EP1280914A1 - Polypeptide du ttv, acide nucleique codant pour ce polypeptide et utilisations - Google Patents

Polypeptide du ttv, acide nucleique codant pour ce polypeptide et utilisations

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EP1280914A1
EP1280914A1 EP01929769A EP01929769A EP1280914A1 EP 1280914 A1 EP1280914 A1 EP 1280914A1 EP 01929769 A EP01929769 A EP 01929769A EP 01929769 A EP01929769 A EP 01929769A EP 1280914 A1 EP1280914 A1 EP 1280914A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
polypeptide
amino acid
sequence
amino acids
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01929769A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Catherine Ott
Florence Komurian-Pradel
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Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA filed Critical Biomerieux SA
Publication of EP1280914A1 publication Critical patent/EP1280914A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/00022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • TTN TT virus
  • TTN was isolated from the serum of a Japanese transfused patient who presented with hepatitis of unknown etiology (non-A to E). It has also been shown to be associated with high levels of transaminases in transfusion patients, as well as in patients with non-A to G hepatitis in the acute and chronic phase of the disease ( ⁇ ishizawa et al., (1997), Okamoto et al. (1998a)).
  • TTN virus genomic AD ⁇ was cloned from the plasma of a blood donor who had a high level of transaminases but who did not have a serological marker for known hepatitis viruses (Okamoto et al (1998a Its genome, of negative polarity, consists of a sequence of 3852 nucleotides and comprises two open reading frames, ORF1 and ORF2, which code respectively for a putative mantle or capsid protein and a putative protein, of 770 and 202 respectively. amino acids TTN has a density of 1.26 g / cm 3 in sucrose, a density which does not change after treatment with Tween 80. The viral genome is sensitive to treatment with AD ⁇ ase I and Mung Bean nuclease .
  • TTV is found in the liver of patients with higher titers of 10 to
  • TTN was probably not the main causative agent of acute sporadic hepatitis of unknown origin.
  • the present inventors have now surprisingly demonstrated that the 3 'terminal region of the TTN ORF1, which begins at amino acid 15 and ends at amino acid 263 of the sequence identified in SEQ ID ⁇ O 1 , was a highly conserved region, antigenic and shown to be usable for detecting the presence of the TTV virus in a biological sample, in particular in sera, with a prevalence rate approaching 100%, regardless of the origin of the virus. 'sample, namely in blood donors, in patients with hepatitis, in adults or children and even in animals. These data are very interesting and surprising given the very high protein variability recognized to date by many authors.
  • the present inventors have also selected, on the basis of a hydrophilicity analysis and a prediction of antigenicity of the 3 'terminal region of the TTN ORF1, the sequences which are potentially the most interesting in terms of antigenicity and immunogenicity, in particular the sequence which begins at amino acid 41 and ends at amino acid 263 of SEQ ID ⁇ O: 1 and preferably the sequence which begins at amino acid 99 and ends at l amino acid 263 of SEQ ID ⁇ O: 1.
  • polypeptide a sequence which corresponds to a chain of amino acids and this definition includes recombinant proteins and synthetic polypeptides or their fragments which are obtained by methods well known to those skilled in the art.
  • polypeptide whose peptide sequence has at least 95%, preferably at least 98% and advantageously at least 99% of homology or identity with the sequence defined in (a), is meant a polypeptide which meets the definition given above and which has at least the same antigenicity and / or immunogenicity as the reference polypeptide (a).
  • the invention also relates to: - (a) a DNA molecule which comprises a nucleotide sequence which codes for a polypeptide whose peptide sequence begins at amino acid 15 and ends at amino acid 263 of the sequence identified in SEQ ID NO 1, or
  • a DNA molecule which comprises a nucleotide sequence which codes for a polypeptide whose peptide sequence has at least 95%, preferably at least 98% and advantageously at least 99% of homology or identity with the sequence defined in (a), or - (c) a DNA molecule which comprises a nucleotide sequence which codes for a polypeptide whose peptide sequence begins at amino acid 41 and ends at amino acid 263 of SEQ JD NO: 1 or whose peptide sequence begins at amino acid 99 and ends at amino acid 263 of SEQ JD NO: 1, or - (d) a DNA molecule which comprises a nucleotide sequence which codes for a fragment of the peptide sequence defined in ( c) and which comprises at least 4 amino acids, preferably at least 5 or 6 amino acids and advantageously at least 7 amino acids, in particular from 6 to 15 amino acids and advantageously from 6 to 12, from 6 to 10 or from 8 to 12 amino acids, - (e) the sequences complementary to said sequences (
  • RNA molecule which is the transcription product of said DNA sequences defined in (a) to (e).
  • the inventors have, inter alia, obtained a recombinant protein which corresponds to the 3 'region of the ORF1 reading frame, as defined above and whose amino acid sequence begins at amino acid 15 and ends with acid amino acid 263 of SEQ ID NO 1.
  • amino acids 1 to 14 correspond to amino acids of the plasmid used for the construction and expression of said recombinant protein and amino acids 264 to 280 correspond to amino acids of said plasmid and the addition of a polyhistidine tail (tagHis).
  • the nucleotide sequence coding for SEQ JD NO 1 is represented in SEQ ID NO 2.
  • the coding sequence was generated from a nucleotide sequence coding for ORF1 obtained in a patient infected with TTN and amplified using primers specific for the 3 ′ or carboxy-terminal region of interest.
  • the fragment obtained was cloned and subcloned into a vector suitable for the expression of the polypeptide of interest in an appropriate host cell under the control of an appropriate promoter. It is thus possible to use a functional expression cassette in a cell originating from a lower prokaryotic or eukaryotic organism allowing the expression of the gene of interest coding for the polypeptide of the invention or for a fragment of said said polypeptide, as defined above.
  • the cell is an Escherichia coli cell, but it is within the capacity of a person skilled in the art to define other appropriate expression systems, in particular in cells originating from higher eukaryotic organisms, such as CHO, COS or HeLa cells or in other cell types infected with Se Liki Forest virus recombinant with the gene of interest.
  • the invention is therefore not limited to a particular expression system.
  • the present invention also encompasses a functional expression cassette in a cell derived from a prokaryotic or lower eukaryotic organism allowing the expression of a DNA sequence or a DNA fragment as defined above, placed under the control of the elements necessary for its expression; the vector comprising the expression cassette and the cell derived from the lower prokaryotic or eukaryotic organism, in particular Escherichia coli, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae, and the protein thus produced by the expression cassette, the vector or the cell.
  • It also relates to a process for preparing a polypeptide of the invention which consists in cultivating a host cell above, in an appropriate culture medium, said host cell being transformed with an expression vector which contains a DNA nucleotide sequence. as defined above and, purifying said polypeptide produced to a required degree of purity.
  • the invention also relates to a diagnostic composition for detecting antibodies in a biological sample, of human or animal origin, in particular in serum, plasma, liver, faeces, said composition comprising, inter alia, a polypeptide as defined above and a method for detecting and / or quantifying said antibodies directed against at least said polypeptide of the invention in a biological sample, according to which the biological sample is brought into contact with the diagnostic composition under predetermined conditions which allow the formation of antibody / antigen complexes and the formation of said complexes is detected.
  • Another subject of the invention is an immunogenic polypeptide which has a peptide sequence as defined above or which consists of a recombinant protein obtained according to the above-mentioned protocol and its use for the production of monoclonal or polyclonal antibodies by immunization of an animal mammal, preferably a mouse, rat or rabbit, with said immunogenic peptide.
  • the production of polyclonal and monoclonal antibodies is part of the general knowledge of those skilled in the art.
  • K ⁇ hler G. and Milstein C. (1975) can be cited: Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature 256 A95-491 and Galfre G. et al.
  • Antibodies can also be produced by immunizing mice or rabbits with the viral particles of TTN.
  • the immunogen can be coupled to Lymphet Keyhole hemocyanin (peptide KLH) as a support for immunization or to serum albumin (peptide SA).
  • the animals are subjected to an injection of immunogen using complete Freund's adjuvant or any other adjuvant.
  • the sera and hybridoma culture supernatants from immunized animals are analyzed for their specificity and selectivity using standard techniques, such as for example ELISA or Western Blot tests.
  • the hybridomas producing the most specific and sensitive antibodies are selected.
  • Monoclonal antibodies can also be produced in vitro by cell culture of the hybridomas produced or by recovery of ascites fluid, after intraperitoneal injection of the hybridomas in mice. Whatever the mode of production, by supernatant or ascites, the antibodies are then purified.
  • the purification methods used are essentially filtration on an ion exchange gel and exclusion chromatography or affinity chromatography (protein A or G). A sufficient number of antibodies is screened in functional tests to identify the best performing antibodies.
  • antibody fragment is meant the fragments F (ab) 2, Fab, Fab ', sFv (Blazar et al., 1997, Journal of Immunology 159 • 5821-5833 and Bird et al., 1988, Science 242 : 423-426) of a native antibody and by derivative means, inter alia, a chimeric derivative of a native antibody (see for example Arakawa et al., 1996, J. Biochem 120: 657-662 and Chaudray et al ., 1989, Nature 339: 394-397).
  • the monoclonal antibody or the polyclonal serum thus obtained is incorporated in a diagnostic composition which is used in a method, sandwich or by competition, to detect and / or quantify at least one polypeptide of the invention, or viral particles containing said polypeptide of the invention in a biological sample (biological fluid such as blood, serum, plasma, urine, bile, saliva, breast milk; tissue such as liver and feces), according to which the biological sample is brought into contact with said diagnostic composition under predetermined conditions which allow the formation of antibody / antigen complexes and the formation of said complexes is detected.
  • a biological sample biological fluid such as blood, serum, plasma, urine, bile, saliva, breast milk; tissue such as liver and feces
  • the monoclonal antibodies obtained are specific for the protein sought or for its fragments as defined above.
  • the invention therefore also relates to said composition and said detection and / or quantification method.
  • the invention also relates to ligands capable of associating with a nucleotide sequence of DNA or RNA or with a nucleotide fragment of the TTN virus as defined above.
  • ligand is meant any molecule capable of associating with a nucleotide sequence of DNA or RNA or with a nucleotide fragment, such as a partially or completely complementary nucleotide fragment, a complementary polynucleotide, an anti- nucleic acid.
  • the production of nucleotide fragments or polynucleotides is part of the general knowledge of a person skilled in the art. Mention may in particular be made of the use of restriction enzymes, and chemical synthesis on an automatic synthesizer.
  • probes and primers capable of hybridizing under stringency conditions determined to a nucleotide sequence of DNA or RNA or to a nucleotide fragment as defined above are part of this definition. He is at the scope of those skilled in the art to define the appropriate stringency conditions.
  • nucleotide fragment is meant either fragments associated with the same molecular unit, or fragments in a molecular complex comprising several homologous or heterologous subunits obtained naturally or artificially , in particular by differential multi-splicing or
  • a diagnostic composition which comprises at least one probe or a primer or an anti-nucleic acid antibody.
  • the primers, probes and anti-nucleic acid antibodies of the invention are also used in a diagnostic process for DNA and / or viral RNA, according to which a sample of human or animal origin (serum, plasma) is taken. , liver tissue extract, faecal extracts, saliva) patient, treat said sample if necessary to extract DNA and / or RNA, put said sample in contact with at least one probe or anti primer or antibody -nucleic acid as defined above, under determined stringency conditions when the ligand is a probe or a primer and the presence of DNA and / or viral RNA in the sample is detected either by demonstrating hybridization of said DNA and / or viral RNA with at least one probe, or by amplification of said DNA and / or RNA, or under determined incubation conditions when the ligand is anti-nucleic acid antibody and the complex thus detected is detected.
  • a sample of human or animal origin serum, plasma
  • treat said sample if necessary to
  • the antibody may itself be labeled with any marker suitable for revealing the complex formed or else the formation of the complex may be revealed by addition to the incubation medium. of a labeled anti-antibody nucleic acid antibody.
  • probes When probes are used, the hybridization complex can be demonstrated directly by using a probe which is complementary or substantially complementary to the sequence of the target, said probe being marked with any appropriate marker or by work of the so-called “sandwich” technique in one or two stages which consists in using a capture probe complementary or substantially complementary to a part of the target sequence and a so-called labeled detection probe complementary or substantially complementary to another part of the target sequence. In the case of the use of primers, these can be directly marked for the detection of an amplification product.
  • the first category involves physical techniques such as micro-injection, electroporation or bombardment of particles.
  • the second category is based on the use of techniques in molecular and cellular biology with which the gene is transferred with a biological or synthetic vector which facilitates the introduction of the material into the cell in vivo.
  • the most used vectors are the adenoviral and retroviral vectors. Viruses have natural properties for crossing plasma membranes, preventing the degradation of their genetic material and introducing their genome into the nucleus of the cell.
  • viruses have been widely studied and some are already used experimentally in human applications in vaccination, immunotherapy, or to compensate for genetic deficiencies.
  • the use of certain adenoviral vectors in gene therapy has drawbacks and may even have harmful effects on public health, as noted recently.
  • viral DNA or protein identified by the present invention overcomes these potential risks.
  • the inventors have shown that the virus of the invention is ubiquitous, which suggests a mechanism of tolerance of the host and therefore makes it possible to envisage at lower risk the use of said polypeptide or recombinant DNA coding for said polypeptide as a vector in therapy, either for introducing ex vivo, in vivo or in vitro into cells a gene of therapeutic interest or a protein of therapeutic interest, or for introducing ex vivo, in vivo or in vitro pharmaceutically active substances.
  • Target cells can thus be transformed by techniques known to those skilled in the art, such as transfection, transduction or transformation and then be introduced into a patient to exercise their properties.
  • the invention therefore also relates to the use of recombinant DNA or of a recombinant TTN polypeptide, corresponding to the preceding definitions, as a therapy vector, said recombinant DNA being placed under the dependence of an autologous or heterologous promoter, preferably a strong promoter.
  • autologous promoter is meant a promoter (UTR) of the TTN virus
  • heterologous promoter is meant any promoter which is not a promoter of TTN, of viral, retroviral or cellular origin, optionally modified, provided that it is functional .
  • UTR promoter
  • heterologous promoter any promoter which is not a promoter of TTN, of viral, retroviral or cellular origin, optionally modified, provided that it is functional .
  • the vector used must be capable of being targeted itself.
  • Another object of the invention is thus a therapeutic composition comprising, inter alia, such a vector.
  • the present invention also relates to a biological material for the preparation of pharmaceutical compositions, the composition comprising at least one cell, in particular a cell which does not naturally produce specific proteins, such as antibodies, in a form allowing its administration in a mammalian organism, human or animal, as well as possibly its prior culture, said cell being genetically modified in vitro by at least one nucleic acid sequence containing at least one gene of therapeutic interest coding in vivo for at least one protein or a fragment of a protein of interest or for at least one molecule that inhibits the function and / or the fixation and / or the expression of at least one protein or of a fragment of protein of interest or for at least one antibody or part of an antibody capable of binding to at least one protein of interest.
  • said target cell comes either from the individual to be treated, or from another mammal. In the latter case, it should be noted that said target cell will have undergone a treatment making it compatible with humans.
  • These cells are established in cell lines and are preferably CMHII + or CMHJI + inducible such as lymphocytes, monocytes, astrocytes, oligodendrocytes.
  • the invention also relates to the modified cells and a method for preparing a cell as described above, characterized in that one introduces into a mammalian cell which does not naturally produce proteins identified, by any or any suitable means, at least one nucleic acid sequence containing at least one gene of therapeutic interest and elements ensuring the expression of said gene in said cell, said gene of therapeutic interest containing a nucleic acid sequence coding for a molecule or a fragment of molecule in vivo, as described above. More particularly, it relates to eukaryotic cells transfected with at least one nucleotide sequence and / or a vector as described above. It also relates to a therapeutic composition comprising, inter alia, such a cell.
  • FIG. 1 represents the complete and reconstructed nucleotide and protein sequences of the ORF1 of the X94-TTV clone of the invention.
  • FIG. 2 represents the construction of a phylogenic tree and shows that the sequence of X94-TTN is of genotype 1 and belongs to the subtype la.
  • FIG. 3 represents the hydrophilicity profile of the C-terminal protein
  • FIG. 4 represents the antigenicity profile of the C-terminal protein ORF1-X94 from TTN obtained by protuberance indexing.
  • FIG. 5 corresponds to the detection of anti-TTV antibodies in human sera by Western Blot, as described in Example 4.
  • Lanes 1 and 2 correspond to the results obtained in the presence of positive sera from children;
  • lanes 3 to 6 correspond to the results obtained in the presence of positive sera from adults;
  • the lane 7 corresponds to the results obtained with a negative adult serum;
  • lane 8 corresponds to the results obtained with an anti-human control IgA + IgG + IgM goat conjugated to alkaline phosphatase;
  • lanes 9 and 10 corresponding to positive controls obtained respectively with an anti-histidine monoclonal antibody and an alkaline phosphatase conjugate coupled to the group N12 + -NT A;
  • lane 11 is a negative specificity control obtained from a purified extract of E. coli incubated with positive anti-TTN human serum.
  • FIG. 6 corresponds to the results of the immunoreactivity of the protein corresponding to the C-terminal end of the ORF1 with respect to a viremic serum.
  • the amount of recombinant protein of the invention and of purified E. coli protein extract respectively adsorbed at the bottom of the plate is represented on the abscissa (25, 50, 100 and 250 ng of antigen per well).
  • the OD values at 492 nm are shown on the ordinate.
  • the histograms represented in light gray correspond to the results obtained with the C-terminal ORFl of the invention and the histograms represented in dark gray correspond to the results obtained with the protein extract E. coli purified under conditions identical to the protein of interest.
  • FIG. 7 corresponds to the results of the serological evaluation of the C-terminal protein of ORF1 by indirect ELISA test and of protein extract E. coli purified with respect to different human sera.
  • the OD values at 492 nm are shown on the ordinate.
  • the histograms shown in light gray correspond to the results obtained with the C-terminal protein of the ORF1 of the invention and the histograms represented in dark gray correspond to the results obtained with the purified wild type E. coli protein extract.
  • FIG. 8 shows the detection of TTN DNA by PCR amplification.
  • M stands for Molecular Weight Marker (D ⁇ A Ladder lOOpb, Gibco BRL).
  • Lane 1 is a negative PCR control;
  • lanes 2 to 4 represent the results obtained with positive sera from the Blood Transfusion Center (CTS);
  • lane 5 represents the results obtained with a CTS negative serum;
  • lanes 6 to 8 represent the results obtained from positive sera from patients with hepatitis of unknown etiology;
  • lane 9 corresponds to a negative serum and lane 10 corresponds to a positive child serum.
  • FIG. 9 represents the prevalence of TTN viremia obtained in the sera tested. The ordinate shows the percentage of positive sera.
  • Example 1 Obtaining the nucleotide sequence of the ORF1 reading frame
  • the nucleotide sequence that codes for the ORF1 reading frame was obtained from a 30-year-old male transplant patient (X94) who had elevated alanine aminotransferase levels, with no detectable viremia for the virus.
  • hepatitis B HBN or HBV
  • HCV hepatitis C virus
  • the negativity of his serum for HBV HCV was confirmed by PCR (Polymerase Chain Reaction) and hybridization by Southern blot. It was shown that he was infected with the TTV virus by demonstrating the AD ⁇ of the virus by nested PCR carried out on the basis of the method described by Simmonds et al. (1998).
  • the total nucleic acids were extracted from 140 ⁇ l of the patient's serum using the QI ⁇ amp Viral RNA Mini Kit (commercial name) kit, sold by the company QIAGEN, according to the protocol established according to the seller's instructions and subject to PCR amplification for the region coding for the TTV ORF1.
  • a first clone (7-94X) comprising the amino-terminal sequence of the TTV ORF1, extending from nucleotide 582 to 2192 relative to the reference sequence of the TA278 isolate (DDBJ, EMBL, GenBank, number d 'access AB008394), was obtained by nested PCR using oligonucleotides deduced from regions well conserved in TTV isolates of different genotypes and subtypes available in the GenBank database.
  • External antisense primer 5427 and internal antisense primer 5432 described by Simmonds et al. (1998).
  • Specific primers were defined at the carboxy-terminal end (COI 5+ and CO 16+) of this sequence and were used to generate a second fragment extending from nucleotides 2062 to 2857 relative to the isolate TA278, by semi-nested PCR, which presented an overlapping region of 92 nucleotides with the sequence of the clone 7-94X and which covered the carboxy-terminal region of the TTV ORF1. This fragment was cloned and named 11-94X.
  • External sense primer SEQ ID NO: 5 5 'T AC AC ATGAATGCC AGACT AC 3'
  • Anti-sense primer COI 2 -
  • SEQ J-D NO: 7 5 'GTAACAAGGTAGGGTTGATATC 3' (position 2836-2857 on isolate TA278).
  • the first amplification was carried out using the Expand TM High Fidelity PCR System kit (sold by the company Roche Diagnostics) on all of the nucleic acids extracted as follows: 94 ° C. for 10 min. ; 35 cycles of 94 ° C for 1 min., 50 ° C for 1 min., 68 ° C for 2 min. ; final extension at 68 ° C for 7 min.
  • the second round was carried out under the same conditions from 10 ⁇ l of amplification products from the first round.
  • the PCR products were analyzed on 0.8% agarose gels and detected by exposure to ultraviolet light after staining with ethidium bromide.
  • the amplified fragments of the N- and C-terminal parts of the ORF1 were cloned separately in the plasmid pCR2.1-TOPO using the TOPO TM TA Cloning Kit, sold by the company Invitrogen. These two fragments were sequenced in both directions using the Prism Ready Reaction Kit Dye Deoxyterminator Cycle Sequencing Kit (commercial name), sold by the company Applied Biosystems, using the automated DNA sequencers 377 and 373A of the Applied Biosystems company, using the usual oligonucleotides.
  • Example 2 Characterization of the ORF1 protein.
  • the present inventors have selected the fragments of SEQ ID NO: 1 which are potentially the most interesting in terms of antigenicity and immunogenicity. It is the fragment whose sequence begins at amino acid 41 and ends at amino acid 263 of SEQ ID NO: 1 and preferably the fragment whose sequence begins at amino acid 99 and ends at l amino acid 263 of SEQ ID NO: 1. These two regions are also part of the invention.
  • a phylogenetic tree was constructed by the method described by Saitou et al. (1987), after alignment of the X94-TTV ORF1 protein with 26 complete sequences available in the TTV ORF1 databases. Three major branches were observed with significant 100% bootstrap supports which corresponded to genotypes 1, 2 and 3 (Mushahwar et al., 1999 and Erker et al., 1999). Similar results were observed after construction of a phylogenic tree on the basis of the nucleotide sequences. The genetic relationship of the X94-TTV sequence was determined to be the closest to genotype 1 sequences and it was inferred that it belonged to the subtype la.
  • Example 4 Expression and purification of the recombinant protein of the C-terminal part of ORFl.
  • the positive clone 11-94X corresponding to the C-terminal region of ORF1 was re-amplified using the oligonucleotides below for the restriction sites BamHI and S ⁇ cl at the 5 'and 3' ends, respectively.
  • the BamHI-SacI digested PCR product was linked in the BamHI and SacI sites of the expression vector pET21b (Novagen) upstream of a polyhistidine tail.
  • the transformation of the ligation mixture was carried out in the JM109 Escherichia coli strain and the recombinant DNA of the selected clones was extracted using the QlAfilter Plasmid Midi Kit (commercial name) kit, sold by the company QIAGEN.
  • the expression of the recombinant proteins was then carried out in the strain BL21 to 'Escherichia coli.
  • the overexpressed recombinant protein is recovered from the insoluble fraction of the cell lysate, suggests protein aggregation in insoluble inclusion bodies or co-precipitation with insoluble bacterial cell debris.
  • the inclusion bodies were treated with 1.5% sarcosyl in STE buffer (10 mmol / 1 Tris, pH 8, 100 mmol / 1 EDTA, pH 8) to obtain the C-terminal part of the ORFl in the soluble fraction.
  • the recombinant protein was solubilized with 8M urea in 0.1M Na HPO4, 0.11 Tris- HC1, 0.05% Tween 20, pH 8. This latter condition made it possible to purify the protein on beads.
  • Ni-NTA Magnetic Agarose Agarose Beads (QIAGEN) under denaturing conditions.
  • the histidine residues of the recombinant protein bind effectively on an affinity column with a chelating agent Ni2 + , under denaturing conditions.
  • the tag-His protein was then eluted from the beads by reducing the pH to 4.5.
  • the eluted protein was analyzed by Coomassie Brilliant Blue staining after electrophoresis on SDS PAGE 10% gel, under denaturing conditions (Lae mli (1970)). The purity of the eluted fraction was greater than 95%.
  • a Western blot analysis of the purified protein with an anti-histidine antibody confirmed the predicted molecular mass of the C-terminal end of ORF1, by detection of a signal. positive around 32 kDa.
  • Example 5 Detection of anti-TTV antibodies in human sera.
  • the immunoreactivity of the C-terminal part of the ORF1 of the protein against human sera was tested by Western blot. After migration on a 10% SDS PAGE preparative gel, the recombinant protein purified or solubilized in sarcozyl was transferred by electrophoresis to fluoride membranes. polyvinylidiene from Millipore, according to the method of Towbin et al. (1979). The blots were blocked 30 min. at room temperature with the 5% non-fat milk powder in a solution buffered with Tris (TBS.
  • TBS-T Tris 20 mmol / 1, pH 7.5, NaCl 500 mmol / 1) before incubation overnight at 4 ° C with human sera diluted 1: 100 in TBS containing Tween 20 (0.5 ml / 1) (TBS-T). 70 sera including 30 voluntary blood donors, 30 patients with hepatitis non A to G and 10 healthy children aged 2 to 5 years were tested. The membranes were washed three times with TBS-T and incubated at room temperature for 1 hour with anti-human IgA + IgG + IgM antibodies from goats conjugated with alkaline phosphatase or with anti-human mouse IgM monoclonal antibodies conjugated with alkaline phosphatase at a 1: 2000 dilution in TBS-T.
  • blots were revealed using either a Ni + -NTA-alkaline phosphatase conjugate with a one-step procedure (QIAGEN), or with an anti-penta-histidine monoclonal antibody with a two-step procedure (QIAGEN) , using the manufacturer's protocols.
  • Example 6 Immunoreactivity of the C-terminal ORF1 protein in ELISA.
  • the reactivity of the C-terminal ORF1 protein was validated by an indirect ELISA test using a serum from a blood donor tested positive for the presence of anti-TTV antibodies by the Western blot technique.
  • the recombinant protein was adsorbed at the bottom of the plate, at the rate of 25, 50, 100 and 250 ng of antigen per well.
  • the specificity of the test was checked by adsorption of a purified E.coli protein extract, prepared under the same conditions as the recombinant protein and constituting a negative control for the experiment.
  • results presented in FIG. 6 demonstrate the reactivity of the C-terminal ORF1 protein with respect to anti-TTV antibodies present in the serum tested.
  • a dose effect is observed with an increase in immunoreactivity as a function of the increasing amount of antigen fixed on the support.
  • the reactivity observed with the negative control E. coli remains weak and constant and confirms the specificity of the signal observed.
  • the test threshold value was calculated from the set absorbance values obtained for the E.coli negative controls (mean value + 2 standard deviations).
  • the positive serum previously validated by ELISA (CTS356) was included in the study as a positive experience control.
  • a monoclonal anti-histidine antibody was also tested in order to validate the ELISA test.
  • TTV viremia was demonstrated by amplification of the DNA of the virus circulating in the serum.
  • the search for viral DNA was carried out by PCR using primers, located in highly conserved non-coding regions of the genome, which allowed the detection of TTV sequences at a high rate of 92% in human sera.
  • DNA amplification was developed from 9 human sera, representative of the three groups of individuals tested in the context of the immune response such as blood donors, patients with hepatitis of unknown etiology and children.
  • a human serum tested positive for the presence of TTV DNA by PCR and confirmed positive after Southern blot analysis, was included in the experiment as a reference positive control.
  • the analysis of the amplification products on 1.5% agarose gel is highlighted in FIG. 8. A positive signal is detected at the expected theoretical size of 199 base pairs and reveals the presence of TTV DNA in 7 out of 9 samples tested.
  • Example 8 Prevalence of Viremia
  • the study was supplemented by a systematic determination of the viraemia in the samples of sera initially tested for the anti-TTV antibody response.
  • the study involved 67 samples, 3 sera from children who could not be tested due to an insufficient volume of serum for the extraction of nucleic acids.
  • the results of the PCR analysis are shown in Figure 9.
  • Virus DNA is detected in 73.3% of blood donors, 83.3% of patients with hepatitis of unknown etiology and 57.1% of children. The average detectable viremia in the human sera tested is therefore 76.1%. An absence of DNA amplification is observed in 16 of the 67 samples tested despite a positive anti-TTV IgG + IgM + IgA response for these 16 sera. The only serum detected negative for the antibody response of the IgG type but also IgM, presents a positive signal for the presence of viral DNA.
  • Example 9 Detection of anti-TTV antibodies in animals.
  • anti-TTV antibodies Due to the very high immune prevalence in humans, and because TTV virus sequences have been detected in sera from domestic animals, anti-TTV antibodies have been tested in sera from dogs, cats , goat, sheep and rabbit. A serum sample from each of these five animal species was tested. The incubation and the treatment of the membranes were carried out under the same conditions as those described in Example 5, with the use of anti-IgG for each species conjugated with alkaline phosphatase. Anti-TTV antibodies were thus detected by Western blot in all the samples of animal sera tested, with a strong signal intensity, such as that observed from human sera.
  • TT virus is not associated with acute sporadic hepatitis. Infection 27, 125-127.
  • TTV novel DNA virus
  • TTV TT virus
  • TTV TT virus

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Abstract

L'invention concerne un polypeptide isolé choisi parmi : (a) un polypeptide dont la séquence peptidique commence à l'acide aminé 15 et se termine à l'acide aminé 263 de la séquence identifiée en SEQ ID NO 1, ou (b) un polypeptide dont la séquence peptidique présente au moins 95%, de préférence au moins 98% et avantageusement au moins 99 % d'homologie ou d'identité avec la séquence définie en (a), ou (c) un polypeptide dont la séquence peptidique commence à l'acide aminé 41 et se termine à l'acide aminé 263 de la séquence identifiée en SEQ ID NO : 1 ou dont la séquence peptidique commence à l'acide aminé 99 et se termine à l'acide aminé 263 de la séquence identifiée en SEQ ID NO : 1, ou (d) un fragment de ladite séquence peptidique définie en (c) qui comprend au moins 4 acides aminés, de préférence au moins 5 ou 6 acides aminés et avantageusement d'au moins 7 acides aminés, en particulier de 6 à 15 acides aminés et avantageusement de 6 à 12, de 6 à 10 ou de 8 à 12 acides aminés. Elle concerne aussi une molécule d'ADN ou d'ARN codant pour ce polypeptide et leurs utilisations.

Description

POLYPEPTIDE DU TTN, ACIDE NUCLEIQUE CODANT POUR CE
POLYPEPTIDE ET UTILISATIONS
Récemment, un virus à ADN linéaire, simple brin, circulaire, non enveloppé, appelé virus TT (TTN) a été identifié. TTN appartient à la famille des Circoviridae.
A l'origine, TTN a été isolé à partir du sérum d'un patient japonais transfusé, qui présentait une hépatite d'étiologie non connue (non-A à E). Il a par ailleurs été montré qu'il était associé à des taux de transaminases élevés chez des patients ayant subi une transfusion, de même que chez des patients atteints d'hépatites non-A à G en phase aiguë et chronique de la maladie (Νishizawa et al., (1997), Okamoto et al. (1998a)).
L'ADΝ génomique du virus TTN a été clone à partir du plasma d'un donneur de sang qui présentait un taux de transaminases élevé mais qui n'avait pas de marqueur sérologique pour des virus connus de l'hépatite (Okamoto et al (1998a). Son génome, de polarité négative, consiste en une séquence de 3852 nucléotides et comprend deux cadres de lecture ouverts, ORF1 et ORF2, qui codent respectivement pour une protéine de manteau ou capside et une protéine non structurale putatives, respectivement de 770 et 202 acides aminés. TTN a une densité de 1,26 g/cm3 dans le sucrose, densité qui ne change pas après un traitement avec du Tween 80. Le génome viral est sensible au traitement à l' ADΝase I et à la nucléase Mung Bean.
La comparaison d'une séquence partielle de 356 nucléotides avec d'autres séquences de TTN provenant d'isolats obtenus à partir des sérums de 78 donneurs de sang et de patients atteints d'hépatite a permis de montrer une divergence importante avec des différences pouvant atteindre jusqu'à 30 %. La variabilité du génome viral est élevée, Mushawar et al. (1999) pouvant atteindre 52% ce qui permet de le classifier dans au moins 16 génotypes différents (Okamoto et al. (1999)).
TTV est trouvé dans le foie des patients avec des titres plus élevés de 10 à
100 fois que ceux de sérums correspondants provenant de patients atteints d'hépatites chroniques non-A à G. Il est sécrété dans les fèces et dans le sérum. Il pourrait être transmis par voies orale et fécale, en plus de la transmission parentérale par transfusion
(Okamoto et al. (1998b)). Dans des études antérieures, la prévalence des infections par TTN a été déterminée par PCR nichée en utilisant deux jeux d'amorces différents définis à partir du clone Ν22 (Nishizawa et al. précité). Les premiers résultats ont révélé une fréquence de l'infection par TTN plus élevée chez les patients avec des hépatites fulminantes (Okamoto et al. (1998)), chez des patients hémophiles ou chez des patients atteints d'une maladie du foie chronique d'étiologie non connue (Okamoto et al. (1998a), que chez des donneurs de sang. Mais des études complémentaires n'ont pas permis de montrer de différences significatives entre chacun de ces groupes (Fukuda et al. (1999),
Desai et al. (1999), Irving et al. (1999)), laissant supposer que TTN n'était probablement pas le principal agent causal des hépatites sporadiques aiguës d'origine inconnue.
Les différences observées dans ces données épidémiologiques pourraient être expliquées par un manque de détection de certains isolats en raison de la divergence dans la séquence nucléotidique et de l'utilisation de paires d'amorces non optimales (Desai et al. (1999)). De plus, la charge virale est faible dans les sérums humains puisqu'elle n'excède pas 104 copies/ml (Nishizawa et al., (1999)) et nécessiterait donc l'utilisation de techniques particulièrement sensibles, fiables et robustes.
Jusqu'à ce jour une seule méthode a été publiée pour la détection d'anticorps anti-TTV qui consiste en une technique indirecte utilisant la précipitation de particules de TTN dans des sérums, suivie par une amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) des séquences d'ADN virales à partir de complexes immuns (Tsuda et al. (1999)). Cette technique n'est toutefois pas adaptée à des essais en routine, sur une large échelle, et son intérêt est restreint du fait de l'utilisation d'une technique d'amplification par PCR et des limitations afférentes, comme décrit ci-dessus, en particulier liées à la divergence nucléotidique, à la détermination d'amorces appropriées et aux problèmes de contamination. Par ailleurs, une amplification par PCR n'est possible qu'en présence de virus circulants dans le matériel biologique testé et ne peut donc rendre compte d'une infection passée.
Il y avait donc un besoin pressant de développer un test sérologique qui pallie les inconvénients précités et qui, de plus, soit plus fiable et plus rapide qu'une détection par PCR. Les présents inventeurs ont maintenant mis en évidence de manière surprenante que la région 3' terminale de l'ORFl de TTN, qui commence à l'acide aminé 15 et se termine à l'acide aminé 263 de la séquence identifiée en SEQ ID ΝO 1, était une région très conservée, antigénique et montré qu'elle était utilisable pour détecter la présence du virus TTV dans un échantillon biologique, en particulier dans des sérums, avec un taux de prévalence avoisinant les 100%, indépendamment de l'origine de l'échantillon, à savoir chez des donneurs de sang, chez des patients atteints d'hépatites, chez des adultes ou des enfants et même chez des animaux. Ces données sont très intéressantes et surprenantes étant donnée la très grande variabilité protéique reconnue jusqu'à ce jour par de nombreux auteurs.
Les présents inventeurs ont également sélectionné sur la base d'une analyse de l'hydrophilie et d'une prédiction d'antigénicité de la région 3' terminale de l'ORFl de TTN les séquences qui sont potentiellement les plus intéressantes en terme d'antigénicité et d'immunogénicité, en particulier la séquence qui commence à l'acide aminé 41 et se termine à l'acide aminé 263 de la SEQ ID ΝO : 1 et préférentiellement la séquence qui commence à l'acide aminé 99 et se termine à l'acide aminé 263 de la SEQ ID ΝO : 1.
Les résultats présentés dans les exemples qui suivent montrent que la région 3' terminale de l'ORFl de TTN qui commence à l'acide aminé 15 et se termine à l'acide aminé 263 de la SEQ ID ΝO : 1 et également les séquences sélectionnées précitées, du fait du degré de conservation ou d'identité très élevé (95% par rapport à la séquence de référence TA278), présentent un intérêt réel pour la mise au point d'un test de diagnostic et d'un procédé de diagnostic universel permettant de détecter toute infection par TTNs, quel que soit le génotype et/ou sous type à l'intérieur d'un même génotype de l'isolât responsable de l'infection. Ces données vont à l' encontre de ce qui était communément admis, puisqu'il était au préalable reconnu que l'ORFl de TTN présentait un degré de variabilité très important. A titre d'exemple, pour illustrer ce qui était communément admis, on peut citer le brevet WO 99/58638 dont l'objet était de détecter et de distinguer les génotypes et sous types de différents isolats TTN en s 'appuyant sur la variabilité nucléique et protéique (voir en particulier les figures 6 à. 8 de cette demande de brevet). Aussi, la présente invention a pour objet :
- (a) un polypeptide dont la séquence peptidique commence à l'acide aminé 15 et se termine à l'acide aminé 263 de la séquence identifiée en SEQ ID NO 1, ou
- (b) un polypeptide dont la séquence peptidique présente au moins 95%, de préférence au moins 98% et avantageusement au moins 99% d'homologie ou d'identité avec la séquence définie en (a), ou
- (c) un polypeptide dont la séquence peptidique commence à l'acide aminé 41 et se termine à l'acide aminé 263 de la séquence identifiée en SEQ ID NO : 1 ou dont la séquence peptidique commence à l'acide aminé 99 et se termine à l'acide aminé 263 de la séquence identifiée en SEQ ID NO : 1, ou
- (d) un fragment de ladite séquence peptidique définie en (c) qui comprend au moins 4 acides aminés, de préférence au moins 5 ou 6 acides aminés et avantageusement d'au moins 7 acides aminés, en particulier de 6 à 15 acides aminés et avantageusement de 6 à 12, de 6 à 10 ou de 8 à 12 acides aminés. Par polypeptide, on entend une séquence qui correspond à un enchaînement d'acides aminés et cette définition inclus les protéines recombinantes et les polypeptides de synthèse ou leurs fragments qui sont obtenus par des méthodes bien connues de l'homme du métier.
Par polypeptide dont la séquence peptidique présente au moins 95%, de préférence au moins 98% et avantageusement au moins 99% d'homologie ou d'identité avec la séquence définie en (a), on entend un polypeptide qui répond à la définition donnée ci-dessus et qui présente au moins la même antigénicité et/ou immunogénicité que le polypeptide de référence (a).
L'invention concerne également : - (a) une molécule d'ADN qui comprend une séquence nucléotidique qui code pour un polypeptide dont la séquence peptidique commence à l'acide aminé 15 et se termine à l'acide aminé 263 de la séquence identifiée en SEQ ID NO 1, ou
- (b) une molécule d'ADN qui comprend une séquence nucléotidique qui code pour un polypeptide dont la séquence peptidique présente au moins 95%, de préférence au moins 98% et avantageusement au moins 99% d'homologie ou d'identité avec la séquence définie en (a), ou - (c) une molécule d'ADN qui comprend une séquence nucléotidique qui code pour un polypeptide dont la séquence peptidique commence à l'acide aminé 41 et se termine à l'acide aminé 263 de SEQ J-D NO : 1 ou dont la séquence peptidique commence à l'acide aminé 99 et se termine à l'acide aminé 263 de SEQ J-D NO : 1, ou - (d) une molécule d'ADN qui comprend une séquence nucléotidique qui code pour un fragment de la séquence peptidique définie en (c) et qui comprend au moins 4 acides aminés, de préférence au moins 5 ou 6 acides aminés et avantageusement d'au moins 7 acides aminés, en particulier de 6 à 15 acides aminés et avantageusement de 6 à 12, de 6 à 10 ou de 8 à 12 acides aminés, - (e) les séquences complémentaires desdites séquences (a) à (d), et
- (f) une molécule d'ARN qui est le produit de transcription desdites séquences ADN définies en (a) à (e).
Les méthodes de construction, de manipulation et de vérification de molécules d'ADN recombinant et de séquences nucléotidiques sont bien connues de l'homme du métier.
Les inventeurs ont, entre autres, obtenu une protéine recombinante qui correspond à la région 3' de la trame de lecture ORF1, telle que définie précédemment et dont la séquence en acides aminés commence à l'acide aminé 15 et se termine à l'acide aminé 263 de la SEQ ID NO 1. Dans SEQ JD NO 1, les acides aminés 1 à 14 correspondent à des acides aminés du plasmide utilisé pour la construction et l'expression de ladite protéine recombinante et les acides aminés 264 à 280 correspondent à des acides aminés dudit plasmide et à l'addition d'une queue polyhistidine (tagHis). La séquence nucléotidique codante pour SEQ J-D NO 1 est représentée en SEQ ID NO 2. La séquence codante a été générée à partir d'une séquence nucléotidique codant pour l'ORFl obtenue chez un patient infecté par TTN et amplifiée à l'aide d'amorces spécifiques de la région 3' ou carboxy-terminale d'intérêt. Le fragment obtenu a été clone et sous clone dans un vecteur approprié pour l'expression du polypeptide d'intérêt dans une cellule hôte appropriée sous le contrôle d'un promoteur approprié. Il est ainsi possible d'utiliser une cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote inférieur permettant l'expression du gène d'intérêt codant pour le polypeptide de l'invention ou pour un fragment dudit polypeptide, tels que défini précédemment. Parmi les systèmes microbiens et eucaryotes inférieurs Escherichia coli, Schizosaccharomyces pombe et Saccharomyces cerevisiae ont largement été utilisés pour la production de protéines recombinantes. De préférence, la cellule est une cellule ^Escherichia coli, mais il est à la portée de l'homme du métier de définir d'autres systèmes d'expression appropriés, en particulier dans des cellules issues d'organismes eucaryotes supérieurs, telles que les cellules CHO, COS ou HeLa ou dans d'autres types cellulaires infectés par le virus de la Forêt de Se Liki recombinant avec le gène d'intérêt. L'invention n'est donc pas limitée à un système d'expression particulier. Aussi, la présente invention englobe également une cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote inférieur permettant l'expression d'une séquence d'ADN ou d'un fragment d'ADN tel que défini précédemment, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression ; le vecteur comprenant la cassette d'expression et la cellule issue de l'organisme procaryote ou eucaryote inférieur, en particulier Escherichia coli, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae, et la protéine ainsi produite par la cassette d'expression, le vecteur ou la cellule. Elle concerne aussi un procédé pour préparer un polypeptide de l'invention qui consiste à cultiver une cellule hôte ci-dessus, dans un milieu de culture approprié, ladite cellule hôte étant transformée avec un vecteur d'expression qui contient une séquence nucléotidique d'ADN telle que définie précédemment et, à purifier ledit polypeptide produit jusqu'à un degré de pureté requis.
L'invention concerne aussi une composition diagnostique pour la détection d'anticorps dans un échantillon biologique, d'origine humaine ou animale, en particulier dans le sérum, le plasma, le foie, les fèces, ladite composition comprenant, entre autres, un polypeptide tel que défini précédemment et un procédé pour détecter et/ou quantifier lesdits anticorps dirigés contre au moins ledit polypeptide de l'invention dans un échantillon biologique, selon lequel on met en contact l'échantillon biologique avec la composition diagnostique dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes anticorps/antigène et on détecte la formation desdits complexes. On peut ainsi mettre en évidence la présence d'anticorps dans un échantillon biologique à tester, d'origine humaine ou animale, par Western Blot, test immunoenzymatique indirect, sandwich ou compétition, en utilisant en particulier pour la révélation, la technologie ELISA (Enzyme Linked Immunosorbant Assay). Toutes ces techniques sont bien connues de l'homme du métier. L'avantage de ladite composition diagnostique et/ou dudit procédé de détection de l'invention est qu'ils permettent de détecter une infection par n'importe quel isolât TTN, indépendamment de son génotype et/ou sous type et constituent donc un système de détection universel et générique des TTNs.
Un autre objet de l'invention est un polypeptide immunogène qui présente une séquence peptidique telle que définie précédemment ou qui consiste en une protéine recombinante obtenue selon le protocole précité et son utilisation pour la production d' anticorps monoclonaux ou polyclonaux par immunisation d'un animal mammifère, de préférence une souris, un rat ou un lapin, avec ledit peptide immunogène. La production d'anticorps polyclonaux et monoclonaux fait partie des connaissances générales de l'homme du métier. On peut citer à titre de référence Kόhler G. et Milstein C. (1975) : Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature 256 A95-491 et Galfre G. et al. (1977) Nature, 266 : 522-550 pour la production d'anticorps monoclonaux et Roda A., Bolelli G.F. : Production of high-titer antibody to bile acids, Journal of Steroid Biochemistry, Vol. 13, pp 449-454 (1980) pour la production d'anticorps polyclonaux. Des anticorps peuvent également être produits par immunisation de souris ou de lapins avec les particules virales de TTN. Pour la production d'anticorps monoclonaux, l'immunogène peut être couplé à de l'hémocyanine de Lymphet Keyhole (peptide KLH) comme support pour l'immunisation ou à de l'albumine sérique (peptide SA). Les animaux sont soumis à une injection d'immunogène en utilisant de l'adjuvant complet de Freund ou tout autre adjuvant. Les sérums et les surnageants de culture d'hybridome issus des animaux immunisés sont analysés pour leur spécificité et leur sélectivité en utilisant des techniques classiques, telles que par exemple des tests ELISA ou de Western Blot. Les hybridomes produisant les anticorps les plus spécifiques et les plus sensibles sont sélectionnés. Des anticorps monoclonaux peuvent également être produits in vitro par culture cellulaire des hybridomes produits ou par récupération de liquide d'ascite, après injection intrapéritonéale des hybridomes chez la souris. Quelque soit le mode de production, en surnageant ou en ascite, les anticorps sont ensuite purifiés. Les méthodes de purification utilisées sont essentiellement la filtration sur gel échangeur d'ions et la chromatographie d'exclusion ou la chromatographie d'affinité (protéine A ou G). Un nombre suffisant d'anticorps est criblé dans des tests fonctionnels pour identifier les anticorps les plus performants. La production in vitro d'anticorps, de fragments d'anticorps ou de dérivés d'anticorps, tels que des anticorps chimères produits par génie génétique est bien connue de l'homme du métier. Plus particulièrement, par fragment d'anticorps on entend les fragments F(ab)2, Fab, Fab', sFv (Blazar et al., 1997, Journal of Immunology 159 • 5821-5833 et Bird et al., 1988, Science 242 : 423-426) d'un anticorps natif et par dérivé on entend, entre autres, un dérivé chimérique d'un anticorps natif (voir par exemple Arakawa et al., 1996, J. Biochem 120 : 657-662 et Chaudray et al., 1989, Nature 339 : 394-397).
L'anticorps monoclonal ou le sérum polyclonal ainsi obtenu est incorporé dans une composition diagnostique qui est utilisée dans un procédé, sandwich ou par compétition, pour détecter et/ou quantifier au moins un polypeptide de l'invention, ou des particules virales contenant ledit polypeptide de l'invention dans un échantillon biologique (fluide biologique tel que sang, sérum, plasma, urine, bile, salive, lait maternel ; tissu tel que foie et fecès), selon lequel on met en contact l'échantillon biologique avec ladite composition diagnostique dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes anticorps/antigène et on détecte la formation desdits complexes. En particulier les anticorps monoclonaux obtenus sont spécifiques de la protéine recherchée ou de ses fragments tels que définis précédemment. L'invention concerne donc également ladite composition et ledit procédé de détection et/ou quantification.
L'invention concerne aussi des ligands susceptibles de s'associer à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à un fragment nucléotidique du virus TTN tels que définis ci-dessus. Ainsi, par ligand, on entend toute molécule susceptible de s'associer à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à un fragment nucléotidique, telle qu'un fragment nucléotidique partiellement ou totalement complémentaire, un polynucléotide complémentaire, un anticorps anti-acide nucléique. La production de fragments nucléotidiques ou de polynucléotides fait partie des connaissances générales de l'homme du métier. On peut notamment citer l'utilisation d'enzymes de restriction, et la synthèse chimique sur synthétiseur automatique. Les sondes et amorces susceptibles de s'hybrider dans des conditions de stringence déterminées à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à un fragment nucléotidique tels que définis précédemment font partie de cette définition. Il est à la portée de l'homme du métier de définir les conditions de stringence appropriées On peut citer à titre d'illustration George H Keller et Mark M Manak, DNA PROBES, Second Edition, publié par Stockton Press, 1993, 49 West 24* St , New York, N Y 10010, USA Des conditions de stringence caractéristiques sont celles qui correspondent à une combinaison de la température et de la concentration saline choisie approximativement entre 12 à 20°C sous le Tm (« melting température ») de l'hybride à l'étude Ainsi, l'homme du métier est à même de déterminer les séquences des sondes et amorces ainsi que les conditions de stringence appropriées pour détecter tous les isolats TTVs indépendamment de leurs génotypes et/ou sous types de manière à réaliser un test et procédé de diagnostic universel ou générique, étant entendu que le taux de conservation très élevé dans la région protéique concernée ou dans ses fragments implique une conservation importante dans les séquences nucléotidiques correspondantes Par ailleurs, on connaît des techniques pour la production d'anticorps anti-acides nucléiques On peut citer à titre d'exemples Philippe Gros et al , Nucleic Acides Researc, 1994, Vol 22, N° 15, 2951-2957 , Anderson, W F et al (1988) Bioessays, 8 (2), 69-74 , Lee, J S et al (1984) FEBS Lett , 168, 303-306 , Malfoy, B et al (1982) Biochemistry, 21(22), 5463-5467 , Stollar, B D et al , J J (eds) Methods in Enzymology, Académie Press, pp 70-85 , Traincard, F et al (1989) J Immunol Meth , 123, 83-91 et Traincard, F ét al (1989) Mol Cell Probes, 3, 27-38) Par fragment nucléotidique, on entend soit des fragments associés à une même unité moléculaire, soit des fragments dans un complexe moléculaire comprenant plusieurs sous-unités homologues ou hétérologues obtenues de manière naturelle ou artificielle, notamment par multi-épissage différentiel ou par synthèse sélective
On définit ainsi une composition diagnostique qui comprend au moins une sonde ou une amorce ou un anticorps anti-acide nucléique
Les amorces, sondes et anticorps anti-acides nucléiques de l'invention sont par ailleurs utilisées dans un procédé de diagnostic d'ADN et/ou d'ARN viral, selon lequel on prélève un échantillon d'origine humaine ou animale (sérum, plasma, extrait tissulaire de foie, extraits fécaux, salive) patient, on traite si nécessaire ledit échantillon pour en extraire l'ADN et/ou l'ARN, on met en contact ledit échantillon avec au moins une sonde ou une amorce ou un anticorps anti-acide nucléique tels que défini précédemment, dans des conditions de stringence déterminées quand le ligand est une sonde ou une amorce et on détecte la présence d'ADN et/ou d'ARN viral dans l'échantillon soit par mise en évidence d'une hybridation dudit ADN et/ou ARN viral avec au moins une sonde, soit par amplification dudit ADN et/ou ARN, ou dans des conditions d'incubation déterminées lorsque le ligand est anticorps anti-acide nucléique et on détecte le complexe ainsi formé. Dans le cas de l'utilisation d'un anticorps antiacide nucléique, l'anticorps peut lui même être marqué par tout marqueur approprié pour la révélation du complexe formé ou bien la formation du complexe peut être révélée par l'addition au milieu d'incubation d'un anticorps anti-anticorps acide nucléique marqué. Dans le cas d'utilisation de sondes la mise en évidence du complexe d'hybridation peut être effectuée directement par utilisation d'une sonde complémentaire ou sensiblement complémentaire de la séquence de la cible, ladite sonde étant marquée par tout marqueur approprié ou par mise en oeuvre de la technique dite « sandwich » en une ou deux étapes qui consiste à utiliser une sonde de capture complémentaire ou sensiblement complémentaire d'une partie de la séquence de la cible et une sonde dite de détection marquée complémentaire ou sensiblement complémentaire d'une autre partie de la séquence de la cible. Dans le cas d'utilisation d'amorces, celles ci peuvent être directement marquées pour la mise en évidence d'un produit d'amplification.
De nombreux outils ont déjà été développés pour introduire des gènes hétérologues et/ou vecteurs dans des cellules, en particulier des cellules de mammifères. Ces techniques peuvent être divisées en deux catégories : la première catégorie implique des technique physiques comme la micro-injection, l'électroporation ou le bombardement de particules. La seconde catégorie est basée sur l'utilisation de techniques en biologie moléculaire et cellulaire avec lesquelles le gène est transféré avec un vecteur biologique ou synthétique qui facilite l'introduction du matériel dans la cellule in vivo. Aujourd'hui, les vecteurs les plus utilisés sont les vecteurs adénoviraux et rétroviraux. Les virus possèdent des propriétés naturelles pour traverser les membranes plasmiques, éviter la dégradation de leur matériel génétique et introduire leur génome dans le noyau de la cellule. Ces virus ont été largement étudiés et certains sont déjà utilisés expérimentalement dans des applications humaines en vaccination, en immunothérapie, ou pour compenser des déficiences génétiques. Toutefois l'utilisation de certains vecteurs adénoviraux en thérapie génique présente des inconvénients et peut même avoir des effets dommageables pour la santé publique, comme relevé récemment. En particulier, il existe un risque de disséminer les particules virales produites dans l'organisme et l'environnement.
L'utilisation de l'ADN viral ou de la protéine identifiés par la présente invention permet de pallier ces risques potentiels. En effet, comme illustré dans les exemples, les inventeurs ont montré que le virus de l'invention était ubiquitaire, ce qui laisse supposer un mécanisme de tolérance de l'hôte et permet donc d'envisager à moindres risques l'utilisation dudit polypeptide ou de l'ADN recombinant codant pour ledit polypeptide comme vecteur en thérapie, soit pour introduire ex vivo, in vivo ou in vitro dans des cellules un gène d'intérêt thérapeutique ou une protéine d'intérêt thérapeutique, soit pour introduire ex vivo, in vivo ou in vitro des substances pharmaceutiquement actives. Des cellules cibles peuvent ainsi être transformées par des techniques connues de l'homme du métier, telles que la transfection, la transduction ou la transformation et être ensuite introduites chez un patient pour exercer leurs propriétés. L'invention concerne donc aussi l'utilisation d'ADN recombinant ou d'un polypeptide recombinant de TTN, répondant aux définitions précédentes, comme vecteur de thérapie, ledit ADN recombinant étant placé sous la dépendance d'un promoteur autologue ou hétérologue, de préférence un promoteur fort. Par promoteur autologue on entend un promoteur (UTR) du virus TTN et par promoteur hétérologue on entend tout promoteur qui ne soit pas un promoteur de TTN, d'origine virale, rétrovirale ou cellulaire, éventuellement modifiée, à la condition qu'il soit fonctionnel. Une telle utilisation n'a pas encore été décrite. Etant donné que l'on souhaite obtenir in vivo une transformation ciblée vers un type cellulaire ciblé, il est évident que le vecteur utilisé doit pouvoir être lui-même ciblé. Un autre objet de l'invention est ainsi une composition thérapeutique comprenant, entre autres, un tel vecteur.
La présente invention concerne aussi un matériel biologique pour la préparation de compositions pharmaceutiques, la composition comprenant au moins une cellule, notamment une cellule ne produisant pas naturellement des protéines déterminées, telles que des anticorps, sous une forme permettant son administration dans un organisme mammifère, humain ou animal, ainsi qu'éventuellement sa culture préalable, ladite cellule étant génétiquement modifiée in vitro par au moins une séquence d'acide nucléique contenant au moins un gène d'intérêt thérapeutique codant in vivo pour au moins une protéine ou un fragment d'une protéine d'intérêt ou pour au moins une molécule inhibitrice de la fonction et/ou de la fixation et/ou de l'expression d'au moins une protéine ou d'un fragment de protéine d'intérêt ou pour au moins un anticorps ou une partie d'anticorps capable de se lier à au moins une protéine d'intérêt. Plus particulièrement, ladite cellule cible provient soit de l'individu à traiter, soit d'un autre mammifère. Dans ce dernier cas, il convient de noter que ladite cellule cible aura subi un traitement la rendant compatible avec l'homme. Ces cellules sont établies en lignées cellulaires et sont préférentiellement CMHII+ ou CMHJI + inductibles comme les lymphocytes, les monocytes, les astrocytes, les oligodendrocytes. L'invention concerne également les cellules modifiées et un procédé de préparation d'une cellule telle que décrite ci dessus caractérisé en ce que l'on introduit dans une cellule de mammifère ne produisant pas naturellement des protéines identifiées, par tout ou moyen approprié, au moins une séquence d'acide nucléique contenant au moins un gène d'intérêt thérapeutique et des éléments assurant l'expression dudit gène dans ladite cellule, ledit gène d'intérêt thérapeutique contenant une séquence d'acide nucléique codant pour une molécule ou un fragment de molécule in vivo, comme décrit ci-dessus. Plus particulièrement, elle concerne des cellules eucaryotes transfectées par au moins une séquence nucléotidique et/ou un vecteur tel que décrit précédemment. Elle concerne aussi une composition thérapeutique comprenant, entre autres, une telle cellule.
La figure 1 représente les séquences nucléotidique et protéique complètes et reconstruites de l'ORFl du clone X94-TTV de l'invention.
La figure 2 représente la construction d'un arbre phylogénique et montre que la séquence de X94-TTN est de génotype 1 et appartient au sous type la. La figure 3 représente le profil d'hydrophilicité de la protéine C-terminale
ORF1-X94 de TTN selon Hopp et Woods.
La figure 4 représente le profil d'antigénicité de la protéine C-terminale ORF1-X94 de TTN obtenu par indexation de protubérance.
La figure 5 correspond à la détection d'anticorps anti-TTV dans des sérums humains par Western Blot, comme décrit dans l'exemple 4. Les pistes 1 et 2 correspondent aux résultats obtenus en présence de sérums positifs d'enfants ; les pistes 3 à 6 correspondent aux résultats obtenus en présence de sérums positifs d'adultes ; la piste 7 correspond aux résultats obtenus avec un sérum négatif d'adulte ; la piste 8 correspond aux résultats obtenus avec un témoin anti-humain IgA+IgG+IgM de chèvre conjugué à la phosphatase alcaline ; les pistes 9 et 10 correspondant à des contrôles positifs obtenus respectivement avec un anticorps monoclonal anti-histidine et un conjugué phosphatase alcaline couplé au groupement NÏ2+-NT A ; la piste 11 est un contrôle négatif de spécificité obtenu à partir d'un extrait purifié d'E. coli incubé avec un sérum humain anti-TTN positif.
La figure 6 correspond aux résultats de l'immmunoréactivité de la protéine correspondant à l'extrémité C-terminale de l'ORFl vis à vis d'un sérum virémique. La quantité de protéine recombinante de l'invention et d'extrait protéique E. coli purifié respectivement adsorbés en fond de plaque est représentée en abscisse (25, 50, 100 et 250 ng d'antigène par puits). Les valeurs de DO à 492 nm sont représentées en ordonnée. Les histogrammes représentés en gris clair correspondent aux résultats obtenus avec l'ORFl C-terminale de l'invention et les histogrammes représentés en gris foncés correspondent aux résultats obtenus avec l'extrait protéique E. coli purifié dans des conditions identiques à la protéine d'intérêt.
La figure 7 correspond aux résultats de l'évaluation sérologique de la protéine C-terminale de l'ORFl par test ELISA indirect et d'extrait protéique E. coli purifié vis à vis de différents sérums humains. Les valeurs de DO à 492 nm sont représentées en ordonnée. Les histogrammes représentés en gris clair correspondent aux résultats obtenus avec la protéine C-terminale de l'ORFl de l'invention et les histogrammes représentés en gris foncés correspondent aux résultats obtenus avec l'extrait protéique E. coli purifié de type sauvage.
La figure 8 représente la détection d'ADN de TTN par amplification PCR. M signifie Marqueur de masses moléculaires (DΝA Ladder lOOpb, Gibco BRL). La piste 1 est un contrôle négatif PCR ; les pistes 2 à 4 représentent les résultats obtenus avec des sérums positifs issus du Centre de Transfusion Sanguine (CTS); la piste 5 représente les résultats obtenus avec un sérum CTS négatif; les pistes 6 à 8 représentent les résultats obtenus à partir de sérums positifs de patients atteints d'hépatites d'étiologie inconnue ; la piste 9 correspond à un sérum négatif et la piste 10 correspond à un sérum positif d'enfant. La figure 9 représente la prévalence de la virémie TTN obtenue dans les sérums testés. En ordonnée est représenté le pourcentage de sérums positifs.
Exemple 1 : Obtention de la séquence nucléotidique de la trame de lecture ORF1
La séquence nucléotidique qui code pour le cadre de lecture ORF1 a été obtenue à partir d'un patient transplanté (X94) de sexe masculin, âgé de 30 ans, qui présentait des taux d'alanine aminotransférase élevés, sans virémie détectable pour le virus de l'hépatite B (HBN ou VHB) et le virus de l'hépatite C (HCV ou VHC), ni réponse immune développée contre ces virus et pour lequel un diagnostic pour une hépatite d'étiologie non connue a été établi. La négativité de son sérum pour HBV HCV a été confirmée par PCR (Polymerase Chain Reaction) et hybridation par Southern blot. Il a été montré qu'il était infecté par le virus TTV par mise en évidence de l'ADΝ du virus par PCR nichée effectuée sur la base de la méthode décrite par Simmonds et al. (1998).
Le acides nucléiques totaux ont été extraits à partit de 140 μl du sérum du patient à l'aide du kit QIÂamp Viral RNA Mini Kit (nom commercial), commercialisé par la société QIAGEN, selon le protocole établi selon les instructions du vendeur et soumis à amplification par PCR pour la région codant pour l'ORFl de TTV. Un premier clone (7-94X) comprenant la séquence amino-terminale de l'ORFl de TTV, s'étendant du nucléotide 582 à 2192 par rapport à la séquence de référence de l'isolât TA278 (DDBJ, EMBL, GenBank, numéro d'accès AB008394), a été obtenu par PCR nichée en utilisant des oligonucléotides déduits de régions bien conservées dans des isolats de TTV de différents génotypes et sous types disponibles dans la base de données GenBank.
Amorce externe sens (CO6+) : SEQ J-D NO :3 5' AGCGAAACCTGCCCCTCCG 3' (position 519-537 sur l'isolât TA278)
Amorce interne sens (CO14+D) : SEQ ID NO :4 5' GAGC ACC ATGGCCT ATGGSTGG 3 ' (position 582-603)
Amorce externe anti-sens 5427 et amorce interne anti-sens 5432, décrites par Simmonds et al. (1998). Des amorces spécifiques ont été définies à l'extrémité carboxy-terminale (COI 5+ et CO 16+) de cette séquence et ont été utilisées pour générer un second fragment s'étendant des nucléotides 2062 à 2857 par rapport à l'isolât TA278, par PCR semi nichée, qui présentait une région chevauchante de 92 nucléotides avec la séquence du clone 7-94X et qui recouvrait la région carboxy-terminale de l'ORFl de TTV. Ce fragment a été clone et appelé 11-94X.
Amorce externe sens (COI 5+) : SEQ ID NO : 5 5 ' T AC AC ATGAATGCC AGACT AC 3 '
Amorce interne sens (COI 6+) : SEQ H) NO :6 5' TACAGACCCCCAACTAATAGTAC 3'
Amorce anti-sens (COI 2-)/ SEQ J-D NO :7 5' GTAACAAGGTAGGGTTGATATC 3' (position 2836-2857 sur l'isolât TA278).
La première amplification a été réalisée à l'aide du kit Expand™ High Fidelity PCR System (commercialisé par la société Roche Diagnostics) sur la totalité des acides nucléiques extraits comme suit : 94°C pendant 10 min. ; 35 cycles de 94°C pendant 1 min., 50°C pendant 1 min., 68°C pendant 2 min. ; extension finale à 68°C pendant 7 min. Le second tour a été réalisé dans les mêmes conditions à partir de 10 μl de produits d'amplification du premier tour. Les produits de PCR ont été analysés sur gels d'agarose 0,8% et détectés par exposition aux ultra violets après coloration au bromure d'éthidium.
Les fragments amplifiés des parties N- et C-terminales de l'ORFl ont été clones séparément dans le plasmide pCR2.1-TOPO en utilisant le kit TOPO™TA Cloning Kit, commercialisé par la société Invitrogen. Ces deux fragments ont été séquences dans les deux directions en utilisant le kit Prism Ready Reaction Kit Dye Deoxyterminator Cycle Sequencing Kit (nom commercial), commercialisé par la société Applied Biosystems, à l'aide des séquenceurs d'ADN automatisés 377 et 373A de la société Applied Biosystems, en utilisant les oligonucléotides habituels.
L'analyse des séquences obtenues a été réalisée à l'aide des logiciels Gène Works (IntelliGenetics) et MacVector 4.5 (Kodak). Les recherches dans les bases de données ont été réalisées par BLAST (http ://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) sur toutes les banques de données principales (GEnBank, EMBL, PJ-R, SWISS-PROT, Dbest) pour générer des alignements multiples à la fois au niveau nucléotidique et protéique.
L'analyse des séquences obtenues à partir des clones 7-94X et 11-94X a révélé 100 % d'identité au niveau de la région de chevauchement. En combinant toutes les parties chevauchantes, une séquence proche de la séquence complète de l'ORFl de TTV, recouvrant les nucléotides 589 à 2857, par rapport à la séquence de l'isolât de référence TA278, a été reconstruite et il a été montré qu'elle contenait un cadre de lecture ouvert codant pour une protéine de 756 acides aminés. Une comparaison par alignement des séquences nucléotidiques de X94 et TA278 a montré une similarité importante, avec une identité de 95 %.
Exemple 2 : Caractérisation de la protéine de l'ORFl. La séquence en acides aminés prédite, codée par la séquence de l'ORFl de X94-TTV a été analysée. Comme montrée à la figure 1 annexée, elle contient à son extrémité N-terminale un domaine très riche en arginine (et lysine), comme cela avait déjà été montré antérieurement pour les protéines de capside des circovirus (Niagro et al., (1998) ; Takahashi et al,. (1998a) ; Mushahwar et al., (1999)), et quatre sites de glycosylation liés à l'asparagine dans la région centrale. De plus, trois des quatre motifs conservés de la protéine Rep (FTL) et (YXXK) décrits antérieurement (Niagro et al., (1998) chez les circovirus ont été trouvés dans la protéine de l'ORFl de X94-TTV suggérant une possibilité de réplication virale par un mécanisme de cycles tournant (Mushahwar et al., (1999)).
La caractérisation de la protéine de l'ORFl par analyse de l'hydrophilie, en utilisant la méthode de Hopp et Woods (1981), au moyen du logiciel Mac Vector, a permis de mettre en évidence la présence de deux régions hydrophiles majeures. La première région hydrophile est localisée au niveau de la partie N-terminale de la séquence en acides aminés et contient un domaine riche en arginine, et la seconde est localisée à proximité de l'extrémité C-terminale de la séquence de l'ORFl et concerne la portion de séquence couvrant les acides aminés 598-715. Parallèlement, une étude de prédiction d'antigénicité de la séquence protéique a été effectuée par analyse de la séquence en acides aminés au moyen du logiciel Mac Vector. Le profil d'antigénicité obtenu par indexation de protubérance a montré que les deux régions hydrophiles préalablement mise en évidence sont potentiellement antigéniques. Les profils d'hydrophilie et d'antigénicité sont respectivement représentés dans les figures 3 et 4. Sur cette base, les présents inventeurs ont sélectionnés les fragments de SEQ ID NO : 1 qui sont potentiellement les plus intéressants en terme d'antigénicité et d'immunogénicité. Il s'agit du fragment dont la séquence commence à l'acide aminé 41 et se termine à l'acide aminé 263 de SEQ ID NO : 1 et préférentiellement du fragment dont la séquence commence à l'acide aminé 99 et se termine à l'acide aminé 263 de SEQ ID NO : 1. Ces deux régions font également partie de l'invention.
Exemple 3 : Analyse phylogénique
Un arbre phylogénique a été construit par la méthode décrite par Saitou et al. (1987), après alignement de la protéine ORF1 de X94-TTV avec 26 séquences complètes disponibles dans les bases de données de l'ORFl de TTV. Trois branches majeures ont été observées avec des supports significatifs de « bootstrap » de 100 % qui correspondaient aux génotypes 1, 2 et 3 (Mushahwar et al., 1999 et Erker et al., 1999). Des résultats similaires ont été observés après construction d'un arbre phylogénique sur la base des séquences nucléotidiques. La relation génétique de la séquence de X94-TTV a été déterminée comme étant la plus proche des séquences du génotype 1 et il en a été déduit qu'il appartenait au sous type la.
Exemple 4 : Expression et purification de la protéine recombinante de la partie C- terminale de l'ORFl.
Le clone positif 11-94X correspondant à la région C-terminale de l'ORFl a été ré-amplifié en utilisant les oligonucléotides ci-dessous pour les sites de restriction BamHl et Sαcl aux extrémités 5' et 3', respectivement.
SEQ ID NO : 8 5 ' TCTCTGGATÇÇGGAC AGACCCCC AACTAATA 3 '
SEQ JX> NO :9 5 ' TCTCTCGAGCTCGGGTTGATATCTTGATTTTG 3 '
Le produit de PCR digéré BamHl-Sacl a été lié dans les sites BamHI et Sacl du vecteur d'expression pET21b (Novagen) en amont d'une queue polyhistidine. La transformation du mélange de ligation a été réalisée dans la souche JM109 Escherichia coli et l'ADN recombinant des clones sélectionnés a été extrait à l'aide du kit QlAfilter Plasmid Midi Kit (nom commercial), commercialisé par la société QIAGEN. L'expression des protéines recombinantes a ensuite été réalisée dans la souche BL21 à' Escherichia coli. Après culture une nuit à 37°C dans le milieu de Luria Bertani (LB) contenant 100 μg/ml d'ampicilline, une dilution au 1 :50eme a été soumise à croissance jusqu'à ce que la densité optique à 600 nm atteigne 0,6 à 1 unité. Les cultures ont ensuite été amenées à la concentration finale de ImM par addition pendant trois heures d'isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside. Les bactéries ont été centifugées à 3000 tpm pendant 20 min., à 4°C, puis le culot de centrifugation a été resuspendu dans 1 : 10 volume de tampon PBS et une lyse a été réalisée par sonication sur glace jusqu'à ce que le surnageant devienne clair. Le fait que la protéine recombinante surexprimée soit récupérée à partir de la fraction insoluble du lysat cellulaire, suggère une agrégation protéique dans des corps d'inclusion insolubles ou une co-précipitation avec des débris cellulaires bactériens non solubles. Les corps d'inclusion ont été traités avec du sarcosyl 1,5% dans du tampon STE (10 mmoles/1 Tris, pH 8, 100 mmoles/1 EDTA, pH 8) pour obtenir la partie C-terminale de l'ORFl dans la fraction soluble. Alternativement, la protéine recombinante a été solubilisée avec de l'urée 8M dans Na HPO4 0, 1M, Tris- HC1 0,01M, Tween 20 0,05%, pH 8. Cette dernière condition a permis de purifier la protéine sur des billes d'agarose magnétiques Ni-NTA (Ni-NTA Magnetic Agarose Beads, QIAGEN) en conditions dénaturantes. Les résidus histidine de la protéine recombinante se lient efficacement sur une colonne d'affinité avec un agent chélatant Ni2+, dans des conditions dénaturantes. La protéine tag-His a ensuite été éluée des billes en réduisant le pH à 4,5. La protéine éluée a été analysée par coloration au Bleu Brillant de Coomassie après électrophorèse sur gel SDS PAGE 10%, en conditions dénaturantes (Lae mli (1970)). La pureté de la fraction éluée était supérieure à 95 % Une analyse par Western blot de la protéine purifiée avec un anticorps anti-histidine a confirmé la masse moléculaire prédite de l'extrémité C-terminale de l'ORFl, par détection d'un signal positif aux alentours de 32 kDa.
Exemple 5 : Détection d'anticorps anti-TTV dans des sérums humains.
L'immunoréactivité de la partie C-terminale de l'ORFl de la protéine contre des sérums humains a été testée par Western blot. Après migration sur gel préparatif SDS PAGE 10 %, la protéine recombinante purifiée ou solubilisée dans le sarcozyl a été transférée par électrophorèse sur des membranes de fluorure de polyvinylidiène de la société Millipore, selon la méthode de Towbin et al. (1979). Les blots ont été bloqués 30 min. à température ambiante avec la poudre de lait non gras à 5% dans une solution tamponnée par du Tris (TBS. Tris 20 mmoles/1, pH 7,5, NaCl 500 mmoles/1) avant incubation pendant une nuit à 4°C avec des sérums humains dilués au 1 : 100 dans du TBS contenant du Tween 20 (0,5 ml/1) (TBS-T). 70 sérums incluant 30 donneurs de sang volontaires, 30 patients atteints d'hépatites non A à G et 10 enfants sains âgés de 2 à 5 ans ont été testés. Les membranes ont été lavées trois fois avec TBS- T et incubées à température ambiante pendant 1 heure avec des anticorps anti- IgA+IgG+IgM humaines de chèvre conjuguées à la phosphatase alcaline ou avec des anticorps monoclonaux anti- IgM humaine de souris conjugués à la phosphatase alcaline à une dilution au 1 :2000 dans du TBS-T. Les membranes ont ensuite été lavées deux fois avec du TBS-T, une fois avec du tampon borate (borate 31,5 mmoles/1, pH 9,7, MgSO 10 mmoles/1) et incubées avec une solution de substrat (o-dianisidine tétra- azotée 0,5g/l et phosphate d'acide β-naphtylique 0,5/1 dans du tampon borate). De manière alternative, des blots ont été révélés en utilisant soit un conjugué Ni +-NTA- phosphatase alcaline avec une procédure en une étape (QIAGEN), soit avec un anticorps monoclonal anti-penta-histidine avec une procédure en deux étapes (QIAGEN), en utilisant les protocoles du fabricant. Les résultats ont révélé la présence d'anticorps anti-TTV, dirigés contre la protéine recombinante de 32 kDa. Une analyse complémentaire avec la protéine recombinante purifiée a conduit à des résultats identiques avec des sérums, sans réactivité croisée avec des protéines de E. coli, ce qui confirme le caractère immunogène de la protéine native. La spécificité de la réponse IgG anti-TTV a été contrôlée par des dilutions successives de 3 sérums positifs qui donnaient pour chacun un signal positif jusqu'à la dilution au 1/1000. De plus, la réactivité de deux sérums anti-TTV était réduite de manière significative quand ces échantillons de sérums avaient été antérieurement pré-incubés avec la protéine recombinante fixée sur des billes d'agarose Ni-NTA. Tous les sérums humains testés, excepté un, montraient une immunoréactivité contre la protéine recombinante, révélée par les anticorps anti-IgG, IgM et IgA humaines, indiquant une prévalence élevée de 98,5 % de la réponse anti- TTV chez les humains. De plus, la réponse IgM anti-TTV a été testée sur 26 sérums d'adultes et 10 sérums d'enfants avec la protéine recombinante solubilisée dans le sarcozyl par Western blot. Aucune réponse primaire n'a été détectée, suggérant qu'il n'y avait pas eu d'infection récente des hôtes infectés.
Les résultats sont présentés dans la figure 5 et dans le tableau ci-dessous.
Tableau
* . Hépatite d'étiologie inconnue
Exemple 6 : Immunoréactivité de la protéine ORFl C-terminale en ELISA.
Test ELISA indirect :
La réactivité de la protéine ORFl C-terminale a été validée par un test ELISA indirect à l'aide d'un sérum provenant d'un donneur de sang testé positif pour la présence d'anticorps anti-TTV par la technique Western blot. La protéine recombinante a été adsorbée en fond de plaque, à raison de 25, 50, 100 et 250 ng d'antigène par puits. La spécificité du test a été contrôlée par adsorption d'un extrait protéique E.coli purifié, préparé dans les mêmes conditions que la protéine recombinante et constituant un témoin négatif pour l'expérience.
Les résultats présentés sur la figure 6 mettent en évidence la réactivité de la protéine ORFl C-terminale vis-à-vis d'anticorps anti-TTV présents dans le sérum testé. Un effet dose est observé avec une augmentation de l'immunoréactivité en fonction de la quantité croissante d'antigène fixée sur le support. En revanche, la réactivité observée avec le témoin négatif E.coli reste faible et constante et confirme la spécificité du signal observé. La valeur seuil du test a été calculée à partir de l'ensemble des valeurs d'absorbance obtenues pour les témoins négatifs E.coli (valeur moyenne + 2 écarts types).
Evaluation de l'immunoréactivité en ELISA
Une évaluation sérologique de la protéine recombinante a été effectuée par test ELISA indirect sur un petit nombre de sérums humains représentatif des trois groupes de population étudiés, soit des donneurs de sang (CTS355 et ctsl57), des patients atteints d'hépatites d'étiologie inconnue (n-l>, Hépatite X30, Hépatite XI 3, Hépatite X121) et des enfants (n=l). Le sérum positif précédemment validé en ELISA (CTS356) a été inclus dans l'étude comme contrôle positif d'expérience. Un anticorps monoclonal anti-histidine a également été testé dans le but de valider le test ELISA.
L'adsorption de la protéine recombinante sur support plaque a été effectuée dans les conditions de réactivité optimales obtenues précédemment avec le sérum de contrôle, soit avec 250 ng d'antigène par puits. Afin de contrôler la spécificité de la réactivité, un extrait E. coli purifié a été adsorbé dans les mêmes conditions. La figure 7 présente l'immunoréactivité de la protéine ORFl C-terminale vis-à-vis des différents sérums humains testés au l/100e. WT signifie contrôle E.coli sauvage.
L'adsorption de la protéine recombinante ORFl C-terminale dans les conditions définies (250ng/puits) permet d'obtenir en ELISA indirect des réactivités spécifiques et significatives sur les sérums testés. Seul le sérum X30 issu du groupe des hépatites d'étiologie inconnue présente une réponse particulièrement faible, voire négative. Il est important de préciser que ce sérum a été détecté négatif par Western blot. Néanmoins, la réactivité observée avec le témoin négatif E.coli n'est pas constante selon les sérums testés. Cette évaluation de l'immunoréactivité ne permet donc pas de définir de valeur seuil puisque la réponse et le titre anû-E.coli apparaissent très variables selon les patients. Par ailleurs, il est intéressant de noter que la protéine réagit fortement avec l'anticorps monoclonal anti-histidine utilisé au 1/1000e et testé parallèlement comme contrôle positif du test ELISA (DO=T362).
L'immunoréactivité de la protéine ORFl C-terminale a été testée par la technique ELISA sur six sérums (n=6). Les résultats de cette évaluation sérologique sont en adéquation avec les réactivités obtenues par la technique de Western blot et mettent en évidence la faisabilité du test ELISA indirect. Exemple 7 : Virémie dans les sérums humains Amplification d'ADN de TTV
La virémie du TTV a été mise en évidence par amplification de l'ADN du virus circulant dans le sérum. La recherche d'ADN viral a été effectuée par PCR à l'aide d'amorces, situées dans des régions non codantes très conservées du génome, ayant permis la détection de séquences TTV au taux élevé de 92% dans les sérums humains
(Takahashi et /., 1998b).
L'amplification d'ADN a été mise au point à partir de 9 sérums humains, représentatifs des trois groupes d'individus testés dans le cadre de la réponse immune tels que les donneurs de sang, les patients atteints d'hépatites d'étiologie inconnue et les enfants. Un sérum humain, testé positif pour la présence d'ADN de TTV par PCR et confirmé positif après analyse Southern blot, a été inclus dans l'expérience comme contrôle positif de référence. L'analyse des produits d'amplification sur gel d'agarose 1,5% est mise en évidence sur la figure 8. Un signal positif est détecté à la taille théorique attendue de 199 paires de bases et révèle la présence d'ADN de TTV dans 7 échantillons sur 9 testés.
Exemple 8 : Prévalence de la virémie Afin d'estimer la fréquence de l'infection suivie d'une possible élimination du virus du sérum, l'étude a été complétée par une détermination systématique de la virémie dans les échantillons de sérums initialement testés pour la réponse anticorps anti- TTV. L'étude a porté sur 67 échantillons, 3 sérums d'enfants n'ayant pu être testés en raison d'un volume de sérum insuffisant pour l'extraction des acides nucléiques. Les résultats de l'analyse PCR sont représentés sur la figure 9.
L'ADN du virus est détecté chez 73,3% des donneurs de sang, 83,3% des patients atteints d'hépatites d'étiologie inconnue et 57,1% des enfants. La virémie moyenne détectable dans les sérums humains testés est donc de 76,1%. Une absence d'amplification d'ADN est observée dans 16 échantillons sur les 67 testés en dépit d'une réponse positive anti-TTV IgG + IgM + IgA pour ces 16 sérums. Le seul sérum détecté négatif pour la réponse anticorps de type IgG mais également IgM, présente un signal positif pour la présence d'ADN viral. Exemple 9 : Détection d'anticorps anti-TTV chez des animaux.
En raison de la prévalence immune très élevée chez les humains, et parce que des séquences du virus TTV ont été détectées dans des sérums d'animaux domestiqués, la recherche d'anticorps anti-TTV a été effectuée dans les sérums de chien, de chat, de chèvre, de mouton et de lapin. Un échantillon sérique de chacune de ces cinq espèces d'animaux a été testé. L'incubation et le traitement des membranes ont été réalisés dans les mêmes conditions que celles décrites à l'exemple 5, avec l'utilisation d'anti-IgG pour chaque espèce conjuguées à la phosphatase alcaline. Des anticorps anti- TTV ont ainsi été détectés par Western blot dans tous les échantillons de sérums animaux testés, avec une intensité de signal forte, comme celle observée à partir des sérums humains.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Polypeptide isolé choisi parmi :
- (a) un polypeptide dont la séquence peptidique commence à l'acide aminé 15 et se termine à l'acide aminé 263 de la séquence identifiée en SEQ ID NO 1, ou
- (b) un polypeptide dont la séquence peptidique présente au moins 95%, de préférence au moins 98% et avantageusement au moins 99 % d'homologie ou d'identité avec la séquence définie en (a), ou
- (c) un polypeptide dont la séquence peptidique commence à l'acide aminé 41 et se termine à l'acide aminé 263 de la séquence identifiée en SEQ ID NO : 1 ou dont la séquence peptidique commence à l'acide aminé 99 et se termine à l'acide aminé 263 de la séquence identifiée en SEQ H) NO : 1, ou
- (d) un fragment de ladite séquence peptidique définie en (c) qui comprend au moins 4 acides aminés, de préférence au moins 5 ou 6 acides aminés et avantageusement d'au moins 7 acides aminés, en particulier de 6 à 15 acides aminés et avantageusement de 6 à 12, de 6 à 10 ou de 8 à 12 acides aminés.
2. Molécule d'ADN choisie parmi :
- (a) une molécule d'ADN qui comprend une séquence nucléotidique qui code pour un polypeptide dont la séquence peptidique commence à l'acide aminé 15 et se termine à l'acide aminé 263 de la séquence identifiée en SEQ ID NO 1, ou
- (b) une molécule d'ADN qui comprend une séquence nucléotidique qui code pour un polypeptide dont la séquence peptidique présente au moins 95%, de préférence au moins 98% et avantageusement au moins 99% d'homologie ou d'identité avec la séquence définie en (a), ou - (c) une molécule d'ADN qui comprend une séquence nucléotidique qui code pour un polypeptide dont la séquence peptidique commence à l'acide aminé 41 et se termine à l'acide aminé 263 de SEQ ID NO : 1 ou dont la séquence peptidique commence à l'acide aminé 99 et se termine à l'acide aminé 263 de SEQ ID NO : 1, ou
- (d) une molécule d'ADN qui comprend une séquence nucléotidique qui code pour un fragment de la séquence peptidique définie en (c) et qui comprend au moins 4 acides aminés, de préférence au moins 5 ou 6 acides aminés et avantageusement d'au moins 7 acides aminés, en particulier de 6 à 15 acides aminés et avantageusement de 6 à 12, de 6 à 10 ou de 8 à 12 acides aminés,
- (e) les séquences complémentaires desdites séquences (a) à (d).
3. Molécule d'ARN, caractérisée en ce qu'elle est le produit de transcription desdites séquences nucléotidiques définies en (a) à (e), selon la revendication 2 ou en ce qu'elle est le produit de transcription desdites séquences nucléotidiques selon la revendication 2.
4. Cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote inférieur permettant l'expression d'une séquence d'ADN telle que définie dans revendication 2, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression.
5. Cassette d'expression selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est fonctionnelle dans une cellule d' Escherichia coli, de Schizosaccharomyces pombe ou de Saccharomyces cerevisiae.
6. Vecteur comprenant une cassette d'expression selon la revendication 5.
7. Cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote inférieur, telle qu'une cellule à Escherichia coli, de Schizosaccharomyces pombe ou de Saccharomyces cerevisiae comprenant une cassette d'expression selon la revendication 4 ou 5 ou un vecteur selon la revendication 6.
8. Procédé pour préparer un polypeptide selon la revendication 1 qui consiste à cultiver une cellule hôte selon la revendication 7 dans un milieu de culture approprié, ladite cellule hôte étant transformée avec un vecteur d'expression qui contient une séquence nucléotidique d'ADN telle que définie dans la revendication 2 et, à purifier ledit polypeptide produit jusqu'à un degré de pureté requis.
9. Polypeptide immunogène, caractérisé en ce qu'il présente une séquence peptidique telle que définie dans la revendication 1.
10. Anticorps monoclonal ou polyclonal, caractérisé en ce qu'il est obtenu par immunisation d'un animal mammifère avec un polypeptide immunogène selon la revendication 9.
11. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un polypeptide selon la revendication 1 ou au moins un anticorps selon la revendication 10.
12. Procédé pour détecter et/ou quantifier des anticorps dirigés contre au moins un polypeptide selon la revendication 1 dans un échantillon biologique, selon lequel on met en contact l'échantillon biologique avec une composition diagnostique selon la revendication 11 dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes antigène/anticorps et on détecte et/ou quantifie la formation desdits complexes.
13. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal tel que défini dans la revendication 10.
14. Procédé pour détecter et/ou quantifier au moins un polypeptide selon la revendication 1 dans un échantillon biologique, tel qu'un fragment tissulaire de foie, du sang, du sérum, du plasma, d'un patient ou d'un animal, ou des extraits fécaux, ou de la salive, ou de l'urine, selon lequel on met en contact l'échantillon biologique avec une composition diagnostique selon la revendication 13 dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes antigène/anticorps et on détecte et/ou quantifie la formation desdits complexes.
15. Sonde, caractérisée en ce qu'elle est susceptible de s'hybrider dans des conditions de stringence déterminées à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN telle que définie dans les revendications 2 et 3.
16. Amorce, caractérisée en ce qu'elle est susceptible de s'hybrider dans des conditions de stringence déterminées à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN telle que définie dans les revendications 2 et 3.
17. Anticorps anti-acide nucléique, caractérisé en ce qu'il est susceptible de se lier à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN telle que définie dans les revendications 2 et 3.
18. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une sonde ou une amorce ou un anticorps anti-acide nucléique tel(Ie) que défini(e) dans les revendications 15, 16 et 17.
19. Procédé de diagnostic d'ADN et/ou d'ARN viral, selon lequel on prélève ou recueille un échantillon biologique, tel qu'un fragment tissulaire de foie, du sang, du sérum, du plasma d'un patient ou d'un animal, ou des extraits fécaux, ou de la salive, ou de l'urine, on traite si nécessaire ledit échantillon pour en extraite l'ADN et/ou l'ARN, on met en contact ledit échantillon avec au moins une sonde ou une amorce telle que définie dans les revendications 15 et 16, dans des conditions de stringence déterminées et on détecte la présence d'ADN et/ou d'ARN viral dans l'échantillon soit par mise en évidence d'une hybridation dudit ADN et/ou ARN viral avec au moins une sonde, soit par amplification dudit ADN et/ou ARN.
20. Procédé de diagnostic d'ADN et/ou d'ARN viral, selon lequel on prélève ou recueille un échantillon biologique, tel qu'un fragment tissulaire de foie, du sang, du sérum, du plasma d'un patient ou d'un animal, ou des extraits fécaux, ou de la salive ou de l'urine, on traite si nécessaire ledit échantillon pour en extraite l'ADN et/ou l'ARN, on met en contact ledit échantillon avec au moins un anticorps anti-acide nucléique tel que défini dans la revendication 17, ledit anticorps étant éventuellement marqué par tout marqueur approprié et on met en évidence la formation d'un complexe acide nucléique/anticorps.
21. Vecteur de thérapie, caractérisé en ce qu'il consiste en un polypeptide selon la revendication 1 ou en une molécule d'ADN selon la revendication 2, associé à une molécule d'intérêt thérapeutique, telle qu'un gène ou une protéine d'intérêt thérapeutique ou une substance pharmaceutiquement active et en ce qu'il est capable de s'introduire dans une ou des cellules cibles ex vivo, in vivo ou in vitro.
22. Composition thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle comprend, entre autres, un vecteur tel que défini dans la revendication 21.
23. Matériel biologique pour la préparation d'une composition thérapeutique, comprenant au moins une cellule, notamment une cellule ne produisant pas naturellement des protéines déterminées, sous une forme permettant son administration dans un organisme mammifère, humain ou animal, ainsi qu'éventuellement sa culture préalable, ladite cellule étant génétiquement modifiée in vitro par au moins un vecteur selon la revendication 21.
24. Cellule génétiquement modifiée, en particulier choisie parmi les cellules eucaryotes et de préférence eucaryotes supérieures humaines ou animales, transformées par au moins un vecteur selon la revendication 21.
25. Composition thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle comprend, entre autre, une cellule telle que définie dans la revendication 24.
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