DE10106295C1

DE10106295C1 - Protein mit mehreren Antigen-Epitop-Sequenzen, welches immobilisiert ist

Info

Publication number: DE10106295C1
Application number: DE10106295A
Authority: DE
Inventors: Heinrich Repke; Eckhard Budde
Original assignee: GAIFAR GERMAN AMERICAN INST FO
Current assignee: GAIFAR GERMAN AMERICAN INST FO
Priority date: 2001-02-02
Filing date: 2001-02-02
Publication date: 2002-08-22
Anticipated expiration: 2021-02-03
Also published as: US20030082208A1; AU2002308275A1; EP1229044A1; WO2002074797A3; WO2002074797A2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Protein mit mehreren Antigen-Epitop-Sequenzen für Antikörper, wobei das Protein an einer Festphase über zumindest eine Bindungsstelle immobilisiert ist, und wobei die Antigen-Epitop-Sequenzen über Brückenverbindungen mit der Maßgabe beabstandet sind, daß nach Bindung der Bindungsstelle an der Festphase die Antigen-Epitop-Sequenzen für eine Bindung der zugeordneten Antikörper aus der flüssigen Phase exponiert sind.

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Protein mit mehreren Antigen-Epitop-Sequenzen, welches immobilisiert ist, eine für ein solches Protein codierende Polynukleo tide, einen Expressionsvektor enthaltend solche Polynukleotide, eine mittels eines solchen Expres sionsvektors transformierte Zelle, sowie Verwendungen eines solchen Proteins zur Herstellung eines Immobili sats und zur Herstellung eines HIV-Tests.

Hintergrund der Erfindung

Immobilisate aufweisend eine feste Phase und ein oder mehrere an der festen Phase gebundene Proteine sind vielfältig aus der Praxis bekannt. Solche Immobilisate werden einerseits zum Nachweis von an das Protein spezifisch bindenden Substanzen eines flüssigen Ana lysats und andererseits zur Abtrennung solcher Sub stanzen aus einer Flüssigkeit eingesetzt. Dabei weist das Protein ein Epitop auf, welches für die nachzu weisende oder abzutrennende Substanz spezifisch ist, und dieses Epitop ist in der Regel über eine Spac erverbindung, die als solche nicht an die Substanz bindet, an die feste Phase gebunden. Die Spacerver bindung gewährleistet u. a., daß das Protein sich im Bereich des Epitops in einer Weise faltet, die der Faltung des nativen Epitops entspricht. Dies, i. e. die gewünschte Exponierung des Epitops, ist die Voraus setzung dafür, daß eine Bindung der Substanz überhaupt möglich ist. Insbesondere wird die Ausbildung unerwün schter Disulfidbrücken verhindert.

In manchen Bereichen der Medizin ist es wünschenswert, wenn verschiedene Epitope gleichzeitig an der festen Phase immobilisiert sind. Dies ist beispielsweise im Falle von HIV-Tests wünschenswert, da nur eine Ansam melung von Epitopen, welche für Antikörper für ver schiedene HIV1 und HIV2 Stämme und Subtypen spezifisch sind, eine zuverlässige Aussage auf Basis des Tester gebnisses darüber gewährleisten, ob die getestete Probe HIV Antikörper, welchen Subtyps auch immer, ent hält oder nicht, i. e. ob eine Person HIV positiv ist oder nicht.

Grundsätzlich könnten die jeweiligen Proteine, beispielsweise Antigene gegen diverse HIV Antikörper, jeweils für sich an der festen Phase immobilisiert werden. Dies birgt jedoch verschiedene Probleme. Ein erstes Problem besteht darin, daß eine gleichmäßige Verteilung der Proteine, insbesondere hinsichtlich der Konzentrationen, und somit eine hinreichend gleichför mige Sensitivität für verschiedene Antikörper nicht gewährleistet werden kann. Denn verschiedene Proteine können zu Verdrängungsreaktionen an der festen Phase führen mit der Folge von in beachtlichem Maße störenden Konzentrationsunterschieden an der festen Phase, auch bei äquimolarem Auftrag. Weiterhin sind bei einer höheren Vielzahl von verschiedenen Proteinen Wechselwirkungen der verschiedenen Proteine im Zuge der Immobilisierung nicht auszuschließen. All dies stört jedoch, wenn gleichsam ein Universaltest, beispielsweise auf HIV, hergestellt werden soll. Die vorstehenden Ausführungen treffen natürlich sinngemäß auf grundsätzlich alle Erkrankungen zu, die, je nach Klassen und Subtypen des infizierenden Organismus, immunologisch unterscheidbare Antikörper in einem Kör per hervorrufen können. Es versteht sich, daß gegen einen spezifischen Subtyp auch unterschiedliche An tikörper gebildet sein können.

Im Zusammenhang mit HIV ist folgendes ergänzend an zumerken. Die erworbene Immunschwächekrankheit AIDS (aquired immunodeficiency syndrome) wird durch das HIV verursacht. Die beiden bisher beobachteten Erreger stämme HIV-1 und HIV-2 haben eine sehr ähnlich Genom struktur und infizieren T-Zellen über einen sehr ähnlichen Mechanismus. Sie unterscheiden sich aber immunologisch so weit, daß Antikörper gegen HIV-1 in der Regel keine Kreuzreaktion mit HIV-2 zeigen und umgekehrt. Bei HIV-1 werden zudem eine Reihe von Sub typen unterschieden, wobei die Gruppe M mehrere Sub typen umfaßt (A, B, C, D, E, F und G) und der Subtyp O in eine eigene Gruppe (Gruppe O) gestellt wird. Auch zwischen den Antikörpern gegen verschiedene Subtypen bestehen immunologische Unterschiede. Daher ist es schwierig, in einem einzigen Testsystem alle Subtypen, bzw. alle Antikörper hiergegen, zuverlässig zu erken nen. Dies gilt in besonderem Maße für Schnelltests, die ohne großen experimentellen Aufwand durchzuführen sein müssen. In einem Schnelltest sollte durch einma ligen Auftrag beispielsweise einer Blutprobe ein zu verlässiges Ergebnis erhaltbar sein. Insbesondere im Zusammenhang mit HIV müssen falsch negative und falsch positive Ergebnisse praktisch ausgeschlossen sein.

Stand der Technik

Beispielhaft für den Einsatz eines oder mehrerer Anti gene in Mischung gegen verschiedene HIV-Antikörper ist die Literaturstelle US-A-5,830,641.

Bisher bekannte Schnelltests arbeiten demgegenüber in Regel mit einem einzigen Antigen, nämlich gp41, und sind daher nicht in der Lage, alle HIV-Subtypen zuver lässig und mit hoher Sensitivität zu erkennen. Es besteht also ein sehr beachtliches Risiko falsch nega tiver Ergebnisse. Sie sind zudem nicht über längere Zeit temperaturstabil, nicht für eine permanente Dokumentation geeignet, gewährleisten keine einfache und sichere Entsorgung und zeigen bei Überentwicklung ein falsch positives Ergebnis.

Fusionsproteine mit mehr als einem Epitop für HIV-An tikörper sind an sich bekannt beispielsweise aus den Literaturstellen US-A-5,800,822 und US-A-5,310,876. Hierbei handelt es sich um Proteine, die in Lösung im Rahmen von Labortests eingesetzt werden. Solche La bortestsysteme sind jedoch für Schnelltests aufgrund der komplexen Handhabung und dem bei Ausführung durch nicht ausgebildete Personen folglich hohen Risiko falscher Ergebnisse nicht geeignet.

Aus der Literaturstelle US-A-4,925,784 ist ein Fu sionsprotein gag/env bekannt, welches auch immobilisiert sein kann. Brückenverbindungen mit Bindungsstellen für eine Bindung mit einer festen Phase zwischen gag und env sind nicht entnehmbar. Das Fusionsprotein ist einseitig über eine Brücke an einer festen Phase gebunden.

Aus der Literaturstelle DE 197 20 914 A1 sind ver schiedene Antigene gegen Antikörper verschiedener Sub typen bekannt. Die Antigene können an einer Festphase gebunden sein. Verschiedene Antigene werden als Gemisch eingesetzt. Sofern Antigen mit multiplen Epi topen angesprochen sind, so handelt es sich um Hap tene, i. e. Proteine mit mehrfachen Sequenzen eines einzigen Epitop-Typs.

Die Literaturstelle US-A-5,241,047 beschreibt Peptide, welche mit Seren HIV-positiver Probanden reagieren. Dabei sind diverse Epitope unmittelbar aneinander gekoppelt und können über eine Spacersequenz am c- oder N-terminalen Ende an einer Festphase gebunden sein. Mittels einer Spacersequenz wird eine Beabstand ung einer Signalsequenz von einem Trägermaterial er reicht. Ein Ende der Spacersequenz ist an das Trägermaterial und das andere an ein Ende der Signal sequenz gebunden. An jede Spacersequenz ist nur eine einzige Signalsequenz gekoppelt.

Technisches Problem der Erfindung

Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, ein immobilisierbares Protein anzugeben, das für einen Schnelltest auf Vorliegen von Antikörpern in einer Patientenprobe eingesetzt werden kann und in einem solchen Schnelltest zuverlässig eine Erkennung vieler bis aller Gruppen und Subtypen eines Erregers bzw. von Antikörpern hiergegen erlaubt.

Grundzüge der Erfindung

Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Er findung ein Protein mit mehreren Antigen-Epitop- Sequenzen für Antikörper, wobei das Protein an einer Festphase über zumindest eine Bindungsstelle immobi lisiert ist, und wobei die Antigen-Epitop-Sequenzen über Brückenverbindungen mit der Maßgabe beabstandet sind, daß nach Bindung der Bindungsstelle an der festen Phase die Antigen-Epitop-Sequenzen für eine Bindung der zugeordneten Antikörper aus der flüssigen Phase exponiert sind.

Die Erfindung beruht auf einer Kombination von Er kenntnissen. Eine erste Erkenntnis liegt darin, daß sich die Nachteile des Einsatzes einer Mischung von Antigenen dadurch vermeiden lassen, daß die Antigen- Epitope in einem einzigen Protein kombiniert werden. Dann kann eine Immobilisierung unschwer erfolgen, ohne daß unterschiedliche Affinitäten zur Festphase und/oder Wechselwirkungen verschiedener Antigene un tereinander zu störenden Verschiebungen der Verteilun gen führen. Hieran anschließend beruht die Erfindung auf der weiteren Erkenntnis, daß es nicht ausreicht, lediglich verschiedene Epitope aneinander zu reihen und dann das Produkt an einem Ende (oder beiden Enden) an der Festphase zu binden. Vielmehr muß erreicht werden, daß die Epitope nach der Immobilisierung in gewünschter Weise exponiert sind, i. e. eine Sekundär- und ggf. Tertiarstruktur bilden, die eine Bindung der zugeordneten Antikörper gewährleistet und zudem ster isch die Zugänglichkeit ermöglicht. Schließlich wurde erkannt, daß dies erreichbar ist, indem zwischen den Epitopen Brückenverbindungen eingerichtet werden, welche einerseits die Bindung an die Festphase be wirken und andererseits für die gewünschte Exponierung der Epitope sorgen. Das Konzept besteht also im Kern aus der Schaffung eines einziges Proteins mit mehreren beabstandeten Epitopen, wobei die Epitope durch Zwischenschaltung der Brückenverbindungen wiederum gleichsam vereinzelt sind. Durch geeignete Wahl der Brückenverbindungen, insbesondere der Strukturen der beiseitig eines Epitops sich bis zu den beidseitigen Bindungsstellen an der Festphase erstreckenden Teile der jeweiligen Brückenverbindungen lassen sich zudem die Epitope auf definierte Weise falten, so daß die Exponierung sicher gewährleistet und zudem gleichsam fixiert ist. Schließlich ist der Konzeption der Er findung inhärent, daß störende Wechselwirkungen ver schiedener Epitope eines Proteins praktisch ausgeschlossen sind.

Geeignete Brückenverbindungen lassen sich nach Maßgabe der diese flankierenden Epitop Strukturen bzw. sequen zen mit den Mitteln des molecular modelling unschwer berechnen. Zusätzlich oder alternativ kann der Durchschnittsfachmann experimentell verschiedene Brückenverbindungen auf Eignung testen, indem die Bindungsfähigkeit von Antikörpern an die die Brückenverbindung flankierenden Epitope mit üblichen Methoden getestet wird.

Es versteht sich, daß ein erfindungsgemäßes Protein Enden besitzen muß. Ein Ende kann das Ende eines Epi tops sein, welches weder direkt noch indirekt an die Festphase gebunden ist. Ein Ende kann weiterhin ein Ende einer Brückenverbindung sein, wobei das Ende der Brückenverbindung die Bindungsstelle sein kann oder, bezogen auf das angeschlossene Epitop, jenseits der Bindungsstelle liegen kann. Ein Ende kann schließlich auch durch ein Tag, insbesondere ein Affinitäts-Tag, gebildet sein.

Grundsätzlich gibt es verschiedene Möglichkeiten, ein erfindungsgemäßes Protein zu erstellen. Beispielsweise kann eine Brückenverbindung durch Insertion von Brück ensequenzen zwischen zwei Antigen-Epitop-Sequenzen und/oder Deletion einer Teilsequenz zwischen zwei in einer Gesamtsequenz angeordneten Antigen-Epitop- Sequenzen gebildet sein. Die Brückenverbindung kann auch durch Fusion einer Brückensequenz mit zwei Antigen-Epitop-Sequenzen gebildet sein.

Als Brückenverbindungen kommen die verschiedensten Moleküle in Frage. Grundsätzlich können beliebige or ganische Substanzen, typischerweise kettenartige Ver bindungen, eingesetzt werden. Als Beispiele sind Oligomere auf Basis gleichartiger oder verschiedenar tiger Monomere der Polymerchemie zu nennen. Bevorzugt ist es, wenn die Brückenverbindung aus Aminosäuren gebildet ist. Die Brückenverbindung muß eine Bindungs stelle für die Festphase aufweisen. Üblicherweise wird hierfür eine positiv geladene Bindungsstelle zur Bindung an eine negativ geladene Festphase, vorzug sweise eine Membran, eingerichtet.

Grundsätzlich können die Antigen-Epitop-Sequenzen in nerhalb des Proteins gleich sein. Besonders bevorzugt ist es jedoch, wenn die Antigen-Epitop-Sequenzen ver schiedene Antikörper binden. Idealerweise werden sol che verschiedenen Antigen-Epitop-Sequenzen in einem erfindungsgemäßen Protein oder in einigen wenigen er findungsgemäßen Proteinen miteinander kombiniert, daß Antikörper der häufigsten, besser aller, Subtypen einer Erregergattung erkannt werden. Die Antigen- Epitop-Sequenzen können beispielsweise repetitive Se quenzelemente aus gleichen oder verschiedenen HIV Sub typen sein. Bevorzugt ist es allerdings, wenn die Antigen-Epitop-Sequenzen Sequenzen aus verschiedenen HIV Genen und/oder Stämmen und/oder Subtypen sind.

Grundsätzlich kann die Brückenverbindung aus einer beliebigen Sequenz gebildet sein, wobei die Brücken verbindung beispielsweise ein Sequenzelement aus gp120 ist. Bevorzugt ist es, wenn Teilsequenzen, welche im Blut enthaltene Antikörper unspezifisch binden, de letiert sind. Dies gilt sowohl bezüglich der Brücken verbindung als auch der Antigen-Epitop-Sequenzen.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine Verwendung er findungsgemäßer Proteine zur Herstellung eines Immobi lisats zur Detektion von Antikörpern, wobei zunächst das Protein in Lösung hergestellt wird, wobei dann das Protein über zumindest eine Bindungsstelle an eine Festphase gebunden wird und wobei optional die Festphase mit dem daran gebundenen Protein zumindest einer Spülverfahrensstufe und/oder Blockierungsver fahrenstufe unterworfen wird, sowie eine Verwendung eines erfindungsgemäßen Proteins zur Herstellung eines HIV Tests, wobei ein erfindungsgemäßes Immobilisat hergestellt wird, wobei dieses Immobilisat in ein Gehäuse eingesetzt wird und wobei eine Detektorlösung entweder in einer Reaktionszone des Immobilisats eingebracht ist oder separat zur Aufbringung auf das Immobilisat beigefügt wird.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Polynukleotid, insbesondere cDNA, codierend für ein erfindungsgemäßes Protein, einen Expressionsvektor, vorzugsweise Plas mid, enthaltend eine Polynukleotid-Sequenz kodierend für ein erfindungsgemäßes Protein, und eine Zelle (wobei menschliche embryonale Stamm zellen und menschliche Keimbahnzellen ausgeschlossen sind), welche mittels eines erfindungsgemäßen Expressionsvek tors transformiert ist.

Die Erfindung betrifft schließlich ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Proteins, wobei die Antigen-Epitop-Sequenzen und die Brückensequenzen ausgewählt werden und die Ordnung der Aneinanderrei hung definiert wird, wobei für die Antigen-Epitop- Sequenzen und die Brückensequenzen codierende DNA in einen Expressionsvektor aneinander in der definierten Weise anschließend und unter üblicher Vorschaltung eines geeigneten Promotors insertiert wird, wobei eine Zelle, vorzugsweise E. coli, mittels des Expressions vektors transformiert wird, wobei transformierte Zel len selektiert und kultiviert werden, und wobei das von den selektierten Zellen exprimierte Protein isoliert wird.

Ein erfindungsgemäßer HIV-Test weist im Kern beispiel sweise den folgenden Aufbau auf: In einer Aus führungsform als "flow through" befindet sich ein poröses Material, meist eine Membran, in einer Vor richtung, beispielsweise einem Kunststoffgehäuse, welche eine Zugriffsöffnung zu der Membran aufweist. An für Flüssigkeiten zugänglichen Oberflächen der Mem bran ist zumidest ein erfindungsgemäßer Protein Typus immobilisiert. Durch die Zugriffsöffnung wird eine zu testende Probe, beispielsweise Blut, Serum oder Plasma, auf die Membran aufgetragen. U. a. aufgrund von Kapillarkräften dringt die Probe in die Membran ein bzw. tritt durch sie hindurch. Dies kann unter stützt werden beispielsweise durch eine Unterfütterung der Membran mittels eines saugfähigen Materials. Die Probe bzw. darin eventuell enthaltene Antikörper reag ieren mit dem Protein. Durch Auftrag einer üblichen Detektorlösung, beispielsweise gefärbte Partikel wie kolloidale Goldpartikel, erfolgt ein visueller Nach weis für die Bindung von Antikörpern an das Protein. Alternativ zur "flow through" Technologie kann mittels einem "lateral flow" Verfahren gearbeitet werden. Hierbei wird ebenfalls eine Membran eingesetzt, die allerdings in lateraler Richtung unterteilt ist in eine Aufbringzone und eine Reaktionszone. Kapil larkraftbedingt wandert die in der Aufbringzone aufge brachte Probe in die Reaktionszone, in welcher zumindest ein erfindungsgemäßer Protein Typus immobi lisiert ist. In der Aufbringzone werden keine er findungsgemäße Proteine immobilisiert sein, es ist aber durchaus möglich, in der Aufbringzone andere Stoffe, beispielsweise Proteine, zu immobilisieren, welche zu detektierende Antikörper nicht binden, dagegen aber in der Probe unerwünschte Stoffe binden und so abtrennen. Hierdurch wird die Zuverlässigkeit der Antikörper-Detektion beachtlich erhöht, da ggf. unerwünschte Wechselwirkungen aufgrund anderer Blut bestandteile ausgeschaltet werden können. Die Reak tionszone kann eine Detektorsubstanz bereits ent halten, es kann aber auch vorgesehen sein, daß in der Detektorzone separat ein Auftrag von Detektorlösung erfolgt.

Die Erzeugung einer Gesamtsequenz aus Antigen-Epitop- Sequenzen und zwischengeschaltenen Brückenverbindun gen, welche geladen sind, beispielsweise positiv geladen sind, hat im übrigen auch besondere präpara tive Vorteile. Wenn ein solches Protein gentechnisch hergestellt wird durch Expression in einer Zelle, so ist zunächst eine Aufreinigung des Proteins aus einem Zellextrakt zweckmäßig. Die Ladungen der Brückenver bindungen erlauben nunmehr eine besonders effektive und einfache Reinigung auf sehr hohe Reinheitsgrade in einer Ionenaustauscherchromatographie, da der isoelek trische Punkt extrem hoch ist. Mit einer solchen Au freinigung eines gentechnisch hergestellten erfindungsgemäßen Proteins vor einer Immobilis ierungsverfahrenstufe wird somit auch ein hinsichtlich gebundenen Proteins besonders reines Immobilisat er halten. Dies erhöht letztendlich die Zuverlässig eines Testsystems in beachtlichem Maße.

Definitionen

Der Begriff des HIV-Tests bezeichnet eine Nachweis methode zur Detektion von HIV-Antikörpern in Körper bestandteilen, insbesondere Körperflüssigkeiten. Körperflüssigkeiten sind beispielsweise Blut, Serum, Plasma, Speichel, Harn oder Liquor.

Der Begriff des Protein umfaßt im Rahmen der Erfindung Verbindungen, die natürliche oder nicht-natürliche Aminosäuresequenzen enthalten. Ein Protein kann syn thetisiert oder jedenfalls hinsichtlich der Ami nosäuresequenzen isoliert sein. Insofern umfaßt der Begriff des Proteins auch Peptide. Ein Protein muß nicht notwendigerweise ausschließlich aus Aminosäuren gebildet sein. Insbesondere die Brückenverbindung kann anders als aus Aminosäuren aufgebaut sein.

Als Antikörper ist bezeichnet eine durch einen Organ ismus natürlicherweise in Verfolg einer Infektion durch Immunreaktion gebildete Substanz, welche an den Erreger der Infektion oder Bestandteilen hiervon spezifisch zu binden vermag.

Als Antigen ist bezeichnet, eine Substanz, welche spezifisch an einen Antikörper zu binden vermag. Anti gen und Antikörper sind einander zugeordnet nach Maßgabe des zu detektierenden Antikörpers bzw. der zu detektierenden Antikörper.

Eine Antigen-Epitop-Sequenz bezeichnet eine Ami nosäurensequenz, gebildet aus natürlichen und/oder nicht natürlichen Aminosäuren, die einerseits chemisch bindungsfähig an einen zugeordneten Antikörper ist und andererseits eine solche Sekundär- und/oder Tertiärstruktur aufweist, daß die rein chemische Bindung auch sterisch, i. e. nach dem "Schlüssel/Schloß-Prinzip", ermöglicht ist.

Der Begriff der Immobilisierung bezeichnet die Bindung einer Substanz aus der Flüssigphase an einer Fest stoffoberfläche. Der Begriff der Bindung umfaßt die Chemisorption, die ionische Bindung, die kovalente Bindung sowie Zwischenformen solcher Bindungen.

Eine Brückenverbindung ist eine typischerweise oli gomere Verbindung, deren Art der Monomere, deren Rei henfolge bzw. Sequenz und deren räumliche Ausrichtung, einschließlich eventueller interner oder externer Ver netzung, definiert ist. Insbesondere definiert sind Positionen der Enden der Brückenverbindung untere inander. Hierbei muß u. U. aber auch die jeweilig angeschlossene bzw. anzuschließende Antigen-Epitop- Sequenz sowie die gegenüberliegende Brückenverbindung berücksichtigt werden, wenn die Anzahl der Frei heitsgrade der Brückenverbindung eine hinreichend eindeutige Definition der räumlichen Stellung der En den nicht ohne weiteres zuläßt. Eine Brückenverbindung ist nicht notwendigerweise eine artifizielle Sequenz bzw. eine artifiziell zwischen zwei Antigen-Epitop- Sequenzen eingefügte Sequenz. Es kann sich auch um eine native Sequenz zwischen zwei natürlicherweise beabstandeten Antigen-Epitop-Sequenzen handeln, wobei eine oder mehrere Aminosäuren auch ausgetauscht sein können.

Eine Bindungsstelle bezeichnet im Rahmen der Termi nologie der Patentansprüche eine reaktive Gruppe der Brückenverbindung, mittels welcher eine Immobilis ierung an der Festphase erreichbar ist.

Exponieren einer Antigen-Epitop-Sequenz bezeichnet die Einstellung der Sekundär- und/oder Tertiärstruktur der Sequenz so, daß eine Bindung an den Zielantikörper erfolgen kann. Insbesondere meint dies daher die Fal tung im Bereich der Antigen-Epitop-Sequenz. Die Fal tung kann auch unter Einbeziehung der Ausbildung von Disulfidbrücken erfolgen. Die Faltung führt in der Regel zur Ausbildung eines spezifischen Loops. Eine falsche Faltung führt zu einem falschen Loop. Eine falsche Faltung kann erfolgen, wenn die Enden einer Antigen-Epitop-Sequenz in ungeeigneter Weise räumlich zueinander stabilisiert sind.

Mit dem Merkmal der Brückenverbindung wird letz tendlich erreicht, daß die Teile von zwei Brückenver bindungen, welche zwischen zwei benachbarten Bindungsstellen liegen, die Enden der zwischengeschal teten Antigen-Epitop-Sequenz so stabilisieren, daß eine gewünschte Faltung eingestellt wird. Wesentlich ist hierbei, daß die beiden Bindungsstellen geometri sche Fixpunkte sind aufgrund der Bindung an der Fest phase. Selbstverständlich können zwischen dem Ende einer Brückenverbindung und der daran angeschlossenen Antigen-Epitop-Sequenz nicht-funktionelle Sequenzen zwischengeschaltet sein, solange dies die vorstehend beschriebenen Zusammenhänge nicht berührt.

Eine Brückensequenz ist eine Brückenverbindung, welche aus mehreren natürlichen und/oder nicht-natürlichen Aminosäuren gebildet ist.

Der Ausdruck der verschiedenen Antikörper meint An tikörper unterschiedlichen Typus bzw. unterschiedli cher Struktur. Entsprechendes gilt im Zusammenhang mit Genen, Stämmen, Subtypen und dergleichen.

Der Begriff der Spezifität bezeichnet die Fähigkeit einer Substanz, aus einer Anzahl gebotener Wechsel wirkungsmöglichkeiten bzw. Reaktionsmöglichkeiten eine ganz Bestimmte oder eine Gruppe von ganz Bestimmten wahrzunehmen. Ein für einen bestimmten Antikörper bzw. eine bestimmte Bindungssite eines Antikörpers spezi fisches Antigen wird mit anderen, in einer Probe, ggf. nach Abtrennung von die Spezifität störenden Stoffen, vorhandenen Antikörpern, die diese Bindungssite nicht aufweisen, keine Reaktion zeigen. Dagegen sind Anti gene bzw. Sequenzen, welche eine Mehrzahl ver schiedener Antikörper einer Probe binden, unspezifisch.

Der Begriff der Detektion bezeichnet die Erzeugung eines beliebigen direkt mittels der Sinne oder indi rekt mittels physikalisch/chemischer Meßmethoden wahrnehmbaren Detektorsignals, welches seine kausale Ursache in einem Antikörper/Antigen Bindungsereignis hat. Im einfachsten Fall handelt es sich um eine Farb reaktion. Detektionsmethoden für Antikörper/antigen Bindungsereignisse sind dem Fachmann in vielfältiger Weise bekannt und brauchen nicht näher erläutert zu werden.

Eine Detektorlösung enthält eine oder mehrere Substan zen, die zur Erzeugung eines Detektorsignals nach Maßgabe eines Bindungsereignisses Antikörper/Antigen in der Lage sind.

Der Ausdruck der Festphase bezeichnet einen Festkörper mit einer für Bindungsstellen bindungsfähigen Oberfläche.

Eine Spülverfahrensstufe umfaßt das Spülen eines erzeugten Immobilisats, i. e. einer Festphase mit daran gebundenem Protein, mit einer Lösung, welche schwach gebundene Proteine und/oder andere Substanzen von der Oberfläche der Festphase entfernt.

Eine Blockierungsverfahrensstufe umfaßt das Spülen eines Immobilisats mit einer Lösung, welche eine oder mehrere Substanzen enthält, die nicht in Bindung mit Protein gegangene Bereich der Oberfläche der Festphase absättigt, i. e. für die Bindung anderer Substanzen direkt an der Oberfläche der Festphase, blockiert.

Ausführungsformen der Erfindung

Im Folgenden werden lediglich beispielhaft nicht beschränkende Ausführungsformen der Erfindung näher erläutert.

Beispiel 1

Im Folgenden werden Beispiele für artifizielle Brück enverbindungen gegeben, welche im Rahmen eines erfindungsgemäßen Proteins zum Nachweis von HIV-An tikörpern einsetzbar sind.

Die Brückenverbindung 1 kann die folgende Sequenz aufweisen:
GKR--K-RK-KR--RRG
wobei "-" für eine oder mehrere beliebige Aminosäuren steht. Ein Beispiel für eine solche Brückenverbindung ist:
GKRAHKSRKHNYKRHIRRG

Die Brückenverbindung 2 kann die folgende Sequenz aufweisen:
G-KK-RR-KGK-RR-KK-G
wobei "-" für eine oder mehrere beliebige Aminosäuren steht. Ein Beispiel für eine solche Brückenverbindung ist:
GSKKARRIKGKMRRLKKVG

Die Brückenverbindung 3 kann die folgende Sequenz aufweisen:
G-C-K-R-KRKXKRK-K--C-G
wobei "-" für eine oder mehrere beliebige Aminosäuren steht und wobei "X" für D oder E steht. Ein Beispiel für eine solche Brückenverbindung ist:
GVCIKHRYKRKDKRKHKVACIG

Die vorstehenden und nachfolgenden Buchstaben in Se quenzinformationen basieren auf dem Single Letter Code.

Beispiel 2

Im Folgenden wird eine native Brückenverbindung angegeben, welche für ein erfindungsgemäßes Protein zum Nachweis von HIV-Antikörpern geeignet ist.
GVA--K-KRR---REKRAVG
wobei "-" für eine beliebige Aminosäure steht. Diese Brückenverbindung stammt aus dem HIV-1 Envelope Gen.

Beispiel 3

Im Folgenden werden erfindungsgemäße Proteine unter Verwendung von Brückenverbindungen u. a. aus den Beispielen 1 und/oder 2 näher beschrieben. Die Tabelle 1 gibt Möglichkeiten der Deletion und/oder Einfügung von Brückenverbindungen in Sequenzen mit Antigen- Epitopen wieder. Geeignete Sequenzen ID I bis ID VI mit Antigen-Epitopen sind in der Fig. 1a-f wieder gegeben, wobei es sich um vollständige Sequenzen von HIV-Proteinen handelt (wobei allerdings für die Er findung nicht notwendigerweise mit vollständigen Se quenzen als Ausgangssequenzen gearbeitet werden muß).

Die Tabelle 1 ist so zu lesen, daß in der linkesten und zweitlinkesten Spalte ein zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Proteins geeignetes Ausgangsprotein, ID I bis ID VI, wiedergegeben ist. Die weiteren Spal ten geben an, ob und wo welche Deletionen und/oder Insertionen mit Brückenverbindungen, beispielsweise gemäß der Tabelle 2, in dem Ausgangsprotein einfügbar sind, um ein erfindungsgemäßes Protein zu erhalten. In der Tabelle 2 sind: ID 1 bis 3 künstliche Brückenver bindungen, ID 4 eine natürliche Brückenverbindung (aus Übergang gp120/gp41 in env), ID 5 bis 8 HIV-1 O- Sequenzen, ID 9 bis 12 Gnann-Region aus HIV-2 und ID 13 bis 36 V3-loop Sequenzen aus HIV-1 (Konsensusse quenzen der jeweiligen Subtypen und diesen ähnliche Sequenzen, auch aus Subtyp O).

Beispielsweise wird ein erfindungsgemäßes Protein er halten, wenn in pol 2, welches 289 Aminosäuren auf weist, an die Position 31 entweder die Brückenver bindung 1 oder die Brückenverbindung 2 aus Tabelle 2 eingefügt wird, nicht jedoch die Brückenverbindung 3. Es ergeben sich letztendlich die in der Tabelle 1 angegebenen uneingeschränkten Kombinationsmöglich keiten.

Aus den graphischen Übersichten der Fig. 1a-f gehen Deletionen und mögliche Einfügestellen der Tabelle 2 ebenfalls hervor. In den Sequenzen entspricht das Sym bol "+1/2/3+" der Insertion der Brückenverbindung 1, 2 oder 3. "+1/2+" steht also für eine Insertion einer der Brückenverbindungen 1 oder 2.

Beispiel 4

In der Fig. 2 sind Sequenzen Seq. ID A bis E dargestellt, wobei A bis D erfindungsgemäße Proteine sind, E jedoch ein nicht erfindungsgemäßes Protein ist. In den Sequenzen A bis D sind Modifikation so ausgeführt, daß zwischen den Antigen-Epitop Sequenzen geeignete Brückenverbindungen entstehen. Dagegen fin det in E keine hinreichende Präsentation von Antigen- Epitop Sequenzen statt. In der Fig. 3a/b sind die Strukturen der Proteine C bis E dargestellt, wozu im einzelnen auf die folgenden Beispiele verwiesen wird.

Beispiel 5

In diesem Beispiel wird die Herstellung eines er findungsgemäßen Proteins beschrieben, nämlich von p31 Δ100/40, 140/23, 163/14 Ω31/2, 100/3

Lesart

ΔX/Y (z. B. Δ100/76): Hinter der Aminosäure an Position 100 sind 76 Aminosäuren deletiert.
ΩX/Y (z. B. Ω30/2): Hinter der Aminosäure 30 ist die Brückenverbindung 2 insertiert

Teilschritt 1

Das Fragment 1 wird mittels der PCR-Technologie gewonnen. Als Primer dienen für die Amplifikation die Oligonukleotide
5'-ATATGGCATATGTTTTTAGATGGAATAGATAAGG CCC-3' und
5'-TATAGGGCCCAGGTGGCAGGTTAAAA-3', als Template wird das HIV-pol Gen verwendet. Die PCR-Reaktion wird nach üblichem Protokoll durchgeführt. Das gewünschte PCR-Produkt (ca. 110 bp) wird isoliert und einer Restriktion mit Apal und NdeI unterworfen.

Fragment 1

Epitope 1, PCR

Teilschritt 2

Zwei Oligonukleotide
(5'-CAAAAAGGCCCGTCGCATCAAGGGCAAAATGCGACGGGTGAAGAAAG-3' und
5'-CCGGCTTTCTTCACCCGTCGCATTTTGCCCTTGATGCGACGGGCCTTTTTGGGCC-3')
werden bei 100°C kurz denaturiert, im linear abfallenden Temperaturgradienten miteinander hybridisiert und das Doppelstrangprodukt anschließend isoliert.

Fragment 2

Brückenverbindung 2, synthetisch

Teilschritt 3

Das Fragment 3 wird mittels der PCR-Technologie gewonnen. Als Primer dienen für die Amplifikation die Oligonukleotide
5'-TAATTTGCCGGCGTAGTAGCAAAAGAAATAGTAG-3' und
5'-TATAGCATGCTCCATATGCTGTTTCCTGCCCTGT-3', als Template wird das HIV-pol Gen verwendet. Die PCR-Reaktion wird nach bekanntem Protokoll durchgeführt. Das gewünschte PCR-Produkt (233 bp) wird einer Restriktion mit NgoMIV und SphI unterworfen und anschließend isoliert.

Fragment 3

Epitop 2, PCR (233 bp)

Teilschritt 4

Zwei Oligonukleotide
(5'-CATGCATCAAACACCGCTACAAGCGACGCGATCGTCGGAAGCATAAAGTGGCCTGC-3' und
5'-CTAGGCAGGCCACTTTATGCTTCCGACGATCGCGTCGCTTGTAGCGGTGTTTGATG-3')
werden bei 100°C kurz denaturiert, im linear abfallenden Temperaturgradienten miteinander hybridisiert und das Doppelstrangprodukt isoliert.

Fragment 4

Brückenverbindung 3, synthetisch

Teilschritt 5

Das Fragment 5 wird mittels der PCR-Technologie gewonnen. Als Primer dienen für die Amplifikation die Oligonukleotide
5'-ATTATCCTAGGTCAAATGGCAGTATTCATCCAC-3' und
5'-TATAGGATCCTAATCCTCATCCTGTCTACTTGC-3', als Template wird das HIV-pol Gen verwendet. Die PCR-Reaktion wird nach bekanntem Protokoll durchgeführt. Das gewünschte PCR-Produkt (360 bp) wird einer Restriktion mit AvrII und BamHI unterworfen und anschließend isoliert.

Fragment 5

Epitop 3, PCR

Teilschritt 6

Ein geeigneter Expressionsvektor wird mit NdeI und BamHI geschnitten und das Vektorfragment isoliert.

Teilschritt 7

Das aufgereinigte Vektorfragment und die jeweils isolierten Teilfragmente werden mit Hilfe von Ligationsreaktionen miteinander verknüpft.

Teilschritt 8

Geeignete E. coli Zellen werden mit den Ligationsprodukten transformiert und selektioniert.

Teilschritt 9

Aus erhaltenen Kolonien wird die Plasmid-DNA isoliert und auf Vorhandensein, Anordnung und Orientierung der Teilsequenzen mit den Enzymen NdeI, ApaI, NgoMIV, SphI, AvrII und BamHI in verschiedenen Kombinationen geprüft. Plasmid-DNA mit positivem Ergebnis wird zur Bestätigung sequenziert.
p31 nativ
p31Δ100/40, 140/23, 163/14 Ω31/2, 100/3

Die Expression eines erfindungsgemäßen Proteins wird wie folgt durchgeführt. Nachdem die kodierende Nukleinsäure für das zu exprimierende Protein hergestellt und über Restriktionsschnittstellen in einen handelsüblichen Vektor eingebaut wurde, erfolgt eine Transformation des Plasmids in eine handelsübliche E. coli-Zelle. Nach einer Inokulierung eines Mediums (z. B. LB-Medium) mit dem Transformationsansatz erfolgt die Anzucht der Zellkultur durch Inkubation bei einer optimalen Temperatur (z. B. 37°C). Die Protein-Expression wird durch eine Zugabe von Isopropyl β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) induziert und durch eine Fortführung der Inkubation erreicht. Nach dem Ernten der E. coli-Zellen durch Zentrifugation wird eine Zelllyse mit einem Lysispuffer (z. B. einem Guanidinhydrochloridhaltigen Puffer) durchgeführt.

Die Reinigung des Proteins kann über herkömmliche Chromatographiemethoden (z. B. Ionenaustauscher chromatographie und Gelchromatographie) erfolgen, wobei der durch Einfügen positiv geladener Sequenzen erhöhte isoelektrische Punkt der Proteine vorteilhaft benutzt werden kann, die Proteine über Kationenaustauscher chromatographie stark anzureichern. Üblicherweise werden die chromatographischen Trennungen mit Hilfe von Chromatographiesäulen, in die das Material eingebracht wird, durchgeführt. Falls die Proteine mit einem "tag" (z. B. einem N- oder C-terminalen His6-Peptid, einem "flag-tag" oder myc-Epitop) versehen wurden, können sie durch Verwendung einer Affinitätschromatographie gereinigt werden, wobei das jeweilige Protein über den "tag" an das entsprechende Affinitätschromatographiematerial (z. B. für His6-tag an Ni-NTA-Material) gebunden wird. Nachdem das Material mit entsprechenden Waschpuffern mehrmals gewaschen wurde, wird das gewünschte Protein mit Hilfe von mindestens einem Elutionspuffer (z. B. durch einen Puffer mit deutlich erhöhten oder erniedrigten pH-Wert) von dem Material abgetrennt. Abschließend werden die Eluate noch mehreren Dialyseschritten unterzogen, um die Weiterverwendung des Proteins zu erlauben.

Beispiel 6

In diesem Beispiel wird die Herstellung eines er findungsgemäßen Immobilisats beschrieben. Das gere inigte Protein wird in geeigneter Weise mit einer wäßrigen Lösung von 100 mM NaCl und 0,4-0,8% SDS verdünnt. Von dieser Lösung werden mit Hilfe eines BioDot-Gerätes (Cambridge, England) 0,5 µl auf eine Nitrozellulosemembran aufgebracht, so daß sich auf einem Fleck mit 3-4 mm Durchmesser 250 ng Protein befinden. Die Membran wird nach Aufbringen des Pro teins für mindestens eine Stunde getrocknet, bevor die Nachweisreaktion durchgeführt wird.

Es wird ein Immobilisat erhalten, bei welchem die Anordnung und Faltung des Proteins in einer Weise erfolgt ist, die schematisch in der Fig. 3a dargestellt ist. Die Epitope sind durch eine positiv geladene Peptidsequenz getrennt, was eine Anheftung an die Membran und eine richtige Faltung der Epitope (unterstrichene Sequenzbereiche) erlaubt.

Zu der in Fig. 3a dargestellten Faltung mag angemerkt werden, daß möglicherweise nicht alle Proteinmoleküle, die auf die feste Phase aufgebracht werden, sich in der skizzierten Weise falten werden. Ein Teil der Moleküle kann, verursacht durch die Lyse der Zellen und die anschließende Reinigungsprozedur in ungeordnetem (denaturiertem) Faltungszustand vorliegen. Für den Zweck der Erfindung ist aber ausreichend, wenn bei einem erfindungsgemäß konstruierten Protein die Wahrschein lichkeit einer für die Bindung von Antikörpern geeigneten Faltung, induziert durch die durch den Einbau der Brückenverbindungen ermöglichte optimale Anheftung auf der festen Phase, gegenüber einem keine Brückenverbindungen enthaltenden Protein deutlich erhöht ist. Durch diese erhöhte Wahrscheinlichkeit der "richtigen" Faltung wird die Möglichkeit der Bindung der Antikörper insgesamt stark verbessert und damit die Erhöhung der Sensitivität des gesamten Nachweisverfahrens gewährleistet.

Beispiel 7

Ein Immobilisat aus Beispiel 6 wurde mit Seren aus diversen HIV positiven Patienten beschickt und die Reaktion wurde mittels einer Detektorlösung geprüft. Es zeigte sich in allen Fällen eine für die Bindung Antikörper/Antigen spezifische Farbreaktion. Falsch negative Ergebnisse wurden nicht erhalten. Versuche mit Seren von HIV negativen Personen ergaben, daß keine einzige falsch positive Anzeige erhalten wird.

Beispiel 8

In diesem Vergleichsbeispiel wurde mit einem Protein env 4 (ID E) ein Immobilisat entsprechend der Ver fahrensweise nach Beispiel 6 hergestellt. Der Unter schied besteht ausweislich einer vergleichenden Betrachtung der Fig. 3a und 3c jedoch darin, daß zwischen den linksseitig liegenden Epitopen keine positiv geladene Brückenverbindung eingerichtet ist. Man erkennt weiterhin, daß dadurch die beiden link sseitigen Epitope nahe beiander liegen und so gefaltet werden - unter Ausbildung von die Antigenizität zer störenden Disulfidbrücken -, daß eine Bindung eines Antikörpers nicht erfolgen kann.

Mit gleicher Proteinmenge, wie in Beispiel 7 wurden wiederum Tests mit Seren diverser HIV positiver Pa tienten durchgeführt. Durchweg wurde praktisch keine Reaktion angezeigt, wurden also regelmäßig falsch negative Ergenisse erhalten.

Beispiel 9

In diesem Beispiel wird anhand der Fig. 3b ein er findungsgemäßes Protein (ID D) bzw. Immobilisat mit repetitiven Sequenzelementen aus verschiedenen HIV- Subtypen schematisch dargestellt (auch gleiche sind möglich). Dieses erfindungsgemäße Protein ist dabei nur aus V3 Loops verschiedener HIV-Subtypen gebildet, die durch ein positiv geladenes Sequenzelement aus gp120 getrennt sind.

Beispiel 10

Ein erfindungsgemäßer Schnelltest ist wie folgt aufge baut: Ein Immobilisat gemäß Beispiel 6 wird in einem Kunststoffgehäuse unter einer Zugriffsöffnung so posi tioniert und fixiert, daß zumindest ein Teilbereich des Immobilisats dem Zugriff unterliegt. Das Immobili sat ist dabei mit einer saugfähigen Unterlage, beispielsweise Watte, unterfüttert. Zu dem Schnelltest gehört eine separat abgepackte Detektorlösung.

Der Nachweis von an das Antigen gebundenen Antikörpern kann mit Hilfe einer Detektionslösung erfolgen, die ein Konjugat aus Protein A mit kolloidalem Gold enthält. Die Verwendung von solchen Konjugaten in immunologischen Testverfahren ist allgemein bekannt und in der Literatur beschrieben. Dieses Konjugat kann beispielsweise wie in US 5,541,059 beschrieben hergestellt werden durch Mischen von 100 ml einer kolloidalen Gold-Lösung (kommerziell erhältlich) mit 100 ml einer 0.006 mg/ml enthaltenden Lösung von Protein A (Protein A ist als sowohl in lyophilisierter Form als auch als Lösung kommerziell erhältlich). Alternativ kann ein Protein A-Gold-Konjugat auch kommerziell erworben werden.

Die Bindung des Konjugats an die gebundenen Antikörper kann visuell detektiert werden. Im vorliegenden Beispiel ergibt sich bei Vorhandensein von gebundenen Antikörpern ein rötlicher Fleck.

Alternativ zu den Konjugaten mit kolloidalem Gold kann auch eine Farbstoffsuspension verwendet werden, wobei Protein A an einen wasserunlöslichen Farbstoff adsorbiert wird.

Ein Schnelltest wird wie folgt durchgeführt. Einem Probanden wird durch Nadelstich eine kleine blutende Wunde zugefügt. Der entstehende Bluttropfen wird in einer kleinen Kapillaren aufgenommen. Die Kapillare mit dem Blut wird dann in einem Behälter mit einem geigneten Lösungsmittel, beispielsweise physiologische Kochsalzlösung, zusammengegeben und solange geschüt telt, bis Blut und Lösungsmittel sich vermischt haben. Der Inhalt des Behälters wird dann über die Zugriff söffnung auf das Immobilisat gegeben. Sodann wird die Detektorlösung aufgegeben und visuell beobachtet, ob eine Verfärbung des durch die Zugriffsöffnung sichtbaren Immobilisats erfolgt. Verfärbung bedeutet, daß HIV-Antikörper in dem Blut des Probanden vor liegen. Tritt keine Verfärbung ein, so ist das Ergeb nis dagegen negativ.

Claims

1. Protein mit mehreren Antigen-Epitop-Sequenzen für Antikörper, wobei das Protein an einer Festphase über zumindest eine Bindungsstelle immobilisiert ist, und wobei die Antigen-Epitop-Sequenzen über Brückenverbindungen mit der Maßgabe beabstandet sind, daß nach Bindung der Bindungsstelle an der Festphase die Antigen-Epitop-Sequenzen für eine Bindung der zugeordneten Antikörper aus der flüssi gen Phase exponiert sind.

2. Protein nach Anspruch 1, wobei eine Brückenverbin dung durch Insertion von Brückensequenzen zwischen zwei Antigen-Epitop-Sequenzen und/oder Deletion einer Teilsequenz zwischen zwei in einer Gesamtse quenz angeordneten Antigen-Epitop-Sequenzen gebil det sind.

3. Protein nach Anspruch 1, wobei die Brückenverbin dung durch Fusion einer Brückensequenz mit zwei Antigen-Epitop-Sequenzen gebildet ist.

4. Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Brückenverbindung positiv geladene Bindungsstellen zur Bindung an eine negativ geladene Festphase, vorzugsweise eine Membran, aufweist.

5. Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Antigen-Epitop-Sequenzen verschiedene Antikörper binden.

6. Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Antigen-Epitop-Sequenzen repetitive Sequenzelemente aus gleichen oder verschiedenen HIV-Subtypen sind.

7. Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Antigen-Epitop-Sequenzen Sequenzen aus verschiede nen HIV-Genen und/oder Stämmen und/oder Subtypen sind.

8. Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Antigen-Epitop-Sequenzen Sequenzen aus einem einzi gen HIV-Subtyp sind.

9. Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Brückenverbindung ein Sequenzelement aus gp120 ist.

10. Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei Teilsequenzen, welche in Körperflüssigkeiten ent haltene Antikörper unspezifisch binden, deletiert sind.

11. Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung eines Immobilisats zur Detektion von Antikörpern, wobei zunächst das Pro tein in Lösung hergestellt wird, wobei dann das Protein über zumindest eine Bindungsstelle an eine Festphase gebunden wird.

12. Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung eines HIV-Tests, wobei ein Immobilisat nach Anspruch 11 hergestellt wird, wobei dieses Immobilisat in ein Gehäuse eingesetzt wird und wobei eine Detektorlösung entweder in einer Reaktionszone des Immobilisats eingebracht ist oder separat zur Aufbringung auf das Immobili sat beigefügt wird.

13. Polynukleotid codierend für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 10.

14. Expressionsvektor enthaltend eine Polynukleotid- Sequenz kodierend für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 10.

15. Zelle, welche mittels eines Expressionsvektors nach Anspruch 14 transformiert ist.

16. Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach ei nem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Antigen-Epi top-Sequenzen und die Brückensequenzen ausgewählt werden und die Ordnung der Aneinanderreihung defi niert wird, wobei für die Antigen-Epitop-Sequenzen und die Brückensequenzen codierende DNA in einen Expressionsvektor aneinander in der definierten Weise anschließend insertiert wird, wobei eine Zelle mittels des Expressionsvektors transformiert wird, wobei transformierte Zellen selektiert und kultiviert werden, und wobei das von den selek tierten Zellen exprimierte Protein isoliert wird.