FR2721618A1

FR2721618A1 - Fragments d'acide nucléique et fragments peptidiques correspondants issus du génome du virus de l'arthrite et de l'encéphalite caprine (VAEC) et leurs applications.

Info

Publication number: FR2721618A1
Application number: FR9407933A
Authority: FR
Inventors: Giuseppe Bertoni; Gianfranco Pancino; Ernst Peterhans; Pierre Sonigo
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1994-06-28
Filing date: 1994-06-28
Publication date: 1995-12-29
Anticipated expiration: 2014-06-28
Also published as: AU2890495A; US5858672A; NZ289147A; AU693575B2; EP0769058A1; CA2193997A1; FR2721618B1; WO1996000784A1

Abstract

Fragments nucléotidiques issus du gène env du virus de l'arthrite et de l'encéphalite caprine (VAEC ou CAEV: caprine arthritis-encephalitis virus) et fragments peptidiques correspondants et leurs applications au dépistage de l'encéphalite et de l'arthrite virale caprine. Anticorps anti-fragments peptidiques ainsi que leurs applications au diagnostic de l'encéphalite et de l'arthrite virale. Lesdits fragments d'acide nucléique codent pour un fragment peptidique incluant au moins un segment de protéine Env du VAEC comprenant au moins un épitope immunodominant, sélectionné dans la région transmembranaire de ladite protéine, lesquels fragments d'acide nucléique comprennent entre 15 et 255 nucléotides.

Description

La présente invention est relative à des fragments nucléotidiques issus du gène env du virus de l'arthrite et de l'encéphalite caprine (VAEC ou CAEV caprine arthri tis-encephali tis virus) et aux fragments peptidiques correspondants et à leurs applications au dépistage de l'encéphalite et de l'arthrite virale caprine ; la présente invention est également relative à des anticorps anti-fragments peptidiques ainsi qu'à leurs applications au diagnostic de l'encéphalite et de 1 'arthrite virale.

Le virus de l'arthrite et de l'encéphalite caprine est un lentivirus, entraînant une leucoencéphalite chez les jeunes chèvres et une arthrite chronique clinique, chez 20 à 30 % des chèvres adultes infectées naturellement. L'arthrite est habituellement progressive et est particulièrement sévère au niveau des espaces synoviaux des articulations carpiennes.

La séquence nucléotidique de la souche VAEC-CO a été séquencée et décrite (M. SALTARELLI et al., Virol., 1990, 179, 347-364), à partir de clones infectieux, obtenus à partir de fragments HindIII, transfectés dans des cellules de membrane synoviale de chèvre. Le génome comprend 9189 nucléotides et inclut successivement la séquence codant pour le LTR, les séquences codant pour les différentes protéines virales : protéine Gag, protéine Pol, la protéine de régulation Q, la protéine Tat, les protéines d'enveloppe et la protéine Rev.

L'organisation du gène env, codant pour la glycoprotéine d'enveloppe du VAEC est similaire à celle des virus du mouton (virus VISNA) et comprend une séquence codant pour une protéine de surface (SU) et une séquence codant pour une protéine transmembranaire (TM), qui forment la glycoprotéine d'enveloppe.

Les protéines d'enveloppe du VAEC sont considérées comme étant au centre de la relation hôte-virus leur étude est donc essentielle pour comprendre l'interaction du virus avec le système immunitaire (épitopes neutralisants, épitopes B et T) et avec les cellules-cibles de l'infection et pour mettre au point des réactifs de diagnostic performants.

La sévérité de la maladie chez les animaux infectés semble directement corrélée au taux d'anticorps anti-protéine d'enveloppe virale (Env), et en particulier au taux d'anticorps anti-protéine transmembranaire (TM) et/ou au taux d'anticorps anti-protéine de surface (SU) de ladite protéine d'enveloppe Env (T.C. McGUIRE et al.

J. Virol., 1992, 66 5, 3247-3250 ; D.P. KNOWLES et al., 1991, J. Virol., 1991, 65 11, 5744-5750).

En effet, la réponse immune à l'antigène viral joue un rôle important dans l'inflammation des articulations (en particulier, l'inflammation des espaces synoviaux des articulations carpiennes), notamment en raison d'une infiltration massive desdites articulations par des lymphocytes, plasmocytes et macrophages et par une accumulation d'anticorps dirigés contre la protéine Env.

En particulier, les sérums, présentant un titre important vis-à-vis des glycoprotéines TM monomérique (38 kDa) et oligomérique, se retrouvent chez les chèvres présentant une arthrite progressive (D.P. KNOWIES et al., J. Virol., 1990, 64, 2396-2398).

En outre, les chèvres, vaccinées avec du virus de l'arthrite et de l'encéphalite caprine inactivé, développent une arthrite plus sévère, après infection en laboratoire, que les animaux contrôles (McGUIRE et al.,
J. Vet. Res., 1986, 47 537-540).

I1 est donc crucial d'établir une surveillance constante des troupeaux, afin d'éviter la propagation de la maladie, en particulier en excluant le plus rapidement possible les animaux malades.

A l'heure actuelle, l'arthrite à VAEC est essentiellement diagnostiquée à l'aide de tests sérologiques, basés sur une préparation de virus entier ; de tels tests présentent l'inconvénient d'être difficiles à préparer et d'être coûteux ; ils nécessitent également une mise au point particulièrement délicate (problème de standardisation) et peuvent, en outre, entraîner des réactions faussement négatives et/ou des réactions faussement positives.

I1 existe également d'autres tests (tests
ELISA), utilisant des protéines recombinantes Gag ; de tels tests présentent également l'inconvénient d'entraîner des réactions faussement négatives et/ou faussement positives et créent, en outre, des problèmes de bruit de fond.

Or, il est absolument crucial de disposer d'un test fiable et peu coûteux, de manière à pouvoir tester l'ensemble des troupeaux, pour éviter une contagion massive (notamment par le lait) (programme d'éradication).

La présente invention s'est, en conséquence, donné pour but de pourvoir à des réactifs aptes à dépister l'arthrite à VAEC, qui répondent mieux aux besoins de la pratique, notamment en permettant la mise au point de tests diagnostics hautement spécifiques (absence de fauxpositifs et de faux négatifs) ne comportant en outre aucun risque pour l'utilisateur et permettant un dépistage rapide de l'ensemble des troupeaux.

La présente invention a pour objet des fragments d'acide nucléique, caractérisés en ce qu'ils codent pour un fragment peptidique incluant au moins un segment de protéine Env du VAEC comprenant au moins un épi tope immunodominant et sélectionné dans la région transmembranaire de ladite protéine, lesquels fragments d'acide nucléique comprennent entre 15 et 255 nucléotides.

Parmi ces fragments d'acide nucléique, on peut citer
- un fragment, correspondant aux positions 8003-8163 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence TAAGGCAGCTGTCCAGACCCTTGCTAATGCAACTGCTGCACAGCAGGA TGTGTTAGAGGCAACCTATGC CATGGTACAGCATGTGGCTAAAGGCGTACGAATCTT
GGAAGCTCGAGTGGCTCGAGTGGAAGCTATCACAGATAGAATAATGCTATACCAAG (SEQ n l), et codant pour un fragment peptidique dénommé Gl
- un fragment, correspondant aux positions 8019-8264 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, et codant pour un fragment peptidique dénommé G2
- un fragment, correspondant aux positions 7991-8107 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, et codant pour un fragment peptidique dénommé G3
- un fragment, correspondant aux positions 8204-8360 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence TACAAAAACAGAAGTAGCAAAATATATCAATTGGACGAGGTTTAAGGA
TAATTGCACATGGCAGCAGTGGGAGAGAGGATTACAGGGGTATGATACAAACTTAAC
AATAC TGTTAAAGGAATCAGCAGCAATGACACAACTAGCAGAAGAGCAAGCA (SEQ n'2), et codant pour un fragment peptidique dénommé G4
- un fragment, correspondant aux positions 8090-8259 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence TAAAGGCGTACGAATCTTGGAAGCTCGAGTGGCTCGAGTGGAAGCTAT
CACAGATAGAATAATGC TATACCAAGAATTGGATTGTTGGCACTATCATCAATACTG
TATAACCTCTACAAAAACAGAAGTAGCAAAATATATCAATTGGACGAGGTTTAAGGA
TAATTGCA (SEQ n 3), et codant pour un fragment peptidique dénommé G5
- un fragment, correspondant aux positions 8049-8093 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence GATGTGTTAGAGGCAACCTATGCCATGGTACAGCATGTGGCTAAA (SEQ n"4), et codant pour un fragment peptidique dénommé TM1
- un fragment, correspondant aux positions 8130-8165 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence GAAGCTATCACAGATAGAATAATGCTATACCAAGAA (SEQ n'5) et codant pour un fragment peptidique dénommé TM2
- un fragment, correspondant aux positions 8160-8204 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence CAAGAATTGGATTGTTGGCACTATCATCAATACTGTATAACCTCT (SEQ n'6) et codant pour un fragment peptidique dénommé TM3 cet et
- un fragment, correspondant aux positions 8256-8297 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence TGCACATGGCAGCAGTGGGAGAGAGGATTACAGGGGTATGAT (SEQ n'7) et codant pour un fragment peptidique dénommé TM4.

La présente invention a également pour objet un fragment peptidique, caractérisé en ce qu'il inclut au moins un segment de protéine Env du VAEC, sélectionné dans la région transmembranaire de ladite protéine, comprenant entre 5 et 85 aminoacides et au moins un épitope immunodominant, et en ce qu'il est reconnu par au moins 60 % d'anticorps produits lors d'une infection et/ou lors d'une inoculation par une souche du VAEC.

On entend par épitope, au sens de la présente invention, les épitopes spécifiques de groupe, c'est-àdire communs à toutes les souches du VAEC (zones conservées), reconnus par les anticorps dirigés contre toutes les souches de VAEC (reconnaissance de groupe).

Parmi ces fragments peptidiques, l'invention englobe entre autre
- un fragment incluant un segment de 53 aminoacides, dénommé G1, et qui correspond aux positions 665-717 de la protéine Env du VAEC
- un fragment incluant un segment de 82 aminoacides, dénommé G2, et qui correspond aux positions 670-751 de ladite protéine Env
- un fragment incluant un segment de 38 aminoacides, dénommé G3, et qui correspond aux positions 661-698 de ladite protéine Env
- un fragment incluant un segment de 52 aminoacides, dénommé G4, et qui correspond aux positions 732-783 de la protéine Env
- un fragment incluant un segment de 56 aminoacides, dénommé G5, et qui correspond aux positions 694-749 de ladite protéine Env
- un fragment incluant un segment de 15 aminoacides, dénommé TM1, et qui correspond aux positions 680-694 de la séquence de la protéine Env du VAEC et dont la formule est
Asp-Val-Leu-Glu-Ala-Thr-Tyr-Ala-Met-Val-Gln-His-Val-Ala-
Lys (SEQ n"8) ;
- un fragment incluant un segment de 12 aminoacides, dénommé TM2, et qui correspond aux positions 707-718 de la séquence de la protéine Env du VAEC et dont la formule est
Glu-Ala-Ile-Thr-Asp-Arg-Ile-Met-Leu-Tyr-Gln-Glu (SEQ n'9)
- un fragment incluant un segment de 15 aminoacides, dénommé TM3, et qui correspond aux positions 717-731 de ladite protéine Env, lequel segment présente la séquence X3-Glu-Leu-Asp-Cys-Trp-His-Tyr-Xl-X2-Tyr-Cys-X4-Thr-Ser (SEQ n"10), dans laquelle X1, X2 et X3 représentent His ou Gln, X4 représente Ile ou Val ; de préférence, lorsque X1 représente His, X2 et X3 représentent Gln et X4 représente Ile et lorsque X1 représente Gln, X2 et X3 représentent His et X4 représente Val
- un fragment incluant un segment de 14 aminoacides, dénommé TM4, et qui correspond aux positions 749-762 de ladite protéine Env, lequel segment présente la séquence Cys-Thr-Trp-Gln-Gln-Trp-Glu-Arg-Glu-Leu-Gln-Gly-Tyr-Asp (SEQ n ll).

De manière inattendue, l'ensemble des séquences définies ci-dessus permettent un dépistage spécifique et sensible d'une infection à VAEC.

Egalement de manière inattendue, parmi ces fragments, les fragments peptidiques G5 ou TM3 et G4 ou
TM4 présentent une corrélation significativement élevée avec le développement de la maladie et servent donc de marqueurs particulièrement spécifiques pour le diagnostic de l'infection au VAEC ; les fragments peptidiques G5 ou
TM3 servent également de marqueurs pour le diagnostic de l'infection à VISNA.

Au sens de la présente invention, le terme fragment peptidique, comprend tous les fragments incluant un segment de peptides tel que défini ci-dessus, ainsi que les peptides homologues ; de manière générale, on entend par peptides homologues, les fragments peptidiques dont la position et la fonction sont équivalentes, au sein du VAEC (même localisation que celle définie ci-dessus, sur le génome du VAEC).

L'ensemble desdits peptides peut avantageusement être obtenu soit par clonage, soit par synthèse, notamment par synthèse de Merrifield.

La présente invention a également pour objet des anticorps anti-VAEC, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des anticorps spécifiques d'au moins un fragment peptidique issu de la zone transmembranaire de la protéine Env de VAEC, conforme à l'invention.

La présente invention a également pour objet un procédé de dépistage d'une infection à VAEC et/ou à
VISNA, caractérisé en ce qu il consiste à détecter les anticorps, éventuellement présents dans un échantillon biologique, à l'aide d'au moins un peptide ou fragment de peptides conforme à l'invention, éventuellement fixé sur un support solide approprié, en mettant en présence ledit échantillon biologique avec ledit/lesdits peptide(s) ou fragment(s) de peptides, auxquels se lient les anticorps, si de tels anticorps sont présents dans l'échantillon à analyser, la lecture du résultat étant révélée par un moyen approprié, notamment EIA, RIA, fluorescence.

Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, le peptide est choisi parmi TM3 et TM4 ou un mélange de ceux-ci.

La présente invention a, également, pour objet un procédé de dépistage d'une infection à VAEC, caractérisé en ce qu'un échantillon biologique convenablement traité pour extraire l'ADN et/ou les produits de transcription du VAEC
(1) est mis en contact avec au moins un fragment nucléotidique tel que défini ci-dessus,
(2) après quoi, l'hybride formé est détecté.

De manière avantageuse, préalablement à l'étape (1), ledit ADN peut être amplifié.

La présente invention a également pour objet un procédé de dépistage d'une infection à VAEC, caractérisé en ce qu'il consiste à détecter les glycoprotéines d'enveloppe du VAEC, en mettant en présence un échantillon biologique à tester avec au moins un anticorps antipeptide conforme à l'invention, la lecture du résultat étant révélée par un moyen approprié.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention.

I1 doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLE 1 : Peptides conformes à l'invention.

1) Construction d'une banque d'exoression des peptides conformes à l'invention
a) Clonage du gène env
Le gène env est obtenu à partir d'un clone infectieux du VAEC-CO (M. SALTARELLI et al., Virology, 1990, 179, 347-364).

Les positions nucléotidiques et aminoacides, qui définissent les différentes régions env précitées, correspondent aux positions des séquences telles que publiées dans cette référence.

Le clone du VAEC-CO consiste en deux plasmides, l'un contenant une grande partie du génome du
VAEC-CO à partir du 5'-LTR et le deuxième contenant un insert court de 321 pb, comprenant les séquences codant pour la partie C-terminale de Env et la partie 3' du LTR viral.

Pour générer un plasmide contenant la région codant pour la protéine Env entière, le fragment SmaI
HindIII du VAEC-CO est sous-cloné dans le plasmide pUC18, ainsi que le fragment HindIII-HindIII de 321 pb ; on obtient une construction dénommée pUC18 env 3.1. (figure 1)
b) Construction de la banque d'expression kgtll :
Le plasmide pUC18 env 3.1 est soumis à une digestion partielle à l'ADNase I à 15 C (15 pg/ml d'ADNase I dans du Tris-HCl, pH 7,4 en présence de MgC12, 1,5 mM, pendant 20 min), de manière à obtenir différents fragments d'ADN, d'environ 200 pb.

Ces différents fragments sont traités avec le fragment de Klenow de l'ADNase polymérase d'E. coli, de manière à obtenir des extrémités à bouts francs, pour une ligature efficace avec des séquences de liaison EcoRI de 10 paires de base (pb) (Pharmacia).

Le marquage au phosphore 32 des fragments d'ADN permet le contrôle des étapes ultérieures.

Les produits de la ligature sont alors digérés avec l'enzyme de restriction EcoRI et séparés par électrophorèse dans des gels d'agarose LMP NUSieves 2 %, de manière à sélectionner un ensemble de fragments comprenant entre 100 et 200 pb et à éliminer les séquences de liaison libres.

Les fragments sélectionnés sont extraits au phénol à partir de l'agarose ; on insère ensuite les dif férents fragments obtenus dans le site EcoRI du phage kgtll.

Les produits de la ligature (phages recombinants) sont alors empaquetés in vitro. Une banque de 3.106 phages est ainsi constituée.

On obtient ainsi une banque d'expression de peptides Env de VAEC, fusionnés à la ss-galactosidase, et exprimés dans E. coli, en utilisant le vecteur kgtll.

Un échantillon de la banque kgtll est inoculé sur la souche de E. coli Y1090 à une dilution représentant 104 phages par boîte de 90 cm de diamètre.

L'induction de l'expression de la protéine sous contrôle du promoteur Lac est déclenchée à 42 C, en présence d'isopropyl-thio--galactosidase (IPTG). Les phages recombinants sont sélectionnés par l'absence de coloration bleue des plaques de lyse.

c) Contrôle des peptides obtenus
Les phages kgtll recombinants permettent l'expression des fragments de gènes env sous le contrôle du promoteur Lac, après fusion de 1'ADN env avec le gène de la ss-galactosidase de E. coli.

Pour contrôler la qualité de ladite banque, et également obtenir un titre plus important, 40 plaques ont été isolées et analysées par PCR, en utilisant des amorces kgtll complémentaires, spécifiques de la portion -galactosidase de la matrice kgtll comme suit
un total de 10 1 de lysat de phage est dilué dans 60 Cil d'eau et porté à ébullition pendant 10 min.

Après microcentrifugation, 15 p1 du surnageant sont ajoutés à 85 1 d'un mélange PCR contenant 50 pM de chaque amorce, 10 nM de chaque désoxynucléoside triphosphate et 0,5 U de Taq polymérase (Perkin-Elmer-Cetus), dans une solution de Tris-HCl 10 mM, KC1 50 mM et MgCl2 2 mM.

Les amorces kgtll utilisées sont, comme précisé ci-dessus, complémentaires de la portion p-galacto- sidase de la matrice #gt11, à savoir
5'GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG 3' (amorce sens)
5'TTGACACCAGACCAACTGGTAATG 3' (amorce anti sens).

La PCR comprend 32 cycles (cycle 1 : 94'C, 2 min ; cycles 2 à 31 - 94"C, 15 sec./55 C, 30 sec./72'C, 30 sec. ; cycle 32 72 C, 3 min).

Les produits de l'amplification montrent que l'on obtient des inserts de différentes tailles, comprenant entre 130 et 250 pb.

Ces fragments amplifiés par PCR sont ensuite hybridés avec trois fragments NcoI radioactifs marqués au phosphore 32, représentant la séquence Env de VAEC-CO entière (sonde 1 : 6071-6456, sonde 2 6457-8071, sonde 3 : 8072-8712), indiquant que la banque est représentative du gène env entier.

2) Criblaqe de la bancue
La banque env Xgtll est criblée en utilisant les sérums de 3 chèvres, naturellement infectées, et ayant un titre élevé en protéines Gag de VAEC, par test
ELISA.

La sonde E. coli Y1090 est infectée par 3x104
PFU de la banque originale non amplifiée, étalée sur plaques et incubée à 42 C pendant 4 heures.

Les plaques sont alors recouvertes de filtres de nitrocellulose, saturés avec de 1'IPTG 10 mM et incubées pendant 3 heures à 37 C, de manière à induire l'expression de la protéine de fusion, ss-galactosidase- peptide Env.

Les filtres sont traités pour un criblage immunologique avec des sérums de 3 chèvres par incubation séparée (2 filtres par sérum), en utilisant des méthodes standard, telle que la procédure au lait dégraissé (MANIATIS).

Ce criblage permet d'isoler 5 clones fortement immunoréactifs, qui sont séquencés selon le protocole suivant
les produits de la PCR sont séparés sur gel d'agarose à 1,8 % et purifiés à laide de billes QIAEX# (Qiagen), selon les instructions du fabricant.

Un total de 1 Rl de diméthylsulfoxyde (DMSO) et de 20 pM soit d'amorce sens, soit d'amorce anti-sens, sont ajoutés dans un volume final de 10 p1.

Ce mélange est dénaturé à 100 C, pendant 12 min, et immédiatement transféré dans un bain glacé de méthanol.

1 Rl de dithiothréitol (0,1 M), 0,2 Rl dGTP (UBS), 0,5 l de [35S]ATP (600 Ci/mM), 0,6 l de DMSO, 3,8 l de dH2O et 0,2 ptl de Séquénase (UBS) sont ajoutés.

Les échantillons sont incubés à température ambiante pendant 1 min, puis pendant 15 min à 37 C.

Les séquences de ces 5 inserts, à savoir

<tb> Nom <SEP> du <SEP> Positions <SEP> sur <SEP> la <SEP> sé- <SEP> positions <SEP> sur <SEP> la <SEP> pro
<tb> fragment <SEP> quence <SEP> d'acide <SEP> nu- <SEP> téine <SEP> Env
<tb> <SEP> cléique
<tb> <SEP> G1 <SEP> 8003-8163 <SEP> 665-617
<tb> <SEP> G2 <SEP> 8019-8264 <SEP> 670-751
<tb> <SEP> G3 <SEP> 7991-8107 <SEP> 661-698
<tb> <SEP> G4 <SEP> 8204-8360 <SEP> 732-783
<tb> <SEP> G5 <SEP> 8090-8259 <SEP> 694-749
<tb> sont comprises dans la région extracellulaire de TM.

Ces résultats indiquent l'immunodominance et la conservation de ces domaines entre les différents isolats viraux.

3) Carte des éDitoDes immunodominants TM conformes à l'invention
a) Protocole
Une analyse PepscanS est réalisée de manière à définir précisément les épitopes TM immunoréactifs.

Des décapeptides chevauchants couvrant les séquences comprises entre les positions 8022 et 8327 de la protéine Env du VAEC ont été synthétisés.

Un essai immunoenzymatique a été réalisé conformément aux instructions du fabricant (Cambridge
Research Biochemicals), en utilisant les sérums provenant de 7 chèvres (dilution 1:100).

5 sérums proviennent de chèvres infectées naturellement avec des souches de VAEC, un sérum provient d'une chèvre infectée expérimentalement avec le VAEC-CO, et un sérum correspond à un pool de 4 sérums provenant de chèvres infectées expérimentalement avec le virus de 1 'arthrite-encéphalite caprine-CO.

La réaction est détectée par incubation en présence d'Ig de lapin anti-chèvre conjuguées à de la peroxydase (Sigma), diluée au 1:20000 ou en présence d'anticorps monoclonal conjugué à de la peroxydase (ChekitB) dilué au 1:200, suivie par une révélation à l'aide de 2,2' -azino-bis (3-éthylbenz-thiazoline-6-acide sulfonique (ABTS, Sigma).

b) Résultats
- TM1, TM2 et TM4
I1 ressort de ces essais que 3 groupes de peptides chevauchants sont réactifs et définissent trois épitopes différents conformément à la figure 2, qui comprend en abscisse les différents fragments chevauchant étudiés et en ordonnée, la densité optique à 405 nm (figure 2A) ainsi que la position des peptides immunoréactifs sur la séquence (figure 2B).

Ces peptides correspondent à TM1, TM2 et TM4.

- TM3
De manière surprenante, la région contenant les deux cystéines conservées, connue pour former une structure immunodominante et conservée chez différents lentivirus, ne réagit pas avec les sérums testés, mais le peptide TM3, comprenant cette région, a néanmoins été synthétisé.

Un autre peptide, avec la même séquence, mais chimiquement cyclisé par un lien covalent entre les deux cystéines a également été préparé (TM3c), de manière à reproduire une structure en boucle, considérée comme devant exister dans la protéine TM native.

Un pool de sérums provenant de 30 chèvres est testé en ELISA pour sa réactivité à TM3 et à TM3c.

Tous les sérums reconnaissent les deux peptides, il n'existe donc aucune différence significative entre TM3 et TM3c, de telle sorte que les autres expériences ont été réalisées uniquement avec TM3c.

L'épitope TM3 est localisé dans la région env la plus conservée, alors que les séquences correspondant à TM1, TM2 et TM4 présentent des variations (figure 3A).

L'étude comparative et l'alignement des séquences TM immunodominantes avec 3 clones moléculaires
MAEDI-VISNA très proches montrent une forte similarité de la région TM3 par rapport à celle de la protéine Env entière (figure 3B).

De plus, il existe une bonne corrélation entre le pourcentage de similarité et la réactivité sérologique des 4 peptides. En fait, la réactivité la plus large du peptide TM3, qui est compris dans la protéine de fusion
G5, confirme que cet épitope est localisé dans une région hautement conservée, comme cela est le cas dans les épitopes correspondants, d'autres lentivirus.

TM4 correspond également à une région conservée. Inversement, le domaine G1 qui contient les épitopes TM1 et TM2, semble plus variable.

EXEMPLE 2 : Test de dépistage d'une infection à VAEC.

I - Analvse sar immunoblot.

a) Protocole
Les domaines se liant aux anticorps, à savoir Gl : 8003-8163, G4 : 8204-8360 et G5 : 8090-8259 ont été exprimés sous forme de protéines de fusion avec la -galactosidase dans les bactéries E. coli lysogéniques Y1089, comme précisé ci-dessus.

Les lysats de bactéries contenant les protéines de fusion ont été préparés à partir de culture lysogénique-HPTG.

Les lysats (40 Ag/puits) sont séparés dans des gels SDS-PAGE (sodium dodécylsulfate-polyacrylamide) à 10 % et transférés sur filtres de nitrocellulose.

Les sites non spécifiques sont bloqués par incubation avec du lait dégraissé à 3 % dans un tampon
Tris-HCl (10 mM), NaCl (150 mM) et Tween 20 (0,1 %).

Les bandes de nitrocellulose sont incubées avec un sérum de chèvre dilué au 1:100/1:800 pendant une nuit à 4 C.

La liaison avec l'anticorps est révélée par incubation avec de la protéine G conjuguée à de la peroxydase, diluée au 1:5 000, suivie par une révélation au 4-chlore-l-naphtol (Sigma).

Un lysat de bactéries infectées avec un phage non recombinant kgtll est utilisé comme contrôle négatif.

Les sérums collectés avant l'infection expérimentale et un pool de sérums provenant de chèvres non infectées sont utilisés comme contrôle de l'anticorps.

De plus, la co-localisation des bandes immunoréactives avec les protéines de fusion est vérifiée avec un anticorps monoclonal dirigé contre la ss-galactosidase (Promega) ; le western blot sur l'antigène viral purifié est réalisé comme précisé dans R. ZANONI et al., J. Clin.

Microbiol., 1989, 27, 580-582.

b) Résultats
Les peptides G1, G4 et G5 tels que définis à l'exemple 1 couvrant la région immunoréactive de la protéine transmembranaire TM, sont utilisés dans un western blot pour cribler 60 sérums de chèvres infectées naturellement provenant de différents troupeaux, dans les conditions ci-dessus.

Le Tableau I ci-après montre que les sérums réagissent avec G5 et G4 à plus de 95 %, alors que seulement 60 % réagissent avec G1.

TABLEAU I

<tb> <SEP> RÉSUMÉ <SEP> DES <SEP> 60 <SEP> SÉRUMS <SEP> TESTÉS
<tb> <SEP> région <SEP> TM <SEP> G1 <SEP> G4 <SEP> G5
<tb> <SEP> sérums <SEP> positifs <SEP> 39 <SEP> 57 <SEP> 57
<tb> % <SEP> de <SEP> sérums <SEP> positifs <SEP> 65 <SEP> % <SEP> 95 <SEP> % <SEP> 95 <SEP> %
<tb>
II - Méthode ELISA.

a) Protocole
Les peptides (TM1-TM4) ont été synthétisés et purifiés.

Les peptides TM3 et TM4 ont été adsorbés sur plaque de microtitration comme suit
100 ptl d'une solution à 5 Rg/ml dans du carbonate de sodium 0,1 M, pH 9,6 ont été adsorbés dans chaque puits de plaque de microtitration (Nunc, Maxisorp), pendant une nuit à 4 C.

Le peptide TM1 montre une liaison faible et le peptide TM2 ne se lie pas du tout à ces plaques ou à d'autres plaques ELISA testées.

Pour cette raison des plaques qui permettent une liaison covalente de peptides dérivatisés (Nunc Cova link#) ont été utilisées pour TM1 et TM2.

La dérivatisation et l'adsorption de ces peptides sur des plaques sont réalisées comme décrit dans
J. SONDERGARD-ANDERSON et al., J. Immunol. Methods, 1990, 131, 99-104.

Ces peptides sont solubilisés dans l'eau (TM1 : 1 mg/ml, TM2 0,5 mg/ml).

A un volume de solution peptidique, un volume égal de solution aqueuse fraîchement préparée de N-hydroxysuccinimide 0,1 M (NHS, Sigma H-7377) et de l-éthyl 3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide, HCl (EDC, Sigma E6383), sont ajoutés.

Après 30 min à température ambiante, les peptides activés sont dilués dans un tampon carbonate 0,1 M glacé (pH 8,9) à 10 zg/ml et 100 Fl/puits sont adsorbés par des plaques CovalinkX pendant une nuit à 4 C.

Le test ELISA est réalisé comme suit
après revêtement des plaques de microtitration, ces dernières sont lavées trois fois avec du PBS, les sites d'adsorption résiduelle sur les plaques sont saturés par incubation avec 100 1 de PBS contenant du lait (1 %) et du Tween 20 (0,1 %) (tampon ELISA EB) pendant 2 heures à température ambiante.

Après lavage, 50 1 de sérum de chèvre, dilués au 1:10, dans un tampon EB, sont incubés pendant 2 heures et demi, à température ambiante.

Après lavage 4 fois avec du tampon EB, de la protéine G conjuguée à de la peroxydase (diluée au 1:5 000 dans du PBS Tween 20 0,1 %) est ajoutée pendant 2 heures à température ambiante.

Après 5 lavages au PBS, le conjugué à la peroxydase adsorbé est visualisé avec de 1'ABTS, 0,2 mg/ml dans de l'acide acétique à 0,6 % pH 4,7 et à une concentration finale p/v de H202 de 0,01 %.

b) Résultats
La densité optique est mesurée à 405 nm sur des essais réalisés en double. Les résultats sont normalisés en utilisant, comme standard, un ensemble de sérums de chèvre, calibré dans un ELISA Gag-GST, réalisé comme décrit dans R.G. ZANONI et al., J. Clin.

Microbiol., 1991, 29, 1290-1294.

On considère qu'il y a une réaction positive, lorsqu'il y a une réactivité supérieure à 25 % du sérum de référence.

190 sérums de chèvres infectées avec le virus de l'arthrite et de l'encéphalite caprine, à un stade clinique bien défini, ont été testés selon cette procédure ELISA pour la réactivité avec les 4 épi topes et avec la protéine Gag.

Comme illustré au Tableau II ci-après, la plupart des sérums réagissent avec le peptide TM3 et avec la protéine Gag.

TABLEAU Il

<tb> <SEP> RÉSUMÉ <SEP> DES <SEP> 190 <SEP> SÉRUMS <SEP> TESTÉS
<tb> <SEP> Peptide <SEP> TM1 <SEP> TM2 <SEP> TM3 <SEP> TM4 <SEP> gag
<tb> sérums <SEP> positifs <SEP> <SEP> 122 <SEP> 136 <SEP> 174 <SEP> 145 <SEP> 175
<tb> % <SEP> de <SEP> sérums <SEP> po- <SEP> 64 <SEP> % <SEP> 72 <SEP> % <SEP> 92 <SEP> % <SEP> 76 <SEP> % <SEP> 93 <SEP> %
<tb> <SEP> sitifs <SEP> * <SEP>
<tb> * <SEP> réactivité <SEP> supérieure <SEP> à <SEP> 25 <SEP> % <SEP> du <SEP> sérum <SEP> de <SEP> référence
<tb>
Les peptides TM4, TM2 et TM1 réagissent avec la majorité des sérums, quoiqu'avec des pourcentages plus faibles que pour TM3.

Quelques sérums, quoique réactifs en western blot avec un culot de virus comme antigènes, sont négatifs en ELISA.

c) Analvse statistique
Les valeurs de densité optique obtenues en
ELISA ont été normalisées et exprimées en tant que pourcentage de réactivité, comparé à un sérum de référence consistant, comme précisé ci-dessus, en un ensemble de sérums séropositifs vis-à-vis du VAEC.

Les réactivités ELISA des sérums d'animaux en bonne santé et d'animaux arthritiques ont été comparées.

Un index de réactivité (IR) est calculé pour chaque sérum testé et correspond à
% de réactivité aux peptides TM
IR = ------------------------------
% de réactivité à la protéine Gag
Ces résultats sont illustrés au Tableau III ci-après
TABLEAU III

Peptide <SEP> GAG <SEP> TM1 <SEP> TM2 <SEP> TM3 <SEP> TM4
<tb> Statut <SEP> clinique <SEP> Sain <SEP> Malade <SEP> Sain <SEP> Malade <SEP> Sain <SEP> Malade <SEP> Sain <SEP> Malade <SEP> Sain <SEP> Malade
<tb> <SEP> % <SEP> de <SEP> réactivité <SEP> 268 <SEP> 249 <SEP> 148 <SEP> 189 <SEP> 73 <SEP> 92 <SEP> 147 <SEP> 205 <SEP> 143 <SEP> 317
<tb> moyenne
<tb> <SEP> % <SEP> de <SEP> réactivité <SEP> 179 <SEP> 154 <SEP> 14 <SEP> 80 <SEP> 22 <SEP> 34 <SEP> 77 <SEP> 160 <SEP> 7 <SEP> 125
<tb> médiane
<tb> Index <SEP> de <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1,57 <SEP> 2,14 <SEP> 0,67 <SEP> 0,86 <SEP> 1,79 <SEP> 2,51 <SEP> 2,6 <SEP> 3,4
<tb> réactivité
<tb>
Les sérums de chèvres arthritiques montrent une réactivité élevée avec TM1, TM3 et plus spécifiquement avec TM4, par rapport aux sérums d'animaux en bonne santé (TM1 - U = 5328,0, p = 0,014 ; TM3 : U = 11468,0, p - 0,002 ; TM4 : U = 5964,5, p < 0,001).

Par contre, il n'existe aucune différence significative entre les deux groupes d'animaux en ce qui concerne la réactivité des sérums vis-à-vis de Gag et de
TM2 (Gag : U = 4106,0, p - 0,391 ; TM2 : U = 4905,5, p -
0,198).

Ces résultats sont illustrés à la figure 4.

La comparaison de la réactivité des sérums de chèvres en bonne santé et arthritiques avec les 4 peptides TM et la protéine Gag a révélé l'existence d'une corrélation entre le développement de l'arthrite virale et la réactivité aux épitopes TM1, TM3 et TM4. Cette corrélation n'a pas été retrouvée pour la réactivité anti-Gag.

La détection de la présence des fragments TM précités (ou des anticorps anti-TM) présente une valeur prédictive, dans le but d'évaluer l'apparition de la maladie clinique et permet de prendre les mesures nécessaires pour une meilleure sauvegarde des troupeaux.

III - Intercrétation des résultats obtenus en
I et en II.

a) Sensibilité des tests
- I1 existe une certaine différence entre les résultats western blot en ce qui concerne le peptide G4 et les résultats ELISA obtenus avec TM4.

- Le western blot se révèle plus sensible pour cet épitope sans doute parce que ce peptide fusionné avec la ss-galactosidase présente une conformation qui n'est pas présente dans le peptide libre ou parce qu'il contient plus qu'un épitope.

- Environ 35 % des animaux ne réagissent pas avec les épitopes TM1 et TM2 dans les deux tests.

b) Intérêt et propriétés des peptides sélectionnés :
Les résultats obtenus ont permis d'identifier les déterminants impliqués dans la corrélation réactivité sérologique-évolution de l'arthrite virale, et permettent donc un meilleur suivi de cette maladie.

De manière intéressante, l'épitope TM3 de la protéine TM de VAEC a la même localisation que l'épitope immunodominant d'autres lentivirus tels que les lentivirus entraînant une immunodéficience : HIV, SIV et FIV.

Cet épitope est localisé dans une région contenant une structure définie par deux cystéines qui est conservée par l'ensemble des lentivirus en dépit de l'absence d'une homologie de la séquence primaire.

Chez HIV-1, SIV et FIV, la séquence comprise entre les cystéines est hautement conservée entre les différents isolats viraux de la même espèce.

Ceci reflète une pression sélective importante de conservation, probablement dictée par des contraintes structurales.

De manière inattendue, il est apparu que la réactivité de TM3 et TM4 vis-à-vis des anticorps produits lors d'une infection par le VAEC, présente une corrélation significativement élevée avec le développement de la maladie.

Si les régions conservées et immunogéniques de ,TM ne mutent pas, en raison de contraintes fonctionnelles, l'apparition continuelle de variants env nouveaux entraîne une stimulation permanente du système immunitaire, qui perpétue et amplifie la production d'anticorps vis-à-vis des épitopes TM constants.

En conséquence, les peptides sélectionnés présentent un intérêt particulier dans le dépistage et l'étude de la réponse humorale à ces épitopes conservés et dans l'étude du suivi et du développement de 1 'arthrite caprine.

EXEMPLE 3 : Test de dépistage d'une infection à VISNA.

Un essai a été réalisé, pour tester la réactivité des peptides TM3 et TM4 avec des sérums de moutons infectés par le virus VISNA. 40 sérums provenant de moutons d'élevage ont été testés avec les peptides conformes à l'invention (méthode "ELISA peptides") ont été comparés avec le test Chekite précité.

Les résultats sont résumés dans le Tableau IV suivant
TABLEAU IV

<tb> nombre <SEP> de <SEP> 10 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 12 <SEP> 1
<tb> <SEP> sérums
<tb> <SEP> Chekit# <SEP> + <SEP> <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> TM3 <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> +
<tb> <SEP> TM4 <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP>
<tb>
I1 apparaît que 1'ELISA TM3 est plus sensible que 1'ELISA TM4. 18 sérums ont été réactifs avec TM3 et avec le test Chekite et 12 sérums sont négatifs avec les trois tests. 10 sérums ont donné des résultats contradictoires entre le test ChekitS et le test TM3 9 sont positifs par le test ChekitX et négatifs avec les peptides, 1 donne des résultats opposés.

6 des sérums positifs avec le test Chekite et négatifs avec TM3 ont pu être contrôlés par immunoblot 5 sur 6 ont été négatifs.

Il apparaît donc qu'un nombre important de faux positifs sont détectés avec le test Chekit# et que 1'ELISA TM3 conforme à l'invention est significativement plus spécifique. Le seul cas de sérum réactif avec TM3 et
TM4 et négatif avec le test Chekits nécessite des outils supplémentaires pour déterminer s'il s'agit d'un vrai ou d'un faux positif.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS

1") Fragments d'acide nucléique, caractérisés en ce qu'ils codent pour un fragment peptidique incluant au moins un segment de protéine Env du VAEC comprenant au moins un épitope immunodominant, sélectionné dans la région transmembranaire de ladite protéine, lesquels fragments d'acide nucléique comprennent entre 15 et 255 nucléotides.

GGCAACCTATGCCATGGTACAGCATGTGGCTAAAGGCGTACGAATCTTGGAAGCTCG AGTGGCTCGAGTGGAAGCTATCACAGATAGAATAATGCTATACCAAG (SEQ n l), et code pour un fragment peptidique dénommé G1.

TAAGGCAGCTGTCCAGACCCTTGCTAATGCAACTGCTGCACAGCAGGATGTGTTAGA

VAEC, de séquence
2 ) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il correspond aux positions 8003-8163 du gène codant pour la protéine Env du

VAEC, et code pour un fragment peptidique dénommé G2.
3 ) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il correspond aux positions 8019-8264 du gène codant pour la protéine Env du

VAEC, et code pour un fragment peptidique dénommé G3.
4 ) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il correspond aux positions 7991-8107 du gène codant pour la protéine Env du

ATGGCAGCAGTGGGAGAGAGGATTACAGGGGTATGATACAAACTTAACAATACTGTT AAAGGAATCAGCAGCAATGACACAACTAGCAGAAGAGCAAGCA (SEQ n'2), et code pour un fragment peptidique dénommé G4.

TACAAAAACAGAAGTAGCAAAATATATCAATTGGACGAGGTTTAAGGATAATTGCAC

VAEC, de séquence
5 ) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il correspond aux positions 8204-8360 du gène codant pour la protéine Env du

G5.

TACAAAAACAGAAGTAGCAAAATATATCAATTGGACGAGGTTTAAGGATAATTGCA (SEQ n'3), et code pour un fragment peptidique dénommé

AATAATGC TATACCAAGAATTGGATTGTTGGCACTATCATCAATACTGTATAACCTC

VAEC, de séquence TAAAGGCGTACGAATC TTGGAAGC TCGAGTGGC TCGAGTGGAAGCTATCACAGATAG
6 ) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il correspond aux positions 8090-8259 du gène codant pour la protéine Env du

ATGTGGCTAAA (SEQ n 4), et code pour un fragment peptidique dénommé TM1.

VAEC, de séquence GATGTGTTAGAGGCAACCTATGCCATGGTACAGC
7 ) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il correspond aux positions 8049-8093 du gène codant pour la protéine Env du

TM2 .

VAEC, de séquence GAAGCTATCACAGATAGAATAATGCTATACCAAGAA (SEQ n'5) et code pour un fragment peptidique dénommé
8 ) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il correspond aux positions 8130-8165 du gène codant pour la protéine Env du

GTATAACCTCT (SEQ n 6) et code pour un fragment peptidique dénommé TM3.

VAEC, de séquence CAAGAATTGGATTGTTGGCACTATCATCAATACT
9 ) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il correspond aux positions 8160-8204 du gène codant pour la protéine Env du

GGTATGAT (SEQ n"7) et code pour un fragment peptidique dénommé TM4.
10-) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il correspond aux positions 8256-8297 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence TGCACATGGCAGCAGTGGGAGAGAGGATTACAGG

(3) en ce qu'il est reconnu par au moins 60 % d'anticorps produits lors d'une infection et/ou lors d'une inoculation par une souche du VAEC.

(2) en ce qu'il comprend entre 5 et 85 aminoacides et au moins un épitope immunodominant, et

(1) en ce qu'il inclut au moins un segment de protéine Env du VAEC, sélectionné dans la région transmembranaire de ladite protéine,
11 ) Fragment peptidique, caractérisé
12-) Fragment peptidique selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 53 aminoacides, qui correspond aux positions 665-717 de la protéine Env du VAEC, lequel fragment est dénommé G1.
13-) Fragment peptidique selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 82 aminoacides, dénommé G2, qui correspond aux positions 670-751 de ladite protéine Env.
14-) Fragment peptidique selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 38 aminoacides, dénommé G3, qui correspond aux positions 661-698 de ladite protéine Env.
15-) Fragment peptidique selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 52 aminoacides, dénommé G4, qui correspond aux positions 732-783 de la protéine Env.
16-) Fragment peptidique selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 56 aminoacides, dénommé G5, qui correspond aux positions 694-749 de ladite protéine Env.

Lys (SEQ n8).

Asp-Val-Leu-Glu-Ala-Thr-Tyr-Ala-Met-Val-Gln-His-Val-Ala-
17-) Fragment peptidique selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 15 aminoacides, dénommé TM1, qui correspond aux positions 680-694 de la séquence de la protéine Env du VAEC et dont la formule est

Glu-Ala-Ile-Thr-Asp-Arg-Ile-Met-Leu-Tyr-Gln-Glu (SEQ n'9).
18-) Fragment peptidique selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 12 aminoacides, dénommé TM2, qui correspond aux positions 707-718 de la séquence de la protéine Env du VAEC et dont la formule est
19 ) Fragment peptidique selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 15 aminoacides, dénommé TM3, qui correspond aux positions 717-731 de ladite protéine Env, lequel segment présente la séquence X3-Glu-Leu-Asp-Cys-Trp-His-Tyr-Xl-X2-Tyr-Cys-X4-Thr-Ser (SEQ nul0), dans laquelle X1, X2 et X3 représentent His ou Gln, X4 représente Ile ou Val ; de préférence, lorsque X1 représente His, X2 et X3 représentent Gln et X4 représente Ile et lorsque X1 représente Gln, X2 et X3 représentent His et X4 représente Val.
20') Fragment peptidique selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 14 aminoacides, dénommé TM4, qui correspond aux positions 749-762 de ladite protéine Env, lequel segment présente la séquence Cys-Thr-Trp-Gln-Gln-Trp-Glu-Arg-Glu-Leu-Gln-Gly-Tyr-Asp (SEQ n'll).

VAEC, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment selon l'une quelconque des revendications 1 à 20.
21-) Réactif de dépistage d'une infection à
22 ) Anticorps anti-VAEC, caractérisés en ce qu ils sont constitués par des anticorps spécifiques d'au moins un fragment peptidique issu de la zone transmembranaire de la protéine Env de VAEC selon l'une quelconque des revendications 11 à 20.

VAEC et/ou à VISNA, caractérisé en ce qu'il consiste à détecter les anticorps anti-virus, éventuellement présents dans un échantillon biologique, à l'aide d'au moins un peptide ou fragment de peptide selon l'une quelconque des revendications 11 à 20, éventuellement fixé sur un support solide approprié, en mettant en présence ledit échantillon biologique avec ledit/lesdits peptide(s) ou fragment(s) de peptides, auxquels se lient lesdits anticorps, si de tels anticorps sont présents dans l'échantillon à analyser, la lecture du résultat étant révélée par un moyen approprié, notamment EIA, RIA, fluorescence.
23 ) Procédé de dépistage d'une infection à
24 ) Procédé de dépistage selon la revendication 23, caractérisé en ce que le peptide est choisi parmi TM3 et TM4, ou un mélange de ceux-ci.

(2) après quoi, l'hybride formé est détecté.

(1) est mis en contact avec au moins un fragment nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10,

VAEC, caractérisé en ce qu ' un échantillon biologique convenablement traité pour extraire 1'ADN et/ou les produits de transcription du VAEC
25 ) Procédé de dépistage d'une infection à

VAEC selon la revendication 25, caractérisé en ce que, préalablement à l'étape (1), ledit ADN peut être amplifié.
26 ) Procédé de dépistage d'une infection à

VAEC, caractérisé en ce qu'il consiste à détecter les glycoprotéines d'enveloppe du VAEC, en mettant en présence un échantillon biologique à tester avec au moins un anticorps anti-peptide selon la revendication 22, la lecture du résultat étant révélée par un moyen approprié.
27 ) Procédé de dépistage d'une infection à