HU228873B1

HU228873B1 - HCV antigén/ellenanyag kombinációs esszé

Info

Publication number: HU228873B1
Application number: HU0500444A
Authority: HU
Inventors: David Y Chien; Phillip Arcangel; Laura Tandeske; Carlos George-Nasciemento; Doris Coit; Angelica Medina-Selby
Original assignee: Novartis Vaccines & Diagnostic
Priority date: 2000-06-15
Filing date: 2001-06-14
Publication date: 2013-06-28
Also published as: AU2001272945A1; JP2011125350A; CN1214244C; BRPI0111731C1; JP2004506878A; BRPI0111731B8; EP1350105A2; DE60125240T2; BR0111731A; CN1660913A; BRPI0111731B1; US6797809B2; US20020146685A1; WO2001096875A2; PL213363B1; US20040063092A1; US7241879B2; SK17772002A3; EP1354204A2; CZ304185B6

Description

A jelen találmány tárgya általában, a virális diagnosztika. Pontosabban, a jelen találmány tárgyát antigén/ellenanyag kombinációs esszé képezi, a hepatitisz C vírusfertőzés pontos diagnosztizálására.

A hepatitisz C vírus (HCV) a fő oka parenterális nem-A, nem-B hepatitisznek (NANBH), ami leginkább vérátömlesztéssel és szexuális kontaktussal terjed. A véradóknak körülbelül 0,42,0%-ában jelen van a vírus. Krónikus hepatitisz a fertőzéseknek körülbelül 50%-ában fejlődik ki, és a fertőzött egyedeknek körülbelül 20%-ában fejlődik ki májcirrőzis, ami néha hepatocelluláris karcinómához vezet. Ennek megfelelően, a betegség tanulmányozásának és gyógyításának gyógyászati jelentősége van.

A HCV-t először Houghton és munkatársai azonosították és jellemezték, mint a NÁ.N.8H kórokozóját. A HCV genomiális szekvenciája ismert, ugyanúgy, mint a szekvencia előállításának módszerei [WO 89/04668; WO 90/11089 és WO 90/14463 számú nemzetközi szabadalmi leírás). A HCV egy 9,5 kilobázis méretű, pozitív-értelmes, egyszálú RNS genommal rei és a Flaviviridae víruscsalád tagja. Filogenetikai elei alapján a HCV-nek legalább hat, de egymással rokonságban álló genotípusát azonosították [Simmonds és mtsai: J. General Virology 74, 2391-2399 (1993)), A vírus egyetlen, több mint 3000 aminosav csoportéi álló poliproteint kódol [Choo és mtsai; Science 244. 359-362 (1989); Choo és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 245.1-2455 (1991); Han ·>

« * és mtsai; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 33, 1711-1715 (1991)). A poliprotein a transzlációval egedében és a transzláció után processzálődik, mind strukturális, mint nem-strukturális (NSj fehérjékké.

Pontosabban, amint az az 1. ábrán látható, a HCV genom, számos fehérjét kódol. A HCV poliprotein hasítási termékeinek sorrendje és nomenklatúrája a következő; NHs-C-Bl-B2~p~NS2NS3~NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-C00H. A poliprotein kiindulási hasítanál a gazdasejt proteázai katalizálják, amik három, strukturális fehérjét, nevezetesen az N-terminális nukleokapszid fehérjét (ennek neve „mag”), és két hurok glikoproteint, azaz az »El*~et (ez E néven is ismert) és az „E2M (ez E2/.NS1 néven is ismert), valamint a vírális enzimeket tartalmazó, nem-strukturális (NS) fehérjéket szabadítanak fel Az NS régiók elnevezése NS2, NS3, NS4 és NS5. Az NS2 egy integrállá membránfehéije, proteotitikus aktivitással. Az NS2, önmagában, vagy az NSS-mal kombinálva elhajtja az NS2-NS3 közötti kötést, ez viszont az N33 N-termináhsát generálja, és egy nagy pobproteint szabadit fel, ami mind szerin proteáz, mind RNS heltkáz aktivitással rendelkezik. Az NS3 proteáz szolgálja a megmaradt poliprotein processzálását. A poliprotein érésének befejezéséi az NS3-NS4a kapcsolódás autokataMtikus hasítása inieiálja, amit az NS3 aaerin. proteáz katalizál. A HCV poliprotein ezután kővetkező, NS3-a.s hasításáról úgy tűnik, hogy magában, foglalja a poliprotein hasítási helyek felismerését egy másik polipeptid NS3 molekulája által. Ezekben a. reakciókban az NS3 felszabadít egy NS3 kofaktort (NS4a), két fehérjét (NS4b és NSSa), valamint egy RNS-dependens RNS polimerázt (NB3b).

Számos általános és specifikus, HCV poliproteinekből szármázó pokpeptidet írtak le, amik jól használhatok a HCV temunológial és diagnosztikai reagenseiként (Heughton és mtsai: 313,216 és 383,232 számú európai szabadalmi leírás; Choo és mtsai: Science 244, 359-392 (1939); Kuo és mtsai: Science 244, 362-364 (1989); Houghton és mtsai: Hepatology 14, 331-388 (1991); Chien és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 39, IÖO11-1ÖÖ15 (1992); Chien és mtsai: 3. Gastroent, Hepatot 8, 333-39 (1993); Chien és mtsai: 94/01773 száffiű nemzetközi szabadalmi leírás). Ezek a publikációk bőséges hátteret biztosítanak általánosan a HCV-hez, valamint a HCV poüpeptid temxmológte reagensek gyártásához és alkalmazásához.

A HCV-hordozók és a HCV-vel fertőzött vér vagy vértermékek kiszűrésének és azonosításának érzékeny, specifikus módszerei fontos előrelépést jelentenének a gyógyászatban, A transzfúzió utáni hepatitisz (FTH) a transzfundált betegeknek körülbelül 10%-ában lép fel, és ezeknek az eseteknek körülbelül 90%~ áért a HCV felelős, A betegek gondozása, valamint a HCV vérrel vagy vérkészítményekkel, vagy szoros emberi érintkezés révén való átvitelének megakadályozása megbízható diagnomáik&i és prognosztikai eszközöket igények Ennek megfelelően számos esszét fejlesztettek ki a HCV fertőzés szerodiagnosztizálására (Choo és mtsai: Science 244, 359-392 (1989); Kuo és mtsai: Science 244, 362-364 (1939); Choo és mtsai: Br, Med, Bull. 46, 423-441 (1990); Ebeling és mtsai: Láncét 635, 932-983 (1990); van dér Foel és mtsai: Láncét 337, 317-319 (1991); Chien, D.Y.: WO 94/01773 számú nemzetközi szabadalmi leírás; Valenzuela és' mtsai: WO 97/44469 számú nemzetközi szabadalmi leírás;

£ φφφ * > *φφφ *φ * «φ * »

Φ Φ ΧΦϊ

Kawasakima és mtsai; 5,871,904 zzámű. Amerikai Egyesült .állsmok-'beli szabadalmi leírás].

Néhány szérum-alapú esszénél azzal a szignifikáns problémával lehet találkozni, hogy szignifikáns rés van a fertőzés és a vírus kimutatása között, ami gyakran meghaladja a 80 napot. Bz a vizsgálati rés nagy kockázatot jelenthet a vértranszfüziót kapottak számára. Ennek a problémának a leküzdésére kifejlesztettek nukleinsav-alapú teszteket (NAT|, amik közvetlenül a viráks RNSt mutatják ki, és HCV mag antigén teszteket, amik az ellenanyag válasz helyett közvetlenül a vitális antigént vizsgálják [Kashiwakuma és mtsai: 5,871,904 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; Beid és mtsai; Transhxsicn 40, 575-579 (20000,

Azonban továbbra is megmaradt az igény egy érzékeny, pontos diagnosztikai és prognosztikai eszközre, azzal a céllal, hogy a betegek megfelelő kezelését biztosítsuk, valamint, hogy megakadályozzuk a HCV vérrel és vértermékekkel, valamint szoros emberi érintkezés révén való transzmisszióját

A jelen találmány részben azon a felfedezésen alapul, hogy a HCV szerokonverziós ellenanyagok tipikusan anti-mag és anti~ NS3 (helikáz) ellenanyagok, .Ennek .megfelelően a jelen találmány tárgya egy HCV mag antigén és NS3 ellenanyag kombinációs esszé, ami képes kimutatni a mintában levő HCV antigéneket és HCV ellenanyagokat, egyetlen szilárd mátrixon.

Tehát az egyik megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgya egy immunesazé szilárd hordozó, ami legalább egy HCV anti-mag ellenanyagot, és legalább egy, ehhez kötött izolált HCV NS3/4a epitopnt tartalmaz. Az ellenanyag és NS3/4a epitop lehet bármelyik itt ismertetett molekula. Emellett a szilárd hordozó * * φ* φ φ φ »

Φ « Ψ X (ί

X φ φ φ φ X « Φ Φ φ φ φ φ φ φ

Φ Φ Φ X Φ Φ φ φ φ φ φ * .* φ*·¹ φ φ tartalmazhatja a több, Itt ismertetett epitop fúziós antigén közöl bármelyiket, azaz például a többszörös epitop fúziós antigént, ami a 7A-7F, ábrákon bemutatott aminosav szekvenciát tartalmazza.

Néhány megvalósítási mód szerint a szilárd hordozó tartalmaz legalább két HCV antigén-mag ellenanyagot, hozzákötve, ellett az anti.-m.ag ellenanyag lehet egy monoklonálís efienakn ellett az NS3/4a epitop lehet egy konformációs epitop, & például konformációs NS3/4a epitop, ami tartalmazza a 4Ά» 4D> ábrákon Ismertetett aminosav szekvenciát.

Egy másik megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgya egy ioimnnesszé szilárd hordozó, ami hozzákötve tartalmaz legalább két HCV anti-mag monoklonálls ellenanyagot és legalább egy HCV NS3/4& tarformáciös epitopot, ami tartalmazza a 4Á-4D. ábrákon ismertetett aminosav szekvenciák

Egy további megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgya eljárás a HCV fertőzés kimutatására egy biológiai mintából Az eljárás a kővetkező lépésekből áll aj egy előzőkben Ismertetett immunesszé szilárd hordozó biztosítása; bj egy biológiai mintát kombinálunk a szilárd hordozóval olyan körülmények között, amik lehetővé teszik, hogy a HCV antigének és ellenanyagok, ha. jelen vannak a biológiai mintában, akkor kötődnek legalább egy anti-mag ellenanyaghoz illetve az HS3/4a epitophoz; ej komplexképzést biztosító körülmények között a bj lépésből származó szilárd hordozóhoz adunk íj egy első kimutathatóan jelzett ellenanyagot, aholis az első jelzett anti-mag ellenanyag egy másik HCV mag epitop ellen irányul, mint legalább az egyik, a szilárd hordozóhoz kötött antí-mag ellenanyag; iij egy antigént, ami reakcióba lép egy KS3/4a epitoppal reagáló, a biológiai mintából * X Φ ·>· * * * « ♦ > « X

Φ * X * * * * «> >' X * « X

X«·» * »>· * w származó HCV ellenanyaggal; és Hl) egy második kimutathatóan jelzett ellenanyagot, amefy második khnutathatoan jelzett ellenanyag reagálni képes a ii) pont szerinti antigénnel; és d) kimutatjuk az ellenanyagok és az antigének közötti komplexeket, ha. vannak ilyenek, ami azt mutatja, hogy a biológiai tnintáfean HCV fertőzés van. Az HS3/4a. epitop lehet egy konformációs epitop, azaz például egy olyan konformációs epitop, ami a 4A-4D. ábrán bemutatott NS3/4a szekvenciát tartalmazza.

Egy további megvalósítási mád szerint a jelen találmány tárgya eljárás HCV fertőzés kimutatására biológiai mintából. Az eljárás a kővetkező lépésekből áll; a) egy immunesszé szilárd hordozót biztosítunk, ami hozzákötve legalább két HCV antí-mag ellenanyagot tartalmaz, az előzőkben ismertetett módon; b) egy biológiai mintát kombinálunk a szilárd hordozóval olyan körülmények között, amik lehetővé teszik, hogy a HCV antigének és ellenanyagok, ha jelen vannak a biológiai mintában, akkor kőtődnek legalább egy anti-mag ellenanyaghoz illetve az NS3/4a epitopboz; c) tonplexképzéat biztosító körülmények között a b) lépésből származó saálárd hordozóhoz adunk i) egy első kimutathatóan jelzett ellenanyagot, aholis az első jelzett antí-mag ellenanyag egy másik HCV mag epitop elten irányul, nem a szilárd hordozóhoz kötött anti-mag ellenanyagok elten; ii) egy epitopot, ami a HCV poliprotein c33c régiójából származik, egy hBOD aminosav szekvenciához fűzionáltatva; és Ili) egy második kimutathatóan jelzett ellenanyagot, amely második kimutathatóan jelzett ellenanyag reagál a hSÖD aminosav szekvenciával; és d) khnutanuk az ellenanyagok és az antigének között kialakuló komplexeket, ha vannak ilyenek, amik azt jelzik, ho^ a biológiai mintában HCV fertőzés van. Az H33/4a epitop lehet egy konferaiá:

ΧΦ Φ φ φ φ

Φ Φ ν Φ ¥ ΦΦ

Φ Φ Φ

ΦΦ Φ Φ’Φ ciős epitop, azaz például a 4A-41X ábrán bemutatott HS3/4a szekvenciával rendelkező konformációs epitop.

Bármelyik előzőkben említett megvalósítást mád szerint az anti-mag ellenanyag irányulhat közvetlenül a HCV mag antigén egy N-terminális régiója ellen, azaz például a HCV 10~S3~as aminosavai ellen, amik a HCV1 poliprotem szekvenciának megfelelően vannak számozva, és/vagy a kimutathatóan jelzett HCV antb mag ellenanyag irányulhat a HCV mag antigén egy C-tenninális régiója ellen, azaz például a HCV 120-130-as aminoeavai ellen, amik a HCV1 poliproteín szekvenciának megfelelően vannak számozva. Emellett az antigén, ami reakcióba lép a biológiai mintában levő HCV ellenanyaggal, származhat az NS3 régióból, azaz például lehet a HCV pcüprotem c33c régiójának egy epítopja, és fúzienáltathatő egy humán smpewmd-diszmutáz (hSÖD) sminosav szekvenciával. Ebben a megvalósítási módban a. második, kimutathatóan jelzett ellenanyag reagál a hSOD aminosav szekvenciával

Egy másik megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgya eljárás a HCV fertőzés kimutatására egy biológiai mintából. Az eljárás a kővetkező lépésekből áll: a| biztosítunk egy ímmunesszé szilárd hordozót, ami tartalmaz két HCV anti-mag monoklonális ellenanyagot és egy konformációs epitcpot, ami tartalmazza a 4Á-4D. ábrán bemutatott amínosav szekvenciát; fej egy biológiai mintát kombináiun.k a szilárd hordozóval, olyan körülmények kőzett, amik lehetőve teszik, hogy a HCV antigének és ellenanyagok, ha jelen, vonnak a biológiai mintában, akkor kötődjenek legalább két anti-mag ellenanyaghoz valamint az HS3/4a konformádős epitophoz; a fej lépésből származó sdlárd .hcrdoschcz komptezképzódést biztosító körülmények között hozzáa*·* > ·> V >

* Μ * < X * «·*♦ -W ΦΦ dónk i) egy kimutathatően jelzett ellenanyagot, niikoriz az első, kimutathatóan. jelzett ellenanyag egy kimutathatóan jelzett HCV antí-mag ellenanyag, és a jelzett aníi-mag ellenanyag közvetlenül egy másik HCV mag epitop ellen irányul, nem a szilárd hordozóhoz kötött legalább két antí~mag ellenanyaghoz', H> egy epxtopot a HCV poliprotein o33c régiójából, egy feSÖD aminosav szekvenciához fűzionáltatva; és iii> egy második, kimutathatóan jelzett ellenanyagot, amely második kimutathatóan jelzett ellenanyag reagál az említett hSÖD aminosav szekvenciával; majd kimutatjuk az ellenanyagok és az antigének között képződő komplexeket (ha vannak ilyenek)» ami arra utal» hogy a biológiai minta HCV-vel fertőzött

Bizonyos megvalósítási módok szerint a. legalább két antimag ellenanyag a HCV mag antigén egy N-terniínális régiója ellen irányul, azaz például a HCV 10-53-as aminosavai ellen» a HCV poliprotein számozásának megfelelően, és a kimutathatóan jelzett HCV antí-niag ellenanyag a HCV mag antigén egy C-terminálls régiója ellen irányul» azaz például a HCV 120-130-aa aminosavai ellen» a HCV poliprotein számozásának megfelelően.

Bgy másik megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgya eljárás a HCV fertőzés kimutatására egy biológiai mintából Az eljárás az alábbi lépésekből áll: a) biztoaitunk egy szilárd ímmunesszé hordozót» ami több epitop fúziós antigént tartalmaz;

b) egy biológiai mintát kombinálunk a szilárd hordozóval, olyan körülmények között, amik lehetővé teazik, hogy a HCV antigének és ellenanyagok, ha jelen vannak a mintában, akkor kötődjenek legalább e^r anti-mag ellenanyaghoz» az HS3/4a opitophoz és a többszörös epitop Wtóös antigénhez; o) a b) lépesben kapott szilárd hordozóhoz komplex-képzési körülmények között hozzám dunk .í) egy első, kimutathatóan jelzett ellenanyagot, amely első kimutathatóan jelzett ellenanyag egy másik HCV mag epitop ellen irányul, nem a szilárd hordozóhoz kötött legalább egy antímag ellenanyaghoz; ü) első és második antigéneket, amik reagálnak a biológiai mintában levő HCV ellenanyaggal, ami képes reagálni az NS3/4a epitoppal valamint a többszörös fúziós antigénnel; és idj egy második kimutathatóan jelzett ellenanyagot, amiben a második kimutathatóan jelzett, ellenanyag reagál az ü) lépésben említett egészségekkel; d) kimutatjuk az ellenanyagok és az antigének között keletkezett ellenanyagokat, ha van ilyen, and azt jelzi, hogy a biológiai mintában HCV fertőzés van.

Az anh-mag ellenanyag irányulhat a HCV anthmag antigén Nrtetmínális régiója ellen, és az említett első kimutathatóan jelzett ellenanyag irányulhat a HCV mag antigén egy C- terminális régiója ellen, az előzékben ismertetett módon. Emellett az első antigén, and reagál a biológiai mintában levő HCV ellenanyaggal, tartalmazhat a HCV poüprotein eS3e régiójából, egy ellenanyagot, és fuzionálhat egy bSÖD aminosav szekvenciával. Ebben a szövegösszefüggésben a második kimutathatóan jelzett ellenanyag reagál a hSÖD andnoasv szekvendával. Emellett a. második antigén, amelyik reagál egy, a biológiai mintában levő HCV ellenanyaggal, tartalmazhat egy epitopot a HCV poüprotein c22 régiójából, azaz például a HCV poüprotein Lysw-Sem aminosava.it, az Arg4? kivágásával és a heu Trp-re való helyettesítésével a 44es pozícióban, a HCV poüprotein szekvencia alapján számozva. Az epitop fözionáitatva lehet egy hSOD aminosav szekvenciához. Ha így van, akkor a khnutatbatöan jelzett ellenanyag a hSOD amínosav szekvenciával reagál A többszörös fnzióas antigén, tartalmazhatja a 7A-7F. ábrákon bemutatott aminosav szekvenciát.

* « χ * X χ «χ· x- ♦ χ χ « « x x .«· ♦ · * *»*« « « X *** x *«« x«

Egy további megvalősitásl mód szerint a jelen találmány tárgya eljárás a HCV fertőzés kimutatására egy biológiai mintából, amely eljárás a kővetkező lépésekből áll: a) egy szilárd immunesazé hordozót biztosítunk, ami tartalmas két HCV anümag monoklonáüs ellenanyagot, egy HCV NS3/4a konformációs epitopot, ami a 4A-4D, ábrákon bemutatott aminosav szekvenciát tartalmazza, valamint hozzákötve egy többszörös epitop fúziós antigént, aminek a szekvenciáját a 7Á-7F, ábrán mutatjuk be; b) egy biológiai mintát a szilárd hordozóval kombinálunk, olyan körülmények között, amik lehetővé teszik, hogy a HCV antigének, és ellenanyagok, ha jelen vannak, akkor kötődjenek legalább két anti-mag ellenanyaghoz, az HS3/4a konformációs epitophoz valamint a többszörös epitop füziós antigénhez; ej a b) lépésben kapott szilárd hordozóhoz komplezképzést biztosító körülmények között hozzáadunk 1) egy első kimutathatóan jelzett ellenanyagot, amely kimutathatóan jelzett ellenanyag egy kknutathatöan jelzett HCV anti-mag ellenanyag, és a jelzett anti-mag ellenanyag egy másik HCV mag epitop ellen irányul, nem a legalább két anti-mag ellenanyag ellen, amik a szilárd hordozóhoz vannak kötve; ii) a HCV poliprotein e33e régiójának egy epitopja, egy hSOD aminosav szekvenciához füzionáltatva, valamint a HCV poliprotein c22 régiójának egy epitopja, egy hSOD aminosav szekvenciához fözáonáltatva; és iii) egy második kimutathatóan jelzett ellenanyag, amely említett második kimutathatóan jelzett ellenanyag reagál az említett hSOD aminosav szekvenciákkal; d) kimutatjuk az ehenanysgok és antigének között keletkező komptokét, ha van ityen, amit azt mutatja, hogf a biológiai mintában HCV fertőzés van.

φ <s

*♦

Ebben a megvalósítási mádban a legalább két anti-mag ellenanyag irányulhat a HCV .mag antigén egy N-terminális régiója ellen, azaz például a HCV 10 --53-as aminosavai ellen, a HCV1 poliprotein szerint számozva, és a kimutathatóan jelzett HCV antimag ellenanyag a HCV mag antigén C-terminális régiója, ellen irányul, azaz például a HCV 12ö~13G~as aminosavai ellen, a HCV1 poliprotein szerint számozva. Emellett a c22 régió tartalmazhatja a HCV poliprotein Lysio~Ser<j9 aminosavait, az Arg47 kivágásával és a Len Trp-re való helyettesítésével a 44-es pozícióban, a HCV1 poliprotein szekvencia alapján számozva.

Más megvalósítási, módok szerint a jelen találmány tárgyát immundiagnosztikai teszt kittek képezik, amik az előzőkben ismertetett immunesszé szilárd, hordozót tartalmazzák, valamint a immundiagnosztikai teszt felhasználását ismertető utasításokat, Egy további megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgyát az immunesszé szilárd hordozó előállítási eljárásai képezik, amik a kővetkező lépéseket tartalmazzák: a) egy szilárd hordozó biztosítása; és b) legalább egy HCV anti-mag ellenanyaghoz, azaz egyhez, kettőhöz vagy többhöz kötése, valamint legalább egy izolált HCV NS3/4a epitopja, és opcionálisan többszörös epitop fúziós antigénje. Az anti-mag ellenanyagokat, az NS3/4a epitopokat és a többszörös epitop fúziós antigéneket az előzőkben ismertettük.

A további megvalósítási módok szerint a jelen találmány tárgyát egy többszörös epitop fúziós antigén képezi, ami a 7A-7F. ábrákon bemutatott aminosav szekvenciát tartalmazza, vagy egy olyan aminosav szekvenciát, ami legalább 80%-os szekvencia azonosságot, azaz például 90%-os, vagy nagyobb szekvencia, azonosságot mutat, ami specifikusan reagál egy HCV-vel fertőzött egyedból származó biológiai mintában levő anti-HCV ellenanyagokkal Néhány megvalósítási mód amint a többszörös epitop fúziós antigén az 5A-SF. ábrákon bemutatott amínosav szekvenciát tartalmazza,

A további megvalósítási módok szerint a jelen találmány tárgya, egy potinuRieotid, ami az előzőkben említett többszörös epitop fúziós antigén kódoló szekvenciáját tartalmazza, a jelen találmány tárgyát képezik továbbá olyan rekombináns vektorok, amik a polimiMeotídokat tartalmazzák, a rekombináns vektorokkal trans^ormált gazdasejtek és azok. az eljárások, amikkel egy rekombináns többszörös epítop fúziós antigént lehet előállítani, azzal jellemezve, hogy az eljárás a kővetkező lépéseket tartalmazza.: a) foiztoaityuk az előzőkben említett sejtek egy populációját; és

b) a sejtek populációját olyan körülmények között tenyésztjük, amely körülmények között a rekombináns vektorban levő kódoló ozekvenda által kódolt többszörös epitop fúzióé antigén eapresszálódik.

A jelen találmánynak ezek és egyéb aspektusai nyilvánvalóak lesznek az alábbi, részletes leírás és a mellékeit ábrák alapján.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt .ábrákat.

Az L ábra a HCV genom egy diagrammos reprezentációja, amely ismerteti a poliprotein különböző régióit, amikből a jelen találmány szerinti esszé antigénjei (fehérjék és ellenanyagok) származnak.

A 2. ábra egy, a jelen, találtay sze rinti reprezentatív ellenanyag/ antigén kombinációs esszé sematikus ábrázolása,

A 3x ábra ismerteti egy, a jelen találmány szerinti esszékben hasmáit reprezentatív NS3/4& konformációs antigén amino-

ϊ sav szekvenciáját. A vastartót! alanin a XS2~es pozícióban a normális körülmények között ebben a pozícióban található szerint helyettesíti.

A. 4A-4D. ábra ismerteti egy, a jelen találmány szerinti esszékben használt reprezentatív NS3/4a konformáció antigén DNS- és ennek megfelelő aminosav szekvenciáját, A 4A-4D. ábrák. 403-as és 404-es pozíciójában levő aminosavak azt jelzik, hogy a HCV-1 természetes aminosav szekvenciájához viszonyítva Thr helyett Pro van» illetve Ser helyett He van.

Az 5, ábra a pd,HCVla.nx3ns4aR készítésének diagrammA 6. ábra a MBFA 12 diagrammos reprezentációja.

A 7A-7.P. ábra a MBFÁ 12 DNS- és annak megfelelő aminosav szekvenciáját ismerteti,

A 8» ábra egy jelen találmány szerinti reprezentatív immunesszé sematikus ábrája» ΜΕΡΑ 12 használatával

A jelen találmány gyakorlatában, hacsak külön nem említjük az eltérést, akkor a kémia» biokémia» rekombináns DNS technikák és immunológia hagyományos módszereit használjuk» antik a szakterületen jártas szakember ismeretéhez tartoznak. Ezeket a technikákat részletesen ismertetik a szakirodalomban [Pundamental Virology, 2. kiadás, l. és II.

Fields és D.M. Krtipe; Handbook of Bzperimental ímmunology, I kötet, ezorkc

ML Weír és C.C. Blactovell»

Scientific Riblications; T.B. Creighten: Profems, Structures an Moleoular Properties (W.H. Freeman and Company, 19931; A..U lehninger: Hiochemistíy (Wortb Fubiishers Inc. kurrens kiadási; Sambrook és mtsai: Molecnlar Clomng; A laboratory Manu&l; 2.

U < O mm, ϊ na s av m

Φ «ς. χχ.

kiadás, Cola Spring Harbor Press, Cold Spríng Harbor, N.Y> (1989); Methods in Bn^ymoiogy, szerk: S. Colowick és TC Káplán, Academíc Press Inc.).

Meg kell jegyeznünk, hogy ebben a leírásban és a csatolt igénypontokban az egyeaszámü nyelvtani kifejezések jelentése magában. foglalja a. többes számot is, hacsak a szövegösszefüggés másként nem kívánja. Tehát például az „egy antigénére való hivatkozás magában foglalja két vagy több antigén keverékét is, és hasonlók.

A szövegben az aminosavak alábbi rövidítéseit használjuk:

Alaním Alá (B) Aszparagín: Aon (N| Cisztein: Cys (C) Clutamínsavi Gin (E) Hísatklín: His (H) Lenem; Len. (L) Melionin: Mei (M) Prolin; Pro (P) Treonin; Thr (T) Tiroaln; Tyr (¥)

Ax'gínin: Arg (R) Aszparaginsav: Asp (D) Glotamin: Gin (Q) Glidn: Gly (G) ízoteuom: He fi) lián; Lys (K) Penllalanin: Phe (P) Szerín: Ser (S) Triptofán: Trp (W) Valin: Val (V)

A jelen találmány leírása során az alábbi szakkifejezéseket használjuk, éa szándékaink szerint definíciójuk az, amit az alábbiakban megadunk,

A „poiípeptid® és „fehére® szakkifejezés amlnosavak polimerére vonatkozik, és nem koriátozodik. a termék egy .minimális hosszára. Tehát a de&tíeln vonatkozik pepddekre, oiígopeptídekre, dimerekre, multimerekre és hasonlókra, A dehnxcio vonatko-

zik mind a teljes hosszúságú fehérjékre, mind azok fragmenseire, A szakkiftjesések tartalmazzák a polipeptid ezpressziö utáni módosításait, azaz például a ghkozilezést, aeetüezést, feszfonlezést és hasonlókat Emellett a jelen találmány esem pontfából a „poíipeptíd* szakkifejezés egy olyan fehérjére vonatkozik, ami magábán foglalja a természetes szekvencia. módosításait, azaz például delédölt, addfeiöit és helyettesítéseit (általában konzervatív természetű helyettesítéseket), mindaddig, amíg a fehérje megtartja a kívánt aktivitását. Ezek. a módosítások lehetnek szándékosak, például helyspecífikus amfagenszfesel, vagy lehetnek véletlenszerűek, azaz például a a fehérjéket termelő gazdaszervezetek mutációi, vagy a polimeráz láncreakció hibái következtébenEgy HCV polipeptid sgy olyan pohpeptíd, amely az előző definíciónak megfelelően a HCV pohproteinhől származik, A fehérjének nem kell feltétlenül bzíkaíteg a HCV-böl származnia, hanem előállítható szintetikusan vagy rokombmáns módszerekkel Emellett, a polipeptid származhat a különböző HCV törzsek bármelyikéből» azaz például a HCV Ima, 2-es, 3-as vagy 4~es törzséből. Ezek kozott a törzsek között számos konzerválódott és variábilis régié ismert, és általában az ezekből a régiókból származó epitopok aminosav szekvenciái nagymértékű azekvenoiahomológiát mutatnak, azaz több mint 30%-os ammosav szekvencia homológját, előnyösen több mint 40%-os homológlát, ha a két szekvenciát egymás alá illesztjük. Tehát például az _sMS3/4a* poíipeptíd szakkifejezés a különböző HCV törzsek bármelyikéből származó természetes HS3/4a-ra vonatkozik, valamint az HS3/4a analógokra, muteinekre és immunogén fragmensekre, amint azt az alábbiakban pontosabban definiáljuk. Ezek kézül a törzsek közöl többnek ismert a teljes genotípusa (B, 160,08?

számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; GenBank AJ238800 és AJ’238799 letéti számok).

Az „analóg* és „műiéin” szakkifejezés a referencia molekula biológiailag aktív származékaira, vagy az ilyen származékok fragmenseire vonatkozik, amik az itt ismertetett esszékben megtartják a. kívánt aktivitást, azaz például az immunreaktivitást. Az „analóg” szakkifejezés általában olyan vegyületre vonatkozik, ami természetes polipeptid szekvenciával és struktúrával rendelkezik, egy vagy főbb aminosav hozzáadással, helyettesítéssel (általában konzervatív helyettesítésekkel) és/vagy deléeiokkal, a természetes molekulához viszonyítva, mindaddig, amíg a módosítások nem rontják el az immunogén aktivitást A „rnutein” szakkifejezés olyan peptidekre vonatkozik, amik egy vagy több pephdmimetikummal rendelkeznek {„peptidoidok*), azaz például a Wö 91/04282 számú nemzetközi szabadalmi leírásban ismertetett peptidek ilyenek. .Az analóg vagy a műiéin előnyösen ugyanazzal az immunaktivitással rendelkezik, mint a természetes molekula. A polipeptid analógok és muteinek előállítási módszerei ismertek a szakterületen, és az alábbiakban ismertetjük ezeket.

A különösen előnyös analógok közé azok a helyettesítések tartoznak, amik konzervatív természetűek, azaz az olyan helyettesítések, antik az oldalláncúk alapján rokon aminosav családokon belül játszódnak le. Fontosabban , az aminosavakat általában négy családba sorolják: 1) savas - aszpartát és glutamát; 2) bázíkus lián, arginin, hisztidm; 3) apoláros - almán, valin, lenem, .izoleudn, prolin, fenüalanin, metíanm, tríptofán, és 4) töltetlen poláros - glícm, aszparagin, glutamín, dsztem, szerín, treonín és tiroaln. A fendalanint, triptofánt és ürozint .néha aromás aminneavalcnak osztályozzák. Az például ésszerűen megfőή;„

ΦΦ ί

solható, hogy a leucin feo.lend.nnol vagy vaiirmal, egy aszpartái gtutamáttal, egy treonin azerinnel izoláltan való helyettesítése, vagy egy aminosav hasonló konzervatív helyettesítése egy szerkezetileg rokon, aminosawal nem lesz nagy hatással a biológiai aktivitásra. Például a szamunkra érdekes pohpeptid tartalmazhat 5-10 konzervatív vagy nem-konzervatív aminosav helyettesítést, vagy akár 15-25 konzervatív vagy nem-konzervatív aminosav helyettesítést, vagy 5 és 25 között· bármilyen egész számú helyettesítést, mindaddig, amíg a molekula kívánt funkciója érintetlen marad. A szakterületen jártas szakember könnyen meghatározhatja a számára érdekes molekulának azokat a régiéit, amik képesek tolerálni a változtatást, a szakterületen jól ismert Hopp/Woods és Kyte-Doolittle ábrázolásokra A szakkifejezés alatt egy olyan

étiünk, ami az intakt, teljes hosszúságú, p es so részét tartalmazza.. A

a. a természetes poKpeptid egy C-termináli.s dotációját és/vagy N-terminális delédóját. Egy bizonyos HCV fehérje 4mmunogén fragpnense* általában legalább körülbelül 5-10 egybefüggő aminosavai tartalmaz a teljes hosszúságú molekulából, előnyösen legalább körülbelül 15-25 egybefüggő aminosavat tartalmaz a teljes hosszúságú molekulából, és legelőnyösebben legalább körülbelül l vagy aminosavat tartalmaz a teljes hosszúságú molekulából, ami egy epitopof definiál, vagy egy egész számmal meghatározható számú aminosavat a szám 5 és a teljes hosszúságú szekvencia aminosavainak száma között van, aszal a feltétellel, hogy a szóban forgó fragmens megtar^a az immunreaktivitását az itt ismertetett esszékben. Például az előnyben részesített immunogén fingη φ* is mensek közé tartónak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk ma« gunfcat, a. HCV magnak a iragmenseb amik a poliproteinnek például a 10-45-ös, ÍÖ~53~as, ő'7~88~aa és X2Ö- X3O~as aminosavait tartalmazzák, aa 5-1-1 epitop (a virális genom HS3 régiójában), valamint a HCV pohprotein. El, E2, c33c (N33), ctÖÖ (NS4), HS3/4a és NS5 régióból származó definiált epitopok, valamint bármelyik» a HCV poliprotemben azonosított különböző epitop (Chien és mtsai; Proeeedings of the National Academy of Sciences, VSA 89, 10011-:10015 (1992); Chien és mtsai: d, Gastroent. Hepatol 8, 333-39 {1993); Chien és mtsai: WO 93/00365 számú Ham.aetkozi szabadalmi leírás; Chien, DX: WO 94/01773 számú nemzetkési szabadalmi leírás; 6,150,037 és 6421,020 számú Amerikai Egyesült AHaxnok-beli szabadalmi leírás).

Az „epitop* szakkifejezés a továbbiakban olyan szekvenciára, vonatkozik, ami legalább 3-5, előnyösen körülbelül 5-10 vagy 15, és mazimnm körülbelül 1000 (vagy ezek kősóit bármilyen egész szárán) amtnesavaf tartalmaz, ami olyan szekvenciát határoz meg, ami önmagában, vagy egy na^obh szekvencia részeként kötődik egy, ez ellen a szekvencia ellen generált ellenanyaghoz.. A fragmens hosszának nincs kritikus felső határa, ami tartalmazhatja a közel teljes hosszúságú febéijesaekveneiát, vagy lehet éppen egy fúziós fehérje, ami a HCV poliproteinbűl két vagy több epitopot tartalmaz.. Egy epitop, amit a jelen találmányban lehet hasznosítani, nem korláfozodik egy olyan polipeptidre, aminek pont ugyanaz a szekvenciája, mint a kiindulási fehérje, amiből származik, egy szekvencia-darabjának,. Valójában a virális genomok folyamatosan változnak, és számos variábilis dóméul tartalmaznak, amik viszonylag magasfokü variabilitást mutatnak az izolátumok között Tehát az „epxtop* szakkifejezés olyan szekvenciákra vonatkozik, amik azonosak a természetes szekvenciával, valamint, vonatkozik a természetes szekvencia módosításaira is, azaz például delécióira, addíeióira és (általában konzervatív természetű) helyettesítéseire.

Egy adott polípeptíduek a régiói, amik tartalmaznak egy epitopoí, a számos, a szakterületen jól ismert epltop-térképezési technikák bármelyikével azonosíthatók (Epitop Mapping Protocols & Methods in Molecular Biology 66 szerk.: Glonn E._tMorris, Humana Press, Totowa, New Jersey (1996)]. A lineáris epitopokat például úgy lehet meghatározni, hogy egyidejűleg nagyszámú pepiidet szintetizálunk szilárd hordozókon, amely peptidek megfelelnek a fehégemolekula e^es részeinek, majd a peptideket ellenanyagokkal reagáltatjuk, miközben a peptidek még a. hordozóhoz vannak. kötve. Ezek a technikák a szakirodalomban jól ismertek (4,708,871 számú Amerikai Egyesült ÁHamok-beli szabadalmi leírás; Geysen és mtsai: Froceedings ef the National Academy of Sciences, USA 61, 3998-4002 (1984); Geysen és mtsai: Froceedings of the National Academy of Sciences, USA 82, 178-182 (1985); Geysen és mtsai: Molec. Immunot 28, 709-715 (1986)], Ezeknek a technikáknak a használatával a HCV számos epitopját azonosították (lásd például Chien és mtsai: Yiral Hepatitis and liver .Disease, 320-324 (1994); valamint lásd a leírás későbbi részében], Hasonlóképpen, a konformációs epitopok könnyen azonosíthatók az aminoaavak térbeli konformációja alapján, azaz például RŐntgen-krisztallográűával és kétdimenziós magmágaeees rezonanciával [Bpltpp Mapping- Protocols ín: Methods in Molecular Bielogy 66 szerkó Glenn Β», Morris, Humana Press, Totowa, New Jersey (1996)). A φ φ

Φ Φ X ς

Φ *Φ φ φ >

**Φ ΦΧ· fehérjék antigén régiéit standard anbgenicítási és hidropátiás görbék használatával is lehet azonosítani, például olyanokkal, amiket az Oxford Molecular Group-tól beszerezhető Omiga LO programmal lehet kiszámítani Ez a számítógépes program a Hopp/Woods módszert használja az antigenieitási profil meghatározására (Hopp ás mtsai: Ftoceedíngs of the National Academy of Sciences, USA 78, 3824-3328 (1981)), ás a Kyte-Doolittíe technikát használja a hxdropátiás görbék meghatározására [Kyte és mtsai: Journal of Molecular Biology 157, 103-132 (1932)).

A továbbiakban a Jkonformádös epitop* szakkifejezés egy teljes hosszúságú feltétje egy részére vonatkozik, illetve annak egy analógjára vagy' műfemjére, aminek a strukturális tulajdonságai ugyanolyan natívak, mint az epitopot kódoló aminosav szekvenciáé a teljes hosszúságú természetes fehérjében, A természetes etrukturáfie tulajdonságok közé tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a. glikoeílezettség és a háromdimenziós struktúra. Az epitopot definiáló szekvencia hossza azéles határok kozott változhat, mivel úgy gondolják, hogy ezeket az epitopokat az antigén háromdimenziós alakja hozza létre (azaz a feketedés), Tehát, az epitopot definiáló ammoaavak száma viszonylag alacsony lehet, de elszóródhatnak a molekula hosszában (vagy például dimerek esetében különböző molekulákon), éa ezeket a részeket a helyes epitop konformációvá a feketedés hozza őaaze. Az antigénnek az epitopot definiáló csoportjai közötti részek nem feltétlenül kritikusak az epitop konformációs struktúrája szemponijáhdt Például ezeknek a megszakító szekvenciáknak a deléciója vagy helyettesítése nem feltétlenül érinti az epitop konformációját, ami a feltétellel, hogy az epitop konformációja szempontéból kritikus esekvenciák megmaradnak (pél·

XX * «· dául a diszulíid hidakban szerepet játszó dszteineik, ghkozilezésí helyek, stb.).

Az N83/4a régióban levő konformációs epitopokat az előzőkben ismertetett módszerekkel könnyen azonosítani lehet. Emellett, egy konformációs epitop jelenléte vagy hiánya egy adott polipeptidfeen könnyen meghatározható, ha a számunkra érdekes antigént egy ellenanyaggal (poüklonáüs szérummal vagy a konformációs epitopra specifikus monoklonálís ellenanyaggal) hozzuk össze, és reaktivitását összehasonü^uk. az antigén denaturált verziójának reakcióképességével, ami csak a lineáris epitopokat tartja meg (ha vannak ilyenek). Egy ilyen, poüklonális ellenanyagokat alkalmazó azűrevizagálatban előnyös lehet, ha előszót a polüdonáiis szérumot abszorbeált&tjuk a denaturált antigénnel, hogy lássuk, megtartja-e a szénatom antigén elleni ellenanyagokat. Emellett, az N83/4a esetében egy molekula, ami megtartja a természetes konformációját, emellett rendelkezhet proteáz és adott esetben heükáz endmaktivitássál, Az ilyen aktivitásokat enzimes esszékkel lehet meghatározni, az alábbiakban ismertetett módon.

Egy konformációs epitopot előnyösen rekombináns módszerekkel lehet előállítani, és egy olyan sejtben lehet expresszálni, araiból extrahálhatő, olyan körülmények kózőtt, amik megőrzik a kívánt strukturális tulajdonságait, azaz például az epitop denaturálása nélkül Ilyen sejtek például a baktériumok, az élesztők, a rovarok és az emlős sejtek. A HCV poliprotein rekombináns konfermádös epitopjainak enpreesziőját és izolálását a szakirodalomban már közölték (lásd például a WÖ 96/04301, WO 94/01773, WO 95/330S3,' WO 92/08734 számú nemzetközi szabadalmi leírást). Egy másik változat szerint az antigéneket ·*'>

Φ ΧΛΦ

Φ *«

Φ Φ Φ X *·Φ Φ .Φφ ΦΦ ezprezszálni lehet, és azután a kinyerés után a fehérjét renaturátei lehet. Az is nyilvánvaló, hogy a kémiai szintézissel is elő lehet állítani konformációs antigén mimotópokat, amik keresztreakdőt adnak a „természetes* antigén konformációs epitopjával

A „többszörös epitop fúziós antigén* vagy „MEFA* szakkifejezés jelentése a továbbiakban egy olyan polipeptid, amiben a többszörös HCV antigének egyetlen folyamatos aminosavlánc részét képezik, amely lánc nem fordul elő a természetben. A HCV antigének vagy közvetlenül pepíidkötésekkel kapcsolódhatnak egymáshoz, vagy kőzbeékelődő aminosav szekvenciák választhatják el őket egymástól A fúziós antigének emellett tartalmazhatnak a HCV poliproteinhez viszonyítva exogén szekvenciákat is. Emellett a jelenlevő HCV szekvenciák a HCV több genomjáböl és/vagy izdátoniából származhatnak. Az egyes MEFA-knak a jelen találmány ezermti immunesszékben való használatát a szakirodalomban részletezik (lásd például WO 97/44469 számú nemzetközi szabadalmi leírást|, valamint a későbbiekben is lexnertetjük.

Az „ellenanyag* szakkifejezés jelentése egy olyan molekula, ami kémiai vagy fizikai úton specifikusan kötődik egy számunkra érdekes polipeptidhez, így például egy HCV mag ellenanyag egy olyan molekula, and specifikusan kötődik a HCV magiebérjébez. Az „ellenanyag* szakkifejezés jelentése a továbbiakban olyan ellenanyag, amit akár pohklonálls, akár monokkmális készítményből lehet előállítani, valamint a kővetkezőkből: hibrid (kimérj ellenanyag molekulák (lásd például Winter és mtsai; Natúré 349. 293-299 (1991b 4,S16,S6? számú Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírási; F{ab> és F(ab> ftagmensek; W molekulák fnem-kovalens hetemdimerek; lásd például Inbar és mtsai;

·>

Μ.

ϊ

XX .$·

Froceedings of the National Academy of Sciences, VSA 69» 26592662 (1972}; Rbrüch és mtsai; Biochemistry 19. 4091-4096 (1980}}; egyláncü Fv molekulák (sFv) (lásd például Muston és mtsai: Boceedings of the National Acadcmy of Sciences, USA 85, 5879-5883 (1988}}; dhner és trimer ellenanyag fragmens konstrukciók» mini ellenanyagok (lásd például Fack és mtsai: Biochemistry 31, 1.579-1584 (1992); Oumber és mtsai: J. of Immunoi. 140« 120-126 (1992)]; humanizált ellenanyag molekulák (lásd például Riechmann és mtsai: Natúré 383, 323-327 (1988}}; Verhoyen és mtsai: Science 939, 15344536 (1988); GB 2,276,169 számú angol szabadalmi bejelentés, publikálva 1994. szeptember 21 -én]; és bármilyen, ezekből a molekulákból kapott fúnkdonáüs fragmens, amely fragmens megtartja a kiindulási ellenanyag molekula immunológiai kötési képességeit.

A továbbiakban a «monoklonáüs ellenanyag* szakkifejezés olyan ellenanyag készítményre vonatkozik, ami homológ ellenanyag populáció. A szakkifejezés nem korlátozódik sem az ellenanyag fajára vagy forrására, és az sem korlátozza, hogy milyen módszerrel állították elő. Tehát a szakkifejezés vonatkozik a hibridőmákból származó ellenanyagokra, valamint humán monoklonális ellenanyagokra, amiket inkább humán mint rágcsáló bíferídömákbdl állítanak elő (lásd például Cote és mtsai: Monodonal Antibodies and Cancer Therapy, 77. oldal. Alán R. láss (1985)(.

A «rekombináns* fehérje egy olyan fehérje, ami megtartja a kívánt aktivitását, és az itt iamertetctt módon, rekombináns DNS technikával átütöttük elő. A számunkra érdekes gént általában Idónozzuk, majd a transzformált szervezetben ezpresszáljuk, amint azt az alábbiakban ímnertetfök. A gazda szervezet az idegen : ÍUx gént expresosálja, ezzel enpresahös körülmények között termeli a fehérjét.

Az penlalri szakkifejezés, ha poHpeptidre vonatkozik, akkor azt jelenti, hogy- a szóban forgó molekula el van választva a teljes szervezettől, amiben a molekula a természetben megtalálható, vagy lényegében mentes más, azonos típusú biológiai .makromolekuláktól, Az izolált* szakkifejezés, ha polinnkleotidrá vonatkozik, akkor azt jelenti, hogy a nukleinsav molekula mentes, részben vagy teljesen, azoktól a szekvenciáktól, amikkel a természetben együtt fordul elő; vagy a szekvencia természetben előforduló formája, de heterológ szekvenciákkal áll kapcsolatban; vagy egy olyan molekula, ami a kromoszómától dizasszodálva van.

Az· ^ekvivalens antigén determináns* szakkifejezés jelentése a HCV különböző törzseiből vagy alfajaiból, azaz például az X~es, 2-es vagy 3-as HCV-ból származó antigén determináns. Pontosabban, az epitopok ismertek, azaz például az 5-1-1, és az ilyen epitopok eltérnek az l-es, 2-es és 3-as törzsekben. Tehát, a három különböző törzsből származó 5-1-1 epitop ekvivalens antigén determináns, és Így „másolatok*, még akkor is, ha szekvenciájuk nem azonos. Általában az ekvivalens antigén determinánsok aminosav szekvenciái magasfokú szekvenda-homoiógpával rendelkeznek, azaz nagyobb mint 30%-os, előnyösen nagyobb mint 40%-os amínosav szekvencia homolőgiával, ha a két szekvenciát egymáshoz illesztjük.

A ^homnlngbü szakkifejezés két polinnkleotid vagy polipeptíd egység közötti százalékos haoonlöságra utal, hét DHS, vagy két poüpeptid szekvencia ^lényegében homológ* egymással, ha a szekvenciák legalább körülbelül 50 százalékos, előnyösen, legalább körülbelül 75 osámléteo, még előnyösebben legalább kÖse- *« κ.» *·♦ < «· * <

Φ << «.«X <· * <· * *> * ί» «.χ rülbeiűl 8Ö-8S százalékos, előnyösen legalább körülbelül 90 százalékos, és legelőnyösebben legalább körülbelül 95-98 százalékos szekvencia hasonlóságot mutatnak a molekulák egy meghatározott szakaszán. A továbbiakban a lényegében homológ szakkifejezés olyan szekvenciákra ís vonatkozik, amik komplett azonosságot mutatnak a specifikált DNS- vagy poüpeptíd szekvenciával.

Az „azonosság* szakkifejezés általában pontos nukleotidnukleotid vagy aminosav-ammosav megfelelést jelent két polinukleotld vagy két pőlipeptíd szekvencia között. A százalékos azonosságot a két molekula szekvencia-információjának közvetlen összehasonlításával lehet, meghatározni, ha a két szekvenciát egymáshoz illesztjük, megszámláljuk a két egymáshoz illesztett szekvencia 'közötti pontos illemkódexek számát, ezt elosztjuk a rövidebb szekvencia hosszával, majd megszorozzuk 100-zal.

Könnyen hozzáférhető számítógépes programok használhatók a hasonlóság és az azonosság elemzésére, ilyen például az AL1GN fDayhöS, M.O., ih: Atlax of Protein Sequenco and Structure, 5, Suppl 3, 353-358 xzsrkz M.O, Dayhoff, National Biomedical Research Foundation, Washington DCj, ami Snhth és Waterman lokális homológja algoritmusát használja (Advances In Appt Mafla 2, 482-489 (198 1>] a pepdd-elemzéshez. A nukleotld szekvencia hasonlóság és azonosság meghatározására szolgáló programok a Wisconsin Sequence Analysis Package~bő.i (8-as v«w) szerezhetők be (Genetícs Computer Group, Madison, Wl], ilyen, például a BBSTFTT, a. FA8TA. és a GAP program, amik szintén a Smith és Waterman algadtmuson alapulnák. Ezek a programok könnyen használhatók a osersök által javasolt alap-paraméterekkel, és amiknek a leírása megtalálható az előzőkben említett. Wiseonsm Saganuáo Malyoh Pacfcage-fecn. Például egy > * * «Ψ *x* * » IS í«S ** adott nukleodd szekvencia százalékos hasonlósága egy referencia szekvenciához a Smith and Waterman homológia algoritmus használatával határozható meg, egy alap értéktáblázattal, valamint egy hat nnkleotid pozícióra vonatkozó résnyilási bvmtetésseh

A jelen találmány őaozefüggéaéhen a százalékos hasonlóság meghatározásának egy másik módszere az MPSRCH programcsomag használata (copyright Iteivemfy of Edinburgh, kifejlesztő John F, Colima és Shane S. Turrock, terjeszd sz IntelkGenetics, Inc. (Mountain View, CA}}. Ebből a programcsomagból a SmithWaterman algoritmus használható, aminél az alap paramétereket használjuk az érték-táblázathoz (például a résnyílási büntetés 12, a résna^obbodási büntetés egy, és a rés hat). A kapott adatokból az illeszkedés* érték tükrözi a „szekvencia hasonlóságot*. A szakterületen más megfelelő programok is ismertek szekvenciák százalékos azonosságának vagy hasonlóságának kiszámítására, ilyen más illesztő program például, a BLAST, az alap paraméterekkel használva. Például a BIÁSTH és a BIASTF használható, az alábbi alap paraméterek használatával: genetikai kőd standard; szá>mindkettő; vágási érték^öö; v&rb-lö; Mátrix ^:s!BhÖSUM62; beírás^SÖ szekvencia; osztályozásba MAGAS ÉRTÉKEK, alapján; Adatházisok^nem-redundáns, Gén,Bank * EMBL *DDBd*FDB*Gen,Ba.nk CDS translaüons* Swiss protein* Spupdate*Fl,R. Ezeknek a programoknak a réatíetei az alábbi internet elmen találhatók meg: bttpte/SlhFdfaMm/áBb

Bgy másik változat szerint a homológte a pohnukleotidok hitódizád^a alapján hattozh&tó meg, olyan körülmények között, hogy ^a homológ régiók kozott stabil duplexek keletkeznek, .·>··*» ezt követi egyszálra spedflkua nutóeázokkal való emésztés, majd az emésztett fragmensek méretének meghatározása, A lényegében homológ DNS szekvenciák Southern biot hibridizációs kísérletben határozhatók meg, például szigorú körülmények között, amit az adott rendszerhez kell megválasztani, A megfeleld hibrídizáeiős körülmények kiválasztása a szakterületen jártas szakember tudásához tartozik fSambrook és mtsak Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2. kiadás, Cold Spríng Harbor Press, Cold Spring Harfeor, NX (1989), DNA Cloning, Nucleíc Add Hybrkhzation. supra).

Bgy kódoló szekvencia⁰, vagy egy olyan szekvencia, ami egy kiválasztott fehérjét kódol, egy nukieinsav molekula, ami átíródik (a DNS esetében) és lefordítódik (a. mRKS esetében) egy polípeptiddé, m vám vagy ét vívó, ha megfelelő szabályozó szekvenciák irányítása alá helyeztük, A kódoló szekvencia határait egy startodon határozza meg az 5* (amino) végen, és egy transzlátíés stopkodon a 3* (karboxi) végen. Egy transzknpciös terminádós azekvenoia lehet a kódoló szekvencia 3' végén,

A „xuükddés szempontjából kapcsolva* szakkifejezés az elemek olyan elrendezésére utal, amiben az itt ismertetett komponensek ügy vannak konfigurálva, hogy végre tudják hajtani az elvárt funkciójukat, Tehát egy adott promoter működés szempontjából egy kódoló szekvenciához kapcsolva képes elvégezni a kódoló szekvencia eaptessziojáf, ha a megfeleld transzkripciós faktorok, sth, jelen vannak, A promoternek a ködőié szökvénólával e^beiuggönek kell lennie, mindaddig, amíg úgy működik, hogy annak exprezaziéját vezérli, Tehát például megszakító nemíranszláiödö, de mégis átírödö szekvenelák lehetnek jelen a promoterswkvenda és a kódoló szekvencia között, ugyanúgy, mint ϊ oc : »♦*» »«j »«« * <χ» W »♦* átiródó intronok, és a promoterszekvendát még ekkor is a kódoló szekvenciával „működés szempontjából kapcsoltnak* tekinthetjük.

A Jcontroli elem* szakkifejezés egy olyan. pofinukleotid szekvenciára vonatkozik, ami segíti a hozzá kapcsolódó kódoló szekvencia impresszióját, A szakkifejezés vonatkozhat promoterekre, transzkripciós termináeiös szekvendákra, upstream szabályozó doménekre, poliadenilezési szignálokra, beleértve az 5'-UTR-e.kef és 3'~UTB-éket, és ha alkalmas, akkor a vezérszekvenciákat és a fokozókat, amik összességeikben biztosítják egy kódoló szekvencia transzkripcióját és transziáeiöját egy gazdasejtben.

A „promotert szakkifejezés jelentése a továbbiakban egy DNS szabályozó régió, ami egy gaxdaseftheo képes az· RNS pofimerázhoz kötődni, és inidáíni egy hozzá downsfmam (3 irány) műkődós szempontjából kapcsolódó kódoló szekvencia transzkripcióját, A jelen találmány céljaira egy premoterszekvenda tartalmazza. a bázisok vagy elemek minimális számát, amik ahhoz szükségesek, hogy ioieíálják egy számunkra érdekes gén transzkripcióját, a háttérsrint fölötti szintem A promoterszekvendán belül van egy transzkripciós inioiáciás hely, valamint iéhérjekötó dóménak (konszenzus szekvenciák), amik az RNS poiinieráz kötődéséért felelősek. Az eukariőta pmmoterek gyakran, de nem mindig tartalmaznak „TATA® hozókat és „OAT hoxokak

Egy kontroli szekvencia akkor „vezérli* egy kódoló szekvencia „transzkripcióját* egy sejtben, ha az RNS polimeráz kötődik a promoterszekvendához és a kódoló szekvenciát mRNB-sé írja át, and azután a kódoló szekvencia által kódolt polipeptiddé fordítódik le.

«X » t Í4.

X <<· *x ** * * * a * <ί·χ * * * ·>

«*«. .j» ·χχ

Az „expressziós kazetta® vagy „expresróős konstrukció® szakkifejezés egy olyan összeállításra vonatkozik, ami képes vezérelni a számunkra érdekes szekvenciák vagy gének expresszióját Az expressziós kazetta tartalmaz kontroll elemeket, az előzőkben ismertetett módon, azaz például egy promotert, ami működés szempontjából kapcsolódik a számunkra érdekes székvendá(k)höz vagy gén(ekjhez (hogy vezérelje a transzkripciójukat), és gyakran tartalmaz poliadenilezési szekvenciákat is. A jelen találmány néhány megvalósítási módja szerint az itt ismertetett expressziós kazetta lehet egy plazmid konstrukcióban. Az expressziős kazetta komponensei mellett a plazmid konstrukció tartalmazhat még egy vagy több azelekdőa markért, azaz egy olyan szignált, ami lehetővé teszi a plazmid konstrukció számára, hogy egyszálú DNS formájában létezzen (azaz például egy Ml3 replikáciős origó), valamint tartalmaz legalább egy többszörös klónozó helyet, és egy „emlős* replikáciős origót (azaz például egy SV4Ö vagy adenovírus replikáciős origót),

A „transzformáció® szakkifejezés jelentése a továbbiakban arra utal, hogy egy exogén pobnukleotidot juttatunk be egy gazdasejtbe» függetlenül a bevitel módszerétől: például transzformáció közvetlen felvétellel, transzfekció, fertőzés és hasonlók. A transzfekció módszereinek részleteit lásd az alábbiakban. Az exogén polinukleotid fennmaradhat nem-integrálódó vektorként, például episzőmaként, vagy egy másik változat szerint integrálódhat a gazdaszervezet genomjába.

A „gszdasejt* szakkifejezés jelentése egy olyan sejt, ami trmxszformálva van, vagy trmszformálható egy exogén DNS szekvenciával.

A «közös szilárd hordozó* jelentése egy szilárd mátrix amihez az immunesszében használt .HCV polipeptidek kovalens kötéssel vagy nem-kovalens kötéssel, azaz például bidroföb adszorpcióval kötődnek.

Az „immunolögiailag reaktív* szakkifejezés azt jelenti, hogy a szóban forgó antigén specifikusan reagál az egy HCV-vel fertőzött egyedői származó biológiai mintában tevő anÜ-HCV ellenanyagokkal.

Az «immunkomplex* szakkifejezés jelentése az a kombinácié, ami akkor keletkezik, ha egy ellenanyag kötődik az antigénen levő egyik epitopboz.

A továbbiakban a „biológiai minta* szakkifejezés jelentése egy alanyból izolált szövőt- vagy folyadékminta, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a vért, a plazmát, a szérumot, a székletmintát, a vizeletet, a csontvelőt, az epét, a gerinofó^adékot, a nyirokfelyadékot, bőrmintákat, a bőr, a légzőszervek, az emésztőszervek és a szaporitészervek által kiválasztott anyagokat, a könnyet, a nyálat, a tejet, a vérsejteket,, a szerveket, a. biopsziákat valamint az in vám sejttenyészet komponenseit, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a sejtek és szövetek, azaz például rekombináns sejtek és sejtkomponensek tenyésztő közegben való tenyésztéséből származó kondicionált táptalajt.

A továbbiakban a jelölés* és a «kimutatható jelölés* szakkifejezés e^r olyan molekulára vonatkozik, amit ki lehet mutatni, beleértve, anélkül hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a radioaktív izotópokat, a ünoreszkálő anyagokat, a kemilumineszkale anyagokat, a kromofórokat, az entemefest, az entem-szubsztrátofed, ,az entem-kotektorokte, óz enrimitdnfokorokat, a kromofem-

ί »** **·* «ί kai, a festékeket, a fémionokat» a fémkoUoidokot, a ligandumokat (azaz például a feiotint, a sztrepfavídint vagy hapténeket) és a hasonlókat Λ ^Onoreazkáló anya^* szakkifejezés egy olyan anyagra, vagy annak egy részére vonatkozik» ami Ouoreszcenciára képes a kimutatható tartományban. A jelen találmányban használható jelölések példái közé tartozik» anélkül» hogy ezekre korlátoznánk a tormaperoxidáz (HRF)» a Ouoreszcein» a fluoreszceint, a rodamtn, a danzil» az umbelliferon» a dimetil-akridinium-észter (DMAB), a Texas red» a .Imáinál» a NADFH és az α-β-

Mielőtt a jelen találmányt részletesen ismertetnénk» meg kell jegyeznünk, hogy a jelen találmány nem korlátozódik bizonyos készítményekre» vagy elisrási paraméterekre» mivel ezek természetesen változhatnak. Az is nyilvánvaló» hogy a jelen találmány bizonyos megvalósítási módjainak leírására itt használt terminológiát nem tekintjük korlátozónak.

Bár a jelen találmány gyakorlatában számos, az itt ismertetetthez hasonló, vagy azzal ekvivalens késsdtmény és módszer használható, az előnyben részesített anyagokat és módszereket az alábbiakban ismertetjük.

Amint azt az előzőkben megegyeztük, a jelen találmány azon alapszik, hogy a korai HCV fertőzés diagnosztizálására új diagnosztikai módszereket fedeztünk let A módszerek az erősen lmmunogén HCV ellenanyagok és antigének azonosításán és használatán alapulnak, araik a HCV szerokonvemó korai szakaszában vannak jelen» eral nóvolvo a kimutatás pontosságát és csók-

kentve a hamis eredmények előfordulási gyakoriságát A módszerek kényelmesen használhatók e^r egyszeres esszé formátumban.

Pontosabban, az esszét egy szilárd hordozón hajtjuk végre, amihez egy vagy több HCV antkmag ellenanyagot (ami ugyanazon, vagy eltörd HCV mag epitop ellen, irányul), és egy, a HCV poliprotein NS3/4& régiójából származó epitopot kötöttünk. A jelen találmányban jól használható anti-mag ellenanyagok lehetnek például, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az ellenanyag molekulák, aaas például a monokionáíis ellenanyagok, amik a 10-53-as ammosavak, 10-45-öa aminosavak, 67-88-as aminosavak, 12013Ö-as aminosavak között található mag-rögiöban levő epitopok ellen irányulnak, vagy olyan ellenanyagok, amik a szakirodalomban azonosítctt bármelyik mag epitop ellen irányulnak (Hougbton és mtsai: 5,350,671 számú Amerikai Egyesült Aöamok-beü szabadalmi leírás; Chien és mtsai: Froceedmgs of the National Aoademy of Sciences, USA 89, 10011-10015 (1992); Chien és mtsai; 3. Gastroent Hepatol 3, 833-39 (1993); Chien és mtsai: 94/01778 számú nemzetközi szabadalmi leírás; Chien, DX: WO 94/01778 számú nemzetközi szabadalmi leírás; és a 08/403,590 és a 08/444,818 sorosatssámü Amerikai Egyesült Államok-beK szabadalmi leírás).

Áz HCV poliprotem RS3/4a régidiát a szakirodalomban leírták, és leírták a fehérje anünosav szekvenciáját és teljes sserkesetét |Y&c és mtsai; Science 7, 1353-1363 (1999.

november); Sáli és mtsai: Bioebemiahy 37, 3392-3401 (1998); Baríertsehlager, Re <1 Viral. Hepat, 6, 16S-I81 (1999);

Pasmshapatra és mtsai: 5,843,752 számú Amerikai Egyesült ABamok-beli szabadalmi Wásj. A szobán forgó immimesssék legalább egy, az M83/4a régmbol származó kcníprmációa epitopot

Λ Μ* _ν··>

V νί használnak» amik a terméwetben előforduló HCV részecske vagy fertőző tennék konformádójában léteznek, amit igawl a proteáz és adott esetben a helikáz aktivitás megmaradása, amivel normális körülmények· körött az N83/4a géntermék rendelkezik, és/vagy az antigén immunreaktivitása egy HCV-vei fertőzött alanyból származó biológiai .mintában levő ellenanyagokkal, valamint az epitop immunreaktivitásának elvesztése az antigén, denaturálásávalx A konformádóa epitop például megszakítható melegítéssel, a pH szélsőségesen savasra, vagy lúgosra való változtatásával, vagy ismert szerves denaturálösserek, azaz például dítloíréitől (DTT)_S vagy megfelelő detesgens hozzáadásával [Protein taíácaikm Methods, a praetíoa! approach, szerkó; É,L,V, Harrís és 8. Angol, IRC Press), és a denaturált terméknek a kezeletlen termékkel való összehasonlításával,

A proteáz és helikáz aktivitást a szakterületen jól ismert standard enzim-esszékkel lehet meghatározni A proteáz aktivitást például a szakterületen jól ismert esszékkel lehet meghatározni (Takeshita és mtsai; Analytical Bioehemístry 247, 24:2-246 (1997); Kakíuebl és mtsai: Journal of Bioehemístry 122, 749-755 (1997); Sah és mtsai: Biochemisfry 37, 3392-3401 (1998); Cho éa mtsai; J> Vlrot Meth> 80, 77-84 (1999); Powler és mtsai: J. Blomoh Sereen, 5, 158-158 (2ÖÖÖ); Kim és mtsai: Analytical Biochemishy 984, 42-48 (2000)), A proteáz esszé vizsgálatának egy különösen kényelmes módszerét az alábbi példákban részletesen ismertetjük

Hasonlóképpen, a helikáz aktivitási esszék a szakirodalomfezn jól Ismertek, és egy BS3/4a eptiop hetikáz aktivitását a wkkodalemban ismertetett módon példán! egy BUSA esszével [Bioehmmeal and Rfepfeysfcel Research Communications Tjgb

¢.

*

594-599 (1993)], egy szcintilláciős prosimitási esszé-rendszerrel (Kyono és mtsai: Analytical Biochemistry 257, 120-126 (1993)], nagyteljesítményű szűrővizsgálati esszékkel (Hicham és mtsai: Antíviral Rés. 46, ISI-193 (2000); Kwong és mtsai: Methods Mot Med. 24, 97-116 (2000)], valamint más, a szakirodalomban ismertetett módszerekkel határozhatjuk meg (Khu és mtsai: d. Virot 75, 205-214 (2001); ütama és mtsai: Virology 273, 316324 (2000); Paolini és mtsai: J. General Virology 81, 1335-1345 (2O00); Frcugsohat és mtsai: Biochemistry 39, 5174-5183 (2000); Preugschat és mtsai: Methods Moh Med. 19, 353-364 (1998); Mosson és mtsai: Biochemistry 39, 2619-2625 (2000)].

Az antigén hossza elég ahhoz, hogy fenntartson egy immunreaktív konformációs epitopot, A használt antigént tartalmazó polipeptid gyakran teljes hosszúságú, a polipeptid azonban lehet csonkított is, például azért, hegy fokozzuk az oldhatóságát, vagy növeljük a szekrécióját. Az NS3/4a~ban talált konformációs epítop rekombináns poKpeptidként esqsresszálodik egy sejtben, és ez a polipeptid biztosítja az epitopot a kívánt formában, amint azt. az alábbiakban réadetesen ismertetjük.

Az H53/4a pohpepddek reprezentatív aminosav szekvenciáit a 3. ábrán, valamint a 4A-4D. ábrán mutatjuk be. A 3. ábrán a 182-es pozícióban levő vastartóit alaninnal helyettesítettük az ebben a pozícióban levő természetes szerint, azzal a céllal, hogy megakadályozzuk a molekulának egyéhként kialakuló autokatáMzisét. A 4A-4D. ábrák 2-686-os poMdóiban bemutatott aminosav szekvencia a HCV-1 1027-171-es· aminosav pozícióinak felel meg. Így metionint (Met) kódoló· inioiátor kodon látható az 1-es pozícióban. Emellett, a HCV-1 1428-as pozíciójában (a 4. ábra 403-as aminosav poridófa) normális körülmények között

előforduló Thr Fro-vá van mirtáltatva, és a HCV-1 1429-es poridójában (a 4, ábra 404-es podciőja} normális körülmények között levő Ser Ile-vé van mutáltatva. Azonban a szóban forgó esszében mind a természetes szekvencia, az N-terminálís metíoninnal vagy anélkül, az ismertetett analóg, az ^-terminális metíoninnal vagy anélkül, vagy más analógok és fragmensek is használható, mindaddig, amíg az ezzel a módszerrel előállított epitop megtartja vagy újra felvesd a természetes konformációját, azaz megtartja a proteáz aktivitását és adott esetben a. heükaz aktivitását is (Dasmahapatra. és mtsaii 5,343,752 számú Amerikai Egyesült Államok-heü szabadalmi leírás; Zhang és mlsai; 5,990,276 számú Amerikai Egyesült Áiiamok-boli szabadalmi leírás, mindegyikben az NS3/4a analógjait írják le}.

Az HS3/4a N33 proteáza körülbelül a 1027-1207-es pozícióban található a HCV-l számozás szerint, és a 4. ábra számozása szerint a 2-lS2-es póridéban. Az NS3 proteáz és aktív hely struktúrája ismert (De Franeeseo és mtsak Antivir. Ther. 3, 99-109 (1998)]; Kocb és mtsai: Biocheahstry 40, 631-640 (2001)]a természetes szekvenciának normális körülmények között tolerált változásai a molekula aktív helyén krimi van. Fontosabban, kívánatos, hogy a 4. ábra 1- vagy 2-155-ös aminosavait megtartsuk, csekély, vagy csak konzervatív helyettesítésekkel. A 155ős pozíció után levő aminosavak elviselnek nagyobb változásokat is. Emellett, ha a 4. ábrán látható HS3/4a. szekvencia fragmenseít hasznaink, akkor ezek a fragmenzek általában legalább az 1vagy 2-155-ös aminneavakst tartalmazzák, előnyösen az 1- vagy 2-175-öa ammcaavakat, és legelőnyösebben az 1- vagy 2-132-es mmnasavató, az· H-termináBs metfentaal vagy anélkül, A hsikáz dómén a HCV-l-nsk körülbelül a l!93~1657-es pori36

ΦΦ Φ Φ * χ φ Φ X Φ φ Φ dójában található (a 4.. ábra 207-632-es pozíciója). Tehát, ha a helikáz aktivitásra szükség van, akkor a molekulának ezt a részét meg kell tartani, minimális, vagy konzervatív változtatásokkal. A szakterületen jártas szakember könnyen meghatározhat más régiókat, amik tolerálják az NS3/4& ismert struktúrájában tett változtatásokat.

A szilárd hordozó is tartalmazhat antigéneket. Például a többszörös fúziós antigének (ezeknek a rövidítése »MEFA*), a Wö 97/44469 számú nemzetközi szabadalmi leírásban ismertetett módon köthetők a szilárd hordozóhoz, hogy a szóban forgó esszékben fel lehessen használni. Az ilyen MEFA-k közé tartoznak az 1. ábrán és az 1. táblázatban bemutatott virális régiók kozni kettőből vagy többől származó többszörös epitopok. Pontosabban, amint az az 1. táblázatban és az 1. ábrán bemutatjuk, egy HCV poliprotein a hasítás következtében legalább tíz különböző terméket eredményez, NHs-Core-E l-E2-p7-NS2-NS3-NS4aNS4b-NS5a-NS5b-COOH sorrendben, A mag polipeptid az l191-os pozícióban fordul elő, a HCV-1 számozás alapján (Choo és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 38. 2451-2455 (1991), a HCV-1 genomra). Ez a polipeptid tovább processzálódik, ezzel körülbelül 1-173 aminosavböl álló HCV polipeptídet termelve. A burok polipeptidek, az El és az E2 a 192383-as és a 384-746-os pozícióban találhatók. A P7 dómén körülbelül a 747-809-es pozícióban található. Az NS2 egy integráns membránfehétje, proteolítikus aktivitássál, és a poliprotein 8 ΙΟΙ 026-os

Nb2, óximagában, vagy az mái kombinálva (az 1027-1657-os pozícióban található) elhasítja az NS2-NS3 közötti kötést, ez viszont az NS3 N-terminálisát generálja, és egy nagy poliproteint szabadit fel, ami. mind szerin *« φ proteáz, mind RNS heükáz aktivitással rendelkezik. Az NS3 proteáz (körülbelül a 1027-1207-es pozícióban található) szolgálja a megmaradt poliprotein processzálását. A helikáz aktivitás körülbelül az 1193-1657-es pozícióban található. A poliprotein érésének befejezését az NS3-N34a kapcsolódás autokatalitikus hasítása iniciálja, amit az NS3 szerbi proteáz katalizál. A HCV poliprotein ezután következő, NS3-as hasításáról úgy tűnik, hogy magában foglalja, a poliprotein hasítási helyek felismerését egy másik potípepüd NS3 molekulája áltat Ezekben a reakciókban az NS3 felszabadít egy NS3 kofaktort (NS4a, körülbelül a 16381711- es pozícióban található), két fehérjét (NS4b, körülbelül a

1712- 1972~es porcióban található) és NS5a, körülbelül a. 19732420-as pozícióban található), valamint egy RNS-dependens RNS pohmerázt (NS5b, körülbelül a 2421-3011-es pozícióban. található).

I. Táblázat

Dömén	Hozzávetőleges határok*
C(mag)	1 -191
El	192-383
B2	384-746
P7	747-809
NS2	810-1026
HS3	1027-1657
N34a	1658-1711
NS4b	Í712-1972
NSSa	1973-2420
NSSb	2421-3011

ϊΐ φ φφφ χ Φ Φ *χ

Φ * Φ Φ Φ X X * *» < φ φφφ φφ φφ * A HCV-1 szerinti számozás. Lásd: Cboo és mtsai: Froceedings of the National Academy of Sciences, USA 88 > 2451-2455 (1991),

A többszörös HCV antigének egyetlen, egybefüggő aminosav lánc részéit képezik, amely lánc nem fordul elő a természetben. Tehát az epitopok lineáris sorrendje eltér attól a lineáris sorrendtől, amiben a genomjukban előfordulnak. A MEFA szekvenciák itteni használatra létrehozott lineáris sorrendje elönvőΦΦ a/ sen az optimális antigenícitás elérésére van. összeállítva. Az epitopok előnyösen egynél több HCV törzsből származnak, ezzel azt a képességet is biztosítják, hogy egyetlen esszében a HCV főbb törzsét is ki lehet mutatni. Tehát a. jelen találmányban va alkalmazásra készített MEFA-k az előzőkben ismertet w inbői származó különböző immunogén régiókat tartalmaznak.

Emellett, a MEFÁ-kban egy olyan fehérje is 1 ató, ami a

bldául a Wi

9/63’ sshiít-ből származik, ezt a szu&seges >an xsmeríí

2, 3, 4, o, vagy 3w-41v-es ammosavakr számú szabadalmi ^u· a túriős fehérje legalá 7, 8, 9 vagy 10 vagy többet tartalmaz egy vagy több, a HCV pohproteinből származó epitopból.

hipervariábilis régiójából, azaz a 384-4lö-es kitexjedó régióból származó epitopok is benne lehetnek a MEFA antigénben. Egy különösen hatékony E2 epitop az, ami egy ebből a régióból származó konszenzus szekvenciát tartalmaz, azaz a Gly-Ser-Ala-Ala-.Arg-Thr~ Ihr-Ser-Öly-Fhe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Fro-Gly-Ala-Lys-Gln-Ásn konszenzus szekvenciát, ami a HCV 1-es típusú genomja 3904 lö-es antinosavainak konszenzus szekvenciája. Egy jelen találmány szerinti MEFA-ban levő reprezentatív E2 epitop tartalmaz egy hibrid epitopot, ami a 39Ö-444~es aminosavakra terjed ki.

* Φ' φ X φ φ Φ * * φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ *φ *φφ

Egy ilyen hibrid Ε2 epitop tartalmazhat egy konszenzus szekvenciát, ami a 390-4lö-es aminosavakból áll, a HCV E2 411-444~es természetes aminosav szekvenciájához fíotíonálfatva.

Emellett az antigének származhatnak különböző HCV törzsekből A HCV több virális törzse ismert, és egy fúziós fehérjében esen törzsek bármelyikéből származó epitop használható. Az jól ismén, hogy bármilyen szervezet egyik egyede eltér a másiktól, és egy adott szervezetnek, azaz például egy vírusnak, számos különböző törzse lehet. Például, amint az az előzőkben elmagyaráztuk, a HCV-nek legalább 6 genotípusa van. Mindegyik ilyen genotípusnak, vannak ekvivalens antigén determinánsai. Pontosabban, mindegyik törzs tartalmaz számos antigén determinánst, amik a vírus összes törzsében megvannak, de enyhén mázzá az 5-1-1 néven ismert antigén determinánst (lásd az L ábrát), Ez a bizonyos antigén determináns három különböző fora HCV három különböző vírustőrzsében. Ennek

en a jelen taiaimany egy. előnyben reszes tásl módja, szerint az 5-1-1. mindhárom formája, megjelenik a többszörös epitop fúziós antigénben,, amit a szóban forgó immunesszében használunk. Hasonlóképpen, a különböző HCV törzsek mag-régiőiból származó ekvivalens antigén determinánsok Is jelen lehetnek. Az ekvivalens antigén determinánsok általában magasfokü bomolögiát mutatnak az aminosav szekvenciában, amely homológ!» általában 30% vagy több, előnyösen 40% vagy több, ha a szekvenciákat egymáshoz illesztjük, A jelen találmány szerinti több kópia tartalmazhat több teljesen azonos kópiát is ugyanabból az e| •X »

4Ö * 0

0 0 «00,

X * 0 0

0 0 « * X «0 ·**0

0*0 *

0 X -0Μ «0

A jelen találmányban való használatra szánt reprezentatív MEFA-kat a Wö 97/44469 számú nemzetközi szabadalmi leírásban ismertetik, A jelen találmányban való felhasználásra szánt további reprezentatív MEFA-k közé tartozik a ΜΕΡΑ 12, a ΜΕΡΑ 13 és a ΜΕΡΑ 13.1. Áz nyilvánvaló, hogy ezek a MEFA-k reprezentatív MEFA-k, és a HCV génemből származó máz szintén használhatók lesznek a jelen találmányban, és ezeket és más MEFA-kat is be lehet építeni.

A MEFA 12 DNS szekvenciáját és a megfelelő aminosav szekvenciáját a 7A-7P. ábrán mutatjuk be. A ΜΕΡΑ 12 általános szerkezeti képletét a 6. ábrán mutatjuk be, ami a következő: hSOD-El(l-es dpus)-E2 HVR konszenzusba típus)-E2 HVR konszenzus(l-es és 2-es tipus)~c33c rÖvid(l-es típus)-5-l~l(l~es tipus)~5~ 1 (3-as típus)-5-1-1 (2-es típus)~c 10Ö(l-es tipus)-NS5(l-es típus)-NS5(l~es típus)-mag(l*2-es típus)~mag(l*2-es típus). Ez a több epitop kópia tartalmazza az alábbi aminosav szekvenciát, a HCV-l alapján számozva (az alábbiakban bemutatott aminosavak számozása a Cboo és munkatársai által használt számozást követi (Choo és mtsai: Froceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 2451-2455 (1991)), amely számozásban a #1 aminosav az első metionin, amit a kódoló régió kódoló szekvenciája kódol): a szuperozid-diszmutáz 1-69-es aminosava (SÓD, amit a fehérje rekombináns ezpressziöjának fokozására lehet használni); a poliprotein El régiójából származó 303-32Ö-as aminosava.: a poliprotein 390-41 Ö-es aminosavm, amik a HCV-l,aE2 bipervariábilis régiójának konszenzus szekvenciáját reprezentálják; a poliprotein E2 régiójának 334-414-es aminosavai, amik a HCV- l és a HCV-2 E2 bipervariábilis régióinak konszenzus szekvenciáját reprezentálják; a HCV-l poliprotein 1211-1457-es amiXX

Φ* nosavai, amik a helikázi definiálják; három kópia az 5-1-1 epitopból, az 1689-1735-Ós aminoaavak» az egyik a HCV-l-bÓl, a másik a HCV~3~ból, a harmadik a HCV-2-bŐl, amely kópiák ekvivalens antigén determinánsok a HCV három különböző virustörzséből; a HCV-1 C1ÖO HCV pokpeptidje, a pofiprotein 19011936-os aminaeavai; a HCV-1 NS5 régiójából származó epitop két azonos másolata, mindegyik a HCV pohprotein 2273-2313-as aminosavait tartalmazza; és a mag-régióból három epitop két kópiája; kettő a HCV-1-bői, és egy a HCV-2-bél, amely kópiák ekvivalens antigén determinánsok, amiket a HCV-1 9-53-as és 64-83-as aminosavai, valamint a HCV-2 67-84-es aminosavai

A 2. táblázat mutatja a ΜΕΡΑ 12 különböző epitopjainak az aminosav póridéit, a 7A-7P. ábrák alapján, A táblázat számozása a HCV-1 alapján történik {Choo és mtsai; Proceedings of the National Aeademy of Sciences» USA 38» 2451.-2455 (1991)). A MEFÁ 12 és 13,1 szintén tartalmazza az előzékben a ΜΕΡΑ 12ben specifikált általános képletet, a módosításokat a 3. és 4, táblázatban mutatjuk be.

ΜΕΡΑ 12 | méla as#

I 72-89 92-112

pel

MiWrtSVAVrt\«

ΓΪΪ3-143

I 146-392

I390-410 konszenzus |

E2 HVk 142 (384-410 _iIW~l4S7~JI ϊ

φφ * φ* «Αί «S-JS Λ· *· * *

Φ *» ΦΦΦ φ <· * Φ

X ,φ Φ ΧΦ Λ' Φ

395-44 Ϊ	Sphl	S-l-í	1689-1735	1
444-490	Kral	5-1-1	1689-1735	3
493-539	Clat	5-1-1	1689-1736	2
543-577	Aval	Cl 00	1901-1936	1
580-615	Xbal	NS5	2278-2313	.1
618-653	BgÖI	N85	2278-2313	1
654-741	Ncol	mag epitopok	9-53, R47L 64-88 67-84	1 1 2
742-829 .............................	Ball	mag 19-53, B47L	1 \| § λ \| 2 ........... .....................1
* A hSOD íe	aérje csonkítva van, oly mádon, hogy a a kimutatási

igatum, egy Ír a dályozzuk a kimutatásban használt k y kötődjenek a MEFÁ-hoz,

zett and-SÓD ellenanyag eimutatt, hogy megakaV mag elleni ellenanyago-

meía as#	5' vég helye	epitop	hév as#	törés
1-156	Ncol	mutált hSOD (70- 72-es ami- nosav, Alá!)
161-178	Miül	El	303-320	1
181-201	Hindii!	B2 HVRla konszenzus	390-410	1

U :

* ·?

ϊ.ϊ

202-232		E2 HVR1*2 konszenzus	334-414	1,2
235-45Ϊ		C33C rövid	121.1-1457	1
454-500	Hindin	5-1-1 PImut*	1639-1735	1
503-549	NrnI	5-1-1 PImuC	1639-1735	3
552-598	Clal	5-1-1 PImut*	1639-1735	2
601-636	Aval	C100	1901-1936	1
639-674	Xbal	NS5	2278-2313	1
677-712	Bg«l	NS5	2278-2313	1
713-806		mag epifcopok	9-53, R47L 64-38 67-34	1 1 2
601-383		mag epitopok	9-53, R47L 64-88 67-34	1 1 2

* Αζ 5-1-1 epitopok módosítva vannak, ezzel ehminálva a lehetséges hasítási helyeket (CS vagy CA), amiket az NS3/4a rekomhináns fehérje irányít. A CS vagy CA helyett a szekvencia ΡΙ-re van változtatva. Emellett a SÓD fehérje el van mu táltatva, oly módon, hogy a kimutató konjugátum, egy tonnaperoxidázzal jelzett antiSÓD ellenanyag nem kötődik a MEFA-hoz. A mag epitop is el van mulattatva, hogy megakadályozzuk, ho^ a kimutatásban használt HCV mag elleni ellenanyagok ne kötődjenek a MBFA-hoz.

Az egyik esszé formátumban a mintát kombináljuk a szilárd hordozóval, amint azt az alábbiakban ismertetjük. Ha a minta ♦ X Jí φ φ *· *

HCV-vei fertőzött, akkor mag antigének valamint a szobán forgó epitopok ellen a szilárd hordozón levő HCV ellenanyagok kötődnek a szilárd hordozó komponenseihez. Ezután egy kimutathatóan jelzett ellenanyagot adunk hozzá. A jelzett anti-mag ellenanyag egy másik epitop ellen irányul, nem az ellen az anti-mag ellenanyag ellen, ami a szilárd hordozóhoz kötődik. Ez az anti-mag ellenanyag kötődik a mag-antigénhez, amit a szilárd, hordozón levő anti-mag ellenanyagok befognak.

Egy antigént, ami reagál a biológiai mintában levő befogott HCV ellenanyaggal, amely befogott minta HCV ellenanyag reagál

nyösen egy epitop, ami a HCV poliprotein N83 régiójából származik. Ez az antigén megköti a mintában levő befogott HCV ellenanyagot, Számos antigén ismert, beleértve ezeket az epitopokat is, és beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat a c33e es ciuu re Khói származó antigéneket, valamint az egy NSS e iul a c25-öt tartalmazó fúziós fehérjét. Ezek és dk jól használhatók a jelen találmányban, jól ismertek a szakterületen és a szakirodalomban (Honghton és mtsai; 5,350,671 számú Amerikai Egyesült Allamok-heli szabadalmi leírás; Chien és mtsai; Froceedings of the National Academy of Sciences, USA 39, 10011-10015 (1992); Chien és mtsai; J. Gastroent. Hepatol. 8, S33-39 (1993); Chien és mtsai; WO 93/00365 számú nemzetközi szabadalmi leírás; Chien., D.YÚ WO 94/01773 számú nemzetközi szabadalmi leírás, és a 03/403,590 valamint 03/444,813 sorozatszámű Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás).

Egy második jelzett ellenanyagot is hozzáadunk, ami. az előzőkben ismertetett antigén ellen irányul. Ez az ellenanyag

X * χχ· « 'Χ'Χ

X X χ ΧΧ O»Ji irányulhat bármelyik, az antigénen levő epitop ellen. Például az ellenanyag irányulhat az antigénen levő NS3 régié ellen, Egy másik változat szerint, ha az előzékben említett antigén fúziós fehérje formában expresszálődik, akkor a második jelzett ellenanyag irányulhat a fúziós partner ellen. Az esszéhez további antigéné-

két és ellenanyagokat adhatunk hozzá, főleg akkor, ha a szilárd hordozó tartalmaz egy MBFA-t Ezeket, az esszé formátumokat az alábbiakban részletesen ismertetjük.

Egy jelen találmány szerinti reprezentatív esszét a. 2.. ábrán az az ábrán látható, a szilárd hordozó kát _ klonáhs ellenanyagot tartalmaz, ezek jelölése cll3 és cl 1-7. Ezek az ellenanyagok a magfehérfe N-terminális régiójában található epitop ellen irányulnak a 10-53-as aminosavaknál, amiket a HCV poliprotein szekvenciának megfelelően szilárd hordozó tartalmaz egy NS3/4& ellem epitoz_S*ai mintát hozzáadjuk a szilárd hordozóhoz. A HCV mag-antigén, valamint az NE3/4a epitop ellen irányuló ellenanyagok, amik mind jelen vannak a mintában, kötődnek a szilárd hordozón lövő befogó reagensekhez.

Ezután a HCVI poliprotein. szekvencia számozása szerint a mag 120- 130-as aminosav pozícióinál található mag C-termináHs régiója ellen irányuló cl 1-14, tormaperoxldászal (HRP) jelzett antí-mag monokkmáiis ellenanyagot adjuk hozzá. Ezután egy fúziós fehérjét adunk hozzá, ami a humán SÓD (hSODj egy szekvenciáját és a c33c régió egy epitopját tartalmazza, ugyanúgy, mint egy második HRP-jelzett ellenanyagot, ami a fúziós fehérje SÓD része ellen irányul. A SOD-c33c fúziós fehérje kötődik az anti-NS3 ellenmiyaghoz és az anti-SOD ellenanyaghos, ami

Φ* φ φ φ φ φ φφφφ

φ. φ φ φ φ

ΦΦ Φ Φ « φ

-φ ψ* * φ» φ -Φ ¥ φ

Φφ ¥ ΦΛ ΦΦ viszont köti a SOD~c33c fúziós fehérjét, A jelölés kimutatása a HCV fertőzés meglétére utak

A jelen találmány egy másik reprezentatív esszéjét a 8, ábrán mutatjuk be. Az ellenanyag esszé konfíguráeiö egy antigén-ellenanyag-antigén szendvics befogó esszé, ami mind a NS3/4a-t, mind a MBFA 12-t használja, A szilárd hordozó tartalmaz két, az előzőkben ismertetett, anti-mag monoklonális ellenanyagot, egy NS3/4& epitcpot, valamint egy reprezentatív MEFA-t, a MBFA 12-t, ami tartalmazza a humán szuperoxid-disznnxtáz csonkított verzióját, Ami az előzőkben ismertetett esszét illeti, a biológiai mintát hozzáadjuk a szilárd hordozóhoz, A HCV mag antigén, valamint a mintában jelen levő NS3/4a epitop és a MBFA epitopok ellen irányított ellenanyagok kötődnek a. szilárd hordozón levő befogó reagensekhez. Két antigént adunk hozzá, az egyik reagál azokkal, a mintában levő elle kötődnek az HS3/4a-hoz (az elődökben ismertetett másik pedig a MBFA 12-höz kötődé minta ellem reagál, A 3. ábrán a MBFA 12/minta ellenanyag komplexszel reagáló antigén egy fúziós termék egy szuperomd-diszmufáz molekula és a. c22ks A47-L44W között, A o22ks antigén a mag régióból származik, és tartalmasa a poliproteín Lysl0~Ser99-es aminosavait, valamint a a normális körülmények között jelen levő Arg47 ki van vágva belőle, és a 44-es pozícióban levő Len

Ap-re van m, Az ellenawág kimutatási m az előzőkben ismertetett második HFP-jelzett monoklonális antiAz előzőkben ismertetett antigén/ellenanyag kombinációs esszék különösen előnyösek, mivel mint a HCA mag-antigén, mind az HS3/4a és/vagy a mag elleni ellenanyagnk Idmutathaφ * φ φφ. φ φ « $ φ » ♦ < »♦♦.

Φ Φ φ φ φΐ χ. « X φ **Φ Φ φφί.φ ΦΦ Φ4 esszék esszék' tők ugyanazzal a hordozóval, ugyanabban az esszében. Emellett, az előzőkben ismertetett módon, további HCV epitopok, azaz például a elöö, az 5-1-1, az NS5, valamint a poiiprotein rnag-régiőjában egy finmeshift~hől származó fehéxje (amit például a. WO számú nemzetközi szabadalmi leírásban ismertetnek) ó a kombinációs koktélban, a HCV nem-strukturális szere.

*, hogy jobban megértsük a találmányt, az alábbiakm tárgyaljuk a jelen találmány ezerinti immimaeználandő ellenanyagok előállítását; az immunnassnaiancto előállítását; valamint az ímhasznál

munesszék végrehajtásán^

ÁjjCy

Amint azt az előzőkben : ellenanyagok előállítása

ztuR, az összeses aon., amik a szilárd kötődnek (azaz például egy vagy több antá-mag ellenanyagot), amik kimutatják az aniágén/eHenanyag komplexeket, ha a mintában HCV fertőzés van. Ezek az ellenanyagok lehetnek poliklonális vagy monoklonálís ellenanyag készítmények, munospeoifíkus antiszérumok, humán ellenanyagok, vagy lehetnek hibrid, vagy kiméra ellenanyag, azaz például humanizált ellenanyagok, megváltoztatott ellenanyagok, F(abj2 fragmensék, F(ab) fragmenzek, .í.s.«.^us.^mek, egyaoraenes ellenanyagok, dimer vagy tréner ellenanyag íragmens konstrukciók, mini ellenanyagok, vagy ezek funkcionális iragmenzeí, amik megkötik a szóban forgó antigént

Áz ellenanyagokat a szakterületen jártas szakember számára jől ismert mádon állítjuk elő (lásd például a 4,011,308;

4S

4,722,890; 4,016,043, 3,876,504; 3,770,380 és 4,372,745 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásokat). A poliklonális ellenanyagokat például ügy álb'tjuk elő, hogy egy megfelelő állatot, azaz például egy egeret, nyalat, birkát vagy kecskét egy számunkra érdekes antigénnel immunizálunk. Ahhoz, hogy az immunogenitást fokozzuk, az immunizálás előtt az antigén köthető a hordozóhoz. . Az ilyen hordozók jól ismertek a szakterületen jártas szakember számára. Az immunizálást előnyösen ügy hajijuk végre, hogy az antigént sóoldatban összekeverjük vagy emulgeáljuk, előnyösen egy Freund féle komplett adjuvánsban, majd a keveréket vagy emulziót parenterálisan (alternatíva szubkuián vagy vagy intramuszkulárisan) injekciózzuk. Az állatnak általában 2-6 héttel később újabb, erősítő injekciót adunk be az antigén sóoldatából, előnyösen Freund féle nem-komplett adjuvánst használva. Az ellenanyagokat előállíthatjuk in vám immunizálással, a szakterületen jól ismert módszerek használatával. Az immunizált állatból azután ki lehet nyerni a poliklonális antiszérumot (az anti-HCV poliklonális ellenanyagok leírását lásd; Houghton és mtsaii 5,350,671 számú Amerikai Egyesült Államok-belí szabadalmi leírás).

A monoklonális ellenanyagokat általában Kohlét és Müstein módszerével, vagy annak módosításával állítjuk elő [Kohlét és Müstein: Natúré 256. 495-497 (1975)). Tipikus esetben egy egeret vagy egy patkányt immunizálunk az előzőkben ismertetett módon. Azonban. ahelyett, hogy az állatot elvéreztetnénk a szérum kivonásához, a lépet (és adott, esetben számos nyirokcsomót) eltávolügük, és egysejtes szus^enziót készítünk belőle. Ha szükséges, akkor a lépsejtek átvizsgálhatok (az aspedfíkusan tapadó sejtek eltávolítása után), elv módon, hogy a sejtszuszpenziót az

4§

5i « * XX' ** ¢. $ * > χ <·?<·>« Κ X » 5ί **í «> «£·„. 4$ί· 'W antigénnel borított lemezre vagy lukba visszük. A B-sejtek, amik az antigénre specifikus, membránhoz kötött immunglobulint exp~ resszálják, kötődnek a lemezhez, éa nem mosódnak le a szuszpenzió többi részévet A kapott B~sejte.ket, vagy az összes disszociált lépsejtet azután mielőma sejtekkel fűzionáltatjuk, hogy hibrídőmákat képezzenek, maid egy szelektív táptalajban (azaz például b mn.

kptalajbt ie~ nv észtjük, A kapott hibridómákat azután határhigitásaal szólesztjük, és vizsgáljuk, hogy tormelnek-e olyan ellenanyagokat, amik specifikusan kötődnek az immunizáló antigénhez (és amik nem kötődnek a nem-rokon antigénekhez), A kiválasztott monoklonális ellenanyagot, szekretálő hibridómákat azután vagy in, ritro tenyésztjük (azaz például szövettenyésztő palackokban vagy hollow fiber reaktorokban), vagy in. rtoo (azaz például egerek aszciteszeiben).

A különböző antí-HCV monoklonátis ellenanyagok előállítását leírták a szakirodalomban (Houghton és mtsai: 5,350,671 számú .Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; Chien és mtsai: 93/00365 számú nemsetkősi szabadalmi. leírás;

és a 08/444,818 sorozattómű Amerikai Egyesült szabadalmi leírás; Kashiwakuma és mtsai: 5,871,904 számú .Amerikai Egyesük Államok-hetí szabadalmi leírás].

Amint az az előzőkben elmagyaráztuk, azokt az ellenanyag fragmenaeket, amik megtartják azt a képességüket, hogy felismerik a számunkra érdekes antigént, azintén felhasmálhatiuk a szobán forgó immunesszékben. Számos különböző ellenanyag fragmens Ismert a, szakterületen, amik olyan antigén,kötő hetyemaznak, amik képesek egy intakt ellenanyag molekula s * kötési tulajdonságait mutatni. Például funkcionális ellenanyag íragmenseket úgy állíthatunk elé, hogy egy konstans régiót, ami nem felelős az antigén-kötésért, például pepsdnnel kivágunk az ellenanyag molekulából, ezzel előállítva a P(ab'h fragmenseket. Ezek a frogmensek két antigénkötő helyet tartalmaznak, de hiányaik belőlük az egyes nehéz láncok konstans régiója, Hasonlóképpen, ha szükséges, akkor az egyetlen antlgénkotö helyet tartalmazó Pab fragmensek is előállíthatők, például a poliklonálís vagy monokionáíis ellenanyagok papainnal való emésztésével. Funkcionális fragmensek, amik a nehéz láncoknak és a könnyű láncoknak csak a variábilis régióit tartalmazzák, szintén előállíthatok standard technikákkal, azaz például rekombináns előállítási ^el y&gy az

F_v néven ismertek (lásd ínhar és mtsai: Froceedings cf the National Academy of Sciences.

265Í lg Hochmsn és mtsai: 2706-2710 (19761: Ehrlich és mtsai:

Egy egyláncú Fv UsPrt vagy „sePv*) polipeptid egy kovalens összekötött Vh-Vl heterodimer, ami egy olyan génfüzioről expreaszálódík, ami tartalmaz Va-t és Vt-t .kódoló gént, amiket a pepiidet kódoló ünker kapcsol össze (Muston és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 85. 58795883 (1988)]. Számos mád szert, írtak le, amikkel egy V ellenanyag régió természetesen aggregálodott, de kémiailag elválasztott, könnyű- és nehéz lánc polipeptid láncait észre lehet venni és ki lehet fejleszteni egy sFV molekulává, ami olyan háremeimenziős struktúrává tekeredik, ami hasonlít az antigénkötő hely struktúrájára (lásd például az 5,091,51.3, 5,132,405 éa

A S A .**» * ** távolságot,

4,946,773 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírást). Az sFv molekulát a szakterületen publikált módszerek használatával lehet leírni [Muston, és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, VSA 35, 5879-5833 (1968); 5,091,513, 5,132,405 és 4,946,778 számú Amerikai Egyesült amok-beli szabadalmi leírási. A tervezési kritériumok közé tark a meghatározása., ami lefedi az egyik lánc C-fermináiisa és a. másik lánc N-terminálisa közötti a línker általában kis hidrofil aminosav csoporc nem hajlamosak arra, hogy burkot vagy szekunder struktúrát képezzenek. Ezek a módszereket a szakirodalomban publikálták (lásd például az 5,091,513, 5,132,405 és 4,946,778 számú Amerikai B^yesült ÁBamok-beli szabadalmi leírást). A megfeleld linkerek általában alternáló glicin és szerin csoportokból állnak, és ezek közé beszúrva glutaminsav és lizin csoportokat is tartalmazhatnak, az oldhatóság fokozására.

„yagok* vagy pnmitestek*’ szintén használha-

láncok amik a C-terminálisukon oHgomerizádős doméneket tartalmasnak, amiket az sFv-től egy csukló-régid választ el [Pack és mtsai: Biochemisfry 31» 1579-1584 (1992)). Az ohgomerizáciős dómén tartalmaz önmagával asszodálodó α-hélixeket, azaz például lencin cippzárakat, amik tovább stabilizalhatök újabb diszuhid hidak hozzáadásával. Az olígomerízádós doméneket úgy tervezzük meg, hogy kompatíbilisek legyenek a membránon keresztül történő vektoriáiis tekeredéssel, ami egy olyan eljárás, ami megkönnyíti a pelipepüd in fenő tekeredését egy funkcionális kötő-fehérévé. A minitesteket általában a szakterületen jól ismert rekorobináns módszerekkel állítják elő [Pack és mtsai:

Biochemistry 31., 1579-1584 (1992); Cumber és mtsai: J. of Immunok 149B, 120-126 (1992)].

A HCV immunesszékben használható antigének előállítása Amint azt az előzőkben elmagyaráztuk, a jelen találmány szerinti molekulákat általában rekombináns módszerekkel állítják elő, tehát a jelen találmányban használandó HCV antigéneket kódoló polinukleotidokat a molekuláris biológia standard technikáival lehet előállítani. Például az előzőkben ismertetett, molekulákat kódoló poliiiukleotíd szekvenciákat rekombináns módszerekkel, azaz például cDNS és genomiális könyvtárak átvizsgálásával lehet előállítani, a gént expresszáiő sejtekből, vagy a gént egy olyan vektorból állítva elő, amiről ismert, hogy tartalmazza a gént. Emellett a kívánt gént közvetlenül izolálhatjuk virális nukleinsav molekulákból, a szakterületen ismertetett technikák használatával (Houghton és mtsai: 5,350,671 számú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírás]. A számunkra érdekes gén előállítható szintetikusan is, ahelyett hogy klónoznánk. A molekulákat, a szóban forgó szekvenciának megfelelő kodonokkal tervezhetjük meg. A komplett szekvenciát standard módszerekkel előállított átfedő oligonukleotidokból állítjuk össze, majd ezekből egy komplett kódoló szekvenciát állítunk elő (Edge: Natúré 292, 756 (1981); Nambair és mtsai: Science 223, 1299 (1984); J'ay és mtsai: Journal of Bíological Chemistry 259, 6311 (1984)].

Tehát egy adott nukleotíd szekvencia előállítható olyan vektorokból, amik hordozzák a kívánt szekvenciákat, illetve teljesen vagy részben meg is szintetizálhatjuk, a szakterületen ismert különböző szintézis-technikák alkalmazásával, azaz például helySS

Φ φ « Φ > ♦ X

X * Φ > < X * φ ν φ φ φ φ φ φ φ φ φ

Φ Φ X φ φ Φ φ X φ

Φ Φ X Φ * Φ φ Φ φ X φ .pecífikus mufagenczisael és polimeráz láncreakció (POR) technikával, mikor melyik alkalmas (Sambrook és mtsai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2. kiadás, Cold Spring Harbor szekvenciákat kódoló nukleotid szekvenciák elállításának egyik módszere az, ha a hagyományos, automatizált pclmukleotid szintetizátorban előállított átfedő szmletíkus oligonukleotidok komplementer szettjét egymáshoz illesztjük, ezt követi egy megfelelő DNS ügázzat való ligálás, ós a ligáit nukleotid szekvencia polimeráz láncreakcióval való amplifikálása payaraman és mtsai; Preccedings of the National Academy of Sciences, USA 83, 40844088 (1991)). Emellett a találmány szerint ollgonnkleotiddal vezérelt szintézis (Jones és mtsai: Natúré 54, 75-82 (1986)(, egy már létező nukleotid régié oügonukleotiddal vezérelt mutagenezise (Riechmann és mtsai: Natúré 332, 323-327 (1988); Verhoeyen és mtsai: Science 239, 1534-1536 (1988)1 és a sza mazo ohgc

srazzai vaxo enzimes feltőltése ÍQueen és mtsai: Proceedíngz of t

&’· of Sciences, USA 36, 10029-10033 (1989)) haaználható olyan íkulák előállítására, amiknek megváltoztak az antigénkötő óságai es/vagy csökkent az imrrmnogenitáza.

Ha egyszer a kódoló szekvenciákat már előállítottuk, vagy .k, ezeket a szekvenciákat egy megfelelő vektorba vagy i klónozhatjuk. Számos klőnozo vektor ismert a szaktejártas szakember számára, és a megfelelő klónozó vektor kiválasztása, a szakemberre van bízva. A megfelelő vektorok közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a plazmidok, fágok, transzpozonok, kozmidok, kromoszómák vagy viru54 sok, amik képesek replikálódni, ha megfelelő kontroll elemekhez kötődnek.

A kődolé szekvenciát azután megfelelő kontroll szekvenciák vezérlése alá helyezzük, az expressziére használt rendszertől függően. Tehát a kódoló szekvenciát egy promoter, rihoszómális kötőhely (a bakteriális expresszióhoz) vezérlése alá helyezzük, majd adott esetben egy operátort kapcsolunk hozzá, oly módon, hogy a számunkra érdekes DNS szekvencia egy megfelelő transzformánsban RNS-sé íródik át A kódoló szekvencia vagy tartalmaz szignálpeptidet vagy vezérszekvenciát, vagy nem, amit azután a gazdaszervezet eltávolít a poszt-transzládös folyamatokban (lásd például a 4,431,739; 4,425,437; 4,338,397 számú Amerikai Egyesölt Államok-beü szabadalmi leírás).

A kontroll szekvenciák mellett, kívánatos lehet, hogy olyan, szabályozó-szekvenciákat adjunk hozzá, ami lehetővé teszi a szekvenciáknak a gazdasejt expressziójához viszonyított expresszíójái. A szabályozó-szekvenciák ismertek a szakterületen, jártas szakember számára, és a példák közé tartoznak azok is, amik a ki- vagy bekapcsolandó gén expresszióját okozzák, kémiai vagy fizikai stímulusokra adott válaszként, beleértve egy szabályozó vegyület jelenlétét. A szabályozó elemek más típusai és jelen lehetnek a vektorban. Például a fokozó elemeket használhatjuk arra is, hogy fokozzák a konstrukciók expressziőjának a szintjét. A példák közé tartozik az SV40 gén korai (okozója (Dijkema és mtsai; EMBO Journal 4, 761 (1985)), a Rous szarkóma vírus hosszú terminális ismétlődésének (LTR) fokozója/promotere (Gorman és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 79, 6777 (1982)), valamim a humán citomegalovírusből származó elemek pBoshart és mtsai; Cell 41, 521 > *

X· >

XX· X * φ < X « « * x·** ** (1985)], azaz a dtomegalovírus A intron szekvenciájában levő elemek (5,688,688 számú Amerikai Egyesült Allamok-heli szabadakéi leírás). Az expressziős kazetta tartalmazhat még egy replikációs origót is, egy megfelelő gazdasejtben való autonóm replikádéhoz, egy vagy több szelekciós markert, egy vagy több restrikciós hasítási helyet, a magas kőpiaszámra valő képességet, és egy erős promotert.

Egy expressziős vektort úgy állítunk össze, hogy a szóban forgó kódoló szekvencia a vektorban a megfelelő szabályozó-szekvenciákkal együtt található, a kódoló szekvencia pozíciója és orientációja a kontroll szekvenciákhoz viszonyítva olyan, hogy a kódoló szekvencia átíródik a kontroll szekvenciák „vezérletével* (azaz a DNS molekulához a kontroll szekvenciáknál kőtődő RNS polimeráz átírja a kódoló szekvenciát), A számunkra érdekes molekulát kódoló szekvenciák módosítása kívánatos lehet, hogy elérjük ezt a célt. Például néhány esetben szükséges lehet, hogy úgy módosítsuk a szekvenciát, hogy a megfelelő orientációban kapcsolódjon a kontroll szekvenciákhoz, azaz hogy megtartsa a leolvasási keretet. A kontroll szekvenciák és más szabályozószekvenciák a vektorba való beépítés előtt Hgálhatök a kódoló szekvenciához. Egy másik változat szerint a kódoló szekvencia közvetlenül egy olyan expressdőa vektorba klónozható, ami már tartalmazza a kódoló szekvenciákat, és egy megfelelő restrikciós hasítási helyet.

Amint azt az előzőkben elmagyaráztuk, az ís kívánatos lehet, hogy előállítsuk a számunkra érdekes antigén, mutánsait vagy analógjait Ez különösen igaz az NS3/4a~ra. Az ennek végrehatásihoz szükséges módszereket már publikálták a szakirodalomban [Pasmahapatra és mtsai: 5,843,752 számú Amerikai * * * φ φ * ♦ Φ φ X Φ X ΧΦ φ

X X Φ Φ ** ΦΦΦ « Χ.ΦΦΦ Φ Φ φ φ

Φ * * χ Φ Φ Φ Φφ Φ X

Egyesült Állatnok-hefi szabadalmi leírás; Zhang és mtsai; 5,990,276 számú Amerikai Egyesült Államok-beH szabadalmi leírás)« Ennek és más HCV fehérjéknek a szóban forgó esszékben való felhasználás céljából készített mutánsait vagy analógjait előállíthatjuk a számunkra érdekes polipeptídef kódoló szekvencia egy részének kivágásával, egy szekvenciának a beszúrásával, és/ vagy a szekvenciában egy vagy több nukleotidnak a helyettesítésével. A szakterületen jártas szakember számára a. nukleotid szekvenciák módosításának technikái, azaz például a helyspecifikus mutagcnezis jól ismertek (Ssmhrook és mtsai: Molecular Cloning; A Laboratory Manna!; 2. kiadás, Cold Spring Karbor Press, Cold Spring Harbor, ΝΎ. (1989); Kunkel, T.A„; Proeeedíngo of the National Academy of Sciences, USA 82. 448 (1985); Gersselsöder és mtsai; BioTechniques 5, 786 (1987); Zeller and Smith: Methods in. Enzymology 100, 468 (1983); DalbieMcFarland és mtsai: Proeeedings of the National Academy of Sciences, VSA 79, 6409 (1982)].

A molekulák számos különböző rendszerben expresszáltathatók, beleértve a rovar, emlős, bakteriális, vitális és élesztő expressziős rendszereket, amint az a szakterületen jól ismert.

Féldául a rovarsejt expresszié® rendszerek, azaz például a bakulovírus rendszerek ismertek a szakterületen jártas szakember számára, és a szakirodalomban publikálták (Summers és Smith; Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987)). Hasonlóképpen, a bakteriális és emlős sejt expressziős rendszerek ismertek a szakterületen, és a szakirodalomban publikálták fSambrook és mtsai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2. kiadás, Cold Spring Hatbor Press, Cold Spring Harbor, N.V. (1989)], Az élesztő expressziős rendszerek is ismer57 lek a szakterületen, és a szakirodalomban publikálták (Teást Genetic Engineering, szerk.: Bárt és munkatársai, Buttenvorths, London (1989)).

A fenti rendszerben való alkalmazás céljára számos megfelelő gazdasejt ismert. Például az emlős sejtvonalak ismertek a szakirodalomban, és ide tartoznak az őrökéletüvé tett. sejtvos Collection-töl (ATCCl k, amik. az Amencan L. szerezhetők be, ilyen például az aranyhőrcsög petefészek sejt (CHO), a HeLa sejt, a bébihörcsög vesesejt (SHK), a majomvese sejt (COS), a humán embrionális vesesejt, a humán hepatocelluláris karcmömasejtek (azaz például a Hep G2), a Madin-Barby szarvasmarha vesesejt valamint más sejtek. Hasonlóképpen a bakteriális gazdaszervezetek, azaz például az Bsekarichia eoS, a Baed&m sahh'ks, és a tkmptoeneeas spp, szintén használhatók, a jelen találmány szerinti konstrukciókban. A jelen találmányban jól használható élesztő gazdaszervezetek közé tartozik, többek kozott, a Saoehurompees eerems&xe, a Candida ölbicons, a Candáia makoso, a Jfonsemda jxdgvnotphn, a Mupwmmpees /fupáis, a Aint/rnroetgees lachs, a Piehia ptháennondn, a Padka pástom, a Sctózosaochömmpoes pomhe és a Farrowin ápoh/dea> A bakulovírus expresszios vektorokban való használatra alkalmas rovarsejtek közé tartozik, többek, között Áedes aepppti, az Aufographa ea^forniea, a Bomfegx móri, a Ikosophda mnlanopasfer, a Apodopfem jtugipenáa és BteAcphmia n£

A számunkra érdekes nukleoüd szekvenciákat tartalmazó nukleinsav molekulák stabilan integrálódhatnak egy gazdasejt genomjába, vagy stabilan fennmaradhatnak egy stabil episzomális elemen egy megfelelő gazdasejtben, a szakterületen ismert, kaφ φ JÍ φ φ φ«

Φ φ χ φφφ φ Φ φ

Φ Φ.Φ φ X* ΦΦΦ

Φ Φ Φ X Φ Φ Φ Φ Φ ionbozö gen-b .ummhi technikák alkalmazásával (lásd pék az 5,399,346 számú Amerikai Egyesült Államok-belí szabadalmi leírást).

A kiválasztott expresszíós rendszertől és gazdaszervezettől függően a molekulákat növekvő gazdasejtek termelik - amiket egy előzőkben, ismertetett expressriős vektorral transzformáltunk - olyan körülmények között, amely körülmények között a fehérje expresszálődik. Az expresszált fehérjét azután izoláljuk a gazdasejtekből és tisztítjuk. Ha az expressziős rendszer egy szaporító táptalajba szekretálja a fehérjét, akkor a tennék közvetlenül a táptalajból tisztítható. Ha nem szekretálja, akkor közvetlenül a sejtlizátumokből tisztítható. A megfelelő szaporítási körülmények és kinyerési módszerek a szakterületen jártas .szakember ismereteihez tartoznak.

A különböző HCV antigének rekombináns technikával való előállítását a szakirodalomban publikálták (Houghton és mtsai: 5,350,671 számú Amerikai Egyesült Áíiamok-beli szabadalmi leírás; Chien és mtsai: J. Gastroent. Hepatol. 3, S33-39 (1993); Chien és mtsai: 94/01778 számú nemzetközi szabadalmi leírás; Chien, D.Y.: Wö 94/01773 számú nemzetközi szabadalmi leírás).

uunmagnoazükai esszék Ha egyszer már előállítottuk, akkor a fenti an nyagokat és az HS3/4a antigéneket egy megfeleld szilárd hordozóra visszük, hogy a szóban forgó immunesszékben használjuk. Bgy szilárd hordozó, a jelen találmány céljaira lehet bármilyen anyag, ami egy oldhatatlan mátrix, és lehet merev vagy félígmerev felszíne. A szilárd hordozók közé tartoznak például, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az olyan szubsztrátok,

5§ φ* ♦

Φ· Φ 'Φ <-χ· φ φ. φ φ> φ

Φ φ φ Φ Φ ν

Φ Φ- Φ χ

Φ Φ Φ *Χ φ φ mint például a nitroeellulóz (membrán vagy mikrotiter luk formában); a polívintlklorid (azaz például lemezek vagy mikrotiter lukak); poliaztírol latez (azaz például gyöngyök vagy mikrotiter lemezek); polivioílíden fluorid; diazotbált papír; nylon membránok; aktivált gyöngyök; mágnesesen reagáló gyöngyök és hasonlók. A szóban forgó hordozók lehetnek lemezek, szemesék, korongok, kapillárisok, hollow fiber-ek, tök, szilárd szálak, cellulóz gyöngyök, porózus üveg gyöngyök, srilikagélek, polisztírol gyöngyök, adott esetben divmilbenzollal keresztkötéseket kialakítva benne, graftolt ko-polí gyöngyök, poliakrilamid gyöngyök, latex győnloiloriléndiaminnel keresztkőtéseket kialakítva benne, és üvegreszecskák, egy hidrofób polimerrel bevonva.

Ha szükséges, akkor a szilárd hordozóhoz kötendő molekulákat könnyen funkcionalízálhafjuk, hogy szurok vagy akrilát. egységeket hozzunk, létre, ezzel lehetővé téve a molekulák, beépíFi vagy más polimerekbe, azaz pél~

atoa, rn tm.Oazo.iOa, politiofénhe, políéterregbe, szihkagélbe, azüoaánba, polifosz(élbe, asarózba, cellulózba és hasonlókba.

reagál a HCV and-mag eUenanyagokkaí és az NS3/4&

(a továbbiakban ezeket együttesen „szilárd fázis nek* nevezik), és adott esetben egy vagy több MBFA-val, meglel lő körülmények között, amik lehetővé teszik a molekulák számára, hogy megfelelően immobilizálódjanak a hordozóhoz. A hordozóhoz való immobilízádö néha lakozható, ha először az anti* * χ· ·>

«· * « xx· χ * ❖ ί ¥ « * > <·<·>

* *.$«♦ > « « * > <>> Α<* X_sv gént és/vagy az ellenanyagot egy olyan fehérjéhez kapcsoljuk, ami jobb szilárd fázís-kőtö tulajdonságokkal rendelkezik. Á megfelelő kapcsoló fehérjék közé tartoznak például, anélkül, hegy ezekre korlátoznánk magunkat, a makromolekulák, azaz például a szérum-albumiuok, beleértve a szarvasmarha azérum-albummt (BSA), a fürókagylő hemodanint, az immungiobnlín molekulákat, a tireglobulint, az evalbumint és más, a szakterületen jártas szakember számára jól ismert fehérjéket. Más, a molekuláknak a hordozóhoz való kapcsolására használt reagensek lehetnek például a poliszacharidok, a pohtejsavak, a pohglikolsavak, a polimer aminosavak, az aminosav kopoMmerek és hasonlók. Ezeknek az antigénekhez való kötésére használható moleés .módszerek jól ismertek a szakterületen jártas szakember számára [Brinkley, M.A.: Bloconjugate Chem. 3, 2-13 (1992);

Hashida és mtsai: J. Appl. Biochem. 6, 56-63 (1934); Anjaneyulu és Stores; International Journal of Protein and Peptide Research 30, 117-124 (1987)).

Miután a szilárd hordozót reagáltattuk a szilárd fázis komponenseivel, mosással minden nem-munobitizálf szilárd fázisú komponenst eltávolítunk a hordozóról, majd a hordozóhoz kötött komponenseket megfelelő kötési körülmények között érintkezésbe hozzuk a biológiai mintával, amiről feltételezzük, hogy HCV ellenanyagokat és antigéneket tartalmaz (ezeket a továbbiakban összefoglalóan Jigandum molekuláknak* nevezzük). A mosás után, amivel eltávolítjuk az összes meg-nem-kötött lígandum molekulát, egy második anti-mag ellenanyagot adunk a rendszerhez, ami megfelelő kötési körülmények között nem a hordozóhoz kötött anh-ntag ellenanyag, hanem egy másik epitop ellen irányul. A hozzáadott anti-mag antigén tartalmaz egy tóműsí * Φ ¢. Φ A fcw.

• * Φ * * A Φ $ # A A A A *AA * «ΦΦ χ. χ. *, φ * Α X * Α .φ ΑΑ A Α tathatő jelölést, az előzőkben ismerteteti módon, és úgy hat, hogy minden mag-andgénhez kötődik, ami jelen lehet a mintában , ami reagált a hordozóhoz kötött anti-mag ellenanyaggal. Emellett egy vagy több antigént is adunk a rendszerhez, ami képes reagálni a mintában leve ellenanyagokkai, amik viszont az NS3/4a epitoppal reagálnak. Amint azt az előzőkben elmagyaráztuk, az tipikus esetben a HCV poliprotein N83 résdóiából származik, leginkább a HCV c33c régiójából (Houghton és mtsai: 5,350,671 számú Amerikai Egyesült Áilamok-beli szabadalmi leírás; Chien és mtsai: Froceedmgs of the National Academy of Sciences, USA 89, 1001.1-100X5 (1992); Chien és mtsai: 93/00365 számú nemzetközi szabadalmi leírás; és a 08/403,590 és a 08/444,818 sorozatszámű Amerikai Egyesült Allamok-belt szabadalmi leírás, ennek a régiónak és az ezekből származó epitopoknak a leírására). Egy ez ellen az antigén ellen irányuló jelzett, ellenanyagot is hozzáadunk. Az ellenanyag ezért megköti az antigént, ami reagált a mintában levő anti-NSS ellenanyagokkal. Erre a célra a e33c yományos módon biztosíthatjuk, a c33e és a humán sromd-diszmutáz fhSÖD) közötti fúzióval, amit rekombináns módszerekkel lehet elöállitani (lásd például Honghton és mtsai;

5,350,671 számú Amerikai Egy esőit Allamok-beli szabadalmi leírás]. A humán szuperomd-diszmutáz nukleotid- éa aminosav szekvenciája ismert (lásd; Hallewell és mtsai: 5,710,033 számú Amerikai Egyesült Államok-belí szabadalmi leírás]. A humán szuperozld-diszmutáz elleni jelzett ellenanyag tehát használható arra, hogy kimutassuk az NS3/4a epitop, bánnilyen a mintában levő, ezzel az epitoppal reagáló ellenanyag, és HCV polipeptidek között kialakuló komplexeket, amik viszont megkötik a mintában levő ellenanyagot.

Ha egy ΜΕΡΑ egy szilárd hordozón van, akkor egy vagy több további antigént, amik képezek reagálni a biológiai mintában levő ellenanyagokkal, amik a MEFA-n levő antigénekhez vannak kötve, szintén hozzáadhatunk az esszéhez. Ebből a szempontból különösen jól használható egy olyan antigén, ami a HCV mag-régiójából származik, pontosabban a e22 antigénből, ami. tartalmazza a HCV poliprotein 119 N-terminális mag aminosavait A c22-ből származó egyik antigén a c22ks A47-L44W, ami tartalmazza a poliprotein Lyslö-Ser99 aminosavait, valamint a normális körülmények kozott jelenlevő Arg47 ki van vágva, és a 44-es pozícióban Trp helyett len. van. Ami az előzőkben ismertetett c33c epitopot illeti, ez az antigén egy hSOD fúzió formájában biztosítható, és ugyanazt a humán szuperoadd-diszmutáz elleni jelzett ellenanyagot lehet használni a mintában levő ellenanyagok valamint az NS3/4a epitop és/vagy a ΜΕΡΑ között képződő komplenek kimutatására, amely komplexek kötődnek a HCV antigáneichez is (azaz például a o33c és e22).

Pontosabban, egy BUSA módszer használható, amiben egy mikrotiter lemez lukait a szilárd fázisú komponenssel vonjuk be. Ezután egy biológiai mintát adunk a bevont Inkákhoz, ami tartalmaz, vagy feltehetően tartalmas Ugandám molekulákat. Annyi inkubálási idő után, ami elég ahhoz, hogy a hgandum-molekulák kötődjenek az immobilizált szilárd hordozóhoz, a lemez(ek) lemoshatok, hogy eltávoMtsuk a megkőtetlon egységeket, és egy .kimutathatóan jelzett szekunder ellenanyag molekulát (jelzett antimag ellenanyag), valamint egy NS3 epitopot tartalmazó molekulát és e©r, az N83 epitopot tartalmazó molekula, elleni ellenanyagot adunk a rendazerbez. Hagyjuk, hogy ezek a molekulák reagáljanak bármelyik befogó antigénnel és ellenanyaggal, a lemezt mos63 «·* *·«' suk, és a jelzett ellenanyagokat kimutatjuk, a szakterületen jól ismert módszerek alkalmazásával

Az előzőkben ismertetett esszé-reagensek, beleértve az immunesszé szilárd hordozót a megkötött ellenanyagokkal és antigénekkel, valamint azokat az ellenanyagokat és antigéneket, amik a befogott mintával reagálnak, kittekben biztosíthatók, megfelelő utasításokkal és más szükséges reagensekkel, azzal a céllal, hogy az előzőkben ismertetett immunesszét elvégezzük. A kit tartalmazhat, a kiválasztott immunesszétől függően, megfelelő jelöléseket és más pakolt reagenseket és anyagokat (azaz például mosó puífereket és hasonlókat) is. A standard inxmnnesszák, azaz például az előzőkben ismertetettek, ezeknek a kitteknek a használatával végrehajthatok..

fiLJÖiérfetireaz

Az aiaoőiaanan a leien íus m :am moniaira ae sak illusztráció éldák bármilyen mó

.«jussnak specm példákat. A példáka , es nem szár átozzák a jelen találmány oltalmi mennyiségek, hőmérsékletek, stb.) pontoeságát biztosítsuk, de áriét! hibák: és eltérések természetesen elöl immuné r? / elier

A jelen találmány szerinti HCV antigén/ellenanyag kombinációs immunesszét más HCV esszékkel hasonlítjuk össze, hogy a azero&onverziő kimutatási korlátáit, és ezeket a $ * V Φ* *·>

** * ¥* ¥ * φ $ ¥ ¥ Φ Φ ** ΦΦφ.

·¥ **ΦΦ «· φ * Φ <·'.. -Λ Φ.ΦΦ φφ φφ korlátokat más, kereskedelmi forgalomban levő esszé korlátáival összehasonlítsuk, az alábbiak szerint.

A„ Anyagok, es módszerek

Vérminták

A kereskedelmi ibrgalamban levő humán vérminták paneljeit használtuk. Az ilyen panelek például az alábbi cégektől szerezhetők be: Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater, MA (BBl); Bioclinical Fartners, Prarddin, MA (BCF); és North American Biologics, Inc.» BoeoRatan, FL (NABl). Az 5. és ő. táblázatban bemutatott napok azok a napok, amiken a vért az ktől levesf”^^s'

Mpn.okionáils.ellenanyagek

A cl 1-3, cl 1-7 és cl 1-14 monoklonális ellenanyagokat az

Ckraeál nntan, New Jersey) szereztük he.

A cl 1-3 és cl 1-7 ellenmiyagok a mag N-terminálís része (a HCV1 pali protein számozása szerint a 10-53 -as aminosuvak) ellen irányulnak. A cl 1-4 monoklonális ellenanyag a mag Ó-terminálisa, ellen irányi-ű (a HCV1 poliprotein számozása szerint a 120-130as aminosavak). A el 1-4 ellenanyagot standard eljárásokkal tormaperosddázhoz konjugáltatjuk.

Az 5A-3 monoklonálís ellenanyag egy anti-szuperozid-diszmutáz ellenanyag, ami a s.eoperoaid-dim'nnW, l -65-ös aminosavai ellen irányul, és standard technikákkal állítható elő. Az ellenanyagot a tormaperoridázhoz az alábbiakban ismertetett mádon konjugáltatjuk.

ίί -«ΧΦ ő5

A c33c antigént (266 aminosav, a HCV poliproteín 11921457-es amínosavai) belső szuperoxíd-diszmutáz fúziós fehérje formájában expresszáltatjuk Eschchchóv colóban az 5-1-1 antigén szintézisére ismertetett módszerek használatával [Choo és mtsai: Science 244, 359-362 (1989)], A rekombináns antigén tisztítását Chien és munkatársai ismertették [Chien és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 89, 10011-10015 (1989)]. A SOD-c33c előállítási protokollját lásd; Houghton és mtsai.: 5,350,671 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás.

Az esszében használt NS3/4a epitop egy konformációs epitop, aminek a szekvenciáját a 3. ábrán mutatjuk be.

C. .Immunesszé formák

Az Abbott PRISM esszé (Abbott Laboratories, Abbott Park, l'L) kereskedelmi forgalomban van, és egy ellenanyag alapú kimutatási esszé. Az esszét a gyártó utasításai szerint végeztük el,

Az ORTHO HCV 3.0 verziószámú ELISA Test System (a továbbiakban Ortho 3.0 esszé néven említjük, Ortho Clínícal Diagnostics, Raritan, New Jersey) egy ellenanyag alapú kimutatási esszé. Az esszé a gyártó utasításai szerint hajtjuk végre,

A Roehe Amplicor esszé (Roche, Pleasant, CA) egy kereskedelmi forgalomban levő polimeráz láncreakció alapú esszé. Az esszét a. gyártó utasításai szerint hajtjuk végre,

A Gen-Probe TMA esszé (San Diego, CA) egy kereskedelmi forgalomban levő, transzkripciós ampüfikációs esszé. Az esszét a gyártó utasításai szerint hajijuk végre.

Az Ortho antigén esszé (Ortho Clinical Diagnostics, Rarítan,

Jersey) egy antigén alapú kimutatási esszé. Az esszét a gyártó utasításai szerint hajtjuk végre,

A szóban forgó HCV antigén /ellenanyag kombinációs immunesszét az alábbiak szerint hajijuk végre, A Cl 1-7 és Cl. 1-3 tisztított monokionáíis ellenanyagokból 4-4 mg/ 1-t (Ix foszfáttal puffereit, sőoldatban, pH~7,4) kombinálunk, és alaposan összekeverünk. Az NS3/4a rekombináns antigént ugyanahhoz a bevonó pufferhez adjuk hozzá. Az oldatot a bevonás előtt 30 percig keverfcetjük, A fenti oldatból Inkánként 200 μΙ-t adunk 96-lukas Costar közeg kötő mikrotiter lemezekhez (Corning, Inc.). A lemezeket 16-24 óra hosszat 15-30 ^öC-on inkubáljuk. Á lemezeket kétszer mossuk desztillált vízzel, majd 300 pl/luk bevonás utáni pufíerrel (1% szarvasmarha szérum-albumai (HSA), lx PBS) 1 óra hosszat, majd 300 μΐ/luk stabilitási pufferrel (IxPBS, 1% BSA, mannát, polietiléngllkol (FEG), zselatin), 1 éra hosszat. A lemezeket leszívjuk, majd .24 óra hosszat 4 °C-on szárítjuk egy liofüizálőban. A lemezeket szárítőszerrel zacskóba tesszük..

Ahhoz, hogy végrehajtsuk az antigén/ellenanyag kombinációs bioesszét, a lemezhez 100 μΐ erősített lízis pufiért adunk (1% N-lauroilszarkozin., Ö,6S mol/1 nátríum-kloríd, 50 mg/ml egér IgG (technikai minőség, Sigma, St, bouis, MO), 1% szulfhid™ rillel módosított B'SA (Bayer), 0,1% kazein). Ezután 100 μΐ mintát adunk hozzá. Ezt egy óra hosszat 40 ®C~on rázatjuk. A lemezeket hatszor mossuk IxFBS, Tween-20 összetételű oldattal, egy Ortho lemezmosóval. 200 μ! konjugátum oldat (a cl 1-14-HRF 1:75 hígítása 250 ng/esszé SOD-c33 antigén plusz 1:5000 higítású egér anti-SOD-HRP HCV 3.0 minta higítőszerben (ORTHO HCV 3,0 verzió BUSA teszt-rendszer, Ortho Clinical Diagnostics, Rarítan, »* X

New Jersey), SÓD kivonat, mindegyiket 30 perccel a hozzáadás előtt állítjuk elő). Az oldatot 45 percig 40 *€-on inkubáljuk rázasn. Ezt hatszor mossuk, az előzőkben ismertetett xx tás kő es 2uu mi tabletta/lö ml) adunk hozzá. Az ÖDF tabletta o-fenüéndiamin-dihidrokloridot és hidrogénperotedot tartalmaz a tormapertaddáz reakció szm-előhivásához, ez a Sigma-tól szerezhető be (Sigma, St. bouis, MO), Ezt 30 percig 15-30 ®C-on, sötétben .inkubáljuk, A reakciót 50 ml 2 mol/1 H2SO4 hozzáadásával állxtjuk le, majd a lemezeket 492 nmen leolvassuk, a 690 nm-es elnyeléshez, mint kontrolihoz viaze-

D, Eredmények

A különbőzb esszék eredményeit az 5. és 6. táblázatos két külön, HCV fertőzést szenvedett vérminε, az ismertetett módon. Az árnyékolt területek a vírus kimutatását jelzik . .Amint azt az alábbiakban ismertetjük, a Chiron kombinációs ant^én/ekenanyag esszé szerokonverziót mutatott ki minden mintában, míg az összes többi ellenanyag- és antigén-alapű esszé legalább egy mintában nem volt képes kimutatni a szerokonverziót. Pontosabban, egyik ellenanyag-alapú esszé sem mutatott ki szerokonverziót, legalább a 18. napig (5. táblázat). A 6. táblázat azt mutatja, hogy egyik ellenanyag-alapú esszé sem mutatta ki a HCV fertőzés jelenlétét a 22. napig. Emellett, az Ortho antigén-alapú esszéje a 85. naptői kezdve nem volt képes szerokonverziót kimutatni.

Tehát a fenti eredmények alapján világos, hogy az új kombinációs eüenanyag/antigén esszé csökkenti a hamis negatív eredmények számát, amiket más, hagyományos ellenanyag- és antigén-alapú esszékkel kaptunk.

5, Táblázat

HCV szerokonverzió

Nap	Abbott PRISM	Ortho 3,0	Roche Amplicor	Gén-Pro be TMA	örtho Ag	Chíron Ag/Ab
0	04	0,0	BLD		041	0,5
13	ö,l	0,0	>5x10«		44,0	3,0 ··;
20	04	0,0	>Sxlö«		24,2	14 . .
22	0,3	0,0	>5x10«		.29,2	4 6 4
85	5_f44	44 ' 5	BQE		0,06	/ 1,1 4
131	4,3	444	BQR		0,09	1,0
135	44	4,7	3x10» .		0,09	42 i
138	5_sS	44	BLD		0,08	14
146	5,9	4,7	BLD		041	4 24

φ* φ

φ

Φ* κ

BQR

1»

M~S§3Z4aUmniom^^ hálátkükrihlá^ál

Az NS3/4& egy konformációs epifopját az alábbiak szerint állítjuk elő. Ennek az epitopnak a. szekvenciáját a 4A-4D. ábrán mutatjuk be, és ez a természetes szekvenciától biztosítja az S' Hindin klónozó helyet, ezt kőveti az ACAAAACAAA szekvencia, az ATG inieiátor és a HCV la kodonjai, amik az XÖ27as aminosawal kezdődnek és a 1046-os aminesavnál levő Bgü hasítási helyig folytatódnak; b) egy 638 bárispár méretű BgO-Clal restrikciós íragmens (ami a 1046-1274-es amineoavakat kódolja) a pAcHLTns3na4aFI-ból; és ej egy pSP72 vektor (Promega, Madison, Wl, GenBank/BMBL letéti száma X6S832), ami Hindii! és Clal restrikciós endmmel van emésztve és gélen van tisztítva. A tisztított pAcHLTns3ns4aPl plazmái a pAcHLT plazmidhöl, egy bakulovírus expressriős vektorból származik, amit a BI3 Pharmingen (San Öiego, CÁ) hoz kereskedelmi forgalomba. Pontosabban, egy pÁcHLT .EcoRl-Psti vektort készítettünk, valamint a kővetkező fragmenzeket: EcoRI-Alwnl, 935 bázispár, ami a HCV-l genom 1027- 1336-os amínosavainak felel meg; AlwnlSacH, 247 bárispár, ami a HCV-l genom 1336-14X9-00 anrinosavainsk felel meg; BmfhBgll, 175 bázispár, ami a HCV-l genom X449--15Ö9-ee amínosavainak felel meg; Bgll-PztI, 619 básispár, .ami a HCV-l genom 1510-1711-es amínosavainak felel, meg, plusz a tranmkripcióz termináeiös kodon. Egy SaeH--.Hm.il szinte70 tikusan előállított, 91 bázispár méretű fragmenst, ami a HCV-1 genom 1420- 1448-as aminosavainak felel meg, és tartalmazza a Pl mutációkat (Thr-1428 Pro~vá mutaltatva, Ser-1429 Ile-vé mutáltatva), a 175 bázispár méretű Hinff-Bgll fragmenssel ligákat)uk, majd az előzőkben ismertetett 619 bázispárhoz .Iigáltatjuk, és egy Saci valamint PstI restrikciós enzimekkel emésztett pGEM~5Zf(+) vektorba szubklőnozzuk. A pGEM-5Zf(4j vektor egy kereskedelmi forgalomban levő Escheric/ua coK vektor (Promega, Madison, WJ, GenBank/EMBL letéti száma X65308). A kompetens HB101 sejtek transzformálása után az egyes kiónokat miniscreen elemzésnek vetjük alá, majd szekvenciájukat verifikáljuk, és a pGEM5.Pl clone2 egy 885 bázispár méretű Sacl-Pstí fragmensét gélen tisztítjuk. Ezt a fragmenst ligáljuk a 935 bázíspár méretű EcoRl-Alwnl fragmenssel, a 247 bázispár méretű Alwrd-Saell fragmenssel, és az előzőkben ismertetett pAeHLT EcoRI-Pstl vektorral. A kapott konstrukció neve pAcHLTns3ns4aPI.

Az előzőkben ismertetett ligálö elegyet kompetens HB100 sejtekbe transzformáljuk, majd Luria a.garra szélesztjük, ami 100 pg/ml ampicillint tartalmaz. Az egyes kiónok mirúprep elemzésével tudtuk azonosítani a feltételezett pozitív kiónokat, amik közül kettőt amplifikáltimk, A pSP72 laHC plazmid DNS-t, a #1 és #2 .kiónokat egy Quiagen Maxiprep kittel állítjuk elő, és megszekvenáljuk.

Ezután a következőket ligáljuk össze: a) egy 761 bázispár méretű Hindii!-Clal firagmens a pSP72aHC# 1-ből (a pSP72.1aHC-t úgy állítjuk elő, hogy az alábbiakat ligáljuk össze: Hindin és Clal restrikciós enzimekkel emésztett pSP72, szintetikus oligonukleotidok, amik az 5 Hindii klónozó helyet bizto7ί sítják, ezt követi az ACAAAACAAA szekvencia, az ATG iniciációs kodon és a HCV la kodonjai, amik az 1027-as aminosawal kezdődnek és a 1046-os aminosavnál levő BgH hasítási helyig folytatódnak, egy 638 bázispár méretű BgH-Claí restrikciós fragmens (ami a 1046-1274-es aminosavakat kódolja) a pAcHLTns3ns4aPIbői; b) egy 1353 bázispár méretű BamHI-HindlII fragmens az ADH2/GAPDH élesztő hibrid promoterhez; c) egy 1320 bázispár méretű Clal-Sall fragmens (ami a HCV la 1046-1711-es aminosavait kódolja, a 1428-as Thr Pro-vá és a 1429-es Ser Ile-vé mutáltatva) a pAcHLTns3ns4aPI-böl; és d) apBS24.1 élesztő expresszié® vektor, amit BamHI és Sáli restrikciós enzimekkel emésztettünk, defoszforileztűnk és gélen tisztítottunk. A ligálő elegyet kompetens HB101 sejtekbe transzformáljuk, majd 100 μ g/ml ampicillint tartalmazó Luria agarlemezekre szélesztjük. Az egyes klönok miniprep-elemzése azoknak a kiónoknak az azonosításához vezetett, amik a várt, 3446 bázispár méretű BamHISall inszertet tartalmazzák, amiben az ADH2/GAPDH promoter, az iniciátor ATG kodon, és a HCV la N'S3/4a 1027-1711-es aminosavai találhatók (ezeket a4A-4D. ábrákon 1-686-os számozásit aminosavként mutatjuk be), amiben a Thr 1428 (a 4A.-4D, ábrán 403-as aminosav) Pro-vá van mutáltatva, és a Ser 1429 (a 4A-4D. ábrákon 404-es aminosav) Ile-vé van mutáltatva. A konstrukció jelzése pd.HCVla.ns3ns4aPI (lásd 5, ábra).

A Sncchnrorm/ees oererisme AD3 törzset transzformáljuk a pd.HCVla.ns3ns4aPI konstrukcióval, és egyes transzformánsoknak ellenőrizzük az expresszi óját, a glükóznak a táptalajból kimerülése után. A rekombináns fehérjét magas szinten resszáljuk élesztőben, Coomassie blue festéssel mutatjuk ki és * > X ** « φ Φ

Κ « *

X » φ φ *«Φ νχ immunbiot elemzéssel igazoljuk, az NSS helikáz doménje elleni políklonális ellenanyagot használva.

^LMÉg

Az NS3/4a konformációs epitopot az alábbiak szerint tisztítjuk. Az NS3/4a epitopot expresszaló Soochorompees cereiásme sejteket az előzőkben ismertetett módon gyűjtjük össze. A sejteket Kzts pufferben szuszpendáljuk (50 mmol/1 RIS pH~8,Ö_f 1.50 mmol/1 nátrium-klorid, 1 mmol/1 BDTA, 1. mmol/1 fenibnetilszulfonibluorid, 0,1 pmol/l pepstatm, 1 pmol/l leupeptín) és e^ Dyno-Mül-ben (Wab Willy A. Bachoíon, Bázel, Svájc), vagy egy ekvivalens berendezésben Imitáljuk, üveggyöngyök használatával, 1:1:1 sejf:puffer:ö»5 mm-es üveggyöngy arány használatával. A lizátumot 3ülÖ0xg-vel centríüigáljuk 30 percig, 4 ^öC-on, maid az oldhatatlan fehérje-frakciót tartalmazó üledéket hozzáadjuk egy mosópufiferhez (6 ml/g khnduláei sejtüledék súly), majd szobahőmérsékleten 15 percig rázatjuk. A mosópufer összetétele 50 mmol/l NaPÖ4 pH*»8,Ö, 0,3 mol/1 aátrium-Idorid, 5 mmol/1 βmerkaptoetanol, 10% glicerin, 0,05% ektil-glükozld, 1 mmol/1 BDTA, 1 mmol/l fenilmetilszuKömlfiuond, 0,1 pmol/l pepstaftn, 1 μηιοί/ΐ leupeptin. A sejttörmeléket centrííugálássel eltávolítjuk (SÖlCXfeg, 30 pere, 4 °C)« A felűlüszőt eföntjuk, és az üledéket megtartjuk.

Az üledékből a fehérjét az alábbiak szerint extraháljuk. 6 mg/ml extrahálő puffért adunk hozzá, majd szobahőmérsékleten 15 percig rázatjuk. Az extrahálő pofiét összetétele: 50 mmol/1 TBIS ρΗ^β,Ο» 1,0 mol/1 nátrítnn-kioríd, 5 mmol/l β-merkaptoetanol, 10% glicerin, 1 mmol/1 ΕΠΤΑ, 1 mmo.l/1 fenilmetilszuifonil·

Φ Φ S * * φ * φ ΦΦ

fluorid, 0,1 μηιοΙ/1 pepstatin, 1 pmol/I leupeptin, A felülúszőt megtartjuk, majd 17,5% koncentrációig ammőnium-szulfátot adunk, hozzá, az alábbi képletet alkalmazva: a felülúsző térfogata (ml) szorozva az ammóniuxn-szulfát x%-ával/fl-x% ammóniumszulfát)^aaml 4,1 mol/1 telített ammőnium-szulfát, amit a felülúszóhoz hozzá kell adni, Az ammőnium-szulfátot cseppenként adjuk hozzá, miközben jégen kevertetjuk, és az oldatot 10 percig jégen kevertetjuk, Az oldatot .i7700*g-vel centrifugáljuk 30 percig, 4 °C~on, majd az üledéket megtartjuk, és 2-8 °C-on tároljuk, maximum 48 óráig.

Az üledéket reszu.szpendáljuk, majd egy Poly U oszlopon futtatjuk (Poly U Sepharose 48, Amersham Pharmacia), 4 °C-on, az alábbiak szerint. Az üledéket 6 ml/gramm üledék Polv U e'kvilíbrációs pufferben reszuszpendáljuk. Áz ekvilibrálő puffer összetétele 25 mmol/1 I-IEPES pH=8,0, 280 nimol/1 nátríum-klorid, 5 mm.ol/1 ditiotreítol (frissen hozzáadva), 10% glicerin, 1,2 oktil glúkozid. Az oldatot 15 percig 4 °C-on rázatjuk, majd 30 percig 4 °C~on 3100öxg-vel centrifugáljuk.

Egy Poly U oszlopot (1 ml gyanta per gramm kiindulási üledék) készítünk. A lineáris áramlási sebesség 60 cm/óra, és a töltet áramlási sebessége a 60 cm/óra 133%-a, Az oszlopot ekvilibrálő pufferrel hozzuk egyensúlyba, és a reszuszpendált ammónium-szulfát üledék, felülűszoját az egyensúlyba, hozott oszlopra töltjük. Az oszlopot addig mossuk az egyensúlyba hozó pufferrel, amíg elérjük az alapvonalat, majd a fehérjét lépésenként eluáljuk az alábbi Polv V elúciős pufferrel: 25 mmol/1 HEPES pH=8,0, 1 mol/1 nátrium-klorid, 5 mmol/1 ditiotreítol (frissen hozzáadva), 10% glicerin, 1,2 oktil-glükozld. Az oszlop eluátumot SDS-poHakrilamid gélen futtatjuk (Coomassie-val <· * ·$· ** * ♦ * *« festjük), majd az slikvot részeket -80 *C-on tároljuk. Az NS3/4& epítop jelenlétét Western blottal igazoljuk, az NS3 proteáz dómén elleni poliklonális ellenanyag, és az 5-1-1 epítop elleni monoklonáhs ellenanyag (HCV a) használatával.

Emellett a proteáz aktivitást a tisztítás során. az alábbiak szerint követtük. Egy HS4a peptidet (KKGSVVXVGR1VWGKFAHFKK) és az N53/4& konformációs epitopot tartalmazó mintát 90 μί reakciőpufferben hígítjuk (25 mmot/l TRIS pH**?,5, 0,15 mol/1 nátrium-klorid, 0,5 mmol/1 EDTA, 10% glicerin, 0,05 n-dodecil B'D maltozid, 5 mmol/1 ditíotreitol), majd hagyjuk, hogy szobahőmérsékleten 30 percig keveredjenek. 90 μί eiegyet (Costár, Inc., Corning', NY) és 10 pl HCV szubsztrátot (AnaSpec, Inc,, San dose, CÁ) adunk a mikrotiter lemezhez, A lemezt egy Ftuostar lemerieoivasőval keverjük és rábaijuk, Az eredményeket percenkénti relatív fiuoreszomda egységekben (RFÜ) fejezzük ki,

Ezeknek a módszereknek a használatával' az 1 mol/1 nátrium-kloridos extrakeió 3,7 RFU/perc aktivitást tartalmaz, az ammőnium-szulfát csapadék aktivitása 7,5 .RFÜ/pere volt, és a oly U tisztítás termékének aktivitása 13.5 RFU/perc volt.

Az alábbi kompetíciós vizsgálatot azzal a céllal hajtjuk végvajon az NS3/4a konformációs epítop a

fő ellenanyagokat mutat-e M. az HS3/4a antigént a c200 antigénnel az alábbiak szerint haeorr htjuk össze.

0,5 pg és 1,0 pg NS3/4a-t, amit az előzőkben ismertetett módon állítunk elő, vagy c200-at (Hepatology 15, 19-25 (1992), beszerezhető az ORTHO HCV' 3.0 verziószámú ELISA Test System-ben (Ortho-Clinical Diagnostícs, Raritan, New Jersey)] keverünk össze 20 μΐ PHV914-5 mintával (egy korai szerokonverziós vér, amit egy fertőzött egyed véréből kaptunk), összesen 220 μΐ össztérfogatban (1*PBS}. Az eiegyet 1 óra hosszat 37 ^öC-on inkubaijuk mikrotiter lukakban. Az eiegyet azután NS3/4a-val borított lukakba visszük át, majd 1 óra hosszat szobahőmérsékleten inkuháliuk. A lemezeket az alábbiak szerint mossuk és vizsgáljuk.

pg c200 antigént adunk 10 μΐ PHV914-5 mintához, összesen körülbelül 220 μΐ össztérfogatban. Az eiegyet 1 óra 37 ° C-on hosszat mkubáljuk egy mikrotiter lukban, majd 200 μΐ-t átviszünk egy N83/4a-val borított lemezre (100 ng/esszé), majd 1 óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk. A lemezeket ötször mossuk 1*PBS, 0,1% Tween-20 összetételű oldattal. Az előzőkben ismertetett konjugátum. oldatból 200 μΐ-t adunk hozzá, majd a lemezeket inkubáljuk és elemezzük, A kontroliakat, amik PHV915-öt. és l*PBS~t tartalmaznak (antigén nélkül), szintén az előzőkben ismertetett módon kezeljük.

ményeket a 7. táblázatban mutatjuk be, A 4. oszlopban bemutatott százalékos gátlás! eredményeket a következő képlettel számítjuk ki: 3, oszlop mínusz (2. oszlop osztva a 3. oszloppal, szorozva 100-zal). Amint az látható, az adatok azt mutatják, hogy az NS3/4a-t neutralizálják a korai szerokonverziós ellenanyagok, míg a c200-at nem, Erős jelet kaptunk, ha a PHV914-5 c33e korai szerokonverziós panel tagban levő ellenanyagok reagálnak a lemezen levő NS34a bevonattal. A c200 antigént ezek az ellenanyagok nem semlegesítik. Ez a 7. táblázat felső paneljében látható. Amikor az NS34a-t összekeverjük a

PHV914-5 mintával, akkor az neutralizélédik, és ezért a mintában nincsenek ellenanyagok, hogy reagáljanak az NS34&val, amivel bevontuk a mikrotíter lemezt. Az adatok azt mutálják, hegy az N334a az ellenanyagok egy másik osztályát muta^a ki, nem azt, amit a c2Ö<X

7. Táblázat

A kompetieins vizsgálatok, annak kimutatására, hogy az NS34a antigén az ellenanyagok egy másik osztályát mutatja ki, nem azt, amit a c20Ö antigén,

	1	2	3	4
c200	v	PHV914-5	Kontroll X*PBS	50-es gátlás
		a	s
i kg		1,450	1,645	12
1 pg		1,545	1,687	S
0>5pg		1,557	1,913	19
0,5 pg		1,719	1,804	5

NS3/4a	4	PHV914-S
		a	s
1 pg		0,054	1,599	97
1 M		0,037	1,677	98
0,5 pg		0,066	1,672	96
0,5 pg		NA	1,524	NA

* χ

Φ χ * * * *« ψψ » Φ *

Φ Φ βΡβ * «β

Ahhoz, hogy megbecsüljük az NS3/4a epitop stabilitását az esszé végrehajtásához, az alábbi vizsgálatot hajtjuk végre, hogy meghatározzuk az NS3/4a immunreaktivításának időbeli változását, szobahőmérsékleten. Az NS3/4a törzsoldat kis aükvot részeit hagyjuk szobahőmérsékleten állni, majd a 8, táblázatban bemutatott időközönként lefagyasztjuk. Minden ampullát egyidőben borítunk be, és vizsgáljuk két korai NS3 szerokonverziós panellel szemben.

Amint az a S. táblázatból látható, az NS3/4a törzsoldat nem stabil, és immunreaktivitása időben csökken. Emellett az NS3/4a konformáció megtartása szükséges az immunreaktivitáshoz.

További stabilitási vizsgálatokat végeztünk, az alábbiak szerint. Két, az NS3/4a ellen standard eljárásokkal készített konformációs monoklonális ellenanyagot helyettesítünk az anti-HCV korai szerokonverziós panelekbe. Az NS3/4a törzsoldat ampulláit szobahőmérsékleten tároljuk, 3, 6 és 2 óra hosszat. A lefagyasztott ampullákból származó NS3/4a-t 90 ng/ml koneenirációban bevonásra használjuk, majd az előzőkben ismertetett eljárással elemezzük. Az eredmények azt sugallják, hogy a két monoklonális ellenanyag valóban konformációs, és reaktivitásuk érzékeny az NS3/4a szobahőmérsékleten való kezelésére. Egy pozitív kontroll monoklonális ellenanyag reakcióképessége nem változott.

- · yflSj ?s ** * ΦΦ . * ? * 8 Λ- J φ «Χφ*

	s/co	s/C0	s/co	á/co	s/co	s/co	s/eo	s/co
FHV 904-1	0,0	0,0	0,0	Ο,Ο	0,0	0,0	Ο,Ο	0,0
FHV 904-2	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
PHV 904-3	1,5	0,3	0,1	0,0	0,0	0,0	0,0	1,8
FHV 904-4	. 3,7	L0	0,2	o,i	0,1	0,1	0,1	4 ,4,4 :
FHV 904-5	4,8		0,7	0,0	0,3	0,2	0,3	44 5,5
FHV 904-6	•5,4	2,3	Μ 4	4>Ö	0,6	0,5	0,6	5>S
FHV 904-7	541	3,4	1,5	1,0	Μχ,'Γ4	0,5	0,7	5,4

PHV 914-1	Ö/Ö	0,0	0,0	0,0	0,0	Ο,Ο	0,0	0,0^:
FHV 914-2	0,0	0,0	Ο,Ο	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
PHV 914-3	Ο,Ο	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	Ö,0
PHV 914-4	0,5	0,1	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,7
FHV 914-5	2.1	0,4	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	3,0.4
PHV 914-6	2,3 :	0,4	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	,· ³>⁴

6. Példa

Az N83/4a konformációs epitop.. Imaiunrea NS3 / 4a-yal szemben

Az előzőkben ismertetett módon előállított NS3/^ mációs epitop immunreaktivitását hasonlítjuk össze olyan N83/4a immunreaktivitásával, amit SDS-nek 2% végkoncentrációban az NS3/4a konformációs epitop készítményhez való hozzáadásával denaturáltunk. A denaturált NS3/4a-t és a konformációs NS3/4a~t az előzőkben ismertetett módon mikrotiter lemezek bevonására használjuk. A c20ö antigént [Hepatology 15, 19-25 (1992), beszerezhető az ORTHO HCV 3.0 verziószámú ELÍSÁ Test System-ben (Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey)) is mikrotiter lemezek bevonására használjuk. A c20Ö antigént használjuk összehasonlításra, mivel feltételezzük, hogy nem-konformációs, mivel készítményében redukáló ágens (OTT) és detergens (SDS) van jelen.

Az immunreaktivitást két korai szerokonverziós panellel, a PHV 904-gyei és a PHV 914-gyel szemben teszteljük (kereskedelmi forgalomban van humán vérmintákból, gyártja a Bostor Biomedica, Inc., West Bridgewater, MA). Az eredményeket a 9.

ja a denaturált táblázatban mutatjuk be. Az adatok azt sugallják, hogy az NS3/4a (valamint a c2öö) denaturált vagy linearizált formája nem mutatja ki a korai szerokonverziós paneleket olyan korán, mint az NS3/4a konformációs epitop.

53/ 4a

2%SDS árit

NS3/4a vs. denaturált j | *tuskés 2^v/o5US az j _s| NS3/4a törzsoldathoz j j

NS3 Tc20F7~]NS3 |dNS3 j c200 j' y 4a j /4a* J í / 4 a

Γ~ο5“Γοπ“ /4 a* >D j s/co j s/co I s/co | [ 0,012 1 0,012 ΤΟ,οδοΊ | 0/D2H oM™fo',01~|

0/0TF“ OfoOóT | 0,02 ί'ο^ΐΐαοΓΐ j 1,124 I 0,071 | 0,045

b““i 1 Ί ö/07 ’'j

2,401 | 0,273 | 0,129 j | 3,85 j 0,44 0,21

3,022 ( 0/793 j 0,347 | j 4,35 | 1,2S ) 0,57 j

Sv'| 2,711 í 1,472 | 0,774 | | 4,85 1 2,87 Γΐ/2βΊ j PHV ] 3_f294 j 1,360 '“Ρ,ξ

1904-7 | | |

	FHV 914-1	0,006	0,004	0,001	0,01	0,01	ö,00
	FHV 914-2	0,005	0,004	0,002	0,01	0,01	0,00
	PHV 914-3	0,098	0,003	0,001	0,16	0,00	0,00
	FHV 914-4	1,118	0,006	0,004	1,79	0,01	0,01
	FHV 914-5	2,035	0,044	0,022		0,07	0,04
	FHV 914-6	2,092	0,074	0,026	3,35	0,12	0,04
	FHV 914-7	2,519	0,281	0432	S.Ö4	0.45	0,22
	FHV 914-8	2,746	0,907	0,500		,1.46	0,82
	FHV 914-9	3,0S4	1,730	0,931	4.94 '	2',?S	1,53

HCV 3.0	neg. kent.	0,023	0,024	0,008
konc rollók	neg. konc	0,027	0,024	0,007
	neg. kosit	0,021	0,017	0,005
	átlag	0,024	0,022	0,007 :

Λ Μ*

vágási érték	0,624	0,622	0,607

póz. kont	1,230	0,903	0,575	1,99	1,45	0,95
póz. kant.	1,445	0,9X6	0,614	2,32	1,47	1,01

A konformációs epitop immunreaktmtását is megvizsgáltuk,, standard eljárásokkal készített, N83/4a elleni monokíonális ellenanyagokat használva. Ezeket a monokíonáíis ellenanyagokat azután BLXSA-val teszteljük NS3/4a és denaturált NS3/4a és c2OÖ antigén ellen. Az adatok azt mutatják, hogy az antí-NS3/4a monokíonális ellenanyagok hasonlóképpen reagálnak az NS3/4aval. és a denaturált NS3/4a-val, mint a 10. táblázatban bemutatott szemkonverziós panelekkel. Ez az eredmény arra. is további bizonyítékot szolgál, hogy az MS3/4a természete konformációs, mivel olyan monoklonáMa ellenanyagok készíthetők, amiknek a reakcióképessége hasonlít a korai c33c saerokonvemós panelekéhez.

Γ Lemez

N83/4& dNS3/4a c200

L______ j MmóMonális		OD	OD	ob
\| 4B9/B3	xoiöö	1,820	0,616	0,369
1	X :1000	1,397	0,380	0,246

ί*

Tehát új HCV kimutatási esszét fejlesztettünk ki. Az előzőkből nyilvánvaló, hogy bár illusztrálás céljából a jelen találmány specifikus megvalósítási módjait ismertettük, ebben különböző módosításokat tehetünk, anélkül hogy eltérnénk az ismertetett leírás szellemétől és oltalmi körétől.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Immunesszé szilárd hordozó, ami legalább egy hepatitisz C vírus (HCV) anti-mag ellenanyagot és legalább egy izolált HCV NS3/4a epitópot tartalmaz hozzákötve, ahol az említett NS3/4a epitop a 4A-4D ábrákon látható aminos&v-szekveneiát tartalmazza.
2,

Az 1« igénypont szerinti szilárd hordozó, ami legalább két HCV anti-mag ellenanyagot tartalmaz hozzákötve.
3. Áz 1. igénypont szerinti szilárd hordozó, amiben legalább az egyik anti-mag ellenanyag a HCV mag antigén Η-terminális régiója elirányul.
4. A 3. igénypont szerinti szilárd .hordozó, amiben legalább egy anti-mag ellenanyag a HCV 10-53-as aminosavai ellen irányul, a. HCVl poliprotein szekvenciának megfelelő számozás szerint.
5. Az 1. igénypont szerinti immunesszé srilárd hordozó, amiben az említett legalább egy anti-mag ellenanyag monoklonálís ellenanyag.
6, Az 1. igénypont szerinti immunesszé szilárd hordozó, ami tartalmaz még egy többszörös epitop fúziós antigént hozzákötve.

í. A
7. igénypont szerinti immunesszé szilárd hordozó, amiben az említett többszörös epitop fúziós antigén tartalmazza a 7A-7F. ábrákon bemutatott amínosav szekvenciát.

Φ * Λ Φ
8, Immunesszé szilárd hordozó, ami az alábbiakat tartalmazza: két hepatitisz C vírus (HCV) anti-mag monoklonális ellenanyag, egy HCV NS3/4a konformációs epitóp, ami a 4A-4D, ábrán ismertetett aminosav-szekvenciát tartalmazza hozzákötve, és egy többszörös epitóp fúziós antigén, amely tartalmazza a 7A-7F. ábrákon bemutatott aminosav szekvenciát hozzákötve.
9. Eljárás hepatitisz C vírus fertőzés kimutatására egy biológiai mintában, ahol az eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza:

a) az 1. igénypont szerinti immunesszé szilárd hordozó biztosítása;

b) egy biológiai mintát kombinálunk a szilárd hordozóval olyan körülmények között, amik lehetővé teszik, hogy a HCV antigének és ellenanyagok, ha jelen vannak a biológiai mintában, akkor kötődnek legalább egy anti-mag ellenanyaghoz illetve az NS3/4a epitőphoz;

c) komplexképzést biztosító körülmények között a b) lépésből származó szilárd hordozóhoz adunk i) egy első kimutathatóan jelzett ellenanyagot, aholis az első jelzett antimag ellenanyag egy kimutathatóan jelzett HCV anti-mag ellenanyag, ahol az említett jelzett anti-mag ellenanyag egy olyan HCV mag epitóp ellen irányul, amely a legalább az egyik, a szilárd hordozóhoz kötött anti-mag ellenanyagtól eltérő; ii) egy antigént, ami reakcióba lép egy NS3/4a epitóppal reagáló biológiai mintából származó HCV ellenanyaggal; és iii) egy második kimutathatóan jelzett ellenanyagot, amely második kimutathatóan jelzett ellenanyag reagálni képes a ii) pont szerinti antigénnel; és

d) kimutatjuk az ellenanyagok és az antigének közötti komplexeket, ha vannak ilyenek, ami azt mutatja, hogy a biológiai mintában HCV fertőzés van.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett legalább egy anti-mag ellenanyag a HCV mag-antigén N-terminális régiója ellen irányul, és az említett kimutathatóan jelzett HCV antimag ellenanyag a HCV mag-antigén C-terminális régiója ellen irányul.
11. A 10, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább egy anti-mag ellenanyag a HCV 10-53-as aminosavai ellen irányul, a HCV1 poliprotein szekvenciának megfelelő számozás szerint, és az említett kimutathatóan jelzett HCV anti-mag ellenanyag a HCV ΓΟΟΙ 30-as aminosavai ellen irányul, a HCV1 poliprotein szekvenciának megfelelő számozás szerint.
12. A 9, igénypont szerinti, eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett antigén, ami reagál egy, a biológiai mintában levő HCV ellenanyaggal, a HCV poliprotein egy, a c33e régiójából származó epitópját tartalmazza.
13, A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c33c epitóp egy humán szuperoxid-diszmutáz (hSÖD) aminosav szekvenciához fuzionált, és a második kimutathatóan jelzett ellenanyag az említett hSOD aminosav szekvenciával reagál.
14, Eljárás hepatitisz C vírus fertőzés kimutatására egy biológiai mintában, amely az eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza:

a) a 2. igénypont szerinti immunesszé szilárd hordozó biztosítása:

b) egy biológiai mintát kombinálunk a szilárd hordozóval olyan körülmények között, amik lehetővé teszik, hogy a HCV antigének és ellenanyagok, ha jelen vannak a biológiai mintában, akkor kötődnek legalább a két említett anti-mag ellenanyaghoz illetve az NS3/4a epitophoz;

c) komplexképzést. biztosító körülmények között a b) lépésből származó szilárd hordozóhoz adunk i) egy első kimutathatóan jelzett ellenanyagot, aholis az első kimutathatóan jelzett, ellenanyag egy kimutathatóan jelzett HCV anti-mag ellenanyag, és az említett jelzett anti-mag ellenanyag egy olyan HCV mag epitop ellen irányul, amely a szilárd hordozóhoz kötött legalább két anti-mag ellenanyagtól eltérő; ii) egy epitópot a HCV poliprotein c33c régiójából, amely egy hSOD aminosav szekvenciához fuzionált; és iii) egy második kimutathatóan jelzett ellenanyagot, amely második kimutathatóan jelzett ellenanyag reagálni képes az említett hSOD aminosav szekvenciával; és

d) kimutatjuk az ellenanyagok és az antigének közötti komplexeket, ha vannak ilyenek, ami azt mutatja, hogy a biológiai mintában HCV fertőzés van.
15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett legalább két anti-mag ellenanyag a HCV mag-antigén N-terminális régiója ellen irányul, és az említett kimutathatóan jelzett HCV anti-mag ellenanyag a HCV mag-antigén C-terminálís régiója, ellen irányul,
16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább két anti-mag ellenanyag a HCV 10-53-as aminosavai ellen irányul, a HCV1 poliprotein szekvenciának megfelelő számozás szerint, és az említett, kimutathatóan jelzett HCV anti-mag ellenanyag a HCV 12088

130-as amino savai ellen irányul, a HCV1 poüprotein szekvenciának megfelelő számozás szerint.
17. Eljárás hepatitisz € vírus fertőzés kimutatására, egy biológiai mintában, amely eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza:

a) a 6. igénypont szerinti immunesszé szilárd hordozó biztosítása;

b) egy biológiai mintát kombinálunk a szilárd hordozóval olyan körülmények között, amik lehetővé teszik, hogy a HCV antigének és ellenanyagok, ha jelen vannak a biológiai mintában, akkor kötődnek legalább az egy említett anti-mag ellenanyaghoz, az említett NS3/4a epitophoz és az említett többszörös fúziós antigénhez;

c) komplexképzést biztosító körülmények között a b) lépésből származó szilárd hordozóhoz adunk i) egy első kimutathatóan jelzett ellenanyagot, aholis az első kimutathatóan jelzett ellenanyag egy kimutathatóan jelzett HCV anti-mag ellenanyag, és az említett jelzett anti-mag ellenanyag egy olyan HCV mag epitóp ellen irányul, amely a szilárd hordozóhoz kötött legalább egy anti-mag ellenanyagtól eltérő; ii) első és második antigéneket, amik reagálnak a biológiai mintában levő HCV ellenanyaggal, ami reagál az említett NS3/4a epitoppal és az említett többszörös epitóp fúziós antigénnel; és iíi) egy második kimutathatóan jelzett ellenanyagot, amely második kimutathatóan jelzett ellenanyag reagálni képes az a ii) antigénekkel;

d) kimutatjuk az ellenanyagok és az antigének közötti komplexeket, ha vannak ilyenek, ami azt mutatja, hogy a biológiai mintában HCV fertőzés van.
18. A 17, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett legalább egy anti-mag ellenanyag a HCV mag-antigén N-termi*« φ φ # φ * * φ φ φ * * φ φ X ·Χ # Φ Φ φ Φ Φ Φ* X ΦΦ >' X nális régiója ellen, irányul és az említett első, kimutathatóan jelzett. HCV anti-mag ellenanyag a HCV mag-antigén C-terminális régiója ellen iránvuL
19« A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább egy anti-mag ellenanyag a. HCV l.Ö-53-as aminosavai ellen irányul, a H.CV1 poliproteín szekvenciának megfelelő számozás szerint, és az említett kimutathatóan jelzett HCV anti-mag ellenanyag a HCV 120130-as aminosavai ellen irányul, a HCVÍ poliproteín szekvenciának megfelelő számozás szerint.
20. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett első antigén, ami egy biológiai mintában levő HCV ellenanyaggal reagál, a HCV poliproteín c33c régiójából származó epitopot tartalmaz.
21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c33c epitop egy humán szuperoxid-diszmutáz (hSOD) aminosav szekvenciával fuzionált, és a második kimutathatóan jelzett ellenanyag reagál az említett hSOD aminosav szekvenciával.
22, A 1.7, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett második antigén, ami reagál egy, a biológiai mintában levő HCV ellenanyaggal, tartalmaz egy epitopot a HCV poliproteín c22-es régiói
23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c22 régióból, származó epitop a HCV poliproteín Lysio-Sem aminosavait tartalmazza, az Arg47 kivágásával és a. Leu. Trp-re való helyettesítésével a 44~es pozícióban, a HCVÍ poliproteín szekvencia alapján számozva, és az említett epitőp egy humán szuperomd-diszmutóz (hSOD) aminosav szekvenciához teionált, és a második kimutathatóan jelzett ellenanyag reagál az említett hSOD aminosav szekvenciával.
24» A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett többszörös fúziós antigén tartalmazza a 7A-7F. ábrán bemutatott aminosav szekvenciát.
25. Eljárás hepatitisz C vírus fertőzés kimutatására egy biológiai mintában, amely eljárás a kővetkező tépéseket tartalmazza;

a) a 3, igénypont szerinti immunesszé szilárd hordozó biztosítása;

b) egy biológiai mintát kombinálunk, a szilárd hordozóval olyan körülmények között, amik lehetővé teszik, hegy a HCV antigének és ellenanyagok, ha jelen vannak a biológiai mintában, akkor kötődnek legalább a két említett anti-mag ellenanyaghoz, az említett NS3/4a. konformációs epitőphoz és az említett többszörös fúziós antigénhez;

c) komplekképzést biztosító körülmények között a h) lépésből származó szilárd hordozóhoz adunk i) egy első kimutathatóan jelzett ellenanyagot, aholis az első kimutathatóan jelzett ellenanyag egy kimutathatóan jelzett HCV antí-mag ellenanyag, és az említett jelzett anti-mag ellenanyag egy olyan HCV mag epitőp ellen irányul, amely a szilárd hordozóhoz kötött legalább két anti-mag ellenanyagtól eltérő; ii) a HCV poliprotein c33c régiójából származó epitőpot, a hSOD aminosav szekvenciához fuzionált, és a HCV poliprotein c22 régiójából származó epitőpot, a hSOD aminosav szekvenciához füzionáltatva; és ül) egy második kimutathatóan jelzett ellenanyagot, amely mása91

Φ Φ ,ΦΦΦΦ χ.Φ φ'# ΦΦ ♦' φ φ φ φ φ*φ φ φ ,φ φ φ φ φφΦ Φί-Sft ΦΦ *$ dik kimutathatóan jelzett ellenanyag reagálni képes az említett hSÖD aami,nosav--szekven.ciák;kal;

kimutatjuk az ellenanyagok és az antigének közötti komplexeket, ha vannak ilyenek, ami azt mutatja, hogy a biológiai mintában HCV fertőzés van.
26, A 25, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett legalább két anti-mag ellenanyag a HCV mag-antigén N-termi'· nális régiója ellen irányul, és az említett kimutathatóan jelzett HCV anti-mag ellenanyag a HCV mag-antigén C-terminális régiója ellen irányút
27, A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább két anti-mag ellenanyag a HCV 10-53-as amínosavai ellen, irányuk a HCV1 poliprotein szekvenciának megfelelő számozás szerint, ás az említett kimutathatőan jelzett HCV anti-mag ellenanyag a HCV 12013Ö-as aminoaavai ellen irányul, a HCV1 poliprotein szekvenciának megfelelő számozás szerint.
28. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a o22 régióból származó epitop a HCV poliprotein lysw-Serw aminosavait tartalmazza, az Arg47 kivágásával és a Leu Trp-re való helyettesítésével a 44-es pozícióban, a HCV1 poliprotein szekvencia alapján számozva.
29. ímmundíagpozztikai teszt kit, arai tartalmazza az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti immunesszé szilárd hordozót, valamint az immundíagnosztikai teszt elvégzéséhez szükséges utasításé92
30. Eljárás egy immunesszé szilárd hordozó előállítására, amely eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza;

a) biztosítunk egy szilárd hordozót, és

b) legalább egy hepatitisz C vírus (HCV) anti-mag antigént, valamint egy izolált HCV N83/4a konformációs epitópot kötünk hozzá, amely említett epitop a 4Α-4Ό ábrákon látható aminosav- szekvenciát tartalmazza.
31. Eljárás egy immunesszé szilárd hordozó előállítására, amely eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza:

a) biztosítunk egy szilárd hordozót, és

b) két hepatitisz C vírus (HCV) anti-mag antigént, valamint egy izolált HCV NS3/4a konformációs epitópot kötünk hozzá, amely említett epitop a 4A-4D ábrákon látható aminosavszekvenciát tartalmazza.
32. A 30. vagy 31. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább tünk a szilárd hordozóhoz.