WO2004027066A2 - Protéine recombinante chimérique et diagnostic in vitro du hiv - Google Patents

Protéine recombinante chimérique et diagnostic in vitro du hiv Download PDF

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WO2004027066A2
WO2004027066A2 PCT/FR2003/002712 FR0302712W WO2004027066A2 WO 2004027066 A2 WO2004027066 A2 WO 2004027066A2 FR 0302712 W FR0302712 W FR 0302712W WO 2004027066 A2 WO2004027066 A2 WO 2004027066A2
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hiv
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Biomerieux
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a chimeric recombinant protein, a DNA encoding said chimeric recombinant protein, as well as the use of this chimeric recombinant protein for the in vitro diagnosis of diseases related to a virus, more particularly the HIV-1 virus and / or and HIV-2.
  • HIV-1 human immunodeficiency virus- 1
  • HF / -2 human immunodeficiency virus-2
  • the primary infection is followed by '' an asymptomatic period, of variable duration before the disease progresses in most AIDS patients, characterized by the appearance of opportunistic germ infections, tumors and neurological manifestations, and the early diagnosis of presence of the HIV virus in the body should be carried out whether the patient was initially infected with HIV-1 or ⁇ ar H ⁇ V-2.
  • Most of the diagnostic tests marketed are based on an antigen-antibody reaction directed against certain viral proteins, such as the transmembrane proteins of the viral envelope.
  • the envelope proteins are derived from the env gene, which encodes a precursor glycoprotein with a molecular weight of 160,000 daltons, called gp 160.
  • the gp 160 is then cleaved into two viral proteins of the envelope, gp 120 and gp 41.
  • the precursor glycoprotein is gpl40, cleaved into gp36 and gpl05 / l 10.
  • patent EP-B-0 577 894 describes the construction of a chimeric recombinant protein used for the diagnosis of AIDS.
  • This protein carries epitopes directed against the viral proteins derived from the HIV-2 gag gene and against the HIV-1 gpl20 protein.
  • this recombinant protein does not allow the simultaneous detection of patients infected with group M and O HIV-1 viruses, which can induce risks of false negatives (patient detected seronegative while carrying the virus), false negatives whose consequences can be dramatic.
  • this recombinant protein does not carry the epitope directed against gp41, which is nevertheless the major immunodominant epitope, which increases, again, the risk of appearance of false negative.
  • Patent application DE 101 06 295 describes a recombinant protein comprising several epitopes directed against HIV-1 or HIV-2, linked by binding regions, making it possible to immobilize the recombinant protein on a solid support.
  • epitopic regions of this recombinant protein allow the recognition of antibodies directed against the products of the pol gene of the HIV virus (protease, reverse transcriptase or endonuclease) or against the sequence which constitutes the V3 loop of gpl20. Since the proteins encoded by the pol gene are relatively conserved from one virus to another, the antibodies directed against these proteins are not very specific. In addition, the antibodies directed against the pol antigens of a virus appear in people infected late, which does not allow a diagnosis of the disease at the start of infection. It has also been shown that the titer of anti-pol antigens decreases with the progression of the disease, and that consequently, a false negative diagnosis could be attributed to a patient in the chronic infection phase.
  • sequence of the V3 loop of gpl20 this sequence is hypervariable and the use of 2 or 3 sequences known as specific types does not guarantee the detection of all the antibodies directed against this domain: false negative results can therefore be obtained.
  • the present invention proposes to solve all the drawbacks of the state of the art, by proposing a new chimeric recombinant protein, easy to purify and to synthesize, having a strong immunoreactivity with respect to will of patients susceptible to '' be infected with one or more viruses, such as HIV-1, group M and or O or HIV-2.
  • viruses such as HIV-1, group M and or O or HIV-2.
  • recombinant DNA an artificially constructed nucleotide sequence obtained by genetic engineering.
  • said recombinant DNA can be inserted into an expression host organism, such as in particular a bacterium, by an expression vector, in particular a bacterial plasmid or a bacteriophage.
  • nucleotide fragment a succession of at least three nucleotide acids encoding at least one amino acid is understood.
  • cleavage site means a site allowing the separation of two nucleotide fragments by the action of at least one cleavage means, such as in particular a restriction enzyme which is capable, at the cleavage site level corresponding to a specific nucleotide sequence to generate for each strand two ends, one having a 3'-OH group, the other a 5'-P group.
  • cleavage means such as in particular a restriction enzyme which is capable, at the cleavage site level corresponding to a specific nucleotide sequence to generate for each strand two ends, one having a 3'-OH group, the other a 5'-P group.
  • chimeric recombinant protein an artificially constructed protein obtained by genetic engineering.
  • said chimeric recombinant protein can be produced by a genetically modified expression host organism by insertion of the nucleotide sequence encoding said chimeric recombinant protein by an expression vector.
  • epitopic region is meant a peptide region which will interact in a stereospecific manner with the paratopic peptide region of the antibody directed against the microorganism, such as in particular the virus, present in the patient's serum.
  • the most immunogenic epitopic regions are said to be immunodominant.
  • binding region is meant a region ensuring better accessibility of the paratopic regions of the various antibodies present in the serum of the patients with respect to the epitopic regions of interest of the chimeric recombinant protein.
  • binding region is meant a region making it possible to fix said chimeric recombinant protein vis-à-vis:
  • the support can be composed of materials, such as:
  • metals chelate metal column for affinity chromatography
  • the support can then be used as an analysis support, in particular during an ELISA (Enzym Linked ImmunoSorbent Assay), for purification steps during affinity chromatography, for washing steps when said chimeric recombinant protein, fixed on a magnetic particle is retained by magnetization in a predetermined place.
  • detection molecule is meant a molecule associated with a marker making it possible to directly or indirectly generate a detectable signal. These markers can be in particular radioactive, enzymatic, fluorescent.
  • the binding of the chimeric recombinant protein to said support or said detection molecule may involve ligands capable of reacting with an anti-ligand.
  • ligands capable of reacting with an anti-ligand.
  • the following ligand / anti-ligand pairs may be cited as examples:
  • the invention relates to a recombinant DNA coding for a chimeric recombinant protein comprising ⁇ at least two first nucleotide fragments each coding for an epitopic region of the HIV-1 virus of group M or of group O or of the HIV-2 virus ⁇ at least a second nucleotide fragment coding for a binding region, ⁇ at least a third nucleotide fragment coding for a binding region characterized in that each first nucleotide fragment codes for at least one immunodominant region of the HIV-1 gp 120 glycoprotein, of the gp 41 glycoprotein group M HIV-1, group O HIV-1 gp 41 glycoprotein or group HIV-2 gp 36 glycoprotein.
  • variable regions of these immunodominant region such as in particular the V3 loop of gpl20 are in no way envisaged in the present invention.
  • said first nucleotide fragment has for sequence any one of the sequences SEQ ID No. 3, SEQ ID No.
  • said second nucleotide fragment comprises at least one cleavage site.
  • said second nucleotide fragment has for sequence at least any one of following sequences, taken alone or in combination, SEQ ID N ° 11 SEQ ID N ° 13, SEQ ID N ° 15, SEQ ID N ° 17, SEQ ID N ° 19, or SEQ ID N ° 20, SEQ ID N ° 33 , SEQ ID N ° 35, SEQ ID N ° 37, SEQ ID N ° 39, SEQ ID N ° 41, SEQ ID N ° 43 SEQ ID N ° 45, or SEQ ID N ° 47
  • said third nucleotide fragment encoding a binding region is included in said second nucleotide fragment encoding a binding region.
  • said third nucleotide fragment has for sequence any one of the sequences SEQ ID No 21, SEQ ID No 23 23, or SEQ ID No 25, SEQ ID No 33 , SEQ ID N ° 35, SEQ ID N ° 37 or SEQ ID N ° 39.
  • nucleotide sequences according to the invention can be prepared by chemical synthesis and genetic engineering using techniques well known to those skilled in the art and described for example in Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
  • nucleotide sequences of the invention can be inserted into expression vectors in order to prepare the recombinant proteins of the invention.
  • the invention also relates to a chimeric recombinant protein encoded by a recombinant DNA, as defined above, comprising ⁇ at least two epitopic regions of the group M or group O HIV-1 virus or the HIV-2 virus of at least one. microorganism, ⁇ at least one binding region ⁇ at least one attachment region.
  • said binding region is a peptide comprising at least one glycine and / or at least one serine.
  • said binding region has as sequence any one of the sequences SEQ ID No 12, SEQ ID No 14, SEQ ID No 16 or SEQ ID No 18, 34 , 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48.
  • said attachment region is a region rich in histidines and its derivatives, such as a region containing a density histidines, greater than or equal to 25%, and preferably greater than or equal to 33%.
  • said attachment region is a peptide comprising at least one lysine.
  • said attachment region has the sequence SEQ ID No. 22, 24 or, 26, 34, 36, 38 or 40.
  • the recombinant proteins of the invention can be obtained by the technique of genetic engineering which comprises the steps of:
  • the invention also relates to an expression vector comprising a recombinant DNA as defined above.
  • expression vector there may be mentioned, for example, plasmids, viral vectors of the vaccinia virus, adenovirus, baculovirus, bacterial vectors of the salmonella, BCG type.
  • the term “means necessary for the expression of a protein” means any means which makes it possible to obtain said protein, such as in particular a promoter, a transcription terminator, an origin of replication and preferably a selection marker.
  • the vectors of the invention may also include sequences necessary for targeting proteins to particular cell compartments.
  • An example of targeting may be targeting to the endoplasmic reticulum obtained using addressing sequences of the type of the leader sequence derived from the E3 protein of the adenovirus (Ciernik IF, et al., The Journal of Immunology, 1999, 162, 3915-3925).
  • yeasts such as those of the following families: Saccharomyces,
  • eukaryotic cells examples include cells from animals such as mammals, reptiles, insects and the like.
  • Preferred eukaryotic cells are cells from the Chinese hamster (CHO cells), monkey (COS and Vero cells), dwarf hamster kidney (BHK cells), pig kidney (PK 15 cells) and rabbit kidney ( RK13 cells, human osteosacorm cell lines (cells 143 B), human HeLa cell lines and human hepatoma cell lines (such as Hep G2 cells), as well as insect cell lines (e.g. of Spodopterafrugiperda).
  • the invention relates to the use of at least one DNA as defined above and / or at least one chimeric recombinant protein as defined above for in vitro diagnosis. This use allows the detection of the HIV-1 group M and O virus as well as the detection of the HIV-2 virus.
  • Example 1 Construction of the recombinant chimeric proteins b-HIV72, b-HIV86 and b-HIV98 allowing the recognition of anti-HIV-1 group O and M and HIV-2 antibodies.
  • the nucleotide sequence SEQ JJD No. 1 was designed to code for a recombinant protein b-HIV72, and cloned into an expression vector. It corresponds to the following sequence:
  • the chimeric recombinant protein b-HIV72 coded by the sequence SEQ ID No. 1, comprises 137 amino acids, for a molecular mass of 15,191.5 Da. Its amino acid sequence is as follows:
  • This b-HIV72 chimeric recombinant protein comprises: a) several epitopic regions (indicated in bold in SEQ ID No. 2) allowing:
  • sequence SEQ ID No. 3 is derived from the viral strain HIV-1 group M (reference clone HXB2) and corresponds to the following sequence:
  • This sequence is amplified by PCR (polymerase chain reaction) by the use of specific amplification primers (primer 5 ′ AGT CGG ATC CAG AAT
  • the nucleotide fragment obtained codes for the peptide corresponding to the amino acid sequence SEQ ID No. 4: RILAVERYLK DQQLLGIWGC SGKLICTTAV. • recognition of anti-HIV-1 antibodies (group O; gp41):
  • sequence SEQ JD No. 5 corresponds to an artificial DNA sequence, designed from the amino acid sequence of the viral strain HIV-1 group O [clone ANT70]. This synthetic portion was designed by selecting codons whose use is favorable for gene expression in E. coli.
  • the sequence is as follows: SEQ ID N ° 5: CGT CTG CTT GCT CTG GAA ACC CTG CTT CAG AAC CAA CAG CTG CTT TCT CTG TGG GGT TGC AAA GGT AAG CTG GTT TGC TAC ACCTCT GTT.
  • This sequence is constructed by PCR by the use of 3 oligonucleotides (a 5 'sense oligonucleotide AAG TCT GCA GGC CGT CTG CTT GCT CTG GAA ACC CTG CTT CAG AAC CAA CAG CTG CTT TCT 3' and two 5 'antisense oligonucleotides GCT ATC TAG ATC AAT GGT GAT GGT GAT GGT GGG AAG CTT TAA CAG AGG TGT AGC AAA C 3 'and 5' AAC AGA GGT GTA GCA AAC CAG CTT ACC TTT GCA ACC CCA CAG AGA AAG CAG CTG TTG GTT 3 '; 17 PCR cycles are performed with each cycle a denaturation step at 9 ° C for 1 min, a hybridization step at 50 ° C for 1 min and an elongation step 68 ° C for 20 seconds).
  • This nucleotide fragment codes for the peptide corresponding to the amino
  • SEQ ID No. 7 is derived from the viral strain HIV-2 (reference clone ROD) and corresponds to the following sequence: SEQ ID No. 7: GCT ATA GAG AAG TAC CTA CAG GAC CAG GCG CGG CTA AATTCATGG GGATGTGCGTTTAGACAAGTC TGC
  • This sequence is amplified by PCR by the use of specific amplification primers (5 'sensible primer CTG TGA GCT CCG GTT CAG GCG CTA TAG AGA AGT ACC TA 3' and 5 'antisense primer AGA ACC GCT CGA GCA GAC TTG TCT AAA CGC 3 '; 17 PCR cycles are performed with each cycle a denaturation step at 94 ° C for 1 min, a hybridization step at 52 ° C for 1 min and an elongation step 72 ° C for 20 seconds).
  • This nucleotide fragment codes for the peptide corresponding to the amino acid sequence SEQ ID No. 8: AIEKYLQDQA RLNSWGCAFR QVC. • recognition of anti-HIV-1 antibodies (group M; gp ⁇ O):
  • sequence SEQ ID No. 9 is derived from the viral strain HIV-1 group M (reference clone HXB2) and corresponds to the following sequence:
  • This sequence is amplified by PCR by the use of specific amplification primers (5 'sensible primer GTC TGC TCG AGC GGT TCT GGA GGA GGA GAT ATG AGG 3' and 5 'antisense primer ACG TCC TGC AGA CTT GGT GGG TGC TAC 3 'TCC; 17 cycles of PCR are carried out comprising at each cycle a denaturation step at 94 ° C for 1 min, a hybridization step at 52 ° C for 1 min and an elongation step at 72 ° C for 20 seconds ).
  • This nucleotide fragment codes for the peptide corresponding to the amino acid sequence SEQ ID No. 10: GGGDMRDNWR SELYKYKWK IEPLGVAPTK
  • restriction enzymes which can be used to modify, remove or add an epitopic domain
  • nucleotide sequence SEQ ID No. 1 1 G AGC TCC GGT TCA GGC allows a cleavage site to be obtained by the enzyme Sac I (indicated in bold), the G indicated in italics, being the last base.
  • Sac I indicated in bold
  • the nucleotide sequence coding for the peptide allowing the recognition of anti-HIV-1 antibodies, group M.
  • This sequence codes for the flexible region corresponding to the peptide of sequence SEQ ID No. 12: SSG SG.
  • the nucleotide sequence SEQ ID N ° 13: CTCG AGC GGT TCT allows a cleavage site to be obtained by the enzyme Xho I (indicated in bold), the C indicated in italics, being the last base of the nucleotide sequence coding the peptide allowing the recognition of anti-HIV-2 antibodies.
  • This sequence codes for the flexible region corresponding to the peptide of sequence SEQ ID No. 14: SSGS.
  • this particular attachment region comprising a succession of histidine, allows in particular the oriented attachment of the recombinant protein on a support consisting of silica or metal oxides, as described in patent FR-B- 98 / 04,879.
  • the order of the sequences coding the different immunodominant epitopic regions of the chimeric recombinant protein can possibly be modified. Certain epitopes can be presented several times within the chimeric recombinant protein. The epitopes can also present variations compared to the sequences described in the example above according to the subtype or the HIV clone that they represent. The length of the binding regions can also be varied to improve the accessibility of an epitope. Finally, the attachment regions can be inserted within the link regions.
  • sequence SEQ ID No. 27 is derived from the viral strain HIV-1 group M (reference clone HXB2) and corresponds to the following sequence:
  • SEQ ID N ° 27 GAA AGA TAC CTA AAG GAT CAA CAG CTC CTA GGG ATT
  • This nucleotide fragment codes for the peptide corresponding to the amino acid sequence SEQ JX) No. 28: ERYLKDQQLL GIWGCSGKLI CTT.
  • the sequence SEQ ID No. 29 corresponds to an artificial DNA sequence, designed from the amino acid sequence of the viral strain HIV-1 group O [clone ANT70].
  • This synthetic portion was designed by selecting codons whose use is favorable for gene expression in E. coli.
  • the sequence is as follows: SEQ ID N ° 29: GAA ACC CTG CTT CAG AAC CAA CAG CTG CTT TCT CTG
  • This nucleotide fragment codes for the peptide corresponding to the amino acid sequence SEQ ID No. 30: ETLLQNQQLL SLWGCKGKLV CYT. • recognition of anti-H ⁇ V-2 antibodies (gp36):
  • the sequence SEQ ID No. 31 is derived from the viral strain HIV-2 (reference clone
  • This nucleotide fragment codes for the peptide corresponding to the amino acid sequence SEQ ID No. 32: LNSWGCAFR QVC
  • nucleotide sequence SEQ ID No. 49 was designed to encode a recombinant protein according to the invention, and cloned in an expression vector.
  • the chimeric recombinant protein coded by the sequence SEQ JO No. 50 is as follows:
  • the epitopic regions are indicated in bold, the binding region in italics and the binding regions in non-bold non-italics.
  • nucleotide sequence SEQ ID No. 51 was designed to encode a recombinant protein according to the invention, and cloned in an expression vector.
  • the epitopic regions are indicated in bold, the binding region in italics and the binding regions in non-bold non-italics.
  • Example 2 Expression and purification of the chimeric recombinant proteins b-HIV 72, b-HIV86 and b-HIV98 of Example 1
  • the first step consists in inserting the sequence SEQ ID No. 1 (example 1), into an expression vector (pMR) then transforming an E. coli bacterium (strain BL21) with the plasmid construction obtained according to a conventional cloning protocol. known to those skilled in the art.
  • the transformed bacteria are selected thanks to their resistance to ampicillin carried by the vector pMR.
  • a clone of recombinant bacteria is then selected to seed a preculture of 40 ml of 2x YT medium (tryptone 16 g / 1; yeast extract 10 g / 1; NaCl 5 g / 1, pH 7.0) containing 100 ⁇ g / ml ampicillin .
  • 2x YT medium tryptone 16 g / 1; yeast extract 10 g / 1; NaCl 5 g / 1, pH 7.0
  • this preculture is used to inoculate 1 liter of 2xYT medium containing 2% glucose and 100 ⁇ g / ml ampicillin. This culture is incubated at 37 ° C with shaking at 250 rpm.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside, Eurogentec
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside, Eurogentec
  • the culture is centrifuged at 6000 rpm for 30 min at 4 ° C and the pellet of bacteria is frozen at - 80 ° C.
  • the thawed bacteria are lysed.
  • the bacteria pellets corresponding to a culture of one liter are taken up in 100 ml of lysis buffer (PBS IX containing protease inhibitors: lysozyme: 1 mg / ml; benzonase: 2.5 units per ml (Novagen ®) and Mg: 1 mM) by vortexing until a homogeneous suspension is obtained.
  • lysis buffer PBS IX containing protease inhibitors: lysozyme: 1 mg / ml; benzonase: 2.5 units per ml (Novagen ®) and Mg: 1 mM
  • This solution is incubated for 1 hour at room temperature with shaking.
  • the solution is then centrifuged 30 min at 4 ° C at 10,000 g.
  • the pellet obtained contains the inclusion bodies.
  • This pellet is suspended in 50 ml of solubilization buffer (sodium bicarbonate: 40 mM; NaCl: 300 mM; SDS: 1%; ⁇ -mercaptoethanol: 20 mM, pH 9.6) containing protease inhibitors (complete EDTA-free, Roche®).
  • solubilization buffer sodium bicarbonate: 40 mM; NaCl: 300 mM; SDS: 1%; ⁇ -mercaptoethanol: 20 mM, pH 9.6
  • the solution thus obtained is incubated for 16 to 18 h with shaking between 18 and 25 ° C. It is then diluted to a quarter with a 2X PBS buffer containing 8 mM imidazole and protease inhibitors (complete EDTA-free, Roche®) at pH 8.0.
  • the elution of the recombinant protein is obtained by application of a buffer B1 (PBS 2X, 4M urea, 100 mM imidazole, pH 7.5 , containing 5 mM ⁇ -mercaptoethanol) or B2 (PBS 2X, 0.25% SDS, 100 mM imidazole, pH 7.5, containing 5 mM ⁇ -mercaptoethanol).
  • B1 PBS 2X, 4M urea, 100 mM imidazole, pH 7.5 , containing 5 mM ⁇ -mercaptoethanol
  • B2 PBS 2X, 0.25% SDS, 100 mM imidazole, pH 7.5, containing 5 mM ⁇ -mercaptoethanol
  • Quantities of the order of 50 mg of purified recombinant protein can be obtained from a liter of culture.
  • the recombinant protein thus purified is subjected to a denaturing treatment by addition of SDS (1500 molecules per molecule of recombinant protein), DIT 5 mM, 50 mM sodium bicarbonate at pH 9.6 and heating 30 min at 37 ° C.
  • SDS 1500 molecules per molecule of recombinant protein
  • DIT 5 mM 50 mM sodium bicarbonate at pH 9.6
  • the stocking of SDS molecules / recombinant protein molecules can be modified (ideally reduced if the heating time or temperature is increased). For example, similar results are obtained by adding 250 molecules of SDS / molecule of recombinant protein, 5 mM DTT, 50 mM sodium bicarbonate at pH 9.6 and heating for 2 hours at 40 ° C.
  • the protein thus denatured is stabilized by addition of Polyethylene glycol (MW 3350 in particular) for a stockiometry of 10 PEG molecules per protein molecule then dialyzed at 4 ° C for 18 to 24 hours against a 50mM sodium bicarbonate buffer, EDTA ImM , SDS 0.01%, PEG 1 mg / 1, pH 9.6.
  • the expression and the purification of the chimeric recombinant proteins b-HIV86 and b-HIV98 were carried out in a comparable manner, with the exception of the denaturation step by SDS and DTT, which is not necessary during the purification of the proteins b-HIV86 and b-HIV98.
  • the use of beta mercaptoethanol in purification buffers is also not necessary.
  • Example 3 Evaluation and validation of the chimeric recombinant protein b-HTV 72, bHIV 86 and b-HIV98 in a VIDAS® test (bioMérieux)
  • VIDAS® test The principle of the VIDAS® test is as follows: a cone constitutes the solid support which also serves as a pipetting system for the reagents present in the strip. The recombinant protein is attached to the cone. After a dilution step, the sample is aspirated and discharged several times inside the cone. This allows the anti-HIV IgGs in the sample to bind to the recombinant protein. Unbound components are washed away. An anti-human IgG antibody conjugated with alkaline phosphatase (PAL) is then incubated in the cone where it binds to anti-HIV IgG. Washing steps remove the unbound conjugate.
  • PAL alkaline phosphatase
  • the PAL substrate 4-methyl-umbelliferyl phosphate
  • 4-methyl-ombelliferone the fluorescence of which is emitted at 450 nm is measured.
  • the intensity of the fluorescence is measured by the Vidas® optical system and is proportional to the presence of anti-HIV IgG present in the sample.
  • the results are automatically analyzed by VIDAS® and expressed in RFV (Relative Fluorescent Value).
  • a recombinant protein solution obtained according to Examples 1 and 2 (1.2 ⁇ g in one milliliter of 50 mM sodium bicarbonate buffer, SDS 0.01%, pH 9.6-9.8) is incubated with VIDAS® 18 cones for 24 h at room temperature (120 ⁇ l / cone).
  • the cones are then incubated in a passivation buffer (330 ⁇ l / cone of HIV Duo buffer containing 3% calf serum) for 18 to 24 h at room temperature Test solutions (Etableau für du Sang, France), of HIV serology known, (28 ⁇ l of serum, of known HIV status, diluted in 300 ⁇ l of PBS 1 X buffer, NaCl 8.76 g / 1, tween 20 2.5% (v / v), skimmed milk powder 2.5 g / 1, albumin 20 g / 1, and 3% (v / v) calf serum, pH 6.1) are then brought into contact with the cones having the recombinant proteins of Example 1, for 13 min and 20 seconds (80 pipetting / delivery cycles of 10 seconds).
  • a passivation buffer 330 ⁇ l / cone of HIV Duo buffer containing 3% calf serum
  • a washing step is then carried out in Tris buffer 24.23 g / 1, maleic acid 23.22 g / 1, tween 20 0.05% (v / v), NaOH 6 g / 1, NaCl 8.77 g / 1, pH 6.1.
  • a solution of anti-human Fc antibodies conjugated to PAL (P5F2F7) and diluted to l / 5000 emc is incubated in contact with the cone for 5 min (with 30 pipetting / delivery cycles of 10 seconds each).
  • a final washing step is carried out in HIV Duo buffer, before the final revelation step.
  • RFV Relative Fluorescent Value
  • Example 4 Construction of a Recombinant Biotinylated Protein
  • a consensus sequence of in vivo biotinylation in E.coli as described by Schatz, (Bio / technology, vol. 11, 1993) can be merged with SEQ ID No. 2 L ' addition of the sequence SEQ ID N ° 23: 5 'CTG CAC CAT ATC CTG GAA GCC CAG AAA ATG GAA TGG CAC CCG CAC, coding the peptide with sequence SEQ ID N ° 24: LHHILEAQKM EWHPH, allows the biotinylation of the recombinant protein b HIV72 obtained according to Examples 1 and 2 in order to use an avidin protein conjugated to an enzyme for the development phase in an EIA test.
  • the bacteria transformed with the recombinant plasmid can be of the BL21 or AVB101 type (Avidity, LLC).
  • the culture medium used for the expression can be of the type: 2x YT (tryptone 16 g / 1; yeast extract 10 g / 1; NaCl 5 g / 1, pH 7.0) containing 100 ⁇ g / ml ampicillin and supplemented with 12 ⁇ g per ml of biotin.
  • Example 5 Evaluation and validation of the chimeric recombinant protein biotinylated in vivo as described in Example 4 in a VIDAS® test of the sandwich type.
  • Example 6 Evaluation and validation of the chimeric recombinant protein bHIV- 86 and bHIV-98 in a VTDAS® sandwich type test.
  • EXAMPLE 7 Improvement of the Sensitivity of the Chimeric Recombinant Protein In order to further increase the recognition sensitivity of the anti-HIV antibodies of the recombinant protein obtained according to the invention, new epitopes characteristic of certain HIV subtypes can be added or a of the epitopes described can be duplicated in the sequence of the chimeric protein.
  • Example 8 Addition of a hexalysin sequence to the recombinant protein to facilitate the coupling of an enzyme or biotin, in particular on the ⁇ -amino function of lysine.
  • a sequence coding for six lysines can be fused 3 'to SEQ ID No. 2.
  • the coupling of this recombinant protein to alkaline phosphatase in particular allows the use of the coupled protein in a sandwich format for revealing anti-HIV antibodies.

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Abstract

L'invention concerne un ADN recombinant codant une protéine recombinante chimérique comprenant - au moins deux premiers fragments nucléotidiques codant chacun une région épitopique du virus HIV- 1 de groupe M ou de groupe O ou le virus HIV-2 - au moins un deuxième fragment nucléotidique codant une région de liaison, - au moins un troisième fragment nucléotidique codant une région de fixation caractérisé en ce que chaque premier fragment nucléotidique code au moins une région immunodominante de la glycoprotéine gp 120 d'HIV-1, de la glycoprotéine gp 41 d'HIV-1 de groupe M, de la glycoprotéine gp 41 d'HIV-1 de groupe O ou de la glycoprotéine gp 36 d'HIV-2. L'invention concerne également une protéine chimérique recombinante codée par l'ADN défini ci dessus, ainsi que l'utilisation dudit ADN et/ou de ladite protéine recombinante pour le diagnostic in vitro.

Description

Protéine recombinante chimérique et diagnostic in vitro
La présente invention est relative à une protéine recombinante chimérique, un ADN codant ladite protéine recombinante chimérique, ainsi que l'utilisation de cette protéine recombinante chimérique pour le diagnostic in vitro des maladies en relation avec un virus, plus particulièrement le virus HIV-1 et/ou et HIV-2.
Le diagnostic précoce de la présence d'un virus dans l'organisme est essentiel afin, d'une part, d'éviter la propagation du virus par les malades qui ne connaissent pas encore leur séropositivité, et d'autre part, de proposer à ces patients un traitement adapté pour reculer la date d'apparition des symptômes.
Dans le cas du SIDA (syndrome d'immunodéficience acquise), conséquence de l'infection par les rétrovirus HIV-1 (human immunodeficiency virus- 1) ou HF/-2 (human immunodeficiency virus-2), la primo infection est suivie d'une période asymptomatique, d'une durée variable avant que la maladie n'évolue chez la plupart des patients en SIDA, caractérisée par l'apparition d'infections à germes opportunistes, de tumeurs et de manifestations neurologiques, et le diagnostic précoce de la présence du virus HIV dans l'organisme doit être effectué que le patient ait initialement été infecté par HIV-l ou ρar HιV-2. La plupart des tests de diagnostic commercialisés est basé sur une réaction antigène-anticorps dirigée contre certaines protéines virales, telles que les protéines transmembranaires de l'enveloppe virale. Dans le cas d'HIV- 1, les protéines de l'enveloppe sont dérivées du gène env, qui code une glycoprotéine précurseur d'un poids moléculaire de 160 000 daltons, dénommée gp 160. La gp 160 est ensuite clivée en deux protéines virales de l'enveloppe, la gp 120 et la gp 41. Dans le cas d'HIV-2, la glycoprotéine précurseur est la gpl40, clivée en gp36 et gpl05/l 10. Ainsi, dans l'article scientifique de Vallari et al (Journal of microbiology, pages 3657-3661, 1998), on retrouve la description d'un kit de diagnostic permettant de détecter la présence de virus HIV-1 groupe M, HIV-1 groupe O et HIV-2, par l'utilisation de trois protéines recombinantes, dérivées des régions env de virus HIV-1 groupe M, HIV-1 groupe O et HIV-2. D'une façon comparable, dans l'article scientifique de Shin et al (Biochemistry and molecular biology international, volume 43, n°4, pages 713-721, 1997), sont décrits des peptides multi-antigéniques pour détecter des infections aux virus HIV-l ou HIV-2. Toutefois, dans de tels tests de diagnostic de plusieurs souches virales, il est nécessaire lors de l'analyse de sera par la technique ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay), de fixer sur le support plusieurs protéines recombinantes ayant des caractéristiques d'adsorption (ou coating) individuelles différentes, induisant des problèmes notamment lors de l'étape de révélation. De plus, la multiplicité des protéines recombinantes engendre des coûts de fabrication importants.
Afin d'éviter ces problèmes de différences de coating entre les différentes protéines recombinantes, d'autres tests de diagnostic utilisent préférentiellement des protéines recombinantes chimériques, porteuses de plusieurs épitopes dirigés contre des protéines virales différentes.
Ainsi, le brevet EP-B-0 577 894 décrit la construction d'une protéine recombinante chimérique utilisée pour le diagnostic du SIDA. Cette protéine est porteuse des épitopes dirigés contre les protéines virales dérivées du gène gag de HIV-2 et contre la protéine gpl20 d'HIV-1. Toutefois, cette protéine recombinante ne permet pas la détection simultanée des patients infectés par les virus HIV-l de groupe M et O, ce qui peut induire des risques de faux négatifs (patient détecté séronégatif alors qu'il est porteur du virus), faux négatifs dont les conséquences peuvent être dramatiques. De plus, cette protéine recombinante n'est pas porteuse de l'épitope dirigé contre la gp41, qui est pourtant l'épitope immunodominant majeur, ce qui augmente, là encore, le risque d'apparition de faux négatif. De même, dans l'article scientifique de Han et al (Biochemistry and molecular biology international, vol 46 n°3, 1998), il est décrit une protéine recombinante présentant un épitope dirigé contre la gp41 d'HIV-1, et un épitope dirigé contre la gp36 d'HIV-2, ces deux épitopes étant liés par un peptide de liaison afin de permettre l'accessibilité à chacun des épitopes. Toutefois, cette protéine recombinante ne permet pas la détection simultanée des patients infectés par les virus HIV-l de groupe M et O, ce qui peut induire, là encore, des risques de faux négatifs. La demande de brevet DE 101 06 295 décrit une protéine recombinante comprenant plusieurs épitopes dirigés contre HIV-l ou HIV-2, liés par des régions de liaisons, permettant d'immobiliser la protéine recombinante sur un support solide. Toutefois, les régions epitopiques de cette protéine recombinante permettent la reconnaissance d'anticorps dirigés contre les produits du gène pol du virus HIV (protéase, reverse transcriptase ou endonucléase) ou contre la séquence qui constitue la boucle V3 de la gpl20. Les protéines codées par le gène pol étant relativement conservées d'un virus à un autre, les anticorps dirigés contre ces protéines sont peu spécifiques. De plus, les anticorps dirigés contre les antigènes pol d'un virus apparaissent chez les personnes infectées tardivement ce qui ne permet pas un diagnostic de la maladie en début d'infection. Il a été montré également que le titre en anticoprs anti-antigènes pol diminue avec la progression de la maladie, et qu'en conséquence, un diagnostic faussement négatif pouvait être attribué à un malade en phase d'infection chronique.
En ce qui concerne la séquence de la boucle V3 de la gpl20, cette séquence est hypervariable et l'utilisation de 2 ou 3 séquences dites sous types spécifiques ne garantie pas la détection de tous les anticorps dirigés contre ce domaine : des résultats faussement négatifs peuvent donc être obtenus.
La présente invention se propose de résoudre l'ensemble des inconvénients de l'état de la technique, en proposant une nouvelle protéine recombinante chimérique, facile à purifier et à synthétiser, présentant une forte immunoréactivité vis-à-vis de sera de patients susceptibles d'être infectés par un ou plusieurs virus, tel que HIV-l, groupe M et ou O ou HIV-2.
Les définitions suivantes permettront de mieux comprendre l'invention.
Par ADN recombinant, on entend une séquence nucléotidique construite artificiellement et obtenue par génie génétique. A titre indicatif, ledit ADN recombinant peut être inséré dans un organisme hôte d'expression, tel que notamment une bactérie, par un vecteur d'expression, notamment un plasmide bactérien ou un bactériophage.
Par fragment nucléotidique. on entend une succession d'au moins trois acides nucléotidiques codant au moins un acide aminé.
Par site de coupure, on entend un site permettant la séparation de deux fragments nucléotidiques par l'action d'au moins un moyen de coupure, tel que notamment une enzyme de restriction qui est capable, au niveau de site de coupure correspondant à une séquence nucléotidique spécifique de générer pour chaque brin deux extrémités, l'une ayant un groupement 3'-OH, l'autre un groupement 5'-P.
Par protéine recombinante chimérique, on entend une protéine construite artificiellement et obtenue par génie génétique. A titre indicatif, ladite protéine recombinante chimérique peut être produite par un organisme hôte d'expression modifiée génétiquement par insertion de la séquence nucléotidique codant ladite protéine recombinante chimérique par un vecteur d'expression.
Par région épitopique, on entend une région peptidique qui va interagir de façon stéréospécifique avec la région peptidique paratopique de l'anticorps dirigé contre le microorganisme, tel que notamment le virus, présent dans le sérum du patient. Les régions epitopiques les plus immunogéniques sont dites immunodominantes.
Par région de liaison, on entend une région assurant une meilleure accessibilité des régions paratopiques des différents anticorps présents dans le sérum des patients vis à vis des régions epitopiques d'intérêt correspondantes de la protéine recombinante chimérique.
Par région de fixation, on entend une région permettant de fixer ladite protéine recombinante chimérique vis-à-vis :
• d'un support, de manière direct et/ou indirect, et/ou
• d'une molécule de détection, Le support peut être composé de matériaux, tels que :
• le verre, un matériau peu onéreux, inerte et mécaniquement stable ,
• les polymères : plaques de microtitration...
• les métaux : colonne de métal chelate de chromatographie d'affinité,
• les particules magnétiques, telles que décrites dans les demandes de brevet WO-A- 97/34909, WO-A-97/45202, WO-A-98/47000 et WO-A-99/35500 déposées par la demanderesse. Le support peut alors être utilisé comme support d'analyse, notamment lors d'un ELISA (Enzym Linked ImmunoSorbent Assay), pour des étapes de purification lors d'une chromatographie d'affinité, pour des étapes de lavage lorsque ladite protéine recombinante chimérique, fixée sur une particule magnétique est retenue par aimantation dans un lieu prédéterminé. Par molécule de détection, on entend une molécule associée à un marqueur permettant de générer directement ou indirectement un signal détectable. Ces marqueurs peuvent être notamment radioactifs, enzymatiques, fluorescents.
La fixation de la protéine recombinante chimérique sur ledit support ou ladite molécule de détection peut impliquer des ligands capables de réagir avec un anti-ligand. On peut citer à titre d'exemples les couples ligand/anti-ligand suivants :
• biotine/streptavidine,
• haptène/anticorps,
• antigène/anticorps, • peptide/anticorps,
• sucre/lectine,
Ainsi, l'invention concerne un ADN recombinant codant une protéine recombinante chimérique comprenant α au moins deux premiers fragments nucléotidiques codant chacun une région épitopique du virus HIV-l de groupe M ou de groupe O ou du virus HIV-2 α au moins un deuxième fragment nucléotidique codant une région de liaison, α au moins un troisième fragment nucléotidique codant une région de fixation caractérisé en ce que chaque premier fragment nucléotidique code au moins une région immunodominante de la glycoprotéine gp 120 d'HIV-1, de la glycoprotéine gp 41 d'HIV- 1 de groupe M, de la glycoprotéine gp 41 d'HIV- 1 de groupe O ou de la glycoprotéine gp 36 d'HIV-2.
Il est bien évidemment que les régions variables de ces région immunodominante telle que notamment la boucle V3 de la gpl20 ne sont nullement envisagées dans la présente invention.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit premier fragment nucléotidique a pour séquence l'une quelconque des séquences SEQ ID N°3, SEQ ID
N°5, SEQ ID N°7, SEQ ID N°9, SEQ ID N°27, SEQ ID N°29 ou SEQ ID N°31.
Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, ledit deuxième fragment nucléotidique comprend au moins un site de coupure. Préférentiellement, ledit deuxième fragment nucléotidique a pour séquence au moins l'une quelconque des séquences suivantes, prises seules ou en combinaison, SEQ ID N°ll SEQ ID N°13, SEQ ID N°15, SEQ ID N°17, SEQ ID N°19, ou SEQ ID N°20, SEQ ID N°33, SEQ ID N°35, SEQ ID N°37, SEQ ID N°39, SEQ ID N°41, SEQ ID N°43 SEQ ID N°45, ou SEQ ID N°47 Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit troisième fragment nucléotidique codant une région de fixation est inclus dans ledit deuxième fragment nucléotidique codant une région de liaison.
Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, ledit troisième fragment nucléotidique a pour séquence l'une quelconque des séquences SEQ ID N°21, SEQ ID N° 23 23,ou SEQ ID N°25, SEQ ID N°33, SEQ ID N°35, SEQ ID N°37 ou SEQ ID N°39.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être préparées par synthèse chimique et génie génétique en utilisant les techniques bien connues de l'homme du métier et décrites par exemple dans Sambrook J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 1989.
Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs d'expression afin de préparer les protéines recombinantes de l'invention.
L'invention concerne également une protéine recombinante chimérique codée par un ADN recombinant, tel que défini précédemment, comprenant α au moins deux régions epitopiques du virus HIV-l de groupe M ou de groupe O ou le virus HIV-2 d'au moins un microorganisme, α au moins une région de liaison α au moins une région de fixation. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ladite région de liaison est un peptide comprenant au moins une glycine et/ou au moins une serine. Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, ladite région de liaison a pour séquence l'une quelconque des séquences SEQ ID N° 12, SEQ ID N°14, SEQ ID N°16 ou SEQ ID N°18, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, ladite région de fixation est une région riche en histidines et ses dérivés, tel qu'une région contenant une densité d'histidines, supérieure ou égale à 25%, et préférentiellement supérieure ou égale à 33%.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, ladite région de fixation est un peptide comprenant au moins une lysine. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ladite région de fixation a pour séquence SEQ ID N°22, 24 ou , 26, 34, 36, 38 ou 40.
Les protéines recombinantes de l'invention peuvent être obtenues par la technique du génie génétique qui comprend les étapes de :
- culture d'organismes hôtes ou de cellules eucaryotes transformées à l'aide d'une séquence nucléotidique selon l'invention et
- récupération de la protéine produit par lesdits organismes hôtes ou lesdites cellules eucaryotes transformées.
Cette technique est bien connue de l'homme du métier. Pour plus de détails la concernant, on pourra se référer à l'ouvrage ci-après : Recombinant DNA Technology I, Editors Aies Prokop, Raskesh K Bajpai ; Armais of the New- York Academy of Sciences, Volume 646, 1991.
L'invention concerne également un vecteur d'expression comprenant un ADN recombinant tel que défini précédemment. A titre de vecteur d'expression, on peut citer par exemple les plasmides, les vecteurs viraux type virus de la vaccine, adenovirus, baculovirus, les vecteurs bactériens du type salmonelle, BCG.
On entend par moyen nécessaire à l'expression d'une protéine, tout moyen qui permet d'obtenir ladite protéine, tel que notamment un promoteur, un terminateur de transcription, une origine de réplication et de préférence un marqueur de sélection. Les vecteurs de l'invention peuvent également comprendre des séquences nécessaires au ciblage des protéines vers des compartiments cellulaires particuliers. Un exemple de ciblage peut être le ciblage vers le réticulum endoplasmique obtenu en utilisant des séquences d'adresssage du type de la séquence leader issue de la protéine E3 de l'adénovirus (Ciernik I.F., et al., The Journal of Immunology, 1999, 162, 3915-3925).
A titre d'exemples d'organismes hôtes qui conviennent aux fins de l'invention, on peut citer les levures, telles que celles des familles suivantes : Saccharomyces,
Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Pichia, Hanseluna, Yarowia, Schwaniomyces,
Zygosaccharomyces, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis et Kluveromyces lactis étant préférées ; et les bactéries, telles que E. coli et celles des familles suivantes : Lactobacillus, Lactococcus, Salmonella, Strptococcus, Bacillus et Streptomyces.
A titre d'exemples de cellules eucaryotes, on peut citer les cellules provenant d'animaux tels que les mammifères, les reptiles, les insectes et équivalent. Les cellules eucaryotes préférées sont les cellules provenant du hamster chinois (cellules CHO), du singe (cellules COS et Vero), du rein de hamster nain (cellules BHK), du rein de cochon (cellules PK 15) et du rein de lapin (cellules RK13, les lignées cellulaires humaines de l'ostéosacorme (cellules 143 B), les lignées cellulaires humaines HeLa et les lignées cellulaires humaines de l'hépatome (du type cellules Hep G2), ainsi que les lignées cellulaires d'insecte (par exemple de Spodopterafrugiperda).
L'invention concerne enfin l'utilisation d'au moins un ADN tel que défini précédemment et/ou d'au moins une protéine recombinante chimérique telle que définie précédemment pour le diagnostic in vitro. Cette utilisation permet la détection du virus HIV-l de groupe M et O ainsi que la détection du virus HIV-2.
Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention. Exemple 1 : Construction des protéines chimériques recombinantes b-HIV72, b- HIV86 et b-HIV98 permettant la reconnaissance d'anticorps anti HIV-l groupe O et M et HIV-2.
La séquence nucléotidique SEQ JJD N°l a été conçue pour coder une protéine recombinante b-HIV72, et clonée dans un vecteur d'expression. Elle correspond à la séquence suivante :
SEQ ID N° 1 : ATG AGG GGA TCC AGA ATC CTA GCT GTG GAA AGA TAC CTA AAG GAT CAA CAG CTC CTA GGG ATT TGG GGT TGC TCT GGA AAA CTCATT TGC ACC ACT GCT GTGAGC TCC GGTTCAGGC GCTATA GAG AAG TAC CTA CAG GAC CAG GCG CGG CTA AAT TCA TGG GGA TGT GCG TTT AGA CAA GTC TGC TCG AGC GGT TCT GGA GGA GGA GAT ATG AGG GAC AAT TGG AGA AGT GAA TTA TAT AAA TAT AAA GTA GTA AAA ATT GAA CCA TTA GGA GTA GCA CCC ACC AAG TCT GCA GGC CGT CTG CTT GCT CTG GAA ACC CTG CTT CAG AAC CAA CAG CTG CTT TCT CTG TGG GGT TGC AAA GGT AAG CTG GTT TGC TAC ACC TCT GTT AAA GCT TCC CAC CAT CAC CAT CAC CATTGA TCT AGA
La protéine recombinante chimérique b-HIV72 codée par la séquence SEQ ID N°l, comprend 137 acides aminés, pour une masse moléculaire de 15191,5 Da. Sa séquence en acides aminés est la suivante :
SEQ ID N°2 : MRGS RILAVERYLK DQQLLGIWGC SGKLICTTAV SSGSG AIEKYLQDQA RLNSWGCAFR QYC SSGS GGGDMRDNWR SELYKYKWK IEPLGVAPTK SAG RLLALETLLQ NQQLLSLWG CKGKLVCYTS V KAS HHHHHH. La présence de MRGS et la séquence ATG AGG GGA TCC correspondante est introduite par la technique de clonage utilisée dans le vecteur d'expression pMR. La séquence d'intérêt est introduite dans le vecteur pMR entre le site de restriction BamHI en 5' et le site Xbal en 3', ce qui conduit à la fusion de la séquence MRGS en N- terminal de la protéine d'intérêt. Seul le codon d'initiation ATG et par conséquent l'acide aminé Met est vraiment indispensable dans cette séquence. Les régions epitopiques sont indiquées en gras, la région de fixation en italique et les régions de liaisons en non gras non italique.
Cette protéine recombinante chimérique b-HIV72 comprend : a) plusieurs régions epitopiques (indiquées en gras dans la SEQ ID n°2) permettant :
• la reconnaissance des anticorps anti-HIV- 1 (groupe M ; gp41 . :
La séquence SEQ ID N°3 est issue de la souche virale HIV-l groupe M (clone de référence HXB2) et correspond à la séquence suivante :
SEQ ID N°3 : AGA ATC CTA GCT GTG GAA AGA TAC CTA AAG GAT CAA CAG CTC CTA GGG ATT TGG GGT TGC TCT GGA AAA CTC ATT TGC ACC
ACT GCT GTG,
Cette séquence est amplifiée par PCR (polymerase chain reaction) par l'utilisation d'amorces d'amplification spécifiques (amorce sensé 5' AGT CGG ATC CAG AAT
CCT AGC TGT GGA A 3' et amorce antisense 5' GCC TGA TCC GGA GCT CAC AGC AGT GGT GCA AAT 3' ; 17 cycles de PCR sont réalisés avec à chaque cycle une étape de dénaturation à 94°C pendant 1 minute (min), une étape d'hybridation à
52°C pendant 1 min et une étape d'élongation 72°C pendant 20 secondes.
Le fragment nucléotidique obtenu code pour le peptide correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID N°4 : RILAVERYLK DQQLLGIWGC SGKLICTTAV. • la reconnaissance des anticorps anti-HIV- 1 (groupe O ; gp41) :
La séquence SEQ JD N° 5 correspond à une séquence ADN artificielle, conçue à partir de la séquence en acide aminé de la souche virale HIV-l groupe O [clone ANT70]. Cette portion synthétique a été conçue en sélectionnant des codons dont l'utilisation est favorable à l'expression de gène chez E. coli. La séquence est la suivante : SEQ ID N° 5 : CGT CTG CTT GCT CTG GAA ACC CTG CTT CAG AAC CAA CAG CTG CTT TCT CTG TGG GGT TGC AAA GGT AAG CTG GTT TGC TAC ACCTCT GTT.
Cette séquence est construite par PCR par l'utilisation de 3 oligonucléotides (un oligonucléotide sens 5' AAG TCT GCA GGC CGT CTG CTT GCT CTG GAA ACC CTG CTT CAG AAC CAA CAG CTG CTT TCT 3 ' et deux oligonucléotides antisens 5' GCT ATC TAG ATC AAT GGT GAT GGT GAT GGT GGG AAG CTT TAA CAG AGG TGT AGC AAA C 3' et 5' AAC AGA GGT GTA GCA AAC CAG CTT ACC TTT GCA ACC CCA CAG AGA AAG CAG CTG TTG GTT 3' ; 17 cycles de PCR sont réalisés avec à chaque cycle une étape de dénaturation à 9°C pendant 1 min, une étape d'hybridation à 50°C pendant 1 min et une étape d'élongation 68°C pendant 20 secondes). Ce fragment nucléotidique code pour le peptide correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID N°6 : RLLALETLLQ NQQLLSLWGC KGKLVCYTSV .
• la reconnaissance des anticorps anti-HIV-2 (gp36 : La séquence SEQ ID N°7 est issue de la souche virale HIV-2 (clone de référence ROD) et correspond à la séquence suivante : SEQ ID N°7 : GCT ATA GAG AAG TAC CTA CAG GAC CAG GCG CGG CTA AATTCATGG GGATGTGCGTTTAGACAAGTC TGC
Cette séquence est amplifiée par PCR par l'utilisation d'amorces d'amplification spécifiques (amorce sensé 5' CTG TGA GCT CCG GTT CAG GCG CTA TAG AGA AGT ACC TA 3' et amorce antisense 5' AGA ACC GCT CGA GCA GAC TTG TCT AAA CGC 3' ; 17 cycles de PCR sont réalisés avec à chaque cycle une étape de dénaturation à 94°C pendant 1 min, une étape d'hybridation à 52°C pendant 1 min et une étape d'élongation 72°C pendant 20 secondes).
Ce fragment nucléotidique code pour le peptide correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID N°8 : AIEKYLQDQA RLNSWGCAFR QVC. • la reconnaissance des anticorps anti-HIV- 1 (groupe M ; gp^O) :
La séquence SEQ ID N°9 est issue de la souche virale HIV-l groupe M (clone de référence HXB2) et correspond à la séquence suivante :
SEQ ID N°9 : GGA GGA GGA GAT ATG AGG GAC AAT TGG AGA AGT GAA TTA TAT AAA TAT AAA GTA GTA AAA ATT GAA CCA TTA GGA GTA GCA CGCACCAAG.
Cette séquence est amplifiée par PCR par l'utilisation d'amorces d'amplification spécifiques (amorce sensé 5' GTC TGC TCG AGC GGT TCT GGA GGA GGA GAT ATG AGG 3' et amorce antisens 5' ACG TCC TGC AGA CTT GGT GGG TGC TAC TCC 3' ; 17 cycles de PCR sont réalisés comprenant à chaque cycle une étape de dénaturation à 94°C pendant 1min, une étape d'hybridation à 52°C pendant 1 min et une étape d'élongation à 72°C pendant 20 secondes). Ce fragment nucléotidique code pour le peptide correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID N°10 : GGGDMRDNWR SELYKYKWK IEPLGVAPTK
b) des régions de liaisons, entre chacune des régions epitopiques citées précédemment, permettant :
• au niveau nucléotidique l'introduction de six sites de coupure par des enzymes de restriction pouvant être utilisés pour modifier, retirer ou ajouter un domaine épitopique, et
• au niveau protéique, l'obtention de régions d'espacement, flexibles, assurant une meilleure accessibilité des anticorps potentiels à chacun des domaines.
Ainsi, la séquence nucléotidique SEQ ID N°l 1 : G AGC TCC GGT TCA GGC permet l'obtention d'un site de coupure par l'enzyme Sac I (indiqué en gras), le G indiqué en italique, étant la dernière base de la séquence nucléotidique codant le peptide permettant la reconnaissance des anticorps anti HIV-l, groupe M. Cette séquence code la région flexible correspondant au peptide de séquence SEQ ID N°12 : SSG SG.
La séquence nucléotidique SEQ ID N°13 : CTCG AGC GGT TCT permet l'obtention d'un site de coupure par l'enzyme Xho I (indiqué en gras), le C indiqué en italique, étant la dernière base de la séquence nucléotidique codant le peptide permettant la reconnaissance des anticorps anti HIV-2. Cette séquence code la région flexible correspondant au peptide de séquence SEQ ID N°14 : SSGS.
La séquence nucléotidique SEQ ID N°15 : TCT GCA GGC permet l'obtention d'un site de coupure par l'enzyme Pst I (indiqué en gras). Cette séquence code la région flexible correspondant au peptide de séquence SEQ ID N° 16 : SAG La séquence nucléotidique SEQ ID N°17 : AAA GCT TCC permet l'obtention d'un site de coupure par l'enzyme Hind III (indiqué en gras). Cette séquence code la région flexible correspondant au peptide de séquence SEQ ID N° 18 : KAS. Les séquences SEQ ID N°19 : ATG AGG GGA TCC et SEQ ID N°20 TGA TCT AGA permettent respectivement d'obtenir un site de coupure par l'enzyme BamHl (indiqué en gras) et un site de coupure par l'enzyme Xbal permettant l'insertion ou l'extraction de la totalité de la séquence codant la protéine recombinante selon l'invention dans un plasmide. c) une région de fixation et permettant la purification de la protéine recombinante chimérique : une séquence hexahistidine est ajoutée en C-terminal afin de faciliter ultérieurement l'étape de purification de la protéine recombinante chimérique. Ce peptide, codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°21 : CAC CAT CAC CAT CAC CAT, correspond à la séquence SEQ ID N°22 : HHHHHH. A titre indicatif, cette région de fixation particulière, comprenant une succession d'histidine, permet notamment la fixation orientée de la protéine recombinante sur un support constitué de silice ou d'oxydes métalliques, tel que décrit dans le brevet FR-B- 98/04879.
L'ordre des séquences codant les différentes régions epitopiques immunodominantes de la protéine recombinante chimérique peut être éventuellement modifié. Certains épitopes peuvent être présentés plusieurs fois au sein de la protéine recombinante chimérique. Les épitopes peuvent également présenter des variations par rapport aux séquences décrites dans l'exemple ci dessus selon le sous type ou le clone HIV qu'ils représentent. La longueur des régions de liaison peut également être modifiée pour améliorer l'accessibilité d'un épitope. Enfin, les régions de fixation peuvent être insérées au sein des régions de liaisons.
Ainsi, les inventeurs ont mis en évidence que des séquences epitopiques plus courtes que celles décrites précédemment peuvent également être utilisées. Ces séquences permettent :
• la reconnaissance des anticorps anti-HIV- 1 (groupe M). : La séquence SEQ ID N°27 est issue de la souche virale HIV-l groupe M (clone de référence HXB2) et correspond à la séquence suivante :
SEQ ID N°27 : GAA AGA TAC CTA AAG GAT CAA CAG CTC CTA GGG ATT
TGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACG
Ce fragment nucléotidique code pour le peptide correspondant à la séquence en acides aminés SEQ JX) N°28 : ERYLKDQQLL GIWGCSGKLI CTT.
• la reconnaissance des anticorps anti-HIV- 1 (groupe O ; gp41) : La séquence SEQ ID N° 29 correspond à une séquence ADN artificielle, conçue à partir de la séquence en acide aminé de la souche virale HIV-l groupe O [clone ANT70].
Cette portion synthétique a été conçue en sélectionnant des codons dont l'utilisation est favorable à l'expression de gène chez E. coli. La séquence est la suivante : SEQ ID N° 29 : GAA ACC CTG CTT CAG AAC CAA CAG CTG CTT TCT CTG
TGGGGTTGCAAAGGTAAGCTGGTTTGCTACACC
Ce fragment nucléotidique code pour le peptide correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID N°30 : ETLLQNQQLL SLWGCKGKLV CYT. • la reconnaissance des anticorps anti-HιV-2 (gp36) : La séquence SEQ ID N°31 est issue de la souche virale HIV-2 (clone de référence
ROD) et correspond à la séquence suivante :
SEQ ID N°31 : CTA AAT TCA TGG GGA TGT GCG TTT AGA CAA GTC TGC
Ce fragment nucléotidique code pour le peptide correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID N°32 : LNSWGCAFR QVC
De plus, les inventeurs ont également utilisés les régions de liaisons suivantes :
• la séquence nucléotidique SEQ JX> N°41 CTG CAC CAT ATC CTG GAA GCC CAG CGT ATG GAA TGG CAC CCG CAC AAA GGT TCT GGA TCC qui correspond à la séquence en acides aminés SEQ ID N°42 LHHILEAQRM EWHPHKGSGS
• la séquence nucléotidique SEQ ID N°43 CTG CAC CAT ATC CTG GAG GCT CAA CGT ATG GAG TGG CGC GAA TCC CAT GGT qui correspond à la séquence en acides aminés SEQ ID N°44 LHHILEAQRM EWRESHG
• la séquence nucléotidique SEQ ID N° 45 GGT CTG AAC GAC ATC CTG GAA GCC CAG CGT ATG GAA TGG CAC GAG TCT GCA GGC qui correspond à la séquence en acides aminés SEQ J£> N°46 GLKDILEAQR MEWHESAG . la séquence nucléotidique SEQ ID N°47 CTG AAC GAT ATT TTC GAA GCG CAG CGT ATT GAA TGG CAT GAG GGT TCT GGA TCC qui correspond à la séquence en acides aminés SEQ ID N°48 LNDIFEAQRI EWHEGSGS Le remplacement d'une arginine par une lysine au sein d'une région de liaison telle que définie ci dessus permet la fixation d'une biotine qui permet d'obtenir une région de fixation au sein de la région de liaison.
Les inventeurs ont ainsi utilisés les séquences suivantes qui permettaient non seulement de lier les régions epitopiques entre elles mais également de fixer la protéine recombinante chimérique selon l'invention sur un support, ou de faciliter sa purification. Ainsi, les inventeurs ont également utilisés les régions de liaisons suivantes :
• la séquence nucléotidique SEQ ID N°33 CTG CAC CAT ATC CTG GAA GCC CAG AAA ATG GAA TGG CAC CCG CAC AAA GGT TCT GGA TCC qui correspond à la séquence en acides aminés SEQ ID N°34 LHHILEAQKM EWHPHKGSGS
• la séquence nucléotidique SEQ ID N°35 CTG CAC CAT ATC CTG GAG GCT CAA AAG ATG GAG TGG CGC GAA TCC CAT GGT TCC CAT GGT qui correspond à la séquence en acides aminés SEQ ID N°36 LHHILEAQKM
EWRESHG
• la séquence nucléotidique SEQ J£> N°37 GGT CTG AAC GAC ATC CTG GAA GCC CAG AAA ATG GAA TGG CAC GAG TCT GCA GGC qui correspon à la SEQ ID N°38 GLKDILEAQK MEWHESAG • la séquence nucléotidique SEQ ID N°39 CTG AAC GAT ATT TTC GAA GCG
CAG AAG ATT GAA TGG CAT GAG GGT TCT GGA TCC qui correspond à la séquence en acides aminés SEQ ID N°40 LND EAQKI EWHEGSGS
Les séquences présentées ci dessus ont permis la construction de la protéine recombinante chimérique bHIV86.
Ainsi, la séquence nucléotidique SEQ ID N°49 a été conçue pour coder une protéine recombinante selon l'invention, et clonée dans un vecteur d'expression. SEQ ID N°49: ATG AGG GGA TCT CTG CAC CAT ATC CTG GAA GCC CAG AAA ATG GAA TGG CAC CCG CAC AAA GGT TCT GGA TCC GAA AGA TAC CTA AAG GAT CAA CAG CTC CTA GGG ATT TGG GGT TGC TCT GGA AAA CTC ATT TGC ACC ACG AGC TCC CTG CAC CAT ATC CTG GAG GCT CAA AAG ATG GAG TGG CGC GAA TCC CAT GGT CTA AAT TCA TGG GGA TGT GCG TTT AGA CAA GTC TGC TCG AGC GGT CTG AAG GAC ATC CTG GAA GCC CAG AAA ATG GAA TGG CAC GAG TCT GCA GGC GAA ACC CTG CTT CAG AAC CAA CAG CTG CTT TCT CTG TGG GGT TGC AAA GGT AAG CTG GTT TGC TAC ACC AAA GCT TCC CAC CAT CAC CAT CAC CAT TGA TCT AGA
La protéine recombinante chimérique codée par la séquence SEQ JO N°50 est la suivante :
SEQ ID N°50 : MRGSLHHILE AQKMEWHPHK GSGSERYLKD QQLLGIWGCS GKLICTTSSL HHILEAQKME WRESHGLNSW GCAFRQVCSS GLKDILEAQK
MEWHESAGET LLQNQQLLSL WGCKGKLVCY TKASHHHHHH
Les régions epitopiques sont indiquées en gras, la région de fixation en italique et les régions de liaisons en non gras non italique.
De même, les séquences présentées précédemment ont permis la construction de la protéine recombinante chimérique bHIV98 dans laquelle la séquence hexa histidine a été déplacé en N terminal, afin de faciliter sa purification. Ainsi, la séquence nucléotidique SEQ ID N°51 a été conçue pour coder une protéine recombinante selon l'invention, et clonée dans un vecteur d'expression.
SEQ ID N°51: ATG AGG GGA TCT CAC CAT CAC CAT CAC CAT GGT CTG AAC GAT ATT TTC GAA GCG CAG AAG ATT GAA TGG CAT GAG GGT TCT GGA TCC GAA AGA TAC CTA AAG GAT CAA CAG CTC CTA GGG ATT TGG GGT TGC TCT GGA AAA CTC ATT TGC ACC ACG AGC TCC CTG CAC CAT ATC CTG GAG GCT CAA AAG ATG GAG TGG CGC GAA TCC CAT GGT CTA AAT TCA TGG GGA TGT GCG TTT AGA CAA GTC TGC TCG AGC GGT CTG AAG GAC ATC CTG GAA GCC CAG AAA ATG GAA TGG CAC GAG TCT GCA GGC GAA ACC CTG CTT CAG AAC CAA CAG CTG CTT TCT CTG TGG GGT TGCAAA GGTAAG CTGGTTTGCTACACCTGAAGCTT La protéine recombinante chimérique codée par la séquence SEQ ID N°52 est la suivante :
SEQ ID N°52 : MRGSHHHHHH GLNDIFEAQK lEWHEGSGSE RYLKDQQLLG IWGCSGKLIC TTSSLHHILE AQKMEWRESH GLNSWGCAFR QVCSSGLKDI LEAQKMEWHE SAGETLLQNQ QLLSLWGCKG KLVCYT.
Les régions epitopiques sont indiquées en gras, la région de fixation en italique et les régions de liaisons en non gras non italique.
Exemple 2 : Expression et purification des protéines recombinantes chimériques b-HIV 72, b-HIV86 et b-HIV98 de l'exemple 1
La première étape consiste à insérer la séquence SEQ ID N°l (exemple 1), dans un vecteur d'expression (pMR) puis à transformer une bactérie E. coli (souche BL21) avec la construction plasmidique obtenue selon un protocole classique de clonage connu de l'homme du métier. Les bactéries transformées sont sélectionnées grâce à leur résistance à l'ampicilline portée par le vecteur pMR.
Un clone de bactérie recombinante est alors sélectionné pour ensemencer une préculture de 40 ml de milieu 2x YT (tryptone 16 g/1 ; yeast extract 10 g/1 ; NaCl 5 g/1, pH 7,0) contenant 100 μg/ml ampicilline. Après 15 à 18h d'incubation à 37°C sous agitation à 250 rpm, cette préculture est utilisée pour ensemencer 1 litre de milieu 2xYT contenant 2 % glucose et 100 μg/ml ampicilline. Cette culture est incubée à 37°C sous agitation à 250 rpm. Lorsque la DO600 nm a atteint 0,7-0,9, de l'IPTG (isopropyl-β-D- thiogalactoside, Eurogentec) est ajouté à 0,5 mM final dans le milieu de culture et la culture est poursuivie pendant 4 h. L'IPTG permet d'induire l'expression de la protéine chimérique recombinante SEQ ID N°2, N°50 ou N°52 qui s'accumule dans les bactéries sous forme de corps d'inclusion. Après 4 h d'induction, la culture est centrifugée à 6000 rpm pendant 30 min à 4°C et le culot de bactéries est congelé à - 80°C.
Afin d'extraire la protéine recombinante des corps d'inclusion, les bactéries décongelées sont lysées. Pour cela, les culots de bactéries correspondant à une culture d'un litre sont repris dans 100 ml de tampon de lyse (PBS IX contenant des inhibiteurs de protéases : lysozyme : 1 mg/ml ; benzonase : 2,5 unités par ml (Novagen®) et Mg : 1 mM) en vortexant jusqu'à obtenir une suspension homogène. Cette solution est incubée 1 heure à température ambiante sous agitation. La solution est ensuite centrifugée 30 min à 4°C à 10000 g. Le culot obtenu contient les corps d'inclusion. Ce culot est mis en suspension dans 50 ml de tampon de solubilisation (bicarbonate de sodium : 40 mM ; NaCl : 300 mM ; SDS : 1% ; β-mercaptoethanol : 20 mM, pH 9,6) contenant des inhibiteurs de protéases (complète EDTA-free, Roche®). La solution ainsi obtenue est incubée 16 à 18 h sous agitation entre 18 et 25°C. Elle est ensuite diluée au quart avec un tampon PBS 2X contenant 8 mM d'imidazole et des inhibiteurs de protéases (complète EDTA-free, Roche®) à pH 8,0. Une centrifugation à 10 000 g pendant 30 min à 20°C permet d'obtenir un surnageant limpide, qui est filtré sur filtre 0,45 μ et purifié par chromatographie d'affinité sur une colonne de chélation de métaux (matrice nickel- nitrilotriacetic acid (Ni-NTA, Qiagen). Les 200 ml d'échantillon sont déposés (1 ml/min) à 18-25°C sur une colonne de 8 ml de gel Ni-NTA équilibrée en tampon Al (PBS 2X, urée 4 M, imidazole 6 mM, pH 7,8 contenant β-mercaptoethanol 5 mM) ou A2 (PBS 2X, SDS 0.25 %, imidazole 6 mM, pH 7,8 contenant β-mercaptoethanol 5 mM). La colonne est ensuite lavée en tampon Al ou A2, jusqu'à obtention en sortie de colonne d'une DO280nm =0. L'élution de la protéine recombinante est obtenue par application d'un tampon Bl (PBS 2X, urée 4M, imidazole 100 mM, pH 7,5, contenant β-mercaptoethanol 5 mM) ou B2 (PBS 2X, SDS 0.25%, imidazole 100 mM, pH 7,5, contenant β-mercaptoethanol 5 mM).
Des quantités de l'ordre de 50 mg de protéine recombinante purifiée peuvent être obtenues à partir d'un litre de culture. La protéine recombinante ainsi purifiée est soumise à un traitement dénaturant par addition de SDS (1500 molécules par molécule de protéine recombinante), DIT 5 mM, bicarbonate de sodium 50 mM au pH 9,6 et chauffage 30 min à 37°C. La stockiométrie molécules de SDS/ molécules de protéine recombinante peut être modifiée (idéalement diminuée si la durée ou température de chauffage est augmentée). Par exemple, des résultats similaires sont obtenus par addition de 250 molécules de SDS/molécule de protéine recombinante, DTT 5 mM, bicarbonate de sodium 50 mM au pH 9.6 et chauffage 2 heures à 40°C. La protéine ainsi dénaturée est stabilisée par addition de Polyethylène glycol (MW 3350 en particulier) pour une stockiométrie de 10 molécules de PEG par molécule de protéine puis dialysée à 4°C pendant 18 à 24 heures contre un tampon bicarbonate de sodium 50mM, EDTA ImM, SDS 0,01%, PEG 1 mg/1, pH 9,6. L'expression et la purification des protéines recombinantes chimériques b-HIV86 et b- HIV98 ont été réalisées d'une manière comparable, à l'exception de l'étape de dénaturation par SDS et DTT, qui n'est pas nécessaire lors de la purification des protéines b-HIV86 et b-HIV98. L'emploi de beta mercaptoéthanol dans les tampons de purification n'est pas nécessaire non plus.
Exemple 3 : Evaluation et validation de la protéine recombinante chimérique b- HTV 72, bHIV 86 et b-HIV98 dans un test VIDAS® (bioMérieux)
Cette validation est réalisée en test VIDAS® par l'utilisation d'une solution de protéine chimérique recombinante obtenue selon les exemples 1 et 2 et ayant subit le traitement dénaturant décrit dans l'exemple 2.
Le principe du test VIDAS® est le suivant: un cône constitue le support solide qui sert également de système de pipetage pour les réactifs présents dans la barrette. La protéine recombinante est fixée sur le cône. Après une étape de dilution, l'échantillon est aspiré et refoulé plusieurs fois à l'intérieur du cône. Ceci permet aux IgG anti-VIH de l'échantillon de se lier à la protéine recombinante. Les composants non liés sont éliminés par lavage. Un anticorps anti-IgG humaines conjugué à la phosphatase alcaline (PAL) est alors incubé dans le cône où il se fixe aux IgG anti-VIH. Des étapes de lavage éliminent le conjugué non fixé. Pendant la dernière étape de révélation, le substrat de la PAL, le 4-méthyl-ombelliferyl phosphate, est hydrolyse en 4-méthyl-ombelliferone dont la fluorescence émise à 450 nm est mesurée. L'intensité de la fluorescence est mesurée par le système optique du Vidas® et est proportionnelle à la présence d'IgG anti-VIH présents dans l'échantillon. Les résultats sont analysés automatiquement par le VIDAS® et exprimés en RFV (Relative Fluorescent Value). Dans cet exemple, une solution de protéine recombinante obtenue selon les exemples 1 et 2, (1,2 μg dans un millilitre de tampon bicarbonate de sodium 50 mM, SDS 0,01%, pH 9,6-9,8) est incubée avec les cônes VIDAS® 18 à 24 h à température ambiante (120 μl/cône). Les cônes sont ensuite incubés dans un tampon de passivation (330 μl/cône de tampon HIV Duo contenant 3 % de sérum de veau) pendant 18 à 24 h à température ambiante Des solutions tests (Etablissement Français du Sang, France), de sérologie HIV connue, (28 μl de sérum, de statut HIV connu, dilué dans 300 μl de tampon PBS 1 X, NaCl 8,76 g/1, tween 20 2,5 % (v/v), lait écrémé en poudre 2,5 g/1, albumine 20 g/1, et 3 % (v/v) sérum de veau, pH 6,1) sont alors mis en contact avec les cônes présentant les protéines recombinantes de l'exemple 1, pendant 13 min et 20 secondes (80 cycles de pipettage/refoulement de 10 secondes). Une étape de lavage est ensuite effectuée en tampon Tris 24,23 g/1, acide maléique 23,22 g/1, tween 20 0,05% (v/v), NaOH 6 g/1, NaCl 8,77 g/1, pH 6,1. Une solution d'anticorps anti-Fc humain conjugué à la PAL (P5F2F7) et dilué au l/5000emc est incubée au contact du cône pendant 5 min (avec 30 cycles de pipettage /refoulement de 10 secondes chacun). Une dernière étape de lavage est réalisé en tampon HIV Duo, avant l'étape finale de révélation.
Les résultats obtenus, sont exprimés en RFV (Relative Fluorescent Value). Les valeurs RFV supérieures ou égales à 250 sont arbitrairement considérées comme provenant d'un sérum HIV séro positifs. Les valeurs inférieures sont négatives. Les résultats obtenus avec la protéine recombinante obtenue selon les exemples 1 et 2, sont tous en accord avec la sérologie HIV, préalablement déterminée par le test VIDAS HIV Duo® (bioMérieux®).
L'utilisation d'une telle protéine recombinante en test VIDAS® permet bien de déterminer la sérologie HIV des échantillons.
Tableau 1 - Validation expérimentale de la protéine recombinante b-HTV72 obtenue selon les exemples 1 et 2
Figure imgf000022_0001
Des résultats comparables ont été obtenus avec les protéines recombinantes chimériques b-ffiV86 et b-fflV98.
Exemple 4 : Construction d'une protéine recombinante biotinylée Une séquence consensus de biotinylation in vivo dans E.coli telle que décrite par Schatz, (Bio/technology, vol. 11, 1993) peut être fusionnée à la SEQ ID n°2 L'addition de la séquence SEQ ID N°23 : 5' CTG CAC CAT ATC CTG GAA GCC CAG AAA ATG GAA TGG CAC CCG CAC, codant le peptide de séquence SEQ ID N°24 : LHHILEAQKM EWHPH, permet la biotinylation de la protéine recombinante b HIV72 obtenue selon les exemples 1 et 2 afin d'utiliser une protéine avidine conjuguée à une enzyme pour la phase de révélation dans un test EIA.
Les conditions d'expression et purification décrites dans l' exemples 2 restent valides avec quelques modifications. Les bactéries transformées avec le plasmide recombinant peuvent être de type BL21 ou AVB101 (Avidity, LLC). Le milieu de culture utilisé pour l'expression peut être de type : 2x YT (tryptone 16 g/1 ; yeast extract 10 g/1 ; NaCl 5 g/1, pH 7,0) contenant 100 μg/ml ampicilline et supplémenté par 12 μg par ml de biotine.
Exemple 5 : Evaluation et validation de la protéine recombinante chimérique biotinylée in vivo tel que décrite dans l'exemple 4 dans un test VIDAS® de type sandwich.
Cette validation est selon un protocole VIDAS® décrit dans l'exemple 3 et modifié comme suit : la protéine chimérique recombinante bHIV-72, non biotinylée obtenue selon l'exemple 1 est fixée sur la phase solide (cône VIDAS®) comme décrit dans l'exemple 3. Après incubation de l'échantillon dilué avec le cône puis lavage, les Ig G anti HIV liées aux cônes sont incubées avec une protéine chimérique recombinante biotinylée in vivo et obtenue selon l'exemple 4. Après lavage, les protéines recombinantes biotynylées fixées sur le cône réagissent avec une solution de streptavidine conjugué à la PAL. L'étape finale de révélation est conforme à la description de l'exemple 3. Les résultats sont présentés dans le tableau 2. Les valeurs RFV supérieures ou égales à 250 sont arbitrairement considérées comme positives. L'utilisation d'une telle protéine recombinante en test VIDAS® permet bien de déterminer la sérologie HIV des échantillons.
Tableau 2 - Validation expérimentale de la protéine recombinante obtenue selon les exemples 4 et 5
Figure imgf000024_0001
Exemple 6 : Evaluation et validation des protéine recombinante chimérique bHIV- 86 et bHIV-98 dans un test VTDAS® de type sandwich.
La présence de la séquence SEQ ID N°33, 35 37 ou 39 codant respectivement les peptides SEQ ID N°34, 36, 38 et 40 permet aux protéines bHlV86 et bHIV98 d'être biotinylées in vivo, d'une façon comparable a ce qui est décrit dans l'exemple 4.
Cette validation est selon un protocole VIDAS® décrit dans l'exemple 3 et modifié comme suit : la protéine chimérique recombinante bHIV-72, non biotinylée obtenue selon l'exemple 1 est fixée sur la phase solide (cône VIDAS®) comme décrit dans l'exemple 3. Après incubation de l'échantillon dilué avec le cône puis lavage, les Ig G anti HIV liées aux cônes sont incubées avec une protéine chimérique recombinante biotinylée in vivo (bHIV-86 ou bHIV-98). Après lavage, les protéines recombinantes biotynylées fixées sur le cône réagissent avec une solution de streptavidine conjugué à la PAL. L'étape finale de révélation est conforme à la description de l'exemple 3. Des résultats comparables à ceux décrits dans l'exemple 5 ont été obtenues avec les protéines bHIV-86 et bfflV-98.
Exemple 7 : Amélioration de la sensibilité de la protéine recombinante chimérique Afin d'augmenter encore la sensibilité de reconnaissance des anticorps anti-HIV de la protéine recombinante obtenue selon l'invention de nouveaux épitopes caractéristiques de certains sous-types HIV peuvent être ajoutés ou un des épitopes décrit peut être dupliqué dans la séquence de la protéine chimérique.
Exemple 8 : Addition d'une séquence hexalysine à la protéine recombinante pour faciliter le couplage d'une enzyme ou de biotine, notamment sur la fonction β- aminé de la lysine.
Une séquence codant pour six lysines peut être fusionnée en 3' de la SEQ ID n°2. L'addition de la séquence ADN SEQ ID n°25: AAG AAA AAG AAA AAG AAA, codant pour le peptide de séquence SEQ ID n°26 : K-KLKKKK, permet le couplage orienté d'enzyme ou biotine en C-terminal de la protéine chimérique. Le couplage de cette protéine recombinante à la phosphatase alcaline en particulier permet l'utilisation de la protéine couplée dans un format sandwich de révélation des anticorps anti-HIV.

Claims

REVENDICATIONS
1. ADN recombinant codant une protéine recombinante chimérique comprenant
• au moins deux premiers fragments nucléotidiques codant chacun une région épitopique du virus HIV-l de groupe M ou de groupe O ou le virus fflV-2
• au moins un deuxième fragment nucléotidique codant une région de liaison,
• au moins un troisième fragment nucléotidique codant une région de fixation caractérisé en ce que chaque premiers fragments nucléotidiques code au moins une région immunodominante de la glycoprotéine gp 120 d' HIV-l, de la glycoprotéine gp 41 d'HIV-l de groupe M, de la glycoprotéine gp 41 d'HIV-1 de groupe O ou de la glycoprotéine gp 36 d'HFV-2.
2. ADN, selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit premier fragment nucléotidique a pour séquence l'une quelconque des séquences SEQ ID N°3, SEQ ID N°5, SEQ ID N°7, SEQ ID N°9, SEQ ID N°27, SEQ ID N°29 ou SEQ Œ> N°31.
3. ADN recombinant, selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit deuxième fragment nucléotidique comprend au moins un site de coupure.
4. ADN recombinant, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit deuxième fragment nucléotidique a pour séquence au moins l'une quelconque des séquences suivantes, prises seules ou en combinaison, SEQ ID N°ll SEQ ID N°13, SEQ ID N°15, SEQ ID N°17, SEQ ID N°19, ou SEQ ID N°20, SEQ ID N°33, SEQ ID N°35, SEQ ID N°37, SEQ ID N°39, SEQ ID N°41, SEQ ID N°43 SEQ ID N°45, ou SEQ ID N°47
5 ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que ledit troisième fragment nucléotidique codant une région de fixation est inclus dans ledit deuxième fragment nucléotidique codant une région de liaison.
6 ADN, selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit troisième fragment nucléotidique a pour séquence l'une quelconque des séquences SEQ ID N°21, SEQ ID N° 23, SEQ ID N°25, SEQ ID N°33, SEQ ID N°35, SEQ ID N°37 ou SEQ ID N039.
7. Protéine recombinante chimérique codée par un ADN recombinant, selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant
• au moins deux régions epitopiques du virus HIV-l de groupe M ou de groupe O ou le virus HIV-2,
• au moins une région de liaison • au moins une région de fixation.
8. Protéine, selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite région de liaison est un peptide comprenant au moins une glycine et/ou au moins une serine.
9. Protéine, selon la revendication 8, caractérisée en ce que ladite région de liaison a pour séquence l'une quelconque des séquences SEQ ID N° 12, SEQ ID N°14, SEQ ID N°16 ou SEQ ID N°18, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48.
10. Protéine, selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite région de fixation est une région riche en histidines et ses dérivés, tel qu'une région contenant une densité d'histidines, supérieure ou égale à 25%, et préférentiellement supérieure ou égale à 33%.
11. Protéine selon la revendication 7 caractérisée en ce que ladite région de fixation est un peptide comprenant au moins une lysine.
12. Protéine selon la revendication 7 caractérisée en ce que ladite région de fixation a pour séquence SEQ ID N°22, 24 , 26, 34, 36, 38 ou 40.
13. Vecteur d'expression comprenant un ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.
14 Utilisation d'au moins un ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 et/ou d'au moins une protéine recombinante chimérique selon l'une quelconque des revendications 7 à 12 pour le diagnostic in vitro.
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