PL213363B1 - Stale podloze immunotestu, sposób wykrywania zakazenia wirusem zapalenia watroby typu C (HCV), zestaw immunodiagnostyczny i sposób wytwarzania stalego podloza immunotestu - Google Patents
Stale podloze immunotestu, sposób wykrywania zakazenia wirusem zapalenia watroby typu C (HCV), zestaw immunodiagnostyczny i sposób wytwarzania stalego podloza immunotestuInfo
- Publication number
- PL213363B1 PL213363B1 PL365599A PL36559901A PL213363B1 PL 213363 B1 PL213363 B1 PL 213363B1 PL 365599 A PL365599 A PL 365599A PL 36559901 A PL36559901 A PL 36559901A PL 213363 B1 PL213363 B1 PL 213363B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- hcv
- core
- antibody
- epitope
- antigen
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 185
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 184
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 184
- 238000003556 assay Methods 0.000 title description 52
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 85
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims abstract description 52
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 31
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 claims description 226
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 111
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 86
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 claims description 84
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 63
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 43
- 108700039791 Hepatitis C virus nucleocapsid Proteins 0.000 claims description 37
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 31
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 28
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 26
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 18
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 15
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 12
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 12
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 claims description 11
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 claims description 8
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 claims description 8
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 claims description 5
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 claims description 4
- 101710144111 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 119
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 86
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 77
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 62
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 60
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 56
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 49
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 46
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 45
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 38
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 27
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 26
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 15
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 14
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 13
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 13
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 12
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 11
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 10
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 10
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 10
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 9
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 7
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101800001838 Serine protease/helicase NS3 Proteins 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 102200076914 rs104893959 Human genes 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 5
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 5
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 4
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 4
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 101000666856 Homo sapiens Vasoactive intestinal polypeptide receptor 1 Proteins 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100038388 Vasoactive intestinal polypeptide receptor 1 Human genes 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 3
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 3
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 3
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 3
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 102100034044 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH1B Human genes 0.000 description 2
- 101710193111 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH4 Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 206010019791 Hepatitis post transfusion Diseases 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000944 RNA Helicases Proteins 0.000 description 2
- 102000004409 RNA Helicases Human genes 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 238000002169 hydrotherapy Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- WHNPOQXWAMXPTA-UHFFFAOYSA-N 3-methylbut-2-enamide Chemical compound CC(C)=CC(N)=O WHNPOQXWAMXPTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 101150031523 4a gene Proteins 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 7-hydroxycoumarin Natural products O1C(=O)C=CC2=CC(O)=CC=C21 CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000256118 Aedes aegypti Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241001533012 Allocricetulus curtatus Species 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- 102000019260 B-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010012919 B-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 241000222128 Candida maltosa Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 244000285963 Kluyveromyces fragilis Species 0.000 description 1
- 235000014663 Kluyveromyces fragilis Nutrition 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 101800000135 N-terminal protein Proteins 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101800001020 Non-structural protein 4A Proteins 0.000 description 1
- 101800001014 Non-structural protein 5A Proteins 0.000 description 1
- 101150038760 Ns3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 101800001452 P1 proteinase Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 239000004642 Polyimide Substances 0.000 description 1
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 description 1
- 229920000388 Polyphosphate Polymers 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005844 autocatalytic reaction Methods 0.000 description 1
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- QXJJQWWVWRCVQT-UHFFFAOYSA-K calcium;sodium;phosphate Chemical compound [Na+].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O QXJJQWWVWRCVQT-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 125000001295 dansyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=C2C([H])=C([H])C([H])=C(C2=C1[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N disiloxane Chemical class [SiH3]O[SiH3] KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 238000012188 high-throughput screening assay Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001600 hydrophobic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 229940065638 intron a Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920000553 poly(phenylenevinylene) Polymers 0.000 description 1
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 1
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001721 polyimide Polymers 0.000 description 1
- 239000001205 polyphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011176 polyphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229920000128 polypyrrole Polymers 0.000 description 1
- 229920000123 polythiophene Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002821 scintillation proximity assay Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/18—Togaviridae; Flaviviridae
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Magnetic Means (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
Description
Niniejszy wynalazek dotyczy stałego podłoża immunotestu, sposobu wykrywania zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV), zestawu immunodiagnostycznego i sposobu wytwarzania stałego podłoża immunotestu.
Tło wynalazku
Wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) jest główną przyczyną pozajelitowego zapalenia wątroby typu nie-A i nie-B (NANBH), który to wirus jest przenoszony przeważnie poprzez transfuzję krwi i kontakty płciowe. Wirus ten jest obecny u 0,4 do 0,2% dawców krwi. Chroniczne zapalenie wątroby rozwija się u około 50% zakażonych, a u około 20% z nich rozwija się marskość wątroby, która czasem prowadzi do raka wątrobowokomórkowego. W związku z tym badania i kontrolowanie tej choroby jest ważne medycznie.
HCV był po raz pierwszy zidentyfikowany i zcharakteryzowany przez Houghten i WSP., jako przypadek NANBH. Wirusowa sekwencja genomowa HCV jest znana, tak jak znane są sposoby otrzymywania tej sekwencji. Patrz np., Publikacja Międzynarodowa nr WO 89/04669; WO 90/11089 i WO 90/14436. HCV ma 9,5 kb dodatni-sensowny, jednoniciowy genom RNA i jest przedstawicielem rodziny wirusów Flaviridae. W oparciu o analizę filogenetyczną zidentyfikowano co najmniej sześć różnych lecz spokrewnionych genotypów HCV (Simmonds i wsp., J. Gen. Virol. (1993) 74:2391-2399). Wirus ten koduje pojedynczą poliproteinę posiadającą więcej niż 3000 reszt aminokwasowych (Choo i wsp., Science (1989) 244:359-362; Choo i wsp., Proc. Natl. Acad.Sci. USA (1991) 88:2451-2455: Han i wsp., Proc.Natl. Acad. Sci. USA (1991 88:1711-1715. Poliproteina ta jest przetwarzana ko- i posttranslacyjnie zarówno w białka strukturalne jak i niestrukturalne (NS).
Zwłaszcza, jak pokazano na Figurze 1, kilka białek jest kodowanych przez genom HCV. Kolejność i nomenklatura produktów rozszczepienia poliproteiny HCV jest następująca: NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. Wstępne rozszczepienie poliproteiny jest katalizowane przez proteazy gospodarza, które uwalniają trzy białka strukturalne, nulkeokapsydowe białko N-terminalne (nazwane „rdzeniem”) i dwie glikoproteiny otoczki „E1” (znane także jako E) i „E2” (znane także jako E2/NS1), jak również białka niestrukturalne (NS) zawierające enzymy wirusowe. Regiony NS zostały nazwane NS2, NS3, NS4 i NS5. NS2 jest integralnym białkiem błonowym z aktywnością proteolityczną. NS2, zarówno sam jak i w połączeniu z NS3, rozszczepia siostrzane wiązanie NS2-NS3, które z kolei wytwarza N-zakończenie NS3 i uwalnia dużą poliproteinę, która obejmuje zarówno proteazę serynową jak i helikazę RNA. Proteaza NS3 służy do przetwarzania pozostałych poliprotein. Ukończenie dojrzewania poliproteiny jest zapoczątkowywane przez autokatalityczne rozszczepienie przy wiązaniu NS3-NS4a, katalizowane przez proteazę serynową NS3. Następne rozszczepienia poliproteiny HCV w których pośredniczy NS3 wydają się być związane z rozpoznaniem przez cząsteczkę innego polipeptydu NS3 poliproteinowych wiązań rozszczepialnych. W tych reakcjach, NS3 uwalnia kofaktor NS3 (NS4a), dwie proteiny (NS4b i NS5a) i RNA-zależną polimerazę RNA (NS5b).
Opisano wiele, pochodzących z poliproteiny HCV polipeptydów, powszechnych jak i specyficznych, użytecznych jako immunologiczne i diagnostyczne reagenty dla HCV,. Patrz np., Houghton i wsp., Publikacja Europejska nr 318,216 i 388,232; Choo i wsp., Science (1989) 244:359-362; Kuo i wsp., Science (1989) 244:362-364; Houghton i wsp., Hepatology (1991) 14:381-388; Chien i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien i wsp., J. Gastroent. Hepatol (1993) 8:S33 -39; Chien i wsp., Międzynarodowa Publikacja nr WO 93/00365; Chien, D.Y., Publikacja Międzynarodowa nr WO 94/01778. Publikacje te dostarczają szerokiej bazy głównie dla HCV, jak też dla wytwarzania i zastosowań immunologicznych reagentów polipeptydu HCV.
Czułe, specyficzne metody badania przesiewowego (screening) i identyfikacji nośników HCV oraz krwi zanieczyszczonej przez HCV lub produktów krwiopochodnych powinny dostarczyć ważnego postępu w medycynie. Postransfuzyjne zapalenie wątroby (PTH) zdarza się u około 10% pacjentów poddanych transfuzji a HCV oblicza się na więcej niż 90% z tych przypadków. Opieka nad pacjentem jak też zapobieganie i przenoszenie HCV przez krew i produkty krwiopochodne lub przez bliski kontakt osobisty wymaga wiarygodnej diagnostyki i narzędzi prognostycznych. W związku z tym wyprodukowano wiele testów do serodiagnostyki zakażeń HCV. Patrz np., Choo i wsp., Science (1989) 244:359 -362; Kuo i wsp., Science (1989) 244:362-364; Choo i wsp., Br. Med. Bull. (1990) 46:423-441; Ebeling i wsp., Lancet (1990) 335:982-983; van der Poel i wsp., Lancet (1990) 335:558-560; van der Poel i wsp., Lancet (1991) 337:317-319; Chien, D.Y., Publikacja Międzynarodowa nr WO 94/01778;
PL 213 363 B1
Valenzuela i wsp., Publikacja Międzynarodowa nr WO 97/44469; i Kashiwakuma i wsp., Patent
St.Zjedn.Am. nr 5,871,904.
Znaczącym problemem napotykanym w niektórych testach opartych na surowicy jest to, że stwierdza się tam znaczącą przerwę pomiędzy zakażeniem a wykryciem wirusa, często przekraczającą 80 dni. Ta przerwa w badaniach może stwarzać dla biorców transfuzji krwi duże ryzyko. Dla uniknięcie tego problemu zostały opracowane testy oparte na kwasie nukleinowym (NAT)(ang. nuclei acid-based tests) wykrywające bezpośrednio wirusowy RNA i antygenowe testy rdzenia HCV, które badają antygen wirusowy zamiast odpowiedzi przeciwciał. Patrz, np., Kashiwakuma i wsp., Patent St.Zjedn.Am. nr 5,871,904; Beld i wsp., Transfusion (2000) 40:575-579.
Wciąż jednak istnieje potrzeba czułych, dokładnych diagnostycznych i prognostycznych narzędzi w celu dostarczenia adekwatnej opieki nad pacjentem jak też w celu zapobieżenia przenoszeniu się HCV przez krew i produkty krwi lub przez bliski kontakt osobisty.
Streszczenie wynalazku
Niniejszy wynalazek jest oparty w części na odkryciu, że serokonwersyjne przeciwciała HCV są typowymi anty-rdzeniowymi i anty-NS3 (helikazami).
A zatem, w jednej postaci, przedmiotowy wynalazek dotyczy stałego podłoża immunotestu, które to podłoże zawiera związane z nim, co najmniej jedno anty-rdzeniowe przeciwciało HCV przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C (HCV), przy czym wspomniany HCV NS3/4a jest konformacyjnym epitopem i zawiera sekwencje aminokwasową opisaną na Fig. 4A - 4D.
W pewnych korzystnych postaciach stałe podłoże immunotestu zawiera związane z nim, co najmniej dwa anty-rdzeniowe przeciwciała.
Stałe podłoże immunotestu korzystnie zawiera co najmniej jedno anty-rdzeniowe przeciwciało skierowane przeciwko N-końcowemu regionowi antygenu rdzeniowego HCV.
Bardziej korzystnie stałe podłoże immunotestu zawiera co najmniej jedno anty-rdzeniowe przeciwciało, które jest skierowane przeciwko aminokwasom 10-53 HCV, ponumerowanym względem sekwencji poliproteiny HCV1.
W kolejnej postaci stałe podłoże immunotestu według wynalazku, jako co najmniej jedno anty-rdzeniowe przeciwciało korzystnie zawiera przeciwciało monoklonalne.
W jeszcze innej postaci stałe podłoże immunotestu według wynalazku korzystnie zawiera ponadto związany z nim wieloepitopowy antygen fuzyjny, przy czym wspomniany wieloepitopowy antygen fuzyjny zawiera sekwencję aminokwasową opisaną na Figurach 7A-7F.
Przedmiotem wynalazku jest również stałe podłoże immunotestu, charakteryzujące się tym, że zawiera związane z nim dwa anty-rdzeniowe monoklonalne przeciwciała przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C (HCV), konformacyjny epitop HCV NS3/4a zawierający sekwencję aminokwasową opisaną na Figurach 4A-4D i wieloepitopowy antygen fuzyjny zawierający sekwencje aminokwasową opisaną na Figurach 7A-7F.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wykrywania zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV) w próbce biologicznej, polegający na tym, że obejmuje etapy:
(a) dostarczenie stałego podłoża immunotestu według wynalazku jak zdefiniowano powyżej;
(b) połączenie próbki biologicznej ze wspomnianym stałym podłożem w warunkach, które pozwalają antygenom HCV i przeciwciałom, jeżeli są obecne w próbce biologicznej, związać się ze wspomnianym co najmniej jednym anty-rdzeniowym przeciwciałem i wspomnianym epitopem NS3/4a, przy czym antygen reagujący z przeciwciałem HCV z próbki biologicznej zawiera epitop z regionu c33c poliproteiny HCV, (c) dodanie do stałego podłoża z etapu (b) w warunkach tworzących kompleks (i) pierwszego wykrywalnego znakowanego przeciwciała, przy czym wspomniane pierwsze wykrywalne znakowane przeciwciało jest wykrywalnym znakowanym przeciwciałem anty-rdzeniowym HCV, przy czym to wspomniane znakowane anty-rdzeniowe przeciwciało jest skierowane przeciwko innemu epitopowi rdzeniowemu HCV niż co najmniej jedno anty-rdzeniowe przeciwciało związane ze wspomnianym podłożem; (ii) antygenu reagującego z przeciwciałem HCV z próbki biologicznej reagującej z epitopem NS3/4a; i (iii) drugiego wykrywalnego znakowanego przeciwciała, przy czym wspomniane drugie znakowane przeciwciało reaguje z antygenem z (ii);
(d) wykrywanie kompleksów utworzonych pomiędzy przeciwciałami i antygenami, jako oznaki zakażenia HCV w próbce biologicznej.
W innej korzystnej postaci sposób według wynalazku, polega na tym, że co najmniej jedno anty-rdzeniowe przeciwciało jest skierowane przeciwko N-końcowemu regionowi antygenu rdzeniowego
PL 213 363 B1
HCV i wspomniane wykrywalne znakowane anty-rdzeniowe HCV jest skierowane przeciwko regionowi
C-terminalnemu antygenu rdzeniowego HCV.
Bardziej korzystnie, wspomniane, co najmniej jedno anty-rdzeniowe przeciwciało jest skierowane przeciwko aminokwasom 10-53 HCV, ponumerowanym względem sekwencji poliproteiny HCV1 i wspomniane wykrywalne znakowane anty-rdzeniowe HCV jest skierowane przeciwko aminokwasom 120-130 HCV, ponumerowanym względem sekwencji poliproteiny HCV1.
W jeszcze innej postaci sposobu według wynalazku, epitop c33c jest połączony fuzyjnie z sekwencją aminokwasową ludzkiej dysmutazy ponadtlenkowej (hSOD) i drugie znakowane przeciwciało reaguje z wspomnianą sekwencją aminokwasową (hSOD).
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wykrywania zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV) w próbce biologicznej, polegający na tym, że obejmuje etapy:
a) dostarczenie stałego podłoża immunotestu według wynalazku zawierające korzystnie co najmniej dwa anty-rdzeniowe przeciwciała.;
b) połączenie próbki biologicznej ze wspomnianym stałym podłożem w warunkach, które pozwalają antygenom HCV i przeciwciałom, jeżeli są obecne w próbce biologicznej, związać się ze wspomnianymi co najmniej dwoma anty-rdzeniowymi przeciwciałami i konformacyjnym epitopem NS3/4a;
c) dodanie do stałego podłoża z etapu (b) w warunkach tworzących kompleks (i) pierwszego wykrywalnego znakowanego przeciwciała, przy czym wspomniane pierwsze wykrywalne znakowane przeciwciało jest wykrywalnym znakowanym przeciwciałem anty-rdzeniowym HCV, przy czym wspomniane znakowane anty-rdzeniowe przeciwciało jest skierowane przeciwko innemu epitopowi rdzeniowemu HCV, niż co najmniej dwa anty-rdzeniowe przeciwciała związane ze stałym podłożem; (ii) epitopu z regionu c33c poliproteiny HCV połączonej fuzyjnie z sekwencją aminokwasową hSOD; i (iii) drugiego wykrywalnego znakowanego przeciwciała, przy czym wspomniane wykrywalne drugie znakowane przeciwciało reaguje z sekwencją aminokwasową hSOD;
d) wykrywanie utworzonych kompleksów pomiędzy przeciwciałami i antygenami, jako wskaźnika zakażenia HCV w próbce biologicznej.
Korzystnie w sposobie według wynalazku wspomniane, co najmniej dwa anty-rdzeniowe przeciwciała są skierowane przeciwko N-końcowemu regionowi antygenu rdzeniowego HCV i wspomniane wykrywalne znakowane anty-rdzeniowe przeciwciało HCV jest skierowane przeciwko C-końcowemu regionowi antygenu rdzeniowego HCV.
Bardziej korzystnie w sposobie według wynalazku wspomniane, co najmniej dwa anty-rdzeniowe przeciwciała są skierowane przeciwko aminokwasom 10-53 HCV, ponumerowanym względem sekwencji poliproteiny HCV1 i wspomniane wykrywalne znakowane anty-rdzeniowe przeciwciało HCV jest skierowane przeciwko aminokwasom 120-130 HCV, ponumerowanym względem sekwencji poliproteiny HCV1.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV) w próbce biologicznej, polegający na tym, że obejmuje etapy:
(a) dostarczenia stałego podłoża immunotestu według wynalazku, które korzystnie zawiera ponadto związany z nim wieloepitopowy antygen fuzyjny który to wieloepitopowy antygen fuzyjny zawiera sekwencję aminokwasową opisana na Fig. 7A-7F;
(b) połączenia próbki biologicznej ze wspomnianym stałym podłożem w warunkach pozwalających antygenom HCV i przeciwciałom, jeżeli znajdują się w próbce, na związanie się do wspomnianego, co najmniej jednego anty-rdzeniowego przeciwciała, wspomnianego epitopu NS3/4a i wspomnianego wieloepitopowego antygenu fuzyjnego;
(c) dodanie do stałego podłoża z etapu (b) w warunkach tworzących kompleks (i) pierwszego wykrywalnego znakowanego przeciwciała, przy czym wspomniane pierwsze wykrywalne znakowane przeciwciało jest wykrywalnym znakowanym przeciwciałem anty-rdzeniowym HCV, przy czym wspomniane znakowane anty-rdzeniowe przeciwciało jest skierowane przeciwko innemu epitopowi rdzeniowemu HCV, niż co najmniej jedno anty-rdzeniowe przeciwciało związane ze stałym podłożem; (ii) antygenów pierwszego i drugiego, które reagują z przeciwciałem HCV z próbki biologicznej reagującej z wspomnianym epitopem NS3/4a i wspomnianym wieloepitopowym antygenem fuzyjnym, przy czym wspomniany pierwszy antygen reagujący z przeciwciałem HCV z próbki biologicznej zawiera epitop z regionu c33c poliproteiny HCV; i (iii) drugiego wykrywalnego znakowanego przeciwciała, przy czym wspomniane drugie wykrywalne znakowane przeciwciało reaguje z antygenami z (ii) ;
PL 213 363 B1 (d) wykrywanie utworzonych kompleksów pomiędzy przeciwciałami i antygenami, jako wskaźnika zakażenia HCV w próbce biologicznej.
W korzystnej odmianie sposób według wynalazku wspomniane, co najmniej jedno antyrdzeniowe przeciwciało jest skierowane przeciwko N-końcowemu regionowi antygenu rdzeniowego HCV i wspomniane pierwsze wykrywalne znakowane anty-rdzeniowe przeciwciało jest skierowane przeciwko C-końcowemu regionowi antygenu rdzeniowego HCV.
W bardziej korzystnej odmianie sposób według wynalazku co najmniej jedno anty-rdzeniowe przeciwciało jest skierowane przeciwko aminokwasom 10-53 HCV, ponumerowanym względem sekwencji poliproteiny HCV1 i wspomniane wykrywalne znakowane anty-rdzeniowe przeciwciało HCV jest skierowane przeciwko aminokwasom 120-130 HCV, ponumerowanym względem sekwencji poliproteiny HCV1.
Również korzystnie w sposobie według wynalazku epitop c33c jest połączony fuzyjnie z sekwencją aminokwasową ludzkiej dysmutazy ponadtlenkowej (hSOD) i drugie wykrywalne znakowane przeciwciało reaguje z sekwencją aminokwasową hSOD.
W dalszej korzystnej postaci sposobu według wynalazku wspomniany drugi antygen reagujący z przeciwciałem HCV z próbki biologicznej zawiera epitop z regionu c22 poliproteiny HCV.
W bardziej korzystnej postaci sposobu według wynalazku epitop z regionu c22 zawiera aminokwasy Lys10 do Ser99 poliproteiny HCV, z delecją Arg47 i podstawieniem Leu na Trp w pozycji 44, ponumerowanych względem sekwencji poliproteiny HCV1, przy czym wspomniany epitop jest połączony fuzyjnie z sekwencją aminokwasową ludzkiej dysmutazy ponadtlenkowej (hSOD) i drugie wykrywalne znakowane przeciwciało reaguje ze wspomnianą sekwencją aminokwasową ludzkiej hSOD.
Jeszcze bardziej korzystnie, wspomniany wieloepitopowy antygen fuzyjny zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na Figurach 7A-7F.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wykrywania zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV) w próbce biologicznej, znamienny tym, że obejmuje etapy:
(a) dostarczenie stałego podłoża immunotestu według wynalazku, które to podłoże zawiera związane z nim dwa anty-rdzeniowe monoklonalne przeciwciała przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C (HCV), konformacyjny epitop HCV NS3/4a zawierający sekwencję aminokwasową opisaną na Figurach 4A-4D i wieloepitopowy antygen fuzyjny zawierający sekwencje aminokwasową opisaną na Figurach 7A-7F.
(b) połączenie próbki biologicznej ze wspomnianym stałym podłożem w warunkach pozwalających antygenom HCV i przeciwciałom, jeżeli znajdują się w próbce, na związanie się z wspomnianymi, co najmniej dwoma anty-rdzeniowymi przeciwciałami, wspomnianym epitopem konformacyjnym NS3/4a, i wspomnianym wieloepitopowym antygenem fuzyjnym;
(c) dodanie do stałego podłoża z etapu (b) w warunkach tworzących kompleks (i) pierwszego wykrywalnego znakowanego przeciwciała, przy czym wspomniane pierwsze wykrywalne znakowane przeciwciało jest wykrywalnym znakowanym anty-rdzeniowym przeciwciałem HCV, przy czym wspomniane znakowane anty-rdzeniowe przeciwciało jest skierowane przeciwko innemu epitopowi rdzeniowemu HCV niż co najmniej dwa anty-rdzeniowe przeciwciała związane ze stałym podłożem; (ii) epitopu z regionu c33c poliproteiny HCV połączonej fuzyjnie z sekwencją aminokwasową hSOD i epitopem z regionu c22 poliproteiny HCV połączonej fuzyjnie z sekwencją aminokwasową hSOD; i (iii) drugiego wykrywalnego znakowanego przeciwciała, przy czym wspomniane drugie wykrywalne znakowane przeciwciało reaguje z wspomnianą sekwencją aminokwasową hSOD;
(d) wykrywanie utworzonych kompleksów pomiędzy przeciwciałami i antygenami, jako oznaki zakażenia HCV w próbce biologicznej.
Korzystnie w powyższym sposobie według wynalazku wspomniane, co najmniej dwa anty-rdzeniowe przeciwciała są skierowane przeciwko N-końcowemu regionowi antygenu rdzeniowego HCV i wspomniane wykrywalne znakowane anty-rdzeniowe przeciwciało HCV jest skierowane przeciwko C-końcowemu regionowi antygenu rdzeniowego HCV.
Bardziej korzystnie wspomniane, co najmniej dwa anty-rdzeniowe przeciwciała są skierowane przeciwko aminokwasom 10-53 HCV, ponumerowanym względem sekwencji poliproteiny HCV1 i wspomniane wykrywalne znakowane anty-rdzeniowe przeciwciało HCV jest skierowane przeciwko aminokwasom 120-130 HCV, ponumerowanym względem sekwencji poliproteiny HCV1.
W innej korzystnej postaci sposobu według wynalazku epitop z regionu c22 zawiera aminokwasy Lys10 do Ser99 poliproteiny HCV, z delecją przy Arg47 i podstawieniem Leu na Trp w pozycji 44, ponumerowanych względem sekwencji poliproteiny HCV1.
PL 213 363 B1
Przedmiotem wynalazku jest również zestaw immunodiagnostyczny, charakteryzujący się tym, że zawiera stałe podłoże immunotestu według wynalazku jak zdefiniowano powyżej.
Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania stałego podłoża immunotestu, obejmujący etapy:
(a) dostarczenie stałego podłoża; i (b) związanie z nim, co najmniej jednego przeciwciała anty-rdzeniowego przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C (HCV) i co najmniej jednego izolowanego epitopu konformacyjnego NS3/4a HCV, przy czym wspomniany epitop NS3/4a posiada sekwencję aminokwasową opisaną na Fig. 4A-4D.
W korzystnej postaci realizacji sposób ten obejmuje ponadto wiązanie, co najmniej jednego wieloepitopowego antygenu fuzyjnego do tego stałego podłoża.
Krótki opis rysunków
Figura 1 jest schematycznym przedstawieniem genomu HCV, przedstawiającą różne regiony, poliproteiny, z których pochodzą reagenty obecnego testu (proteiny i przeciwciała).
Figura 2 jest rysunkiem schematycznym reprezentatywnego łączonego testu według wynalazku antygen/przeciwciało.
Figura 3 przedstawia sekwencje aminokwasową reprezentatywnego konformacyjnego antygenu NS3/4a do zastosowania w obecnych testach. Pogrubione alaniny w pozycji 182 oznacza podstawie natywnej seryny normalne występującej w tej pozycji.
Figura 4A do 4D przedstawia DNA i odpowiadającą sekwencję aminokwasową innego reprezentatywnego konformacyjnego antygenu NS3/4a do stosowania w obecnych testach. Pozycje aminokwasowe 403 i 404 Figury 4A do 4D reprezentują podstawienia Pro na Thr i Ile na Ser, sekwencji aminokwasowej HCV-1.
Figura 5 jest schematem konstrukcji pd.HCV1a.ns3ns4PI.
Figura 6 jest schematycznym przedstawieniem MEFA 12.
Figury 7A-7F przedstawiają DNA i odpowiadającą sekwencję MEFA 12.
Figura 8 jest schematycznym rysunkiem reprezentatywnego immunotestu według wynalazku, stosując MEFA 12.
Szczegółowy opis wynalazku
W praktyce w niniejszym wynalazku będzie się korzystało, jeżeli nie zaznaczono inaczej, z konwencjonalnych metod chemii, biochemii, technik rekombinacyjnych DNA i immunologii, w zakresie wiedzy fachowców w stanie techniki. Techniki te są w pełni wyjaśnione w literaturze. Patrz np., Fundamental Virology, Wydanie 2-gie, tom I i II (B.N. Fields i D.M. Knipe, eds.); Handbook of Experimental Immunology, tom I-IV (D.M. Weir i C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., wydanie aktualne); Sambrook, i wsp., Molecual Cloning: A Laboratory Manual (Wydanie 2-gie, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick i N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.).
Trzeba zaznaczyć, że tak jak użyto w opisie i załączonych zastrzeżeniach, forma liczby pojedynczej „a” i „an” oraz „the” obejmuje odniesienia mnogie chyba, że z kontekstu jasno wynika, że jest inaczej. Dlatego zatem, na przykład, odnośnik „antygen” obejmuje mieszaninę dwóch lub więcej antygenów, lub podobnie.
W tekście użyto następujących skrótów:
Alanina: Ala (A)
Aspargina: Asn (N)
Cysteina: Cys (C)
Kwas glutaminowy: Glu (E) Histydyna: His (H) Leucyna: Leu (L) Metionina: Met (M)
Prolina: Pro (P)
Treonina: Thr (T)
Tyrozyna: Tyr (Y)
Arginina: Arg (R)
Kwas asparaginowy: Asp (D) Glutamina: Gln (Q)
Glicyna: Gly (G)
Izoleucyna: He (I)
Lizyna: Lys (K)
Fenyloalanina: Phe (F)
Seryna: Ser (S)
Tryptofan: Trp (W)
Walina: Val (V)
PL 213 363 B1
I. Definicje
Przy opisywaniu niniejszego wynalazku, zastosowano następujące określenia, które są przeznaczone do zdefiniowania tak jak wskazano poniżej.
Określenia „polipeptyd” i „proteina” odnoszą się polimeru reszt aminokwasowych i nie są ograniczone do minimalnej długości tego produktu. Zatem, peptydy, oligopeptydy, dimery, multimery i tym podobne objęte są tą definicją. Definicją tą są objęte zarówno pełnej długości białka jak i ich fragmenty. Określenia te obejmują modyfikacje postekspresyjne tych polipeptydów, na przykład, glikozylację, acetylację, fosforylację i tym podobne. Ponadto, do celów niniejszego wynalazku „polipeptyd” odnosi się do proteiny, która obejmuje modyfikacje, takie jak delecje, addycje i substytucje (generalnie natury konserwatywnej), do sekwencji natywnej, tak długo aż proteina utrzymuje żądaną aktywność. Modyfikacje te mogą być rozważane, jako mutagenezy miejscowo ukierunkowane, lub mogą być przypadkowe, takie jak przez mutacje gospodarzy wytwarzających te proteiny lub przez błędy wynikające z amplifikacji techniką reakcji łańcuchowej polimerazy PCR.
Polipeptyd HCV jest polipeptydem, tak jak zdefiniowano powyżej, pochodzącym z poliproteiny HCV. Polipeptyd ten nie musi pochodzić fizycznie od HCV, lecz może być wytwarzany syntetycznie lub rekombinacyjnie. Ponadto, polipeptyd ten może pochodzić od każdego z różnych szczepów wirusa, takich jak szczepy HCV - 1,2, 3 lub 4. Liczba regionów konserwowanych i zmiennych jest znana pomiędzy tymi szczepami i generalnie sekwencja aminokwasowa epitopów pochodzących z tych regionów będzie miała wysoki stopień homologii sekwencji, np., homologię sekwencji aminokwasowej większą niż 30%, korzystnie większą, niż 40%, kiedy te dwie sekwencja są zestawione. Zatem, na przykład, określenie „polipeptyd NS3/4a” odnosi się do natywnego NS3/4a z różnych szczepów HCV, jak też analogów NS3/4a, mutein i fragmentów immunogenicznych, jak zdefiniowano dalej poniżej. Pełne genotypy wielu z tych szczepów są znane. Patrz np., patent St.Zjedn.Am. nr 6,150,087 i Nr dostępu GenBank AJ238800 i AJ238700.
Określenie „analog” i „muteina” odnosi się do aktywnych biologicznie pochodnych cytowanej cząsteczki lub fragmentów takich cząsteczek, które zachowują pożądaną aktywność, taką jak immunoreaktywność w opisanych tutaj testach. Ogólnie, określenie „analog” odnosi się do związków posiadających sekwencję natywnego polipeptydu i budowę z jednego lub więcej aminokwasowych przyłączeń, podstawień (w naturze zwykle konserwatywnych) i/lub delecji w stosunku do natywnej cząsteczki, tak długo jak te modyfikacje nie niszczą aktywności immunogenicznej. Określenie „muteina” odnosi się do peptydów posiadających jeden lub więcej peptydów naśladujących „peptydoidów”, takich jak te opisane w Publikacji Międzynarodowej nr WO 91/04282. Korzystnie, analog ten lub muteina ma, co najmniej tą samą immunologiczną aktywność, co cząsteczka natywna. Sposoby wytwarzania analogów peptydowych i mutein są znane w stanie techniki i są dalej opisywane poniżej.
Szczególnie preferowane analogi obejmują podstawienia, które są w naturze konserwatywne, to znaczy, takie podstawienia, jakie mają miejsce w rodzinie aminokwasów, która związana jest z ich łańcuchami bocznymi.
Aminokwasy dzieli się ogólnie na cztery rodziny: (1) kwasowe - asparaginian i glutaminian; (2) zasadowe - lizyna, arginina, histydyna; (3) nie-polarne alanina, walina, leucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan; i bez ładunku polarnego - glicyna, asparagina, glutamina, cysteina, seryna, treonina, tyrozyna. Fenyloalanina, tryptofan i tyrozyna są czasami klasyfikowane, jako aminokwasy aromatyczne. Na przykład, można przewidzieć, że wyizolowane zastąpienie leucyny na izoleucynę lub walinę, asparaginianu na glutaminian, treoniny na serynę, lub podobne konserwatywne zastąpienia aminokwasów na strukturalnie podobne do nich aminokwasy, nie będzie miało znaczącego wpływu na aktywność biologiczną. Na przykład, polipeptyd, o którym mowa może zawierać do około 5-10 konserwatywnych lub nie konserwatywnych aminokwasowych podstawień, lub nawet do 15-25 konserwatywnych lub nie konserwatywnych aminokwasowych podstawień, lub jakąkolwiek liczbę całkowitą pomiędzy 5-25, tak długo jak żądana funkcja tej cząsteczki pozostaje aktywna. Fachowiec w tej dziedzinie może łatwo oznaczyć regiony interesującej go cząsteczki, która może tolerować tą zmianę, za pomocą wykresów Hoop/Woods i Kyte-Doolittle, dobrze znanych ze stanu techniki.
Przez „fragment” rozumie się polipeptyd stanowiący tylko część sekwencji i struktury nienaruszonego polipeptydu pełnej długości. Ten fragment może zawierać delecję C-końcową i/lub delecję N-końcową peptydu natywnego. „Immunogeniczny fragment” poszczególnej proteiny HCV będzie zawierał głównie, co najmniej 5-10 sąsiadujących z sobą reszt aminokwasowych cząsteczki pełnej długości, korzystnie, co najmniej 15-25 sąsiadujących reszt aminokwasowych, najbardziej korzystnie, co najmniej 20-50 lub więcej sąsiadujących reszt aminokwasowych cząsteczki pełnej długości definiu8
PL 213 363 B1 jącej epitop, lub każdą dodatnia liczbę całkowitą pomiędzy 5 aminokwasów a pełnej długości sekwencją, pod warunkiem, że omawiany fragment zachowuje immunoreaktywność w opisanych tutaj testach.
Na przykład, korzystne immunogeniczne fragmenty, obejmują, lecz nie są ograniczone do fragmentów HCV rdzenia zawierających np., aminokwasy 10-45, 10-53, i 120-130 tej, poliproteiny, epitop 5-1-1 (w regionie NS3 genomu wirusowego) jak też zdefiniowane epitopy pochodzące z regionów E1, E2, c33c (NS3), c100 (NS4), NS3/4a i NS5 poliproteiny HCV, jak też któregokolwiek z różnych innych zidentyfikowanych epitopów z poliproteiny HCV. Patrz np., Chien i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 10011-10015; Chien i wsp., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien i wsp., Międzynarodowa Publikacja nr WO 93/00365; Chien, D.Y., Publikacja Międzynarodowa nr WO 94/01778; Patent St.Zjedn.Ameryki nr 6,150,087 i 6,121,020.
Określenie „epitop” tak jak stosuje się tutaj odnosi się do sekwencji, co najmniej około 3 do 5, korzystnie około 5 do 10 lub 15 i więcej niż około 1,000 aminokwasów (lub którejkolwiek mieszczącej się pomiędzy liczby całkowitej), który definiuje sekwencję, która sama albo, jako część większej sekwencji, wiąże się z przeciwciałem generowanym w odpowiedzi na taką sekwencję. Nie ma górnego limitu krytycznego, co do długości tego fragmentu, który może zawierać prawie pełną długość sekwencji proteinowej, lub nawet proteinę fuzyjną zawierającą dwa lub więcej epitopów z poliproteiny HCV. Epitop stosowany w niniejszym wynalazku nie jest ograniczony do polipeptydu posiadającego dokładną sekwencję części proteiny rodzicielskiej, z której pochodzi. Faktycznie, genomy wirusowe są w stanie nieustannych zmian i zawierają kilka domen zmiennych, które przejawiają względnie wysoki stopień zmienności pomiędzy izolatami. Zatem, określenie „epitop” obejmuje sekwencje identyczną do sekwencji naturalnej, jak też modyfikacje w stosunku do tej sekwencji naturalnej, takie jak delecje, addycje, i substytucje (ogólnie konserwatywnej natury).
Regiony danego polipeptydu zawierającego epitop mogą być identyfikowane stosując każdą z technik mapujących epitopy, dobrze znanych w stanie techniki. Patrz, np., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, tom 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Na przykład, epitopy liniowe mogą być oznaczane przez np., konkurencyjnie syntetyzowane dużej liczby peptydów na stałych podłożach, peptydów odpowiadających części cząsteczki proteinowej i reakcja peptydów z przeciwciałami, podczas gdy peptydy te są wciąż przyłączone do podłoża. Takie techniki znane są w literaturze jak opisano w np., Patencie St.Zjedn.Ameryki nr 4,708,871; Geysen i wsp., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geysen i wsp., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 178-182; Geysen i wsp., (1986) Molec. Immunol. 23:709-715. Stosując takie techniki, zdefiniowana została liczba epitopów HCV,. Patrz, np., Cien i wsp., Viral Hepatitis and Liver Disease (1994) str. 320-324, oraz przedstawione publikacje. Podobnie, epitopy konformacyjne są łatwo identyfikowane przez oznaczanie przestrzennej konformacji aminokwasów, tak jak np., krystalograficznie promieniowaniem X, dwuwymiarowym jądrowym rezonansem magnetycznym. Patrz np., Epitope Mapping Protocols, supra. Antygenowe regiony proteinowe mogą być również identyfikowane stosując standardowe wykresy antygenowości i hydropatii, takich jak te wyliczone stosując np., wersję Omiga 1,0 oprogramowania dostępną z Oxford Molecular Group. Ten program komputerowy wykorzystuje metodę Hopp/Woods, i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78:3824-3828 do oznaczania profili antygenowości i technika Kyte-Doolittle, Kyte i wsp., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132 do wykresów hydropatii.
Tak jak stosuje się tutaj określenie „epitop konformacyjny” odnosi się do części pełnej długości proteiny, jej analogu lub muteiny, posiadających cechy budowy natywne do sekwencji aminokwasowej kodującej epitop pełnej długości naturalnej proteiny. Wrodzone cechy konstrukcyjne obejmują, lecz nie są ograniczone do glikozylacji i do budowy trójwymiarowej. Długość epitopu definiującego sekwencję może być przedmiotem wielu odmian, ponieważ sądzi się, że epitopy te tworzone są przez kształt trójwymiarowy antygenu (np., pofałdowanie). Dlatego więc, aminokwasy określające ten epitop mogą być względnie małej liczby, ale szeroko rozproszone wzdłuż długości cząsteczki (lub nawet na różnych cząsteczkach w przypadku dimerów itp.,) będąc doprowadzonymi do prawidłowej konformacji epitopowej poprzez pofałdowanie. Te części antygenu pomiędzy resztami określającymi ten epitop mogą nie być krytyczne dla konformacyjnej budowy epitopu. Na przykład, delecja lub substytucja tych rozpościerających się sekwencji może nie zmieniać tego epitopu konformacyjnego sprawiając, że sekwencje krytyczne dla epitopu konformacyjnego są utrzymane (np., cysteiny odpowiedzialne za mostki dwusiarczkowe, miejsca glikozylacji, itp.).
Epitopy konformacyjne obecne w regionie NS4/4a są łatwo identyfikowane stosując powyżej omawiane sposoby. Ponadto, obecność lub nieobecność epitopu konformacyjnego w danym peptydzie
PL 213 363 B1 może być łatwo określona poprzez skrining antygenu, o który chodzi, za pomocą przeciwciał (serum poliklonalne lub monoklonalne do epitopu konformacyjnego) i porównanie ich reaktywności do zdenaturowanej wersji tych antygenów, który zachowuje tylko epitopy liniowe, (jeżeli w ogóle). W takim skriningu stosowanie przeciwciał poliklonalnych może być korzystne dla absorbowania surowicy poliklonalnej najpierw z zdenaturowanym antygenem i sprawdzenia czy zachowuje ona przeciwciała w stosunku do antygenu badanego. Ponadto, w przypadku NS3/4a, cząsteczka, która zachowuje wrodzoną konformację będzie także mieć proteazową i ewentualnie helikazową aktywność enzymatyczną. Takie aktywności mogą być wykrywane stosując testy enzymatyczne, jak opisano dalej poniżej.
Korzystnie, epitop konformacyjny jest wytwarzany rekombinacyjnie i jest wyrażany w komórce, z której jest ekstrahowany w warunkach, które zabezpieczają jego pożądaną cechę strukturalną, np., bez denaturacji epitopu. Komórki takie obejmują bakterie, drożdże, owady i komórki ssaka. Ekspresja (wyrażanie) i izolacja epitopów konformacyjnych rekombinantowych z poliproteiny HCV opisano, w np., International Publication nr WO 96/04301, WO 94/01778, WO 95/33053, WO 92/08734. Alternatywnie, możliwa jest ekspresja tych antygenów i następnie po odzyskaniu tej proteiny jej renaturacja. Jest także zrozumiałym, że synteza chemiczna może także dostarczać konformacyjnych mimitopów antygenowych, które reagują krzyżowo z „wrodzonym” konformacyjnym epitopem antygenowym.
Określenie „wieloepitopowy antygen fuzyjny” („multiple epitope fusion antigen”) lub MEFA” jak stosuje się tutaj oznacza polipeptyd, w którym wielokrotne antygeny HCV są częścią pojedynczego, ciągłego łańcucha aminokwasowego, który to łańcuch nie występuje w naturze. Antygeny HCV mogą być powiązane wprost ze sobą wiązaniami peptydowymi lub mogą być oddzielone przez ingerujące sekwencje aminokwasowe. Antygeny fuzyjne mogą także zawierać sekwencje egzogenne w stosunku do poliproteiny HCV. Ponadto, sekwencje HCV obecne mogą być z licznych genotypów i/lub izolatów HCV. Przykłady szczególnych MEFA do zastosowania w obecnych immunotestach są wymienione np., w Publikacji Międzynarodowej nr WO 97/44469 i są opisane poniżej.
„Przeciwciało” oznacza cząsteczkę, która w znaczeniu chemicznym lub fizycznym, specyficznie wiąże się z polipeptydem będącym przedmiotem zainteresowania. Dlatego zatem, rdzeniowe przeciwciało HCV jest cząsteczką, która specyficznie wiąże się z proteiną rdzeniową HCV. Określenie „przeciwciało”, jak stosuje się tutaj, obejmuje przeciwciała otrzymane z zarówno preparatów poliklonalnych jak i monoklonalnych, jak też z następujących: hybryd (chimerycznych) cząsteczek przeciwciał (patrz np., Winter i wsp., (1991) Nature 349:293-299; i Patent USA nr 4,816,567); fragmentów F(ab')2 i F(ab);
cząsteczek Fv (heterodimerów niekowalencyjnych, patrz na przykład, Inbar i wsp., (1972) Proc Natl Acad Sci USA 69:2659-2662 i Ehrlihch i wsp., (1980) Biochem 1:4091-4096); cząsteczek Fv o pojedynczym łańcuchu (sFv) (patrz na przykład, Huston i wsp., (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-5883); dimerycznych i trimerycznych konstruktów fragmentów przeciwciał; miniprzeciwciała (patrz, np., Pack i wsp. (1992) Blochem 31:1579-1584; Cumber i wsp. (1992) J Immunology 149B: 120-126; cząsteczki przeciwciała humanizowanego (patrz na przykład, Riechmann i wsp. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyan i wsp. (1988) Science 239:1534-1536; i publikacja patentowa Wielkiej Brytanii nr GB 2,276,169, opublikowana 21 września 1994); i każdych funkcjonalnych fragmentów otrzymanych z takich cząsteczek, przy czym fragmenty takie zachowują immunologiczne właściwości wiążące rodzicielskiej cząsteczki przeciwciała.
Tak jak zastosowano tutaj, określenie „przeciwciało monoklonalne” odnosi się do kompozycji przeciwciała posiadającej homogenną populację przeciwciała. Określenie to nie jest ograniczone ani co do gatunku ani co do źródła tego przeciwciała, ani nie jest ograniczone sposobem, którym jest otrzymane. Zatem, określenie obejmuje przeciwciała otrzymane z mysich hybrydom, jak również ludzkie monoklonalne przeciwciała otrzymane stosując raczej ludzkich niż mysich hybrydomy. Patrz, np., Cote i wsp. Monclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 1985, str. 77.
Proteina „rekombinowana” jest proteiną, która zachowuje pożądaną aktywność i która była przygotowywana technikami rekombinacji DNA tak jak tutaj opisano. Ogólnie, gen będący przedmiotem zainteresowania jest klonowany i następnie wyrażany w organizmach transformowanych, jak opisano poniżej. Organizm gospodarza wyraża ten obcy gen produkując w ten sposób proteinę w warunkach ekspresji.
Przez „izolowany” rozumie się wtedy gdy odnosi się do polipetydu, że wskazana cząsteczka jest wyodrębniana i oddzielana z całego organizmu, w którym cząsteczka ta znajduje się w naturze lub jest w znaczącej mniejszości w stosunku do w innych biologicznych makrocząsteczkach tego samego typu. Określenie „izolowany” w odniesieniu do polinukleotydu oznacza cząstkę kwasu nukleinowego pozbawioną, w całości lub w części, sekwencji zwykle związanej z nim w naturze; lub sekwencję jaka
PL 213 363 B1 istnieje w naturze, lecz posiadającą sekwencje heterologiczne z nimi związane; lub cząsteczkę odłączoną od chromosomu.
Przez „równoważnik determinanty antygenowej” rozumie się determinantę antygenową z różnych podgatunków lub szczepów HCV, takich jak szczepy 1, 2, lub 3 HCV. Bardziej szczegółowo, znane są takie epitopy jak 5-1-1, i takie epitopy różnią się pomiędzy szczepami 1, 2, i 3. Zatem, epitopy 5-1-1 z trzech różnych szczepów są równoważnikami determinant antygenowych i są zatem „kopiami” nawet wtedy gdy ich sekwencje nie są identyczne. Ogólnie, sekwencje aminokwasowe równoważników determinant antygenowych będą miały wysoki stopień homologii sekwencji, np., homologię sekwencji aminokwasowej większą niż 30%, korzystnie większą niż 40% kiedy te dwie sekwencje są przyrównane.
„Homologia” odnosi się do procentowego podobieństwa pomiędzy dwoma polinukleotydami lub dwiema cząsteczkami polpeptydu. Dwie sekwencje DNA lub polipeptydu są „homologiczne zasadniczo” jedna do drugiej wtedy gdy sekwencje te wykazują co najmniej około 50%, korzystnie co najmniej około 75%, bardziej korzystnie co najmniej około 80% - 85%, korzystnie co najmniej około 90% i najbardziej korzystnie co najmniej około 95% - 98% podobieństwa sekwencji na określoną długość cząsteczki. Tak jak stosuje się tutaj, zasadniczo homologiczna odnosi się także do sekwencji wykazujących całkowitą identyczność do wymienionych sekwencji DNA lub polipeptydów.
Ogólnie „identyczność” odnosi się do dokładnej zgodności nukleotydu-do-nukleotydu i aminokwasu-do-aminokwasu odpowiednio dwóch polinukleotydowych lub polipeptydowych sekwencji. Procent identyczności może być oznaczony przez proste porównanie informacji sekwencji pomiędzy dwiema cząsteczkami przez przyrównanie tych sekwencji, zliczenie dokładnego numeru par pomiędzy dwiema przyrównanymi sekwencjami, podzielenie przez długość sekwencji krótszej i pomnożenie tego wyniku przez 100.
Łatwo dostępne programy komputerowe mogą być pomocne w analizie podobieństwa i identyczności, takie jak ALIGN, Dayhoff, M.O. w Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff wydawca, 5 Suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, które dostosowują algorytm miejscowej homologii Smith and Waterman Advances in Appl. Math. 2:482-489, 1981 do analizy peptydu. Programy do oznaczania podobieństwa i identyczności sekwencji dostępne są w Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (dostępna z Genetics Computer Group, Madison, WI) na przykład w programach, BESTFIT, FASTA i GAP, które również polegają na algorytmie Smith and Waterman. Programy te są łatwo stosowalne z wyjściowymi parametrami zalecanymi przez wytwórcę i opisanymi w Wisconsin Sequence Analysis Package. Na przykład, procent podobieństwa poszczególnej sekwencji nukleotydowej do odnośnej sekwencji może być oznaczony stosując algorytm homologii Smith and Waterman z tabelą i standardową tablicą wartościującą i „karami” za sześć pozycji nukleotydowych.
Innym sposobem ustalania procentowego podobieństwa w kontekście niniejszego wynalazku jest zastosowanie grupy programów MPSRCH autorstwa University of Edinburgh, rozwiniętej przez John F. Collins i Shane S. Sturrok i rozpowszechnionej przez IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Z tego zestawu grup zastosować można algorytm Smith Waterman, gdzie stosowane są dowolne parametry użyte do tabeli wyników (na przykład, otwarty przedział „kary” za 12, rozszerzony przedział „kary” za 1 jeden i przedział kary za sześć). Generowana z tych danych wartość „Par” odzwierciedla „podobieństwo sekwencji”. Inne odpowiednie programy do obliczania procentowej identyczności lub podobieństwa pomiędzy sekwencjami są ogólnie znane w stanie techniki, na przykład, innym programem dopasowania jest BLAST, stosowany z dowolnymi parametrami. Na przykład, BLASTN i BLASTP mogą być stosowane używając następujących dowolnych parametrów: kod genetyczny=standard; filtr=żaden; nić=obie; przecięcie=60; spodziewane=10; Matryca=BLOSUM62; opisy=50 sekwencji; sort by=WYSOKI WYNIK; baza danych=nie nadmierna, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+ +GenBank CDS translacje + proteina Swiss + Spupdate + PIR. Szczegóły tych programów można znaleźć pod następującym adresem internetowym:
http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.
Alternatywnie homologia może być oznaczana przez hybrydyzację polinukleotydów w warunkach, które tworzą stałe dupleksy pomiędzy regionami homologicznymi, następnie trawienie specyficzną nukleazą(ami) jednoniciowymi, i oznaczenie rozmiarów tych trawionych fragmentów. Sekwencje DNA, które są zasadniczo homologiczne mogą być identyfikowane w doświadczeniu hybrydyzacji Southern w warunkach, na przykład ścisłych, jak zdefiniowano dla tego szczególnego układu.
PL 213 363 B1
Zdefiniowanie odpowiednich warunków hybrydyzacji mieści się w zakresie wiedzy fachowca w tej dziedzinie. Patrz, np., Sambrook i wsp. supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
„Sekwencja kodująca” lub sekwencja która „koduje” wybrany polipeptyd jest cząsteczką kwasu nukleinowego, która jest transkrybowana (w przypadku DNA) i podlega translacji (w przypadku mRNA) do polipeptydu in vitro lub in vivo kiedy umieszczona jest pod kontrolą odpowiednich sekwencji regulatorowych. Granice tej sekwencji kodującej są wyznaczone przez kodon start przy zakończeniu 5' (aminowym) i kodon stop przy zakończeniu 3' (karboksylowym). Sekwencja zakończenia transkrypcji może być ulokowana 3' do sekwencji kodującej.
„Operacyjnie związany” odnosi się do rozmieszczenia elementów, przy czym opisane składniki są tak skonfigurowane aby uzyskać ich pożądaną funkcję. Zatem dany promotor operacyjnie związany z sekwencją kodującą zdolny jest do wywołania ekspresji sekwencji kodującej kiedy są obecne właściwe czynniki transkrypcyjne i tym podobne. Promotor ten nie musi sąsiadować z sekwencją kodującą, tak długo jak jego funkcje kierują tą ekspresją. Zatem więc, na przykład, interwencyjne, transkrybowane nie ulegające dotąd translacji sekwencje mogą być obecne pomiędzy sekwencjami promotora i sekwencją kodującą, jak mogą introny transkrybowane i sekwencje promotora wciąż mogą być uważane jako operacyjnie związane z sekwencją kodującą.
„Element kontrolny” odnosi się do sekwencji nukleotydu, który ułatwia ekspresję sekwencji kodującej z którą jest związany. Określenie to obejmuje promotory, sekwencje terminacji transkrypcji, domeny regulatorowe w kierunku do góry nici, sygnały poliadenylacji, regiony nie-translacyjne, włącznie z 5'-UTRs i 3'-UTRs i kiedy jest to odpowiednie sekwencje liderowe i wzmacniacze, które wspólnie prowadzą do transkrypcji i translacji sekwencji kodującej w komórce gospodarza.
„Promotor” tak jak stosuje się tutaj jest regionem regulatorowym DNA zdolnym do wiązania polimerazy RNA w komórce gospodarza i rozpoczynania transkrypcji w dół nici (kierunek 3') związanej z nią operacyjnie sekwencji kodującej. Dla celów niniejszego wynalazku sekwencja promotora obejmuje minimalną liczbę zasad lub koniecznych elementów do zapoczątkowania transkrypcji genu, będącego przedmiotem zainteresowania, na poziomie dającego się wykryć powyżej tła. Wewnątrz sekwencji promotora jest miejsce inicjacji transkrypcji, jak również białkowe domeny wiążące (sekwencje zgodności) odpowiedzialne za wiązanie polimerazy RNA. Promotory eukariotyczne będą często, lecz nie zawsze zawierać miejsca „TATA” i miejsca „CAT”.
Sekwencja kontrolna „kieruje transkrypcją” sekwencji kodującej w komórce kiedy polimeraza RNA zwiąże sekwencję promotora i zajdzie transkrypcja sekwencji kodującej do mRNA, który jest następnie przetłumaczony (ang. translated) na polipeptyd kodowany przez tą sekwencję kodującą.
„Kaseta ekspresji” lub „konstrukt ekspresji” odnosi się do grupy, która jest zdolna do kierowania ekspresją sekwencji lub genu(ów) będących przedmiotem zainteresowania. Kaseta ekspresji obejmuje elementy kontrolne, takie jak opisano powyżej, takie jak promotor, który jest związany operacyjnie z (do kierowania transkrypcją) sekwencją(ami) lub genem(ami), i często zawiera także sekwencję poliadenylacji. W ramach pewnych postaci wynalazku mieści się także opisana tutaj kaseta ekspresji, która może być zawarta w konstrukcie plazmidowym. Ponadto do składników kasety ekspresji można zaliczyć także konstrukt plazmidowy, jeden lub więcej markerów selekcyjnych, sygnał, który pozwala konstruktowi plazmidowemu istnieć jako jednoniciowe DNA (np., M13 miejsce ori replikacji), co najmniej jedno wielokrotne miejsce klonowania i „ssacze” miejsce ori replikacji (np., SV40 lub adenowirusa miejsce ori replikacji).
„Transformacja” tak jak zastosowano tutaj, odnosi się do wstawienia egzogennego polinukleotydu do komórki gospodarza, niezależnie od metody zastosowanej do wstawienia: na przykład transformacja poprzez wychwyt bezpośredni, transfekcja, infekcja i podobne. Poszczególne sposoby transfekcji, patrz dalej poniżej. Egzogenny polinukleotyd może być utrzymany jako nie zintegrowany wektor, na przykład, episom, lub ewentualnie może być zintegrowany do genomu gospodarza.
„Komórka gospodarza” jest komórką, która była transformowana lub jest zdolna do transformacji przez egzogenną sekwencję DNA.
„Wspólne stałe podłoże” oznacza pojedyncze stałe podłoże do którego polipeptydy HCV stosowane w niniejszym immunoteście są związane kowalencyjnie lub za pomocą środków niekowalencyjnych takich jak adsorbcja hydrofobowa.
„Immunologicznie reaktywny” oznacza, że badany antygen będzie reagował specyficznie z przeciwciałami anty-HCV obecnymi w próbie biologicznej od zakażonych przez HCV osobników.
„Kompleks immunologiczny” oznacza utworzoną kombinację kiedy przeciwciało wiąże się do epitopu na antygenie.
PL 213 363 B1
Tak jak zastosowano tutaj „próba biologiczna” odnosi się do próbki tkanki lub płynu wyizolowanego z osobnika, obejmując lecz nie w sposób ograniczony, na przykład, krew, osocze, surowicę, wydaliny, mocz, szpik kostny, żółć, płyn rdzeniowego, chłonki, próbek skóry, zewnętrznych wydzielin skóry, przewodów: oddechowego, jelitowego i moczowopłciowego, łez, śliny, mleka, komórek krwi, organów, biopsji a także próbek składników hodowli komórek in vitro obejmując lecz nie w sposób ograniczony kondycjonowane podłoża otrzymywane z hodowli komórek i tkanek w medium hodowlanym, na przykład komórek rekombinowanych i składników komórek.
Tak jak zastosowano tutaj, określenia „znacznik” i „wykrywalny znacznik” odnosi się do cząsteczki zdolnej do wykrycia obejmując, lecz nie w sposób ograniczony, izotopy radioaktywne, związki fluorescencyjne, chemiluminescencyjne, chromoforów, barwników, jony metali, sole metali, ligandy (np., biotyna, streptoawidyna lub hapteny) i tym podobne. Określenie „związek fluorescencyjny” odnosi się do substancji lub jej części, która jest zdolna do wykazywania fluorescencji w zakresie wykrywalnym. Poszczególne przykłady znaczników, które mogą być zastosowane zgodnie z wynalazkiem obejmują lecz nie są ograniczone do, peroksydazy chrzanowej (HRP), fluoresceiny, FITC, rodaminy, dansylu, umbelliferonu, estru dimetyloakrydynowego (DMAE), czerwieni teksaskiej, luminolu, NADPH i α-β-galaktozydazy.
II. Sposoby realizacji wynalazku
Przed opisaniem niniejszego wynalazku w szczegółach, należy zrozumieć, że wynalazek ten nie jest ograniczony do szczególnych preparatów lub parametrów sposobu, które mogą się oczywiście wahać. Należy również rozumieć, że stosowana tutaj nomenklatura ma tylko dla celu opisanie poszczególnych postaci wynalazku i nie jest przeznaczona do jego ograniczenia.
Jakkolwiek można zastosować wiele kompozycji i sposobów podobnych lub równoważnych do opisanego tutaj, korzystne materiały i sposoby zostaną opisane w niniejszym opisie. Jak zaznaczono powyżej, niniejszy wynalazek jest oparty na odkryciu nowych sposobów diagnostycznych do precyzyjnego wczesnego wykrywania zakażeń HCV. Sposoby te polegają na identyfikacji i zastosowaniu wysoko immunogenicznych przeciwciał HCV i antygenów, które są obecne podczas wczesnych stadiów serokonwersji HCV przez co jest podwyższona dokładność wykrywania i zredukowane występowanie fałszywych wyników. Sposoby te mogą być wygodnie realizowane w skali pojedynczego testu.
Bardziej szczegółowo, test jest przeprowadzany na stałym podłożu do którego związano jedno lub więcej anty-rdzeniowych przeciwciał HCV (skierowanych przeciwko zarówno temu samemu lub różnym epitopom rdzeniowym HCV) i epitopowi pochodzącemu z regionu NS3/4a poliproteiny HCV. Przykłady poszczególnych przeciwciał antyrdzeniowych użytecznych w niniejszym wynalazku obejmują lecz nie są ograniczone do cząsteczek przeciwciał takich jak przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko epitopom w regionie rdzeniowym znalezionym pomiędzy 10-53 aminokwasem; 10-45 aminokwasem; 67-88 aminokwasem; 120-130 aminokwasem, lub przeciwciała skierowane przeciwko któremukolwiek z epitopów rdzeniowych zidentyfikowanych w np., Houghton i wsp., U.S. Patent nr 5,350,671; Chien i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien i wsp., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien i wsp., Międzynarodowa Publikacja nr WO 93/00365; Chien, D.Y., Międzynarodowa Publikacja nr WO 94/01778; i zaaprobowanymi zgłoszeniami patentowymi St. Zjedn.Ameryki nr nr 08/403,590 i 08/444,818 należącymi do zgłaszającego.
Region NS3/4a poliproteiny HCV był opisany i sekwencja aminokwasowa i ogólna budowa tej proteiny była ujawniona np., w: Yao i wsp., Structure (listopad 1999) 7:1353-1363; Sali i wsp., Biochem. (1998) 37:3392-3401; i Bartenschlager, R., J. Viral Hepat. (1999) 6:165-181. Patrz, także Dasmahapatra i wsp., patent St.Zjedn.Ameryki nr 5,843,752. Przedmiotowe immunotesty wykorzystują co najmniej jeden epitop konformacyjny pochodzący z regionu Ns3/4a, który istnieje w konformacji jaką znajduje się w naturalnie występującej cząsteczce HCV lub jej infekcyjnym produkcie, jak wykazano przez zabezpieczenie proteazy i ewentualnie enzymatycznej aktywności helikazy zwykle ujawnianej przez genowy produkt NS3/4a i/lub imunoreaktywność tego antygenu z przeciwciałami w próbie biologicznej od osobników zakażonych HCV, i przez utratę imunoreaktywności epitopowej po denaturacji tego antygenu. Na przykład epitop konformacyjny może być rozłożony przez podgrzewanie, zmianę pH do bardzo kwaśnego lub zasadowego lub poprzez dodanie znanych organicznych substancji denaturujących, takich jak ditiotreitol (DTT) lub odpowiedniego detergentu. Patrz, np., Protein Purfication Methods, a practical approach (E.L.V. Harris i S. Angal wyd., IRL Press) i denaturowany produkt jest porównywany do produktu, który nie był traktowany jak powyżej.
Aktywność proteazowa i helikazowa może być oznaczana stosując standardowe testy enzymatyczne dobrze znane w stanie techniki. Na przykład aktywność proteazowa może być oznaczana
PL 213 363 B1 stosując testy dobrze znane w stanie techniki. Patrz, np., Takeshita i wsp., Anal. Biochem. (1997) 247:242-246; Kakiuchi i wsp. J. Biochem. (1997) 122; 749-755; Sali i wsp., Biochemistry (1998) 37:3392-3401; Cho i wsp., J. Virol. Meth. (1998) 72:109-115; Cerretani i wsp., Anal. Biochem. (1999) 266:192-197; Zhang i wsp., Anal. Biochem. (1999) 270:268-275; Kakiuchi i wsp., J. Virol. Meth. (1999) 80:77-84; Fowler i wsp., J. Biomol. Screen. (2000) 5:153-158; i Kim i wsp., Anal. Biochem. (2000) 284:42-48. Szczególnie wygodny test do sprawdzenia aktywności proteazowej jest przedstawiony w przykładach poniżej. Podobnie, testy aktywności helikazowej są dobrze znane w stanie techniki i aktywność helikazy epitopu NS3/4a może być oznaczana stosując, na przykład test ELISA jak opisano w na przykład w Hsu i wsp., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1998) 253:594-599; testowy układ zbliżeniowej scyntylacji, jak opisano w Kyono i wsp., Anal. Biochem. (1998) 257:120-126; próby skriningowe o dużej przepustowości jak opisano np., w Hicham i wsp., Antiviral Res. (2000) 46:181-193 i Kwong i wsp., Methods Mol. Med. (2000) 24:97-116; jak również w innych metodach testowych znanych w stanie techniki. Patrz, np., Khu i wsp., J.Virol. (2001) 75:205-214; Utama i wsp., Virology (2000) 273:316-324; Paolini i wsp., J. Gen. Virol. (2000) 81:1335-1345; Preugschat i wsp., Biochemistry (2000) 39:5174-5183; Preugschat i wsp., Methods Mol. Med. (1998) 19:353-364; i Hesson i wsp., Biochemistry (2000) 39:2619-2625.
Długość antygenu jest wystarczająca do utrzymania immunoreaktywnego konformacyjnego epitopu. Często, polipeptyd zawierający stosowany antygen będzie prawie pełnej długości, jakkolwiek polipeptyd ten może być także skrócony, na przykład dla zwiększenia rozpuszczalności lub poprawienia wydzielania. Ogólnie, stwierdzony w NS3/4a konformacyjny epitop jest wyrażany w komórce jako polipeptyd rekombinacyjny i polipeptyd ten dostarcza epitop w żądanej postaci, jak opisano w szczegółach poniżej.
Reprezentatywne sekwencje aminokwasowe dla polipeptydów NS3/4a są pokazane na Figurze 3 i Figurach 4A do 4D. Pogrubiona alanina występująca w pozycji 182 Figury 3 zastąpiła miejsce natywnej seryny stwierdzanej w tej pozycji w celu zapobieżenia autokatalizie jaka mogłaby w tym przypadku zajść. Sekwencja aminokwasowa pokazana w pozycjach 2-686 Figur 4A do 4D odpowiada pozycjom aminokwasowym 1027-1711 HCV-1. Inicjatorowy kodon (ATG) kodujący Met, jest pokazany jako pozycja 1. Ponadto, Thr normalnie występująca w pozycji 1428 w HCV-1 (pozycja aminokwasowa 403 na Figurze 4) jest zmutowana do Pro a Ser normalnie występująca w pozycji 1429 HCV-1 (pozycja aminokwasowa 404 na Figurze 4) jest zmutowana do Ile. Jakkolwiek, ani sekwencja natywna, z lub bez N-terminalnej Met, przedstawiony analog, z lub bez N-terminalnej Met lub inne analogi i fragmenty mogą być stosowane w przedmiotowych testach, tak długo jak epito jest wytwarzany stosując metodę, która zachowuje lub odzyskuje swoją natywną konformację taką, że aktywność proteazowa i ewentualnie aktywność helikazowa są zachowane. Dasmahapatra i wsp., patent St.Zjedn.Am. nr 5,843,752 i Zhang i wsp., patent St.Zjedn.Am. nr 5,990,276, oba opisują analogi NS3/4a.
NS3 proteaza NS3/4a jest znajdowana w pozycjach 1027-1207 ponumerowanych względem HCV-1, pozycje 2-182 na Figurze 4. Budowa proteazy NS3 i miejsca aktywnego są znane. Patrz, np., De Francesco i wsp., Antivir. Ther. (1998) 3:99-109; Koch i wsp., Biochemistry (2001) 40:631-640. Zmiany na sekwencję natywną, które normalnie będą tolerowane będą tymi na zewnątrz miejsca aktywnego tej cząsteczki. Szczególnie, jest pożądanym utrzymanie aminokwasu 1- lub 2-155 na Figurze 4 z małymi lub tylko konserwatywnymi podstawieniami. Aminokwasy występujące poza 155 będą tolerowały większe zmiany. Dodatkowo jeżeli fragmenty sekwencji NS3/4a przedstawione na Figurze 4 są stosowane, fragmenty te będą generalnie obejmować co najmniej aminokwasy 1- lub 2-155, korzystnie aminokwasy 1- lub 2-175 i najbardziej korzystnie aminokwasy 1- i 2-182 z lub bez N-końcowej Met. Domenę helikazy stwierdzono w pozycjach 1193-1657 HCV-1 (pozycje 207-632 na Figurze 4). Zatem, jeśli aktywność helikazy jest pożądana, ta część cząsteczki będzie utrzymana z małymi lub tylko konserwatywnymi zmianami. Fachowiec w stanie techniki będzie łatwo mógł oznaczyć inne regiony, które będą tolerowały zmianę opartą o znaną budowę NS3/4a.
Stałe podłoże może również zawierać inne antygeny. Na przykład, wieloepitopowe antygeny fuzyjne (określone „MEFAs”) jak opisano w Publikacji Międzynarodowej nr WO 97/44469, mogą być wiązane do stałego podłoża w celu zastosowania w niniejszych testach. Takie MEFAs obejmują wielokrotne epitopy otrzymane z dwóch lub więcej różnych regionów wirusa pokazanych na Figurze 1 i w Tabeli 1. Zwłaszcza, jak pokazano na Figurze 1 i w Tabeli 1, poliproteina HCV pod wpływem rozszczepienia wytwarza co najmniej dziesięć określonych produktów w porządku rdzeń-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. Polipeptyd rdzenia znajduje się w pozycjach 1-191, ponumerowanych względem HCV-1 (patrz, Choo i wsp. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:2451-2455,
PL 213 363 B1 dla genomu HCV-1). Ten polipeptyd następnie jest przetwarzany w celu wytworzenia polipeptydu HCV z aminokwasami, w przybliżeniu, 1-173. Polipeptydy otoczkowe E1 i E2 występują w pozycjach odpowiednio około 192-383 i 384-746. Domena P7 została stwierdzona w pozycjach około 747-809. NS2 jest integralną proteiną błonową z proteolityczną aktywnością i została stwierdzona w pozycjach 810 -1026 tej poliproteiny. NS2 zarówno sama jak i w połączeniu z NS3 (znaleziona w pozycjach około 1027-1657), rozszczepia to siostrzane wiązanie NS2-NS3, które z kolei generuje N-zakończenie NS3 i uwalnia dużą poliproteinę obejmującą zarówno proteazę serynową jak i helikazę RNA. Proteaza NS3 znaleziona w pozycjach około 1027-1207 służy do wytwarzania pozostałej poliproteiny. Helikazę stwierdzono w pozycjach 1193-1657. Zakończenie dojrzewania polproteiny jest zapoczątkowywane poprzez autokatalityczne rozszczepienie wiązania NS3-NS4a, katalizowane przez proteazę serynową NS3. Kolejne rozszczepienie poliproteiny HCV, w którym pośredniczy NS3, wydaje się być związane z rozpoznaniem wiązań rozszczepialnych przez cząsteczkę NS3 innego polpeptydu. W tych reakcjach, NS3 uwalnia kofaktor NS3 (NS4a znalezione w pozycjach około 1658-1711), dwie proteiny (NS4b znalezione w pozycjach około 1712-1972, i NS5A znalezione w pozycjach około 1973-2420) i zależną od RNA polimerazę RNA (NS5b znalezione w pozycjach około 2421-3011).
T a b e l a 1
Domena | Przybliżone obszary* |
C (rdzeń) | 1-191 |
E1 | 192-383 |
E2 | 384-746 |
P7 | 747-809 |
NS2 | 810-1026 |
NS3 | 1027-1657 |
NS4a | 1658-1711 |
NS4b | 1712-1972 |
NS5a | 1973-2420 |
NS5b | 2421-3011 |
* Ponumerowane względem HCV-1. Patrz, Choo i wsp. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-2455.
Wielokrotne antygeny HCV są częścią pojedynczego ciągłego łańcucha aminokwasowego, który to łańcuch nie występuje w naturze. Zatem, liniowy porządek epitopów jest różny niż ich liniowy porządek w genomie, z którego one pochodzą. Liniowy porządek sekwencji MEFAs do stosowania jest korzystnie aranżowany dla optimum antygeniczności. Korzystnie, epitopy te pochodzą z więcej niż jednego szczepu HCV, dostarczając w ten sposób dodatkowych możliwości wykrycia wielu szczepów HCV w pojedynczym teście. Zatem więc, MEFAs do stosowania tutaj, może zawierać różne regiony immunogeniczne pochodzące z poliproteiny opisanej powyżej. Ponadto, proteina wynikająca z przesunięcia ramki w regionie rdzeniowym tej poliproteiny taka jak opisano w publikacji międzynarodowej nr WO 99/63941 może być używana w MEFAs. Jeżeli jest to pożądane w proteinie fuzyjnej może występować co najmniej 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 lub 10 lub więcej jednego lub więcej epitopów pochodzących z poliproteiny HCV.
Na przykład, epitopy pochodzące z np., hyperzmiennego regionu E2, takiego jak region rozpostarty pomiędzy aminokwasami 384-410 lub 390-410, mogą być zawarte w antygenie MEFA. Szczególnie skutecznym epitopem E2 jest ten, który obejmuje sekwencje zgodności otrzymane z tego regionu, takie jak sekwencja zgodności Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn, która reprezentuje sekwencję zgodności dla aminokwasów 390-410 genomu HCV typu 1. Reprezentatywny epitop E2 obecny w MEFA według wynalazku może zawierać hybrydowy epitop rozpostarty między aminokwasami 390-444. Taki hybrydowy epitop E2 może obejmować sekwencję zgodności reprezentującą aminokwasy 390-410 w fuzyji z sekwencją natywnych aminokwasów dla aminokwasów 411-444 HVC E2.
Ponadto, antygeny te mogą pochodzić z różnych szczepów HCV. Wiele szczepów wirusowych HCV jest znanych i epitopy pochodzące z któregokolwiek z tych szczepów mogą być użyte w proteinie
PL 213 363 B1 fuzyjnej. Jest dobrze wiadomym, że w każdym gatunku poszczególne organizmy różnią się między sobą i dalej, że dany organizm taki jak wirus może mieć wiele różnych szczepów. Na przykład, jak wyjaśniono powyżej HCV obejmuje co najmniej 6 genotypów. Każdy z tych genotypów obejmuje równoważne antygenowe determinanty. Bardziej szczegółowo, każdy szczep obejmuje wiele determinant antygenowych, które są obecne na wszystkich szczepach tego wirusa lecz różnią się trochę od jednego szczepu wirusowego do drugiego. Na przykład HCV obejmuje antygenową determinantę znaną jako 5-1-1 (patrz Figura 1). Ta szczególna determinanta antygenowa występuje w trzech różnych formach na trzech różnych szczepach wirusowych HCV. Odpowiednio, w korzystnej postaci wynalazku wszystkie trzy formy 5-1-1 występują na wieloepitopowym antygenie fuzyjnym stosowanym w niniejszym immunoteście. Podobnie równoważne antygenowe determinanty z regionu rdzeniowego różnych szczepów HCV mogą być także obecne. Ogólnie, równoważne determinanty antygenowe mają wysoki stopień homologii w kategoriach sekwencji aminokwasowej, kiedy są zestawiane, stopień homologii jest ogólnie 30% lub większy, korzystnie 40% lub większy. Wielokrotna kopia epitopu według wynalazku może również obejmować wiele kopii, które są dokładnymi kopiami tego samego epitopu.
Reprezentatywne MEFAs do stosowania w niniejszych testach są opisane w Publikacji Międzynarodowej nr WO 97/44469. Dodatkowe reprezentatywne MEFAs do niniejszego stosowania obejmują te które zostały określone jako MEFA 12, MEFA 13 i MEFA 13.1. Jest zrozumiałym, że te MEFAs są jedynie przedstawicielami i inne epitopy pochodzące z genomu HCV również będą miały zastosowanie w niniejszych testach i mogą być włączone do tych lub innych MEFAs.
Sekwencja DNA i odpowiadająca jej sekwencja aminokwasowa MEFA 12 jest pokazana na Figurach 7A do 7F. Ogólny wzór strukturalny dla MEFA 12 jest pokazany na Figurze 6 i jest następujący: hSOD-E1(typ1)-E2 HVR zgodność(typ 1a)-E2 HVR zgodność (typ 1 i 2)-c33c krótki (typ1)-5-1-1 (typ1)-5-1-1) (typ 3)-5-1-1(typ 2)-c100 (typ1)-NS5 (typ 1)-rdzeń (typy 1 + 2)-rdzeń (typy 1 + 2). Ta zwielokrotniona kopia epitopu zawiera następującą sekwencję aminokwasową, numerowaną względem HCV-1 (numerowanie aminokwasów przeprowadzone poniżej zgodnie z numeracją dostarczoną w publikacji Choo, i wsp. (1991) Proc. Natl. Sci. USA 88:2451-2455, w której aminokwas #1 jest pierwszą metioniną zakodowaną przez sekwencję kodującą regionu rdzeniowego): aminokwasy 1-69 dysmutazy ponadtlenkowej (SOD używanej do wzmacniania ekspresji rekombinacyjnej tego białka); aminokwasy 303-320 poliproteiny z regionu E1; aminokwasy 390-410 poliproteiny, reprezentujące sekwencję zgodności dla hyperzmiennego regionu E2 HCV-1a; aminokwasy 384-411 poliproteiny z regionu E2, reprezentujące sekwencję zgodności dla hyperzmiennych regionów E2, HCV-1 i HCV-2; aminokwasy 1211-1457 poliproteiny HCV-1, które definiują helikazę; trzy kopie epitopu z 5-1-1, aminokwasy 1689-1735, jeden z HCV-1, jeden z HCV-3 i jeden z HCV-2, które to kopie są równoważne determinantom antygenowym z tych trzech różnych szczepów wirusowych HCV; polipeptyd C100 z HCV-1, aminokwasy 1901-1936 poliproteiny; dwie dokładne kopie epitopu z regionu NS5 HCV-1, każdy z aminokwasów 2278-2313 poliproteiny HCV; i dwie kopie trzech epitopów z regionu rdzeniowego, dwie z HCV-1 i jedna z HCV-2, które to kopie są równoważnymi antygenowymi determinantami reprezentowanymi przez aminokwasy 9-53 i 64-88 HCV-1 i 67-84 HCV-2.
Tabela 2 pokazuje pozycje aminokwasów różnych epitopów w MEFA 12 w odniesieniu do Figury 7A do 7F. Numerowanie w tych tabelach jest względem HCV-1. Patrz, Choo, i wsp. (1991) Proc. Natl. Sci. USA 88:2451-2455. MEFAs 13 i 13.1 mają wspólny wzór ogólny wymieniony powyżej dla MEFA 12 z modyfikacjami takimi jak wskazano w Tabelach 3 i 4, odpowiednio.
T a b e l a 2. MEFA 12
mefa aa# | 5' zakończenie | epitop | hcv aa# | szczep |
1-69* | Nco1 | hSOD | ||
72-89 | MluI | E1 | 303-320 | 1 |
92-112 | Hindlll | E2 HVR1a zgodność | 390-410 | 1 |
113-143 | E2 HVR1+2 zgodność | 384-414 | 1,2 | |
146-392 | Spel | C33C krótki | 1211-1457 | 1 |
395-441 | SphI | 5-1-1 | 1689-1735 | 1 |
PL 213 363 B1 ciąg dalszy Tabeli 2
444-490 | NruI | 5-1-1 | 1689-1735 | 3 |
493-539 | Clal | 5-1-1 | 1689-1735 | 2 |
542-577 | AvaI | C100 | 1901-1936 | 1 |
580-615 | XbaI | NS5 | 2278-2313 | 1 |
618-653 | Bglll | NS5 | 2278-2313 | 1 |
654-741 | NcoI | epitopy | 9-53, R47L | 1 |
rdzeniowe | 64-88 | 1 | ||
67-84 | 2 | |||
742-829 | Bali | epitopy | 9-53, R47L | 1 |
rdzeniowe | 64-88 | 1 | ||
67-84 | 2 |
* Proteina SOD jest skrócona w taki sposób, że wykrywany koniugat znakowane HRP-przeciwciało anty-SOD nie wiąże się do MEFA. Epitop rdzeniowy stosowany w detekcji jest zmutowany w celu zapobieżenia wiązania się z MEFA przeciwciał dla rdzenia HCV.
T a b e l a 3. MEFA 13
mefa aa# | 5' zakończenie | epitop | hcv aa# | szczep |
1-156* | Ncol | zmutowany hSOD (aa 70-72, ALA) | ||
161-178 | MluI | E1 | 303-320 | 1 |
181-201 | HindIII | E2 HVR1a zgodność | 390-410 | 1 |
202-232 | E2 HVR1+2 zgodność | 384-414 | 1, 2 | |
235-451 | C33C krótki | 1211-1457 | 1 | |
454-500 | HindIII | 5-1-1 Plmut* | 1689-1735 | 1 |
503-549 | NruI | 5-1-1 PImut * | 1689-1735 | 3 |
552-598 | ClaI | 5-1-1 Plmuc* | 1689-1735 | 2 |
601-636 | Aval | C100 | 1901-1936 | 1 |
639-674 | XbaI | NS5 | 2278-2313 | 1 |
677-712 | BglII | NS5 | 2278-2313 | 1 |
713-800 | Epitopy rdzeniowe | 9-53, R47L 64-88 67-84 | 1 1 2 | |
801-888 | Epitopy rdzeniowe | 9-53, R47L 64-88 67-84 | 1 1 2 |
* Epitopy 5-1-1 są modyfikowane przez eliminowanie możliwych miejsc rozszczepienia (CS lub CA) kierowanego przez rekombinantową proteinę NS3/4a. Zamiast CS lub CA sekwencje te były zmieniane na PI. Ponadto, proteina SOD jest mutowana tak aby koniugat detekcji przeciwciało anty-SOD znakowane HRP nie wiązało się do MEFA. Epitop rdzeniowy jest mutowany w celu zabezpieczenia przeciwciał rdzeniowych HCV, stosowanych w detekcji, przed wiązaniem się do MEFA.
PL 213 363 B1
T a b e l a 4. MEFA 1.3.1
mefa aa# | 5' zakończenie | epitop | hcv aa# | szczep |
1-86* | Ncol | zmutowany hSOD (aa 70-72, ALA) | ||
89-106 | MluI | E1 | 303-320 | 1 |
109-129 | HindIII | E2 HVR1a zgodność | 390-410 | 1 |
130-160 | E2 HVR1+2 zgodność | 384-414 | 1, 2 | |
163-379 | C33C krótki | 1211-1457 | 1 | |
382-428 | HindIII | 5-1-1 PImut* | 1689-1735 | 1 |
431-477 | NruI | 5-1-1 Plmut* | 1689-1735 | 3 |
480-526 | ClaI | 5-1-1 Plmut* | 1689-1735 | 2 |
529-564 | Aval | C100 | 1901-1936 | 1 |
567-602 | XbaI | NS5 | 2278-2313 | 1 |
605-640 | BglII | NS5 | 2278-2313 | 1 |
641-728 | epitopy rdzeniowe | 9-53, R47L 64-88 67-84 | 1 1 2 | |
729-816 | epitopy rdzeniowe | 9-53, R47L 64-88 67-84 | 1 1 2 |
* Epitopy 5-1-1 są modyfikowane przez eliminowanie możliwych miejsc rozszczepienia (CS lub CA) ukierunkowywane poprzez rekombinantową proteinę NS3/4a. Zamiast CS lub CA sekwencje te były zmieniane na PI. Ponadto, proteina SOD jest mutowana tak aby koniugat detekcji przeciwciało anty-SOD znakowane HRP nie wiązało się do MEFA. Epitop rdzeniowy jest mutowany w celu zabezpieczenia przeciwciał rdzeniowych HCV, stosowanych w detekcji, przed wiązaniem się do MEFA.
W jednym formacie testu, próba jest łączona ze stałym podłożem, jak opisano dalej poniżej. Jeżeli próba ta jest zakażana HCV, antygeny rdzeniowe jak również przeciwciała HCV do tych epitopów obecne na tym stałym podłożu, będą wiązały się do składników stałego podłoża. Następnie dodawane jest wykrywalne znakowane przeciwciało anty-rdzeniowe. To znakowane przeciwciało anty-rdzeniowe jest skierowane przeciwko innemu epitopowi niż to przeciwciało anty-rdzeniowe, które jest związane do stałego podłoża. To przeciwciało anty-rdzeniowe wiąże antygen rdzeniowy wychwycony przez przeciwciała anty-rdzeniowe na stałym podłożu.
Dodawany jest także antygen reagujący z wychwyconym z próbki biologicznej przeciwciałem HCV, który wychwycił próbkę przeciwciała HCV, reaguje z epitopem NS3/4a.
Bardziej pożądanym antygenem jest epitop pochodzący z regionu NS3 poliproteiny HCV. Antygen ten wiąże wychwycone z próbki przeciwciało HCV. Wiele antygenów obejmujących takie epitopy jest znanych, obejmując ale nie ograniczając do antygenów pochodzących z regionów c33c i c100 jak również proteiny fuzyjne zawierające epitop NS3, takie jak c25. Te i inne epitopy NS3 są użyteczne w niniejszych testach i są znane w stanie techniki jak opisano w np., Houghton i wsp., patent St.Zjedn.Am. nr 5,350,671; Chien i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien i wsp., J.Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien i wsp. Publikacja Międzynarodowa nr WO 93/00365; Chien, D.Y., Publikacja Międzynarodowa nr WO 94/01778; i zaakceptowane zgłoszenia patentowe St.Zjedn.Am. nr 08/403,590 i 08/444,818 należące do zgłaszającego.
PL 213 363 B1
Dodawane jest drugie znakowane przeciwciało skierowane przeciwko opisanemu powyżej antygenowi. To przeciwciało może być skierowane przeciwko każdemu epitopowi zawartemu w antygenie. Na przykład przeciwciało może być skierowane przeciwko regionowi NS3 obecnemu w antygenie. Alternatywnie, jeśli ten powyższy antygen jest wyrażany jako proteina fuzyjna drugie znakowane przeciwciało może być skierowane przeciwko fuzyjnemu partnerowi. Dodatkowe antygeny i przeciwciała mogą być dodawane do testu, szczególnie jeśli podłoże stałe zawiera MEFA. Te formaty testów są objaśniane dalej, poniżej.
Reprezentatywny test według wynalazku jest przedstawiony na Figurze 2. Jak pokazano na tej Figurze to stałe podłoże zawiera dwa anty-rdzeniowe przeciwciała monoklonalne, nazwane c11-3 i c11-7. Te przeciwciała są skierowane przeciwko epitopowi znajdowanemu w regionie N-końcowym proteiny rdzeniowej przy aminokwasach 10-53 numerowanych względem sekwencji poliproteinowej HCV-1. Stałe podłoże również zawiera epitop NS3/4a. Próba biologiczna jest dodana do stałego podłoża. Antygen rdzeniowy HCV, jak również przeciwciała skierowane przeciwko epitopowi NS3/4a, oba obecne w tej próbie będą wiązały wychwycone na stałym podłożu reagenty.
Następnie, dodaje się anty-rdzeniowe przeciwciało monoklonalne c11-14 znakowane peroksydazą chrzanową (HRP) skierowane przeciwko regionowi C-końcowemu rdzenia znalezionemu przy pozycjach aminokwasowych 120-130 numerowanych względem sekwencji poliproteiny HCV-1. Jeżeli drugie przeciwciało jest znakowane HRP, skierowane przeciwko części SOD fuzyjnej proteiny to wtedy dodawane jest fuzyjne białko zawierające sekwencję z ludzkiego SOD (hSOD) i epitop z regionu c33c. Fuzja SOD-c33c będzie wiązała się do przeciwciała anty-NS3 i przeciwciało anty-SOD będzie z kolei wiązało się z proteiną fuzyjną SOD-c33c. Wykrycie znacznika wskazuje obecność infekcji HCV.
Na Figurze 8 został przedstawiony inny reprezentatywny test według wynalazku. Układ przeciwciał w teście jest wychwytującym testem kanapkowym antygen-przeciwciało-antygen, wykorzystującym zarówno NS3/4a MEFA 12. Stałe podłoże zawiera dwa anty-rdzeniowe monoklonalne przeciwciała opisane powyżej, epitop NS3/4a, a także jako reprezentatywne MEFA, MEFA 12, zawierające skróconą wersję ludzkiego SOD. Tak jak w powyższym teście, biologiczną próbkę dodaje się do stałego podłoża. Antygen rdzeniowy HCV jak również przeciwciała skierowane przeciwko epitopowi NS3/4a i epitopom MEFA, obecnym w próbce, będą wiązać wychwycone na stałym podłożu reagenty. Dodawane są dwa antygeny, jeden reagujący z próbką przeciwciał NS3/4a (jak opisano powyżej) i drugi antygen reagujący z próbką przeciwciał wiążącą się z MEFA. Na Figurze 8, antygen reagujący z kompleksem MEFA 12/próbka przeciwciała jest złączony fuzyjnie pomiędzy cząsteczką SOD a c22ksA47-L44W. Antygen c22ks jest z regionu rdzeniowego i zawiera aminokwasy Lys10 do Ser99 tej poliproteiny, jak również zwykle obecną delecję Arg47 i podstawienie 44 Leu na Trp w pozycji. Koniugatem wykrywającym przeciwciało jest, opisane powyżej, drugie monoklonalne przeciwciało anty-SOD znakowane HRP.
Powyżej opisane testy łączone antygen/przeciwciało są szczególnie korzystne ponieważ wykrywane mogą być zarówno antygen rdzeniowy HCV jak i przeciwciała dla NS3/4a i/lub rdzenia, przez to samo podłoże w tym samym teście. Ponadto, jak opisano powyżej, dodatkowe epitopy HCV takie jak SOD połączony fuzyjnie do antygenów c100, 5-1-1, NS5 jak również proteina wynikająca z przesunięcia ramki w regionie rdzeniowym tej poliproteiny, taka jak opisano w Międzynarodowej Publikacji nr WO 99/63941, mogą być używane w łączonym koktajlu w celu pokrycia innych nie-strukturalnych epitopów HCV.
W celu lepszego zrozumienia wynalazku poniżej przedstawia się bardziej szczegółową dyskusję odnośnie wytwarzania przeciwciał do stosowania w niniejszych immunotestach; wytwarzania polipeptydów do stosowania w tych immunotestach; i sposobów przeprowadzania tych immunotestów.
Wytwarzanie przeciwciał do stosowania w immunotestach HCV
Jak wyjaśniono powyżej, testy te wykorzystują różne przeciwciała, które są związane do stałego podłoża (np. jeden lub więcej przeciwciał anty-rdzeniowych) i które wykrywają kompleksy antygen/przeciwciało utworzone gdy w próbce jest obecna infekcja HCV. Przeciwciała te mogą być preparatami przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych, antysurowicami monospecyficznymi, przeciwciałami ludzkimi, lub mogą być hybrydowymi lub himerycznymi przeciwciałami, takimi jak humanizowane przeciwciała, zmienione przeciwciała, fragmentami F(ab')2, fragmentami F(ab), fragmentami Fv, przeciwciałami jedno-domenowymi, dimerycznymi lub trimerycznymi konstruktami fragmentów przeciwciał, miniprzeciwciałami lub ich fragmentami funkcjonalnymi, które wiążą się z antygenem będącym przedmiotem badania.
PL 213 363 B1
Przeciwciała są wytwarzane stosując techniki dobrze znane fachowcom w stanie techniki i ujawnionymi w np. patentach St.Zjedn.Ameryki nr 4,011,308; 4,722,890; 4,016,043; 3,876,504; 3,770,380 i 4,372,745. Na przykład, przeciwciała poliklonalne są generowane przez immunizowanie odpowiedniego zwierzęcia takiego jak mysz, szczur, królik, owca lub koza, danym antygenem. W celu wzmocnienia immunogeniczności, antygen ten może być związany z nośnikiem przed immunizacją. Nośniki takie są dobrze znane zwykłym fachowcom w tej dziedzinie. Immunizację ogólnie prowadzi się przez mieszanie lub emulgowanie antygenów w ślinie, korzystnie w adjuwancie takim jak kompletny adjuwant Freunda, i wstrzyknięcie tej mieszaniny lub emulsji poza jelitowo (ogólnie podskórnie lub śródmięśniowo). 2-6 tygodni później zwierzęciu podaje się ogólnie dawkę przypominającą jedną lub dwiema iniekcjami w ślinie, korzystnie stosując niekompletny adjuwant Freunda. Przeciwciała mogą także być generowane przez immunizację in vitro stosując sposoby znane w stanie techniki. Następnie od immunizowanych zwierząt uzyskuje się poliklonalną antysurowicę. Opis wytwarzania poliklonalnych przeciwciał anty-HCV, patrz, np. Houghton i wsp., patent St.Zjedn.Am. nr 5,350,671.
Monoklonalne przeciwciała są zwykle wytwarzane stosując metodę Kohler i Milstein (1975) Nature 256:495-497, lub jej modyfikację. Typowo, mysz lub szczura typowo immunizuje się tak jak opisano powyżej. Jednak w celu ekstrakcji osocza raczej niż skrwawianie zwierząt pobiera się śledzionę (i ewentualnie kilka dużych węzłów chłonnych) i dysocjuje się na pojedyncze komórki. Jeżeli jest to pożądane, komórki śledziony mogą być zliczane (po usunięciu niespecyficznych komórek przylegających) przez nakładanie zawiesiny komórek na płytkę lub studzienkę pokrytą antygenem. Komórki B, wyrażające związaną z błoną immunoglobulinę specyficzną dla tego antygenu wiążą się do płytki i nie są wymywane resztą zawiesiny. Otrzymywane komórki B, lub wszystkie zdysocjowane komórki śledziony są następnie pobudzane do fuzji z komórkami szpiczaka do utworzenia hybrydom i są hodowane na pożywce selektywnej (jak np. hypoksantyna, aminopteryna, pożywka tymidynowa, „HAT”). Uzyskane hybrydomy są nakładane przez malejące rozcieńczenia i są testowane pod względem wytwarzania przeciwciał, które wiążą się specyficznie do tego antygenu immunizującego (i które nie wiążą się z antygenami niespokrewnionymi). Wyselekcjonowane hybrydomy wydzielające monoklonalne przeciwciała są następnie hodowane zarówno in vitro (np. w słojach do hodowli tkankowych lub reaktorach wydrążonych włóknowych), lub in vivo (np. jako wodobrzusze u myszy).
Wytwarzanie różnych monoklonalnych przeciwciał anty-HCV było opisywane w np., Houghton i wsp., patent St.Zjedn.Ameryki nr 5,350,671; Chien i wsp. Publikacja Międzynarodowa nr WO 93/00365; i zaakceptowanych zgłoszeniach patentowych St.Zjedn.Ameryki nr 08/403,590 i 08/444,818 i Kashiwakuma i wsp., patent St.Zjedn.Ameryki nr 5,871,904, należących do zgłaszającego.
Jak wyjaśniono powyżej, fragmenty przeciwciała, które zachowują zdolność rozpoznania interesującego antygenu, będą również znajdowały zastosowanie w przedmiotowych immunotestach. Wiele fragmentów znanych w stanie techniki przeciwciał zawiera miejsca wiążące antygen zdolny do przejawiania immunologicznych właściwości wiązania nienaruszonej cząsteczki przeciwciała. Na przykład, funkcjonalne fragmenty przeciwciała mogą być wytwarzane przez odłączanie regionu stałego, nieodpowiedzialnego za wiązanie antygenu, od cząsteczki przeciwciała, stosując np. pepsynę do wytwarzania fragmentów fragmenty F(ab')2. Fragmenty te będą zawierały dwa miejsca wiążące antygen, lecz bez części regionu stałego w każdym ciężkim łańcuchu. Podobnie jeśli jest to pożądane, mogą być wytwarzane fragmenty Fab, zawierające pojedyncze miejsce wiążące antygen, np. przez trawienie papainą poliklonalnych lub monoklonalnych przeciwciał. Mogą także być wytwarzane funkcjonalne fragmenty, zawierające tylko zmienne regiony łańcuchów ciężkiego lub lekkiego, stosując standardowe techniki, takie jak rekombinacyjna produkcja lub preferencyjne proteolityczne rozszczepienie cząsteczek immunoglobuliny. Fragmenty te są znane jako Fv. Patrz, np., Inbar i wsp. (1972) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69:2659-2662; Hochman i wsp. (1976) Biochem 15:2706-2710; i Ehrlich i wsp. (1980) Biochem 19:4091-4096.
Pojedynczo łańcuchowy polipeptyd Fv („sFv” lub „scFv”) jest kowalencyjnie związanym heterodimerem VH-VL, który jest wyrażany przez fuzję genową genów kodujących VH i VL połączonych łącznikiem kodującym peptyd. Huston i wsp. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:5879-5883. Opisano wiele sposobów rozróżniania i rozwijania chemicznej budowy (łączniki) dla przekształcenia naturalnie zagregowanych lecz chemicznie rozdzielonych lekkich i ciężkich łańcuchów polipeptydów z regionu V przeciwciała w cząsteczkę sFv, która zostanie pofałdowana w postaci trójwymiarowej struktury znacząco podobnej do struktury miejsca wiążącego antygen. Patrz, np., patenty St.Zjedn.Ameryki nr 5,091,513, 5,132,405 i 4,946,778. Cząsteczki sFv mogą być wytwarzane stosując sposoby opisane w stanie techniki. Patrz, np. Huston i wsp., (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; patenty
PL 213 363 B1
St.Zjedn.Ameryki 5,091,513, 5,132,405 i 4,946,778. Kryteria projektowania obejmują oznaczanie odpowiedniej długości do łączenia odległości pomiędzy zakończeniami C jednego łańcucha i zakończeniami N innego, przy czym linker ten jest ogólnie tworzony z małych hydrofilowych reszt aminokwasowych, które nie mają tendencji do zwijania się ani tworzenia struktur drugorzędowych. Takie sposoby opisane były w stanie techniki. Patrz, np. patenty St.Zjedn.Ameryki nr 5,091,513, 5,132,405 i 4,946,778. Odpowiednie linkery generalnie zawierają polipeptydowe łańcuchy naprzemiennych zestawów reszt glicyny i seryny, i mogą zawierać reszty kwasu glutaminowego i lizyny wstawione w celu zwiększenia rozpuszczalności.
„Mini-przeciwciała” lub „miniciała” znajdą również zastosowanie w niniejszym wynalazku. Miniciała są łańcuchami polipeptydowymi sFv, które obejmują domeny oligomeryzacji przy ich zakończeniach C oddzielone od sFv regionem zawiasowym. Pack i wsp. (1992) Biochem 31:1579-1584. Ta domena oligomeryzacji zawiera samo-asjocjujące się α-helisy, np. zamek leucynowy, które mogą być następnie stabilizowane przez dodatkowe mostki dwusiarczkowe. Ta domena oligomeryzacji jest wyznaczona aby była zgodna z wektorowym fałdowaniem się poprzez błonę, który to proces wydaje się ułatwiać fałdowanie in vivo tego polipeptydu w funkcjonalnej wiążącej proteinie. Generalnie, miniprzeciwciała są wytwarzane stosując metody rekombinacji dobrze znane w stanie techniki. Patrz, np., Pack i wsp. (1992) Biochem 31:1579-1584; Cumber i wsp. (1992) J Immunology 149B:120-126.
Wytwarzanie przeciwciał do stosowania w immunotestach HCV
Jak wyjaśniono powyżej, cząsteczki według wynalazku są zwykle wytwarzane rekombinacyjnie. Zatem więc, polinukleotydy kodujące antygeny HCV do stosowania w niniejszym wynalazku mogą być wytwarzane stosując techniki standardowe biologii molekularnej. Na przykład, sekwencje polinukleotydowe kodujące powyżej opisane cząsteczki mogą być opisane stosując metody rekombinacyjne, takie jak skrining bibliotek cDNA i genomowych z komórek wyrażających ten gen lub przez uzyskiwanie tego genu z wektora o którym wiadomo, że zawiera ten gen. Ponadto pożądany gen może być izolowany bezpośrednio z wirusowych cząsteczek kwasu nukleinowego, stosując techniki opisane w stanie techniki, takie jak w Houghton i wsp., w patencie St.Zjedn.Ameryki nr 5,350,671. Gen będący przedmiotem zainteresowania może być także wytwarzany syntetycznie, raczej niż klonowany. Cząsteczki mogą być zaprojektowane z odpowiednimi kodonami do poszczególnych sekwencji. Kompletna sekwencja jest następnie grupowana z zazębiających się oligonukleotydów wytwarzanych standardowymi metodami i grupowana w kompletną sekwencję kodującą. Patrz, np., Edge (1981) Nature 292:756; Nambair i wsp. (1984) Science 223:1299; i Jay i wsp. (1984) J. Biol. Chem. 259:6311.
Tak więc, poszczególne sekwencje nukleotydowe mogą być otrzymywane z wektorów niosących pożądane sekwencje lub syntetyzowane całkowicie albo w części stosując różne techniki syntezy oligonukleotydu znane w stanie techniki, jak ukierunkowana mutageneza i reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR). Patrz, np., Sambrook, supra. Zwłaszcza, jedną z metod otrzymywania sekwencji nukleotydowej kodującej pożądaną sekwencję jest topienie komplementarnych zestawów zazębiających się syntetycznych olinukleotydów wytwarzanych w konwencjonalnych zautomatyzowanych syntetyzatorach polinukleotydów, a następnie ligacja odpowiednią ligazą DNA i amplifikacja zligowanych sekwencji nukleotydu przez PVR. Patrz, np., Jayaraman i wsp. (1991) Proc. Natl. Sci. USA 88:4084-4088. Ponadto, kierowane oligonukleotydem syntezy (Jones i wsp. (1986) Nature 54:75:82), mutagenezy poprzednio istniejących regionów nukleotydowych kierowane oligonukleotydem (Riechmann i wsp. (1988) Nature 332:323-327 i Verhoeyen i wsp. (1988) Science 239:1534-1536) mogą być stosowane według wynalazku, oraz enzymatyczne wypełnianie przerw oligonukleotydowych stosując polimerazę T4DNA (Queen i wsp. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033) w celu dostarczenia cząsteczek posiadających zmienione lub zwiększone możliwości wiązania antygenu i/lub zredukowaną immunogeniczność.
Jeżeli sekwencje kodujące zostały już sporządzone lub wyizolowane, takie sekwencje mogą być klonowane do każdego odpowiedniego wektora lub replikonu. Liczne wektory klonujące są znane fachowcom w tej dziedzinie i selekcja odpowiedniego wektora klonującego jest sprawą wyboru. Odpowiednie wektory zawierają lecz nie są ograniczone do plazmidów, fagów, transpozonów, kosmidów, chromosomów lub wirusów, które jeśli związane są z odpowiednim elementem kontrolnym są zdolne do replikacji.
Sekwencja kodująca jest następnie umieszczana pod kontrolą odpowiednich elementów kontrolnych w zależności od układu jaki był stosowany do ekspresji. Zatem, sekwencja kodująca może być umieszczana pod kontrolą promotora, miejsca wiążącego rybosomu (dla ekspresji bakteryjnych)
PL 213 363 B1 i ewentualnie operatora, tak aby sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania była transkrybowana w RNA przez odpowiedniego transformanta. Sekwencja kodująca może lub nie zawierać polipeptyd sygnałowy lub sekwencję liderową, które później mogą być usunięte przez gospodarza w post-translacyjnym przekształcaniu. Patrz, np., patenty St.Zjedn.Ameryki nr 4,431,739; 4,425,437; 4,338,397.
Oprócz sekwencji kontrolnych pożądanym może być dodanie sekwencji regulatorowych, które pozwolą na regulację ekspresji tych sekwencji w zależności do wzrostu komórki gospodarza. Sekwencje regulatorowe są znane fachowcom w tej dziedzinie, i przykłady obejmują te, które powodują ekspresję genu włączanego lub wyłączanego w odpowiedzi na chemiczne lub fizyczne bodźce, obejmujące obecność związku regulatorowego. W wektorze mogą być także obecne inne rodzaje elementów regulatorowych. Na przykład mogą być tutaj zastosowane, elementy wzmacniające w celu podwyższenia poziomów ekspresji tych konstruktów. Przykłady obejmują wczesny wzmacniacz genowy SV40 (Dijkema i wsp. (1985) EMBO J. 4:761), wzmacniacz/promotor pochodzący od długiego końcowego powtórzenia (LTR) wirusa Rous Sarcoma Virus (Gorman i wsp. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci USA 79:6777) i elementy pochodzące z ludzkiego CMV (Boshart i wsp. (1985) Cell 41:521) takie jak elementy zawarte w sekwencji CNV intronu A (Patent St.Zjedn.Ameryki nr 5,688,688). Kaseta ekspresji może ponadto zawierać miejsce ori replikacji dla replikacji autonomicznej w odpowiedniej komórce gospodarza, jeden lub więcej markerów nadających się do selekcji, jeden lub więcej miejsc restrykcji, silny promotor dla dużej ilości kopii.
Wektor ekspresji jest skonstruowany tak, że poszczególna sekwencja kodująca jest umieszczana w wektorze z odpowiednimi sekwencjami regulatorowymi, pozycjonowanie i orientacja tej sekwencji kodującej w odniesieniu do sekwencji kontrolnej jest takie, że sekwencja kodująca jest transkrybowana pod „kontrolą” sekwencji kontrolnej (to znaczy, polimeraza RNA, która się wiąże do cząsteczki DNA przy sekwencji kontrolnej transkrybuje sekwencję kodującą). Modyfikacja sekwencji kodującej cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania może być pożądana aby osiągnąć to zakończenie. Na przykład, w pewnych przypadkach może być konieczne zmodyfikowanie sekwencji tak aby mogła być dołączona do sekwencji kontrolnej w odpowiedniej orientacji; to znaczy w celu utrzymania ramki odczytu. Sekwencje kontrolne i inne sekwencje regulatorowe mogą być ligowane do sekwencji kodującej przed włączeniem do wektora. Alternatywnie, sekwencja kodująca może być klonowane bezpośrednio w wektorze ekspresji, który już zawiera sekwencję kontrolną i odpowiednie miejsce restrykcyjne.
Jak wyjaśniono powyżej, może to być również pożądane w celu wytworzenia mutantów lub analogów antygenu będącego przedmiotem zainteresowania. Jest to szczególnie istotne w odniesieniu do NS3/4a. Sposoby wykonania tego są opisane w np., Dasmahapatra i wsp., patent St.Zjedn.Ameryki nr 5,843,752 i Zhang i wsp., patent St.Zjedn.Ameryki nr 5,990,276. Mutanty lub analogii tej i innych protein HCV do stosowania w niniejszych testach mogą być wytwarzane przez delecję części sekwencji kodującej ten peptyd, przez wstawienie sekwencji, i/lub przez podstawienie jednego lub więcej nukleotydów wewnątrz tej sekwencji. Techniki modyfikowania sekwencji nukleotydowych, takie jak mutageneza ukierunkowana miejscowo i podobne są dobrze znane fachowcom w tej dziedzinie. Patrz, np., Sambrook i wsp., supra; Kunkel, T.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:448; Geisselsoder i wsp. (1987) Bio Techniques 5:786; Zoller i Smith (1983) Methods Enzymol. 100:468; Dalbie-McFarland i wsp. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci USA 79:6409.
Cząsteczki te mogą być wyrażane w szerokim zakresie układów obejmującym owadzie, ssacze, bakteryjne, wirusowe i drożdżowe układy ekspresji, wszystkie dobrze znane w stanie techniki.
Na przykład, układy ekspresji komórek owadzich, takie jak układy baculowirusów, są znane fachowcom w tej dziedzinie i opisane są np., w Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin nr 1555 (1987). Materiały i metody dla komórkowych układów ekspresji baculowirus/owad są dostępne handlowo w postaci zestawów, miedzy innymi, Invitrogen, San Diego CA („MaxBac” zastaw). Podobnie, bakteryjne i ssacze komórkowe układy ekspresji są dobrze znane w stanie techniki i opisane są np., w Sambrook i wsp., supra. Drożdżowe układy ekspresji są dobrze znane w stanie techniki i opisane w np., Yeast Genetic Engineering (Barr i wsp., eds., 1989) Butterworths, London.
Wiele odpowiednich komórek gospodarzy do stosowania w powyższych układach jest również znanych. Na przykład, ssacze linie komórkowe są znane w stanie techniki i obejmują unieśmiertelnione linie komórkowe dostępne z American Type Culture Collection (ATCC), takie jak, ale nieograniczone tylko do, takich jak, komórki jajnika chomika mongolskiego (CHO), komórki HeLa, komórki nerek noworodków chomika (BHK), komórki nerek małpy (COS), embrionalne komórki ludzkiej nerki, komórki ludzkiego raka wątrobowokomórkowego (np., Hep G2), komórki nerki bydlęcej Madin-Darby
PL 213 363 B1 („MDBK”) jak i inne. Podobnie, gospodarze bakteryjni, tacy jak E.coli, Bacillus subtilis, i Streptococcus spp., będą znajdowały zastosowanie w niniejszych konstruktach ekspresji. Drożdżowi gospodarze użyteczni w niniejszym wynalazku, obejmują między innymi Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Sehizosaccharomyces pombe i Yarrowia lipolytica. Komórki owadzie do zastosowania z wektorami ekspresji baculowirusa obejmują między innymi, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, i Trichoplusia ni.
Cząsteczki kwasu nukleinowego zawierające sekwencje nukleotydowe będące przedmiotem zainteresowania mogą być trwale integrowane do genomu komórek gospodarza lub podtrzymywane na stałym elemencie episomalnym w odpowiedniej komórce gospodarza stosując różne techniki dostarczania genu dobrze znane w stanie techniki. Patrz, np., patent St.Zjedn.Ameryki nr 5,399,346.
W zależności od układu ekspresji i danego gospodarza cząsteczki te są wytwarzane tak przez hodowanie transformowanych wektorem ekspresji komórek gospodarza, opisanym powyżej, w warunkach, w których proteina ta jest wyrażana. Wyrażana proteina jest następnie izolowana z komórek gospodarza i oczyszczana. Jeśli układ ekspresji wydziela tą proteinę do medium wzrostowego to produkt może być oczyszczany bezpośrednio z tego medium. Jeżeli nie jest ona wydzielana to można ją izolować z lizatu komórkowego. Wybór odpowiednich warunków hodowli i odzyskiwania jest w zakresie wiedzy fachowca w tej dziedzinie.
Rekombinancyjne wytwarzanie różnych antygenów HCV było opisane. Patrz, np., Houghton i wsp., w patencie St.Zjedn.Ameryki nr 5,350,671; Chien i wsp., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33 -39; Chien i wsp. Publikacja Międzynarodowa nr WO 93/00365; Chien, D.Y., Publikacja Międzynarodowa nr WO 94/01778.
Testy immunodiagnostyczne
Raz wyprodukowane powyższe przeciwciała anty-rdzeniowe i antygeny NS3/4a są umieszczane na odpowiednim stałym podłożu do stosowania w niniejszych immunotestach. Stałe podłoże dla celów niniejszego wynalazku, może być każdym materiałem który jest nierozpuszczalną matrycą i może posiadać sztywną lub prawie sztywną powierzchnię. Przykładowe stałe podłoża obejmuj, nie będąc jednak ograniczonymi, substraty takie jak nitroceluloza (np., w postaci błony lub studzienki do mikromiareczkowania); polichlorek winylu (np., arkusze lub studzienki do mikromiareczkowania); lateks polistyrenowy (np., kulki lub płytki do mikromiareczkowania); fluorek polifluorku winilidenu, papier diazowany; błony nylonowe; aktywowane wrażliwe magnetycznie kulki, i tym podobne. Poszczególne podłoża obejmują płytki, peletki, dyski, kapilary, włókna wydrążone, igły, kołki, stałe włókna, kulki celulozowe, kulki z porowatego szkła, żele krzemionkowe, kulki polistyrenowe ewentualnie sieciowane dwuwinylobenzenem, kulki szczepione ko-poli, kulki poliakrylamidowe, kulki lateksowe, kulki dwumetyloakrylamidowe ewentualnie usieciowane N-N'-bis-akryloiloentylenodiaminą i szklane cząstki otoczone polimerem hydrofobowym.
Jeśli to pożądane, cząsteczki, które są dodawane do stałego podłoża mogą być łatwo funkcjonalizowane w celu wytworzenia cząsteczek styrenowych lub akrylowych, umożliwiając w ten sposób włączenie tych cząsteczek do polistyrenu, poliakrylu i innych polimerów takich jak poliimid, poliakrylamid, polietylen, poliwinyl, polidiacetylen, polifenylen-winylen, polipeptyd, polisacharyd, polisulfon, polipyrol, poliimidazol, politiofen, polieter, epoksyd, szkło krzemionkowe, żel krzemionkowy, siloksan, polifosforan, hydrożel, agaroza, celuloza i tym podobne.
W jednym kontekście, stałe podłoże jest najpierw poddawane reakcji z przeciwciałami antyrdzeniowymi HCV i epitopem NS3/4a (wspólnie nazywanymi „składnikami stałej-fazy”), i ewentualnie jednym lub więcej MEFAs, w odpowiednich warunkach wiązania takich, że cząsteczki te są odpowiednio unieruchamiane do podłoża. Czasami, unieruchomienie do podłoża może być wzmacniane przez pierwsze sprzęganie antygenu i/lub przeciwciała z białkiem z lepszymi właściwościami wiązania fazy stałej. Odpowiednie białka sprzęgające obejmują lecz nie są ograniczone do makrocząsteczek takich jak albuminy osocza obejmujące albuminę osocza wołowego (BSA), hemocjaninę skałoczepu, cząsteczki immunoglobuliny, tyreoglobulinę, owaalbuminę i inne białka dobrze znanych fachowcom w tej dziedzinie. Inne odczynniki, które mogą być stosowane do wiązania cząsteczek do podłoża obejmują polisacharydy, kwasy polimlekowe, kwasy poliglikolowe, polimeryczne aminokwasy, kopolimery aminokwasowe, i tym podobne. Takie cząsteczki i sposoby sprzęgania tych cząsteczek do antygenów są dobrze znane zwykłym fachowcom w tej dziedzinie. Patrz, np., Brinkley, M.A. (1992)
PL 213 363 B1
Bioconjugate Chem. 3:2-13; Hashida i wsp. (1984) J. Appl. Biochem. 6:56-63; i Anjaneyulu i Staros (1987) International J. of Peptide and Protein Res. 30:117-124.
Po przeredagowaniu stałego podłoża ze składnikami fazy stałej, wszystkie nie unieruchomione składniki fazy stałej są usuwane z podłoża przez wymywanie, a następnie składniki związane z podłożem są kontaktowane z próbką biologiczną podejrzewaną o zawieranie przeciwciał i antygenów HCV (wspólnie nazywanych „cząsteczkami ligandowymi”) w odpowiednich warunkach wiążących. Po przemyciu dla usunięcia jakichkolwiek nie związanych cząsteczek liganda, drugie anty-rdzeniowe przeciwciało skierowane przeciwko innemu epitopowi niż przeciwciało antyrdzeniowe związane z podłożem, jest dodawane w odpowiednich warunkach wiązania. Dodane anty- rdzeniowe przeciwciało zawiera wykrywalny znacznik, jak opisano powyżej, i działa wiążąc każdy antygen rdzeniowy, który może być obecny w próbce, który przereagował z związanym do podłoża przeciwciałem antyrdzeniowym. Również są dodawane jeden lub więcej antygenów mogących reagować z przeciwciałami obecnymi w próbce, które ma z kolei reagować z epitopem NS3/4a. Jak wyjaśniono powyżej, antygen jest zwykle otrzymywany z regionu NS3 poliproteiny HCV, a zwłaszcza z regionu c33c HCV. Dla opisu tych regionów i otrzymanych z nich epitopów patrz, np., Houghton i wsp., patent St.Zjedn.Ameryki nr 5,350,671; Chien i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci (1989) 89:10011-10015; Publikacja Międzynarodowa nr WO 93/00365; i zaakceptowane będące własnością zgłaszającego zgłoszenia patentowe St.Zjedn.Ameryki nr 08/403,590 i 08/444,818. Dodawane jest także znakowane przeciwciało skierowane przeciwko temu antygenowi. Dlatego przeciwciało to będzie wiązało antygen, który przereagował z przeciwciałami anty-NS3 obecnymi w próbce. W tym celu, epitop c33c może być wygodnie dostarczany jako fuzja pomiędzy c33c i ludzką dysmutazą ponadtlenkową (h SOD) , wytwarzaną rekombinacyjnie np., sposobem opisanym w Houghton i wsp. patent St.Zjedn.Ameryki nr 5,350,671. Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe ludzkiej SOD są znane i opisane w Hallewell i wsp., Patent St.Zjedn.Ameryki nr 5,710,033. W celu detekcji obecności kompleksu utworzonego pomiędzy epitopem NS3/4a każdym przeciwciałem w próbce, które reaguje z tym epitopem a polipeptydami HCV, które z kolei wiążą przeciwciało w tej próbce może dlatego być stosowane znakowane przeciwciało skierowane przeciwko ludzkiej SOD.
Jeśli MEFA jest obecna na stałym podłożu, do testu można także dodawać jeden lub więcej dodatkowych antygenów reagujących z przeciwciałami z próbki biologicznej, które są związane do antygenów obecnych na MEFA. Szczególnie użytecznym w tym kontekście jest antygen pochodzący z regionu rdzeniowego HCV a zwłaszcza z antygenu c22, który zawiera 119 N-końcowych aminokwasów rdzeniowych poliproteiny HCV. Jednym szczególnym antygenem pochodzącym z c22 jest c22ksA47-L44W, który zawiera aminokwasy Lys10 do Ser99 poliproteiny, jak również delecję normalnie obecnej Arg47 i podstawienie Leu na Trp w pozycji 44. Tak jak epitop c33c opisany powyżej, antygen ten może być dostarczany jako fuzja z hSOD i to samo oznakowane przeciwciało skierowane przeciwko ludzkiej SOD może być używane w celu wykrywania obecności kompleksów utworzonych pomiędzy przeciwciałami obecnymi w próbce a epitopem NS3/4a i/lub MEFA, które to kompleksy związane są z antygenami HCV (np., c33c i c22).
Bardziej szczegółowo, może być stosowana metoda ELISA, przy czym studzienki płytek do mikromiareczkowania są pokryte składnikami-fazy stałej. Próbka biologiczna zawierająca lub podejrzana o zawieranie cząsteczek ligandu jest następnie dodawana do powleczonych studzienek. Po okresie inkubacji wystarczającym do związania cząsteczki ligandu do unieruchomionego składnika stałej fazy, płytka(ki) mogą być przemywane w celu usunięcia niezwiązanych cząstek i wykrywalna znakowana wiążąca cząsteczka drugiego rzędu (znakowane przeciwciało anty-rdzeniowe), cząsteczka zawierająca epitop NS3, i przeciwciało skierowane przeciwko cząsteczce zawierającej epitop NS3 są dodawane. Cząsteczką tym pozwala się na reakcję z każdym wychwyconym antygenem próbki i przeciwciałem, płytki przemywa się i wykrywa się obecność znakowanych przeciwciał stosując metody dobrze znane w stanie techniki. Powyżej opisane odczynniki testu obejmujące stałe podłoże immunotestu ze związanymi przeciwciałami i antygenami jak również z przeciwciałami i antygenami reagującymi z wychwyconą próbką mogą być dostarczane w zestawach z odpowiednią instrukcją i innymi koniecznymi odczynnikami w celu przeprowadzenia opisanego powyżej immunotestu. Zestaw może zawierać także, w zależności od zastosowanego immunotestu, odpowiednie znaczniki i inne opakowane reagenty i materiały (tak jak bufory myjące i tym podobne). Standardowe immunotesty takie jak te opisane powyżej mogą być przeprowadzone stosując te zestawy.
PL 213 363 B1
III. Część doświadczalna
Poniżej są przedstawione przykłady specyficznych realizacji niniejszego wynalazku. Przykłady te są zaproponowane jedynie w celu ilustratywnym i nie jest ich intencją ograniczenie zakresu niniejszego wynalazku. Dokonano wysiłków w celu zapewnienia dokładności w odniesieniu do zastosowanych liczb (np., ilości, temperatury itd.), lecz oczywiście pewne doświadczalne błędy i odchylenia powinny być dopuszczone.
P r z y k ł a d 1
Immunotest łączony antygen HCV/przeciwciało
Niniejszy łączony test antygen HCV/przeciwciało porównywano do następujących innych testów HCV w celu sprawdzenia limitów wykrywania serokonwersji i porównania tych limitów do otrzymanych w innych handlowo dostępnych testach.
A. Materiał i metody
Próbki krwi: Stosowano panele próbek handlowo dostępnej ludzkiej krwi. Panele takie są dostępne z np., Boston Biomedica, Inc. West Bridgewater, MA (BBI); Bioclinical Partners, Franklin, MA (BCP); i North American Biologics, Inc. BocoRatan, FL (NABI). Dni wskazane w Tabelach 5 i 6 są dniami, w których pobierano od osobników krew.
Przeciwciała monoklonalne: Przeciwciała monoklonalne c11-3, c11-7 i c11-14 były otrzymywane z Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey. Przeciwciała c11-3 i c11-7 są skierowane przeciwko N-końcowej części rdzenia (aminokwasy 10-53, ponumerowane względem poliproteiny HCV-1). Monoklonalne przeciwciało c11-14 jest skierowane przeciwko C-końcowej części rdzenia (aminokwasy 120-130 ponumerowane względem poliproteiny HCV-1). Przeciwciało c11-14 było koniugowane z peroksydazą chrzanową (HRP) stosując procedury standardowe.
Monoklonalne przeciwciało 5A-3 jest przeciwciałem anty-SOD skierowanym przeciwko aminokwasom 1 do 65 i SOD i było wytworzone stosując procedury standardowe. Przeciwciało to było koniugowane z HRP, jak opisano powyżej.
B. Antygeny: Antygen c33c (266 aminokwasów, aminokwasy 1192 do 1457 poliproteiny HCV-1) były wyrażane w E.coli jako wewnętrzny polipeptyd fuzyjny SOD sposobami opisanymi dla syntezy antygenu 5-1-1 (Choo, i wsp., Science (1989) 244:359-362). Rekombinowany antygen był oczyszczany jak opisano w Chien, i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci (1989) 89:10011-10015. Patrz, także Houghton i wsp., patent St.Zjedn.Ameryki nr 5,350,671, do wytwarzania protokołów dla SOD-c33c.
Epitop NS3/4a stosowany w tym teście jest konformacyjnym epitopem posiadającym sekwencję wymienioną na Figurze 3.
C. Formaty immunotestu:
Test Abbott PRISM (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), jest handlowo dostępny i jest testem wykrywania opartym o przeciwciało. Test był przeprowadzany stosując instrukcje producenta.
Układ testowy ORTHO HCV wersja 3 ELISA Test System (nazywany tutaj testem Ortho 3.0 Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) jest opartym o przeciwciało testem wykrywania. Test był przeprowadzany stosując instrukcje producenta.
Test Roche Amplicor (Roche, Pleasant, CA) jest dostępnym handlowo opartym o PCR testem. Test był przeprowadzany stosując instrukcje producenta.
Test Gen-Probe TMA (San Diego, CA) jest dostępnym handlowo testem amplifikacji związanym z transkrypcją. Test był przeprowadzany stosując instrukcje producenta.
Test antygenowy Ortho (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) jest testem wykrywania opartym o antygen. Test był przeprowadzany stosując instrukcje producenta.
Przedmiotowy łączony immunotest antygenHCV/przeciwciało był przeprowadzany w sposób następujący. 4 mg/ml każdego z oczyszczonych monoklonalnych przeciwciał C11-7 i C11-3 w 1x buforowanej fosforanem soli (PBS, pH 7,4) były łączone i dobrze mieszane. Do tego samego buforu powlekającego dodawano 90 ng rekombinantowego antygenu NS3/4a. Roztwór był mieszany przez 30 minut przed nałożeniem. 200 ml powyższego roztworu dodawano na studzienkę do 96-studzienkowych płytek do mikromiareczkowania Constar wiążących podłoże (Corning, Inc.). Płytki były inkubowane w 15-30°C przez 16-24 godziny. Płytki były przemywane dwukrotnie dH2O, a następnie 300 μl/studzienkę buforem postpowleczeniowym (1% albuminy surowicy wołowej (BSA), 1x PBS) przez 1 godzinę i 300 μl/studzienkę buforem stabilizującym (1x PBS, 1% BSA, mannitol, glikol polietylenowy (PEG), żelatyna) przez 1 godzinę. Płytki aspirowano i suszono w 4°C w Iiofilizatorze przez 24 godziny. Płytki były zamykane w woreczkach z środkiem suszącym.
PL 213 363 B1
W celu przeprowadzenia łączonego immunotestu antygen/przeciwciało do płytek dodawano
100 μ! wzmocnionego buforu do Iizy (1% N-Iaurylosarkozyna, 0,65 M NaCl, 50 mg/ml technicznie czystej mysiej lgG (Sigma, St. Louis, MO), 1% BSA modyfikowanej sulfhydrylowo (Bayer), 0,1% kazeina). Następnie dodawano 100 ml próbki. Była ona inkubowana na wytrząsarce w 40°C przez jedną godzinę. Płytki były przemywane sześciokrotnie 1x PBS, 0,1% Tween 20 na Ortho Plate Washer. 200 ml roztworu koniugatu (rozcieńczenie 1:75 c11-14-HRP z 250 ng/test antygenu SOD-c33c plus 1:5000 rozcieńczonego anty-SOD-HRP w rozpuszczonej próbce HCV 3.0 (z ORTHO HCV wersja 3.0 ELlSA Test System, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) bez ekstraktu SOD, wszystkie przygotowywano 30 minut przed dodaniem). Roztwór inkubowano 45 minut z wytrząsaniem w temperaturze 40°C. Był on przemywany sześć razy, jak wyżej i dodawano 200 ml roztworu substratu (1 OPD tabletka/10 ml). Tabletka OPD zawiera dwuhydrochlorek o-fenylenodwuaminy i nadtlenek wodoru dla rozwinięcia koloru reakcji pyroksydazy chrzanowej i jest dostępna z Sigma, St. Louis, MO. Była ona inkubowana przez 30 minut w 15-30°C w ciemności. Reakcję zatrzymywano przez dodanie 50 ml 4N H2SO4 i płytki odczytywano przy 492 nm, względem absorbancji przy 690 nm jako kontroli.
D. Wyniki:
Wyniki różnych testów są pokazane w Tabelach 5 i 6, które przedstawiają dwa odrębnie wykonane doświadczenia na próbkach krwi poddanych infekcji HCV tak jak wskazano. Zacienione pola wskazują wykrycie wirusa. Jak pokazano poniżej, łączone testy Chirona antygen/przeciwciało wykryły serokonwersję we wszystkich próbkach, podczas gdy wszystkie inne testy oparte o przeciwciało i antygen nie powiodły się w przynajmniej jednej próbce jeśli chodzi o detekcję serokonwersji. Zwłaszcza testy oparte o przeciwciało nigdy nie wykryły serokonwersji do co najmniej 18 dnia (Tabela 5). Tabela 6 pokazuje, że żaden z testów opartych o przeciwciało nie wykrył obecności infekcji HCV do 22 dnia. Ponadto, Test ORTHO oparty o antygen nie powiódł się jeśli chodzi o detekcję serokonwersji do 85 dnia.
Dlatego zatem, w oparciu o powyższe wyniki jest jasnym, że nowy łączony test przeciwciało/antygen zmniejsza ilość uzyskanych fałszywych negatywnych wyników w konwencjonalnych opartych o antygen i przeciwciało testach.
T a b e l a 5 HCV
Dni | Abbott PRISM | Ortho 3,0 | Roche Amplicor | Gen-Probe TMA | Ortho Ag | Chiron Ag/Ab |
0 | 0,1 | 0,0 | >5 x 105 | 9,25 | 18,6 | 2,8 |
4 | 0,1 | 0,0 | >5 x 105 | 9,29 | 19,0 | 3,1 |
7 | 0,1 | 0,0 | >5 x 105 | 9,52 | 22,3 | 1,5 |
13 | 0,3 | 0,1 | >5 x 105 | 9,59 | 26,2 | 1,7 |
18 | 1,3 | 0,4 | >5 x 105 | 9,70 | 15,9 | 1,2 |
21 | 2,2 | 1,0 | >5 x 105 | 9,39 | 11,3 | 1,5 |
164 | 4,2 | 4,4 | 4 x 104 | 9,28 | 0,11 | 2,5 |
T a b e l a 6 Serokonwersja HCV
Dni | Abbott PRISM | Ortho | Roche Amplicor | Gen-Probe TMA | Ortho Ag | Chiron Ag/Ab |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
0 | 0,1 | 0,0 | BLD | 0,11 | 0,5 | |
13 | 0,1 | 0,0 | >5 x 105 | 44,0 | 3,0 | |
20 | 0,1 | 0,0 | >5 x 105 | 24,2 | 1,3 | |
22 | 0,3 | 0,0 | >5 x 105 | 29,2 | 1,6 | |
85 | 5,4 | 4,7 | BQR | 0,06 | 1,1 |
PL 213 363 B1 ciąg dalszy Tabeli 6
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
131 | 4,3 | 4,7 | BQR | 0,09 | 1,2 | |
135 | 4,6 | 4,7 | 3 x 103 | 0,09 | 1,2 | |
138 | 5,5 | 4,7 | BLD | 0,08 | 1,2 | |
146 | 5,9 | 4,7 | BLD | 0,11 | 2,1 | |
152 | 5,2 | 4,7 | BQR | 0,07 | 1,8 |
P r z y k ł a d 2
Wytwarzanie epitopu konformacyjnego NS3/4a z podstawieniami Thr na Pro i Ser na Ile
Konformacyjny epitop NS3/4a był otrzymywany następująco. Epitop ten posiada sekwencję wymienioną na Figurach 4A do 4D i różni się od sekwencji natywnej przy pozycji 403 (aminokwas 1428 w sekwencji pełnej długości HCV-1) i 404 (aminokwas 1429 w sekwencji pełnej długości HCV-1). Występująca normalnie w pozycji 1248 sekwencji natywnej Thr była mutowana do Pro a Ser, które występuje w pozycji 1429 natywnej sekwencji była mutowana na Ile.
Zwłaszcza stosowanym, drożdżowym wektorem ekspresji był pBS24.1, jak opisano powyżej. Plazmid pd.hcvla.ns3ns4aPI, który kodował reprezentatywny epitop NS3/4a stosowany w przedmiotowych immunotestach był wytwarzany następująco. Używano procedurę dwuetapową. Najpierw, ligowano do siebie następujące dwa kawałki DNA: (a) oligonukleotydy syntetyczne które mogłyby dostarczać miejsce klonujące 5'HindIII, a po nim sekwencję ACAAAACAAA, inicjator ATG i kodony dla HCV1a, rozpoczynające się od aminokwasu 1027 i z kontynuacją do miejsca BglI przy aminokwasie 1046; b) fragment restrykcyjny bp BglI-ClaI o 683 bp (kodujący aminokwasy 1046-1274) pAcHLTns3ns4aPI; i c) wektor pSP72 (Promega, Madison, WI, GenBank/EMBL Numer Dostępu X65332), który był trawiony za pomocą HindIII i ClaI, defosforylowany i oczyszczony na żelu. Plazmid pAcHLTns3ns4aPI był otrzymywany z pAcHLT, handlowo dostępny bakulowirusowy wektor ekspresji z BD Pharmingen (San Diego, CA). Wytwarzano zwłaszcza wektor pAcHLT EcoRI-PstI jak również następujące fragmenty: EcoRI-AlwnI, 935 bp, odpowiadający aminokwasom 1027-1336 genomu HCV-1; AlwnI-SacII, 247 bp, odpowiadający aminokwasom 1336-1419 genomu HCV-1; HinfI-BglI, 175 bp, odpowiadający aminokwasom 1449-1509 genomu HCV-1; BglI-PstI, 619 bp, odpowiadający aminokwasom 1510-1711 genomu HCV-1, plus kodon zakończenia transkrypcji. Syntetycznie generowany fragment SacII-HinfI o 91 bp odpowiadający aminokwasom 1420-1448 genomu HCV-1 i zawierający mutację PI (Thr-1428 zmutowana na Pro, Ser-1429 zmutowana na Ile), był ligowany do 175 bp fragmentu HinfI-BglI i 619 bp fragmentu BglI-PstI opisanych powyżej i subklonowany w pGEM-5Zf(+) wektorze trawionym za pomocą SacII i PstI. pGEM-5Zf(+) jest dostępnym handlowo wektorem E.coli (Promega Madison, WI, GenBank/EMBL Numer Dostępu X65308). Po transformacji kompetentnych komórek HB101, miniskriningowej analizie indywidualnych klonów i weryfikacji sekwencji fragment 885 bp SacII-PstI z klonu 2 pGEM5.PI był oczyszczany na żelu. Fragment ten był ligowany do 935 bp fragmentu EcoRI-AlwnI, 247 bp fragmentu AlwnI-SacII i wektora pAcHLT EcoRi-PstI opisanego powyżej. Otrzymany konstrukt został nazwany pAcHLTns3ns4aPI.
Powyższa mieszanina ligacyjna, była transformowana do kompetentnych komórek HB 101 i nakładana na płytki agarowe Luria zawierające 100 μο/ml ampicyliny. Analiza minipreparatywna indywidualnych klonów prowadzi do identyfikacji domniemanych pozycji dwóch z tych które były amplifikowane. Plazmid DNA dla pSP72 1aHC, klony #1 i #2 były sporządzane z zestawu Qiagen Maxiprep i były sekwencjonowane.
Następnie, następujące fragmenty były ligowane razem :
a) 761 bp fragmentem HindIII-ClaI z pSP721aHC #1 (pSP72.1aHC był generowany przez ligowanie razem następujących: pSP72, który był trawiony za pomocą HindIII-ClaI, syntetycznego oligonukleotydu, który mógłby dostarczać miejsce klonujące 5'HindIII, a następnie sekwencję ACAAAACAAA, kodonu inicjacji ATG i kodonów HCV1a, rozpoczynających się na aminokwasie 1027 i kontynuujących do miejsca BglII przy aminokwasie 1046 i 683 bp fragmentu restrykcyjnego BglII-ClaI (kodującego aminokwasy 1046-1274) z pAcHLTns3ns4aPI) ; b) 1353 bp fragment BamHI-HindIII dla drożdżowego hybrydowego promotora ADH2/GAPDH ; c) 1320 bp fragment ClaI-SalI (kodujący aminokwasy 1406 -1711 HcV1a z Thr 1428 zmutowaną na Pro i Ser 1429 zmutowaną na Ile) z pAcHLTns3ns4aPI ; i d) drożdżowy wektor ekspresji pBS24.1, który był trawiony za pomocą BamHI i SalI, defosforylowany
PL 213 363 B1 i oczyszczany na żelu. Mieszanina ligacyjna była transformowana do kompetentnych komórek HB101 i nakładana na płytki agarowe Luria zawierające 100 μο/ml ampicyliny. Minipreparatywna analiza indywidualnych klonów prowadzi do identyfikacji klonów ze spodziewanym 3446 bp BamHI-SalI insertem, który był złożony z promotora ADH2/GAPDH, kodonu inicjatorowego ATG i aminokwasów 1027 -1711 HCV1a NS3/4a (pokazanych jako aminokwasy 1-686 na Figurach 4A-4D) z Thr 1428 (pozycja aminokwasowa 403 na Figurach 4A-4D) zmutowana na Pro i Ser 1429 (pozycja aminokwasowa 404 na Figurach 4A-4D) zmutowana na Ile. Konstrukt ten został nazwany pAcHLTns3ns4aPI (patrz, Figura 5).
Szczep AD3 s.cerevisiare był transformowany za pomocą pAcHLTns3ns4aPI i pojedyncze transformanty były sprawdzane pod względem ekspresji po usunięciu glukozy z pożywki. Rekombinantowe białko było wyrażane w drożdżach na wysokim poziomie jak wykryto barwieniem błękitem coomassyny i potwierdzone analizą immunoblotu stosując przeciwciało poliklonalne do helikazowej domeny NS3.
P r z y k ł a d 3
Oczyszczanie epitopu konformacyjnego NS3/4a
Konformacyjny epitop NS3/4a był oczyszczony jak następuje. Komórki S.cerevisiae, wyrażające epitom NS3/4a były zbierane jak opisano powyżej. Komórki były zawieszane w buforze do Iizy (50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,1 μΜ pepstatyna, 1 μΜ leupeptyna) i poddawane lizie w Dyno-Mill (Wab Willy A. Bachofon, Basel, Szwajcaria) lub w równoważnym aparacie stosując szklane kulki, w proporcji 1 : 1 : 1 komórki : bufor : 0,5 mm szklane kulki. Lizat był wirowany przy 30100 x g przez 30 minut w 4°C i osad zawierający nierozpuszczalną frakcję białkowa był dodawany do buforu myjącego (6 ml/g ciężaru wyjściowego osadu komórkowego) i kołysany przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Bufor myjący składał się z 50 mM NaPO4 pH 8.0, 0,3 m. NaCl, 5 mM β-merkaptoetanolu, 10% glicerolu, 0,05% octylu glukozydowego, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,1 μΜ pepstatyny, 1 μΜ leupeptyny. Odpad komórkowy był usuwany przez wirowanie przy 30100 x g przez 30 minut w 4°C. Supernatant był wyrzucany i osad był pozostawiany.
Białko było ekstrahowane z osadu jak następuje. 6 ml/g buforu ekstrakcyjnego dodawano i kołysano w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Bufor ekstrakcyjny składał się z 50 mM Tris pH 8.0, 1M NaCl, 5 mM merkaptoetanolu, 10% glicerolu, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,1 μΜ pepstatyny, 1 μΜ leupeptyny. Był on wirowany przy 30100 x g przez 30 minut w 4°C. Supernatant był pozostawiany i siarczan amonowy był dodawany do 17,5% stosując następujący wzór: objętość supernatanu (ml) pomnożony przez x % siarczanu amonowego/(1-x% siarczanu amonowego) = ml 4,1 M nasyconego siarczanu amonowego do dodania do supernatantu. Siarczan amonowy był dodawany kroplami podczas wytrząsania w lodzie i roztwór wytrząsano w lodzie przez 10 minut. Roztwór był wirowany przy 17700 x g przez 30 minut w 4°C i osad pozostawiano i przechowywano w 2°C do 8°C przez 48 godzin.
Osad był ponownie zawieszany i nakładany na kolumnę Poly U (Poly U Sepharose 4B, Amersham Pharmacia) w 4°C jak następuje. Osad był ponownie zawieszany w 6 ml Poly U zrównoważonego buforu na gram ciężaru osadu. Bufor równoważący składał się z 25 ml HEPES pH 8.0, 200 mM NaCl, 5 mM DTT (dodawanego na świeżo) 10% glicerolu, 1,2 octylu glukozydowego. Roztwór był kołysany przez 15 minut w 4°C i wirowany przy 31000 x g przez 30 minut w 4°C.
Kolumna Poly U (1 ml żywicy na gram wagi wyjściowego osadu) była przygotowywana. Liniowa prędkość przepływu wynosiła 60 cm/godzinę a upakowująca prędkość przepływu wynosiła 133% z 60 cm/godzinę. Kolumna ta była równoważona buforem równoważącym i supernatant ponownie zawieszonego osadu siarczanu amonowego był ładowany na zrównoważoną kolumnę. Kolumna była przemywana do linii zerowej buforem równoważącym i białko eluowano w etapie elucji w następującym buforze elucyjnym Poly U : 25 mM HEPES pH 8.0, 1M NaCl, 5 mM DTT (świeżo dodany), 10% glicerol, 1,2 octyl glukozydowy, eluat kolumny był rozwijany na SDS-PAGE (barwionym comasyną) i podwielokrotności mrożono i przechowywano w -80°C. Obecność epitopu NS3/4a była potwierdzona przez Western blot, stosując poliklonalne przeciwciało skierowane przeciwko domenie proteazowej NS3 i monoklonalne przeciwciało przeciwko epitopowi 5-1-1 (HCV 4a).
Ponadto enzymatyczną aktywność proteazy monitorowano podczas oczyszczania jak następuje. Peptyd NS4A (KKGSVVIVGRIVLSGKPAIIPKK) i próbka zawierająca konformacyjny epitop NS3/4a była rozpuszczana w 90 μl buforu reakcyjnego (25 mM Tris, pH 7.5, 0,15 M NaCl, 0,5 mM EDTA, 10% glicerol, 0,05 n-dodecylo B-D-maltozyd, 5 mM DTT) i pozwalano na mieszanie przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 90 μl tej mieszaniny dodawano do płytek do mikromiareczkowania (Constar, Inc., Corning, NY) i 10 μΙ substratu HCV (AnaSpec, Inc. San Jose CA). Płytka była mieszana i odczytywana
PL 213 363 B1 na odczytniku płytek Fluostar. Wyniki były wyrażane jako pochodna jednostek fluorescencji na minutę (RFU).
Stosując te metody produkt ekstrakcji 1 M NaCl zawierał 3,7 RFU/minutę aktywności, precupitat siarczanu amonowego miał aktywność 7,5 RFM/minutę i produkt oczyszczania Poly U miał aktywność 18,5 RFU/minutę.
P r z y k ł a d 4
Badania kompetycyjne
Następujące badania kompetycyjne były przeprowadzone w celu ocenienia czy konformacyjny epitop NS3/4a wykryty różnymi przeciwciałami niż inne antygeny HCV. Zwłaszcza antygen NS3/4a porównywano z antygenem c200 następująco.
0,5 μg i 1,0 μg NS3/4a, wytworzonego tak jak opisano powyżej lub c200 (Hepatology (1992) 15 :19-25, dostępny w ORTHO HCV wersja 3.0 ELISA Test System, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) były mieszane z 20 μl próbki PHV914-5 (bleed wczesnej serokonwersji uzyskane z krwi zakażonych osobników) w całkowitej objętości 220 μl (1 x PBS). Mieszaninę inkubowano przez 1 godzinę w mikrostudzienkach w 37°C. Mieszaninę następnie przenoszono do pokrytych NS3/4a płytek inkubowano przez 1 godzinę w 37°C. Płytki przemywano i badano w sposób następujący.
μg antygenu c200 dodawano do 10 μΙ próbki PHV914-5 w całkowitej objętości około 220 pl. Mieszaninę inkubowano przez 1 godzinę w mikrostudzience w 37°C i 200 pl przenoszono na pokrytą NS3/4a płytkę (100 ng/próbę) i inkubowano przez 1 godzinę w 37°C. Płytki przemywano pięć razy 1 x PBS, 0,1% Tween-20. 200 pl roztworu koniugatu (opisanego powyżej) dodawano i płytki inkubowano oraz badano. Kontrole które stanowiły PHV914-5 i 1 x PBS (bez antygenu) były traktowane tak jak powyżej.
Wyniki są przedstawione w Tabeli 7. Procentowe wyniki hamowania pokazane w kolumnie 4 są obliczone jako kolumna 3 minus (kolumna 2 podzielona na kolumnę 3 razy 100). Jak można zobaczyć, dane te pokazują, że NS3/4a jest neutralizowane przez wczesną serokonwersję przeciwciał a c200 nie jest. Silny sygnał był otrzymany kiedy przeciwciała w panelu wczesnej konwersji PV914-5 c33c reagowały z nałożonym na płytkę NS3/4a. Antygen c200 nie był neutralizowany przez te przeciwciała. Jest to pokazane w górnym panelu Tabeli 7. Kiedy NS3/4a był zmieszany z próbką PHV914-5, był on neutralizowany i dlatego w próbce nie było przeciwciał, które reagowały by z NS3/4a którym była pokryta mikropłytka. Dane te wskazują, że NS3/4a może być wykrywany różnymi klasami przeciwciał niż c200.
P r z y k ł a d 5
Badania stabilności konformacyjnego epitopu NS3/4a dla oceny roly stabilności epitopu NS3/4a dla przeprowadzania testu wykonano następujące badania w celu oceny immunoreaktywności NS3/4a w funkcji czasu w temperaturze pokojowej. Małe podwielokrotności wyjściowego NS3/4a były trzymane w temperaturze pokojowej a następnie mrożone w przedziałach czasowych jak pokazano w Tabeli 8. Wszystkie fiolki były pokrywane jednocześnie i testowane wobec dwóch paneli wczesnej serokonwersji NS3.
Jak widać z Tabeli 8 wyjściowy NS3/4a nie jest stabilny i immunoreaktywność spadała w czasie. Ponadto, podtrzymywanie konformacji jest konieczne dla immunoreaktywności.
Dalsze badania stabilności były przeprowadzane następująco. Dwa konformacyjne monoklonalne przeciwciała wykonane przeciwko NS3/4a stosując standardowe procedury były podstawione panelami wczesnej serokonwersji anty-HCV. Fiolki wyjściowego NS3/4a były przechowywane w temperaturze pokojowej w przedziałach czasowych 3, 6 i 24 godziny. NS3/4a z fiolki mrożonej był nakładany przy 90 ng/ml i badany stosując opisaną powyżej procedurę. Wyniki sugerowały, że te dwa monoklonalne przeciwciała były rzeczywiście konformacyjne i ich reaktywność była wrażliwa na trzymanie wyjściowego antygenu NS3/4a w temperaturze pokojowej. Reaktywność pozytywnej kontroli monoklonalnego przeciwciała nie zmieniła się.
P r z y k ł a d 6
Immunoreaktywność konfirmacyjnego epitopu NS3/4a
Immunoreaktywność konfirmacyjnego epitopu NS3/4a, wytworzonego, tak jak opisano powyżej, porównana była do NS3/4a, który został zdenaturowany przez dodanie SDS do preparatu epitopu konformacyjnego NS3/4a do końcowego stężenia 2%. Zdenaturowany NS3/4a i konformacyjny NS3/4a nałożono na płytki do mikromiareczkowania, tak jak opisano powyżej. Antygen c200 (Hepatology (1992) 15:19-25, dostępny w ORTHO HCV wersja 3.0 ELISA Test System, Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) był także nałożony na płytki do miareczkowania. Antygen c200 był
PL 213 363 B1 zastosowany jako porównanie ponieważ założono, że nie jest on konformacyjny w związku z obecnością czynnika redukującego (DTT) i detergentu (SDS) w tym preparacie.
Immunoreaktywność była testowana wobec dwóch paneli wczesnej serokonwersji HCV PHV 904 i PHV 914 (handlowo dostępne próbki ludzkiej krwi z Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater, MA). Wyniki pokazano w Tabeli 9. Dane wskazują, że denaturowana lub linearyzowana postać NS3/4a (jak również c200) nie wykryła paneli wczesnej serokonwersji tak wcześnie jak konformacyjny epitop NS3/4a.
T a b e l a 9
NS3/4a wobec denaturowanego NS3/4a | ||||||||
* Spiked 2% SDS to stock NS3/4a | ||||||||
NS3/4a | dNS3/4a* | c200 | NS3/4a | dNS3/4a* | c200 | |||
OD | OD | OD | s/co | c/co | s/co | |||
HCV | PHV 904-1 | 0,012 | 0,012 | 0,009 | 0,02 | 0,02 | 0,01 | |
Serokon- wersja | PHV 904-2 | 0,011 | 0,009 | 0,008 | 0,02 | 0,01 | 0,01 | |
PHV 904-3 | 1,124 | 0,071 | 0,045 | 1,80 | 0,11 | 0,07 | ||
PHV 904-4 | 2,401 | 2,273 | 0,129 | 3,85 | 0,44 | 0,21 | ||
PHV 904-5 | 3,022 | 0,793 | 0,347 | 4,85 | 1,28 | 0,57 | ||
PHV 904-6 | 2,711 | 1,472 | 0,774 | 4,35 | 2,37 | 1,28 | ||
PHV 904-7 | 3,294 | 1,860 | 0,943 | 5,28 | 2,99 | 135 | ||
PHV 914-1 | 0,006 | 0,004 | 0,001 | 0,01 | 0,01 | 0,00 | ||
PHV 914-2 | 0,005 | 0,004 | 0,002 | 0,01 | 0,01 | 0,00 | ||
PHV 914-3 | 0,098 | 0,003 | 0,001 | 0,16 | 0,00 | 0,00 | ||
PHV 914-4 | 1,118 | 0,006 | 0,004 | 1,79 | 0,01 | 0,01 | ||
PHV 914-5 | 2,035 | 0,044 | 0,022 | 3,26 | 0,07 | 0,04 | ||
PHV 914-6 | 2,092 | 0,074 | 0,025 | 3,35 | 0,12 | 0,04 | ||
PHV 914-7 | 2,519 | 0,281 | 0,132 | 4,04 | 0,45 | 0,22 | ||
PHV 914-8 | 2,746 | 0,907 | 0,500 | 4,40 | 1,46 | 0,82 | ||
PHV 914-9 | 3,084 | 1,730 | 0,931 | 4,94 | 2,78 | 1,53 | ||
HCV 3.0 | Kontr.neg. | 0,023 | 0,024 | 0,008 | ||||
Kontrole | Kontr.neg. | 0,027 | 0,024 | 0,007 | ||||
Kontr.neg. | 0,021 | 0,017 | 0,005 | |||||
średnia | 0,024 | 0,022 | 0,007 | |||||
0,624 | 0,622 | 0,607 | ||||||
Kontr.poz. | 1,239 | 0,903 | 0,575 | 1,99 | 1,45 | 0,95 | ||
Kontr.poz. | 1,445 | 0,916 | 0,614 | 2,32 | 1,47 | 1,01 | ||
Immunoreaktywność konformacyjnego epitopu była także testowana stosując monoklonalne przeciwciała do NS3/4a, wytworzone stosując standardowe procedury. Te monoklonalne przeciwciała
PL 213 363 B1 były następnie testowane w formacie ELISA wobec NS3/4a i z denaturowanego NS3/4a i antygenu c200. Te dane pokazują, że monoklonalne przeciwciała anty-NS3/4a reagują z NS3/4a i z denaturowanym NS3/4a w podobny sposób do paneli serokonwersji pokazanych w Tabeli 10. Wyniki te także dostarczają dalszych dowodów, że NS3/4a jest konformacyjny w naturze ponieważ monoklonalne przeciwciała mogą być wytworzone co jest podobne w reaktywności do wczesnego c33 z panelu serokonwersji. Ujawniono zatem nowy test detekcji HCV.
T a b e l a 10
Płytka | ||||
NS3/4a | dNS3/4a | c200 | ||
Monoklonalne | OD | OD | OD | |
4B9/E3 | 1 : 100 | 1,820 | 0,616 | 0,369 |
1 :1000 | 1,397 | 0,380 | 0,246 | |
1 :10000 | 0,864 | 0,173 | 0,070 | |
1 : 20000 | 0,607 | 0,116 | 0,085 | |
5B7/D7 | 1 : 100 | 2,885 | 0,898 | 0,436 |
1 :1000 | 2,866 | 0,541 | 0,267 | |
1 :10000 | 1,672 | 0,215 | 0,086 | |
1 : 20000 | 1,053 | 0,124 | 0,059 | |
1A8/H2 | 1 : 100 | 1,020 | 0,169 | 0,080 |
1 :1000 | 0,921 | 0,101 | 0,043 | |
1 :10000 | 0,653 | 0,037 | 0,013 | |
1 : 20000 | 0,337 | 0,027 | 0,011 |
Zastrzeżenia patentowe
Claims (28)
1. Stałe podłoże immunotestu, znamienne tym, że zawiera związane z nim, co najmniej jedno anty-rdzeniowe przeciwciało przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C (HCV) i co najmniej jeden izolowany epitop HCV NS3/4a, przy czym wspomniany epitop NS3/4a jest konformacyjnym epitopem i zawiera sekwencję aminokwasową opisaną na Fig. 4A-4D.
2. Stałe podłoże immunotestu według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera związane z nim, co najmniej dwa anty-rdzeniowe przeciwciała.
3. Stałe podłoże immunotestu według zastrz. 1, znamienne tym, że wspomniane, co najmniej jedno anty-rdzeniowe przeciwciało jest skierowane przeciwko N-końcowemu regionowi antygenu rdzeniowego HCV.
4. Stałe podłoże immunotestu według zastrz. 3, znamienne tym, że wspomniane, co najmniej jedno anty-rdzeniowe przeciwciało jest skierowane przeciwko aminokwasom 10-53 HCV, ponumerowanym względem sekwencji poliproteiny HCV1.
5. Stałe podłoże immunotestu według zastrz. 1, znamienne tym, że wspomniane, co najmniej jedno anty-rdzeniowe przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym.
6. Stałe podłoże immunotestu według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera ponadto związany z nim wieloepitopowy antygen fuzyjny, przy czym wspomniany wieloepitopowy antygen fuzyjny zawiera sekwencję aminokwasową opisaną na Fig. 7A-7F.
7. Stałe podłoże immunotestu, znamienne tym, że zawiera związane z nim dwa antyrdzeniowe monoklonalne przeciwciała przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C (HCV), konformacyjny epitop HCV NS3/4a zawierający sekwencję aminokwasową opisaną na Fig. 4A-4D i wieloepitopowy antygen fuzyjny zawierający sekwencje aminokwasową opisaną na Figurach 7A-7F.
PL 213 363 B1
8. Sposób wykrywania zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV) w próbce biologicznej, znamienny tym, że obejmuje etapy:
(a) dostarczenie stałego podłoża immunotestu jak zdefiniowano w zastrz. 1;
(b) połączenie próbki biologicznej ze wspomnianym stałym podłożem w warunkach, które pozwalają antygenom HCV i przeciwciałom, jeżeli są obecne w próbce biologicznej, związać się ze wspomnianym co najmniej jednym anty-rdzeniowym przeciwciałem i wspomnianym epitopem NS3/4a, przy czym antygen reagujący z przeciwciałem HCV z próbki biologicznej zawiera epitop z regionu c33c poliproteiny HCV, (c) dodanie do stałego podłoża z etapu (b) w warunkach tworzących kompleks (i) pierwszego wykrywalnego znakowanego przeciwciała, przy czym wspomniane pierwsze wykrywalne znakowane przeciwciało jest wykrywalnym znakowanym przeciwciałem anty-rdzeniowym HCV, przy czym to wspomniane znakowane anty-rdzeniowe przeciwciało jest skierowane przeciwko innemu epiopowi rdzeniowemu HCV niż co najmniej jedno anty-rdzeniowe przeciwciało związane ze wspomnianym podłożem; (ii) antygenu reagującego z przeciwciałem HCV z próbki biologicznej reagującej z epitopem NS3/4a; i (iii) drugiego wykrywalnego znakowanego przeciwciała, przy czym wspomniane drugie znakowane przeciwciało reaguje z antygenem z (ii) ;
(d) wykrywanie kompleksów utworzonych pomiędzy przeciwciałami i antygenami, jako oznaki zakażenia HCV w próbce biologicznej.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że co najmniej jedno anty-rdzeniowe przeciwciało jest skierowane przeciwko N-końcowemu regionowi antygenu rdzeniowego HCV i wspomniane wykrywalne znakowane anty-rdzeniowe HCV jest skierowane przeciwko regionowi C-terminalnemu antygenu rdzeniowego HCV.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że wspomniane, co najmniej jedno antyrdzeniowe przeciwciało jest skierowane przeciwko aminokwasom 10-53 HCV, ponumerowanym względem sekwencji poliproteiny HCV1 i wspomniane wykrywalne znakowane anty-rdzeniowe HCV jest skierowane przeciwko aminokwasom 120-130 HCV, ponumerowanym względem sekwencji poliproteiny HCV1.
11. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że epitop c33c jest połączony fuzyjnie z sekwencją aminokwasową ludzkiej dysmutazy ponadtlenkowej (hSOD) i że drugie znakowane przeciwciało reaguje z wspomnianą sekwencją aminokwasową (hSOD).
12. Sposób wykrywania zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV) w próbce biologicznej, znamienny tym, że obejmuje etapy:
a) dostarczenie stałego podłoża immunotestu jak zdefiniowano w zastrz. 2;
b) połączenie próbki biologicznej ze wspomnianym stałym podłożem w warunkach, które pozwalają antygenom HCV i przeciwciałom, jeżeli są obecne w próbce biologicznej, związać się ze wspomnianymi co najmniej dwoma anty-rdzeniowymi przeciwciałami i konformacyjnym epitopem NS3/4a;
c) dodanie do stałego podłoża z etapu (b) w warunkach tworzących kompleks (i) pierwszego wykrywalnego znakowanego przeciwciała, przy czym wspomniane pierwsze wykrywalne znakowane przeciwciało jest wykrywalnym znakowanym przeciwciałem anty-rdzeniowym HCV, przy czym wspomniane znakowane anty-rdzeniowe przeciwciało jest skierowane przeciwko innemu epitopowi rdzeniowemu HCV, niż co najmniej dwa anty-rdzeniowe przeciwciała związane ze stałym podłożem; (ii) epitopu z regionu c33c poliproteiny HCV połączonej fuzyjnie z sekwencją aminokwasową hSOD; i (iii) drugiego wykrywalnego znakowanego przeciwciała, przy czym wspomniane wykrywalne drugie znakowane przeciwciało reaguje z sekwencją aminokwasową hSOD;
d) wykrywanie utworzonych kompleksów pomiędzy przeciwciałami i antygenami, jako wskaźnika zakażenia HCV w próbce biologicznej.
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że wspomniane, co najmniej dwa antyrdzeniowe przeciwciała są skierowane przeciwko N-końcowemu regionowi antygenu rdzeniowego HCV i wspomniane wykrywalne znakowane anty-rdzeniowe przeciwciało HCV jest skierowane przeciwko C-końcowemu regionowi antygenu rdzeniowego HCV.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że wspomniane, co najmniej dwa antyrdzeniowe przeciwciała są skierowane przeciwko aminokwasom 10-53 HCV, ponumerowanym względem sekwencji poliproteiny HCV1 i wspomniane wykrywalne znakowane anty-rdzeniowe przeciwciało HCV jest skierowane przeciwko aminokwasom 120-130 HCV, ponumerowanym względem sekwencji poliproteiny HCV1.
PL 213 363 B1
15. Sposób wykrywania zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV) w próbce biologicznej, znamienny tym, że obejmuje etapy:
(a) dostarczenia stałego podłoża immunotestu jak zdefiniowano w zastrz. 6;
(b) połączenia próbki biologicznej ze wspomnianym stałym podłożem w warunkach pozwalających antygenom HCV i przeciwciałom, jeżeli znajdują się w próbce, na związanie się do wspomnianego, co najmniej jednego anty-rdzeniowego przeciwciała, wspomnianego epitopu NS3/4a i wspomnianego wieloepitopowego antygenu fuzyjnego;
(c) dodanie do stałego podłoża z etapu (b) w warunkach tworzących kompleks (i) pierwszego wykrywalnego znakowanego przeciwciała, przy czym wspomniane pierwsze wykrywalne znakowane przeciwciało jest wykrywalnym znakowanym przeciwciałem anty-rdzeniowym HCV, przy czym wspomniane znakowane anty-rdzeniowe przeciwciało jest skierowane przeciwko innemu epitopowi rdzeniowemu HCV, niż co najmniej jedno anty-rdzeniowe przeciwciało związane ze stałym podłożem; (ii) antygenów pierwszego i drugiego, które reagują z przeciwciałem HCV z próbki biologicznej reagującej z wspomnianym epitopem NS3/4a i wspomnianym wieloepitopowym antygenem fuzyjnym, przy czym wspomniany pierwszy antygen reagujący z przeciwciałem HCV z próbki biologicznej zawiera epitop z regionu c33c poliproteiny HCV; i (iii) drugiego wykrywalnego znakowanego przeciwciała, przy czym wspomniane drugie wykrywalne znakowane przeciwciało reaguje z antygenami z (ii) ;
(d) wykrywanie utworzonych kompleksów pomiędzy przeciwciałami i antygenami, jako wskaźnika zakażenia HCV w próbce biologicznej.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że wspomniane, co najmniej jedno antyrdzeniowe przeciwciało jest skierowane przeciwko N-końcowemu regionowi antygenu rdzeniowego HCV i wspomniane pierwsze wykrywalne znakowane anty-rdzeniowe przeciwciało jest skierowane przeciwko C-końcowemu regionowi antygenu rdzeniowego HCV.
17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że co najmniej jedno anty-rdzeniowe przeciwciało jest skierowane przeciwko aminokwasom 10-53 HCV, ponumerowanym względem sekwencji poliproteiny HCV1 i wspomniane wykrywalne znakowane anty-rdzeniowe przeciwciało HCV jest skierowane przeciwko aminokwasom 120-130 HCV, ponumerowanym względem sekwencji poliproteiny HCV1.
18. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że epitop c33c jest połączony fuzyjnie z sekwencją aminokwasową ludzkiej dysmutazy ponadtlenkowej (hSOD) i drugie wykrywalne znakowane przeciwciało reaguje z sekwencją aminokwasową hSOD.
19. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że wspomniany drugi antygen reagujący z przeciwciałem HCV z próbki biologicznej zawiera epitop z regionu c22 poliproteiny HCV.
20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że epitop z regionu c22 zawiera aminokwasy Lys10 do Ser99 poliproteiny HCV, z delecją Arg47 i podstawieniem Leu na Trp w pozycji 44, ponumerowanych względem sekwencji poliproteiny HCV1, przy czym wspomniany epitop jest połączony fuzyjnie z sekwencją aminokwasową ludzkiej dysmutazy ponadtlenkowej (hSOD) i drugie wykrywalne znakowane przeciwciało reaguje ze wspomnianą sekwencją aminokwasową ludzkiej hSOD.
21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że wspomniany wieloepitopowy antygen fuzyjny zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na Figurach 7A-7F.
22. Sposób wykrywania zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV) w próbce biologicznej, znamienny tym, że obejmuje etapy:
(a) dostarczenie stałego podłoża immunotestu jak zdefiniowano w zastrz. 7;
(b) połączenie próbki biologicznej ze wspomnianym stałym podłożem w warunkach pozwalających antygenom HCV i przeciwciałom, jeżeli znajdują się w próbce, na związanie się z wspomnianymi, co najmniej dwoma anty-rdzeniowymi przeciwciałami, wspomnianym epitopem konformacyjnym NS3/4a, i wspomnianym wieloepitopowym antygenem fuzyjnym;
(c) dodanie do stałego podłoża z etapu (b) w warunkach tworzących kompleks (i) pierwszego wykrywalnego znakowanego przeciwciała, przy czym wspomniane pierwsze wykrywalne znakowane przeciwciało jest wykrywalnym znakowanym anty-rdzeniowym przeciwciałem HCV, przy czym wspomniane znakowane anty-rdzeniowe przeciwciało jest skierowane przeciwko innemu epitopowi rdzeniowemu HCV niż co najmniej dwa anty-rdzeniowe przeciwciała związane ze stałym podłożem; (ii) epitopu z regionu c33c poliproteiny HCV połączonej fuzyjnie z sekwencją aminokwasową hSOD i epitopem z regionu c22 poliproteiny HCV połączonej fuzyjnie z sekwencją aminokwasową hSOD; i (iii) drugiego wykrywalnego znakowanego przeciwciała, przy czym wspomniane drugie wykrywalne znakowane przeciwciało reaguje z wspomnianą sekwencją aminokwasową hSOD;
PL 213 363 B1 (d) wykrywanie utworzonych kompleksów pomiędzy przeciwciałami i antygenami, jako oznaki zakażenia HCV w próbce biologicznej.
23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że wspomniane, co najmniej dwa antyrdzeniowe przeciwciała są skierowane przeciwko N-końcowemu regionowi antygenu rdzeniowego HCV i wspomniane wykrywalne znakowane anty-rdzeniowe przeciwciało HCV jest skierowane przeciwko C- końcowemu regionowi antygenu rdzeniowego HCV.
24. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że wspomniane, co najmniej dwa antyrdzeniowe przeciwciała są skierowane przeciwko aminokwasom 10-53 HCV, ponumerowanym względem sekwencji poliproteiny HCV1 i wspomniane wykrywalne znakowane anty-rdzeniowe przeciwciało HCV jest skierowane przeciwko aminokwasom 120-130 HCV, ponumerowanym względem sekwencji poliproteiny HCV1.
25. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że epitop z regionu c22 zawiera aminokwasy Lys10 do Ser99 poliproteiny HCV, z delecją przy Arg47 i podstawieniem Leu na Trp w pozycji 44, ponumerowanych względem sekwencji poliproteiny HCV1.
26. Zestaw immunodiagnostyczny, znamienny tym, że zawiera stałe podłoże immunotestu jak zdefiniowano w zastrz. 1-7.
27. Sposób wytwarzania stałego podłoża immunotestu, znamienny tym, że obejmuje etapy:
(a) dostarczenie stałego podłoża; i (b) związanie z nim, co najmniej jednego przeciwciała anty-rdzeniowego przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C (HCV) i co najmniej jednego izolowanego epitopu konformacyjnego NS3/4a HCV, przy czym wspomniany epitop NS3/4a posiada sekwencję aminokwasową opisaną na Fig. 4A-4D.
28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że obejmuje ponadto wiązanie co najmniej jednego wieloepitopowego antygenu fuzyjnego do tego stałego podłoża.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US21208200P | 2000-06-15 | 2000-06-15 | |
US28086701P | 2001-04-02 | 2001-04-02 | |
US28081101P | 2001-04-02 | 2001-04-02 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL365599A1 PL365599A1 (pl) | 2005-01-10 |
PL213363B1 true PL213363B1 (pl) | 2013-02-28 |
Family
ID=27395684
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL365599A PL213363B1 (pl) | 2000-06-15 | 2001-06-14 | Stale podloze immunotestu, sposób wykrywania zakazenia wirusem zapalenia watroby typu C (HCV), zestaw immunodiagnostyczny i sposób wytwarzania stalego podloza immunotestu |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US6632601B2 (pl) |
EP (2) | EP1354204B2 (pl) |
JP (3) | JP4834279B2 (pl) |
CN (3) | CN100463922C (pl) |
AT (2) | ATE368221T1 (pl) |
AU (2) | AU2001272945A1 (pl) |
BG (1) | BG66205B1 (pl) |
BR (2) | BRPI0111682B8 (pl) |
CA (2) | CA2412035C (pl) |
CY (2) | CY1107537T1 (pl) |
CZ (1) | CZ304185B6 (pl) |
DE (2) | DE60129598T2 (pl) |
DK (2) | DK1350105T3 (pl) |
ES (2) | ES2277932T5 (pl) |
HK (2) | HK1061861A1 (pl) |
HU (1) | HU228873B1 (pl) |
MX (2) | MXPA02012401A (pl) |
NO (1) | NO332275B1 (pl) |
PL (1) | PL213363B1 (pl) |
PT (2) | PT1354204E (pl) |
SI (1) | SI1354204T2 (pl) |
SK (1) | SK287694B6 (pl) |
WO (2) | WO2001096870A2 (pl) |
Families Citing this family (40)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69433160T2 (de) * | 1993-05-12 | 2004-07-08 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | Konserviertes Motiv der Hepatitis C Virus E2/NS1 Region |
AU2001272945A1 (en) * | 2000-06-15 | 2001-12-24 | Chiron Corporation | Immunoassays for anti-hcv antibodies |
US7491808B2 (en) * | 2000-06-15 | 2009-02-17 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | HCV non-structural protein mutants and uses thereof |
WO2002014362A2 (en) * | 2000-08-17 | 2002-02-21 | Tripep Ab | A hepatitis c virus non-structural ns3/4a fusion gene |
US7022830B2 (en) | 2000-08-17 | 2006-04-04 | Tripep Ab | Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene |
DE10106295C1 (de) * | 2001-02-02 | 2002-08-22 | Gaifar German American Inst Fo | Protein mit mehreren Antigen-Epitop-Sequenzen, welches immobilisiert ist |
SG118120A1 (en) * | 2001-03-28 | 2006-01-27 | Ortho Clinical Diagnostics Inc | A hepatitis C antigen - antibody combination assayfor the early detection of HCV infection |
US7101683B2 (en) | 2001-06-26 | 2006-09-05 | Abbott Laboratories | Methods for the simultaneous detection of HCV antigens and HCV antibodies |
EP1412538B1 (en) * | 2001-06-26 | 2013-03-27 | Abbott Laboratories | Methods for the simultaneous detection of hcv antigens and hcv antibodies |
US7049060B2 (en) * | 2001-11-05 | 2006-05-23 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | HCV anti-core monoclonal antibodies |
US7332269B2 (en) * | 2001-11-11 | 2008-02-19 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | HCV core protein sequences |
FR2839555B1 (fr) * | 2002-05-10 | 2007-07-27 | Bio Rad Pasteur | Procede de detection simultanee d'un antigene et d'un anticorps d'un microorganisme infectieux |
EP1546414B1 (en) * | 2002-09-09 | 2008-10-08 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Hcv assay |
US20040152070A1 (en) * | 2003-02-04 | 2004-08-05 | Shah Dinesh O. | Method of detection of HCV antibodies in combination assay or sole antibody assay |
US20070003977A1 (en) | 2003-08-20 | 2007-01-04 | Amorfix Life Sciences Ltd | Epitope protection assay and method for detecting protein conformations |
WO2006024020A2 (en) | 2004-08-27 | 2006-03-02 | Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. | Hcv non-structural protein mutants and uses thereof |
US7658930B2 (en) * | 2005-02-02 | 2010-02-09 | Peng Cui | Kit for detecting the antibody of HCV and its preparing method |
CA2630220C (en) | 2005-11-22 | 2020-10-13 | Doris Coit | Norovirus and sapovirus antigens |
US7794692B2 (en) * | 2005-12-02 | 2010-09-14 | Amorfix Life Sciences Ltd. | Methods and compositions for detecting amyotrophic lateral sclerosis |
US7887803B2 (en) | 2005-12-02 | 2011-02-15 | Amorfix Life Sciences | Methods and compositions to treat misfolded-SOD1 mediated diseases |
EP2514823B1 (en) | 2006-03-03 | 2018-05-02 | ProMIS Neurosciences Inc. | Methods and compositions to treat and detect misfolded-SOD1 mediated diseases |
CN1908666B (zh) * | 2006-08-14 | 2010-05-12 | 武汉大学 | 一种检测乙肝核心抗体的双夹心法酶联免疫诊断试剂盒及应用 |
US8071561B2 (en) | 2007-08-16 | 2011-12-06 | Chrontech Pharma Ab | Immunogen platform |
CN102378914B (zh) * | 2009-03-30 | 2014-12-10 | 生物梅里埃公司 | 用于hcv检测的固体支持物 |
US20100297607A1 (en) * | 2009-05-20 | 2010-11-25 | Jian Zheng | Reagents For HCV Antigen-Antibody Combination Assays |
JP2013529894A (ja) | 2010-04-07 | 2013-07-25 | ノバルティス アーゲー | パルボウイルスb19のウイルス様粒子を生成するための方法 |
CN106771219B (zh) * | 2010-06-17 | 2020-04-07 | 皇家飞利浦电子股份有限公司 | 多表位测定 |
CA2804501C (en) | 2010-07-06 | 2021-01-26 | Novartis Ag | Noro virus derived immunogenic compositions and methods |
WO2012006500A2 (en) * | 2010-07-08 | 2012-01-12 | Abbott Laboratories | Monoclonal antibodies against hepatitis c virus core protein |
CA2824758C (en) * | 2011-01-13 | 2019-06-04 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Treponema pallidum triplet antigen |
FR2984328B1 (fr) | 2011-12-20 | 2016-12-30 | Bio-Rad Innovations | Procede de detection d'une infection par le virus de l'hepatite c |
US9371374B2 (en) | 2013-03-14 | 2016-06-21 | Abbott Laboratories | HCV core lipid binding domain monoclonal antibodies |
CN105228649B (zh) | 2013-03-14 | 2019-01-18 | 雅培制药有限公司 | Hcv抗原-抗体组合测定和方法以及用在其中的组合物 |
MX2015012824A (es) | 2013-03-14 | 2016-06-24 | Abbott Lab | Antigenos recombinantes ns3 del vhc y mutantes de los mismos para la deteccion mejorada de anticuerpos. |
CN103630690B (zh) * | 2013-12-17 | 2014-08-20 | 朱之炜 | 丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒及其检测方法 |
WO2016160046A1 (en) | 2015-03-27 | 2016-10-06 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Hcv ns4a/modified ns3 polypeptides and uses thereof |
US20180292408A1 (en) * | 2015-04-20 | 2018-10-11 | Qoolabs, Inc. | Camelid single-domain hcv antibodies and methods of use |
US11639933B2 (en) * | 2017-09-27 | 2023-05-02 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital affinity linkage assay |
CN110261616B (zh) * | 2019-04-30 | 2021-07-20 | 广东菲鹏生物有限公司 | 一种丙型肝炎病毒检测试剂盒 |
CN115838420B (zh) * | 2022-10-31 | 2023-05-05 | 北京科跃中楷生物技术有限公司 | 一种可溶性hcv重组蛋白的制备方法及其制备的抗体检测试剂 |
Family Cites Families (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6171782B1 (en) | 1987-11-18 | 2001-01-09 | Chiron Corporation | Antibody compositions to HCV and uses thereof |
EP0318216B2 (en) * | 1987-11-18 | 2001-08-29 | Chiron Corporation | NANBV diagnostics |
US5683864A (en) * | 1987-11-18 | 1997-11-04 | Chiron Corporation | Combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies |
YU48038B (sh) * | 1987-11-18 | 1996-10-18 | Chiron Corp. | Postupak za dijagnostiku ne-a, ne-v hepatitisa |
US5350671A (en) | 1987-11-18 | 1994-09-27 | Chiron Corporation | HCV immunoassays employing C domain antigens |
JP2730153B2 (ja) | 1989-03-16 | 1998-03-25 | 日本合成ゴム株式会社 | 熱可塑性樹脂組成物およびその製造方法 |
HUT54896A (en) | 1989-03-17 | 1991-04-29 | Chiron Corp | Process for producing aquous diagnosticum and vaccine of nanbv |
GEP20002164B (en) * | 1989-05-18 | 2000-07-10 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Oligomers, method for detecting of hcv sequence, kit for its detecting, method for production of the blood free from hcv |
US5712087A (en) | 1990-04-04 | 1998-01-27 | Chiron Corporation | Immunoassays for anti-HCV antibodies employing combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens |
US6194140B1 (en) * | 1990-04-04 | 2001-02-27 | Chiron Corporation | HCV NS3 protein fragments having helicase activity and improved solubility |
JP2733138B2 (ja) * | 1990-04-04 | 1998-03-30 | カイロン コーポレイション | 抗hcv抗体の免疫アッセイに使用するc型肝炎ウイルス(hcv)抗原の組合せ |
CA2049679C (en) * | 1990-08-24 | 2005-06-21 | Sushil G. Devare | Hepatitis c assay utilizing recombinant antigens |
PT97247B (pt) * | 1991-04-03 | 1997-10-31 | Chiron Corp | Processo de preparacao de combinacoes de antigenios do virus da hepapite c (hcv) para uso em imunoensaios para anticorpos anti-hcv |
DE69232871T2 (de) | 1991-06-24 | 2003-05-08 | Chiron Corp | Polypeptide des hepatitis c-virus (hiv) |
UA39944C2 (uk) | 1992-07-07 | 2001-07-16 | Чірон Корпорейшн | Спосіб визначення ранньої сероконверсії у ссавця-хазяїна до вірусу гепатиту с і набір для використання в способі |
EP1004670B1 (en) * | 1993-04-27 | 2012-04-11 | Innogenetics N.V. | Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents |
US6001604A (en) * | 1993-12-29 | 1999-12-14 | Bio-Technology General Corp. | Refolding of proinsulins without addition of reducing agents |
JP3217600B2 (ja) | 1994-07-12 | 2001-10-09 | 株式会社先端生命科学研究所 | 非a非b型肝炎ウイルス関連抗原のイムノアッセイ、それに使用するモノクローナル抗体、およびこの抗体を産生するハイブリドーマ |
DE4428705A1 (de) * | 1994-08-12 | 1996-02-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Rekombinantes Antigen aus der NS3-Region des Hepatitis C Virus |
US5843752A (en) | 1995-05-12 | 1998-12-01 | Schering Corporation | Soluble active hepatitis C virus protease |
US5990276A (en) | 1996-05-10 | 1999-11-23 | Schering Corporation | Synthetic inhibitors of hepatitis C virus NS3 protease |
AU719929B2 (en) | 1996-05-24 | 2000-05-18 | Grifols Worldwide Operations Limited | Multiple epitope fusion protein |
US6514731B1 (en) * | 1996-05-24 | 2003-02-04 | Chiron Corporation | Methods for the preparation of hepatitis C virus multiple copy epitope fusion antigens |
EP0870830A3 (en) * | 1997-02-10 | 2004-02-25 | Advanced Life Science Institute, Inc. | Chimera hepatitis C virus antigen |
DE69837155T2 (de) * | 1997-09-22 | 2007-06-21 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc., Emeryville | Verfahren zum nachweiss von antikörpern in einer probe |
BR9906660A (pt) * | 1998-07-30 | 2000-08-29 | Advanced Life Science Inst Inc | Processo para medir vìrus da hepatite c |
AU2001272945A1 (en) * | 2000-06-15 | 2001-12-24 | Chiron Corporation | Immunoassays for anti-hcv antibodies |
-
2001
- 2001-06-14 AU AU2001272945A patent/AU2001272945A1/en not_active Abandoned
- 2001-06-14 DE DE60129598T patent/DE60129598T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 SK SK1777-2002A patent/SK287694B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-06-14 BR BRPI0111682A patent/BRPI0111682B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-06-14 PL PL365599A patent/PL213363B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2001-06-14 CZ CZ20024058A patent/CZ304185B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-06-14 PT PT01952160T patent/PT1354204E/pt unknown
- 2001-06-14 EP EP01952160A patent/EP1354204B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 DK DK01952156T patent/DK1350105T3/da active
- 2001-06-14 SI SI200130682T patent/SI1354204T2/sl unknown
- 2001-06-14 CN CNB2004100116606A patent/CN100463922C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 PT PT01952156T patent/PT1350105E/pt unknown
- 2001-06-14 AT AT01952156T patent/ATE368221T1/de active
- 2001-06-14 EP EP01952156A patent/EP1350105B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 ES ES01952160T patent/ES2277932T5/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 WO PCT/US2001/019156 patent/WO2001096870A2/en active IP Right Grant
- 2001-06-14 JP JP2002510953A patent/JP4834279B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 CA CA2412035A patent/CA2412035C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 DK DK01952160.8T patent/DK1354204T4/da active
- 2001-06-14 ES ES01952156T patent/ES2288969T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 AU AU2001272948A patent/AU2001272948A1/en not_active Abandoned
- 2001-06-14 BR BRPI0111731A patent/BRPI0111731C1/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-06-14 CN CNB018112463A patent/CN1214244C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 US US09/881,654 patent/US6632601B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 HU HU0500444A patent/HU228873B1/hu unknown
- 2001-06-14 CA CA2413003A patent/CA2413003C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 AT AT01952160T patent/ATE348337T1/de active
- 2001-06-14 US US09/881,239 patent/US6630298B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 WO PCT/US2001/019369 patent/WO2001096875A2/en active IP Right Grant
- 2001-06-14 JP JP2002510948A patent/JP4837229B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 CN CNB018112439A patent/CN1256591C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 DE DE60125240T patent/DE60125240T3/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 MX MXPA02012401A patent/MXPA02012401A/es active IP Right Grant
- 2001-06-14 MX MXPA02012424A patent/MXPA02012424A/es active IP Right Grant
-
2002
- 2002-12-06 NO NO20025878A patent/NO332275B1/no not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-01-07 BG BG107441A patent/BG66205B1/bg unknown
- 2003-08-08 US US10/637,323 patent/US6797809B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-19 US US10/643,853 patent/US7319144B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-07-06 HK HK04104878A patent/HK1061861A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2004-07-26 US US10/899,715 patent/US7241879B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-12-21 HK HK05111793.1A patent/HK1079796A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-03-07 CY CY20071100319T patent/CY1107537T1/el unknown
- 2007-08-20 CY CY20071101092T patent/CY1106820T1/el unknown
-
2011
- 2011-03-28 JP JP2011071150A patent/JP2011125350A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7319144B2 (en) | Polynucleotides encoding a multiple epitope fusion antigen for use in an HCV antigen/antibody combination assay | |
JP2009258128A (ja) | Hcvアッセイ | |
RU2274863C2 (ru) | Определение комплекса hcv-антиген/антитело | |
EP1829891B1 (en) | Immunoassays for Anti-HCV Antibodies |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
VDSO | Invalidation of derivated patent or utility model |
Ref document number: 388367 Country of ref document: PL Kind code of ref document: A1 |