PT1354204E - Ensaio de combinação dum antigénio/anticorpo para o hcv - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO EPÍGRAFE: "ENSAIO DE COMBINAÇÃO DUM ANTIGÉNIO/ANTICORPO PARA 0 HCV"

Campo Técnico A presente invenção relaciona-se no geral com diagnósticos virais. Em particular, a invenção relaciona-se com um ensaio de combinação dum antigénio/ anticorpo para um diagnóstico preciso na infecção pelo virus da hepatite C.

Antecedentes da Invenção 0 Virus da Hepatite C (HCV) é a principal causa de hepatite não-A, não-B parentérica (NANBH) que é transmitida principalmente através de transfusão sanguínea e contacto sexual. 0 vírus está presente em 0.4 a 2.0% dos dadores de sangue. Em cerca de 50% dos casos de infecção desenvolve-se hepatite crónica e, destes, cerca de 20% dos indivíduos infectados desenvolvem cirrose do fígado, que por vezes conduz a carcinoma hepatocelular. Daqui deriva a importância médica do estudo e controlo da doença. O HCV foi primeiramente identificado e caracterizado como uma causa de NANBH por Houghten et al. A sequência genómica virai do HCV é conhecida, bem como os métodos de obtenção da mesma sequência. Consultar, por exemplo, as Publicações Internacionais Nos. WO 89/04669, WO 90/11089 e WO 90/14436. O HCV tem um genoma de RNA de cadeia simples de sentido positivo de 9.5 kb e é um membro da família dos vírus Flaviridae. Foram identificados pelo menos 6 genótipos distintos, mas relacionados com HCV, baseados em análises filogenéticas 1 (Simmonds et al., J. Gen. Virai. (1993) 74:2391-2399). 0 vírus codifica uma única poliproteína com mais de 3000 resíduos de aminoácidos (Choo et al., Science (1989) 244:359-362; Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1991) 88:2451-2455; Han et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1991) 88:1711-1715). A poliproteína é processada simultaneamente e após a tradução em proteínas estruturais e não estruturais (NS) .

Em particular, como apresentado na Figura 1, várias proteínas são codificadas pelo genoma de HCV. A ordem e nomenclatura dos produtos clivagem da poliproteína de HCV é como se segue: NH2-C-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. A clivagem inicial da poliproteína é catalisada por proteases hospedeiras que libertam três proteínas estruturais, a proteína nucleocápside N-terminal (denominada "núcleo") e duas glicoproteínas envelope, "El" (também conhecida como E) e "E2" (também conhecida como E2/NS1), bem como proteínas não estruturais (NS) que contêm as enzimas virais. As regiões NS são denominadas NS2, NS3, NS4 e NS5. A NS2 é uma proteína de membrana integral com actividade proteolítica. A NS2, quer sozinha ou em combinação com a NS3, cliva a forte ligação NS2-NS3 que, por sua vez, cria a NS3 N-terminal e liberta uma poliproteína grande que inclui as actividades da protease de serina e da helicase de RNA. A protease de NS3 serve para processar a poliproteína restante. A finalização da maturação da poliproteína é inicializada por clivagem autocatalítica na junção de NS3-NS4a, catalisada pela protease da serina de NS3. A subsequente clivagem mediada por NS3 da poliproteína HCV parece envolver o reconhecimento das junções de clivagem da poliproteína por uma molécula NS3 de outro polipéptido. Nestas reacções, a NS3 liberta um cofactor de NS3 (NS4a), duas proteínas (NS4b e NS5a) uma RNA polimerase dependente de RNA (NS5b). 2 Têm sido descritos um número de polipéptidos gerais e específicos úteis como reagentes de diagnóstico e imunológicos para HCV, derivados a partir da poliproteína HCV. Cosultar, por exemplo, Houghton et al., European Publication Nos. 318,216 e 388,232; Choo et al., Science (1989) 244:359-362; Kuo et al., Science (1989) 244:362-364; Houghton et al., Hepatology

(1991) 14:381-388; Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1992) 89:10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien et al., Publicação Internacional N°. WO 93/00365; Chien, D.Y., Publicação Internacional N°. WO 94/01778. Estas publicações fornecem extensivos antecedentes sobre HCV, generalidade, bem como sobre a manufactura e usos dos reagentes imunológicos de polipéptidos de HCV.

Os métodos sensíveis e específicos para pesquisa e identificação de transportadores de HCV e sangue contaminado com HCV ou produtos sanguíneos deverão fornecer uma vantagem importante em medicina. A hepatite pós-transfusão (PTH) ocorre em aproximadamente 10% dos pacientes transfusionados, e o HCV é responsável por cerca de 90% destes casos. O tratamento do paciente bem como a prevenção e transmissão de HCV pelo sangue e produtos sanguíneos ou por contactos pessoais íntimos requerem diagnósticos fiáveis e ferramentas de prognóstico. Assim, têm sido desenvolvidos vários ensaios para o serodiagnóstico da infecção por HCV. Consultar, por exemplo, Choo et al., Science (1989) 244:359-362; Kuo et al., Science (1989) 244:362-364; Choo et al., Br. Mod. Buli. (1990) 46:423-441; Ebeling et al., Lancet (1990) 335:982-983; van der Poel et al., Lancet (1990) 335:558-560; van der Poel et al., Lancet (1991) 337:317-319; Chien, D.Y., Publicação Internacional N°. WO 94/01778; Vatenzuela et al., Publicação Internacional N°. WO 97/44469; e Kashiwakuma et al., Patente U.S. N°. 5,871,904. 3

Um problema significativo encontrado com alguns ensaios baseados no soro é que existe um lapso significativo entre a infecção e a detecção do vírus, geralmente, excedendo os 80 dias. Este hiato no ensaio pode criar um risco maior para os receptores de transfusão. Para ultrapassar este problema, testes à base de ácido nucleico (NAT) que detectam RNA virai directamente e testes de antigénio do núcleo de HCV que ensaiam o antigénio virai em vez da resposta do anticorpo, têm sido desenvolvidos. Consultar, por exemplo, Kashiwakuma et al., Patente U.S. N°. 5,871,904; Beld et al., Transfusion (2000) 40:575-579.

No entanto, permanece uma necessidade para ferramentas de prognóstico e diagnóstico precisas e sensíveis, de modo a fornecer os cuidados adequados aos pacientes, bem como para prevenir a transmissão de HCV através do sangue e produtos sanguíneos ou através do contacto pessoal íntimo.

Sumário da Invenção A presente invenção é baseada em parte, na descoberta que os anticorpos de seroconversão de HCV são, tipicamente, anti-núcleo e anti-NS3 (helicase) . Assim, a invenção fornece um ensaio de antigénio do núcleo de HCV e combinação de anticorpo de NS3 que pode ser detectado tanto por anticorpos como por antigénios de HCV presentes numa amostra usando uma matriz sólida única.

Assim, numa modalidade, o objecto da invenção está direccionado para um suporte sólido de imunoensaio que compreende pelo menos um anticorpo anti-núcleo de HCV e pelo menos um epitopo de HCV NS3/4a isolado aí ligado. O anticorpo e o epitopo NS3/4a podem ser quaisquer das moléculas aqui descritas. Adicionalmente, o suporte sólido pode incluir qualquer dos antigénios de fusão de múltiplos epitopos aqui descritos, tais como o antigénio de fusão de múltiplo epitopo 4 que compreende a sequência de aminoácidos representada nas Figuras 7A-7P.

Em determinadas modalidades, o suporte sólido compreende pelo menos dois anticorpos anti-núcleo de HCV ai ligados. Além disso, o anticorpo anti-núcleo pode ser um anticorpo monoclonal. Adicionalmente, o epitopo NS3/4a pode ser um epitopo conformacional, tal como um epitopo NS3/4a conformacional que compreende a sequência de aminoácidos representada nas Figuras 4A-4D.

Numa outra modalidade, a invenção está direccionada para um suporte sólido de imunoensaio que compreende, pelo menos, dois anticorpos monoclonais anti-núcleo de HCV e pelo menos um epitopo conformacional HCV NS3/4a que compreende a sequência de aminoácidos representada nas Figuras 4A-4D, ai ligada.

Numa ainda outra modalidade, a invenção está direccionada para um método para detectar a infecção por HCV numa amostra biológica. 0 método compreende: (a) fornecer um suporte sólido de imunoensaio como descrito acima; (b) combinar uma amostra biológica com o suporte sólido sob condições que permitem os anticorpos e antigénios de HCV, quando presentes na amostra biológica, ligarem-se ao pelo menos um anticorpo anti-núcleo e ao epitopo NS3/4a, respectivamente; (c) adicionar ao suporte sólido a partir do passo (b) sob condições de formação de complexo (i) um primeiro anticorpo detectavelmente marcado, em que o primeiro anticorpo é um anticorpo anti-núcleo de HCV detectavelmente marcado, em que o anticorpo anti-núcleo marcado está direccionado contra um epitopo do núcleo de HCV diferente do pelo menos um anticorpo anti-núcleo ligado ao suporte sólido; (ii) um antigénio que reage com um anticorpo de HCV a partir da amostra biológica reactiva com o epitopo NS3/4a; e (iii) um segundo anticorpo detectavelmente marcado, em que o segundo anticorpo detectavelmente marcado é reactivo com o antigénio de (ii); e (d) detectar os complexos formados 5 entre os anticorpos e os antigénios, se algum, como uma indicação de infecção por HCV na amostra biológica. Adicionalmente, o epitopo NS3/4a pode ser um epitopo conformacional, tal como um epitopo NS3/4a conformacional que compreende a sequência de aminoácidos representada nas Figuras 4A-4D.

Ainda noutra modalidade, a invenção está direccionada para um método de detecção da infecção por HCV numa amostra biológica. 0 método compreende: (a) fornecer um suporte sólido de imunoensaio com pelo menos dois anticorpos anti-núcleo de HCV ai ligados, como descrito acima; (b) combinar uma amostra biológica com o suporte sólido sob condições que permitem os anticorpos e antigénios de HCV, quando presentes na amostra biológica, ligarem-se aos pelo menos dois anticorpos anti-núcleo e ao epitopo NS3/4a, respectivamente; (c) adicionar ao suporte sólido a partir do passo (b) sob condições de formação de complexo (i) um primeiro anticorpo detectavelmente marcado, em que o primeiro anticorpo é um anticorpo anti-núcleo de HCV detectavelmente marcado, em que o anticorpo anti-núcleo marcado está direccionado contra um epitopo do núcleo de HCV diferente do pelo menos um anticorpo anti-núcleo ligado ao suporte sólido; (ii) um epitopo a partir da região c33c da poliproteina de HCV fundida a uma sequência de aminoácidos para hSOD; e (iii) um segundo anticorpo detectavelmente marcado, em que o segundo anticorpo detectavelmente marcado é reactivo com a sequência de aminoácidos para hSOD; e (d) detectar os complexos formados entre os anticorpos e os antigénios, se algum, como uma indicação de infecção por HCV na amostra biológica. Adicionalmente, o epitopo NS3/4a pode ser um epitopo conformacional, tal como um epitopo NS3/4a conformacional que compreende a sequência de aminoácidos representada nas Figuras 4A-4D. 6

Em qualquer uma das modalidades acima, o anticorpo anti-núcleo pode ser direccionado contra uma região N-terminal do antigénio do núcleo de HCV, tal como contra os aminoácidos 10-53 de HCV, numerados relativamente à sequência da poliproteína de HCV1, e/ou o anticorpo anti-núcleo de HCV detectavelmente marcado pode ser direccionado contra uma região C-terminal do antigénio do núcleo de HCV, tal como os aminoácidos 120-130 de HCV, numerados relativamente à sequência da poliproteína de HCV1. Além disso, o antigénio que reage com um anticorpo de HCV, a partir da amostra biológica, pode ser a partir da região NS3, tal como um epitopo a partir da região c33c da poliproteína de HCV e pode ser fundido com uma sequência aminoácidos da superóxido dismutase humana (hSOD). Nesta modalidade, o segundo anticorpo detectavelmente marcado é reactivo com a sequência de aminoácidos de hSOD.

Noutra modalidade, a invenção está direccionada para um método de detecção da infecção por HCV numa amostra biológica. O método compreende: (a) fornecer um suporte sólido de imunoensaio incluindo dois anticorpos monoclonais anti-núcleo de HCV e um epitopo conformacional que compreende a sequência de aminoácidos representada nas Figuras 4A-4D; (b) combinar uma amostra biológica com o suporte sólido sob condições que permitem os anticorpos e antigénios de HCV, quando presentes na amostra biológica, ligarem-se aos pelo menos dois anticorpos anti-núcleo e ao epitopo NS3/4a conformacional, respectivamente; (c) adicionar ao suporte sólido a partir do passo (b) sob condições de formação de complexo (i) um primeiro anticorpo detectavelmente marcado, em que o primeiro anticorpo detectavelmente marcado é um anticorpo anti-núcleo de HCV detectavelmente marcado, em que o anticorpo anti-núcleo marcado está direccionado contra um epitopo do núcleo de HCV diferente dos pelo menos dois anticorpos anti-núcleo ligados ao suporte sólido; (ii) um epitopo a partir da região c33c da 7 poliproteína de HCV fundida a uma sequência de aminoácidos para hSOD; e (iii) um segundo anticorpo detectavelmente marcado, em que o segundo anticorpo detectavelmente marcado é reactivo com a referida sequência de aminoácidos para hSOD; detectar os complexos formados entre os anticorpos e os antigénios, se algum, como uma indicação de infecção por HCV na amostra biológica.

Em determinadas modalidades, os pelo menos dois anticorpos anti-núcleo estão direccionados contra uma região N-terminal do antigénio do núcleo de HCV, tal como contra os aminoácidos 10-53 de HCV, numerados relativamente à sequência da poliproteina de HCV1, e o anticorpo anti-núcleo de HCV detectavelmente marcado pode ser direccionado contra uma região C-terminal do antigénio do núcleo de HCV, tal como os aminoácidos 120-130 de HCV, numerados relativamente à sequência da poliproteina de HCV1.

Noutra modalidade, a invenção está direccionada para um método de detecção da infecção por HCV numa amostra biológica. O método compreende: (a) fornecer um suporte sólido de imunoensaio que inclui um antigénio de fusão de epitopos múltiplos; (b) combinar uma amostra biológica com o suporte sólido sob condições que permitem os anticorpos e antigénios de HCV, quando presentes na amostra biológica, ligarem-se ao pelo menos um anticorpo anti-núcleo, ao epitopo NS3/4a e ao antigénio de fusão de epitopos múltiplos; (c) adicionar ao suporte sólido a partir do passo (b) sob condições de formação de complexo (i) um primeiro anticorpo detectavelmente marcado, em que o primeiro anticorpo detectavelmente marcado é um anticorpo anti-núcleo de HCV detectavelmente marcado, em que o anticorpo anti-núcleo marcado está direccionado contra um epitopo do núcleo de HCV diferente do pelo menos um anticorpo anti-núcleo ligado ao suporte sólido; (ii) o primeiro e segundo antigénios que reagem com um anticorpo de HCV a partir 8 da amostra biológica reactiva com o epitopo NS3/4a e com o antigénio de fusão de epitopos múltiplos; e (iii) um segundo anticorpo detectavelmente marcado, em que o segundo anticorpo detectavelmente marcado é reactivo com o antigénio de (ii); (d) detectar os complexos formados entre os anticorpos e os antigénios, se algum, como uma indicação de infecção por HCV na amostra biológica. 0 anticorpo anti-núcleo pode ser direccionado contra uma região N-terminal do antigénio do núcleo de HCV e o referido primeiro anticorpo anti-núcleo de HCV detectavelmente marcado pode ser direccionado contra uma região C-terminal do antigénio do núcleo de HCV, como descrito acima. Além disso, o primeiro antigénio que reage com um anticorpo de HCV a partir da amostra biológica pode compreender um epitopo a partir da região c33c da poliproteina de HCV e pode ser fundida com uma sequência de aminoácidos de hSOD. Neste contexto, o segundo anticorpo detectavelmente marcado é reactivo com a sequência de aminoácidos de hSOD. Adicionalmente, o segundo antigénio que reage com um anticorpo de HCV a partir da amostra biológica pode compreender um epitopo a partir da região c22 da poliproteina de HCV, tal como um epitopo que compreende os aminoácidos Lysio a Ser99 da poliproteina de HCV, com uma depleção de Arg47 e uma substituição e Leu por Trp na posição 44, numerada relativamente à sequência da poliproteina de HCV1. 0 epitopo pode ser fundido com uma sequência de aminoácidos de hSOD. Assim sendo, o segundo anticorpo detectavelmente marcado é reactivo com a sequência de aminoácidos de hSOD. 0 antigénio de fusão múltiplos epitopos pode compreender a sequência de aminoácidos representada nas Figuras 7A-7F.

Ainda numa outra modalidade, a invenção está direccionada para um método para detectar a infecção por HCV numa amostra biológica, o referido método compreendendo: (a) fornecer um 9 suporte sólido de imunoensaio que compreende dois anticorpos monoclonais anti-núcleo de HCV, um epitopo conformacional NS3/4a de HCV que compreende a sequência de aminoácidos representada nas Figuras 4A-4D, e um antigénio de fusão de epitopos múltiplos que compreende a sequência de aminoácidos representada nas Figuras 7A-7P, ai ligado; (b) combinar uma amostra biológica com o suporte sólido sob condições que permitem que os anticorpos e antigénios de HCV, quando presentes na amostra biológica, ligarem-se aos pelo menos dois anticorpos anti-núcleo, o epitopo conformacional NS3/4a, e o antigénio de fusão de epitopos múltiplos, respectivamente; (c) adicionar ao suporte sólido do passo (b) sob condições de formação de complexo (i) um primeiro anticorpo detectavelmente marcado, em que o primeiro anticorpo detectavelmente marcado é um anticorpo anti-núcleo de HCV detectavelmente marcado, em que o anticorpo anti-núcleo marcado está direccionado contra um epitopo do núcleo de HCV diferente dos pelo menos dois anticorpos anti-núcleo ligados ao suporte sólido; (ii) um epitopo a partir da região c33c da poliproteina de HCV fundida à sequência de aminoácidos de hSOD e um epitopo a partir da região c22 da poliproteina fundida à sequência de aminoácidos hSOD; e (iii) um segundo anticorpo detectavelmente marcado, em que o referido anticorpo detectavelmente marcado é reactivo com as referidas sequências de aminoácidos de hSOD; (d) detectar os complexos formados entre os anticorpos e antigénios, se algum, como uma indicação da infecção por HCV na amostra biológica.

Nesta modalidade, os pelo menos dois anticorpos anti-núcleo podem ser direccionados contra uma região N-terminal do antigénio do núcleo de HCV, tal como contra os aminoácidos 10-53 de HCV, numerados relativamente à sequência da poliproteina de HCV1, e o anticorpo anti-núcleo de HCV detectavelmente marcado pode ser direccionado contra uma região C-terminal do 10 antigénio do núcleo de HCV, tal como os aminoácidos 120-130 de HCV, numerados relativamente à sequência da poliproteína de HCV1. Além disso, o epitopo a partir da região c22 pode compreender os aminoácidos Lysio a Ser99 da poliproteína de HCV, com uma depleção de Arg47 e uma substituição de Leu por Trp na posição 44, numerada relativamente à sequência da poliproteína de HCVl.

Noutras modalidades, a invenção está direccionada para kits de testes de imunodiagnóstico que compreendem o suporte sólido de imunoensaio descrito acima, e instruções para realizar o teste de imunodiagnóstico. [0023] Ainda noutras modalidades, a invenção está direccionada para métodos de produção dum suporte sólido de imunoensaio, que compreende: (a) fornecer um suporte sólido; e (b) ligar pelo menos um anticorpo anti-núcleo de HCV, tal como um ou dois ou mais, e pelo menos um epitopo NS3/4a de HCV aí isolado e, opcionalmente, um antigénio de fusão de epitopos múltiplos. Os anticorpos anti-núcleo, os epitopos NS3/4a e antigénios de fusão de epitopos múltiplos são como descrito acima.

Em modalidades adicionais, a invenção está direccionada para um antigénio de fusão de múltiplos epitopos que compreende a sequência de aminoácidos representada nas Figuras 7A-7F, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% da identidade da sequência, assim como 90% ou mais da identidade da sequência, que aí reage especificamente com os anticorpos anti-HCV presentes numa amostra biológica a partir de um indivíduo infectado com HCV. Em determinadas modalidades, o antigénio de fusão de epitopos múltiplos consiste na sequência de aminoácidos representada nas Figuras 5A-5F.

Noutras modalidades, a invenção está direccionada para um polinucleótido que compreende uma sequência de codificação para o antigénio de fusão de epitopos múltiplos acima, vectores recombinantes que compreendem os polinucleótidos, 11 células hospedeiras transformadas com os vectores recombinantes e métodos de produção dum antigénio de fusão de epitopos múltiplos recombinante que compreende: (a) fornecer uma população de células hospedeiras como acima; e (b) pôr em cultura a população de células sob condições em que o antigénio de fusão de múltiplos epitopos codificado pela sequência de codificação presente no vector recombinante é expresso.

Este e outros aspectos da presente invenção tornar-se-ão evidentes após referência à seguinte descrição detalhada e desenhos anexos.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 é uma representação em diagrama do genoma de HCV, representando as várias regiões da poliproteina a partir das quais os reagentes de ensaio presentes (proteínas e anticorpos) são derivados. A Figura 2 é um desenho esquemático dum ensaio representativo de combinação anticorpo/antigénio da invenção. A Figura 3 representa a sequência de aminoácidos dum antigénio conformacional NS3/4a representativo para uso nos presentes ensaios. A alanina em negrito na posição 182 é substituída pela serina nativa normalmente presente nesta posição.

As Figuras 4A até 4D representam o DNA a sequência de aminoácidos dum antigénio conformacional NS3/4a representativo para uso nos presentes ensaios. Os aminoácidos nas posições 403 e 404 das Figuras 4A até 4D representam substituições de Pro por Thr e Ile por Ser, da sequência de aminoácidos nativos de HCV-1. A Figura 5 é um diagrama da construção de pd.HCVla.ns3ns4aPI. A Figura 6 é uma representação em diagrama de MEFA 12. 12

As Figuras 7A-7F representa o DNA e a sequência de aminoácidos que corresponde a ΜΕΡΑ 12. A Figura 8 é um desenho esquemático de um imunoensaio representativo da invenção, que usa ΜΕΡΑ 12.

Descrição Detalhada da Invenção A prática da presente invenção irá utilizar, a menos que indicado em contrário, métodos convencionais de química, bioquímica, técnicas de DNA recombinante e imunologia, dentro do estado da arte. Tais técnicas estão completamente explicadas na literatura. Consultar, por exemplo, Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.); Handbook of Experimental Immunology. Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); T.E. Creighton, Proteins:

Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.).

Deverá ser notado que, como usado nesta especificação e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um" e "o" incluem o plural referente a menos que o conteúdo dite claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um antigénio" inclui uma mistura de dois ou mais antigénios, e similares.

As seguintes abreviações de aminoácidos são usadas ao longo do texto:

Alanina: Ala (A) Arginina: Arg (R)

Asparagina: Asn (N) Ácido aspártico: Asp (D) 13

Cisteína: Cys (C) Glutamina: Gin (Q) Ácido glutâmico: Glu (E) Glicina: Gly (G) Histidina: His (IT) Isoleucina: Ile (I)

Leucina: Leu (L) Metionina: Met (M) Prolina: Pro (P) Treonina: Thr (T) Tirosina: Tyr (Y)

Lisina: Lys (K) Fenilalanina: Phe (F) Serina: Ser (S) Triptofano: Trp (W) Valina: Vai (V) I. Definições

Na descrição da presente invenção, os termos seguintes irão ser empregues e pretende-se que sejam definidos como indicado abaixo.

Os termos "polipéptido" e "proteina" referem-se a um polimero de residuos de aminoácidos e não estão limitados a um comprimento mínimo do produto. Assim, péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros e similares, estão incluídos dentro da definição. Os comprimentos completos das proteínas e dos seus fragmentos estão englobados pela definição. Os termos também incluem modificações pós-expressão do polipéptido, por exemplo, glicosilação, acetilação, fosforilação e similares. Além disso, para os propósitos da presente invenção, um "polipéptido" refere-se a uma proteína que inclui modificações, tais como depleções, adições e substituições (geralmente de natureza conservativa), na sequência nativa, desde que a proteína mantenha a desejada actividade. Estas modificações podem ser deliberadas, tais como as através de mutagénese dirigida, ou podem ser acidentais, tais como as através de mutações dos hospedeiros que produzem as proteínas ou erros devido à amplificação por PCR. [0033] Um polipéptido de HCV é um polipéptido, como definido acima, derivado da poliproteína de HCV. O polipéptido não necessita ser derivado fisicamente de HCV, mas pode ser produzido sinteticamente ou 14 de modo recombinante. Mais, o polipéptido pode ser derivado a partir de qualquer uma das várias estirpes de HCV, tal como a partir das estirpes 1, 2, 3 ou 4 de HCV. São conhecidas regiões conservadas e variáveis entre estas estirpes e, geralmente, as sequências de aminoácidos dos epitopos derivados a partir destas regiões irão ter um grau elevado de homologia de sequência, por exemplo, uma homologia da sequência de aminoácidos de mais de 30%, preferivelmente mais de 40%, quando as duas sequências estão alinhadas. Assim, por exemplo, o termo polipéptido "NS3/4a" refere-se ao NS3/4a nativo a partir de qualquer das várias estirpes de HCV, bem como aos análogos de NS3/4a, fragmentos imunogénicos e muteinas, como definido mais adiante. Os genótipos completos de muitas destas estirpes são conhecidos. Consultar, por exemplo, a Patente U.S. N°. 6,150,087 e Registos da GenBank Nos. AJ238800 e AJ238799.

Os termos "análogo" e "muteína" referem-se a derivados biologicamente activos da molécula de referência, ou fragmentos de tais derivados, que retêm a desejada actividade, tal como imunoreactividade nos ensaios aqui descritos. Geralmente, o termo "análogo" refere-se a compostos com uma sequência e estrutura do polipéptido nativo com uma ou mais adições de aminoácidos, substituições (geralmente de natureza conservativa) e/ou depleções, relativas à molécula nativa, desde que as modificações não destruam a actividade imunogénica. O termo "muteína" refere-se a péptidos com um ou mais péptidos mímicos ("peptóides"), tais como aqueles descritos na Publicação Internacional N°. WO 91/04282. Preferivelmente, o análogo ou muteína tem pelo menos a mesma imunoactividade da molécula nativa. Métodos para fazer os análogos dos polipéptidos e muteinas são conhecidos na arte e estão descritos mais adiante. 15

Análogos particularmente preferidos incluem substituições que são de natureza conservativa, i.e., aquelas substituições que têm lugar dentro da familia de aminoácidos que estão relacionados nas suas cadeias laterais. Especificamente, os aminoácidos estão divididos, geralmente, em quatro famílias: (1) acídica - aspartato e glutamato; (2) Alcalina - lisina, arginina, histidina; (3) não polar - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polar sem carga - glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. A fenilalanina, triptofano e tirosina são, por vezes, classificados como aminoácidos aromáticos. Por exemplo, é razoavelmente previsível que uma substituição isolada de leucina por isoleucina ou valina, um aspartato por um glutamato, uma treonina por uma serina, ou uma substituição similar conservativa de um aminoácido por outro aminoácido estruturalmente relacionado, não terá um efeito importante na actividade biológica. Por exemplo, o polipéptido de interesse pode incluir até cerca de 5-10 substituições de aminoácidos conservativas ou não conservativas, ou mesmo até cerca de 15-25 substituições de aminoácidos conservativas ou não conservativas, ou qualquer inteiro entre 5-25, desde que a função desejada da molécula permaneça intacta. Um especialista na arte pode determinar prontamente regiões da molécula de interesse que podem tolerar variação por referência às curvas de Hopp/Woods e Kyte-Doolittle, bem conhecidas na arte.

Por "fragmento" entende-se um polipéptido que consiste em apenas uma parte da sequência e estrutura intacta do comprimento total do polipéptido. O fragmento pode incluir uma depleção C-terminal e/ou uma depleção N-terminal do polipéptido nativo. Um "fragmento imunogénico" de uma proteína de HCV particular irá incluir, geralmente, pelo menos cerca de 5-10 resíduos de aminoácidos contíguos da molécula de 16 comprimento total, preferivelmente pelo menos cerca de 15-25 residuos de aminoácidos contíguos da molécula de comprimento total, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 20-50 ou mais resíduos de aminoácidos contíguos da molécula de comprimento total, que definem um epitopo, ou qualquer inteiro entre 5 aminoácidos e a sequência de comprimento total, providenciando que o fragmento em questão retém a imunoreactividade nos ensaios aqui descritos. Por exemplo, fragmentos imunogénicos preferidos, incluem, mas não estão limitados a, fragmentos do núcleo de HCV que compreendem, por exemplo, 10-45, 10-53, 67-88 e 120-130 aminoácidos da poliproteína, epitopo 5-1-1 (na região NS3 do genoma virai), bem como epitopos definidos derivados a partir das regiões El, E2, c33c (NS3) , clOO (NS4), NS3/4a e NS5 da poliproteína de HCV, bem como qualquer um de vários outros epitopos identificados a partir da poliproteína de HCV. Consultar, por exemplo, Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1992) 89:10011-10015; Chien et al., J. Gastroent Hepatol. (1993)

8:S33-39; Chien et al., Publicação Internacional N°. WO 93/00365; Chien, D.Y., Publicação Internacional N°. WO 94/01778; Patentes U.S. Nos. 6, 150,087 e 6,121,020. O termo "epitopo" como aqui usado refere-se a uma sequência de pelo menos cerca de 3 a 5, preferivelmente cerca de 5 a 10 ou 15, e não mais de cerca de 1000 aminoácidos (ou qualquer inteiro entre estes valores), que define uma sequência que por si só ou como parte duma sequência maior, liga-se a um anticorpo gerado como resposta a tal sequência. Não existe um limite superior crítico para o comprimento do fragmento, que pode compreender quase todo o comprimento total da sequência da proteína, ou mesmo uma proteína de fusão que compreende dois os mais epitopos a partir da poliproteína de HCV. Um epitopo para uso no objecto da invenção não está limitado a um polipéptido com a sequência exacta da porção da 17 proteína parental a partir da qual é derivada. De facto, os genomas virais estão num estado de fluxo constante e contêm vários domínios variáveis que exibem graus relativamente elevados de variabilidade entre os isolados. Assim, o termo "epitopo" engloba sequências idênticas à sequência nativa, bem como modificações da sequência nativa, tal como depleções, adições e substituições (geralmente de natureza conservativa).

As regiões de um dado polipéptido que incluem um epitopo podem ser identificadas usando qualquer número de técnicas de mapeamento de epitopos, bem conhecidas na arte. Consultar, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa. New Jersey. Por exemplo, epitopos lineares podem ser determinados, por exemplo, por síntese corrente de grandes números de péptidos num suporte sólido, os péptidos que correspondem a porções da molécula da proteína, e os péptidos postos a reagir com anticorpos enquanto os péptidos continuam ligados aos suportes. Tais técnicas são conhecidas na arte e estão descritas em, por exemplo, Patente U.S. N°. 4,708,871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:178-182; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715. Usando estas técnicas, têm sido identificados vários epitopos de HCV. Consultar, por exemplo, Chien et al., Virai Hepatitis and Liver Disease (1994) pp. 320-324, e outros abaixo. Do mesmo modo, os epitopos conformacionais são prontamente identificados por determinação da conformação espacial dos aminoácidos tais como, por exemplo, por cristalografia de raios X e ressonância magnética nuclear bidimensional. Consultar, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. As regiões antigénicas das proteínas também podem ser identificadas usando curvas padrão de antigenicidade e hidropatia, tal como aquelas calculadas usando, por exemplo, o 18 programa de software Omiga versão 1.0 disponível pelo Oxford Molecular Group. Este programa de computador emprega o método de Hoop/ Woods, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA (1981) 78:3824-3828, para a determinação de perfis de antigenicidade e a técnica de Kyte-Doolittle, Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132 para curvas de hidropatia.

Como aqui usado, o termo "epitopo conformacional" refere-se a uma porção duma proteína de comprimento completo, ou um seu análogo ou muteína, com características estruturais nativas da sequência de aminoácidos que codifica o epitopo dentro da proteína natural de comprimento total. As características estruturais nativas incluem, mas não estão limitadas a, glicosilação e estrutura tridimensional. O comprimento do epitopo que define a sequência pode ser sujeito a amplas variações, uma vez que se acredita que esses epitopos sejam formados pela forma tridimensional do antigénio (por exemplo, por formação de dobras). Assim, os aminoácidos que definem o epitopo podem ser num número relativamente pequeno, mas largamente dispersos ao longo do comprimento da molécula (ou mesmo em moléculas diferentes no caso de dímeros, etc.), sendo colocados na conformação correcta do epitopo por dobragem. As porções do antigénio entre os resíduos que definem o epitopo podem não ser críticas para a estrutura conformacional do epitopo. Por exemplo, a depleção ou substituição destas sequências intermédias pode não afectar as sequências do epitopo conformacional fornecido, críticas para a conformação do epitopo, que são mantidas (por exemplo, cisteínas envolvidas na ligação bissulfito, locais de glicosilação, etc.).

Os epitopos conformacionais presentes na região NS3/4a são prontamente identificados usando os métodos discutidos acima. Além disso, a presença ou ausência dum epitopo conformacional num dado polipéptido pode ser prontamente determinada através 19 de pesquisa do antigénio de interesse com um anticorpo (soro policlonal ou monoclonal para o epitopo conformacional) e comparar a sua reactividade com a da versão desnaturada do antigénio que retém apenas epitopos lineares (se algum). Nesta pesquisa que usa anticorpos policlonais, pode ser vantajoso em primeiro absorver o soro policlonal com o antigénio desnaturado e ver se retém os anticorpos para o antigénio de interesse. Adicionalmente, no caso de NS3/4a, uma molécula que preserva a conformação nativa também terão actividades enzimáticas da protease e, opcionalmente, da helicase. Tais actividades podem ser detectadas usando ensaios enzimáticos, como descritas mais abaixo.

Preferivelmente, um epitopo conformacional é produzido recombinantemente e é expressado numa célula a partir da qual pode ser extraido sob condições que preservam as suas caracteristicas estruturais desejadas, por exemplo, sem desnaturação do epitopo. tais células incluem as de bactérias, de leveduras, de insecto e de mamíferos. A expressão e isolamento dos epitopos recombinantes conformacionais a partir da poliproteína de HCV estão descritos em, por exemplo, Publicação Internacional Nos. WO 96/04301, WO 94/01778, WO 95/33053, WO 92/08734. Alternativamente, é possível expressar os antigénios e ainda renaturar a proteína após a recuperação. Também se entende que a síntese química também pode fornecer antigénios mímicos conformacionais que têm uma reacção cruzada com o epitopo "nativo" do antigénio conformacional. O termo "antigénio de fusão de epitopos múltiplos" ou "MEFA" como aqui usado pretende ser um polipéptido em que os antigénios múltiplos de HCV são parte de uma cadeia simples, continua de aminoácidos, cuja cadeia não ocorre na natureza. Os antigénios de HCV podem ser conectados directamente entre si por ligações peptídicas ou podem ser separados por sequências intermédias de aminoácidos. Os antigénios de fusão 20 também podem conter sequências exógenas à poliproteína de HCV. Além disso, as sequências de HCV presentes podem ser a partir de múltiplos genótipos e/ou isolados de HCV. Exemplos de MEFA particulares para serem usados nos imunoensaios presentes estão detalhados em, por exemplo, Publicação Internacional N°. WO 97/44469, como descritos mais abaixo.

Um "anticorpo" pretende referir-se a uma molécula que, por meios químicos ou físicos, se liga especificamente a um polipéptido de interesse. Assim, um anticorpo do núcleo de HCV é uma molécula que se liga especificamente à proteína do núcleo de HCV. 0 termo "anticorpo" como aqui usado inclui os anticorpos obtidos a partir de quer preparações policlonais quer monoclonais, bem como as seguintes: moléculas de anticorpo híbridas (quiméricas) (consultar, por exemplo, Winter et al. (1991) Nature 349:293-299; e Patente U.S. N°. 4,816,567); fragmentos F(ab')2 e F(ab); moléculas Fv (heterodímeros não covalentes, consultar, por exemplo, Inbar et al. (1972) Proc Natl Acad Sei USA 69:2659-2662; e Ehrlich et al. (1980) Biochem 19:4091-4096); moléculas Fv de cadeia simples (sFv) (consultar, por exemplo, Huston et al. (1988) Proc Natl Acad Sei USA 85:5879-5883); constructos de fragmentos de anticorpo diméricos e triméricos; minicorpos (consultar, por exemplo, Pack et al. (1992) Biochem 31:1579-1584; Cumber et al. (1992) J Immunology 149B:120-126); moléculas de anticorpo humanizadas (consultar, por exemplo, Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534-1536; e Publicação da Patente U.K. N°. GB 2,276,169, publicada em 21 Setembro de 1994); e, quaisquer fragmentos funcionais obtidos a partir de tais moléculas, em que esses fragmentos retêm as propriedades de ligação imunológicas da molécula de anticorpo parental.

Como aqui usado, o termo "anticorpo monoclonal" refere-se a uma composição de anticorpo com uma população de anticorpos 21 homogénea. 0 termo não está limitado em relação a espécies ou fontes do anticorpo, nem se pretende que esteja limitado pelo modo com que é feito. Assim, o termo engloba os anticorpos obtidos a partir de hibridomas de ratinhos, bem como os anticorpos monoclonais humanos obtidos usando de preferência hibridomas humanos do que de ratinhos. Consultar, por exemplo, Cote, et al. Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, 1985, p. 77.

Uma proteína "recombinante" é uma proteína que retém a actividade desejada e que foi preparada por técnicas de DNA recombinante como aqui descritas. De modo geral, o gene de interesse é clonado e depois expressado em organismos transformados, como descrito mais abaixo. 0 organismo hospedeiro expressa o gene estranho para produzir a proteína sob condições de expressão.

Por "isolado" pretende-se dizer, quando se refere a um polipéptido, que a molécula indicada é separada e diferenciada a partir do organismo completo onde a molécula é encontrada na natureza ou está presente na ausência substancial de outras macromoléculas biológicas do mesmo tipo. 0 termo "isolado" com respeito a um polinucleótido é uma molécula de ácido nucleico desprovida, no todo ou em parte, de sequências normalmente associadas com esta na natureza; ou uma sequência, que existe na natureza, mas com sequências heterólogas associadas; ou uma molécula dissociada do cromossoma. 0 "determinante antigénico equivalente" significa um determinante antigénico de diferentes subespécies ou estirpes de HCV, tais como as estirpes 1, 2, ou 3 de HCV. Mais especificamente, os epitopos são conhecidos, tais como 5-1 -1, e tais epitopos variam entre as estirpes 1, 2, e 3. Assim, o epitopo 5-1-1 a partir de três estirpes diferentes são determinantes antigénicos equivalentes e, desse modo, são "cópias" mesmo as suas sequências não sendo idênticas. Em 22 geral, as sequências de aminoácidos dos determinantes antigénicos equivalentes irão ter um grau elevado de homologia de sequência, por exemplo, a homologia da sequência de aminoácidos de mais de 30%, preferivelmente mais do que 40%, quando as duas sequências estão alinhadas. A "homologia" refere-se à semelhança percentual entre dois polinucleótidos ou dois radicais de polipéptidos. Dois DNA, ou duas sequências de polipéptidos são "substancialmente homólogas", uma em relação à outra, quando as sequências apresentam pelo menos cerca de 50%, preferivelmente pelo menos cerca de 75%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 80%-85%, preferivelmente pelo menos cerca de 90%, e o mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%—98% de semelhança de sequência sobre um comprimento definido das moléculas. Como aqui usado, substancialmente homólogo também se refere a sequências que apresentam identidade completa com o DNA especificado ou sequência de polipéptido.

Em geral, "identidade" refere-se a uma exacta correspondência de nucleótido-para-nucleótido ou aminoácido-para-aminoácido de dois polinucleótidos ou sequências polipéptido, respectivamente. A percentagem de identidade pode ser determinada por uma comparação directa da informação da sequência entre duas moléculas por alinhamento das sequências, contando o número exacto de coincidências entre as duas sequências alinhadas, dividindo pelo comprimento da sequência mais curta, e multiplicando o resultado por 100.

Podem ser usados programas de computador prontamente disponíveis para ajudar na análise da semelhança e identidade, tal como ALIGN, Dayhoff, M.O. in Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC, o qual adapta o algoritmo de homologia local de Smith and Waterman Advances in Appl. Math. 2:482-489, 1981 para análise de péptidos. Os 23 programas para a determinação da semelhança e identidade da sequência de nucleótidos estão disponíveis em Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (disponível em Genetics Computer Group, Madison, WI) por exemplo, os programas BESTFIT, FASTA e GAP, que também são baseados no algoritmo de Smith and Waterman. Estes programas são prontamente utilizados com os parâmetros por defeito recomendados pelo fabricante e descritos no Wisconsin Sequence Analysis Package referido acima. Por exemplo, a percentagem de semelhança de uma sequência de nucleótidos particular com uma sequência de referência pode ser determinada usando o algoritmo de homologia de Smith and Waterman com uma tabela de pontuação por defeito e uma falta de lacuna de seis posições de nucleótidos.

Outro método para estabelecer a percentagem de semelhança no contexto da presente invenção é o uso do pacote MPSRCH de programas com direitos protegidos pela Universidade de Edimburgo, desenvolvido por John F. Collins e Shane S. Sturrok, e distribuído pela IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA) . A partir deste pacote adequado o algoritmo Smith-Waterman pode ser empregue onde os parâmetros são usados para a tabela de pontuação (por exemplo, falta aberta de lacuna de 12, falta de extensão de lacuna de um e uma lacuna de seis). A partir dos dados gerados o valor de "Coincidência" ("Match") reflecte a "semelhança de sequência." Outros programas adequados para o cálculo da percentagem de identidade ou semelhança entre sequências são geralmente conhecidos na arte, por exemplo, outro programa de alinhamento é BLAST, usado com parâmetros por defeito. Por exemplo, o BLASTN e BLASTP podem ser usados usando os seguintes parâmetros por defeito: código genético = padrão; filtro = nenhum; cadeia = ambas; corte = 60; previsão = 10; Matriz = BLOSUM62; Descrições = 50 sequências; ordenar por = MAIOR PONTUAÇÃO; Base de dados = não 24 redundante, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR (genetic eode = Standard; filter = none; strand = both; cutoff = 60; expect = 10; Matrix = BLOSUM62; Descriptions = 50 sequences; sort by = HIGH SCORE; Databases = non-redundant, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR) . Podem ser encontrados mais detalhes destes programas no seguinte endereço electrónico: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.

Alternativamente, a homologia pode ser determinada por hibridação de polinucleótidos sob condições que formam duplexes estáveis entre regiões homólogas, seguida por digestão com nucleases especificas de cadeia simples e determinação do tamanho dos fragmentos digeridos. As sequências de DNA que são substancialmente homólogas podem ser identificadas numa hibridação Southern experiência sob, por exemplo, condições rigorosas, como definido para o sistema particular. A definição apropriada das condições é feita pelos especialistas na arte. Consultar, por exemplo, Sambrook et al., supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

Uma "sequência de codificação" ou uma sequência que "codifica" um polipéptido seleccionado, é uma molécula de ácido nucleico que é transcrita (neste caso de DNA) e traduzida (neste caso de mRNA) num polipéptido in vitro ou in vivo quando colocado sob o controlo de sequências reguladoras apropriadas. Os limites da sequência de codificação são determinados por um codão de iniciação de tradução na extremidade 5' (amino) e um codão de terminação de tradução na extremidade 3' (carboxi). Uma sequência de terminação de transcrição pode estar localizada em 3' em relação à sequência de codificação. 25 0 termo "ligado operacionalmente" refere-se a uma disposição de elementos na qual os componentes assim descritos são configurados de modo a realizar a sua função desejada. Assim, um dado promotor ligado operacionalmente a uma sequência de codificação é capaz de efectuar a expressão da sequência de codificação quando os factores de transcrição próprios, etc., estão presentes. 0 promotor de controlo não precisa de ser contíguo à sequência de codificação, desde que funcione de modo a direccionar a sua expressão. Assim, por exemplo, podem estar presentes sequências de intervenção não traduzidas mas já transcritas entre uma sequência promotora e a sequência de codificação, como intrões transcritos, e a sequência promotora pode ainda ser considerada "ligada operacionalmente" à sequência de codificação.

Um "elemento de controlo" refere-se a uma sequência de polinucleótidos que ajuda na expressão duma sequência de codificação à qual está ligado. 0 termo inclui promotores, sequências de terminação da transcrição, domínios de regulação a montante, sinais de poliadenilação, regiões não traduzidas, que inclui 5'-UTRs e 3'-UTRs e quando apropriado, sequências líderes e intensificadores, que fornecem colectivamente, para a transcrição e tradução, de uma sequência de codificação numa célula hospedeira.

Um "promotor" como aqui usado é uma região reguladora de DNA capaz de ligar a RNA polimerase numa célula hospedeira e iniciar a transcrição duma sequência de codificação a jusante (direcção 3') aí ligada operacionalmente. Para os propósitos da presente invenção, uma sequência promotora inclui o número mínimo de bases ou elementos necessário para iniciar a transcrição de um gene de interesse em níveis detectáveis acima dos anteriores. Dentro da sequência promotora está um local de iniciação da transcrição, bem como um domínio de ligação da proteína (sequências de consenso) responsável pela 26 ligação da RNA polimerase. Os promotores eucarióticas, irão normalmente conter, mas nem sempre, caixas (boxes) "TATA" e "CAT".

Uma sequência de controlo "direcciona a transcrição" de uma sequência de codificação numa célula quando a polimerase de RNA se liga à sequência promotora e transcreve a sequência de codificação em mRNA, que é então traduzida no polipéptido codificado pela sequência de codificação. A "cassete de expressão" ou "constructo de expressão" refere-se a um agregado que é capaz de direccionar a expressão das sequências ou genes de interesse. A cassete de expressão inclui elementos de controlo, como descrito acima, tal como um promotor que está ligado operacionalmente (tal como a transcrição directa de) às sequências ou genes de interesse e também inclui, geralmente, uma sequência poliadenilação. Dentro de determinadas modalidades da invenção, a cassete de expressão aqui descrita pode estar contida num constructo de plasmideo. Adicionalmente aos componentes da cassete de expressão, o constructo de plasmideo pode também incluir, uma ou mais marcas de selecção, um sinal que permite ao constructo de plasmideo existir como DNA de cadeia simples (por exemplo, uma origem M13 de replicação) , pelo menos um local de clonagem múltiplo e uma origem de replicação de "mamífero" (por exemplo, uma origem de replicação de SV40 ou de adenovírus). "Transformação", como aqui usada, refere-se à inserção de um polinucleótido exógeno numa célula hospedeira, independentemente do método usado para a inserção: por exemplo, obtenção directa, transfecção, infecção, e similares. Para métodos particulares de transfecção, ver mais abaixo. 0 polinucleótido pode ser mantido como um vector não integrado, por exemplo, um epissoma, ou alternativamente, pode ser integrado num genoma hospedeiro. 27

Uma "célula hospedeira" é uma célula que foi transformada, ou é capaz de transformação, por uma sequência de DNA exógeno. 0 "suporte sólido comum" refere-se a uma matriz sólida única na qual os polipéptidos de HCV usados nos objectos de imunoensaios estão ligados covalentemente ou por meios não covalentes tal como adsorção hidrofóbica.

Os meios "imunologicamente reactivos" com os quais o antigénio em questão irá reagir especificamente com os anticorpos anti-HCV presentes numa amostra biológica de um indivíduo infectado com HCV. 0 "complexo imune" pretende referir-se à combinação formada quando um anticorpo se liga a um epitopo num antigénio.

Como aqui usado, uma "amostra biológica" refere-se a uma amostra de tecido ou fluido isolado a partir dum sujeito, incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, sangue, plasma, soro, material fecal, urina, medula óssea, bílis, fluido espinhal, fluido linfático, amostras de pele, secreções externas da pele, respiratórias, intestinais, e do trato genitourinário, lágrimas, saliva, leite, células sanguíneas, órgãos, biopsias e também amostras de constituintes de cultura células in vitro incluindo, mas não se limitando a, meios condicionados que resultam do crescimento de células e tecidos no meio de cultura, por exemplo, células recombinantes e componentes celulares.

Como aqui usados, os termos "marcado" e "detectavelmente marcado" referem-se a uma molécula capaz de detecção, incluindo, mas não limitado a, isótopos radioactivos, fluorescentes, quimioluminescentes, cromóforos, enzimas, substratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inibidores enzimáticos, corantes, iões metálicos, soluções metálicas, ligandos (por exemplo, biotina, estrepavidina ou haptenos) e similares. 0 termo "fluorescente" refere-se a uma substância 28 ou uma sua porção que é capaz de exibir fluorescência na gama detectável. Os exemplos particulares dos marcadores que podem ser usados na invenção incluem, mas não estão limitados a, peroxidase de rábano (HRP), fluoresceina, FITC, rodamina, dansilo, umbeliferona, éster de dimetil acridinio (DMAE), vermelho do Texas, luminol, NADPH e α-β-galactosidase. II. Modos de Realização da Invenção

Antes da descrição da presente invenção em detalhe, deve ser entendido que esta invenção não está limitada a formulações particulares ou parâmetros de processo que, evidentemente, podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada aqui tem o propósito de descrever apenas modalidades particulares da invenção e não pretende ser limitativa.

Embora várias composições e métodos similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática da presente invenção, os materiais e métodos preferidos estão aqui descritos.

Como referido acima, a presente invenção é baseada na descoberta de novos métodos de diagnóstico para detectar com precisão uma infecção por HCV precocemente. Os métodos estão baseados na identificação e uso de anticorpos e antigénios de HCV altamente imunogénicos que estão presentes durante os primeiros estágios da seroconversão de HCV, aumentando, por isso, a precisão de detecção e redução da incidência de falsos resultados. Os métodos podem ser convenientemente postos em prática num formato de ensaio único.

Mais particularmente, o ensaio é conduzido num suporte sólido ao qual foi ligado um ou mais anticorpos anti-núcleo HCV (direccionados contra quer o mesmo ou diferentes epitopos do núcleo de HCV) e um epitopo derivado a partir da região NS3/4a da poliproteína de HCV. Exemplos de anticorpos anti- 29 núcleo particulares úteis na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, moléculas de anticorpos tais como anticorpos monoclonais, direccionados contra epitopos na região do núcleo encontrados entre os aminoácidos 10-53; os aminoácidos 10-45; os aminoácidos 67-88; os aminoácidos 120-130, ou anticorpos direccionados contra qualquer um dos epitopos do núcleo identificados em, por exemplo, Houghton et al., Patente U.S. N°. 5,350, 671; Chien et al., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA (1992) 89:10011-10015; Chien et al., J.

Gastroent. Hepatol. (1993) 8: S33—39; Chien et al., Publicação Internacional N°. WO 93/00365; Chien, D.Y., Publicação Internacional N°. WO 94/01778; e pedido de Patente U.S. de propriedade comum com os Nos. de série 08/403,590 e 08/444,818. A região NS3/4a da poliproteina de HCV foi descrita e a sequência de aminoácidos e a estrutura completa da proteína estão reveladas em, por exemplo, Yao et al., Structure (November 1999) 7:1353-1363; Sati et al., Biochem. (1998) 37:3392-3401; e Bartenschlager, R., J. Virai Hepat. (1999) 6:165-181. Consultar, também, Dasmahapatra et al., Patente U.S. N°. 5,843, 752. Os imunoensaios submetidos utilizam pelo menos um epitopo conformacional derivado da região NS3/4a, que existe na conformação encontrada naturalmente, que ocorre na partícula de HCV ou nos seus produtos infecciosos, como é evidenciado pela conservação das actividades enzimáticas da protease e, opcionalmente, da helicase, normalmente apresentadas pelo produto do gene de NS3/4a e/ou imunoreactividade do antigénio com os anticorpos numa amostra biológica a partir de sujeitos infectados com HCV e uma perda da imunoreactividade do epitopo sobre a desnaturação do antigénio. Por exemplo, o epitopo conformacional pode ser desfeito por calor, variação do pH para ácido ou base extremos, ou por adição de desnaturantes orgânicos conhecidos, tais como ditiotreitol (DTT) ou um detergente apropriado. 30

Consultar, por exemplo, Protein Purification Methods, a practical approach (E.L.V. Hams and S. Angal eds., IRL Press) e o produto desnaturado comparado com o produto que não é tratado como acima.

As actividades da protease e da helicase podem ser determinadas usando ensaios enzimáticos padrão bem conhecidos na arte. Por exemplo, a actividade da protease pode ser determinada por ensaios bem conhecidos na arte. Consultar, por exemplo, Takeshita et al., Anal. Biochem. (1997) 247:242-246;

Kakiuchi et al., J. Biochem. (1997) 122:749-755; Sali et al., Biochesmtry (1998) 37; 3392-3401; Cho et al., J. Virol. Meth. (1998) 72:109-115; Cerretani et al., Anal. Biochem. (1999) 266:192-197; Zhang et al., Anal. Biochem. (1999) 270:268-275;

Kakiuchi et al., J. Virol. Meth. (1999) 80:77-84; Fowler et al., J. Biomol. Screen. (2000) 5:153-158; e Kirn et al., Anal. Biochem. (2000) 284:42-48. Um ensaio particularmente conveniente para testar a actividade da protease é apresentado nos exemplos abaixo.

Do mesmo modo, ensaios da actividade da helicase são bem conhecidos na arte e a actividade da helicase de um epitopo NS3/4a pode ser determinada usando, por exemplo, um ensaio ELISA, como descrito em, por exemplo, Hsu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1998) 253:594-599; um sistema de ensaio de cintilação de proximidade, como descrito em Kyono et al., Anal. Biochem, (1998) 257: 120-126; ensaios de pesquisa de elevado rendimento como descrito em, por exemplo, Hicham et al., Antiviral Res, (2000) 46:181-193 e Kwong et al., Methods Mol. Med. (2000) 24:97-116; bem como por outros métodos de ensaio conhecidos na arte. Consultar, por exemplo, Khu et al., J. Virol. (2001) 75:205-214; Utama et al., Virology (2000) 273:316-324; Paolini et al., J. Gen. Virol. (2000) 81: 1335- 1345; Preugschat et al., Biochemistry (2000) 39:5174 — 5183; 31

Preugschat et al., Methods Mol. Mod. (1998) 19: 353-364; e Hesson et al., Biochemistry (2000) 39:2619-2625. O comprimento do antigénio é suficiente para manter um epitopo conformacional imunoreactivo. Geralmente, o polipéptido que contém o antigénio usado será quase de comprimento completo, no entanto, o polipéptido também pode ser truncado para, por exemplo, aumentar a solubilidade ou para melhorar a secreção. Geralmente, o epitopo conformacional encontrado em NS3/4a é expresso como um polipéptido recombinante numa célula e este polipéptido fornece o epitopo numa forma desejada, como descrito em detalhe abaixo.

As sequências de aminoácidos representativas para os polipéptidos NS3/4a estão apresentadas na Figura 3 e Figuras 4A até 4D. A alanina em negrito que ocorre na posição 182 da Figura 3 é substituída pela serina nativa presente nesta posição de modo a prevenir a autocatálise da molécula que, de outra forma, ocorrer. A sequência de aminoácidos apresentada nas posições 2-686 das Figuras 4A até 4D corresponde às posições de aminoácidos 1027-1711 de HCV-1. Um codão iniciador (ATG) que codifica para Met, é apresentada como posição 1. Adicionalmente, a Thr que ocorre normalmente na posição 1428 de HCV-1 (posição de aminoácido 403 da Figura 4) é mutada para Pro e a Ser que ocorre normalmente na posição 1429 de HCV-1 (posição de aminoácido 404 da Figura 4) é mutada para to Ile. No entanto, a sequência nativa, com ou sem uma Met N-terminal, o análogo representado, com ou sem a Met N-terminal, ou outros análogos e fragmentos podem ser usados no ensaio em questão, desde que o epitopo seja produzido usando um método que retém ou restabelece a sua conformação nativa de modo que a actividade da protease e, opcionalmente, a actividade da helicase são mantidas. Dasmahapatra et al., Patente U.S. N°. 5,843,752 e Zhang et al., Patente U.S. N°. 5,990,276, ambos descrevem análogos de NS3/4a. 32 A protease NS3 de NS3/4a é encontrada cerca das posições 1027-1207, numeradas relativamente a HCV-1, nas posições 2-182 da Figura 4. A estrutura da protease NS3 e local activo são conhecidos. Consultar, por exemplo, De Francesco et al., Antivir. Ther. (1998) 3:99-109; Koch et al., Biochemistry (2001) 40:631-640. Variações da sequência nativa que, normalmente, será tolerada serão aquelas fora do local activo da molécula. Particularmente, é desejável manter os aminoácidos 1- ou 2-155 da Figura 4, com poucas ou apenas substituições conservativas. Os aminoácidos que ocorrem para além de 155 irão tolerar variações maiores. Adicionalmente, se os fragmentos da sequência de NS3/4a encontrada na Figura 4 são usados, estes fragmentos irão, geralmente, incluir pelo menos os aminoácidos 1- ou 2-155, preferivelmente os aminoácidos 1- ou 2-175 e mais preferivelmente os aminoácidos 1- ou 2-182, com ou sem a Met N-terminal. O domínio da helicase é encontrado cerca das posições 1193-1657 de HCV-1 (posições 207-632 da Figura 4) . Assim, se a actividade da helicase for desejada, esta porção da molécula irá ser mantida com poucas ou apenas variações conservativas. Um especialista na arte pode determinar prontamente outras regiões que irão tolerar variações baseadas na estrutura conhecida de NS3/4a. O suporte sólido também pode compreender outros antigénios. Por exemplo, os antigénios de fusão de epitopos múltiplos (denominados "MEFA"), como descrito em Publicação Internacional N°. WO 97/44469, podem ser ligados ao suporte sólido para serem usados nos ensaios em questão. Tais MEFA incluem epitopos múltiplos derivados a partir de duas ou mais de várias regiões virais apresentadas na Figura 1 e Tabela 1. Em particular, como apresentado na Figura 1 e Tabela 1, uma poliproteína de HCV, após clivagem, produz pelo menos dez produtos distintos, na ordem de NH2-Núcleo-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NSSa-NSSb-COOH. O polipéptido do núcleo ocorre nas 33 posições 1-191, numeradas relativamente a HCV-1 (consultar, Choo et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:2451-2455, para o genoma de HCV-1). Este polipéptido é mais processado para produzir um polipéptido HCV com, aproximadamente, aminoácidos de 1-173. Os polipéptidos envelope, EI e E2, ocorrem em torno das posições 192-383 e 384-746, respectivamente. 0 domínio P7 é encontrado em torno das posições 747-809. A NS2 é uma proteína de membrana integral com actividade proteolítica e é encontrada em torno das posições 810-1026 da poliproteína. A NS2, quer sozinha ou em combinação com NS3 (encontrada em torno das posições 1027-

1657), cliva a forte ligação NS2-NS3 que, por sua vez, cria a NS3 N-terminal e liberta uma poliproteína grande que inclui as actividades da protease de serina e da helicase de RNA. A protease NS3, encontrada em torno das posições 1027-1207, serve para processar a restante poliproteína. A actividade da helicase é encontrada em torno das posições 1193-1657. A finalização da maturação da poliproteína é inicializada por clivagem autocatalítica na junção de NS3-NS4a, catalisada pela protease da serina de NS3. A subsequente clivagem mediada por NS3 da poliproteína HCV parece envolver o reconhecimento das junções de clivagem da poliproteína por uma molécula NS3 de outro polipéptido. Nestas reacções, a NS3 liberta um cofactor NS3 (NS4a, encontrado em torno das posições 1658-1711), duas proteínas (NS4b encontrada em torno das posições 1712-1972 e NS5a encontrada em torno das posições 1973-2420) e uma RNA polimerase dependente de RNA (NS5b encontrada em torno das posições 2421-3011) . 34

Tabela 1 Domínio Limites Aproximados* C (núcleo) 1-191 EI 192-383 E2 384-746 P7 747-809 NS2 810-1026 NS3 1027-1657 NS4a 1658-1711 NS4b 1712-1972 NS5a 1973-2420 NS5b 2421-3011 Numerada relativamente a HCV-1. Consultar, Choo et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:2451-2455.

Os antigénios de HCV múltiplos são parte duma cadeia simples e continua de aminoácidos, cuja cadeia não ocorre na natureza. Assim, a ordem linear dos epitopos é diferente da sua ordem linear no genoma em que estes ocorrem. A ordem linear das sequências dos MEFA para uso aqui é preferivelmente arranjada para uma antigenicidade óptima. Preferivelmente, os epitopos são a partir de mais de uma estirpe de HCV, fornecendo assim a habilidade adicional para detectar múltiplas estirpes de HCV num único ensaio. Assim, os MEFA para uso aqui podem compreender várias regiões imunogénicas derivadas a partir da poliproteína descrita acima. Além disso, uma proteína que resulta a partir dum deslocamento da janela na região do núcleo da poliproteína, tal como descrito na Publicação Internacional N°. WO 99/63941, pode ser usada nos MEFA. Se desejado, pode ocorrer na proteína de fusão pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais de um ou mais epitopos derivados a partir da poliproteína de HCV. 35

Por exemplo, os epitopos derivados a partir, por exemplo, da região hipervariável de E2, tal como uma região de transposição de aminoácidos 384-410 ou 390-410, podem ser incluídos no antigénio MEFA. Um epitopo E2 particularmente eficaz é um que inclui uma sequência de consenso derivada a partir desta região, tal como a sequência de consenso Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn, que representa uma sequência de consenso para os aminoácidos 390-410 do genoma do tipo 1 de HCV. Um epitopo E2 representativo apresenta num MEFA da invenção pode compreender um epitopo híbrido de transposição de aminoácidos 390-444. Tal epitopo híbrido E2 pode incluir uma sequência de consenso que representa os aminoácidos 390-410 fundidos à sequência de aminoácidos nativa para os aminoácidos 411-444 de HCV E2.

Adicionalmente, os antigénios podem ser derivados a partir de várias estirpes de HCV. Estirpes virais múltiplas de HCV são conhecidas, e os epitopos derivados a partir de qualquer uma dessas estirpes pode ser usado numa proteína de fusão. É bem conhecido que qualquer dada espécie de organismo varia de um organismo individual para outro e ainda que um dado organismo tal como um vírus pode ter um diferente número de estirpes. Por exemplo, como explicado acima, o HCV inclui pelo menos 6 genótipos. Cada um destes genótipos inclui os determinantes antigénicos equivalentes. Mais especificamente, cada estirpe inclui um número de determinantes antigénicos que estão presentes em todas as estirpes de vírus, mas são ligeiramente diferentes de uma estirpe virai para outra. Por exemplo, o HCV inclui o determinante antigénico conhecido pelo 5-1-1 (consultar a Figura 1) . Este determinante antigénico particular aparece em três formas diferentes nas três diferentes estirpes virais de HCV. Assim, numa modalidade 36 preferida da invenção todas as três formas de 5-1-1 aparecem no antigénio de fusão de epitopos múltiplos usado no imunoensaio em questão. Do mesmo modo, determinantes antigénicos equivalentes a partir da região do núcleo de diferentes estirpes de HCV também podem estar presentes. Geralmente, os determinantes antigénicos equivalentes têm um elevado grau de homologia em termos da sequência de aminoácidos cujo grau de homologia é geralmente de 30% ou mais, preferivelmente 40% ou mais, quando alinhados. O epitopo de múltiplas cópias da presente invenção também pode incluir múltiplas cópias que são cópias exactas do mesmo epitopo.

Os MEFA representativos para serem usados com os presentes ensaios estão descritos na Publicação Internacional N°. WO 97/44469. Os MEFA representativos adicionais para serem usados aqui incluem aqueles denominados por MEFA 12, MEFA 13 e MEFA 13.1. Deve ser entendido que estes MEFA são meramente representativos e que epitopos derivados a partir do genoma de HCV também poderão ser usados nos presentes ensaios e podem ser incorporados nestes ou noutros MEFA. A sequência de DNA e a correspondente sequência de aminoácidos de MEFA 12 está apresentada nas Figuras de 7A a 7F. A fórmula da estrutura geral para MEFA 12 está apresentada na Figura 6 e é como se segue: hSOD-EI (tipo 1 ) - consenso E2 HVR (tipo Ia) - consenso E2 HVR (tipos 1 e 2) - curto c33c (tipo 1) - 5-1-1 (tipo 1) - 5-1-1 (tipo 3) - 5-1-1 (tipo 2) -clOO (tipo 1) - NS5 (tipo 1) - NS5 (tipo 1) - núcleo (tipos 1+2) - núcleo (tipos 1+2). Este epitopo de múltiplas cópias inclui a seguinte sequência de aminoácidos, numerada relativamente ao HCV-1 (a numeração dos aminoácidos apresentada abaixo segue a designação da numeração fornecida em Choo, et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:2451-2455, em que o aminoácido #1 é a primeira metionina codificada pela sequência de codificação da região do núcleo): os 37 aminoácidos 1-69 da superóxido dismutase (SOD, usados para aumentar a expressão recombinante da proteína); os aminoácidos 303 a 320 da poliproteína a partir da região El; os aminoácidos 390 a 410 da poliproteína, que representam uma sequência de consenso para a região hipervariável E2 de HCV-la; os aminoácidos 384 a 414 da poliproteína a partir da região E2, que representam uma sequência de consenso para as regiões hipervariáveis E2 de HCV-1 e HCV-2; os aminoácidos 1211-1457 da poliproteína HCV-1 que define a helicase; três cópias de um epitopo a partir de 5-1-1; os aminoácidos 1689-1735, um a partir de HCV-1, um a partir de HCV-3 e um a partir de HCV-2, cujas cópias são determinantes antigénicos equivalentes a partir de três estirpes virais diferentes de HCV; o polipéptido C100 de HCV do HCV-1, os aminoácidos 1901-1936 da poliproteína; duas cópias exactas dum epitopo a partir da região NS5 de HCV-1, cada um com os aminoácidos 2278 a 2313 da poliproteína de HCV; e duas cópias de três epitopos a partir da região do núcleo, duas a partir de HCV-1 e uma a partir de HCV-2, cujas cópias são determinantes antigénicos equivalentes representadas pelos aminoácidos 9 a 53 e 64-88 de HCV-1 e 67-84 de HCV-2. A Tabela 2 apresenta as posições de aminoácidos de vários epitopos em MEFA 12 com referência às Figuras de 7A a 7F. A numeração nas tabelas é relativa a HCV-1. Consultar, Choo et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 2451-2455. Os MEFA 13 e 13.1 também partilham a fórmula geral especificada acima para MEFA 12, com modificações como indicado nas Tabelas 3 e 4, respectivamente. 38

Tabela 2. MEFA 12 mefa aa# local de terminação 5' epitopo hcv aa# estirpe 1-69* Ncol hSOD 72-89 MluI EI 303-320 1 92-112 HindIII consenso E2 HVRIa 390-410 1 113-143 consenso E2 HVR1+2 384-414 1,2 146-392 Spel C33C curta 1211-1457 1 395-441 Sphl 5-1-1 1689-1735 1 444-490 NruI 5-1-1 1689-1735 3 493-539 Ciai 5-1-1 1689-1735 2 542-577 Aval C100 1901-1936 580-615 Xbal NS5 2278-2313 618-653 BglII NS5 2278-2313 654-741 Ncol epitopos do núcleo 9-53, R47L 1 64-88 1 67-84 2 742-829 Bali epitopos do núcleo 9-53, R47L 1 64-88 1 67-84 2 *A proteína SOD é truncada de modo a que a detecção conjuga um anticorpo anti-SOD marcado com HRP não liga o MEFA. 0 epitopo do núcleo é mutado para prevenir que os anticorpos para o núcleo de HCV, usados na detecção, se liguem ao MEFA._ _ 39

Tabela 3. MEFA 13 mefa aa# local de terminação 5' epitopo hcv aa# estirpe 1-156 Ncol hSOD mutada (aa 70-72, ALA) 161-178 MluI EI 303-320 1 181-201 HindIII consenso E2 HVRIa 390-410 1 202-232 consenso E2 HVR1+2 384-414 1,2 235-451 C33C curta 1211- 1457 1 454-500 HindIII 5-1-1 PImut* 1689- 1735 1 503-549 NruI 5-1-1 PImut* 1689- 1735 3 552-598 Ciai 5-1-1 PImut* 1689- 1735 2 601-636 Aval C100 1901- 1936 1 639-674 Xbai NS5 2278- 2313 1 677-712 BglII NS5 2278- 2313 1 713-800 epitopos do núcleo 9-53, R47L 1 64-88 1 67-84 2 801-888 epitopos do núcleo 9-53, R47L 1 64-88 1 67-84 2 *0s epitopos 5-1-1 estão modificados para eliminar os locais possíveis de clivagem (CS ou CA) alvos da proteína recombinante NS3/4a. Em vez de CS ou CA, a sequência foi modificada para PI. *Adicionalmente, a proteína SOD é mutada de modo a que a detecção conjuga um anticorpo anti-SOD, marcado com HRP, não liga o MEFA. 0 epitopo do núcleo é mutado para prevenir que os anticorpos para o núcleo de HCV, usados na detecção, se liguem ao MEFA._ 40

Tabela 4. MEFA 13,1 mefa aa# local de terminação 5' epitopo hcv aa# estirpe 1-86 Ncol hSOD mutada (aa 70-72, ALA) 89-106 MluI EI 303-320 1 109-129 HindIII consenso E2 HVRIa 390-410 1 130-160 consenso E2 HVRl+2 384-414 1,2 163-379 C33C curta 1211- 1457 1 382-428 HindIII 5-1-1 PImut* 1689- 1735 1 431-477 NruI 5-1-1 PImut* 1689- 1735 3 480-526 Ciai 5-1-1 PImut* 1689- 1735 2 529-564 Aval C100 1901- 1936 1 567-602 Xbal NS5 2278- 2313 1 605-640 BglII NS5 2278- 2313 1 641-728 epitopos do núcleo 9-53, R47L 1 64-88 1 67-84 2 729-816 epitopos do núcleo 9-53, R47L 1 64-88 1 67-84 2 *0s epitopos 5-1-1 estão modificados para eliminar os locais possíveis de clivagem (CS ou CA) alvos da proteína recombinante NS3/4a. Em vez de CS ou CA, a sequência foi modificada para PI. *Adicionalmente, a proteína SOD é mutada de modo a que a detecção conjuga um anticorpo anti-SOD, marcado com HRP, não liga o MEFA. 0 epitopo do núcleo é mutado para prevenir que os anticorpos para o núcleo de HCV, usados na detecção, se liguem ao MEFA,___

Num formato de ensaio, a amostra é combinada com o suporte sólido, como descrito mais abaixo. Se a amostra está infectada com HCV, os antigénios do núcleo, como os anticorpos de HCV para aqueles epitopos presentes no suporte sólido, irão ligar- 41 se aos componentes suporte sólido. É então adicionado um anticorpo anti-núcleo detectavelmente marcado. 0 anticorpo anti-núcleo marcado está direccionado contra um epitopo diferente do anticorpo anti-núcleo que está ligado ao suporte sólido. Este anticorpo anti-núcleo liga-se ao antigénio do núcleo capturado pelos anticorpos anti-núcleo no suporte sólido.

Também é adicionado um antigénio que reage com o anticorpo de HCV capturado a partir da amostra biológica, cujo anticorpo de HCV capturado da amostra é reactivo com o epitopo de NS3/4a. Este antigénio é preferivelmente um epitopo derivado a partir da região NS3 da poliproteina de HCV. Este antigénio liga-se ao anticorpo de HCV capturado a partir da amostra. Um número de antigénios que incluem tais epitopos são conhecidos, incluindo, mas não limitados a, antigénios derivados a partir das regiões c33c e clOO, bem como proteínas de fusão que compreendem um epitopo NS3, tal como c25. Estes e outros epitopos NS3 são úteis nos presentes ensaios e são conhecidos na arte e descritos em, por exemplo, Houghton et al, Patente U.S. N°. 5, 350, 671; Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1992) 89:10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33—39; Chien et al., Publicação Internacional N°. WO 93/00365; Chien, D.Y., Publicação Internacional N°. WO 94/01778; e pedido de Patente U.S. de propriedade comum com os Nos. de série 08/403,590 e 08/444,818. É adicionado um segundo anticorpo marcado, direccionado contra o antigénio descrito acima. Este anticorpo pode ser direccionado contra qualquer epitopo incluído no antigénio. Por exemplo, o anticorpo pode ser direccionado contra a região NS3 presente no antigénio. Alternativamente, se o antigénio acima é expresso como uma proteína de fusão, o segundo anticorpo marcado pode ser direccionado contra o parceiro de fusão. Adicionalmente, os antigénios e os anticorpos podem ser 42 adicionados ao ensaio, particularmente, se o suporte sólido inclui um MEFA. Este formato de ensaio está melhor explicado abaixo.

Um ensaio representativo da invenção está representado na Figura 2. Como mostra a figura, o suporte sólido inclui dois anticorpos anti-núcleo monoclonais, denominados cll-3 e cll-7. Estes anticorpos estão direccionados contra um epitopo encontrado na região N-terminal da proteina do núcleo nos aminoácidos 10-53, numerados relativamente à sequência da poliproteina de HCV1. O suporte sólido também inclui um epitopo para NS3/4a. A amostra biológica é adicionada ao suporte sólido. O antigénio do núcleo de HCV, bem como os anticorpos direccionados contra o epitopo NS3/4a, que estão ambos presentes na amostra, vão se ligar aos reagentes de captura no suporte sólido. É então adicionado o anticorpo monoclonal anti-núcleo cll-14 marcado com a peroxidase de rábano (HRP), direccionado contra uma região C-terminal do núcleo encontrada nas posições dos aminoácidos 120-130, numerados relativamente à sequência da poliproteina de HCV1. É adicionada uma proteina de fusão, que compreende uma sequência a partir da SOD humana (hSOD) e um epitopo a partir da região c33c, que é um segundo anticorpo marcado com HRP, direccionado contra a porção SOD da proteina de fusão. A fusão SOD-c33c vai se ligar ao anticorpo anti-NS3 e o anticorpo anti-SOD vai, por sua vez, ligar-se à proteina de fusão SOD-c33c. A detecção do marcador indica a presença de infecção por HCV.

Outro ensaio representativo da invenção está representado na Figura 8. A configuração do ensaio de anticorpo é um ensaio de captura em sanduíche de antigénio-anticorpo-antigénio que usa tanto NS3/4a como MEFA 12. O suporte sólido inclui os dois anticorpos monoclonais anti-núcleo descritos acima, um epitopo para NS3/4a, bem como um MEFA representativo, MEFA 12, que 43 inclui uma versão truncada da SOD humana. Tal como no ensaio acima, a amostra biológica é adicionada ao suporte sólido. 0 antigénio do núcleo de HCV, bem como os anticorpos direccionados contra o epitopo NS3/4a e epitopos de MEFA, presentes na amostra, vão se ligar aos reagentes de captura no suporte sólido. São adicionados dois antigénios, um reactivo com os anticorpos da amostra que se ligam à NS3/4a (como descrito acima) e um reactivo com os anticorpos da amostra que se ligam ao MEFA 12. Na Figura 8, o antigénio reactivo com o complexo MEFA 12/anticorpo da amostra é uma fusão entre uma molécula de SOD e c22ks 47-L44W. 0 antigénio c22ks é da região do núcleo e inclui os aminoácidos Lysio a Ser99 da poliproteina, bem como uma depleção de Arg47 normalmente presente e uma substituição de Leu por Trp na posição 44. 0 conjugado de detecçâo do anticorpo e o segundo anticorpo anti-SOD monoclonal marcado com HRP, descrito acima.

Os ensaios de combinação antigénio/anticorpo acima descritos são particularmente vantajosos uma vez que tanto os antigénios do núcleo de HCV como os anticorpos para NS3/4a e/ou núcleo podem ser detectados pelo mesmo suporte no mesmo ensaio. Além disso, como descrito acima, os epitopos adicionais de HCV, tais como SOD fundido com os antigénios clOO, 5-1-1, NS5, bem como uma proteina que resulta a partir dum deslocamento da janela na região do núcleo da poliproteina, tal como descrito na Publicação Internacional N°. WO 99/63941, podem ser usados no cocktail de combinação para cobrir outros epitopos não estruturais de HCV.

De modo a melhor se compreender a invenção, é fornecida abaixo uma discussão mais detalhada em relação à produção de anticorpos para serem usados nos imunoensaios em questão; produção de polipéptidos para serem usados nos imunoensaios; e métodos de condução dos imunoensaios. 44

Produção de Anticorpos para a utilização em Imunoensaios de HVC

Tal como explicado acima, o ensaio utiliza vários anticorpos que estão ligados a um suporte sólido (por exemplo, um ou mais anticorpos anti-núcleo), e que detectam complexos antigénios/anticorpos formados quando a infecção HVC está presente na amostra. Estes anticorpos podem ser preparações de anticorpos policlonais ou monoclonais, anti-soros monoespecificos, anticorpos humanos, ou podem ser anticorpos híbridos ou quiméricos, tais como anticorpos humanizados, anticorpos alterados, fragmentos F(ab')2, fragmentos F(ab), fragmentos FV, anticorpos de domínio simples, construções de fragmentos de anticorpos diméricos ou triméricos, minicorpos, ou fragmentos funcionais disso que se ligam ao antigénio em questão.

Os anticorpos são produzidos utilizando técnicas bem conhecidas por aqueles entendidos na arte e revelados em, por exemplo, Patente U.S Nos. 4,011,308; 4,722,890; 4,016,043; 3,876,504; 3,770,380; e 4,372,745. Por exemplo, anticorpos policlonais são gerados imunizando um animal apropriado, como um ratinho, rato, coelho, ovelha ou cabra, com um antigénio de interesse. De forma a intensificar a imunogenicidade, o antigénio pode ser ligado a um portador antes da imunização. Tais portadores são bem conhecidos pelos especialistas correntes na arte. A imunização é realizada geralmente misturando ou emulsionando o antigénio numa solução salina, preferencialmente num adjuvante tal como o adjuvante completo de Freund, e injectando a mistura ou emulsão parenteralmente (em geral subcutaneamente ou intramuscularmente) . O animal leva, geralmente, um reforço 2 a 6 semanas depois com uma ou mais injecções do antigénio em solução salina, preferencialmente utilizando o adjuvante incompleto de Freund. Os anticorpos podem também ser gerados por imunização in 45 vitro, utilizando métodos conhecidos na arte. 0 anti-soro policlonal é então obtido a partir do animal imunizado. Ver, por exemplo, Hougton et al., Patente U.S. N°. 5,350,671, para uma descrição da produção de anticorpos policlonais anti-HCV.

Os anticorpos monoclonais são geralmente preparados utilizando o método de Kohler e Milstein (1975) Nature 256: 495-497, ou uma modificação disso. Tipicamente, um ratinho ou rato é imunizado como descrito acima. No entanto, em vez de se sangrar o animal para se extrair o soro, o baço (e opcionalmente vários nódulos linfáticos grandes) é removido e desassociado em células únicas. Se for desejado, as células de baço podem ser pesquisadas (após a remoção de células aderentes não-especificas) aplicando uma suspensão celular numa placa ou poço coberto com o antigénio. Células B, que expressam imunoglobina de ligação de membrana especifica para o antigénio, irão ligar à placa, e não são enxaguadas com o resto da suspensão. As células B, ou todas as células de baço desassociadas resultantes, são então induzidas para se fundirem células de mieloma para formarem hibridomas e são postas em cultura num meio selectivo (por exemplo, hipoxantina, aminopterina, meio de timidina, "HAT"). Os hibridomas resultantes são plaqueados limitando a diluição, e são ensaiados para a produção de anticorpos que se ligam especificamente ao antigénio imunizante (e que não se ligam a antigénios não relacionados) . Os hibridomas que excretam anticorpos monoclonais seleccionados são então cultivados tanto in vitro (por exemplo, em frascos de cultura de tecido ou reactores de fibras ocas), ou in vivo (por exemplo, tal como ascites em ratinhos).

A produção dos variados anticorpos anti-HCV monoclonais tem sido descrito em, por exemplo, Hougton et al., Patente U.S. N°. 5,350, 671; Chien et al., Publicação Interna N°. WO 93/00365; pedido de Patente U.S. de propriedade comum Nos. 46 08/403,590 e 08/444,818; e Kashiwakuma et al., Patente U.S. N°. 5,817,904.

Tal como explicado acima, os fragmentos de anticorpos que retêm a habilidade de reconhecer o antigénio de interesse, irão também encontrar utilidade no assunto imunoensaios. Um número de fragmentos de anticorpos é conhecido na arte que compreendem zonas de ligação de antigénios capazes de exibir propriedades de ligação imunológicas de uma molécula de anticorpo intacta. Por exemplo, fragmentos de anticorpos funcionais podem ser produzidos pela clivagem de uma região constante, não responsável pela ligação do antigénio, da molécula de anticorpo, utilizando por exemplo, pepsina, para produzir fragmentos F(ab')2- Estes fragmentos irão conter duas regiões de ligação de antigénios, mas não possuem a porção da região constante de cada uma das cadeias pesadas. Da mesma forma, se desejado, fragmentos Fab, compreendendo uma única região de ligação de antigénio, podem ser produzidos, por exemplo, pela digestão de anticorpos monoclonais ou policlonais com papaína. Fragmentos funcionais, que apenas incluem as regiões variáveis das cadeias leves e pesadas, podem também ser produzidos, utilizando técnicas padrão tais como produção recombinante ou preferencialmente pela clivagem proteolitica de moléculas de imunoglobina. Estes fragmentos são conhecidos como Fv. Ver, por exemplo, Inbar et al. (1972)

Proc. Nat. Acad. Sei. USA 6_9:2659-2662; Hochman et al., (1976)

Biochem L5:2706-2710; e Erich et al., (1980) Bíochem 19:4091-4096.

Um polipéptido de cadeia única FV ("sFV" ou "scFV") é um etiómero VH-VL ligado covalentemente que é expresso a partir de uma fusão genética incluindo genes que codificam VH~ e VL“ ligados por um péptido codificante ligante. Houston et al., (1988) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 8_5:5879-5883. Um número de métodos foram descritos para discernir e desenvolver 47 estruturas químicas (ligantes) para a conversão de cadeias polipéptidas leves e pesadas naturalmente agregadas, mas quimicamente separadas, a partir de uma região V de anticorpo numa molécula sFv que irá dobrar numa estrutura tridimensional substancialmente similar à estrutura de uma região de ligação de antigénio. Ver, por exemplo, Patente U.S. N03. 5,091,513, 5,132,405 e 4,946,778. As moléculas sFv podem ser produzidas utilizando métodos descritos na arte. Ver, por exemplo, Houston et al., (1988) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 85:5879-5883; Patente U.S. Nos. 5, 091,513, 5,132, 405 e 4,946,778. O critério de concepção inclui a determinação do tamanho apropriado para estender a distância entre o C-terminal de uma cadeia e o N-terminal da outra, onde o ligante é geralmente formado de pequenos resíduos de aminoácidos hidrofilicos que tendem a não enrolar ou formar estruturas secundárias. Tais métodos foram descritos na arte. Ver, por exemplo, Patente U.S. Nos. 5,091,513, 5,132,405 e 4,946,778. Ligantes apropriados geralmente compreendem cadeias polipeptídicas ou agregados alternados de resíduos de glicina e serina, e podem incluir ácido glutâmico e resíduos de lisina inseridos para intensificar a solubilidade. "Mini-anticorpos" ou "minicorpos" irão também encontrar uso na presente invenção. Minicorpos são cadeias polipéptidas sFv que incluem domínios de oligomerização no seu C-terminal, separados do sFv por uma região de charneira. Pack et al., (1992) Biochem _31:1^79-1584. O domínio de oligomerização compreende hélices-α, por exemplo, de leucina-zipper, que podem ser estabilizados posteriormente por ligações bissulfídicas adicionais. O domínio de oligomerização é desenhado para ser compatível com as dobras vectoriais através da membrana, um processo pensado para facilitar a dobra in vivo do polipéptido numa proteína ligante funcional. Geralmente, os minicorpos são produzidos utilizando métodos 48 recombinantes bem conhecidos na arte. Ver Pack et al., (1992) Biochem 31:1579-1584; Cumber et al., (1992) J Immunology 149B:120-126.

Produção de Antigénios para o uso nos Imunoensaios de HCV

Tal como descrito acima, as moléculas da presente invenção são geralmente produzidas recombinantemente. Por conseguinte, antigénios HCV que codificam polinucleótidos para a utilização com a presente invenção podem ser feitos utilizando técnicas padrão de biologia molecular. Por exemplo, sequências polinucleótidas que codificam as moléculas acima descritas podem ser obtidas utilizando métodos recombinantes, tais como por pesquisa do cDNA e de bibliotecas genómicas a partir de células que expressam o gene, ou derivando o gene de um vector conhecido por incluir o mesmo. Em adição, o gene desejado pode ser directamente isolado de moléculas de ácidos nucleicos virais, utilizando técnicas acima descritas na arte, tais como Houghton et al., Patente U.S. N°. 5,350,671. O gene de interesse pode também ser produzido sinteticamente, em vez de ser clonado. As moléculas podem ser concebidas com os codões apropriados para a sequência em particular. A sequência completa é então montada a partir da sobreposição de oligonucleótidos preparados por técnicas padrão e montados numa sequência codificante completa. Ver, por exemplo, Edge (1981) Nature 292:756; Nambair et al. (1984) Science 223:1299; e Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:6311.

Por conseguinte, sequências de nucleótidos particulares podem ser obtidas a partir de vectores de abarcam as sequências desejadas ou sintetizadas completamente ou em parte utilizando várias técnicas de síntese de oligonucleótidos conhecidas na arte, tais como técnicas de mutagénese dirigida e de reacções de polimerase de reacção em cadeia (PCR) foram as apropriadas. Ver, por exemplo, Sambrook, supra. Em 49 particular, um método para a obtenção de sequências de nucleótidos que codificam as sequências desejadas é pela hibridação de cadeias complementares de oligonucleótidos sintéticos sobrepostos produzidos num sintetizador de polinucleótidos convencional, automatizado, seguida pela ligação com uma ligase apropriada de DNA e amplificação da sequência nucleótida ligada via PVR. Ver, por exemplo, Jayaraman et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:4084-4088. Adicionalmente, síntese directa de oligonucleótidos (Jones, et al. (1986) Nature 5_4:75-82), mutagénese dirigida de oligonucleótidos de regiões nucleótidas pré-existentes (Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327 e Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), e preenchimento enzimático de oligonucleótidos espaçados utilizando polimerase T4DNA (Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8_6:10029-10033) podem ser utilizados sob a invenção para fornecer moléculas possuindo capacidades de antigénios ligantes alteradas ou intensificadas, e/ou imunogenicidade reduzida.

Assim que as sequências de codificação tenham sido preparadas ou isoladas, tais sequências podem ser clonadas em qualquer vector ou replicador apropriado. Numerosos vectores de clonagem são conhecidos pelos especialistas na arte, e a selecção de um vector de clonagem apropriado é uma questão de escolha. Vectores apropriados incluem, mas não estão limitados a, plasmídeos, fagos, transposões, cosmídeos, cromossomas ou vírus que têm a capacidade de replicação quando associados aos elementos de controlo correctos. A sequência codificante é então colocada sob o controlo de elementos de controlo apropriados, dependendo do sistema a ser utilizado para expressão. Por conseguinte, a sequência codificante pode ser colocada sob o controlo de um promotor, de uma região de ligação de ribossoma (para expressão de bactérias) e, opcionalmente, um operador, para que a sequência 50 de interesse de DNA seja transcrita em RNA através de um transformador apropriado. A sequência codificante pode ou não conter um péptido sinal ou uma sequência lider que mais tarde pode ser removida pelo hospedeiro num processamento pós-traslacional. Ver, por exemplo, Patente U.S. Nos. 4,431,739; 4,425,437; 4,338,397.

Em adição às sequências de controlo, poderá ser desejável adicionar sequências reguladoras que permitem regular a expressão das sequências relativamente ao crescimento da célula hospedeira. Sequências reguladoras são conhecidas por aqueles entendidos na arte, e exemplos incluem aquelas que causam o ligar ou desligar da expressão de um gene em resposta a estímulos químicos ou físicos, incluindo a presença de um composto regulador. Outros tipos de elementos reguladores poderão também estar presentes no vector. Por exemplo, elementos intensificadores podem ser utilizados aqui para aumentar os níveis de expressão dos construtores. Exemplos incluem o intensificador genético SV40 precoce (Dijkema et al., (1985) EMBO J. £:761), o intensificador promotor derivado da longa repetição terminal (LTR) do Vírus Rous Sarcoma (Gorman et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 7_9:6777) e elementos derivados do CMV humano (Boshart et al., (1985) Cell ££:521), tais como elementos incluídos na sequência A do intrão CMV (Patente U.S. N°. 5, 688,688). A cassete de expressão poderá depois incluir uma origem de replicação para uma replicação autónoma numa célula hospedeira apropriada, um ou mais marcadores selectivos, uma ou mais regiões de restrição, o potencial para grande número de cópias e um forte promotor.

Um vector de expressão é construído para que a sequência codificante em particular esteja localizada no vector com as sequências reguladoras apropriadas, para que o posicionamento e orientação da sequência codificante no que diz respeito às 51 sequências de controlo sendo tal que a sequência codificante é transcrita sob o "controlo" das sequências de controlo (i.e., a polimerase RNA que se liga à molécula de DNA nas sequências de controlo transcreve a sequência codificante). A modificação das sequências que codificam a molécula de interesse pode ser desejável para se atingir este fim. Por exemplo, em alguns casos poderá ser necessário modificar a sequência para que possa ser anexada às sequências de controlo na orientação apropriada; i.e., para manter a janela de leitura. As sequências de controlo e outras sequências reguladoras podem ser ligadas à sequência codificante antes da inserção num vector. Em alternativa, a sequência codificante pode ser clonada directamente num vector de expressão que já contém as sequências de controlo de uma região de restrição apropriada.

Tal como explicado acima, poderá também ser desejável produzir mutantes ou análogos do antigénio de interesse. Isto é particularmente verdade com NS3/4a. Métodos para isto ser realizado estão descritos em, por exemplo, Dasmahapatra et al., Patente U.S. N°. 5, 843, 752 e Zhang et al., Patente U.S. N°. 5,990,276. Mutantes ou análogos disto e outras proteínas HCV para o uso nos ensaios em questão podem ser preparados pela remoção de uma porção da sequência que codifica o polipéptido de interesse, pela inserção de uma sequência, e/ou pela substituição de um ou mais nucleótidos da sequência. Técnicas para a modificação de sequências de nucleótidos, tais como mutagénese dirigida, e semelhantes, são bem conhecidos por aqueles entendidos na arte. Ver, por exemplo, Sambrok et al., supra; Kunkel, T.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1985) _82:448; Geisselsoder et al., (1987) BioTechniques 5:786; Zoller and Smith (1983) Methods Enzymol. 100:468; Dalbie-McFarlandcet al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:6409. 52

As moléculas podem ser expressas numa vasta variedade de sistemas, incluindo insectos, mamíferos, bactérias, vírus e sistemas de expressão de leveduras, todos bem conhecidos na arte.

Por exemplo, sistemas de expressão celular de insectos, tais como os sistemas de baculovírus, são bem conhecidos por aqueles entendidos na arte e descritos em, por exemplo,

Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) . Os materiais e métodos para os sistemas de expressão celular de insectos/baculovírus estão disponíveis comercialmente em forma de kit pela,entre outros, Invitrogen, San Diego CA ("MaxBac" kit). Da mesma forma, sistemas de expressão de mamíferos e bactérias são bem conhecidos na arte e descrito em, por exemplo, Sambrook, et al., supra. Sistemas de expressão de leveduras são também conhecidos na arte e descritos em, por exemplo, Yeast Genetic

Engineering (Barr et al., eds, 1989) Butterworths, London.

Um número de células hospedeiras apropriado para o uso nos sistemas acima é também conhecido. Por exemplo, linhas celulares de mamíferos são conhecidas na arte e incluem linhas celulares imortalizadas disponíveis pela American Type Culture Collection (ATCC), tais como, mas não limitadas a, células de ovários de hamsters chineses (CHO), células HeLa, células de rins de hamster bebés (BHK), células de rins de macacos (COS), células de rins embrionários humanas, células de carcinomas hepatocelulares humanas (por exemplo, Hep G2), células de rins bovinos Mandin-Darby ("MDBK"), tais como outras. Da mesma forma, hospedeiros bacterianos tais como E. coli, Bacillus subtilis, e Streptococcus spp., irão ter utilidade nas construções de expressões presentes. Hospedeiros leveduras úteis na presente invenção incluem entre outros, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, 53

Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe e Yanowia lipolytica. Células de insecto para o uso em vectores de expressão de baculovírus incluem, entre outros, Aedes aeqypti, Autographa californica, Bômbix mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, e Tríchoplusía ni.

Moléculas de ácidos nucleicos compreendendo sequências nucleótidas de interesse podem ser integradas com estabilidade num genoma celular hospedeiro ou mantidas num elemento epissomal estável numa célula hospedeira apropriada utilizando variadas técnicas de manipulação genética bem conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Patente U.S. N°. 5,339,346.

Dependendo do sistema de expressão e hospedeiro seleccionado, as moléculas são produzidas pela cultura de células hospedeiras transformadas por um vector de expressão descrito acima sob as condições onde a proteína é expressa. A proteína expressa é então isolada das células hospedeiras e purificada. Se o sistema de expressão secreta a proteína para o meio de crescimento, o produto pode ser purificado directamente a partir do meio. Se não é excretada, pode ser isolada a partir de lisados celulares. A selecção das condições apropriadas de crescimento e dos métodos de recolha são conhecidos pelos especialistas na arte. A produção recombinante de variados antigénios de HCV foi descrita. Ver, por exemplo, Houghton et al., Patente U.S. N°. 5,350,671; Chien, et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) _8:S33-39; Chien, et al., Publicação Internacional N°. WO 93/00365; Chien, D.Y., Publicação Internacional N°. WO 94/01778.

Ensaios Imunodiagnósticos

Uma vez produzidos, os anticorpos anti-núcleo acima e os antigénios de NS3/4a são colocados num suporte sólido apropriado para o uso nos imunoensaios em questão. Um suporte sólido, para os propósitos desta invenção, pode ser qualquer 54 material que é uma matriz insolúvel e pode ter uma superfície rígida ou semi-rígida. Alguns exemplos de suportes sólidos incluem, mas não estão limitados a, substratos tais como nitrocelulose (por exemplo, em forma de membrana ou poços de microtitulação); cloreto de polivinilo (por exemplo, folhas ou poços de microtitulação); látex de poliestireno (por exemplo, camas ou placas de microtitulação); fluoreto de polivinilidina; papel diazotizado, membranas de nylon, esferas activadas, esferas de resposta magnética, e semelhantes. Suportes em particular incluem placas, pellets, discos, capilares, fibras ocas, agulhas, pinos, fibras sólidas, esferas de celulose, esferas de vidro poroso, géis de sílica, esferas de poliestireno opcionalmente cruzadas com divinilbenzeno, esferas enxertadas com copolímero, esferas de poliacrilamida, esferas de látex, esferas de dimetilacrilamida opcionalmente cruzadas com N-N'-bis-acriloetilenodiamina, e partículas de vidro cobertas com um polímero hidrofóbico.

Se for desejado, as moléculas para serem adicionadas ao suporte sólido podem ser prontamente funcionalizadas para criar estireno ou radicais de acrilato, activando por conseguinte a incorporação de moléculas no poliestireno, poliacrilato ou outros polímeros tais como, poliamida, poliacrilamida, polietileno, polivinil, polidiacetileno, polifenileno-vinileno, polipéptido, polissacárido, polissulfona, polipirola, poli-imidazole, politiofeno, poliéter, epóxidos, vidro de sílica, sílica gel, siloxano, polifosfato, hidrogel, agarose, celulose, e semelhantes.

Num contexto, um suporte sólido é primeiro reagido com os anticorpos anti-núcleo HCV e epitopo NS3/4a (colectivamente aqui chamados "componentes de fase sólida"), e opcionalmente, um os mais MEFA, sob condições de ligação apropriadas tais que as moléculas são suficientemente imobilizadas ao suporte. Por vezes, a imobilização ao suporte pode ser intensificada por 55 primeiro acoplar o antigénio e/ou anticorpo a uma proteína com melhores propriedades de ligação de fase sólida. Proteínas de acoplamento apropriadas incluem, mas não são limitadas a, macromoléculas tais como soros de albumina incluindo soro de albumina bovino (BSA), hemocianina de lapa, moléculas de imunoglobina, tiroglobina, ovalbumina, e outras proteínas bem conhecidas por aqueles entendidos na arte. Outros reagentes que podem ser utilizados para ligar moléculas ao suporte incluem polissacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, aminoácidos copoliméricos, e semelhantes. Tais moléculas e métodos de acoplagem destas moléculas aos antigénios, são bem conhecidos por aqueles de conhecimento comum na arte. Ver, por exemplo, Brinkley, M.A. (1992) Bioconjugate Chem. 3^:2—13; Hashida, et al., (1984) J. Appl. Biochem. _6:56-63; e Anjaneyulu and Staros (1987) International J. of Peptide and Protein Res. 30:117-124 .

Após se reagir o suporte sólido com os componentes de fase sólida, quaisquer componentes de fase sólida não imobilizados, são removidos do suporte por lavagem, e os componentes ligados ao suporte entram então em contacto com uma amostra biológica que se suspeita que contenha anticorpos e antigénios HCV (colectivamente aqui chamadas de "moléculas ligantes") sob condições de ligação apropriadas Após a lavagem para a remoção de quaisquer moléculas ligantes não ligadas, um segundo anticorpo anti-núcleo, direccionado contra um epitopo diferente do anticorpo anti-núcleo ligado ao suporte, é adicionado sob condições de ligação apropriadas. O anticorpo anti-núcleo adicionado inclui uma marca detectável, tal como descrito acima, e age para ligar qualquer antigénio nuclear que possa estar presente na amostra que reagiu com o anticorpo anti-núcleo suporte de ligação. Também adicionados são um ou mais antigénios que podem reagir com anticorpos presentes na 56 amostra e que têm, por sua vez, reagido com o epitopo de NS3/4a. Tal como explicado acima, o antigénio é tipicamente derivado a partir da região NS3 da poliproteina HCV, e em particular a partir da região c33c do HCV. Consultar, Houghton et al., U.S. Patent No. 5,350, 671; Chien, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (1989) 8j): 10011-10015; Publicação Internacional No. WO 93/00365; e pedidos de Patentes U.S. comuns com os Nos. de série 08/403,590 e 08/444,818, para uma descrição desta região e epitopos derivados dela. Um anticorpo marcado direccionado contra este antigénio é também adicionado. O anticorpo irá por conseguinte ligar-se ao antigénio, que reagiu com anticorpos anti-NS3 presentes na amostra. Para este propósito, o epitopo c33c pode convenientemente ser fornecido como uma fusão entre c33c e dismutase superóxido humana (hSOD), produzida recombinantemente por exemplo, por métodos descritos em Houghton et al., Patente U.S. N°. 5, 350,671. As sequências de nucleótidos e aminoácidos para o SOD humano são conhecidas e registadas em Hallewell et al., Patente U.S. N°. 5, 710,033. Um anticorpo marcado direccionado contra SOD humano pode por conseguinte ser utilizado para detectar a presença de complexos formados entre o epitopo NS3/4a, quaisquer anticorpos na amostra que reajam com este epitopo, e polipéptidos de HCV que por sua vez ligam o anticorpo na amostra.

Se a MEFA está presente no suporte sólido, um ou mais antigénios adicionais, reactivos com anticorpos da amostra biológica que estão ligados a antigénios presentes na MEFA, poderão também ser adicionados ao ensaio. Particularmente útil neste contexto é um antigénio derivado de uma região nuclear de HCV, e mais particularmente, a partir do antigénio c22 que inclui 199 aminoácidos nucleares N-terminais da poliproteina HCV. Um antigénio em particular derivado do c22 é o c22ks Δ47-L44W que inclui aminoácidos da poliproteina do Lysio ao Ser99, 57 bem como uma falta de Arg47 normalmente presente e uma substituição de Leu por Trp na posição 44. Tal como com a epitope c33c descrita acima, este antigénio pode ser fornecido como uma fusão com hSOD e o mesmo anticorpo, direccionado contra a SOD humana, pode ser utilizado para detectar a presença de complexos formados entre anticorpos presentes na amostra e o epitopo de NS3/4a e/ou a MEFA, cujos complexos estão também ligados aos antigénios de HCV (por exemplo, c33c e c22) .

Mais particularmente, um método ELISA pode ser utilizado, onde os poços de uma placa microtitulação estão cobertos com componentes de fase sólida. Uma amostra biológica contendo ou suspeitando-se que contenha moléculas ligantes é então adicionada aos poços cobertos. Após um período de incubação suficiente para permitir a ligação das moléculas ligantes ao componente imobilizado de fase sólida, as placas podem ser lavadas para remoção de radicais não ligados e uma molécula ligante secundária detectavelmente marcada (anticorpo anti-núcleo marcado), um epitopo contendo a molécula NS3, e um anticorpo direccionado contra o epitopo contendo a molécula NS3 adicionada. A estas moléculas é permitido reagir com qualquer anticorpo ou antigénio capturado da amostra, com a placa lavada e com a presença de anticorpos marcados detectáveis utilizando métodos bem conhecidos na arte.

Os ensaios reagentes acima descritos, incluindo o suporte sólido de imunoensaio com anticorpos e antigénios ligados, bem como anticorpo e antigénios para reagirem com a amostra capturada, podem ser fornecidos em kits, com instruções apropriadas e outros reagentes necessários, de forma a se conduzir imunoensaios como os acima descritos. 0 kit poderá também conter, dependendo do imunoensaio usado em particular, marcadores apropriados e outros reagentes e materiais empacotados (i.e, tampões de lavagem e semelhantes). 58

Imunoensaios padrão, tais como aqueles acima descritos, podem ser conduzidos utilizando estes kits. III. Experimental

Em baixo estão exemplos de modalidades especificas para a realização da presente invenção. Os exemplos são dados apenas com fins ilustrativos, e não pretendem limitar o âmbito da presente invenção de qualquer forma. Têm sido feitos esforços para garantir a precisão com respeito à numeração usada (por exemplo, quantidades, temperaturas, etc.), mas, evidentemente, deverão ser permitidos alguns erros e desvios experimentais. EXEMPLO 1

Imunoensaio da Combinação do Antigénio/Anticorpo de HCV 0 presente imunoensaio da combinação dos antigénios/anticorpos de HCV foi comparado com outros ensaios de HCV para testar os limites da detecção da seroconversão e comparar estes limites àqueles obtidos em outros ensaios disponíveis comercialmente tal como segue. A. Materiais e Métodos

Amostras de Sangue: painéis de amostras de sangue humano disponíveis comercialmente foram utilizados. Tais painéis estão disponíveis a partir da, por exemplo, Boston Biomedica, Inc., BocoRatan, FL (NABI) . Os dias indicados na Tabela 5 e 6 são dias em que se recolheu o sangue dos sujeitos.

Anticorpos Monoclonais: Anticorpos monoclonais cll-3, cll-7 e cll-14 são obtidos a partir da Ortho Clinicai Diagnostics, Raritan, New Jersay. Os anticorpos cll-3 e cll-7 são direccionados contra uma porção N-terminal do núcleo (aminoácidos 10-53, numerados relativamente à poliproteína HCV1). O anticorpo monoclonal cll-14 é direccionado contra uma 59 porção C-terminal do núcleo (aminoácidos 120-130, numerados relativamente à poliproteína HCV1). O anticorpo cll-14 foi conjugado a peroxidase de rábano picante (HRP) utilizando procedimentos padrão. O anticorpo monoclonal 5A-3 é um anticorpo anti-SOD direccionado contra os aminoácidos 1 ao 65 de SOD e foi realizado utilizando técnicas Standard. O anticorpo foi conjugado a HRP tal como descrito acima. B. Antigénios: O antigénio c33c (266 aminoácidos, aminoácidos 1192 a 1457 da poliproteina HCV1) foi expresso como um polipéptido de fusão SOD interno em E. coli por métodos descritos para a síntese do antigénio 5-1-1 (Choo, et al., Science (1989) 244:359-362). O antigénio recombinante foi purificado tal como descrito em Chien, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (1989) 89:10011-10015. Ver, também, Houghton et al., U.S. Patent 5,350,671, para a produção de protocolos para SOD-c33c.

[125] O epitopo de NS3/4 utilizada no ensaio é um epitopo conformacional tendo a sequência especificada na Figura 3. C. Formatos dos Imunoensaios: O ensaio Abbott PRISM (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) está disponível comercialmente e é um ensaio de detecção baseado em anticorpos. O ensaio foi realizado utilizando as instruções do fabricante. O Sistema de Teste ELISA ORTHO HCV Versão 3.0 (denominado por ensaio Ortho 3.0, daqui em diante, Ortho Clinicai Diagnostics, Raritan, New Jersey) é um ensaio de detecção baseado em anticorpos. O ensaio foi conduzido utilizando as instruções do fabricante. 60 0 ensaio Roche Amplicor (Roche, Pleasant, CA) é um ensaio baseado em PCR comercialmente disponível. 0 ensaio foi realizado utilizando as instruções do fabricante. 0 ensaio Gen-Probe TMA (San Diego, CA) é um ensaio de amplificação mediada por transcrição comercialmente disponível. 0 ensaio foi realizado utilizando as instruções do fabricante. 0 ensaio de antigénio Ortho (Ortho Clinicai Diagnostics, Raritan, New Jersey) é um ensaio de detecção baseado em antigénios. 0 ensaio foi realizado utilizando as instruções do fabricante. 0 imunoensaio da combinação dos antigénios/anticorpos de HCV foi realizado tal como de seguida. 4mg/mL cada um de anticorpos monoclonais purificados Cll-7 Cll-3 numa solução salina lx fosfato-tamponado (PBS), pH 7.4 foram combinados e bem misturados. Foram adicionados ao mesmo tampão de cobertura 90ng do antigénio recombinante de NS3/4a. A solução foi misturada por 30 minutos antes da cobertura. Foram adicionados 200pL da solução acima para emparelhar bem com às placas de micropipetas Costar de colagem médias (Corning, Inc. ) . As placas foram incubadas a 15-30°C por 16-24 horas. As placas foram lavadas duas vezes com dH20, seguiram com 30yL/poço pós cobertura (1% de soro de albumina bovina (BSA), lx PBS) durante 1 hora e 300yL/poço de tampão de estabilidade (lx PBS, 1% BSA, manitol, polietilenoglicol (PEG), gelatina) por 1 hora. As placas foram aspiradas e secadas a 4°C num liofilizador por 24 horas. As placas foram ensacadas com excicante.

Para conduzir o ensaio de combinação de antigénio/anticorpo, 100yL de tampão de lise intensificado (1% de N-laurilsarcosina, NaCl 0.65M, 50mg/mL grau técnico IgG de ratinho (Sigma, St. Louis, MO), 1% de sulfidrilo de BSA modificado (Bayer), 0.1% de Caseína) foram adicionados à 61 placa. lOOpL de amostra foram então adicionados. Esta foi incubada num misturador a 40°C por 1 hora. As placas foram lavadas seis vezes com lxPBS, 0:1% de Tween-20, numa máquina de lavagem de placas Ortho, 200pL de solução conjugada (diluição 1:75 de cll-14-HRP com 250ng/ensaio de antigénio de SOD-c33c mais uma diluição 1:5000 anti-SOD-HRP de rato numa amostra diluente de HCV 3.0 (a partir do Sistema de Teste ELISA ORTHO HCV versão 3.0, Ortho Clinicai Diagnostics, Raritan, New Jersey) sem extracção de SOD, tudo preparado 30 minutos antes da adição). A solução foi incubada a 40°C com agitação por 45 minutos. Esta foi lavada seis vezes, tal como acima, e 200yL de solução substrato (1 pastilha OPD/lOmL) foram adicionados. A pastilha OPD contém dihidrocloreto de o-fenilenodiamina e peróxido de hidrogénio para um desenvolvimento da coloração da reacçâo da peroxidase de rábano picante e está disponível a partir da Sigma, St. Louis, MO Este foi incubado por 30 minutos a 15-30°C no escuro. A reacção foi interrompida pela adição de 50mL de 4NH2S04 e as placas foram lidas a 492nm, relativamente à absorvância controlo de 690nm. D. Resultados:

Os resultados dos vários ensaios são mostrados nas Tabelas 5 e 6, que representam duas experiências separadas realizadas em amostras de sangue expostas uma infecção de HCV como indicado. As áreas a sombreado indicam a detecção de vírus. Tal como mostrado abaixo, o ensaio Chiron de combinação antigénio/anticorpo, detectou seroconversão em todas as amostras, enquanto todos os outros ensaios baseados em antigénios e anticorpos falharam na detecção de seroconversão em pelo menos uma amostra. Em particular, nenhum dos ensaios baseados em anticorpos detectou seroconversão até, pelo menos, ao dia 18 (Tabela 5). A Tabela 6 mostra que nenhum dos ensaios 62 baseados em anticorpos detectou a presença de infecção por HCV ao dia 22. Além disso, o ensaio Ortho baseado em antigénio falhou na detecção de seroconversão a partir do dia 85 adiante.

Por conseguinte, baseado nos resultados, é claro que o novo ensaio de combinação antigénio/anticorpo reduz o número de falsas negativas obtidas utilizando ensaios convencionais baseados em antigénios e anticorpos.

Tabela 5 - Seroconversão de HVC Dia Abbott PRISM Ortho 3.0 Roche Amplicor Gen-Probe TMA Ortho Ag Chiron Ag/ Ab 0 0.1 0.0 >5x10" 9.25 18.6 2.8 4 0.1 0.0 >5x10" 9.29 19.0 3.1 7 0.1 0.0 >5x10" 9.52 22.3 1.5 13 0.3 0.1 >5x10" 9.59 26.2 1.7 18 1.3 0.4 >5x10" 9.70 15.9 1.2 21 2.2 1.0 >5x10" 9.39 11.3 1.5 164 4.2 4.4 4xl04 9.28 0.11 2.5

Tabela 6 - Seroconversão de HVC Dia Abbott PRISM Ortho 3.0 Roche Amplicor Gen-Probe TMA Ortho Ag Chiron Ag/Ab 0 0.1 0.0 BLD 0.11 0.5 13 0.1 0.0 >5x10" 44.0 3.0 20 0.1 0.0 >5x10" 24.2 1.3 22 0.3 0.0 >5x10" 29.2 1.6 85 5.4 4.7 BQR 0.06 1.1 131 4.3 4.7 BQR 0.09 1.0 135 4 . 6 4.7 3x10" 0.09 1.2 138 5.5 4.7 BLD 0.08 1.2 146 5.9 4.7 BLD 0.11 2.1 152 5.2 4.7 BQR 0.07 1.8 63 EXEMPLO 2

Produção dum Epitopo Conformacional NS3/4a com Substituições de Thr para Pro e de Ser para Ile

Um epitopo conformacional de NS3/4a foi obtido como se segue. Este epitopo tem a sequência especificada nas Figuras 4A até 4D e difere da sequência nativa nas posições 403 (aminoácido 1428 da sequência de HCV-1 de comprimento completo) e 404 (aminoácido 1429 da sequência de HCV-1 de comprimento completo). Especificamente, o Thr que ocorre normalmente na posição 1428 da sequência nativa foi mutado para Pro e Ser que ocorre na posição 1429 da sequência nativa foi mutada para Ile.

Em particular, o vector expressão em leveduras usado foi pBS24.1, descrito acima. O plasmideo pd.hcvla.ns3ns4aPI, que codifica um epitopo NS3/4a representativo usado no imunoensaios em questão, foi produzido como se segue. Foi usado um procedimento de dois passos. Primeiro, as partes de DNA seguintes foram ligadas umas às outras: (a) oligonucleótidos sintéticos que podem fornecer um local de clonagem HindIII 5' , seguidos pela sequência ACAAAACAAA, o iniciador ATG, e os codões para HCVla, que começam com o aminoácido 1027 e continuam para um local Bgll no aminoácido 1046; (b) um fragmento de restrição de 683 bp BglI-Clal (que codifica os aminoácidos 1046-1274) a partir de pAcHLTns3ns4aPI; e (c) um vector pSP72 (Promega, Madison, WI, GenBank/EMBL Número Acesso X65332) que foi digerido com HindIII e Ciai, desfosforilado, e purificado em gel. O plasmideo pAcHLTns3ns4aPI foi derivado de pAcHLT, um vector de expressão de baculovirus comercialmentedisponivel em BD Pharmingen (San Diego, CA) . Em particular, foi preparado um vector pAcHLT EcoRI-PstI, bem como os seguintes fragmentos: EcoRI-Alwnl, 935 bp, que correspondem ao aminoácidos 1027-1336 64 do genoma de HCV-1; Alwnl-SacII, 247 bp, que correspondem ao aminoácidos 1336-1419 do genoma de HCV-1; Hinfl-Bgll, 175 bp, que correspondem ao aminoácidos 1449-1509 do genoma de HCV-1; BglI-PstI, 619 bp, que correspondem ao aminoácidos 1510-1711 do genoma de HCV-1, mais o codão de terminação da transcrição. Um fragmento SacII-Hinfl de 91 bp gerado sinteticamente, que corresponde aos aminoácidos 1420-1448 do genoma de HCV-1 e que contém as mutações PI (Thr-1428 mutada para Pro, Ser-1429 mutada para Ile), foi ligado com o fragmento Hinfl-Bgll de 175 bp e o fragmento BglI-PstI de 619 bp descrito acima e subclonado num vector pGEM-5Zf(+) digerido com SacII e PstI. O pGEM-5Zf(+) é um vector de E. coli comercialmente disponível (Promega, Madison, WI, GenBank/EMBL Accession Number X65308) . Após a transformação de células HB 101 competentes, foi feito uma análise por miniscreen dos clones individuais e verificação da sequência, um fragmento SacII-PstI 885 bp de pGEM5.PI clone2 foi purificado em gel. Este fragmento foi ligado com o fragmento EcoRI-Alwnl de 935 bp, o fragmento Alwnl-SacII 247 bp e o vector pAcHLT EcoRl-Pstl, descrito acima. O constructo resultante foi denominado pAcHLTns3ns4aPI. A mistura de ligação acima foi transformada em HB células 101 competentes e plaqueadas em placas de agar com Luria com 100 g/ml de ampicilina. As análises de miniprep de clones individuais conduziram à identificação de putativos positivos, dois dos quais foram amplificados. Foram preparados o DNA de plasmideo para pSP72 IaHC, os clones #1 e #2 com um kit da Qiagen Maxiprep e foram sequenciados.

Depois, os fragmentos seguintes foram ligados uns aos outros: (a) um fragmento HindIII-Clal 761 bp a partir de pSP721aHC #1 (o pSP72.1aHC foi gerado ligando o conjunto que se segue: O pSP72 que foi digerido com HindIII e Ciai, oligonucleótidos sintéticos que deverão fornecer um local de clonagem HindIII 5', seguido pelo sequência ACAAAACAAA, o 65 codão de iniciação ATG, e os codões para HCVla, começando com o aminoácido 1027 e continuando para um local BglII no aminoácido 1046, e um fragmento de restrição BglII-Clal de 683 bp (que codifica os aminoácidos 1046-1274) a partir de pAcHLTns3ns4aPI); (b) um fragmento BamHI-HindIII de 1353 bp para o promotor híbrido de levedura ADH2/GAPDH; (c) um fragmento Clal-Sall de 1320 bp (que codifica os aminoácidos 1046-1711 de HCVla com Thr 1428 mutada para Pro e Ser 1429 mutada para Ile) a partir de pAcHLTns3ns4aPI; e (d) o vector de expressão de levedura pBS24.1 que foi digerido com BanaHI e Sall, desfosforilado e purificado em gel. A mistura de ligação foi transformada em HB 101 competentes e plaqueadas em placas de agar com Luria com 100 yg/ml de ampicilina. As análises miniprep das colónias individuais conduziram à identificação de clones com o inserto esperado BamHI-SalI de 3446 bp que era compreendido pelo promotor ADH2/GAPDH, o codão iniciador ATG e NS3/4a de HCVla a partir dos aminoácidos 1027-1711 (apresentados como os aminoácidos 1-686 das Figuras 4A-4D), com Thr 1428 (posição do aminoácido 403 das Figuras 4A-4D) mutada para Pro e Ser 1429 (posição do aminoácido 404 das Figuras 4A-4D) mutada para Ile. O constructo foi denominado por pd.HCVla.ns3ns4aPI (consultar, Figura 5). A estirpe AD3 de S. cerevisiae foi transformada com pd.HCVla.ns3ns4aPI e os transformados simples foram verificados quanto à expressão após a depleção da glucose no meio. A proteína recombinante foi expressa em níveis elevados na levedura, como detectado pela coloração com azul de Coomassie e confirmada por análises de imunotransferência usando um anticorpo policlonal para o domínio da helicase de NS3. 66 EXEMPLO 3

Purificação do Epitopo Conformacional NS3/4a

0 epitopo conformacional NS3/4a foi purificado como se segue. As células de S. cerevisiae acima, que expressam o epitopo NS3/4a foram postas em cultura como descrito acima. As células foram suspendidas num tampão de lise (50 mM Tris pH

8.0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, pepstatina 0.1 μΜ, leupeptina 1 μΜ) e lisadas num Dyno-Mill (Wab Willy A. Bachofon, Basel, Suiça) ou aparelho equivalente que use esferas de vidro, numa taxa de 1:1:1 de células:tampão:esferas de vidro de 0.5 mm. O lisado foi centrifugado a 30100 x g durante 30 min a 4°C e o pellet com a fracção da proteína insolúvel foi adicionado ao tampão de lavagem (6 ml/g peso do pellet célula de arranque) e agitado à temperatura ambiente durante 15 min. O tampão de lavagem consiste em NaP04 50 mM, pH 8.0, NaCl 0.3 M, p-mercaptoetanol 5 mM, glicerol a 10%, octil glucósido a 0.05%, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, pepstatina 0.1 μΜ, leupeptina 1 μΜ. Os debris celulares foram removidos por centrifugação a 30100 x g durante 30 min a 4°C. O sobrenadante foi descartado e o pellet guardado. A proteína foi extraída a partir do pellet como se segue. Foram adicionados 6 ml/g de tampão de extracção e agitado à temperatura ambiente durante 15 min. O tampão de extracção consistiu em Tris 50 mM, pH 8.0, NaCl 1 M, β-mercaptoetanol 5 mM, glicerol 10%, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, pepstatina 0.1 μΜ, leupeptina 1 μΜ. Este foi centrifugado a 30100 x g durante 30 min a 4°C. O sobrenadante foi retido e foi adicionado sulfato de amónio a 17.5% usando a seguinte fórmula; volume de sobrenadante (ml) multiplicado por x% de sulfato de amónio/(1 - x% sulfato de amónio) = ml de sulfato de amónio saturado 4.1 M para adicionar o sobrenadante. O sulfato de amónio foi adicionado gota-a-gota durante a agitação em gelo e a solução agitada em gelo durante 10 min. A solução foi centrifugada a 67 17700 x g durante 30 min a 4°C e o pellet retido e armazenado de 2°C a 8"C até 48 horas. O pellet foi ressuspendido e posto a correr numa coluna Poly U (Poly U Sepharose 4B, Amersham Pharmacia) a 4°C como se segue. O pellet foi ressuspendido em 6 ml de tampão de equilíbrio Poly U por grama de peso do pellet. O tampão de equilíbrio consistia em HEPES 25 mM, pH 8.0, NaCl 200 mM, DTT 5 mM (adicionado fresco), glicerol a 10%, octil glucósido a 1.2%. A solução foi agitada a 4°C durante 15 min e centrifugada a 31000 x g durante 30 min a 4°C.

Foi preparada uma coluna Poly U (1 ml de resina por grama de peso inicial de pellet) . A taxa de fluxo linear foi de 60 cm/h e a taxa do fluxo de empacotamento foi de 133% de 60 cm/h. A coluna foi equilibrada com tampão de equilíbrio e o sobrenadante do pellet ressuspendido com sulfato de amónio foi carregado para a coluna equilibrada. A coluna foi lavada até à linha de base com o com tampão de equilíbrio e a proteína eluída com um passo de eluição no seguinte tampão de eluição Poly U: HEPES 25 mM, pH 8.0, NaCl 0.1 mM, DTT 5 mM (adicionado fresco), glicerol a 10%, octil glucósido a 1.2%. O eluído na coluna foi corrido em SDS-PAGE (corado com Coomassie) e foram armazenadas alíquotas congeladas a -80°C. A presença do epitopo NS3/4a foi confirmado por Western blot, usando um anticorpo policlonal direccionado contra o domínio da protease NS3 e um anticorpo monoclonal contra o epitopo 5-1-1 (HCV 4a) .

Adicionalmente, a actividade da enzima protease foi monitorizada durante a purificação como se segue. Um péptido NS4A (KKGS-VVIVGRIVLSGKPAIIPKK), e a amostra com o epitopo conformacional NS3/4a, foram diluídos em 90 μΐ de tampão de reacção (Tris 25 mM, pH 7.5, NaCl 0.15M, EDTA 0.5 mM, glicerol a 10%, n-dodecil B-D-maltósido a 0.05%, DTT 5 mM) e deixado a misturar durante 30 minutos à temperatura ambiente, foram adicionados 90 μΐ da mistura a uma placa de microtitulação 68 (Costar, Inc., Corning, NY) e foram adicionados 10 μ 1 de substrato de HCV (AnaSpec, Inc., San Jose CA). A placa foi misturada e lida num leitor de placas Fluostar. Os resultados foram expressos como unidades de fluorescência relativa (RFU) por minuto.

Usando estes métodos, o produto da extracção com NaCl 1 M continha uma actividade de 3.7 RFU/min, o precipitado de sulfato de amónio tinha uma actividade de 7.5 RFU/min e o produto da purificação com Poly U tinha uma actividade de 18.5 RFU/min. EXEMPLO 4

Estudos de Competição

Os estudos de competição seguintes foram conduzidos de modo a avaliar se o epitopo conformacional NS3/4a detectou anticorpos diferentes de outros antigénios de HCV. Em particular, o antigénio NS3/4a foi comparado com o antigénio c200 como se segue. 0.5 pg e 1.0 pg de NS3/4a, produzidos como descrito acima, ou c200 (Hepatology (1992) 15:19-25, disponível em ORTHO HCV versão 3.0 ELISA Test System, Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey), foram misturados com 20 pl de amostra de PHV914-5 (uma drenagem de seroconversão precoce obtida a partir de sangue de um indivíduo infectado) num volume total de 220 pl (1 x PBS) . A mistura foi incubada durante 1 hora em micropoços a 37°C. A mistura foi então transferida para placas com NS3/4a cobertas e incubadas durante 1 hora a 37°C. As plascas foram lavadas e ensaiadas como se segue.

Foi adicionado 1 pg de antigénio c200 a 10 pl da amostra PHV914-5 num volume total de cerca de 220 pl. A mistura foi incubada durante 1 hora num micropoço a 37°C e foram transferidos 200 pl para uma placa NS3/4a coberta (100 ng/ensaio) e incubada durante 1 hora a 37°C. As placas foram 69 lavadas cinco vezes com 1 x PBS, 0.1% Tween-20. Foram adicionados 200 μΐ da solução de conjugado (descrita acima) e as placas foram incubadas e ensaiadas. Os controlos que consistiram em PHV914-5 e 1 x PBS (sem antigénio) também foram tratados como acima.

Os resultados estão apresentados na Tabela 7. Os resultados da percentagem de inibição apresentada na coluna 4 são calculados como a coluna 3 menos (coluna 2 dividida pela coluna 3 vezes 100) . Com pode ser visto, os dados mostram que o NS34a é neutralizado pelos anticorpos de seroconversão precoces e o c200 não é. Foi conseguido um forte sinal quando os anticorpos no membro do painel de seroconversão PHV914-5 c33c precoce posto a reagir com NS34a coberto na placa. O antigénio c200 não foi neutralizado por estes anticorpos. Isto está apresentado no painel de topo da Tabela 7. Quando o NS34a foi misturado com a amostra PHV914-5, este foi neutralizado e, assim, não haviam anticorpos presentes na amostra para reagir com o NS34a que estava coberto nas microplacas. Os dados indicam que o NS34a talvez possa detectar uma classe diferente de anticorpos dos que são detectados por c200.

Tabela 7

Estudos de Competição Para mostrar que o antigénio NS34a detecta anticorpos diferentes no painel de seroconversão c33c precoce comparado com o antigénio c200 1 2 3 4 Controlo C200 + PHV914-5 lxPBS % Inibição s s lug 1.450 1.645 12 lug 1545 1.687 8 0.5ug 1.557 1.913 19 0.5ug 1.719 1.804 5 70

NS3/4a + PHV914-5 S lug 0.054 lug 0.037 0.5ug 0.066 0.5ug NA

S 1.599 97 1.677 98 1672 96 1.524 NA EXEMPLO 5

Estudos de Estabilidade do Epitopo Conformacional NS3/4a

Para avaliar o papel da estabilidade do epitopo NS3/4a na performance do ensaio, foi feito o seguinte estudo para determinar a imunoreactividade de NS3/4a versus tempo à temperatura ambiente. Deixaram-se pequenas aliquotas de NS3/4a base assentar à temperatura ambiente e depois congeladas em intervalos tal como apresentados na Tabela 8. Todos os frascos foram tapados simultaneamente e testados contra dois painéis de seroconversão de NS3 precoce.

Tal como pode ser visto na Tabela 8, o NS3/4a base não é estável e a imunoreactividade decresce com o tempo.

Adicionalmente, é necessário a manutenção da conformação de NS3/4a para a imunoreactividade.

Foram realizados outros estudos de estabilidade como se segue. Dois anticorpos monoclonais conformacionais feitos contra a NS3/4a que usam procedimentos padrão foram substituídos por painéis de seroconversão anti-HCV precoces. Os frascos de NS3/4a base foram armazenados à temperatura ambiente com intervalos de tempo de 3, 6 e 24 horas. A NS3/4a a partir dos frascos congelados foi coberta com 90 ng/ml e ensaiada usando o procedimento descrito acima. Os resultados sugeriram que os dois monoclonais foram de facto conformacionais e a sua reactividade foi sensível à manipulação do antigénio de NS3/4a base à temperatura ambiente. A reactividade dum anticorpo monoclonal de controlo positivo não variou. 71

Tabela 8

Tempo (H) 0 6 21.4 29 35.5 46 52 controlo A D G H I K N Referência s/co s/co s/co s/co s/co s/co s/co s/co PHV 904-1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 PHV 904-2 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 PHV 904-3 1.5 0.3 0.1 0.0 0.0 0.0 0.0 1.8 PHV 904-4 3.7 1.0 0.2 0.1 0.1 0.1 0.1 4.4 PHV 904-5 4.8 2.0 0.7 0.6 0.3 0.2 0.3 5.5 PHV 904-6 5.4 2.8 1.1 1.0 0.6 0.5 0.6 5.8 PHV 904-7 5.1 3.4 1.5 1.0 1.1 0.5 0.7 5.4 PHV 914-1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 PHV 914-2 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 PHV 914-3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 PHV 914-4 0.5 0.1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.7 PHV 914-5 2.1 0.4 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 3.0 PHV 914-6 2.3 0.4 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 3.4 PHV 914-7 2.8 0.5 0.1 0.1 0.0 0.0 0.0 4.9 PHV 914-8 2.9 0.7 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 4.9 Ensima RFU/min 8.75 4.14 3.08 1.88 1.75 1.75 0.75 EXEMPLO 6

Imunoreactividade do Epitopo Conformacional NS3/4a versus NS3/4a Desnaturado A imunoreactividade do epitopo conformacional NS3/4a, produzido como descrito acima, foi comparada com NS3/4a que foi desnaturado através da adição de SDS à preparação do 72 epitopo conformacional NS3/4a numa concentração final de 2%. 0 NS3/4a desnaturado e o NS3/4a conformacional foram cobertos em placas de microtitulação como descrito acima. 0 antigénio c200 (Hepatology (1992) 15:19-25, disponível na ORTHO HCV versão 3.0 ELISA Test System, Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) também foi coberto em placas de microtitulação. O antigénio c200 foi usado como uma comparação que se presume ser não conformacional devido à presença de agente redutor (DTT) e detergente (SDS) na sua formulação. A imunoreactividade foi testada contra dois painéis de seroconversão HCV precoces, PHV 904 e PHV 914 (disponíveis comercialmente em amostras de sangue humano da Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater, MA). Os resultados estão apresentados na Tabela 9. Os dados sugerem que a forma desnaturada ou linearizada de NS3/4a (bem como de c200) não detecta os painéis de seroconversão precoces tão cedo como o epitopo conformacional NS3/4a. TABELA 9 NS3/4a vs NS3/4a desnaturado SDS 2% espiculado para NS3/4a base NS3/4a dNS3/4a * C200 NS3/4a dNS3/4a * C200 OD OD OD s/co s/co s/co HCV PHV 904-1 0.012 0.012 0.009 0.02 0.02 0.01 Seroconver -são PHV 904-2 0.011 0.009 0.008 0.02 0.01 0.01 PHV 904-3 1.124 0.071 0.045 1.80 0.11 0.07 PHV 904-4 2.401 0.273 0.129 3.85 0.44 0.21 PHV 904-5 3.022 0.793 0.347 4.85 1.28 0.57 PHV 904-6 2.711 1.472 0.774 4.85 2.37 1.28 PHV 904-7 3.294 1.860 0.943 5.28 2.99 1.55 73 PHV 914-1 0.006 0.004 0.001 0.01 0.01 0.00 PHV 914-2 0.005 0.004 0.002 0.01 0.01 0.00 PHV 914-3 0.098 0.003 0.001 0.16 0.00 0.00 PHV 914-4 1.118 0.006 0.004 1.79 0.01 0.01 PHV 914-5 2.035 0.044 0.022 3.26 0.07 0.04 PHV 914-6 2.092 0.074 0.025 3.35 0.012 0.04 PHV 914-7 2.519 0.281 0.132 4.04 0.45 0.22 PHV 914-8 2.746 0.907 0.500 4.40 1.45 0.82 PHV 914-9 3.084 1.730 0.931 4.94 2.78 1.53 HVC 3.0 Cont. Neg. 0.023 0.024 0.008 Controlos Cont. Neg 0.027 0.024 0.007 Cont. Neg 0.021 0.017 0.005 média 0.024 0.022 0.007 corte 0.624 0.622 0.607 Pós contagem 1.239 0.903 0.575 1.99 1.45 0.95 Pós contagem 1.445 0.916 0.614 2.32 1.47 1.01 A imunoreactividade do epitopo conformacional também foi testada usando anticorpos monoclonais to NS3/4a, feitos usando procedimentos padrão. Estes anticorpos monoclonais foram então testados no formato ELISA contra NS3/4a e NS3/4a desnaturado e antigénio c200. Os dados mostram que os monoclonais anti-NS3/4a reagem com o NS3/4a e o NS3/4a desnaturado de um modo similar ao dos painéis de seroconversão apresentados na Tabela 10. Este resultado também fornece outras evidências de que o NS3/4a é conformacional na natureza como os anticorpos monoclonais podem ser feitos o que é similar em reactividade dos painéis de seroconversão c33c precoces. 74

Tabela 10 Placa NS3/4a dNS3/4a c200 Monoclonal OD OD OD 4B9/E3 1:100 1.820 0.616 0.369 1:1000 1.397 0.380 0.246 1:10000 0.864 0.173 0.070 1:20000 0.607 0.116 0.085 5B7/D7 1:100 2.885 0.898 0.436 1:1000 2.866 0.541 0.267 1:10000 1.672 0.215 0.086 1:20000 1.053 0.124 0.059 1A8/H2 1:100 1.020 0.169 0.080 1:1000 0.921 0.101 0.043 1:10000 0.653 0.037 0.013 1:20000 0.337 0.027 0.011 2007

Lisboa, 12 de Março de 75

Claims (27)

1. REIVINDICAÇÕES 1- Um suporte sólido de imunoensaio, caracterizado por compreender, pelo menos, um anticorpo anti-núcleo do virus da hepatite C (HCV) e, pelo menos, um epitopo NS3/4a de HCV isolado ai ligado. 2- 0 suporte sólido de imunoensaio, de acordo com a reivindicação N°.l, caracterizado por compreender, pelo menos, dois anticorpos anti-núcleo de HCV ai ligados. 3- 0 suporte sólido de imunoensaio, de acordo com a Rreivindicação N°.l, caracterizado por o referido, pelo menos um anticorpo anti-núcleo, estar direccionado contra uma região N-terminal do antigénio do núcleo de HCV. 4- 0 suporte sólido de imunoensaio, de acordo com a reivindicação N°.3, caracterizado por, pelo menos, um anticorpo anti-núcleo estar direccionado contra os aminoácidos 10-53 de HCV, numerados relativamente à sequência da poliproteina de HCV1.
2. 5- O suporte sólido de imunoensaio, de acordo com a reivindicação N°.l, caracterizado por o referida, pelo menos, um anticorpo anti-núcleo ser um anticorpo monoclonal.
3. 6- O suporte sólido de imunoensaio, de acordo com a reivindicação N°.l, caracterizado por o referido epitopo NS3/4a ser um epitopo conformacional e compreender a sequência de aminoácidos representada nas Figuras 4A-4D.
4. 7- O suporte sólido de imunoensaio, de acordo com a reivindicação N°.l, caracterizado por compreender ainda um antigénio de fusão de múltiplos epitopos aí ligado.
5. 8- O suporte sólido de imunoensaio, de acordo com a reivindicação N°.7, caracterizado por o referido antigénio de fusão de múltiplos epitopos compreender a sequência de aminoácidos representada nas Figuras 7A-7F. 1
6. 9- Um suporte sólido de imunoensaio, caracterizado por compreender dois anticorpos monoclonais anti-núcleo do vírus da hepatite C (HCV) e um epitopo conformacional NS3/4a de HCV que compreende a sequência de aminoácidos representada nas Figuras 4A-4D, aí ligados.
7. 10- O suporte sólido de imunoensaio, de acordo com a reivindicação N°.9, caracterizado por os referidos anticorpos anti-núcleo estarem direccionados contra uma região N-terminal do antigénio do núcleo de HCV.
8. 11- O suporte sólido de imunoensaio, de acordo com a reivindicação N°.10, caracterizado por os referidos anticorpos anti-núcleo estarem direccionados contra os aminoácidos 10-53 de HCV, numerados relativamente à sequência da poliproteina de HCV1.
9. 12- Um suporte sólido de imunoensaio, caracterizado por compreender dois anticorpos monoclonais anti-núcleo do vírus da hepatite C (HCV), um epitopo conformacional NS3/4a de HCV que compreende a sequência de aminoácidos representada nas Figuras 4A-4D, e um antigénio de fusão de múltiplos epitopos que compreende a sequência de aminoácidos representada nas Figuras 7A-7P, aí ligados.
10. 13- Um método para detectar a infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) numa amostra biológica, caracterizado por referido método compreender: (a) o fornecimento dum suporte sólido de imunoensaio, de acordo com a reivindicação N°.l; (b) a combinação duma amostra biológica com o referido suporte sólido, sob condições que permitem que os anticorpos e antigénios de HCV, quando presentes na amostra biológica, ligarem-se ao referido, pelo menos, um anticorpo anti-núcleo e o referido epitopo NS3/4a, respectivamente; (c) a adição ao suporte sólido a partir do passo (b) sob condições de formação de complexo (i) um primeiro anticorpo 2 detectavelmente marcado, em que o referido primeiro anticorpo detectavelmente marcado é um anticorpo anti-núcleo de HCV detectavelmente marcado, em que o referido anticorpo anti-núcleo detectavelmente marcado está direccionado contra um epitopo do núcleo de HCV diferente do, pelo menos, um anticorpo anti-núcleo ligado ao suporte sólido; (ii) um antigénio que reage com um anticorpo de HCV a partir da amostra biológica reactivo com o referido epitopo NS3/4a; e (iii) um segundo anticorpo detectavelmente marcado, em que o referido segundo anticorpo detectavelmente marcado é reactivo com o antigénio de (ii); (d) a detecção de complexos formados entre os anticorpos e antigénios, se algum, como uma indicação de infecção por HCV na amostra biológica. 14- 0 método, de acordo com a reivindicação N°.13, caracterizado por o referido, pelo menos, um anticorpo anti-núcleo estar direccionado contra uma região N-terminal do antigénio do núcleo de HCV, e o referido anticorpo anti-núcleo de HCV detectavelmente marcado, estar direccionado contra uma região C-terminal do antigénio do núcleo de HCV. 15- 0 método, de acordo com a reivindicação N°.14, caracterizado por o referido, pelo menos, um anticorpo anti-núcleo estar direccionado contra os aminoácidos 10-53 de HCV, numerado relativamente à sequência da poliproteína de HCV1, e o referido anticorpo anti-núcleo de HCV detectavelmente marcado estar direccionado contra os aminoácidos 120-130 de HCV, numerado relativamente à sequência da poliproteína de HCV1.
11. 16- O método, de acordo com a reivindicação N°.13, caracterizado por o referido antigénio, que reage com um anticorpo de HCV, a partir da amostra biológica, compreender um epitopo a partir da região c33c da poliproteína de HCV. 3 17- 0 método, de acordo com a reivindicação N°.16, caracterizado por o epitopo c33c ser fundido com uma sequência de aminoácidos da superóxido dismutase humana (hSOD) e o segundo anticorpo detectavelmente marcado ser reactivo com a referida sequência de aminoácidos hSOD. 18- 0 método, de acordo com a reivindicação N°.13, caracterizado por o em que o referido epitopo NS3/4a ser um epitopo conformacional e compreender a sequência de aminoácidos representada nas Figuras 4A-4D.
12. 19- Um método para detectar a infecção pelo virus da hepatite C (HCV) numa amostra biológica, caracterizado por o referido método compreender: (a) o fornecimento dum suporte sólido de imunoensaio, de acordo com a reivindicação N°.2; (b) a combinação duma amostra biológica com o referido suporte sólido sob condições que permitem que os anticorpos e antigénios de HCV, quando presentes na amostra biológica, ligarem-se aos referidos, pelo menos, dois anticorpos anti-núcleo e o referido epitopo NS3/4a, respectivamente; (c) a adição ao suporte sólido, a partir do passo (b), sob condições de formação de complexo, (i) de um primeiro anticorpo detectavelmente marcado, em que o referido primeiro anticorpo detectavelmente marcado é um anticorpo anti-núcleo de HCV detectavelmente marcado, em que o referido anticorpo anti-núcleo detectavelmente marcado está direccionado contra um epitopo do núcleo de HCV, diferente dos, pelos menos dois anticorpos anti-núcleo ligados ao suporte sólido; (ii) um epitopo a partir da região c33c da poliproteina de HCV fundida à sequência de aminoácidos de hSOD; e (iii) um segundo anticorpo detectavelmente marcado, em que o referido segundo anticorpo detectavelmente marcado é reactivo com a referida sequência de aminoácidos de hSOD; 4 (d) a detecção de complexos formados entre os anticorpos e antigénios, se algum, como uma indicação de infecção por HCV na amostra biológica.
13. 20- O método, de acordo com a reivindicação N°.19, caracterizado por o referido epitopo NS3/4a ser um epitopo conformacional e compreendendo a sequência de aminoácidos representada nas Figuras 4A-4D.
14. 21- Um método para detectar a infecção pelo virus da hepatite C (HCV) numa amostra biológica, o referido método caracterizado por compreender: (a) o fornecimento dum suporte sólido de imunoensaio de acordo com a reivindicação N°.9; (b) a combinação duma amostra biológica com o referido suporte sólido sob condições que permitem que os anticorpos e antigénios de HCV, quando presentes na amostra biolóqica, ligarem-se ao referido, pelo menos dois anticorpos anti-núcleo, e o referido epitopo conformacional NS3/4a, respectivamente; (c) a adição ao suporte sólido a partir do passo (b) sob condições de formação de complexo (i) um primeiro anticorpo detectavelmente marcado, em que o referido primeiro anticorpo detectavelmente marcado é um anticorpo anti-núcleo de HCV detectavelmente marcado, em que o referido anticorpo anti-núcleo detectavelmente marcado está direccionado contra um epitopo do núcleo de HCV diferente dos pelos menos dois anticorpos anti-núcleo ligados ao suporte sólido; (ii) um epitopo a partir da região c33c da poliproteína de HCV fundida à sequência de aminoácidos de hSOD; e (iii) um segundo anticorpo detectavelmente marcado, em que o referido segundo anticorpo detectavelmente marcado é reactivo com a referida sequência de aminoácidos de hSOD; 5 (d) a detecção de complexos formados entre os anticorpos e antigénios, se algum, como uma indicação de infecção por HCV na amostra biológica.
15. 22- O método, de acordo com a reivindicação N°.21, caracterizado por os referidos, pelo menos dois anticorpos anti-núcleo, estarem direccionados contra uma região N-terminal do antigénio do núcleo de HCV, e o referido anticorpo anti-núcleo de HCV detectavelmente marcado estar direccionado contra uma região C-terminal do antigénio do núcleo de HCV. 23- 0 método, de acordo com a reivindicação N°.22, caracterizado por os referidos, pelo menos dois anticorpos anti-núcleo, estarem direccionados contra os aminoácidos 10-53 de HCV, numerados relativamente à sequência da poliproteina de HCV1, e o referido anticorpo anti-núcleo de HCV detectavelmente marcado estar direccionado contra os aminoácidos 120-130 de HCV, numerado relativamente à sequência da poliproteina de HCV1.
16. 24- Um método para detectar a infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) numa amostra biológica, caracterizado por o referido método compreender: (a) o fornecimento dum suporte sólido de imunoensaio, de acordo com a reivindicação N°.7; (b) a combinação duma amostra biológica com o referido suporte sólido sob condições que permitem que os anticorpos e antigénios de HCV, quando presentes na amostra biológica, ligarem-se ao referido pelo menos um anticorpo anti-núcleo e ao referido epitopo NS3/4a e ao referido antigénio de fusão de múltiplos epitopos; (c) a adição ao suporte sólido, a partir do passo (b) , sob condições de formação de complexo, (i) dum primeiro anticorpo detectavelmente marcado, em que o referido primeiro anticorpo detectavelmente marcado é um anticorpo anti-núcleo de HCV detectavelmente marcado, em que o referido anticorpo anti- 6 núcleo detectavelmente marcado está direccionado contra um epitopo do núcleo de HCV diferente do pelo menos um anticorpo anti-núcleo ligado ao suporte sólido; (ii) um primeiro e um segundo antigénios que reagem com um anticorpo de HCV a partir da amostra biológica reactiva com o referido epitopo NS3/4a e o referido antigénio de fusão de múltiplos epitopos; e (iii) um segundo anticorpo detectavelmente marcado, em que o referido segundo anticorpo detectavelmente marcado é reactivo com o antigénio de (ii); (d) a detecção de complexos formados entre os anticorpos e antigénios, se algum, como uma indicação de infecção por HCV na amostra biológica. 25- 0 método, de acordo com a reivindicação N°.24, caracterizado por o referido, pelo menos um anticorpo anti-núcleo, estar direccionado contra uma região N-terminal do antigénio do núcleo de HCV e o referido primeiro anticorpo anti-núcleo de HCV detectavelmente marcado, estar direccionado contra uma região C-terminal do antigénio do núcleo de HCV. 26- 0 método, de acordo com a reivindicação N°.25, caracterizado por o referido, pelo menos um anticorpo anti-núcleo, estar direccionado contra os aminoácidos 10-53 de HCV, numerado relativamente à sequência da poliproteína de HCV1, e o referido anticorpo anti-núcleo de HCV detectavelmente marcado estar direccionado contra os aminoácidos 120-130 de HCV, numerado relativamente à sequência da poliproteina de HCV1.
17. 27- O método, de acordo com a reivindicação N°.24, caracterizado por o referido primeiro antigénio que reage com um anticorpo de HCV, a partir da amostra biológica, compreender um epitopo a partir da região c33c da poliproteina de HCV.
18. 28- O método, de acordo com a reivindicação N°.27, caracterizado por o epitopo c33c ser fundido com uma sequência 7 de aminoácidos da superóxido dismutase humana (hSOD), e o segundo anticorpo detectavelmente marcado ser reactivo com a referida sequência de aminoácidos hSOD.
19. 29- O método, de acordo com a reivindicação N°.24, caracterizado por o referido segundo antigénio, que reage com um anticorpo de HCV a partir da amostra biológica, compreender um epitopo a partir da região c22 da poliproteina de HCV.
20. 30- O método, de acordo com a reivindicação N°.29, caracterizado por o epitopo, a partir da região c22, compreender os aminoácidos Lysio a Sergg da poliproteina de HCV, com uma depleção da Arg47 e uma substituição de Leu por Trp a posição 44, numerada relativamente à sequência da poliproteina de HCV1, em que o referido epitopo é fundido com uma sequência de aminoácidos da superóxido dismutase humana (hSOD) e o segundo anticorpo detectavelmente marcado é reactivo com a referida sequência de aminoácidos da hSOD.
21. 31- O método, de acordo com a reivindicação N°.24, caracterizado por o referido antigénio de fusão de múltiplos epitopos compreender a sequência de aminoácidos representada nas Figuras 7A-7F.
22. 32- Um método para detectar a infecção pelo virus da hepatite C (HCV) numa amostra biológica, caraterizado por o referido método compreender: (a) o fornecimento dum suporte sólido de imunoensaio de acordo com a reivindicação 12; (b) a combinação duma amostra biológica com o referido suporte sólido sob condições que permitem que os anticorpos e antigénios de HCV, quando presentes na amostra biológica, ligarem-se aos referidos, pelo menos dois anticorpos anti-núcleo, o referido epitopo conformacional NS3/4a e o referido antigénio de fusão de múltiplos epitopos, respectivamente; (c) a adição ao suporte sólido a partir do passo (b) sob condições de formação de complexo (i) um primeiro anticorpo 8 detectavelmente marcado, em que o referido primeiro anticorpo detectavelmente marcado é um anticorpo anti-núcleo de HCV detectavelmente marcado, em que o referido anticorpo anti-núcleo detectavelmente marcado está direccionado contra um epitopo do núcleo de HCV diferente dos pelos menos dois anticorpos anti-núcleo ligado ao suporte sólido; (ii) um epitopo a partir da região c33c da poliproteina de HCV fundida à sequência de aminoácidos de hSOD e um epitopo a partir da região c22 da poliproteina de HCV fundida à sequência de amino ácido de hSOD; e (iii) um segundo anticorpo detectavelmente marcado, em que o referido segundo anticorpo detectavelmente marcado é reactivo com a referida sequência de aminoácidos de hSOD; (d) a detecção de complexos formados entre os anticorpos e antigénios, se algum, como uma indicação de infecção por HCV na amostra biológica. 33- 0 método, de acordo com a reivindicação N°.32, caracterizado por os referidos, pelo menos, dois anticorpos anti-núcleo estarem direccionados contra uma região N-terminal do antigénio do núcleo de HCV e o referido anticorpo anti-núcleo de HCV detectavelmente marcado estar direccionado contra uma região C-terminal do antigénio do núcleo de HCV.
23. 34- O método, de acordo com a reivindicação N°.33, caracterizado por os referidos, pelo menos dois anticorpos anti-núcleo, estarem direccionados contra os aminoácidos 10-53 de HCV, numerados relativamente à sequência da poliproteina de HCVl e o referido anticorpo anti-núcleo de HCV detectavelmente marcado estar direccionado contra os aminoácidos 120-130 de HCV, numerado relativamente à sequência da poliproteina de HCVl.
24. 35- O método, de acordo com a reivindicação N°.32, caracterizado por o epitopo a partir da região c22 compreender os aminoácidos Lysio a Ser99 da poliproteina de HCV, com uma 9 depleção de Arg47 e uma substituição de Leu por Trp na posição 44, numerada relativamente à sequência da poliproteina de HCV1.
25. 36- Um kit de teste de imunodiagnóstico, caracterizado por compreender o suporte sólido de imunoensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicações N°.l-N°.12 e instruções para realizar o teste de imunodiagnóstico.
26. 37- Um método de produção dum suporte sólido de imunoensaio, caracterizado por compreender: (a) fornecimento dum suporte sólido; e (b) ligação de, pelo menos, um anticorpo anti-núcleo do virus da hepatite C (HCV) e, pelo menos, um epitopo conformacional NS3/4a de HCV ai isolado.
27. 36- Um método de produção dum suporte sólido de imunoensaio, caracterizado por compreender: (a) fornecimento dum suporte sólido; e (b) ligação de, pelo menos, dois anticorpos anti-núcleo do virus da hepatite C (HCV) e um epitopo conformacional NS3/4a de HCV ai isolado. 37- 0 método, quer de acordo com a reivindicação N°.38 quer da reivindicação N°.39, caracterizado por compreender ainda a ligação de pelo menos um antigénio de fusão de epitopos múltiplos ao suporte sólido. Lisboa, 12 de Março de 2007 10