CZ304185B6 - Pevný nosic pro imunoeseje a zpusob jeho prípravy, zpusob detekce infekce HIV a souprava pro imunodiagnostickou zkousku - Google Patents

Abstract

Je popsán pevný nosic pro imunoeseje, k nemuz je pripojena alespon jedna protilátka proti jádru viru hepatitidy C (HCV) a alespon jeden izolovaný epitop HCV NS3/4a. Je popsán také zpusob jeho prípravy, zpusob detekce infekce HIV a souprava pro imunodiagnostickou zkousku.

Description

Pevný nosič pro imunoeseje a způsob jeho přípravy, způsob detekce infekce HIV a souprava pro imunodiagnostickou zkoušku

Oblast techniky

Tento vynález se obecně týká virové diagnostiky. Tento vynález se týká kombinačního stanovení antigen/protilátka pro přesnou diagnózu infekcí virem hepatitidy C. Vynález se konkrétně týká pevného nosiče pro imunoeseje a způsobu jeho přípravy, způsobu detekce infekce HIV a soupravy pro imunodiagnostickou zkoušku.

Dosavadní stav techniky

Virus hepatitidy C (HCV) je zásadní příčinou parenterální hepatitidy jiného typu než A a B (NANBH), která se většinou přenáší transfuzí krve a pohlavním stykem. Tento virus je přítomen u 0,4 až 2,0 % dárců krve. Chronická hepatitida se rozvine zhruba u 50 % infekcí a zhruba u 20 % infikovaných osob se vyvine cirhóza, která někdy vede k hepatocelulárnímu karcinomu. Proto má studium a kontrola této choroby lékařský význam.

Houghten a kol. jako první identifikovali a charakterizovali HCV jako příčinu NANBH. Virová genomová sekvence HCV je známa a jsou též k dispozici způsoby zjištění této sekvence. Viz: například zveřejnění mezinárodní přihlášky WO 89/04 669, WO 90/11 089 a WO 90/14 436. HCV má genom jednovláknové RNA 9,5 kb v kladném směru a patří do skupiny virů Flaviridae. Bylo identifikováno alespoň šest rozlišených avšak příbuzných genotypů HCV na základě fylogenetických analýz [Simmonds a kol., J. Gen. Virol., 74, 2391-2399 (1993)]. Virus kóduje jednotlivý polyprotein mající více než 3000 aminokyselinových zbytků [Choo a kol., Science, 244, 359-362 (1989), Choo a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 2451-2455 (1991), Han a kol.. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 1711-1715 (1991)]. Polyprotein se zpracovává kotranslačně a posttranslačně na strukturní a nestrukturní (NS) proteiny.

Konkrétně, jak ukazuje obrázek 1, se několik proteinů kóduje HCV genomem. Pořadí a nomenklatura produktů štěpení HCV polyproteinu je následující: NH₂-C-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4aNS4b-NS5a-NS5b-COOH. Počáteční štěpení polyproteinu se katalyzuje proteasami hostitele, které uvolňují tři strukturní proteiny, N-terminální nukleokapsidový protein (zvaný „jádro“) a glykoproteiny obálky, „El“ (též známé jako E) a „E2“ (též známé jako E2/NS1), stejně tak jako nestrukturní (NS) proteiny obsahující virové enzymy. Oblasti NS se nazývají NS2, NS3, NS4 aNS5. NS2 je protein integrální membrány s proteolytickou aktivitou. NS2, buď samotný, nebo v kombinaci sNS3, štěpí vazbu NS2, NS3, čímž se dále tvoří konec N NS3 a uvolňuje se velký polyprotein, který zahrnuje aktivity serin proteasy a RNA helikasy. NS3 proteasa slouží pro zpracování zbývajícího polyproteinu. Dokončení zrání polyproteinu začíná autokatalytickým štěpením spojení NS3-NS4a katalyzovaným NS3 serin proteasou. Následující štěpení HCV polyproteinu zprostředkovaná NS3 zahrnují rozpoznání míst štěpení polyproteinu molekulou NS3 jiného polypeptidu. V těchto reakcích uvolňuje NS3 kofaktor NS3 (NS4a), dva proteiny (NS4b a NS5a) a RNA-dependentní RNA polymerasu (NS5b).

Popisuje se řada obecných a specifických polypeptidů použitelných jako imunologické a diagnostické prostředky pro HCV odvozených od HCV polyproteinu. Viz například Houghton a kol., evropská přihláška EP 318 216 a EP 388 232, Choo a kok, Science, 244, 359-362 (1989), Kuo a kol.. Science, 244, 362-364 (1989), Houghton a kol., Hepatology, 14, 381-388 (1991), Chien a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 10011-10015 (1992), Chien a kol., J. Gastroent. Hepatol., 8, S33-39 (1993), Chien a kol, mezinárodní přihláška WO 93/00 365, D. Y. Chien mezinárodní přihláška WO 94/01 778. Tyto přihlášky poskytují rozsáhlý základ pojednávající obecně o HCV stejně tak jako o přípravě a použití HCV polypeptidových imunologických reakčních prostředků.

- 1 CZ 304185 Β6

Citlivé a specifické způsoby pro screening a identifikaci nosičů HCV a HCV kontaminované krve či krevních produktů by poskytly důležitý pokrok v lékařství. Posttransfuzní hepatitida (PTH) se vyskytuje zhruba u 10 % pacientů po transfuzi a HCV odpovídá za 90 % těchto případů. Péče o pacienty stejně tak jako o prevenci přenosu HCV krví a krevními produkty nebo těsným osobním kontaktem vyžaduje diagnostické a prognostické prostředky. Existuje několik způsobů rozboru pro serodiagnózu infekce HCV. Viz například Choo a kol., Science, 244, 359-362 (1989), Kuo a kol., Science, 244, 362-364 (1989), Choo a kol., Br. Med. Bull., 46, 423-441 (1990), Ebeling a kol., Lancet, 335, 982-983 (1990), van der Poel a kol., Lancet, 335, 558-560 (1990), van der Poel a kol., Lancet, 337, 317-319 (1991), D. Y. Chien, mezinárodní přihláška WO 94/01 778, Valenzuela a kol., mezinárodní přihláška WO 97/44 469 a Kashiwakuma a kol., patent US 5 871 904.

Značným problémem při rozborech založených na krevním séru je dlouhý interval mezi infekcí a detekcí viru, který často překračuje 80 d. Tento interval může představovat pro příjemce krevní transfuze značné riziko. Pro překonání tohoto problému slouží vypracované testy založené na nukleových kyselinách (NAT) detekující přímo virovou ribonukleovou kyselinu a testy antigenu jádra HCV, které stanovují virový antigen místo protilátkové odpovědi. Víz například Kashiwakuma a kol., patent US 5 871 904, Beld a kol., Transfusion, 40, 575-579 (2000).

Dokument WO 94/25 601 popisuje nové sekvence žňových HCV genotypů. Tento dokument popisuje imunoeseje založené na nukleové kyselině a založené na antigenu, pro detekci a potenciální rozlišení HCV genotypů. Uvedený dokument však nepopisuje ani nenavrhuje kombinační imunoesej antigenu či protilátky.

Dokument EP 696 640 popisuje nový rekombinantní antigen zNS3 regionu HCV a jeho použití při imunoesejích. Uvedený patent nepopisuje ani nenavrhuje kombinační imunoesej antigenu či protilátky.

Dokument US 5 683 684 popisuje kombinace HCV antigenů pro použití v imunoesejích. Uvedený US patent však nepopisuje ani nenavrhuje kombinační imunoesej antigenu či protilátky.

Dokument EP 318 216 popisuje HCV polyprotein a kódující polynukleotid. Tento patent také popisuje nukleotidové sondy, antigeny, protilátky a imunoeseje používající takové sondy, protilátky atd. Uvedený patent však nepopisuje ani nenavrhuje kombinační imunoesej antigenu či protilátky.

Zůstává však potřeba citlivého diagnostického a prognostického způsobu zajišťujícího adekvátní péči o pacienta, stejně tak jako prevenci přenosu HCV krví a krevními produkty nebo těsným osobním kontaktem.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je pevný nosič pro imunoeseje, jehož podstata spočívá v tom, že se k němu připojuje alespoň jedna protilátka proti jádru viru hepatitidy C (HCV) a alespoň jeden izolovaný epitop HCV NS3/4a, přičemž epitop NS3/4a je konformační epitop a obsahuje sekvenci aminokyseliny znázorněnou na obrázcích 4A až 4D, s výhodu se k němu připojují alespoň dvě protilátky proti jádru HCV.

Předmětem tohoto vynálezu je také pevný nosič pro imunoeseje, jehož podstata spočívá v tom, že se kněmu připojují dvě monoklonální protilátky proti jádru viru hepatitidy C (HCV) a HCV N3/4a konformační epitop zahrnující aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 4A až 4D.

Předmětem tohoto vynálezuje rovněž pevný nosič pro imunoeseje, jehož podstata spočívá v tom, že se k němu připojují dvě monoklonální protilátky proti jádru viru C (HCV), HCV N3/4a konformační epitop zahrnující aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 4A až 4D a antigen vzniklý spojením více epitopů zahrnující aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 7A až 7F.

Dalším předmětem tohoto vynálezuje způsob detekce infekce virem hepatitidy C (HCV) v biologickém vzorku, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje následující kroky:

(a) zajištění prvního nosiče pro imunoeseje popsaného na samém začátku kapitoly podstata vynálezu, (b) spojení biologického vzorku s tímto pevným nosičem za podmínek umožňujících HCV antigenům a protilátkám, pokud se vyskytují v biologickém vzorku, vázat se s alespoň jednou protilátkou proti jádru respektive s epitopem NS3/4a, (c) přidání pevného nosiče z kroku (b) za podmínek tvorby komplexu (i) první detekovatelné značené protilátky, kde tato první detekovatelné značená protilátka je detekovatelné značená protilátka proti jádru HCV, kde tato značená protilátka proti jádru se zaměřuje proti jinému epitopu jádra HCV než alespoň jedna protilátka proti jádru vázaná na pevný nosič, (ii) antigenu, který reaguje s protilátkou HCV z biologického vzorku reaktivní s epitopem NS3/4a a (iii) druhé detekovatelné značené protilátky, kde tato druhá detekovatelné značená protilátka je reaktivní s antigenem (ii), (d) detekci komplexů vytvořených protilátkami a antigeny, pokud kjejich tvorbě dochází, jako indikaci infekce HCV v biologickém vzorku.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je také způsob detekce infekce virem C (HCV) v biologickém vzorku, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje následující kroky:

(a) zajištění pevného nosiče pro imunoeseje popsaného jako výhodné provedení v prvním odstavci na samém začátku kapitoly podstata vynálezu, (b) spojení biologického vzorku s tímto pevným nosičem za podmínek umožňujících, aby se HCV antigeny a protilátky, pokud se vyskytují v biologickém vzorku, vázaly na alespoň dvě protilátky proti jádru respektive epitop NS3/4a, (c) přidání k pevnému nosiči z kroku (b) za podmínek tvorby komplexu (i) první detekovatelné značené protilátky, kde tato první detekovatelné značená protilátka je detekovatelné značenou protilátkou proti jádru HCV, kde tato značená protilátka proti jádru se zaměřuje proti jinému epitopu jádra HCV než alespoň dvě protilátky proti jádru vázané na pevný nosič, (ii) epitopu z oblasti c33c polyproteinu HCV připojeného na aminokyselinovou sekvenci hSOD a (iii) druhé detekovatelné značené protilátky, kde tato druhá detekovatelné značená protilátka je reaktivní s aminokyselinovou sekvencí hSOD, (d) detekci komplexů vytvořených mezi protilátkami a antigeny, pokud se tvoří, jako indikaci infekce HCV v biologickém vzorku.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je také způsob detekce infekce virem hepatitidy c (HCV) v biologickém vzorku, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje následující kroky:

(a) zajištění pevného nosiče pro imunoeseje podle druhého odstavce kapitoly podstata vynálezu,

- J CZ 304185 B6 (b) spojení biologického vzorku s tímto pevným nosičem za podmínek umožňujících, aby se HCV antigeny a protilátky, pokud se vyskytují v biologickém vzorku, vázaly na alespoň dvě protilátky proti jádru respektive konformační epitop NS3/4a, (c) přidání k pevnému nosiči z kroku (b) za podmínek tvorby komplexu (i) první detekovatelně značené protilátky, kde tato první detekovatelně značená protilátka je detekovatelně značenou protilátkou proti jádru HCV, kde tato značená protilátka proti jádru se zaměřuje proti jinému epitopu jádra HCV než alespoň dvě protilátky proti jádru vázané na pevný nosič, (ii) epitopu z oblasti c33c polyproteinu HCV připojeného na aminokyselinovou sekvenci hSOD a (iii) druhé detekovatelně značené protilátky, kde tato druhá detekovatelně značená protilátka je reaktivní s aminokyselinovou sekvencí hSOD, (d) detekci komplexů vytvořených mezi protilátkami a antigeny, pokud se tvoří, jako indikaci infekce HCV v biologickém vzorku.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je rovněž způsob detekce infekce virem hepatitidy C (HCV) v biologickém vzorku, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje následující kroky:

(a) zajištění pevného nosiče pro imunoeseje, popsaného na samém začátku kapitoly podstata vynálezu, který dále obsahuje připojený antigen vzniklý spojením více epitopů, (b) spojení biologického vzorku s tímto pevným nosičem za podmínek umožňujících HCV antigenům a protilátkám, pokud se vyskytují v biologickém vzorku, vázat se s alespoň jednou protilátkou proti jádru, epitopem NS3/4a a antigenem vzniklým spojením více epitopů, (c) přidání k pevnému nosiči z kroku (b) za podmínek tvorby komplexu (i) první detekovatelně značené protilátky, kde tato první detekovatelně značená protilátka je detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV, kde tato značená protilátka proti jádru se zaměřuje proti jinému epitopu jádra HCV než alespoň jedna protilátka proti jádru vázané na pevný nosič, (ii) prvního a druhého antigenu, který reaguje s protilátkou HCV z biologického vzorku reaktivní s epitopem NS3/4a respektive s antigenem vzniklým spojením více epitopů a (iii) druhé detekovatelně značené protilátky, kde tato druhá detekovatelně značená protilátka je reaktivní s antigeny (ii), (d) detekci komplexů vytvořených mezi protilátkami a antigeny, pokud k jejich tvorbě dochází, jako indikaci infekce HCV v biologickém vzorku.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je taktéž způsob detekce infekce virem C (HCV) v biologickém vzorku, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje následující kroky:

(a) zajištění pevného nosiče pro imunoeseje podle třetího odstavce kapitoly podstata vynálezu, (b) spojení biologického vzorku s tímto pevným nosičem za podmínek umožňujících, aby se HCV antigeny a protilátky, pokud se vyskytují v biologickém vzorku, vázaly na alespoň dvě protilátky proti jádru, konformační epitop NS3/4a, respektive antigen vzniklý spojením více epitopů, (c) přidání k pevnému nosiči z kroku (b) za podmínek tvorby komplexu (i) první detekovatelně značené protilátky, kde tato první detekovatelně značená protilátka je detekovatelně značenou protilátkou proti jádru HCV, kde tato značená protilátka proti jádru se zaměřuje proti jinému epitopu jádra HCV než alespoň dvě protilátky proti jádru vázané na pevný nosič, (ii) epitopu z oblasti c33c polyproteinu HCV připojeného na aminokyselinovou sekvenci hSOD a epitopu z oblasti c22 polyproteinu HCV připojeného na aminokyselinovou sekvenci hSOD (iii) druhé detekovatelně značené protilátky, kde tato druhá detekovatelně značená protilátka je reaktivní s aminokyselinovou sekvencí hSOD,

-4CZ 304185 B6 (d) detekci komplexů vytvořených mezi protilátkami a antigeny, pokud se tvoří, jako indikaci infekce HCV v biologickém vzorku.

Ještě dalším předmětem tohoto vynálezu je souprava pro imunodiagnostické zkoušky, jehož: podstata spočívá v tom, že obsahuje kterýkoli pevný nosič pro imunoeseje popsaný výše nebo jeho výhodné provedení a pokyny pro provádění imunodiagnostické zkoušky.

Ještě jiným předmětem tohoto vynálezu je způsob přípravy pevného nosiče, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje:

(a) zajištění pevného nosiče a (b) vazbu alespoň jedné protilátky proti jádru viru hepatitidy C (HCV) a alespoň jednoho izolovaného HCV NS3/4a konformačního epitopu, který obsahuje sekvenci aminokyselin znázorněnou na obrázcích 4A až 4D.

Předmětem tohoto vynálezu je konečně způsob přípravy pevného nosiče pro imunoeseje, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje:

(a) zajištění pevného nosiče a (b) vazbou dvou protilátek proti jádru viru hepatitidy C (HCV) a izolovaného HCV NS3/4a konformačního epitopu, který obsahuje sekvenci aminokyselin znázorněnou na obrázcích 4A až 4D.

Dále se uvádějí podrobnější údaje, které dokreslují a blíže upřesňují svrchu popsanou podstatu vynálezu. Jsou také popsána výhodná provedení předmětného vynálezu.

Tento vynález se částečně zakládá na zjištění, že protilátky serokonverze HCV jsou obvykle protilátkami proti jádru a proti NS3 (helikase). V souladu stím tento vynález poskytuje kombinační rozbor antigenů jádra HCV a protilátky NS3 detekující antigeny HCV i protilátky přítomné ve vzorku s použitím jednoho tuhého nosiče.

Proto se v jednom svém ztělesnění tento vynález zaměřuje na pevný nosič pro imunoesej obsahující alespoň jednu protilátku proti jádru HCV a alespoň jeden izolovaný epitop HCV NS3/4a připojený k tomuto nosiči. Protilátka a epitop NS3/4a může být kterákoliv z molekul, které se zde popisují. Navíc může pevný nosič zahrnovat kterýkoliv z antigenů obdržených spojením více epitopu, které se zde popisují, jako je antigen obdržený spojením více epitopů zahrnující aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 7A až 7F.

V určitých ztělesněních jsou na pevný nosič připojené alespoň dvě protilátky proti jádru. Dále může být protilátkou proti jádru monoklonální protilátka. Navíc může být epitop NS3/4a konformační epitop, jako je konformační epitop NS3/4a zahrnující aminokyselinovou sekvenci zobrazenou na obrázcích 4A až 4D.

V dalším ztělesnění se tento vynález zaměřuje na pevný nosič pro imunoesej, ke kterému se připojují alespoň dvě monoklonální protilátky proti jádru HCV a alespoň jeden konformační epitop NS3/4a HCV s aminokyselinovou sekvencí znázorněnou na obrázcích 4A až 4D.

V dalším ztělesnění se tento vynálezu zaměřuje na způsob detekce infekce HCV v biologickém vzorku. Tento způsob zahrnuje (a) zajištění pevného nosiče pro imunoesej, jak se popisuje výše, (b) kombinaci biologického vzorku s tímto pevným nosičem za podmínek, které umožní antigenům HCV a protilátkám, pokud se vyskytují v biologickém vzorku, vazbu na alespoň jednu protilátku proti jádru respektive epitopu NS3/4a, (c) přidání pevného nosiče z kroku (b) za podmínek tvorby komplexu (i) první detekovatelně značené protilátky, kde tato první detekovatelně značená

-5CZ 304185 B6 protilátka je detekovatelně značenou protilátkou proti jádru HCV, kde tato značená protilátka proti jádru je zaměřená proti jinému epitopu jádra HCV než alespoň jedna protilátka proti jádru vázaná na pevný nosič, (ii) antigenu, který reaguje s protilátkou HCV z biologického vzorku reaktivního s epitopem NS3/4a a (iii) druhé detekovatelně značené protilátky, kde tato druhá detekovatelně značená protilátka je reaktivní s antigenem (ii) a (d) detekci komplexů vytvořených mezi protilátkami a antigeny, pokud jsou přítomny, jako indikaci infekce HCV v biologickém vzorku. Epitop NS3/4a může být konformačním epitopem, jako je konformační epitop mající sekvenci NS3/4a znázorněnou na obrázcích 4A až 4D.

V dalším ztělesnění se tento vynález zaměřuje na způsob detekce infekce HCV v biologickém vzorku. Tento způsob zahrnuje (a) poskytnutí pevného nosiče pro imunoesej s alespoň dvěma protilátkami proti jádru HCV připojenými na tento nosič, jak se popisuje výše, (b) kombinaci biologického vzorku s pevným nosičem za podmínek umožňujících antigenům HCV a protilátkám, pokud se vyskytují v biologickém vzorku, vazbu na alespoň dvě protilátky proti jádru respektive epitop NS3/4a, (c) přidání k pevnému nosiči z kroku (b) za podmínek tvorby komplexu (i) první detekovatelně značené protilátky, kde tato první detekovatelně značená protilátka je detekovatelně značenou protilátkou proti jádru HCV, kde tato značená protilátka proti jádru se zaměřuje proti jinému epitopu jádra HCV než protilátky proti jádru vázané na pevný nosič, (ii) epitopu z oblasti c33c polyproteinu HCV připojeného na aminokyselinovou sekvenci hSOD a (iii) druhé detekovatelně značené protilátky, kde tato druhá detekovatelně značená protilátka je reaktivní s aminokyselinovou sekvencí hSOD a (d) detekci komplexů vytvořených mezi protilátkami a antigeny, pokud jsou přítomny, indikující infekci HCV v biologickém vzorku. Epitop NS3/4a může být konformačním epitopem, jako je konformační epitop mající sekvenci NS3/4a znázorněnou na obrázcích 4A až 4D.

Ve kterémkoliv zvýše popsaných ztělesnění může být protilátka proti jádru zaměřená proti Nterminální oblasti antigenu jádra HCV, jako například proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1, a/nebo může být detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV zaměřená proti C-terminální oblasti antigenu jádra HCV, jako jsou aminokyseliny 120 až 130 HCV, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1. Navíc může být antigen reagující s protilátkou HCV biologického vzorku z oblasti NS3, jako je epitop c33c oblasti HCV polyproteinu a může být spojen s lidskou aminokyselinovou sekvencí superoxid dismutasy (hSOD). V tomto ztělesnění je druhá detekovatelně značená protilátka reaktivní s aminokyselinovou sekvencí hSOD.

V dalším ztělesnění tohoto vynálezu je způsob detekce infekce HCV v biologickém vzorku. Tento způsob zahrnuje (a) zajištění pevného nosiče pro imunoeseje včetně monoklonálních protilátek proti jádru HCV a konformačního epitopu zahrnujícího aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 4A až 4D, (b) kombinaci biologického vzorku s pevným nosičem za podmínek umožňujících vazbu HCV antigenu a protilátek, pokud se vyskytují ve vzorku, s alespoň dvěma protilátkami proti jádru a konformačním epitopem NS3/4a, přidání pevného nosiče z kroku (b) za podmínek tvorby komplexu (i) první detekovatelně značené protilátky, kde tato první detekovatelně značená protilátka je detekovatelně značenou protilátkou proti jádru HCV, kde tato značená protilátka proti jádru se zaměřuje proti jinému epitopu jádra HCV než alespoň dvě protilátky proti jádru vázané na pevný nosič, (ii) epitopu z oblasti c33c polyproteinu HCV připojeného na aminokyselinovou sekvenci hSOD a (iii) druhé detekovatelně značené protilátky, kde tato druhá detekovatelně značená protilátka je reaktivní s popsanou aminokyselinovou sekvencí hSOD, a detekci komplexů mezi protilátkami a antigeny, pokud jsou přítomny, indikující infekci HCV v biologickém vzorku.

V určitých ztělesněních jsou alespoň dvě protilátky proti jádru zaměřené proti N-terminální oblasti antigenu jádra HCV, jako je oblast aminokyselin 10 až 53 HCV, číslováno vzhledem k polyproteinu HCV1 a detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV je zaměřená proti Cterminální oblasti antigenu jádra HCV, jako je oblast aminokyselin 120 až 130 HCV, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1.

-6CZ 304185 B6

V dalším ztělesnění se tento vynález zaměřuje na způsob detekce infekce HCV v biologickém vzorku. Tento způsob zahrnuje (a) zajištění pevného nosiče pro imunoesej zahrnujícího antigen obdržený spojením více epitopů, (b) kombinaci biologického vzorku s tímto pevným nosičem za podmínek umožňujících vazbu HCV antigenu a protilátek, pokud jsou v biologickém vzorku, s alespoň jednou protilátkou proti jádru, epitopem NS3/4a a antigenem obdržením spojením více epitopů, (c) přidání k pevnému nosiči z kroku (b) za podmínek tvorby komplexu (i) první detekovatelně značené protilátky, kde touto první detekovatelně značenou protilátkou je detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV, kde značená protilátka proti jádru je zaměřená proti jinému epitopů jádra HCV než alespoň jedna protilátka proti jádru vázané na pevný nosič, (ii) prvního a druhého antigenu reagujícího s protilátkou HCV z biologického vzorku reaktivní s epitopem NS3/4a a antigenem obdrženým spojením více epitopů a (iii) druhé detekovatelně značené protilátky, kde tato druhá detekovatelně značená protilátka je reaktivní s antigeny (ii), (d) detekci komplexů tvořených mezi protilátkami a antigeny, pokud jsou ve vzorku, indikující infekci HCV biologického vzorku.

Protilátka proti jádru se může zaměřovat proti N-terminální oblasti antigenu jádra HCV a první detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV se může zaměřovat proti C-terminální oblasti antigenu jádra HCV, jak se popisuje výše. Dále může první antigen reagující s protilátkou HCV z biologického vzorku obsahovat epitop z oblasti c33c polyproteinu HCV a může být spojený s aminokyselinovou sekvencí hSOD. V této souvislosti je druhá detekovatelně značená protilátka reaktivní s aminokyselinovou sekvencí hSOD. Navíc druhý antigen reagující s protilátkou HCV z biologického vzorku může obsahovat epitop z oblasti c22 polyproteinu HCV, jako je epitop obsahující aminokyseliny Lysio až Ser₉₉ polyproteinu HCV s delecí Arg47 a substitucí Leu místo Trp v poloze 44, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1. Tento epitop může být spojený s aminokyselinovou sekvencí hSOD. Pokud je tomu tak, je druhá detekovatelně značená protilátka reaktivní s aminokyselinovou sekvencí hSOD. Antigen obdržený spojením více epitopů může obsahovat aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 7A až 7F.

V dalším ztělesnění se tento vynález zaměřuje na způsob detekce infekce HCV v biologickém vzorku, který zahrnuje (a) zajištění pevného nosiče pro imunoesej obsahujícího dvě monoklonální protilátky proti jádru HCV, konformační epitop HCV NS3/4a obsahující aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 4A až 4D a antigen obdržený spojením více epitopů obsahující aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 7A až 7F, které se k němu připojují, (b) kombinaci biologického vzorku s pevným nosičem za podmínek, které umožňují vazbu HCV antigenů a protilátek, pokud jsou v biologickém vzorku, s alespoň dvěma protilátkami proti jádru, s konformačním epitopem NS3/4a respektive antigenem s vícečetným spojením epitopů, (c) přidání k pevnému nosiči v kroku (b) za podmínek tvorby komplexu (i) první detekovatelně značené protilátky, kde tato první detekovatelně značená protilátka je detekovatelně značenou protilátkou proti jádru HCV, kde značená protilátka proti jádru se zaměřuje proti jinému epitopů jádra HCV než poslední dvě protilátky proti jádru vázané na pevný nosič, (ii) epitopů z oblasti c33c polyproteinu HCV připojené na aminokyselinovou sekvenci hSOD a epitopů z oblasti c22 polyproteinu HCV připojeného na aminokyselinovou sekvenci hSOD a (iii) druhé detekovatelně značené protilátky, kde tato druhá detekovatelně značená protilátka je reaktivní s aminokyselinovými sekvencemi hSOD, (d) detekci komplexů tvořených mezi protilátkami a antigeny, pokud jsou přítomné, jako indukci infekce HCV v biologickém vzorku.

V tomto ztělesnění se alespoň dvě protilátky proti jádru mohou zaměřovat proti N-terminální oblasti antigenu jádra HCV, jako proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslováno vzhledem k polyproteinu HCV1, a detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV se zaměřuje proti Cterminální oblasti antigenu jádra HCV, jako proti aminokyselinám 120 až 130 HCV, číslováno vzhledem k sekvenci polyproteinu HCV1. Navíc může epitop z oblasti c22 obsahovat aminokyseliny Lysio až Ser₉₉ polyproteinu HCV s delecí Arg47 a substitucí Leu místo Trp v poloze 44, číslováno vzhledem k sekvenci polyproteinu HCV1.

-7CZ 304185 B6

V dalších ztělesněních se tento vynález zaměřuje na imunodiagnostické soupravy obsahující pevný nosič pro imunoeseje popsaný výše a instrukce pro provádění imunodiagnostického testu.

V dalších ztělesněních se tento vynález zaměřuje na způsoby přípravy pevného nosiče pro imunoesej zahrnující (a) zajištění pevného nosiče a (b) vazbu alespoň jedné protilátky proti jádru HCV, jako je jedna, dvě či více protilátek a alespoň jednoho izolovaného připojeného epitopu HCV NS3/4a a případně antigenu obdrženého spojením více epitopů. Protilátky proti jádru, epitopy NS3/4a a antigeny s vícečetným spojením epitopů jsou podle popisu výše.

V dalších ztělesněních se tento vynález zaměřuje na antigen s vícečetným spojením epitopů zahrnující aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 7A až 7F nebo aminokyselinovou sekvenci s alespoň 80% sekvenční identitou, jako je 90% nebo vyšší sekvenční identita reagující specificky s protilátkami proti HCV přítomnými v biologickém vzorku z jednotlivce infikovaného HCV. V určitých ztělesněních se antigen s vícečetným připojením epitopu skládá z aminokyselinové sekvence popsané na obrázcích 5A až 5F.

V dalších ztělesněních se tento vynález zaměřuje na polynukleotid zahrnující kódovací sekvenci pro antigen s vícečetným spojením epitopů výše, rekombinantní vektory zahrnující polynukleotidy, hostitelské buňky transformované rekombinantními vektory a způsoby tvorby rekombinantního antigenu s vícečetným spojením epitopů zahrnující: (a) zajištění populace hostitelských buněk, jak se popisuje výše, a (b) pěstování populace buněk za podmínek, za kterých se exprimuje antigen obsahující spojení více epitopů kódovanou sekvencí přítomnou v rekombinantním vektoru.

Tyto a další aspekty tohoto vynálezu budou zřejmé při odkazu na následující podrobný popis a připojené výkresy.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 je diagramem znázorňujícím HCV genom s různými oblastmi polyproteinu, od kterých se odvozují reakční složky eseje (proteiny a protilátky).

Obrázek 2 je schématický výkres representativní kombinační eseje protilátka/antigen podle tohoto vynálezu.

Obrázek 3 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci reprezentativního NS3/4a konformačního antigenu pro použití v těchto esejích. Zvýrazněný alanin v poloze 182 nahrazuje nativní serin, který se normálně vyskytuje v této poloze.

Obrázky 4A až 4D znázorňují deoxyribonukleotidovou kyselinu a odpovídající aminokyselinovou sekvenci dalšího reprezentativního NS3/4a konformačního antigenu pro použití v těchto esejích. Aminokyseliny v polohách 403 a 404 obrázků 4A až 4D představují substituce Pro místo Thr a lle místo Ser nativní aminokyselinové sekvence HCV-1.

Obrázek 5 je diagram konstrukce pd.HCVla.ns3ns4aPI.

Obrázek 6 je diagram znázorňující MEFA 12.

Obrázky 7A až 7F znázorňují deoxyribonukleotidovou kyselinu a odpovídající aminokyselinovou sekvenci MEFA.

Obrázek 8 je schématický výkres reprezentativní imunoeseje podle tohoto vynálezu s použitím MEFA 12.

-8CZ 304185 B6

Příklady provedení vynálezu

Následuje podrobný popis vynálezu.

Praxe tohoto vynálezu používá, pokud se nepopisuje jinak, konvenční způsoby chemie, biochemie, způsoby s rekombinantní deoxyribonukleovou kyselinou a způsoby imunologie v rámci současné znalosti oboru. Tyto způsoby se plně vysvětlují v literatuře. Viz například Fundamental Virology, 2. vydání, díl I & II (Β. N. Fields a D. M. Knipe, red.), Handbook of Experimental Immunology, díly I až IV (D. M. Weir a C. C.Blackwell, red., Blackwell Scientific Publications), Τ. E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, 1993), A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, lne., current addition), Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. vydání, 1989), Methods in Enzymology (S. Colowick aN. Kaplan, red., Academie Press, Inc).

Je třeba poznamenat, že v tomto popisu a připojených nárocích zahrnují singulární formy odkazy na množné číslo, pokud zřejmě obsah neurčuje jinak. Takže například odkaz na „antigen“ zahrnuje směs dvou či více antigenů a podobně.

V celém textu se používají následující zkratky aminokyselin.

Alanin: Ala (A)

Asparagin: Asn (N)

Cystein: Cys (C)

Kyselina glutamová: Glu (E) Histidin: His (H)

Leucin: Leu (L)

Methionin: Met (M)

Prolin: Pro (P)

Threonin: Thr (T)

Tyrosin: Tyr (Y)

I. Definice

Arginin: Arg (R)

Kyselina asparagová: Asp (D) Glutamin: Gin (Q)

Glycin: Gly (G)

Isoleucin: Ile (I)

Lysin: Lys (K)

Fenylalanin: Phe (F)

Serin: Ser (S)

Tryptofan: Trp (W)

Valin: Val (V)

Při popisu tohoto vynálezu se používají následující pojmy, jejichž význam je podle definice popsané níže.

Pojmy „polypeptid“ a „protein“ se vztahují k polymeru aminokyselinových zbytků a nejsou omezené minimální délkou produktu. Peptidy, oligopeptidy, dimerv, multimery a podobně se zahrnují do této definice. Definice zahrnuje proteiny plné délky i fragmenty. Tyto pojmy též zahrnují postexpresní modifikace polypeptidu, například glykosylací, acetylaci, fosforylaci a podobně. Dále se pro účely tohoto vynálezu pojem „polypeptid“ vztahuje k proteinu zahrnujícímu modifikace, jako jsou delece, adice a substituce (obecně konzervativní svou povahou) nativní sekvence, pokud protein zachovává požadovanou aktivitu. Tyto modifikace mohou být úmyslné, jako je tomu prostřednictvím mutageneze směrované na místo, nebo mohou být náhodné, jako je tomu prostřednictvím mutací hostitele poskytujících proteiny, nebo chyby následkem amplifikace PCR.

Polypeptid HCV je polypeptid, jak se definuje výše, odvozený od polyproteinu HCV. Tento polypeptid nemusí být fyzicky odvozený od HCV, avšak může být vytvořený synteticky či rekombinačně. Navíc tento polypeptid může být odvozený od kteréhokoliv z kmenů HCV, jako jsou kmeny 1, 2, 3 nebo 4. Je známá řada zachovaných a proměnných oblastí mezi těmito kmeny

-9CZ 304185 B6 a obecně aminokyselinové sekvence epitopů odvozené od těchto oblastí budou mít vysoký stupeň sekvenční homologie, to jest homologii aminokyselinové sekvence více než 30 %, přednostně více než 40 % při seřazení sekvencí. Pojem „NS3/4a“ polypeptid se tedy vztahuje k nativnímu NS3/'4a z kteréhokoliv z různých kmenů HCV stejně tak jako k analogům NS3/4a, muteinům a imunogenním fragmentům, jak se definují níže. Jsou známy úplné genotypy mnohého z těchto kmenů. Viz například patent US 6 150 087 a GenBank Accesion č. AJ238800 a AJ238799.

Pojmy „analog“ a „mutein“ se týkají biologicky aktivních derivátů referenční molekuly nebo fragmentů těchto derivátů, které zachovávají požadovanou aktivitu, jako je imunoreaktivita v esejích, které se zde popisují. Obecně se pojem „analog“ týká sloučenin majících nativní polypeptidovou sekvenci a strukturu s adicí jedné či více aminokyselin, substitucemi (obecně svou povahou konzervativními) a/nebo delecemi oproti nativní molekule, pokud tyto modifikace neničí imunogenní aktivitu. Pojem „mutein“ se týká peptidů majících jedno či více peptidových mimetik („peptoidů“), jak se popisují v mezinárodní publikaci WO 91/04 282. Přednostně má analog či mutein alespoň stejnou imunoaktivitu jako nativní molekula. Způsoby přípravy polypeptidových analogů a muteinů jsou známy v oboru a popisují se dále níže.

Zvláště preferované analogy zahrnují substituce, které jsou svou povahou konzervativní, to jest takové substituce, které nastávají ve skupině aminokyselin příbuzných ve svých postranních řetězcích. Konkrétně se aminokyseliny dělí do 4 skupin: (1) kyselé - aspartát a glutamát, (2) bazické - lysin, arginin, histidin, (3) nepolární - alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, methionin, tryptofan a (4) polární bez náboje - glycin, asparagin, glutamin, cystein, serin, threonin, tyrosin. Fenylalanin, tryptofan a tyrosin se někdy klasifikují jako aromatické aminokyseliny. Například lze rozumně předvídat, že izolovaná náhrada leucinu isoleucinem nebo valinem, aspartátu glutamátem, threoninu serinem nebo podobná konzervativní náhrada aminokyseliny strukturně příbuznou aminokyselinou nebude mít velký účinek na biologickou aktivitu. Například může daný polypeptid zahrnovat až zhruba 5 až 10 konzervativních či nekonzervativních aminokyselinových substitucí nebo dokonce až zhruba 15 až 25 konzervativních nebo nekonzervativních aminokyselinových substitucí nebo jakékoliv celé číslo mezi 5 až 25, pokud zůstává požadovaná funkce molekuly neporušená. Ten, kde má zkušenost v boru, může snadno určit oblasti dané molekuly, které mohou tolerovat změnu s odkazem na grafy Hopp/Woods a Kyte-Doolittle dobře známé v oboru.

„Fragmentem“ se rozumí polypeptid skládající se pouze zčásti intaktní polypeptidové sekvence a struktury plné délky. Fragment může zahrnovat C-terminální deleci a/nebo N-terminální deleci nativního polypeptidu. „Imunogenní fragment“ daného proteinu HCV bude obecně zahrnovat alespoň 5 až 10 souvisejících aminokyselinových zbytků molekuly plné délky, přednostně alespoň zhruba 15 až 25 souvisejících aminokyselinových zbytků molekuly plné délky a nejpřednostněji alespoň zhruba 20 až 50 či více souvisejících aminokyselinových zbytků molekuly plné délky, které definují epitop, nebo jakýkoliv počet mezi 5 aminokyselinami a sekvencí plné délky s podmínkou, že daný fragment zachovává imunoreaktivitu v esejích, které se zde popisují. Preferované imunogenní fragmenty například zahrnují, avšak bez omezení, fragmenty jádra HCV obsahující například aminokyseliny 10 až 45, 10 až 53, 67 až 88 a 120 až 130 polyproteinu, epitop 5-1-1 (v oblasti NS3 virového genomu) stejně tak jako epitopy odvozené od oblastí El, E2, c33c (NS3), clOO (NS4), NS3/4a a NS5 polyproteinu HCV, stejně tak jako kterýkoliv z dalších epitopů identifikovaných z polyproteinu HCV. Viz například Chien a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 10011-10015 (1992), Chien a kol., J. Gastroent. Hepatol., 8, S33-39 (1993), Chien a kol., mezinárodní publikace WO 93/00 365, Chien, D. Y., mezinárodní přihláška WO 94/01 778, patenty US 6 150 087 a US 6 121 020.

Pojem „epitop“, jak se zde používá, se týká sekvence alespoň zhruba 3 až 5 přednostně zhruba 5 až 10 či 15 a ne více než zhruba 1000 aminokyselin (nebo sekvence o jakémkoliv počtu mezi těmito hodnotami), která definuje sekvenci, která je sama částí větší sekvence a váže se na protilátku vytvořenou na základě odpovědi na tuto sekvenci. Neexistuje žádná kritická horní mezi na délku fragmentu, který může obsahovat proteinovou sekvenci téměř plné délky nebo dokonce

- 10CZ 304185 B6 spojený protein zahrnující dva či více epitopů polyproteinu HCV. Epitop používaný v rámci tohoto vynálezu se neomezuje na polypeptid mající přesnou sekvenci části mateřského proteinu, ze kterého se odvozuje. Virové genomy jsou skutečně ve stavu konstantního toku a obsahují několik proměnných domén vykazujících relativně vysoké stupně variability mezi izolovanými částmi. Proto pojem epitop zahrnuje sekvence identické s nativní sekvenci stejně tak jako modifikace nativní sekvence, jako jsou delece, adice a substituce (obecně svou povahou konzervativní).

Oblasti daného polypeptidu zahrnující epitop lze identifikovat s použitím řady způsobů mapování epitopů dobře známých v oboru. Viz například Epitop Mapping Protocols v monografii Methods in Molecular Biology, díl 66 (Glenn E. Morris, redakce, 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Například lineární epitopy lze stanovit současnou přípravou velkého počtu peptidů na pevných nosičích, kde peptidy odpovídají částem molekuly proteinu, a reakcí peptidu s protilátkami, při které peptidy zůstávají připojené na nosiče. Tyto způsoby jsou známé v oboru a popisují se například v patentu US 4 708 871, Geyesn a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81, 39984002 (1984), Geysen a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 82, 172-182 (1985), Geyes a kol., Molec. Immunol., 23, 709-715 (Ί986).

S použitím těchto způsobů se identifikuje řada epitopů HCV. Viz například Chien a kol., Viral Hepatitis and Liver Disease, str. 320-324 (1994) a další níže. Podobně se snadno identifikují konformační epitopy stanovením prostorové konformace aminokyselin, například rentgenovou krystalografií a dvojrozměrnou nukleární magnetickou rezonancí. Viz například Epitope Mapping Protocols, výše. Antigenní oblasti proteinů lze též identifikovat s použitím standardních vynesení antigenního působení a hydropatie, jako jsou výpočty s použitím například programového vybavení Omiga verze 1.0 od Oxford Molecular Group. Tento počítačový program využívá způsob Hopp/Woods, Hopp a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 78, 3824-3828 (1981) pro stanovení antigenního působení a způsob Kyte-Doolittie, Kyte a kol., J. Mol. Biol., 157, 105-132 (1982) pro vynesení hydropatie.

Pojem „konformační epitop“, jak se zde používá, se týká části proteinu plné délky nebo analogu či muteinu tohoto proteinu majícího strukturní vlastnosti nativní jako aminokyselinová sekvence kódující epitop v rámci přirozeného proteinu plné délky. Nativní strukturní vlastnosti zahrnují, avšak bez omezení, glykosylaci a trojrozměrnou strukturu. Délka epitopu definující sekvenci může být předmětem širokých změn, neboť se uvažuje, že tyto epitopy se vytvářejí trojrozměrným tvarem antigenu (například skládáním). Proto stačí relativně málo aminokyselin pro definici epitopu, avšak jsou široce rozptýleny podél délky molekuly (nebo dokonce na různých molekulách v případě dimerů, atd.) s tvorbou správné konformace epitopu skládáním. Části antigenu mezi zbytky definujícími epitop nemusí být pro konformační strukturu epitopu kritické. Například delece či substituce těchto zasahujících sekvencí nemusí ovlivňovat konformační epitop s podmínkou, že sekvence kritické pro konformaci epitopu jsou zachované (například cysteiny účastnící se disulfidových vazeb, místa glykosylace atd.).

Konformační epitopy přítomné v oblasti NS3/4a se snadno identifikují s použitím výše diskutovaných způsobů. Navíc přítomnost či nepřítomnost konformačního epitopu v daném polypeptidu lze snadno stanovit screeningem antigenu protilátkou (polyklonálním sérem či monoklonálním vůči konformačnímu epitopu) a srovnáním reaktivity s případem denaturované verze antigenu, která zachovává nejvýše lineární epitopy. Při takovém screeningu s použitím polyklonálních protilátek může být výhodné absorbovat polyklonální sérum nejprve denaturovaným antigenem a pozorovat, zda zadržuje protilátky proti danému antigenu. Navíc v případě NS3/4a molekula zachovávající nativní konformaci bude též mít proteasové a případně i helikasové enzymatické aktivity. Tyto aktivity lze detekovat s použitím enzymatických analýz, jak se dále popisují níže.

Přednostně se konformační epitop tvoří rekombinačně a exprimuje se v buňce, ze které jej lze odstranit za podmínek zachovávajících jeho požadované strukturní funkce, například bez denaturace epitopu. Tyto buňky zahrnují bakterie, kvasinky, hmyzí a savčí buňky. Exprese a izolace

- 11 CZ 304185 B6 rekombinačních konformačních epitopů z polyproteinu HCV se popisuje například v mezinárodních přihláškách WO 96/04 301, WO 94/01 778, WO 95/3 053 a WO 92/08 734. Alternativně lze exprimovat antigeny a dále renaturovat protein po jeho získání. Uvažuje se, že chemická syntéza může též poskytnout konformační antigenové mimitopy vykazující zkříženou reakci s „nativním“ konformačním epitopem antigenu.

Pojem „vícečetný epitopový spojený antigen“ nebo „MEFA“, jak se zde používá, znamená polypeptid, ve kterém tvoří více HCV antigenů část jednoho spojitého řetězce aminokyselin, který se v přírodě nevyskytuje. HCV antigeny lze spojovat přímo navzájem peptidovými vazbami neboje lze oddělovat vloženými sekvencemi aminokyselin. Spojené antigeny mohou též obsahovat sekvence exogenní vůči HCV polyproteinu. Navíc mohou přítomné HCV sekvence vznikat z více genotypů a/nebo izolovaných částí HCV. Příklady konkrétních MEFA pro použití v imunoesejích podle tohoto vynálezu se podrobně popisují například v mezinárodní přihlášce. WO 97/44 469 a dále se popisují níže.

Pojem „protilátka“ znamená molekulu, která se chemicky nebo fyzikálně váže na daný polypeptid. Proto je protilátka jádra HCV molekula, která se specificky váže na protein jádra HCV. Pojem „protilátka“, jak se zde používá, zahrnuje protilátky obdržené z polyklonálních i monoklonálních přípravků, stejně tak jako hybridní (chimérické) protilátkové molekuly (viz například Winter a kol., Nátuře, 349, 293-299 (1991) a patent US 4 816 567, F(ab')₂ a F(ab) fragmenty, molekuly Fv (nekovalentní heterodimery, viz například Inbar a kol., Proč. Nati. Acad Sci USA, 69, 2659-2662 a Ehrich a kol., Biochem., 19, 4091-4096 (1980), molekuly Fv o jednom řetězci (sFv) (viz například Huston a kol., Proč. Nati. Acad. Sci, 85, 5879-5883 (1988), dimerní atrimerní konstrukty proti látkových fragmentů, miniprotilátky (viz například Pack a kol., Biochem., 31, 1579-1584 (1992), Cumber a kol., J. Immunology, 149B, 120-126 (1992), humanizované protilátkové molekuly (viz například Riechmann a kol., Nátuře, 332, 323-327 (1988), Verhoeyan a kol., Science, 239, UK 1534-1536 (1988) a patentová přihláška GB 2 276 169, publikovanou 21. září 1994) a jakékoliv funkční fragmenty obdržené z těchto molekul, kde tyto fragmenty zachovávají imunologické vazebné vlastnosti mateřské protilátkové molekuly.

Pojem „monoklonální protilátka“ se týká protilátkové složení majícího homogenní populaci protilátek. Tento termín se neomezuje na druh či zdroj protilátky ani se neomezuje způsobem, kterým vzniká. Proto tento termín zahrnuje protilátky obdržené z myších hybridomů stejně jako lidské monoklonální protilátky obdržené s použitím spíše lidských než myších hybridomů. Viz například Cote a kol., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 1985, str. 77.

„Rekombinační“ protein je protein, který zachovává svou požadovanou aktivitu a který byl připraven způsoby rekombinační deoxyribonukleové kyseliny, jak se zde popisuje. Obecně se daný gen klonuje a poté se exprimuje v transformovaných organismech, jak se dále popisuje níže. Hostitelský organismus exprimuje cizí gen s obdržením proteinu za podmínek exprese.

Pojem „izolovaný“ ve vztahu k polypeptidu znamená, že je daná molekula oddělená a diskrétní oproti celému organismu, ve kterém je tato molekula přítomná v přírodě, neboje přítomná v podstatě v nepřítomnosti jiných biologických makromolekul téhož typu. Pojem „izolovaný“ v souvislosti s polynukleotidem je molekula nukleové kyseliny zbavená jako celek nebo část sekvencí normálně připojených k této molekule v přírodě nebo sekvence, jak existuje v přírodě, avšak mají připojené heterologní sekvence, nebo molekula oddělená z chromozomu.

Pojem „ekvivalentní antigenní determinant“ znamená antigenní determinant z různých podruhů či kmenů HCV, jako jsou kmeny 1, 2 nebo 3 HCV. Konkrétněji jsou známé epitopy jako 5-1-1 a tyto epitopy se mění mezi kmeny 1,2 a 3. Epitop 5-1-1 z různých kmenů tedy představuje antigenní determinanty, takže kopie a dokonce ani jejich sekvence nejsou identické. Obecně budou mít aminokyselinové sekvence ekvivalentních antigenních determinantů vysoký stupeň sekvenční homologie, to jest sekvenční homologii více než 30 %, přednostně více než 40 %, když jsou obě sekvence seřazeny.

- 12CZ 304185 B6 „Homologie“ se týká procentické podobnosti mezi dvěma polynukleotidovými nebo dvěma polypeptidovými zbytky. Dvě deoxyribonukleové kyseliny nebo dvě polypeptidové sekvence jsou „podstatně homologní“ navzájem, pokud sekvence vykazují alespoň 50 %, přednostně alespoň 75 %, přednostněji alespoň 80 až 85 %, ještě přednostněji alespoň 90 % a nej přednostněji alespoň 95 až 98 % sekvenční podobnosti na definované délce molekul. Pojem podstatně homologní, jak se zde používá, se též vztahuje k sekvencím vykazujícím úplnou identitu se specifikovanou sekvencí deoxyribonukleové kyseliny nebo polypeptidu.

Obecně se „identita“ týká přesné korespondence mezi nukleotidy nebo aminokyselinami ve dvou polynukleotidových či polypeptidových sekvencích. Procento identity lze stanovit přímým srovnáním sekvenční informace mezi dvěma molekulami seřazením sekvencí, zajištěním přesného počtu odpovídajících shodných dvojic mezi dvěma seřazenými sekvencemi, dělením délkou kratší sekvence a násobením výsledku 100.

Pro pomoc při analýze podobnosti a identity lze použít snadno dostupný počítačový program, jako je ALIGN, M. O. Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure M. O. Dayhoff, redakce, 3, Suppl. 5, 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, který přizpůsobuje algoritmus lokální homologie Smithe a Watermana, Advances in Appl. Math., 2, 482M89 (1981) pro peptidovou analýzu. Programy pro stanovení nukleotidové sekvenční podobnosti a identity jsou k dispozici jako Wisconsin Sequence Analysis Package, verze 8 (dodává Genetics Computer Group, Madison, WI), například programy BESTFIT, FASTA a GAP, které se rovněž zakládají na algoritmu Smithe a Watermana. Tyto programy lze snadno použít s parametry standardního nastavení doporučenými výrobcem a popsanými ve výše citovaném Wisconsin Sequence Analysis Package. Například procentická podobnost dané nukleotidové sekvence s referenční sekvencí se stanoví s použitím algoritmu homologie Smithe a Watermana s tabulkou skóre ve standardním nastavení a s mezerou šesti nukleotidových poloh.

Další způsob zjištění procentické podobnosti v souvislosti s tímto vynálezem je použití souboru programu MPSRCH, University of Edinburgh, autorů John F. Collinse a Shane S. Sturroka distribuovaný společností IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Z těchto souborů lze použít Smithův-Watermanův algoritmus s použitím parametrů standardního nastavení ze skórovací tabulky [například „gap open penalty 12“, „gap extension penalty 1“ a „gap 6“]. Hodnota „Match (shody) vytvořená z údajů odráží „sekvenční podobnost“. Další vhodné programy pro výpočet procenta identity či podobnosti mezi sekvencemi jsou v oboru dobře známy, například další program BLAST použitý s parametry standardního nastavení. Například BLASTN a BLASTP je použitelný s následujícími parametry standardního nastavení: genetický kód = standardní, filtr = žádný, vlákno = obě, zkrácení = 60, očekávání = 10, Matrice = BLOSUM62, popisy = 50 sekvencí, hodnocení = vysoké skóre, databáze = neredundantní, GeriBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS překlady + Swiss protein + Spupdate + PIR. Podrobnosti o těchto programech lze nalézt na následující internetové adrese http:/www.nebi.nlm.gov/cgi-bis/BLAST.

Alternativně lze homologii stanovit hybridizací polynukleotidů za podmínek tvořících stabilní duplexy mezi homologními oblastmi s následným natrávením jednovláknově specifickou nukleázou a stanovením velikosti natrávených fragmentů. Sekvence DNA, které jsou v podstatě homologní, lze identifikovat Southemovou hybridizací například za přísných podmínek definovaných pro daný systém. Definice příslušných podmínek hybridizace spadá do oblasti zkušenosti v oboru. Viz například Sambrook a kol., výše, DNA Cloning, výše, Nucleic Acid hybridization, výše.

„Kódovací sekvence“ nebo sekvence, která kóduje zvolený polypeptid, je molekula nukleové kyseliny, která se přepisuje (v případě deoxyribonukleotidové kyseliny) a překládá (v případě mRNA) do polypeptidu in vitro nebo in vivo při umístění pod kontrolu příslušných regulačních sekvencí. Meze kódovací sekvence se stanoví zahajovacím kodonem při konci 5' (amino) a kodonem zastavení translace při konci 3' (karboxy). Sekvence ukončení transkripce se může připojovat v poloze 3' ke kódovací sekvenci.

- 13 CZ 304185 B6

Pojem „operabilně spojený“ se týká uspořádání elementů, ve kterých se takto popisované složky konfigurují tak, aby prováděly své požadované funkce. Proto je daný promotor operabilně připojený ke kódovací sekvenci schopen provádět expresi kódovací sekvence za přítomnosti vhodných transkripčních faktorů atd. Promotor nemusí být spojený s kódovací sekvencí, pokud je jeho funkcí směrovat její expresi. Proto například vložené nepřeložené a přitom přepsané sekvence mohou být mezi sekvencí promotoru a kódovací sekvencí, jako je tomu pro přepisované introny, a sekvence promotoru se přitom může považovat za „operabilně připojenou“ ke kódovací sekvenci.

Pojem „kontrolní element“ se týká sekvence polynukleotidu, která napomáhá expresi kódovací sekvence, ke které se připojuje. Tento pojem zahrnuje promotory, sekvence ukončení transkripce, domény vzestupné regulace, signály polyadenylace, nepřeložené oblasti, včetně 5'-UTR a 3'UTR a ve vhodných případech vedoucí sekvence a enhancery, které společně zajišťují transkripci a translaci kódovací sekvence v buňce hostitele.

Pojem „promotor“, jak se používá zde, je DNA regulační oblast schopná vazby RNA polymerasy v hostitelské buňce a zahájení transkripce sestupné (směr 3') kódovací sekvence, ke které je operabilně připojená. Pro účely tohoto vynálezu zahrnuje sekvence promotoru minimální počet bází či elementů nezbytných pro zahájení transkripce daného genu na úrovních detekovatelných nad pozadím. V rámci sekvence promotoru je místo zahájení transkripce stejně tak jako domény vazby proteinu (sekvence konsensu) odpovědné za vazbu RNA polymerasy. Eukaryotické promotory často, avšak ne vždy, obsahují boxy „TATA“ a boxy „CAT“.

Kontrolní sekvence „směruje transkripci“ kódovací sekvence v buňce, když se RNA polymerasa váže na sekvenci promotoru a přepisuje kódovací sekvence do mRNA, která se poté překládá do kódovaného polypeptidů kódovací sekvencí.

„Expresní kazeta“ nebo „expresní konstrukt“ se týká souboru schopného směrovat expresi dané sekvence (sekvencí) nebo daného genu (genů). Expresní kazeta zahrnuje kontrolní prvky, jak se popisují výše, jako je promotor, kterýje operabilně připojený kdané sekvenci (sekvencím) nebo danému genu (genům) a často též zahrnuje sekvenci polyadenylace. Pří určitých ztělesněních tohoto vynálezu může být expresní kazeta, která se zde popisuje, obsažena v rámci plasmidového konstruktu. Navíc ke složkám expresní kazety může plasmidový konstrukt též obsahovat jeden či více volitelných markérů, jejichž signál umožňuje existenci plasmidového konstruktu ve formě jednovláknové deoxyribonukleové kyseliny (například původ M13 replikace), v alespoň jednom místu vícečetného klonování a „savčí“ původ replikace (například SV40 nebo adenovirový původ replikace).

Pojem „transformace“, jak se zde používá, se týká vložení exogenního polynukleotidu do hostitelské buňky bez ohledu na způsob použitý při tomto vložení: například transformace přímým zachycením, transfekci, infekcí a podobně. Ohledně konkrétních způsobů transfekce viz dále níže. Exogenní polynukleotid se může udržovat jako neintegrovaný vektor, například episom nebo alternativně může být integrovaný do hostitelova genomu.

„Hostitelská buňka“ je buňka, která se transformovala nebo je schopna transformace exogenní sekvencí deoxyribonukleové kyseliny.

„Obvyklý pevný nosič“ značí jednotlivou tuhou matrici, ke které se polypeptidy použité v daných imur.oesejích vážou kovalentně nebo nekovalentními způsoby, jako je hydrofobní adsorpce.

Pojem „imunologicky reaktivní“ znamená, že daný antigen bude reagovat specificky s protilátkami proti HCV přítomnými v biologickém vzorku od jednotlivce infikovaného HCV.

- 14CZ 304185 B6

Pojem „imunitní komplex“ znamená kombinaci vytvořenou při vazbě protilátky na epitop antigenu.

Pojem „biologický vzorek“, jak se zde používá, se týká vzorku tkáně nebo kapaliny izolované ze subjektu včetně, avšak bez omezení, například krve, plazmy, séra, hmoty stolice, moče, kostní dřeně, žluče, spinální tekutiny, lymfatické tekutiny, vzorků kůže, vnějších sekretů kůže, respiračního intestinálního a urogenitálního traktu, slz, slin, mléka, krvinek, orgánů, biopsií a rovněž vzorků složek buněčné kultury in vitro včetně, avšak bez omezení, upravených médií získaných z růstu buněk a tkání v médiu, například rekombinantních buněk a buněčných složek.

Pojmy „značka“ a „detekovatelná značka“, jak se zde používají, se týkají molekuly schopné detekce včetně, avšak bez omezení, radionuklidů, fluorescenčních látek, chemiluminiscenčních látek, chromoforů, enzymů, enzymových substrátů, enzymových kofaktorů, enzymových inhibitorů, chromoforů, barviv, kovových iontů, kovových solů, ligandů (například biotin, streptavidin nebo hapteny) a podobně. Pojem „fluorescenční látka“ se týká látky nebo její části, která je schopná vykazovat fluorescenci v detekovatelném rozmezí. Konkrétní vzorky značek, které lze využít v rámci tohoto vynálezu, zahrnují, avšak bez omezení, křenovou peroxidasu (HRP), fluorescein, FITC, rhodamin, dansyl, umbelliferon, dimethylakridiniumester (DMAE), texaskou červeň, luminol, NADPH a α-β-galaktosidasu.

II. Způsoby provedení vynálezu

Před podrobným popisem tohoto vynálezu je třeba si uvědomit, že se tento vynález neomezuje na konkrétní formulace nebo že se parametry procesu mohou samozřejmě měnit. Je třeba si též uvědomit, že terminologie, která se zde používá, slouží pouze pro účely popisů konkrétních ztělesnění tohoto vynálezu a není omezující.

I když počet směsí a způsobů podobných či ekvivalentních těm, které se zde popisují, lze použít v praxi tohoto vynálezu, jsou preferovanými látkami a způsoby ty, které se zde popisují.

Jak se poznamenává výše, zakládá se tento vynález na objevu nových diagnostických způsobů pro přesné stanovení časné infekce HCV. Tyto způsoby se zakládají na identifikaci a použití vysoce imunogenních HCV protilátek a antigenů, které se vyskytují včasných fázích serokonverze HCV, čímž se zvyšuje správnost detekce a snižuje výskyt falešných výsledků. Tyto způsoby lze vhodným způsobem provádět ve formátu jednotlivé eseje.

Konkrétněji se esej provádí na pevné podložce, ke které se naváže jedna či více protilátek proti jádru HCV (směrované buď proti stejným, nebo jiným epitopům jádra HCV) a epitop odvozený od oblasti NS3/4a polyproteinu HCV. Příklady konkrétních protilátek proti jádru použitelných v tomto vynálezu zahrnují, avšak bez omezení, protilátkové molekuly, jako jsou monoklonální protilátky zaměřené proti epitopům v oblasti jádra mezi aminokyselinami 10 až 53, aminokyselinami 10 až 45, aminokyselinami 67 až 88, aminokyselinami 120až 130 nebo protilátky zaměřené proti epitopům jádra identifikovaným například v Houghton a kol., patent US 5 350 671, Chien a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 10011-10015 (1992), Chien a kol., J. Gastroent. Hepatol, 8, S33-39 (1993), Chien a kol., mezinárodní přihláška WO 93/00 365, D. Y. Chien, mezinárodní přihláška WO 94/01 778 a patentové přihlášky US 08/403 590 a US 08/444 818.

Oblast NS3/4a polyproteinu HCV se popisuje a aminokyselinová sekvence a celková struktura proteinu se uveřejňuje například v Yao a kol., Structure, 7, 1353-1363 (1999), Sáli a kol., Biochem., 37, 3392-3401 (1998) a R. Bartenschlager, J. Viral Hepat., 6, 165-181 (1999). Viz též Dasmahapatra a kol., patent US 5 843 752. Imunoeseje subjektu používají alespoň jeden konformační epitop odvozený od oblasti NS3/4a, který se vyskytuje v konformaci nalézané v přirozené částici HCV nebo v jejím neúčinném produktu, jak se ukazuje zachováním proteasové a případně helikasové enzymatické aktivity normálně vykazované produktem genu NS3/4a a/nebo imunoreaktivitou antigenů s protilátkami v biologickém vzorku subjektu infikovaného

- 15 CZ 304185 B6

HCV a ztrátou imunoreaktivity epitopu při denaturaci antigenu. Například konformační epitop lze porušit zahříváním, změnou pH na mimořádně kyselé či bazické nebo přidáním známých organických denaturačních prostředků, jako je dithiothreitol (DTT) nebo příslušný detergent, viz například Protein Purification Methods, a practical approach (E. L. V. Harris a S. Angal, red., IRL Press), a denaturovaný produkt se srovnává s produktem, který se nezpracovává, jak se popisuje výše.

Proteasovou a helikasovou aktivitu lze stanovit s použitím standardních způsobů stanovení enzymů dobře známých v oboru. Například lze proteasovou aktivitu stanovit s použitím eseji dobře známých v oboru. Viz například Takeshita a kol., Anal. Biochem., 247, 242-246 (1997), Kakiuchi a kol., J. Biochem., 122, 749-755 (1997), Sáli a kol., Biochemistry, 37, 3392-3401 (1998), Cho a kol., J. Virol. Meth., 72, 109-115 (1998), Cerretani a kol., Anal. Biochem., 266, 192-197 (1999), Zhang a kol., Anal. Biochem., 270, 268-275 (1999), Kakiuchi a kol., J. Virol. Meth., 80, 77-84 (1999), Fowler a kol., J. Biomol. Screen, 5, 153-158 (2000) a Kim a kol., Anal. Biochem., 284, 42—48 (2000). Zvláště vhodnou esej pro stanovení aktivity proteasy ukazují příklady popsané níže.

Podobně jsou v oboru dobře známé eseje aktivity helikasy a aktivitu helikasy epitopu NS3/4a lze stanovit například s použitím eseje ELISA, jak se popisuje například v Hsu a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun., 253, 594-599 (1998) a scintilačním systémem, jak popisuje Kyono a kol., Anal. Biochem., 257, 120-126 (1998) screeningovými esejemi s vysokými výkony, jak se popisují například v Hicham a kol., Antiviral Res., 46, 181-193 (2000) a Kwong a kol., Methods Mol. Med., 24, 97-116 (2000) stejně tak jako jinými způsoby eseji známými v oboru. Viz například Khu a kol., J. Virol., 75, 205-214 (2001), Utama a kol., Virology, 273, 316-324 (2000), Paolini a kol., J. Gen. Virol., 81, 1335-1345 (2000), Preugschat a kol., Biochemistry, 39, 5174— 5183 (2000), Preugschat a kol., Methods Mol. Med., 19, 353-364 (1998) a Hesson a kol., Biochemistry, 39, 2619—2625 (2000).

Délka antigenu je dostatečná pro udržení imunoreaktivního konformačního epitopu. Často má užívaný polypeptid obsahující antigen téměř plnou délku, avšak tento polypeptid může být též zkrácený, například pro zvýšení rozpustnosti či zlepšení sekrece. Obecně se může konformační epitop v NS3/4a exprimovat jako rekombinantní polypeptid v buňce a tento polypeptid poskytuje epitop žádané formy, jak se popisuje podrobně níže.

Reprezentativní aminokyselinové sekvence pro polypeptidy NS3/4a ukazují obrázky 3 a obrázky 4A až 4D. Zvýrazněný alanin v poloze 182 na obrázku 3 se substituuje místo aktivního šeřinu přítomného v této poloze, aby se zabránilo autokatalýze molekuly, která jinak mohla nastat. Aminokyselinová sekvence znázorněná v polohách 3 až 686 obrázků 4A až 4D odpovídá aminokyselinovým polohám 1027 až 1711 HCV-1. Iniciátorový kodon (ATG) kódující Met je znázorněný jako poloha 1. Navíc Thr normálně přítomný v poloze 1428 HCV—1 (aminokyselinová poloha 403 obrázku 4) se mutuje na Pro a Ser normálně přítomný v poloze 14289 HCV-1 (aminokyselina poloha 404 v obrázku 4) se mutuje na Ile. Avšak nativní sekvence s nebo bez Nterminálního Met, znázorněný analog s nebo bez N-terminálního Met nebo další analogy a fragmenty lze použít v esejích subjektu, pokud se epitop tvoří s použitím způsobu, který zachovává nebo obnovuje nativní konformaci, takže se zachovává proteasová a případně též helikasová aktivita. Dasmahapatra a kol., patent US 5 843 752 a Zhang a kol., patent US 5 990 276 popisují analogy NS3/4a.

NS3 proteasa NS3/4a je zhruba v polohách 1027-1207, číslováno vzhledem k HCV-1, polohy 1 až 182 obrázku 4. Struktura NS3 proteasy a aktivní místo jsou známy. Viz například De Francesco a kol., Antivir. Ther., 3, 99-109 (1998), Koch a kol., Biochemistry, 40, 631—640 (2001). Změny nativní sekvence, které lze normálně tolerovat, jsou ty, které jsou vně aktivního místa molekuly. Konkrétně je vhodné zachovávat aminokyseliny 1- nebo 2 až 155 obrázku 4 smálo substitucemi nebo pouze s konzervativními substitucemi. Aminokyseliny mimo 155 budou tolerovat větší změny. Navíc, pokud se použijí fragmenty sekvence NS3/4a znázorněné na obráz- 16CZ 304185 B6 ku 4, budou tyto fragmenty obecně zahrnovat alespoň aminokyseliny 1 nebo 2 až 155, přednostně aminokyseliny 1 nebo 2 až 175 a nej přednostněji aminokyseliny 1 nebo 2 až 182 sN-terminálními Med nebo bez nich. Helikasová doména je zhruba v polohách 1193 až 1657 HCV-1 (polohy 207 až 632 na obrázku 4). Proto, pokud se požaduje helikasová aktivita, bude tato část molekuly zachovaná s málo změnami nebo pouze s konzervativními změnami. Ten, kdo má zkušenost v oboru, může snadno stanovit další oblasti, které budou tolerovat změnu na základě známé struktury NS3/4a.

Pevný nosič může též obsahovat další antigeny. Například antigeny tvořené spojením více epitopů (zvané „MEFA“), jak se popisují v mezinárodní publikaci WO 97/44 469, se mohou vázat na pevný nosič pro použití v esejích subjektu. Tyto MEFA obsahují vícečetné epitopy odvozené od dvou či více různých virových oblastí znázorněných na obrázku 1 a v tabulce 1. Konkrétně, jak ukazuje obrázek 1 a tabulka 1, tvoří HCV polyprotein při štěpení alespoň deset různých produktů v pořadí NH₂-jádro-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. Polypeptid jádra se vyskytuje v polohách 1 až 191, číslováno vzhledem k HCV-1 [viz Choo a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 88, 2451-2455 (1991) ohledně genomu HCV-1], Tento polypeptid se dále zpracovává s obdržením HCV polypeptidu s aminokyselinami zhruba 1 až 173. Polypeptidy obálky, El a E2 se vyskytují zhruba v polohách 192 až 383 respektive 384 až 746. Doména P7 je zhruba v polohách 747 až 809. NS2 je integrální membránový protein s proteolytickou aktivitou a je zhruba v polohách 810 až 1026 polyproteinu. NS2, buď samotný, nebo v kombinaci sNS3 (v polohách zhruba 1027 až 1657) štěpí vazbu NS2-NS3, která tvoří konec N NS3 a uvolňuje velký polyprotein zahrnující aktivity serin proteasy a RNA helikasy. NS3 proteasa v polohách 1027 až 1207 slouží ke zpracování zbývajícího polyproteinu. Helikasová aktivita je zhruba v polohách 1193 až 1657. Dokončení zrání polyproteinu se zahajuje autokatalytickým štěpením spojení NS3-NS4a katalyzovaným NS3 serin proteasou. Následující štěpení HCV polyproteinu zprostředkované NS3 zahrnuje rozpoznání spojů štěpení polyproteinu molekulou NS3 dalšího polypeptidu. V těchto reakcích NS3 uvolňuje kofaktorNS3 (NS4a v polohách 1658 až 1711), dva proteiny (NS4b zhruba v polohách 1712 až 1972 a NS5a zhruba v polohách 1973 až 2420) a RNA-dependentní RNA polymerasou (NS5b přítomnou zhruba v polohách 2421 až 3011).

Tabulka 1

Doména	Přibližné rozmezí:*
C (core)	1-191
El	192-383
E2	384-746
P7	747-809
NS2	810-1026
NS3	1027-1657
NS4a	1658-1711
NS4b	1712-1972
NS5a	1973-2420
NS5b	2421-3011

*Číslování vzhledem k HCV-1. Viz Choo a kol., Proč. Nati. Acad. Sci, USA, 88, 2451-2455 (1991).

- 17CZ 304185 B6

Vícečetné antigeny HCV jsou částí jednoho spojitého řetězce aminokyselin, který se nevyskytuje v přírodě. Proto je lineární pořadí epitopů odlišné od jejich lineárního pořadí v genomu, ve kterém se vyskytují. Lineární pořadí sekvencí MEFA pro použití v tomto vynálezu je přednostně uspořádané pro dosažení optimálního antigenního působení. V preferovaných způsobech pocházejí epitopy od více než jednoho kmene HCV, čímž se zajišťuje přídavná schopnost detekovat vícečetné kmeny HCV v jedné eseji. Proto mohou MEFA pro použití v tomto vynálezu obsahovat různé imunogenní oblasti odvozené od výše popsaného polyproteinu. Navíc protein obdržený z posunu rámce v oblasti jádra polyproteinu, jak se popisuje v mezinárodní přihlášce WO 99/63 941, je použitelný v MEFA. V případě požadavku se v hybridním proteinu může vyskytnout alespoň 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 nebo 10 či více epitopů odvozených od polyproteinu HCV.

Například epitopy odvozené od hypervariabilní oblasti E2, jako je oblast aminokyselin 384 až 410 nebo 390 až 410, mohou být součástí antigenu MEFA. Zvláště účinným epitopem E2 je takový, který zahrnuje sekvenci konsensu odvozenou z této oblasti, jako je sekvence konsensu Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-GlnAsn, která představuje sekvenci konsensu pro aminokyseliny 390 až 410 genomu HCV typu 1. Reprezentativní epitop E2 přítomný v MEFA podle tohoto vynálezu může obsahovat hybridní epitop v rozmezí aminokyselin 390 až 444. Tento hybridní epitop E2 může zahrnovat sekvenci konsensu představovanou kyselinami 390 až 410 připojenou k nativní aminokyselinové sekvenci pro aminokyseliny 411 až 444 HCV E2.

Navíc se mohou antigeny odvozovat od různých kmenů HCV. Jsou známy vícečetné virové kmeny HCV a epitopy odvozené od kterýchkoliv z těchto kmenů lze používat ve spojeném proteinu. Je dobře známo, že v jakémkoliv druhu organismu existuje individuální proměnlivost a dále, že daný organismus, jako je virus, může mít řadu různých kmenů. Například, jak se popisuje výše, zahrnuje HCV alespoň 6 genotypů. Každý z těchto genotypů zahrnuje ekvivalentní antigenní determinanty. Konkrétněji zahrnuje každý kmen řadu antigenních determinantů, které jsou přítomné ve všech kmenech viru, avšak jsou mírné rozdíly mezi jednotlivými kmeny viru. HCV například zahrnuje antigenní determinant známý jako 5-1-1 (viz obrázek 1). Tento konkrétní antigenní determinant je ve třech různých formách na třech různých virových kmenech HCV. V souladu s tím se v preferovaném ztělesnění podle tohoto vynálezu vyskytují všechny tři formy 5-1-1 na antigenu obdrženém spojením více epitopů použitém v imunoesejích prováděných na subjektu. Podobně mohou být též přítomny ekvivalentní antigenní determinanty z oblasti jádra různých kmenů HCV. Obecně mají ekvivalentní antigenní determinanty vysoký stupeň homologie ve smyslu aminokyselinové sekvence, který je obecně 30 % či více, přednostně 40 % či více při seřazení. Epitop vícečetné kopie podle tohoto vynálezu může též zahrnovat více kopií, které jsou přesnými kopiemi téhož epitopu.

Reprezentativní MEFA pro použití v těchto analýzách se popisuje v mezinárodní přihlášce WO 97/44 469. Další reprezentativní MEFA pro toto použití zahrnují MEFA 12, MEFA 13 a MEFA 13.1. Je třeba si uvědomit, že tyto MEFA jsou čistě reprezentativní a v těchto analýzách lze používat další epitopy odvozené od genomu HCV a lze je inkorporovat do těchto nebo jiných MEFA.

Sekvenci DNA a odpovídající aminokyselinovou sekvenci MEFA 12 znázorňují obrázky 7A až 7F. Obecný strukturní vzorec MEFA 12 znázorňuje obrázek 6 a je následující: hSOD-El (typ 1)E2 HVR konsensus (typ la)-E2 HVR konsensus (typy 1 a 2)-c33c krátký(typ 1)-5-1-1 (typ 1)5-1-1 (typ 3)—5—1—l(typ 2)-cl00(typ 1)—NS5(typ lý-NS5(typ l)-jádro(typy l+2)-jádro-(typy 1+2). Tento epitop s vícečetným i kopiemi zahrnuje následující aminokyselinovou sekvenci, číslováno vzhledem k HCV-1 (číslování aminokyselin popsané níže vyplývá z určení číslování podle Choo a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 2451-2455 (1991), kde aminokyselina 1 je první methionin kódovaný kódovací sekvencí oblasti jádra): aminokyseliny 1 až 69 superoxid dismutasy (SOD se používá pro zvýšení rekombinantní exprese proteinu), aminokyseliny 303 až 320 polyproteinu z oblasti El, aminokyseliny 390 až 410 polyproteinu představujícího sekvenci

- 18CZ 304185 B6 konsensu pro hypervariabilní oblast HCV-la a E2, aminokyseliny 384 až 414 polyproteinu z oblasti E2, představující sekvenci konsensu pro hypervariabilní oblasti E2 HCV-1 a HCV-2, aminokyseliny 1211 až 1457 polyproteinu HCV-1 definující helikasu, tři kopie epitopu z 5-1-1, aminokyseliny 1689 až 1735, jedna z HCV-1, jedna z HCV-3 a jedna z HCV-2, kde tyto kopie jsou ekvivalentní antigenním determinantům ze tří různých virových kmenů HCV, HCV polypeptid C100 HCV-1, aminokyseliny 1901-1936 polyproteinu, dvě přesné kopie epitopu z oblasti NS5 HCV-1, každá z aminokyselin 2278 až 2313 HCV polyproteinu, a dvě kopie tří epitopů z oblasti jádra, dvě z HCV-1 a jedna z HCV-2, které jsou ekvivalentní antigenním determinantům představovaným aminokyselinami 9 až 53 a 64 až 88 HCV-1 a 67 až 84 HCV-2.

o

Tabulka 2 ukazuje polohy aminokyselin různých epitopů v MEFA 12 s odkazem na obrázky 7A až 7F. Číslování v tabulkách se vztahuje k HCV-1. Viz Choo a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 2451-2455 (1991). MEFA 13 a 13.1 rovněž sdílejí obecný vzorec popsaný výše pro MEFA 12 s modifikacemi znázorněnými v tabulkách 3 a 4.

Tabulka 2

MEFA 12

mefa aa#	Koncové místo 5	epitope	hcv aa#	kmen
1-69*	Ncol	hSOD
72-89	Mlul	El	303-320	1
92-112	HindlII	E2HVRla konsensus	390-410	1
113-143		E2 HVR1+2 konsensus	384-414	1,2
146-392	Spěl	C33C krátký	1211-1457	1
395-441	Sphl	5-1-1	1689-1735	1
444-490	Nrul	5-1-1	1689-1735	3
493-539	Clal	5-1-1	1589-1735	2
542-577	Aval	C100	1901-1936	1
580-615	Xbal	NS5	2278-2313	1
618-653	BglR	NS5	2278-2313	1
654-741	Ncol	epitopy jádra	9-53, R47L 64-88 67-84	1 1 2
742-829	Balí	epitopy jádra	9-53, R47L 64-88 67-84	1 1 2

*Protein SOD je zkrácený tak, že detekční konjugát , protilátka proti SOD značená HRP, se neváže na MEFA. Epitop jádra se mutuje, aby se předešlo vazbě protilátek proti jádru HCV použitých v detekci s MEFA.

- 19CZ 304185 B6

Tabulka 3

MEFA 13

mefa aa#	5' end site	epitop	hcv aa#	kmen
1-156	Ncol	mutovaný hSOD (aa 7072, ALA)
161-178	Mlul	El	303-320	1
181-201	Hindlll	E2HVRla konsensus	390-410	1
202-232		E2 HVR1+2 konsensus	384-414	1,2
235-451		C33C krátký’	1211-1457	1
454-500	HindHÍ	5-1-1 Plmut*	1689-1735	1
503-549	Nrul	5-1-1 Plmut*	1689-1735	3
552-598	Clal	5-1-1 Plmut*	1689-1735	2
601-636	Aval	C100	1901-1936	1
639-674	Xbal	NS5	2278-2313	1
677-712	BglR	NS5	2278-2313	1
713-800		epitopy jádra	9-53, R47L 64-88 67-84	1 1 2
801-888		epitopy jádra	9-53, R47L 64-88 67-84	1 1 2

*Epitopy 5-1-1 se modifikují eliminací možných míst štěpení (CS nebo CA) cílených NS3/4a rekombinantních proteinem. Místo CS nebo CA se sekvence mění na Pl. Navíc se protein SOD o mutuje takovým způsobem, že se detekční konjugát, protilátka proti SOD značená HRP, nenaváže na MEFA. Epitop jádra se mutuje, aby se předešlo vazbě protilátek jádra HCV použitých při detekci na MEFA.

-20CZ 304185 B6

Tabulka 4

MEFA 13.1

mefa aa#	— koncové místo 5	epitop	hcv aa#	kmen
1-86	Ncol	mutovaný hSOD(aa7072, ALA)
89-106	MIul	El	303-320	1
109-129	HinďDl	E2HVRla konsensus	390-410	1
130-160		E2HVR1+2 konsensus	384-414	1,2
163-379		C33C krátký	1211-1457	1
382-428	HindEEl	5-1-1 Plmut*	1689-1735	1
431-477	Nrul	5-1-1 Plmut*	1689-1735	3
480-526	Clal	5-1-1 Plmut*	1689-1735	2
529-564	Aval	C100	1901-1936	1
567-602	Xbál	NS5	2278-2313	1
605-640	BgRi	NS5	2278-2313	1
641-728		epitopy jádra	9-53, R47L 64-88 67-84	1 1 2
729-816		epitopy jádra	9-53, R47L 64-88 67-84	1 1 2

*Epitopy 5-1-1 se modifikují eliminací možných míst štěpení (CS nebo CA) cílených NS3/4a rekombinantních proteinem. Místo CS nebo CA se sekvence mění na Pl. Navíc se protein SOD io mutuje takovým způsobem, že se detekční konjugát, protilátka proti SOD značená HRP, neváže na MEFA. Epitop jádra se mutuje, aby se předešlo vazbě protilátek jádra HCV použitých při detekci na MEFA.

V jednom formátu eseje se vzorek kombinuje s pevným nosičem, jak se dále popisuje níže. 15 Pokud se vzorek infikuje HCV, budou se antigeny jádra, stejně tak jako protilátky proti těmto epitopům přítomné na pevném nosiči, vázat na složky pevného nosiče. Poté se přidá detekovatelně značená protilátka proti jádru. Značená protilátka proti jádru se zaměřuje proti jinému epitopu než protilátka proti jádru, která se váže na pevný nosič. Tato protilátka proti jádru se váže na antigen jádra zachycený protilátkami proti jádru na pevném nosiči.

-21 CZ 304185 Β6

Rovněž se přidává antigen reagující se zachycenou protilátkou HCV z biologického vzorku, která je reaktivní sNS3/4a epitopem. Tento antigen je přednostně epitop odvozený od oblasti NS3 polyproteinu HCV. Tento antigen váže zachycenou protilátkou HCV ze vzorku. Je známá řada antigenů včetně těchto epitopů, avšak bez omezení, odvozených z oblastí c33c a cl00 stejně tak jako hybridních proteinů zahrnujících epitop NS3, jako je c25. Tyto a další epitopy NS3 jsou použitelné v těchto esejích a jsou známy v oboru a popisují je například Houghton a kol., patent US 5 350 671, Chien a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 10011-10015 (1992), Chien a kol., J. Gastroent. Hepatol., 8, S33-39 (1993). Mezinárodní přihláška WO 93/00 365, D. Y. Chien, mezinárodní přihláška WO 94/01 778 a patentové přihlášky US 08/403 590 a US 08/444 818.

Přidá se druhá značená protilátka směrovaná proti výše popsanému antigenu. Tuto protilátku lze směrovat proti kterémukoliv epitopů obsaženému v antigenu. Například lze tuto protilátku směrovat proti oblasti NS3 přítomné v antigenu. Alternativně, pokud se antigen výše exprimuje jako spojený protein, lze druhou značenou protilátku směrovat proti partneru fúze. Další antigeny a protilátky lze přidávat do eseje, zvláště pokud pevný nosič obsahuje MEFA. Tyto formáty eseje se vysvětlují dále níže.

Reprezentativní esej podle tohoto vynálezu se znázorňuje na obrázku 2. Jak ukazuje obrázek, zahrnuje pevný nosič dvě monoklonální protilátky proti jádru nazvané cl 1-3 a cl 1-7. Tyto protilátky se směrují proti epitopů přítomnému v N-terminální oblasti proteinu jádra při aminokyselinách 10 až 53, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1. Pevný nosič též zahrnuje epitop NS3/4a. K pevnému nosiči se přidá biologický vzorek. Antigen jádra HCV, stejně tak jako protilátky směrované proti epitopů NS3/4a rovněž přítomné ve vzorku, vážou prostředky pro zachycení na pevném nosiči.

Monoklonální protilátka značená křenovou peroxidasou cl 1-14 směrovaná proti C-terminální oblasti jádra při polohách aminokyselin 120 až 130, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1, se následně přidá. Spojený protein zahrnující sekvenci z lidské SOD (hSOD) a epitop z oblasti c33c se přidá a je druhou protilátkou značenou křenovou peroxidasou směrovanou proti části SOD spojeného proteinu. Spojení SOD-c33c se váže na protilátku proti NS3 a protilátka proti SOD se váže na spojený protein SOD-c33c. Detekce značky indikuje přítomnost infekce HCV.

Další reprezentativní esej podle tohoto vynálezu se znázorňuje na obrázku 8. Konfigurací protilátkové eseje je sendvičová esej antigen-protilátka-antigen s použitím NS3/4a a MEFA 12. Pevný nosič zahrnuje dvě monoklonální protilátky proti jádru popsané výše, epitop NS3/4a a reprezentativní MEFA, MEFA 12, zahrnující zkrácenou verzi lidské SOD. Podobně jako při eseji popsané výše se přidá biologický vzorek k pevnému nosiči. Antigen jádra HCV stejně tak jako protilátky proti epitopů NS3/4a a epitopům MEFA přítomné ve vzorku se vážou na zachycovací prostředky na pevném nosiči. Přidají se dva antigeny, jeden reaktivní s protilátkami vzorku, který váže NS3/4a (jak se popisuje výše) a jeden reaktivní s protilátkami vzorku, který váže MEFA 12. Na obrázku je antigen reaktivní s komplexem MEFA 12/protilátka vzorku spojením mezi molekulu SOD a c22ks delta47-L44W. Antigen c22ks je z oblasti jádra a zahrnuje aminokyseliny Lysio až Ser₉₉ polyproteinu stejně tak jako delecí Arg47 normálně přítomné a substituci Leu místo Trp v poloze 44. Detekčním konjugátem protilátky je druhá monoklonální protilátka proti SOD značená HRP popsaná výše.

Výše popsané kombinační eseje antigen/protilátka jsou zvláště výhodné, neboť lze detekovat antigen jádra HCV i protilátky proti NS3/4a a/nebo jádru stejným nosičem v téže eseji. Navíc, jak se popisuje výše, lze použít další HCV epitopy, jako je SOD připojená k clOO, 5-1-1, NS5 antigenům stejně tak jako protein z posunu rámce v oblasti jádra polyproteinu, který se popisuje v mezinárodní publikaci WO 99/63 941, v kombinační směsi pro pokrytí jiných nestruktumích epitopů HCV.

-22CZ 304185 B6

Pro další pochopení tohoto vynálezu se níže poskytuje podrobná diskuse ohledně tvorby protilátek pro použití v oblasti imunoesejí, tvorby polypeptidů pro užití v imunoesejích a způsobů provádění imunoesejí.

Tvorba protilátek pro použití v imunoesejích HCV

Jak se popisuje výše, využívá esej různých protilátek, které se vážou na pevný nosič (například jedné či více protilátek proti jádru) a které detekují komplexy antigen/protilátka tvořené při přítomnosti infekce HCV ve vzorku. Tyto protilátky mohou být polyklonálními či monoklonálními proti látkovým i přípravky, monospecifickými antiséry, lidskými protilátkami nebo to mohou být hybridní či chimérické protilátky, jako jsou humanizované protilátky, pozměněné protilátky, fragmenty F(ab')2, fragmenty F(ab), fragmenty Fv, jednodoménové protilátky, dimerní a trimerní protilátkové konstrukty fragmentů, miniprotilátky nebo jejich funkční fragmenty, které se vážou s daným antigenem.

Protilátky se tvoří způsoby dobře známými tomu, kdo má zkušenost v oboru a popisují se například v patentech US 4 011 308, US 4 722 890, US 4 016 043, US 3 876 504, US 3 770 380 a US 4 372 745. Například polyklonální protilátky se tvoří imunizací vhodného zvířete, jako je myš, krysa, králík, ovce či koza, daným antigenem. Pro zvýšení imunogenity se antigen může spojovat před imunizací s nosičem. Tyto nosiče jsou dobře známy tomu, kdo má běžnou zkušenost v oboru. Imunizace se obecně provádí míšením či emulgací antigenu ve fyziologickém roztoku, přednostně v adjuvantním prostředku, jako je Freundův úplný adjuvant a injekcí směsi či emulze parenterálně (obecně subkutánně nebo intramuskulárně). Zvíře se obecně vystaví o 2 až 6 týdnů později jedné či více posilovacím injekcím antigenu ve fyziologickém roztoku, přednostně s použitím Freundova neúplného adjuvantu. Protilátky se též mohou vytvářet imunizací in vitro způsoby známými v oboru. Polyklonální antisérum se poté obdrží z imunizovaného zvířete. Viz například Houghton a kol., patent US 5 350 671 ohledně popisu tvorby polyklonální protilátky proti HCV.

Monoklonální protilátky se obecně připraví způsobem Kohlera a Milsteina, Nátuře, 256, 495-497 (1975) nebo jeho modifikací. Obvykle se myš nebo krysa imunizuje, jak se popisuje výše. Avšak spíše než odebrání krve zvířeti pro obdržení séra se vyjme slezina (a případně několik velkých lymfatických uzlin) a rozdělí se na jednotlivé buňky. V případě požadavku se mohou buňky sleziny rozdělit (po odstranění nespecificky adherujících buněk) aplikací buněčné suspenze na misku či jamku potaženou antigenem. B-buňky exprimující inrunoglobulin vázaný na membránu specifický po antigen se vážou na misku a nevymyjí se se zbytkem suspenze. Výsledné B-buňky neboli všechny disociované slezinné buňky se poté indukují pro spojení s buňkami myelomu pro vytvoření hybridomů a pěstují se v selektivním médiu (například v hypoxanthinovém, aminopterinovém, thymidinovém médiu „HAT“). Výsledné hybridomy se přenesou na misky omezujícím zředěním a analyzují ohledně tvorby protilátek, které se specificky vážou na imunizující antigen (a které se nevážou na nepříbuzné antigeny). Zvolené monoklonální hybridomy vylučující protilátku se poté pěstují buď in vitro (například v baňkách pro tkáňové kultury nebo reaktorech s dutými vlákny), nebo in vivo (například jako ascity u myši).

Tvorba různých monoklonálních protilátek proti HCV se popisuje například v Houghton a kol., patent US 5 350 671, Chien a kol., mezinárodní přihláška WO 93/00 365, patentová přihláška US 08/403 590 a US 08/444 818 a Kashiwakuma a kol., a patent US 5 871 904.

Jak se popisuje výše, protilátkové fragmenty zachovávající schopnost rozpoznávat daný antigen rovněž nalézají použití při imunoesejích subjektů. V oboru je známa řada proti látkových fragmentů, které obsahují antigenová vazebná místa schopná vykazovat imunologické vazebné vlastnosti intaktní protilátkové molekuly. Například lze funkční protilátkové fragmenty vytvářet štěpením konstantní oblasti neodpovědné za vazbu antigenu z. protilátkové molekuly s použitím například pepsinu s obdržením fragmentů F(ab')₂· Tyto fragmenty obsahují dvě antigenová vazebná místa, avšak postrádají část konstantní oblasti od každého z těžkých řetězců. Podobně

-23 CZ 304185 B6 lze též v případě požadavku obdržet Fab fragmenty obsahující jednotlivé antigenové vazebné místo například digescí polyklonálních či monoklonálních protilátek papainem. Lze též obdržet funkční fragmenty obsahující pouze variabilní oblasti těžkých a lehkých řetězců s použitím standardních způsobů, jako je rekombinantní tvorba preferenčního proteolytického štěpení imunoglobulinových molekul. Tyto fragmenty se popisují jako F_v. Viz například Inbar a kol., Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 69, 2659-2662 (1972), Hochman a kol., Biochem, 15, 2706-2710 (1976) a Ehrich a kol., Biohem., 19, 40914096 (1980).

Jednořetězcový Fv „sFv“ nebo „scFv“) polypeptid je kovaientně spojený V_H-V_L heterodimer, který se exprimuje spojením genů včetně V_tl - A _L -kódovacích genů spojených linkerem kódujícím peptid. Huston a kol., Proč. Nat. Acad. Sci., USA, 85, 5879-5883 (1988). Popisuje se řada způsobů pro rozlišení a tvorbu chemických struktur (linkerů) pro konverzi přirozeně agregovaných avšak chemicky oddělených lehkých a těžkých polypeptidových řetězců z protilátkové V oblasti do sFv molekuly, které se skládají do trojrozměrné struktury v podstatě podobné struktuře místa vazby antigenu. Viz například patent US 5 091 513, US 5 132 405 a US 4 946 778. Molekuly sFv lze tvořit s použitím způsobů popsaných v oboru. Viz například Huston a kol., Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 85, 5879-5883 (1988), patent US 5 091 513, US 5 132 405 a US 4 946 778. Kritéria konstrukce zahrnují stanovení příslušné délky pro přemostění vzdálenosti mezi koncem C jednoho řetězce a koncem N druhého řetězce, kde linker obecně tvoří malé hydrofilní aminokyselinové zbytky, které nejeví snahu ke svinování či tvorbě sekundárních struktur. Takové způsoby se popisují v oboru, viz například patent US 5 091 513, US 5 132 405 a US 4 946 778. Vhodné linkery obecně zahrnují polypeptidové řetězce střídavých seskupení glycinových a serinových zbytků a mohou zahrnovat glutamovou kyselinu a lysinové zbytky vložené pro zvýšení rozpustnosti.

„Miniprotilátky“ nebo „minilátky“ rovněž nacházejí použití v tomto vynálezu. Miniprotilátky jsou sFv polypeptidové řetězce zahrnující domény oligomerizace ajejich konce C oddělené od sFv oblastí zavěšení. Pack a kol., Biochem., 31, 1579-1584 (1992). Doména oligomerizace zahrnuje samoasociační α-helixy, například leucinové zippery, které lze dále stabilizovat přídavnými disulfidickými vazbami. Oligomerizační doména se navrhuje tak, aby byla kompatibilní s vektorovým skládáním napříč membránou, způsobem uvažovaným pro skládání polypeptidu in vivo na funkční vazební protein. Obecně se tvoří miniprotilátky s použitím rekombinantních metod dobře známých v oboru. Viz například Pack a kol., Biochem. 31, 1579-1584 (1992), Cumber a kol., J. Immunology. 149B, 120-126(1992).

Tvorba antigenů pro použití v imunoeseji HCV

Jak se popisuje výše, tvoří se molekuly podle tohoto vynálezu obecně rekombinantním způsobem. Polynukleotidy kódující antigen HCV pro použití v tomto vynálezu lze tedy připravit standardními způsoby molekulární biologie. Například polynukleotidové sekvence kódující výše popsané molekuly lze obdržet rekombinantní způsoby, jako je screening cDNA a genomové knihovny z buněk exprimujících gen nebo odvozením genu z vektoru, kterýje obsahuje. Dále lze požadovaný gen izolovat přímo z molekul virové nukleové kyseliny způsoby známými v oboru, jako popisuje Houghton a kol., patent US 5 350 671. Daný gen lze též obdržet synteticky místo klonováním. Molekuly lze konstruovat s příslušnými kodony pro danou sekvenci. Úplná sekvence se poté vytvoří z překrývajících se oligonukleotidů připravených standardními způsoby a uspořádaných do úplné kódovací sekvence. Viz například Edge, Nátuře, 292, 756 (1981), Nambair a kol., Science, 223, 1299 (1984) a Jay a kol., J. Biol. Chem., 259, 6311 (1984).

Konkrétní nukleotidové sekvence lze tedy obdržet z vektorů nesoucích požadované sekvence neboje lze připravit synteticky, úplně či částečně s použitím různých způsobů přípravy oligonukleotidů známých v oboru, jako je mutageneze směrovaná na místo a polymerasová řetězová reakce (PCR). Viz například Sambrook, výše. Zejména je jeden ze způsobů obdržení nukleotidových sekvencí kódujících požadované sekvence anelací komplementárních souborů přesahujících syntetických oligonukleotidů obdržených v konvenčním automatickém polynukleotidovém synte-24CZ 304185 B6 tizátoru s následující ligací příslušnou DNA ligasou a amplifikací ligované nukleotidové sekvence prostřednictvím PVR. Viz například Jayaraman a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 88, 40844088(1991).

Navíc lze v rámci tohoto vynálezu použít syntézu směrovanou na oligonukleotidy [Jones a kol., Nátuře, 54, 75-82 (1986)], mutagenezi předem existujících nukleotidových oblastí směrovanou na oligonukleotidy [Riechmann a kol., Nátuře, 332, 323-327 (1988) a Verhoeyen a kol., Science, 239, 1534-1536 (1988)] a enzymatické zaplňování oligonukleotidů s mezerami s použitím T₄DNA polymerasy [Queen a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 86, 10029-10033 (1989)] s obdržením molekul vykazujících pozměněné či zvýšené schopnosti vazby antigenů a/nebo sníženou imunogenitu.

Jakmile se kódovací sekvence připraví či izolují, mohou se klonovat do jakéhokoliv vhodného vektoru či replikonu. Četné klonovací vektory jsou známé pro toho, kdo má zkušenost v oboru, a výběr příslušného klonovacího vektoru je věcí volby. Vhodné vektory zahrnují, avšak bez omezení, plasmidy, fágy, transporty, kosmidy, chromosomy či viry schopné replikace při spojení s vhodnými kontrolními prvky.

Kódovací sekvence se potom umístí pod kontrolu vhodnými kontrolními prvky v závislosti na systému užitém pro expresi. Kódovací sekvenci lze tedy umístit pod kontrolu promotoru, vazebného místa ribosomů (pro bakteriální expresi) a případně operátoru, takže se daná sekvence deoxyribonukleové kyseliny přepisuje do ribonukleové kyseliny vhodným transformantem. Kódovací sekvence může a nemusí obsahovat signální peptid nebo vedoucí sekvenci, která může být později odstraněna hostitelem posttranslačním zpracováním. Viz například patenty US 4 431 739, US 4 425 437, US 4 338 397.

Navíc ke kontrolním sekvencím se může požadovat přidání regulačních sekvencí umožňujících regulaci exprese sekvencí vzhledem k růstu hostitelské buňky. Regulační sekvence jsou známé tomu, kdo má zkušenost v oboru, a příklady zahrnují takové sekvence, které způsobují expresi genu pro zapnutí či vypnutí jako odpověď na chemický či fyzikální podnět včetně přítomnosti regulační sloučeniny. Ve vektoru též mohou být přítomné další regulační prvky. Například enhancerové prvky lze použít pro zvýšení hladin exprese konstruktů. Příklady zahrnují časný genový enhancer SV40 [Dijkema a kol., EMBO J., 4, 761 (1985)], enhancer/promotor odvozený od LTR viru Rousova sarkomu [Gorman a kol., Proč. Nati. Acad. Sci, USA, 79, 6777 (1982)] a prvky odvozené od lidského CMV [Boshart a kol., Cell., 44, 521 (1985)] jako prvky obsažené v sekvenci CMV intronu A (patent US 5 688 688). Expresní kazeta může dále zahrnovat původ replikace pro autonomní replikaci ve vhodné hostitelské buňce, jeden či více volitelných markérů, jedno či více restrikčních míst, možnost vysokého počtu kopií a silný promotor.

Expresní vektor se konstruuje tak, aby byly dané kódovací sekvence uložené ve vektoru s příslušnými regulačními sekvencemi, a aby umístění a orientace kódovacích sekvencí vzhledem ke kódovacím sekvencím bylo takové, že se kódovací sekvence přepisují „za kontroly“ kontrolních sekvencí (to jest RNA polymerasa, která se váže k molekule RNA, při kontrolních sekvencích přepisuje kódovací sekvenci). Modifikace sekvencí kódujících danou molekulu se může požadovat k tomuto účelu. Například může být v některých případech nezbytné modifikovat sekvenci takovým způsobem, aby se připojovala ke kontrolním sekvencím v příslušné orientaci, to jest udržovat čtecí rámec. Kontrolní sekvence a další regulační sekvence se mohou připojovat ke kódovací sekvenci před vložením do vektoru. Alternativně lze kódovací sekvenci klonovat přímo do expresního vektoru, který již obsahuje kontrolní sekvence a příslušné restrikční místo.

Jak se popisuje výše, lze požadovat tvorbu mutantů či analogů daného antigenů. To platí zejména pro NS3/4a. Způsoby, jakými to lze dosáhnout, se popisují například v Dasmahapatra a kol., patentu US 5 843 752 a Zhang a kol., patent US 5 990 276. Mutanty či analogy tohoto a dalších HCV proteinů pro použití v esejích subjektu lze připravit delecí části sekvence kódující daný polypeptid, inzercí sekvence, a/nebo substitucí jednoho či více nukleotidů v sekvenci. Způsoby

-25 CZ 304185 B6 modifikace nukleotidových sekvencí, jako je mutageneze směrovaná na místo a podobně, jsou dobře známy tomu, kdo má zkušenost v oboru. Viz například Sambrook a kol., výše, T. A. Kunkel, Proč. Nati. Acad. Sci, USA. 82, 448 (1985), Geisselsoder a kol., BioTechniques, 5, 786 (1987), Zoller a Smith, Methods Enzymol. 100, 468 (1983), Dalbie-McFarland a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA 79, 6409 (1982).

Molekuly lze exprimovat širokým rozmezím systémů včetně hmyzích, savčích, bakteriálních, virových a kvasinkových expresních systémů, jak se popisují v oboru.

Například systémy exprese hmyzích buněk, jako jsou bakulovirové systémy, jsou dobře známé tomu, kdo má zkušenost v oboru a popisují se například v Summers a Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). Materiály a způsoby pro systémy exprese bakulovirus/hmyzí buňka jsou komerčně dostupné v soupravě, mimo jiné od Invitrogen, San Diego CA („MaxBac“ kit). Podobné systémy exprese bakteriálních a savčích buněk jsou v oboru dobře známy a popisují se například v Sambrook a kol. výše. Kvasinkové systémy expresí jsou rovněž v oboru dobře známy a popisují se například v Yeast Genetic Engineering (Barr a kol., redakce, 1989) Butterworths, London.

Řada příslušných hostitelských buněk pro použití s výše popsanými systémy je rovněž známa. Například jsou v oboru známy savčí buněčné linie a zahrnují immortalizované buněčné linie od American Type Culture Collection (ATCC), jako jsou, avšak bez omezení, buňky vaječníků čínského křečka (CHO), HeLa buňky, ledvinové buňky mláďat křečků (BHK), opičí ledvinové buňky (COS), lidské embryonální ledvinové buňky, buňky lidského hepatocelulárního karcinomu (například Help G2), buňky hovězích ledvin Madin-Darby („MDBK“) a další. Podobně bakteriální hostitelé, jako je E. coli, Bacillus substilis a Streptococcus spp., naleznou použití s uvažovanými konstrukty exprese. Kvasinkoví hostitelé použitelní v tomto vynálezu zahrnují mimo jiné Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe a Yarrowia lipolytica. Hmyzí buňky pro použití s vektory exprese bakuloviru zahrnují mimo jiné Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx moři, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda a Trichoplusia ni.

Molekuly nukleových kyselin zahrnující dané nukleotidové sekvence se mohou stabilně integrovat do genomu hostitelské buňky nebo udržovat na stabilním episomálním elementu ve vhodné hostitelské buňce s použitím různých způsobů dodání genu dobře známých v oboru. Viz například patent US 5 399 346.

V závislosti na systému exprese a zvoleném hostiteli se tyto molekuly obdrží pěstováním hostitelských buněk transformovaných výše popsaným vektorem exprese za podmínek, při kterých se exprimuje protein. Exprimovaný protein se poté izoluje z hostitelských buněk a purifikuje. Pokud systém exprese vylučuje protein do média, lze produkt purifikovat přímo z média. Pokud se nevylučuje, může se izolovat z lyzátů buněk. Volba vhodných růstových podmínek a způsobů získávání spadá do oblasti zkušeností v oboru.

Popisuje se rekombinační tvorba různých HCV antigenů. Viz například Houghton a kol., patent US 5 350 671, Chien a kol., J. Gastroent. Hepatol., 8 S33-39 (1993), Chien a kol., mezinárodní přihláška WO 93/00 365, D. Y. Chien, mezinárodní přihláška WO 94/01 778.

Imunodiagnostické eseje

Připravené protilátky proti jádru a antigeny NS3/4a popsané výše se umístí na vhodný pevný nosič pro použití při imunoeseji subjektů. Pevný nosič pro účely podle tohoto vynálezu může být jakákoliv látka, která má nerozpustnou matrici a může vykazovat tuhý či polotuhý povrch. Příklady pevných nosičů zahrnují, avšak bez omezení, substráty, jako je nitrocelulosa (například v membráně ve formě mikrotitrační jamky), polyvinylchlorid (například listy nebo mikrotitrační

-26CZ 304185 B6 jamky), polystyrénový latex (například kuličky nebo mikrotitrační misky), polyvinylidinfluorid, diazotovaný papír, nylonové membrány, aktivované kuličky, magnetické kuličky a podobně. Konkrétní nosiče zahrnují desky, pelety, disky, kapiláry, dutá vlákna, jehly, kolíčky, tuhá vlákna, celulosové kuličky, kuličky z pórovitého skla, silikagely, polystyrénové kuličky případně zesíťované divinylbenzenem, kopolymerové kuličky, polyakrylamidové kuličky, latexové kuličky, dimethylakrylamidové kuličky případně zesíťované Ν,Ν'-bis-akryloylethylendiaminem a skleněné částice potažené hydrofobním polymerem.

V případě požadavku lze molekuly přidávané k pevnému nosiči snadno opatřit funkčními skupinami s vytvořením styrenových či akrylátových zbytků, čímž se umožňuje inkorporace molekul do polystyrenu, polyakrylátu či dalších polymerů, jako je polyamid, polyakrylamid, polyethylen, polyvinyl, polydiacetylen, polyfenylen-vinylen, polypeptid, polysacharid, polysulfon, polypyrrol, polyimidazol, poiythiofen, polyether, epoxidové polymery, křemičité sklo, silikagel, siloxan, polyfosfát, hydrogel, agarosa, celulosa a podobně.

V jednom z případů se pevný nosič nechá nejprve reagovat s protilátkami proti jádru HCV a epitopem NS3/4a (zde společně nazývané „komponenty pevné fáze“) a případně s jednou nebo více MEFA za vhodných podmínek vazby tak, aby se molekuly dostatečně immobilizovaly na nosiči. Někdy lze immobilizaci na nosiči zvýšit nejprve připojením antigenu a/nebo protilátky k proteinu s lepšími vazebnými vlastnostmi vůči tuhé fázi. Vhodné spojovací proteiny zahrnují, avšak bez omezení, molekuly, jako jsou serumalbuminy včetně bovinního serumalbuminu (BSA), keyhole limpet hemocyaninu, molekul imunoglobulinu, thyroglobulinu, ovalbuminu a dalších proteinů dobře známých v oboru. Lze použít další prostředky pro vazbu molekul na nosič včetně polysacharidů, polymléčných kyselin, polyglykolových kyselin, polymerních aminokyselin, aminokyselinových kopolymerů a podobně. Tyto molekuly a způsoby připojování těchto molekul k antigenům znají dobře ti, kdo mají zkušenost v oboru. Viz například M. A. Brinkley, Bioconjugate Chem., 3 2-13 (1992), Hashida a kol., J. Appl. Biochem. 6, 56-63 (1984) a Anjaneyulu a Staros, International J. of Peptide and Protein Res., 30, 117-124 (1987).

Po reakci tuhého nosiče se složkami tuhé fáze se jakékoliv neimmobilizované komponenty tuhé fáze odstraní z nosiče promytím a komponenty navázané na nosič se poté přivedou do styku s biologickým vzorkem s podezřením na protilátky a antigeny HCV (zde společně nazývané „molekuly ligandů“) za vhodných vazebných podmínek. Po promytí pro odstranění nenavázaných molekul ligandů se za vhodných podmínek vazby přidá druhá protilátka proti jádru zaměřená proti jinému epitopu než protilátka proti jádru navázaná na nosič. Přidaná protilátka proti jádru obsahuje detekovatelnou značku, jak se popisuje výše, a působí ve smyslu vazby jakéhokoliv antigenu jádra, který může být přítomen ve vzorku, který reagoval s protilátkou proti jádru navázanou na nosič. Také se přidá jeden či více antigenů, které mohou reagovat s protilátkami přítomnými ve vzorku a které reagovaly s epitopem NS3/4a. Jak se popisuje výše, odvozuje se antigen obvykle od oblasti NS3 polyproteinu HCV a zejména od oblasti c33c HVC. Viz Houghton a kol., patent US 5 350 671, Chien a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., 89, 10011-10015 (1989), mezinárodní přihláška WO 93/00 365, patentová přihláška US 08/403 590 a US 08/444 818 ohledně popisu této oblasti a epitopů, které se od ní odvozují. Přidá se též značená protilátka zaměřená proti tomuto antigenu. Tato protilátka bude tedy vázat antigen, který reagoval s protilátkami proti NS3 přítomnými ve vzorku. Pro tento účel lze zajistit výhodně epitop c33c jako spojení mezi c33c a lidskou superoxid dismutasou (hSOD) obdrženou rekombinantně, například způsoby popsanými v Houghton a kol., patent US 5 350 671. Nukleotidové a aminokyselinové sekvence pro lidskou SOD jsou známé a popisují se v Hallewel a kol. patent US 5 710 033. Značenou protilátku zaměřenu proti lidské SOD lze tedy použít pro detekci přítomnost komplexů tvořených mezi epitopem NS3/4a, jakýmikoliv protilátkami ve vzorku reagujícími s tímto epitopem a polypeptidy HCV, které se vážou na protilátku ve vzorku.

V případě přítomnosti MEFA na pevném nosiči lze k eseji též přidat jeden či více dalších antigenů reaktivních s protilátkami z biologického vzorku, které jsou vázané na antigeny přítomné na MEFA. Zvláště užitečný je v této souvislosti antigen odvozený od oblasti jádra HCV a zejména

-27CZ 304185 B6 od c22 antigenu, který zahrnuje 119 N terminální aminokyseliny jádra HCV polyproteinu. Jeden konkrétní antigen odvozený od c22 je c22ks delta47-L44W, který obsahuje aminokyseliny Lys_]0 až Ser₉₉ polyproteinu, stejně tak jako deleci Arg47 normálně přítomného a substituci Leu místo Trp v poloze 44. Podobně jako epitop c33c popsaný výše lze tento antigen obdržet jako spojení s hSOD a stejnou značenou protilátkou zaměřenou proti lidské SOD a lze jej použít pro detekci přítomnosti komplexů tvořených mezi protilátkami přítomnými ve vzorku a epitopem NS3/4a a/nebo MEFA, jehož komplexy jsou též vázané s antigeny HCV (například c33c a c22).

Konkrétněji lze použít metodu ELISA, kde jsou jamky mikrotitrační desky potažené komponenty pevné fáze. Biologický vzorek obsahující molekuly ligandu nebo vzorek, u kterého je podezření na obsah těchto molekul, se poté přidá do těchto potažených jamek. Po době inkubace dostatečné pro umožnění vazby molekuly ligandu s immobilizovanou složkou pevné fáze se miska (misky) promyje (promyjí) pro odstranění nevázaných zbytků a přidá se detekovatelně značená molekula sekundární vazby (značená protilátka proti jádru), molekula obsahující NS3 epitop a protilátka zaměřená proti molekule obsahující NS3 epitop. Tyto molekuly se ponechají reagovat sjakýmkoliv zachyceným antigenem a protilátkou ve vzorku, miska se promyje a přítomnost značených protilátek se detekuje způsoby dobře známými v oboru.

Výše popsané reakční prostředky pro esej včetně pevného nosiče imunoeseje s navázanými protilátkami a antigeny, stejně tak jako s protilátkami a antigeny, které mají reagovat se zachyceným vzorkem, lze obdržet v soupravách s vhodnými pokyny a dalšími nezbytnými reakčními prostředky pro provedení imunoesejí podle popisu výše. Tato souprava může též obsahovat, v závislosti na konkrétní imunoesejí, vhodné značky a další balené chemikálie a látky (například promývací pufry a podobně). Standardní imunoeseje, jako jsou ty, které se popisují výše, lze provádět s použitím těchto souprav.

III. Experimentální část

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady specifických ztělesnění provedení tohoto vynálezu. Tyto příklady slouží pouze pro ilustrativní účely a žádným způsobem se neuvažují jako omezení obsahu tohoto vynálezu.

Je snahou zajistit správnost ohledně použitých hodnot (například množství, teplot atd.), avšak je třeba připustit určitou experimentální chybu a odchylku.

Příklad 1

Kombinační imunoesej HCV antigen/protilátka

Kombinační imunoesej HCV antigen/protilátka, která se zde popisuje, se srovnává sjinými esejemi HCV pro testování detekčních mezí serokonverze a srovnání těchto mezí s mezemi obdrženými v jiných komerčně dostupných esejích následujícím způsobem.

A. Materiály a způsoby provedení

Vzorky krve

Používají se komerčně dostupné soubory vzorků lidské krve. Tyto soubory lze obdržet například od Boston Biomedica. Inc., West Bridgewater MA (BBI), Bioclinical Partners, Franklin, MA (BCP) a North American Biologics, lne., BocoRatan, FL (NABI). Dny v tabulkách 5 a 6 jsou dny, ve kterých byly vzorky krve odebrány od osob.

-28CZ 304185 B6

Monoklonální protilátky

Monoklonální protilátky cl 1-3, cl 1-7 a cl 1-14 se obdrží od Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey. Protilátky cl 1-3 a cl 1-7 jsou zaměřené proti N-terminální části jádra (aminokyseliny 10 až 53, číslováno vzhledem k polyproteinu HCV1). Monoklonální protilátka cl 1-14 je zaměřená proti C-terminální části jádra (aminokyseliny 120 až 130, číslováno vzhledem k HCV1 polyproteinu). Protilátka cl 1-14 se konjuguje s křenovou peroxidasou (HRP) standardními způsoby.

Monoklonální protilátka 5A-3 je protilátka proti SOD, zaměřená proti aminokyselinám 1 až 65 SOD a připravuje se standardními způsoby. Tato protilátka se konjuguje s HRP, jak se popisuje výše.

B. Antigeny

Antigen c33c (266 aminokyselin, aminokyseliny 1192 až 1457 HCV1 polyproteinu) se exprimuje jako vnitřní SOD spojený polypeptid v E. coli způsoby popsanými pro přípravu antigenu 5-1-1 (Choo a kol., Science, 244, 359-362 (1989). Rekombinantní antigen se purifikuje podle popisu v Chien a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., 89, 10011-10015 (1989). Viz Houghton a kol., patent US 5 350 671 ohledně způsobů přípravy SOD-c33c.

Epitop NS3/4a použitý v eseji je konformační epitop mající sekvenci znázorněnou na obrázku 3.

C. Způsoby uspořádání imunoeseje

Esej Abbott PRISM (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) je komerčně dostupná aje to detekční esej založená na protilátce. Tato esej se provádí podle instrukcí výrobce.

ORTHO HCV Version 3.0 ELIAS Test System (nazývaná Ortho 3.0 esej v tomto patentu, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) je detekční esej založená na protilátce. Analýza se provádí podle instrukcí výrobce.

Souprava Roche Amplicor (Roche, Pleasant, CA) je komerčně dostupná souprava založená na PCR. Esej se provádí podle instrukcí výrobce.

Souprava Gen-Probe TMA (San Diego, CA) je komerčně dostupná transkripčně zprostředkovaná amplifikační souprava. Esej se provádí podle instrukcí výrobce.

Souprava pro antigenovou esej Ortho (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) je detekční souprava založená na antigenu. Esej se provádí podle návodů výrobce.

Kombinační imunoesej HCV antigen subjektu/protilátka se provádí následujícím způsobem. 4 mg/ml každé z purifikovaných monoklonálních protilátek Cl 1-7 a Cl 1-3 v lx fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS), pH 7,4, se kombinuje a dobře promísí. K témuž potahovacímu pufru se přidá 90 ng rekombinantního antigenu NS3/4a. Roztok se míchá před potažením po dobu 30 min. 200 μΐ výše popsaného roztoku se přidá na jamku v 96-jamkových mikrotitračních miskách s médiem Costar (Corning, lne.). Misky se inkubují při teplotě 15 až 30 °C po dobu 16 až 24 h. Promyjí se dvakrát dH₂O, poté 300 μΐ na jamku pufru po potažení (1% bovinní serumalbumin, BSA, 1 x PBS) po dobu 1 h a stabilitním pufrem 300 μΐ na jamku (lx PBS, 1 % BSA, mannitol, polyethylenglykol, želatina) v průběhu 1 h. Roztoky se aspirují a suší při teplotě 4 °C v lyofilizačním zařízení po dobu 24 h. Misky se naplní desikačním prostředkem.

Pro provedení kombinační imunoeseje antigen/protilátka se do misky přidá 100 μΐ obohaceného pufru pro cytolýzu [1 % N-laurylsarkosinu, 0,65 M chlorid sodný, 50 mg/ml IgG čistoty pro

-29CZ 304185 B6 technické použití (Sigma, St. Louis, MO), 1 % BSA s modifikovanými thioskupinami (Bayer), 0,1 % kaseinu]. Poté se přidá 100 μΐ vzorku. Ten se inkubuje na třepacím zařízení při teplotě 40 °C po dobu 1 h. Misky se promyjí šestkrát lx PBS, 0,1% Tween-20 na zařízení Ortho Plate Washer. 200 μΐ roztoku konjugátu [zředění 1:75 cl 1-14-HRP s 250 ng/esej SOD-c33c antigenu plus zředění 1:5000 myší protilátky proti SOD-HRP v HCV 3.0 zřeďovacím prostředku pro vzorky (od ORTHO HCV verze 3.0 ELISA Test System, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) bez SOD extraktu, vše se připraví 30 min před přidáním]. Roztok se inkubuje 45 min za třepáni při teplotě 40 °C. Promyje se šestkrát jako výše a přidá se 200 μΐ roztoku substrátu (1 tableta OPD/10 ml). Tableta OPD obsahuje dihydrochlorid o-fenylendiaminu a peroxid vodíku pro tvorbu zbarvení křenovou peroxidasou a obdrží se od Sigma, St. Louis, MO. Směs se inkubuje po dobu 30 min při teplotě 15 až 30 °C ve tmě. Reakce se zastaví přídavkem 50 ml 4N roztoku kyseliny sírové a misky se odečítají při vlnové délce 492 nm vzhledem k absorbanci při 690 nm jako kontrole.

D. Výsledky

Výsledky různých eseji ukazují tabulky 5 a 6 znázorňující samostatné experimenty provedené na vzorcích krve exponovaných infekcí HCV. Srafované plochy ukazují detekci viru. Jak se ukazuje výše, kombinační esej antigen/protilátka detekuje serokonverzi ve všech vzorcích, zatímco všechny ostatní eseje založené na protilátce a antigenu alespoň v jednom ze vzorků nedetekují serokonverzi. Konkrétně žádná z eseji založených na protilátce nedetekuje serokonverzi alespoň do 18. dne (tabulka 5). Tabulka 6 ukazuje, že žádná z eseji založených na protilátce nedetekuje přítomnost HCV infekce v den 22. Navíc esej založená na antigenu Ortho není schopná detekovat serokonverzi od dnů 85 dále.

Proto je na základě výše popsaných výsledků zřejmé, že nová kombinační esej protilátka/antigen snižuje počet falešně negativních výsledků obdržených s použitím jiných konvenčních eseji založených na protilátce a antigenu.

Tabulka 5

Serokonverze HCV

Days	Abbott PRISM	Ortho 3.0	Roche Amplicor	Gen-Probe TMA	Ortho Ag	Chiron Ag/Ab
0	0,1	0,0	>5 x 105	• / 9,25 7'	>18,6	' 2,8
4 ·	θ,ι	0,0	>5 χ 105	9,29 γ :	19,0 ' <	SW-V
7	θ,ι	0,0	>5 χ 105 .	<?· 9t52 A í '	22,3,
13	0,3	0,1	>5 χ 105	. · 9, 5 9 '	.26,2;-'	WS'
18	1,3,	0.4	>5x105	-’· 9,70	15,9/	1,2 - a
21	2;2. '	1,0	’ >5 x 105 -		-Xá/
164	- 4,2 · '	4,4 '	4x 104 ' .	•9,28	0,11	·' ' 2,5

-30CZ 304185 B6

Tabulka 6

Serokonverze HCV

Days	Abbott PRISM	Ortho 3.0	Roche Amplicor	Gen-Probe TMA	Ortho Ag	Chiron Ag/Ab
0	θ/l	0,0	BLD		0,11	0,5
13	θ/l	0,0	>5x10’ ;		44,0	/'73,0? <'
20	0/1	0,0	A >5 x .10’7		./24)27
22	0,3	0,0	>5xl05		29,2	'· 'l,6s;a'.
85	.5,4a		BQR		0,06	7-/1,1./-
131	‘M',	4 7	BQR		0,09	- ........ 7,7^7.-7
135			? 3x 103		0,09	7w//
138	; '5,5		BLD		0,08	. ·.- · : t-i 7 7/71,2 ;; v .1 · ·· ·
146	5,9	INN·	BLD		0,11
152	5,2.7;		BQR		0,07	7? 1,8.7·

Příklad 2 io

Tvorba konformačního epitopu NS3/4a se substitucemi Thr na Pro a Ser na Ile

Konformační epitop NS3/4a se obdrží následujícím způsobem. Tento epitop má sekvenci znázorněnou na obrázcích 4A až 4D a liší se od nativní sekvence v polohách 403 (HCV-1 aminokyseli15 nová sekvence 1428 plné délky) a 404 (HCV-1 aminokyselinové sekvence 1429 plné délky). Konkrétně Thr vyskytující se normálně v poloze 1428 nativní sekvence mutuje na Pro a Ser, které v případě výskytu v poloze 1429 nativní sekvence, jsou mutovány na Ile.

Zvláště používaný kvasinkový expresní vektor je pBS24.l·, jak je popsáno výše. Plasmid pd.hcvla.ns3ns4aPI, který je kodován reprezentativním epitopem NS3/4a používaným v imunoeseji subjektu, se produkuje, jak je uvedeno dále. Používá se postup sestávající ze dvou kroků. Nejprve se spolu ligují dále uvedené části DNA: (a) syntetické oligonukleotidy, které by poskytly klonovací místo 5' HindlII následované sekvencí ACAAACAAA, iniciátor ATG a kodony HCVla počínaje aminokyselinou 1027 s pokračováním k místu BglI aminokyseliny 1046, (b) restrikční fragment 683 bp BglI-Clal (kódovací aminokyseliny 1046 až 1274) z pAcHL/Tns3ns4aPl a (c) vektor pSP72 (Promega, Madison, WI, GenBank/EMBL č. X65332, který byl zpracován HindlII a Clal, defosforylován a podroben gelové purifikaci. Plasmid pAcHLTns3ns4aPI se odvozuje od pAcHLT, vektoru bakulovirové exprese komerčně dostupného od BD Pharmingen (San Diego, CA). Konkrétně se připraví vektor pAcHLT EcoRl-Pstl a následující fragmenty:

EcoRI-Alwnl, 935 bp odpovídající aminokyselinám 1027 až 1336 geonomu HCV-1, AlwnlSacII, 247 bp odpovídající aminokyselinám 1336 až 1419 genomu HCV-1, Hinfl—BglI, 175 bp odpovídající aminokyselinám 1449 až 1509 genomu HCV-1, BglI—Pstl, 619 bp odpovídající aminokyselinám 1510 až 1711 genomu HCV-1 plus transkripční terminační kodon. SacII—Hinfl odvozený fragment 91 bp odpovídající aminokyselinám 1420 až 1448 genomu HCV-1 a obsahuji CZ 304185 B6 jící mutace Pl (Thr-1428 mutovaný na Pro, Ser-1429 mutovaný na lle) se liguje s fragmentem 175 bp Hinfl-Bgll a fragmentem 619 bp Bgll-Pstl popsaným výše a subklonuje do vektoru pGEM-5Zf(+) zpracovaného SacII a Pstl. pGEM-5Zf(+) je komerčně dostupný vektor E. coli (Promega, Madison, WI, GenBank/EMBL Accession Number X65308). Po transformaci kompetentních buněk HB101, se provádí miniscreening jednotlivých klonů a verifikace sekvence, fragment 885 bp SacII-Pstl z pGEM5.PI klonu 2 se čistí gelovou purifikací. Tento fragment se liguje s EcoRI-Alwnl 935 bp fragmentem, Alwnl SacII 247 bp fragmentem a pAcHLT EcoRI-Pstl vektorem popsaným výše. Výsledný konstrukce se nazývá pAcHLTns3ns4aPl.

Ligační směs popsaná výše se transformuje do HB101 kompetentních buněk a nanese na agarové desky Luria obsahující 100 pg/ml ampicilinu. Analýzy miniprep jednotlivých klonů vedou k identifikaci předpokládaných pozitivních vzorků, z nichž dva se amplifikují. Plasmid DNA pro pSP72 laHC, klony 1 a 2, se připraví s použitím soupravy Qiagen Maxiprep a sekvenuje.

Poté se spolu ligují následující fragmenty (a) 761 bp HindlII—Clal z pSP721aHC 1 [pSP72.1aHC se tvoří Iigací spolu s následujícími: pSP72 zpracovaný HindlII a Clal, syntetické oligonukleotidy poskytující klonovací místo 5' HindlII, následované sekvencí ACAAACAAA, iniciační klon ATG a kodony HCVla, počínaje aminokyselinou 1027 s pokračováním k místu BglII při aminokyselině 1046 a 683 bp BglII—Clal restrikční fragment (kódovací aminokyseliny 1046 až 1274) z pAcHLTns3-ns4aPI], (b) 1353 bp BamHI-HindlII fragment pro kvasinkový hybridní promotor ADH2/GAPDH, (c) 1320 bp Clal-Sall fragment (kódující HCVla aminokyseliny 1046 až 1711 s Thr 1428 mutovaným na Pro a Ser 1429 mutovaným na lle) z pAcHLTns3ns4aPI a (d) pBS24.1 kvasinkový expresní vektor, který je zpracovaný BamHI a Sáli, defosforylovaný a čištěný gelovou purifikací. Ligační směs se transformuje na kompetentní HB101 a nanáší na agarové desky Luria obsahující 100 pg/ml ampicilinu. Analýzy miniprep jednotlivých kolonií vedou k identifikaci klonu s očekávanou vloženou částí 3446 bp BamHI-SalI, která obsahuje ADH2/GAPDH promotor, iniciátorový kodon ATG a HCVla NS3/4a z aminokyselin 1027 až 1711 (znázorněné jako aminokyseliny 1 až 686 na obrázcích 4A až 4D) s Thr 1428 (poloha aminokyseliny 403 na obrázcích 4A až 4D) mutovaným na Pro a Ser 1429 (poloha aminokyseliny 404 na obrázcích 4A až 4D) mutovaným na lle. Konstrukt se nazývá pd.HCVla.ns3ns4aPl (viz obrázek 5).

S. cerevisiae, kmen AD3, se transformuje pd.HCVla.ns3ns4aPl a jednotlivé transformanty se ověří ohledně exprese po vyčerpání glukózy v médiu. Rekombinantní protein se exprimuje při vysokých hladinách v kvasinkách jak se detekuje barvením modří Coomassie a ověří imunoblotovací analýzou s použitím polyklonální protilátky proti helikasové doméně NS3.

Příklad 3

Purifikace konformačního epitopu NS3/4a

Konformační epitop NS3/4a se purifikuje následujícím způsobem. Buňky S. cerevisiae popsané výše exprimující epitop NS3/4a se sbírají, jak se popisuje výše. Buňky se suspendují v pufru pro cytolýzu (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM chloridu sodného, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,1 μΜ pepstatinu, 1 μΜ leupeptinu) a podrobí se cytolýze v zařízení Dyno-Mill (Wab Willy A. Bachofon, Basel, Švýcarsko) nebo ekvivalentní aparatuře s použitím skleněných kuliček v poměru 1:1:1 buňky:pufr:skleněné kuličky 0,5 mm. Lyzát se centrifuguje při 30100 g po dobu 30 min při teplotě 4 °C a peleta obsahující nerozpustnou proteinovou frakci se přidá kpromývacímu pufru (6 ml/g výchozí hmotnosti pelety buněk) a směs se pomalu míchá nakláněním při teplotě místnosti po dobu 15 min. Promývací pufr obsahuje koncentrace 50 mM fosforečnanu sodného, pH 8,0, 0,3 M chloridu sodného, 5 mM β-merkaptoethanolu, 10 % glycerolu, 0,05 % oktylglukosidu, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,1 μΜ pepstatinu, 1 μΜ leupeptinu. Zbytky z rozpadlých buněk se odstraní centrifugaci při 30100 g v průběhu 30 min při teplotě 4 °C. Supematant se odstraní do odpadu a peleta se zachová.

-32CZ 304185 B6

Z pelety se extrahuje protein následujícím způsobem. Přidá se 6 mg/g extrakčního pufru a směs se naklání při teplotě místnosti po dobu 15 min. Extrakční pufr obsahuje koncentrace 50 mM Tris, pH 8,0, 1 M chloridu sodného, 5 mM β-merkaptoethanolu, 10 % glycerolu, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,1 μΜ pepstatinu, 1 μΜ leupeptinu. Tato směs se centrifuguje při 30100 g po dobu 30 min při teplotě 4 °C. Supematant se zachová a přidá se síran amonný do koncentrace 17,5 % s použitím následujícího vzorce: objem supematantu (ml) násobený x % síranu amonného/(l-x % síranu amonného) = ml 4,1 M nasyceného síranu amonného pro přidání k supematantu. Síran amonný se přidává po kapkách za míchání na ledu a roztok se míchá na ledu po dobu 10 min. Roztok se centrifuguje při 17700 g po dobu 30 min při teplotě 4 °C a peleta se zachová a ukládá při teplotě 2 až 8 °C po dobu až 48 h.

Peleta se resuspenduje a aplikuje na kolonu Póly U (Póly U Sepharose 4B, Amersham Pharmacia) při teplotě 4 °C následujícím způsobem. Peleta se resuspenduje v 6 ml Póly U ekvilibračního pufru na gram hmotnosti pelety. Ekvilibrační pufr obsahuje 25 mM HEPES, pH 8,0, 200 mM chloridu sodného, 5 mM DTT (přidává se čerstvý), 10 % glycerolu, 1,2 % oktylglukosidu. Roztok se míchá nakláněním při teplotě 4 °C po dobu 15 min a centrifuguje při 31000 g po dobu 30 min při teplotě 4 °C.

Připraví se sloupec Póly U (1 ml pryskyřice na gram výchozí hmotnosti pelety). Lineární průtok je 60 cm/h a průtok náplně 133 % z 60 cm/h. Sloupec se upraví ekvilibračním pufrem a supernatant resuspendované amonium-sulfátové pelety se nanese na ekvilibrovanou kolonu. Kolona se promyje na výchozí hodnotu ekvilibračním pufrem a protein se eluuje stupňovou elucí v následujícím elučním pufru Póly U: 25 mM HEPES pH 8,0, 1 M chloridu sodného, 5 mM DTT (přidává se čerstvý), 10 % glycerolu, 1,2 % oktylglukosidu. Eluát z kolony se nanese na SDS-PAGE (barvený Coomassie) a alikvóty se zamrazí a uloží při teplotě -80 °C. Přítomnost epitopu NS3/4a se ověří Westernovým blotováním s použitím polyklonální protilátky zaměřené proti NS3 proteasové doméně a monoklonální protilátky proti 5-1-1 epitopu (HCV 4a).

Navíc se monitoruje proteasová enzymatická aktivita v průběhu purifikace následujícím způsobem. Peptid NS4A (KKGSVVIVGRIVLSGKPAIIPKK) a vzorek obsahující konformační epitop NS3/4a se zředí v 90 μΐ reakčního pufru (25 mM Tris, pH 7,5, 0,15 M chloridu sodného, 0,5 mM EDTA, 10 % glycerolu, 0,05 % n-dodecyl B-D-maltosidu, 5 mM DTT) a ponechá se míchat po dobu 30 min při teplotě místnosti. 90 μΐ směsi se přidá do mikrotitrační misky (Costar, lne., Corning, NY) a přidá se 10 μΐ HCV substrátu (AnaSpec, lne., San Jose CA). Miska se míchá a odečítá na čtecím zařízení Fluostar. Výsledky se vyjadřují jako relativní fluorescenční jednotky (RFU) za minutu.

Při použití těchto způsobů obsahuje produkt extrakce 1 M roztokem chloridu sodného aktivitu 3,7 RFU/min, sraženina síranu amonného má aktivitu 7,5 RFU/min a produkt purifikace Póly U má aktivitu 18,5 RFU/min.

Příklad 4

Kompetiční studie

Následující kompetiční studie se provádí pro vyhodnocení, zda konformační epitop NS3/4a detekuje různé protilátky nebo různé antigeny HCV. Konkrétně se srovnává antigen NS3/4a s antigenem c200 následujícím způsobem.

0,5 pg a 1,0 pg NS3/4a obdrženého, jak se popisuje výše, nebo c200 (Hepatology, 15, 19-25 (1992) od ORTHO HCV, Version 3.0 ELISA Test System, OrthoClinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) se smísí s 20 μΐ vzorku PHV914-5 (časný serokonverzní odběr krve obdržený

-33 CZ 304185 B6 z krve infikovaného jednotlivce) v celkovém objemu 220 μΐ (1 x PBS). Směs se inkubuje po dobu 1 h v mikrojamkách při teplotě 37 °C. Směs se přenese na misky potažené NS3/4a a inkubuje po dobu 1 h při teplotě 37 °C. Misky se promývají a analyzují následujícím způsobem.

1 pg antigenu c200 se přidá k 10 μΐ vzorku PHV914-5 v celkovém objemu zhruba 220 μΐ. Směs se inkubuje po dobu 1 h v mikrojamce při teplotě 37 °C a 200 μΐ se přenese na misku potaženou NS3/4a (100 ng/esej) a inkubuje po dobu 1 h při teplotě 37 °C. Misky se promyjí pětkrát 1 x PBS, 0,1% Tween-20. 200 μΐ roztoku konjugátu (podle popisu výše) se přidá a misky se inkubují a analyzují. Kontroly obsahující PHV914-5 a 1 x PBS (bez antigenu) se rovněž zpracují, io jak se popisuje výše.

Výsledky ukazuje tabulka 7. Výsledky procenta inhibice ve sloupci 4 se vypočítají jako hodnoty sloupce 3 minus (sloupec 2 dělený sloupcem 3 krát 100). Jak lze vidět, údaje ukazují, že NS34a se neutralizuje protilátkami časné serokonverze a c200 nikoliv. Silný signál se obdrží při reakci protilátek v členu souboru časné serokonverze PHV914-5 c33c s potahem NS34a na misce. Antigen c200 se neneutralizuje těmito protilátkami. To lze vidět ve vrchní části tabulky 7. Když se NS34a smísí se vzorkem PHV914-5, neutralizuje se, a proto nejsou ve vzorku přítomné žádné protilátky, které by reagovaly sNS34a naneseným na mikromisce. Údaje ukazují, že NS34a může detekovat jinou skupinu protilátek než c200.

Tabulka 7

Kompetiční studie ukazující detekci různých protilátek v souboru časné serokonverze c33c anti25 genem NS34a ve srovnání s antigenem c200

Příklad 5

Studie stability konformačního epitopu NS3/4a

Pro vyhodnocení úlohy stability epitopu NS3/4a při provedení eseje se provádí následující studie zjišťující imunoreaktivitu NS3/4a proti času při teplotě místnosti. Malé alikvóty zásobního roztoku NS3/4a se ponechají v klidu při teplotě místnosti a poté se zamrazí v časových intervalech udaných v tabulce 8. Všechny lahvičky se současně potáhnou a testují proti dvěma NS3 serokonverzním souborům.

-34CZ 304185 B6

Jak ukazuje tabulka 8, není zásobní NS3/4a stabilní a imunoreaktivita s časem klesá. Navíc je pro imunoreaktivitu nezbytné udržet konformaci NS3/4a.

Další stabilitní studie se provádějí následujícím způsobem. Dvě konformační monoklonální protilátky připravené proti NS3/4a standardními způsoby se substituují pro časné serokonverzní soubory proti HCV. Zásobní lahvičky NS3/4a se uchovávají při teplotě místnosti v časových intervalech 3, 6 a 24 h. NS3/4a ze zamrazených lahviček se potahuje při 90 ng/ml a podrobí analýze způsobem popsaným výše. Výsledky ukazují, že tyto dvě monoklonální látky jsou skutečně konformační a jejich reaktivita je citlivá na zacházení se zásobním antigenem NS3/4a při teplotě místnosti. Reaktivita pozitivní kontroly monoklonální protilátky se nemění.

Tabulka 8

-35CZ 304185 B6

Příklad 6

Imunoreaktivita konformačního epitopu NS3/4a ve srovnání s denaturovaným NS3/4a

Imunoreaktivita konformačního epitopu NS3/4a obdrženého podle popisu výše se srovnává sNS3/4a denaturovaným přípravkem SDS do přípravku konformačního epitopu NS3/4a do konečné koncentrace 2 %. Denaturovaný NS3/4a a konformační NS3/4a se nanáší na mikrotitrační misky, jak se popisuje výše. Na mikrotitrační misky se rovněž nanáší antigen c200 [Hepaio tology, 15, 19-25 (1992) ORTHO, HCV Version 3.0 ELISA Test System, Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey], Antigen c200 se používá pro srovnání a předpokládá se, že je nekonformační vzhledem k přítomnosti redukujícího Činidla (DTT) a detergentu (SDS).

Imunoreaktivita se testuje proti dvěma souborům časné HCV serokonverze, PHV 904 a PHV 914 15 (komerčně dostupné vzorky lidské krve od Boston Biomedica, lne., West Bridgewater, MA).

Výsledky ukazuje tabulka 9. Údaje ukazují, že denaturovaná či linearizovaná forma NS3/4a (stejně tak jako c200) nedetekuje časné serokonverzní soubory tak časně jako konformační epitop NS3/4a.

Tabulka 9

	NS</4a proti denat. NS3/4a
	*NS3/4a + 2	% SDS
		ŇS3/4a	dNS3/4a*	c200		NS3/4a	dNS3/4a*	c200
		OD	OD	OD		s/co	s/co	s/co
HCV	PHV 904-1	0,012	0,012	0,009		0,02	0,02	0,01
Serokonverze	PHV 904-2	0,011	0,009	0,008		0,02	0,01	0.01
	PHV 904-3	1,124	0,071	0,045			0,11	0,07
	PHV 904 4	2,401	0,273	0,129			0,44	0,21
	PHV 904-5	3,022	0,793	0,347			$&«28sS	0,57
	PHV 904-6	2,711	1,472	0,774				'^1?2f‘S
	PHV 904-7	3,294	1,860	0,943
	PHV 914-1	0,006	0,004	0,001		0,01	0,01	0,00
	PHV 914-2	0,005	0,004	0,002		0,01	0,01	0,00
	PHV 914-3	0,098 .	0,003	0,001		0,16	0,00	0,00
	PHV 914-4	1,118	0,006	0,004			0,01	0,01
	PHV 914-5	2,035	0,044	0,022			0,07	0,04
	PHV 914-6	2,092	0,074	0,025			0,12	0,04
	PHV 914-7	2,519	0,281	0,132			0,45	0,22
	PHV 914-8	2,746	0,907	0,500				0,82
	PHV 914-9	3,084	1,730	0,931				gSSáfeSW?
HCV 3.0	TJeg/koní.	0,023	0,024	0,008
Kontroly	Ncg. koni.	0,027	0,024	0,007
	Neg. kont.	0,021	0,017	0,005
	priímír	0,024	0,022	0,007
	odn/.nutí	0,624	0,622	0,607
	Poz. kont.	1,239	0,903	0,575		1,99	.....M5	0,95
	Poz. kom.	1,445	0,916	0,614		2,32	1,47	1,01

-36CZ 304185 B6

Imunoreaktivita konformačního epitopu se též testuje s použitím monoklonálních protilátek proti NS3/4a standardními způsoby. Tyto monoklonální protilátky se poté testují v uspořádání EL1SA proti NS3/4a a denaturovanému NS3/4a a antigenů c200. Údaje ukazují, že monoklonální proti5 látky proti NS3/4a reagují s NS3/4a a denaturovaným NS3/4a podobným způsobem jako se serokonverzními soubory, jak ukazuje tabulka 10. Tento výsledek též poskytuje další důkaz toho, že NS3/4a je svou povahou konformační, jak se mohou stát monoklonální protilátky, které jsou svou reaktivitou podobné časným serokonverzním souborům c33c.

o

Tabulka 10

	Miska	c200
NS3/4a	dNS3/4a
Monoklonální		OD	OD	OD
4B9/E3	1:100	1.820	0.616	0.369
	1:1000	1.397	0.380	0.246
	1:10000	0.864	0.173	0.070
	1:20000	0.607	0.116	0.085
5B7/D7	1:100	2.885	0.898	0.436
	1:1000	2.866	0.541	0.267
	1:10000	1.672	0.215	0.086
	1:20000	1.053	0.124	0.059
1A8/H2	1:100	1.020	0.169	0.080
	1:1000	0.921	0.101	0.043
	1:10000	0.653	0.037	0.013
	1:20000	0.337	0.027	0.011

Popisují se nové eseje pro detekci HCV. Z popisu výše je třeba si uvědomit, že specifická ztělesnění tohoto vynálezu zde slouží pouze pro účely ilustrace. Lze uskutečnit různé modifikace bez odchylky od myšlenky a obsahu vynálezu, který se zde popisuje.

Claims (25)

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Pevný nosič pro imunoeseje, vyznačující se tím, že se k němu připojuje alespoň jedna protilátka proti jádru viru hepatitidy C (HCV) a alespoň jeden izolovaný epitop HCV NS3/4a, přičemž epitop NS3/4a je konformační epitop a obsahuje sekvenci aminokyselin znázorněnou na obrázcích 4A až 4D.

2. Pevný nosič pro imunoeseje podle nároku 1, vyznačující se tím, že sek němu připojují alespoň dvě protilátky proti jádru HCV.

3. Pevný nosič pro imunoeseje podle nároku 1, vyznačující se tím, že alespoň jedna protilátka proti jádru je zaměřená proti N-terminální oblasti antigenu jádra HCV.

4. Pevný nosič pro imunoeseje podle nároku 3, vyznačující se tím, že alespoň jedna protilátka proti jádru je zaměřená proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV 1.

5. Pevný nosič pro imunoeseje podle nároku 1, vyznačující se tím, že alespoň jednou protilátkou proti jádru je monoklonální protilátka.

6. Pevný nosič pro imunoeseje podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále obsahuje připojený antigen vzniklý spojením více epitopů.

7. Pevný nosič pro imunoeseje podle nároku 6, vyznačující se tím, že antigen vzniklý spojením více epitopů obsahuje aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 7A až 7F.

8. Pevný nosič pro imunoeseje, vyznačující se tím, že se k němu připojují dvě monoklonální protilátky proti jádru viru hepatitidy C (HCV) a HCV NS3/4a konformační epitop zahrnující aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 4A až 4D.

9. Pevný nosič pro imunoeseje podle nároku 8, vyznačující se tím, že jsou tyto dvě protilátky proti jádru zaměřené proti N-terminální oblasti antigenu jádra HCV.

10. Pevný nosič pro imunoeseje podle nároku 9, vyznačující se tím, že jsou tyto dvě protilátky proti jádru zaměřené proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1.

11. Pevný nosič pro imunoeseje, vyznačující se tím, žesek němu připojují dvě monoklonální protilátky proti jádru viru C (HCV), HCV NS3/4a konformační epitop zahrnující aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 4A až 4D a antigen vzniklý spojením více epitopů zahrnující aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 7A až 7F.

12. Způsob detekce infekce virem hepatitidy C (HCV) v biologickém vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

(a) zajištění prvního nosiče pro imunoeseje podle nároku 1, (b) spojení biologického vzorku s tímto pevným nosičem za podmínek umožňujících HCV antigenům a protilátkám, pokud se vyskytují v biologickém vzorku, vázat se s alespoň jednou protilátkou proti jádru respektive s epitopem NS3/4a,

-38CZ 304185 B6 (c) přidání pevného nosiče z kroku (b) za podmínek tvorby komplexu (i) první detekovatelně značené protilátky, kde tato první detekovatelně značená protilátka je detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV, kde tato značená protilátka proti jádru se zaměřuje proti jinému epitopů jádra HCV než alespoň jedna protilátka proti jádru vázaná na pevný nosič, (ii) antigenu, který reaguje s protilátkou HCV z biologického vzorku reaktivní s epitopem NS3/4a a (iii) druhé detekovatelně značené protilátky, kde tato druhá detekovatelně značená protilátka je reaktivní s antigenem (ii), (d) detekci komplexů vytvořených protilátkami a antigeny, pokud k jejich tvorbě dochází, jako indikaci infekce HCV v biologickém vzorku.

13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že alespoň jedna protilátka proti jádru je zaměřená proti N-terminální oblasti antigenu jádra HCV a detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV je zaměřená proti C-terminální oblasti antigenu jádra HCV.

14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím. že alespoň jedna protilátka proti jádru je zaměřená proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1 a detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV je zaměřená proti aminokyselinám 120 až 130 HCV, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1.

15 na obrázcích 4A až 4D.

37. Způsob přípravy pevného nosiče pro imunoeseje, vyznačující se tím, že zahrnuje:

15. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že antigen reagující s protilátkou HCV z biologického vzorku obsahuje epitop z oblasti c33c polyproteinu HCV.

16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že se epitop c33c spojuje s aminokyselinovou sekvencí lidské superoxid dismutasy (hSOD) a druhá detekovatelně značená protilátka je reaktivní s touto aminokyselinovou sekvencí hSOD.

17. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že epitop NS3/4a je konformační epitop a zahrnuje aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 4A až 4D.

18. Způsob detekce infekce virem C (HCV) v biologickém vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

(a) zajištění pevného nosiče pro imunoeseje podle nároku 2, (b) spojení biologického vzorku s tímto pevným nosičem za podmínek umožňujících, aby se HCV antigeny a protilátky, pokud se vyskytují v biologickém vzorku, vázaly na alespoň dvě protilátky proti jádru respektive epitop NS3/4a, (c) přidání k pevnému nosiči z kroku (b) za podmínek tvorby komplexu (i) první detekovatelně značené protilátky, kde tato první detekovatelně značená protilátka je detekovatelně značenou protilátkou proti jádru HCV, kde tato značená protilátka proti jádru se zaměřuje proti jinému epitopu jádra HCV než alespoň dvě protilátky proti jádru vázané na pevný nosič, (ii) epitopů z oblasti c33c polyproteinu HCV připojeného na aminokyselinovou sekvenci hSOD a (iii) druhé detekovatelně značené protilátky, kde tato druhá detekovatelně značená protilátka je reaktivní s aminokyselinovou sekvencí hSOD, (d) detekci komplexů vytvořených mezi protilátkami a antigeny, pokud se tvoří, jako indikaci infekce HCV v biologickém vzorku.

19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že epitop NS3/4aje konformační epitop a obsahuje aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 4A až 4D.

-39CZ 304185 B6

20 (a) zajištění pevného nosiče a (b) vazbu dvou protilátek proti jádru viru hepatitidy C (HCV) a izolovaného HCV NS3/4a konformačního epitopů, který obsahuje sekvenci aminokyselin znázorněnou na obrázcích 4A až 4D.

20. Způsob detekce infekce virem hepatitidy C (HCV) v biologickém vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

(a) zajištění pevného nosiče pro imunoeseje podle nároku 8, (b) spojení biologického vzorku s tímto pevným nosičem za podmínek umožňujících, aby se HCV antigeny a protilátky, pokud se vyskytují v biologickém vzorku, vázaly na alespoň dvě protilátky proti jádru respektive konformační epitop NS3/4a, (c) přidání k pevnému nosiči z kroku (b) za podmínek tvorby komplexu (i) první detekovatelně značené protilátky, kde tato první detekovatelně značená protilátka je detekovatelně značenou protilátkou proti jádru HCV, kde tato značená protilátka proti jádru se zaměřuje proti jinému epitopu jádra HCV než alespoň dvě protilátky proti jádru vázané na pevný nosič, (ii) epitopu z oblasti c33c polyproteinu HCV připojeného na aminokyselinovou sekvenci hSOD a (iii) druhé detekovatelně značené protilátky, kde tato druhá detekovatelně značená protilátka je reaktivní s aminokyselinovou sekvencí hSOD, (d) detekci komplexů vytvořených mezi protilátkami a antigeny, pokud se tvoří, jako indikaci infekce HCV v biologickém vzorku.

21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že tyto alespoň dvě protilátky proti jádru jsou zaměřené proti N-terminální oblasti antigenu jádra HCV a detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV je zaměřená proti C-terminální oblasti antigenu jádra HCV.

22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že alespoň dvě protilátky proti jádru jsou zaměřené proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslováno vzhledem k sekvenci polyproteinu HCV1 a detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV je zaměřená proti aminokyselinám 120 až 130 HCV, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1.

23. Způsob detekce infekce virem hepatitidy C (HCV) v biologickém vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

(a) zajištění pevného nosiče pro imunoeseje podle nároku 6, (b) spojení biologického vzorku s tímto pevným nosičem za podmínek umožňujících HCV antigenům a protilátkám, pokud se vyskytují v biologickém vzorku, vázat se s alespoň jednou protilátkou proti jádru, epitopem NS3/4a a antigenem vzniklým spojením více epitopů, (c) přidání k pevnému nosiči z kroku (b) za podmínek tvorby komplexu (i) první detekovatelně značené protilátky, kde tato první detekovatelně značená protilátka je detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV, kde tato značená protilátka proti jádru se zaměřuje proti jinému epitopu jádra HCV než alespoň jedna protilátka proti jádru vázaná na pevný nosič, (ii) prvního a druhého antigenu, který reaguje s protilátkou HCV z biologického vzorku reaktivní s epitopem NS3/4a respektive s antigenem vzniklým spojením více epitopů a (iii) druhé detekovatelně značené protilátky, kde tato druhá detekovatelně značená protilátka je reaktivní s antigeny (ii), (d) detekci komplexů vytvořených mezi protilátkami a antigeny, pokud k jejich tvorbě dochází, jako indikaci infekce HCV v biologickém vzorku.

24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že tato alespoň jedna protilátka proti jádru je zaměřená proti N-terminální oblasti antigenu jádra HCV a první detekovatelně značená protilátka proti jádru HCV je zaměřená proti C-terminální oblasti antigenu jádra HCV.

-40CZ 304185 B6

25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že alespoň jedna protilátka proti jádru je zaměřená proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslováno vzhledem k sekvenci polyproteinu HCV1 a detekovatelné značená protilátka proti jádru HCV je zaměřená proti aminokyselinám 120 až 130 HCV, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1.

26. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že tento první antigen reagující s protilátkou HCV z biologického vzorku obsahuje epitop z oblasti c33c polyproteinu HCV.

27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že tento epitop c33c je spojený s aminokyselinovou sekvencí lidské superoxid dismutasy (hSOD) a druhá detekovatelné značená protilátka je reaktivní s touto aminokyselinovou sekvencí hSOD.

28. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že tento druhý antigen reagující s protilátkou HCV z biologického vzorku obsahuje epitop z oblasti c22 polyproteinu HCV.

29. Způsob podle nároku 28, vyznačující se tím., že epitop z oblasti c22 obsahuje aminokyseliny Lysio až Ser₉₉ polyproteinu HCV s deleci Arg47 a substitucí Leu místo Trp v poloze 44, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1, kde se tento epitop spojuje s aminokyselinovou sekvencí lidské superoxid dismutasy (hSOD) a druhá detekovatelné značená protilátka je reaktivní s touto aminokyselinovou sekvencí hSOD.

30. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že tento antigen vzniklý spojením více epitopů obsahuje aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázcích 7A až 7F.

31. Způsob detekce infekce virem C (HCV) v biologickém vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

(a) zajištění pevného nosiče pro imunoeseje podle nároku 11, (b) spojení biologického vzorku s tímto pevným nosičem za podmínek umožňujících, aby se HCV antigeny a protilátky, pokud se vyskytují v biologickém vzorku, vázaly na alespoň dvě protilátky proti jádru, konformační epitop NS3/4a, respektive antigen vzniklý spojením více epitopů, (c) přidání k pevnému nosiči z kroku (b) za podmínek tvorby komplexu (i) první detekovatelné značené protilátky, kde tato první detekovatelné značená protilátka je detekovatelné značenou protilátkou proti jádru HCV, kde tato značená protilátka proti jádru se zaměřuje proti jinému epitopu jádra HCV než alespoň dvě protilátky proti jádru vázané na pevný nosič, (ii) epitopu z oblasti c33c polyproteinu HCV připojeného na aminokyselinovou sekvenci hSOD a epitopu z oblasti c22 polyproteinu HCV připojeného na aminokyselinovou sekvenci hSOD (iii) druhé detekovatelné značené protilátky, kde tato druhá detekovatelné značená protilátka je reaktivní s aminokyselinovou sekvencí hSOD, (d) detekci komplexů vytvořených mezi protilátkami a antigeny, pokud se tvoří, jako indikaci infekce HCV v biologickém vzorku.

32. Způsob podle nároku 31, vyznačující se tím, že tyto alespoň dvě protilátky proti jádru se zaměřují proti N-terminální oblasti antigenu jádra HCV a první detekovatelné značená protilátka proti jádru HCV se zaměřuje proti C-terminální oblasti antigenu jádra HCV.

33. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že alespoň dvě protilátky proti jádru jsou zaměřené proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslováno vzhledem k sekvenci polyproteinu HCV1 a detekovatelné značená protilátka proti jádru HCV je zaměřená proti aminokyselinám 120 až 130 HCV, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1.

-41 CZ 304185 B6

34. Způsob podle nároku 31, vyznačující se tím, že epitop z oblasti c22 zahrnuje aminokyseliny Lysio až Ser₉₉ polyproteinu HCV s delecí Arg47 a substitucí Leu místo Trp v poloze 44, číslováno vzhledem k polyproteinové sekvenci HCV1.

5

35. Souprava pro imunodiagnostické zkoušky, vyznačující se tím, že obsahuje pevný nosič pro imunoeseje podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11 a pokyny pro provádění imunodiagnostické zkoušky.

36. Způsob přípravy pevného nosiče, vyznačující se tím, že zahrnuje: io (a) zajištění pevného nosiče a (b) vazbu alespoňjedné protilátky proti jádru viru hepatitidy C (HCV) a alespoň jednoho izolovaného HCV NS3/4a konformačního epitopů, který obsahuje sekvenci aminokyselin znázorněnou

25 38. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 36 nebo 37, vyznačující se tím, že zahrnuje vazbu alespoň jednoho antigenu vzniklého spojením více epitopů s pevným nosičem.