−　ｎｎ１４００’”１４００−　ｎｎ１３１０’　”１４１０−　ｎｎ１４２０’　ｎｎ１４２０−　ｎｎ１４３０’ｎｎ１４３０　”’　ｎｎ１４４０’　ｎｎ１４４０　””　ｎｎ１４５０’　”１４５０−　ｎｎ１４６０’ｎｎ１４６０− 　ｎｎ１４７０’　ｎｎ１４７０−ｎｎ１４８０’　ｎｎ１４８０−　ｎｎ１４９０’ｎｎ１４９０−　ｎｎ１５００’　”１５００−　”１５１０’　ｎｎ１５１０″″ｎｎ１５２０’ｎｎ１５２０−　ｎｎ１５３０’　ｎｎ１５３０−　ｎｎ１５４０’　ｎｎ１５４０−　ｎｎ１５５０’”１５５０−ｎｎ１３２０’ 　”１５６０−　ｎｎ１５７０’　ｎｎ１５７０−　”１５８０’ｎｎ１５Ｅｌｏ　−”１５９０’　ｎｎ１５９０−　ｎｎ１６００’　ｎｎ１６００　”　ｎｎ１６１０；ｎｎ１６１０−　ｎｎ１６２０’　ｎｎ１６２０−　ｎｎ１６３０ ’　ｎｎ１６３０−　ｎｎ１６４０’ｎｎ１６４０−　ｎｎ１６５０’　”１６５０−　ｎｎ１６６０’　ｎｎ１３６０−　”１６７０’ｎｎ１６７０−　ｎｎ１６８０’　ｎｎ１６ＥＩＯ−ｎｎ１６９０’　ｎｎ１６９０−　ｎｎ１７００；ｎｎ１７００　−　ｎｎ１７１０’　ｎｎ１７１０　−　ｎｎ１７２０’　ｎｎ１７２０　−　ｎｎ１７３０’ｎｎ１７３０　”’　ｎｎ１７４０；ｎｎ１７４０−　ｎｎ１７５０’　ｎｎ１７５０−　”１７６０’ｎｎ１７６０−　ｎｎ１７７０’　ｎｎ１７７０−　ｎｎ１７８０’　ｎｎ１７８０　”’　”１７９０；ｎｎ１７９０−　ｎｎ１８００’　”１８００−　ｎｎ１８１０’　ｎｎ１８１０−　”１８２０’ｎｎ１８２０−　ｎｎ１８３０’　ｎｎ１８３０−　” １８４０’　ｎｎ１８４０−　ｎｎ１８５０’ｎｎ１８５０−　ｎｎ１８６０’ 　ｎｎ１８６０−　”１８７０’　ｎｎ１８７０−　ｎｎ１８８０’ｎｎ１８８０　”’　ｎｎ１８９０’　”１８９０−　ｎｎ１９００’　ｎｎ１９００　” ’　”１９１０’ｎｎ１９１０−　ｎｎ１９２０’　ｎｎ１９２０−　ｎｎ１９３０’　ｎｎ１９３０−　”１９４０’ｎｎ１９４０−　ｎｎ１９５０’　”１９５０−　ｎｎ１９６０；ｎｎ１９６０−　ｎｎ１９７０；ｎｎ１９７０　”’ 　ｎｎ１９８０’　ｎｎ１９８０　’−ｎｎ１９０’　ｎｎ１９９０−　ｎｎ２０００；ｎｎ２０００−　ｎｎ２０１０’　ｎｎ２０１０−　ｎｎ２０２０；ｎｎ２０２０−　ｎｎ２０３０’ｎｎ２０３０−　ｎｎ２０４０’　ｎｎ２０４０ −　ｎｎ２０５０’　ｎｎ２０５０−　ｎｎ２０６０’ｎｎ２０６０−　ｎｎ２０７０’　ｎｎ２０７０−　ｎｎ２０８０’　ｎｎ２０８０−　ｎｎ２０９０’ ｎｎ２０９０−　ｎｎ２１００；”２１００−　ｎｎ２１１０’　ｎｎ２１１０　”’　ｎｎ２１２０’ｎｎ２１２０−　ｎｎ２１３０；ｎｎ２Ｌ３０−　ｎｎ２１４０’　ｎｎ２Ｌ４０−　ｎｎ２Ｌ５０’ｎｎ２１５０−　ｎｎ２１６０’ 　ｎｎ２１６０−　”２１７０’　ｎｎ２１７０−　ｎｎ２１８０’ｎｎ２１８０−　ｎｎ２１９０；ｎｎ２１９０−　ｎｎ２２００’　ｎｎ２２００−　ｎｎ２２１０’ｎｎ２２１０−　ｎｎ２２２０’　ｎｎ２２２０−　”’：２３０’ 　”’：：！３０−　”２２４０’ｎｎ：２４０　−　ｎｎ２２５０’　”２２５０　−　ｎｎ１３６０’　”２２６０　−　”２２７０’ｎｎ２２７０　−　 ”２２８０’　ｎｎ２２ｔ３０　−　ｎｎ：、”９０’　ｎｎ二２９０　−　ｎｎ：３００’ｎｎ２３００　−　”２３１０’　”＝３１０　−　ｎｎ２３２０ ’　”’二３２０　−　”２３３０’ｎｎ２３３０−　ｎｎ１３５０’　ｎｎ２３４０−　ｎｎ２３５０’　”２３５０−　”２３６０’ｎｎ２３６０　”’　 ”２３７０ｉ　ｎｎ２３７０　−　ｎｎ２３８０；　ｎｎ２３８０−　ｎｎ２３９０：”２３９０−　ｎｎ２４００’　ｎｎ２４００−　ｎｎ２４１０’　ｎｎ２４１０−　ｎｎ２４２０’ｎｎ２４２０−　ｎｎ２４３０’　”２４３０−　ｎｎ２４４０’　ｎｎ２４４０−　ｎｎ２４５０’”２４５０−　ｎｎ２４６０ ’　ｎｎ２４６０−　ｎｎ２４７０’　ｎｎ２４７０−　ｎｎ２４８０’ｎｎ２４ＥＩＯ−ｎｎ２４９０’　ｎｎ２４９０−　ｎｎ２５００’　ｎｎ２５００− 　ｎｎ２５１０’ｎｎ２５１０−　ｎｎ２５２０’　ｎｎ２５２０−　ｎｎ２５３０’　ｎｎ２５３０　”　”２５４０’”２５４０−　ｎｎ２５５０’　ｎｎ２５５０　”’　ｎｎ２５６０’　ｎｎ２５６０　”’　ｎｎ２５７０’”２５７０−　ｎｎ２５８０’　ｎｎ２５８０−　ｎｎ２５９０’　ｎｎ２５９０−　ｎｎ２６００’ｎｎ２６００−　ｎｎ２６１０’　ｎｎ２６１０−　ｎｎ２６２０’　ｎｎ２６２０−　ｎｎ２６３０’ｎｎ２６３０−　ｎｎ２６４０’　ｎｎ２６４０　”’　ｎｎ２６５０’　ｎｎ２６５０−　”２６６０；ｎｎ２６６０ −　ｎｎ２６７０’　ｎｎ１３６０−　ｎｎ２６８０’　ｎｎ２６８０−　”２６９０’ｎｎ２６９０−　ｎｎ２７００’　ｎｎ２７００−　ｎｎ２７１０’　ｎｎ２７１０−　ｎｎ２７２０’ｎｎ２７２０−　ｎｎ２７３０’　ｎｎ２７３０−　ｎｎ２７４０’　ｎｎ２７４０−　ｎｎ２７５０’ｎｎ２７５０−　ｎｎ２７６０’　”２７６０−　ｎｎ２７７０；ｎｎ２７７０−　ｎｎ２７ＥＩＯ’ ｎｎ２７８０　−　ｎｎ２７９０’　ｎｎ２７９０　−　ｎｎ２８００’　ｎｎ１３８００　−　ｎｎ２８１０’ｎｎ２８１０−　”２８２０’　ｎｎ２８２０　”’　ｎｎ２８３０’　ｎｎ２Ｅ’３０−　”２８４０’ｎｎ２８４０　−　ｎｎ２８５０’　ｎｎ２８５０　−　ｎｎ２８６０；　ｎｎ２８６０　−　ｎｎ２８７０’ｎｎ２８７０−　ｎｎ２８８０’　ｎｎ２８８０−　ｎｎ２Ｂ９０’ 　ｎｎ２Ｂ９０　”’　ｎｎ２９００’ｎｎ２９００−　ｎｎ２９１０’　ｎｎ２９１０−　ｎｎ２９２０’　ｎｎ２９２０　”’　ｎｎ２９３０’ｎｎ２９３０−　ｎｎ２９４０；ｎｎ２９４０−　ｎｎ２９５０’　ｎｎ２９５０−　ｎｎ２９６０’ｎｎ２９６０−　ｎｎ２９７０；”２９７０　”’　ｎｎ２９８０’ 　ｎｎ２９８０−　”２９９０’”２９９０−　”３０００’　ｎｎ３０００− 　ｎｎ３０１０’　”３０１０　”’　”３０２０’ｎｎ３０２０−　ｎｎ３０３０’　ｎｎ３０３０−　ｎｎ３０４０’　ｎｎ３０４０−　ｎｒ１３０５０’ ｎＪ″３０５０−　ｎｎ３０６０’　ｎｎ３０６０−　ｎｎ３０７０’　ｎｎ３０７０−ｎｎ３０８０’ｎｎ３０８０−　ｎｎ１３１０’　ｎｎ３０９０−　ｎｎ３１００’　ｎｎ３１００−　ｎｎ３１１０’ｎｎ３１１０−　ｎｎ３１２０ ’　ｎｎ３１２０−　ｎｎ３１３０’　ｎｎ３１３０−　ｎｎ３１４０’ｎｎ３１４０−　ｎｎ３１５０’　ｎｎ３１５０−　ｎｎ３１６０；ｎｎ３１６０−　ｎｎ３１７０’ｎｎ３１７０　−　”３１８０’　ｎｎ３１８０　−　ｒｌｎ３１９０’　ｎｎ３１９０　−　ｎｎ３２００’ｎｎ３２００−　ｎｎ３２１０’ 　３２１０　３２２０’　ｎｎ３２２０−　”３２３０；３２３０　３２４０’ 　３２４０　３２５０　ｊ２５０　３２６０ｎｎ３２６０−　ｎｎ３２７０’　ｎｎ３２７０−　ｎｎ：ｌ：ＥＩＯ’　”３２８０−　”３２９０’”３２９０ −ｎｎ３３００’　＝３００　ｊ３１０’　？３１０　３３２０ｎｎ３３２０− ｎｎ３３３０’　３’３０　３３−ｒａ　３＞＝ｏ　ｊ３５０’３３５０　３３６０’　３３６０　３ｊ７０’　３３７０　３３８０’３３８０　３３９０’　３３９０　３４００’　３４００　３４！Ｏ’”３４ＬＯ−ｎｎ３４２０’　３４２０　３４３０’　３４３０　３４４０’ｎｎ３ｎｏ　−ｎ”３４５０；　ｎｎ３４５０　−　ｎｎ３４６ｏ；　Ｉ’ｄ”３４６０　−　ｎｎ３４７０；ｎｎ３４７０−　ｎｎ：１４８０’　ｎｎ３４８０−　”３４９０’　ｎｎ３４９０　”　”３５００’”３６５０−　”３６６０’　ｎｎ３６６０−　”３６７０ ’　ｎｎ３６７０−　”３６８０’ｎｎ３６８０″″ｎｎ３６９０’　”３６９０−　ｎｎ３７００’　”３７００−　ｎｎ３７１０’ｎｎ３７１０−　ｎｎ３７２０’　ｎｎ３７２０−　”３７３０’　０ｎ３７３０−　”３７４０’ｎｎ３７４０−　”３７５０；”３７５０−　ｎｎ３７６０；ｎｎ３７６０−　ｎｎ３７７０’ｎｎ３７７０　”’　ｎｎ３７８０’　ｎｎ３７８０　”’　ｎｎ３７９０’　”３７９０　”’　”３８００’ｎｎ３８００−　ｎｎ３８１０’　ｎｎ３８１０−　ｎｎ３８２０’　ｎｎ３Ｂ２０−　ｎｎ１４３０’ｎｎ１４３０−　ｎｎ３８４０’　”３［１４０−ｎｎ３８５０；”３８５０−　ｎｎ３８６０’ｎｎ３８６０−　ｎｎ３８７０’　ｎｎ３８７０−　ｎｎ３８８０’　ｎｎ３８８０−　ｎｎ３［］９０’ｎｎ３８９０−　ｎｎ３９００’　ｎｎ３９００−　”３９１０；ｎｎ３９１０−　ｎｎ３９２０；ｎｎ３９２０−　”３９３０；ｎｎ３９３０−　ｎｎ３９４０’　ｎｎ３９４０−　ｎｎ３９５０’ｎｎ３９５０−　ｎｎ３９６０’　ｎｎ３９６０−　ｎｎ３９７０’　ｎｎ３９７０　 ”’　ｎｎ３９８０’ｒＹｎ３９８０−　ｎｎ３９９０’　ｎｎ１３１０−　ｎｎ４０００’　”４０００　”’　”４０１０’ｎｎ４０１０−　ｎｎ４０２０；ｎｎ４０２０　”’　ｎｎ４０３０’　ｎｎ４０３０　”ｎｎ４０４０；４０４０　４０５０’　ｎｎ４０５０−　ｎｎ４０６０’　４０６０　４０７０’’ ｎｎ　−ｎｎ　’ ｎｎ４０７０　”’　ｎｎ４０８０；ｎｎ４０［１０−ｎｎ４０９０’　４０９０　４１００’４１００　４１１０　４１１０　４１２０’　”４１２０−　ｎｎ４１３０’ｎｎ　−ｎｎ　；ｎ、ｎ　−ｎｎ４１３０　４１４０’　４１４０　４１５０’　ｎｎ４１５０−　ｎｎ４１６０ ’ｎｎ　−ｎｎ　ゝ　ｎｎ　−ｎｎ４１６０　４１７０　４１７０　４１８０；ｎｎ４１８０−　ｎｎ４１９０’ｎｎ　−ｎｎ　；ｎｎ　−ｎｎ４１９０　４２００’　４２００　４２１０’　ｎｎ４２１０−　ｎｎ４２２０ ’ｎｎ　−ｎｎ　’ｎｎ　−ｎｎｎｎ４２２０−　ｎｎ４２３０’　ｎｎ４２３０−　ｎｎ４２４０’　ｎｎ４２４０　”’　ｎｎ４２５０’ｎｎ４２５０−　”４２６０’　ｎｎ４２６０−　ｎｎ４２７０’　ｎｎ４２７０−　ｎｎ４２８０’”４２８０−　ｎｎ４２９０ ’　ｎｎ４２９０−　”４３００’　ｎｎ４３００−　ｎｎ４３１０’ｎｎ４３１０　”−”４３２０’　４３２０　４３３０’　ｎｎ１３１０−　ｎｒ１４３４０’４３４０　４３５０’　４３５０　４３６０’　ｎｎ４３６０−　ｎｎ４３７０’ｎｎ　−ｎｎ　“　ｎｎ　−ｎｎｎｎ　−ｎｎ　’ｎｎ　−ｎｎ４３７０　４３８０’　４３Ｅｉ０　４３９０’　４３９０　４−ｔｏｏ’ｎｎ　−ｎｎ　’ｎｎ　−ｎｎ　’ｎｎ　−ｎｎ、　’４４００　４４１０’　４４ｉ０　４４：Ｏ’　４４２０　ｑ４３０’４４３０　４４４０’　→→４０４シ５０’　”４４５０−　ｎｎ４４６０’ｎｎ　−ｎｎ　’　ｎｎ、　−ｎｎｎｒ！　−：１ｊ”、　’　ｎｎ　−ｎｎ、　；　ｎｎ、　−ｎｎ、　’４４６０　４４７０’　４４７０　−＋４８０　＋４８０　ｑ４９０’”４４９０−　ｎｎ４５００’　４５００　４５１０’　ｎｎ４５１０−　ｎｎ４５２０’ｎｎ４５２０　−　”４５３０Ｘ　”４５３０　−　ｎｎ４５４０；　ｎｎ４５４０　−　”４５５０；４７９０　４８００’　４８００　４８１０’　４８１０　４８２０４８２０　４８３０’　４８３０　４８４０’　４Ｅ！４０　４２１５０’間４８５０−　”４［］６０’　ｎｎ４８６０　”　ｎｎ４８７０’　ｎｎ４８７０″″”４Ｂ！！Ｏ；”４８８０−　ｎｎ４８６０’　ｎｎ４９０　”’ 　ｎｎ４９００’　ｎｎ４９００−　”４９１０’ｎｎ５０９０−　ｎｎ５１００’　ｎｎ１１００−　ｎｎ５１１０’　ｎｎ５１１０−　”５１２０’ｎｎ５１２０−　ｎｎ５１３０’　ｎｎ５１３０−　ｎｎ５１４０’　ｎｎ５１４０− 　ｎｎ５１５０’ｎｎ５Ｌ５０−　ｎｎ５１６０；ｎｎ５１６０−　ｎｎ４８７０’　ｎｎ５１７０−　ｎｎ５Ｌ８０’ｎｎ５１８０−　ｎｎ５Ｌ９０’　ｎｎ５ｉ９０−　ｎｎ５２００’　ｎｎ５２００−　ｎｎ５２１０’ｎｎ５２１０− 　ｎｎ１９６０’　”５２２０−　ｎｎ５２３０’　ｎｎ５２３０−　ｎｎ５２４０’ｎｎ５２４０−　ｎｎ５２５０’　ｎｎ５２５０−　ｎｎ５２６０’　ｎｎ５２６０−　ｎｎ５２７０’ｎｎ５２７０　”’　ｎｎ５２８０’　”５２８０−　”５２９０’　ｎｎ５２９０−　ｎｎ５３００’ｎｎ５３００−　ｎｎ５３１０’　ｎｎ５３１０−　ｎｎ５３２０’　ｎｎ５３２０−ｎｎ５３３０’” ５３３０−　ｎｎ１９６０’　ｎｎ５３４０−　ｎｎ５３５０’　ｎｎ５３５０ −　ｎｎ５３６０’ｎｎ５３６０−　”５３７０’　ｎｎ５３７０−　ｎｎ５３８０’　”５３８０−　”５３９０’ｎｎ５３９０−　ｎｎ５４００’　ｎｎ５４００−　ｎｎ５４１０’　ｎｎ５４１０−　”５４２０’ｎｎ５４２０　”− ｎｎ５４３０’　ｎｎ５４３０−　ｎｎ５二４０’　”５’、４０−　”５４５０’ｎｎ５４５０−　ｎｎ５４６０’　ｎｎ５４６０−　ｎ″′５”、７０’　 ”５４７０−　”５４８０’ｎｎｓ　４ｅ　ｏ−ｎｎ　５４　Ｑ　０＋　ｎｎ　ｓ　４ｏ　ｎ　ｎｎ　＝、ｓ　ｎ　ｎ　：　＊　ｎ　＝　＝　ｏ　ｏ−ｎｎ　＝　＝　１潤@； ”５９００　−　ｎｎ５９１０’　ｎｎ５９１０　”’　ｎｎ５９２０’　ｎｎ５９２０　”　ｎｎ５９３０’ｎｎ５９３０−　ｎｎ５９４０’　ｎｎ５９４０ −　ｎｎ５９５０’　ｎｎ５９５０−　ｎｎ５９６０’ｎｎ５９６０−　ｎｎ５９７０；ｎｎ５９７０　”’　ｎｎ５９ＥＩＯ’　ｎｎ５９８０−　ｎｎ５９９０’ｎｎ５９９０−　”６０００’　ｎｎ６０００−　”６０１０’　ｎｎ６０１０−　ｎｎ６０２０’ｒ１ｎ６０２０−　ｎｎ６０３０’　ｎｎ６０３０−　 ”６０４０’　ｎｎ６０４０　”　ｎｎ６０５０’ｎｎ６０５０−　ｎｎ６０６０’　ｎｎ６０６０　”’　ｎｎ６０７０′ｎｎ６０７０　”’　ｎｎ６０８０ ’ｎｎ６０８０−　ｎｎ６０９０’　ｎｎ６０９０−　ｎｎ６１００’　ｎｎ６１００−　ｎｎ６１１０’ｎｎ６１１０−　ｎｎ６１２０’　ｎｎ６１２０−　 ”６１３０’　ｎｎ６１３０−　ｎｎ６１４０’ｎｎ６１４０−　ｎｎ６１５０ ’　ｎｎ６１５０　”’　ｎｎ６１６０’　”６１６０−　ｎｎ６１７０’ｎｎ６１７０　−　ｎｎ６１８０’　ｎｎ６１［］０　−　ｎｎ６１９０’　ｎｎ６１９０　−　ｎｎ６２００’ｎｎ６２００−　ｎｎ６２１０’　”６２１０−　ｎｎ６２２０；ｎｎ６２２０−　ｎｎ６２３０’ｎｎ６２３０−　ｎｎ６２４０ ’　ｎｎ６２４０−　ｎｎ６２５０’　”６２５０−　”６２６０’ｎｎ６２６０−　ｎｎ６２７０’　”６２７０−　ｎｎ６２８０’　ｎｎ６２８０−　ｎｎ６２９０’ｎｎ６２９０　”’　ｎｎ６３００’　ｎｎ６３００−　ｎｎ５１１０；ｎｎ６３１０　”’　”６３２０’ｎｎ６３２０−　ｎｎ６３３０’　ｎｎ６３３０−　ｎｎ６３４０’　”６３４０−　ｎｎ６３５０’ｎｎ６３５０　” ’　ｎｎ６３６０’　ｎｎ６３６０　−　ｎｎ６３７０’　ｎｎ６３７０　−　ｎｎ６３８０’ｎｎ６３８０−　ｎｎ６３９０’　ｎｎ６３９０−　ｎｎ６４００’　ｎｎ６４００−　ｎｎ６４１０；０ｎ６４１０−ｎｎ６４２０’　６４２０　６４３０　６４３０　ｏ４４０’ｎｎ６４４０−ｎｎ６４５０；６４５０　６４６０　６４６０　６４７０ｎｎ６４７０−　ｎｎ６４８０；ｎｎ６４８０− 　”６４９０’　ｎｎ６４９０−　ｎｎ６５００’６５００　６５ｉ０’　６５１０　０）２０　Ｅ二２０　５５３０’ｎｒ１６５３０−　ｎｎ６５４０’　ｎｎ６５４０−　ｎｎ６５５０’　ｎｎ４５５０−　”５５５０’６５６０　εフッ０’　６５７０　５５Ｂ０’　”５８０　５１：ＯＱ’ｎｎＥ５９０−”６６００Ｘ６６００　：＝ＩＯ′６６ＩＱ　５５．’Ｑ’６６２０　６６３０’　ｃ：３０　６６４０’　６６４０　５６５０ｎｎ７１９０　−　ｎｎ７２００’　ｎｎ７２００　−　ｎｎ５２０’　ｎｎ７：！１０　−　ｎｎ７２２０’”７６４０−　ｒｌｎ７６５０’　ｎｎ７６５０−　ｎｎ７６６０’　”−，６６０− ｎｎ７６、ｏ；ｎｎ７５７０−　ｎｎ７６８０’　ｎｎ７６８０−　”τ６９０ ’　”１６９０−　ｎｎ＝：ｏｏ；ｎｎ７７００−　”７７１０’　ｎｎ７７１０−　”７７２０’　ｎｎ７７２０−　”７７３０’”７７９０−　ｎｎ７８００’　ｎｎ７８００−　ｎｎ７８１０’　ｎｎ７８１０″″ｎｎ７８２０’ｎｎ７８８０−　ｎｎ７８９ｏ’　ｎｎ７８９０−　ｎｎ７９００’　ｎｎ７９００ −　ｎｎ７９１０’ｎｎ７９１０−　ｎｎ７９２０’　ｎｎ７９２０−　ｎｎ７９３０’　ｎｎ７９３０−　ｎｎ７９４０’ｎｎ７９４０−　ｎｎ７９５０’　ｎｎ７９５０−　ｎｎ１９６０’　ｎｎ７９６０−　ｎｎ７９４０’ｎｎ７９４０−　ｎｎ７９８Ｑ’　ｎｎ７９８０　’″ｎｎ７９９０’　”７９９０−　” ８０００’”８０００　”’　”８０１０’　ｎｎ８０１０−　ｎｎ８０２０；ｎｎ８０２０−　ｎｎ８０３０’ｎｎ８０３０−　ｎｎ８０４０’　ｎｎ４９００−　”８０５０’　ｎｎ８０５０−　”８０６０’ｎｎ８０６０−　ｎｎ８０７０’　ｎｎ８０７０　”’　ｎｎ８０８０’　ｎｎ８０８０　”　ｎｎ８０９０’ｎｎ８０９０−　ｎｎ８１００’　ｎｎ８１００−　ｎｎ８１１０’　ｎｎ８１１０−　ｎｎ８１２０’ｎｎ８１２０　−　ｎｎ８１３０；　ｎｎ日１３０　−　”８１４０’　ｎｎ８１４０　−　ｎｎ５１５０’ｎｎ５Ｌ５０　”’　ｎｎ８１６０’　ｎｎ８１６０−　ｒｌｎ８１７０’　ｎｎ８１７０　”’　ｎｎ８１８０’”８１８０−　ｎｎ４８７０’　”８１９０−　”８２００’　” ８２００−　”８２１０’ｎｎ８２１０−　ｎｎ８２２０’　ｎｎ８２２０−　ｎｎ６２３０’　ｎｎ８２３０−　ｎｎ８２４０’ｎｎ８２４０−　ｎｎ８２５０’　ｎｎ８２５０−　ｎｎ８２６０’　ｎｎ８２６０−　ｎｎ８２７０’ｎｎ８２１０−　ｎｎ８２８０’　ｎｎ８２８０−　ｎｎ８２９０；ｎｎ５１１０− 　ｎｎ６３００’ｎｎ８４８０−　ｎｎ８４９０’　ｎｎ８４９０−　ｎｎ８５００’　ｎｎ８５００−　ｎｎ８５１０’ｎｎＥ！５１０−　ｎｎ８５２０’　ｎｎ８５２０−　ｎｎ８５３０’　ｒ１ｎ８５３０−　ｎｎ８５４０’ｎｎ８８８０−　ｎｎ８８８０’　ｎｎ８８８０−　ｎｎ８８９０’　ｎｎ８Ｂ９０−　 ”８９００’”９０２０−　ｎｎ９０３０’　ｎｎ９０３０　”’　ｎｎ９０４０；ｎｎ９０４０−　”９０５０’ｎｎ９０５０−　ｎｎ９０６０’ 体１：鰭ム）しかしながら、オリゴマーは、標的のＨＣＶ配列に相補的である配列のみからなる必要はない。さらに、ヌクレオチド配列あるいはオリゴマーが用いられる標的物に適切な他の部分を含み得る。例えば、ＨＣＶ配列のＰＣＲによる増幅のためのプライマーとしてそのオリゴマーが用いられる場合、それらには、２本鎖のとき、増幅される配列のクローニングを促進する制限酵素部位を形成する配列を含み得る。例えば、さらに、オリゴマーをハイブリダイゼーションアッセイ（下記）の「キャブチャーブローブ」として用いられる場合に、標的のＨＣＶ配列に相補的なヌクレオチド配列を含有するオリゴマーにカップルされる結合パートナ− をさらに含む。オリゴマーが含まれ得る、あるいはカップルされ得るのに有用な他の型の部分あるいは配列は、ヌクレオチドプローブの標識を含む、種々の目的に適切であることは当分野では公知である。

オリゴマーの調製は、例えば、削除、転写あるいは化学合成法を含む当分野には公知の方法によってなされる。標的のゲノムの配列および／または領域は、オリゴマーの標的づけるポリヌクレオチドが標的に依存して相補的であるように選択される。例えば、最終目的が、生物学的サンプル（例えば、血液）中のＨＣＶの存在をスクリーニングすることである場合、好ましいオリゴマーは、プローブおよび／またはプライマーとして用いられ、モしてＨＣＶゲノムの保存領域にハイブリダイズされる。オリゴマーが結合し得るＨＣＶゲノムの保存領域のいくつかは、ここに記載されている。例えば、図１８に示されているように、ヌクレオチド番号が、末端から約５から約２００、あるいは約４０００から約５０００、あるいは８０００から約９０４０、あるいは好ましくは、ヌクレオチド−３１８から１７４．４０５６から４４４８および４３７８から４９０２を含む領域である。保存されているゲノムの他の領域は、原型のＨＣＶ、すなわちＨＣＶＩを含む種々のＨＣＶの単離物のヌクレオチド配列の比較によって、容易に確定し得る。保存領域および非保存領域を決定するための遺伝子型間の比較をする方法は、当分野には公知であって、このような方法の例は、ここに記載されている。

基本的な核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、一本鎖の分析物核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）は、核酸プローブとハイブリダイズされ、そして生じた２本鎖が検出される。ＨＣＶポリヌクレオチドのプローブ（天然のあるいは誘導された）は、ハイブリダイゼーションによる新しいウィルス配列の検圧を可能とする長さである。６−８ヌクレオチドが働き得る長さであるが、１０−１２のヌクレオチドの配列が好ましく、そして約２０ヌクレオチドあるいはそれ以上が最も好ましい。好ましくは、これらの配列は、異種性を欠く領域に由来する。これらのプローブは、自動オリゴヌクレオチド合成法を含む、定法を用いて調製され得る。有用なプローブのなかには、例えば、ここに開示されている新しく単離されたクローン由来のもの、並びに下記に示すｃ　ＤＮＡライブラリーをプローブするのに有用な種々のオリゴマーがある。

ＨＣＶゲノムの任意の新しい部分への補体は納得される。プローブとして用いるために、フラグメントの長さが増される必要はないが、完全な相補性が望まれる。

ＨＣＶポリヌクレオチドの存在を検出するための因子としてこのようなプローブの使用（例えば、汚濁血液のスクリーニングで）ために、血液あるいは血清のような、分析される生物学的サンプルが、必要に応じて、含有される核酸の抽出のために、処理される。サンプルから得られた核酸は、ゲル電気泳動、あるいは他のサイズ分離技術に供せられ得、あるいは核酸サンプルは、サイズ分離しないでドツトプロットされ得る。プローブの標的づける配列に二本鎖にブリダイズを形成するのに、分析物核酸の標的の領域が一本鎖にされる。

配列が天然に一本鎖である場合、変性は要求されない。しかし、配列が２本鎖である場合、配列は変性される。変性は、当分野に公知の種々の方法で行われ得る。変性に続いて、分析物核酸およびプローブは、プローブ中の標的の配列の、分析物の推定上の標的の配列とのハイブリッド形成をなすのに適し、そして検出されるプローブを含む２本鎖を得る条件下に、インキュベートする。

得られた２本鎖の検出は、もしあれば、通常、標識プローブの使用で完成される；あるいは直接的にあるいは間接的に、ａ！識されたりガントへの特異的結合によて検出され得れば、プローブはｔ＝Ｘａされ得ない。適切な標識、およびプローブおよびリガンドの標本方法は当分野に公知であって、例えば、公知の方法（例えば、ニックトランスレーションあるいはキナージング（ｋｉｎａｓｉｎｇ））を用い得る放射活性橋本、ビオチン、蛍光基、ケミルネ／セント基（例えば、ジオキシエタン、特に誘起ジオキシエタン）、酵素、抗体を含む。

分析物に結合さすのに用いられるプローブの領域は、ＨＣ■ゲノムに完全に相補的につくられ得る。従って、通常、不正確さを避けるために高度に厳重な条件が望まれる。しかし、高度に厳重な条件は、プローブが異種性を欠くウィルスゲノムの領域に相補的である場合にのみ、用いられるべきである。

ハイブリダイゼーションの厳重さは、温度、イオン強度、時間の長さおよびホルムアミドの濃度を含み、ハイブリダイゼーションの間、および洗浄の工程の間の多くの因子によって決定される。これらの因子は、例えば、Ｍｎ１ａｔｉｓ、Ｔ、　（１９８２）に概説されていり。

当分野に公知のこの基本的な方法の変法もまた、外来物質からの検出されるべき２本鎖の促進された分離および／または標識部分からの／グナルの増幅の方法を含んで、用いられ得る。これらの変法の多くは、例えば、ＭａｔｔｈｅｖｓおよびＫｒ１ｃｋａ　（１９８８）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１６９：ｌ；　Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ　ら、（１９８８）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４２：２２９；およびＭｉｔｔｌｉｎ　（１９８９）、　ＣＣ１１ｎｉｃａｌｃｈｅ、　３５：１８１９に総説されている。これらおよびアッセイの形態が記載されている次の出版物は、ここに引用文献とじて援用されている。これらのアッセイでＨＣＶを検出するために適したプローブは、標的のＨＣＶポリヌクレオチド配列にハイブリダイズして分析の鎖と２本鎖を形成する配列を含有する。ここで、この２本鎖は、特定のアンセイ系において検出のために十分に安定である。

適切な変法は、例えば、１９８９年９月９日に特許になった、米国特許第４．８６８．１０５号、およびＥ、Ｐ、Ｏ，公開第２２５．１１０７号（１９８７年６月１６日に公開）に記載されている。これらの出版物には、分析物核酸が、標識プローブセットおよび牛ヤブチャーブローブセノトにハイブリダイズされる、液相核酸ハイブリダイゼーションア、セイが記載されている。　ブローブー分析物複合体は、キャプチャープローブセットと相補的である個体固定されたキュブチャーブローブとのハイブリダイゼーションによりカップルされる。分析物のアミノ酸は、固相複合体として溶液から除去される。分析物を固相複合体の形態で有することは、アッセイでの次の分離工程を促進する。標識プローブセットは、ハイブリダイゼーションを介しての固相／分析物複合体に結合される標識されたプローブと相補的である。

一般に、ＨＣＶゲノム配列は、感染患者には比較的に低レベル、すなわち、ｍ＋当たり約１０２−１０３のチンパンジーを感染させる用量（ＣＩＤ）で血清中に存在する。このレベルは、ハイブリダイゼーションアッセイで増幅法が用いられるのに要求される。このような技術は当分野に公知である。

例えば、Ｅｎｚｏ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅａｌ　Ｃｏｐｏｒａｔｉｏｎ　”Ｂｉｏ −Ｂｒｉｇｅ＋システムでは、ＤＮＡプローブに非修飾の３”−ポリーｄＴ−末端を付加するために末端デオキ／ヌクレオチドトランスフェラーゼが用いられる。このポリｄＴ末端付加のプローブは、標的のヌクレオチド配列にハイブリダイズされて、そして次に、ビオチン修飾されたポリＡにハイブリダイズされる。ＰＣＴ公開８４１０３５２０およびＥＰ公開第１２４２２１号には、（１）分析物が酵素標識されたオリゴヌクレオチドに相補的である１本鎖のＤＮＡプローブにアニールされ：そして（２）得られた末端付加された２本鎖が、酵素標識されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる：　ＤＮＡのハイブリダイゼーションアッセイが記載されている。Ｅ　Ｐ　Ａ　２０４５１０には、分析物ＤＮＡが、ポリーｄＴ末端のような末端を有するプローブ、ポリＡ配列のようなプローブ末端にハイブリダイズする配列を有する増幅鎖に結合し、および標識鎖の大部分に結合し得るＤＮＡノ＼イブリダイゼーンヨンアソセイが記載されている。Ｅ、Ｐ、Ｏ，公開簗３１７．０７７号（１９８９年５月２４日公開）に記載されているハイブリダイゼーションアッセイは、約１０６／ｍｌのレベルで配列を検出し、１本鎖の分析物核酸に結合し、さらに、多（の１本鎖標識オリゴヌクレオチドに結合する核酸マルチマーを用いている。と（に記載されている技術には、〕＼イブリダイゼーシコン系の一部として、血清中に約１０，０００倍（すなわち、約１０６配列／　ｍ　ｌ　）標的のＨＣＶ配列の増幅物が含有される。増幅は、例えば、５ａｉｋｉら、（１９８６）、ＭｕｌｌｉＳ、米国特許第４．６８３．１９６号、およびＭｕｌｌｉｓら、米国特許第４、６８３．２０２号に記載のポリメラーゼチェーンリアクシラン（ＰＣＲ）法により完成される。増幅は、ＨＣＶの標的配列の精製の前、あるいは好ましくは、精製に引き続いてなされ得る。

例えば、増幅は、米国特許第４．８６８．１０５号に記載のアッセイ法とともに用いられ得るし、あるいは、さらに増幅が望まれる場合には、Ｅ、Ｐ、Ｏ，公開第３１７．０７７号に記載のハイブリダイズ系とともに用いられ得る。

分析物ポリヌクレオチド鎖中のＨＣＶ配列を検出する好ましい方法は、米国特許第４．８６８．１０５号およびＥ、、　Ｐ、Ｏ，公開第３１７，０７７号に記載のハイブリダイゼーション検出法に基づいている。これらの方法は、分析物の核酸中の標的の配列にハイブリダイズするキャブチャーおよび標識プローブを用いる、液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイである。

生物学的サンプルのＨＣＶをスクリーニングするアッセイの使用において、用いられるプローブは、ＨＣＶゲノムの保存領域に結合される。キャプチャーおよび標識プローブは、標的の配列への結合に配置され得る。あるいは、好ましいモードのキャプチャーおよび標識プローブはセクトで存在し、そして１つの七ノドのプローブ池のセットのプローブとともに配置されない。後者のモードにおいて、好ましくは、複数のキャプチャープローブのセットがゲノムの最も保存された領域にハイブリダイズし、一方、複数の標識プローブのセットは、少しの相違を示すりょいきにハイブリダイズし得る。例えば、図１８に示される原型のＨＣＶＩ　ｃＤＮＡ配列を用いて、約−３１８から約１７４のヌクレオチドの領域および／または約４３７８から４９０２の領域のヌクレオチド、および／または約４０５６から約４４４８の領域のヌクレオチドの配列にハイブリダイズするプローブが用いられた。好ましいプローブは、ＨＣＶゲノムの５゛領域の配列にハイブリダイズする。なぜなら、下記に示すように、この領域は、高度に保存されるようだ。従って、好ましいプローブは、例えば、図１８に示されているように、約− ３１８から約１７４のヌクレオチドにハイブリダイズし得る。例えば、ウィルスゲノム配列の検出、あるいはＰＣＲ増幅により生じたＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列の検出、あるいは、正のＨＣＶ　ＲＮＡ鎖に対する複製中間生成物の検出の目的に応じて、保存領域の玉鎖およびまたはその補体にハイブリダイズするプローブが用いられる。

（鼾細２ＨＣＶ／ｃＰＣＲ法を　いた、ＨＣＶ　ＲＮＡ　びそののポリヌクレオチドの検出ＨＣＶ　ＲＮＡまたはＨＣＶ　ＲＮＡに由来するポリヌクレオチドの特に好ましい検８法はこの出願の主題である、ＨＣＶ／ｃＰｃＲ法であり、５ａｉｋｉ等（１９８６）、Ｍｕｌｌｉｓによる米国特許番号４，６８３，１９５及びＭｕｌＩｔｓ等による米国特許番号４，６８３，２０２により述べられている、ポリメラーゼチェーン反応技術（ＰＣＲ）を利用する。ＨＣＶ　／　ｃ　Ｐ　ＣＲ法はＨＣＶゲノムの性質に関しここで与えられる情報に由来するプライマーとプローブを利用する。

一般に、ＰＣＲ技術では、短いオリゴヌクレオチドブライマーが準備され、所望の配列の反対の末端に合う。プライマー間の配列は知られる必要はない。ポリヌクレオチドのサンプルは好ましくは熱により抽出され、変性され、超過モルに存在するオリゴヌクレオチドブライマーとともにハイブリッドされる。ポリメライゼーシヨンは、三リン酸デオキシヌクレオチドまたはアナログヌクレオチド（ｄＮＴＦ　Ｓ）の存在する時に鋳型及びプライマー依存的なポリメラーゼにより触媒作用される。このことは、５′基のそれぞれのプライマーを含む２つの”長い生成物”に帰着し、元の鎖の新しく合成された補足に共有結合される。複製されたＤＮＡは再び変性され、オリゴヌクレオチドブライマーとともにハイブリッドされ、重合条件にもどされ、２回目の複Ｍ回路が始められる。

２回目の回路は２つの元の鎖、回路ｌからの２つの長い生成物、及び長い生成物から複製された２つの”短い生成物”を供給する。短い生成物は標的配列に由来する配列（センス又はアンチノーゼ）をふくみ、プライマー配列のある５′及び３′基に側面をもつ。各追加の回路では、短い生成物の数が指数関数的に複製される。従って、このプロセスは特別な標的配列の増幅の原因となる。この方法では、ＨＣＶ　ＲＮＡ。

またはその断片を含むと推測されるサンプルが準備される。

このサンプルは通常はＮＡＮＢＨを持つと推測される独立したものから取り出される。しかしながら、サンプルの池の源は例えば、ウィルスがｉ製されるｖｉｔｒｏシステムからのならし培地または細胞が含まれる。サンプルは、しかしながら、標的核酸配列を含まなければならない。

サンプルはそれからＨＣＶ　ＲＮＡの逆転写であるＨＣＶｃＤＮＡにする条件が行われる。ＲＮＡの逆転写は当業者には公知であり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ等（１９８２）及び酵素学法に述べられている。逆転写の好ましい方法は例えば、レトロウィルス、好ましくはトリ骨髄芽球ウィルス（ＡＭＶ）から分離され、組換え分子を含む、様々な源からの逆転写酵素と、転写に適した条件を利用する。逆転写のＨＣＶ　ｃＤＮＡ生成物はＲＮＡ、逆転写の一回目の結果である、ＤＮＡハイブリッド、それ以降のＤＮＡ、及び２回目以上の転写の結果であるＤＮＡハイブリッド内にある。

逆転写酵素により得られたこの１（ＣＶのｃＤＮＡを、次に標的配列を増幅するためにＰＣＲした。これを実施するために、このＩ（Ｃ’／のｃＤＮＡを変性し、分離された開鎖は、標的配列に隣接したプライマーと供にハイブリ、ドした。

鎖の分離は、適切な変性手段ならば、当業者に知られた、物理的、化学的、あるいは酵素的な手段の何によってでもよい。推奨方法は、物理的方法で、完全に（９９％）変性するまで核酸を加熱する工程を含む。典型的な熱変性は、約８０℃ から１００℃の間の温度でで、約１分から１０分間の間行った。ＨＣＶのＣＤＮＡをプライマーと供にハイブリッドした後、標的のＨＣＶ配列は、プライマーのオリゴヌクレオチドにより複製鎖の合成を開始させるという、ポリマー化手段によって複製した。プライマーは、ＨＣＶのゲノムの配列に相補的である様に選ばれた。

ＨＣＶのｃＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の領域に相補的ナオリゴマー性のプライマーは、図１８に与えられたｃｏｍｐｏｓｔ　ｔ６　ｃＤＮＡ配列からの［ＩＣＶのｃＤＮＡ配列から設計された。

プライマーは、一つのプライマーから合成され、テンプレート（相補鎖）から分離した、伸長産物が、池のプライマーの伸長用テンプレートとして、定義された長さの複製鎖を与えることができる様に、二重鎖配列の上の相対的位置がなる様に選択した。

最高効率の増幅のためには、プライマーはｊ１１鎖であるのが好適であるが、二重鎖であっても構わない。二重鎖の場合には、伸長産物を生成するために用いる前に、先ず、開鎖を分離するために処理しなければならない。プライマーは、オリゴデオキシヌクレオチドが好適である。プライマーは、ポリマー化用の試薬の存在下で伸長産物の合成の開始をするためには、十分長くなくてはならない。プライマーの適切な長さは、温度、およびプライマーの由来、および使用法等を含む、多くの因子に依存する。例えば、標的配列のｃｏａ＋ｐｌｅｘｔｔｙに依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には約１５から４５のヌクレオチドを含むが、場合によってはこれより多いことも少ないこともある。短いプライマー分子で、テンプレートと十分安定なハイブリッド複合体を形成するには、一般により低い温度が要求される。

本明細書に用いたプライマーは、増幅されるべき各特異的す異なる鎖に「実質的に」相補的な様に選択されている。そのためプライマーは、テンプレートの正確な配列を反映する必要はな（、それらの対応する鎖に選択的にハイブリッドするのに十分な相補性を持たなければならない。例えば、非相補的なヌクレオチド断片は、プライマー配列の鎖に相補的な残りの部分で、プライマーの５・−末端に結合することもある。

あるいは、非相補的な塩基あるいはより長い配列が、プライマーの中に点在し、そのため、増幅されるべき片方の鎖の配列に対し十分なだけ相補的となり、それとハイブリダイズし、ポリマー化手段により伸長された、二重鎖構造を形成する。

プライマー中の非相補的なヌクレオチド配列は、制限酵素部位を含むことがある。標的配列のく両）末端に制限酵素部位を加えることは、標的配列をクローニングする際に特に有用である。

本明細書で用いる用語「プライマー」は、特に増幅されるべき標的領域の（両）末端配列に関する情報に部分かの曖昧さがある場合に、一つ以上のプライマーを指すことがあることは理解されたい。「プライマー」は、配列中の可能な変化を表す配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドの集合を包含する、あるいは、典型的な塩基対形成をするヌクレオチドを含むことが許されるため、である。この集合中の、ブライマーオリゴヌクレオチドの一つが、標的配列の末端と相同的である。実施例にはこの特殊な例を示してあり、４４−ｍｅｒｓと４５−ｍｅｒｓのオリゴマーの組を、）ｆｃＶゲノムの潜在的可変領域の増幅を開始するのに朋いている。

プロトタイプ株であるＦＩＣＶ　１から誘導された配列を持つのＨＣＶの種々の株あるいは単離橿があることは予期されていた。そのため、変種株を検出するために、ＨＣＶゲノムの保存領域とハイブリッドするプライマーを構成することが好ましい。保存領域は、数種のＨＣＶの株／単１ＩＩｔ種ヌクレオチドあるいはアミノ酸配列を比較することによって決定される。前出の文献の記述によると、ＨＣＶゲノム中には、少なくとも三つのアミノ酸の保存領域があり、プライマーはその中から由来させている。

これらの領域は、信じられているものである。後に実施例中で記述されるプライマーは、Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓの保存領域との配列相同性に基づいて、ＩＩｃＶの保存領域と信じられている部位から由来したものである。

オリゴヌクレオチドブライマーは、適切な方法ならば、如可なる方法で：Ａ製してもよい。特定の配列を有するオリゴヌクレオチドの調製方法は、当該分野では公知であり、例えば、適切な配列のクローニングおよび制限酵素切断による、および、直接の化学的合成による、方法を含む方法で調製できる。

化学的合成法には、例えば、Ｎａｒａｎｇらの（１９７９）記述したフォスフオトリエステル法、Ｂｒｏｗｎらの（１９７９）開示したフォスフオシエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅらの（１９８１＞開示したジエチルフォスフォアミデート法、および米国特許第Ｎｏ、　４．４５８．０６６号の個体担体法がある。

所望するならば、分光学的に、光化学的に、微生物学的に、免疫化学的に、あるいは化学的に検出可能な手段を組み込むことにより、プライマーは標識してもよい。

テンプレート依存性のオリゴヌクレオチドブライマーの伸長反応は、ポリマー化薬剤により触媒され、適切な量の四種のデオキシリボヌクレオチドトリフォスフェート（ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰＳｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ　）あるいはその類似物の存在下で、適切な、塩類、金属カチオン、およびｐＨ緩衝系からなる反応溶媒中で行われる。適切なポリマー化薬剤は、プライマー依存性およびテンプレート依存性のＤＮＡ合成を触媒する酵素である。知られているＤＮＡポリメラーゼには、例えば、Ｅ、ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩあるいはそのＫｌｅｎｏｖ断片、Ｔａ　ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼがある。

これらのＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ合成を触媒する反応条件は公知である。

この合成の産物は、テンプレート鎖およびプライマー伸長鎖から構成される二重鎖の分子であり、その中に標的配列を包含している。これらの産物は、次には、以降の複製の段階ではテンプレートとして＃！能する。復製の第２段階では、第１サイクルのプライマー伸長鎖は、その相補的なプライマーと７二−ルする；この合成は、５・−末端および３・−末端の両方にプライマー配列あるいはその相補体が結合した、「短い」産物を生成する。変性、プライマーの７二−リング、および伸長の繰り返されるサイクルは、プライマーによって定義される標的領域の指数的な蓄積をもたらす。核酸からなる標的領域を包含する、所望する童のポリヌクレオチドを得るために十分なサイクル数が行われる。所望する量は、変化し、ポリヌクレオチド産物の果たす機能によって決定される。

ＰＣＲ法は、多くの一時的な配列に対して行うことができる。

例えば、ＰＣＦｉは、各段階の終わりに新しく試薬を加え、あるいは、予め決めた段階数の後に新鮮な試薬を加えることにより、全ての試薬を同時に入れるような様式で、段階的に行うこともできる。

推奨する方法においては、ＰＣＲ反応は熱安定性酵素を利用して、日勤化された工程として行った。この工程では、反応混合物は、変性過程、プライマーのアニーリング過程、および反応過程をサイクルさせられる。熱安定性酵素を用いた使用法に特に適合した、酵素を各サイクル毎に加える必要がないので液体制御システムを持たない、装置を用いてもよい。この種の装置は、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　Ｃａｒｐ、から市販されている。

ＰＣＢによる増幅の後、標的ポリヌクレオチドは、かなり厳格なから適切に厳格なハイブリダイゼーシヨンおよび洗浄条件下で、標的配列と安定にハイブリッドを形成するプローブポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより検出される。もしも、プローブが標的配列と完全に相補的（即ち、約９９ｚあるいはそれ以上）であると期待できるならば、かなり厳格な条件が用いられる。もしも、妓らかのミスマツチが予想されるならば、例えば、プローブが完全に相補的ではない変異株が結果として予想されるならば、ハイブリダイゼーションの厳格さは減じられる。しかしながら、条件は非特異的／偶発的結合の排除を巨的に選択される。ハイブリダイゼーションに影響を与える条件、および、非特異的結合を選別するための条件、は公知であり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓらにより（１９８２＞記述されている。一般的に、低い塩濃度および高温は結合のストリンジェンンーを増す。例えば、厳格な条件とは、約Ｑ、１χＳＳＣと、Ｏ，１ｍ　５ＤＳ８含む溶液中でインキュベートし、約６５°Ｃのインキュベーション／洗浄温度、適度に厳格な条件とは、約１から２　Ｘ　ＳＳＣと、０．１％　ＳＤＳで、約５０から６５°Ｃのインキュベーション／洗浄温度、と考えられている。低いストリンジエンシー条件は、２　ｘ　ＳＳＣで、約３０から５０℃である。

ＨＣＶ標的配列のプローブは、図１８に示したＩＪＣＶのｃＤＮＡ配列から、あるいは新しい１ｆｃＶ分離株から、由来したものでよい。

ＨＣＶプローブは、標的領域を覆うならば、そしてプライマー部分が排除されているならば、そして標的領域と特異的にハイブリダイゼーシヨンするならば、如何なる長さでもよい。もしも、完全な相補性があるならば、すなわち、その株がプローブと同じ配列を含有するならば、二重鎖は厳格な条件下でさえ相対的に安定であり、プローブは短（とも、すなわち約１０から３０塩基対の長さでも、構わない。もしも、プローブにある程度のミスマツチが予想されるならば、すなわち、プローブが変異した領域とハイブリダイズすることが疑われるならば、長さはミスマツチの効果の幾分かを補償する様に考えられているため、プローブはより長（される。この例は、プローブをＨＣＶの潜在的な変異株に結合させ様と設計した実施例に見られる。この場合、プライマーは、ＨＣＶゲ７ムの仮想的な保存領域に虫来したＨＣＶ　ｃＤＮＡに結合する様に設計され、標的領域は潜在的に変異（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓのモデルに基づ（）を含む部位である。ＨＣＶ標的配列を検出するために用いたこのプローブは、およそ２６８塩基対であった。

標的配列に相補的なプローブの核酸は、以前にプライマー配列の合成用に記述したのと同様な技術を用いて合成できる。

所望するならば、プローブは標識してもよい。適切な標識物は、以前に記述しである。

時として、プローブにより検出された、ＰＣＲ産物の長さを決定したいことがある。これは、もし変異したＨＣＶ株が標的領域に欠損を有している場合、あるいは、ＰＣＲ産物の長さをＷＬ認したいと望む場合に、起こる。この様な場合、プローブと／−イブリダイズすると同時に、この産物をサイズ分析に付することが望ましい。核酸のサイズを決定する方法は、公知であり、たとえば、ゲル電気泳動、グラジェント中での沈降、およびゲル排除コロマドグラフィー、が含まれる。

生物学的試料中の標的配列の存在は、ＨＣｖポリヌクレオチドプローブとＰＣＲ増幅技術にかけたその核酸とが、ノ・イブリッドするかどうかを調べることにより検出される。プローブと核酸配列との間で形成されたハイブリッドを検出する方法は、公知である。簡単には、たとえば、標識していない試料をそれが結合できる固相マトリックスに移し、そして結合した試料を標識したプローブと特異的なハイブリダイゼーシヨンが起こる条件に置き；次に、固相マトリックスに標識プローブが存在しているかどうか調べる。あるいは、試料が標識化されている場合、未標識プローブはこのマトリックスに結合し、適切なハイブリダイゼーション条件下に曝すことで、マトリ、クスは標識が存在するかどうかを試験される。

他の適切なハイブリダイゼーシッンアッセイについては以前に記述しである。

（以下余白）ＰＣＲを　いるＨＣＶ　の　７１゛ＨＣＶ変異株を同定するために、およびそれによってこれらの変異株のプローブを設計するために、上記のＨＣＶ　／　ｃＰＣＲの方法がＨＣＶゲ／ムの変異領域を増幅するのに用いられ、それによってこれらの変異した標的領域のヌクレオチド配列が決定され得る。一般に、ＨＣＶの変異型は、ＨＣＶ１株が主（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ）である地域、例えば、日本、アフリカなどの地域とは異なる地域に存在すること；あるいはウィルスにも感染される異なるを髄動物種に存在することが予想され得るだろう。ＨＣＶ変異株は、組織培養系の継代にも現れ得るし、あるいは突然変異あるいは誘導された変異の結果として現れ得る。

変異した標的領域を増幅するのに、疑わしい領域をフランキングするように、プライマーが設計され、好ましくは保存領域に相補的である。ＨＣＶの２つの領域（これらの領域はフラビウイルスモデルに基づき、おそらく保存されている）に対するプライマーは実施例に記述される。図１８に示されるＨＣＶ１株の配列の情報を用いて、これらのプライマーおよびプローブを設計し得る。

標的領域のヌクレオチド配列決定はＰＣＲで増幅された生成物を直接分析することによって行われ得る。ＰＣＲで増幅された生成物の配列を直接分析する方法が５ａｉｋｉら（１９８８）に記述されている。

一方、増幅された標的配列は配列決定の前にクローンされ得る。酵素的で増幅されたゲノム断片の直接クローニングおよび配列分析の方法が５ｃｈａｒｆ　（１９８６）によって述べられた。この方法において、例えば、Ｍ１３シークエンシングベクターに直接クローニングできるように便利な制限酵素の切断部位を与えるため、ＰＣＲ技術に用いられるプライマーにはプライマーの５′末端の近傍に改変される。増幅後、ＰＣＲ生成物が適切な制限酵素で開裂される。制限酵素で切断された断片をＭ１３ベクターに組み込み、そして例えば、ＪＭ１０３宿主に形質転換して、プレートにまき、そしてこのように得られたプラークがラベルしたオリゴポリヌクレオチドプローブでハイブリダイゼーシヨンによってスクリーニングされる。クローニングおよび配列分析の他の方法は当該分野で公知である。

フラビウイルスのおよびＨＣＶのユニバサールブライマ−ＨＣＶのｃ　ＤＮＡ由来のプローブを用いて、ＨＣＶのゲノムの性質を調べた結果によって、およびＨＣＶのｃ　ＤＮＡ内に含有される配列情報によって、ＨＣＶがフラビ様ウィルス（Ｆｌａｖｆ−ｆ　ｉｋｅ　ｖｌｒｕｓ）であることが推定される。これらの研究は、この明細書の譲受人が所有する欧州特許出願公開第３１８，２１６号に記述されている。これの全文は本明細書に援用されている。ＨＣＶのｃ　ＤＮＡクローン由来のＨＣＶのｃＤＮＡ配列と多数のワラビウイルスの公知の配列との比較から、ＨＣＶが、フラビウイルスの保存配列と相同性である配列を含有することが分かった。これらの保存配列によって、フラビウィルスの標的領域の増幅、およびＨＣＶに適用するのに、ユニバサールであり得るプライマーが作製され得る。これらの配列は、実施例に記述されるプライマーの３°末端由来の１６−ｍｅｒあるいはそれより小さい配列である。次いで、柵特異的プローブを用いて、橿の同定は達成される。多数のワラビウィルスのゲノムは当該分野に公知であり、それらには、例えば、ＪａｐａｎｅｓｅＥｎｃｅｐｈａｌ　ｉｔ　ｉｓウィルス（Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉら（１９８７））、Ｙｅｌｌｏｗ　Ｆｅｖｅｒウィルス（Ｒｆｃｅら（１９８５））、Ｄｅｎｇｕｅ　Ｔｙｐｅ２ウィルス（Ｈａｈｎら（１９８８））、Ｄｅｎｇｕｅ　Ｔｙｐｅ４ウィルス（Ｍａｃｋｏｗ　（１９８７））、およびＷｅｓｔＮ１１ｅウィルス（Ｃａｓｔｌｅら（１９８６））が含まれる。

ＨＣＶ特異的なプローブを用いて、ＨＣＶのＲＮＡの同定は達成され、そしてこの配列が本明細書に提供されているＨＣＶ（ＤｃＤＮＡ配列によって決定され得る。

一方、コドン縮退（ｃｏｄｏｎ　ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）のために設計されるプローブであって、そして、フラビウィルスおよびＨＣＶの共通配列（ワラビウィルスの公知の配列とＨＣＶのアミノ酸配列との比較によって決定される）を含有するプローブのセットの使用は、これらのウィルスを一般の検出システムで検出され得る。

Ｐ　のＤＮＡ　１のＷａｒｎｅｒ　（１９８４）の方法に従って、自動オリゴヌクレオチド合成機を用いて、合成オリゴヌクレオチドが調製され得る。所望ならば、反応の標準の条件下で、３２　Ｐ　Ａ　７Ｐの存在下で、ポリヌクレオチドキナーゼの処理によって、合成鎖が３２ｐでラベルされ得る。

ｃＤＮＡライブラリーから単離されたものを含む、ＤＮＡ配列が、Ｚｏｌ　Ｉｅｒ　（１９８２）の記載の部位特異的突然変異誘発のような公知の技術によって改変され得る。要するに、改変されようとするＤＮＡを単鎖配列として、ファージにパッケージし、そしてプライマー（改変されるＤＮＡの部分に相補的である合成オリゴヌクレオチドであり、自分自身の配列内に所望な改変を有する）を用いて、ＤＮＡポリメラーゼで２Ｍ重鎖ＤＮＡ変換する。このように得られた２重鎖ＤＮＡを、ファージを維持できる宿主バクテリウムに形質転換する。ファージの各鎖の複製を含有する、形質転換したバクテリアの培養物を寒天にプレートして、プラークを得る。

理論的に、５０％の新しいプラークは変異した配列を有するプラークを含有し、そして残りの５０％は現型の配列を有する。正しい鎖とハイブリダイズするが、改変されない配列とハイブリダイズしないようなハイブリダイゼーシヨンの温度および条件下で、これらのプラークの複製物をラベルした合成プローブとハイブリダイズした。ハイブリダイゼ／目ンによって同定された配列を回収し、クローン化する。

ＨＣＶ　来のポリヌクレオチドをスクリーニングするためのキットＨＣＶのサンプルの増幅、および／あるいはスクリーニングのための、プローブおよび／あるいはプライマーであるオリゴマーがキット内にパッケージされ得る。ＨＣＶ配列のスクリーニングのためのキットには、オリゴマーのプローブＤＮＡが含まれる。ＨＣＶ配列の増幅のためのキットには、増幅に用いられるオリゴマーのプライマーが含まれ得る。このキットは通常、特定のハイブリダイゼーションおよび／あるいは増幅のプロトコールで必要とされる、前もって測定したあるいは荊もって決めた量のプローブあるいはプライマーを含有し、そして他の適切な包装された試薬および材料をも、別々の適当な容器に入れられていて、含有する。例えば、キットは標準物、緩衝剤、支持体、酵素、基質、ラベルプローブ、結合対、および／あるいはテストを行うするための説明書を含有する。

支立五以下、本発明の実施例が述べられている。これらの実施例は本発明について説明するものであって、本発明を制限するものではない。

１３ｆ、２６Ｊ、ＣＡ３９ａ、ＣＡ３４ａ％　ＣＡ１５８ｅおよびＣＡ１６７１：＋のこれらのクローンを、ＨＣＶのｃＤＮＡを有するラムダ−ｇｔｌｌライブラリー（ＡＴＣＣＮｏ。

４０３９４）から単離した。このライブラリーの調製は、欧州特許出願公開第３１８，２１６号（１９８９年５月３１日公開した）およびＷＯ３９１０４６６９（１９８９年６月１日公開した）に記載されている。）（ｕｙｎｈ　（１９８５）が述べられた方法を用いて、下記のプローブで、このライブラリーをスクリーニングした。それぞれのプローブに対するポジティブのクローンの検出する頻度はｓｏ、ｏｏｏ個に約１個であった。

クローン１２ｆの配列由来の合成プローブを用いて、クローン１３ｆを単離した。このプローブの配列は以下である：５　’　ＧＡＡ　ＣＧＴ　ＴＧＣＧＡＴ　ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＧＡＣＡＧＧ　ＧＡＣＡＧＧ　３′クローンに９−１の５′領域由来のプローブを用いて、クローン２６ｊを単離した。このプローブの配列は以下である５　’　ＴＡＴ　ＣＡＧ　ＴＴＡ　ＴＧＣＣＡＡ　ＣＧＧ　ＡＡＧ　ＣＧＧ　ＣＣＣＣＧＡ　３　’クローン１２ｆおよびクローンに９−１　（Ｋ９ −１とも呼ばれる）の単離の方法が欧州特許出願公開第３１８，２１６号に記載されている。ごれらのクローンの配列は図１および図２それぞれに示されている。クローン１３ｉおよび２６ｊのＨＣＶのｃＤＮＡ配列は図４および図５にそれぞれ示されている。これらの図には、これらの配列にコードされるアミノ酸、およびクローン１３ｆのクローン１２ｆとのオーバーラツプ、およびクローン２６ｊのクローン１３ｉとのオーバーラツプも示されている。これらのクローンの配列はクローンに９−１の配列を確認した。クローンに９−１を別のＨＣＭのｃＤＮＡライブラリーから単離した（欧州特許出願公開第２１８，３１６号参照）。

クローン２６」の５′領域の配列に基づくプローブを用いて、クローンＣＡ３９ａを単離した。このプローブの配列は以下である：５　’　ＣＴＧ　ＧＴＴ　ＡＧＣＡＧＧ　ＧＣＴ　ＴＴＴ　ＣＴＡ　ＴＣＡ　ＣＣＡ　ＣＡＡ　３　’りｏ−ンＣＡ５９　ａの配列由来のプローブが、クローンＣＡ３４ａの単離に用いられた。この単離に用いられるプローブの配列は以下である：５°ＡＡＧ　ＧＴＣＣＴＧ　ＧＴＡ　ＧＴＧ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＣＴＡ　ＴＴＴ　ＧＣＣ３’（以下余白）クローンＣＡ３４ａの配列由来のプローブを用いて、クローンＣＡ１５６ｅを単離した。このプローブの配列は以下のとおりであった。　：５°ＡＣＴ　ＧＧＡ　ＣＧＡ　ＣＧＣＡＡＧ　ＧＴＴ　ＧＣＡ　ＡＴＴ　ＧＣＴ　ＣＴＡ　３゜り０−７ＣＡ　１５６ｅの配列由来のプローブを用いてクローンＣＡ１６７ｂを単離した。このプローブの配列は以下のとおりであった。　：５’　ＴＴＣＧＡＣＧＴＣＡＣＡ　ＴＣＧ　ＡＴＣＴＧＣＴＴＧ　ＴＣＧ　ＧＧＡ　３’クローンＣＡ３９ａ、　ＣＡ３４ａ、　ＣＡ１５６ｅ、およびＣＡ１６７ｂにおけるＨＣＶ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は図６．７．８、および９に、それぞれ示されている。ここにコードされているアミノ酸、および関連したクローンの配列を有するオーバーラツプもまた、これらの図に示されている。

“　ｌ″ＨＣＶ　ｃＤＮＡライブラリーのｇ欧州特許公開第３１８．２１６号に記載されているラムダ−ｇｔｌｌ　ＨＣＭ　ｃＤＮＡライブラリーを構築するために用いられる感染チンパンジーの血漿の同一のバッチから、本質的に同様の方法を用いて、ＨＣＶ　ｃＤＮＡのライブラリー、すなわち“ｐｉ″　ライブラリーを構築した。しかし、“ｐｉ″′ライブラリーの構築には、プライマー延長法を用いた。この方法において、逆転写酵素のプライマーはクローンＣＡ３９ａの配列に基づいている。このプライマーの配列は、以下のとおりである。：５°ＧＧＴ　ＧＡＣＧＴＧ　ＧＧＴ　ＴＴＣ３’クローン１１４ａの単離および配ダ１クローンＣＡ１６７ｂ　（上記を参照のこと）を単離するのに用いたプローブによる上記の“ｐｉ″ＨＣＶ　ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより、クローンｐｉ１４ａが得られた。このクローンは、ラムダｇｔ−１１１（ＣＶ　ｃＤＮＡライブラリー（ＡＴＣＣＮｏ、４０３９４）から単離されたクローンＣＡ１６７ｂ、　ＣＡ１５６ｅ、　ＣＡ３４ａおよびＣＡ３９ａとオーバーラツプしている約８００塩基対のｃＤＮＡを含有している。

さらに、ｐｉ１４ａはまた、約２５０塩基対のＤＮＡを含有しており、その塩基対は、クローンＣＡ１６７ｂにおけるＨＣＶ　ｃＤＮＡの上流に存在している。

クローンＣＡ２１６ａ、　ＣＡ２９０ａおよびａ３０ａの単離および　′ｙ１クローンＣＡ１６７ｂの配列に基づいて、以下の配列を有する合成プローブを製造した。：５’　ＧＧＣＴＴＴ　ＡＣＣＡＣＧ　ＴＣＡ　ＣＣＡ　ＡＴＧ　ＡＴＴ　ＧＣＣＣＴＡ　３゜上記プローブを、スクリーニングするために用い、クローンＣＡ２１６ａを得た。そのＨＣＶ配列は図１０に示されている。

以下の配列を有するクローンＣＡ２１６ａの配列に基づいて、他のプローブを製造した。：５°ＴＴＴ　ＧＧＧ　ＴＡＡ　ＧＧＴ　ＣＡＴ　ＣＧＡ　ＴＡＣＣＣＴ　ＴＡＣＧＴＧ　３’コノブロ一ブチラムグーｇｔｌｌライブラリー（ＡＴＣＣＮｏ、４０３９４）をスクリーニングすることにより、クローンＣＡ２９０ａが得られた。その中のＨＣＶ配列は図１１に示されている。

パラレルアプローチリジナルのラムダ−ｇｔｌｌ　ｃＤＮＡライブラリーにおいて用いた同様の感染血漿から抽出された核酸を用いて、プライマー延長ｅＤＮＡライブラリーを製造した。用いたプライマーはクローンＣＡ２１６ａおよびＣＡ２９０ａの配列に基づいていた。：５°ＧＡＡ　ＧＣＣ　ＧＣＡ　ＣＧＴ　ＡＡＧ　３。

クローンｐｉ１４ａおよびに９−１の単離において用いられるライブラリーの上記で記載された方法と同様の方法を用いて、このｃＤＮＡライブラリーを製造した。このライブラリーをスクリーニングするのに用いたプローブはクローンＣＡ２９０ａの配列に基づいていた。：５°ＣＣＧ　ＧＣＧ　ＴＡＧ　ＧＴＣ　ＧＣＧ　ＣＡＡ　ＴＴＴ　ＧＧＧ　ＴＡＡ　３゛クロ一ンａｇ３０ａを上記のプローブを用いて新しいライブラリーから単離した。それは、約６７０塩基対のＨＣＶ配列を含んでいる。

図１２を参照のこと。この配列の一部は、クローンＣＡ２１６ａおよびＣＡ２９０ａのＨＣＶ配列とオーバーラツプしている。しかし、約３００塩基対のａｇ３０ａ配列は、クローンＣＡ２９０ａ由来の配列の上流に存在する。オーバーラツプしていない配列はＨＣＶ　ＯＲＦの開始を示し得る開始コドン（゛）および終止コドンを示す。図１２には以下のものも含まれる：翻訳を制御する役割を果たし得るコードされた推定される小さいペプチド（：）、および推定されるポリペプチドの推定される最初のアミノ酸（１）、およびその下流でコードされたアミノ酸。

クローンＣＡ２０５ａの単離および配夕１クローンＣＡ２９０ａ　（図１１）におけるＨＣＶ配列由来の合成プローブを用いて、オリジナルのラムダｇｔ−１　１ライブラリー（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．４０３９４）からクローンＣＡ２０５ａを単離した。このプローブの配列は以下のとおりであった。：図１３に示されるＣＡ２０５ａにおけるＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列は、クローンａｇ３０ａおよびＣＡ２９０ａの両方におけるｃＤＮＡ配列とオーバーラツプしている。ＣＡ２９０ａの配列とオーバーラツプしている配列はその配列の上に点線で示されている（この図はまた、この断片においてコードされた推定されるアミノ酸を示す）。

クローンＣＡ２０５ａおよびａｇ３０ａにおける）ＩＣＶ　ｃＤＮＡ配列から明らかなように、この推定されるＨＣＶポリプロティンはＡＴＧ開始フドンで始まると思われる；両クローンにおけるＨＣＶ配列は、このＡＴＧから４２ヌクレオチド上流に、フレーム内の連続するダブルストンブフドン（　ＴＧＡＴＡＧ）を含有する。このＨＣＶ　ＯＲＦはこれらの終止；トンの後で開始し、そして、少なくとも８９ｏ７ヌクレオチド延長すると考えられる（図１８において示されるフンポジット（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）　ＨＣＶ　ｃＤＮＡを参照のこと）。

クローン１８の　および　ダ１クローンａｇ３０ａ　（図１２を参照のこと）およびオリジナルのラムダｇｔ− １１ライブラリー（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．４０３９４）由来のオーバーラツプしているクローンの配列に基づいて，　ＣＡ２３０ａ，　ｔなわち、以下の配列を有する合成プローブを製造した。：５°ＣＣＡ　ＴＡＧ　ＴＧＧ　ＴＣＴ　ＧＣＧ　ＧＡＡ　ＣＣＧ　ＧＴＧ　ＡＧＴ　ＡＣＡ　３。

プローブでオリジナルのラムダ−ｇｔｌｌ　ＨＣＶ　ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、クローン１８ｇが得られ、そのＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列は図１４に示されている。この図には以下のものもまた示されている：クローンａｇ３０ａとのオーパーラ、ブ、およびＨＣＶ　ｃＤＮＡ中でフードされた推定されるポリペプチド。

クローン１８ｇ　（Ｃｘａｇまたは１８ｇ）におけるｃＤＮＡは、クローンａｇ３０ａおよびＣＡ２０５ａにおけるｃＤＮＡとオーバーラツプしており、そのことは上記で記載されている。Ｃ１８ｇの配列はまた、クローンａｇ３０ａにおいて見られるダブルストップコドン領域を含む。

これらの終止コドンの上流のポリヌクレオチド領域は、おそら＜　）ＩＣＶゲノムの５°領域の一部を表す。これは、短いＯＲＦを有し得、そして精製ＨＣＶゲノムの直接配列決定法により、確認され得る。これらのフードされた推定される小さいペプチドは、翻訳において制御する役割を果たし得る。Ｃ１８ｇで表される領域の上流のＨＣＶゲノムの領域は、本質的に欧州特許公開策３１８、２１６号に記載された方法（これは、クローン１２ｆにおけるＨＣＶｃＤＮＡ配列の上流のｃＤＮＡ配列を単離する方法である。）を用いて、配列決定のために、単離され得る。本質的にＣ１８ｇの配列に基ツ＜逆転写酵素の小さい合成オリゴヌクレオチドブライマーを合成し、そしてＨＣＶゲノムＲＮＡにおいて相当する配列と結合するために用いられる。このプライマー配列は既知の０１８ｇの５°末端に近いが、プライマー配列の上流のプローブ配列の設計を可能にするのに十分なだけ下流に存在する。周知のブライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）およびクローニングの標準法が用いられる。得られたｃＤＮＡライブラリーをブライミング部位の上流の配列でスクリーニングする（　Ｃ１８ｇの明らかにされた配列から推測される）。ＮＡＮＢＨを有する個体由来の血漿または肝臓のサンプルのいずれかからＨＣＶ’ゲノムＲＮＡを得る。ＨＣＶはワラビ様ウィルスであると考えられるので、このゲノムめ５°末端はｃａｐ”構造で修飾され得る。フラピウイルスゲノムが５゛末端″ｅａｐ”構造を含んでいるということは知られている。　（黄熱病ウィルス、ライス（Ｒｉｃｅ）ら、　（１９８８）　；　デング熱ウィルス、バーン（Ｈａｈｎ）ら、　（１９８８）　；　日本脳炎ウィルス（１９８７））。

−ＨＣＶ　ｃＤＮＡライブラリー由来のクローンの単離および　夕ＩＨＣＶゲノムの３°末端領域を代表するｃＤＮＡを含むクローンをオリジナルの感染チンパンジー血漿プール（ＨＣＶ　ｃＤＮＡ５ムｆ−ｇｔｌｌライブラリー（ＡＴＣＣＮｏ、４０３９４）の創製のためにもちいられ、欧州特許公開第３１８．２１６号に記載されている）から構築したｃＤＮＡライブラリーから単離した。ＤＮＡライブラリーを創製するために、血漿から抽出されたＲＮＡをポリ（ｒＡ）ポリメラーゼを用いてポリｒＡで付加（ｔａｉｌｅｄ）Ｌ、そして、ｃＤＮＡを逆転写酵素のプライマーとしてオリゴ（ｄＴ）　！２−１８を用いて合成した。

得られたＤＮＡ　：、　ｅＤＮＡハイブリッドをＲＮＡａｓｅ　Ｈで分解し、そして二本鎖ＨＣＶ　ｅＤＮＡに変換した。この得られたＨＣＩ／　ｃＤＮＡを、本質的にヒ二−ン（Ｈｕｙｎｈ）　（１９８５）において記載された方法を用いて、ラムダ−ｇｔ　１０にクローン化し、β（またはｂ　）　ＨＣＶ　ｃＤＮＡライブラリーを得た。用いられた方法は以下のとおりであった。

血漿のアリフォート（１２ｍｌ）をプロテイナーゼにで処理し、０．０５ＭのトリスＣＬ　ｐＨ１，ｓ、０，０５％（Ｖ／Ｖ）β−メルカプトエタノール、０．１％ｈ／ｖ）ヒドロキシキノロン、１　＋ｎＭ　ＥＤＴＡで飽和させた同量のフェノールで抽出した。得られた水相をフェノール混合物で再抽出し、次いで、フェノールおよびクロロホルム：イソアミルアルコール（２４＋１）を（１：１）で含有する混合物で３回抽出し、次いで、クロロホルム：イソアミルアルコール（１：１）で２回抽出した。ＮａＣ１について水相を２００ｍＭに調製した後、水相における核酸を一２０″Ｃで一晩、２．５容量の冷却した無水エタノールで沈澱させた。この沈澱物を遠心分離（１０，００ＯＲＰＭ、４０分間）により集め、２０ｍＭのＮａＣ１を含有する７０％エタノール、そして１００％冷却したエタノールで洗浄し、デシケータ−中で５分間乾燥し、そして、水で溶解した。

感染チンパンジー血漿プール由来の単離した核酸に、ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター（ＨＰＲＩ）　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃａｒｐ、から購入した）の存在下でポリーＡポリメラーゼを用い、担体としてＭＳ２　ＲＮＡを用いて、ポリｒＡを付加した。２ｍｌの血漿中の核酸と等量の単離された核酸をＴＭＮ　（５０ｍＭのトリスＨＣ１，ｐＨ７，９，１０ｍＭのＭｇＣｌ２．２５０ｍＭのＮａＣ１，２，５ｍＭのＭｎＣｌ２．２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＤＴ）、４０マイクロモルのα−［３２Ｐ］　ＡＴＰ、２０単位のＨＰＲＩ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、）、および約９から１０単位のＲＮａｓｅを含まないポリーＡポリメラーゼ（ＢＲＬ）を含有する溶液中でインキュベートした。３７℃で１０分間、インキュベートを行い、この反応をＥＤＴＡで終了させた（最終濃度約２５０ｍＭ）。この溶液を同量のフェノール−クロロホルムで抽出し、そして、同量のクロロホルムで抽出し、そして、核酸を２００ｍＭのＮａＣ１の存在下で２．５容量のエタノールで一２０℃で一晩、沈澱させた。

クローンｂ５ａの単 βＨＣＶ　ｃＤＮＡライブラリーを、クローン１５ｅ中のＨＣＩ／　ｃＤＮＡ配列に基づいた配列を有した合成プローブを使用するノ・イブリダイゼーションによってスクリーニングした。クローン１５ｅの単離は、Ｅ、　Ｐ、　Ｏ公開箪３１！１．２１６号に記載されており、その配列は、図３に示されている。合成プローブの配列は、以下の通りであった。

５’　ＡＴＴ　ＧＣＧ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＡＣＧ　ＧＧＧ　ＣＣＴ　ＧＣＴ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　３゜ライブラリーのスクリーニングによって、約１．０００個の塩基対のＨＣＶ　ｃＤＮＡ領域を有するクローンβ−５ａ（ｂ５ａ）が生産された。

このｃＤＮＡの５°領域は、クローン３５ｆ、　１９ｇ、２６ｇおよび１５ｅと重複している（これらのクローンは、前述されている）。

３゛末端ポリＡ配列とクローン１５ｅに重複する３゛配列との間の領域は、約２００個の塩基対を含んでいる。このクローンによって、３°末端配列の領域がＨＣＶゲノムであると同定され得る。

ｂ５ａの配列は、クローン１６ｊｈ（以下に記載されている）中のＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列内に含まれている。さらに、配列はまた、オリジナルのλ−ｇｔｌｌライブラリー（ＡＴＣＣＮｏ、　４０３９４）から単離された、ＣＣ３４ａ中に存在している。　（オリジナルのλ−ｇｔｌｌライブラリーは、本願では、−Ｃ ”ライブラリーと呼ばれる）。

）ＩＣＶゲノムの３°領域のＰＣＲ幅によって生成されたクローンの１１Ｌ１ムＨＣＶゲノムの３°領域由来のヌクレオチド配列を有する複数のｃＤＮＡクローンを生成した。これは、以下に記載のように改変された、５ａｉｋｉら（１９８６）および５ａｉｋｉら（１９８８）に記載のポリメラーゼ鎖反応技術によって、ゲノムの標的領域を増幅させることによって成し遂げられた。増幅されたＨＣＶ　ＲＮＡを、Ｅ、　Ｐ、　０、公開第３１８．２１６号に記載のＨＣＶ　ｃＤＮＡλ−ｇｔｌｌライブラリー（ＡＴＣＣＮｏ、　４０３９４号）の生産に使用されたオリジナルの感染性チンパンジープラズマプールから得た。ＨＣＶ　ＲＤＮＡの単離については、前述した。チノパンツー清から単離された核酸を核酸基質の代わりに用いたこと以外は、５ｉｐｐｅｌ（１９７３）に記載されるように、Ｅ、　ｃｏｌｉポリＡポリメラーゼによって単離されたＲＮＡの３゛末端にＡＴＰを付加した。ついで、プライマー−アダプターの成分および配列が以下の通りであったこと以外は、実質的にＨａｎ　（１９８７）によって記載されるように、付加されたＲＮＡを、オリゴｄＴ−プライマーアダプターを使用して、逆転写酵素によってｃＤＮＡに逆転写した。

スタッフＴ−及免ｔｌ　ＳＦ３　フ゛０モーター　プライマーＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＡＣＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡ　Ｔ＋ｓ得られたｃＤＮＡを、２つのプライマーを使用するＰＣＨによって増幅にかけた。

ブライ７−　百シタ隼ＪＨ３２（３０ｍｅｒ）　ＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＴＣＧＡＴＴＧＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＪ）Ｉｌｌ　（２０ｍｅｒ）　ＡＡＴＴＣＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＡＣＧＡＪＩ（３２プライマーは、６６℃の算出されたＴ、で、ｃＤＮＡ中の標的領域の５°末端にハイブリダイズ可能な２０個のヌクレオチド配列を宵していた。Ｊｌ！１１は、オリゴｄＴ−ブライマーアダプターの−部から由来したものであるため、６４°ＣのＴ、で、ｃＤＮＡの３゛末端に特異的である。両方のプライマーは、増幅されたＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列クローニングに使用される、５°末端における制限酵素である、Ｎｏｔｌのためのｚ２部位を有するように設計された。

Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＰＣＲ牛ッドツト　Ｎ８０１−００４３またはＮ８０１−００５５）中にある、４つのテ゛オ牛シリボヌクレオシド　トリポスフエート、緩衝塩、金属イオン、およびユ肛ム二ｌＬＬ匡■（Ｔａｑポリメラーゼ）から単離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む１００マイクロリ、トルの反応混合液中でｃＤＮＡおよびプライマーを懸濁させることによって、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＤＮＡ熱循環器中で、３５サイクル行った。各サイクルは、９４℃における１、５分間の変性工程、６０℃における２分間のアユ−リング工程、および７２℃ における３分間のプライマー延長工程から構成された。ＰＣＲ生産物を、クローン１５ｅの３°末端領域の配列に基づいた配列である、３０個のヌクレオチドプローブ、ＪＨＥ４を使用するサザンブロノト分析にかけた。ＪＨ３４の配列は、以下の通りである。

５°ＣＴＴ　ＧＡＴ　ＣＴＡ　ＣＣＴ　ＣＣＡ　ＡＴＣＡＴＴ　ＣＡＡ　ＡＧＡ　ＣＴＣ３゜ＨＣｖｃＤＮＡプローブによって検出されたＰＣＲ生産物のサイズは、約５０個から約４００個の塩基対の範囲であった。

増幅されたＨＣＶ　ｃＤＮＡをクローン化するために、ＰＣＲ生産物は、Ｎｏｔ　Ｉで消化されポリアクリルアミドゲル電気泳動法によってサイズをした。３００個の塩基対よりも大きなりＮＡは、ｐＵｃ１８ｓのＮｏｔ　１部位１：りｏ− ７化された。ヘク９−　ｐＵｃ１８ｓハ、ｐＵｃ１ｇノＥｃｏＲＩとＳａｌ［部位との間にクローン化されたＮｏｔ　Ｉポリリンカーを含ませることによって構築される。クローンのＨＣＶ　ｃＤＮＡの存在を、ＪＨ３４プローブを使用して、スクリーニングした。陽性クローンの数を得て、配列決定した。これらのクローンの１つであるｘａｊｈ中の、ＨＣＶ　ｃＤＮＡ挿入部のヌクレオチド配列、およびそこにコードされたアミノ酸を、図１５に示す。クロー／１６ｊｈ１ｍオけるＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列中に検出されたヌクレオチド異変性を、この領域のもう一つのクローンと比較したものを、この図に示す。

クローン６にの単離および配夕１クローン１６ｊｈおよびクローンｂ５ａ　（上記を参照）の配列に基づいて、以下の配列を有する合成プローブを生産した。

５°ＴＣＴ　ＴＣＡ　ＡＣＴ　ＧＧＧ　ＣＡＧ　ＴＡＡ　ＧＡＡ　ＣＡＡ　ＡＧＣＴＣＡ　３’オリジナルのλ−ｇｔｌｌＨｃＶ　ｃＤＮＡライブラリーをプローブを用いＴ：　（Ｅ、Ｐ、Ｏｌ＞間第３１８．２１６号に記載されるように）スクリーニングすることによって、１０６中約１の頻度でクローンを生産した。

これらの一つをクローン６にと名付け（また、Ｃ６ｋとも名付け）、そのＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列を図１６中に示す。また、この図に示されているのは、クローン１６ｊｈと重複しているものと、ＨＣＶｃＤＮＡ内にコードされた推定ポリペプチドである。クローン６に中のＨＣＶ　ｃＤＮＡ上の配列情報を、１本鎖のみから得た。クローンが、λｇｔｌｌ　ｃ６にとして名付けられている、寄託されたこのクローン情報は、以下に記載している。Ｃ６に配列が、ＨＣＶＩポリペプチドをコードするＯＲＦの一部であるという確認は、他の重複クローンを配列決定することによって得られた。

クローン１３１゛ｈの単　および　夕ＩＨＣＶケノムの３′領域からの配列を含み、インフレーム終止コドンを含むクロー７を、実質的に以下に記載されるように単離した。すなわち、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、ＨＣＶＩ　ＲＮＡをｃＤＮＡに変換したこと以外は、ゲノムの３°領域のＰＣＲ増幅によって生成されたクローンを単離した。

５°ＡＡＴ　ＴＣＧ　ＣＧＧ　ＣＣＧ　ＣＣＡ　ＴＡＣＧＡＴ　ＴＴＡ　ＧＧＴ　ＧＡＣＡＣＴ　ＡＴＡ　ＧＡＡ　Ｔ＋ｓ　３゜ついで、ｃＤＮＡを、以下のプライマーを使用して、ＰＣＲ反応によって増幅させた。

５°ＴＴＣＧＣＧ　ＧＣＣＧＣＴ　ＡＣＡ　ＧＣＧ　ＧＧＧ　ＧＡＣＡＣＡ　Ｔ　３’および５°ＡＡＴ　ＴＣＧ　ＣＧＧ　ＣＣＧ　ＣＣＡ　ＴＡＣＧＡ　３゜増幅後、ＰＣＲ生産物を、スペルミンで沈澱させ、Ｎｏｔｌで消化し、フェノールで抽出した。精製された生産物を、ｐＵｃ１８ｓのＮｏｔ　１部位にクローン化し、ＨＣＶ陽性クローンを以下のオリゴヌクレオチドを使用して選択した。

５°ＣＧＡ　ＴＧＡ　ＡＧＧ　ＴＴＧ　ＧＧＧ　ＴＡＡ　ＡＣＡ　ＣＴＣＣＧＧ　ＣＣＴ　３゜ｐ１３１ｊｈとして名付けられた１つのクローン中のＨＣＶ　ｃＤＮＡは、図１７に示される。このクローンは、ＨＣＶゲノム中に含まれる大きなＯＲＦのインフレーム終止コドンを含んでいる。

クローン５−クローン３２の胤　および　１クローンｂｌｌＡａ中の配列の上流側である、ＨＣＩ／ゲノムの５゛領域からの配列を含むクローンを単離し、本願に参考のために取り入れたＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　４５６．６３７号に記載される、ゲノムの３゛領域のＰＣＲ増幅によって生成されたクローン単離と配列のための方法を改変したものによって、ヌクレオチド配列を決定した。

一般に、ゲノムの標的領域を、５ａｉｋｉら（１９８６）および５ａｉｋｉら（１９８８）に記載のＰＣＲ法によって増幅させた。増幅されたＨＣＶ　ＲＮＡを、Ｈａｎら（１９８７）によって記載されるコールドグアニジニウムチオシアネート法を使用して、ヒト血清（米国臨床単離株、ＨＣＶ２７）を抽出することによって得た。抽出されたＲＮＡを、ＨＣＶゲノムのヌクレオチド−２５０から− ２２３に相補的なプライマーＪＨ９４を使用して、逆転写酵素を用いて、−重鎖ｃＤＮＡに変換した（図１８を参照）。ＪＨ９４の配列は、以下の通りである。

５°ＣＣＴ　ＧＣＧ　ＧＣＣＧＣＡ　ＣＧＡ　ＣＡＣＴＣＡ　ＴＡＣＴＡＡ　３゜−重鎖から二本鎖ＨＣＶ　ｃＤＮＡへの変換を、末端デオキシヌクレオチジル　トランスフェラーゼを使用して、約２０から５０個のｄＡ残基をＤＮＡに付加（Ｓａｍｂｒｏｏｋら　（１９８９）、　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ）、Ｎｏｔ１部位およびｓｐ６プロモーターを有する以下のオリゴｄＴプライマーーアダプターを使用して、この付加された分子を複製することによって成し遂げた。

スタッフｙ−Ｎｏｔｌ　ＳＦ３　プロモーター　プライマーＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＡＣＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡ　ＴＩ５得られたｃＤＮＡを、ＪＨ９４（上記に記載されている）および以下の配列を有しているＪＨＩＩの２つのプライマーを使用して、ＰＣＲによって増幅にかけた。

７°　ライ７−　ぺＬ夕１ＪＨＩＩ　（２０ｍａｒ）　ＡＡＴＴＣＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＡＣＧＡＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＰＣＲキ、ト　（Ｎ８０１−００４３またはＮ８０１−００５５）中にある、４つのデオキシリボヌクレオシド　トリホスフェート、緩衝塩、金属イオン、およびユ肛ｍｏｌｓ　ａ、（匡り匡旦（Ｔａｑポリメラーゼ）から単離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む１００マイクロリツトルの反応混合液中でｅＤＮＡおよびプライマーを！！４濁させることによって、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＤＮＡ熱循環器中で、３５サイクル行った。各サイクルは、９４°Ｃにおける１、５分間の変性工程、６０°Ｃにおける２分間のアユ−リング工程、および７２°Ｃにおける３分間のプライマー延長工程から構成された。

ＰＣＲ生産物を、Ｎｏｔｌで消化し、ｐＵｃ１８５にクローン化した。ＨＣＶヌクレオチド配列を含むクローンを、以下の配列を宵する、ＨＣＶＩゲノムのヌクレオチド−３１２から一２８３由来のプローブであるＡｌｅｘ９０でスクリーニングすることによって得た。

５°ＡＣＣＡＴＧ　ＡＡＴ　ＣＡＣＴＣＣＣＣＴ　ＧＴＧ　ＡＧＧ　ＡＡＣＴＡＣ３゜単離されたクローン中のＨＣＶ　ｃＤＮＡを、ジデオキシ鎖ターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒら（１９７７））によって配列決定した。単離されたクローンの１つである５−クローン３２中のＨＣＶ　ｅＤＮＡの配列は、図１８のヌクレオチド−２２４から−３４１までの領域に至っている。

ＨＣＶ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を分析すると、ＩＩＣＶ　ＦｉＮＡ、ストランドの複製物が、安定したヘアピン構造を形成し得るＧＣが豊富な配列を含んでいるのが示された。

この構造において、ダッシュ線は、相補的なヌクレオチド間の可能な水素結合を示す。

コンピューターデータベースである遺伝子バンク（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）をサーチして、相同な配列が、既知のウィルス配列には見られないことが示された。従って、この配列は、ＨＣＶゲノムの５°末端に特有のものであり得る。

ヘアピン構造は、転写酵素の認識信号としての役割を果たし得、および／または５°末端におけるＲＮＡの安定性に貢献し得る。

′　されたＨＣＶ　ｃＤＮＡ　１本願およびＥ、Ｐ、Ｏ，公間第３１８，２１６号に記載の様々なＨＣＶ　ｃＤＮＡライブラリー由来の一連の重複クローンから、ＨＣＶ　ｃＤＮＡを編集した。

図１８が由来するところのクローンは、５−３２、ｂｌ１４ａ。

１８ｇ％ａｇ３０ａ、　ＣＡ２０５ａ、　ＣＡ２９０ａ、　ＣＡ２１６ａ、　ｐｉ１４ａ、　ＣＡ１６７ｂ、　ＣＡ２１６ａ、　ＣＡ３４ａＳＣＡ５９ａ、　Ｋ９−１　（またに９−１とも名付けられている）、２６ｊ、　１３ｉ、１２ｆ、１４ｉ、ｌｌｂ、７ｆ、　７ｅ、　８ｈ、３３ｃ、　４０ｂ、　３７ｂ、　３５．３６．８１．３２．３３ｂ、　２５ｃ、１４ｃ、　８ｆ１３３ｆ、　３３ｇ、　３９ｃ、３５ｆ、１９ｇ。

２６ｇ、１５ｅ、　ｂ５ａ、１６ｊｈ、　Ｃ６におよびｐ１３１ｊｈである。これらのクローンの単離方法および配列は、本願および本願に参考のために取り入れられたＥ、　Ｐ、　Ｏ，公間第３１８．２１６号に記載されている。

図１８において、配列の上にある３つのダノンユは、推定開始メチオニンフドンの位置を示ス。

クローンｂｌ１４ａが、クローン１８ｇ（すなわち、５°−ＣＡ）における配列の上流側にさらに２つヌクレオチドを含んでいること以外は、クローンｂｌ１４ａは、クローン１１１ｇ、　ａｇ３０ａおよびＣＡ２０５ａと重複している。これらの余分な二つのヌクレオチドは、図１８に示されるように、ＨＣＶゲノム配列中に含まれている。

上記に記載のクローンのい（つかは、オリジナルのＨＣＶ　ｃＤＮＡλ−ｇｔｌｌ　Ｃライブラリー（ＡＴＣＣＮｏ、　４０３９４）以外のライブラリーから得られたが、これらのクローンは、オリジナルのライブラリー中のＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列と重複するＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列を含んでいる。従って、実質的にすべてのＨＣＶ配列が、第１　ＨＣＶ　ｃＤＮＡクローン（５−１−１）を単離するのに使用されたオリジナルのλ−ｇｔｌｌ　Ｃライブラリー（ＡＴＣＣＮｏ、４０３９４）から抽出できる。

クローン５−１−１の単離については、本願で参考のために取り入れたＥ、Ｐ、Ｏ，公間第３１８．２１６号に記載されている。

ＨＣＶＩ　ｃＤＮＡの複合体（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）中にコードされた主要なＨＣＶポリタンパクの推定配列をまた示す。この配列中の第１アミノ酸は、大きなＯＲＦの推定開始メチオニンである。クローナル不均一性による、変異アミノ酸は、配列の上に示されている。λｇｔｌｌライブラリーは、１つの個体から得られた血清から生産された（　Ｅ、　Ｐ、　Ｏ，公間第３１８，２１６号）ため、この結果は、変異型ウィルス配列（ヌクレオチドおよびアミノ酸）が、この個体中に存在していることを示唆している。

複合（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）　ＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列を調べると、大きなＯＲＦの他に、ポリタンパクをコードする配列の上流側に、多数のＯＲＦが存在し、ポリタンパクをコードする配列内においては、他の２つの翻訳フレーム中に多数の小さなＯＲＦが存在していることが示される。ＨＣＶポリタンパクの上流側にあるＯＲＦは、表のすぐ下に示されている。

−３１０１ＫＮＨ５ＰＶＲＮＹＣＬＫＡＥＳＶ−３２９３ＭＣ；ＡＴＬＦＬＨＥＳＬＰＣＥＥＬＬＳＳＲＲＫＲＬＡＭＡＬｖ −２４６２Ｐ、Ｓ’ＪＶＱＰＰＧＰＰＬＰＧ！：Ｐ−１２７１ＭＰＧＤＬＧＶＰＰＱＤＣ（ｔ＞Ａ千余白ンポリタンパクの推定イニシエータＭＥＴをフード化する配列より下流側のＯＲＦのリーディングフレーム、位置およびサイズを下表に示す。主要なポリタンパクはリーディングフレーム２から翻訳されるものである。

＋　（Ｃ’ｚつ一１ン゛・７トシ・１）Ｉ）−モンン？・・　フし−ｋ　”ｒイ又・。久久）　Ｉｔｉ　ｃ即２１０５　：！３４３１１９　、　５６Ｌ６上記に加えて、ＨＣＶ　ＲＮＡのゲノムストランドと相補する配列の試験もまたいくつかの小さなＯＲＦを含有する。ＨＣＶ　ＲＮＡ配列の−３４１から＋８３７のヌクレオチドと相補するこれらＯＲＦの１つは３８５アミノ酸のポリペプチドをコード化する。

ｌム」」ロロυ１五からのＨＣＶ単離　から？９られる５゛μ釦の　１の　゛米国（ＨＣＶＩ８、ＨＣＶ２７）、イ９　’Ｊ　７　（ＨＣＶｌｌ、）ＨＣＶＩ２４）および韓国（ＨＣＶＫＩ）のそれぞれからのＨＣＶ単離体の５°領域からのヌクレオチド配列を比較した。

ＨＣＶ　ｅＤＮＡ配列の単離は、以下の点を除いては、本質的には上述の５リローン３２の単離に対してと同様に行われた。ＨＣＶヌクレチオド−９０から−７３および３６６から３８３にそれぞれ相補するＪ’Ｈ５１またはｒ１５のいずれがをプライマーとして使用して、抽出されたＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写した。

これらのプライマーの配列は以下の通りである。

ＪＨ５１５’　ＣＣＣＡＡＣＡＣＴ　ＡＣＴ　ＣＧＧ　ＣＴＡ　３’ｒ１６　５ ’　ＣＡＣＧＴＡ　ＡＧＧ　ＧＴＡ　ＴＣＧ　ＡＴＧ　３’ＨＣＩ／　ｄｓＤＮＡの増幅は、５゛および３゛プライマーとしてそれぞれＪ１１９３およびＪｌ！５２を使用してＰＣＲ方法により行なわれた。ＪＨ９２におけるＨＣＶ配列は− ３１７から−２９６のＩＩｃＶヌクレチオド由来であり、ＪＨ５２における配列は−９３から−１１７のＩ（ＣＭヌクレチオドに由来する。ヌクレオチ番号は配列の下の括弧内に示す。ＪＨ５２では下線を引いたジヌクレチオドが突然変異してＮｏｔｌサイトを生成した。これらのプライマーの配列は以下の通りである。

（１゛ライマー　）　じζＺゴタ＝−Ｎｏ三工　旦二ｙ−−二勾！（ＪＨ９３）　５’　ＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＡＴＣＡＣＴＣ’ｌ”ＣＣ３’増幅の後、ＰＣＲ生成物はＮｏｔ　Ｉにより分裂しｐＵｃ１８ｓへとクローン化されたａ　ＨＣＶ　ｃＤＮＡｓは、ＰＣＲによる増幅のあき直接配列決定により、またはクローン化されたＩ（ＣＶ　ｃＤＮＡｓがプライマーの延長およびジデオキシ法により配列決定された。配列決定のプライマーの延長およびジデオキシ法は、上述の５°クローン３２に対してと同様に行われた〇直接配列決定のためのＰＣＲ法は５°プライマーとしてＡｌｅｘ９０　（上記の該配列について参照）を使用し、また３°プライマーとしてｒ２５を使用した。

　ＡｌｅＸ９０は−３１２から−２８３のＨＣｖヌクレオチドに由来し、ｒ２５は３６５から３４２のヌクレオチドに由来する（図１８寥照）。ｒ２５の配列は以下の通りである。

５’　ＡＣＣＴＴＡ　ＣＣＣＡＡＡ　ＴＴＧ　ＣＧＣＧＡＣＣＴＡ　３゜ＨＣＶ２７、ＨＣＶＫＩ、ＨＣＶＩＩ、　ＨＣＶＩ２４、およびＨＣＶＩ８（７）　５ °領域の配列と、プロトタイプＨＣＶ、ＨＣＶＩの配列との比較は以下のことを示した。試験された５°領域は５ＨＣＶＩｉ離体の間に高度に保持される。配列は、［ＨＣＶＩ２４の位置−１７１で削除された１つのヌクレオチド、および単離体ＨＣＶＫＩの位置−２２２から−２１９の４個のヌクレオチドが不明瞭である以外は同じであるように見えた。

この領域での高レベルの配列保持はウィルスの複製および／または転写および／または翻訳におけるこの領域の役割を反映し得る。

１庄」」Ｉ（ヒｉ旦ＨＣＶ　にお（る　（パ１ＣＤＣ／ＨＣＶＩから逸脱する配列を含むＨＣＶの単離体がヒトの個体において同定された。これらのいくつかは抗Ｃ１００−３抗体に対して血清学的にポジティブであった（ＥＣＩＯは抗体に対してネガティブであった）。これらの新しい単離体の同定は、ＣＤＣ／ＨＣＩ配列を使用するＰＣＲ法により増幅されたＨＣＶゲノムのクローン化および配列決定セグメントにより行われた。増幅は本質的にはＨＣＶ／ｃＰｃＲ法に基づいて行われた。この方法は本明細書にて述べたＨＣＶ　ｃＤＮＡに基づいてプライマーおよびプローブを使用する。この方法の第１段階は、逆転転写酵素を使用してｃＤＮＡをＨＣＶゲノムまたはその複製中間物のいずれかへと合成することである。ＨＣＶ　ｃＤＮＡの合成後、および増幅の前にサンプルの＋？ＮＡは当該分野において既知の方法により減退される。ＨＣＶ　ｃＤＮＡの特定のセグメントは次に適切なプライマーを使用して増幅される。増幅された配列はクローン化され、増幅した配列を含むクローンが、プライマーの間に存在するがプライマーとは重複しない配列に相補するプローブにより探知される。

のヒトか゛　されたＨＣＶＨＣＶピリオンの源として使用された血液サンプルがノースカロライナ州シャーロットの米国赤十字社およびミズーリ州カンサスシティのＣｏｍｍｕｎｉｔｙ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｋａｎｓａｓから得られた◎サンプルは、ＥＰＯ公開第３１８．２１５号にて述べられているＥＬＩＳＡアッセイを使用してＨＣＶ　Ｃ１００−３抗原に対する抗体をめてスクリーニングされ、また多クローン性のヤギの抗ヒトＨＲＰを使用して相補するｗａｓ　ｔｅｒｎブｏｌｌ−分析を行って抗ＨＣＶ抗体を測定した。それぞれ米国赤十字社およびＣｏｍ＋ｍｕｎｉｔｙ　ＢｌｏｏｄＣｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｋａｎｓａｓからの２つのサンプル、＃２３および＃２７がこれらのアッセイによりＨＣＶポジティブであると決定された。

これらのサンプルの血清中に存在するウィルス粒子が、Ｂｒａｄｌｅｙら（１９８５）の述べた条件の下で超遠心分離法により単離された。ｌＯマイクログラム／ｍｌのプロティナーゼにおよび０゜１％のＳＤＳという最終濃度でプロティナーゼにおよびＳＤＳによる消化によりＲＮＡが粒子から抽出された。消化は３７ °Ｃで１時間の間行われた。ウィルスＲＮＡは、ＥＰＯ公開第３１８．２１６号にて述べられているようにクロロホルム−フェノールによる抽出によりさらに精製された。

ＲＮＡの調製において）ＩＣＶ　ＲＮＡは、ｃＤＮＡ配列１９５８−１９３９に対応しまた次の配列をもつオリゴヌクレチオドＪＨＣ７が逆転写酵素の反応のためのプライマーとして使用されたということ以外は、本質的にはＥＰＯ公開第３１８．２１６号にて述べられているように、ｃ　ＤＮＡへと逆転写された。

ＪＨＣ７：　ＣＣＡ　ＧＣＧ　ＧＴＧ　ＧＣＣＴＧＧ　ＴＡＴ　ＴＧｃＤＮＡの両ストランドが合成された後、結果として得られたｃＤＮＡは次に、使用したオリゴヌクレオチドプライマー、すなわちＪＨＣ６およびＡＬＸ　８０が、６７３から１７５１（７）ＣＤＣ／ＨＣＶＩ　ヌクレオチドからのＨＣＶゲ／ムの１０８０ヌクレオチドセグメントを増幅するように設計されているという点以外は、本質的にはＰＣＲ増幅により生成されたクローンの単離に対して上述したＰＣＲ法により増幅された。さらに、プライマーはＰＣＲ生成物の３′末端でＮＯＴ　Ｉ制限サイトを、および５°終端でプラント末端を組み込むように設計されている。プライマーの配列は次の通りである。

ＡＬＸ　８０：　ＴＴＴ　ＧＧＧ　ＴＡＡ　ＧＯＴ　ＣＡＴ　ＣＧＡ　ＴＡＣＣＣＴ　ＴＡＣＧＴＧおよびＪＨＣ６二ＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＴＣＣＧＴＴＧＧＣＡＴＡＡＡＬＸ　８０はＣＤＣ／ＨＣＶＩ配列ｃＤ　ヌ’ｙ　Ｌ／　ｔ　＋　）’　６７３−７０２１＝対応する。ＪＨＣ６はＨＣＶＩのヌクレオチド１７５２−１７３８に対応する。（ざらにＮ。

ｔｌサイトをコード化する１２個の余分のヌクレオチドがある）。

ＪＨＣ６におけるヌクレオチドの命名、すなわち下降番号はアンチセンスストランドにおける配置を示している。

ＰＣＨの上述のプライマーとの増幅の後、プラントエントテルミヌスは次のようにＮＯＴ　Ｉサイトに変換された。１５　ＤｇＳのホモポリマーチイルが最後のデオキシヌクレオチド転写酵素を使用してＰＣＲ生成品に接着され、この生成品はＪＨＣ６およびＪＨＣ工３をプライマーとして使用してＰＣＲにより再び増幅された。下記の配列をもつ後者のプライマー、ＪＨＣ１３は、ＳＰ６フアージプロモータに加えてＮＯＴ　Ｉサイトを含有するように設計されている。　（ＳＰ６ブロモータについてはＪ、　ＳｅｔｌｏｗｇのＧＥＮＥＴＩＣＥＮＧＩＮＥＥＲ［ＮＧ　（１９８８）に述べられている。）ＪＨＣ１３：　ＡＡＴ　ＴＣＧ　ＣＧＧ　ＣＣＧ　ＣＣＡ　ＴＡＣＧＡＴ　ＴＴＡ　ＧＧＴ　ＧＡＣＡＣＴ　ＡＴＡ　ＧＡＡ　ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ増幅されたＨＣＶ　ｅＤＮＡをクローン化するために、ＰＣＲ生成品がＮｏｔｌにより分裂され、スペルミンにより沈澱して遊離オリゴヌクレオチドを除去（Ｈｏｏｐｅｓら（１９１１１））、次いでｐｔｌｃ１８ｓのＮｏｔ　１サイトへとクローン化された（第１＋／、Ａ、３４参照）。各ＨＣＶ単離体に由来する３個のクローンにおけるＨＣＶ　ｃＤＮＡに対して配列分析が行われた。分析は本質的にはＣｈｅｎおよびＳｅｅｂｕｒｇ　（１９８５）により述べられた方法により行われた。

サンプル２３および２７においてＨＣＶに由来するクローンのコンセンサス配列をそれぞれ図４６および図４７に示す。これらの図には、コンセンサス配列においてフード化されたアミノ酸と同様、変異配列もまた示されている。

図３９および図４０は、サンプル２３．２７およびＨＣＶＩの整合したポジティブストランドのヌクレオチド配列（図３９）および推定のアミノ酸配列（図４０）の比較を示す。図３９のＨＣＶＩのアミノ酸配列は、ＨＣｖゲ／ムＲＮＡの中の大きなＯＲＦによりコード化されたＨＣＶポリタンパクのアミノ酸番号１２９ −４６７を表わす。図４６および図４７の試験は３個の単離クローンの配列において変異が存在することを示す。ヌクレオチドレベルおよびアミノ酸しベルでの配列変異をすぐ下の表にて要約する。表において、ＳおよびＮＳＩと命名されたポリペプチドはそれぞれアミノ酸番号１３０から約３８０、および３８０から約４７０を表す。番号付けは推定ビニ／エータメチオニンからのものである。ＳおよびＮＳ１という用語はＦｌａｖｉｖｉｒｕｓモデルを使用してポリペプチドをコード化する配列の位置決めに基づくものである。しかし上述のように、ウィルスのポリペプチド領域、特に推定のＥ／ＮＳ１領域に関してはＨＣＶとＦｌａｖｉｖｉｒｕｓとの間には全体的な相関関係はないことが最近明らかとなっている。実際には、ＨＣＶポリペプチドおよびそれらのコーディング領域はＦｌａｖｉｖｉｒｕｓモードからの実質的な由来を示し得る。

７フ（七Ｖつ一ビイし　マミ、［）・ビイレ／＋ｌ：’ｐ　Ｓ　ＮＳ１　メトイ千　５　ＮＳＩ一一一一一一一一一一一一と−Ｉｓ　％−−−二Ｌ−二Ｌ−ＨＣＶＩ／ＨＣＶ２３　９３　９５　９１　９２　９５　８７）ＩＣＶ１／ＨＣＶ２７　Ｂ９　９３　８４　８９　９５　Ｂ２’−ＩＣＶ２３／Ｉ−ＩＣＶ２７Ｂ９　９３　８５　９０　９３　８４新たに単離されたＨＣ’／配列においては変異は存在しないが、サンプル２３および２７　（）ｌｃＶ２３および１（ＣＶ２７と呼ばれる）からクローン化された配列はそれぞれ１０１９ヌクレオチドを含有し、選択されたクローンにおけるこの領域の削除および追加ミニータントの欠如を示している。図３９および４０における配列はまた単離配列がこの領域で再配列されていないことを示す。

ＨＣＶＩのための同意配列とＨＣＶのその他の単離体のための同意配列との比較を上の表に要約する。チンパンジーの単離ＨＣＶ　１とヒトから単離されたＨＣＶとの間の配列変異は、ヒト起源のＨＣＶの間に見られるものとほとんど同じであった。

２つの推定領域における配列変異が均一ではないということは興味深い。推定Ｓ領域における配列は比較的一定しているように見え、領域を通じて不規則に分散されている。これに対して、推定ＮＳＩ領域は全体の配列より変異程度が高く、変異は推定ポリタンパクの推定Ｎ−テルミヌスから約７０個のアミノ酸だけ下流に位置する約２８個よりなる高可変ポケット内にあるように見える。

探知された変異は増幅プロセスの間に導入されたと論じされ得るが、変異のすべてはこの結果からであるとは思われない。Ｔａｑポリメラーゼがサイクル当りのＤＮＡテンプレート１ｏキロベース当り約１ベースで配列にエラーを導入することが概算されている（Ｓａｉｋｉら（１９１１８＞）。この概算に基づけば、１０１９　ｂｐ　ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅の間に最大７個のエラーが導入されたであろうことになる。しかし、ＨＣＶ−２３およびＨＣＶ−２７の３個のサブクローンはそれぞれ２９および１４のベース変異を生じた。次のことはこれらの変異が自然に発生することを示唆する。ベース変化の約６０％はアミノ酸配列を変化させない静かな突然変異である。Ｔａｑポリメラーゼにより導入された変異は無作意に起こることが予想される。しかし結果は、変異配列が少なくとも１つの特定の領域に密集する。さらに、ＰＣＲ増幅生成品から由来する多数の異なるクローンを配列決定することにより、フンセンサス配列が由来する。

（に鉛白）イタリア　び米　に、けるヒトからのＨＣＶ異なった分離株に存在するＨＣ’／　ＲＮＡのセグメントはＨＣＶ／ｃＰＣＲ法により拡大された。これらのセグメントは推定ＨＣＶポリ蛋白のメチオニンコード開始コドンから下流の〜０．６ｋｂから〜１．６ｋｂの領域を作り出す。分離株はＨＣＶ感染の個体から得られる生物学的標本からのものである。より詳細には、分離株ＨＣＴ：１８は米国に於ける個体のヒトプラズマから、ＥＣＩおよびＥＣｌ０はイタリアの患者の肝の生検から、モしてＴｈはアメリカ人の患者の末梢血単核球分画からのものである。

ＨＣＶ　ＲＮＡの比較できるセグメントはチンパンジーから単離された。

ＲＮＡはヒトプラズマの標本からフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール抽出液を使用して抽出された。Ｏ，１ｍｌまたは０．０１ｍ１のプラズマを１０から４０Ｍｇ／＋１のポリアデニル酸を含むＴＥＮＢ／プロテアーゼに／Ｓ　ＤＳ溶液（０，０５Ｍ）リス−ＨＣＬ、　ｐｉ（８゜０、Ｏ，ＯＯＩＭ　ＥＤＴＡ、　Ｏ，１Ｍ　ＮａＣ１，ＩＢ／＋１プロテアーゼに１　および０．５％５ＤＳ）で最終容量の１．０ｍｌに希釈し、３７°Ｃで６０分間培養した。このプロテアーゼにの消化の後、得られたプラズマ分画をＴＥ　（Ｓｏｄ　）リス−ＨＣ１，ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）飽和フェノールで、ｐ）１６．５で抽出することによって脱蛋白した。フェノール相を遠心分離によって分離し、０．１％ＳＤＳを含むＴＥＮＢで再抽出した。得られた各抽出からの水相を集め、等容量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール／　［ｌ：１（９９：１）］　、で二変度抽出、次いで等容量のクロロホルム／イソアミルアルコールの９９：１混合液で変度抽出した。遠心分離により相分離をし、水相を０．２Ｍ酢酸ナトリウムの最終濃度にし、二容量のエタノールを加えて核酸を沈澱させた。

沈澱した核酸を５Ｗ４１３８にのローター中で４°Ｃで６０分間超遠心分離により、またはＩＯＫのマイクロッエージ中で４°Ｃで１０分間超遠心分離した。

肝の生検から抽出されたＲＮＡが０ｓｐｅｄａｌｅ　Ｍａｇｇｉｏｒｅ　ｄｉ　Ｓ、　Ｇｉｏｖａｎｎｉ　Ｂａｔｔｉｓｔａ、　Ｔｏｒｉｎｏ、ＩｔａｌｙのＦ、　Ｂｏｎｆｎｏ博士により提供された。

単核球分画がメーカーの指示を用いてＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ■（ファルマシア社）を通して得られる個体の血の部分標本の沈澱によって得られた。全ＲＮＡを分画から欧州特許第３１８．２１６号（Ｃｈｏｏら（１９８９）をも参照）に記載のグアニジンチオシアネート法を用いて抽出した。サンプルからのＨＣＶ　ｃＤＮＡの合成を逆転写酵素と、クローン１５６ｅおよびクローンに９１由来のプライマーを使用して行った。ゲノムＲＮＡに相対的なアンチセンスであるこれらのプライマーは次の様な配列を宵する。

１５６ｅ１６Ｂ：　５°ＣＧＡ　ＣＡＡ　ＧＡＡ　ＡＧＡ　ＣＡＧ　Ａ　３°。

およびに９１／１５Ｂ　５°ＣＧＴ　ＴＧＧ　ＣＡＴ　ＡＡＣＴＧＡ　Ｔ　３’。

エタノール沈澱に続いて沈澱したＲＮＡまたは核酸分画を乾燥し、ＤＥＰＣ処理された希釈水中に再懸濁した。核酸中の二次構造を６５℃で１０分間加熱して壊し、そのサンプルを直ちに氷上で冷却した。ｃＤＮＡを１から３μｇの肝から全ＲＮＡ、または１０から１００μｌのプラズマから抽出された核酸（またはＲＮＡ）を使用して合成した。その合成には逆転写酵素が用いられ、メーカーにより特定されたプロトコールのＢＲＬを用いて２５μｍの反応であった。ｃＤＡＮ合成のためのすべての反応混合物はＲＮＡａｓｅ阻害剤、ＲＮＡ５ＩＮ　（Ｆｉｓｈｅｒ／Ｐｒｏｍｅｇａ）の２３単位を含んでいた。　ｃＤＮＡ合成に続いて、その反応混合物を水で希釈し、１０分間ボイルし、そして速やかに水上で冷却した。

各サンプルは２周のＰＣＲ増幅を受けた。反応のためのプライマーを”ＥｎｖＬ ”および”ＥｎｖＲ−と示された領域を増幅するために選択した。−ＥｎｖＬ″ 領域はヌクレオチド６６９−１２４３、および推定アミノ酸１１７から３０８を包含しており；　−ＥｎｖＲ″領域はヌクレオチド１２１５−１６２９を包含し、推定アミノ酸３００から４０８（推定アミノ酸は推定メチオニン開始コドンから始めて番号づけられる）をコードする。これらの領域のＨＣＶ　ｃＤＮＡにフードされた推定ポリ蛋白に対する相対的な関係、そしてＦｌａｖｉｒｕｓモデルにコードされたポリペプチドに対する相対的な関係を第４８図に示す。

第１ラウンドのＰＣＲ反応のためのプライマーはクローンａｇ３０ａ、クローン１５６ｅ、またはクローンに９−１のいずれかのＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列から誘導された。ＥｎｖＬ領域の増幅のために用いられるプライマーは１５６ｅ１６Ｂ　（上出の）、およびセンスストランドのためのａｇ３０ａ１６Ａであった；　ＥｎｖＲの増幅にはプライマーに９１７１６Ｂ（上出の）が使用され、センスストランドのためには１５６ｅＬ６ａが用いられた。センスストランドブライマーの配列は次の様である。

Ｆｏｒ　ＥｎｖＲ，ａｇ３０ａ１６Ａ：　５°ＣＴＣＴＡＴ　ＧＧＣＡＡＴ　ＧＡＧ　Ｇ　３’およびＦｏｒ　Ｅｎｖｒ、　１５６ｅ１６Ａ：　５°ＡＧＣＴＴＣＧＡＣＧＴＣＡＣＡ　Ｔ　３゜ＰＣＲ反応は、１μｇのＲＮａｓｅＡを加えること以外は本質的にメーカーの指示（Ｃｅｔｕｓ−Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）に従って行われた。反応は最終容量が１００μｍになるように行われた。ＰＣＲを、９４℃（１分）、３７℃（２分）、および７２℃（３分）、そして最終サイクルの７２°Ｃでは７分間延長する方式を利用して３０サイクル行った。次いで、サンプルをフェノール：クロロホルムで抽出し、エタノールで２回沈澱させ、１０ｍＭ）リス塩酸中にｐＨ８，０で再懸濁させ、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０（Ａｍｉｃｏｎ）濾過を用いて濃縮した。

この方法は効率的に３０ヌクレチドより小さなオリゴヌクレオチドを除去する；このようにして、ＰＣＲ増幅の箪１ラウンドからのプライマーを除去する。

Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０で濃縮されたサンプルは、次いで、ＥｎｖＬ領域のためにクローン２０２ａおよび１５６ｅから、モしてＥｎｖＲ領域のために１５６ｅおよび５９ａから設けられたプローブを用いるＰＣＲ増幅の第２ラウンドにかけられた。ＥｎｖＬ領域の増幅のためのプライマーは次の様な配列を有する。

２０２ａＥｎｖ４１ａ：　５°ＣＴＴ　ＧＡＡ　ＴＴＣＧＣＡ　ＡＴＴ　ＴＧＧ　ＧＴＡＡＧＧ　ＴＣＡ　ＴＣＧ　ＡＴＡ　ＣＣＣＴＴＡ　ＣＧ　３゜およびｌ５６ｅ３８Ｂ’：　５°ＣＴＴ　ＧＡＡ　ＴＴＣＧＡＴ　ＡＧＡ　ＧＣＡ　ＡＴＴＧＣＡ　ＡＣＣＴＴＧ　ＣＧＴ　ＣＧＴ　ＣＣ３゜ヒト由来のＲＮＡ　ｓのＥｎｖＲ領域の増幅のためのプライマーは次の様な配列を有する。

１５６ｅ３８Ａ’：　５°ＣＴＴ　ＧＡＡ　ＴＴＣＧＧＡ　ＣＧＡ　ＣＧＣＡＡＧＧＴＴ　ＧＣＡ　ＡＴＴ　ＧＣＴ　ＣＴＡ　ＴＣ３゜ＡＧＧ　ＣＴＡ　ＴＣＡ　ＴＴＧ　ＣＡＧ　ＴＴＣ３゜ＰＣＨによる増幅は、９４℃（１分）、６０℃（１分）、および７２℃（２分）で、最後のサイクルでは７２℃で７分間延長する方式を用いた３５サイクルであった。そのサンプルを、次いで、フェノール：クロロホルムで抽出し、２回沈澱させ、モしてＥｃｏＲＩで消化した。ＰＣＲ反応生成物を６％ポリアクリルアシドゲルの電気泳動により生成物を分析した。はぼ推定された大きさの期待されたＰＣＲ生成物のＤＮＡがゲルから電気溶出され、ｐＧＥＭ−４プラスミドベクターまたはラムダｇｔｌｌのいずれかにサブクローンされた。増幅の第一ラウンドの後、ＥｎｖＬおよびＥｎｖＲに期待される生成物の大きさはそれぞれ６１５ｂｐおよび６８３ｂｐであり；増幅の第二ラウンドの後、ＥｎｖＬおよびＥｎｖＲに期待される生成物の大きさはそれぞれ４１４ｂｐおよび５７５ｂｐである。増幅された生成物を含むプラスミドを宿主細胞を形質転換するために用いた；　ｐＯＥＭ−４プラスミドをＤＨ５−アルファを形質転換するために使用し、ラムダｇｔｌＬをｃ６００デルタ−ＨＦＬを形質転換するために使用した。適当なＨＣＶプローブ（以下に記述される）にハイブリダイズするかまたは正しい大きさの挿入物を有するプローブにハイブリダイズした形質転換された細胞のクローンを選択した。次いで、挿入物をＭ１３にクローンし、配列した。

すべてのＨＣＶ／ｃＰｃＲ生成物のためのプローブは、ＨＣＶ　ｃＤＮＡの３２ｐラベル化セクシヨンから成り、このｃＤＮＡはクローン２１６（プライマーとしてＣＡ２１６ａ１６Ａおよび２１６ａ１６Ｂを使用する）、およびクローン８４（プライマーとしてＣＡ３４ａ１６ＡおよびＣＡ３４ａ１６ＢまたはＣＡ３４ａ１６ｃを使用する）の領域のＰＣＲ増幅によって調製された；３２Ｐはニッケル翻訳によりＰＣＲ生成物の中に導入された。

ＥｎｖＬ増幅の第一および第二ラウンドのプローブはクローン２１６からのものであった。ＥｎｖＲ増幅の第一ラウンドのためのプローブは８４（すなわち、ＣＡ３４ａ１６ＡおよびＣＡ３４ａ１６Ｂ）からのものであり、ＥｎｖＬ増幅の第二ラウンドのためのプローブはＣＡ３４ａ１６ＡおよびＣＡ３４ａ１６Ｃであった。これらのプローブはＨＣＶ／ｃＰＣＲ反応に用いられるプライマーとオーバーラツプしなかった。プローブのＰＣＲ増幅のためのプライマー配列は次の表でのようである。

（以下余白）プライマー　クローン　配列ＣＡ２１６ａ１６Ａ　２１６　５°ＴＧＡ　ＡＣＴ　ＡＴＧ　ＣＡＡ　ＣＡＧ　Ｇ　３゜ＣＡ２１６ａ１６Ｂ　２１６　５°ＧＧＡ　ＧＴＧ　ＴＧＣＡＧＧ　ＡＴＧ　Ｇ　３゜ＣＡ３４ａ１６Ａ　８４　５’　ＡＡＧ　ＧＴＴ　ＧＣＡ　ＡＴＴ　ＧＣＴ　Ｃ３゜ＣＡ３４ａ１６Ｂ　８４　５°ＡＣＴ　ＡＡＣＡＧＧ　ＡＣＣＴＴＣＧ　３’ＣＡ３４ａ１５Ｃ８４５°ＴＡＡ　ＣＧＧ　ＧＴＣＡＣＣＧＣＡ　Ｔ　３’ＥｎｖＬ領域の変位体（Ｖａｒｉａｎｔｓ）についての配列情報＋ｆＨｃＴ＃１８からの３クローン、ＴＨからの２クローン、ＥＣＩからの３クローンから得られ、そして前出の欧州特許第３１８，２１６号（こ記載のＨＣＶＩクローンから得られた。図４９には、これらのクローン由来の各々の分離株の複合のヌクレオチド配列の比較力；示されている。この図では、各配列がＥｎｖＬ領域のセンスストランドのために５°から３°に示され、そしてその配列が並べられてｌ、Ｎる。垂直線および大文字は配列ホモロジーを示し、線がなくて大文字化されていない文字はホモロノーがなｔｌことを示している。

線で示されている配列は次の様である：線１　％Ｔｈｏｒｎ　；線２、ＥＣＩ；線３、ＨＣＴ：Ｌｉｔ、線４、■ＣＶＩＥｎｖＲ領域の変位体についての配列情報はＥＣｌ０の２つのクローンから、そして前出の欧州特許第３１８．２１６号番ご記載されて（する■（’Ｖｌクローンから得られた。二つのＥＣｌ０クローンは一つのヌクレオチドだけ興なっていた。図５０に、ＥＣｌ０（クローン２）のヌクレオチド配列と複合物のＩ（ＣＶＩ配列との比較が示されている；各々の配列をＥｎｖＲＱ域のセンスストランドに対して５′から３゛と示されており、その配列が並べられている。配列間のダブルドツトは配列ホモロジーを示している。

ＥｎｖＬ　（アミノ酸３１１７−３０８）にフードされたアミノ酸配列と各々の単離体のＥｎｖＲ領域（アミノ酸＄３００−４３８）との比較が図５１および図５２にそれぞれ示されている。これらの図に前述の分離株ｊ）１２３およびｊ）１２７の配列が念まれでいる。日本人の分離株からの配列もまた示されている；　これらの配列は日本のＴ。

ＭｉｙａＩＩｕｒａによって提供された。図には、その領域のアミノ酸がＨＣＶＩに対してそっくりそのまま与えられており、種々の分離株のノンーホモロガスアミノ酸が示されている。

図５１かられかるように、ＥｎｖＬ領域ではＩＩｃＶｌと池の分離株との間に全体でおよそ９３％のホモロジーがある。ＨＣＴ１８．　Ｔｈ、およびＥＣＩはＨＣＶＩとおよそ９７％のホモロジーがあり；　ＪＨ２３およびＪＨ２１はＨＣＶＩと、それぞれおよそ９６％および９５％のホモロジーを有する。図５２はＥｎｖＲ領域のホモロジーがＥｎｖＬ領域よりも有意に少なくて；さらに、一つの副領域は超可変性（すなわちアミノ酸３８３−４０５から）のように見える。このデータをすぐ下の表に要約する。

（以下余白）表ＥｎｖＲ領域のホモロジーＪ）１２３（Ｕ、　Ｓ、　＞　８３　５７ＪＨ２７（Ｕ、　Ｓ、　）８０　３９Ｊａｐａｎｅｓｅ　７３　４８ＥＣＩＯ（Ｉｔａｌｙ）　８４　４８ボジテイフ′およびネガティブストランドの検中の５°ＨｃＶ　ＲＮＡ血清から単離された、）ｌｃＶ２７のＲＩＩＡは、ＰＣＲ法を用いてポジティブおよびネガティブストランドの存在について分析した。

ＰＣＲ法については、次の事柄を除いて、基本的に上述のように実施した。抽出したＨＣＶ２７　ＲＮＡは、Ａ１ｅｘ９０またはＪＨ５２（配列については前出参照）をプライマーとして用いて、−重鎖ｃＤＮＡに逆転写した。ＡＬｅｘ９Ｑの配列は１（ＣＩ／　ＲＮＡのポジティブストランドの−３１２から一２８３位のヌクレオチドに一致している。これに対して、ＪＨ５２は、ネガティブストランドの−１１７から一９３位のヌクレオチドに一致している。得られた一本＠ｌＨＣＮ　ｃＤＮＡは、各々ＡＩｅｘ９０およびＪＨ５２を用いたＰＣＨにより増幅を行つた。増幅された生産物はＡＬｅｘ８９をプローブとしてサザンブロッティングにより行われたｏ　Ａｌｅｘ８９は）ＩｃＶ　ＲＮＡの−２０３から一１７５位ノヌクレオチドに一致する。Ａｌｅｘ８９の配列は次のとおりである。

５’　ＣＣＡ　ＴＡＧ　ＴＧＧ　ＴＣ丁　ＧＣＧ　ＧＡＡ　Ｃ（：Ｇ　ＧＴＧ　ＡＧＴ　ＡＣＡ　３’この方法によると、分析により、ＲＮＡの両ストランドの増幅生産物のシグナルは同等の強度を有することが示された。このことにより、ＨＣＶのＲＮＡの５°領域は二本鎖ＲＮＡとして存在し得ることが示唆された。

ＨＣＶのサントイ、７チ／）イブリダイゼーションのためのプローブ本実施例は、米国特許第４８６８１０５号に記載の分析方法を基本的に用いて生物学的資料中のＨＣＶ　ＲＮＡを検出するのに有用な一対のラベルおよびカブチャーブローブを例示する。この方法は、溶液相サンドイノチノ＼イブリダイゼーシコンアツセイであり、このアッセイにおいては、分析物である核酸において標的の配列にハイブリダイズする、カブチャーおよびラベルプローブを用いる。生物学的資料のスクリーニングにおいて使用されたプローブは、ＨＣＶゲノムの保持領域（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｒｅｇｉｏｎｓ）に結合し、ＨＣＶ結合領域はＨＣＶゲ／ムに対するユニーク性について選択される。カブチャーブローブの結合／＜−トナーに結合する領域、またはラベル部分（あるいは、ＥＰＯ公開Ｎｏ、　３１７．０７７に開示の方法が用いられるのであれば、増幅多量体）に結合するラベルプローブの部分は、次のように選択される。つまり、それらはデータ／　ｚＨンクまたはＨＣＶの既知の配列のいずれにも結合しないように、そしてそれらは選択条件下において、それらの相補体と安定な二本鎖を形成するようにＧおよびＣの適切な量を有するように、選択される。カブチャーおよびラベルプローブはセットであり、−組のプローブは他の組のプローブに変化を与えない。これらのプローブは、第１８図に示されるプロトタイプ）ＩｃＶ　ｃＤＮＡ配列のフード鎖の中の次のヌクレオチド配列に相捕的な配列を含む。

カブチー１−−４２．ＸＴ１．１　−３１８から一２８９カプチ＋　−４２，ＸＴ１．２　−２８５から一２５６カプｆ＋−４２，ＸＴ１．３　−２５２から一２２３カブチ＋　−４２，ＸＴ１．４　−２１９から一１９０ラ　ベ　ル　４２．ＬＬＡ２Ｃ，５−１８６から一１５７ラ　ベ　ル　４２．ＬＬＡ２Ｃ，６−１５３から一１２４ラ　ベ　ル　４２．ＬＬＡ２Ｃ，７、−１２０から　−９１ラ　ベ　ル　４２．ＬＬＡ２Ｃ，８−８７から　−５８ラ　ベ　ル　４２．ＬＬＡ２Ｃ，９−５４から　−２５ラ　ベ　ル　４２．ＬＬＡ２Ｃ，１０−２１から　９ラ　ベ　ル　４２．ＬＬＡ２Ｃ，ｌｌ　１３から　４２ラ　ベ　ル　４２．ＬＬＡ２Ｃ，１２４６から　７５ラ　ベ　ル　４２．ＬＬＡ２Ｃ，１３７９から　１０８ラ　ベ　ル　４２．ＬＬＡ２Ｃ，１４１１２から　１４１ラ　ベ　ル　４２．ＬＬＡ２Ｃ，１５１４５から　１７４セット２カブチャー　４２．１６．ＸＴｌ　４３７８がら４４ｏ７カブチ＋　−４２，１７，ＸＴ１　４４１１がら４４４゜カブチャー　４２．１８．　ＸＴＩ　４４４４カラ４４７３カブチ＋　−４２，１９，ＸＴ１　４４７７がら４５ｏ６カブチ＋　−４２，２０，ＸＴＩ　４５１０がう４５３９ラ　ベ　ル　４２．２１．ＬＬＡ２Ｃ４５４３がら４５７２ラ　ベ　ル　４２．２２．ＬＬＡ２Ｃ４５７６がら４６ｏ５ラ　ベ　ル　４２．２３、ＬＬＡ２Ｃ４６０９がら４６３８ラ　ベ　ル　４２．２４゜ＬＬＡ２Ｃ４６４２がら４６７１ラ　ベ　ル　４２．２５．ＬＬＡ２Ｃ４５７５がら４７ｏ４ラ　ベ　ル　４２．２Ｂ、ＬＬＡ２Ｃ４７０８がら４７３７ラ　ベ　ル　４２．２７．ＬＬＡ２Ｃ４７７１がら４７７゜ラ　ベ　ル　４２．２８．ＬＬＡ２Ｃ４７７４がら４８０３ラ　ベ　ル　４２．２９．ＬＬＡ２Ｃ４８０７がら４８３６ラ　ベ　ル　４２．３０．ＬＬＡ２Ｃ４８４０がら４８６９ラ　ベ　ル　４２．３１．ＬＬＡ２Ｃ４８７３がら４９ｏ２（以下余白）セット３カプチ＋　−４２，３２，ＸＴｌ　４０５６から４０８５カプチ＋　−４２，３３，ＸＴ１　４０８９から４０８５カブチ＋　−４２，３４，ＸＴ１　４１２２がう４１５１カブチヤー　４２．３５．ＸＴ１　４１５５から４１８４ラ　ベ　ル　４２．３６．ＬＬＡ２Ｃ４１ＢＢから４２１７ラ　ベ　ル　４２．３７．ＬＬＡ２Ｃ４２２１から４２５０ラ　ヘル４２．３８．ＬＬＡ２Ｃ４２５４から４２８３ラ　ヘ／ｌ／　４２．３９゜ＬＬＡ２Ｃ４２８７がら４３１６ラ　ベ　ル　４２．４０．ＬＬＡ２Ｃ４２３０から４３４９ラ　ベ　ル　４２．４１．ＬＬＡ２Ｃ４３５３がら４３８２ラ　ベ　ル　４２．４２．ＬＬＡ２Ｃ４３１１６がら４４１５ラ　ベ　ル　４２．４３．ＬＬＡ２Ｃ４４１９がら４４４８上記のセｙｈにおいて、各々のカブチャープローブは、ＨＣＶ配列に相補的な配列に加えて、次の配列をＨＣＶ配列の下流（つまり、３°末端）に有する：５°ＣＴＴ　ＣＴＴ　ＴＧＧ　ＡＧＡ　ＡＡＧ　ＴＧＧ　ＴＧ　３’各々のカブチャープローブに共通の配列は結合パートナ−の配列に相補的であり、従って、ハイブリダイゼーションの後、二本鎖は固相に固定することにより捕捉され得る。

各セクトにおいてまた、各ラベルプローブはＨＣＶ配列の相補的な配列に加えて、次の配列をＨＣＶ配列の下流に有する二５°　ＴＴＡ　ＧＧＣＡＴＡ　ＧＧＡ　ＣＣＣＧＴＧ　ＴＣ３’ＥＰＯ公開Ｎｏ、　３１７．００７に記載の方法が用いられる場合には、各ラベルプローブに共通の配列は、多量体（＋ｎｕｌｔｊｍｅｒ）の配列に相補的であり、該多量体とのハイブリノト二本鎖の形成を可能とする。

上記七ノド中のプローブの配列を箪１９図に示す。

ＰＣＲ幅を　いたＨＣＶポリヌクレオチド配列の検ｃＰｃＲによるＨＣＶ　ＲＮＡの増幅の一般化された方法において、ＲＮＡ鎖はピリオンまたはｍＲＮＡ鎖であり、これは”センス”鎖である。しかし、中間体のＦｌｕ型がまた、”アンチセンス”であるとして検出されることも可能である。この場合には、プライマーが”センス”である。標的領域を含むＲＮＡセンス鎖がアンチセンスプライマーとハイブリダイズし、このアンチセンスプライマーは、標的を含む復製ストランドの合成をプライムする。ＲＮＡ鋳型に対するｃＤＮＡは、プライマーおよび鋳型依存性逆転写酵素を用いて合成される。得られたＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドのｃＤＮＡは変性およびＲＮＡ５ｅによる処理により放出される。プライマーはｃＤＮＡにアニールし、プライマーおよび鋳型依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長する。生産物は変性され、プライマーに再びアニールされ、２回目の合成が続けられる。

標的領域を含む増幅された生産物が所望の量（これは少なくとも検知し得るレベルである）に達するまで、何度も繰り返して行われる。

ＮＡＮＢＨヲスるチノパンツー由　の　および漿ヰ１品における！！！ｎ−配タ１由来の、幅された）ＩｃＶ核　配ｌ！のＮＡＮＢＨを有するチンパンジーの肝臓および血漿に存在し、コントロールのチンパンジーには存在しないＨＣＶ核酸は、基本的（こ５ａｉｋｉら（１９８６）に君己載されたポリメラーゼチェーンリアクシコンにより増幅された。プライマーオリゴヌクレオチドは、クローン８１（第２２図）、またはクローン３６（第２３図）およびクローン３７ｂ（第２４図ン中の）ＩＣＶ　ｃＤＮＡ配列に由来する。増幅された配列は、ゲル電気泳動および改変されたサザンブロ７ティング法を用いて決定された。この方法においては、２つのプライマー間の配列であってプライマーを含まない配列により適当なｃＤＮＡオソゴマ一または二ンク翻訳されたｃＤＮＡ配列をプローブすることにより、決定された。

増幅システムにより調べられる）ＩＣＶ配列を含むＲＮＡのサンプル力、ＮＡＮＢＨを宵する３匹のチンパンジーおよび２匹のコントロールのチンパンジーの肝臓生検材料から単離された、ｐｏｌｙＡ”　ＲＮＡフラクシコンの単離は、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）に記載のグアニジンチオシアネート法により行われた。

増幅システムにより調べられたＲＮＡのサンプルはまた、ＮＡＮＢｌ（’２　有する２匹のチンパンジーおよび一匹のコントロールのチンパンジー、さらにコントロールのチンパンジーの血漿のプールから単離された、−匹の感染したチンパンジーは１０６ＣＩＤ／＋１以上のタイターを有し、もう−匹の感染したチノパンツ−は１０５ＣＩＤ／ｍ１以上のタイターを有していた。

核酸を血漿から次のように抽出した。Ｏ，ｌ＋ＩｌｔまたはＯｌｏｌｍｌの血漿を、１０１１ｇ／ｍｌのポリアデニル酸を含むＴＥＮＢ／ブロティナーゼに／ＳＤＳ溶液＜　ｏ、　ｏｓ、ｙ　トリス）ＩＣＩ、ｐＨ８，０、Ｏ，ＯＯＩＭ　ＥＤＴＡ、０．１ＭＮａＣ１，１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼに１　および０．５％５ＤＳ）で希釈して、最終容量を１．　Ｏｗｌとして、３７℃で６０分間インキュベートした。

このプロテイナーゼにでの消化の後、得られた血漿画分は、ＴＥ　（１０，０ｍＭ　トリスＨＣＩ、ｐＨ８，０，１＋ｉＭ　ＥＤＴＡ）で飽和したフェノールにより抽出することにより脱タンパクを行った。フエ／−ル相を遠心分離により分離し、０．１％ＳＤＳを含むＴＥＮＢで再抽出した。各抽出物から得られた水相をプールし、等量のフェノール／クロロホルム　イソアミルアルコール［１：１（９９：ｌ）］で抽出し、次いでクロロホルム／イソアミルアルコールの９９＝１の混合物等Ｉにより２度抽出した。遠心分離による相分離に続き、水相を酢酸ナトリウムか０．２Ｍの濃度となるようにし、そしてエタノール２（＠容量を加えて核酸を沈澱させた。沈澱した核酸はＳＷ４１　ローターを用い３８にで４℃ にて６０分間超遠心分離により回収した。

上記に加えて、高タイターのチン１＜ンジー血漿およびプールされたコントロール血漿を、それぞれ、Ｃｈｏｍｃｙｚｓｋｉおよび５ａｃｃｈｉ　（１９８７）の方法により５０℃ｇのポリＡキャリアを用いて抽出した。この方法においては、酸性グアニジンチオンアネート抽出（ａｃｉｄ　ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ　ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）を用いる。ＲＮＡを、１０．　ＯＯＯＲＰＭで４°Ｃにて１０分間、エノペンドルフマイクロチューブにより遠心分離することにより回収した。

２つの場合において、ＰＣＲ反応にてｃＤＮＡの合成に先立ち、プロテイナーゼに／ＳＤＳ／フェノール法により血漿から抽出された核酸は、さらに、ＳおよびＳ　Ｅｌｕｔｉｐ−Ｒカラムに結合および溶出させることにより精製される。製造者の指示による方法が、それに続いて行われる。

ＰＣＲ反応に鋳型として用いられるｃＤＮＡは、上記のようにして調製された核酸（総核酸またはＲＮＡ）由来である。エタノール沈澱に続き、沈澱した核酸を乾燥し、ＤＥＰＣ処理された蒸留水に再懸濁する。核酸の２次構造を、６５°Ｃで１０分間加熱することにより破壊し、サンプルを直ちに氷上で冷却した。チンパンジーの肝臓由来、または１０〜１００μｍの血漿から抽出した核酸（またはＲＮＡ　）由来の、チンパンジーの総ＲＮＡ　１〜３８ｇを用いて合成された。

合成には逆転写酵素を用い、製造業者であるＢＲＬにより決めれたプロトコルにより２５μｍて反応を行った。

ｃＤＮＡの合成に用いたプライマーはまた、ＰＣＲ反応に用いたそれである。ｃＤＮＡ合成のためのすべての反応混合物は、ＲＮＡａｓｅインヒビター、ＲＮＡ５ＩＮ”　（Ｆｉｓｈｅｒ／Ｐｒｏｍｅｇａ）　２３単位を含冑していた。ｃＤＮＡの合成に続き、反応混合物を水で希釈し、１０分間煮沸し、そして、速やかに水上で冷却した。

ＰＣＲ反応は、ＲＮａｓｅＡを１μｇ加えたことを除いては、基本的には製造業者であるＣｅｔｕｓ−Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒの指示書に従って行った。反応は、最終容量１００μｍで行った。ＰＣＲ反応は３７℃（２分）、７２℃（３分）および９４℃（１分）で３５サイクル行った。

ｃＤＮＡ合成のためのプライマーおよびＰＣＲ反応のためのプライマーはクローン８１、クローン３６またはクローン３７ｂのＨＣＶｃＤＮＡ配列に由来していた。　（クローン８１．３６および３７ｂのＨＣＶｃＤＮＡの配列を、各々第２２図、第２３図および第２４図にそれぞれ示す。

）クローン８１由来の２種の１６１体の配列は次のとおりである。

５°ＣＡＡ　ＴＣＡ　ＴＡＣＣＴＧ　ＡＣＡ　Ｇ　３’および５’　ＧＡＴ　ＡＡＣＣＴＣＴＧＣＣＴＧ　Ａ　３゜クローン３６由来のプライマーの配列は次のとおりである：５’　ＧＣＡ　ＴＧＴ　ＣＡＴ　ＧＡＴ　ＧＴＡ　Ｔ　３゜クローン３７ｂ由来のプライマーの配列は次のとおりである＝５’ 　ＡＣＡ　ＡＴＡ　ＣＧＴ　ＧＴＧ　ＴＣＡ　Ｃ３゛ＰＣＢ反応において、プライマー対を、クローン８Ｉｌｌｌｌｌ１７来の２つの１６−ｍａｒ、またはクローン３６由来の１６−＋＋＋ｅｒおよびクローン３７ｂ由来の１６−ｍａｒから構成した。

ＰＣＲ反応生産物を、アルカリゲル電気泳動法による生産物の分離に次いで、サザンブロノトおよびプライマーに重複しないＨＣＶ　ｃＤＮＡの領域由来の３２ｐ＝ｆｊＡ識された内部オリゴヌクレオチドプローブで、増幅されたＨＣＶ−ｃＤＮＡ配列を検出することによって、分析した。ＰＣＲ反応混合液を、フェノール／クロロホルムで抽出し、核酸を塩およびエタノールを用いて水溶相から沈澱させた。沈澱させた核酸を、遠心分離によって収集し、蒸留水中に溶解させた。

サンプルの一部を、１．８ｚのアルカリアガロースゲル上で電気泳動にかけた。

長さが６０．１０８および１６１のヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡを、分子量マーカーとしてゲル上で共電気泳動にかけた。電気泳動の後、ゲル中のＤＮＡを、Ｂｉｏｒａｄ　Ｚｅｔａ　Ｐｒｏｂｅ’紙上に移した。プレハイブリダイゼーシジンおよびハイブリタイセーンヨン、ならびに洗浄条件は、製造業者（Ｂｉｏｒａｄ）によって規定されたものであった。

増幅されたＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列のハイブリダイゼーション検出に使用されたプローブは、以下の通りであった。一対のＰＣＲプライマーをクローン８１から得たとき、プローブは、２つのプライマーの配列間の領域中に配置されている配列に対応する配列を有する１０８−ｍａｒであった。一対のＰＣＲプライマーをクローン３６および３７ｂから得たとき、プローブは、そのヌクレオチド配列が図３４に示されるクローン３５由来のニックトランスレートされｆ：ＨｃＶ　ｃＤＮＡＤＮＡ−トであった。プライマーを、クローン３７ｂインサートのヌクレオチド１５５−１７０およびクローン３６インサートのヌクレオチド２０６−２６８から得る。クローン３５中のＨＣＶ　ｃＤＮＡインサートの３゛末端は、クローン３６中のインサートのヌクレオチドｌ−１８６に重複し、クローン３５インサートの５°末端は、クローン３７ｂ中のインサートのヌクレオチド２０７−２５９に重複する。　（図２３．３４および２４を比較すること）。従って、クローン３５中のｃＤＮＡインサートは、クローン３６および３７ｂ由来のプライマーの配列間の領域の一部に延長し、これらのプライマーを含む増幅された配列のプローブとして有用である。

肝臓検体からのＲＮＡの分析は、プライマーおよびプローブの両方を使用して、上記の手法に従った。ＮＡＮＢＨを有する３匹のチンパンノーの肝臓からのＲＮＡは、予想されたサイズ（８１および３６および３７ｂのそれぞれに対する１６１および５８６のヌクレオチド）の増幅配列に対して陽性のハイブリダイゼーシヨンＰｉ　１を生み出したのに対して、対称群のチンパンノーは、陰性のハイブリダイゼーション結果を生み出した。実験を３回繰り返すと、同一の結果が得られた。

核酸およびプラズマからのＲＮＡの分析はまた、プライマーおよびクローン８工からのプローブを使用して、上記の手法に従った。プラズマは、ＮＡＮＢＨを有する２匹のチンパンジー、対称群のチンパンジーおよび対称群のチンパンジーからプールされたプラズマから得た。ＮＡＮＢＨプラズマの両方は、ＰＣＲ増幅されたアッセイにおいて陽性の結果を生み出したのに対して、対称群のプラズマの両方は、陰性の結果を生み出した。これらの結果は、繰り返して何度も得られた。

欠陥ウィルスは、ｌｉ’ＮＡウィルス中に発生することが知られている。ＰＣＲ技術を使用することによって、Ｈｃｖケノゲノ配列を増幅させるためにプライマーを設計することが可能である。

増幅された生産物を分析することによって、ウィルスゲノムの欠陥および野生型のウィルス種の両方を同定することが可能であると予想される。従って、既知のＨＣＶ配列に基ついて２つのプライマーを使用すると、ＰＣＲ生産物の予想サイズが正確に予想され得る。ゲル電気泳動法およびハイブリダイゼーション分析によって観察された大きな種はいずれも、潜在的に異型のゲノムを示し得た。あるいは、このように観察された小さな種のいずれもが、欠陥作用因を示し得た。これらの型の分析は、それが本当に野生型ウィルス配列であるがまたは欠陥ゲノムであるが、既知のＨＣＶ配列の正確な起ｆＩＸを確認するのに冑用であり得る。

これらの分析の技術および方法は、当該技術分野において既知であり、前述されている。この方法によって、当業者は、ウィルスゲノムの関連した（野生または欠陥）型を得ることが可能となる。

（区千余幻ＰＣＲで　幅されたときにクローン８１の由来のＨＣＶｃＤＮ八と雑　形成する、捕足粒　の配ダの検捕捉粒子のＲＮＡは下記のようにして得た。クローン８１由来のＨＣＶ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａと雑種成形する配列の分析は、雑種形成プローブか、クローン８１のｃＤＮＡ配列由来のキナーゼ処理を行ったオリコヌクレオチドであることを除いて、先に述べたのと同様のＰＣＲ増幅法を利用して実施した。試験結果は、増幅された配列が、ＨＣＶｃＤＮＡプローブと雑種形成したことを示している。

粒子は、クローン５−１−１にコードされているポリペプチドに対する免疫Ｍｍ抗体でコードされたポリスチレンビーズを用いて、Ｈ（ｙ＠ｇ染させたチンパンジーの血漿から捕捉された。免疫精製された抗体の製剤の製造方法は、本願出願人が権利を有するヨーロッパ特許願公開第３１８，２１６号に記載されているが、上記特許出願（士本願に援用するものとする。簡単に述べれば、クローン５− １−１内にクローン化されたＨＶポリペプチドは、スーパーオキシドジムスターセ（Ｓ　ＯＤ）によって融合ポリペプチドとして発現された。

これは、クローン５−１−１ｃＤＮＡ挿入断片を発現ベクターｐｓＯＤｃ　ｆ　１にサブクローン化することによて行った（Ｓｔｅｉ＋ｅｅｒ″ｉｐの１９８６年の文Ｖ＞。ｐｓＯＤｃ　ｆ　１から単離したＤＮＡをＢａｍ１とＥｃｏＲＩで処理し、これら制限酵素によって生成した線状ＤＮＡに下記のリンカ−を連結させた。

５’　ＧＡＴ　ＣＣＴ　ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＣＴＧ　ＡＴＡ　ＡＧＡＣＣＴ　ＴＡＡ　ＧＡＣＴＡＴ　ＴＴＴ　ＡＡ　３゜クローン化した後、上記挿入断片を含有するプラスミドを単離した。この挿入断片を含有するプラスミドをＥｃｏＲＩで切断した。クローン５〜１−１中のＨＣＶ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ挿入断片をＲｃ　ｏＲＩで切取り、上記のＥｃｏＲＩで線状にしたＤＮＡに連結させた。得られたＤＮＡ混合物を用いて、イーフリ（Ｅ、Ｃｏ１１）菌株Ｄ　１２１０　（Ｓａｄｌｅｒ等の１９８０年の文献）を形質転換させた。ＯＲＦを発現するのに正しい配向の５−１−１ｃＤＮＡを有する組換え体を、制限地図を作成し、ヌクレオチドの配列を決定することによって同定した。

１つのクローン由来の組換え体細菌を、ＩＦＴＧの存在下、増殖させることによって、５ＯＤ−ＮＡＮＢ５−！−１ポリペプチドを発現するよう誘導した。生成した融合ポリペプチドを、細胞抽出液を尿素で分画抽出し次いでアニオン交換カラムとカチオン交換カラムのクロマトグラフィを行うことによって、組換え体イー・コリから精製した。精製された５ＯＤ−ＮＡＮＢｓ−＋−＋ポリペプチドをニトロセルロース膜に結合すせた。

ＨＣＶ感染血漿の試料中の抗体を、前記のマトリックスに結合させたオリペプチドに吸収させた。洗浄して、非特異的に結合した物質と未結合の物質を除去した後、結合した抗体を結合したポリペプチドから放出させた。

ＮＡＮＢＨを　する　の　と　の１（ＣＶ　ＲＮＡを　するｃＰｃＲ法ＨＣＶの感染を検出する、ＰＣＲ検定法すなわちｃＰＣＲ検定法の改変法の信頼性と有用性を、感染個体由来の全肝臓ＲＮＡと血漿について検定することによって試験した。ｃＰＣＲ検定法では、試料中の推定ウィルスＲＮＡは、逆転写酵素によってｃＤＮＡに逆転写され、得られたｃＤＮＡのセグメントは、次ぎに、５ａｉｋｆ等の１９８６年の文献に記載されたＰＣＲ法の改変法を利用して増幅される。このｃＰｃＲ法のプライマーは、ＨＣＶ　ＲＮＡから誘導され、本願発明で提供されるＨＣＶｃＤＮＡのファミリーいよって同定することができる。ＨＣＶ−ＲＮＡに対応する増幅生成物は本願発明のファミリー由来で提供されるＨＣＶｃＤＮＡのプローブを利用して検定される。

これらの試験に用いられるｃＰＣＲ／ＨＣＶ検定法は、次のような方法を使って行った。すなわち、ＲＮＡを製造し、得られたＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、得られたｃ　ＤＮＡの特異的セグメントをＰＣＲで増幅し、次いでＰＣＲ産生物を分析する方法である。

ＲＮＡは、Ｍａｎｉａｔｉｓ等の１９８２年の文献に記載されている、全ＲＮＡの製造法のグアニジウムイソ／アネート法を利用して肝臓から抽出した。

血漿から全ＲＮＡを単離するために、血漿をＴＥＮＳ　［０゜１Ｍ　ＮａＣＬ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）。

１ｍＭ　ＥＤＴＡ］で５倍〜１０倍希釈し、ブロティナーゼ、Ｋ／ＳＤＳ溶液（０，５％のＳＤＳ、１ｍｇ／ｍｌのプロティナーゼ、２０Ｍｇ　／　ｍ　＋のポリＡキャリアー）中で３７℃にて６０〜９０分間インキュベートした。得られた試料をフェノール（ｐ　Ｈ６，５）で１回抽出し、生成した有機相を、０．１％５ＤＳｉ有ＴＥＮＳて１回再抽出し、両抽出の水性相をプールして、同容積のフェノール／′ＣＨＣ１３／′イソアミルアルコール［１：　１　（９９：　ｔ）］で２回抽出した。生成した水性相を同容積のＣＨＣｌ３／イソアミルアルコール（９９：１）で２回抽出し、０．２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ　Ｈ６゜５）と２．５倍容積の１００％エタノールを使用してエタノール沈澱を行い、２０°Ｃで一夜沈澱させた。

ＰＣＲ反応の鋳型として用いられるｃ　ＤＮＡは、対応するｃ　ＤＮＡを製造するための指定の試料を利用して製造した。

各ＲＮＡ試料（２Ｍｇの熱変性させた全チンパンジー肝臓ＲＮＡ、２μｍの血漿由来のＲＮＡまたは１０１０ｍｍＸ４の円筒形のヒト肝臓生検品から抽出したＲＮＡを１００％含宵している）を、１ＭＭの各プライマー、１ｍＭの各チオキンリボヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，３）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、７３ｍＭ　ＫＣＩ、４０単位のＲＮアーゼ阻害剤（ＲＮＡＳｉＮ）および５単位のＡＭＶ逆転写酵素を含有する２５μｌの反応物中でインキュベートした。

このインキ二へ−／ｇンは、３７°Ｃで６０分間行った。ｃＤＮＡの合成に続いて、得られた反応混合物を、５０μｌの脱イオン水（ＤＩＷ）で希釈し、１０分間沸騰させてから水上で冷却した。

ＨＣＶ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのセグメントの増幅は、２つの合成オリゴマーすなわチ、ＨＣＶｃＤＮＡクローン３６（アンチセンスクローン）ト同クローン３７ｂ（センスクローン）由来の配列を有する１６７−のプライマーを利用して行った。

クローン３６由来のプライマーの配列は、５°　ＧＣＡ　ＴＧＴ　ＣＡ丁ＧＡＴ　ＧＴＡ　Ｔ　３°であり、クローン３７ｂ由来のプライマーの配列は、５’　ＡＣＡ　ＡＴＡ　ＣＧＴ　ＧＴＧ　ＴＣＡ　Ｃ３’　てあった。

これらのプライマーは、各々１ｍＭの最終の濃度で使用した、プライマーが隣接しているＨＣＶ　ｃＤＮＡのセグメントを増幅するために、ｃＤＮＡｆｚ料を、０．１ＭｇのＲＮアーゼＡと、Ｐｅｒｋｉｎ　ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ　ＰＣＲキット（Ｎ８０１−００４３もしくはＮ８０１−００５５）のＰＣＲ反応物質とともに、このメーカーの説明書に従って、インキュベートした。ＰＣＲ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒ中で３０サイクルまたは６０サイクル行った。各サイクルは、９４℃で１分間の変性工程、３７℃で２分間のアニール工程および７２°Ｃて３分間の伸長工程で構成されている。しかし最終サイクル（３０もしくは６０サイクル）は、３分間ではなくて７分間に下。増幅後、試料を、同容積のフェノール：クロロホルム（１：ｌ）で抽出し、次に同容量のクロロホルムで抽出し、得られた試料を０．２Ｍの酢酸ナトリウムを含有するエタノールで沈澱させた。

ＣＰＣＲ生成物は次のようにして分析した。生成物を、ＭｕｒａｋａＶａ等の１９８８年の文献に記載されている方法に従って、１．８％のアルカリ性アガロースゲル上で電気泳動させ、ゲルを０．４ＭＮａＯＨ中で一夜ブロットさせることによって、ゼータ（登録商標）プローブ紙（ＢｉｏＲａｄ　Ｃａｒｐ社）に転移させた。得られたプロ。

トを２ＸＳＳＣ（ＩＸＳＳＣは０．１５Ｍ　ＮａＣ１と０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムを含有している）で中和し、０．３Ｍ　ＮａＣ１，１５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，８）、１５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１．０％ＳＤＳ、　０．５％脱脂牛乳（Ｃａｒｎａｔｊｏｎ　Ｃｏ、社）、および０．５ｍｇ／ｍｌの音波処理を行った変性サケ精子ＤＮＡ８含有する液中で予備雑種形成を行った。ＨＣＶｃＤＮＡ断片について分析すべきプロ、ｌ−を、ヨーロッパ特許願公間第３１８．２１６号に記載されている。クローン３５のＨＣＶ　ｅＤＮＡ挿入断片配列のニックトランスレーションによって作成した、３２Ｐで標識を受けたプローブと雑種形成させた。雑種形成を行った後、ブｃ、、トをＯ，ｌＸ５ＳＣ（ＩＸｓｓｃは０．１５ＭのＮａＣ１と０．ＯＩＭのクエン酸ナトリウムを含有している）中で６５°Ｃにて洗浄し、乾爆し、オートラジオグラフにかけた。予想生成物の大きさは長さが５８６ヌクレオチドであり、プローブと雑種形成し、この大きさの範囲でゲル中に移動する生成物は、ウィルスＲＮＡに対して陽性であった。

対照として、α−１抗トリプシンｍＲＮＡを増幅するよう設計されたｃＰｃＲプライマーを、各被分析試料中にＲＮＡが存在することを確認するために用いた。

α−１抗トリプ／ン遺伝子のコーディング領域は、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等の１９８４年の文献に記載されている。α−１抗トリプ／ン遺伝子のコーディング領域の３６５ヌクレオチドの断片を増幅するように設計された合成オリゴマーの１６フープライマーは、ヌクレオチド２２−３７　（センス）およびヌクレオチド３７２〜３８７（アンチセンス）から誘導シた。ｃＤＮＡ／’ＰＣＲプライマーの配列の間に存在してその配列を含有せず、ニックトランスレー／コンを行い、３２Ｐで標識をつけたプローブを用いて、ＰＣＲ産生物を検出した。

ＰＣＲ反応は高度に感受性なために、全試料について少なくとも３回試験した。

次のような注意、すなわち、１）ゴム製Ｏリング密閉具を備えた、ねじふた付きチューブを用いてエーロゾルをなくし、２）使い捨てピストン／キャピラリーを有するＲａｎ１ｎ　Ｍｉｃｒｏｍａｎ　（登録商標）容量ピペットでピペット採取し、および３〉非隣接ｃＤＮＡクローンから、ｃＤＮＡとＰＣＲプライマーのオリゴヌクレオチド配列を選択することによって、すべての偽陽性がなくなった。

ｃＰｃＲ法によりクモサンプルのＣ型肝炎ウィルス）ＩＣＶ　ＩＩＮＡの検出実験的に非Ａ非Ｂウィルス性肝炎因子に感染させたチンパンジー３頭の肝臓及び、慢性非Ａ非Ｂワイルス性肝炎と診断されたイタリア人患者の肝生検から分離した総ＲＮＡのｃＰｃＲ検定を実施した。

第２５図Ａは、肝総ＲＮＡの各標本から１μｇを用いたｃＰｃＲ検定の結果を表している。このＲＮＡは、非Ａ非Ｂウィルス性肝炎慢性期のチ／パノ／−１頭（９１０）　（レーンｌ）及び、感染急性期のチンパンノー２頭（１０２Ｂ及び５０１１）　（それぞれレーン２及び３）の肝サンプルから分離したものである。

３０サイクル用レーン１−３のサンプルについてＰＣＲを実施し、これらのレーンを含むプロットのオートラジオグラムを５時間暴露した。急性感染動物１０２８　（レーン４）及び非感染チンパンジー３頭（レーン５−７）の総ＲＮＡ　１８ｇから得られたｃＤＮＡを６０サイクル用に増幅し、これらのレーンを含むオートラジオグラムを７日間暴露した。３２ｐラヘルしたＭｓｐｌ−同化ｐＢＲ３２２ＤＮＡをオートラジオグラム全でのマーカーとして用いた。結果かられかるように、ＨＣＶ　ＲＮＡに相当するｃＤＮＡは、急性・慢性を問わず、非Ａ非Ｂウィルス性肝炎チンパンジーのサンプルにのみ認められたくレーンＬ　３．４）。これらのレーンにおけるｃＰｃＲ産物は５２７から６２２ヌクレオチドまでのマーカーフラグメントを移動したく表示せず）。

第２５図Ｂは、慢性非Ａ非Ｂウィルス性肝炎患者１５例の１０＋ｓ＋＊Ｘ４ｍｍの肝生検シリンダーから抽出したＲＮＡの１０％を使用して検定したｃＰＣＲの結果を表すもので（レーンｌ−１５）、１症例は細胞発生性肝疾患、芒者（レーン１６）、もうｌ症例は慢性Ｂ型肝炎患者のコントロールサンプル（レーン１７）である。ＰＣＨによる増幅は３０サイクル用とし、プロット用オートラジオグラムはレーン１の１５時間１ｘｎを除き、４日間暴露した。結果かられかるように、ヒトサンプルの９／１５　（６０％）はＨＣＶ　ＲＮＡ陽性であった（レーン１．２．４．６．７．１Ｏ−１３）。細胞発生性肝疾患と診断されたｌ症１ｆｌｌ　（レーン１６）及び慢性ＨＢＶ感染患者１症例（レーン１７）はｃＰｃＲ検定を繰り返しても陰性であった。

ヒト千　のＨＣＶ／ｃＰｃＲとＨＣ’／　Ｃ１００−３ポリペプチドを　いた　ｔのラジオイムノアッセイとの比較ＳＯＤ／ＨＣＶ　Ｃ１００−３ポリペプチド（Ｃ１００とも呼ぶ）ハ、ウィルスのアミノ酸３６３＠を含む組み換え型融合ポリペプチドである。

本ペプチドはＨＣＶに対する抗体の検出に宵用である（Ｋｕｏら（（１９８９）参照）。Ｃ１００の調製法はＢ、Ｐ、０３１８．２１６号公報に記述されている。

上記肝サンプルのＨＣＶ／ｃＰＣＲ検定を行った患者と同じ患者１７例から採取した血清について、Ｃ１００を使用したラジオイムノアッセイを実施した。肝生検と同じ日に血清を採取した。一般に所有され、参考文献によりここに組み込まれているＢ、Ｐ。

０３１８．２１６号公報の記述に本質的に従って検定した。簡潔に言うと、Ｍｉｃｒｏｔ　ｉ　ｔｅｒプレート　（１ｍｍｕｎｏｌ　２．　Ｒｅｖａｏｖｅａｖｅｌｌ　５ｔｒｉｐＳ）を０．１μｇの純粋なＣ１００でコーティングした。コーティングしたプレートを、血清サンプル（１：ｌＯＯ希釈液１００μｌ）又は適切なコントロールと共に３７℃で１時間インキュベートした。

インキュベート後、非結合物質を除去し、このプレートを洗浄してから１２５Ｉラヘルしたヒツノ抗ヒト免疫グロブリンとインキュベートしてヒト抗体−ｃｉｏｏｉ合体を検出した。結合していないラヘルした抗体を吸引で除去し、プレートを洗浄した。

ウェルごとの放射能を測定した。

イムノラノオア、セイの結果から、これらのサンプルの６７パーセントが抗Ｃ１００抗体陽性であった。細胞発生性肝疾患と診断された患者の血清は抗Ｃ１００抗体陽性であったが、本症例の肝サンプル中のウィルスＲＮＡレベルは検出不可能であった。

抗Ｃ１００抗体の存在とＨＣＶ　ＲＮＡとの相関水準は７０％であった。う／オイムノアッセイて抗体陰性であった症例の肝ＨＣＶ　ＲＮＡレベルは有意であった（データは示さず）。

循環性抗Ｃ１００抗体を有する書者の肝臓には往々にしてウィルスが存在していることをこの結果は示しており、抗Ｃ１００抗体の存在がＨＣＶ彼曝を正確に表すことか確証により明白である。

さらに、これらを組み合わせると、本研究の症例では、このタイプのＨＣＶが非Ａ非Ｂウィルス性肝炎の少なくとも７５％の原因であり、イタリアで優勢のＨＣＶｍ株か合衆国で流行するＨＣＶ菌株と！接な関係があると考えられる。

ｌの）ｔｃＶ／ｃＰＣＲ″′″′：チンパンジーに晋ける。、　１ｔＬ染ｒノウイルスＲＮＡの・肝障害の発症、ＨＣＶ　ＲＮＡの存在、抗ＨＣＶ抗体の存在との間の一般的な関係を、実験的に非Ａ非Ｂウィルス性肝炎を感染させたチンパンジー２頭の血清でモニターした（Ｎｏ、７７１及び９１０）　ｏ　ａｌａｎｉｎｅ　ａｍｉｎｏ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　（ＡＬＴ）レベルにより肝障害を測定し、また上述のＨＣＶ　ｃＰＣＲ検定でＨＣＶ　ＲＮＡの存在を決定し、さらに抗ＨＣＶ抗体はｃｉｏｏう７オイムノアノセイを用いて検出した。

チンパンジーの血漿１μｇから抽出したＲＮＡのＨＣＶ／ｃＰＣＲ分析を実施した。注射後２５．３２．７０．８８日にチンパンジー７７１から血清を採取し、３０サイクル用ｃＰＣＲを実施してオートラジオグラムを１８日間暴露した。注射後１１．２８．６７日にチンパンジー９１０から血清を採取し、６０サイクル用ｃＰｃＲを実施してオートラジオグラムを５日間Ｊｌ露した。

（以下余白）アッセイの結果は、チンパンジー７７１は、図２６Ａに、そしてチンパンジー９１０については図２６Ｂに示している。

図２６Ａと図２６Ｂとの比較から、急性肝炎間の初期のよく特徴づけられたＡＬＴ値は、感染した個体中のウィルスＲＮＡの存在に相関するようである。

データは、ＨＣＶのＲＮＡの存在をも示唆しており、そのことは抗ＨＣＶ抗体の存在に先立つウィルス血症の状態を示している。チンパンジー７７１　（図２６Ａ）は、２８日ロー輸血後のＮＡＮＢＨのはっきり特徴つけられた急性の症状を示す。これは、ＡＬＴレベルの初期のピークに特徴的である。

ＨＣＶのＲＮＡは、２５日目詰よび３２日ロー集められた血清中に検出されに。

しかしながら、この急性の時期に、抗ＨＣＶ抗体は、存在しない。反対に、７０日口のＨＣＶのＲＮＡは、実験で検出するレベルを下回っていた。そして抗ＨＣ ■抗体は上昇していた。８８日ロー、ＨＣＶのＲＮＡは検出されないままで、一方抗ＨＣＶ抗体は、７０日口の値より有為に上昇していた。

チンパンジー９１０の血清から得られた結果は、パターンとたいたい同様であったか、感染によって誘導されたＨＣＶ抗体の時間は、疾病の急性の時期では検出されず、少なくとも６７日ローでｆ中びた。１１日ローＲＩＡによって検出された抗ＨＣＶ抗体ｉ、ｔ、動物の接種に用いたプラズマ白来の抗体で個体９１０を受動免疫したことによった。抗ＨＣＶ抗体は、感染の後期の慢性間のチンパンジー９１０の血清に見いだされた（データは示さない）。

慢性のＮ　Ａ　Ｎ　Ｂ　Ｈにかかっている個体由来のプラズマ中の低いＡＬＴ値は、必ずしも弱いウィルスの生産と相関しているわけではない。接種後２年から３年および１軍手にわたって、チンパンジー９１０から取った１７の異なるプラズマ試料のプールのＡＬＴレベルおよびＨＣＶのＲＮＡをモニターした。試料のＡＬＴ値は４５ｍＵ／ｍｌを越えず、力価研究は、ＨＣＶの高いタイターを示した（３　Ｘ　１０６ＣＩ　Ｄ／ｍ　Ｉ）。ｃＰｃＲは、３０サイクル行い、そしてオートラジオグラムを１５時間でとった。ｃＰｃＲ分析で、ウィルスＲＮ　Ａの存在がはっきりと示された（データは示していない）。

７のＨＣＶ／ＣＰＣＲアンセイ：ヒトの急伸、の感染でのワイルスＲＮＡの発早期の急性ＮＡＮＢＨの間収集された人の外科患者からの血清が、それぞれＨＣＶ　／　ｃ　ＲＮ　ＡアラでイおよびＣｌ０Ｏ−ＲｒＡを利用して、ＨＣＶ　ＲＮＡおよび抗ＨＣＶ抗体を試験した。

ＨＣＶ　／　ｃ　Ｐ　ＣＲアッセイは、その患者からの１マイクロリツターの血漿を用いて行われ、そして、知られた血統の４人から行われた。ｃＰｃＲは１３回行われ、そして、／１イブリダーゼーシ望ンと洗浄の後、オートラジオグラムが８時間暴露された。

感染の急性期の間、外科患者から収集された血清は高い値のウィルスＲＶＡを含み、そして抗−ＨＣＶ抗体はＣｌ０Ｏ−ＲＩＡによって検出されなかった結果を示した（データは現在示されない）。（外科患者からの急性期の血漿は、ＮＡＮＢＨ感染試薬の高い力価を宵していることが知られた。［１０’・５ＣＩ　Ｄ／ｍ　１、フェインストーン（Ｆｅ１ｎｓｔｏｎｅ）　らにより決定された（１９８１）；　フェインストーン（Ｆｅ１ｎｓｔｏｎｅ）ら（１９８１）。しかしながら、この患者は感染後はぼ９力月、Ｃ１００／ＲＩＡにより抗ＨＣＶ抗体に上口変換されたことは注意すべきである。

大制御血漿の血統からの血清は、Ｈ（Ｖ　／　ｃ　Ｐ　ＣＲア、セイとＣｌ０Ｏ −ＲＩＡに対してともに否定的であった。

ＨＣＶ　／　ｃ　Ｐ　ＣＲアッセイの威）（（Ｖ　／　ｃ　Ｐ　ＣＲアッセイの感度は、既知の力価の血清の１０倍連続希釈の分析によって決定された。チンパンジーの血漿は〜３Ｘ１０５ＣＩＤの力価を持っていた。モしてＲＮＡはその血漿１マイクロリツターの１０倍希釈から抽出された。

ｃ　ＰＣＲは３０回なされた。そしてハイブリダイゼーシヨンと洗浄の後、オートラジオグラムが１５時間ｊ！ｌｉｉされた。３００．３０および３倍のＨＣＶのＣＩＤゲノム増幅から得られたｃＰｃＲ生成物は、図２９のコース１〜３に示す。

コース１と２は２時間暴露されたオートグラムに検知されたものである。

感染されたＨＣｖの力価の平均は、はぼ１００と１０，０００　ＣＩＤ／ｍｌ血清の間であるので、このデータはＨＣＶ／　ｃ　Ｐ　ＣＲアッセイは臨床的に宵月であると思われる。

々のＨＣＶ株のためのＨＣＶ　／　ｃ　Ｐ　ＣＲアッセイオリゴマー４４−ｍａｒのセ・７トとオリゴマー４５−ｍａｒのセットからなるプライマーはＨＣＶ株を増幅するために設計された。その株は図１８の中のｃＤＮＡ配列が導かれているＨＣＶから分離されたＨＣＶに類似または同一である。

これらのプライマーの設計の土台となる前提は、我々の発見であり、ＨＣＶはフライのような（Ｆｌａｖｉ−１ｉｋｅ）ウィルスである。

フラビウイルス科ファミリーのメンバーは、Ｈｃｖと比較されるとき、二つの主に保存されたアミノ酸配列セットを有する。それはＴＡＴＰＰＧとＱＲＲＧＲであり、これらのウィルスのＮＳ３の中にある。池の少量のセットのいくつかは、例えば、推定上のＮＳ５領域中のＧＤＯである。他のセｙトは既知のアミノ酸配列のＨＣＶとの比較によって決定される。

この情報はい（っかのワラビウィルス科のメンバーの配列から推論される。そのフラビウィルス科は、日本エンサイクロベデア　ウィルス（Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉ　ら　（１９８７））、Ｙｅｌｌｏｗ　Ｆｅｖｅｒ　Ｖｉｒｕｓ　（Ｒｉｃｅら（１９８５））、Ｄｅｎｇｕｅ　Ｔｙｐｅ　２　Ｖｉｒｕｓ　（Ｍａｃｋｏｗ（１９８７））、およびＷｅｓｔ　Ｎｉ１ｅ　Ｖｉｒｕｓ（Ｃａｓｔｌｅら（１９８６））らによって開示されている。

変換されたアミノ酸配列とコドン利用はすぐ次の表にある。

フライマー配列とＨＣＶの間に保　されたアミノ　Ａ、Ａ、　ア ■Ｇ余５）注：フライマー配列の３°末端におけるヌクレオチド縮退性の数を最低限にし、上記に示した保存されたアミノ酸をコードする可能なヌクレオチド配列またはその相補体のいずれかに、正確に適合する、それぞれのプライマーの３゛末端におけるヌクレオチド数を最高にするように、プライマー配列を選択した。

４４−ｍｅｒおよび４５−ｍｅｒのオリゴマーブライマーは、これらのアミノ酸をコードした配列がプライマー内に組み込まれるように明示された。さらに、それらは、それぞれのプライマーの３°末端における縮退を含有し、クローン４０ｂ　（図２８参照）に存在し、ＨＣＶの推定ＮＳ３をコードする領域から誘導されるＨＣＶゲノムの異なった２つの領域から誘導される。組になったオリゴヌクレオチドブライマーの配列式は、ＸがＡ、Ｔ、ＧまたはＣの時、５’　ＧＡＣＴＧＣＧＧＧ　ＧＧＣＧＡＧ　ＡＣＴ　ＧＧＴ　ＴＧＴ　ＧＣＴ　ＣＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＣＣＸ　ＣＣ３゜であり、ＹがＴまたはＣの時５’　ＴＣＴ　ＧＴＡ　ＧＡＴ　ＧＣＣＴＧＧ　ＣＴＴ　ＣＣＣＣＣＴ　ＧＣＣＡＧＴＣＣＴ　ＧＣＣＣＣＧ　ＡＣＴ　ＹＴＧ　３゜（以下余白）である。

ＨＣＶ／ｃＰｃＲアッセイが、チンパンジー９１０プラスマにおけるＨＣＶ　ＲＮＡを増幅するために、これらのプライマーを用いて実施された。アッセイ方法は、オリコマ−プライマーの４４−ｍｅｒおよび４５−ｍａｒの組が、クローン３６およびクローン３７ｂより誘導されたプライマーに代換される以外は、本質的に前述部分で説明した通りである。加えて、増幅されたＨＣＶ　ｃＤＮＡの検出がクローン４０ａから誘導されたプローブとのハイブリッド形成によって行われ、その配列は図３２に示されている。

該プローブは、前述のＰＣＲ法を用いて、クローン４０ａのセグメントを増幅することによって準備され、１８−ｍａｒのプライマーは以下の配列を含有していた。

５°ＧＡＧ　ＡＣＡ　ＴＣＴ　ＣＡＴ　ＣＴＴ　ＣＴＧ　３゜と５’　ＧＡＧ　ＣＧＴ　ＧＡＴ　ＴＧＴ　ＣＴＣＡＡＴ　３゜増幅の後、クローンの準備はニックトランスレー／コンにより３２ｐで標識された。

図３３は、クローン４０ａから誘導された配列でプローブされたサザーンブロノトの放射線写真を示している。３２ｐで′ｖＡ識されたＭｓｐｌ消化ｐＢＲ３２２ＤＮＡの断片がマーカーとして使われた（レーン１）。これらのプライマーを用いて増幅した結果のＰＣＲ産物の予想される大きさは、４９０ヌクレオチド（ｎｔ）である。

ＩＩ反応がレーン２および３に示されている。

ＨＣＶの５’ｆｉ域における　ンのフラヴイウイルスモデルに基づいて、クローンａｇ３０ａおよびに９−１に標本された領域に隣接する５゛領域のＨＣＶ　ｃＤＮＡは、推定容器および・またはマトリックスプロティンのセグメントをコードする（Ｅ／Ｍ）。ｒｃＪ　ライブラリーが構成されるチンパンジーから得た血清が、この標的領域に変形が存在するか否かを判断するためにＨＣＶ／ｃＰＣＲによって分析された。

ＨＣＶ／ｃＰｃＲアッセイが、クローン５−３２の単離に対して、使用されるプライマーとプローブ以外は、前述と本質的には同様に行われる。図３７は、プライマーおよびプローブ（およびその誘導されたクローン）の関係とＨＣＶ　ｃＤＮＡの標的領域の関係とを示している。ＰＣＲプライマーの１組である、ａｇ３０ａ１６Ａおよびに９１Ｅｎｖ１６Ｂは、クローンａｇ３０ａおよびに９−１から誘導されたが、これらはそれぞれ標的配列の上流および下流にある。ａｇ３０ａ１６Ａおよびに９１Ｅｎｖ１６ＢによりプライムされたｃＰｃＲ産物の期待される大きさは、ＨＣＶ　ｃＤＮＡの確認された配列に基づいて１．１４５　ｋｂである。ａｇ３０ａ１６Ａおよびに９１Ｅｎｖ１６Ｂを用いて増幅された領域におよび、互いに重重しているＰＣＲプライマーの池の２組もまた、血清中のＨＣＶ　ＲＮＡのＰＣＲ増幅のために用いられる。このように、この場合には、ブライ？　−ａｇ３０ａ　１６ＡおよびＣＡ１５６ｅ１６Ｂを１つの組として、ブライ？−ＣＡ１５６ｅ１６Ａおよびに９１Ｅｎｖ１６Ｂをもう１つの組として用いることによって、ＰＣＲ反応か起こされる。これらの組に対する予測されるＰＣＲ産物の大きさは、それぞれ６１５ヌクレオチド（ＮＴ）および６８３ヌクレオチドであった。この直後の表は、プライマーおよびそれが誘導されたクローンおよびプライマー配列を記載している。

（ｐ人壬路家白）すべてのＨＣＶ／ｃＰｃＲ産物のためのプローブが、クローン２１６　（ＣＡ２１６ａ１６Ａおよび２１６ａ１６Ｂをプライマーとして用いて）およびクローン８４　（ＣＡ３４ａ１６ＢおよびＣＡ３４ａ１６Ｂをプライマーとして用いて）の領域をＰＣＲ増幅して準備された、ＨＣＶ　ｃＤＮＡの３２ｐで標識された部分から成り、３２ｐはニックトランスレーン層ンによりＰＣＲ産物に導入された。これらのプローブは、ＨＣＶ／ｃＰｃＲ反応に用いられたプライマーには重複しなかった。

図３８は、ＨＣＶ／ｃＰｃＲ産物か３２ｐで標識されたプローブとハイブリッド形成されたサザーンブロノトの放射線写真を示している。ブライ７−　ａｇ３０ａ１６．Ａおよびに９１Ｅｎｖ１６Ｂ　（レーン１）から伸びたＨＣＶ／ｃＰＣＲ産物は、約１．　ｌＫｂであった。１５時間放射の間に、池のＰＣＲ産物は観察されなかった。プライマーの組ａｇ３０ａ１５Ａ／ＣＡ１５６ｅ１６Ｂ　（レーン２）およびＣＡ１５６ｅ１６Ａ／に９１Ｅｎｖ１６Ｂ　（レーン３）から伸びたＨＣＶ産物は、それぞれ約６２５ＮＴおよび約７０ＯＮＴであった。ＰＣＲ産物の大きさは、ＭｓｐｌてのｐＢＲ３２２の消化およびＨａｅｌｌｌで消化されたＰｈ１Ｘ１７４の消化の結果としての相対的な断片移動に比較して決定される（レーン５）。

上記の研究は、約２ＯＮＴから５ＯＮＴの小ささの挿入または欠失、および標的ＤＮＡの大きさを変化させるＤＮＡの再配列を検出する。

（以下余白）図３８の結果により、チノパンツー血清内のＨＣＶのＥ／Ｍ領域から誘導されたｃＤＮＡの唯一の主要種が存在することが確信できる。

ＨＣＶがフラヴイ状のウィルスであるという我々の発見により、ＰＣＲ技術を用いての、特徴づけされていないＨＣＶ　ｅＤＮＡ配列のクローニングのための戦略、およびフラヴイウイルスにおいて保存されたアミノ酸配列をコードする領域から誘導されたプライマーが可能になる。一般に、プライマーの１つが、定義されたＨＣＶゲノム配列から誘導され、そして配列されていないＨＣＶポリヌクレオチドの領域に隣接する他のプライマーが、フラグイウイルスゲノムの保存された領域から誘導される。フラヴイウイルスゲ／ムは、ＮＳＩおよびフラグイウイルスゲノムの５゛末端にコードされたＥポリペプチドに保存された配列を包含することは公知である。このように、ＨＣＶゲ／ムの推定比較領域から誘導されたｃＤＮＡ配列を単離するためには、これらのフラウ゛イウイルスポリペプチドに保存された配列から誘導された上流プライマーが明示される。下流プライマーは、ＨＣＶｃＤＮＡの公知の上流末端から誘導される。

コードの変性のため、フラウ′イウイルスプローブおよび対応するＨＣＶゲノム配列の間に適合間違いが起こり得る。ゆえに、Ｌｅｅ（１９８８）によって説明されているものに類似した戦略が用いられる。Ｌｅｅの手順は、アミノ酸配列の逆トランスレージマン産物に相補的な混合オリゴヌクレオチドブライマーを用いる。

混合プライマー内の配列は、保存されたアミノ酸配列のそれぞれのコドン変性を考慮に入れている。

３組のプライマー混合物が、デング熱−２，４（Ｄ−２，４）、日本脳炎ウィルス（ＪＥＶ）、黄熱病（ＹＦ）およびウェスドナイルウィルス（ＷＮ）を含むいくつかのフライマー混合物に見られるアミノ酸同族に基づいて発生させられる。

最上流に保存された配列（５−１）から誘導されるフライマー混合物は、アミノ酸配列ｇｌｙ−ｔｒｐ−ｇｌｙに基づいており、これは、Ｄ−２、ＪＥＶ、　ＹＦおよびＷＮのＥプロティンに見られる保存された配列ａｓｐ−ａｒｇ−ｇｌｙ −ｔｒｐ−ｇｌｙ−ａｓｐＮの一部である。その次のプライマー混合物（５−２）は、Ｅプロティン内の下流に保存された配列ｐｈｅ−ａｓｐ−ｇｌｙ−ａｓｐ −ｓｅｒ−ｔｙｒ−口ｅｕ−ｐｈｅ−ｇｌｙ−ａｓｐ−ｓｅｔ−ｔｙｒ−ｉ　１ｅｕに基づいており、ｐｈｅ−ｇｌｙ−ａｓｐから誘導される。保存された配列はＤ−２、ＪＥＶ、　ＹＦおよびＷＮに存在する。三番目のプライマー混合物（５゛−３）は、アミノ酸配列ａｒｇ−ｓｅｔ−ｃｙｓに基づいており、これは、Ｄ−２、Ｄ−４、ＪＥＶ、ＹＦおよヒＷＮノＮＳｌプロティンに保存された配列ａｙｓ−ａｙｓ−ａｒｇ−ｓｅｒ−ａｙｓの一部である。５°−３の混合物を形成する個別のプライマーは図５３に示されている。保存された領域から誘導された変性配列に加えて、それぞれの混合物内のそれぞれのプライマーは、酵素、Ｈｉｎｄｌｌｌ、　Ｍｂｏｌ、およびＥｃｏＲＩを制限するためにコードする配列位置を含有する、５°末端において不変領域をも包含する。

（上Ｘ）余９）、下流プライマー、５ｓｃ５ｈ２０Ａ、　は、クローン１４ｉ及びｌｌｂの配列とオーパーラ、プする配列を有するＨＣＶ　ｃＤＮＡを含有し、クローン５ｈ中のヌクレオチド配列から誘導される。５ｓｃ５ｈ２ＯＡの配列は、５’　ＧＴＡ　ＡＴＡ　ＴＧＧ　ＴＧＡ　ＣＡＧ　ＡＧＴ　ＣＡ　３’　である。

これに代わるプライマー、５ｓｃ５ｈ３４Ａ、も使用され得る。このプライマーは、クローン５ｈ中の配列から誘導される。そしてさらに制限定酵素部位をつくるヌクレオチドを５′末端に持ち、そのためクローン化を促している。この配列５ｓｃ５ｈ３４Ａは、５’　ＧＡＴ　ＣＴＣＴＡＧ　ＡＧＡ　ＡＡＴ　ＣＡＡ　ＴＡＴ　ＧＧＴ　ＧＡＣＡＧＡ　ＧＴＣＡ　３’である。

はじめに５ａｉｋｉらによって開示された（１９８６）　Ｐ　ＣＲ反応は、ｃＤＮＡのためのテンプレートがＨＣｖに感染したチンパンジーの肝臓から分離されたＲＮＡである点、またはＨＣＶに感染したチンパンジーの血清から分離されたウィルス粒子から成る点を除いて、Ｌｅｅらに開示された（１９８８）ように、本質的に行われた。さらに、ＨＶＣ配列にアニーリングするプライマーの一部は、ヌクレオチドが９しかなく、そしてミスマ・ツチし得るので、アニーリング条件は増幅の一回目において緩和されている（０．６ＭＮａＣ１，２５℃）。さらに、もし、５ｓｃ５ｈ３４Ａが使用されるならば、ＨＣ■ゲノムから誘導されていない付加的な配列は、プライマー−テンプレートハイブリノドを不安定にする傾向がある。−回目の増幅の後、アニーリング条件はより厳しくなり得る（０．０６６Ｍ　ＮａＣ１，３２℃−３７℃）。なぜなら増幅された配列は、このときプライマーと相補的にまたは重複する領域を持っているからである。加えて、増幅のはじめの１０サイクルは、ＫｌｅｎＯｖ酵素■と共に、その酵素に適したＰＣＲ条件の下で行われる。これらのサイクルか終了すると、サンプルは抽出され、Ｋｉｔ方向に沿って、Ｃｅｔｕｓ／Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒにより供給されるように、Ｔａｑポリメラーゼと共に使用される。

増幅の後、増幅されたＨＶＣｃＤＮＡ配列は、クローン５ｈから誘導されるプローブを使用して交雑されることにより、検知される。このプローブは、フライマーを誘導するために使用される配列の上方の配列から誘導され、プライマーを誘導したクローン５ｈの配列とオーバーラツプしない。このプローブの配列は、５°ＣＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＡ　ＣＧＣＧＣＴ　ＧＧＡ　ＣＡＣＧＧＡ　ＧＧＴ　ＧＧＣＣＧＣＧＴＣＧＴＧ　ＴＧＧ　ＣＧＧ　ＴＧＴ　ＴＧＴ　ＴＣＴ　Ｃ０丁　ＣＧＧ　ＧＴＴ　ＧＡＴ　ＧＧＣＧＣ３’である。

１１上旦且且ここに記載される方法、オリゴマー、ＨＣＶ　ｃＤＮＡから誘導されたプローブとプライマーの両方、そしてそれらを含むｋｉｔｓは、正確で、比較的簡単で、経済的に、生物学的なサンプル中、　（さらに詳細には、輸血に使用され得る血液、及びＨＣＶ感染を持つ疑いのある人の中に）　ＨＣＶが存在することを決定するために有用である。さらにまた、これらの方法とオリゴマーは、再結合ＨＣＶポリペプチドの使用に基づく免疫学的分析法よりも早い段階でのＨＣＶｆｔ、染を検知するために有用である。また、増幅されたポリヌクレオチド交雑分析法は、抗ＨＣＶ抗体を持たない場合のサンプルにおいてＨＣＶ　ＲＮＡを検知する。このようにして、ここで記述されたプローブとプライマーは、ＨＣＶ、　及び血液を含むＨＣＶ感染された生物的検体による感染を一層完全に同定するためにＨＣＶポリペプチドに基づく免疫学を利用して、増幅交雑分析法に使用され得る。

ここで提供される情報により、ＦＩＣＶゲノムの保持領域から誘導されたプライマーそして、／またはプローブが明示できる。

これらのプライマーとプローブを提供することで、種々のＨＣＶ株を検知し且つ血液と血液製剤をスクリーニングする際に使用される一般的な方法が利用可能になる。

もし、この方法で使用されるプライマーが、ＨＣＶゲ／ンの保持領域から誘導されると、この方法は種々のＨＣＶ株の検知モして／または同定に有用である。これは、換言すると、ＨＣＶの検知と分析のさらなる免疫学的な試薬の開発、及びＩＩＣＶの検知モして／または処理のためのさらなるポリヌクレオチド試薬の開発を可能にする。

加えて、Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ及びＨＣＶの保持されたアミノ酸配列から示されたプライマー及びプローブの組は、これらの感染性薬剤の万能な検知法を与える。

以下に挙げられた素材は、Ａ＋ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）、　１２３０１　Ｐａｒｋｌａｖｎ　Ｄｒ、、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２、のブダペスト条約に関して寄託されており、以下の符号数字が付与されている。

さらに、以下の寄託が１９８９年５月１１日になされた。

」包−ユ堕二　ＡＴＣＣＮ口。

Ｃｆ２１０　（Ｃｆ１１５−１−１ン　ＥＦ　６７９６７Ｄ１２１０　（Ｃｆｌ／８１１　ＥＦ　６７９６ＢＤＬ２１０　（Ｃｆｌ／２７９ａｌ　Ｅｒ　６７９６９Ｄ１２１０　（Ｃｆｌ／３５ｆｌ　ＡＢ　６７９７０Ｄ１２１０　（Ｃｆｌ／２７９ａ）　ＥＦ　６７９７１Ｄ１２１０　（Ｃｆｌ／Ｃ３６１ＣＤ　６７９７２Ｄ１２ユＯ（Ｃｆｌ／１３ｆｌ　ＡＥ　６７９７３Ｄ１２１０　（Ｃｆｌ／Ｃ３３ｂｌ　Ｅｒ　６７９７４ｏＬ２１０　（Ｃｆｌ／ＣＡ２９０ａｌ　ＡＢ　６７９７５ＨＢ１０１　（ＡＢ２４／Ｃ１００＃３Ｒ）　６７９７６以下の株Ｄ１２１０は、１９８９年５月３日に寄託された。

以下の株は、１９８９年５月１２日に寄託された。

Ｌａｍｂｄａ　ｇｔｌｏ（ｂｅｔａ−５ａｌ　４０６０２０１２１０　（Ｃ４０ｂ）　６７９８０Ｄ１２１０　［Ｍ１６）　６７９８１ＯＱｌ　い　コ　！：ｌａＪ ”　”　＋　、Ｈ＋　Ｐ−１り　（ト）　ロ　？　ＯＨＰ＠　へ　ｎＴＴ　ＴＧＣＧＧＣＧＡＧＴＴＣＧＴＣＧＣＡＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＡＧＧＣＡＴＡＧＧＡＣＣＣＧＴＧＴＣｊ４２．３７．ＬＬＡ２ＣＴＡＧＧＣＣＡＣＧＧＣＡＴＴＧＡＴＧＣＣＣＡＡＴＧＣＧＡＣＣＴＴＡＧＧＣＡＴＡＧＧＡＣＣＣＧＴＧＴＣＧＴＣＧＧＧＡＴＧＡＣＧＧＡＣＡＣＧＴＣＡＡＧＡＣＣＧＣＧＧＴＴＡＧＧＣＡＴＡＧＧＡＣＣＣＧＴＧＴＣ：４２．４０．ＬＬＡ２ＣＦＩＧ、　２５Ａ１２３４５６フ・・−− ＦＩＧ、　２５Ｂ９耘８執ＦＩＧ、　２６Ｂ’ ＦＩＧ、　２９ＮＯＴ　ＦＵＲＮＩＳＨＥＤ　ｔＪＰＯＮ　Ｆ工ＩＪＮＧＮＯＴ　ＦＵＲＮＩＳＨＥＤ　ＵＰＯＮ　Ｆ’工り工ＮＧ浄ｌＦ（内容に変更なし）２４　１Ｔ、　ヱ呈　鼾λ １　ご敷うの見４が５の櫃の血、ｒンっｌ−１７・−イし八・特表平５−５００１５５　（５９）Ａ　ＢＣ浄書（内容に変更なし）ＦＩＧ、　５Ｏ−１ＮＯＴ　ＦＬＩＲＮ工５ＨＥＤ　ＵＰＯＮ　Ｆ工り工ＮＧ浄Ｃ（内容に変更なし）６）ＲＮＬＧＫＶＩＤＴＬＴＣＧＦＡＤＬＭＧＹＩＰＬＶＧＡＰＬＧ　ＧＡＡＲＡＬＡＨＧＶＲＶＬＥＤＧＶＮＹＡＴＧＮＬｌ）　Ｎ２）Ａ　ＤＶ　Ｖ　Ｋ　Ｔ３）ｓ　ＰＶＡ　Ｎ６）ＡＬ’Ａ’ＧＤＬＣＧＳＶＦＬｖＧＯＬＦｒＦＳＰＲＲ）ｎ＃ＴｒＯＧＣＮＣ８Ｉ賀カニ　”Ｓ”　ＡＡ１１７−３０８　（９３ｚ）浄書（内容に変更なし）６２６．工、１゜ユ、３ＪＬ−（ｘ＞６ｏ　−７・＋ｉａン賞央Ａ　ｎｃ−１４１；Ａ１鳶りＬ’！ｙ：、Ｎｑ１４　−１／３了ミノｐ書しP．４３）ＦＲ！５ＫＩＶ　ＩＲＯＦ？ｈｆｆ　：　ＮＳ　Ｌ　ＡＡ　３３０−６６０＃Ａｉ−バ＆　％ａｍ　自＋ｑ　（ＡＡ３３０−４３８）　ｘ＃１Ｑ−）ｔ　（ＡＡ３８３−４０５）ＦＩＧ、　５２浄：（内容に変更なし）

Claims

【特許請求の範囲】１．分析物ポリヌクレオチド鎖中のＨＣＶ配列にハイプリダイズ可能なオリゴマーであって、図１８に示すＨＣＶｃＤＮＡの、少なくとも４個の連続するヌクレオチドに相補する、ＨＣＶを標的付ける配列を包含する、オリゴマー。２．前記標的付ける配列が、図１８に示す、以下のＨＣＶｃＤＮＡヌクレオチド（ｎｎｘ−ｎｎｙはヌクレオチド番号ｘからヌクレオチド番号ｙを示す）から選択されるヌクレオチドに相補する、ヌクレオチドを有する、請求項１に記載のオリゴマー。【配列があります】３．前記標的付ける配列が、ＨＣＶ　ＲＮＡに保持されるＨＣＶヌクレオチド配列中に存在する、少なくとも８個の配列に相補する配列を有する、請求項１に記載のオリゴマー。４．前記保持される配列が、図１８における、５′末端から約２００までのヌクレオチド番号の配列中に位置する、請求項３に記載のオリゴマー。５．前記保持される配列が、図１８におけるヌクレオチド番号約４０００から約５０００に位置する、請求項３に記載のオリゴマー。６．前記保持される配列が、図１８におけるヌクレオチド番号約８０００から約９０４０に位置する、請求項３に記載のオリゴマー。７．前記保持される配列が、図１８におけるヌクレオチド番号約−３１８から約１７４に位置する、請求項３に記載のオリゴマー。８．前記保持される配列が、図１８におけるヌクレオチド番号約４０５６から約４４４８に位置する、請求項３に記載のオリゴマー。９．前記保持される配列が、図１８におけるヌクレオチド番号約４３７８から約４９０２に位置する、請求項３に記載のオリゴマー。１０．前記保持される配列が、図１８におけるヌクレオチド番号約４０４２から約４０５９に位置する、請求項３に記載のオリゴマー。１１．前記保持される配列が、図１８におけるヌクレオチド番号約４４５６から約４４７０に位置する、請求項３に記載のオリゴマー。１２．前記保持される配列が、図１８におけるヌクレオチド番号約８２０９から約８２１７に位置する、請求項３に記載のオリゴマー。１３．捕捉プローブである、請求項３に記載のオリゴマー。１４．標識プローブである、請求項３に記載のオリゴマー。１５．プライマーである、請求項３に記載のオリゴマー。１６．ＨＣＶポリヌクレオチドを含む疑いのある分析物ストランド中のＨＣＶ配列を検出する方法であり、該ＨＣＶポリヌクレオチドは選択される標的される部分を包含し、前記工程は；（ａ）図１８に示す、少なくとも４個の連続するヌクレオチドに相補する、ＨＣＶを標的付ける配列を有する、ＨＣＶｃＤＮＡのヌクレオチド分析物ポリヌクレオチド鎖中のＨＣＶ配列にハイプリダイズ可能なオリゴマーを提供する工程；（ｂ）分析物ストランドを、標的付ける配列と標的とされる配列との間に特異的ハイブリッド２重鎖を形成させる（ａ）のオリゴマーとインキユベートする工程；および（ｄ）もし存在するならば、標的付ける部分と該オリゴマーとの間に形成されたハイブリッドを検出する、工程；を包含する、工程。１７．さらに以下の工程を包含する、請求項１６に記載の方法：（ａ）標的領域に隣接する、ポリメラーゼ連鎖反応のプライマーである一組のオリゴマーを提供する工程；および（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応により、標的領域を増幅する工程。１８．分析物中のＨＣＶ標的配列を検出するためのキットであって、適当な容器に包装された請求項１に記載のオリゴマーを含む、キット。１９．ＨＣＶを含まない血液を調製するための方法であって、（ａ）ＨＣＶ標的配列を含有すると予想される血液試料から、分析する核酸を提供する工程；（ｂ）分析するポリヌクレオチド鎖中のＨＣＶ配列がもしも存在するならば、それにハイプリダイズ可能なオリゴマーを提供する工程であって、該オリゴマーが、ＨＣＶＲＮＡの保持されたＨＣＶヌクレオチド配列中に存在する少なくとも８個のヌクレオチド配列に相補的な、ＨＣＶ標的付け配列を含有する、工程；（ｃ）標的付け配列と、もしも存在するなら標的配列との間にポリヌクレオチド二重鎖を形成可能にする条件下で、（ａ）に（ｂ）を反応させる工程；（ｄ）もしも存在するなら、（ｃ）中に形成された二重鎖を検出する工程；および（ｅ）（ｄ）で二重鎖が検出されなかった血液を蓄える工程、を包含する、方法。