CN111587291A - 用于快速有效捕获抗原的蛋白质 - Google Patents
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Abstract
本公开内容涉及包含用于检测目的靶标的靶标结合结构域的蛋白质、其方法、组合物和试剂盒。
Description
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2017年10月13日提交的美国临时申请No.62/572,392的优先权，其整体通过引用并入本文。
政府支持
本发明在由国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授予No.P30 CCA14051的政府支持下完成。政府在本发明中具有一定的权利。
技术领域
本文中公开了用于检测目的靶标的方法和组合物。
背景技术
在典型诊断测定的抗原稀释条件下，尚未捕获的每个靶分子均表示潜在结合信号的丢失，并直接降低了诊断灵敏度(Kelley et al.，2014；Rissin et al.，2013)。鉴于免疫测定的信噪比与结合分析物的摩尔丰度成正比，必须开发一般策略来增强靶标捕获的效率，以提高任何给定诊断平台的最大可实现灵敏度。
发明概述
在一些方面中，本公开内容涉及使用双功能融合蛋白构建体用于在免疫测定中增强靶标捕获效率的一般策略的开发，所述双功能融合蛋白构建体并入基底锚固部分(例如，用于使抗原结合蛋白(例如，Sso7d、减电荷Sso7d(reduced charge Sso7d，rcSso7d))高丰度固定化的纤维素结合结构域(cellulose binding domain，CBD))。该方法利用伪一阶速率常数模型，以及使用由rcSso7d结合蛋白和CBD组成的融合构建体(rcSso7d-CBD融合蛋白)在基于纸测定形式中进行测试。本文中所述的rcSso7d-CBD融合蛋白能够使抗原结合蛋白(例如，rcSso7d)定向、高密度且快速地吸附至含纤维素基底。
根据一些方面，本文中提供了双功能融合蛋白，其包含纤维素结合结构域(CBD)或碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding module，CBM)和经工程化的减电荷Sso7d(rcSso7d)抗原结合蛋白。
在一些实施方案中，经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白的C端与CBD的N端连接。
在一些实施方案中，经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白通过接头与CBD连接。在一些实施方案中，接头是Gly-Ser接头。
在一些实施方案中，经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白包含链霉抗生物素蛋白结合结构域。在一些实施方案中，rcSso7d抗原结合蛋白包含结核抗原结合结构域、黄病毒(Flavivirus)非结构性1(non-structural 1，NS1)结合结构域、白介素6(interleukin-6，IL-6)结合结构域或荧光团结合结构域。在一些实施方案中，结核抗原结合结构域包含Rv1656结合结构域。
在一些实施方案中，rcSso7d抗原结合蛋白包含来自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)SEQ ID NO：3的氨基酸序列的至少85％。
在一些实施方案中，CBD是3a型CBD或1型二聚化纤维素结合结构域(dimerizedcellulose binding domain，dCBD)。在一些实施方案中，3a型CBD是来自热纤梭菌(Clostridium thermocellum)的蛋白质CipA的结构域。
根据一些方面，本文中提供了用于检测目的抗原的方法。在一些实施方案中，该方法包括使本文中所述的任何双功能融合蛋白与含纤维素基底接触足以使双功能融合蛋白与含纤维素基底结合的时间；使与含纤维素基底结合的双功能融合蛋白与包含目的抗原的样品接触；以及检测由经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白结合的目的抗原。
在一些实施方案中，双功能融合蛋白在溶液中。在一些实施方案中，溶液包含缓冲剂。
在一些实施方案中，样品是生物样品。
在一些实施方案中，双功能融合蛋白摩尔过量于目的抗原。在一些实施方案中，双功能融合蛋白至少10倍摩尔过量于目的抗原。在一些实施方案中，目的抗原是结核抗原。在一些实施方案中，目的抗原是Rvl656或链霉抗生物素蛋白。
在一些实施方案中，至少50％的目的抗原从样品中消耗(depleted)。
在一些实施方案中，含纤维素基底是纸或硝酸纤维素。在一些实施方案中，含纤维素基底是色谱纸。在一些实施方案中，色谱纸是未改性的。
在一些实施方案中，该方法还包括在检测被经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白结合的目的抗原之前，将含纤维素基底用缓冲溶液清洗。
在一些实施方案中，样品是来自对象的生物样品。在一些实施方案中，对象是哺乳动物。在一些实施方案中，对象是人。
在一些实施方案中，CBD与含纤维素基底结合。
在一些实施方案中，经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白与结核抗原结合。在一些实施方案中，经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白与Rv1656结合或与链霉抗生物素蛋白结合。
根据一些方面，本文中提供了用于检测目的抗原的方法。在一些实施方案中，该方法包括使本文中所述的任何双功能融合蛋白与包含目的抗原的样品接触，其中所述目的抗原与所述双功能融合蛋白结合并且形成复合体；使复合体与含纤维素基底接触足以使复合体与含纤维素基底结合的时间；以及检测由经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白结合的目的抗原。
在一些实施方案中，双功能融合蛋白在溶液中。在一些实施方案中，溶液包含缓冲剂。
在一些实施方案中，样品是生物样品。
在一些实施方案中，双功能融合蛋白摩尔过量于目的抗原。在一些实施方案中，双功能融合蛋白至少10倍摩尔过量于目的抗原。在一些实施方案中，目的抗原是结核抗原。在一些实施方案中，目的抗原是Rv1656或链霉抗生物素蛋白。
在一些实施方案中，至少50％的目的抗原从样品中消耗。
在一些实施方案中，含纤维素基底是纸或硝酸纤维素。在一些实施方案中，含纤维素基底是色谱纸。在一些实施方案中，色谱纸是未改性的。
在一些实施方案中，该方法还包括在检测被经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白结合的目的抗原之前，将含纤维素基底用缓冲溶液清洗。
在一些实施方案中，样品是来自对象的生物样品。在一些实施方案中，对象是哺乳动物。在一些实施方案中，对象是人。
在一些实施方案中，CBD与含纤维素基底结合。
在一些实施方案中，经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白与结核抗原结合。在一些实施方案中，经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白与Rv1656结合或与链霉抗生物素蛋白结合。
根据一些方面，本文中提供了用于评估样品中目的抗原的存在或量的方法。在一些实施方案中，该方法包括使样品与本文中所述的任何双功能融合蛋白接触，以及测量样品中目的抗原的存在或量。
在一些实施方案中，双功能融合蛋白在溶液中。在一些实施方案中，溶液包含缓冲剂。
在一些实施方案中，样品是生物样品。
在一些实施方案中，双功能融合蛋白摩尔过量于目的抗原。在一些实施方案中，双功能融合蛋白至少10倍摩尔过量于目的抗原。在一些实施方案中，目的抗原是结核抗原。在一些实施方案中，目的抗原是Rv1656或链霉抗生物素蛋白。
在一些实施方案中，至少50％的目的抗原从样品中消耗。
在一些实施方案中，双功能融合蛋白与含纤维素基底结合。在一些实施方案中，含纤维素基底是纸或硝酸纤维素。在一些实施方案中，含纤维素基底是色谱纸。在一些实施方案中，色谱纸是未改性的。
在一些实施方案中，样品是来自对象的生物样品。在一些实施方案中，对象是哺乳动物。在一些实施方案中，对象是人。
在一些实施方案中，CBD与含纤维素基底结合。
在一些实施方案中，经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白与结核抗原结合。在一些实施方案中，经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白与Rv1656结合或与链霉抗生物素蛋白结合。
根据一些方面，本文中提供了组合物。在一些实施方案中，该组合物包含与含纤维素基底结合的本文中所述的任何双功能融合蛋白。
在一些实施方案中，含纤维素基底是纸、硝酸纤维素或纤维素粉末。在一些实施方案中，含纤维素基底是色谱纸。在一些实施方案中，色谱纸是未改性的。
根据一些方面，本文中提供了用于评估抗原的存在或量的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含含有本文中所述的任何双功能融合蛋白的容器。在一些实施方案中，试剂盒包含含有本文中公开的靶标结合蛋白或结构域中的任一个的容器，其中靶标结合蛋白或结构域不是本文中公开的双功能融合蛋白的一部分。
在一些实施方案中，试剂盒还包含含纤维素基底。
在一些实施方案中，双功能融合蛋白与含纤维素基底结合。在一些实施方案中，双功能融合蛋白不与含纤维素基底结合。在一些实施方案中，含纤维素基底是纸、硝酸纤维素或纤维素粉末。在一些实施方案中，含纤维素基底是色谱纸。在一些实施方案中，色谱纸是未改性的。
根据一些方面，本文中提供了用于测定目的抗原的方法。在一些实施方案中，该方法包括使抗原与结合含纤维素基底的本文中所述任何双功能融合蛋白接触，其中双功能融合蛋白以至少10倍或更高摩尔过量于目的抗原或者至少10倍或更高体积平均浓度过量于目的抗原与含纤维素基底结合。在一些实施方案中，双功能融合蛋白至少60倍摩尔过量于目的抗原。
在一些实施方案中，目的抗原是结核抗原。在一些实施方案中，目的抗原是Rv1656或链霉抗生物素蛋白。
在一些实施方案中，含纤维素基底是纸或硝酸纤维素。在一些实施方案中，含纤维素基底是色谱纸。在一些实施方案中，色谱纸是未改性的。
在一些实施方案中，CBD与含纤维素基底结合。
在一些实施方案中，经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白与结核抗原结合。在一些实施方案中，经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白与Rv1656结合或与链霉抗生物素蛋白结合。
在一些实施方案中，本文中公开的任何双功能融合蛋白包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个rcSso7d抗原结合蛋白或抗原结合结构域。在一些实施方案中，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个rcSso7d抗原结合蛋白遗传融合在一起。在一些实施方案中，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个rcSso7d抗原结合蛋白与CBM或CBD直接或间接地连接。
在一些实施方案中，纤维素粉末在溶液中以捕获可溶性分析物、抗原或目的抗原。
根据另一个方面，本文中考虑了经工程化的减电荷Sso7d(rcSso7d)抗原结合蛋白或结构域。
在一些实施方案中，rcSso7d抗原结合蛋白与麦芽糖结合蛋白(maltose bindingprotein，MBP)直接或间接地连接。
在一些实施方案中，rcSso7d还包含生物素接纳体(acceptor)。
根据另一个方面，本文中考虑了用于检测目的抗原的方法。
在一些实施方案中，该方法包括使目的抗原与氧化的纤维素基底接触足以使目的抗原与氧化的纤维素基底结合的时间，使与氧化纤维素基底结合的目的抗原与本文中公开的经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白接触足以使目的抗原与本文中公开的经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白结合的时间，以及检测由经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白结合的目的抗原。
在一些实施方案中，目的抗原用与荧光团缀合的链霉抗生物素蛋白进行检测。
附图简述
以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本公开内容的某些方面，通过与本文中给出的具体实施方案的详细描述组合参考这些附图中的一个或更多个，可更好地理解这些方面。应当理解，附图中举例说明的数据决不限制本公开内容的范围。
图1：rcSso7d.SA-CBD遗传构建体以及该免疫测定形式的相关结合复合体的示意性表示(schematic representation)。CBD：纤维素结合结构域；rcSso7d：来自硫磺矿硫化叶菌的减电荷蛋白Sso7d；SA：链霉抗生物素蛋白；AF-647：Alexa Fluor 647。PDB结构：4JO5(CBD)(Yaniv et al.，2013)；1SSO(Sso7d)；(Baumann et al.，1994)1MEP(SA)(Hyre etal.，2006)。
图2A至2B：解析解(analytical solution)与PFORC模型结果的比较(图2A)。解析模型和PFORC模型在平衡时的配体捕获效率。曲线表示不同初始浓度的配体和受体在平衡时结合的游离配体的比例。(图2B)在解析模型和PFORC模型中实现99％平衡结合所需的计算时间。所有图均使用5.5×10-10M的KD生成。有色三角形表示其中受体浓度等于相关配体浓度的点，以突出这些值附近的局部变化。
图3：初级孵育的时间过程。以30μM的可溶性浓度(180皮摩尔的施加结合剂)，将rcSso7d.SA-CBD与非官能化(non-functionalized，NF)纸接触，以及将rcSso7d.SA与官能化(functionalized，F)和非官能化(NF)纸二者接触30秒至16小时的时间段。在洗涤和基底中和之后，将这些样品随后用10μL的256nM可溶性浓度的SA-AF647(2.56皮摩尔的靶标)进行处理。将所有样品在Cy5通道中使用80ms的曝光时间进行成像并使用相关阴性对照减去背景。误差棒表示四个独立重复的标准差。
图4A至4B：(图4A)rcSso7d.SA/rcSso7d.SA-CBD与(图4B)rcSso7d.Rv1656/rcSso7d.Rv1656-CBD的抗原滴定曲线的比较。将rcSso7d和rcSso7d-CBD物质以20μM的可溶性浓度与其缔合的基底(分别为官能化和非官能化的纤维素)接触标准的孵育时间。将样品集用浓度为256nM至0.25nM的(图4A)SA-E或(图4B)Rv1656b的系列稀释液进行处理。随后将与Rv1656b接触的样品与256nM浓度的SA-E接触。将样品在Texas Red通道中使用1000ms的曝光时间进行成像。将数据集用二阶多项式
rcSso7d.SA：-0.008362x2+3.851x+100.0，r2＝0.9904；rcSso7d.SA-CBD：-0.01059x2+9.899x+100.0.r2＝0.9986；rcSso7d.Rv1656：-0.002774x2+1.229x+100.0，r2＝0.8271；rcSso7d.Rv1656-(CBD：-0.02791x2+14.16x+100.0，r2＝0.9961)进行拟合。将这些数据集的基线校正为100AU的任意值，以能够对信号出现(signal onset)进行比较。误差棒表示四个独立重复的标准差。
图5A至5B：(图5A)对于不同的所施加可溶性浓度的rcSso7d.SA-CBD的SA-E滴定曲线。用一系列可溶性rcSso7d.SA-CBD浓度制备非官能化纤维素测试区集。使所有测试区接触30s并洗涤，并且然后用256nM至0.25nM的SA-E的系列稀释液处理30分钟。将样品在TexasRed通道中使用1000ms的曝光时间进行成像。将数据集用二阶多项式进行拟合。误差棒表示四个独立重复的标准差。(图5B)对于不同所施加浓度的rcSso7d.SA-CBD的检测限。将所有阴性对照样品(其中[SA-E]为256nM至0.25nM)的测量的MFI值求平均以计算167.8AU的保守3σ检测阈值。对于使用不同所施加rcSso7d.SA-CBD浓度处理的每个样品集，使用最佳拟合的二阶多项式线来计算对应于该LOD的抗原浓度。还使用最佳拟合的二阶多项式线以绘制每个数据点的上界和下界(由标准差确定)，并且使用这些界限趋势线以生成由误差棒表示的检测限上的界限。
图6：微BCA(Micro BCA)测定数据表明rcSso7d.SA-CBD在非官能化纤维素上的吸附效率。使用已知质量的所吸附rcSso7d.SA-CBD的标准曲线对rcSso7d.SA-CBD在经洗涤样品上的固定化密度进行定量。将通过该标准曲线评估的实验确定的固定化质量针对已知施加量的rcSso7d.SA-CBD绘图(保留百分比)。误差棒表示四个独立重复的标准差。
图7A至7B：(图7A)中的精确解析解模型与PFORC模型之间的偏差预测了在平衡时的比例配体捕获(proportional ligand capture)，以及(图7B)预测了实现99％的平衡结合所需的时间。所有图均使用Kv＝5.5×10-10(rcSso7d.SA物质的所测量亲和力)生成。三角形表示受体浓度等于对应颜色曲线的配体浓度的点。
图8：rcSso7d的Rv1656结合变体的酵母菌表面展示选择的FACS图。数据点表示20,000个单独酵母菌细胞的所测量荧光。通过Alexa Fluor 488荧光团的表面定位进行定量的rcSso7d支架的全长表面在x轴上呈现。通过Alexa Fluor 64 7荧光团定量的Rv1656结合活性在y轴上呈现。每个象限的拐角均用落入这些界限内的文库群的比例进行标记，并且用于捕获后续子文库的分选设门用捕获的文库群百分比进行标记。还标注了对应于与第二试剂(SA-AF647)结合的群体比例的第二结合。前三轮分选的Rv1656的可溶性浓度为100nM，第四轮为50nM，以及第五轮为25nM。
图9：通过酵母菌表面展示滴定对rcSso7d.Rv1656进行亲和力确定。对于每个样品，将500,000个酵母菌细胞与浓度为256nM至0.25nM的可溶性Rv1656b一起孵育，并用SA-AF647进行标记。捕获每个样品的几何平均荧光强度。每个数据点表示在不同日期进行的三个技术重复的平均值。误差棒表示三个独立重复的标准差。
图10：所有纯化的重组产物的15％SDS-PAGE凝胶。看到rcSso7d.SA和rcSso7d.Rvl656以其理论MW(分别为9.26k.Da和9.33k.Da)以及rcSso7d.SA-CBD和rcSso7d.Rv1656-CBD(分别为27.88k.Da和27.99kDa)运行。观察到生物素化的Rv1656以接近其理论MW35.32k.Da运行，以及观察到蛋白质二聚体为约70k.Da。将Precision Plus蛋白质双色标准液用于蛋白质梯带(protein ladder)。预期的Rv1656分子量与观察到的单体和二聚体的带位置之间的差异可能是由于多个生物素部分的共价添加或所施加的蛋白质样品中甘油的存在引起。
图11A至11B：在干燥、纸固定化形式下于40℃下孵育的rcSso7d.SA、rcSso7d.SA-CBD和可商购获得的链霉抗生物素蛋白结合多克隆抗体的活性保留。将样品在存在5w/v％海藻糖的情况下进行干燥。使显影的样品与256nM SA-AF647接触，并在Cy5通道中以80ms(rcSso7d.SA-CBD)、400ms(pAb-SA)和1000ms(rcSso7d.SA)进行成像。所有数据点均相对于初始结合活性，以及误差棒表示四个独立重复的标准差。(图11A)干孵育样品随时间推移的性能；(图11B)干孵育样品在40℃下孵育四个月之后的性能。
图12：在高CBD浓度下的信号饱和演示。将不同可溶性浓度的rcSso7d.SA-CBD(0.5至250μM)施加至纤维素测试区30分钟。使样品与100nM的SA-AF647接触，并在Cy5通道中以150ms的曝光时间进行成像。尽管似乎在约10μM处发生了抗原消耗，但在较高的施加浓度下观察到荧光团淬灭。这可能是由于rcSso7d.SA-CBD物质在更高表面覆盖下更接近基底，这允许所捕获SA-AF647的亚群足够近地结合从而发生荧光团猝灭。误差棒表示四个独立重复的标准差。
图13：用于对表面固定化的rcSso7d.SA-CBD进行定量的BCA测定数据。对所有样品在562nm处的吸光度进行定量，并且这些值(黑色)与在纤维素表面上蒸发的已知质量的rcSso7d.SA-CBD相关。来自经洗涤的实验样品的吸光度值(浅灰色)拟合至该标准曲线。将标准品用二阶多项式(r2＝0.9978)进行拟合。误差棒表示四个独立重复的标准差。
图14：在不同pH的洗涤条件下，与链霉抗生物素蛋白伊红(SA-E)的非特异性结合和与Rv1656的特异性结合的比较。可溶性浓度为256nM的SA-E和Rv1656b溶液在一系列具有不同pH和离子强度的柠檬酸/磷酸二钠缓冲液(含1％BSA w/v)中制备。将这些溶液施加到用30μM的rcSso7d：Rv1656-CBD处理的纸样品上持续30分钟孵育时期，并且随后在样品组合物的缓冲液中洗涤。随后将用Rv1656b处理的样品用256nM SA-AF647进行处理(未显示非特异性结合)，以评估在这些孵育条件下的靶标特异性结合。将用SA-E和Rv1656b处理的样品分别在Texas Red通道中成像1000ms，以及在Cy5通道中成像100ms，并且相对于在pH 7.5的信号对观察到的结合活性进行定量。误差棒表示四个独立重复的标准差。
图15：对于所有滴定实验中使用的抗原浓度，使用精确解析解生成的理论结合谱。虚线表示测试区体积中rcSso7d.SA-CBD的大约局部浓度，并且显示了在所有配体浓度的抗原消耗方案内的运算(operation)。
图16：来自10μL的256nM SA-AF647样品的抗原消耗。将非官能化纸样品用6μL的30μM rcSso7d.SA-CBD进行处理持续至少三十秒。使用SA-AF647的系列稀释液(0.25至256nM；10μL；30分钟)生成标准结合曲线。选择SA-AF647是因为其低背景信号(IBG＝8.9AU)，以仅通过特异性结合相互作用消耗抗原。将包被有rcSso7d.SA-CBD的测试区与256nM SA-AF647孵育30分钟。然后撤出来自该第一样品集(称为“第一捕获物”)的流通物(flow-through)，并直接施加到第二集(称为“第二捕获物”)。将显影的测试区在Cy5通道中使用80ms的曝光时间进行成像。误差棒表示四个独立重复的标准差。
图17：对于rcSso7d和rcSso7d-CBD的基底预处理、活性物质的制备以及活性物质的功能。
图18：MFI(AU)相对于SA-E浓度(nM)。
图19：1型和3a型rcSso7d-CBD的SA-E滴定。
图20示出了表明黄病毒NS1蛋白结合剂rcSso7d.NS1.1的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图21示出了表明黄病毒NS1蛋白结合剂rcSso7d.NS1.2的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图22示出了表明黄病毒NS1蛋白结合剂rcSso7d.NS1.3的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图23示出了表明黄病毒NS1蛋白结合剂rcSso7d.NS1.4的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图24示出了表明黄病毒NS1蛋白结合剂rcSso7d.NS1.5的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图25示出了表明黄病毒NS1蛋白结合剂rcSso7d.NS1.6的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图26示出了表明人IL-6蛋白结合剂rcSso7d.IL6.1的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图27示出了表明人IL-6蛋白结合剂rcSso7d.IL6.2的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图28示出了表明人IL-6蛋白结合剂rcSso7d.IL6.3的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图29示出了表明人IL-6蛋白结合剂rcSso7d.IL6.4的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图30示出了表明人IL-6蛋白结合剂rcSso7d.IL6.5的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图31示出了表明人IL-6蛋白结合剂rcSso7d.IL6.6的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图32示出了表明人IL-6蛋白结合剂rcSso7d.IL6.7的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图33A示出了在与寨卡病毒(Zika virus)NS1(在不同浓度下)、生物素化的抗寨卡病毒NS1抗体以及链霉抗生物素蛋白-AF 647孵育之后，固定化至纤维素的rcSso7d.NS1.1-CBD构建体的示意性表示。
图33B示出了在基于纤维素纸测定中rcSso7d.NS1.1-CBD的结合剂性能。
图34示出了显示在表达和纯化之后四种蛋白质(rcSso7d.H4、BA-rcSso7d.H4、MBP-rcSso7d.H4和BA-MBP-rcSso7d.H4)的纯度的12％SDS-PAGE凝胶图像。
图35示出了四种蛋白质构建体，包括BA-rcSso7d.H4和BA-MBP-rcSso7d.H4的经抗生物素蛋白纯化前亚群和经抗生物素蛋白纯化后亚群二者的结合剂性能。
图36A示出了显示在表达和纯化之后三种多聚化蛋白质(BA-(rcSso7d.H4)1、BA-(rcSso7d.H4)2和BA-(rcSso7d.H4)3)的纯度的12％SDS-PAGE图像。
图36B示出了固定化至纤维素的TB抗原Rv1656随后孵育BA-(rcSso7d.H4)n和链霉抗生物素蛋白-AF 647的示意性表示。
图36C示出了在基于纤维素纸测定中BA-(rcSso7d.H4)n构建体的结合剂性能。
图37示出了显示H1BA的纯化蛋白制备物的12％SDS-PAGE凝胶。
图38示出了表明H1结合剂rcSso7d.H1BA.1的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图39示出了表明H1结合剂rcSso7d.H1BA.2的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图40A至40C示出了表明H1结合剂rcSso7d.H1BA.3的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图41示出了表明结合剂rcSso7d.H1BA.4(1.E2.3)的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图42示出了表明H1结合剂rcSso7d.H1BA.5(1.E2.4)的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图43示出了表明H1结合剂rcSso7d.H1BA.6的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图44示出了显示H2BA的纯化蛋白制备物的12％SDS-PAGE凝胶图像。
图45示出了表明H2结合剂rcSso7d.H2BA.1的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图46示出了显示H4的纯化蛋白制备物的12％SDS-PAGE凝胶。
图47示出了表明H4结合剂rcSso7d.H4.1的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图48示出了表明H4结合剂rcSso7d.H4.2的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图49示出了表明H4结合剂rcSso7d.H4.3的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图50示出了表明H4结合剂rcSso7d.H4.4的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图51示出了表明H4结合剂rcSso7d.H4.5的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图52示出了表明H4结合剂rcSso7d.H4.6的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图53示出了表明H4结合剂rcSso7d.H4.7的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图54示出了表明H4结合剂rcSso7d.H4.8的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图55示出了表明H4结合剂rcSso7d.H4.9的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图56A至56B示出了表明H4结合剂rcSso7d.H4.2/H4/BA-MBP-rcSso7d.H4.1的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图57示出了显示H6BA的纯化蛋白制备物的12％SDS-PAGE凝胶。
图58A至58B示出了表明H6结合剂rcSso7d.H6BA.1的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图59A至59B示出了表明H6结合剂rcSso7d.H6BA.2的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图60A至60B示出了表明H6结合剂rcSso7d.H6BA.3的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图61示出了显示H7BA和H7的纯化蛋白制备物的12％SDS-PAGE凝胶。
图62示出了表明H7结合剂rcSso7d.H7.1的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图63示出了表明AF647结合剂rcSso7d.AF647.1的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图64示出了表明AF647结合剂rcSso7d.AF647.2的特异性结合活性的流式细胞术数据。
图65A至65B示出了rcSso7d.H4.5-CBD(图65A)和rcSso7d.H4.9-CBD(图65B)的克隆和纯化数据。图65A的序列从上至下对应于SEQ ID NO：122和98。图65B的序列从上至下对应于SEQ ID NO：123和102。
图66A至66D示出了rcSso7d.H4.5-CBD、rcSso7d.H4.9-CBD和rcSso7d.H4.2-CBD的免疫测定性能。图66A至66B示出了所选择克隆的H4结合活性。图66C示出了阳性rcSso7d.H4.E1-BA对照。图66D示出了在rcSso7d.H4.2-CBD完整(1)和与rcSso7d.H4.E1-BA和SA-AF647物质一起预孵育的rcSso7d.H4.2-CBD(4)测定中构建体的示意性表示。
图67示出了针对rcSso7d.SA-CBD和rcSso7d.SA-dCBD的抗原滴定的结果，并显示了使用不同的CBD变体(dCBD)的原理。
图68A至68C示出了用于进一步增强表面丰度的多聚化(rcSso7d.SA)n-CBD。图68A是多聚体示意图。图68B示出了显示用固定化金属亲和色谱法纯化之后1x-、2x-和3x-CBD变体的纯度的12％SDS-PAGE。图68C示出了在抗原捕获测定中使用链霉抗生物素蛋白AlexaFluor 647作为分析物，固定化的rcSso7d-CBD变体的结合剂性能。
图69示出了与大体积组合的rcSso7d.SA-CBD在纤维素粉末上的固定化。图像示出了阴性对照、阳性对照和实验样品的结果。
图70是示出了大体积处理的示意图。
图71示出了显示在不同的体积流量以及不同浓度的结合试剂下的比例分析物渗透(breakthrough)的有限元建模数据。这些曲线描绘了分析物捕获如何受结合反应动力学与纤维素内运输过程的速率之间的关系的影响。每条曲线表示在不同的局部结合剂浓度(mol L-1；图例中所示)的单一10mL再循环。入口分析物浓度为1nM。
图72示出了由有限元模型在扩散极限中预测的比例结合曲线。在该情况下，向纤维素纤维的扩散速率是限速过程，因为固定化的结合剂位于孔壁，并且假设分析物捕获的速率相对于扩散较快。虚线(dashed curve，ND)表示在标准rcSso7d-CBD浓度(400μM)下由非扩散均匀分布模型预测的结合性能。实线表示在不同局部浓度的固定化结合剂(mol L-1)时在扩散受限的情况下的结合。使用对应于40mM的局部表面浓度的最左扩散曲线(黑色)来模拟瞬时捕获；对于较高的局部浓度，未观察到结合比例的明显提高。
图73示出了通过大体积处理的灵敏度增强。对于大体积(10mL；5mL分钟-1；20次再循环)和小体积(10μL；40分钟)样品，在不同分析物浓度下观察到的平均荧光强度(meanfluorescence intensity，MFI)。使用五点S形曲线(方程S10)生成最佳拟合线(Miller etal.Anal Chem(2018)90(15)：9472-9)。误差棒表示三个(大体积)或四个(小体积)独立重复的标准差。
图74A至74B示出了在不同局部浓度的rcSso7d-CBD的分析物滴定曲线之间的比较。图74A示出了使用局部rcSso7d-CBD浓度为400和40μM的测试区，对于大体积(10mL)和小体积(10μL)样品在不同分析物浓度下观察到的平均荧光强度(MFI)。对应于400μM/10μL样品的数据点与对应于40μM/10μL样品的哪些直接重合(图87)。图74B示出了在400和40μM的局部rcSso7d-CBD浓度下比较相应的大体积和小体积样品的荧光比例。大体积样品由10mL分析物溶液(5mL分钟-1，20次再循环)组成。小体积样品由10μL组成，将其在测试区上孵育等同的40分钟时期。误差棒表示三个(大体积)或四个(小体积)独立重复的标准差。
图75A至75D示出了不同流量和总处理时间下的测定性能。图75A示出了绝对平均荧光强度(MFI)，图75B示出了比例MFI(相对于在1mL分钟-1下在相同时间段处理的样品)，以及图75C示出了不同单程停留时间(single-pass residence time)和总处理时间的信号发生效率(signal development efficiency)(MFI分钟-1)。图75D示出了作为再循环数目的函数的信号发生。线性趋势线指示使用常见体积流量(图例中所示)产生的样品的性能。样品规格：10mL和1nM SA-AF647。误差棒表示三个独立重复的标准差。
图76示出了基于注射器的测定形式。切下纸样品并将其固定在13mm Swinnex过滤器保持器(filter holder)中。将10mL注射器连接上游，并用于将分析物溶液预填充过滤器保持器。使用Qosina母对母(Female-to-Female)Luer-Lok连接器将该盒(cassette)连接至第二注射器下游，并且从系统中排出任何剩余空气。在所有情况下，将测试区的顶部(施加rcSso7d.SA-CBD溶液的表面)均定向为成为与分析物溶液接触的第一侧。
图77A至77D示出了COMSOL比例分析物捕获模型的设置(set-up)。将测试区建模为二维反应器体积，在整个二维反应器体积中固定化结合剂均匀分布。深度＝L＝180μm；宽度＝2rtz＝1.8mm。在入口(左侧)的分析物浓度为1nM。样品集的体积流量和结合剂浓度在不同的子图中有所变化：1μM，1mL分钟-1(图77A)；1μM，20mL分钟-1(图77B)；400μM，1mL分钟-1(图77C)和400μM，20mL分钟1(图77D)。在每个子图内，测试快照(snapshot)的行对应于可溶性分析物、游离结合剂和所占据的结合剂(从上至下)。沿每个子图顶部指示的时间点每60秒捕获测试区快照。右侧的图例指示截面快照相应行的相关物质的浓度。为了捕获体系动态，将色条(color-bar)相对于每个集合的运算条件下的相关物质进行缩放，而不是表示通用浓度标度。
图78示出了COMSOL扩散模型的设置。用1nM的分析物浓度使理想化的圆孔(r＝5.5μm)初始化。周围的基质表示经结合剂官能化的纤维网络，平均结合剂浓度为40mM。允许分析物的扩散和捕获在2秒的过程中进行，以模拟在不同样品停留时间范围内的扩散捕获。每个快照表示一个不同的时间点，将其指示在孔图像上方，以及色条表示可溶性分析物的浓度。
图79示出了在整个测定截面积中的流体流动的确定。向样品体积添加不溶性纤维素粉末(直径为50μm)，以追踪作为样品的流体流动在测试区中的再循环。作为仅集中在亲水区域内的替代，粉末分布在整个截面积上，表明疏水区域允许流体流动，一旦使其足够的润湿。因此，相关的流动体积为12.81μL，而不是严格与经结合剂官能化区域相关的流动体积(0.45μL)。
图80示出了在不同的浓度和体积流量下的比例结合剂占据率。每条线图表示在不同的局部结合剂浓度(图例中所示)下的运算。对于所有数据集，分析物以1nM的浓度引入，并且在单一模拟的10mL再循环之后立即收集数据。
图81A至81B示出了流量、结合剂浓度、分析物捕获与DaI的相关性。图81A示出了与体积流量、结合剂浓度(mol L-1)和达姆霍勒数(
number)，以及通过伪一阶速率模型预测的比例分析物捕获的速率相关的标准曲线。图81B示出了对于不同局部浓度的固定化结合剂所预测的比例结合曲线。
图82A至82B示出了有限元分析与PFORC模型之间的偏差。图82A示出了非扩散极限中分析物结合的有限元模型(虚线)与伪一阶速率常数模型(实线)的比较。图82B示出了对于所有处理条件，FEA模型与PFORC模型之间的绝对基点偏差。在动态信号变化区域中观察到预测模型之间的最大偏差。
图83示出了达姆霍勒主曲线。通过伪一阶速率模型生成的所有一维结合曲线均折叠到描述体系性能的单一无量纲结合曲线上。该关系对于其中固定化结合剂显著摩尔过量(＞10x)于可溶性分析物的所有情况均有效。虚线突出了达姆霍勒数的值，在该值处捕获了50％的分析物。
图84示出了结合等温线。曲线指示在不同浓度的固定化结合剂下，在给定的体积流量(或停留时间)下观察到的理论的比例分析物捕获。虚线指示标准rcSso7d-CBD体系(CB＝400μM)的运算方案。
图85示出了信号出现点附近的滴定曲线。所有大体积样品均由10mL样品体积组成，将其以5mL分钟-1穿过测试区进行20次再循环。所有小体积样品均由10μL样品体积组成，将其直接施加至测试区，并允许孵育等同的40分钟时期。数据集与图73中所见的数据集相同。误差棒表示三个(大体积)或四个(小体积)独立重复的标准差。
图86A至86B示出了在官能化纸上固定化的蛋白质丰度的计算。图86A示出了在0.25nM至256nM的链霉抗生物素蛋白-伊红(SA-E)浓度和10μL样品体积下，对于施加至非官能化纸的rcSso7d.SA-CBD(黑色)和施加至醛官能化纸的rcSso7d.SA(红色)的滴定数据。图86B示出了在不同的所施加分析物浓度下的比例分析物捕获。对所有施加的浓度进行分析，其中对于官能化和非官能化样品观察到的信号之间存在明显差异。将所有测试物与分析物溶液一起孵育三十分钟。误差棒表示四个独立重复的标准差。
图87示出了对于局部浓度为400μM和40μM的rcSso7d-CBD的小体积滴定曲线之间的比较。数据集与图74A中所见的数据集相同。小体积样品由10μL组成，将其在测试区上孵育40分钟时期。误差棒表示四个独立重复的标准差。
图88示出了与再循环数目和信号发生程度相关的线性回归斜率随着体积流量的提高而下降。在几乎所有情况下，均可观察到线性回归曲线与实验数据很好地相关，如由皮尔逊系数(Pearson coefficient)接近±1所示。
图89示出了使用链霉抗生物素蛋白-伊红作为可溶性分析物的代表性人工滴定曲线。将样品各自进行20次再循环。每个数据点表示一个单一测定重复。将人工样品以可持续而不会出现身体不适的流量(～25mL分钟-1)进行处理。使用TxRed-4040C滤光片组(filterset)将样品曝光1000ms。链霉抗生物素蛋白-伊红如参考文献3中所述进行制备。
图90示出了使用几何平均荧光强度而不是群体比例定量的rcSso7d.H1BA.2结合剂针对经尿处理的分析物的结合活性。
图91示出了使用几何平均荧光强度而不是群体比例定量的rcSso7d.H1BA.3结合剂针对经尿处理的分析物的结合活性。
图92示出了结合剂rcSso7d.H1BA.1和rcSso7d.H1BA.3的特异性和比例特异性。
图93示出了使用几何平均荧光强度而不是群体比例定量的rcSso7d.H1BA.6结合剂针对经尿处理的分析物的结合活性。
图94示出了使用几何平均荧光强度而不是群体比例定量的rcSso7d.H2BA.1结合剂针对经尿处理的分析物的结合活性。
图95A至95B示出了使用几何平均荧光强度而不是群体比例定量的H4完整夹心(H4full sandwich)针对经尿(过夜尿(图95A)和1周尿(图95B))处理的分析物的性能。
图96是H4夹心测定的示意图。
图97示出了完整H4与空H4夹心测定的性能。BA-MBP-rcSso7d.H4.1和rcSso7d.H4.2-CBD产生完整夹心。
图98示出了在H4夹心测定中不同Sso-CBD变体的比较。仅rcSso7d.H4.2-CBD产生完整夹心性能。
图99示出了在基于纸测定中和在酵母菌表面展示形式中H4.E1和H4.E2的交叉反应性。
图100示出了通过BSA钝化(passivation)的非特异性结合的降低。
图101示出了在不同pH值下的测定性能和分析物特异性结合信号。结果表明在pH5时非特异性检测试剂结合的降低。
图102描绘了在完整夹心形式中的H4滴定，在pH 5洗涤下显示LOD为8nM。
图103示出了随BA-MBP-H4.E1浓度的信号变化以及分析物特异性信号。结果表明随着BA-MBP-H4.1浓度的提高观察到信号增加。
发明详述
根据质量作用定律，靶标结合相互作用的化学计量和动力学可通过三种一般方法有利地影响：i)提高可溶性抗原的摩尔丰度和浓度，ii)提高其表面固定化结合伴侣的丰度和浓度，或iii)在相关测定条件下增强该结合相互作用的亲和力(Esteban et al.，2013)。这些指导原则已在许多实验研究中得到证实，所述实验研究表明抗原预浓缩(Ahmed etal.，2016；Giri et al.，2016；Tang et al.，2016)和增强的结合亲和力(Kaastrup etal.，2013；Ricci et al.，2016)对靶标捕获和测定灵敏度的有利影响。
先前的研究还探索了表面固定化的结合物质的丰度对分析物检测灵敏度的影响(Esteban et al.，2013；Parsa et al.，2008；Peluso et al.，2003)。然而，尽管这些研究确定了在较高丰度的固定化结合剂下进行测定的诊断灵敏度提高，但仅实现了表面结合的物质的中等密度(例如，皮摩尔/cm2)，并且靶分析物摩尔过量于固定化的结合剂。在真正的靶标消耗方案内进行运算的意义尚未充分研究，在该方案中，结合蛋白以显著摩尔过量于分析物存在。
为了探索增强的结合剂固定化对靶标捕获效率的影响，已开发出简化的结合模型，该模型采用伪一阶速率常数(pseudo first-order rate constant，PFORC)来描述抗原结合相互作用。该PFORC假设固定化结合物质显著摩尔过量，以使得可用结合剂的丰度由可溶性抗原捕获物有效地消除。这些建模结果表明在该高丰度吸附方案中，靶抗原快速且有效地从溶液中消耗。此外，该模型表明在摩尔过量大的情况下，固定化结合剂的亲和力对捕获效率的影响较小-只要表面结合的物质的局部浓度比解离常数(KD)高至少十倍即可，结合反应将继续进行至接近完成。因此，如果可实现该摩尔过量，则无需在所选择的结合剂的亲和力成熟方面中投入蛋白质工程的努力-取决于具体的固定化丰度，高纳摩尔或甚至低微摩尔范围中的中等结合亲和力可足以用于有效的靶标捕获。
该PFORC模型的预测使用双功能融合蛋白构建体进行实验验证，该构建体将3a型纤维素结合结构域(CBD)与基于热稳定rcSso7d蛋白的模块结合支架组合(Miller et al.，2016；Traxlmayr et al.，2016)(图1)。先前的研究表明CBD融合蛋白可用于纤维素基底的生物官能化，其应用包括蛋白质纯化(Sugimoto et al.，2012；Tomme et al.，1998)、纺织物制造(Levy和Shoseyov，2002)和免疫测定发生(Dai et al.，2016；Holstein et al.，2016；Hussack et al.，2009；Kim et al.，2013)。这些研究表明该CBD物质在标准的诊断环境中以相对于可溶性靶标将产生显著过量的固定化蛋白质的摩尔量吸附至纤维素(Dai etal.，2016；Li et al.，2016)。实验研究确定在基于纸测定形式中该基底锚固结构域的使用允许抗原结合蛋白(例如，经工程化的减电荷rcSso7d)快速且定向地吸附在未改性的色谱纸(例如，
1级定性过滤纸)上以足够的丰度从溶液中完全捕获所有抗原，并且因此从溶液中消耗抗原。在一些实施方案中，从溶液中捕获多至0.5纳摩尔的抗原，从而从10μL的50μM溶液中消耗所有抗原。对于在典型诊断测定中观察到的样品体积和抗原浓度(即，微升以及皮摩尔至低纳摩尔范围的浓度)而言，该抗原结合蛋白丰度相对于可溶性靶标可以以大于1000倍摩尔过量表示。该固定化CBD融合蛋白在纸基底内的高局部浓度(～760μM)还提高了靶标捕获的速率，使结合平衡朝着从溶液中快速消耗稀释的抗原的方向倾斜。在该摩尔丰度下，从溶液中捕获靶抗原的效率接近100％，从而使任何给定诊断体系可获得的灵敏度最大化。
该表面锚固方法可适用于存在已知锚固部分的任何基底，只要给定的本体材料具有足够的可利用表面积特征以使结合构建体高丰度固定化即可，并且还被构造成使得有利于抗原向表面的有效转运。例如，固体结合肽已用于使生物分子固定化至多种基底，从金属和金属氧化物到塑料、矿物、半导体和碳基材料(Care et al.，2017，2015；Kumada，2014；Seker和Demir，2011)。该策略还可扩展到可与该锚固部分相互作用或表达为与该锚固部分遗传融合的结合结构域的任何固定化靶标或类别(例如抗原、抗体和抗体片段、非抗体结合支架、DNA寡核苷酸和适配体等)(Holstein et al.，2016；Hussack et al.，2009；Rosa etal.，2014)。
最后，显示该体系在不同的可溶性靶标上也具有通用性-使用两种不同的经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白变体确定了rcSso7d-CBD融合蛋白的捕获效率增强。针对52.8kDa模型抗原链霉抗生物素蛋白产生了一种经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白变体，并将其与CBD连接(rcSso7d.SA-CBD)。因此，rcSso7d.SA-CBD融合蛋白包含与链霉抗生物素蛋白结合或识别其的基序(例如，氨基酸序列)。针对活动性结核(active tuberculosis)的33.1kDa基于尿的生物标志物Rv1656，产生了另一种经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白变体(Napolitano et al.，2008)，并将其与CBD连接(rcSso7d.Rv1656-CBD)。因此，rcSso7d.Rv1656-CBD融合蛋白包含与抗原Rv1656结合或识别其的基序(例如，氨基酸序列)。
因此，本公开内容的一些方面涉及使用双功能融合蛋白来增强对靶标，例如靶分子或目的抗原进行捕获的一般策略的开发，所述双功能融合蛋白包含抗原结合蛋白或抗原结合结构域以及基底锚固结构域，例如纤维素结合结构域(CBD)或碳水化合物结合模块(CBM)。
双功能融合蛋白
在一些方面中，本文中提供了并入基底锚固结构域和靶标结合结构域，例如抗原结合蛋白或抗原结合结构域的双功能融合蛋白。在一些实施方案中，基底锚固结构域是CBM或CBD。在一些实施方案中，CBM具有碳水化合物结合活性。在一些实施方案中，CBM是CBM1、CBM2、CBM3、CBM4、CBM5、CBM6、CBM9、CBM10、CBM11、CBM12、CBM14、CBM15、CBM17、CBM18、CBM19、CBM20、CBM21、CBM25、CBM27、CBM28、CBM32、CBM33、CBM48或CBM49。已经描述了本文中考虑的CBM的核酸和氨基酸序列，例如在www.cazypedia.org/index.php/Carbohydrate-binding_modules中公开的那些，并且可由本领域普通技术人员使用BLAST检索容易地鉴定。
在一些实施方案中，基底锚固结构域是CBD。CBD的直向同源物已在多种物种中描述，所述物种包括但不限于米罗布里格小单孢菌(Micromonospora mirobrigensis)(GenBank ID：SCF42127.1)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(GenBank ID：CNE10097.1)、黑色小单孢菌(Micromonospora nigra)(GenBank ID：SCL15442.1)、米罗布里格小单孢菌(GenBank ID：SCF04121.1)、粪纤维单胞菌(Cellulomonas Fimi)(PDB：1EXH_A)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)732(GenBank：EUA13076.1)、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)8(GenBank：EGC02462.1)、Leifsonia aquatic(NCBI参考序列：WP_021763186.1)、粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)(NCBI参考序列：NP_593986.1)、Desulfitobacterium hafniense(GenBank：CDX04743.1)。本文中还考虑了在本领域普通技术人员已知的其他物种中表达的CBD，例如如在Tomme et al.，J Chromatogr BBiomed Sci Appl(1998)715(1)：283-96中公开的I、II、III和IV家族的CBD。
本文中还考虑了不同类型的CBD。在一些实施方案中，本文中考虑了1型CBD，并且其用作本文中所述的双功能融合蛋白的基底锚固结构域。在一些实施方案中，1型CBD由SEQID NO：10标识。
1型CBD的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)
1型CBD的直向同源物已经在多种物种中描述，所述物种包括但不限于本文还考虑的里氏木霉(Trichoderma reesei)QM6a(NCBI参考序列：XP_006969224.1)；米根霉(Rhizopus oryzae)(GenBank：BAC53988.1)；日本裂殖酵母菌(Schizosaccharomycesjaponicus)yFS275(NCBI参考序列：XP_002172247.1)；绿木霉(Trichoderma virens)Gv29-8(NCBI参考序列：XP_013954979.1)；绿色木霉(Trichoderma viride)(GenBank：CAA37878.1)。本文中还考虑了本领域普通技术人员已知的其他物种中的1型CBD或其直向同源物。
在一些实施方案中，本文中考虑了3a型CBD，并且其用作本文中所述的双功能融合蛋白的基底锚固结构域。在一些实施方案中，3a型CBD是来自热纤梭菌(Genbank：HF912725.1；UniProtKB/TrEMBL：N1JW75)的CipA蛋白的结构域。
来自热纤梭菌CipA蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)
在一些实施方案中，SEQ ID NO：1的加下划线的缬氨酸(V)残基是异亮氨酸(I)，其对应于SEQ ID NO：15。
来自热纤梭菌的CipA蛋白的氨基酸序列，用异亮氨酸替换缬氨酸(SEQ ID NO：15)
来自热纤梭菌的CipA蛋白的3a型CBD的氨基酸序列，其对应于来自热纤梭菌的CipA蛋白的第364位至第522位氨基酸，对应于SEQ ID NO：2。
在一些实施方案中，SEQ ID NO：2的加下划线的缬氨酸(V)残基是异亮氨酸(I)，其对应于SEQ ID NO：16。
3a型CBD的直向同源物已在多种物种中描述，所述物种包括但不限于热纤梭菌(Ruminiclostridium thermocellum)AD2(GenBank：ALX08828.1)、产乳酸乙酸热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor lactoaceticus)6A(GenBank：AEM74847.1)、Niastellakoreensis GR20-10(GenBank：AEV99440.1)、放线菌细菌(Actinobacteria bacterium)OV450(GenBank：KPH97519)、舌螺状菌(Spirosoma linguale)DSM 74(GenBank：ADB37689.1)。本文中还考虑了来自本领域普通技术人员已知的其他物种的3型CBD，包括3a型CBD。
在一些实施方案中，CBD包括与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少或约50％同一性，至少或约60％同一性，至少或约70％同一性，至少或约80％同一性，至少或约85％同一性，至少或约90％同一性，至少或约95％同一性，至少或约96％同一性，至少或约97％同一性，至少或约98％同一性，至少或约99％同一性，至少或约99.5％同一性，至少或约99.9％同一性或约100％同一性的变体。
在一些实施方案中，1型CBD包括与SEQ ID NO：10的氨基酸序列有至少或约50％同一性，至少或约60％同一性，至少或约70％同一性，至少或约80％同一性，至少或约85％同一性，至少或约90％同一性，至少或约95％同一性，至少或约96％同一性，至少或约97％同一性，至少或约98％同一性，至少或约99％同一性，至少或约99.5％同一性，至少或约99.9％同一性或约100％同一性的变体。
在一些实施方案中，3a型CBD包括与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：16的氨基酸序列有至少或约50％同一性，至少或约60％同一性，至少或约70％同一性，至少或约80％同一性，至少或约85％同一性，至少或约90％同一性，至少或约95％同一性，至少或约96％同一性，至少或约97％同一性，至少或约98％同一性，至少或约99％同一性，至少或约99.5％同一性，至少或约99.9％同一性或约100％同一性的变体。
在一些实施方案中，CBD包括比SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：15的氨基酸序列短或长约5个氨基酸，约10个氨基酸，约15个氨基酸，约20个氨基酸，约25个氨基酸，约30个氨基酸，约40个氨基酸，约50个氨基酸，约75个氨基酸，约100个氨基酸，200个氨基酸，300个氨基酸，400个氨基酸，500个氨基酸，800个氨基酸，1000个氨基酸，1200个氨基酸，1400个氨基酸或更多的变体。
在一些实施方案中，1型CBD包括比SEQ ID NO：10的1型CBD的氨基酸序列短或长约5个氨基酸，约10个氨基酸，约15个氨基酸，约20个氨基酸，约25个氨基酸，约30个氨基酸，约40个氨基酸，约50个氨基酸，约75个氨基酸，约100个氨基酸或更多的变体。
在一些实施方案中，3a型CBD包括比SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：16的CBD的氨基酸序列短或长约5个氨基酸，约10个氨基酸，约15个氨基酸，约20个氨基酸，约25个氨基酸，约30个氨基酸，约40个氨基酸，约50个氨基酸，约75个氨基酸，约100个氨基酸或更多的变体。
根据一些方面，双功能融合蛋白包含靶标结合结构域，例如抗原结合蛋白或抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合蛋白是经工程化的Sso7d抗原结合蛋白。来自嗜热古菌硫磺矿硫化叶菌的Sso7d蛋白是一种具有高热稳定性(Tm为98℃)的小蛋白(7kDa)，由于其是一种DNA结合蛋白，因此其是高度带正电的。Sso7d中的高正电荷为结合表位引入了强特异性限制，并导致与哺乳动物细胞膜的非特异性相互作用。已经报道了保持高热稳定性的Sso7d的电荷中和的变体(Traxlmayr et al.，J Biol Chem(2016)291(43)：22496-508)。
在一些实施方案中，Sso7d抗原结合蛋白包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列，其对应于来自硫磺矿硫化叶菌的Sso7d的氨基酸序列(UniProtKb：P39476；欧洲核苷酸档案(European Nucleotide Archive)：AAK42212.1)。
来自硫磺矿硫化叶菌的Sso7d的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)：
Sso7d的直向同源物已经在多种物种中描述，所述物种包括冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)(NCBI参考序列：WP_012713334.1)、超嗜热古菌(Sulfolobustokodaii)(NCBI参考序列：WP_010978621.1)、硫化叶菌属(Sulfolobus sp.)A20(序列ID：WP_069284107.1)、好客嗜酸两面菌(Acidianus hospitalis)(NCBI参考序列：WP_013777046.1)和极端嗜酸热古菌(Acidianus manzaensis)(GenBank：ARM76167.1)。
在一些实施方案中，Sso7d抗原结合蛋白是Sso7d的减电荷变体(rcSso7d)。在一些实施方案中，rcSso7d抗原结合蛋白包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
来自硫磺矿硫化叶菌的rcSso7d的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)：
在一些实施方案中，经工程化的抗原结合蛋白是Sso7a。在一些实施方案中，Sso7a抗原结合蛋白来自硫磺矿硫化叶菌(UniProtKB：P61991；欧洲核苷酸档案：AAK42090.1)。
来自硫磺矿硫化叶菌的Sso7a的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)：
在一些实施方案中，本文中考虑了Sso7a的减电荷变体。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白是来自嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius)的Sac7d(UniProtKB：P13123)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白是Sac7d的减电荷变体(rcSac7d)。
来自嗜酸热硫化叶菌的Sac7d的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)：
在一些实施方案中，Sso7抗原结合蛋白是与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12或SEQ ID NO：13的氨基酸序列具有至少或约50％同一性，至少或约60％同一性，至少或约70％同一性，至少或约80％同一性，至少或约85％同一性，至少或约90％同一性，至少或约95％同一性，至少或约96％同一性，至少或约97％同一性，至少或约98％同一性，至少或约99％同一性，至少或约99.5％同一性，至少或约99.9％同一性或约100％同一性的变体。
在一些实施方案中，Sso7抗原结合蛋白包括比SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：11、SEQID NO：12或SEQ ID NO：13的氨基酸序列短或长约5个氨基酸，约10个氨基酸，约15个氨基酸，约20个氨基酸，约25个氨基酸，约30个氨基酸，约40个氨基酸，约50个氨基酸或更多的变体。
本文中所述序列的任何直向同源物可通过进行目的序列的BLAST检索来鉴定。
在一些实施方案中，双功能融合蛋白并入了基底锚固结构域和靶标结合结构域，其中靶标结合结构域表达为与基底锚固结构域的遗传融合。在一些实施方案中，靶标结合结构域不表达为与基底锚固结构域的遗传融合。在一些实施方案中，靶标结合结构域与基底锚固结构域相互作用。靶标结合结构域的一些非限制性实例包括但不限于抗原、酶、肽、抗体、抗体片段、非抗体结合支架、DNA寡核苷酸、适配体等(参见，例如，Care et al.，Trends Biotechnol(2015)33(5)：259-68)。靶标结合结构域或靶标结合蛋白的另一些实例包括蛋白A、脂质运载蛋白、纤连蛋白结构域、锚蛋白共有重复结构域、scFv和硫氧还蛋白(参见例如，Skerra et al.，Curr Opin Biotechnol(2007)18(4)：295-304)。本文中还考虑了本领域普通技术人员已知的另外的靶标结合结构域。
本文中所述示例性rcSso7d.SA-CBD双功能融合蛋白构建体的氨基酸序列可表示为以下：
加单下划线的氨基酸对应于用于纯化的组氨酸标签-凝血酶位点。加
下划线的氨基酸对应于rcSso7d.SA(即与链霉抗生物素蛋白-SA结合的rcSso7d抗原结合蛋白变体)。加
下划线的氨基酸对应于(G4S)3接头(SEQ ID NO：125)。加
下划线的氨基酸对应于CBD。在一些实施方案中，本文中所述的任何双功能融合蛋白构建体具有相似的布置，由纯化标签和切割位点、随后是本文中所考虑的抗原结合蛋白的氨基酸序列、随后是接头，并且随后是本文中所考虑的CBD结构域的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，靶标结合蛋白是经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白，其与抗原结合。本文中所述的“抗原”或“目的抗原”是指可与靶标结合结构域，例如经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白结合的任何分子。在一些实施方案中，抗原是能够在宿主生物体中诱导免疫应答(产生抗体)的分子。在一些实施方案中，抗原是不诱导免疫应答的分子。在一些实施方案中，抗原是外源性抗原、内源性抗原、自身抗原或新生抗原(例如，病毒抗原、肿瘤抗原等)。
在一些实施方案中，抗原或目的抗原是结核抗原或结核分子。结核抗原或结核分子是由结核分枝杆菌以其活性或潜伏形式产生的抗原或分子，或者其可表示对来自感染对象中的存在的结核分枝杆菌(M tuberculosis)(以其活性或潜伏形式)的生物化学应答(例如，疾病特异性免疫球蛋白、信号传导细胞因子、在多种生物化学实体中表示特征应答的复合生物标志物等)。在一些实施方案中，经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白包括识别目的特定抗原和/或与其结合的基序。在一些实施方案中，识别目的抗原和/或与其结合的经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白(例如，rcSso7d.SA或rcSso7d.SA-CBD)包含识别链霉抗生物素蛋白和/或与其结合的氨基酸序列，例如氨基酸序列
与链霉抗生物素蛋白或与山羊抗鸡抗体AF488结合的经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白变体的另一些非限制性实例列于表1中。
表1：与链霉抗生物素蛋白或与山羊抗鸡抗体结合的经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白变体
在一些实施方案中，识别目的抗原和/或与其结合的经工程化的Sso7d抗原结合蛋白(例如，rcSso7d)包含识别结核标志物(例如由活动性结核产生的抗原)和/或与其结合的氨基酸序列。在一些实施方案中，识别目的抗原和/或与其结合的经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白(例如，rcSso7d.Rv-1656或rcSso7d.Rv-1656-CBD)包含识别结核标志物Rv-1656和/或与其结合的序列，例如氨基酸序列
在一些实施方案中，识别目的抗原和/或与其结合的经工程化的Sso7d抗原结合蛋白(例如，rcSso7d)包含识别结核标志物(例如由活动性结核产生的抗原)和/或与其结合的氨基酸序列。在一些实施方案中，结核标志物是Rv1656、Rv1681、Rv2392、Rv1729c或TBCG_03312。
可由本文中所述的任何双功能融合蛋白识别或与其结合的结核中产生的抗原或目的抗原的另一些非限制性实例包括引起结核的细菌(即结核分枝杆菌)的检测物、结核分枝杆菌基因组的特定区域，例如通过GeneXpert MTB/RIF核酸扩增测试检测到的区域的检测物，从结核分枝杆菌中脱落进入一种或更多种感染组织周围的体液中的抗原，其可到达血液循环并且从对象身体中排出，例如在尿中。可从肺结核或肺外结核中检测抗原(参见例如Tucci et al.，Front Microbiol(2014)5(549)：1-6)。脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)是本文中考虑的另一种抗原。LAM是从代谢活跃或降解的细胞中脱落的所有分枝杆菌的外细胞壁的一种组分，其被肾清除并且可在尿中检测到，其可通过本文中所述的双功能融合蛋白和方法进行检测(参见例如，Hunter et al.J Biol Chem(1986)261(26)：12345-51；Chan et al.Infect Immun(1991)59(5)：1755-61)。可检测LAM的双功能融合蛋白包含靶标结合蛋白，例如被选择用于与目的抗原LAM结合的经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白。
用于检测和诊断结核的可使用本文中所述的双功能融合蛋白和方法检测的抗原的另一些非限制性实例(参见例如，Tucci et al.，Front Microbiol(2014)5(549)：1-6)列于表2中。
表2：与结核分枝杆菌相关的示例性抗原。
本文中所述的双功能融合蛋白可通过使用与含纤维素基底(例如色谱纸(例如，
1级定性过滤纸))结合的rcSso7d.Rv1656-CBD双功能融合蛋白来例证。可将与含纤维素基底结合的双功能融合蛋白与从对象中获得的包含目的抗原的样品，例如生物样品(例如，尿)接触。目的抗原可以是从患有或怀疑患有结核的对象中获得的活动性结核的基于尿的生物标志物，在一些情况下，其可用于确定对象是否患有结核。在一些实施方案中，结核的生物标志物是Rv1656、LAM、表2中列出的任意生物标志物或本领域普通技术人员已知的结核的任何生物标志物。
抗原或目的抗原的另一些非限制性实例包括抗体、肽等。在一些实施方案中，抗原或目的抗原是前列腺癌的生物标志物[例如，前列腺特异性抗原(prostate specificantigen，PSA)]；心脏停搏的生物标志物(例如，肌钙蛋白)；神经丝光(neuro-filamentlight)或者创伤性脑损伤的生物标志物；τ蛋白或者阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease)的生物标志物；NS1或者登革热(Dengue Fever)的生物标志物或寨卡病毒的生物标志物；pLDH、HRP2、醛缩酶、HSP70或者疟疾的生物标志物；干扰素-γ-诱导蛋白-10(interferon-γ-inducible protein-10，IP-10)或者人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiencyvirus，HIV)的生物标志物；血吸虫GST或者血吸虫病的生物标志物；癌抗原125(cancerantigen 125，CA-125)或者卵巢癌的生物标志物；或外表面蛋白A(outer surface proteinA，ospA)或者莱姆病(Lyme Disease)的生物标志物。
在一些实施方案中，抗原或目的抗原是非结核抗原。
在一些实施方案中，抗原或目的抗原是一种或更多种细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子是血细胞因子(hemokine)、干扰素、白介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子、趋化因子、促炎细胞因子或抗炎细胞因子。细胞因子的一些非限制性实例包括白介素，例如白介素(IL)-1α、白介素(IL)-β、白介素(IL)-2、白介素(IL)-3、白介素(IL)-4、白介素(IL)-5、白介素(IL)-6、白介素(IL)-7、白介素(IL)-8、白介素(IL)-9、白介素(IL)-10、白介素(IL)-11、白介素(IL)-12、白介素(IL)-13、白介素(IL)-18；干扰素(interferon，IFN)，例如干扰素(IFN)-α、干扰素(IFN)-β、干扰素(IFN)-γ；巨噬细胞炎性蛋白(macrophage inflammatoryprotein，MIP)，例如巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1α、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1β；肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-β、干细胞因子(stem cell factor，SCF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF)、MIP-ly、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)、c-kit配体、血小板生成素(thrombopoietin，TPO)、CD40配体(CD40 ligand，CD40L)、肿瘤坏死因子相关的激活诱导细胞因子(tumornecrosis factor-related activation-induced cytokine，TRANCE)或fit3配体(flt3ligand，flt-3L)。本文中还考虑了本领域普通技术人员已知的另一些细胞因子(参见例如，Zhang et al.Int Anesthesiology Clin(2007)45(2)：27-7)。
在一些实施方案中，抗原或目的抗原由黄病毒属的成员释放或分泌。在一些实施方案中，黄病毒属的成员是西尼罗河病毒(West Nile virus、WNV)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitis virrus，SLEV)、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、黄热病毒(yellow fever virus，YFV)、登革病毒(dengue virus，DENV)或寨卡病毒(ZIKV)(参见例如，Guzman et al.Lancet(2015)385：453-65)。本文中还考虑了本领域普通技术人员已知的黄病毒属的其他成员。在一些实施方案中，抗原或目的抗原是黄病毒非结构性1(NS1)。在一些实施方案中，NS1抗原或目的抗原由黄病毒属的成员，例如WNV、SLEV、JEV、SLEV、JEV、YFV、DEVN或ZIKV释放。由WNV、SLEV、JEV、SLEV、JEV、YFV、DEVN或ZIKV释放的NS1抗原或目的抗原的核酸和/或氨基酸序列是已知的和/或可由本领域普通技术人员容易地鉴定。在一些实施方案中，抗原或目的抗原由非黄病毒属的成员释放或分泌。在一些实施方案中，抗原或目的抗原由引起疟疾的生物体，例如本领域普通技术人员已知的生物体释放或分泌。在一些实施方案中，抗原或目的抗原由疟原虫(Plasmodium)属的成员释放或分泌。在一些实施方案中，抗原或目的抗原由恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、卵形疟原虫(Plasmodiumovale)释放或分泌。在一些实施方案中，抗原或目的抗原是疟原虫乳酸脱氢酶(pLDH)，富含组氨酸的蛋白2(HRP2)或疟原虫醛缩酶。pLDH、HRP2或疟原虫醛缩酶的核酸和/或氨基酸序列是本领域普通技术人员已知的，并且可使用工具例如BLAST检索容易地鉴定。
在一些实施方案中，抗原或目的抗原是检测试剂。在一些实施方案中，检测试剂是荧光团。在一些实施方案中，抗原或目的抗原是荧光团，例如Alexa Fluor 647(AF647)。在一些实施方案中，该荧光团是羟基香豆素、甲氧基香豆素、氨基香豆素、Cy2、FAM、AlexaFluor 405(AF405)、Alexa Fluor 488(AF488)、荧光素FITC、Alexa Fluor 430(AF430)、Alexa Fluor 532(AF532)、HEX、Cy3、TRITC、Alexa Fluor 546(AF546)、Alexa Fluor 555(AF555)、R-藻红蛋白(PE)、罗丹明红-X(Rhodamine Red-X)、Tamara、Cy3.5 581、Rox、AlexaFluor 568(AF568)、Red 613、Texas Red、Alexa Fluor 594(AF594)、Alexa Fluor 633(AF633)、别藻蓝蛋白、Cy5、Alexa Fluor 660(AF660)、Cy5.5、TruRed、Alexa Fluor 680(AF680)、Cy7、Cy7.5或本领域普通技术人员已知的任何其他荧光团(例如参见，www.biosyn.com/Images/ArticleImages/Comprehensive％20fluorophore％201ist.pdf)。在一些实施方案中，该荧光团是荧光蛋白或发色团，例如绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)、来自珊瑚多孔鹿角珊瑚(Acropora millepora)的色蛋白(amilCP)、来自珊瑚多孔鹿角珊瑚的色蛋白(amilGFP)、来自多孔鹿角珊瑚的荧光蛋白(amilRFP)等或与本领域普通技术人员已知的检测试剂化学连接的其他物质。在一些实施方案中，一种或更多种荧光团可用于纯化经化学标记的分子以确保100％或接近100％的标记效率。在一些实施方案中，抗原或目的抗原是发出可检测信号的分子。在一些实施方案中，该分子是藻红蛋白。在一些实施方案中，发出可检测信号的分子是产色酶(color-producing enzyme)(例如，β-半乳糖苷酶)、用于金属螯合和高对比度电子显微术(electron microscopy，EM)的APEX2，或化学发光物质。在一些实施方案中，本文中公开的任何抗原结合蛋白，例如与基底锚固结构域缔合或不与其缔合的多聚体rcSso7d结合蛋白均包含结合分析物、抗原或目的抗原的结合面和结合本文中公开的一种或更多种检测试剂的第二结合面。本文中还考虑了本领域普通技术人员已知的发出可检测信号的其他检测试剂、荧光团或分子。在一些实施方案中，发出可检测信号的检测试剂、荧光团或分子与以下中的一种或更多种直接或间接地连接：链霉抗生物素蛋白、IgG抗体(多克隆或单克隆的)、本文中公开的任何生物标志物、本文中公开的任何抗原结合蛋白[例如，rcSso7d、基于rcSso7d的检测试剂(例如，BA-MBP-rcSso7d)]、核酸(例如，DNA、RNA等)或者有机或无机纳米颗粒(例如，包含金、碳、乳胶、纤维素等的纳米颗粒)。
在一些实施方案中，基底锚固结构域，例如CBD，与靶标结合结构域，例如抗原结合蛋白或抗原结合结构域(例如，经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白)直接连接。基底锚固结构域，例如CBD，可通过基底锚固结构域与靶标结合蛋白或抗原结合结构域之间的肽键与靶标结合蛋白或抗原结合结构域(例如，经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白)直接连接。在一些实施方案中，基底锚固结构域，例如CBD，与靶标结合结构域，例如抗原结合蛋白或抗原结合结构域(例如，经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白)间接连接。在一些实施方案中，经工程化的Sso7d抗原结合蛋白(例如，rcSso7d)通过接头与CBD间接地连接(即，被连接)。本文中考虑的接头的一些非限制性实例包括蛋白质接头；肽接头，例如Gly-Ser接头(例如，包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：125)的接头，称为(G4S)3)。Gly-Ser接头可重复n次，例如，其中n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30。本文中还考虑了本领域普通技术人员已知的天然存在的或合成的接头的另一些非限制性实例，例如化学接头(例如，交联剂、双功能接头、三官能三接头)，例如双[2-(N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基氧基)乙基]砜、O，O’-双[2-(N-琥珀酰亚胺基-琥珀酰氨基)乙基]聚乙二醇2,000、O，O’-双[2-(N-琥珀酰亚胺基-琥珀酰氨基)乙基]聚乙二醇3,000、O，O’-双[2-(N-琥珀酰亚胺基-琥珀酰氨基)乙基]聚乙二醇10,000、BS(PEG)5(PEG化的双(磺基琥珀酰亚胺基)丁二酸酯)、4，4’-二异硫氰酸根合二苯乙烯-2，2’-二磺酸二钠盐水合物、溴乙酸(rromoacetic acid)N-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺-PEG2-琥珀酰亚胺酯、SBAP(3-(溴乙酰氨基)丙酸琥珀酰亚胺酯)、5-叠氮基-2-硝基苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯等；柔性接头(例如，(Gly)6(SEQ ID NO：126)、(Gly)8(SEQ IDNO：127)等)；刚性接头(例如，(EAAAK)3(SEQ ID NO：128)、A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(SEQ IDNO：129)、PAPAP(SEQ ID NO：130)等)以及可切割的接头(例如，二硫化物、VSQTSKLTR↓AETVFPDV(SEQ ID NO：131)、RVL↓AEA(SEQ ID NO：132)；EDVVCC↓SMSY(SEQ ID NO：133)；
GGIEGR↓GS(SEQ ID NO：134)；GFLG↓(SEQ ID NO：135)等)，例如在Chen et al.，Adv Drug Deliv Rev(2013)65(10)：1357-69中公开的那些。
在一些实施方案中，经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白的C端与CBD的N端直接或间接地连接。在一些实施方案中，经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白的C端与CBD的N端直接连接。在一些实施方案中，经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白的C端通过接头与CBD的N端间接连接。在一些实施方案中，经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白的N端与CBD的C端直接或间接地连接。在一些实施方案中，经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白的N端与CBD的C端直接连接。在一些实施方案中，经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白的N端通过接头与CBD的C端间接连接。
双功能融合蛋白的表达
本文中还公开了编码本文中所述的任何双功能融合蛋白的核酸、包含本文中所述的核酸和/或双功能融合蛋白中的任一种的文库，以及包含本文中所述的核酸和/或双功能融合蛋白中的任一种的组合物。应当理解，包含核酸或蛋白质的文库可使用本领域中已知的方法生成。包含核酸的文库可包含基因和/或全长基因的片段，并且可包含野生型序列和突变序列。包含蛋白质的文库可包含蛋白质和/或全长蛋白质的片段，并且可包含野生型序列和突变序列。
本文中所述的抗原结合蛋白，例如rcSso7d.SA或rcSso7d.Rv1656的开发和选择可通过在Miller et al.，2016中公开的方法来产生。简言之，抗原结合蛋白，例如rcSso7d.SA或rcSso7d.Rv1656选自基于减电荷Sso7d支架(rcSso7d)的酵母菌表面展示文库。酵母菌文库可使用三核苷酸寡核苷酸合成以及与线性化质粒(例如pCTcon2质粒)在体内同源重组来生成(Traxlmayr et al.，2016)。可采用分离方法，例如高亲合力(highly-avid)磁珠分选(magnetic bead sorting，MBS)(Ackerman et al.，2009)和荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，FACS)(Chao et al.，2006)来选择针对目的抗原(例如Rv1656)的结合剂，以及在基于FACS的文库筛选轮中提高严格性，在此之后可对子文库进行测序，并且可选择结合目的抗原的抗原结合蛋白(例如，rcSso7d.Rv1656)以进行进一步表征，例如在系统，例如细菌系统中稳健的表达，用于下游应用。用于创建酵母菌表面展示文库的另一些方法包括本领域普通技术人员已知的方法。
在一些实施方案中，本文中公开的靶标结合蛋白、抗原等中的一种或更多种在重组表达载体中表达。本文中使用的“载体”可以是通过限制和连接将期望的序列或多个序列插入其中的许多核酸中的任一种用于在不同遗传环境之间转运或用于在宿主细胞中表达。载体通常由DNA构成，尽管RNA载体也是可用的。载体包括但不限于：质粒、黏粒、噬菌粒、病毒基因组和人工染色体。
克隆载体是一种能够在宿主细胞中自主复制或整合在基因组中的载体，并且其特征还在于一个或更多个内切核酸酶限制位点，在该位点可以以可确定的方式切割该载体，并且可将期望的DNA序列连接到其中，以使得新重组载体保持其在宿主细胞中复制的能力。在质粒的情况下，所期望序列的复制随着质粒在宿主细胞(例如宿主细菌)内的拷贝数的提高可发生多次，或者在宿主通过有丝分裂繁殖之前每个宿主仅发生一次。在噬菌体的情况下，复制可以在裂解阶段期间主动发生，或者在溶原阶段期间被动发生。
表达载体是其中可通过限制和连接插入期望的DNA序列，以使得其与调节序列可操作地连接并且可表达为RNA转录物的表达载体。载体可还包含适用于鉴定已经或尚未被载体转化或转染的细胞的一种或更多种标志物序列。包含用于表达的所有必需元件的表达载体是可商购获得的并且是本领域技术人员已知的。参见，例如，Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989。通过将异源DNA(RNA)引入细胞中对细胞进行遗传改造。
可使用本领域中标准的方法和技术将编码本文中公开的双功能融合蛋白或抗原或任何其他分子的核酸分子引入一个细胞或多个细胞中。例如，可通过标准方案，例如转化，包括化学转化和电穿孔、转导、粒子轰击等引入核酸分子。
可被经工程化以重组表达基因的任何类型的细胞均可用于本文中所述的方法中，所述细胞包括原核和真核细胞。在一些实施方案中，细胞是细菌细胞，例如埃希氏菌属(Escherichia spp.)、链霉菌属(Streptomyces spp.)、发酵单胞菌属(Zymonas spp.)、醋杆菌属(Acetobacter spp.)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter spp.)、集胞藻属(Synechocystis spp.)、根瘤菌属(Rhizobium spp.)、梭菌属(Clostridium spp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、黄单胞菌属(Xanthomonas spp.)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、乳球菌属(Lactococcus spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、产碱杆菌属(Alcaligenes spp.)、假单胞菌属(Pseudomonasspp.)、气单胞菌属(Aeromonas spp.)、固氮菌属(Azotobacter spp.)、丛毛单胞菌属(Comamonas spp.)、分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)、红球菌属(Rhodococcus spp.)、葡糖杆菌属(Gluconobacter spp.)、雷尔氏菌属(Ralstonia spp.)、硫杆菌属(Acidithiobacillus spp.)、小月菌属(Microlunatus spp.)、地杆菌属(Geobacterspp.)、芽孢杆菌属(Geobacillus spp.)、节杆菌属(Arthrobacter spp.)、黄杆菌属(Flavobacterium spp.)、沙雷氏菌属(Serratia spp.)、糖多孢菌属(Saccharopolysporaspp.)、栖热菌属(Thermus spp.)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas spp.)、色杆菌属(Chromobacterium spp.)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium spp.)、糖多孢菌属(Saccharopolyspora spp.)、农杆菌属(Agrobacterium spp.)和泛菌属(Pantoea spp.)。细菌细胞可以是革兰氏阴性细胞，例如大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)细胞，或革兰氏阳性细胞，例如芽孢杆菌物种。在另一些实施方案中，细胞是真菌细胞，例如酵母菌细胞，例如，酵母菌属(Saccharomyces spp.)(例如，酿酒酵母菌(S.cerevisiae))、裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyces spp.)、毕赤酵母菌属(Pichia spp.)、Paffia属(Paffia spp.)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces spp.)、假丝酵母菌属(Candida spp.)、踝节菌属(Talaromyces spp.)、布雷特酵母菌属(Brettanomyces spp.)、管囊酵母菌属(Pachysolenspp.)、德巴利酵母菌属(Debaryomyces spp.)、亚罗酵母菌属(Yarrowia spp.)和工业多倍体酵母菌菌株。真菌的另一些实例包括曲霉属(Aspergillus spp.)、青霉属(Penicilliumspp.)、镰孢菌属(Fusarium spp.)、根霉属(Rhizopus spp.)、枝顶孢属(Acremoniumspp.)、脉孢菌属(Neurospora spp.)、粪壳菌属(Sordaria spp.)、稻瘟菌属(Magnaporthespp.)、异水霉属(Allomyces spp.)、黑粉菌属(Ustilago spp.)、葡萄孢属(Botrytisspp.)和木霉属(Trichoderma spp.)。在另一些实施方案中，细胞是藻细胞或植物细胞。
抗原检测
在一些方面中，本文中还提供了用于检测目的抗原的方法。在一些实施方案中，该方法包括使本文中所述的任何双功能融合蛋白与含纤维素基底接触足以使双功能融合蛋白与含纤维素基底结合的时间；使与含纤维素基底结合的双功能融合蛋白与包含目的抗原的样品接触；以及检测由经工程化的减电荷Sso7d抗原结合蛋白(例如，rcSso7d)结合的目的抗原。
在一些实施方案中，该方法包括使本文中所述的任何双功能融合蛋白与包含目的抗原的样品接触，其中所述目的抗原与所述双功能融合蛋白结合并形成复合体；使复合体与含纤维素基底接触足以使复合体与含纤维素基底结合的时间；以及检测由经工程化的Sso7d抗原结合蛋白结合的目的抗原。
在一些实施方案中，该方法包括使本文中所述的任何双功能融合蛋白例如rcSso7d-CBD与含纤维素基底接触足以使双功能融合蛋白与含纤维素基底结合的时间；使包含抗原或目的抗原的样品，例如生物样品，接触足以允许所述抗原或目的抗原与双功能融合蛋白结合并形成复合体的时间；使复合体与识别抗原或目的抗原的抗体接触；以及检测抗体。在一些实施方案中，抗体与发出可检测信号以检测抗原或目的抗原的荧光团或分子直接或间接地连接。在一些实施方案中，抗体是生物素化的。在一些实施方案中，使生物素化的抗体与直接或间接地连接发出可检测信号以检测抗原或目的抗原的荧光团或分子的链霉抗生物素蛋白分子接触。
在一些实施方案中，双功能融合蛋白包含多于一个的rcSso7d抗原结合蛋白。在一些实施方案中，双功能融合蛋白包含至少或2、至少或3、至少或4、至少或5、至少或6、至少或7、至少或8、至少或9、至少或10、至少或12、至少或14、至少或16、至少或18、至少或20、至少或25、至少或30、至少或35、至少或40、至少或45、至少或50、至少或55、至少或60、至少或65、至少或70、至少或75、至少或80、至少或85、至少或90、至少或95、或者至少或100个抗原结合蛋白或结构域，例如本文中公开的任何rcSso7d或其变体。
在一些实施方案中，将多于一个的抗原结合蛋白或结构域，例如本文中公开的任何rcSso7d或其变体遗传融合在一起。通过使用表达载体将多于一个的抗原结合蛋白或结构域，例如本文中公开的任何rcSso7d或其变体，遗传融合在一起，所述表达载体包含编码该抗原结合蛋白或结构域的核酸序列的多于一个拷贝。在一些实施方案中，通过编码接头的核酸将编码一个抗原结合蛋白或结构域的核酸序列与编码一个抗原结合蛋白或结构域的另一核酸序列分开。本文中考虑的核酸编码的接头的一些非限制性实例包括蛋白质接头或肽接头，例如Gly-Ser接头(例如，包括氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：125)的接头，称为(G4S)3)。Gly-Ser接头可重复n次，例如，其中，n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30。本文中还考虑了本文中公开和/或本领域普通技术人员已知的接头的另一些非限制性实例。在一些实施方案中，不将多于一个的抗原结合蛋白或结构域，例如本文中公开的任何rcSso7d或其变体遗传融合在一起。在一些实施方案中，将多于一个的抗原结合蛋白或结构域，例如本文中公开的任何rcSso7d或其变体化学融合。在一些实施方案中，将多于一个的抗原结合蛋白或结构域，例如本文中公开的任何rcSso7d或其变体化学融合在一起。在已从核酸序列表达蛋白质之后，通过化学试剂将多于一个的抗原结合蛋白或结构域，例如本文中公开的任何rcSso7d或其变体化学融合。在一些实施方案中，在表达例如来自表达载体的抗原结合蛋白或结构域，例如本文中公开的任何rcSso7d或其变体之后，将多于一个的抗原结合蛋白或结构域，例如本文中公开的任何rcSso7d或其变体化学融合。在一些实施方案中，通过接头，例如双功能接头，或使用本领域普通技术人员已知的其他方法将多于一个的rcSso7d抗原结合蛋白化学融合。在一些实施方案中，通过经由在N端和C端的半胱氨酸残基之间的二硫键或者经由双马来酰亚胺化学试剂的融合将多于一个的抗原结合蛋白或结构域，例如本文中公开的任何rcSso7d或其变体化学融合。在一些实施方案中，本文中还考虑了体内连接标签(例如HALO或SPY标签)以将正交反应性部分与抗原结合蛋白或结构域，例如本文中公开的任何rcSso7d或其变体连接，从而允许单独的分子一起反应。在一些实施方案中，抗原结合蛋白或结构域，例如本文中公开的任何rcSso7d或其变体的残基可被化学改变以表征醛部分，所述醛部分可与伯胺反应以形成共价亚胺键(参见例如，Tuley etal.，Chemical communications(2014)50(56)：7424-7426.doi：10.1039/c4cc02000f)。在一些实施方案中，基于分选酶(sortase)的方法可用于抗原结合蛋白或结构域，例如本文中公开的任何rcSso7d或其变体的体外融合。
在一些实施方案中，双功能融合蛋白或复合体在溶液中。在一些实施方案中，溶液包括缓冲剂，例如本领域普通技术人员已知的缓冲剂。双功能蛋白可以以所期望的浓度存在于溶液中。在一些实施方案中，双功能融合蛋白的期望浓度为5μM或约5μM、10μM或约10μM、15μM或约15μM、20μM或约20μM、25μM或约25μM、30μM或约30μM、35μM或约35μM、40μM或约40μM、45μM或约45μM、50μM或约50μM、60μM或约60μM、70μM或约70μM、80μM或约80μM、90μM或约90μM、100μM或约100μM、200μM或约200μM、300μM或约300μM或者400μM或约400μM。
在一些实施方案中，使本文中所述的双功能融合蛋白与含纤维素基底接触约5秒、约15秒、约20秒、约30秒、约35秒、约40秒、约45秒、约1分钟、约1.5分钟、约2分钟、约2.5分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约7分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约30分钟或约1小时。
在一些实施方案中，使与含纤维素基底结合的双功能融合蛋白与包含目的抗原的样品接触。在一些实施方案中，使本文中所述的双功能融合蛋白与包含目的抗原的样品接触，其中目的抗原与双功能融合蛋白结合并形成复合体；然后使复合体与含纤维素基底接触足以使复合体与含纤维素基底结合的时间。
在一些实施方案中，样品是生物样品。生物样品可从对象中获得。本文中所述的术语“生物样品”通常用于指从对象中获得的任何生物材料。生物样品通常是流体样品。可使用本领域中的常规方法将固体组织制成流体样品。在一些实施方案中，生物样品是从对象中获得的组织、粪便或细胞。在一些实施方案中，生物样品包含来自对象的体液。体液可以是从对象身体中任何地方，优选外周位置分离的流体，包括但不限于例如，血液、血浆、血清、尿、痰、脊液、脑脊液、胸膜液、乳头抽吸物、淋巴液、呼吸道液、肠道液和泌尿生殖道液、泪液、唾液、乳汁、来自淋巴系统的流体、精液、器官内系统液、腹水液、肿瘤囊肿液、羊膜液，或其组合。
在一些实施方案中，含纤维素基底是纸(例如，色谱纸)或硝酸纤维素。在某些实施方案中，将含纤维素基底在氧化化学浴中进行改性以产生蛋白质与基底的共价化学键，并用封闭剂进行钝化(参见例如，Y.Zhu，et al.，Anal Chem.(2014)86：2871-5；M.Vuoriluoto，et al.，ACS Appl.Mater.Interfaces(2016)8，5668-78)，以降低非特异性蛋白质吸附至基底，或者与稳定化物质例如海藻糖进行预孵育以提高测定功能性和稳定性。在某些实施方案中，不对含纤维素基底进行改性(未改性的)。在一些实施方案中，含纤维素基底是未改性的色谱纸，例如未改性的
1级定性过滤纸。本文中还考虑了含纤维素基底的另一些非限制性实例，包括纤维素粉末、纤维素微珠、纤维素织物/纱等。
在一些实施方案中，对含纤维素基底进行氧化。在一些实施方案中，用偏高碘酸钠对含纤维素基底进行氧化，以用醛基使纤维素表面官能化，或者用本领域普通技术人员已知的其他方法使纤维素氧化(参见例如，Badu-Tawiah，et al.，Lab Chip，(2015)15：655-9)。
例如，一个非限制性实例是使用与含纤维素基底，例如色谱纸(例如，
1级定性过滤纸)结合的rcSso7d.Rv1656-CBD双功能融合蛋白，使其与包含目的抗原，例如从患有或怀疑患有结核的对象中获得的活动性结核的基于尿的生物标志物的样品接触，在一些情况下，其可用于确定对象是否患有结核。在一些实施方案中，结核的生物标志物是Rv1656。
可通过本文中所述的任何方法通过本文中所述的任何双功能融合蛋白检测的结核生物标志物的另一些非限制性实例包括引起结核的细菌(即，结核分枝杆菌)的检测物、结核分枝杆菌基因组的特定区域，例如通过GeneXpert MTB/RIF核酸扩增测试检测到的区域的检测物。结核的目的抗原的另一些实例包括从结核分枝杆菌中脱落进入一种或更多种感染组织周围的体液中的抗原，其可到达血液循环并且从对象身体中排出，例如在尿中。可从肺结核或肺外结核二者中检测到抗原。可从潜伏性结核中检测到抗原或目的抗原，如果潜伏性结核已被鉴定/确认(参见例如，Tucci et al.，Front Microbiol(2014)5(549)：1-6)。例如，脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)是从代谢活性或降解性细胞中脱落的所有分枝杆菌外细胞壁的组分，其被肾清除并且可在尿中检测到，其可通过本文中所述的双功能融合蛋白和方法进行检测(参见例如，Hunter et al.J Biol Chem(1986)261(26)：12345-51；Chan etal.Infect Immun(1991)59(5)：1755-61)。
用于检测和诊断结核的可使用本文中所述的双功能融合蛋白和方法检测的抗原的另一些非限制性实例(参见例如，Tucci et al.，Front Microbiol(2014)5(549)：1-6)列于表2中。
本文中还考虑了本领域普通技术人员已知的存在于患有结核的对象中的其他抗原，其可使用本文中所述的双功能融合蛋白、方法、组合物和试剂盒进行检测。
在一些实施方案中，目的抗原是链霉抗生物素蛋白。
在一些实施方案中，至少或约0.1微摩尔、至少或约0.2微摩尔、至少或约0.3微摩尔、至少或约0.4微摩尔、至少或约0.5微摩尔、至少或约0.6微摩尔、至少或约0.7微摩尔、至少或约0.8微摩尔、至少或约0.9微摩尔、至少或约1微摩尔、至少或约1.1微摩尔、至少或约1.2微摩尔、至少或约1.3微摩尔、至少或约1.4微摩尔、至少或约1.5微摩尔、至少或约1.6微摩尔、至少或约1.7微摩尔、至少或约1.8微摩尔、至少或约1.9微摩尔、至少或约2微摩尔、至少或约2.1微摩尔、至少或约2.2微摩尔、至少或约2.3微摩尔、至少或约2.4微摩尔、至少或约2.5微摩尔、至少或约2.6微摩尔、至少或约2.7微摩尔、至少或约2.8微摩尔、至少或约2.9微摩尔、至少或约3微摩尔、至少或约3.5、至少或约4微摩尔、至少或约4.5微摩尔或者至少或约5微摩尔的本文中所述的任何双功能融合蛋白与含纤维素基底(含纤维素基底的每克纤维素)连接。
在一些实施方案中，至少或约1μM、至少或约25μM、至少或约50μM、至少或约60μM、至少或约70μM、至少或约80μM、至少或约90μM、至少或约100μM、至少或约150μM、至少或约200μM、至少或约250μM、至少或约300μM、至少或约350μM、至少或约400μM、至少或约500μM、至少或约550μM、至少或约600μM、至少或约650μM、至少或约700μM、至少或约750μM、至少或约800μM、至少或约850μM、至少或约900μM、至少或约950μM、至少或约1mM、至少或约1.5mM、至少或约2mM、至少或约2.5mM、至少或约3mM、至少或约3.5mM、至少或约4mM、至少或约4.5mM、至少或约5mM体积平均浓度的本文中所述的任何双功能融合蛋白与含纤维素基底连接。
在一些方面中，相对于目的抗原，在双功能融合蛋白(例如与CBD连接的rcSso7d)中摩尔丰度或摩尔过量的抗原结合蛋白允许快速捕获，并且在一些实施方案中，从样品中有效且完全的消耗目的抗原。
在一些实施方案中，至少或约10倍摩尔过量的双功能融合蛋白或抗原结合蛋白从样品或溶液中完全地消耗目的抗原。在一些实施方案中，至少或约10倍的体积平均浓度过量导致快速捕获双功能融合蛋白或抗原结合蛋白和/或使其固定化。
在一些实施方案中，双功能融合蛋白摩尔过量于目的抗原。在一些实施方案中，双功能融合蛋白相对于样品中的目的抗原至少或约2倍摩尔过量、至少或约3倍摩尔过量、至少或约4摩尔过量、至少或约5倍摩尔过量、至少或约6倍摩尔过量、至少或约7倍摩尔过量、至少或约8倍摩尔过量、至少或约9倍摩尔过量、至少或约10倍摩尔过量、至少或约15倍摩尔过量、至少或约20倍摩尔过量、至少或约25倍摩尔过量、至少或约30倍摩尔过量、至少或约35倍摩尔过量、至少或约40倍摩尔过量、至少或约45倍摩尔过量、至少或约50倍摩尔过量、至少或约60倍摩尔过量、至少或约65倍摩尔过量、至少或约70倍摩尔过量、至少或约80倍摩尔过量、至少或约90倍摩尔过量、至少或约100倍摩尔过量、至少或约200倍摩尔过量、至少或约300倍摩尔过量、至少或约400倍摩尔过量、至少或约500倍摩尔过量、至少或约600倍摩尔过量、至少或约700倍摩尔过量、至少或约800倍摩尔过量、至少或约900倍摩尔过量、至少或约1000倍摩尔过量、至少或约1500倍摩尔过量或者至少或约2000倍摩尔过量。
在一些实施方案中，双功能融合蛋白过量以使得从样品中消耗目的抗原。在一些实施方案中，约或至少10％、约或至少20％、约或至少30％、约或至少40％、约或至少50％、约或至少55％、约或至少60％、约或至少65％、约或至少70％、约或至少75％、约或至少80％、约或至少81％、约或至少82％、约或至少83％、约或至少84％、约或至少85％、约或至少86％、约或至少87％、约或至少88％、约或至少89％、约或至少90％、约或至少91％、约或至少92％、约或至少93％、约或至少94％、约或至少95％、约或至少95.5％、约或至少96％、约或至少96.5％、约或至少97％、约或至少97.5％、约或至少98％、约或至少98.5％、约或至少99％、约或至少99.5％或者约100％的目的抗原从样品，例如生物样品中消耗。
在一些方面中，鉴于本公开内容的有利特性，其中可实现目的抗原从样品或溶液中的完全或接近完全消耗，可制备标准曲线。所捕获抗原的丰度可使用读出，例如荧光读出或比色读出来检测和测量或确定。
在一些实施方案中，使用蛋白质测定，例如微二辛可宁酸(BCA)测定对抗原结合蛋白(例如，rcSso7d.SA-CBD)的表面固定化浓度进行定量。通过使已知量的蛋白质蒸发到纤维素测试区上，使这些测试区沉积到微BCA测定的孔中，以及以该形式对信号发生进行定量，可制备标准曲线。对于实验样品，遵循相同的步骤(在基底洗涤步骤之后)，然后将每个样品的相关信号映射到该标准曲线，以确定固定化的rcSso7d.SA-CBD的质量。
在一些实施方案中，样品是来自对象的生物样品。对象包括但不限于任何哺乳动物，例如人、灵长类、小鼠、大鼠、狗、猫、马或农业家畜(agricultural stock)(例如，鱼、猪、牛、绵羊、和鸟-特别是鸡)。在某些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，样品是溶液，例如缓冲溶液。
在一些实施方案中，在检测被经工程化的减电荷Sso7d抗原结合蛋白(例如，rcSso7d)结合的目的抗原之前，将含纤维素基底用缓冲溶液进行清洗。在一些实施方案中，缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline，PBS)或本领域普通技术人员已知的另外的缓冲液，其为大分子，例如蛋白质、蛋白质复合体、抗原等提供了稳定的环境。
在一些实施方案中，该方法还包括检测由双功能融合蛋白中的经工程化的减电荷Sso7d抗原结合蛋白(例如，rcSso7d)结合的目的抗原。在一些实施方案中，使与双功能融合蛋白结合的目的抗原与含纤维素基底接触，其中双功能融合蛋白的CBD结合含纤维素基底(例如，色谱纸，例如
1级定性过滤纸)。该方法允许目的抗原与可存在于样品，例如生物样品(例如，尿)中的任何其他分子分开或分离。在一些实施方案中，目的抗原的存在或量使用特异性识别目的抗原并生成信号的信号生成试剂来确定或测量。
在一些实施方案中，使双功能融合蛋白(例如，rcSso7d-CBD)固定化在纤维素基底(例如，色谱纸、纤维素粉末等)上，并且然后使其与带有目的抗原的溶液/生物样品接触(强制对流以使流体穿过或通过测试区，或者将CBD/基底与抗原进行可溶性共孵育)。然后使该固定化的复合体与rcSso7d的第二表位特异性变体(不与CBD融合，而是与生物素接纳体序列融合，或者用荧光团修饰的)接触。第二物质(例如，rcSso7d)将与所捕获抗原的第二表位结合。该第二物质将与转导该结合反应的手段结合；数个实例概述于下。所有这些步骤可在含纤维素基底上直接进行。
可与抗原结合蛋白(例如，rcSso7d)融合的信号生成的一些非限制性实例包括但不限于金纳米颗粒、产生比色响应的酶(表达为融合伴侣或与rcSso7d间接结合)、产生电流(amperometric)或阻抗(impedometric)信号的酶(例如，葡糖氧化酶)、可引发聚合反应的大分子光引发剂(macrophotoinitiator)、纤维素纳米珠、其他金属纳米颗粒、染料填充的脂质体、可酶促扩增的DNA、可表达用于产生产色酶的RNA，等等。信号生成试剂的存在或量可使用成像装置，例如数字成像仪来检测。检测信号生成试剂的另一些非限制性实例包括金纳米颗粒，其可在即时护理(point-of-care)环境中使用，并且是在传统妊娠测试中使用的试剂。由抗原结合相互作用介导的金纳米颗粒的空间定位使光信号集中(光信号也因表面等离体子共振的发生而放大)。这可由肉眼进行检测。基于聚合的扩增将使用大分子光引发剂的定位，以在与单体溶液孵育以及用合适波长的光辐照之后产生快速、持久的聚合响应。在施加碱性溶液之后，携带的酚酞产生高对比度的比色读出，其可用肉眼进行检测。电流法，例如将葡糖氧化酶与第二rcSso7d物质融合，以及使受试物与金探针和葡萄糖溶液接触，将允许基于智能电话的检测。也可使用酶法，并且其依赖于第二物质(例如，rcSso7d)与酶的融合，以及使受试物与不稳定的底物接触，所述不稳定的底物在酶切割之后变色。检测信号生成试剂的阻抗方法也是可以的，并且可使用与智能电话兼容的适配器来实现。
在一些方面中，本文中还提供了用于增强测定灵敏度的方法。该方法包括靶标与靶标结合物质的结合，这包括将与目的靶标结合的靶标结合物质与纤维素结合结构域(CBD)融合。可与纤维素结合结构域连接的任何抗原结合蛋白均可从其良好的特性中受益；双功能融合蛋白与CBD的高固定化丰度导致结合物质的高摩尔丰度，从而在一些情况下允许目的抗原的消耗和该物质的高局部浓度，从而在一些情况下允许快速捕获目的抗原。在一些实施方案中，目的抗原在溶液中。与其中固定化的结合伴侣是限制性试剂并且目的抗原被缓慢且不完全地捕获的传统免疫测定相反，本公开内容允许抗原捕获/检测迅速进行至完成。另外，因为双功能融合蛋白以及抗原结合结构域的高局部丰度，因此这允许使用包含更高量抗原的更高样品体积，在一些情况下，所述抗原被捕获和消耗，从而提供了高于其中抗原结合物质实际上是限制性试剂，从而降低了在给定点可捕获和检测的抗原量的本领域中先前可用方法的信号。这可通过将结合支架表达为CBD的融合伴侣来应用于任何结合支架。
靶标结合结构域
在一些实施方案中，本文中所述的任何靶标结合结构域或任何其变体都不是本文中所述的双功能融合蛋白的一部分。在一些实施方案中，本文中所述的任何靶标结合结构域，例如不是双功能融合蛋白(例如，rcSso7d-CBD)的一部分的rcSso7d或任何其变体与提高靶标结合结构域溶解度的分子或蛋白质直接或间接地连接或者与其一起表达。在一些实施方案中，提高溶解度的分子或蛋白质是麦芽糖结合蛋白(MBP；例如，基因ID：1097664)或包含以下氨基酸序列的MBP：
在一些实施方案中，提高溶解度的分子或蛋白质是小泛素样修饰物(SUMO；例如如，基因ID：7341)、谷胱甘肽S-转移酶(GST；例如基因ID：101890455)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP；例如，基因ID：20473140)或硫氧还蛋白(TRX；例如，基因ID：22166)。本文中还考虑了本领域普通技术人员已知的提高蛋白质或蛋白质构建体的溶解度的其他分子或蛋白质。
在一些实施方案中，本文中公开的任何靶标结合结构域均包含生物素接纳体序列。在一些实施方案中，本文中公开的任何靶标结合结构域是化学生物素化的。本文中公开的靶标结合结构域可通过本领域普通技术人员已知的方法进行化学生物素化。用于使蛋白质化学生物素化的方法的一些非限制性实例包括使用磺基-NHS-LC-生物素。在一些实施方案中，用于使蛋白质化学生物素化的方法是NHS与具有不同接头臂的生物素缀合的变化形式(例如，磺基-NHS-生物素、磺基-NHS-LC-生物素、磺基-NHS-LC-LC-生物素)。用于使蛋白质化学生物素化的方法的另一些非限制性实例包括巯基缀合[例如，BMCC-生物素(1-生物素酰氨基-4-[4’-(马来酰亚胺甲基)环己烷-羧酰胺基]丁烷))、碘乙酰基-生物素和吡啶基二硫醇-生物素]。
在一些实施方案中，含纤维素基底是氧化的。在一些实施方案中，靶标结合结构域，例如rcSso7d，包含一个或更多个生物素接纳体。在一些实施方案中，靶标结合结构域包含至少1个或1个、至少2个或2个、至少3个或3个、至少4个或4个、至少5个或5个、至少6个或6个、至少7个或7个、至少8个或8个、至少9个或9个、至少10个或10个、至少15个或15个、至少20个或20个、至少25个或25个、至少30个或30个、至少35个或35个、至少40个或40个、至少45个或45个、至少50个或50个或者至少100个或100个生物素接纳体。在一些实施方案中，生物素接纳体是氨基酸序列。在一些实施方案中，生物素接纳体是生物素分子。在一些实施方案中，将生物素分子化学添加至本文中所述的任何靶标结合结构域，例如rcSso7d或任何其变体。
在一些实施方案中，本文中所述的抗原或目的抗原与氧化的纤维素基底结合。在一些实施方案中，使抗原或目的抗原与包含一个或更多个生物素接纳体的靶标结合结构域接触并形成复合体。在一些实施方案中，使包含一个或更多个生物素接纳体的靶标结合结构域与链霉抗生物素蛋白分子接触。在一些实施方案中，对链霉抗生物素蛋白进行标记或将其与发出可检测信号的荧光团或分子连接。
疾病与病症
本文中所述的双功能融合蛋白、组合物、方法和试剂盒可用于检测响应于多种疾病或病症而产生的分子，例如抗原的存在。可进行检测的产生分子，例如抗原的疾病或病症的一些非限制性实例包括释放目的抗原的疾病或病症，例如癌症、心血管疾病、感染性疾病、肝病例如肝衰竭、阿尔茨海默病、帕金森病或自身免疫病。理论上可进行检测具有相关生物化学特征的任何病症。
癌症可以是恶性或非恶性癌症。癌症或肿瘤包括但不限于胆道癌；脑癌；乳腺癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食管癌；胃癌；上皮内赘生物；淋巴瘤；肝癌；肺癌(例如，小细胞和非小细胞)；黑素瘤；神经母细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤；皮肤癌；睾丸癌；甲状腺癌；和肾癌，以及其他癌和肉瘤。在一些实施方案中，癌症是毛细胞白血病；慢性髓细胞性白血病；皮肤T细胞白血病；多发性骨髓瘤；滤泡性淋巴瘤；恶性黑素瘤；鳞状细胞癌；肾细胞癌；前列腺癌；膀胱细胞癌或结肠癌。
感染性疾病可由细菌、病毒、真菌或寄生物引起。细菌引起这样的疾病：例如链球菌性喉炎(strep throat)、尿路感染和结核。病毒引起多种疾病，从普通感冒到AIDS不等。真菌引起多种皮肤疾病，例如癣和运动员足(athlete’s foot)，或者可还影响肺和/或神经系统。寄生物可引起疾病，例如疟疾。
自身免疫病是一类这样的疾病，其中对象自身的抗体与宿主组织反应，或者其中免疫效应T细胞对内源性自身肽具有自身反应性并引起组织破坏。因此，针对对象的自身抗原(称为自身抗原)产生了免疫应答。自身免疫病包括但不限于类风湿性关节炎；克罗恩病(Crohn’s disease)；多发性硬化；系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)；自身免疫性脑脊髓炎；重症肌无力(myasthenia gravis，MG)；桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)；肺出血-肾炎综合征(Goodpasture’s syndrome)；天疱疮(例如，寻常型天疱疮)；格雷夫斯病(Grave’s disease)；自身免疫性溶血性贫血；自身免疫性血小板减少性紫癜；具有抗胶原蛋白抗体的硬皮病；混合性结缔组织病；多肌炎；恶性贫血；特发性艾迪生病(idiopathic Addison’s disease)；自身免疫性相关不育；肾小球肾炎(例如，新月体性肾小球肾炎、增生性肾小球肾炎)；大疱性类天疱疮；干燥综合征(
syndrome)；胰岛素抵抗和自身免疫性糖尿病。
在一些实施方案中，疾病或病症是前列腺癌，并且可进行检测的抗原是PSA。在一些实施方案中，疾病或病症是心脏停搏，并且可进行检测的目的抗原是肌钙蛋白。在一些实施方案中，疾病或病症是阿尔茨海默病，并且可进行检测的目的抗原是τ蛋白。在一些实施方案中，疾病或病症是HIV，并且可进行检测的目的抗原是IP-10。在一些实施方案中，疾病或病症是血吸虫病，并且可进行检测的目的抗原是血吸虫GST。在一些实施方案中，疾病或病症是卵巢癌，并且可进行检测的目的抗原是CA-125。在一些实施方案中，疾病或病症是莱姆病，并且可进行检测的目的抗原是ospA。
在一些实施方案中，本文中还考虑了由载体播散的疾病(例如，基孔肯雅(chikungunya)、查加斯(Chagas)、埃博拉(Ebola)、腺鼠疫(bubonic plague)、莱姆病、布鲁菌病(brucellosis)、脑炎等)产生的抗原或目的抗原；本文中还考虑了由食物/水播散的疾病(例如，腹泻、霍乱、血吸虫病、牛海绵状脑病(朊病毒)等)产生的抗原或目的抗原；本文中还考虑了由患者之间传播的感染性疾病(例如，结核(ESAT-6/CFP-10/Rv1656/LAM)、HIV(CD32a)、流行性感冒(HA)、鼻炎、肺炎、支气管炎、梅毒、淋巴结炎(gonnorhea)、甲型/乙型/丙型肝炎、HPV等)产生的抗原或目的抗原；本文中还考虑了由慢性疾病(糖尿病/糖尿病前期(糖化血红蛋白)、贫血(血红蛋白)、肝硬化、心脏停搏(肌钙蛋白)、阿尔茨海默病、自身免疫病等)产生的抗原或目的抗原。本文中还考虑了一般健康测定(蛋白质尿分析等)、牲畜测定、癌症治疗剂的伴随诊断剂。
组合物
在一些方面中，还提供了本文中所述的双功能融合蛋白的组合物。在一些实施方案中，该组合物包含与含纤维素基底结合的本文中所述的任何双功能融合蛋白。在一些实施方案中，含纤维素基底是纸(例如，色谱纸)或硝酸纤维素。在某些实施方案中，将含纤维素基底在氧化化学浴中进行改性以产生蛋白质与基底的共价化学键，用封闭剂进行钝化以降低非特异性蛋白质吸附至基底，或者与稳定化物质例如海藻糖进行预孵育，以提高测定功能性和稳定性。在某些实施方案中，不对含纤维素基底进行改性(未改性的)。在一些实施方案中，含纤维素基底是未改性的色谱纸，例如未改性的
1级定性过滤纸。本文中还考虑了含纤维素基底的另一些非限制性实例，包括纤维素粉末、纤维素微珠或纤维素织物/纱等。
在一些实施方案中，至少或约0.1微摩尔、至少或约0.2微摩尔、至少或约0.3微摩尔、至少或约0.4微摩尔、至少或约0.5微摩尔、至少或约0.6微摩尔、至少或约0.7微摩尔、至少或约0.8微摩尔、至少或约0.9微摩尔、至少或约1微摩尔、至少或约1.1微摩尔、至少或约1.2微摩尔、至少或约1.3微摩尔、至少或约1.4微摩尔、至少或约1.5微摩尔、至少或约1.6微摩尔、至少或约1.7微摩尔、至少或约1.8微摩尔、至少或约1.9微摩尔、至少或约2微摩尔、至少或约2.1微摩尔、至少或约2.2微摩尔、至少或约2.3微摩尔、至少或约2.4微摩尔、至少或约2.5微摩尔、至少或约2.6微摩尔、至少或约2.7微摩尔、至少或约2.8微摩尔、至少或约2.9微摩尔、至少或约3微摩尔、至少或约3.5微摩尔、至少或约4微摩尔、至少或约4.5微摩尔或者至少或约5微摩尔的本文中所述的任何双功能融合蛋白与含纤维素基底(含纤维素基底的每克纤维素)连接。
在一些实施方案中，至少或约1μM、至少或约25μM、至少或约50μM、至少或约60μM、至少或约70μM、至少或约80μM、至少或约90μM、至少或约100μM、至少或约150μM、至少或约200μM、至少或约250μM、至少或约300μM、至少或约350μM、至少或约400μM、至少或约500μM、至少或约550μM、至少或约600μM、至少或约650μM、至少或约700μM、至少或约750μM、至少或约800μM、至少或约850μM、至少或约900μM、至少或约950μM、至少或约1mM、至少或约1.5mM、至少或约2mM、至少或约2.5mM、至少或约3mM、至少或约3.5mM、至少或约4mM、至少或约4.5mM、至少或约5mM体积平均浓度的本文中所述的任何双功能融合蛋白与含纤维素基底连接。
试剂盒
在一些方面中，在试剂盒中提供了本文中所述的双功能融合蛋白和组合物。在一些实施方案中，试剂盒用于评估分子，例如抗原或目的抗原的存在或量，并且包含含有本文中所述的任何双功能融合蛋白的容器。
在一些实施方案中，试剂盒还包含含纤维素基底。在一些实施方案中，双功能融合蛋白与含纤维素基底结合。在一些实施方案中，至少或约0.1微摩尔、至少或约0.2微摩尔、至少或约0.3微摩尔、至少或约0.4微摩尔、至少或约0.5微摩尔、至少或约0.6微摩尔、至少或约0.7微摩尔、至少或约0.8微摩尔、至少或约0.9微摩尔、至少或约1微摩尔、至少或约1.1微摩尔、至少或约1.2微摩尔、至少或约1.3微摩尔、至少或约1.4微摩尔、至少或约1.5微摩尔、至少或约1.6微摩尔、至少或约1.7微摩尔、至少或约1.8微摩尔、至少或约1.9微摩尔、至少或约2微摩尔、至少或约2.1微摩尔、至少或约2.2微摩尔、至少或约2.3微摩尔、至少或约2.4微摩尔、至少或约2.5微摩尔、至少或约2.6微摩尔、至少或约2.7微摩尔、至少或约2.8微摩尔、至少或约2.9微摩尔、至少或约3微摩尔、至少或约3.5、至少或约4微摩尔、至少或约4.5微摩尔或者至少或约5微摩尔的本文中所述的任何双功能融合蛋白与含纤维素基底(含纤维素基底的每克纤维素)连接。
在一些实施方案中，至少或约1μM、至少或约25μM、至少或约50μM、至少或约60μM、至少或约70μM、至少或约80μM、至少或约90μM、至少或约100μM、至少或约150μM、至少或约200μM、至少或约250μM、至少或约300μM、至少或约350μM、至少或约400μM、至少或约500μM、至少或约550μM、至少或约600μM、至少或约650μM、至少或约700μM、至少或约750μM、至少或约800μM、至少或约850μM、至少或约900μM、至少或约950μM、至少或约1mM、至少或约1.5mM、至少或约2mM、至少或约2.5mM、至少或约3mM、至少或约3.5mM、至少或约4mM、至少或约4.5mM、至少或约5mM体积浓度的本文中所述的任何双功能融合蛋白与含纤维素连接。
在一些实施方案中，双功能融合蛋白与含纤维素基底结合。在一些实施方案中，含纤维素基底是纸(例如，色谱纸)、硝酸纤维素或纤维素粉末。在某些实施方案中，将含纤维素基底在氧化化学浴中进行改性以产生蛋白质与基底的共价化学键，用封闭剂进行钝化以降低非特异性蛋白质吸附至基底，或者与稳定化物质例如海藻糖进行预孵育，以提高测定功能性和稳定性。在某些实施方案中，不对含纤维素基底进行改性(未改性的)。在一些实施方案中，含纤维素基底是未改性的色谱纸，例如未改性的
1级定性过滤纸。本文中还考虑了含纤维素基底的另一些非限制性实例，包括纤维素粉末或纤维素微珠、纤维素织物/纱。
实施例
实施例1：抗原消耗方案中的基于纸的诊断剂：用于有效靶标捕获的高密度固定化
的Resso7d-纤维素-结合结构域融合蛋白
材料和方法
材料
除非另外指明，否则所有化学试剂、生物材料和消耗品均购自与参考文献1的补充信息中所述的相同来源。所有DNA克隆酶均购自New England Biolabs(Ipswich，MA，USA)。链霉抗生物素蛋白-伊红-缀合物如前所述进行制备(Miller et al.，2016，SI)。
基于rcSso7d的结合变体的酵母菌表面展示选择和表征
rcSso7d.SA的开发和选择在先前的工作中进行了描述(Miller et al.，2016)。rcSso7d的Rv1656结合变体是从基于减电荷Sso7d支架(rcSso7d)的酵母菌表面展示文库中以相似的方式进行选择。该酵母菌文库使用三核苷酸寡核苷酸合成以及与线性化pCTcon2质粒在体内同源重组来生成(Traxlmayr et al.，2016)。
高亲合力磁珠分选(MBS)(Ackerman et al.，2009)和荧光激活细胞分选(FACS)(Chao et al.，2006)均用于选择针对生物素化Rv1656靶标的结合剂(图8)。经过五轮基于FACS的文库筛选，提高了分选严格性，在此之后对子文库进行测序并选择rcSso7d.Rv1656进行进一步表征。该物质的亲和力以酵母菌表面展示形式，通过针对所展示rcSso7d变体进行生物素化的Rv1656的可溶性滴定进行评估。
重组蛋白的表达、纯化和表征
如前所述，将rcSso7d.SA和rcSso7d.Rv1656的基因均从pCTcon2酵母菌均展示质粒克隆到pET28b(+)细菌表达质粒中(Miller et al.，2016)。rcSso7d.SA-CBD基因产物由Integrated DNA Technologies(IDT；Coralville，IA，USA)通过基因合成产生，以及使用传统的PCR克隆将rcSso7d.Rv1656模块整合到该rcSso7d-CBD融合构建体中。将所有基因产物均用N端六组氨酸标签进行修饰，以通过固定化金属亲和色谱法(immobilized metalaffinity chromatography，IMAC)进行纯化。pET14b-Rv1656质粒由Forsyth机构的AntonioCampos-Neto博士的实验室提供(Napolitano et al.，2008)。
所有蛋白质物质的异源表达均在大肠杆菌的BL21(DE3)菌株中进行，并通过添加0.5mM异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)进行诱导。将经诱导的细胞通过超声进行裂解，并通过IMAC从澄清的裂解物中纯化重组产物。使用3kDa Amicon超速离心过滤盒将9.24kDa rcSso7d单体进行缓冲液更换1,000倍成重悬缓冲液(40mM乙酸钠，pH 5.5)。使用3.5kDa MWCO Slide-A-Lyzer透析盒(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)对以CBD融合伴侣为特征的产物进行缓冲液更换，以防止CBD融合产物吸附至旋转过滤器的乙酸纤维素膜。
Rv1656使用BL21(DE3)大肠杆菌以相似的方式进行表达，并使用10kDa MWCOSlide-A-Lyzer透析盒重悬于50mM HEPES缓冲液(pH 8.0)中。将纯化的Rv1656使用来自Thermo Fisher Scientific的EZ-Link磺基-NHS-LC-生物素No-Weigh形式标签试剂盒进行生物素化，并且然后使用来自Santa Cruz Biotech(Dallas，TX，USA)的微G-25旋转柱(Micro G-25 Spin Column)进行脱盐。
所有纯化蛋白质的浓度均使用二辛可宁酸(BCA)测定进行评估，并一式三份测试所有标准品和纯化样品以提高准确性。蛋白质纯度使用新鲜铸造的15％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝胶(使用考马斯亮蓝G-250染色)进行评估。
生物功能纤维素测试区的制造和测试
将未改性的Whatman No.1色谱纸用作使rcSso7d-CBD融合蛋白固定化的载物(ship)。为了能够使缺少CBD融合伴侣的rcSso7d变体共价固定化，如前所述，使WhatmanNo.1色谱纸在30mM偏高碘酸钠溶液中官能化(Miller et al.，2016)。将该氧化的、醛官能化的纤维素在干燥器中于真空下储存直至使用，而非官能化纸则在环境条件下储存。如前所述，使用固体墨水打印机(solid ink printer)产生测试区阵列，并将该打印蜡融化到纸厚度(0.18mm)中，以得到平均面积为2.5±0.1mm2(除非另外指出)的测试区。
将纯化的rcSso7d和rcSso7d-CBD变体的储备溶液在重悬缓冲液中稀释至期望的浓度。对于裸rcSso7d物质，还以10％的最终体积浓度向溶液中添加甘油，以防止在延长的初始孵育期间蒸发。除非另外指明，否则将所有结合蛋白溶液以30μM的最终浓度进行制备。官能化纸样品的阴性对照由与1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)接触的测试区组成。将裸纸测试区用作未改性纸样品的阴性对照。
如先前工作中所述，将官能化的测试区用裸rcSso7d变体进行改性，洗涤并在Tris缓冲盐水中中和。将两种rcSso7d-CBD变体以6μL等分试样均与未改性的纸接触至少三十秒，并且然后在20μL的1x磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH 7.4)中洗涤两次。
然后使经蛋白质包被的测试区与10μL的相关抗原接触，在无菌过滤的1x PBS/1％w/v BSA中稀释至期望的浓度。使rcSso7d.SA和rcSso7d.SA-CBD物质与如先前所述制备的链霉抗生物素蛋白伊红(SA-E)(Miller et al.，2016)或来源于Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)的链霉抗生物素蛋白Alexa Fluor 647(SA-AF647)接触。使rcSso7d.Rv1656-CBD与生物素化的重组Rv1656接触。将所有测试区与抗原溶液在室温下孵育30分钟，在此之后将其用PBS洗涤两次。在此期间，将阴性对照在不存在可溶性抗原的情况下在PBS中孵育。
然后，将并入rcSso7d.Rv1656和rcSso7d.Rv1656-CBD的测定与浓度为256nM的SA-E/SA-AF647进行另外的30分钟孵育。SA-E样品在包含1％BSA的柠檬酸-磷酸钠缓冲液体系(50mM柠檬酸，90mM Na2HPO4，pH 4.5)中进行制备，并在缺少BSA的相同酸性缓冲液中洗涤，以降低rcSso7d.Rv1656-CBD与伊红试剂的非特异性结合(图14)。将显影的样品吸干，并于黑暗中储存在冷冻箱中，直至需要进行荧光显微术成像。
荧光显微术
将所有样品使用Olympus 1X81显微镜如前所述(Miller et al.，2016)进行成像。除非另外指出，否则将用SA-E显影的所有样品使用Semrock TxRed-4040C滤光片组曝光1000ms。将用SA-AF647显影的样品使用Semrock Cy5-4040C滤光片组曝光80ms或100ms(如所指出的)。每个样品区的界限使用ImageJ自动阈值功能(默认算法)来鉴定，并且每个样品的平均荧光强度(MFI)通过对阈值区域内所有像素的亮度求平均来计算。针对所有实验条件制备四个技术重复，并将所有重复的所得MFI值求平均。误差棒表示与该平均强度值的一个标准差。
表面固定化的CBD融合蛋白的定量
使用微BCA测定(Thermo Fisher Scientific)确定经工程化的rcSso7d.SA-CBD融合蛋白在非官能化Whatman No.1色谱纸上的固定化表面密度。通过使测试区与已知质量的rcSso7d.SA-CBD接触并使这些溶液在室温下于真空室中蒸发30分钟，从而使蛋白质完全吸附至纤维素基底来制备一系列标准品。通过向测试区施加一系列已知可溶性浓度的rcSso7d.SA-CBD，随后进行PBS洗涤步骤，产生实验样品。
从测试条(test strip)中切下所有样品，并将其沉积到预填充有150μL 40mM乙酸钠(pH 5.5)的96孔板的孔中。将这些测试区用干净的吸管端(pipette tip)剧烈搅拌，并且然后向每个样品孔添加150μL的工作试剂。将该板在37℃下孵育两个小时，并且在取出纸测试区(将任何携带的流体旋回样品孔中)之后，对所有样品在562nm处的吸光度进行定量。
将经蒸发的标准品的响应曲线拟合至二阶多项式，并且该标准曲线用于确定固定化在经洗涤样品上的rcSso7d.SA-CBD的有效量。通过对这些实验确定的量与施加至表面的已知蛋白质质量进行比较，计算比例rcSso7d.SA-CBD保留。为了对在这些处理条件下纤维素基底的结合能力进行定量，一式三份地测量Whatman No.1色谱纸的密度，并且发现为0.088±0.00016mg/mm2。测试区的面积通过确定40x放大率下的像素密度(0.287兆像素/mm2)并在ImageJ中测量阈值测试区面积来测量。对于该微BCA实验，发现测试区的平均面积为3.65±0.25mm2，对应于0.32±0.021mg的纤维素质量。
组合文库筛选
将rcSso7d变体的经pCTcon2编码的文库进行表达，并作为与酵母菌Aga2p交配蛋白(mating protein)的C端融合体输出至酵母菌膜的外部。这允许基于所展示蛋白质的结合活性选择酵母菌载体细胞，从而使群体遗传学偏向于编码功能性rcSso7d变体的质粒。为了选择针对重组Rv1656b抗原的结合变体，使用两轮靶标阳性MBS以将文库多样性从14亿降低至约100万，并且使用一轮靶标阴性MBS以消耗链霉抗生物素蛋白-结合变体的文库。然后通过五轮FACS筛选该子文库，通过降低可用抗原的浓度和所捕获文库群的比例来依次提高筛选严格性。
在最后FACS轮之后，对酵母菌亚群进行测序，并基于其优异的结合特性选择rcSso7d.Rv1656。rcSso7d.Rv1656物质的结合亲和力以酵母菌表面展示形式，通过针对所展示rcSso7d结合物质的可溶性、生物素化的Rv1656抗原的滴定进行评估。抗原浓度从256nM至0.25nM变化，并且在Rv1656的每种浓度下，将酵母菌细胞以足够的体积重悬，以使得抗原以十倍摩尔过量于所展示的结合物质(假设每个细胞50,000个所展示拷贝，并在60％的群体中有效展示)存在。将样品在连续混合下孵育足够的时间，以实现大于99％的理论平衡结合。在用链霉抗生物素蛋白Alexa Fluor 647进行荧光标记之后，使用BD FACSLSR Fortessa II流式细胞仪和FACSDiva软件包对细胞表面荧光进行分析。使用设置到300V电压的488nm和640nm激光器对所有样品进行分析。对所有展示rcSso7d的细胞的总几何平均荧光强度进行定量，并将S形函数拟合到这些数据点，以确定rcSso7d.Rv1656结合物质的亲和力。
基因构建体的产生
如前所述，将rcSso7d-Rv1656从pCTcon2酵母菌展示质粒克隆到pET28b(+)细菌表达质粒中(Miller et al.，2016)。简言之，使用rcSso7d-正向和rcSso7d-反向引物(表3)在58.3℃的退火温度下进行所期望基因的聚合酶链式反应(PCR)扩增。将该PCR扩增子在37℃下进行NdeI/XhoI双重消化持续三小时(在两小时之后添加NdeI酶以防止异常切割)，随后将该切割产物在室温下连接至经消化的pET-28b(+)质粒骨架中以产生稳定的rcSso7d.RvI656构建体。将所有连接混合物使用来自Zyrno Research(Irvine，CA，USA)的DNA Clean and Concentrator-5试剂盒进行纯化，并在12μL的PCR级水中洗脱。将4μL的该连接产物通过电穿孔转化到DH5α大肠杆菌(F-
(lacZYA-argF)U169 recA1末端A1 hsdR17(rk-，mk+)gal-phoA supE44 λ-thi-1 gyrA96 relA1)中。将该转化混合物的整体种板在LB-kan板上，并在37℃下孵育过夜。使用T7启动子和T7终止子测序引物通过N端和C端测序二者验证阳性克隆。
该一般工作流程用于所有克隆项目，并且所有相关引物均可见于表3。另一些克隆项目涉及1)对rcSso7d.SA-CBD基因块(GeneBlock)进行扩增并将其整合到pET28b(+)质粒中(引物：rcSso7d-正向/CBD-反向；Tm：58.3℃)，以及将rcSso7d.Rv1656基因整合到CBD构建体中(引物：rcSso7d正向/rcSso7d-BamHI-反向；Tm：58.3℃)。在该后面的项目中，将PCR扩增子和pET28b(+)质粒均在37℃下进行Ndel/BamHI双重消化持续一小时，以切下rcSso7d.SA基因并制备互补的黏性末端。将所有经序列验证的质粒通过电穿孔转化到BL21(DE3)(F-ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-)λ(DE3))大肠杆菌中进行表达和纯化。
表3：用于所选择结合剂rcSso7d.SA和rcSso7d.Rv1656的测序反应和质粒克隆中的引物的寡核苷酸序列。
单价结合体系精确解析解的推导
对于单价结合体系，其中[L]和[R]分别表示游离配体和游离受体的体积摩尔浓度，并且[LR]表示结合的复合体的浓度，配体捕获反应可使用以下一阶微分方程进行描述：
还注意：
[L]＝[L]0-[LR]
并且
[R]＝[R]0-[LR]
因此：
相乘并再布置：
为简单起见，这些术语应称为：
a＝[L]0[R]0
b＝-([L]0+[R]0+KD)
c＝1
因此：
进行变量分离，得出以下形式的方程：
这属于Riccati方程类别，并且可进行隐式求解。该积分还以CRC Handbook ofChemistry and Physics(式108)，以下形式进行制表：
其中：
X＝a+bx+cx2
并且
q＝4ac-b2
该解形式适用于所有q＜0，这对于该二次方程的所有实解均是正确的。
将这些值代入，见以下解：
该表达式可通过以下定义进行简化(Schafer，1983)：
D＝[L]0-[R]0
S＝[L]0+[R]0
将这些表达式代入：
再布置：
为简单起见，该指数项定义为
并且因此：
[LR]-P＝w([LR]-Q)
[LR]-w[LR]＝P-wQ
认识到在t＝0，[LR]＝0时，常数w0可求解为：
也可通过将极限设为t→∞来求解[LR]平衡：
因此，在任何给定时间平衡结合的比例等于：
实现99％的平衡结合的时间t99为：
0.99P-0.99wP＝P-wQ
w(Q-0.99P)＝P-0.99P
这些发现也可以是无量纲化的，替换为：
或
并且
τ＝k结束t
这样，得出以下相关方程：
伪一阶速率常数模型的推导
假设R＞＞L，因此可建立伪一阶速率常数，其中k*＝k初始[R]。
注意，[L]总＝[L]+[LR]。
在平衡时，
0＝k*[L]总-(k*+k结束)[LR]平衡
该关系可用于在该PFORC模型中对理论平衡结合进行求解：
将k结束的表达式再代入微分方程形式中：
整合：
还通过以下关系对每个浓度对计算发生99％的平衡结合的时间t99：
成本计算
每次生产运行的成本以与参考文献1的补充信息相似的方式估算，尽管HisTrapFF粗制柱(HisTrap FF Crude column)的成本分布在五次运行中，由于这些柱是可再用的。然后，以1000mL标尺的每批次成本确定为＄18.02。假设保守估计为100,000μg rcSso7d-CBD/L，且每次测试使用5μg(每次测试6μL 30μM溶液，以及MW为27.88kDa)，则1L产生运行得到足够的物质用于20,000次测试。这样使得每次测试成本为＄0.0009/测试。
为了评估rcSso7d.SA-CBD融合物质相对于裸rcSso7d.SA单体和代表性的SA结合多克隆抗体(SA-binding polyclonal antibody，pAb.SA)的热稳定性，使所有三种物质以20μM的浓度固定化在合适的基底(在rcSso7d.SA单体和pAb.SA的情况下，为醛官能化的纤维素；在rcSso7d.SA-CBD的情况下，为未改性的纤维素)上。在16小时的初级孵育并随后在TBS中失活之后，将样品在湿润的室中于1×PBS中的4μL 5w/v％海藻糖中孵育10分钟。从这些样品中吸干过量的溶液，并且然后施加另外的2μL 5w/v％海藻糖溶液，然后将所有样品置于在45℃下的真空烘箱中直至干燥(5至7分钟)。然后将这些样品置于在40℃下的Binder烘箱中持续不同的时间段，在此之后将其暴露于330nM SA-AF647的10μL等分试样中，并通过荧光显微术进行成像。
应当指出的是，在rcSso7d-CBD构建体情况下观察到的功能性增强并不会以牺牲该结合物质的热稳定性为代价-在40℃下干燥培养四个月之后，观察到rcSso7d-CBD保留了与裸rcSso7d相同程度的活性(-90％，与代表性多克隆抗体相比为-60％；图11A至11B)。
在30μM rcSso7d.SA-CBD处观察到最大结合信号，并且在更高浓度下，观察到平均荧光信号减弱。这可能是由于荧光团淬灭，而来自30μM rcSso7d.SA-CBD溶液中固定化的结合剂的摩尔量却足以捕获浓度为100nM的10μL抗原溶液中的所有抗原，更高表面密度的固定化结合剂使所捕获靶标的亚群足够接近，以使荧光团可相互作用和自猝灭。为了避免该事件，将采用30μM CBD的最佳浓度。这允许从溶液中消耗抗原，而不会产生足够的表面覆盖而发生淬灭。
实施例2：伪一阶速率常数模型
为了在抗原限制性结合方案内探索运算的效果，开发了基于质量作用动力学原理的单价结合模型。该结合体系可通过简单的一阶微分方程在数学上进行描述：
此处，[L]和[R]分别表示游离配体和游离受体的体积摩尔浓度，并且[LR]表示结合的复合体的浓度。通过采用摩尔守恒律(例如，[L]＝[L]0-[LR]；[R]＝[R]0-[LR])，可对该单价结合体系进行解析求解以得到表达式：
然而，当在抗原消耗方案中运算时，该关系可通过以下进行进行简化：注明抗原捕获不会使游离受体库显著减少，以使得可假设恒定浓度的可用结合物质。这允许并入初始受体浓度的伪一阶速率常数(PFORC；单位：s-1)的使用：
k*＝k初始[R]0
通过将该PFORC应用于描述该结合体系的一阶微分方程(也在SI中进行推导)，发现针对结合的抗原的比例(相对于平衡值)的以下更紧凑的表达式。尤其地，该关系不再取决于可溶性配体的初始浓度，只要受体浓度单独地确定结合平衡方法的谱即可。
结合方案不仅影响抗原捕获的热力学和化学计量，而且还影响结合动力学。这些基本模型还能够计算体系达到99％平衡结合的所需时间。该值的精确解析表达式为：
相比之下，PFORC模型允许计算简化的有效反应率(k观察＝k结束+k初始[R])，可将其并入到以下关系中以评价t99：
通过改变初始受体和配体的浓度，针对解析解和PFORC近似值二者可绘制在平衡和t99值时的比例配体捕获(图2A至2B)，从而允许直接比较模型并确立PFORC方法有效性的界限。观察到PFORC模型在其中固定化受体摩尔过量于可溶性配体的大部分方案中是高度精确的。
实际上，PFORC模型仅明显偏离解析解，当初始受体浓度i)接近游离配体的初始浓度，或ii)靠近结合对的解离常数(取其较大值)时(图7A至7B)。通常，解析解与PFORC模型之间的比例偏差仅在配体浓度或KD在固定化受体局部浓度的一个数量级以内时才有意义。注意，该处理假设所有物质均以相同体积的可溶性形式存在，从而在摩尔浓度与摩尔丰度之间建立直接联系。在非均相测定的情况下，固定化结合剂在测试区体积内的平均局部浓度不会直接反映其相对于可溶性靶标的摩尔丰度。因此，必须考虑固定化物质的摩尔丰度而不是其局部浓度，并且该量必须是大于可溶性靶标丰度的数量级，以产生如由PFORC模型所述的抗原消耗。
实施例3：rcSso7d结合变体的选择和表征
为了测试该基本结合模型的预测，基于热稳定rcSso7d支架开发了两种独特的结合变体。rcSso7d.SA和rcSso7d.Rv1656二者均通过磁珠分选和流式细胞术选自具有高初始多样性(～14亿个文库成员)的酵母菌表面展示文库。这些所选择结合变体的氨基酸序列可参见下文(表4)。如Traxlmayr et al(2016)所报道的，观察到芳香族残基酪氨酸和色氨酸的强富集。这可用于在平面的rcSso7d结合面上赋予更大的拓扑多样性和电子密度，从而促进与靶抗原的强共形结合。
表4：所选择rcSso7d结合剂的初级蛋白质结构。
rcSso7d.SA和rcSso7d.Rv1656模块的解离常数均以酵母菌表面展示形式通过针对表达这些结合物质作为表面结合的融合蛋白的单克隆酵母菌群滴定可溶性生物素化抗原来测量。先前报道rcSso7d.SA的亲和力为556±136pM(Miller et al.，2016)，而发现rcSso7d.Rv1656的亲和力为15.1±7.0nM(图9)。
为了将这些结合蛋白并入rcSso7d-CBD形式中，编码来自热纤梭菌的CipA蛋白的3型纤维素结合结构域的基因(GenBank：HF912725.1，第364位至第522位残基)由IDT合成作为与rcSso7d.SA物质的C端融合伴侣。选择该特定的纤维素结合结构域是因为其具有高固定化密度并证明了免疫测定形式活性(Dai et al.，2016；Holstein et al.，2016；Hussacket al.，2009)以及其热稳定性(McBee，1954)和化学稳定性(Berdichevsky et al.，1999)。所述两种融合伴侣均通过柔性的(G4S)3-接头序列(SEQ ID NO：125)连接，并且内部的BamHI位点包含在rcSso7d基因的C端末端。
将这些rcSso7d-CBD构建体在BL21(DE3)大肠杆菌中进行表达，并通过可再用IMAC柱进行纯化，从而在单一纯化步骤内得到电泳纯度的产物(图10)。通过BCA测定对蛋白质浓度进行定量，并且确定蛋白质产量为131.4mg/L培养物(14.28mg/g湿细胞质量(wet cellmass，WCM))(对于rcSso7d.SA-CBD)至105.5mg/L培养物(8.55mg/g WCM)(对于rcSso7d.Rv1656-CBD)。假设单次细菌产生运行的计算成本基础为＄18.02，并且保守的每次测试使用为5微克，则以1000mL规模进行的单一36小时产生运行可产生足够的物质用于约20,000次测定，成本为＄0.0009/装置。这些有利的生物制造经济学使得这些基于纸的测定的高通量产生成为可能，其价格点非常适合在资源有限的环境中进行低成本生物医学应用。
实施例4：rcSso7d.SA-CBD纤维素结合活性的表征
为了评估用rcSso7d.SA-CBD融合物质官能化的生物活性纤维素的捕获效率，将这些结合蛋白固定化在亲水性测试区中，并且随后与可溶性抗原接触，形成免疫复合体。通过使用这些半夹心测定形式，可使典型的免疫测定结合步骤去耦，以使得在再整合成完整的诊断形式之前，单独地评价每个分子的相互作用，并针对最佳性能进行改造。
所显影测试区的荧光显微术成像表明纤维素结合结构域以高丰度与未改性的Whatman No.1色谱纸强结合(图3)，除去了进行基底预处理步骤的需要。这表示在这些基于纸的测定的产生中的显著过程改进，只要典型程序需要用于使惰性纤维素基底激活的官能化步骤即可，以使诊断性结合蛋白以更大的丰度固定化(Credou和Berthelot，2014；Nery和Kubota，2016；Shen et al.，2016；Yu et al.，2012；Zhao et al.，2016)。这些化学预处理方法限制了产生通量，并且在结合剂固定化之后需要有效的表面钝化步骤，以防止患者蛋白质与游离检测试剂的非特异性吸附(Vuoriluoto et al.，2016；Zhu et al.，2014)。另外，随机化学缀合方法导致结合物质的非定向固定化，这可降低靶标结合互补位的溶剂可及性，并导致固定化结合剂的失活亚群(Song et al.，2012)。
此外，鉴于亚胺键的速率依赖性形成，通常需要延长的初级孵育，以使该共价固定化反应进行至完成。甚至在以官能化纸形式进行的该孵育期之后，该时间依赖性过程仍产生对裸rcSso7d物质的次优抗原捕获(图3)。
相比之下，未改性的色谱纸不需要特殊的预处理，可在环境条件下储存，并且在免疫测定发生之前和期间二者产生最少的非特异性蛋白质吸附。rcSso7d-CBD融合体还产生了定向展示的结合抗原的rcSso7d模块，从而确保最大的互补位可及性和表面活性。最后，CBD融合体以高丰度与纤维素基底快速结合。不管CBD融合体是否与表面接触了16小时或30秒的初级孵育期，都观察到结合信号大约相等，并且显著大于裸rcSso7d物质的结合信号(图3)。这显著降低了从原始纤维素基底到进行完整功能测定所需的时间量，从两天的处理时间到大约十分钟。
实施例5：使用经纤维素固定化的rcSso7d.SA-CBD的测定灵敏度的表征
相对于裸rcSso7d.SA物质，更高表面密度的rcSso7d.SA-CBD物质还导致在较低浓度的可溶性抗原下可辨别结合信号的出现。测定灵敏度的标准定义以高于阴性对照的平均信号的三个标准差建立了可靠的检测阈值。通过比较用SA-E的系列稀释液处理这些物质获得的结合曲线(图4A)，发现保守检测限(limit of detection，LOD)对于裸rcSso7d物质为8.2nM(IBG＝324.3AU；σ＝41.7AU)，以及对于rcSso7d.SA-CBD为2.56nM(IBG＝150.1AU；σ＝5.9AU)。对于未改性的纤维素，由于非特异性SA-E结合而产生的背景信号也较低，使得更好地将真正的结合信号与噪声阈值附近的随机波动区分开。在高纳摩尔浓度的可溶性抗原下，还看到rcSso7d.SA-CBD的结合曲线继续上升，而rcSso7d.SA物质的结合信号似乎饱和。这表明显著高程度的rcSso7d.SA-CBD表面固定化，这对从溶液中更快速且有效地捕获靶标具有影响。
这些发现还使用rcSso7d.Rv1656结合模块在第二正交结合体系中进行验证(图4B)。在该体系中，在rcSso7d-CBD融合物质的情况下也观察到结合响应显著提高，无论是其在高抗原浓度下的捕获效率方面还是其检测限方面(rcSso7d.Rv1656-CBD：LOD＝3.1nM；IBG＝468.8AU；σ＝17.3AU；rcSso7d.Rv1656：LOD：48.3nM；IBG＝350.1AU；σ＝32.2AU)。rcSso7d.Rv1656物质的背景信号在未改性的纤维素上显著更高，由于与芳香族伊红物质的非特异性结合的程度有限(参见图14)。
应当指出的是，可在裸rcSso7d形式中定性观察到这两种结合剂之间亲和力的30倍差异的影响。然而，在将这些独特结合物质整合到rcSso7d-CBD形式中时，结合曲线更加相似，表明在更高的固定化密度下，结合亲和力对最终捕获效率几乎不具有影响。
实施例6：抗原结合方案的鉴定
虽然这些观察结果表明了并入CBD融合伴侣的益处，但有必要直接表征结合方案，以确信地验证PFORC模型的预测。鉴于在rcSso7d.SA-CBD物质的情况下观察到的捕获效率明显提高，试图确定该抗原结合是否可通过使纤维素基底与更大摩尔量的rcSso7d.SA-CBD接触来进一步增强(图12)。将一系列可溶性rcSso7d.SA-CBD浓度(0.5mg/mL至7mg/mL(18.3μM至256μM)施加至纸测试区。将这些样品集与SA-E的系列稀释液(256nM至0.25nM)一起孵育(图11A)。
每次抗原滴定的所得结合曲线非常规则，当用二阶多项式进行拟合时，得到平均r2值为0.9994。这些曲线通常重合，但是虽然在这些聚类数据集中没有立即明显的大规模趋势，但发现在低纳摩尔范围内的抗原浓度下，更高可溶性浓度的所施加结合剂确实产生更高的捕获效率。使用来自施加至裸纤维素的所有SA-E浓度的阴性对照数据集(IBG＝150.1AU；σ＝5.9AU)，计算Ith＝167.8AU的保守3σ阈值MFI。对于每个样品集应用二阶多项式拟合方程，发现随着rcSso7d.SA-CBD的施加浓度提高，最小可检测抗原浓度降低(图5B)。该发现表明，另外的rcSso7d.SA-CBD以更高的施加浓度与纤维素基底结合，并指示这种更大的表面覆盖在稀释的抗原浓度下得到提高的捕获效率。鉴于在更浓缩的抗原溶液中观察到显著更高的MFI值，因此在低抗原浓度下捕获效率的这种提高很可能是由于结合动力学增强，而不是由于在rcSso7d.SA-CBD的较低施加浓度下固定化的结合剂摩尔量不足。
rcSso7d.SA-CBD结合曲线的一般重合指示该结合体系在以下两种方案之一中运算：a)该测定实际上在抗原消耗方案之内，以使得在给定的可溶性抗原浓度下不存在用于捕获的另外的靶标，或b)纤维素基底被固定化的rcSso7d.SA-CBD饱和，防止了任何另外的结合剂的吸附。虽然这些初步结果表明基底未饱和(即在稀释的抗原浓度下随着rcSso7d.SA-CBD施加量的提高观察到的捕获效率增强)，但仍试图通过对纤维素基底上固定化的rcSso7d.SA-CBD物质的丰度进行直接定量来在实验上确定该发现。
实施例7：rcSso7d-CBD表面丰度的直接定量
为了进一步验证该结合体系的相关结合方案，使用微BCA测定对rcSso7d.SA-CBD物质的固定化表面浓度进行定量。将已知质量的rcSso7d.SA-CBD蒸发到测试区上，以生成与经洗涤实验样品直接相当的标准曲线。对于所有标准样品，观察到高度规则的响应曲线(r2＝0.9978)，并且所有经洗涤的样品均落在该标准曲线的界限内(图13)。对于这些实验样品观察到明显的单调提高，表明基底在以30μM的标准浓度使用的结合条件下远未饱和(图6)。
这用于确定抗原消耗是在不同可溶性rcSso7d-CBD浓度下观察到的相似响应曲线的原因。对于经洗涤样品观察到的信号发生表明rcSso7d-CBD的摩尔丰度为0.1至0.5nmol/测试区。鉴于平均测试区质量为0.32±0.021mg，这相当于0.32至1.56μmol的rcSso7d-CBD/g纤维素的表面密度，这与先前报道的值一致(Dai et al.，2016；Li et al.，2016)。
应当指出的是，随着施加高可溶性浓度的蛋白质，rcSso7d.SA-CBD固定化的效率降低，表明基底饱和实际上可在高固定化的表面密度下发生。尽管向表面施加0.1至0.2nmol的rcSso7d-CBD产生～90％的固定化产率，但该效率在施加1.5nmol时下降至～30％。尽管更高密度的固定化结合剂确实允许在低抗原浓度下增强捕获效率，但这些递减的收益必将对可驱动表面覆盖怎样接近饱和施加一定的实际和经济约束。
在180皮摩尔的标准摩尔应用(对应于30μM的可溶性浓度)下，观察到的90％固定化效率产生约162皮摩尔的固定化在测试基底上(对应于～360μM的平均局部浓度)。在该摩尔丰度下，当固定化的rcSso7d.SA-CBD与最高滴定浓度(256nM)下的10μL样品接触时，其以相对于可溶性抗原的63.3倍摩尔过量存在。在这些条件下，PFORC模型预测将发生可溶性配体的快速、完全消耗(图15)。对于所有解离常数和低于1.62μM的可溶性靶标浓度(对于10μL样品体积)，该近似值仍然有效。
最后，为了在实验上直接测试该预测，在经rcSso7d.SA-CBD包被的测试区上孵育256nM SA-AF647溶液(10μL)30分钟之后，收集流通物。将该流通物直接施加至包被有rcSso7d.SA-CBD的测试区的第二集合，并且在孵育另外的30分钟之后，将这些样品集洗涤并在Cy5通道中成像。通过使用施加至基于rcSso7d.SA-CBD的测定的已知浓度的SA-AF647的标准曲线(数据未示出)，可将所得荧光测量值与其相关的抗原浓度相关联(图16)。这些结果表明，在初始从256nM溶液中消耗SA-AF647之后，后续溶液的浓度为20.7nM。这表示在初始孵育期间的捕获效率为92.2％，确定rcSso7d.SA-CBD以高效率捕获可用抗原。
在该研究中，已经考虑了使用简化的伪一阶速率常数模型来预测并入摩尔过量固定化结合剂的免疫测定的捕获效率，在抗原消耗方案内进行运算的影响。为了测试这些预测，已经开发了rcSso7d-CBD融合蛋白，其可在细菌中容易地表达并以高摩尔产率被轻易地纯化。已显示该物质快速吸附至未改性的纤维素，产生足以从溶液中几乎完全消耗可溶性抗原的结合物质的摩尔丰度。这些发现用两种独特的结合体系进行验证，并用于验证该简单PFORC模型的预测。
通过在该抗原消耗方案内进行运算，可使生物活性纤维素基底的分析物捕获效率最大化。鉴于该所捕获靶标是诊断放大方法必须使在视觉上可辨别的生物信号，该增强的捕获效率保证了对于从异质患者群中收集的每个样品，均可实现给定生物标志物的最大可能信号底限(maximum possible signal floor)。这种使用基底锚固部分进行靶标结合物质的高丰度表面吸附的一般策略，有望成为在广泛的测定形式中提高诊断灵敏度的适用方法。
实施例8：1型和3a型rcSso7d-CBD的SA-E滴定
对于两种样品集，双功能rcSso7d.SA-CBD融合蛋白均以20μM的可溶性浓度与纤维素测试区接触。然后将这些经rcSso7d.SA-CBD改性的纤维素基底与0.5nM至256nM的不同浓度的链霉抗生物素蛋白-伊红(SA-E)接触。在孵育30分钟之后，将这些样品在20μL的1x PBS缓冲液中洗涤两次，并将样品于荧光显微镜上在Texas Red通道中以700ms的曝光时间成像。每个数据点表示样品的平均荧光，并且误差棒指示关于四个实验重复平均值的标准差。相似的结合曲线指示rcSso7d.SA-CBD1和rcSso7d.SA-CBD3a二者的表现相似，它们以高丰度与纤维素基底结合，并从溶液中消耗可溶性抗原。
实施例9：与黄病毒NS1蛋白结合的rcSso7d结合变体的选择和表征
已开发出与黄病毒非结构性1(NS1)蛋白，包括寨卡病毒NS1和登革2病毒NS1结合的中等结合蛋白。将寨卡病毒NS1(寨卡NS1)重组表达并用N端六组氨酸标签进行纯化。将寨卡病毒NS1的生物素化形式(寨卡NS1-BA)进行克隆、表达并用C端上的另外生物素接纳体序列标签进行纯化。将登革2病毒NS1(登革2.NS1)重组表达，并用N端六组氨酸标签进行纯化。将寨卡病毒NS1的生物素化版本(登革2.NS1-BA)进行克隆、表达并用C端上另外的生物素接纳体序列标签进行纯化。
所选择的结合变体的氨基酸序列可见于下(表5)。表明与黄病毒非结构性1(NS1)蛋白结合的所选择rcSso7d结合变体的每个特定的rcSso7d克隆的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图20A至20C、21A至21C、22A至22C、23A至23C、24A至24C和25A至25C中的FACS图中。
流式细胞术数据使用酵母菌表面展示平台进行收集，其中将特定的rcSso7d变体展示在酵母菌克隆群的表面上。每个特定rcSso7d变体的靶标特异性结合活性使用对与靶标生物标志物缔合的表位融合标签(生物素接纳体标签或六组氨酸标签)具有特异性的荧光试剂进行评估。
数据集包含次级对照(secondary control)和实验样品二者，其表明了在理想化的0.1％BSA/PBS缓冲液中的基线结合。次级对照指示与用于检测结合活性的荧光试剂脱靶(off-target)结合的程度，并且因此是rcSso7d变体结合特异性的近似量度。实验样品指示经表面展示的rcSso7d变体针对相应图中所示浓度的纯化的寨卡NS1和登革2.NS1生物标志物的活性。x轴表示酵母菌表面上的rcSso7d表达水平(使用具有生物素化抗体的经酵母菌表面展示的rcSso7d上的cMyc或HA标签)。y轴表示与目的抗原(在该情况下为NS1)结合。观察到特异性结合变体在流式细胞术图的y轴上显示出荧光信号增加。
表5：与黄病毒NS1蛋白结合的所选择rcSso7d结合变体的初级蛋白质结构。
实施例10：与人白介素-6(IL-6)蛋白结合的rcSso7d结合变体的选择和表征
开发了与人白介素-6(IL-6)结合的结合蛋白。与人白介素-6(IL-6)蛋白结合的所选择rcSso7d结合变体的氨基酸序列可见于下(表6)。表明与人白介素-6(IL-6)蛋白结合的所选择rcSso7d结合变体的每个特定的rcSso7d克隆的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图26A至26B、27A至27B、28A至28B、29A至29B、30A至30B、31A至31B和32A至32B中的FACS图中。
流式细胞术数据使用酵母菌表面展示平台进行收集，其中将特定的rcSso7d变体展示在酵母菌克隆群的表面上。每个特定rcSso7d变体的靶标特异性结合活性使用对与靶标生物标志物缔合的表位融合标签(生物素接纳体标签或六组氨酸标签)具有特异性的荧光试剂进行评估。
数据集包含三组分阴性对照和实验样品二者，其表明了在理想化的0.1％BSA/PBS缓冲液中的基线结合。三组分阴性对照经受与实验样品相同的条件，但不包含靶标生物标志物；因此，其指示与用于检测结合活性的荧光试剂脱靶结合的程度，并且因此是rcSso7d变体结合特异性的近似量度。实验样品指示经表面展示的rcSso7d变体针对相应图中所示浓度的人IL-6的活性。x轴表示酵母菌表面上的rcSso7d表达水平(使用具有生物素化抗体的经酵母菌表面展示的rcSso7d上的cMyc或HA标签)。y轴表示与目的抗原(在该情况下为IL-6)结合。观察到特异性结合变体在流式细胞术图的v轴上显示出荧光信号增加。
表6：与人白介素-6(IL-6)蛋白结合的所选择rcSso7d结合变体的初级蛋白质结构。
实施例11：rcSso7d蛋白融合体
rcSso7d.NS1.1-CBD
将rcSso7d.NS1.1(SEQ ID NO：31)克隆到CBD构建体，rcSso7d.NS1.1-CBD中。
rcSso7d.NS1.1-CBD
上述序列中的斜体氨基酸是指六组氨酸标签，加下划线的氨基酸是指rcSso7d.NS1.1序列，以及粗体氨基酸是指CBD序列。
构建体通过以下在纤维素纸上进行测试：首先使rcSso7d.NS1.1-CBD固定化至纤维素，并且然后与寨卡病毒NS1(以不同浓度)、生物素化的抗寨卡病毒NS1抗体和链霉抗生物素蛋白-AF 647一起孵育(参见图33A至33B)。使用与实验样品相同的条件，但用牛血清白蛋白(BSA)代替NS1蛋白进行阴性对照。然后使用荧光显微术对测试区进行成像，并进行分析以确定每个测试区的平均荧光强度。从样品中减去背景(不存在抗原的情况下的荧光)以获得背景减去的MFI。显示rcSso7d.NS1.1-CBD蛋白融合体具有从溶液中检测寨卡病毒NS1蛋白的功能。
BA-MBP-rcSso 7d.H4和MBP-rcSso 7d.H4-bx
将rcSso7d.H4克隆到具有BA(生物素接纳体序列)的MBP(麦芽糖结合蛋白)融合蛋白构建体中。还将rcSso7d.H4克隆到不具有BA的MBP中，以使该蛋白融合体(MBP-rcSso7d.H4-bx)化学生物素化。在以下氨基酸序列中，斜体氨基酸是指六组氨酸标签，粗体氨基酸是指生物素接纳体序列，粗体和加下划线氨基酸是指MBP序列，以及加下划线氨基酸是指rcSso7d.H4。
BA-MBP-rcSso7d.H4
MBP-rcSso7d.H4
将MBP融合蛋白与作为不包含MBP融合蛋白的蛋白质序列BA-rcSso7d.H4和rcSso7d.H4-bx进行比较，以表明MBP融合伴侣的作用。BA-rcSso7d.H4
rcSso7d.H4
将所有四种蛋白质(rcSso7d.H4、BA-rcSso7d.H4、MBP-rcSso7d.H4和BA-MBP-rcSso7d.H4)进行表达并纯化。将rcSso7d.H4和MBP-rcSso7d.H4进行化学生物素化。将BA-rcSso7d.H4和BA-MBP-rcSso7d.H4蛋白的部分在单体抗生物素蛋白柱上进行纯化，以分离出在蛋白质上具有生物素的亚群(参见图34)。
对于生物素接纳体序列(BA)(在大肠杆菌中表达期间将生物素添加到BA序列中)以及使用磺基-NHS-LC-生物素进行化学生物素化以使生物素与蛋白质上的游离胺缀合二者的生物素效率进行定量(参见表7)。在单体抗生物素蛋白柱纯化之后的纯化产率表明在当BA序列与蛋白质直接融合时的情况下生物素可及性问题；然而，在BA与rcSso7d序列之间具有MBP结构蛋白降低了生物素可及性的影响。在化学缀合之后蛋白质的产物产率也表明rcSso7d.H4失去了结构完整性，如由大多数蛋白质从溶液中沉淀出所指示。MBP融合体的添加提高了蛋白质的溶解度和稳定性，如由更高的产物产率所指示。
表7
所有蛋白质构建体(以及BA-rcSso7d.H4和BA-MBP-rcSso7d.H4的经抗生物素蛋白纯化前亚群和经抗生物素蛋白纯化后亚群二者)通过以下进行测试：首先使TB抗原Rv1656固定化在氧化纤维素上，并且然后与rcSso7d.H4构建体和链霉抗生物素蛋白-AF647一起孵育。使用与实验样品相同的条件，但使用固定化的牛血清白蛋白(BSA)代替TB抗原蛋白进行阴性对照。然后使用荧光显微术对测试区进行成像，并进行分析以确定每个测试区的平均荧光强度。从样品中减去背景(在不存在抗原的情况下的荧光)以获得背景减去的MFI。
rcSso7d.H4-bx导致信号降低(除缀合之后产物产率低之外)。MBP-rcSso7d.H4-bx的MBP添加显示出更高的信号，其中一部分可归因于生物素价的提高(每个蛋白质有多个生物素)。对于BA-rcSso7d.H4，抗生物素蛋白柱纯化之后的性能远远高于35％至100％生物素化的理论提高。该显著提高-背景减去的MFI提高了约一个数量级-可归因于BA-rcSso7d.H4上生物素的不可及性。通过抗生物素蛋白柱纯化，仅收集抗生物素蛋白可及的具有生物素的蛋白质；因此，经抗生物素蛋白柱纯化后的群体反映了具有可及生物素的蛋白质，而经抗生物素蛋白柱纯化前的群体主要包含具有不可及生物素的蛋白质(参见图35)。对于BA-MBP-Sso.TB，与经抗生物素蛋白柱前群体相比，经抗生物素蛋白柱后级分显示出信号强度提高；这可归因于比例生物素化的提高，由于该变体似乎没有生物素可及性问题。与BA-rcSso7d.H4相比，BA-MBP-rcSso7d.H4显示出信号增加，这可能是由于生物素在BA-MBP-rcSso7d.H4上固有的可及性提高的结果，并且还潜在地减弱了位阻效应，这可导致较少的rcSso7d.H4从TB抗原中解离作为链霉抗生物素蛋白结合的结果。
开发rcSso7d.H4和MBP(麦芽糖结合蛋白)的蛋白融合体作为具有提高的溶解度特征的结构蛋白块(structure protein mass)，当将其用作检测试剂时显示出信号检测提高。
多聚化BA-(rcSso 7d.H4)n
将rcSso7d.H4多聚体(1x、2x、3x)克隆到BA(生物素接纳体序列)构建体BA-rcSso7d.H4(Ix)、BA-rcSso7d.H4(2x)和BA-rcSso7d.H4(3x)中。在以下氨基酸序列中，斜体氨基酸是指六组氨酸标签，粗体氨基酸是指生物素接纳体序列，以及加下划线的氨基酸是指rcSso7d.H4。
BA-rcSso7d.H4(1x)
BA-rcSso7d.H4(2x)
BA-rcSso7d.H4(3x)
在表达和纯化之后，使用BA-(rcSso7d.H4)1、BA-(rcSso7d.H4)2和BA-(rcSso7d.H4)3进行初步测试。SDS-PAGE显示每种蛋白质的纯度(每种蛋白质以两种不同的稀释度跑胶)(参见图36A)。然后将每种多聚化蛋白质通过以下进行测试：首先使TB抗原Rv1656固定化至氧化纤维素纸，并且然后与BA-(rcSso7d.H4)n和链霉抗生物素蛋白-AF647一起孵育(参见图36B至36C)。使用与实验样品相同的条件，但使用固定化的牛血清白蛋白(BSA)代替TB抗原蛋白进行阴性对照。然后使用荧光显微术对测试区进行成像，并进行分析以确定每个测试区的平均荧光强度。从样品中减去背景(在不存在抗原的情况下的荧光)以获得背景减去的MFI。
开发了具有生物素接纳体序列(BA)的rcSso7d.H4的多聚体以用作检测试剂。
实施例12：与基于尿的TB生物标志物结合的rcSso7d结合变体的选择和表征
生物素化
在一些情况下，生物标志物已经在体内与生物素化标签(称为BA)一起表达，所述标签提供了这样的化学处理(chemical handle)，通过化学处理可使用荧光链霉抗生物素蛋白试剂检测生物标志物的捕获物。该生物素化物质可使用单体抗生物素蛋白柱进一步纯化，从而以100％生物素化效率产生制备物。
磁珠分选和荧光激活细胞分选(FACS)
rcSso7d结合变体使用酵母菌表面展示平台进行开发，其中将rcSso7d变体的组合文库展示在酵母菌细胞群的表面上。该文库使用磁珠分选和荧光激活细胞分选进行筛选，以富集与目的靶标结合的rcSso7d变体群。简言之，将生物素化靶标与经链霉抗生物素蛋白包被的磁性Dynabead孵育，以用靶标包被这些珠。将经靶标覆盖的珠与组合酵母菌文库一起孵育足够的时间段使分析物特异性的rcSso7d变体与珠结合。然后使用磁条(magneticrack)从溶液中引出这些克隆。在其中基于尿的生物标志物为目的靶标的情况下，可将生物标志物在尿样品中于25至37℃下孵育4至16小时，以使选择偏向与尿处理形式的分析物相互作用的结合变体。
该文库还使用荧光激活细胞分选进行筛选。在用磁珠筛选酵母菌文库之后，将可溶性生物素化分析物与酵母菌文库一起孵育。使用荧光团缀合的链霉抗生物素蛋白或通过使用表位特异性抗体(例如，小鼠抗六组氨酸/山羊抗小鼠Alexa Fluor 647)，将荧光团与结合分析物的rcSso7d变体缔合。为了防止选择针对荧光试剂的结合剂，以交替轮(例如，链霉抗生物素蛋白藻红蛋白和小鼠抗六组氨酸/山羊抗小鼠Alexa Fluor 647)使用正交集。将带有rcSso7d分子结合变体的酵母菌细胞(如通过荧光信号证明)分选到培养基中进行扩大和进一步分选。
流式细胞术分析
流式细胞术数据使用酵母菌表面展示平台进行收集，其中将特定的rcSso7d变体展示在酵母菌克隆群的表面上。每个特定rcSso7d变体的靶标特异性结合活性使用对与靶标生物标志物缔合的表位融合标签(BA标签或六组氨酸标签)具有特异性的荧光试剂进行评估。
下面讨论的数据集包含次级对照和实验样品二者，其表明了在理想化的0.1％BSA/PBS缓冲液中的基线结合。次级对照指示与用于检测结合活性的荧光试剂的脱靶结合程度，并且因此是rcSso7d变体结合特异性的近似量度。实验样品指示经表面展示的rcSso7d变体针对相应图中所示浓度的纯化的TB生物标志物的活性。观察到特异性结合变体在次级对照和实验样品之间在比例结合方面显示出大的差异(在FACS图下方的表中观察到)。通常，高结合信号与阳性象限(Q1和Q2)中显著的经标记酵母菌群相关联-这些图的方向/布局中的差异是由于使用了不同的荧光团(AlexaFluor 647和链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白，例如图38和39)，或者用于对rcSso7d展示进行定量而对酵母菌细胞正交标记(例如，图40A至40C)所致。
H1结合剂
抗原名称：H1
蛋白质ID：Rv1681
基因ID：MT1721
(参见例如，Kashino et al.Clin Exp Immunol(2008)153：56-62；Pollock etal.，J Clin Microbiol(2013)51：1367-73)
H1BA(参见图37)
上述序列中的斜体氨基酸是指六组氨酸标签，以及括号中加下划线的氨基酸是指(生物素接纳体序列)。
与H1结合的所选择rcSso7d结合变体的氨基酸序列可见于下(表8)。表明与H1结合的所选择rcSso7d结合变体的每个特定的rcSso7d克隆的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图38至43中的FACS图中。例如，表明rcSso7d.H1BA.1的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图38中的FACS图中。表明rcSso7d.H1BA.2的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图39中的FACS图中。表明rcSso7d.H1BA.3的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图40A至40C中的FACS图中。表明rcSso7d.H1BA.4的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图41中的FACS图中。表明rcSso7d.H1BA.5的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图42中的FACS图中。表明rcSso7d.H1BA.6的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图43中的FACS图中。
表8：与H1结合的所选择rcSso7d结合变体的初级蛋白质结构。
图40B和40C示出了克隆H1BA.3与H1BA抗原的结合特异性，显示其针对H1BA的结合活性(71.5％阳性)与其针对抗原H2BA、H6BA和H7BA的结合活性(分别为0.9％、0.9％和1.3％)之间存在显着差异。
H2结合剂
抗原名称：H2
蛋白质ID：Rv2392
基因ID：MT2462
H2BA(参见图44)
上述序列中的斜体氨基酸是指六组氨酸标签，以及括号中加下划线的氨基酸是指(生物素接纳体序列)。
与H2结合的所选择rcSso7d结合变体的氨基酸序列可见于下(表9)。指示rcSso7d.H2BA.1的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图45中的FACS图中。
表9：与H2结合的所选择rcSso7d结合变体的初级蛋白质结构。
H4结合剂
抗原名称：H4
蛋白质ID：Rv1656
基因ID：MT1694
(参见例如，Napolitano et al.，2008)
H4(参见图46)
上述序列中的斜体氨基酸是指六组氨酸标签。
与H4结合的所选择rcSso7d结合变体的氨基酸序列可见于下(表10)。表明与H4结合的所选择rcSso7d结合变体的每个特定rcSso7d克隆的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图47至55中的FACS图中。例如，表明rcSso7d.H4.1的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图47中的FACS图中。表明rcSso7d.H4.2的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图48中的FACS图中。表明rcSso7d.H4.3的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图49中的FACS图中。表明rcSso7d.H4.4的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图50中的FACS图中。表明rcSso7d.H4.5的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图51中的FACS图中。表明rcSso7d.H4.6的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图52中的FACS图中。表明rcSso7d.H4.7的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图53中的FACS图中。表明rcSso7d.H4.8的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图54中的FACS图中。表明rcSso7d.H4.9的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图55中的FACS图中。表明rcSso7d.H4.2/H4/BA-MBP-rcSso7d.H4.1的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图56A至56B中的FACS图中。
图56A至56B表明了在完整夹心测定形式中结合剂H4.1和H4.2的性能，其中H4.1已在BA-MBP-rcSso7d融合构建体中可溶表达，并且生物素化的变体已通过单体抗生物素蛋白柱而纯化。在这些样品中，将经酵母菌表面展示的rcSso7d.H4.2变体与100nM的H4抗原(除在次级对照情况下之外)、纯化的BA-MBP-rcSso7d.H4.1蛋白以及链霉抗生物素蛋白AlexaFluor 647依次孵育。图56A示出了将完整免疫复合体(在缓冲液中与H4一起孵育)的基线结合信号与在尿中与H4在37℃下孵育过夜的完整免疫复合体的结合信号进行比较。图56B比较了类似的样品，除H4抗原已在尿中于37℃下孵育一周之外。
表10：与H4结合的所选择rcSso7d结合变体的初级蛋白质结构。
H6结合剂
抗原名称：H6
蛋白质ID：Rv1729c
基因ID：MT1770
H6BA(参见图57)
上述序列中的斜体氨基酸是指六组氨酸标签，以及括号中加下划线的氨基酸是指(生物素接纳体序列)。
与H6结合的所选择rcSso7d结合变体的氨基酸序列可见于下(表11)。表明与H6结合的所选择rcSso7d结合变体的每个特定rcSso7d克隆的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图58至60中的FACS图中。例如，表明rcSso7d.H6BA.1的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图58A至58B中的FACS图中。表明rcSso7d.H6BA.2的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图59A至59B中的FACS图中。表明rcSso7d.H6BA.3的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图60A至60B中的FACS图中。
表11：与H6结合的所选择rcSso7d结合变体的初级蛋白质结构。
H7结合剂
抗原名称：H7
蛋白质ID：TBCG_03312
基因ID：ZP_04927296.1
H7BA(参见图61)
上述序列中的斜体氨基酸是指六组氨酸标签，以及括号中加下划线的氨基酸是指(生物素接纳体序列)。
与H7结合的所选择rcSso7d结合变体的氨基酸序列可见于下(表12)。表明rcSso7d.H7.1的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图62中的FACS图中。
表12：与H7结合的所选择rcSso7d结合变体的初级蛋白质结构。
Alexa Fluor 647(AF647)结合剂
抗原名称：Alexa Fluor 647
分类：小分子
与Alexa Fluor 647(AF647)结合的所选择rcSso7d结合变体的氨基酸序列可见于下(表13)。已发现图63和64的详细结合变体与两种独特的试剂结合，所述试剂已用AlexaFluor 647荧光团(山羊抗小鼠抗体和链霉抗生物素蛋白)标记。表明rcSso7d.AF647.1的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图63中的FACS图中。表明rcSso7d.AF647.2的特异性结合活性的流式细胞术数据示出于图64中的FACS图中。
表13：与Alexa Fluor 647(AF647)结合的所选择rcSso7d结合变体的初级蛋白质结构。
所选择rcSso7d结合变体的结合剂性能概述于下表14中。
表14：TB抗原结合剂性能
rcSso7d.H4.5-CBD和rcSso7d.H4.9-CBD的克隆和纯化
已将数个H4结合rcSso7d变体克隆到rcSso7d-CBD构建体中。这些包括本文中上面讨论的H4.2克隆，以及H4.5和H4.9。将rcSso7d.H4.5和rcSso7d.H4.9分别克隆到CBD构建体rcSso7d.H4.5-CBD和rcSso7d.H4.9-CBD中，并进行纯化。图65A至65B举例说明了rcSso7d.H4.5-CBD和rcSso7d.H4.9-CBD的质粒图，以及与这些结合物质相关的纯化色谱图。
rcSso7d.H4.5-CBD和rcSso7d.H4.9-CBD的免疫测定性能
纯化的变体rcSso7d.H4.5-CBD、cSso7d.H4.9-CBD和rcSso7d.H4.2-CBD的结合活性示出于图66A至66D中，并且分别表示为C5-CBD、C9-CBD和4-5CBD。图66A表明这些物质中的每个在完整夹心(具有H4.1-BA构建体)、空夹心、具有生物素化H4变体的半夹心以及在使其与rcSso7d.H4-CBD变体接触之前预孵育H4.1-BA和H4的半夹心中的性能。在完整夹心形式中，使180皮摩尔的rcSso7d-CBD融合体固定化在纤维素测试点上。在磷酸盐缓冲液中进行两个20μL洗涤步骤之后，使10μL的256nM可溶性H4与点接触。在另一个洗涤步骤之后，使表面与10μL的256nM可溶性H4.E1-BA接触，并且在另外的洗涤步骤之后，使表面与10μL的256nM链霉抗生物素蛋白Alexa Fluor 647接触。在空夹心的情况下，所有步骤都是相同的，除作为使表面与H4接触的替代之外，将表面在PBS中孵育等同的时间段。半夹心实验使用化学生物素化形式的H4，使其与经rcSso7d-CBD包被的表面接触。在洗涤步骤之后，使表面与链霉抗生物素蛋白Alexa Fluor 647接触。预孵育样品与完整夹心相同，除将H4.E1-BA和链霉抗生物素蛋白Alexa Fluor 647在本体溶液(bulk solution)中以1：1摩尔比一起预孵育之外。
半夹心数据(图66A和66B中的大条(large bar))指示所选择变体以CBD形式保留其功能。完整夹心不产生信号，由于直接连接的生物素物质的可及性有限，示出于图66C中。
使用不同的CBD变体：dCBD数据的原理演示
rcSso7d.SA-dCBD
dCBD是碳水化合物结合模块家族1(Carbohydrate-binding module family 1，CBM-1)的成员。在该dCBD变体情况下观察到与先前报道的CBM-3变体(CBD)相似的性能(参见图67)。初级孵育时间为30秒。6μL的30μM所施加蛋白质和从溶液中快速消耗可溶性分析物。图67示出了这样的证明：使用rcSso7d-CBD融合构建体的方法与碳水化合物结合模块家族的其他成员有关。此处，rcSso7d.SA-dCBD构建体的序列已包括在内，并且已针对使用rcSso7d.SA-CBD和rcSso7d.SA-dCBD产生的两个独特样品集制备了荧光链霉抗生物素蛋白-伊红试剂的代表性滴定。这些数据集表明3型CBD与1型dCBD物质之间的性能相似。
实施例13：多聚化rcSso7d-CBD变体
用于进一步增强表面丰度的多聚化(rcSso7d.SA)n-CBD
创建了多聚化rcSso7d-CBD变体1x-rcSso7d.SA-CBD、2x-rcSso7d.SA-CBD和3x-rcSso7d.SA-CBD，其中将一个、两个或三个独立的rcSso7d.SA结合模块遗传融合在一起，并且整合到CBD结合构建体中(参见图68A)。用于产生多聚化物质的方法已在例如Paloni，etal.Biomacromolecules(2018)19(9)：3814-24中记载。这些变体的序列示出于下。该融合构建体的一般示意图举例说明于图68A中，表明在每个rcSso7d结合变体之间，以及在最后的rcSso7d模块与CBD融合伴侣之间包含(G4S)3接头序列(SEQ ID NO：125)。
1x-rcSso7d.SA-CBD
2x-rcSso7d.SA-CBD
3x-rcSso7d.SA-CBD
图68B中示出的12％SDS-PAGE凝胶显示了在用固定化金属亲和色谱纯化之后1x-、2x-和3x-CBD变体的纯度。这些固定化rcSso7d-CBD变体在抗原捕获测定中的性能示出于图68C中，使用链霉抗生物素蛋白Alexa Fluor 647作为分析物。尤其地，在高分析物浓度下，较高的rcSso7d-CBD多聚体的信号似乎下降，这与预期的趋势相悖-随着表面固定化1x-rcSso7d-CBD物质饱和，预期存在2x和3x变体的另外游离的rcSso7d模块，以及对于这些构建体结合信号将继续增加。在目视检查5μM样品时(在图形下方显示)，看起来2x和3x均比1x变体更深，表明实际上另外的分析物已被这些样品捕获。这表明平均荧光信号的降低实际上可能是由于荧光猝灭，因为高阶结合构建体螯合了更大摩尔量的紧密邻近的荧光分析物。这表明使用多聚体(rcSso7d)x-CBD构建体确实可用于更有效地捕获分析物，并且在大体积处理形式中可产生显著的益处，在该形式中分析物捕获的时间标尺必须与在分析物与测试区接触的短时间标尺的期间相匹配。
与大体积组合的rcSso7d.SA-CBD在纤维素粉末上的固定化
已表明rcSso7d.SA-CBD蛋白可固定化在纤维素粉末上，可将其混合到大体积样品中以有效捕获可溶性分析物。将180皮摩尔的rcSso7d.SA-CBD施加至圆形测试区(参见图69中的阳性对照)或等同质量的纤维素粉末(在实验样品中表示)。制备了2nM的链霉抗生物素蛋白Alexa Fluor 647溶液的两个10mL等分试样。一种方法是使用注射泵通过压力驱动流迫使穿过纸测试区，并以5mL/分钟的体积流量在测试区中来回循环40分钟。将经rcSso7d.SA-CBD包被的纤维素粉末加标到另一等分试样中，将其在混合下孵育等同的时间段。在分析物孵育步骤之后，通过使分析物溶液流过纸测试区来保留该粉末，将粉末和所捕获分析物浓缩在相对较小区域中以进行检测和定量。分析物信号似乎更分散，但平均强度大约等同，表明更稳健的用于浓缩粉末的方法可允许灵敏地检测由纤维素粉末试剂捕获的化学物质。
实施例14：大体积处理数据
通过rcSso7d-CBD构建体实现的高丰度固定化独特地能够通过大体积处理增强分析灵敏度。
大体积处理数据已于先前公开(参见Miller et al.，Anal Chem(2018)90(15)：9472-9)，并显示了通过使用CBD融合物质实现的浓度结构域的启用性质。较高固定化浓度的结合剂能够在分析物与测试区接触的短时间内从流动的体系中捕获稀释的分析物。这允许在临床相关的时间标尺内处理大的样品体积，并且即使在较低浓度下也捕获更多量的分析物，提高了分析灵敏度(参见图70)。
显示了在不同的体积流量和不同浓度的结合试剂下的比例分析物渗透的有限元建模数据示出于图71中。这些曲线描绘了分析物捕获如何受结合反应动力学与纤维素内运输过程速率之间的关系的影响。每条曲线表示在不同的局部结合剂浓度(mol L-1；图例中所示)下的单一10mL再循环。入口分析物浓度为1nM。
由有限元模型在扩散极限中预测的比例结合曲线示出于图72中。在该情况下，向纤维素纤维的扩散速率是限速过程，因为固定化结合剂位于孔壁，并且假设分析物捕获的速率相对于扩散快速。虚线(ND)表示在标准rcSso7d-CBD浓度(400μM)下通过非扩散均匀分布模型预测的结合性能。实线表示在固定化结合剂(mol L-1)的不同局部浓度下在扩散受限的情况下的结合。对应于40mM的局部表面浓度的最左扩散曲线(黑色)用于模拟瞬时捕获。对于较高的局部浓度，未看到结合比例的明显提高。
通过大体积处理的灵敏度增强示出于图73中。对于大体积(10mL；5mL分钟-1；20次再循环)和小体积(10μL；40分钟)样品，在不同分析物浓度下观察到的平均荧光强度(MFI)。使用五点S形曲线(方程S10)生成最佳拟合线。误差棒表示三个(大体积)或四个(小体积)独立重复的标准差。
对于不同局部浓度的rcSso7d-CBD的分析物滴定曲线之间的比较示出于图74A至74B中。使用局部rcSso7d-CBD浓度为400和40μM的测试区，对于大体积(10mL)和小体积(10μL)样品，在不同的分析物浓度下观察到的平均荧光强度(MFI)(参见图74A)。对应于400μM/10μL样品的数据点与对应于40μM/10μL样品的数据点直接重合(图87)。在局部rcSso7d-CBD浓度为400和40μM下比较相应的大体积和小体积样品的荧光比示出于图74B中。大体积样品由10mL的分析物溶液(5mL分钟-1，20次再循环)组成。小体积样品由10μL组成，将其在测试区上孵育等同的40分钟时期。误差棒表示三个(大体积)或四个(小体积)独立重复的标准差。
对于不同流量和总处理时间的测定性能示出于图75A至75D中。绝对平均荧光强度(MFI)示出于图75A中，比例MFI(相对于在1mL分钟-1下在相同时间段内处理的样品)示出于图75B中，在不同单程停留时间和总处理时间下的信号发生效率(MFI分钟-1)示出于图75C中。作为再循环数目的函数的信号发生描绘于图75D中。线性趋势线指示使用常见体积流量(图例中所示)产生的样品的性能。样品规格：10mL和1nM SA-AF647。误差棒表示三个独立重复的标准差。
基于注射器的测定形式描绘于图76中。将纸样品切下并固定在13mm Swinnex过滤器保持器中。将10mL注射器连接上游并用于将分析物溶液预填充过滤器保持器。使用Qosina母对母Luer-Lok连接器将该盒连接至第二注射器下游，并且从系统中排出任何剩余空气。在所有情况下，将测试区的顶部(施加rcSso7d.SA-CBD溶液的表面)均定向为成为与分析物溶液接触的第一面。
COMSOL比例分析物捕获模型的设置描绘于图77A至77D中。将测试区建模为二维反应器体积，在整个二维反应器体积中固定化结合剂均匀分布。深度＝L＝180μm；宽度＝2rtz＝1.8mm。在入口左侧)的分析物浓度为1nM。结合剂浓度和样品集的体积流量在不同的子图中有所变化：1μM，1mL分钟-1(图77A)；1μM，20mL分钟-1(图77B)；400μM，1mL分钟-1(图77C)和400μM，20mL分钟1(图77D)。在每个子图内，测试快照的行对应于可溶性分析物、游离结合剂和所占据的结合剂(从上至下)。沿每个子图顶部指示的时间点每60秒捕获测试区快照。右侧的图例指示截面快照相应行的相关物质的浓度。为了捕获体系动态，将色条相对于每个集合的运算条件下的相关物质进行缩放，而不是表示通用浓度标度。
COMSOL扩散模型的设置示出于图78中。用1nM的分析物浓度使理想化的圆孔(r＝5.5μm)初始化。周围的基体表示经结合剂官能化的纤维网络，平均结合剂浓度为40mM。允许分析物的扩散和捕获在2秒的过程中进行，以模拟在不同样品停留时间范围内的扩散捕获。每个快照表示一个不同的时间点，将其指示在孔图像上方，以及色条表示可溶性分析物的浓度。
在整个测定截面积中的流体流动的确定示出于图79中。向样品体积中添加不溶性纤维素粉末(直径为50μm)，以追踪作为样品的流体流动在测试区中的再循环。作为仅集中在亲水区域内的替代，粉末分布在整个截面积上，表明疏水区域允许流体流动一旦使其足够的润湿。因此，相关的流动体积为12.81μL，而不是严格与经结合剂官能化区域相关的动体积(0.45μL)。
在不同的浓度和体积流量下的比例结合剂占据率示出于图80中。每条线图表示在不同的局部结合剂浓度(图例中所示)下的运算。对于所有数据集，分析物以1nM的浓度引入，并且在单一模拟的10mL再循环之后立即收集数据。
流量、结合剂浓度、分析物捕获与DaI的相关性示出于图81A至81B中。与体积流量、结合剂浓度(mol L-1)和达姆霍勒数，以及通过伪一阶速率模型预测的比例分析物捕获的速率相关的标准曲线示出于图81A中。对于不同局部浓度的固定化结合剂所预测的比例结合曲线示出于图81B中。
有限元分析与PFORC模型之间的偏差示出于图82A至82B中。非扩散极限中分析物结合的有限元模型(虚线)与伪一阶速率常数模型(实线)的比较示出于图82A中。对于所有处理条件，FEA模型与PFORC模型之间的绝对基点偏差示出于图82B中。在动态信号变化区域中观察到预测模型之间的最大偏差。
达姆霍勒主曲线示出于图83中。通过伪一阶速率模型生成的所有一维结合曲线均折叠到描述体系性能的单一无量纲结合曲线上。该关系对于其中固定化结合剂显著摩尔过量(＞10x)于可溶性分析物的所有情况均有效。虚线突出了达姆霍勒数的值，在该值处捕获了50％的分析物。
结合等温线示出于图84中。曲线指示在不同浓度的固定化结合剂下，在给定的体积流量(或停留时间)下观察到的理论的比例分析物捕获。虚线指示标准rcSso7d-CBD体系(CB＝400μM)的运算方案。
信号出现点附近的滴定曲线示出于图85中。所有大体积样品均由10mL样品体积组成，将其以5mL分钟-1穿过测试区进行20次再循环。所有小体积样品均由10μL样品体积组成，将其直接施加至测试区，并允许孵育等同的40分钟时期。数据集与图73中所见的数据集相同。误差棒表示三个(大体积)或四个(小体积)独立重复的标准差。
官能化纸上固定化的蛋白质丰度的计算示出于图86A至86B中。在0.25nM至256nM的链霉抗生物素蛋白-伊红(SA-E)浓度和10μL样品体积下，对于施加至非官能化纸的rcSso7d.SA-CBD(黑色)和施加至醛官能化纸的rcSso7d.SA(红色)的滴定数据示出于图86A中。在不同的所施加分析物浓度下比例分析物捕获示出于图86B中。对所有施加的浓度进行分析，其中对于官能化和非官能化样品观察到的信号之间存在明显差异。将所有测试物与分析物溶液一起孵育三十分钟。误差棒表示四个独立重复的标准差。
对于局部浓度为400μM和40μM的rcSso7d-CBD的小体积滴定曲线之间的比较示出于图87中。数据集与图74A中所见的数据集相同。小体积样品由10μL组成，将其在测试区上孵育40分钟时期。误差棒表示四个独立重复的标准差。
与再循环数目和信号发生程度相关的线性回归斜率随着体积流量的提高而下降(参见图88)。在几乎所有情况下，均可观察到线性回归曲线与实验数据很好地相关，如由皮尔逊系数接近±1所示。
使用链霉抗生物素蛋白-伊红作为可溶性分析物的代表性人工滴定曲线示出于图89中。将样品各自进行20次再循环处理。每个数据点表示一个单一测定重复。将人工样品以可持续而不会出现身体不适的流量(～25mL分钟-1)进行处理。使用TxRed-4040C滤光片组将样品曝光1000ms。
实施例15：尿样品中的结合剂活性
使用几何平均荧光强度而不是群体比例来定量的多种结合剂针对经尿处理的分析物的结合活性示出于图90、91、93、94和95A至95B中。使用几何平均荧光强度定量的rcSso7d.H1BA.3的结合特异性示出于图92中。BA-MBP-rcSso7d.H4.1和rcSso7d.H4.2-CBD物质在基于纸的免疫测定形式中的性能示出于图96至103中。
图96包含完整夹心免疫测定的示意图(以及用于评估结合特异性的空版本)。图97记载了这些结合试剂在多种形式(完整免疫复合体和空免疫复合体)中的性能，表明完整夹心具有显著的分析物特异性活性。图98显示了该分析物特异性活性对互补结合物质rcSso7d.H4.1和rcSso7d.H4.2具有特异性-其他H4结合变体在完整夹心形式中未产生可辨别的信号。图99显示了在基于纸形式中H4.1-CBD和H4.2-CBD物质针对其他结核抗原的有限交叉反应性。在看到高信号时，这可能是由于a)表面钝化不足，b)CBD结合物质的丰度高，以及c)基于链霉抗生物素蛋白的检测方法的近乎永久性。当相同的rcSso7d.H4.1/rcSso7d.H4.2物质在酵母菌表面展示形式中受到其他TB抗原的攻击时，仅在H4物质情况下观察到明显信号。图100和101记载了通过在牛血清白蛋白中使表面钝化进行空夹心测定(图100)和通过改变其中施加/洗涤BA-MBP-rcSso7d.H4.1物质的溶液的pH(图101)二者来降低检测试剂的非特异性结合以降低背景信号的努力。将这些发现应用于产生图102中所见的滴定曲线。观察到检测限为约8nM，该检测限被确定为高于平均负信号的三个标准差的荧光值。图103记载了增强测定灵敏度的进一步努力，显示通过提高BA-MBP-rcSso7d.H4.1的施加浓度，对于H4的给定施加浓度，可极大提高分析物特异性信号。
参考文献
Ackerman，M.，Levary，D.，Tobon，G.，Hackel，B.，Orcutt，K.D.，Wittrup，K.D.，2009.Biotechnol.Prog.25，774-783.
Ahmed，S.，Bui，M.-P.P.N.，Abbas，A.，2016，Biosens.Bioelectron.77，249-263.
Baumann，H.，Knapp，S.，Lundback，T.，Ladenstein，R.，Hard，T.，1994.Nat.Struct.Biol.1，808-819.
Berdichevsky，Y.，Lamed，R.，Frenkel，D.，GoPhna，U.，Bayer，E.A.，Yaron，S.，Shoham，Y.，Benhar，I.，1999.Protein Expr.Purif.17，249-259.
Care，A.，Bergquist，P.L.，Sunna，A.，2015.Trends Biotechnol.33，259-268.
Care，A.，Petroll，K.，Gibson，E.S.Y.，Bergquist，P.L.，Sunna，A.，2017.Biotechnol.Biofuels 10，1-16.
Chao，G.，Lau，W.L.，Hackel，B.J.，Sazinsky，S.L.，Lippow，S.M.，Wittrup，K.D.，2006.Nat.Protoc.1，755-68.
Credou，J.，Berthelot，T.，2014.J.Mater.Chem.B 2，4767-4788.
Dai，G.，Hu.J.，Zhao，X.，Wang，P.，2016.Sensors Actuators B Chem.238，138-144.
Esteban，B.，De，A.，Watkins，H.M.，Pingarro，J.M.，Plaxco，K.W.，Palleschi.G.，Ricci，F.，2013.Anal.Chem.1-5.
Giri，B.，Pandey，B.，Neupane，B.，Ligler，F.S.，2016.TrAC-TrendsAnal.Chem.79，326-334.
Holstein，C.A.，Chevalier，A.，Bennett，S.，Anderson，C.E.，Keniston，K.，Olsen，C.，Li，B.，Bales，B.，Moore，D.R.，Fu，E.，Baker，D.，Yager，P.，2016.Anal.Bioanal.Chem.408，1335-1346.
Hussack，G.，Luo，Y.，Veldhuis，L.，Hall，J.C.，Tanha，J.，MacKenzie.R.，2009.Sensors 9.5351-5367.
Hyre，D.E.，Le Trong，I.，Merritt，E.A.，Eccleston，J.F.，Green，N.M.，Stenkamp，R.E.，Stayton，P.S.，2006.Protem Sci.15，459-467.
Kaastrup，K.，Chan，L.，Sikes，H.D.，2013.Anal.Chem.85.8055-8060.
Kelley，S.O.，Mirkin，C.A.，Walt，D.R.，Ismagilov，R.F.，Toner，M.，Sargent，E.H.，2014.Nat.Nanotcchnol.9，969-980.
Kim，H.D.，Choi.S.L.，Kim，H.，Sohn，J.H.，Lee.S.G.，2013.Biotechnol.Bioprocess Eng.18，575-580.
Kumada，Y.，2014.Biochim.Biophys.Acta-Proteins Proteomics 1844，1960-1969.
Levy，I.，Shoseyov，O.，2002.Biotechnol.Adv.20，191-213.Li，M.，Yue，Y.，Zhang，Z.J.，Wang.Z.Y.，Tan，T.W.，Fan，L.H.，2016.Bioconjug.Chem.27，1579-1583.
McBee，R.H.，1954.J.Bacteriol.67，505-6.
Millcr，E.A.，Traxlmayr，M.W.，Shcn，J.，Sikcs，H.D.，2016.Mol.Syst.Dcs.Eng.1，377-381.Napolitano，D.R.，Pollock，N.，Kashino，S.S.，Rodrigues，V.，Campos-Neto，A.，2008.Clin.Vaccine Immunol.15，638-43.
Nery，E.W.，Kubota，L.T.，2016.J.Pharm.Biomed.Anal.117，551-559.
Parsa，H.，Chin，C.D.，Mongkolwisetwara，P.，Lee，B.W.，Wang，J.J.，Sia，S.K.，2008.Lab Chip 8，2062.
Peluso，P.，Wilson，D.S.，Do，D.，Tran，H.，Venkatasubbaiah，M.，Quincy，D.，Heidecker，B.，Poindexter，K.，Tolani，N.，Phelan，M.，Witte，K.，Jung，L.S.，Wagner，P.，Nock，S.，2003.Anal.Biochem.312，113-24.
Ricci，F.，Vallée-Bélisle.A.，Simon，A.J.，Porchetta，A.，Plaxco，K.W.，2016.Acc.Chem.Res.49.1884-1892.
Rissin，D.M.，Wilson，D.H.，Duffy，D.C.，2013.Chapter 2.13：Measurement ofSingle Protein Molecules Using Digital ELIS A.in：The Immunoassay Handbook，Elsevier.pp.223-242.
Rosa，A.M.M.，Louro，A.F.，Martins，S.A.M.，Inácio，J.，Azevedo，A.M.，Prazeres，D.M.F.，2014.AnaJ.Chem.86，4340-4347.
Seker，U.O.S.，Demir，H.V.，2011.Molecules 16，1426-1451.
Shen，M.，Rusling，J.，Dixit，C.K.，2016.Methods 116，95-111.
Song，H.Y.，Zhou，X.，Hoblcy，J.，Su，X.，2012.Langmuir 28，997-1004.
Sugimoto，N.，Igarashi，K.，Samejima，M.，2012.Protein Expr.Purif.82.290-296.
Tang，R.，Yang，H.，Choi，J.R.，Gong，Y.，Hu，J.，Feng，S.，Pingguan-Murphy，B.，Mei，Q.，Xu，F.，2016.Talanta 152，269-276.
Tomme，P.，Boraston，A.，McLean，B.，Kormos，J.，Creagh，A.L.，Sturch，K.，Gilkes，N.R.，Haynes，C.A.，Warren，R.A.J.，Kilbum，D.G.，1998.J.Chromatogr.BBiomed.Appl.715，283-296.
Traxlmayr，M.W.，Kicfcr，J.D.，Srinivas，R.R.，Lobncr，E.，Tisdalc，A.W.，Mchta，N.K.，Yang，N.J.，Tidor，B.，Wittrup，K.D.，2016.J.Biol.Chem.291.22496-22508.
Vuoriluoto，M.，Orelma，H.，Zhu，B.，Johansson，L.-S.S.，Rojas，O.J.，2016.ACSAppl.Mater.Interfaces 8，5668-5678.
Yaniv，O.，Morag，E.，Borovok，I.，Bayer，E.A.，Lamed，R.，Frolow，F.，Shimon，L.J.W.，2013.Acta Cryst 69，733-737.
Yu，A.，Shang，J.，Cheng，F.，Paik，B.A.，Kaplan，J.，Andrade，R.B.，Ratner，D.M.，2012.Langmuir 28，11265-11273.
Zhao，M.，Li，H.，Liu，W.，Guo，Y.，Chu，W.，2016.Biosens.Bioelectron.79，581-588.
Zhu，Y.，Xu.X.，Brault，N.D.，Keefe，A.J.，Han，X.，Deng，Y.，Xu.J.，Yu，Q.，Jiang，S.，2014.Anal.Chem.86，2871-2875.
Miller，E.A.，Traxlmayr，M.W.，Shen，J.，Sikes，H.D.，2016.Mol.Syst.Des.Eng.1，377-381.
Schafer，D.E.，1983.Measurement of Receptor-Ligand Binding：Theory andPractice，in：Lambrecht，R.M.，Rescigno，A.(Eds.)，.Springer Berlin Heidelberg，Berlin，Heidelberg，pp.445-507.
其他实施方案
本说明书中公开的所有特征可以以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可由具有相同、等同或相似目的的替代特征代替。因此，除非另外明确指出，否则所公开的每个特征仅是一系列等同或相似特征的实例。
根据以上描述，本领域技术人员可容易地确定本公开内容的基本特征，并且在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，可对本公开内容进行多个改变和修改以使其适应多个用途和情况。因此，其他实施方案也在要求保护之内。
等同方案
虽然已在本文中描述和举例说明了数个发明实施方案，但是本领域普通技术人员将容易想到用于执行本文中所述的功能和/或获得本文中所述的结果和/或一个或更多个优点的多种其他手段和/或结构，并且这样的变化方案和/或修改方案中的每一个均被认为在本文中所述的发明实施方案的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易地理解，本文中所述的所有参数、尺寸、材料和配置均意在示例性的，而且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于使用本发明教导的一个或更多个具体应用。本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定本文中所述的具体本发明实施方案的许多等同方案。因此，应当理解，前述实施方案仅通过实例给出，并且在其所附权利要求书和等同方案的范围内，本发明实施方案可以以除具体描述和要求保护的之外的方式进行实践。本公开内容的发明实施方案针对本文中所述的每个单独的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果这样的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法不是相互矛盾的，则两个或更多个这样的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任意组合包括在本公开内容的发明范围内。
本文中所定义和使用的所有定义应理解为优先于字典定义、通过引用并入的文献中的定义和/或所定义术语的一般含义。
本文中公开的所有参考文献、专利和专利申请均关于其被引用的各自主题通过引用并入，其在一些情况下可涵盖文件的整个内容。
除非明确指出相反，否则本文中在说明书和权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词应理解为意指“至少一个/种”。
本文中在说明书和权利要求书中所使用的，短语“和/或”应理解为意指这样连接的要素，即在一些情况下共同存在而在另一些情况下分别存在的要素中的“任一个或二者”。用“和/或”列出的多个要素应以相同的方式解释，即，如此连接的要素中的“一个或更多个”。除了由“和/或”子句具体标识的要素之外，还可任选地存在其他要素，无论与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为一个非限制性实例，在与诸如“包含”的开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的引用在一个实施方案中仅指A(任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中，仅指B(任选地包括除A之外的要素)；在又一个实施方案中，指A和B二者(任选地包括其他要素)；等。
本文中在说明书和权利要求书中使用的“或”应理解为具有与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或“和/或”应理解为包括，即包括多个要素或要素列表中的至少一个，但也包括其中的多于一个，并且任选地包括另外的未列举的项目。仅明确指出相反的术语，例如“仅一个”或“恰好一个”，或当用于权利要求书中时“由……组成”，将是指包括多个要素或要素列表中的恰好一个要素。一般而言，当前面有排它术语例如“二者之一”、“其一”、“仅有其一”或“恰好其一”时，本文中使用的术语“或”应该理解为表示排它的替代方案(即“一个或另一，但非二者”)。“基本由……组成”当在权利要求书中使用时应具有其在专利法领域中所使用的一般含义。
本文中在说明书和权利要求书中使用的短语“至少一个”在提及一个或更多个要素的列表时应理解为意指从要素列表中的任一个或更多个要素中选择的至少一个要素，但并不一定包括要素列表内具体列举的每个要素中的至少一个，并且也不排除要素列表中要素的任何组合。该定义还允许除了在短语“至少一个”所提及的要素列表内具体确定的要素之外的要素，无论与具体确定的那些要素相关还是不相关，都可任选地存在。因此，作为一个非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等同地，“A或B中的至少一个”，或等同地，“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中可指至少一个A，任选地包括多于一个A，但不存在B(并且任选地包括除了B以外的要素)；在另一个实施方案中，可指至少一个B，任选地包括多于一个B，但不存在A(并且任选地包括除了A以外的要素)；在又一个实施方案中，可指至少一个A，任选地包括多于一个A，以及至少一个B，任选地包括多于一个B(并且任选地包括其他要素)；等。
应当理解的是，除非明确指出相反，否则在本文中要求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，方法中的步骤或动作的顺序不一定受限于所列举的该方法之步骤或动作的顺序。
在权利要求书中以及上述说明书中，所有的连接词(例如“包含”、“包括”、“带有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由……构成”等)都应理解为开放式的，即，意指包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节(United States Patent OfficeManual of Patent Examining Procedures，Section 2111.03)中所述，仅连接词“由……组成”和“基本上由……组成”应当分别是封闭或半封闭的连接词。应当理解，在本文件中描述的使用开放式连接词(例如，“包含”)的实施方案也在作为替代的实施方案中被考虑为“由开放式连接词描述的特征组成”和“基本上由开放式连接词描述的特征组成”。例如，如果本公开内容描述“包含A和B的组合物”，则本公开内容还考虑作为替代的实施方案“由A和B组成的组合物”和“基本上由A和B组成的组合物”。
Claims (97)
1.双功能融合蛋白，其包含纤维素结合结构域(CBD)或碳水化合物结合模块(CBM)，和工程化的减电荷Sso7d(rcSso7d)抗原结合蛋白。
2.权利要求1所述的双功能融合蛋白，其中所述工程化的rcSso7d抗原结合蛋白的C端与所述CBD的N端连接。
3.权利要求1或2所述的双功能融合蛋白，其中所述工程化的rcSso7d抗原结合蛋白通过接头与所述CBD连接。
4.权利要求3所述的双功能融合蛋白，其中所述接头是Gly-Ser接头。
5.权利要求1至4中任一项所述的双功能融合蛋白，其中所述工程化的rcSso7d抗原结合蛋白包含链霉抗生物素蛋白结合结构域。
6.权利要求1至5中任一项所述的双功能融合蛋白，其中所述rcSso7d抗原结合蛋白包含结核抗原结合结构域、黄病毒非结构性1(NS1)结合结构域、白介素-6(IL-6)结合结构域或荧光团结合结构域。
7.权利要求6所述的双功能融合蛋白，其中所述结核抗原结合结构域包含Rv1656结合结构域、Rv1681结合结构域、Rv2392结合结构域、Rv1729c结合结构域或TBCG_03312结合结构域。
8.权利要求1至7中任一项所述的双功能融合蛋白，其中所述rcSso7d抗原结合蛋白包含来自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的SEQ ID NO：3的氨基酸序列的至少85％。
9.权利要求1至8中任一项所述的双功能融合蛋白，其中所述CBD是3a型CBD或1型二聚化CBD(dCBD)。
10.权利要求9所述的双功能融合蛋白，其中所述3a型CBD是来自热纤梭菌(Clostridium thermocellum)的蛋白质CipA的结构域。
11.用于检测目的抗原的方法，所述方法包括：
(a)使权利要求1至10中任一项所述的双功能融合蛋白与含纤维素基底接触足以使所述双功能融合蛋白结合所述含纤维素基底的时间；
(b)使与所述含纤维素基底结合的所述双功能融合蛋白与包含目的抗原的样品接触；以及
(c)检测被所述工程化的rcSso7d抗原结合蛋白结合的所述目的抗原。
12.权利要求11所述的方法，其中所述双功能融合蛋白在溶液中。
13.权利要求11或12所述的方法，其中所述溶液包含缓冲剂。
14.权利要求11至13中任一项所述的方法，其中所述样品是生物样品。
15.权利要求11至14中任一项所述的方法，其中所述双功能融合蛋白摩尔过量于所述目的抗原。
16.权利要求15所述的方法，其中所述双功能融合蛋白至少10倍摩尔过量于所述目的抗原。
17.权利要求11至16中任一项所述的方法，其中所述目的抗原是结核抗原。
18.权利要求11至16中任一项所述的方法，其中所述目的抗原是Rv1656或链霉抗生物素蛋白。
19.权利要求11至18中任一项所述的方法，其中至少50％的所述目的抗原从所述样品中消耗。
20.权利要求11至19中任一项所述的方法，其中所述含纤维素基底是纸或硝酸纤维素。
21.权利要求11至19中任一项所述的方法，其中所述含纤维素基底是色谱纸。
22.权利要求21所述的方法，其中所述色谱纸是未改性的。
23.权利要求11至22中任一项所述的方法，其还包括在检测被所述工程化的rcSso7d抗原结合蛋白结合的所述目的抗原之前，将所述含纤维素基底用缓冲溶液清洗。
24.权利要求11至23中任一项所述的方法，其中所述样品是来自对象的生物样品。
25.权利要求24所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。
26.权利要求24所述的方法，其中所述对象是人。
27.权利要求11至26中任一项所述的方法，其中所述CBD与所述含纤维素基底结合。
28.权利要求11至27中任一项所述的方法，其中所述工程化的rcSso7d抗原结合蛋白与结核抗原结合。
29.权利要求11至27中任一项所述的方法，其中所述工程化的rcSso7d抗原结合蛋白与Rv1656结合或与链霉抗生物素蛋白结合。
30.用于检测目的抗原的方法，所述方法包括：
(a)使权利要求1至10中任一项所述的双功能融合蛋白与包含目的抗原的样品接触，其中所述目的抗原与所述双功能融合蛋白结合并且形成复合体；
(b)使所述复合体与含纤维素基底接触足以使所述复合体与所述含纤维素基底结合的时间；以及
(c)检测被所述工程化的rcSso7d抗原结合蛋白结合的所述目的抗原。
31.权利要求30所述的方法，其中所述双功能融合蛋白在溶液中。
32.权利要求30或31所述的方法，其中所述溶液包含缓冲剂。
33.权利要求30至32中任一项所述的方法，其中所述样品是生物样品。
34.权利要求30至33中任一项所述的方法，其中所述双功能融合蛋白摩尔过量于所述目的抗原。
35.权利要求34所述的方法，其中所述双功能融合蛋白至少10倍摩尔过量于所述目的抗原。
36.权利要求30至35中任一项所述的方法，其中所述目的抗原是结核抗原。
37.权利要求30至35中任一项所述的方法，其中所述目的抗原是Rv1656或链霉抗生物素蛋白。
38.权利要求30至37中任一项所述的方法，其中至少50％的所述目的抗原从所述样品中消耗。
39.权利要求30至38中任一项所述的方法，其中所述含纤维素基底是纸或硝酸纤维素。
40.权利要求30至38中任一项所述的方法，其中所述含纤维素基底是色谱纸。
41.权利要求40所述的方法，其中所述色谱纸是未改性的。
42.权利要求30至41中任一项所述的方法，其还包括在检测被所述工程化的rcSso7d抗原结合蛋白结合的所述目的抗原之前，将所述含纤维素基底用缓冲溶液清洗。
43.权利要求30至42中任一项所述的方法，其中所述样品是来自对象的生物样品。
44.权利要求43所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。
45.权利要求43所述的方法，其中所述对象是人。
46.权利要求30至45中任一项所述的方法，其中所述CBD与所述含纤维素基底结合。
47.权利要求30至46中任一项所述的方法，其中所述工程化的rcSso7d抗原结合蛋白与结核抗原结合。
48.权利要求11至27中任一项所述的方法，其中所述工程化的rcSso7d抗原结合蛋白与Rv1656、Rv1681、Rv2392、Rv1729c、TBCG_03312或链霉抗生物素蛋白结合。
49.用于评估样品中目的抗原的存在或量的方法，所述方法包括使所述样品与权利要求1至10中任一项所述的双功能融合蛋白接触，以及测量所述样品中所述目的抗原的存在或量。
50.权利要求49所述的方法，其中所述双功能融合蛋白在溶液中。
51.权利要求49或50所述的方法，其中所述溶液包含缓冲剂。
52.权利要求49至51中任一项所述的方法，其中所述样品是生物样品。
53.权利要求49至52中任一项所述的方法，其中所述双功能融合蛋白摩尔过量于所述目的抗原。
54.权利要求53所述的方法，其中所述双功能融合蛋白至少10倍摩尔过量于所述目的抗原。
55.权利要求49至54中任一项所述的方法，其中所述目的抗原是结核抗原。
56.权利要求49至54中任一项所述的方法，其中所述目的抗原是Rv1656或链霉抗生物素蛋白。
57.权利要求49至56中任一项所述的方法，其中至少50％的所述目的抗原从所述样品中消耗。
58.权利要求49至57中任一项所述的方法，其中所述双功能融合蛋白与含纤维素基底结合。
59.权利要求58所述的方法，其中所述含纤维素基底是纸或硝酸纤维素。
60.权利要求58所述的方法，其中所述含纤维素基底是色谱纸。
61.权利要求60所述的方法，其中所述色谱纸是未改性的。
62.权利要求49至61中任一项所述的方法，其中所述样品是来自对象的生物样品。
63.权利要求62所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。
64.权利要求62所述的方法，其中所述对象是人。
65.权利要求49至64中任一项所述的方法，其中所述CBD与所述含纤维素基底结合。
66.权利要求49至65中任一项所述的方法，其中所述经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白与结核抗原结合。
67.权利要求49至66中任一项所述的方法，其中所述经工程化的rcSso7d抗原结合蛋白与Rv1656结合或与链霉抗生物素蛋白结合。
68.组合物，其包含与含纤维素基底结合的权利要求1至10中任一项所述的双功能融合蛋白。
69.权利要求68所述的组合物，其还包含含纤维素基底。
70.权利要求68或69所述的组合物，其中所述含纤维素基底是纸或硝酸纤维素。
71.权利要求68或69所述的组合物，其中所述含纤维素基底是色谱纸。
72.权利要求68或69所述的组合物，其中所述色谱纸是未改性的。
73.用于评估抗原的存在或量的试剂盒，所述试剂盒包含含有权利要求1至10中任一项所述的双功能融合蛋白的容器。
74.权利要求73所述的试剂盒，其还包含含纤维素基底。
75.权利要求73或74所述的试剂盒，其中所述双功能融合蛋白与所述含纤维素基底结合。
76.权利要求73或74所述的试剂盒，其中所述双功能融合蛋白不与所述含纤维素基底结合。
77.权利要求73至76中任一项所述的试剂盒，其中所述含纤维素基底是纸或硝酸纤维素。
78.权利要求73至76中任一项所述的试剂盒，其中所述含纤维素基底是色谱纸。
79.权利要求78所述的试剂盒，其中所述色谱纸是未改性的。
80.用于测定目的抗原的方法，其包括
使抗原与结合含纤维素基底的权利要求1至10中任一项所述双功能融合蛋白接触，其中所述双功能融合蛋白以至少10倍或更高摩尔过量于所述目的抗原或者至少10倍或更高浓度过量于所述目的抗原与所述含纤维素基底结合。
81.权利要求80所述的方法，其中所述双功能融合蛋白至少60倍摩尔过量于所述目的抗原。
82.权利要求80或81所述的方法，其中所述目的抗原是结核抗原。
83.权利要求80或81所述的方法，其中所述目的抗原是Rv1656或链霉抗生物素蛋白。
84.权利要求80至83中任一项所述的方法，其中所述含纤维素基底是纸、硝酸纤维素或纤维素粉末。
85.权利要求80至83中任一项所述的方法，其中所述含纤维素基底是色谱纸。
86.权利要求85所述的方法，其中所述色谱纸是未改性的。
87.权利要求80至86中任一项所述的方法，其中所述CBD与所述含纤维素基底结合。
88.权利要求80至87中任一项所述的方法，其中所述工程化的rcSso7d抗原结合蛋白与结核抗原结合。
89.权利要求80至87中任一项所述的方法，其中所述工程化的rcSso7d抗原结合蛋白与Rv1656结合或与链霉抗生物素蛋白结合。
90.权利要求1至10中任一项所述的双功能融合蛋白，其中所述双功能融合蛋白包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个rcSso7d抗原结合蛋白。
91.权利要求90所述的双功能融合蛋白，其中所述至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个rcSso7d抗原结合蛋白遗传融合在一起。
92.权利要求91所述的双功能融合蛋白，其中所述至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个rcSso7d抗原结合蛋白与所述CBM或CBD直接或间接地连接。
93.权利要求84所述的方法，其中所述纤维素粉末在溶液中以捕获可溶性分析物、抗原或目的抗原。
94.工程化的减电荷Sso7d(rcSso7d)抗原结合蛋白，其包含与麦芽糖结合蛋白(MBP)直接或间接地连接的rcSso7d抗原结合蛋白。
95.权利要求94所述的工程化的rcSso7d抗原结合蛋白，其中所述rcSso7d还包含生物素接纳体。
96.用于检测目的抗原的方法，所述方法包括：
(a)使目的抗原与氧化的纤维素基底接触足以使所述目的抗原与所述氧化的纤维素基底结合的时间；
(b)使(a)中与所述氧化的纤维素基底结合的所述目的抗原与权利要求94或95所述的工程化的rcSso7d抗原结合蛋白接触足以使所述目的抗原与(b)的所述工程化的rcSso7d抗原结合蛋白结合的时间；以及
(c)检测与所述工程化的rcSso7d抗原结合蛋白(b)结合的所述目的抗原。
97.权利要求96所述的方法，其中在(c)中所述目的抗原用与荧光团缀合的链霉抗生物素蛋白进行检测。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020231504A1 (en) * | 2019-05-16 | 2020-11-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Glycan-binding proteins and related compositions and methods |
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| WO2022103797A1 (en) * | 2020-11-10 | 2022-05-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Engineered protein for rapid, efficient capture of pathogen-specific antibodies |
| WO2022103793A1 (en) * | 2020-11-10 | 2022-05-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Engineered proteins that bind the sars-cov-2 nucleocapsid protein |
| CN112851821B (zh) * | 2021-01-12 | 2022-07-05 | 山东省科学院生物研究所 | 一种融合酶及所述融合酶在纸基生物传感器中的应用 |
| WO2022220754A1 (en) * | 2021-04-14 | 2022-10-20 | Attonics Systems Pte Ltd | Methods, devices and systems for rapid detection of biomolecules |
| EP4190358A1 (en) | 2021-12-05 | 2023-06-07 | Affilogic | Polypeptide as carrier for intestinal barrier crossing |
| CN114594262B (zh) * | 2022-02-21 | 2022-11-01 | 国家粮食和物资储备局科学研究院 | 基于双功能融合蛋白的真菌毒素磁化学发光免疫分析试剂盒及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1125452A (zh) * | 1993-04-14 | 1996-06-26 | 加州大学评议会 | 纤维素结合区域 |
| US20170252417A1 (en) * | 2016-03-07 | 2017-09-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Protein-chaperoned t-cell vaccines |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003074722A2 (en) * | 2002-03-07 | 2003-09-12 | Zephyr Proteomix Ltd. | Microarrays of cellulose binding chimeric proteins and methods of use thereof |
| WO2008141436A1 (en) * | 2007-05-18 | 2008-11-27 | University Of Guelph | Method for the detection and/or detoxification of compounds |
| CN102392000A (zh) * | 2011-11-07 | 2012-03-28 | 李志茹 | 一种耐高温Pyrolobus聚合酶及其高效表达质粒和应用 |
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-
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1125452A (zh) * | 1993-04-14 | 1996-06-26 | 加州大学评议会 | 纤维素结合区域 |
| US20170252417A1 (en) * | 2016-03-07 | 2017-09-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Protein-chaperoned t-cell vaccines |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| E. A. MILLER等: "Activity-based assessment of an engineered hyperthermophilic protein as a capture agent in paper-based diagnostic tests", MOL. SYST. DES. ENG., vol. 1, no. 4, pages 377 - 381, XP055533713, DOI: 10.1039/C6ME00032K * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112646007A (zh) * | 2020-11-09 | 2021-04-13 | 中国人民解放军总医院第八医学中心 | 用于结核分枝杆菌检测的组合蛋白及检测试剂 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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Legal Events
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