BG107441A - Изследване на комбинация на hcv антиген/антитяло - Google Patents

Description

ИЗСЛЕДВАНЕ НА КОМБИНАЦИЯ НА HCV АНТИГЕН/АНТИТЯЛО

I

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Настоящето изобретение се отнася най-общо до вирусната диагностика. По-специално изобретението се отнася до изследване на комбинация антиген/антитяло за правилна диагноза за хепатит С вирусна инфекция.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Вирусът на хепатит С (HCV) е главната причина за парентерален не-А, не-В хепатити (NANBH), който се предава широко чрез преливане на кръв и сексуален контакт. Вирусът присъства в 2,0% от кръвните донори. Хроничен хепатит се развива при 50% от инфекциите, а от тях 20% от инфектираните индивиди развиват цироза на черния дроб, което понякога води до хепатокпетъчна карцинома. В съответстие, изследването и контролирането на заболяването е от медицинска значимост.

Ws**“'

HCV за първи път е идентифициран и охарактеризиран като причина за NANBH от Houghten et al. вирусната геномна последователност на HCV е известна, както и методи за получаване на послидователността. Виж например, International Publication Nos. WO 89/04669; WO 90/11089; и WO 90/14436. HCV e c 9,5 kb позитивен-сенс, едноверижен PHK геном и е член на семейството на Flaviridae вирусите. Били са идентифицирани най-малкото шест отделни, но свързани генотипа на HCV, осоновани на филогенетични анализи, (Simmonds et al., J. Gen. Virol. (1993) 74:2391-2399). Вирусът кодира единичен полипротеин, притежаващ повече от 3000 аминокиселинни остатъци (Choo et al., Science (1989) 244:359-362; Choo et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA (1991) 88:2451-2455; Han et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA (1991) 88:1711-1715). Полипротеинът се преработва ко- и пост-транслационно както в структурен, така и в неструктурен (NS) протеини.

По-специално, както е посочено на фигура 1, няколко протеина се кодират от HCV генома. Редът и номенклатурата на продуктите от разцепването на HCV полипротеина е както следва; NH₂-C-E1-p7-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NSb-COOH.

Първоначалното разцепване на полипротеина се катализира от протеазите на гостоприемника, които освобождават три структурни гликопротеина, Έ1” (известен, също така, като Е) и Έ2” (известен, също така, като E2/NS1), така както и неструктурни (NS) протеини, които съдържат вирусните ензими. NS областите се наименоват като NS2, NS3, NS4 и NS5. NS2 е интегрален мембранен протеин с протеолитична активност. NS2, било то самостоятелно или в комбинация с NS3, разцепва NS2NS3 sissle връзка, който на свой ред генерира NS3 N-терминуса и освобождава голям полипротеин, който включва както серии протеазна, така и РНК хеликазна активности. NS3 протеазата служи за преработване на остатъка от полипротеина. Завършването на узруването на полипротеина се инициира от автокаталитично разцепване при NS3-NS4a свързването, катализирано от NS3 серин протеаза. Впоследствие, NS3медиирани разцепвания на HCV полипротеина изглежда включват разпознаване на свързването на полипротеиновото разцепване чрез NS3 молекула от друт полипептид. При тези реакции, NS3 освобождава NS3 кожактор (NS4a), два протеина (NS4b и NS5a), както и една РНК-зависима РНК полимераза (NS5b).

Описани са известен брой общи и специфични полипептиди, полезни като имунологични и диагностични реагенти за HCV, произлезли от HCV полипротеин. Виж например, Houghton et al., European Publication Nos. 318,216 и 388,232; Choo et al., Science (1989) 244:359-362; Kuo et al., Science (1989) 244:362-364; Houghton et al., Hepatology (1991) 14:381-388; Chien et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S3339; Chien et al., International Publication Nos. WO 93/00365; Chien et al., International Publication Nos. WO 93/00365; Chien et al., International Publication Nos. WO 94/0101778. Тези публикации предоставят в широки граници ниво на техниката за HCV найобщо,така както и върху получаването и използуването на HCV полипептидни имунологични·реагенти.

Чувствителни, специфични методи за скриниране и идентифициране на носители на HCV и кръв и кръвни продукти, зъръзени с HCV биха предоставили значителен напредък в медицината. Пост-трансфузионен хепатит (РТН) се появява при приблизително 10% от пациентите с трансфузии, a HCV е изчислен на над 90% от тези случаи. Грижите за болните, както и предпазването и предаването на HCV чрез кръв и кръвни продукти или чрез близък личен контакт изискват сигурни средства за диагностициране и прогнозиране. В съответствие са разработени известен брой изследвания за серодиагностика на HCV инфекции. Виж например, Choo et al., Science (1989) 244:359-362; Kuo et al., Science (1989) 244:362-364; Choo et al., Br. Med. Bull. (1990) 46:423-441; Ebeling et al., Lancet (1990) 335:982983; van der Poel et al., Lancet (1990) 335:558-560; van der Poel et al., Lancet (1991) 337:317-319; Chien, D.Y., International Publication No. WO 94/01778; Valenzuela et al., International Publication No. WO 97/44469;v и Kashiawakuma et al., U.S. Patent No. 5,871,904.

Значителен проблем, срещан при някои изследвания на основата на серуми е това, че съществува значителен интервал между инфектирането и откриването на вируса, често надвишаващ 80 дни. Този интервал на изследването може да създаде сериозни рискове за пациентите с преливане на кръв. За превъзмогването на този проблем са били разработени тестове на основата на нуклеинова киселина (NAT), които i

откриват директо вирусна РНК, и тестове за HCV протеина на сърцевината на антигена, които изследват вирусния антиген, вместо отговора на антитялото. Виж, Kashiawakuma et al., U.S. Patent No. 5,871,904; Bled et al., Transfusion (2000) 40:575-579=

Въпреки това, остава необходимост от чувствителни, точни диагностични и протгностични средства, за да може да се предостави на пациентите адекватни грижи, както и предпазване и предаване на HCV чрез кръв и кръвни продукти или чрез близък личен контакт.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящото изобретение се основава, отчасти, върху откритието, че HCV антителата на сероконверсията са типични анти-сърцевинни и aHTH-NS3 (хеликаза). В съответствие с това, изобретението предоставя комбинирано изследване на антитялото на сърцевината на HCV и NS3 антитяло, което може да установи и двете, както HCV антигени, така и антитела, присъстващи в проба, при използуване на една единствена твърд матрикс.

Следователно, при един вариант за изпълнение, посоченото изобретение се отнася до твърда подложка за имуноизследване, включваща поне едно антитяло на сърцевината на HCV и поне един изолиран HCV NS3/4a епитоп, свързан към него. Антитялото и NS3/4a епитопът могат да бъдат които и да е от тук описаните молекули. Освен това, твърдата подложка може да включва който и да е от антигените с множествен епитоп, описани в настоящото, така че антигенът с множествен епитоп, включва амино-киселинната последователност, посочена на фигури 7A-7F.

При някои варианти за изпълнение на изобретението, твърдата подложка включва поне две HCV антитела за антисърцевината, свързани нея. Освен това, антитялото за сърцевината може да е моноклонално антитяло. Допълнително, NS3/4a епитопът може да е конформационен епитоп, като конформационния NS3/4a епитоп, включващ аминокиселинната последователност, обрисувана на фигури 4A-4D.

При един друг вариант за изпълнение, изобретението се отнася до твърда подложка за имуноизследване, включваща поне две антитела на сърцевината на HCV и поне един HCV NS3/4a конформационен епитоп, включващ аминокиселинната последователност, обрисувана на фигури 4А-4О.свързан към него.

При един друг вариант за изпълнение, изобретението се отнася до метод за откриване на HCV инфекция в биологични проби. Методът включва: (а) предоставя се твърда подложка за имуноизследване, както е описано по-горе; (Ь) комбинира се биологична проба с твърдата подложка, при условия, които позволяват на HCV антигени и антитела, когато присъстват в биологичната проба, да се свържат към поне едното антитяло на сърцевината и NS3/4a епитопа, съответно; (с) прибавя се към твърдата подложка от етап (Ь) при условия за образуване на комплекс (i) едно първо антитяло, маркирано за разпознаване, при което първото антитяло, маркирано за разпознаване, е маркирано за разпознаване HCV антитялото на сърцевината, при което маркираното антитялото на сърцевината се насочва срещу един друг HCV епитоп на сърцевината, различен от поне едното антитялото на сърцевината, свързано към твърдата подложка; (ii) антиген, който влиза в реакция с HCV антитяло от биологичната проба, реактивна с NS3/4a епитоп; (iii) едно второ антитяло, маркирано за разпознаване, при което второто антитяло, маркирано за разпознаване, е реактивно към антигена от (ii); и (d) откриват се комплекси, образувани между антитела и антигени, като индикация за HCV инфекция в биологичната проба. NS3/4a епитопът може да е конформационен епитоп, като конформационен епитоп, притежаващ NS3/4a последователността, обрисувана на фигури 4A-4D.

При един друг вариант за изпълнение, изобретението се отнася до метод за откриване на HCV инфекция в биологични проби. Методът включва: (а) предоставя се твърда подложка за имуноизследване с поне две антитана сърцевината на HCV, свързани към него, както е описано по-горе; (Ь) комбинира се биологична проба с твърдата подложка, при условия, които позволяват на HCV антигени и антитела, когато присъстват в биологичната проба, да се свържат към поне две антитела на сърцевината и NS3/4a епитопа, съответно; (с) прибавя се към твърдата подложка от етап (Ь) при условия за образуване на комплекс (i) едно първо антитяло, маркирано за разпознаване, при което първото антитяло, маркирано за разпознаване, е маркирано за разпознаване HCV антитялото на сърцевината, при което маркираното антитялото на сърцевината се насочва срещу един друг HCV епитоп на сърцевината, различен от поне едното антитялото на сърцевината, свързано към твърдата подложка; (ii) епитоп от сЗЗс областа на HCV полипротеин, слят към една hSOD аминокиселинна последователност; и (iii) едно второ антитяло, маркирано за разпознаване, при което второто антитяло, маркирано за разпознаване, е реактивно към hSOD аминокиселинната последователност; и (d) откриват се комплексите, образувани между антитела и антигени, като индикация за HCV инфекция в биологичната проба. NS3/4a епитопът може да е конформационен епитоп, като конформационен епитоп, притежаващ NS3/4a последователността, обрисувана на фигури 4A-4D.

Ако което, и да е от горе-посочените варианти за изпълнение, антитялото на сърцевината може да се носочи срещу N-терминалната област на HCV антигена на.сърцевината, като срещу аминокиселини 10-53 на HCV, , номемирани относително спрямо последователноста на HCV1 полипротеина, и/или маркираното за разпознаване антитяло на сърцевината на HCV може да се насочи срещу С-терминалната област на HCV антигена на сърцевината, като срещу аминокиселини 120-130 на HCV, номемирани относително спрямо последователноста на HCV1 полипротеина. Освен това, антигенът, който влиза в реакция с HCV антитялото от биологична проба може да произхожда от NS3 областа, като епитоп от сЗЗс областа на HCV полипротеина и може да се слее с амйнокиселинна последователност на човешка супероксид дисмутаза (hSOD). При този вариант за изпълнение, второто антитяло, маркирано за разпознаване, е реактивно с hSDO аминокиселинната последователност.

При един друг вариант за изпълнение, изобретението се отнася до метод за откриване на HCV инфекция в биологични проби. Методът включва: (а) предоставя се твърда подложка за имуноизследване, включваща две моноклонални антитела на сърциваната HCV и конформационен епитоп, включващ аминокиселинната последователност посочена на фигури 4A-4D; (Ь) комбинира се биологична проба с твърдата подложка, при условия, които позволяват на HCV антигени и антитела, когато присъстват в биологичната проба, да се свържат към поне две антитела на сърцевината и NS3/4a конформационен епитоп; прибавя се към твърдата подложка от етап (Ь) при условия за образуване на комплекс (i) едно първо антитяло, маркирано за разпознаване, при което първото антитяло, маркирано за разпознаване, е маркирано за разпознаване HCV антитялото на сърцевината, при което маркираното антитялото на сърцевината се насочва срещу един друг HCV епитоп на сърцевината, различен от поне две антитела на сърцевината, свързани към твърдата подложка; (ii) епитоп от сЗЗс областа на HCV полипротеин, слят към една hSOD аминокиселинна последователност; и (iii) едно второ антитяло, маркирано за разпознаване, при което второто антитяло, маркирано за разпознаване, е реактивно към hSOD аминокиселинната последователност; откриват се комплекси, образувани между антитела и антигени, като индикация за HCV инфекция в биологичната проба.

При някои варианти за изпълнение, най-малко двете антитела на сърцевината са насочени срещу N-терминална област на HCV антигена на сърцевината, така че срещу аминокиселини 10-53 на HCV, номерирани относително по отношение на HCV1 полипротеина, а маркираното за разпознаване антитяло на сърцевината на HCV се насочва срещу С-терминалната област на HCV антигена на сърцевината, като срещу аминокиселини 120-130 на HCV, номемирани относително спрямо последователноста на HCV1 полипротеина.

При един друг вариант за изпълнение, изобретението се отнася до метод за откриване на HCV инфекция в биологични проби. Методът включва: (а) предоставя се твърда подложка за имуноизследване, включваща слят антиген с множествен епитоп; (Ь) комбинира се биологична проба с твърдата подложка, при условия, които позволяват на HCV антигени и антитела, когато присъстват в биологичната проба, да се свържат към поне едно антитяло на анти-сърцевина, NS3/4a епитоп и слят антиген с множествен епитоп; (с) прибавя се към твърдата подложка от етап (Ь) при условия за образуване на комплекс (i) едно първо антитяло, маркирано за разпознаване, е маркирано за разпознаване HCV антитялото на сърцевината, се насочва срещу един друг HCV епитоп на сърцевината, различен от поне едното антитяло на сърцевината, свързано към твърдата подложка; (ii) едно първо и едно второ антитяло влизат в реакция с HCV антитяло от биологичната проба, реактивна с NS3/4a епитопа и слят антиген с множествения епитоп, съответно; и (iii) второто антитяло, маркирано за разпознаване е реактивно с антигени от (ii); (d) откриват се комплекси, образувани между антитела и антигени,, като индикация за HCV инфекция в биологичната проба.

Антитялото на анти-сърцевината може да е насочено срещу N-терминалната област на HCV антиген на сърцевината и това първо белязано за откриване антитяло на анти-сързевината може да е насочено срещу срещу N-терминалната област на HCV антиген на сърцевината, както е описано по-горе. Освен това, първият антиген, който влиза в реакция с HCV антитяло от биологичната проба може да включва епитоп от с23с областа на HCV полипротеина, и може да е слят с hSOD аминокиселинна последователност. В този контекст, второто антитяло белязано за откриване влиза в реакция с hSOD аминокиселинна последователност. Допълнително, вторият антиген, който влиза в реакция с HCV антитяло от биологичната проба може да включва епитоп от с23с областа на HCV полипротеина, както и един епитоп, който включва аминокиселинни Lys₁₀ до Ser₉₉ на HCV полипротеина, с делеция на Arg47 и заместване на Leu до

Тгр в позиця 44, с относителна номерация спрямо последователноста на HCV полипротеина. Епитопът може да е слят към hSOD аминокиселинна последователност. В този случай, второто белязано за откриване антитяло влиза в реакция с hSOD аминокиселинната последователност, Слятият антиген с множество епитопи може · да включва аминокиселинната последователност, описана на фигури 7A-7F.

При един друг вариант, за изпълнение, изобретението се отнася до метод за откриване на HCV инфекция в биологична проба, като посоченият метод включва: (а) предоставя се твърда подложка за имуноизследване, която включва две HCV антисърцевина моноклонални антитела, HCV NS3/4a конформационен епитоп, съдържащ аминокиселинната последователност, посочена на фигури 4A-4D и слят антиген с множествен епитоп, който включва аминокиселинната последователност, посочена на фигури 7A-7F, към който е свързан; (Ь) биологична проба се комбинира с твърда подложка при условия, който позволяват HCV антигени и антитела, когато присъстват в биологичната проба, да се свързват поне към двете анти-сърцевина антитела, NS3/4a конформационен епитоп, и слят антиген с множествен епитоп, съответно; (с) прибавя се към твърдата подложка от етап <Ь) при условия за образуване на комплекс (i) едно първо маркирано антитяло за откриване, при което това първо маркирано антитяло за откриване е маркирано за откриване HCV анти-сърцевина антитяло, при което маркираното анти-сърцевина антитяло е насочено срещу различен HCV епитоп на сърцевината^ свързан към твърдата подложка; (ii) епитоп от сЗЗс областа на HCV полипротеин, слят към hSOD аминокиселинна последователност и епитоп от с22 областа на HCV полипротеин, слят към hSOD аминокиселинна последователност; (iii) второ маркирано антитяло за откриване, при което това второ маркирано антитяло за откриване влиза в реакция с hSOD аминокиселинна последователност; (d) откриват се комплекси, образувани между антителата и антигените, ако присъстват, като индикация за HCV инфекция в биологична проба.

При този вариант, за изпълнение, най-малкото две анти♦ сърцевина антитела срещу N-терминална област на HCV антиген на сърцевината, такива както срещу аминокиселинна последователност 10-53 от HCV, номериран относително спрямо HCV1 полипротеин, и маркиран за откриване HCV антисърцевина антитяло срещу С-терминална област на HCV антиген на сърцевината, както срещу аминокиселинна последователност 120-130 от HCV, номериран относително спрямо последователноста на HCV1 полипротеина. Освен това, епитопът от с22 областта може да включва аминокиселини Lys₁₀ до Ser₉₉ на HCV полипротеина, с една делеция на Агд₄₇ и заместване на Leu с Тгр в позиция 44, номерирана относително спрямо последователноста на HCV1 полипротеина.

При един друг вариант за изпълнение, изобретението се отнася до комплекти за имунодиагностични тестове, където се включва твърдата подложка за имунологичното изследване, описана по-горе и инструкции за провеждане на имунодиагностичния тест.

При един друг вариант за изпълнение, изобретението се отнася до методи за получаване на твърдата подложка за имунологичното изследване, където се включва: (а) предоставяне на твърда подложка; и (Ь) свързване на HCV анти сърцевина антитялото, като един или два или повече, и найвмалко един изолиран HCV NS3/4a негов епитоп, и при желание, негов слят антиген с мъожествен епитоп. По-долу се описват анти-сърцевина антителата, NS3/4a епитопи и антигени с множествен епитоп.

При един допълнителен вариант, изобретението се отнася до слят антиген с множествен епитоп, който включва аминокиселинна последователност, посочена на фигури 7A-7F, или аминокиселинна последователност с поне 80% идентичност на последователноста, като 90% или повече идентичност на последователноста, която специфично влиза в реакция с антиHCV антитела, присъстващи в биологична проба от индивид, инфектиран с HCV. При някои варианти за изпълнение, слетият антиген с множествен епитоп се състои от аминокиселинна последователност, посочена на фигури 5A-5F.

При един друг вариант за изпълнение, изобретението се отнася до полинукпеотид, включващ кодираща последователност за слят антиген с множествен епитоп, по-горе, рекомбинантни вектори, включващи полинукпеотиди, клетки гостоприемници, трансформирани с рекомбинантни вектори, и методи за получавана на рекомбинантен слят антиген с множествен епитоп, включващи: (а) предоставяне на популация от клетки гостоприемници, по-горе; и (Ь) култивиране на популацията от клетки при условия, при което се експресира слятия антиген с множествен епитоп, кодиран от кодиращата последователност, присъстваща в рекомбинантния вектор.

Тези, както и други аспекти на настоятото изобретение ще станат очевидни след справка със следващото подробно описание и прикрепените фигури.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ

Фигура 1 е диаграмно представяне на HCV генома, което обрисува различни области на полипротеина, от който произлизат реагентите (реагенти и антитела) от настоящия опит.

Фигура 2 представлява схематична фигура на репрезентативен опит на комбинация антитяло/антиген от изобретението.

Фигура 3 обрисува аминокиселинната на репрезентативен NS3/4a конформационен антиген за използуване в настоящите изследвания. Удебеленият аланин в позиция 182 е заместен с нативен серин, който присъства нормално в тази позиция.

Фигури 4А до 4D обрисуват ДНК и съответната аминокиселинна последователонст на друг репрезентативен NS3/4a конформационен антиген за използуване в настоящите изследвания. Аминокиселините в позиция 403 и 404 на фигури 4А до 4D представят замествания на Pro с Thr, и Не със Ser на нативната аминокиселинна последователонст на HCV-1.

Фигура 5 представлява диаграма на структурата на pd.HCV1a.ns3ns4aPI.

Фигура 6 е диаграмно представяне на MEFA 12.

Фигури 7А до 7F показва ДНК и съответната аминокиселинна последователонст на MEFA.

Фигура 8 представлява схематична фигура на репрезентативно имуноизследване съгласно изобретението, при използуване на MEFA 12.

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

В практиката, настояшото изобретение използува, ако не е посочено друго, конвенционални методи на химията, биохимията, рекомбинантни ДНК техники и имунология, в обхвата на специелиста в областа. Тези техники са подробно обяснени в литературата. Виж например, Fundamental Virology, 2^nd Edition, vol, l&ll (B.N.Fields and D.M.Knipe, eds.); Blackwell Scientific Publications); T.E. Creghton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2^nd Edition, 1989); Methods in Enzymology (S. CoIowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.).

Трябва да се отбележи че, както се използува в настоящата заявка и прилежащите патентни претенции, пълния или непълен член в единствено число включва множество референци, при условие, че съдържанието не показва ясно, че става въпрос за друго. Така например, отпратка към “антиген” включва смес от два или повече антигена и други подобни.

В текста се използуват следните съкращения на аминокиселини:

Аланин: Ala (А) Аспарагин: Asn (N) Цистеин: Cys (С)

Аргинин: Arg (R) • Аспартамова киселина: Asp (D) Глутамин: Gin (Q)

Глутаминова киселина: Glu (Е) Глицин: Gly (Q)

Хистидин: His (Н) Левцин: Leu (L) Метионин: Met (М)

Пролин: Pro (Р) Треонин: Thr (Т) Тирозин: Tyr (Y)

Изолевцин: Не (I) Лизин: Lys (К) Фенилаланин: Phe (F)

Серин: Ser (S) Триптофан: Trp (W)

Валин: Vai (V)

I. Дефиниции

При описанието на настоящото изобретение се използуват следните термини и се счита, че се дефинират, както е посочено по-долу.

Термините “полипептид” и “протеин” се отнасят до полимер от аминокиселинни остатъци и не се ограничават до минимална дължина на продукта. Следователно, пептиди, олигопептиди, димери, мултимери и други подобни, се включват в определението. И двете, протеините в цяла дължина, както и тяхните фрагменти се обхващат от определението. Термините включват, освен това, постекспресионни модификации на полипептида, например, гликозилиране, ацетилиране, фосфорилиране и други. Освен това, за целите на настоящото изобретение, “полипептид” се отнася до протеин, който включва модификации, като делеции, добавки и замествания (обикновено консервативни в природата), към нативната последователност, толкова дълги, че протеинът да може да поддържа желаната активност. Тези модификаци могат да са предумишлени, както чрез сайт-насочент мутагенез, или могат да са спонтанни, както чрез мутации на гостоприемниците, които продуцират протеините или грешки, дължащи се на PCR амплифицирането.

Един HCV полипептид и полипептид, както е дефинирано по-горе, произлезъл от HCV полипротеина. Полипептидът няма необходимост физически да произлиза от HCV, но може да се продуцира синтетично или рекомбинантно. Освен това, полипептидът може да произлиза от който и да е от многбройните HCV щамове, както от щамове 1, 2, 3 или 4 HCV. Известни са голям брой консервативни и вариабилни области измежду тези щамове, като най-общо, аминокиселинните последователонсти на епитопи, произлизащи от тези области, имат висока степен на хомоложност на последователноста, например, хомоложност на аминокиселинна последователонст от повече от 30%, за . предпочитане над 40%, когато са линеаризилани и двете последователности. Таа например, терминът “NS3/4a” полипептид се отнася до нативен NS3/4a от различните HCV щамове, така както и NS3/4a аналози, мутеини и имуногенни фрагменти, както се дефинират по-долу. Пълният генотип на голямя част от тези щамове е известен. Виж например, U.S. патент 6,150,087 и GenBank Accession Nos. AJ238800 и AJ238799.

Термините “аналог” и “мутеин” се отнасят до биологичноактивни производни на стандартен образец молекули, или фрагменти на такива молекули, които задържат желаната активност, като имунореактивност при опитите, описани в настоящото. Най-общо, терминът “аналог” се отнася до съединения, които притежават последователност на нативен полипептид и структура с една или повече аминокиселинни добавки, замествания (обикновено консервативни в природата) и/или делеции по отношение на нативната молекула, толкова дълги, че модификациите .да не разрушават имуногенната активност. Терминът “мутеин” се отнася до пептиди, които притежават един или повече пептиди имитиращи (“пептоиди”), като тези, описани в International Publication No, WO 91/04282. за предпочитане, аналогът или,мутеинът притежава поне същата имуноактивност, като нативната молекула. Методи за получаване на аналози на полипептиди и мутеини са идвестни от състоянието на техниката и са описани по-долу.

Особено предпочитани аналози включват замествания, които са консервативни в природата, т.е., тези замествания, които се осъществяват вътре в семейството на аминокиселини, които са свързани в тяхните странични вериги. Специфично, аминокиселините обикновено се разделят на четири семейства: (1) сиселинни - аспартат и глутамат; (2) основни - лизин, аргинин, хистидин; (3) неполярни - аланин, валин, левцин, изолевцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) полярни без заряд - глицин, аспаргин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин понякога се класифицират като ароматни аминокиселини. Например, с право се счита, че едно изолирано заместване на левцин с изолевцин или валин, на един аспартат с глутамат, на треонин със серин, или на друго консервативно заместване на аминокиселина със структорно свързана аминокиселина, няма да има голям ефект върху биологичната активност. Например, полипептидът, представляващ интерес, може да включва до приблизително 5-10 консервативни или не консервативни аминокиселинни замествания, или или даже до приблизително 15-25 консервативни или не консервативни аминокиселинни замествания, или което и да е цяло число между 5-25, докато желаното действие на молекулата остава интактно. Специалистът в областа лесно може да определи областите на молекулата, представляваща интерес, които могат да толерират промени във връзка с Hopp/Woods и Kyte-Doolittle участъци, добре известни от състоянието на техниката.

Под “фрагмент” се разбира полипептид, който се състои от само една част от интактната последователност на цялата дължина на полипептида и сткруктура. Фрагментът може да '· 19 включва С-терминална делеция и/или N-телминална делеция на нативния полипептид. “Имуногенен фрагмент” на определен HCV протеин обикновено включва поне приблизително 5-10 съседни аминокиселинни остатъка от молекулата в цяла дължина, за предпочитане поне приблизително 15-25 съседни аминокиселинни остатъка от молекулата в цяла дължина, и попредпочитано поне приблизително 20-50 или повече съседни аминокиселинни остатъка на молекулата в цяла дължина, които дефинират един епитоп, или което и да е цяло чело между 5 аминокиселини и последователноста с цяла дължина, при положение, че въпросния фрагмент зъпъзва имунореактивноста в изследването, описано* в настоящото. Например, предпочитани имуногенни фрагменти, включват, но без да се ограничават до, фрагменти на HCV сърцевината, които включват, например, аминокиселини 10-45, 10-53, 67-88 и 120-130 на полипротеина, епитоп 5-1-1 (в NS3 областа на вирусния геном), така както и дефинираните епитопи от Е1, Е2, сЗЗс (NS3), сЮО (NS4), (NS3/4a и NS5 областите на HCV полипротеина, така както и който и да е друг от различни епитопи, идентифицирани от HCV полипротеина. Виж например, Chien et al., Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien et al., International Publication No. WO 93/00365; Chien, D.Y. International Publication No. WO 94/01778; U.S. патенти Nos. 6,150,087 и 6,121,020.

Терминът “епитоп”, както се използува в настоящото се отнася до последователност от поне приблизително 3 до 5, за предпочитане приблизително 5 до 10 или 15, и не-повече от приблизително 1000 аминокиселини (или което и да е цяло число между тях), което определя последователност, която сама по себе си или като част от по-голяма последователност, се свързва към антитяло, генерирано в отговор на такава последователност. Не съществува критична горна граница за дължината на фрагмента, който може да включва близко да цялата дължина на последователноста на протеина, или даже слят протеин, който да включва два или повече епитопа на HCV полипротеина. Епитоп, който може да се използува във въпросното изобретение не се ограничава до полипептид, който да притежава точната последователност -на участъка на родителския протеин, от който произлиза. Всъщност, вирусните геноми са в състояние на постоянен поток и съдържат няколко вариабилни домена, които проявяват сравнително високи нива на вариабилност между изолатите. Следователно, терминът “епитоп” обхваща последователности, идентични на нативната последователност, така както и модификации на нативната последователност, като делеции, прибавяния и замествания (обикновено консервативни в природата).

Области от определен полипептид, които включват епитоп могат да се идентифицират при използуване на какъвто и да е брой епитоп-картиращи техники, добре известни от състоянието на техниката. Виж например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glann E. Morris, Ed., 1996) Humans Press, Totowa, New Jersey. Например, линейни епитопи могат да се определят чрез например, конкурентно синтезиране на голям брой пептиди върху твърда подложка, пептидите съответстващи на участъци от молекулата на пептида, и поставяне в реакция на пептидите с антитела, докато пептидите са все още свързани към- подложките. Такива техники са известни от състоянието на техниката и са описани в, например, патент на САЩ № 4,708,871; Gaysen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Gaysen et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:178-182; Gaysen et al., (1986) Molec. Immunol. 23:709-715.

При използуване на такива техники са били идентифицирани голям брой епитопи на HCV. Виж например, Chien et al., Viral Hepatitis and Liver Dease (1994) pp. 320-324, както и по-долу. Подобно, конформационни епитопи лесно могат да се идентифицират чрез определяне пространствената конформация аминокйселини, като например, рьонтгенови лъчи и 2-измерен ядреномагнитен резонанс. Виж нопршмиру Epitope Mepping Protocols, по-горе. Могатда се идентифицират, също така, антигенни области на проеините, при. използуване на стандартни участъци за антигенност и хидропатия (стр 14-6,7), както тези изчислени при използуване на, например, Omiga версия 1.0 софтуерна програма, предоставена от Oxford Molecular Group. Тази компютърна програма използува Hopp/Woods метод, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1981) 78:3824-3828, за определяне* на профилите на антигенност, и Kyte-Doolittle техника, Kyte et.al., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132, за плотове на хидропатия.

Както се използува в настоящото, терминът “конформационен епитоп” се отнася до участък от цяла дължина на протеин, или. негов аналог или мутеин, притежаващ нативни структурни белези за аминокиселинната последователност, кодираща епитопа, в природния протеин в цяла дължина. Нативните структурни белези включват, но без да се ограничават до, гликозилиране и триизмерни структури. Дължината на последователноста, определяща епитопа може да обект на вариации в широки граници, тъй като се вярва, че тези епитопи са образувани от триизмерната форма на антигена (например, прегъване). Следователно, аминокиселините, които определят епитопа могат да са относително малко на брой, но да са широко разпръснати по дължината на молекулата (или даже по различни молекули, в слючай на димери, и т.н.), като се внасят в правилната конформация на епитопа чрез нагъване. Участъкът на антигена между остатъците, които дефинират епитопа не могат да са критични за конформационалната структура ва епитопа. Например, делеция или заместване на тези намесващи се последователности може да не засегне конформационния епитоп, при положение, че последователностите, които са критични за конформацията на епитопа се поддържат (например, необходимите цистеини за дисулфидните мостове, сайтове на гликозилиране, идр.).

Конформационните епитопи, присъстващи в NS3/4a областа лесно се идентифицират при зиползуване на методи, дискутирани по-горе. Освен това, присъствието или отсъствието на конформационен епитоп в определен полипептид може лесно да се определи чрез скриниране на антигена, представляващ интерес, с антитяло (поликлонален серум или монокпонален за конформационния епитоп) и сравняване на неговата реактивност с тази на денатурирана версия на антигена, който задържа единствено линейни епитопи (ако присъстват). При едно такова скриниране с използуване на поликпонални антитела може да представлява предимство абсорбирането първо на поликпоналния серум с денатурирания антиген и да се види дали задържа антителата към антигена, представляващ интерес. Освен това, в случая на NS3/4a, молекула, която запазва нативната конформация ще притежава протеазна и, при желание, хеликазна ензиматични активности. Такива активности могат да се установят при използуване на анзимни методи, както са описани по-долу.

За предпочитане, конформационен епитоп се получава рекомбинантно и се експресира в клетката, от която може да се извлече при условия, които запазват неговите структурни халактеристики, например, без денатуриране на епитопа. Такива клетки включват клетки от бактерии, дрожди, насекоми и бозайници. Експресирането и изолирането на конформационните епитопи от HCV полипротеина са описани в, например, International Publication WO 94/33053, WO 92/08732. алтернативно, възможно е да се експресират антигените и след това да се ренатурира протеина следвъзстановяване. Разбира се, също така, че химичния синтез също предоставя конформационен мимитопи на антигена, които влизат в кпъстосана реакция с конформационния епитоп на “нативния” антигена.

Терминът “слят антиген с множестевн епитоп” или “MEFA”, както се използуват в настоящото се счита, че включва полипептид, в който множествените HCV антигени са част от единична, непрекъсната аминокиселинна верига, която верига не се среща в природата. HCV антигените могдт да се свържат директно един с друг чрез пептидни мостове или могат да са отделно чрез намесване на аминокиселинни последователности. Слятите антигени също могат да съдържат последователности екзогенни за HCV полипротеина. Осовен това, присъстващите HCV последователности могат да образуват множествени генотипи и/или изолирани HCV. Примери за определени MEFAs за използуване в настоящите имуноизследвания са дадени в подробности в, например, International Publication No WO 97/44469 е са описани по-долу.

“Антитяло” се счита молекула, която по химични или физични начини се свързва специфично към полипептида, представляващ интерес. Следователно, HCV антитялото на сърцевината е молекула, която специфично се свързва към HCV протеина на сърцевината. Терминът “антитяло”, както се използува в ^настоящото включва антитела, получени от поликронални, както и от монокпонални препарати, така както и от следните: хибридни (химерни) молекули на антитела (виж например, Winter et al., (1991) Nature 349:293-299; и патент на САЩ № 4,816,567); и F(ab) фрагменти; Fv молекули (нековаленти хетеродимери, виж например, Inbar et al., (1972) Proc. Natl. Acad. Sci USA 69:2659-2662; и Ehrlich et al., (1980) Biochem 19:4091-4096); Fv молекули c единични вериги (sFV) (виж например, Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:58795883); структури на димерни и тримерни фрагменти на антитела; минитела (виж например, Pack et al., (1992) Biochem 31:15791584; Cumber et al., (19920) J Immunology 149B: 120-126); молекули на хуманизирани антитела (виж например, Riechman et al., (1988) Nature 332:332-327; Verhoyen et al., (1988) Science 239:1534-1536; и патентна публикация на Великобретания № GB 2,276,169, публикувана на 21.09.1994); и които и да са функционални фрагменти, получен от такива молекули, като такива фрагменти запазват свойствата на имунологично свързване на родителската молекула на антитяло.

Както се използува в настоящото, терминът “монокпонално антиняло” се отнася до състав на антитяло, притежаващ хомогенна популация от антитела. Терминът на се ограничава по отношение на видовете или източника на антитела, нито се счита, че се ограничава от ночина по който се получава. Следователно, терминът обхваща антитела, получени от миши хибридоми, така както и човешки моноклонални антитела, получени при използуване по скоро на човеши, отколкото на миши хибридоми. Виж например, Cote et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 1985, p. 77.

“Рекомбинантен протеин” е такъв протаин, който запазва желана активност и който е бил получен чрез рекомбинантни ДНК техники, както се описва в настоящото. Най-общо, генът, представляващ интерес се кпонира и се експресира в трансформирани организми, както се описва по-долу. Оргънизмът гостоприемник експресира чуждия ген, за да се получи протеина при условия на експресия.

Под “изолиран” се разбира, когато се отнася до полипептид, че посочената молекула се отделя и разделя, от целия организъм, с който молекулата се открива в природата или присъства при същественото отсъствие на други биологичини макромолекули от същия тип. Терминът “изолиран”, с оглед на полинуклеотида, е молекула нуклеинова киселина лишена, частично или изцяло, от последователности, които нормално са асоциирани с нея в природата; или последователност, както съществува в природата, но с хетероложни последователности асоциирани с нея; или молекула, дисаооциирана от хромозомата.

Под “еквивалентна антигенна детерминанта” се разбира антигенна детерминанта от различни под-видове или щамове на HCV, както от щамове 1, 2 или 3 на HCV. По-специално, известни са епитопи, като 5-1-1, и такива епитопи варират между щамовете 1, 2 и 3. така, епитопа 5-1-1 от три различни щама са еквивалентни антигенни детерминанти и следователно са “копия”, въпреки че тяхните последователности не са идентични. Най-общо, амино-киселинните последователности не са идентични. Най-общо, аминокиселинните последователности на еквивалентни антигенни детерминанти ще имат висока степен на хомоложност на последователности, например, хомоложност на аминокиселинната последователност от повече от 30%, за предпочитане повече от 40%, когато двете последователности се линеаризират.

“Хомоложност” се отнася до процента на подобност междудва полинукпеотида или две полипептидни части. Две <

ДНК, или две полипептидни последователности са “хомоложни по същество” една с друга, когато последователностите проявяват поне приблизително 50%, за предпочитане поне приблизително 75%, още по-предпочитано приблизително поне 80%-85%, за предпочитане поне приблизително 90%, и найпредпочитано поне приблизително 95%-98% подобност на последователностите, пир определена дължина на молекулите. Както се използува в настоящото, хомоложни по същество се отнася, също така до последователности.

Най-общо, “идентичност” се отнася до едно точно съответстви нуклеотид-към-нуклеотид или аминокиселина-къмаминокиселина на две полинуклеотидни или полипептидни последователности, съответно. Процентътт на идентичност може да се определи чрез директно сравняване на информацията от последователноста между две молекули чрез линеаризиране на последователностите, преброяване на точния брой съвпадения между двете линеаризирани последователности, като се разделя на дължината на най-късата последовмателност и се умножава резултата по 100.

Могат да се използуват лесно предоставени компютърни програми за помощ в анализа на подобноста и идентичноста, както ALIGN, Dayhoff, Μ.О. in Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff., 5 Suppl. 3:353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC, които адаптират локалната хомоложност алгоритъм на Smith and Waterman Advances in Appl. Math. 2:482-489, 1981 за анализ н пептиди. Програми за определяне на подобност и идентичност на нукпеотидни последователностисе предоставят от Wisconsin Sequence Analys Packcge, Varsion 8 (на разположение от Genetics Computer Group, Madison, Wl) например, BESTFIT, FASTA и GAP програми, които също се опират на алгоритъма на Smith and Waterman. Тези програми лесно се използуват с параметрите Ло подразбиране, препоръчани от производителя и описани в Wisconsin Sequence Analys Packcge, посочен по-горе. Например, процентът на подобност между определена нукпеотидна последователност и една сравнителна последователност може да се определи при използуване на алгоритъма на хомоложност на Smith and Waterman с таблица обобщаваща грешките и неудобството от интервала от шест нуклеотидни позиции.

Друг метод за установяване на процента на подобност, в контекста на настоящото изобретение, е използуването на MPSRCH пакет програми- с авторско право на University of Edinburgh, разработени от John F. Collins and Shane S. Sturrok, и разпространени от IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, СА). От тази серия пакети на Smith and Waterman може да се използува алгоритъм, при който се използуват параметри на грешката за таблица на резултатите (например, отворени наказателни дупки от 12, разширени наказателни дупки за един, и дупка за шест). От данните, които генерира “Match” стойноста рефлектира “подобноста на последователностите”. Други подходящи програми за изчисляване на процента на идентичност или на подобност на последователностите са известни, най-общо, от състоянието· на техниката, например, друга прпограма за линеаризиране е BLAST, която се използува при параметрите по подразбиране. Например, BLASTN и BLASTP могат да се използуват при използуване на следните параметри по подразбиране: генетичен код = стандартен; филтър няма; верига = и двете; отрязване = 60; очакване = 10; Матрикс = <

BLOSUM62; Описания = 50 последователности; сортиране по = HIGH SCORE; базаданни = не-излишен, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS транслация + Swiss протеин + Spupdate + PIR. Подробности за тези програми могат да се намерят на следните интернет адреси: http://www.ncbi.nlm.qov/cqi-bin/BLAST.

Алтнернативно, хомологията може да се определи чрез хибридизиране · на полинуклеотидите при условия, коитопозволяват образуването на солидни дуплекси между хомоложни области, последвано от смилане единоверижнаспецифична нуклеаза(и), и определяне на размера на смляните *

фрагменти. ДНК последователности, които са хомоложни по същество могат да се идентифицират при експеримент на Southern хибридизация при, например, строги условия, както са дефинирани за тази определена система. Дефинирането на подходящите условия на хибридизиране е в уменията на с пециалиста в областа. Виж например, Sambrook et al., по-горе; DNA Cloning, по-горе; Nucleic Acid Hybridization, no-rope.

“Кодираща последователност” или · последователност, която “кодира” избран полипептид е молекула нуклеинова киселина, която се транскрибира (в случай на ДНК) и транслира (в случай на РНК) в полипептид in vitro или in vivo, когато се постави под контрола на подходящи регулаторни последователност. Свързването на . кодиращите последователности се определя чрез стартов кодон при 5’ (амино) терминуса и стоп кодон на транслацията при 3 ‘ (карбокси) терминуса. Последователността за терминация на транскрипцията може да е локализирана в посока 3’ от кодиращата последователност.

“Операционно сварзан” се отнася до подреждане на елементи, при което, така описаните елементи са в конфигурация, така че да осъществяват желаната тяхна функция. Следователно, даден промотор, операционно свързан към кодираща последователност е в състояние да осъществи експресията на кодиращата последователност, когато присъстват факторите за правилна транскрипция, и др. Не е необходимо промоторът да е съседен с кодиращата последователност докато действа за насочване на неговата експресия. Следователно, например, участието на нетранслирани все още, но транскрибирани последователности може да се установи между промоторната последователност и кодиращата последователност, както могат и транскрибираните интрони, и промоторната последователност може все пак да се разглежда, като “операцинно сварзана” към кодиращата последователност.

“Контролен елемент” се отнася до полинукпеотидна последователност, която спомага за експресията на кодиращата последователност, към която е свързнана. Терминът включва промотори, последователности и за терминация на транскрипцията, регулаторни домени в посока upstream, сигнали за полиаденилация, нетранслирани области, включително 5’UTRs и 3’-UTRs и при необходимост, лидерни последователност и енхансери, които колективно предоставят възможност за транскрипцията и транслацията на кодиращата последователност в клетката гостоприемник.

“Промотор”, както се използува в настоящото е ДНК регулаторна област, способна да свързва РНК полимераза в клетката гостоприемник и да инициира транскрипцията на кодиращата последователност в посока downstream (3’ посока)операционно свързана с нея. За целите на изобретението, проторната последователност включва минималния брой бази или елементи, необходими за иницииране на транскрипция на гена, представляващ интерес при нива за откриване над фона. Измежду промоторните последователности е сайт за иницииране на транскрипцията, така както и домени за свързване на протеин (консенсус последователности), отоговорни за свързването на РНК полемуразата. Еукариотни промотори често’ но не винаги, съдържат “ТАТА” блок и “CAT” блок.

Контролни последователности, “насочват транскипцията” на кодираща последователност в клетка, когато РНК полимеразата се свързва с промотораната последователност и транскрибира кодиращата последователност в иРНК, която на свой ред се транслира в полипептида, кодиран от кодиращата последователност.

“Експресионна касета” или “експресонна структура” се отнася до обединяване, което направлява експресията на последователноста(ите) или гена(ите), представляващ интерес. Експресионната касета включва контролни елементи, както е описано по-горе, като промотор, който е операционно сварзан към (както към директната транскрипция на) последователността(ите или гена(ите), представляващ интерес, и често включва последователност за полиаденилиране, също така. При някои варианти за изпълнение на изобретението, експресионната касета, описана в настоящото, може да се съдържа в плазмидна структура. В допълнение към компонентите на експресионната касета, плазмидната структура * ·.· също може да включва един или повече маркери за селекция, сигнал, който позволавя на плазмидните структури да съществуват като едноверижни ДНК (например, М13 начало на репликация), поне един множествен сайт на кпониране, и “начало на репликация” от бозайник (например, начало на репликация от SV40 или аденовирус).

“Транформация”, както се използува в настоящото, се отнася до инсерирането на екзогенен полинукпеотид в клетка *

гостоприемник, независимо от използувания метод за инсериране: например, трансформиране чрез директно поемане, трансфекция, инфекция и други подобни. Екзогенният полинукпеотид може да се поддържа като неинтегриран вектор, например, епизом, или алтернативно, може да е интегриран в генома на гостоприемника.

“Клетка гостоприемник” е клетка, която е трансформирана, или е способна на трансформация от екзогенна ДНК последователност.

“Обикновена твърда подложка” означава единична твърд матрикс, към който, HCV полепептидите, които се използуват при посочените имуноизследвания, се свързват ковалентно или чрез нековалентни средства, като хидрофобна абсорбция.

“Имунологично реактивен” означава, че посочения антиген ще реагира специфично с анти-HCV антитела, присъстващи в биологична проба от индивид инфектиран с HCV.

“Имунен комплекс” означава комбинацията, образувана когато антитялото се свързва към един епитоп върху антигена.

Както се използува в настоящото, “биологична проба” се отнася до тъканна проба или течност, изолирана от субект, включително, но без да се ограничава до, например, кръв, плазма, серум, фекалийна маса, урина, костен мозък, жлъчка, гръбначномозъчна течност, лимфна течност, кожни проби, външна секреция от кожа, респираторния, чревния и урогениталния тракт, сълзи, слюнка, млеко, кръвни клетки, органи, биопсии, както и проби от съставки на in vitro клетъчни култури, включващи, но без да се ограничават до кондиционирана среда, получена от прорастването на клетки и тъкани в културална среда, например, рекомбинантни клетки, и клетъчни съставки.

Както се използува в настоящото, “маркер” и “маркери за откриване” се отнася до молекула, способна до бъде открита, включващ, но без да се ограничават до, радиоактивни изотопи, флуоресценцентни вещества, хемилуминесцентни вещества, хромофори, ензими, ензимни субстрати, ензимни кофактори, ензимни инхибитори, хромофори, багрила, метални йони, метални соли, лиганди (например, биотин, стрептавидин или хаптени) и други подобни. Терминът “флуоресцентно вещество” се отнася до вещество или до част от него, което е способен да проявява флуоресцения в границите за откриване. Определени примери за маркери, които могат да се използуват при изобретението включват, но без да се ограничават до пероксидаза от хрян (HRP), флуоресцеин, FITC, родамин, дансил, умбелиферон, диметилакридиниев естер (DMAE), тексаско червено, луминол, NADPH и α-β-галактозидаза.

II. Начини за осъществяване на изобретението

Преди да се опише с подробности настоящото изобретение, трябва да се разбира, че това изобретение не се ограничава до определени лекарствени форми или параметри на методи, които, естествено, могат да варират. Трябва да се разбира, също така, че използуваната терминология в насоящото е за целите единствено на описанието на определени варианти за изпълнение на изобретението, и не се счита за ограничаваща.

Въпреки, че в практиката на настоящото изобретение могат да се използуват многобройни състави и методи, подобни или еквивалентни на тези, описани в настоящото, предпочитаните материали и методи са описани в настоящото.

Както се отбелязва по-горе, настоящото изобретение се основава на отритието на нови диагностични методи за точно определяне на ранна HCV инфекция. Методите се основават върху идентифицирането и използуването на високоимуногенни HCV антитела и антигени, които присъстват при ранните стадии на HCV сероконверсията, като по този начин се увеличава точноста на откриване и се намаляват грешните резултати. Методите могат да се провеждат по подходящ начин под формата на единично изследване.

По-специално, изследването се провежда върху твърда подложка, към която е свързан един или повече HCV антисърцевина антитела (насочени или срещу същия или срещуразлични HCV епитопи на сърцевината) и един епитоп, произлизащ от NS3/4a областа на HCV полипротеина. Примери за определени анти-сърцевина антитела, поле.зни в настоящото изобретение включват, но без да се ограничават до, молекули на антитела, като монокпонални антитела, насочени срещу епитопи в областа на сърцавината, открита между аминокиселини 10-53; аминокиселини 10-45; аминокиселини 67-88; аминокиселини 120130; или антитела, насочени срещу който и да е от епитопите на сърцавината, идентифицирани в, например, Houghton et al., U.S. патент № 5,350,671; Chien et al., Chien et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien et al., European Publication No WO 93/00365; Chien, D.Y., International Publication No WO 94/0101778; и патент на САЩ с обществено притежание U.S. Patent Application Serial Nos. 08/403,590 и 08/444,818.

NS3/4a областта на HCV полепротеина е описана и аминокиселинната последователност и цялата структура на протеина са описани в, например, Yao et al., Structure (November 1999) 7:1353-1363; Sali et al., Biochem. (1998) 37:3392-3401; и Bartenschlager, R., J. Virol Hepat. (1999) 6:165-181. виж също така, Dasmahapatra et al., U.S. Patent No. 5,843,752. Въпросното имуноизследване използува понеедин конформационен епитоп, получен от NS3/4a областа, която съществува в конформацията, както е открита в естествено срещана в природата HCV частица или неговия инфектиращ продукт, като се показва чрез консеревиране от протеаза и, при желание, хеликазна ензимна активност, нормално проявявани от NS3/4a генния продукт и/или имунареактивност на антиген с антитела в биологична проба от субекти инфектирани с HCV, и загуба на имунореактивноста на епитопите при денатуриране на антигена. Например, конформационният епитоп може да се разруши чрез нагряване, промяна на pH до изключително кисело или основно, или чрез прилавяне на известни органични денатуриращи средства, като дитиотреитол (DTT) или подходящ детергент. Виж например, Protein Purification Methods, a prectical approach (E.L.V. Harris and

S. Angal eds., IRL Press) и денатурирания продукт, в сравнениес продукта, който не е третиран както по-горе.

Протеазната и хеликазната активности могат да се определят при използуване на стандарнтни ензимни изследвания, добре известни от състоянието на техниката. Например, протеазната активност може да се опрадали при използуване на опит, добрле известен от състоянието на техниката. Виж например, Takeshita et al., Anal. Biochem. (1997) 247:242-246; Kakiuchi et al., J. Biochem. (1997) 122:749-755; Sali et al., Biochemistry (1998) 37:3392-3401; Chao et al., J. Virol. Meth. (1998) 72:109-115; Cerretani et al., Anal. Biochem. (1999) 266:192197; Zhang et al., Anal. Biochem. (1999) 270:268-275; Kakiuchi et al., J. Virol. Meth. (1999) 80:77-84; Fowler et al., J. Biomol. Screen. (2000) 5:152-158; и Kim et al., Anal. Biochem. (2000) 284:42-48. Особено подходящо изследване за тестване на протеазна активност е посочено в примерите по-долу.

Подобно, изследвания за хеликазна активност са добре известни от състоянието на техниката и хеликазната активност на NS3/4a епитоп може да се определи при използуване на, например, ELISA изследване, както е описано от например, Hsu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1998) 253:594-599; сцинтилационна система за изследоване на проксималност, както е описано в Kyono et al., Anal. Biochem. (1998) 257:120-126; високоефективно скрининг изследване за вложеното количество, както е описано в, например, Hicham et al., Antiviral Res. (2000) 46:181-193 и Kwong et al., Methods Mol. Med. (2000) 24:97-116; така както и от други методи на изследване, известни от състоянието на техниката. Виж например, Khu et al., J. Virol. (2001) 75:205-214; Utama et al., Virology (2000) 273:316-324; Paolini et al., J. Gen. Virol. (2000) 81:1335-1345; Preugschat et al., Methods Mol. Med. (1998) 19:353-364; и Hesson et al., Biochemistry (2000) 39:2619-2625.

Дължината на антигена е достатъчна за поддържането на имунореактивен конформационен епитоп. Често, полипептидът съдържащ използуван ияантиген ще е почти в цяла дължина, въпреки че полипептидът може, също така да е съкратен, например, за да се увеличи разтворимоста или да се подобри секрецията. Обикновено, конформационен епитоп, открит в NS3/4a, се експресира в клетка като рекомбинантен полипептид и този полипептид предоставя епитопа в желаната форма, както е описано подробно по-долу.

Репрезентативни аминокиселинни последователности за NS3/4a полипептиди са показани на фигура 3 и фигура 4А до 4D. Удебеления аланин, който се появява в позиция 182 на фигура 23 е заместен с нативния серин, открит в тази позиция, с цел да се предотврати автокатализа на молекулата, която може иначе може да се получи. Аминокиселинната последователност показана на позиции 2-686 на фигури 4А до 4D съответства на аминокиселинни позиции 1027-1711 на HCV-1. иницииращ кодон (ATG), кодиращ Met е показан в позиция 1. допълнително Thr, който обикновено се среща в позиция 1428 на HCV-1 (аминокиселинна позиция 403 на фигура 4) е мутиран в Pro, а Ser, който обикновено се среща в позиция 1429 на HCV-1 (аминокиселинна позиция 404 на фигура 4) е мутиран в Не. Въпреки това, даже и нативната последователност, с или без Nтерминален Met, посочения аналог, с или без N-терминален Met, или други аналози и фрагменти могатда се използуват в посочените изселдавния, до толкова доколкото епитопът се продуцира при използуване на метод, който задържа или отново връща състоянието на неговата нативна конформация, така че протеазната активност, и при желание, хеликазната активност се запазва. Dasmahapatra et al., U.S. Patent No 5,843,752 и Zhang et al., U.S.Patent No 5,990,276, и двамата описват аналози на NS3/4a.

NS протеазата на NS3/4a е открита при приблизителна позиция 1027-1207, номерирано относително спрямо HCV-1, позиции 2-182 на фигура 4. структурата на NS3 протеазата и активния сайт са известни. Виж например, De Francesco et al., Antivir. Ther. (1998) 3:99-109; Koch et al., Biochemistry (2001) 40:631-640. Промени на нативната последователност, които бихабили нормално толерирани, ще са тези извън активния сайт на молекулата. По-специално, желателно е да се поддържат аминокиселини 1- или 2-155 от фигура 4, с малки или само консервативни замедтавния. Аминокиселини, които се намират извън 155 биха толерирали по-големи промени. Допълнително, ако се използуват фрагменти на NS3/4a последователноста, открита на фигура 4, тези фрагменти биха включвали най-общо най-малкото аминокиселини 1- или 2-155, за предпочитане аминокиселини 1- или 2-175, и най-предпочитано аминокиселини 1- или 2-188, с или без N-терминалния Met. Хеликазният домен се открива при приблизителни позиции 1193-1657 или HCV-1 (позиции 207-632 на фигура 4). Следователно, хеликазната активност е желана, този участък на молекулата ще бъде поддържан с малки или единствено консервативни промени. Специалистът в областа лесно ще определи други области, които биха толерирали промени, основаващи се върху известната структура на NS3/4a.

Твърдата подложка може, също така, да съдържа други антигени. Например сляти антигени с множестевн епитоп (названи “MEFAs”), както се описва в публикация на международна заявка No WO 97/44469, може да са свързани към твърдата подложка, при използуване в изследването. Такъв MEFAs включва множествени епитопи от две или повече от вируснети области, показани на фигура 1 и таблица 1. Поспециално, както е показано на фигура 1 и таблица 1, един HCV полипротеин, при разцепване, продуцира поне десет различни продукта, по реда на НН₂-сърцевина-Е1-Е2-р7- NS2- NS3- NS4aNS4b- NS5a- NS5b- COOH. Полипептидът на сърцевината се намира в позиции 1-191, номерирането е относително спрямо HCV-1 (виж Choo et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:24512455, за HCV-1 генома). Този полипептид, по-нататък се преработва за продуциране на HCV полипептид с приблизителни аминокиселини 1-173. Полипептидите на обвивката, Е1 и Е2, се намира в позиции 192-383 и 384-746, съответно. Р7 доменът се намира при позиции 747-809. NS2 е интегрален протеин на мембраната с протеолитична активност и се намира при позиции 810-1026 на полипротеина. NS2, било то самостоятелно или в комбинация с NS3 (намерен в приблизителни позиции 10271657), разцепва NS2- NS3 sissle връзка, което на свой ред генерира NS3 N-терминус и освобождава голям полипротеин, който включва както серин протеазна, така и РНК хеликазна активности. NS3 протеазата, открита в позиции 1027-1207, служи да се преработи оставащия полипротеин. Хеликазната активност се открива при позиции 1193-1657. Завършването на узряването на полипротеина се инициира чрез автокаталитично разцерване при връзката на NS3- NS4a, катализирано от NS3 серин протеаза. Последващо ИЗЗ-медиирано разцепване на HCV полипротеина се окъзва, че включва разпознаване на връзките на полипротеина за разцепване чрез NS3 молекула на друг полипептид. При тези реакции, NS3 освобождава N.S3 кофактор (NS4a, открит в позиции 1658-1711), два протеина (NS4b, открит в позиции 1712-1972, и NS5a, открит в позиции 1973-2420), и РНК зависима РНК полимераза (NS5b, открит в позиции 241-3011).

ТАБЛИЦА 1
Домен	Приблизителни свързвания*
С(сърцевина)	1-191
Е1	192-383
Е2	384-746
Р7	747-809
NS2	810-1026
NS3	1027-1657
NS4a	1658-1711
NS4b	1712-1972
NS5a	1973-242
NS5b	2421-3011
* Брой по отношение на Н	CV-1. Виж Choo et al., (1991) Pro

Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-2455.

Множествените HCV антигени са част от единична, непрекъсната верига на аминокиселини, чиято верига не се среща в природата. Така, линейният ред на епитопите е различен от този на в генома, към който те пренадлежат. Линейният ред на последователностите на MEFAs, който се използува в настоящото е за предпочитане подреден за оптимална антигенност. За предпочитане, епитопите са от повече от един HCV щам, като по този начин предоставят добавената възможност да се откриват множество щамове на HCV в единично изследване. Следователно, MEFAs, който се използува в настоящото може да включва различни имуногенни области, произлизащи от полипротеин, описан по-горе. Освен това, протеинът получен в резултат на изместването на рамката в областа на сърцивинате на полипротеина, както е описано в International Publication No WO 99/63941 може да се използува като MEFAs. При желание, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или повече от един или повече епитопи, произлизащи от HCV полипротеин могат да се срещнат в слятия протеин.

Например, епитопи, произлизащи от, например, хипервариабилна област на Е2, като област, подобна на областа на разпростиране на аминокиселини 384-410 или 390-410, може да се включи в MEFA антигена. Изключително ефективен Е2 епитоп е този, който включва консенсус последователност, произлизаща от тази област, като консенсус последователност Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-ProGly-Ala-Lys-GIn-Asn, която представлява консенсус последователност за аминокиселини 390-410 на HCV тип 1 генома. Репрезентативен Е2 епитоп присъстващ в. MEFA на изобретението може да включва хибриден епитоп на разпростиране на аминокиселини 390-444. такъв хибриден Е2 епитоп може да включва консенсус последователност, представляваща аминокиселини 390-410 , слята към нативната аминокиселинна последователност за аминокиселини 411-444 на HCV Е2.

Допълнително, антигените могат да произлизат от различни HCV щамове. Множество вирусни щамове на HCV са известни, и епитопи произлизащи от който и да е от тези щамове могат да се използуват в слят протеин, добре известно е, че който и да е вид организъм варира от един отделен организъм до друг и освен това един определен организъм, като вирус може да има голям брой различни щамове. Например, както е обяснено по-горе, HCV включва най-малкото 6 генотипа. Всеки от тези генотипове включва еквивалентни антигенни детерминанти. По-специално, всеки щам включва известен брой антигенни детерминанти, които присъстват върху всички щамове на вируса, но са леко различни от един вирусен щам до друг. Например, HCV включва антигенни детерминанти, известни като 5-1-1 (виж фигура 1). Тази определена антигенна детерминанта се явява в три различни форми върху три различни вирусни щама на HCV. В съответствие, при един предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, всичките три форми на 5-1-1 се появяват върху слят антиген с множествен епитоп, използуван в посоченото имуноизследване. Подобно, еквивалентни антигенни детерминанти от областа на сърцевината на различни HCV щамове също могат да присъстват. Най-общо, еквивалентни антигенни детерминанти имат висока степен на хомоложност по отношение на аминокиселинната последователност, която степен на хомоложност обикновено е 30% или повече, за предпочитане 40% или повече, при линеаризиране. Епитопът с множество копия, на настоящото изобретение също може да включва множество копия, които са точни .копия на същия епитоп.

Репрезентативни MEFAs за използуване в настоящото изследване са описани в International Publication No. WO 97/44469. Допълнителни репрезентативни MEFAs за използуване в настоящото, включват тези, названи като MEFA 13-и MEFA13.1. трябва да се разбира, че тези MEFAs са слабо репрезентитивни и други епитопи, произлизащи от HCV генома също ще намерят приложение в настоящото изследване и могатда се инкорпорират в тези други MEFAs.

ДНК последователноста и съответната аминокиселинна последователност на MEFA 12 е показана на фигури 7А до 7F. Общата структурна формула на MEFA 12 е показана на фигура 6 и е както следва: hSOD-E1 (тип 1) HVR консенсус (тип1а)-Е2 HVR консенсус(типове1 и 2)-сЗЗс къс (тип 1)-5-1-1 (тип 1)-5-1-1 (тип 3)5-1-1 (тип 2)-с100(тип 1)-NS5(Tnn 1 )-сърцевина(типове 1+2). Този епитоп с множество копия включва следната аминокиселинна последователност, номерирана относително спрямо HCV-1 (номерирането на комплекта на аминокиселинната последователност, посочен по-горе, следва номерирането предоставено в Choo et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA (1991) 88:2451-2455, където аминокиселина #1 е първия метионин, кодиран от кодиращата последователност на областа на сърцевината): аминокиселини 1-69 на супероксид дисмутаза (SOD, използувана за да засили експресията напротеина); аминокиселини 303 до 320 на полипротеина от Е1 областа; аминокиселини 390 до 410 на полипротеина, представляващи консенсус последователност за свръхвариабилната област на HCV-1a Е2; аминокиселини 384 до 414 на полипротеина от областа Е2, представляващи консенсус последователност за Е2 свръхвариабилни области на HCV-1 и HCV-2; аминокиселини 1211-1457 на HCV-1 полипротеина, които дефинират хеликазата; три копия на епитоп от 5-1-1, аминокиселини 1689-1735, една от HCV-1, една от HCV-З и една от HCV2, чиито копия са еквивалентни антигенни детерминанти на трите различни вирусни щама на HCV; HCV полипептид С100 на HCV-1, аминокиселини 1901-1936 на полипротеина; две точни копия на епитоп от NS5 областа на HCV-1, всяко от които с аминокиселини 2278 до 2313 на HCV полипротеина; и две копия на три епитопа от областа на сърцевината, две от HCV-1 и едно от HCV-2, които копия са еквивалентни антигенни детерминанти, представени от аминокиселини 9 до 53 и 64-88 на HCV-1 и 67-84 на HCV-2.

Таблица 2 показва аминокиселинните позициите на различни епитопи на MEFA 12 с отпратка към фигури 7А до 7F в настоящото. Номерирането в таблиците е относително, спрямо HCV-1. Виж Choo et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA (1991) 88:24512455. MEFAs 13 и 13.1 също споделят общата формула, / уточнена по-горе, за MEFA 12, с модификации, както е посочено на таблици 3 и 4, съответно.

Таблица 2. MEFA 12
mefa aa#	5’ край страна	епитоп	hcv aa#	Щам
1-69*	Nco1	hSOD
72-89	Mlul	E1	303-320	1
92-112	Hindi 11	E2 HVR' консенсус	390-410	1
113-143		E2 HVR1a^ консенсус	380-414	1,2
146-392	Spel	C22C къс	1211-1457	1
395-441	Sph1	5-1-1	1689-1735	1
444-490	Nrul	5-1-1	1689-1735	3
493-539	Clal	5-1-1	1689-1735	2
542-577	Aval	C100	1901-1936	1
580-614	Xbal	NS5	2278-2313	1
618-653	Bglll	NS5	2278-2313	1

(продължение)
654-741	Ncol	Епитопи г сърцевинат;	9-53, R47L 64-88 67-84	1 1 2
742-829	Ball	Епитопи ; сърцевинат;	9-53, R47L 64-88 67-84	1 1 2

* SOD протеина е срязан, така че за конюгата за определяне, маркиран с HRP анти-SOD антитяло не свързва *

MEFA. Епитопът на сърцевината се мутира, за да се предпазят антителата от HCV сърцевината, използувани при определянето, да се свържат към MEFA.

Таблица 3. MEFA 13
mefa aa#	5’ край страна	епитоп	hcv aa#	Щам
1-156	Nco1	Мутиран hSC (aa 70-72, AU
161-178	Mlul	E1	303-320	1
181-201 ·	Hindi 11	E2 HVR' консенсус	390-410	1
202-232		E2 HVR laконсенсус	384-414	1,2
235-451		СЗЗС къс	1211-1457	1
454-500	Hindlll	5-1-1 Pimut*	1689-1735	1
503-549	Nrul	5-1-1 Pimut*	1689-1735	3
552-598	Clal	5-1-1 Pimut*	1689-1735	2
601-636	Aval	C100	1901-1936	1

(продължение)
639-674	Xbal	NS5	2278-2313	1
677-712	Bglll	NS5	2278-2313	1
713-800		Епитопи t сърцевината	9-53, R47L 64-88 67-84	1 1 2
801-888		Епитопи h • сърцевината	9-53, R47L 64-88 67-84	1 1 2
* 5-1-'	епитопите са модифицирани чрез елиминиране г

възможни сайтове на разцерване (CS или СА) насочени чрез NS3/4a рекомбинантен протеин. Вместо CS или СА, последователността е променена на PI. Допълнително, SOD протеина е мутиран, така че конюгата за определяне, маркиран с HRP анти-SOD антитяло не свързва MEFA. Епитопът на сърцевината се мутира, за да се предпазят антителата от HCV сърцевината, използувани при определянето, да се свържат към MEFA.

Таблица 4. MEFA 13.1
mefa aa#	5’ край страна	епитоп	hcv aa#	Щам
1-86	Nco1	Мутиран hSO (aa 70-72, AU
89-106	Mlul	E1	303-320 •	1
109-129	Hindlll f	E2 HVR' консенсус	390-410’	1
130-160		E2 HVRIai консенсус	384-414	1,2

(продължение)

163-379		СЗЗС къс	1211-1457	1
382-428	Hindlll	5-1-1 Plmut*	1689-1735	1
431-477	Nrul	5-1-1 Plmut*	1689-1735	3
480-526	Clal	5-1-1 Plmut*	1689-1735	2
521-564	Aval	C100	1901-1936	1
567-602	Xbal	NS5	2278-2313	1
605-640	Bglll	NS5	2278-2313	1
641-728		Епитопи h сърцевината	9-53, R47L 64-88 67-84	1 1 2
729-816	9-	Епитопи 1 сърцевината	9-53, R47L 64-88 67-84	1 1 2

* 5-1-1 епитопите са модифицирани чрез елиминиране на възможни сайтове на разцерване (CS или СА) насочени чрез NS3/4a рекомбинантен протеин. Вместо CS или СА, последователността е променена на. PI. Допълнително, SOD протеина е мутиран, така че конюгата за определяне, маркиран с HRP анти-SOD антитяло не свързва MEFA. Епитопът на сърцевината, се мутира, за да се предпазят антителата от HCV сърцевината, използувани при определянето, да се свържат към MEFA.

При една форма на изследването, пробата се комбинира с твърда подложка, както е описано по-долу. Ако пробата е инфектирана с HCV, антигените на сърцевината, така както и антителата на HCV за тези епитопи, присъстващи върху твърдата подложка, ще се свържат към съставките на твърдата подложка. След това се прибавя анти-сърцевина антитяло маркирано за откриване. Маркираното анти-сърцевина антитяло е насочено срещу различен епитоп, а не като анти-сърцевина антитялото, което е свързано към твърдата подложка. Това антисърцевина антитяло свързва антигена на сърцевината, задържан от анти-сърцевина антителата върху твърдата подложка.

Добавя се, също така, антиген, който влиза в реакция с задържаното HCV антитяло от биологичната проба, която е заловила HCV антитяло от пробата, влиза в реакция с NS3/4a епитоп. Този антиген е, за предпочитане, епитоп, произлезъл от NS3/4a областа на HCV полипротеина. Този антиген свързва задържаното HCV антитяло от пробата. Известни са голям брой антигени, включващи такива епитопи, включително, но без да се ограничават до,, антигени произлизащи от сЗЗс и сЮО областите, така както и сляти протеини, включващи NS3/4a епитоп, като с25. тези, както и други NS3/4a епитопи се използуват в настоящото изследване и са известни от състоянието на техниката и са описани в

Houghton et al., U.S. Patent No. 5,350,671; Chien et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien et al., European Publication Nos. WO 93/00365; Chien et al., European Publication Nos. WO 93/00365; Chien D.Y., International Publication Nos. WO 94/0101778; и общо притежавани заявки за патент на САЩ с входящ No 08/403,590 и 08/444/818.

Прибавя се второ маркирано антитяло, насочено срещу описания по-горе антиген.антитялото може да е насочено срещу който и да е епитоп, включително в антигена. Например, антитялото ^;може да се насочи срещу NS3/4a областа, присъстваща в антигена. Алтернативно, ако гърният антиген се експресира като слят протеин, второто маркирано антитяло може да се насочи срещу слятия партньор. Могат да се прибавят в изследването допълнителни антигени и антитела, по-специално, ако твърдата подложка включва MEFA. Тези формати на изследванията са обяснени по-долу.

Репрезентативно изследване при условията на изобретението е посочено на фигура 2. както е показано на фигурата, твърдата подложка включва две анти-сърцевина монокпонални антитела, наименовани

11-13 и 11-7. тези антитела са насочени срещу един епитоп, открит в Nтерминалната област на протеина на сърцевината при аминокиселини 10-53, номериран относително спрямо последователноста на HCV1 полипротеина. Твърдата подложка включва, също така, един епитоп за NS3/4a. Биологичната проба се добавя към твърдата подложка. HCV антигена на сърцевината,, така както и антителата, насочени срещу NS3/4a епитопи, и двете присъстващи в пробата, ще се свържат с реактива за задържане върху твърдата подложка.

Маркирано с пероксидаза от хрян (HRP) анти-сърцевина моноклонално антитяло с11-14, насочено срещу С-терминалната област на сърцевината, открита в аминокиселинни позиции 120130, номерирана относително спрямо последователноста на HCV1 полипротеина се прибавя след това. Слят протеин, който включва последователност от човешки SOD (hSOD) и епитоп от сЗЗс областа се прибавя като второ HRP-маркирано антитяло, насочено срещу SOD участъка на слятия протеин. SOD-сЗЗс сливането се свързва към анти-ИБЗ антитяло и анти-SOD антитялото, на свой ред, свързва SOD-сЗЗс слятия протеин, откриване на маркировката означава наличие на HCV инфекция.

Друг репрезентативен пример при условията на изобретението, е посочен на фигура 8. конфигурацията на изследването на антитялото е антиген-антитяло-антиген сандвич изследване на задържането, при използуване на NS3/4a и MEFA 12. Твърдата подложка включва двете анти-сърцевина моноклонални антитела, описани по-горе, епитоп за NS3/4a, така както и репрезентативен MEFA, MEFA 12, който включва съкратена версия на човешки SOD. Както при горното изследване, биологичната проба се прибавя към твърдата подложка. HCV антигенът на сърцевината, така както антителата насочени срещу NS3/4a епитопа и епитопите върху MEFA, присъстващи в пробата, свързват реактив за задържаното върху твърдата подложка. Прибавят се два антигена, един който реагира с антитела от пробата, които свързват NS3/4a (както е описано по-горе) и един който реагира с антитела от пробата, който свързва MEFA 12. на фигура 8, антигенът, който влиза в реакция с комплекса MEFA 12/антитяло от пробата, е сливане между една SOD молекула и c22ks A47-L44W. c22ks антигенът е от областа на сърцевината и включва аминокиселините Lys₁₀ до Ser₉₉ на полипротеина, както и делеция на Агд₄₇ , обикновено присъствнаща и заместването на Leu от Тгр, в позиция 44. конюгатът за откриване на антитяло е второто HRP-маркирано моноклонално анти-SOD антитяло, описано по-горе.

Горе-описаните изследвания на антиген/антитяло комбинация са изключително полезни, тай като и двете, HCV '· антигена на сърцевината и антителата за NS3/4a и/или сърцевината могат да се открият чрез същата подложка в същото изследване. Освен това, както е описано по-горе, допълнителни HCV епитопи, като SOD-срят към сЮОО, 5-1-1, NS5 антигени, както и протеинът, получен от отместването на рамката в областа на сърцевината на полипротеина, както и описания в International Publication No. WO 99/63941, могат да се използуват при. коктейло на комбинацията, за да покрият други не-структурни епотипи на HCV.

С цел по-нататъшното разбиране на изобретението се предлага по-подробно разглеждане, след взимане предвид получаването на антитела за използуване във въпросното имуноизследване; получаване на полипептиди за използуване в имуноизследването; и методи за провеждане на имуноизследване.

Получаване на антитела за използуване в HCV имуноизследване

Както е обяснено по-горе, изследването използува различни антитела, които са свързани към твърдата подложка (например, едно или повече анти-сърцевина антитела), и които откриват камплексите антиген/антитяло, образувани когато HCV инфекцията, присъства в пробата. Тези антитела могат да са поликлонални или моноклонални препарати, моноспецифични антисеруми, човешки антитела, или могат да са хибридни или химерни антитела, както хуменизираните антитела, променени антитела, (Fab’)₂ фрагменти, (Fab) фрагменти, Fv фрагменти, антитела с единичен домен, структури на димерни или тримерни фрагменти, минитела, или тяхни функционални фрагменти, които се свързват към въпросния антиген.

Антителата се продуцират при използуване на техники, добре идвестни на специалистите в областа и описани в, например, патенти на САЩ Nos. 4,011,308; 4,722,890; 4,016,043; 3,876,504; 3,770,380; и 4,372,745. например, поликлонални антитела се генерират чрез имунизиране на подходящо животно, като мишка, плъх, заек, обца или коза, с антиген, представляващ интерес. С цел да се засили имуногенноста, антигенът може да е свързан към носител преди имунизирането. Такива носители са добре известни на специалистите в областа. Имунизирането обикновено протича чрез смесване или емулгиране на антигена във физиологичен разтвор, за предпочитане в помощно средство, като пълен адювант на Freund, и инжектиране на сместа или емулсията парантерално (обикновено подкожно или интрамускулно). Обикновено на животното се прилага лекарствено средство с подсилващо действие 2-6 седмици покъсно с една или повече инжекции от антиген във физиологичен разтвор, за предпочитане непълен адювант на Freund. Антителата могат да се генерират, също така чрез in vitro имунизиране, . при използуване на методи, известни от състоянието на техниката. Полкилоналният антисерум се получава след това от имунизираното животно. Виж, Houghton et al., патент на САЩ No. 5,350,671, за описание на получаването на анти-HCV поликлонални антитела.

Моноклонални антитела обикновено се получават при използуване на методи на Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497, или негова модификация. Характерно, мишка или плъх се имунизира, както е описано по-горе. Въпреки това, вместо да се взима кръв от животното, за да се отдели серума, далакът (и при желание някои големи лимфни възли) се отстранява и се се разделя(дисоцциира) на единични клетки. При желание, клетките от далака могат да се скринират (след отстраняване на неспецифично адхерентните клетки) чрез прилагане на клетъчна суспенсия в блюдо или ямка, с покритие от антигена. В-клетките, експресиращи свързани към мембраната имуноглобулин, специфичен за антигена, ще се свържат към блюдото, и не се промиват с остатъка от суспенсията. Получените В-клетки, цели или дисоциирани клетки от далак, след това се индуцират да се слеят с миеломни клетки, за да образуват хибридоми, и се култивират в селективна среда (например, среда с хипоксантин, аминоптерин, тимидин, ΉΑΤ”). Получените хобридоми се посяват чрез пределно разреждане, и се изследват за продукция на антитела, които се свързват специфично към имунизиращия антиген (и който не се свързва къмнесвързаните антигени). Селекционираните хибридоми, секретиращи моноклонални антитела след това се култивират или in vitro (например, в колби за тъканни култури или hollow fiber реактори), или in vivo (например, като асцити в мишки).

Продуцирането на различни анти-HCV моноклонални антитела е описано в, например, Houghton et al., патент на САЩ No 5,350,671; Chien et al., International Publication Nos. WO 93/00365; общопритежавана U.S. заявки за изобретение c входящи номера Nos., 08/403,590 и 08/444,818; и Kawahiwakuma et al., U.S. Patent No. 5,871,904.

Както е обяснено по-горе, фрагментите отантитела, които запазват способноста да разпознават антигена, представляващ интерес, също ще намерят приложение във въпросното имуноизследване. От състоянието на техниката са известни голям брой фрагменти на антитела, които съдържат сайтове за свързване на антигена, способни да проявят имунологични свойства на свързване на молекула на интактно антитяло. Например, фрагменти на функционални антитела могат да се продуцират чрез разцепване на констнатнта област, която не е отговорна за свързването на антигена, от молекулата на антитялото, при използуване на, например, пепсин, за продуциране на F(ab’)₂ фрагменти. Фрагментите ще съдържат два сайта за свързване на антигени, но ще липсва участък от константната област от всяка от тежките вериги. Подобно, при желение, Fab фрагменти, съдържащи единичен сайт за свързване на антиген, могатда се продуцират, например, чрез смилане на полйклонално или моноклонално антитяло с папаин. Функционални фрагменти, включващи единствено вариабилните области на тежката и леката вериги, също могат да се продуцират при използуване на стандартни техники, като рекомбинантно продуциране или преференциално протеолитично разцерване на молекулите на имуноглобулина. Тези фрагменти са известни като Fv. Виж например, Inbar et al., (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2659-2662; Hochman et al., (1976) Biochem 15:2706-2710; и Ehrlich et al._r (1980) Biochem 19:4091-4096.

Едноверижен Fv (“sFv” или “scFv”) полипептид е ковалентно свързан V_H-V_L хетеродимер, който се икспресира от генно сливане, включващо V_H- и \4-кодиращи гени, свързани чрез пептид-кодиращ линкер. Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883. Описани са голям брой методи за разпознаване и развитие на химични структури (линкери) за конвертиране на естествено агрегирани задържаното, но химически разделени, леки и тежки полипептидни вериги от V областа на антитяло в sFv молекула, която ще се нагъне в триизмерна структура, по същество подобна на структурата на антиген-свързващия сайт. Виж например, патенти на САЩ Nos. 5,091,513; 5,132,405; и 4,946,778. sFv молекулите могат да се продуцират при използуване на методи, описани в техническата същност на изобретението. Виж например, Huston et al., (1988) Proc. Natl, Acad. Sci. USA 85:5879-5883; патенти на САЩ Nos. 5,091,513; 5,132,405; и 4,946,778. Критериите за проектирането включват определяне на подходящата дължина за обхващане на разстоянието между С-терминуса на една верига и N-терминуса на другата, при което линкерът, обикновено образуван от малки хидрофилни аминокиселинни остатъци, които нямат тенденция за слепване или за образуване на вторични структури. Такива методи са описани в предществащото състояние на техниката. Виж например, патенти на САЩ Nos. 5,091,513; 5,132,405; и 4,946,778. подходящите линкери обикновено включват полипептидни вериги на алтернативни комплекти на глицинови и серинови остатъци, и могат да включват остатъци на глутаминова киселина и лизинови остатъци, инсерирани за засилване на разтворимоста.

“Мини-антитела” или “минитела” също ще намерят приложение в настоящото изобретение. Минителата са sFv полипептидни вериги, които включват домени на олигомеризация при техните С-терминуси, разделени от sFv от шавнирна (hinge) област. Pack et al., (1992) Biochem 31:15791584. Доменът на олигомеризация включва самоасоцииращи се α-спирали, например, левцин “зипери”, които могат след това да се стабилизират чрез допълнителни дисулфидни мостове. Доменът на олигомеризация е проектиран да е съвместим с векторното нагъване през мембраната, процес, за който се предполага, че подпомага in vivo нагъването на полипептида във функционален свързващ протеин, обикновено, минителата се продуцират при иползуване на рекомбинантни методи, добре известни от техническата същност на изобретението. Виж например, Pack et al., (1992) Biochem 31:1579-1584; Cumber et al., (1992) J Immunology 149B:120-126.

Получаване на антигени за използуване при HCV имуноизследвания

Както е обяснено по-горе, молекулите от настоящото изобретение обикновано се продуцират рекомбинантно. Така, полинуклеотидите, кодиращи· HCV антигените за използуване в настоящото изобретение, могат да се получат при използуване на стандартни техники на молекулярната биология. Например, полинукпеотидните последователности, кодиращи гореописаните молекули могат да се получат при използуване на рекомбинантни методи, както чрез скриниране на сДНК и геномни библиотеки от клетки, експресиращи гена, или чрез ген произлизащ от вектор, известен с това, че включва същия. Освен това, желаният ген може да се изолира директно от молекулите на вирусните нуклеинови киселини, при използуване на техники, описани в състоянието на техникит, както Houghton et al., U.S. Patent No. 5,350,671. Генът, представляващ интерес може да се продуцира, също така, синтетично, а не да се клонира. Молекулите могат да се проектират с подходящи кодони за определената последователност. След това се сглобява пълната последователност от припокриващи се олигонукпеотиди, изготвени чрез стандартни методи и сглобени в пълна кодираща последователност. Виж например, Edge et al., (1981) Nature 292:756; Nambair et al., (1984) Science 223:1299; и Jay et al., (1984) J. Biol. Chem. 259:6311.

Следователно, определени нуклеотидни последователност могат да се получат от вектори, пренасящи желаните последователност или да се синтезират изцуло или частично при използуване на различни техники на олигонукпеотиден синтез, известни от състоянието на техниката, както сай-насочен мутагенез и полимеразна верижна реакция (PCR) техники, когато са подходящи. Виж например, Sambrook, по-горе. По-специално, един метод за получаване на нуклеотидни последователности, кодиращи желаните последователности е чрез хибридизиране комплементарните сетове на припокриващи се синтетични олигонуклеотиди, продуцирани чрез конвенционален, автоматизиран полинуклеотиден синтезатор, следвано от лигиране с подходяща ДНК лигаза и амплифициране на лигираната нуклеотидна последователност чрез PVR. Виж например, Jayaraman et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4084-4088.

Допълнително, насочената синтеза на олигонуклеотиди (Jones et al., (1986) Nature 54:75-82), насочения мутагенез на олигонуклеотиди на предварително съществуващи нуклеотидни области ( Richmann et al., (1988) Nature 332:323-327), и Verhoeyen et al., (1988) Science 239:1534-1536, и ензимно запълняне на олигонуклеотиди с “празнини” при използуване на Т₄ ДНК полимераза (Queen et al., (1989) Proc. Acad. Sci. USA 86:1002910033) могат да се използуват за изобретението, за да се предоставят молекули, с променени или засилени антигенсвързващи способности, и/или намалена имуногенност.

•58

След като веднъж се изготвят или изолират кодиращите последователности, такива последователности могат да се клонират в който и да е подходящ вектор или репликон. Голям брой кпониращи вектори са известни на специалистите в областа и селекцията на който и да е подходящ вектор за клониране е въпрос на избор. Подходящите вектори включват, но без да се ограничават до, плазмиди, фаги, транспозони, космиди, хромозоми или вируси, които са способни на репликация когато се асоциират с правилен контролен елемент.

След това, кодиращата последователност се поставя под контрола на подходящи контробни елементи, в зъвисимост от системата, която ще се използува за експресиране. По този начин кодиращата последователност може да се постави под контрола на промотор, сайт за свързване на рибозом (за бактериална експресия) и, при желание, оператор, така че ДНК последователността, представляваща интерес да се транскрибира насочената синтеза на олигонукпеотиди Nature 54:75-82), (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033) последователности PHK чрез подходящи трансформанти.

•

Кодиращата последователност може да съдържа или да не съдържа сигнален пептид или ледерна последователност, които могат по-късно да бъдат отстранени от гостоприемника чрез пост-транслационен процесинг. Виж например; патенти на САЩ Nos. 4,431,739; 4,425,437; 4,338,397.

В допълнение към контролните последователности, може да е желателно да се добавят регулаторни последователности, които да позволяват регулирането на експресията на последователностите, свързани с растежа на клетката гостоприемник. Регулаторните последователности са известни на специалистите в областа и примери включват тези, които причиняват експресията на гена, който трябва да се “включи” или “изключи” в отговор на химичен или физичен стимул, включително присъствието на регулаторно съединение. Друг тип регулаторни елементи също могат да присъстват във вектора. Например, енхансерни елементи могат да се използуват в настоящото, за увеличаване нивата на експресията на структурите. Примери, които включват SV40 ранен генен енхансер (Dijkema et al., (1985) EMBO j. 4:761) енхансер/промотор произлизащ от дългия краен повтор (LTR) на Raous Sarcoma Virus (Gorman et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777) и елементи, произлизащи от човешки CMV (Boshart et al., (1985) Cell 41:521), както и елементи, включени в е последователността на интрон А на CMV (патент на САЩ No. 5,688,688). Експресианната касета може да включва, освен това, начало на репликация за автономна репликация в подходяща клетка гостоприемник, един или повече маркери за селекция, един или повече рестрикционни сайтове, потенциал за голям брой копия е силен промотор.

* Един експресионен вектор се конструира така, че посочената кодираща област да се локализира във вектора с подходящите регулаторни последователности, позициониране и ориентиране на кодиращата последователност, като се имат предвид контролните последователности, да са такива, че кодиращата последователност да се транскрибира под “контрола” на контролни последователности (т.е. РНК полимераза, която се свързва към ДНК молекула при контролните последователности, да транскрибира кодиращите последователности). Модифициране на последователностите, кодиращи молекулата, представляваща интерес може да е желано за достигане на този.край. Например, при някои случаи може да е необходимо да се модифицира последователноста така, че да може да се прикрепи към контролните последователности в подходящата ориентация; т.е., да се поддържа рамката на разчитане. Контролните последователности и други регулаторни последователности могат да се лигират към кодиращата последователност преди инсериране във вектор. Алтернативно, кодиращата последователност може дируктно да се клонира в експресионен ч», вектор, който вече съдържа контролните последователности и подходящ рестрикционен сайт.

Както е обяснено по-горе, може да е желателно,‘също така, да се продуцират мутанти или аналози на антигена, представляващ интерес. Това е в сила особено за NS3/4. методи за постигане на това са описани в, например, Dasmahapatra et al., U.S. Patent No. 5,843,752 и Zhang et al., U.S.Patent No 5,990,276. мутанти или аналози на този и други HCV протеини за използуване при въпросното изследване могат да се приготвят чрез делетиране на участък от последователноста, кодираща полипептида, представляващ интерес, чрез инсериране на последователност, и/или чрез заместване на един йли повече нукпеотида в последователноста. Техники за модифициране на нуклеотидни последователности, като сайт-насочен мутагенез, и други подобни, са добре известни на специалиста в областа. Виж, например, Sambrook et al., по-горе; Kunkel, Т.А. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:448; Geisselsoder et al., (1987) BioTechniques 5:786; Zoller and Smith (1983) Methods Enzymol.

100-468; Dalbie-McFarland et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6409.

Молекулите могат да се експресират в широка гама от системи, включително експресионни системи от насекоми, бозайници, бактерии, вируси и дрожди, също известни от предшестващото състоянието на тепниката.

Например, експресионна система от клетки на насекоми, като бакуловируснй системи, са известни на специалистите в областа и са описани в, например, Summers and Smith, Texas Agricultural Experimement Station Bulletin No. 1555 (1987). Материали и методи за експресионни системи от бакуловирус/кпетки на насекоми се предоставят на пазара под формата на комплекти, между другото на Invitrogene, San Diego СА (“МахВас” комплект). Подобно, експресионни системи от клетки на бозайници и бактерии са известни от предшестващото състояние на техниката и са описани в, например, Sambrook et al., по-горе. Експресионни системи от дрожди също са известни от предшестващото състояние на техниката и са описани в, например, Yeast Genetic Engineering (Barr et al., eds., 1989) Butterworths, London.

Известни са, също така, голям брой клетки гостоприемници, за използуване с горните системи. Например, известни са от предшестващото състояние на техниката клетъчни линии от бозайници и включват имортализирани клетъчни линии, предоставени от American Type Culture Collection (ATCC), както, но без да се ограничава до, клетки от яйчник на китайски хамстер (СНО), HeLa клетки, клетки от бъбрек на бебе хамстер (ВНК), клетки от бъбрек на маймуна (COS), клетки от бъбрек на човешки ембрион, клетки от човешка хепатокарцинома (например Hep G2), Madin-Darby клетки от говежди бъбрек (“MDBK”), така както и други. Подобно, бактериални гостоприемници, като Е. coli, Bacillus subtilis, и Streptococcus spp., ще намерят приложение с настоящите експресионни структури. Гостоприемници дрожди, които намират приложение в настоящото изобретение включват, между другото, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha. Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe и Yarrowia lipolytica. Клетки от насекоми за използуване с експресионни вектори от бакуловирус включват, между другото, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda и Trichoplusia ni.

Молекули нуклеинови киселини, които съдържат и\/1/плптм п им πηοπΑτοηπαοοι им митлпал ллпгот

ΓΊ y IXJ I ΚΙ^ΓΊ KI I ll/X^J I X-zjL^X-/0 G4 I X», J I П ЧУХ-, I KI , I l|JV|IJ|V I G4OJ IЛ DULL^I KI ΓΊ I X-z |м» X> 0 IVIX^IG* стабилно да бъдат интегрирани в генома на клетката гостоприемник или да се поддържат върху стабилен епизомален елемент в подходяща клетка гостоприемник, при използуване на различни техники на доставяне на гени, добре известни от предшестващото състояние на техниката. Виж например, патент на САЩ No. 5,399,346.

Спооед избоаната експоесионна система и гостопоиемник, молекулите се продуцират чрез култивиране на клетките гостоприемник, трансформирани чрез, експресионен вектор, описани по-горе при условия, при които протеинът се експресира. Експресираният протеин се експресира, след това, от клетките гостоприемник и се пречиства. Ако експресионната система секретира протеина в растителната среда, продуктът може да се поечисти диоектно от соедата. Ако не се секоетиоа, той може да се изолира от клетъчните лизати. Изборът на подходящите растежни условия и на методине на извличане са известни от предшестващото състояние+ia техниката.

Рекомбинантното продуциране на различни HCV антигени е описано вече. Виж например, Houghton et al., U.S. патент № 5,350,671; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien et al., International Publication No WO 93/00365; Chien, D.Y., International Publication No WO 94/0101778.

Имунодиагностични-изследвания

След като се продуцира, горните анти-сърцевина антитела и NS3/4aHTnreHH се поставят върху подходяща твърда подложка за използуване в посочените имуноизследвания. Твърда подложка, за целите на изобретението, може да е който и да е материал, който е неразтворим матрикс и може да има твърда или полу-твърда повърхност. Примерни твърди подложки включват, но без да се ограничават до, субстрати като нитроцелулоза (например, под формата на мембрана или микротитърна ямка); поливинилхлорид (например, повърхност или микротитърна ямка); полистиролов латекс (например, перли или микротитърно блюдо); поливинилидин флуорид;

* диазотизирана хартия; найлонови мембрани; активирани перли, магнито-чувствител.ни перли, и други подобни. Определени подложки включват блюда, пелети, дискове, капиляри, кухи влакна, игли, карфици, твърди влакна, целулозни перли, порьозни стъклени перли, силикагел, полистиролови перли, при желание омрежени с дивинилбензен, перли от присадени съполимери, полиакриламидни перли, диметилакриламидни перли, при желание омрежени с М-1М’=бис-акрилоилетилендиамин, и стъклени частици с покритие от ходрофобен полимер.

При желание, молекулите, които трябва да се добавят към твърдата подложка лесно могат да се направят функционални за създаване на стиролови или акрилатни остатъци, като по този начин да се направи възможно инкорпорирането на молекулите в полистирол, полиакрилат или полимери, като полиамид, полиакриламид, полиетилен, поливинил, полидиацетилен, полифенилен-винилен, полипептид, полизахарид, полисулфонил, полипропол, полиимидазол, политиофен, полиетир, епокси, квърцово-стъкло, силикагел, полифосфат, хидрогел, агароза, целулоза, и други подобни.

При един контекст, твърдата подложка първо се привежда в реакция с HCV анти-сърцевина антитела и NS3/4 епитоп (колективно наричани “компоненти на твърдата фаза”, в настоящото), и при желание, един или повече MEFAs, при условия подходящи за свързване, така че молекулите да са достатъчно имобилизирани към твърдата подложка. Понякога, имобилизирането към твърдата подложка може да бъде усилено, като първо се свърже антигена и/или антитялото към протеин с по-добри свойства на свързване към твърда фаза. Подходящи свързващи протеини включват, но без да се ограничават до, макромолекули като серумен албумин, говежди серумен албумин (BSA), хемоцианин от keyhole limpe (вид риба), молекули именоглобулин, тироглобулен, овалбумин, и други протеини, добре известни на специалистите в областа. Други реагенти, които могат да бъдат използувани за свързване на молекули към подложката включват полизахариди, полимлечни киселини, полигликолови киселини, полимерни аминокиселини,

Чш··'

Чйй.‘^! аминокиселинни съполимери, и други подобни. Такива молекули и методи на присъединяване тези молекули към анатигени са добре известни на специалистите в областа. Виж например, Brinkley, М.А. (1992) Bioconjugate Cham. 3:2-13; Hashida et al., (1984) J. Appl. Biochem. 6:56-63; и Anjaneyulu and Storos (1987) International J. of Peptide and Protein Res. 30:117-124.

След като влезе в реакция твърдата подложка с компонентите на твърдата фаза, всички не-имобилизирани компонентите на твърдата фаза се отстраняват от подложката чрез промиване, а свързаните с подложката компонентни се привеждат тогава в контакт с биологичната проба, за която се предполага, че съдържа HCV антитела и антигени (колективно наречени в настоящото “лигандни молекули”), при подходящи условия на свързване. След промиване, за да се отстранят всички несвързани лигандни молекули, второ анти-сърцевина антитяло насочено срещу друг епитоп, различен от антисърцевина антитялото, свързван към подложката, се прибавя при подходящи условия на свързване. Добавеното антисърцевина антитяло съдържа откриваем маркер, както е описано по-горе, и действа към свързване на който и да е антиген, който би могъл да присъства в пробата, която е реагирала с антисърцевина антитялото свързано с подложката. Прибавят се, също така, един или повече антигени, които могат да реагират с антитела, които присъстват в пробата, която на свой ред е реагирала с NS3/4 епитопа. Както е обяснено по-горе, антигенът произлиза характерно от NS3/4 областа на HCV полипротеин, и по-специално от сЗЗс областа на HCV. Виж например, Houghton et al., патент на САЩ No. 5,350,671. нуклеотидните и аминокиселинните последователности за човешка SOD са известни и са посочени в Hallewell et al., U.S. No. 5,710,033. Маркирано антитяло, насочено срещу човешки SOD може, следователно, да се използува за откриване присъствието на комплекси, образувани между NS3/4 епитоп, което и да е антитяло в пробата, което влиза в реакция с този епитоп, и HCV полипептиди, които на свой ред свързват антитялото в пробата.

Ако присъства MEFA върху твърдата подложка, един или повече допълнителни антигени, които влизат в реакция с «

антитела от биологичната проба, които са свързани с антигени, присъстващи върху MEFA, също могат да се добавят към изследването. Особено полезен, в този контекст, е един антиген, произлизащ от областа на сърцевината на HCV, ι/ι по-специално, от с22 антигена, който включва 119 · N-терминални аминокиселини на сърцевината на HCV полипротеина. Един определен анхиген, произлизащ от с22 е c22ks A47-L44W, който включва аминокиселини Lys₁₀ до Ser₉₉ на полипротеина, както и делеция на Arg47, обикновено присъстваща и заместване на Leu с Тгр в позиция 44. както при описания по-горе сЗЗс епитоп, този антиген може да се достави като слят с hSOD и същото маркирано антитяло, насочено срещу човешки SOD може да се използува за откриване присъствието на комплекси, образувани между антителата, които присъстват в пробата и NS3/4a епитопа и/или MEFA,които комплекси също са свързани с HCV антигените (например, сЗЗс и с22).

По-специално, може да се използува ELISA метод, при който ямките на миктотитърните блюда са с покритие от съставките на твърдата фаза. Биологична проба, съдържаща или за която се подозира, че съдържа лигандни молекули се добавя след това към ямките с покритието. След период на инкубиране, достатъчен за да се позволи свързването на лигандните молекули към имобилизираните съставки на твърдата фаза., блюдото(ата) може да се промие за да се отстранят несвързаните молекули и маркираната за откриване вторично свързана молекула (маркирано анти-сърцемина антитяло), молекула, съдържаща NS3 епитоп, и антитяло, насочено срещу молекулата, съдържаща NS3 епитоп могат да се добавят. На молекули се дава възможност да взаимодействат с който и да задържан антиген и антитяло от проба, блюдото се промива и се открива присъствието на маркираните антитела чрез използуване на методи, добре известни от предшестващото състояние на техниката.

Горе-описаните реагенти, включително твърдата подложка на имуноизследването със свързаните антитела и антигени, така както и антителата и антигените, които ще влезат в реакция с задържаното проба могат да се доставят като китове (комплекти), с подходящи инструкции и други необходими реагенти, с цел да се проведе имуноизследването, както е описано по-горе. Китовете могат да съдържат освен това, според определеното имуноизследване, което се използцува, подходящи маркери и други пакетирани реагенти и материали (т.е. промивни буфери и други подобни). Стандартни имуноизследвания, като тези описани по-горе, могат да се проведат при използуване на тези китове.

III. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНА ЧАСТ

По-долу се	излагат примери за	изпълнение	на
изобретението за	специфични	варианти за	изпълнение,	за
провеждане на	настоящото	изобретение.	Примерите	се

предлагат единствено с илюстративна цел, и нямат цел да ограничават обхвата на настоящото изобретение по какъвто и да е начин.

Направени са усилия за осигуряването на точност по отношение на използуваните цифри (например, количества, температури, и др), но някои експериментални грешки и отклонения могат, разбира се, да се допуснат.

ПРИМЕР 1

HCV антиген/антитяло комбинирано изследване

Настоящото HCV антиген/антитяло комбинирано изследване се сравнява с други HCI изследвания, за да се тестват границите на откриване на сероконверсията и да се сравнят тези граници с тези, получени при други, достъпни от търговската мрежа, изследвания, както следва.

А. Материали и Методи

Кръвни проби: Използуват се панели от достъпни на пазара човешки кръвни проби. Такива панели се доставят от например, Boston Biomedica, Inc., West Bridgeswater, MA (BBI); Bioclinical Partners, Franklin, МА (ВСР); и North American Biologies, Inc., *

BocoRatan, FL (NABI). Дните, отбелязани в таблиците 5 и 6 са дните, в които се взима кръм от субектите.

Моноклонални антитела: Монокпонални антитела с11-3, с11-7 и с11-14 се получават от Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey. c11-3 и c11-7 антителата са насочени срещу Nтерминалния участък на сърцевината (аминокиселини 10-53, номерирани относително по отношение на HCV1 полипротеина). Моноклоналното антитяло с11-14 е насочено срещу Стерминалния участък но сърцевината (аминокиселини 120-130, номерирани относителни по отношение на HCV1 полипротеина). с11 -14 антитялото се конюгира с пероксидаза от хрян (HRP), при използуване на стандартни процедури.

Монокпонално антитяло 5А-3 е анти- SOD антитяло, насочено срещу аминокиселини 1 до 65 на SOD и е получено чрез стандартни техники. Антитялото се конюгира с HRP, както е описано по-горе.

B. Антигени сЗЗс антигенът (266 аминокиселини, аминокиселини 1192 до 1457 на HCV1 полипротеина) се експресира като вътрешен SOD слят полипептид в Е. coli чрез методи, описани за синтеза на 5-1-1 антигена (Choo, et al., Science (1989) 244:359-362). Рекомбинантният антиген се пречиства както е описано в Chien et al., Proc. Natl., Acad. Sci. (1989) 89:10011-10015. Виж, също така, Houghton et al., патент на САЩ No. 5,350,671 за получаване на протоколи за SOD-сЗЗс.

NS3/4a епитопът, който се използува при изследването е конформационен епитоп, който притежава последователноста, посочена на фигура 3.

C. Формати на муноизследвания

Abbott PRISM изследвание (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) се доставя от търговската мрежа и представлява изследване за откриване, основаващо се на антотяло. Изследването се провежда при използуване на препоръките на производителя.

ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System (наречена Ortho 3.0 изследване в настоящото, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) представлява изследване за откриване, основаващо се на антитяло. Изследването се провежда при използуване на препоръките на производителя.

Roche Amplicor изследване (Roche, Pleasant, СА) се доставя от търговската мрежа и представлява изследване, осоновано на PCR. Изследването се провежда при използуване на препоръките на производителя.

Gen-Probe ТМА изследване (San Diego, СА) се доставя от търговската мрежа и представлява изследване на амплификацията, медиирана от транскрипцията. Изследването се провежда при използуване на препоръките на производителя.

Ortho антигенно изследване (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) представлява изследване за откриване, основаващо се на антиген. Изследването се провежда при използуване на препоръките на производителя.

Посоченото HCV антиген/антитяло комбинирано имуноизследване се провежда както следва. 4 mg/ml от всяко от пречистените моноклонални антитела С11-7. и С11-3 х физиологичен разтвор във фосфатен буфер (PBS), pH 7,4 се комбинират и се смесват добре. 90 ng NS3/4a рекомбинантен антиген се прибавя към същия покривен буфер. Сместта се смесва в продължение на 30 минути преди покриването. Прибавят се 200 ml от горния разтвор на ямка от 96-ямково Costar mediym binding микротитърни блюда (Corning, Inc.), блюдата се инкубират при 15-30°С в продължение на 16-24 часа. Блюдата се промиват двукратно с dH₂O, следвано от 300 μΙ/ ямка буфер за след нанасяне на покритие (1% говежди серумен албумин (BSA) в продължение на 1 час и. 300 μΙ на ямка стабилизиращ буфер (1 х PBS, манитол, полиетиленгликол (PEG), желатин) в продължение на 1час. Блюдата се аспирират и изсушават при 4°С в лиофилизатор в продължение на 24 часа. Блюдата се пълнят с десикант.

За да се проведе антиген/антитяло комбинираното имуноизследване, 100 μΙ засилен лизисен буфер (1: Νлаурилсаркозин, 0,65 М NaCI, 50 mg/ml миши IgG със степен на чистота технически чист (Sigma, St. Louis, МО), 1% BSA сулфхидрил-модифициран (Bayer), 0,1% Казеин) се прибавят към блюдото. След това се прибавят 100 ml от пробата. Инкубира се върху шейкер. при 40°С за 1 час. Блюдата се промиват шест пъти с 1 х PBS, 0,1% Tween-20, върху Ortho Plate Washer. 200 ml разтвор за конюгиране (1:75 разреждане на с1114-HRP с 250 пд/изследване SOD-сЗЗс антиген плюс 1:5000 разреждане на миши анти- SOD-HRP в HCV 3.0 разредител на проба (от ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) без SOD екстракт, всичките приготвени 30 минути преди прибавянето). Разтворът се инкубира 45 минути при разклащане на 40°С. Промива се шест-кратно, както по-горе, и се прибавят 200 ml разтвор на субстрат (1 OPD таблек/100 ml). OPD таблекта съдържа офенилендиамин дихидрохлорид и водородна пероксидаза за развиване на цветната реакция с пероксидазата от хрян, и се доставя от Sigma, St. Louis, МО. Инкубира се 30 минути при 1530°С на тъмно. Реакцията се спира чрез прибавяне на 50 ml 4N H₂SO₄ и блюдата се отчитат при 492 nm, спрямо абсорбцията при 690 nm като контрола.

D. Резултати:

Резултатите от различните изследвания са показани на таблици 5 и 6, които представят два отделни експеримента, извършени върху кръвни проби, поставени при HCV инфекция, както е посочено. Потъмнените области показват откриване на вирус. Както е показано по-долу, комбинираното изследване антиген/антитяло на Chiron открива сероконверсия във всичките проби, докато всички други изследвания на основата на антиген и антитяло не показват сероконверсия даже ив една проба. Поспециално, нито едно от изследванията на основата на антитяло не открива сероконверсия поне до 18-ия ден (таблица 5). Таблица 6 показва, че нито едно от изследванията на основата на антитяло не открива сероконверсия от 85-ия ден нататък.

Следователно, на основата на горните резултати, става ясно, че новото комбинирано изследване антиген/антитяло намалява броя на негативните грешки, получени при използуване на други конвенционални антитяло- антигеносноваващи се изследвания.

Таблица 5 HCV сероконверсия
Дни	Abbott PRISM	Ortho 3.0	Roche Amplico	Gen- Probe TMA	Ortho A	Chiron Ag/Ab
0	0,1	0,0	>5x10*	9,25	18,6	2,8
4	0,1	0,0	>5x105	9,29	19,0	3,1
7	0,1	0,0	>5x10s	9,52	22,3	1,5
13	0,3	0,1	>5x105	9,59	26,2	1.7

(продължение)

18	1,3	0,4	>5x106	9,70	15,9	1,2
21	2,2	1,0	>5x105	9,39	11,3	1,5
164	4,2	4,4	4x104	9,28	0,11	2,5

Таблица 6 HCV сероконверсия
Дни	Abbott PRISM	Ortho 3.0	Roche Amplico	Gen- Probe TMA	Ortho A	Chiron Ag/Ab
0	0,1	0,0	BLD		0,11	0,5
13	0,1	0,0	>5x105		44,0	3,0
20	0,1	0,0	>5x105		24,2	1,3
22	0,3	4,7	>5x105		29,2	1,6
85	5,4	4,7	BQR		0,06	1,1
131	4,3	4,7	BQR		0,09	1,0
135	4,6	4,7	3x103		0,09	1,2
138	5,5	4,7	BLD		0,08	1,2
146	5,9	4,7	BLD		0,11	2,1
152	5,2	4,7	BQR		0,07	1,8

ПРИМЕР 2

Продуциране на NS3/4a конформационен епитоп с Thr до

Pro и Ser до Не заместавиня

Конформационен епитоп NS3/4a се получава както следва. Този епитоп притежава последователноста, определена на фигури 4А до 4D и се различава от нативната последователност при позиции 403 (аминокиселини 1428 на HCV-1 в цяла дължина последователности и 404 (аминокиселина 1429 на HCV-1 в цяла дължина последователност). Специфично, Thr, който нормално се среща в позиция 1428 на нативната последователност е мутиран в Pro и Ser, които се срещат в позиции 1429 на нативната последователност са мутирани в Не.

По-специално, използуваният дрождев експресионен вектор е pBS241.1, описан по-горе. Плазмид pd.hcv1a.ns4aPI, който кодира репрезентативен NS3/4a епитоп, използуван в посочените имуноизследвания, се продуцира както следва. Използува се двуетапна процедура. Първо, следните ДНК части се лигират заедно: (а) синтетични олигонукпеотиди, които биха предоставили 5’ Hindlll сайтове за клониране, последвано от последователност АСААААСААА, инициатор ATG, и кодони за HCV1a, като започва с аминокиселина 1027 и продължава до Bgll сайт при аминокиселина 1046; (Ь) 683 bp Bgll-Clal рестрикционен фрагмент (кодиращ аминокиселини 1046-1274) от pAcHLTns3ns4aPI; и (с) pSP72 вектор (Promega, Madison, Wl, GenBank/EMBL Accession Number X65332), който е смлян c Hindlll и Clal, дефосфорилиран, и пречистен през гел. Плазмид pAcHLTns3ns4aPI произлиза от pAcHLT, експресионен вектор от бакуловирус, достъпен от търговската мрежа на BD Pharmingen (San Diego, СА). По-специално, pAcHLT EcoRI-Pstl вектор се получава, така както и следните фрагменти: EcoRI-Alwnl, 935 bp, съответстващ на аминокиселини 1027-1336 на HCV-1 генома; Alwnl-Sacll 247 bp, съответстващ на аминокиселини 1336-1419 на HCV-1 генома; Hinfl-Bgll, 175 bp, съответстващ на аминокиселини 1449-1509 на HCV-1 генома; Bgll-Pstl, 6-19 bp, съответстващ на аминокиселини 1510-1711 на HCV-1 генома; плюс кодона за край на транскрипцията. Sacll-Hinfl, синтетично генериран фрагмент от 91 Ьр, съответстващ на аминокиселини 1420-1448 на HCV-1 генома и съдържащ PI мутации (Thr-1428 мутиран в Pro, Ser1429, мутиран в Не), се лигира с 175 bp Hinfl-Bgll фрагмент и 619 bp Bgll-Pstl фрагмент, описан по-горе се субкпонира в pGEM5Zf(+) вектор, смлян с Sacll и Pstl. pGEM-5Zf(+) е предлаган на пазара Е. coli вектор (Promega, Medison, Wl, Gen Ba n k/E М BL Accession Number X65308). След трансформиране на компетентни НВ101 клетки, миниекранен анализ на отделни клонове и проверка на последователности , 885 bp Sacll-Pstl фрагмента от pGEM.5PI клон 2 се пречиства през гел. Този фрагмент се лигира с EcoRI-Alwnl 935 bp фрагмент, Alwnl-Sacll 247 bp фрагмент и pAcHLT EcoRI-Pstl вектор, описан по-горе. Получената структура се нарича pAcHLTns3ns4aPI.

Горната лигираща смес се трансформира в НВ101компетентни клетки и се посява в Lauria агарови блюда, съдържащи 100 цд/т1 ампицилин. Минипреп. анализ на индивидуални клонове води до идентифицирането на предполагаеми позитивни клона, два от които се амплифицират. Плазмидната ДНК за pSP72 1аНС, клонове #1 и #2 се приготвят с Qiagen Maxiprep кит и се секвенират.

Следващо, следните фрагменти се лигират заедно: (а) 761 bp Hindlll-Clal фрагмент от pSP721aHC #1 (pSP72.1aHC се генерира чрез лигиране заедно на следните: pSP72, който е бил смлян с Hindlll и Clal, синтетични олигонуклеотиди, който би предоставил 5’ Hinadlll сойт на клониране, следвано от последователноста АСААААСААА, кодона за иницииране ATG, и кодони за HCV1a, започващ с аминокиселина 1027 и продължаващ до Bglll сайт при аминокиселина .1046, и 683 Ьр Bglll-Clal рестрикционен фрагмент (кодиращ аминокиселини 1046-1274) от pAcHLTns3ns4aPI); (b) 1353 bp BamHI-Hindlll фрагмент за дрождевия хибриден промотор ADH2/GAPDH; (с) 1320 bp Clal-Sall фрагмент (кодиращ HCV1a аминокиселини 1046-1711 с Thr 1428 мутиран на Pro и Ser 1429 мутиран на Не) от pAcHLTns3ns4aPI; и (d) pBS24.1 дрождев експресионен вектор , който е смлян с BamHI и Sall, дефосфорилиран и пречистен през гел. Лигиращата смесс се трансформира в компетентни НВ101 и се посява върху Lauria агарови блюда, съдържащи 100 цд/т1 ампицилин. Минипреп анализ на индивидуални клонове води до идентифицирането на клонове с очаквания 3446 Ьр BamHI- Sall инсерт, който се състои от ADH2/GAPDH промотор, кодона за иницииране ATG и HCV1a NS3/4a от аминокиселини 1027-1711 (показан като аминокиселини 1-686 на фигури 4A-4D), с Thr 1428 (аминокиселинна позиция 403 на фигури 4A-4D) мутиран на Pro и Ser 1429 (аминокиселинна позиция 404 на фигури 4A-4D) мутиран на Не. Структурата се нарича pd.HCV1a.ns3ns4aPI (виж фигура 5).

Щам AD3 на S. cerevisiae се трансформира с pd.HCV1a.ns3ns4aPI и единичните трансформанти се проверяват за експресия след изчерпване на глюкозата в средата. Рекомбинантният протеин се експресира при вйсоки нива в дрожди, както се открива чрез оцветяване с Coomassie Blue и потвърждаване чрез имуноблотинг анализ, при използуване на поликлонално антитяло за хеликазния домен на NS3.

ПРИМЕР 3

Пречистване на NS3/4a конформационен епитоп

NS3/4a конформационният епитоп се пречиства както следва. Клетки от S. cerevisiae, както по-горе, експресиращи NS3/4a епитоп се събират както е описано по-горе. Клетките се •77 суспендират в лизисен буфер (50 mM Tris pH 8,0, 150 тМ NaCI, 1 тМ EDTA, 1 тМ PMSF, 0,1 μΜ пепстатин 1μΜ леупептин) и се лизират в Dyno-Mill (Wab Willy A. Bachofon, Basel, Switzerland) или друга еквивалентна апаратура, при използуване на стъклени перли, при съотношение от 1:1:1 клетки:буфер:0,5 mm стъклени перли. Лизатът се центрофугира при 30100 х g в продължение на 30 минути при 4°С и пелетата (плътната утайка), съдържаща неразтворимата бетъчна фракция се прибавя към промивен буфер (6т1/начално тегло на клетъчната пелета) и се поставят на кпатачен апарат при стайна температура в продължение на 15 минути. Промивният буфер се състои от 50 mM NaPO₄ pH 8,0, 0,3 М NaCI, 5 тМ β- меркаптоетанол, 10% глицерол, 0,05% октил глюкозид, 1 mM EDTA, 1 тМ PMSF, 0,1 μΜ пепстатин, 1μΜ леупептин. Клетъчнитге отломки се отстраняват чрез центрофугиране при 30100 х g в продължение на 30 минути при 4°С. Супернатантата се изхвърля, а пелетата се запазва.

Протеинът се екстрахира от пелетата както следва. 6 ml/g екстракционен буфер се прибавят и се поставят на клатачен f апарат при стайна температура в продължение на 15 минути. Екстракционният буфер се състои от 50 mM Tris pH 8,0, 1 М NaCI, 5 тМ β- меркаптоетанол, 10% глицерол, 1 mM EDTA, 1 тМ PMSF, 0,1 μΜ пепстатин 1μΜ леупептин. Центрофугира се при 30100 х g в продължение на 30 минути при 4°С. Супернатантата се запазва и се прибавя амониев сулфат към 17,5% , при използуване на следната формула: обем на супернатантата (ml) умножен по х% амониев сулфат/(1 - х% амониев сулфат) = ml от

4,1 М наситен амониев сулфат за прибавяне към супернатантата. Амониевият сулфат се прибавя на капки при разбъркване върху лед, и разтворът се бърка върху лед 10 минути. Разтворът се центрофугира при 3017700100 х g в продължение на 30 минути при 4°С и пелетата се запазва и се съхранява от 2°С до 8°С до 48 часа.

Пелетата се ресуспендира и се пропуска през Poly U колона (Poly U Sepharose 4В, Amersham Pharmacia) при 4°С, както следва. Пелетата се ресуспендира в 6 ml Poly U изравнявща буфер на грам тегло на пелетата. Изравняващият буфер се състои от 25 mM HEPES pH 8,0, 200 тМ NaCI, 5 тМ DTT (прибавя се свеж), 10% глицерол, 1,2 ?' октил глюкозид. Разтворът се поставя на клатачен апарат при стайна температура и се центрофугира при 30100 х g в продължение на 30 минути при 4°С.

Poly U колоната (1 ml смола на грам стартова пелета) се подготвя. Скоростта на линейният поток е 60 cm/hr и скоростта на обвиващия поток е 133% от 60 cm/hr. Колоната се уравновесява с уравновесяващ буфер , а супернатантата на ресуспендирана пелета на амониевия сулфат се натоварва на уравновесената колона. Колоната се промива до базовата линия с уравновесяващ буфер и протеинът се елюира посредством стъпково елюиране в следния Poly U буфер за елюиране: 25 тМ HEPES pH 8,0, 1 М NaCI, 5 тМ DTT (прибавя се свеж), 10% глицерол, 1,2 ? октил глюкозид. Колонният елюат се пропуска през SDS-PAGE (оцветен с Coomassie) и аликвотни части се замразяват и се съхраняват при -80°С. Присъствието на NS3/4a епитоп се потвърждава чрез Western blot, при използуване на поликпонално антитяло срещу 5-1-1 епитоп (HCV 4а).

Допълнително, наблюдава се ензимната протеазна активност по време на пречистване както следва. NS3/4a пептид ( KKGSWIVGRIVLSGKPAIIPKK), и фракците,- които съдържат NS3/4a конформационния епитоп, се разреждат в 90 μΙ реакционен буфер (25 mM Tris pH 7,5, 0,15 mM NaCI, 0,5 тМ EDTA, 10% глицерол0,05 п-додецил B-D-малтозид, 5 mM DTT) и позволява смесването за 30 минути при стайна температура. 90 μΙ от сместта се прибавят към микротитърно блюдо (Costar, Inc., Corning, NY) и се прибавят 10 μΙ от HCV субстрата (AnaSpec, Inc., San Jose СА). Блюдата се размесват и се отчитат на Fluorostar четящо устройство за блюда. Резултатите се отразяват като относителни флуоресцентни единици (RFU) за минута.

При използуване на тези методи, продуктът от екстрахиране 1 М NaCI съдържа 3,7 RFU/min активност, преципитатът с амониев сулфат е с активност от 7,5 RFU/min, а продуктът от Poly U пречистването е с активност от 18,5 RFU/min.

ПРИМЕР 4 :

Съревнователно изследване

Следното съревнователно изследване се провежда с цел да се оцени дали NS3/4 конформационен епитоп открива различни антитела от други HCV антигени. По-специално, NS3/4 антигенът се сравнява с с200 антигена, както следва.

0,5 pg и 1,0 pg NS3/4, продуциран както е описано по-горе, или с200 (Hepatology (1992) 15:19-25, на разположение от ORTHO HCV VERSION 3.0 ELISA Test System, Ortho-Clinical Diagnosistics, Raritam, New Jersey) се смесват c 20 μΙ от проба PHV914-5 (кръв от ранна сероконверсия, получена от кръв от инфектиран индивид) в общ обем от 220 μΙ (1 х PBS). Сместта се инкубира 1 час в микроямки при 37°С. След това сместта се прехвърля в блюда с покритие от NS3/4 и се инкубират в продължение на 1 час при 37°С. Блюдата се промиват и се изследват както следва.

цд с200 антиген се прибавя към 10 μΙ от проба PHV914-5 в общ обем от приблизително 220 μΙ. Сместта се инкубира в продължение на 1 час при 37°С и 200 μΙ се прехфърлят в блюдо с покритие от NS3/4 и се инкубира в продължение на 1 час при 37°С. Блюдата се промиват пет-кратно с 1 х PBS, 0,1% Tween-20. Прибавят се 200 μΙ разтвор на конюгат (описан по-горе), а блюдата се инкубират и се изследват. Контроли, които се състоят от PHV914-5 и 1 х PBS (без антиген) също се обработват, както по-горе.

Резултатите са показани на таблица 7. резултатите от процентното инхибиране, показани на фигура 4 са изчислени като колона 3 минус (колона 2 разделена на колона 3, умножено по 100). Както може да се види, данните показват, че NS34a се неутрализира чрез ранни сероконверсни антитела, а с200 не. Постига се силен сигнал, когато антителата в PHV914-5 сЗЗс член на панел на ранна сероконверсия реагира с блюдо с покритие от NS34a. с200 антигенът не се неутрализира от тези антитела. Това е показано в горния панел на таблица 7. Когато NS33a се смеси с PHV914-5 проба, то се неутрализира и поради това не присъстват антитела в пробата, за да реагират с NS34a, който покрива микроблюдото. Данните показват, че NS34a може да открие различен клас антитела, от тези, които се откриват чрез с200.

ТАБЛИЦА 7

ПРИМЕР 5

Изследване на стабилноста на NS3/4a конформационен епитоп

За да се оцени ролята за стабилност на NS3/4a епитопа за провеждането на изследването, са осъществени следните изследвания, за да се определи имунореактивноста на NS3/4a спрямо време при стайна температура. Малки аликвотни части от изходен NS3/4a се оставят да престоят при стайна температура, след което се замразяват на интервали, както е показано на таблица 8. Всички ампули едновременно се покриват и се тестват срещу два ранни NS3 сероканверсни панела.

Както се вижда от таблица 8, изходен NS3/4a не е стабилен и имунореактивността намалява с времето. Освен това е необходимо поддържането на конформацията на NS3/4a за имунореактивноста.

Други изследвания на стабилноста се провеждат както следва. Две конформационни моноклонални антитела, направени срещу NS3/4a, при използуване на стандартни процедури се заместват с анти-HCV панела на ранни сероканверсни. Ампули с изходен NS3/4a се съхраняват при стайна температура на интервали от време 3, 6 и 24 часа. NS3/4a от зъмразените ампули се покриват при 90 ng/ml и се изследват при използуване на горе-описаната процедура. Резултатите подсказват, че двата моноклонала са действително конформационни и тяхната активностт е чувствителна на обработване с изходния NS3/4a антиген при стайна температура. Реактивността на позотивната контрола моноклонално антитяло не се променя.

PHV 914-6

PHV 914-5

PHV 914-4

PHV 914-3

PHV 914-2

PHV 914-1

PHV 904-7

PHV 904-6

PHV 904-5

PHV 904-4

PHV 904-3

PHV 904-2

PHV 904-1

Време

I

-° CD

o o

o o

o o

fl

1

§

o o

ω o' o

>

o

fl

P ω

p o

p o

o' o

O

σ>

o o

o Ъ

o o

o o

o o

p o

o 4i

o K)

p

p o

o o

o' o

Q

ro 4»

o o

o o

o o

o o

o o

o o

§

o Λ

o o

o o

p o

ω o' o

I

M co

o o

o o

o o

o o

o o

o o

•

§

p ω

p

o o

p o

o o

o' o

ω Ul CD

o o

o o

o o

o o

o o

o o

o CD

o CD

o K5

p

p o

o o

o o

o' o

7s

CD

o o

o o

o o

o o

o o

o o

o “>J

o CD

o ω

p

o o

o o

o o

ω o o

Z

CD N)

ЯИ Я1

ω o

o 4i

o o

o o

o o

-2

g

s

£

ъ

g

o o

ω o' o

o Ό 0) CD X CD X s a>

Ж o X 4 Ό o ω

-U

ПРИМЕР 6

Имунореактивност на NS3/4a конформационен епитоп спрямо денатуриран NS3/4a

Имунореактивността на NS3/4a, който е денатуриран чрез SDS за препарата с NS3/4a .конформационния епитоп до крайна концентрация 2%. Денатурираният NS3/4a и конформационният NS3/4a се нанасят като покритие върху върху микротитърни блюда, както е описано по-горе. с200 антигенът (Hepatology (1992) 15:19-25, предлаган от ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey също се нанася като покритие върху микротитърните блюда. с200 антигенът се използува като контрола за рравнение, тъй като се предполага, да не е еконформационен, поради присъствието на редуциращите ,средства (DTT) и детергенти (SDS) в неговия състав.

Имунореактивността се тества срещу два ранни HCV панела на сероканверсия, PHV 904 и PHV 914 (намиращи се на пазара проби от човешка кръв от Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater, МА). Резултатите се показани-на таблица 9. данните подсказват, че денатурираната и неутрализирана NS3/4a (както и с200) не открива панели на ранна сероканверсния, като ранен NS3/4a конформационен епитоп.

	NS3/4a спрямо денатуриран NS3/4a
	2 изходен NS3/4a *на бод в 2% SDS
		NS3/4a	dNS3/4a*	с200		NS3/4a	dNS3/4a*	c200
		OD	OD	OD		s/co	s/co	s/co
HCV	PHV 904-1	0,012	0,012	0,009		0,02	0,02	0,01
Сероконверсии	PHV 904-2	0,011	0,009	0,008		0,02	0,01	0,01
	PHV 904-3	1,124	0,071	0,045		1,80	0,11	0,07
	PHV 904-4	2,401	0,273	0,129		3,85 .	0,44	0,21
	PHV 904-5	3,022	0,793	0,347		4,85	1,28	0,58
	PHV 904-6	2,711	1,472	0,774		4,35	2,37	1,28
	PHV 904-7	3,294	1,860	0,943		5,28	2,99	1,55
	PHV 914-1	0,006	0,004	0,001		0,01	0,01	0,00
	PHV 914-2	0,005	0,004	0,002		0,01	0,01	0,00
	PHV 914-3	0,098	0,003	0,001		0,16	0,00	0,00
	PHV 914-4	1,118	0,006	0,004		1,79	0,01	0,01
	PHV 914-5	2,035	0,044	0,022		3,26	0,07	0,04
	PHV 914-6	2,092	0,074	0,025		3,35	0,12	0,04
	PHV 914-7	2,519	0,281	0,132		4,04	0,45	0,22
	PHV 914-8	2,746	0,907	0,500		4,40	1,46	0,82
	PHV 914-9	3,084	1,730	0,931		4,94	2,78	1,53
HCV 3.0	Негат. Контр.	0,023	0,024	0,008
Контроли	Негат. Контр.	0,027	0,024	0,007
	Негат. Контр.	0,021	0,017	0,005
	Средно	0,024	0,022	0,007
	отрязан	0,624	0,622	0,607
	Поз. Контр.	1,239	0,903 .	0,575		1,99	1,45	0,95
	Поз. Контр.	1,445	0,916	0,614		2,32	1,47	1,01

Таблица 9

Имунореактивността на конформационния епитоп също се тества при използуване на моноклонални антитела за NS3/4a, изготвени при ползуване на стандартни процедури. Тези моноклонални антитела се тестват след това в ELISA формат срещу NS3/4a и денатуриран NS3/4a и с200 антиген. Данните показват, че анти-1МБЗ/4а моноклонали реагират с NS3/4a и денатураран NS3/4a по подобен начин, като сероконверсните панели, показани на таблица 10. Резултатите предоставят, също така, друго доказателство, че NS3/4a е конформационен в природата, както могат да се направят монокпоналните антитела, които са подобни по реактивност на ранни сЗЗс сероконверсни панели.

Таблица 10
Блюда NS3/4a dNS3/4a с200
Момонклонал		OD	. OD	OD
4В9/ЕЗ	1:100	1,820	0,616	0,369
	Т:1000	1,397	0,380	0,246
	1:10000	0,864	0,173	0,070
	1:20000	0,607	0,116	0,085
5B7/D7	1:100	2,885	0,898	0,436
	1:1000	2,866	0,541	0,267
	1:10000	1,672	0,215	0,086
	1:20000	1,053	0,124	0,059
1А8/Н2	1:100	1,020	0,169	0,080
	1:1000	0,921	0,101	0,043

	1:10000	0,653	0,037	0,013
	1:20000	0,337	0,027	0,011

В съответствие е описано ново изследване за откриване на HCV. От горе-описаното ще се разбере, че въпреки че са описани в настоящото конкретни варианти за изпълнение на изобретението с цел за илюстриране, различни модификации могат да се направят без да се отстраняваме от идеята на описаното в настоящото.

Claims (46)

1. ‘патентни претенции

   1. Твърда подложка за имуноизследване, включваща наймалкото едно анти-сърцевина антитяло на вируса на хепатит С (HCV) и най-малкото един изолиран HCV NS3/4a епитоп, свързан към него.
2. 2. Твърда подложка за имуноизследване, съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че включва наймалкото две анти-сърцевина антитела на HCV, свързани към него.
3. 3. Твърда подложка за имуноизследване, съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че посоченото наймалкото едно анти-сърцевина антитяло е насочено срещу Nтерминалната област на сърцевината на HCV антигена.
4. 4. Твърда подложка за имуноизследване, съгласно претенция 3, характеризираща се с това, че посоченото наймалкото едно анти-сърцевина антитяло е насочено срещу аминокиселиви 10-53 на HCV, номерирани относително спрямо последователноста на HCV1 полипротеина.
5. 5. Твърда подложка за имуноизследване, съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че посоченото наймалкото едно анти-сърцевина антитяло е монокпонално антитяло.
6. 6. Твърда подложка за имуноизследване, съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че NS3/4a епитопът е конформационен епитоп и съдържа аминокиселинна последователност, посочена на фигури 2A-4D.
7. 7. Твърда подложка за имуноизследване, съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че включва освен това слят антиген с.множествен епитоп, свързан към него.
8. 8. Твърда подложка за имуноизследване, съгласно претенция 7, характеризираща се с това, че посоченият слят антиген с множествен епитоп включва аминокиселинна последователност, посочена на фигури 7A-7F.
9. 9. Твърда подложка за имуноизследване, включваща две моноклонални анти-сърцевина антитела за хепатит С вирус (HCV) и HCV NS3/4a конформационен епитоп, съдържащ аминокиселинната последователност, посочена на фигури 4А4D.
10. 10. Твърда подложка за имуноизследване, съгласно претенция 10, характеризираща се с това, че посочените две моноклонални анти-сърцевина антитела са насочени срещу една N-терминална област на HCV антигена на сърцевината.
11. 11. Твърда подложка за имуноизследване, съгласно претенция 10, характеризираща се с това, че пасачените две моноклонални анти-сърцевина антитела са насочени срещу аминокиселини 10-53 на HCV, номерирани относително спрямо HCV1 последователноста на полипротеина.
12. 12. Твърда подложка за имуноизследване, включваща две моноклонални анти-сърцевина антитела за хепатит С вирус (HCV), HCV NS3/4a конформационен епитоп, съдържащ аминокиселинната последователност, посочена на фигури 4А4D, и слят антиген с множествен епитоп, съдържащ аминокиселинната последователност, посочена на фигури 7А7F, свързани към нея.
13. 13. Метод за откриване на хепатит С вирус (HCV) инфекция в биологична проба, характеризиращ се с това, че :

    (a) предоставя се твърда подложка за имуноизследване, съгласно претенция 1;

    (b) комбинира се биологична проба с посочената твърда подложка при условия, които позволяват HCV антигени и антитела, когато присъстват в биологичната проба, да се свързват към посочения поне един анти-сърцевина антитяло и посочения NS3/4a епитоп, съответно;

    (c) прибавя се към твърдата подложка от етап (Ь) при условия за образуване на комплекс (i) едно първо маркирано антитяло, при което посоченото първо маркирано антитяло е маркирано за откриване HCV анти-сърцевина антитяло, където посоченото маркирано анти-сърцевина антитяло е насочено срещу различни HCV епитопи на сърцевината, отколкото свързано поне едното анти-сърцевина антитяло, свързано към твърдата подложка; (ii) антиген, който влиза в реакция с HCV антитяло от биологичната проба, реактивоспособна с посочения NS3/4a епитоп; и (iii) второ «маркирано за откриване антитяло, при което посоченото второ маркирано за откриване антитяло е реактивоспособно с антигена от (ii);

    (d) откриват се комплекси, образувани между антителата и антигените, ако има такива, като индикация за HCV инфекция в биологичната проба.
14. 14. Метод, съгласно претенция 13, характиризиращ се с това, че посоченото поне едно анти-сърцевина антитяло е насочено срещу N-терминална област на HCV антигена на сърцевината и посоченото маркирано за откриване HCV анти сърцевина антитяло е насочено срещу С-терминална област на HCV антиген на сърцевината.
15. 15. Метод, съгласно претенция 14, характиризиращ се с това, че посоченото поне едно анти-сърцевина антитяло е насочено срещу аминокиселини 10-53 на HCV, номерирани относително спрямо HCV1 последователноста на полипротеина и посоченото маркирано за откриване HCV анти-сърцевина антитяло е насочено срещу аминокиселини 120-130 на HCV, номерирани относително спрямо HCV1 последователноста на полипротеина.
16. 16. Метод, съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че посоченият антиген, който влиза в реакция с HCV антитяло от биологичната проба съдържа епитоп от сЗЗс областа на HCV полипротеина.
17. 17. Метод, съгласно претенция 16, характеризиращ се с това, че сЗЗс епитопът е слят с аминокиселинна последовмателност на човешка супероксид дисмутаза (hSOD) и второто маркирано за откриване антитяло е реактивоспособно с посочената аминокиселинна последователност на hSOD.
18. 18. Метод, съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че NS3/4a епитопът е'конформационен епитоп и включва аминокиселинната последователност, отразена на фигури 4А4D.
19. 19. Метод за откриване на хепатит С вирус (HCV) инфекция в биологична проба, характеризиращ се с това, че :

    (a) предоставя се твърда подложка за имуноизследване, съгласно претенция 2;

    (b) комбинира се биологична проба с посочената твърда подложка при условия, които позволяват HCV антигени и антитела, когато присъстват в биологичната проба, да се свързват към посочените поне две анти-сърцевина антитела и посочения NS3/4a епитоп, съртветно;

    (c) прибавя се към твърдата подложка от етап (Ь) при условия за образуване на комплекс (i) едно първо маркирано за откриване антитяло, при което посоченото първо маркирано за откриване антитяло е маркирано за откриване HCV антисърцевина антитяло, където посоченото маркирано антисърцевина антитяло е насочено срещу различен HCV епитоп на сърцевината, отколкото свързаното поне двете анти-сърцевина антитела, свързани към твърдата подложка; (Н) епитоп от сЗЗс областа на HCV полипротеина, слят към hSOD аминокиселинна последователност; и (iii) второ маркирано за откриване антитяло, при което посоченото второ маркирано за откриване антитяло е реактивоспособно с посочената .hSOD аминокиселинна последователност;

    (d) откриват се комплекси, образувани между антителата и антигените, ако има такива, като индикация за HCV инфекция в биологичната проба.
20. 20. Метод, съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че посочения NS3/4a епитоп е конформационен епитоп и садаржа аминокиселинната последователност посочена на фигури 4A-4D.
21. 21. Метод за откриване на хепатит С вирусна (HCV) инфекция в биологична проба, характеризиращ се с това, че методът включва:

    (а) предоставя се твърда подложка за имуноизследване, съгласно претенция 9;

    (b) комбинира се биологична проба с посочената твърда подложка при условия, които позволява HCV антигени и антитела, когато присъстват в биологичната проба, да се свързват към посочените поне две анти-сърцевина антитела и посочения NS3/4a конформационен епитоп, съответно;

    (c) прибавя се към твърдата подложка от етап (Ь) при условия за образуване на комплекс (i) едно първо маркирано за откриване антитяло, при което посоченото първо маркирано за откриване антитяло е маркирано за откриване HCV антисърцевина антитяло, където посоченото маркирано антисърцевина антитяло е насочено срещу различен HCV епитоп на сърцевината, отколкото свързаните поне две анти-сърцевина антитела, свързани към твърдата подложка; (ii) епитоп от сЗЗс областа на HCV полипротеина, слят към hSOD аминокиселинна последователност; и (iii) второ маркирано за откриване антитяло, при което посоченото второ маркирано за откриване антитяло е реактивоспособно с посочената hSOD аминокиселинна последователност;

    (d) откриват се комплекси, образувани между антителата и антигените, ако има такива, като индикация за HCV инфекция в биологичната проба.
22. 22. Метод, съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че посочените поне ’ две анти-сърцевина антитела, са насочени срещу N-терминална област на HCV антигена на сърцевината и посоченото маркирано за откриван HCV антисърцевина антитяло е насочено срещу С-терминална област на HCV антигена на сърцевината.
23. 23. Метод, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочените поне, две анти-сърцевина антитела са насочени срещу аминокиселини 10-53 на HCV, номерирани относително спрямо HCV1 последователноста на полипротеина и посоченото маркирано за откриване HCV анти-сърцевина антитяло е насочено срещу аминокиселини 120-130 на HCV, номерирани относително спрямо HCV1 последователноста на полипротеина.
24. 24. Метод за откриване на хепатит С вирусна (HCV) инфекция в биологична проба, характеризиращ се с това, че методът включва:

    (a) предоставя се твърда подложка за имуноизследване, съгласно претенция 7;

    (b) комбинира се биологична проба с посочената твърда подложка при условия, които позволяват HCV антигени и антитела, когато присъстват в биологичната проба, да се свързват към посочените поне две анти-сърцевина антитела и посочения NS3/4a епитоп, и посочения слят антиген с множествен епитоп;

    (c) прибавя се към твърдата подложка от етап (Ь) при условия за образуване на комплекс (i) едно първо маркирано за откриване антитяло, при което посоченото първо маркирано за откриване антитяло е маркирано за откриване HCV антисърцевина антитяло, където посоченото маркирано антисърцевина антитяло е насочено срещу различен HCV епитоп на сърцевината, отколкото поне двете анти-сърцевина антитела, свързани към твърдата подложка; (ii) първи и втори антигени, влизащи в реакция с NS3/4a епитоп и посочения слят антиген с множествен епитоп, съответно; и (iii) второ маркирано за откриване антитяло, при което посоченото второ маркирано за откриване антитяло е реактивоспособно с антигена от (ii);

    (d) откриват се комплекси, образувани между антителата и антигените, ако има такива, като индикация за HCV инфекция в биологичната проба.
25. 25. Метод, съгласно претенция 24, характиризиращ се с това, че посоченото поне едно анти-сърцевина антитяло е насочено срещу N-терминална област на HCV антигена на сърцевината и посоченото първо маркирано за откриване HCV анти-сърцевина антитяло е насочено срещу С-терминална област на HCV антиген на сърцевината.
26. 26. Метод, съгласно претенция 25, характиризиращ се с това, че посоченото поне едно анти-сърцевина антитяло е насочено срещу аминокиселини 10-53 на HCV, номерирани относително спрямо HCV1 последователноста на полипротеина и посоченото маркирано за откриване HCV анти-сърцевина антитяло е насочено срещу аминокиселини 120-130 на HCV, номерирани относително спрямо HCV1 последователноста на полипротеина.
27. 27. Метод, съгласно претенция 24, характеризиращ се с това, че посоченият първи антиген, който влиза в реакция с HCV ь · антитяло от биологичната проба съдържа епитоп от сЗЗс областа на HCV полипротеина.
28. 28. Метод, съгласно претенция 27, характеризиращ се с това, че сЗЗс епитопът е слят с аминокиселинна последовмателност на човешка супероксид дисмутаза (hSOD) и второто маркирано за откриване антитяло е реактивоспособно с посочената аминокиселинна последователност на hSOD.
29. 29. Метод, съгласно претенция 24, характеризиращ се с това, че посоченият втори антиген, който влиза в реакция с HCV антитяло от биологичната проба, включва епитоп от с22 областа на HCV полипротеина.
30. 30. Метод, съгласно претенция 29, характеризиращ се с това, че епитопът от с22 областа съдържа аминокиселини Lys₁₀ до Ser₉₉ от HCV полипротеина, с делеция на Агд₄₇ и заместавен на Leu с Тгр в позиция 44, номерирани относително спрямо HCV1 последователноста . на полипротеина, при което посоченият епитоп е слят с амино-киселинна последовмателност на човешка супероксид дисмутаза (hSOD) и второто маркирано за откриване антитяло е реактивоспособно с посочената аминокиселинна после-дователност на hSOD.
31. 31. Метод, съгласно претенция 24, характеризиращ се с това, че посоченият антиген с множествен епитоп съдържа аминокиселинната последователност посочена на фигури 7A-4F.
32. 32. Метод за откриване на хепатит С вирусна (HCV) инфекция в биологична проба, характеризиращ се с това, че методът включва:

    (a) предоставя се твърда подложка за имуноизследване, съгласно претенция 12;

    (b) комбинира се биологична проба с посочената твърда подложка при^: условия, които позволяват HCV антигени и антитела, когато присъстват в биологичната проба, да се свързват към посочените поне две анти-сърцевина антитела и посочения NS3/4a епитоп, съответно;

    (c) прибавя се към твърдата подложка от етап (Ь) при условия за образуване на комплекс (i) едно първо маркирано за откриване антитяло, при което посоченото първо маркирано за откриване антитяло е маркирано за откриване HCV антисърцевина антитяло, където посоченото маркирано анти сърцевина антитяло е насочено срещу различен HCV епитоп на сърцевината, отколкото свързаното поне двете анти-сърцевина антитела, свързани към твърдата подложка; (Н) епитоп от сЗЗс областа на HCV полипротеина, слят към hSOD аминокиселинна последователност и епитоп от с22 областа на HCV полипротеина, слят към hSOD аминокиселинна последователност; и (iii) второ маркирано за откриване антитяло, при което посоченото второ маркирано за откриване антитяло е реактивоспособно с посочената hSOD аминокиселинна последователност;

    (d) откриват се комплекси, образувани между антителата и антигените, ако има такива, като индикация за HCV инфекция в биологичната проба.
33. 33. Метод, съгласно претенция 32, характиризиращ се с това, че посочените поне две анти-сърцевина антитела са насочени срещу N-терминална област на HCV антигена на сърцевината и посоченото първо маркирано за откриване HCV анти-сърцевина антитяло е насочено срещу С-терминална област на HCV антиген на сърцевината.
34. 34. Метод, съгласно претенция 33, характиризиращ се с това, че посочените поне две анти-сърцевина антитела са насочени срещу аминокиселини 10-53 на HCV, номерирани относително спрямо HCV1 последователноста на полипротеина и посоченото маркирано за откриване HCV анти-сърцевина антитяло е насочено срещу аминокиселини 120-130 на HCV, номерирани относително спрямо HCV1 последователноста на полипротеина.

    • »
35. 35. Метод, съгласно претенция 32, характеризиращ се с това, че епитопът от с22 областа включва аминокиселини Lys_w до Ser₉₉ на HCV полипротеина, с делеция на Arg47 и'заместване на Leu с Тгр в позиция 44, номерирани относително спрямо HCV1 последователноста на полипротеина.
36. 36. Комплект за имунодиалностичен тест, включващ твърдата подложка за имуноизследване, съгласно коя да е претенция от1-12, и инструкции за . провеждане на имунодиагностичен тест.
37. 37. Метод за получаване на твърда подложка за имуноизследване, характеризиращ се с това, че методът включва:

    (a) предоставя се твърда подложка; и (b) свързва се- поне едно анти-сърцевина антитяло за хепатип С вирус (HCV) и поне един изолиран HCV NS3/4a конформационен негов епитоп.
38. 38. Метод за получаване на твърда подложка за имуноизследване, характеризиращ се с това, че методът включва:

    (a) предоставя се твърда подложка; и (b) свързват се две анти-сърцевина антитела за хепатип С вирус (HCV) и един изолиран HCV NS3/4a конформационен негов епитоп.
39. 39. Метод, съгласно коя да е претенция от 38 и 39, характеризиращ се с това, че се свързва поне един слят антиген с множествен епитоп към твърдата подложка.
40. 40. Слят антиген б множествен епитоп включващ аминокиселинната последователност, посочена на фигури 7А7F, или аминокиселинна ’ последователност с поне 80% идентичност на тази оследователност, която специфично влиза в

    100 реакция с анти-HCV антитела, присъстващи в биологична проба от индивид, инфектиран с HCV.
41. 41. Слят антиген с множествен епитоп, съгласно претенция 40, характеризиращ се с това, че посоченият слят антиген с множествен епитоп · включва аминокиселинната последователност, посочена на фигури 7A-7F, или аминокиселинна последователност с поне 90% идентичност на тази оследователност, която специфично влиза в реакция с анти-HCV антитела, присъстващи в биологична проба от индивид, инфектиран с HCV.
42. 42. Слят антиген с множествен епитоп, съгласно претенция 40, характеризиращ се с това, че посоченият слят антиген с множествен епитоп се състои от аминокиселинна последователност, посочена на фигури 5A-5F..
43. 43. Полинуклеотид, съдържащ кодираща последователност за слятия антиген с множествен епитоп, съгласно коя да е претенция 40-42.
44. 44. Рекомбинантен вектор, включващ:

    (a) полинуклеотид, съгласно претенция 43;

    (b) контрални елементи, операционно свързани към посочения полинуклеотид, при което кодиращата последователност може да се транскрибира и да се транслира в клетка гостоприемник.
45. 45. Клетка гостоприемник, трасформирана с рекомбинантния вектор от претенция 44.
46. 46. Метод за получаване на рекомбинантен слят антиген с множествен епитоп, характерлизиращ се с това, че :

    (а) се предоставя популация от клетки гостоприемник, съгласно претенция 45; и.

    101 (b) посочената популация се култивира при условия, при които слятият антиген с множествен епитоп, кодиран от кодиращата последователност, присъстваща в посочения рекомбинантен вактор, се експресира.