CA2193997A1 - Fragments d'acide nucleique et fragments peptidiques correspondants issus du genome du virus de l'arthrite et de l'encephalite caprine (vaec) et leurs applications - Google Patents
Fragments d'acide nucleique et fragments peptidiques correspondants issus du genome du virus de l'arthrite et de l'encephalite caprine (vaec) et leurs applicationsInfo
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Abstract
Nucleotide fragments from caprine arthritis-encephalitis virus (CAEV) env gene, corresponding peptide fragments, and uses thereof in screening for viral caprine arthritis-encephalitis, are disclosed. Antibodies to peptide fragments and uses thereof for diagnosing viral arthritis-encephalitis are also disclosed. Said nucleic acid fragments code for a peptide fragment including at least one CAEV Env protein segment comprising at least one immunodominant epitope selected from the transmembrane region of said protein, and include 15255 nucleotides.
Description
~ 1 21 ~3997 WO 96/00784 PCT/~ "'Q0~8 -E RAGMI~TS D ' ACIDE N~JCI,EIQ~E ET FRAG~OENTS ~ QllES
COP~ ePONDANTS ISSUS DU GENOME DU trIRUS DE L ' ARTHRITE ET
DE L ' Eh~ r-ITE CAPRINE (~rAEC ) ET L~sunS APPLICATIONS .
La présente invention est relative à des frag-i ments nucléotidiques issus du gène env du virus del~arthrite et de l'encéphalite caprine (VAEC ou CAEV :
caprine arthritis-encephalitis virus) et aux fragments peptidiques correspondants et à leurs applications au dépistage de l'encéphalite et de l'arthrite virale caprine ; la présente invention est également relative à
des anticorps anti-fragments peptidiques ainsi qu'à leurs applications au diagnostic de l'encéphalite et de l~arthrite virale.
Le virus de l'arthrite et de l'encéphalite caprine est un lentivirus, entraînant une leucoencépha-lite chez les jeunes chèvres et une arthrite chronique clinique, chez 20 à 30 % des chèvres adultes infectées naturellement. L'arthrite est habituellement progressive et est particulièrement sévère au niveau des espaces synoviaux des articulations carpiennes.
La séquence nucléotidique de la souche VAEC-CO
a été séquencée et décrite (M. SALTARELLI et al., Virol., l990, 179, 347-364), à partir de clones infectieux, obte-nus à partir de fragments HindIII, transfectés dans des cellules de membrane synoviale de chèvre. Le génome com-prend 9189 nucléotides et inclut successivement la séquence codant pour le LTR, les séquences codant pour les différentes protéines virales : protéine Gag, pro-téine Pol, la protéine de régulation Q, la protéine Tat, les protéines d'enveloppe et la protéine Rev.
L'organisation du gène env, codant pour la glycoprotéine d'enveloppe du VAEC est similaire à celle des virus du mouton (virus VISNA) et comprend une séquence codant pour une protéine de surface (SU) et une séquence codant pour une protéine tr~ncm~mhranaire (TM), qui forment la glycoprotéine d'enveloppe.
COP~ ePONDANTS ISSUS DU GENOME DU trIRUS DE L ' ARTHRITE ET
DE L ' Eh~ r-ITE CAPRINE (~rAEC ) ET L~sunS APPLICATIONS .
La présente invention est relative à des frag-i ments nucléotidiques issus du gène env du virus del~arthrite et de l'encéphalite caprine (VAEC ou CAEV :
caprine arthritis-encephalitis virus) et aux fragments peptidiques correspondants et à leurs applications au dépistage de l'encéphalite et de l'arthrite virale caprine ; la présente invention est également relative à
des anticorps anti-fragments peptidiques ainsi qu'à leurs applications au diagnostic de l'encéphalite et de l~arthrite virale.
Le virus de l'arthrite et de l'encéphalite caprine est un lentivirus, entraînant une leucoencépha-lite chez les jeunes chèvres et une arthrite chronique clinique, chez 20 à 30 % des chèvres adultes infectées naturellement. L'arthrite est habituellement progressive et est particulièrement sévère au niveau des espaces synoviaux des articulations carpiennes.
La séquence nucléotidique de la souche VAEC-CO
a été séquencée et décrite (M. SALTARELLI et al., Virol., l990, 179, 347-364), à partir de clones infectieux, obte-nus à partir de fragments HindIII, transfectés dans des cellules de membrane synoviale de chèvre. Le génome com-prend 9189 nucléotides et inclut successivement la séquence codant pour le LTR, les séquences codant pour les différentes protéines virales : protéine Gag, pro-téine Pol, la protéine de régulation Q, la protéine Tat, les protéines d'enveloppe et la protéine Rev.
L'organisation du gène env, codant pour la glycoprotéine d'enveloppe du VAEC est similaire à celle des virus du mouton (virus VISNA) et comprend une séquence codant pour une protéine de surface (SU) et une séquence codant pour une protéine tr~ncm~mhranaire (TM), qui forment la glycoprotéine d'enveloppe.
2 21 93997 W096/00~84 ~lirk5S/00~8 ---Les protéines d~enveloppe du VAEC sont consi-dérées comme étant au centre de la relation hôte-virus ;
leur étude est donc essentielle pour comprendre l'interaction du virus avec le système ;mml~n; taire (épitopes neutralisants, épitopes B et T) et avec les cellules-cibles de l'infection et pour mettre au point des réactifs de diagnostic performants.
La sévérité de la maladie chez les animaux infectés semble directement corrélée au taux d'anticorps anti-protéine d'enveloppe virale (Env), et en particulier au taux d'an~icorps anti-protéine trAnsm~mhranaire (TM) et/ou au taux d'anticorps anti-protéine de surface (SU) de ladite protéine d'enveloppe Env (T.C. McGUIRE et al.
J. Virol., 1992, 66, 5, 3247-3250 ; D.P. KNOWLES et al., 1991, J. Virol., 1991, 65, 11, 5744-5750).
En effet, la réponse immune à l'antigène viral joue un rôle important dans l'inflammation des articula-tions (en particulier, l'inflam.mation des espaces syno-viaux des articulations carpiennes), notAmm~nt en raison d~une infiltration massive desdites articulations par des lymphocytes, plasmocytes et macrophages et par une accu-mulation d~anticorps dirigés contre la protéine Env.
En particulier, les sérums, présentant un titre important vis-à-vis des glycoprotéines TM monomé-rique (38 kDa) et oligomérique, se retrouvent chez leschèvres présentant une arthrite progressive (D.P. KNOWIES
et al., J. Virol., 1990, 64, 2396-2398).
En outre, les chèvres, vaccinées avec du virus de l~arthrite et de l'encéphalite caprine inactivé, déve-loppent une arthrite plus sévère, après infection enlaboratoire, ~ue les animaux contrôles (McGUIRE et al., J. Vet. Res., 1986, 47, s37-s40).
Il est donc crucial d~établir une surveillance constante des troupeaux, afin d'éviter la propagation de la mAl~;e, en particulier en excluant le plus rapidement possible les animaux malades.
leur étude est donc essentielle pour comprendre l'interaction du virus avec le système ;mml~n; taire (épitopes neutralisants, épitopes B et T) et avec les cellules-cibles de l'infection et pour mettre au point des réactifs de diagnostic performants.
La sévérité de la maladie chez les animaux infectés semble directement corrélée au taux d'anticorps anti-protéine d'enveloppe virale (Env), et en particulier au taux d'an~icorps anti-protéine trAnsm~mhranaire (TM) et/ou au taux d'anticorps anti-protéine de surface (SU) de ladite protéine d'enveloppe Env (T.C. McGUIRE et al.
J. Virol., 1992, 66, 5, 3247-3250 ; D.P. KNOWLES et al., 1991, J. Virol., 1991, 65, 11, 5744-5750).
En effet, la réponse immune à l'antigène viral joue un rôle important dans l'inflammation des articula-tions (en particulier, l'inflam.mation des espaces syno-viaux des articulations carpiennes), notAmm~nt en raison d~une infiltration massive desdites articulations par des lymphocytes, plasmocytes et macrophages et par une accu-mulation d~anticorps dirigés contre la protéine Env.
En particulier, les sérums, présentant un titre important vis-à-vis des glycoprotéines TM monomé-rique (38 kDa) et oligomérique, se retrouvent chez leschèvres présentant une arthrite progressive (D.P. KNOWIES
et al., J. Virol., 1990, 64, 2396-2398).
En outre, les chèvres, vaccinées avec du virus de l~arthrite et de l'encéphalite caprine inactivé, déve-loppent une arthrite plus sévère, après infection enlaboratoire, ~ue les animaux contrôles (McGUIRE et al., J. Vet. Res., 1986, 47, s37-s40).
Il est donc crucial d~établir une surveillance constante des troupeaux, afin d'éviter la propagation de la mAl~;e, en particulier en excluant le plus rapidement possible les animaux malades.
3 21 93q97 - ~ w096/00784 P~ h5~0~q8 A l'heure actuelle, l'arthrite à VAEC est essentiellement diagnostiquée à l'aide de tests sérolo-giques, basés sur une préparation de virus entier ; de tels tests présentent l'inconvénient d'être difficiles à
préparer et d'être coûteux ; ils nécessitent également une mise au point particulièrement délicate (problème de stAn~Ardisation~ et peuvent, en outre, entraîner des réactions faussement négatives et/ou des réactions faus-sement positives.
Il existe également d'autres tests ~tests ELISA), utilisant des protéines recombinantes Gag ; de tels tests présentent également l'inconvénient d~entrainer des réactions faussement négatives et/ou faussement positives et créent, en outre, des problèmes de bruit de fond.
Or, il est absolument crucial de disposer d'un test fiable et peu coûteux, de manière à pouvoir tester l'ensemble des troupeaux, pour éviter une contagion mas-sive (notamment par le lait) (pLGy~&,~.,e d'éradication).
La présente invention s'est, en conséquence, donné pour but de pourvoir à des réactifs aptes à dépis-ter l'arthrite à VAEC, qui r~pon~nt mieux aux besoins de la pratique, notAmm~nt en permettant la mise au point de tests diagnostics hautement spécifiques (absence de faux-positifs et de faux négatifs) ne comportant en outre au-cun risque pour l'utilisateur et permettant un dépistage rapide de l'ensemble des troupeaux.
La présente invention a pour objet des frag-ments d'acide nucléique, caractérisés en ce qu'ils codent pour un fragment peptidique incluant au moins un segment de protéine Env du VAEC comprenant au moins un épitope immuno~ominAnt et sélectionné dans la région trAncm~mhra-naire de ladite protéine, lesquels fragments d~acide nu-cléique comprennent entre 15 et 255 nucléotides.
Parmi ces fragments d~acide nucléique, on peut citer :
W096/00784 2 1 q 3 q 9 7 ~1irh5~/00848 - un fragment, correspondant aux positions 8003-8163 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence TAAGGCAGCTGTCCAGACCCTTGCTAATGCAACTGCTGCACAGCAGGA
~ ~llAGAGGCAACCTATGCCATGGTACAGCATGTGGCTAAAGGCGTACGAATCTT
~SEQ ID n~l), et codant pour un fragment peptidique dénommé G1 ;
- un fragment, correspondant aux positions 8019-8264 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, et codant pour un fragm.ent peptidique ~nomm~ G2 ;
- un fragment, correspondant aux positions 7991-8107 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, et codant pour un fragment peptidique dénommé G3 ;
- un fragment, correspondant aux positions lS 8204-8360 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence TACAA~AACA~-~AGTAGCAAAATATATCAATTGGACGAGGTTTAAGGA
TAATTGCACATGGCAGCAGTGGGAGAGAGGATTACAGGGGTATGATACAAACTTAAC
AATA~l~llAAAGGAATCAGCAGCAATGACACAACTAGCAGAAGAGCAAGCA (SEQ
ID n~2), et codant pour un fragment peptidique ~no G4 ;
- un fragment, correspondant aux positions 8090-8259 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence TAAAGGCGTACGAATCTTGGAAGCTCGAGTGGCTCGAGTGGAAGCTAT
CACAGATAGAATAATGCTATACCAAGAATTGGAll~llGGCACTATCATCAATACTG
TATAACCTCTACAAAAACAGAAGTAGCAAAATATATCAATTGGACGAGGTTTAAGGA
TAATTGCA (SEQ ID n~3), et codant pour un fragment peptidique dénommé G5 ;
- un fragment, correspondant aux positions 8049-8093 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence GAl~l~llAGAGGCAACCTATGCCATGGTACAGCATGTGGCTAAA
(SEQ ID n~4), et codant pour un fragment peptidique ~énomm~ TM1 ;
- un fragment, correspondant aux positions 8130-8165 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence GAAGCTATCACAGATAGAATAATGCTATACCAAGAA (SEQ ID
n~5) et codant pour un fragment peptidique dénommé TM2 ;
21 93q97 W096/00784 PCT~5/00848 - un fragment, correspondant aux positions 8160-8204 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence CAAGAATTGGAll~llGGCACTATCATCAATACTGTATAACCTCT
(SEQ ID n~6) et codant pour un fragment peptidique 5 dénommé TM3 ; et - un fragment, correspondant aux positions 8256-8297 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence TGCACATGGCAGCAGTGGGAGAGAGGATTACAGGGGTATGAT (SEQ
ID n~7) et codant pour un fragment peptidique dénommé
~ 10 TM4.
La présente invention a également pour objet un fragment peptidique, caractérisé en ce qu'il inclut au moins un segment de protéine Env du VAEC, sélectionné
dans la région tr~n~m~mhranaire de ladite protéine, com-prenant entre 5 et 85 aminoacides et au moins un épitopeimmllnodom;nAnt, et en ce qu~il est reconnu par au moins 60 % d'anticorps produits lors d'une infection et/ou lors d~une inoculation par une souche du VAEC.
On entend par épitope, au sens de la présente invention, les épitopes spécifiques de groupe, c'est-à-dire cn~mnn-~ à toutes les souches du VAEC (zones conser-vées), reconnus par les anticorps dirigés contre toutes les souches de VAEC (reconnaissance de groupe).
Parmi ces fragments peptidiques, l'invention englobe entre autre :
- un fragment incluant un segment de 53 aminoacides, dénommé G1, et qui correspond aux positions 665-717 de la protéine Env du VAEC ;
- un fragment incluant un segment de 82 aminoacides, dénommé G2, et qui correspond aux positions 670-751 de ladite protéine Env ;
- un fragment incluant un segment de 38 ami-noacides, dénommé G3, et qui correspond aux positions 661-698 de ladite protéine Env ;
- un fragment incluant un segment de 52 am.~i-noacides, dénommé G4, et qui correspond aux positions 732-783 de la protéine Env ;
W096l00784 PCT~5100848 -.
- un fragment incluant un segment de 56 ami-noacides, dénommé G5, et qui correspond aux positions 694-749 de ladite protéine Env ;
- un fragment incluant un segment de 15 aminoacides, dénommé TMl, et qui correspond aux positions 680-694 de la séquence de la protéine Env du VAEC et dont la formule est :
Asp-Val-Leu-Glu-Ala-Thr-Tyr-Ala-Met-Val-Gln-His-Val-Ala-Lys (SEQ ID n~8) ;
- un fragment incluant un segment de 12 aminoacides, dénommé TM2, et qui correspond aux positions 707-718 de la séquence de la protéine Env du VAEC et dont la formule est :
Glu-Ala-Ile-Thr-Asp-Arg-Ile-Met-Leu-Tyr-Gln-Glu (SEQ ID
n~9) ;
- un fragment incluant un segment de 15 aminoacides, dénommé TM3, et qui correspond aux positions 717-731 de ladite protéine Env, lequel segment présente la séquence :
Xaa-Glu-Leu-Asp-Cys-Trp-His-Tyr-Xaa-Xaa-Tyr-Cys-Xaa-Thr-Ser (SEQ ID n~10), dans laquelle l'aminoacide Xaa en position 1, 9 et 10 représente His ou Gln, l'aminoacide Xaa en position 13 représente Ile ou Val ; de préférence,~ lorsque l'aminoacide Xaa en position 9 représente His, l~aminoacide Xaa en position 10 et l'aminoacide Xaa en position 1 représentent Gln et l'aminoacide Xaa en position 13 représente Ile et lorsque l'aminoacide Xaa en position 9 représente Gln, l'aminoacide Xaa en position 10 et l'aminoacide Xaa en position 1 représentent His et l~aminoacide Xaa en position 13 représente Val ;
- un fragment incluant un segment de 14 aminoacides, dénommé TM4, et qui correspond aux positions 749-762 de ladite protéine Env, lequel segment présente la séquence :
Cys-Thr-Trp-Gln-Gln-Trp-Glu-Arg-Glu-Leu-Gln-Gly-Tyr-Asp (SEQ ID n~ll).
~_ W096/00784 2 1 q 3 9 ~ 7 P~''l/r'h95/00848 De manière inattendue, l'ensemble des sé-quences définies ci-dessus permettent un dépistage spé-cifique et sensible d'une infection à VAEC.
Egalement de manière inattendue, parmi ces fragments, les fragments peptidiques G5 ou TM3 et G4 ou TM4 présentent une corrélation significativement élevée avec le développement de la maladie et servent donc de marqueurs particulièrement spécifiques pour le diagnostic de l'infection au VAEC i les fragments peptidiques G5 ou TM3 servent également de marqueurs pour le diagnostic de l'infection à VISNA.
Au sens de la présente invention, le terme fragment peptidique, comprend tous les fragments incluant un segment de peptides tel que défini ci-dessus, ainsi que les peptides homologues ; de manière générale, on en-tend par peptides homologues, les fragments peptidiques dont la position et la fonction sont équivalentes, au sein du VAEC (même localisation que celle définie ci-des-sus, sur le génome du VAEC).
L'ensemble desdits peptides peut avantageuse-ment être obtenu soit par clonage, soit par synthèse, no-tAmm~nt par synthèse de Merrifield.
La présente invention a également pour objet des anticorps anti-VAEC, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des anticorps spécifiques d'au moins un fragment peptidique issu de la zone trAn.~m~mhranaire de la protéine Env de VAEC, conforme à 1'invention.
La présente invention a également pour objet un procédé de dépistage d'une infection à VAEC et/ou à
VISNA, caractérisé en ce qu~il consiste à détecter les anticorps, éventuellement présents dans un échantillon biologique, à l'aide d'au moins un peptide ou fragment de peptides conforme à l'invention, éventuellement fixé sur ~ un support solide approprié, en mettant en présence ledit échantillon biologique avec ledit/lesdits peptide(s) ou fragment(s) de peptides, auxquels se lient les anticorps, si de tels anticorps sont présents dans l'échantillon à
' W096/00784 8 2 ! 9 3 9 9 7 PCT~5/00848 --analyser, la lecture du résultat étant révélée par un moyen approprié, not~mm~nt EIA, RIA, fluorescence.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du-dit procédé, le peptide est choisi parmi TM3 et TM4 ou un mélange de ceux-ci.
La présente invention a, également, pour objet un procédé de dépistage d'une infection à VAEC, caracté-risé en ce qu'un échantillon biologique convenablement traité pour extraire l'ADN et/ou les produits de trans-cription du VAEC :
(l) est mis en contact avec au moins un frag-ment nucléotidique tel que défini ci-dessus, (2) après quoi, l'hybride formé est détecté.
De manière avantageuse, préalablement à
l'étape (l), ledit ADN peut être amplifié.
La présente invention a également pour objet un procédé de dépistage d'une infection à VAEC, caracté-risé en ce qu'il consiste à détecter les glycoprotéines d'enveloppe du VAEC, en mettant en présence un échantil-lon biologique à tester avec au moins un anticorps anti-peptide conforme à l'invention, la lecture du résultat étant révélée par un moyen approprié.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se ré-fère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l~objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
W096/00784 9 2 1 93997 PCTn~5/00848 ~LE 1 : Peptides conformes à l'invention.
1) Construction d'une banque d'expression des peptides conformes à l'invention :
a) Clonage du gène env :
Le gène env est obtenu à partir d'un clone in-fectieux du VAEC-CO (M. SALTARELLI et al., Virology, 1990, 179, 347-364).
Les positions nucléotidiques et aminoacides, qui définissent les différentes régions env précitées, correspondent aux positions des séquences telles que pu-bliées dans cette référence.
Le clone du VAEC-CO consiste en deux plas-mides, l'un contenant une grande partie du génome du VAEC-CO à partir du 5'-LTR et le deuxième contenant un insert court de 321 pb, comprenant les séquences codant pour la partie C-termln~le de Env et la partie 3' du LTR
viral.
Pour générer un plasmide contenant la région codant pour la protéine Env entière, le fragment SmaI-HindIII du VAEC-CO est sous-cloné dans le plasmide pUC18, ainsi que le fragment HindIII-HindIII de 321 pb ; on obtient une construction ~nommée pUC18 env 3.1. (figure 1) . .
b) Construction de la banque d'expression ~gtll :
Le plasmide pUC18 env 3.1 est soumis à une digestion partielle à l'ADNase I à 15~C (15 pg/ml d'ADNase I dans du Tris-HCl, pH 7,4 en présence de MgC12, 1,5 mM, pendant 20 min), de manière à obtenir différents fragments d'ADN, d'environ 200 pb.
Ces différents fragments sont traités avec le fragment de Klenow de l'ADNase polymérase d'E. coli, de manière à obtenir des extrémités à bouts francs, pour une ligature efficace avec des séquences de liaison EcoRI de 10 paires de base (pb) (Pharmacia).
W096/00784 l0 2 1 93q97 pCTn~5l00848 --Le marquage au phosphore 32 des fragments d'ADN permet le contrôle des étapes ultérieures.
Les produits de la ligature sont alors digérés avec llenzyme de restriction EcoRI et séparés par élec-trophorèse dans des gels d'agarose LMP NUSieve~ 2 %, demanière à sélectionner un ensemble de fragments compre-nant entre 100 et 200 pb et à éliminer les séquences de liaison libres.
Les fragments sélectionnés sont extraits au phénol à partir de l'agarose ; on insère ensuite les dif-férents fragments obtenus dans le site EcoRI du phage ~gtll.
Les produits de la ligature (phages recombi-nants) sont alors empaquetés in ~i tro. Une banque de 3.106 phages est ainsi constituée.
On obtient ainsi une banque d'expression de peptides Env de VAEC, fusionnés à la ~-galactosidase, et exprimés dans E. col i, en utilisant le vecteur ~gtll.
Un échantillon de la banque ~gtll est inoculé
sur la souche de E. coli Y1090 à une dilution représen-tant 104 phages par boite de 90 cm de diamètre.
L'induction de l'expression de la protéine sous contrôle du promoteur Lac est déclenchée à 42~C, en présence d'isopropyl-thio-~-galactosidase (IPTG). Les phages recombinants sont sélectionnés par l'absence de coloration bleue des plaques de lyse.
c) Contrôle des peptides obtenus : -Les phages ~gtll recombinants permettent l'expression des fragments de gènes env sous le contrôle du promoteur Lac, après fusion de 1'ADN env avec le gène de la ~-galactosidase de E. col i .
Pour contrôler la qualité de ladite banque, et également obtenir un titre plus important, 40 plaques ont été isolées et analysées par PCR, en utilisant des W096/00784 11 2 ! 9 3~ q 7 PCTn~5/00848 amorces ~gtll complémentaires, spécifiques de la portion ~-galactosidase de la matrice ~gtll comme suit :
un total de 10 ~1 de lysat de phage est dilué
dans 60 ~1 d'eau et porté à ébullition pendant 10 min.
Après microcentrifugation, 15 ~1 du surnageant sont ajou-tés à 85 ~l d'un mélange PCR contenant 50 pM de chaque amorce, 10 nM de chaque désoxynucléoside triphosphate et 0,5 U de Taq polymérase (Perkin-Elmer-Cetus), dans une solution de Tris-HCl 10 mM, KCl 50 mM et MgC12 2 mM.
Les amorces ~gtll utilisées sont, comme pré-cisé ci-dessus, complémentaires de la portion ~-galacto-sidase de la matrice ~gtll, à savoir :
5'GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG 3' (amorce sens) (SEQ ID N~ 12) 5'TTGACACCAGACCAACTGGTAATG 3' (amorce anti-sens) (SEQ ID N~ 13).
La PCR comprend 32 cycles (cycle 1 : 94~C, 2 min ; cycles 2 à 31 : 94~C, 15 sec./55~C, 30 sec./72~C, 30 sec. ; cycle 32 : 72~C, 3 min).
Les produits de l'amplification montrent que l'on obtient des inserts de différentes tailles, compre-nant entre 130 et 250 pb.
Ces fragments amplifiés par PCR sont ensuite hybridés avec trois fragments NcoI radioactifs marqués au phosphore 32, représentant la séquence Env de VAEC-CO
entière (sonde 1 : 6071-6456, sonde 2 : 6457-8071, sonde 3 : 8072~8712), indiquant que la banque est repré-sentative du gène env entier.
2) Criblage de 1A bAnqUe :
La banque env ~gtll est criblée en utilisant les sérums de 3 chèvres, naturellement infectées, et ayant un titre élevé en protéines Gag de VAEC, par test ELISA.
W096/00784 2 1 Y 3 S q 7 PCTn~5/00~8 La sonde E. col i YlO90 est infectée par 3xlO4 PFU de la banque originale non amplifiée, étalée sur plaques et incubée à 42~C pendant 4 heures.
Les plaques sont alors recouvertes de filtres de nitrocellulose, saturés avec de l'IPTG lO mM et incu-bées pendant 3 heures à 37~C, de manière à ' n~tl; re l'expression de la protéine de fusion, ~-galactosidase-peptide Env.
Les filtres sont traités pour un criblage im-munologique avec des sérums de 3 chèvres par incubationséparée (2 filtres par sérum), en utilisant des méthodes st~n~rd, telle que la procédure au lait dégraissé
(MANIATIS).
Ce criblage permet d'isoler 5 clones fortement immunoréactifs, qui sont séquencés selon le protocole suivant :
les produits de la PCR sont séparés sur gel d~agarose à l,8 % et purifiés à l'aide de billes QIAEX~
(Qiagen~), selon les instructions du fabricant.
Un total de 1 ~l de diméthylsulfoxyde ~DMSO) et de 20 pM soit d'amorce sens, soit d'amorce anti-sens, sont ajoutés dans un volume final de lO ~l.
Ce mélange est dénaturé à 100~C, pendant 12 min, et ;mmé~;atement transféré dans un bain glacé de méthanol.
l ~l de dithiothréitol (O,l M), 0,2 ~l dGTP
(UBS), 0,5 ~l de [35S]ATP (600 Ci/m~M), 0,6~1 de DMSO, 3,8 ~l de dH20 et 0,2 ~l de Séquénase (UBS) sont ajoutés.
Les échantillons sont incubés à température ambiante pendant l min, puis pendant 15 min à 37~C.
W096l00784 2 1 ~ 3 9 q 7 PCTl~h5s/oo~q8 Les séquences de ces 5 inserts, à savoir :
Nom du Positions sur la sé- positions sur la pro-fragmentquence d'acide nu- téine Env cléique Gl 8003-8163 665-~17 sont compr-ses dans la région extracellulaire de TM.
Ces résultats indiquent l'immuno~om;n~nce et i la conservation de ces ~omA;nes entre les différents iso-lats viraux.
3) Carte des épito~es immunodom;n~nts TM
conformes à l'invent;on :
a) Protocole :
Une analyse Pepscan~ est réalisée de manière à définir précisément les épitopes TM ;mmllnoréactifs.
Des décapeptides chevauchants couvrant les sé-quences comprises entre les positions 8022 et 8327 de la protéine Env du VAEC ont été synthétisés.
lS Un essai ;mml~noenzymatique a été réalisé
conform~m~nt aux instructions du fabricant (Cambridge Research Biochemicals), en utilisant les sérums provenant de 7 chèvres (dilution 1:100).
sérums proviennent de chèvres infectées naturellement avec des souches de VAEC, un sérum provient d'une chèvre infectée expérimentalement avec le VAEC-CO, et un sérum correspond à un pool de 4 sérums provenant de chèvres infectées expérimentalement' avec le virus de l'arthrite-encéphalite caprine-CO.
La réaction est détectée par incubation en présence d'Ig de lapin anti-chèvre conjuguées à de la peroxydase (Sigma), diluée au 1:20000 ou en présence d~anticorps monoclonal conjugué à de la peroxydase (Chekit~) dilué au 1:200, suivie par une révélation à
l~aide de 2,2'-azino-bis(3-éthylbenz-thiazoline-6-acide sulfonique (ABTS, Sigma).
W096100784 2 9 3 9 q 7 PCT/~K5S~E1B
b) Résultats :
- TMl, TM2 et TM4 :
Il ressort de ces essais que 3 groupes de pep-tides chevauchants sont réactifs et définissent trois 3 épitopes différents conformément à la figure 2, qui com-prend en abscisse les différents fragments chevauchant étudiés et en ordonnée, la densité optique à 405 nm (figure 2A) ainsi que la position des peptides immuno-réactifs sur la séquence (figure 2B).
Ces peptides correspondent à TMl, TM2 et TM4.
- TM3 :
De manière surprenante, la région contenant les deux cystéines conservées, connue pour former une structure immuno~om;nAnte et conservée chez différents lentivirus, ne réagit pas avec les sérums testés, mais le peptide TM3, comprenant cette région, a néanmoins été
synthétisé.
Un autre peptide, avec la même séquence, mais chimiquement cyclisé par un lien covalent entre les deux cystéines a également été préparé (TM3c), de manière à
reproduire une structure en boucle, considérée comme de-vant exister dans la protéine TM native.
Un pool de sérums provenant de 30 chèvres est testé en ELISA pour sa réactivité à TM3 et à TM3c.
Tous les sérums reconnaissent les deux pep-tides, il n'existe donc aucune différence significative entre TM3 et TM3c, de telle sorte que les autres expé-riences ont été réalisées uniquement avec TM3c.
L'épitope TM3 est localisé dans la région env la plus conservée, alors que les séquences correspondant à TMl, TM2 et TM4 présentent des variations (figure 3A).
L'étude comparative et l'alignement des sé-quences TM immuno~minAntes avec 3 clones moléculaires MAEDI-VISNA très proches montrent une forte similarité de la région TM3 par rapport à celle de la protéine Env en-tière (figure 3B).
W096/00784 i 2 1 9 39 97 P~ 5J~c~q8 De plus, il existe une bonne corrélation entre le pourcentage de similarité et la réactivité sérologique des 4 peptides. En fait, la réactivité la plus large du peptide TM3, qui est compris dans la protéine de fusion G5, confirme que cet épitope est localisé dans une région hautement conservée, comme cela est le cas dans les épi-topes correspondants, d'autres lentivirus.
TM4 correspond également à une région conservée. Inversement, le ~om~; ne G1 qui contient les épitopes TM1 et TM2, semble plus variable.
~LE 2 : Test de,dépistage d'une infection à VAEC.
I - Analyse par immllnoblot.
a) Protocole :
Les ~om~ lnes se liant aux anticorps, à sa-voir : G1 : 8003-8163, G4 : 8204-8360 et G5 : 8090-8259 ont été exprimés sous forme de protéines de fusion avec la ~-galactosidase dans les bactéries E. coli lyso-géniques Y1089, comme précisé ci-dessus.
Les lysats de bactéries contenant les pro-téines de fusion ont été préparés à partir de culture lysogénique-HPTG.
Les lysats (40 ~g/puits) sont séparés dans des gels SDS-PAGE (sodium dodécylsulfate-polyacrylamide) à
10 % et transférés sur filtres de nitrocellulose.
Les sites non spécifiques sont bloqués par in-cubation avec du lait dégraissé à 3 % dans un tampon Tris-HCl (10 mM), NaCl (150 mM) et Tween 20 (0,1 %).
Les h~n~P5 de nitrocellulose sont incubées avec un sérum de chèvre dilué au 1:100/1:800 pendant une nuit à 4~C.
La liaison avec l'anticorps est révélée par incubation avec de la protéine G conjuguée à de la per-oxydase, diluée au 1:5 000, suivie par une révélation au
préparer et d'être coûteux ; ils nécessitent également une mise au point particulièrement délicate (problème de stAn~Ardisation~ et peuvent, en outre, entraîner des réactions faussement négatives et/ou des réactions faus-sement positives.
Il existe également d'autres tests ~tests ELISA), utilisant des protéines recombinantes Gag ; de tels tests présentent également l'inconvénient d~entrainer des réactions faussement négatives et/ou faussement positives et créent, en outre, des problèmes de bruit de fond.
Or, il est absolument crucial de disposer d'un test fiable et peu coûteux, de manière à pouvoir tester l'ensemble des troupeaux, pour éviter une contagion mas-sive (notamment par le lait) (pLGy~&,~.,e d'éradication).
La présente invention s'est, en conséquence, donné pour but de pourvoir à des réactifs aptes à dépis-ter l'arthrite à VAEC, qui r~pon~nt mieux aux besoins de la pratique, notAmm~nt en permettant la mise au point de tests diagnostics hautement spécifiques (absence de faux-positifs et de faux négatifs) ne comportant en outre au-cun risque pour l'utilisateur et permettant un dépistage rapide de l'ensemble des troupeaux.
La présente invention a pour objet des frag-ments d'acide nucléique, caractérisés en ce qu'ils codent pour un fragment peptidique incluant au moins un segment de protéine Env du VAEC comprenant au moins un épitope immuno~ominAnt et sélectionné dans la région trAncm~mhra-naire de ladite protéine, lesquels fragments d~acide nu-cléique comprennent entre 15 et 255 nucléotides.
Parmi ces fragments d~acide nucléique, on peut citer :
W096/00784 2 1 q 3 q 9 7 ~1irh5~/00848 - un fragment, correspondant aux positions 8003-8163 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence TAAGGCAGCTGTCCAGACCCTTGCTAATGCAACTGCTGCACAGCAGGA
~ ~llAGAGGCAACCTATGCCATGGTACAGCATGTGGCTAAAGGCGTACGAATCTT
~SEQ ID n~l), et codant pour un fragment peptidique dénommé G1 ;
- un fragment, correspondant aux positions 8019-8264 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, et codant pour un fragm.ent peptidique ~nomm~ G2 ;
- un fragment, correspondant aux positions 7991-8107 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, et codant pour un fragment peptidique dénommé G3 ;
- un fragment, correspondant aux positions lS 8204-8360 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence TACAA~AACA~-~AGTAGCAAAATATATCAATTGGACGAGGTTTAAGGA
TAATTGCACATGGCAGCAGTGGGAGAGAGGATTACAGGGGTATGATACAAACTTAAC
AATA~l~llAAAGGAATCAGCAGCAATGACACAACTAGCAGAAGAGCAAGCA (SEQ
ID n~2), et codant pour un fragment peptidique ~no G4 ;
- un fragment, correspondant aux positions 8090-8259 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence TAAAGGCGTACGAATCTTGGAAGCTCGAGTGGCTCGAGTGGAAGCTAT
CACAGATAGAATAATGCTATACCAAGAATTGGAll~llGGCACTATCATCAATACTG
TATAACCTCTACAAAAACAGAAGTAGCAAAATATATCAATTGGACGAGGTTTAAGGA
TAATTGCA (SEQ ID n~3), et codant pour un fragment peptidique dénommé G5 ;
- un fragment, correspondant aux positions 8049-8093 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence GAl~l~llAGAGGCAACCTATGCCATGGTACAGCATGTGGCTAAA
(SEQ ID n~4), et codant pour un fragment peptidique ~énomm~ TM1 ;
- un fragment, correspondant aux positions 8130-8165 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence GAAGCTATCACAGATAGAATAATGCTATACCAAGAA (SEQ ID
n~5) et codant pour un fragment peptidique dénommé TM2 ;
21 93q97 W096/00784 PCT~5/00848 - un fragment, correspondant aux positions 8160-8204 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence CAAGAATTGGAll~llGGCACTATCATCAATACTGTATAACCTCT
(SEQ ID n~6) et codant pour un fragment peptidique 5 dénommé TM3 ; et - un fragment, correspondant aux positions 8256-8297 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence TGCACATGGCAGCAGTGGGAGAGAGGATTACAGGGGTATGAT (SEQ
ID n~7) et codant pour un fragment peptidique dénommé
~ 10 TM4.
La présente invention a également pour objet un fragment peptidique, caractérisé en ce qu'il inclut au moins un segment de protéine Env du VAEC, sélectionné
dans la région tr~n~m~mhranaire de ladite protéine, com-prenant entre 5 et 85 aminoacides et au moins un épitopeimmllnodom;nAnt, et en ce qu~il est reconnu par au moins 60 % d'anticorps produits lors d'une infection et/ou lors d~une inoculation par une souche du VAEC.
On entend par épitope, au sens de la présente invention, les épitopes spécifiques de groupe, c'est-à-dire cn~mnn-~ à toutes les souches du VAEC (zones conser-vées), reconnus par les anticorps dirigés contre toutes les souches de VAEC (reconnaissance de groupe).
Parmi ces fragments peptidiques, l'invention englobe entre autre :
- un fragment incluant un segment de 53 aminoacides, dénommé G1, et qui correspond aux positions 665-717 de la protéine Env du VAEC ;
- un fragment incluant un segment de 82 aminoacides, dénommé G2, et qui correspond aux positions 670-751 de ladite protéine Env ;
- un fragment incluant un segment de 38 ami-noacides, dénommé G3, et qui correspond aux positions 661-698 de ladite protéine Env ;
- un fragment incluant un segment de 52 am.~i-noacides, dénommé G4, et qui correspond aux positions 732-783 de la protéine Env ;
W096l00784 PCT~5100848 -.
- un fragment incluant un segment de 56 ami-noacides, dénommé G5, et qui correspond aux positions 694-749 de ladite protéine Env ;
- un fragment incluant un segment de 15 aminoacides, dénommé TMl, et qui correspond aux positions 680-694 de la séquence de la protéine Env du VAEC et dont la formule est :
Asp-Val-Leu-Glu-Ala-Thr-Tyr-Ala-Met-Val-Gln-His-Val-Ala-Lys (SEQ ID n~8) ;
- un fragment incluant un segment de 12 aminoacides, dénommé TM2, et qui correspond aux positions 707-718 de la séquence de la protéine Env du VAEC et dont la formule est :
Glu-Ala-Ile-Thr-Asp-Arg-Ile-Met-Leu-Tyr-Gln-Glu (SEQ ID
n~9) ;
- un fragment incluant un segment de 15 aminoacides, dénommé TM3, et qui correspond aux positions 717-731 de ladite protéine Env, lequel segment présente la séquence :
Xaa-Glu-Leu-Asp-Cys-Trp-His-Tyr-Xaa-Xaa-Tyr-Cys-Xaa-Thr-Ser (SEQ ID n~10), dans laquelle l'aminoacide Xaa en position 1, 9 et 10 représente His ou Gln, l'aminoacide Xaa en position 13 représente Ile ou Val ; de préférence,~ lorsque l'aminoacide Xaa en position 9 représente His, l~aminoacide Xaa en position 10 et l'aminoacide Xaa en position 1 représentent Gln et l'aminoacide Xaa en position 13 représente Ile et lorsque l'aminoacide Xaa en position 9 représente Gln, l'aminoacide Xaa en position 10 et l'aminoacide Xaa en position 1 représentent His et l~aminoacide Xaa en position 13 représente Val ;
- un fragment incluant un segment de 14 aminoacides, dénommé TM4, et qui correspond aux positions 749-762 de ladite protéine Env, lequel segment présente la séquence :
Cys-Thr-Trp-Gln-Gln-Trp-Glu-Arg-Glu-Leu-Gln-Gly-Tyr-Asp (SEQ ID n~ll).
~_ W096/00784 2 1 q 3 9 ~ 7 P~''l/r'h95/00848 De manière inattendue, l'ensemble des sé-quences définies ci-dessus permettent un dépistage spé-cifique et sensible d'une infection à VAEC.
Egalement de manière inattendue, parmi ces fragments, les fragments peptidiques G5 ou TM3 et G4 ou TM4 présentent une corrélation significativement élevée avec le développement de la maladie et servent donc de marqueurs particulièrement spécifiques pour le diagnostic de l'infection au VAEC i les fragments peptidiques G5 ou TM3 servent également de marqueurs pour le diagnostic de l'infection à VISNA.
Au sens de la présente invention, le terme fragment peptidique, comprend tous les fragments incluant un segment de peptides tel que défini ci-dessus, ainsi que les peptides homologues ; de manière générale, on en-tend par peptides homologues, les fragments peptidiques dont la position et la fonction sont équivalentes, au sein du VAEC (même localisation que celle définie ci-des-sus, sur le génome du VAEC).
L'ensemble desdits peptides peut avantageuse-ment être obtenu soit par clonage, soit par synthèse, no-tAmm~nt par synthèse de Merrifield.
La présente invention a également pour objet des anticorps anti-VAEC, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des anticorps spécifiques d'au moins un fragment peptidique issu de la zone trAn.~m~mhranaire de la protéine Env de VAEC, conforme à 1'invention.
La présente invention a également pour objet un procédé de dépistage d'une infection à VAEC et/ou à
VISNA, caractérisé en ce qu~il consiste à détecter les anticorps, éventuellement présents dans un échantillon biologique, à l'aide d'au moins un peptide ou fragment de peptides conforme à l'invention, éventuellement fixé sur ~ un support solide approprié, en mettant en présence ledit échantillon biologique avec ledit/lesdits peptide(s) ou fragment(s) de peptides, auxquels se lient les anticorps, si de tels anticorps sont présents dans l'échantillon à
' W096/00784 8 2 ! 9 3 9 9 7 PCT~5/00848 --analyser, la lecture du résultat étant révélée par un moyen approprié, not~mm~nt EIA, RIA, fluorescence.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du-dit procédé, le peptide est choisi parmi TM3 et TM4 ou un mélange de ceux-ci.
La présente invention a, également, pour objet un procédé de dépistage d'une infection à VAEC, caracté-risé en ce qu'un échantillon biologique convenablement traité pour extraire l'ADN et/ou les produits de trans-cription du VAEC :
(l) est mis en contact avec au moins un frag-ment nucléotidique tel que défini ci-dessus, (2) après quoi, l'hybride formé est détecté.
De manière avantageuse, préalablement à
l'étape (l), ledit ADN peut être amplifié.
La présente invention a également pour objet un procédé de dépistage d'une infection à VAEC, caracté-risé en ce qu'il consiste à détecter les glycoprotéines d'enveloppe du VAEC, en mettant en présence un échantil-lon biologique à tester avec au moins un anticorps anti-peptide conforme à l'invention, la lecture du résultat étant révélée par un moyen approprié.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se ré-fère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l~objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
W096/00784 9 2 1 93997 PCTn~5/00848 ~LE 1 : Peptides conformes à l'invention.
1) Construction d'une banque d'expression des peptides conformes à l'invention :
a) Clonage du gène env :
Le gène env est obtenu à partir d'un clone in-fectieux du VAEC-CO (M. SALTARELLI et al., Virology, 1990, 179, 347-364).
Les positions nucléotidiques et aminoacides, qui définissent les différentes régions env précitées, correspondent aux positions des séquences telles que pu-bliées dans cette référence.
Le clone du VAEC-CO consiste en deux plas-mides, l'un contenant une grande partie du génome du VAEC-CO à partir du 5'-LTR et le deuxième contenant un insert court de 321 pb, comprenant les séquences codant pour la partie C-termln~le de Env et la partie 3' du LTR
viral.
Pour générer un plasmide contenant la région codant pour la protéine Env entière, le fragment SmaI-HindIII du VAEC-CO est sous-cloné dans le plasmide pUC18, ainsi que le fragment HindIII-HindIII de 321 pb ; on obtient une construction ~nommée pUC18 env 3.1. (figure 1) . .
b) Construction de la banque d'expression ~gtll :
Le plasmide pUC18 env 3.1 est soumis à une digestion partielle à l'ADNase I à 15~C (15 pg/ml d'ADNase I dans du Tris-HCl, pH 7,4 en présence de MgC12, 1,5 mM, pendant 20 min), de manière à obtenir différents fragments d'ADN, d'environ 200 pb.
Ces différents fragments sont traités avec le fragment de Klenow de l'ADNase polymérase d'E. coli, de manière à obtenir des extrémités à bouts francs, pour une ligature efficace avec des séquences de liaison EcoRI de 10 paires de base (pb) (Pharmacia).
W096/00784 l0 2 1 93q97 pCTn~5l00848 --Le marquage au phosphore 32 des fragments d'ADN permet le contrôle des étapes ultérieures.
Les produits de la ligature sont alors digérés avec llenzyme de restriction EcoRI et séparés par élec-trophorèse dans des gels d'agarose LMP NUSieve~ 2 %, demanière à sélectionner un ensemble de fragments compre-nant entre 100 et 200 pb et à éliminer les séquences de liaison libres.
Les fragments sélectionnés sont extraits au phénol à partir de l'agarose ; on insère ensuite les dif-férents fragments obtenus dans le site EcoRI du phage ~gtll.
Les produits de la ligature (phages recombi-nants) sont alors empaquetés in ~i tro. Une banque de 3.106 phages est ainsi constituée.
On obtient ainsi une banque d'expression de peptides Env de VAEC, fusionnés à la ~-galactosidase, et exprimés dans E. col i, en utilisant le vecteur ~gtll.
Un échantillon de la banque ~gtll est inoculé
sur la souche de E. coli Y1090 à une dilution représen-tant 104 phages par boite de 90 cm de diamètre.
L'induction de l'expression de la protéine sous contrôle du promoteur Lac est déclenchée à 42~C, en présence d'isopropyl-thio-~-galactosidase (IPTG). Les phages recombinants sont sélectionnés par l'absence de coloration bleue des plaques de lyse.
c) Contrôle des peptides obtenus : -Les phages ~gtll recombinants permettent l'expression des fragments de gènes env sous le contrôle du promoteur Lac, après fusion de 1'ADN env avec le gène de la ~-galactosidase de E. col i .
Pour contrôler la qualité de ladite banque, et également obtenir un titre plus important, 40 plaques ont été isolées et analysées par PCR, en utilisant des W096/00784 11 2 ! 9 3~ q 7 PCTn~5/00848 amorces ~gtll complémentaires, spécifiques de la portion ~-galactosidase de la matrice ~gtll comme suit :
un total de 10 ~1 de lysat de phage est dilué
dans 60 ~1 d'eau et porté à ébullition pendant 10 min.
Après microcentrifugation, 15 ~1 du surnageant sont ajou-tés à 85 ~l d'un mélange PCR contenant 50 pM de chaque amorce, 10 nM de chaque désoxynucléoside triphosphate et 0,5 U de Taq polymérase (Perkin-Elmer-Cetus), dans une solution de Tris-HCl 10 mM, KCl 50 mM et MgC12 2 mM.
Les amorces ~gtll utilisées sont, comme pré-cisé ci-dessus, complémentaires de la portion ~-galacto-sidase de la matrice ~gtll, à savoir :
5'GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG 3' (amorce sens) (SEQ ID N~ 12) 5'TTGACACCAGACCAACTGGTAATG 3' (amorce anti-sens) (SEQ ID N~ 13).
La PCR comprend 32 cycles (cycle 1 : 94~C, 2 min ; cycles 2 à 31 : 94~C, 15 sec./55~C, 30 sec./72~C, 30 sec. ; cycle 32 : 72~C, 3 min).
Les produits de l'amplification montrent que l'on obtient des inserts de différentes tailles, compre-nant entre 130 et 250 pb.
Ces fragments amplifiés par PCR sont ensuite hybridés avec trois fragments NcoI radioactifs marqués au phosphore 32, représentant la séquence Env de VAEC-CO
entière (sonde 1 : 6071-6456, sonde 2 : 6457-8071, sonde 3 : 8072~8712), indiquant que la banque est repré-sentative du gène env entier.
2) Criblage de 1A bAnqUe :
La banque env ~gtll est criblée en utilisant les sérums de 3 chèvres, naturellement infectées, et ayant un titre élevé en protéines Gag de VAEC, par test ELISA.
W096/00784 2 1 Y 3 S q 7 PCTn~5/00~8 La sonde E. col i YlO90 est infectée par 3xlO4 PFU de la banque originale non amplifiée, étalée sur plaques et incubée à 42~C pendant 4 heures.
Les plaques sont alors recouvertes de filtres de nitrocellulose, saturés avec de l'IPTG lO mM et incu-bées pendant 3 heures à 37~C, de manière à ' n~tl; re l'expression de la protéine de fusion, ~-galactosidase-peptide Env.
Les filtres sont traités pour un criblage im-munologique avec des sérums de 3 chèvres par incubationséparée (2 filtres par sérum), en utilisant des méthodes st~n~rd, telle que la procédure au lait dégraissé
(MANIATIS).
Ce criblage permet d'isoler 5 clones fortement immunoréactifs, qui sont séquencés selon le protocole suivant :
les produits de la PCR sont séparés sur gel d~agarose à l,8 % et purifiés à l'aide de billes QIAEX~
(Qiagen~), selon les instructions du fabricant.
Un total de 1 ~l de diméthylsulfoxyde ~DMSO) et de 20 pM soit d'amorce sens, soit d'amorce anti-sens, sont ajoutés dans un volume final de lO ~l.
Ce mélange est dénaturé à 100~C, pendant 12 min, et ;mmé~;atement transféré dans un bain glacé de méthanol.
l ~l de dithiothréitol (O,l M), 0,2 ~l dGTP
(UBS), 0,5 ~l de [35S]ATP (600 Ci/m~M), 0,6~1 de DMSO, 3,8 ~l de dH20 et 0,2 ~l de Séquénase (UBS) sont ajoutés.
Les échantillons sont incubés à température ambiante pendant l min, puis pendant 15 min à 37~C.
W096l00784 2 1 ~ 3 9 q 7 PCTl~h5s/oo~q8 Les séquences de ces 5 inserts, à savoir :
Nom du Positions sur la sé- positions sur la pro-fragmentquence d'acide nu- téine Env cléique Gl 8003-8163 665-~17 sont compr-ses dans la région extracellulaire de TM.
Ces résultats indiquent l'immuno~om;n~nce et i la conservation de ces ~omA;nes entre les différents iso-lats viraux.
3) Carte des épito~es immunodom;n~nts TM
conformes à l'invent;on :
a) Protocole :
Une analyse Pepscan~ est réalisée de manière à définir précisément les épitopes TM ;mmllnoréactifs.
Des décapeptides chevauchants couvrant les sé-quences comprises entre les positions 8022 et 8327 de la protéine Env du VAEC ont été synthétisés.
lS Un essai ;mml~noenzymatique a été réalisé
conform~m~nt aux instructions du fabricant (Cambridge Research Biochemicals), en utilisant les sérums provenant de 7 chèvres (dilution 1:100).
sérums proviennent de chèvres infectées naturellement avec des souches de VAEC, un sérum provient d'une chèvre infectée expérimentalement avec le VAEC-CO, et un sérum correspond à un pool de 4 sérums provenant de chèvres infectées expérimentalement' avec le virus de l'arthrite-encéphalite caprine-CO.
La réaction est détectée par incubation en présence d'Ig de lapin anti-chèvre conjuguées à de la peroxydase (Sigma), diluée au 1:20000 ou en présence d~anticorps monoclonal conjugué à de la peroxydase (Chekit~) dilué au 1:200, suivie par une révélation à
l~aide de 2,2'-azino-bis(3-éthylbenz-thiazoline-6-acide sulfonique (ABTS, Sigma).
W096100784 2 9 3 9 q 7 PCT/~K5S~E1B
b) Résultats :
- TMl, TM2 et TM4 :
Il ressort de ces essais que 3 groupes de pep-tides chevauchants sont réactifs et définissent trois 3 épitopes différents conformément à la figure 2, qui com-prend en abscisse les différents fragments chevauchant étudiés et en ordonnée, la densité optique à 405 nm (figure 2A) ainsi que la position des peptides immuno-réactifs sur la séquence (figure 2B).
Ces peptides correspondent à TMl, TM2 et TM4.
- TM3 :
De manière surprenante, la région contenant les deux cystéines conservées, connue pour former une structure immuno~om;nAnte et conservée chez différents lentivirus, ne réagit pas avec les sérums testés, mais le peptide TM3, comprenant cette région, a néanmoins été
synthétisé.
Un autre peptide, avec la même séquence, mais chimiquement cyclisé par un lien covalent entre les deux cystéines a également été préparé (TM3c), de manière à
reproduire une structure en boucle, considérée comme de-vant exister dans la protéine TM native.
Un pool de sérums provenant de 30 chèvres est testé en ELISA pour sa réactivité à TM3 et à TM3c.
Tous les sérums reconnaissent les deux pep-tides, il n'existe donc aucune différence significative entre TM3 et TM3c, de telle sorte que les autres expé-riences ont été réalisées uniquement avec TM3c.
L'épitope TM3 est localisé dans la région env la plus conservée, alors que les séquences correspondant à TMl, TM2 et TM4 présentent des variations (figure 3A).
L'étude comparative et l'alignement des sé-quences TM immuno~minAntes avec 3 clones moléculaires MAEDI-VISNA très proches montrent une forte similarité de la région TM3 par rapport à celle de la protéine Env en-tière (figure 3B).
W096/00784 i 2 1 9 39 97 P~ 5J~c~q8 De plus, il existe une bonne corrélation entre le pourcentage de similarité et la réactivité sérologique des 4 peptides. En fait, la réactivité la plus large du peptide TM3, qui est compris dans la protéine de fusion G5, confirme que cet épitope est localisé dans une région hautement conservée, comme cela est le cas dans les épi-topes correspondants, d'autres lentivirus.
TM4 correspond également à une région conservée. Inversement, le ~om~; ne G1 qui contient les épitopes TM1 et TM2, semble plus variable.
~LE 2 : Test de,dépistage d'une infection à VAEC.
I - Analyse par immllnoblot.
a) Protocole :
Les ~om~ lnes se liant aux anticorps, à sa-voir : G1 : 8003-8163, G4 : 8204-8360 et G5 : 8090-8259 ont été exprimés sous forme de protéines de fusion avec la ~-galactosidase dans les bactéries E. coli lyso-géniques Y1089, comme précisé ci-dessus.
Les lysats de bactéries contenant les pro-téines de fusion ont été préparés à partir de culture lysogénique-HPTG.
Les lysats (40 ~g/puits) sont séparés dans des gels SDS-PAGE (sodium dodécylsulfate-polyacrylamide) à
10 % et transférés sur filtres de nitrocellulose.
Les sites non spécifiques sont bloqués par in-cubation avec du lait dégraissé à 3 % dans un tampon Tris-HCl (10 mM), NaCl (150 mM) et Tween 20 (0,1 %).
Les h~n~P5 de nitrocellulose sont incubées avec un sérum de chèvre dilué au 1:100/1:800 pendant une nuit à 4~C.
La liaison avec l'anticorps est révélée par incubation avec de la protéine G conjuguée à de la per-oxydase, diluée au 1:5 000, suivie par une révélation au
4-chlore-1-naphtol (Sigma).
Un lysat de bactéries infectées avec un phage non recombinant ~gtll est utilisé comme contrôle négatif.
w096/00784 ~1 q 3~ q7 pCTn~5/00848 Les sérums collectés avant l'infection expéri-mentale et un pool de sérums provenant de chèvres non _n-fectées sont utilisés comme contrôle de l'anticorps.
De plus, la co-localisation des bandes imm.uno-réactives avec les protéines de fusion est vérifiée avec un anticorps monoclonal dirigé contre la ~-galactosidase (Promega) i le western blot sur l'antigène viral purifié
est réalisé comm.e précisé dans R. ZANONI et al., J. Clin.
Microbiol., 1989, 27, 580-582.
b) Résultats :
Les peptides Gl, G4 et GS tels que définis à
l'exemple 1 couvrant la région immunoréactive de la pro-téine tr~n~mPmhranaire TM, sont utilisés dans un western blot pour cribler 60 sérums de chèvres infectées naturel-lement provenant de différents troupeaux, dans les condi-tions ci-dessus.
Le Tableau I ci-après montre que les sérums réagissent avec G5 et G4 à plus de 95 %, alors que seule-ment 60 % réagissent avec Gl.
TABLEAU I
RÉSUMÉ DES 60 ~~ r~ TESTES
région TM ~-1 G4 G5 sérums positifs 9 57 57 % de sérums positifs 6 % 95 % 95 II - Métho~e ELlSA.
a) Protocole :
Les peptides (TM1-TM4) ont été synthétisés et purifiés.
Les peptides TM3 et TM4 ont été.adsorbés sur plaque de microtitration comme suit :
100 ~1 d'une solution à 5 ~g/ml dans du carbo-nate de sodium 0,1 M, pH 9, 6 ont été adsorbés dans chaque puits de plaque de microtitration (Nunc, Maxisorp~), pen-dant une nuit à 4~C.
W096/00784 2 1 9 3 9 q 7 PCTn~5100848 Le peptide TMl montre une liaison faible et le peptide TM2 ne se lie pas du tout à ces plaques ou à
d'autres plaques ELISA testées.
Pour cette raison des plaques qui permettent S une liaison covalente de peptides dérivatisés (Nunc Cova-link~) ont été utilisées pour TMl et TM2.
La dérivatisation et l'adsorption de ces pep-tides sur des plaques sont réalisées comme décrit dans J. SONDERGARD-ANDERSON et al., J. Immunol. Methods, 1990, 131, 99-104.
Ces peptides sont solubilisés dans l'eau (TMl : 1 mg/ml, TM2 : 0,5 mg/ml).
A un volume de solution peptidique, un volume égal de solution aqueuse fraîch~m~nt préparée de N-hy-droxysuccinimide 0,1 M (NHS, Sigma H-7377) et de l-éthyl-3-~3-diméthylaminopropyl)carbodiimide, HCl (EDC, Sigma E-6383), sont ajoutés.
Après 30 min à température ambiante, les pep-tides activés sont dilués dans un tampon carbonate 0,1 M
glacé (pH 8,9) à 10 ~g/ml et 100 ~l/puits sont adsorbés par des plaques Covalink~ pendant une nuit à 4~C.
Le test ELISA est réalisé comme suit :
après revêtement des plaques de microtitra-tion, ces dernières sont lavées trois fois avec du PBS, les sites d~adsorption résiduelle sur les plaques sont saturés par incubation avec 100 ~l de PBS contenant du lait (1 %) et du Tween 20 (0,1 %) (tampon ELISA EB) pen-dant 2 heures à température ambiante.
Après lavage, 50 ~l de sérum de chèvre, dilués au 1:10, dans un tampon EB, sont incubés pendant 2 heures et demi, à température ambiante.
Après lavage 4 fois avec du tampon EB, de la protéine G conjuguée à de la peroxydase (diluée au 1:5 000 dans du PBS Tween 20 0,1 %) est ajoutée pendant 2 heures à température ambiante.
W096/00784 l8 2 1 9 3 9 9 7 P~lirng~ q~
Après 5 lavages au PBS, le conjugué à la per-oxydase adsorbé est visualisé avec de l'ABTS, 0,2 mg/ml dans de l'acide acétique à 0,6 % pH 4,7 et à une concen-tration finale p/v de H2~2 de 0,01 %.
b) Résultats :
La densité optique est mesurée à 405 nm sur des essais réalisés en double. Les résultats sont normalisés en utilisant, comme st~n~rd, un ensemble de sérums de chèvre, calibré dans un ELISA Gag-GST, réalisé
comme décrit dans R.G. ZANONI et al., J. Clin.
Microbiol., 1991, 29, 1290-1294.
On considère qu'il y a une réaction positive, lorsqu'il y a une réactivité supérieure à 25 % du sérum de référence.
190 sérums de chèvres infectées avec le virus de l'arthrite et de l'encéphalite caprine, à un stade clinique bien défini, ont été testés selon cette procé-dure ELISA pour la réactivité avec les 4 épitopes et avec la protéine Gag.
Comme illustré au Tableau II ci-après, la plu-part des sérums réagissent avec le peptide TM3 et avec la protéine Gag.
T~ RT .~U II
REST~NE DES 19 0 SER~S TES~ES
Peptide TMl TM' TM3 TM~ gag sérums positifs~ 122 13~ 174 14 175 % de sérums po- 64 % 72 92 % 76 93 %
sitifs réactivité supérieure à 25 % du sérum de référence Les peptides TM4, TM2 et TMl réagissent avec la majorité des sérums, quoiqu'avec des pourcentages plus faibles que pour TM3.
Quelques sérums, quoique réactifs en western blot avec un culot de virus comme antigènes, sont néga-tifs en ELISA.
W096/00784 19 ~1 9 ~ 9 9 7 PCT~R95/00848 , c) Analyse statistique :
Les valeurs de densité optique obtenues en ELISA ont été normalisées et exprimées en tant que pour-centage de réactivité, comparé à un sérum de référence consistant, comme précisé ci-dessus, en un ensemble de sérums séropositifs vis-à-vis du VAEC.
Les réactivités ELISA des sérums d'animaux en bonne santé et d'animaux arthritiques ont été comparées.
Un index de réactivité (IR) est calculé pour chaque sérum testé et correspond à :
% de réactivité aux peptides TM
IR = ---------------------------------% de réactivité à la protéine Gag Ces résultats sont illustrés au Tableau III15 ci-après :
o ~ ~ 3 o oo Peptide GAG TM1 TM2 TM3 TM4 Statut clinique Sain Malade Sain Malade Sain Malade Sain Malade Sain Malade ~ de r~activité268 249 148 189 73 92 147 205 143 317 moyenne % de réactivité 179 154 14 80 22 34 77 160 7 125 médiane . H
Index de 1 1 1,57 2,14 0,67 0,86 1,79 2,51 2,6 3,4 H r~réactivité
L
W096/00784 21 2 ~ 9~9q7 PCTn~sl00848 Les sérums de chèvres arthritiques montrent une réactivité élevée avec TM1, TM3 et plus spécifique-ment avec TM4, par rapport aux sérums d'animaux en bonne santé (TM1 : U = 5328,0, p = 0,014 i TM3 : U = 11468,0, p - 0,002 ; TM4 : U = 5964,5, p < 0,001).
Par contre, il n'existe aucune différence significative entre les deux groupes d'animaux en ce qui concerne la réactivité des sérums vis-à-vis de Gag et de TM2 (Gag : U = 4106,0, p - O,391 ; TM2 : U = 4905,5, p -0,198).
Ces résultats sont illustrés à la figure 4.
La comparaison de la réactivité des sérums dechèvres en bonne santé et arthritiques avec les 4 pep-tides TM et la protéine Gag a révélé 1'existence d'une corrélation entre le développement de l'arthrite virale et la réactivité aux épitopes TM1, TM3 et TM4. Cette corrélation n'a pas été retrouvée pour la réactivité
anti-Gag.
La détection de la présence des fragments TM
précités (ou des anticorps anti-TM) présente une valeur prédictive, dans le but d'évaluer l'apparition de la ma-ladie clinique et permet de prendre les mesures néces-saires pour une meilleure sauvegarde des troupeaux.
III - Interprétation des résultats obtenus en I et en II.
a) Sensibilité des tests :
- Il existe une certaine différence entre les résultats western blot en ce qui concerne le peptide G4 et les résultats ELISA obtenus avec TM4.
- Le western blot se révèle plus sensible pour cet épitope sans doute parce que ce peptide fusionné avec la ~-galactosidase présente une conformation qui n'est pas présente dans le peptide libre ou parce qu~il contient plus qu'un épitope.
- Environ 35 % des animaux ne réagissent pas avec les épitopes TM1 et TM2 dans les deux tests.
W096/00784 22 2 1 9 3 ~ 9 7 PCT/~K55~Eq~
b) Intérêt et propriétés des peptides sélec-tionnés :
Les résultats obtenus ont permis d'identifier les déterminants impliqués dans la corrélation réactivité
sérologique-évolution de l'arthrite virale, et permettent donc un meilleur suivi de cette maladie.
De manière intéressante, l'épitope TM3 de la protéine TM de VAEC a la même localisation que l'épitope immuno~om;n~nt d'autres lentivirus tels que les lenti-virus entraînant une ;mmllnodéficience : HIV, SIV et FIV.
Cet épitope est localisé dans une régioncontenant une structure définie par deux cystéines qui est conservée par l'ensemble des lentivirus en dépit de l~absence d'une homologie de la séquence primaire.
Chez HIV-l, SIV et FIV, la séquence comprise entre les cystéines est hautement conservée entre les différents isolats viraux de la même espèce.
Ceci reflète une pression sélective importante de conservation, probablement dictée par des contraintes structurales.
De manière inattendue, il est apparu que la réactivité de TM3 et TM4 vis-à-vis des anticorps produits lors d'une infection par le VAEC, présente une corréla-tion significativement élevée avec le développement de la maladie.
Si les régions conservées et immunogéniques de TM ne mutent pas, en raison de contraintes fonction-nelles, l'apparition continuelle de variants env nouveaux entraîne une stimulation permanente du système ;mmlln;-taire, qui perpétue et amplifie la production d'anticorpsvis-à-vis des épitopes TM constants.
En conséquence, les peptides sélectionnés pré-sentent un intérêt particulier dans le dépistage et l~étude de la réponse humorale à ces épitopes conservés et dans l'étude du suivi et du développement de l'arthrite caprine.
W096/007~ 23 2 1 93997 pCTn~5l00848 EXEMPLE 3 : Test de de~istaae d'une infection à VISNA.
Un essai a été réalisé, pour tester la réacti-vité des peptides TM3 et TM4 avec des sérums de moutons infectés par le virus VISNA. 40 sérums provenant de mou-tons d'élevage ont été testés avec les peptides conformesà l~invention (méthode "ELISA peptides") ont été comparés avec le test Chekit~ précité.
Les résultats sont résumés dans le Tableau IV
suivant :
TART.T~ U IV
nombre de 10 8 9 12 sé-ums Che~-t~ + + + _ _ TM, + + _ _ +
T~ + -- _ _ +
Il apparaît que l'ELISA TM. est plus sensible que l'ELISA TiM4 . 18 sérums ont été réactifs avec TM3 et avec le test Chekit~ et 12 sérums sont négatifs avec les trois tests. 10 sérums ont donné des résultats contradic-toires entre le test Chekit~ et le test TM3: 9 sont po-sitifs par le test Chekit~ et négatifs avec les peptides, 1 donne des résultats opposés.
6 des sérums positifs avec le test Chekit~ et négatifs avec TM3 ont pu être contrôlés par immunoblot :
Un lysat de bactéries infectées avec un phage non recombinant ~gtll est utilisé comme contrôle négatif.
w096/00784 ~1 q 3~ q7 pCTn~5/00848 Les sérums collectés avant l'infection expéri-mentale et un pool de sérums provenant de chèvres non _n-fectées sont utilisés comme contrôle de l'anticorps.
De plus, la co-localisation des bandes imm.uno-réactives avec les protéines de fusion est vérifiée avec un anticorps monoclonal dirigé contre la ~-galactosidase (Promega) i le western blot sur l'antigène viral purifié
est réalisé comm.e précisé dans R. ZANONI et al., J. Clin.
Microbiol., 1989, 27, 580-582.
b) Résultats :
Les peptides Gl, G4 et GS tels que définis à
l'exemple 1 couvrant la région immunoréactive de la pro-téine tr~n~mPmhranaire TM, sont utilisés dans un western blot pour cribler 60 sérums de chèvres infectées naturel-lement provenant de différents troupeaux, dans les condi-tions ci-dessus.
Le Tableau I ci-après montre que les sérums réagissent avec G5 et G4 à plus de 95 %, alors que seule-ment 60 % réagissent avec Gl.
TABLEAU I
RÉSUMÉ DES 60 ~~ r~ TESTES
région TM ~-1 G4 G5 sérums positifs 9 57 57 % de sérums positifs 6 % 95 % 95 II - Métho~e ELlSA.
a) Protocole :
Les peptides (TM1-TM4) ont été synthétisés et purifiés.
Les peptides TM3 et TM4 ont été.adsorbés sur plaque de microtitration comme suit :
100 ~1 d'une solution à 5 ~g/ml dans du carbo-nate de sodium 0,1 M, pH 9, 6 ont été adsorbés dans chaque puits de plaque de microtitration (Nunc, Maxisorp~), pen-dant une nuit à 4~C.
W096/00784 2 1 9 3 9 q 7 PCTn~5100848 Le peptide TMl montre une liaison faible et le peptide TM2 ne se lie pas du tout à ces plaques ou à
d'autres plaques ELISA testées.
Pour cette raison des plaques qui permettent S une liaison covalente de peptides dérivatisés (Nunc Cova-link~) ont été utilisées pour TMl et TM2.
La dérivatisation et l'adsorption de ces pep-tides sur des plaques sont réalisées comme décrit dans J. SONDERGARD-ANDERSON et al., J. Immunol. Methods, 1990, 131, 99-104.
Ces peptides sont solubilisés dans l'eau (TMl : 1 mg/ml, TM2 : 0,5 mg/ml).
A un volume de solution peptidique, un volume égal de solution aqueuse fraîch~m~nt préparée de N-hy-droxysuccinimide 0,1 M (NHS, Sigma H-7377) et de l-éthyl-3-~3-diméthylaminopropyl)carbodiimide, HCl (EDC, Sigma E-6383), sont ajoutés.
Après 30 min à température ambiante, les pep-tides activés sont dilués dans un tampon carbonate 0,1 M
glacé (pH 8,9) à 10 ~g/ml et 100 ~l/puits sont adsorbés par des plaques Covalink~ pendant une nuit à 4~C.
Le test ELISA est réalisé comme suit :
après revêtement des plaques de microtitra-tion, ces dernières sont lavées trois fois avec du PBS, les sites d~adsorption résiduelle sur les plaques sont saturés par incubation avec 100 ~l de PBS contenant du lait (1 %) et du Tween 20 (0,1 %) (tampon ELISA EB) pen-dant 2 heures à température ambiante.
Après lavage, 50 ~l de sérum de chèvre, dilués au 1:10, dans un tampon EB, sont incubés pendant 2 heures et demi, à température ambiante.
Après lavage 4 fois avec du tampon EB, de la protéine G conjuguée à de la peroxydase (diluée au 1:5 000 dans du PBS Tween 20 0,1 %) est ajoutée pendant 2 heures à température ambiante.
W096/00784 l8 2 1 9 3 9 9 7 P~lirng~ q~
Après 5 lavages au PBS, le conjugué à la per-oxydase adsorbé est visualisé avec de l'ABTS, 0,2 mg/ml dans de l'acide acétique à 0,6 % pH 4,7 et à une concen-tration finale p/v de H2~2 de 0,01 %.
b) Résultats :
La densité optique est mesurée à 405 nm sur des essais réalisés en double. Les résultats sont normalisés en utilisant, comme st~n~rd, un ensemble de sérums de chèvre, calibré dans un ELISA Gag-GST, réalisé
comme décrit dans R.G. ZANONI et al., J. Clin.
Microbiol., 1991, 29, 1290-1294.
On considère qu'il y a une réaction positive, lorsqu'il y a une réactivité supérieure à 25 % du sérum de référence.
190 sérums de chèvres infectées avec le virus de l'arthrite et de l'encéphalite caprine, à un stade clinique bien défini, ont été testés selon cette procé-dure ELISA pour la réactivité avec les 4 épitopes et avec la protéine Gag.
Comme illustré au Tableau II ci-après, la plu-part des sérums réagissent avec le peptide TM3 et avec la protéine Gag.
T~ RT .~U II
REST~NE DES 19 0 SER~S TES~ES
Peptide TMl TM' TM3 TM~ gag sérums positifs~ 122 13~ 174 14 175 % de sérums po- 64 % 72 92 % 76 93 %
sitifs réactivité supérieure à 25 % du sérum de référence Les peptides TM4, TM2 et TMl réagissent avec la majorité des sérums, quoiqu'avec des pourcentages plus faibles que pour TM3.
Quelques sérums, quoique réactifs en western blot avec un culot de virus comme antigènes, sont néga-tifs en ELISA.
W096/00784 19 ~1 9 ~ 9 9 7 PCT~R95/00848 , c) Analyse statistique :
Les valeurs de densité optique obtenues en ELISA ont été normalisées et exprimées en tant que pour-centage de réactivité, comparé à un sérum de référence consistant, comme précisé ci-dessus, en un ensemble de sérums séropositifs vis-à-vis du VAEC.
Les réactivités ELISA des sérums d'animaux en bonne santé et d'animaux arthritiques ont été comparées.
Un index de réactivité (IR) est calculé pour chaque sérum testé et correspond à :
% de réactivité aux peptides TM
IR = ---------------------------------% de réactivité à la protéine Gag Ces résultats sont illustrés au Tableau III15 ci-après :
o ~ ~ 3 o oo Peptide GAG TM1 TM2 TM3 TM4 Statut clinique Sain Malade Sain Malade Sain Malade Sain Malade Sain Malade ~ de r~activité268 249 148 189 73 92 147 205 143 317 moyenne % de réactivité 179 154 14 80 22 34 77 160 7 125 médiane . H
Index de 1 1 1,57 2,14 0,67 0,86 1,79 2,51 2,6 3,4 H r~réactivité
L
W096/00784 21 2 ~ 9~9q7 PCTn~sl00848 Les sérums de chèvres arthritiques montrent une réactivité élevée avec TM1, TM3 et plus spécifique-ment avec TM4, par rapport aux sérums d'animaux en bonne santé (TM1 : U = 5328,0, p = 0,014 i TM3 : U = 11468,0, p - 0,002 ; TM4 : U = 5964,5, p < 0,001).
Par contre, il n'existe aucune différence significative entre les deux groupes d'animaux en ce qui concerne la réactivité des sérums vis-à-vis de Gag et de TM2 (Gag : U = 4106,0, p - O,391 ; TM2 : U = 4905,5, p -0,198).
Ces résultats sont illustrés à la figure 4.
La comparaison de la réactivité des sérums dechèvres en bonne santé et arthritiques avec les 4 pep-tides TM et la protéine Gag a révélé 1'existence d'une corrélation entre le développement de l'arthrite virale et la réactivité aux épitopes TM1, TM3 et TM4. Cette corrélation n'a pas été retrouvée pour la réactivité
anti-Gag.
La détection de la présence des fragments TM
précités (ou des anticorps anti-TM) présente une valeur prédictive, dans le but d'évaluer l'apparition de la ma-ladie clinique et permet de prendre les mesures néces-saires pour une meilleure sauvegarde des troupeaux.
III - Interprétation des résultats obtenus en I et en II.
a) Sensibilité des tests :
- Il existe une certaine différence entre les résultats western blot en ce qui concerne le peptide G4 et les résultats ELISA obtenus avec TM4.
- Le western blot se révèle plus sensible pour cet épitope sans doute parce que ce peptide fusionné avec la ~-galactosidase présente une conformation qui n'est pas présente dans le peptide libre ou parce qu~il contient plus qu'un épitope.
- Environ 35 % des animaux ne réagissent pas avec les épitopes TM1 et TM2 dans les deux tests.
W096/00784 22 2 1 9 3 ~ 9 7 PCT/~K55~Eq~
b) Intérêt et propriétés des peptides sélec-tionnés :
Les résultats obtenus ont permis d'identifier les déterminants impliqués dans la corrélation réactivité
sérologique-évolution de l'arthrite virale, et permettent donc un meilleur suivi de cette maladie.
De manière intéressante, l'épitope TM3 de la protéine TM de VAEC a la même localisation que l'épitope immuno~om;n~nt d'autres lentivirus tels que les lenti-virus entraînant une ;mmllnodéficience : HIV, SIV et FIV.
Cet épitope est localisé dans une régioncontenant une structure définie par deux cystéines qui est conservée par l'ensemble des lentivirus en dépit de l~absence d'une homologie de la séquence primaire.
Chez HIV-l, SIV et FIV, la séquence comprise entre les cystéines est hautement conservée entre les différents isolats viraux de la même espèce.
Ceci reflète une pression sélective importante de conservation, probablement dictée par des contraintes structurales.
De manière inattendue, il est apparu que la réactivité de TM3 et TM4 vis-à-vis des anticorps produits lors d'une infection par le VAEC, présente une corréla-tion significativement élevée avec le développement de la maladie.
Si les régions conservées et immunogéniques de TM ne mutent pas, en raison de contraintes fonction-nelles, l'apparition continuelle de variants env nouveaux entraîne une stimulation permanente du système ;mmlln;-taire, qui perpétue et amplifie la production d'anticorpsvis-à-vis des épitopes TM constants.
En conséquence, les peptides sélectionnés pré-sentent un intérêt particulier dans le dépistage et l~étude de la réponse humorale à ces épitopes conservés et dans l'étude du suivi et du développement de l'arthrite caprine.
W096/007~ 23 2 1 93997 pCTn~5l00848 EXEMPLE 3 : Test de de~istaae d'une infection à VISNA.
Un essai a été réalisé, pour tester la réacti-vité des peptides TM3 et TM4 avec des sérums de moutons infectés par le virus VISNA. 40 sérums provenant de mou-tons d'élevage ont été testés avec les peptides conformesà l~invention (méthode "ELISA peptides") ont été comparés avec le test Chekit~ précité.
Les résultats sont résumés dans le Tableau IV
suivant :
TART.T~ U IV
nombre de 10 8 9 12 sé-ums Che~-t~ + + + _ _ TM, + + _ _ +
T~ + -- _ _ +
Il apparaît que l'ELISA TM. est plus sensible que l'ELISA TiM4 . 18 sérums ont été réactifs avec TM3 et avec le test Chekit~ et 12 sérums sont négatifs avec les trois tests. 10 sérums ont donné des résultats contradic-toires entre le test Chekit~ et le test TM3: 9 sont po-sitifs par le test Chekit~ et négatifs avec les peptides, 1 donne des résultats opposés.
6 des sérums positifs avec le test Chekit~ et négatifs avec TM3 ont pu être contrôlés par immunoblot :
5 sur 6 ont été négatifs.
Il apparaît donc qu'un nombre important de faux positifs sont détectés avec le test Chekit~ et que l'ELISA TM3 conforme à l'invention est significativement plus spécifique. Le seul cas de sérum réactif avec TM3 et TM4 et négatif avec le test Chekit~ nécessite des outils supplémentaires pour déterminer s'il s'agit d'un vrai ou d'un faux positif.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien-nent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en em-W096/00784 PCT~R95/00848 -~.
brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent ve-nir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente inven-tion.
2 ~ 93997 LIgTE DE ~Q~EN OE S
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(1) DEPOSANT:
(A) NOM: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE
SCl~Nll~lQUE-CNRS
(B) RUE: 3 rue Michel Ange (C) VILLE: PARIS
~E) PAYS: FRANCE
~F) CODE POSTAL: 75794 PARIS
~ ii) TITRE DE L' INVENTION: FRAGMENTS D'ACIDE NUCLEIQUE ET
FRAGMENTS
PEPTIDIQUES CORRESPONDANTS ISSUS DU GENOME DU VIRUS DE
L'ARTHRITE ET DE L'~E~ALITE CAPRINE ~VAEC) ET LEURS
APPLICATIONC.
~iii) NOMBRE DE ~kyu N~S: 13 (iv) FORME D~:~lE~ABLE PAR ORDINATEUR:
~A) TYPE DE ~u~PO~: Floppy disk ~B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 ~OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
~i) CARACTERISTIQUES DE LA ~ U'N~':
~A) LON~U~UK: 161 paires de bases (B) TYPE: nucléotide ~C) NONBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: l; n~A; ~e ~ii) TYPE DE MnT.FrrJT.~ ADN (génomique) (xi) D~CrRTpTIoN DE LA ~:QU~N~:: SEQ ID NO: 1:
TA-A~r-GrA-GcT GTCCAGACCC TTGCTAATGC AA~LGC~GCA CAr~AGr~ATG TGTTAr~Ar7GC 60 AACCTATGCC ATGGTACAGC Al~lGG~AA AGGCGTACGA Al~ll~GAAG CTCGAGTGGC 120 TCGAGTGGAA GCTATCACAG ATAr.AATAAT GCTATACCAA G 161 (2) INFORMATIONS porJR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~:Qu N~:
(A) LON~U~U~: 157 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CON~l~uKATION: li n ~; re (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) ~xi) DESCRIPTION DE LA ~:QU~N~: SEQ ID NO: 2:
~ArAAAAArA GAAGTAGCAA AATATATcAA TTGr~ArrAr~G TTTAArrATA- ATTGCACATG 60 GCAGCAGTGG rArArArrAT TAr~rGGGTA Tr~A~ArAAAr TTAArAATAr TGT~AAArr~A 120 ATCAGCAGCA ATr~ArArAAC TAr-CAr~AAr-A GCAAGCA 157 W 096/00784 26 2 1 9 3 9 9 7 pCTA~R95100848 r (2) INFORNATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~OU~N~
(A) LON~U~:UK: 170 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS simple (D) CONFIGURATION 1 inéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN ( génomique) (Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQ ID NO 3:
TAAAGGCGTA CGAATCTTGG AAGCTCGAGT GGCTCGAGTG GAAGCTATCA ~A~.ATA,~.A~T 60 AATGCTATAC CAAGAATTGG A'1"1'~'1"i'GG~'A CTATCATCAA TACTGTATAA CCTCTACAAA 120 A,ArA~.AAr.TA G~AAAA~A TCAATTGGAC GAGGTTTAAG GATAATTGCA 170 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~ U~
(A) LUN~U~UK 45 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: I;n~A;re (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (Xi) DESCRIPTION DE LA ~kYU~N~: SEQ ID NO: 4:
GA'L~'1'~'1"1'AG AGGCAACCTA TGCCATGGTA CAGCATGTGG CTAAA 45 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
~i) CARACTERISTIQUES DE LA ~YU~N~:
(A~ LUN~U~UK 3 6 paires de bases (B TYPE nucléotide (C NOMBRE DE BRINS: simple (D, CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (Xi) DESCRIPTION DE LA ~QUkN~: SEQ ID NO: 5:
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~YU~N~:
(A) LON~U~UK 45 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS simple (D) CONFIGURATION 1' n é~-re (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
CAAGAATTGG A'1"1~'1"1'~GU'A CTATCATCAA TACTGTATAA CCTCT 4 5 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~YUk~
(A) LON~U~UK: 42 paires de bases-(B) TYPE: nucléotide ~ 27 21 93q97 W 096/00784 P~ K5Sl00848 ~C~ NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
TGCACATGGC AGCAGTGGGA ~AC-~AGr~ATTA CAGGGGTATG AT 42 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~y~ NC~:
(A) LUNCjU~UK: 15 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NONBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA ~:yu~Nc_~: SEQ ID NO: 8:
Asp Val Leu Glu Ala Thr Tyr Ala Net Val Gln His Val Ala Lys (2) lN~un~ATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~yu~c~:
(A) T~C~NCjU~:UK: 12 acides aminés (B~ TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOT~CUT~: peptide (xi) DT~C~RTPTION DE LA ~b'yU NC_~: SEQ ID NO: 9:
Glu Ala Ile Thr Asp Arg Ile Met Leu Tyr Gln Glu (2) INFORN~TIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~yu~N~:
(A' T(~N~u~:uK: 15 acides aminés (B TYPE: acide aminé
(C NOMBRE DE BRINS: simple (D: CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOT~FCUT~F: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA S~:yu NC_~: SEQ ID NO: 10:
Xaa Glu Leu Asp Cys Trp His Tyr Xaa Xaa Tyr Cys Xaa Thr Ser (2) lN~u~lATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~yu NC_~:
(A) LU~U~UK: 14 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NONBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lin~ire (ii) TYPE DE MOTT~UTT~ peptide ~ W 096/00784 28 2 1 939 97 pcTA~Rgsloo848 (xi) DESCRIPTION DE LA ~Qu~ SEQ ID NO: 11:
Cys Thr Trp Gln Gln Trp Glu Arg Glu Leu Gln Gly Tyr Asp t2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~u~
~A) LONGU~Un: 24 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple ~D) CONFIGURATION: ll n~A; re ~ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique ~A) DESCRIPTION: /desc = namorce sensR
~xi) DESCRIPTION DE LA S~:QU~N~: SEQ ID NO: 12:
G~GGC~ACG A~lC~l~GAG ~CCG 24 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
~i) CARACTERISTIQUES DE LA ~UU~N~:
~A) LON~U~U~: 24 paires de bases ~B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: l; n~A; re ~ii) TYPE DE MOr~CUr~: Autre acide nucléique (A) D~-CrRTPTION: /desc = ~amorce anti-sens~
~xi) D~-~rRTPTION DE LA ~yu~N~: SEQ ID NO: 13:
TT~-A~ACrAr- ACCAACTGGT AATG 24
Il apparaît donc qu'un nombre important de faux positifs sont détectés avec le test Chekit~ et que l'ELISA TM3 conforme à l'invention est significativement plus spécifique. Le seul cas de sérum réactif avec TM3 et TM4 et négatif avec le test Chekit~ nécessite des outils supplémentaires pour déterminer s'il s'agit d'un vrai ou d'un faux positif.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien-nent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en em-W096/00784 PCT~R95/00848 -~.
brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent ve-nir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente inven-tion.
2 ~ 93997 LIgTE DE ~Q~EN OE S
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(1) DEPOSANT:
(A) NOM: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE
SCl~Nll~lQUE-CNRS
(B) RUE: 3 rue Michel Ange (C) VILLE: PARIS
~E) PAYS: FRANCE
~F) CODE POSTAL: 75794 PARIS
~ ii) TITRE DE L' INVENTION: FRAGMENTS D'ACIDE NUCLEIQUE ET
FRAGMENTS
PEPTIDIQUES CORRESPONDANTS ISSUS DU GENOME DU VIRUS DE
L'ARTHRITE ET DE L'~E~ALITE CAPRINE ~VAEC) ET LEURS
APPLICATIONC.
~iii) NOMBRE DE ~kyu N~S: 13 (iv) FORME D~:~lE~ABLE PAR ORDINATEUR:
~A) TYPE DE ~u~PO~: Floppy disk ~B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 ~OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
~i) CARACTERISTIQUES DE LA ~ U'N~':
~A) LON~U~UK: 161 paires de bases (B) TYPE: nucléotide ~C) NONBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: l; n~A; ~e ~ii) TYPE DE MnT.FrrJT.~ ADN (génomique) (xi) D~CrRTpTIoN DE LA ~:QU~N~:: SEQ ID NO: 1:
TA-A~r-GrA-GcT GTCCAGACCC TTGCTAATGC AA~LGC~GCA CAr~AGr~ATG TGTTAr~Ar7GC 60 AACCTATGCC ATGGTACAGC Al~lGG~AA AGGCGTACGA Al~ll~GAAG CTCGAGTGGC 120 TCGAGTGGAA GCTATCACAG ATAr.AATAAT GCTATACCAA G 161 (2) INFORMATIONS porJR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~:Qu N~:
(A) LON~U~U~: 157 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CON~l~uKATION: li n ~; re (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) ~xi) DESCRIPTION DE LA ~:QU~N~: SEQ ID NO: 2:
~ArAAAAArA GAAGTAGCAA AATATATcAA TTGr~ArrAr~G TTTAArrATA- ATTGCACATG 60 GCAGCAGTGG rArArArrAT TAr~rGGGTA Tr~A~ArAAAr TTAArAATAr TGT~AAArr~A 120 ATCAGCAGCA ATr~ArArAAC TAr-CAr~AAr-A GCAAGCA 157 W 096/00784 26 2 1 9 3 9 9 7 pCTA~R95100848 r (2) INFORNATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~OU~N~
(A) LON~U~:UK: 170 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS simple (D) CONFIGURATION 1 inéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN ( génomique) (Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQ ID NO 3:
TAAAGGCGTA CGAATCTTGG AAGCTCGAGT GGCTCGAGTG GAAGCTATCA ~A~.ATA,~.A~T 60 AATGCTATAC CAAGAATTGG A'1"1'~'1"i'GG~'A CTATCATCAA TACTGTATAA CCTCTACAAA 120 A,ArA~.AAr.TA G~AAAA~A TCAATTGGAC GAGGTTTAAG GATAATTGCA 170 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~ U~
(A) LUN~U~UK 45 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: I;n~A;re (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (Xi) DESCRIPTION DE LA ~kYU~N~: SEQ ID NO: 4:
GA'L~'1'~'1"1'AG AGGCAACCTA TGCCATGGTA CAGCATGTGG CTAAA 45 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
~i) CARACTERISTIQUES DE LA ~YU~N~:
(A~ LUN~U~UK 3 6 paires de bases (B TYPE nucléotide (C NOMBRE DE BRINS: simple (D, CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (Xi) DESCRIPTION DE LA ~QUkN~: SEQ ID NO: 5:
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~YU~N~:
(A) LON~U~UK 45 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS simple (D) CONFIGURATION 1' n é~-re (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
CAAGAATTGG A'1"1~'1"1'~GU'A CTATCATCAA TACTGTATAA CCTCT 4 5 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~YUk~
(A) LON~U~UK: 42 paires de bases-(B) TYPE: nucléotide ~ 27 21 93q97 W 096/00784 P~ K5Sl00848 ~C~ NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
TGCACATGGC AGCAGTGGGA ~AC-~AGr~ATTA CAGGGGTATG AT 42 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~y~ NC~:
(A) LUNCjU~UK: 15 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NONBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA ~:yu~Nc_~: SEQ ID NO: 8:
Asp Val Leu Glu Ala Thr Tyr Ala Net Val Gln His Val Ala Lys (2) lN~un~ATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~yu~c~:
(A) T~C~NCjU~:UK: 12 acides aminés (B~ TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOT~CUT~: peptide (xi) DT~C~RTPTION DE LA ~b'yU NC_~: SEQ ID NO: 9:
Glu Ala Ile Thr Asp Arg Ile Met Leu Tyr Gln Glu (2) INFORN~TIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~yu~N~:
(A' T(~N~u~:uK: 15 acides aminés (B TYPE: acide aminé
(C NOMBRE DE BRINS: simple (D: CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOT~FCUT~F: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA S~:yu NC_~: SEQ ID NO: 10:
Xaa Glu Leu Asp Cys Trp His Tyr Xaa Xaa Tyr Cys Xaa Thr Ser (2) lN~u~lATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~yu NC_~:
(A) LU~U~UK: 14 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NONBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lin~ire (ii) TYPE DE MOTT~UTT~ peptide ~ W 096/00784 28 2 1 939 97 pcTA~Rgsloo848 (xi) DESCRIPTION DE LA ~Qu~ SEQ ID NO: 11:
Cys Thr Trp Gln Gln Trp Glu Arg Glu Leu Gln Gly Tyr Asp t2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA ~u~
~A) LONGU~Un: 24 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple ~D) CONFIGURATION: ll n~A; re ~ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique ~A) DESCRIPTION: /desc = namorce sensR
~xi) DESCRIPTION DE LA S~:QU~N~: SEQ ID NO: 12:
G~GGC~ACG A~lC~l~GAG ~CCG 24 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
~i) CARACTERISTIQUES DE LA ~UU~N~:
~A) LON~U~U~: 24 paires de bases ~B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: l; n~A; re ~ii) TYPE DE MOr~CUr~: Autre acide nucléique (A) D~-CrRTPTION: /desc = ~amorce anti-sens~
~xi) D~-~rRTPTION DE LA ~yu~N~: SEQ ID NO: 13:
TT~-A~ACrAr- ACCAACTGGT AATG 24
Claims (27)
1°) Fragments d'acide nucléique, caractérisés en ce qu'ils codent pour un fragment peptidique incluant au moins un segment de protéine Env du VAEC comprenant au moins un épitope immunodominant, sélectionné dans la région transmembranaire de ladite protéine, lesquels fragments d'acide nucléique comprennent entre 15 et 255 nucléotides.
2°) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il correspond aux positions 8003-8163 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence :
TAAGGCAGCTGTCCAGACCCTTGCTAATGCAACTGCTGCACAGCAGGATGTGTTAGA
GGCAACCTATGCCATGGTACAGCATGTGGCTAAAGGCGTACGAATCTTGGAAGCTCG
AGTGGCTCGAGTGGAAGCTATCACAGATAGAATAATGCTATACCAAG (SEQ ID
n°1), et code pour un fragment peptidique dénommé G1.
TAAGGCAGCTGTCCAGACCCTTGCTAATGCAACTGCTGCACAGCAGGATGTGTTAGA
GGCAACCTATGCCATGGTACAGCATGTGGCTAAAGGCGTACGAATCTTGGAAGCTCG
AGTGGCTCGAGTGGAAGCTATCACAGATAGAATAATGCTATACCAAG (SEQ ID
n°1), et code pour un fragment peptidique dénommé G1.
3°) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il correspond aux positions 8019-8264 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, et code pour un fragment peptidique dénommé G2.
4°) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il correspond aux positions 7991-8107 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, et code pour un fragment peptidique dénommé G3.
5°) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il correspond aux positions 8204-8360 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence :
TACAAAAACAGAAGTAGCAAAATATATCAATTGGACGAGGTTTAAGGATAATTGCAC
ATGGCAGCAGTGGGAGAGAGGATTACAGGGGTATGATACAAACTTAACAATACTGTT
AAAGGAATCAGCAGCAATGACACAACTAGCAGAAGAGCAAGCA (SEQ ID n°2), et code pour un fragment peptidique dénommé G4.
TACAAAAACAGAAGTAGCAAAATATATCAATTGGACGAGGTTTAAGGATAATTGCAC
ATGGCAGCAGTGGGAGAGAGGATTACAGGGGTATGATACAAACTTAACAATACTGTT
AAAGGAATCAGCAGCAATGACACAACTAGCAGAAGAGCAAGCA (SEQ ID n°2), et code pour un fragment peptidique dénommé G4.
6°) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il correspond aux positions 8090-8259 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence :
TAAAGGCGTACGAATCTTGGAAGCTCGAGTGGCTCGAGTGGAAGCTATCACAGATAG
AATAATGCTATACCAAGAATTGGATTGTTGGCACTATCATCAATACTGTATAACCTC
TACAAAAACAGAAGTAGCAAAATATATCAATTGGACGAGGTTTAAGGATAATTGCA
(SEQ ID n°3), et code pour un fragment peptidique dénommé
G5.
TAAAGGCGTACGAATCTTGGAAGCTCGAGTGGCTCGAGTGGAAGCTATCACAGATAG
AATAATGCTATACCAAGAATTGGATTGTTGGCACTATCATCAATACTGTATAACCTC
TACAAAAACAGAAGTAGCAAAATATATCAATTGGACGAGGTTTAAGGATAATTGCA
(SEQ ID n°3), et code pour un fragment peptidique dénommé
G5.
7°) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il correspond aux positions 8049-8093 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence GATGTGTTAGAGGCAACCTATGCCATGGTACGAC
ATGTGGCTAAA (SEQ ID n°4), et code pour un fragment peptidique dénommé TM1.
ATGTGGCTAAA (SEQ ID n°4), et code pour un fragment peptidique dénommé TM1.
8°) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il correspond aux positions 8130-8165 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence GAAGCTATCACAGATAGAATAATGCTATACCAAGAA
(SEQ ID n°5) et code pour un fragment peptidique dénommé
TM2.
(SEQ ID n°5) et code pour un fragment peptidique dénommé
TM2.
9°) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il correspond aux positions 8160-8204 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence CAAGAATTGGATTGTTGGCACTATCATCAATACT
GTATAACCTCT (SEQ ID n°6) et code pour un fragment peptidique dénommé TM3.
GTATAACCTCT (SEQ ID n°6) et code pour un fragment peptidique dénommé TM3.
10°) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il correspond aux positions 8256-8297 du gène codant pour la protéine Env du VAEC, de séquence TGCACATGGCAGCAGTGGGAGAGAGGATTACAGG
GGTATGAT (SEQ ID n°7) et code pour un fragment peptidique dénommé TM4.
GGTATGAT (SEQ ID n°7) et code pour un fragment peptidique dénommé TM4.
11°) Fragment peptidique, caractérisé :
(1) en ce qu'il inclut au moins un segment de protéine Env du VAEC, sélectionné dans la région trans-membranaire de ladite protéine, (2) en ce qu'il comprend entre 5 et 85 amino-acides et au moins un épitope immunodominant, et (3) en ce qu'il est reconnu par au moins 60 %
d'anticorps produits lors d'une infection et/ou lors d'une inoculation par une souche du VAEC.
(1) en ce qu'il inclut au moins un segment de protéine Env du VAEC, sélectionné dans la région trans-membranaire de ladite protéine, (2) en ce qu'il comprend entre 5 et 85 amino-acides et au moins un épitope immunodominant, et (3) en ce qu'il est reconnu par au moins 60 %
d'anticorps produits lors d'une infection et/ou lors d'une inoculation par une souche du VAEC.
12°) Fragment peptidique selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 53 aminoacides, qui correspond aux positions 665-717 de la protéine Env du VAEC, lequel fragment est dénommé G1.
13°) Fragment peptidique selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 82 aminoacides, dénommé G2, qui correspond aux positions 670-751 de ladite protéine Env.
14°) Fragment peptidique selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 38 aminoacides, dénommé G3, qui correspond aux positions 661-698 de ladite protéine Env.
15°) Fragment peptidique selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 52 aminoacides, dénommé G4, qui correspond aux positions 732-783 de la protéine Env.
16°) Fragment peptidique selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 56 aminoacides, dénommé G5, qui correspond aux positions 694-749 de ladite protéine Env.
17°) Fragment peptidique selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 15 aminoacides, dénommé TM1, qui correspond aux positions 680-694 de la séquence de la protéine Env du VAEC et dont la formule est :
Asp-Val-Leu-Glu-Ala-Thr-Tyr-Ala-Met-Val-Gln-His-Val-Ala-Lys (SEQ ID n°8).
Asp-Val-Leu-Glu-Ala-Thr-Tyr-Ala-Met-Val-Gln-His-Val-Ala-Lys (SEQ ID n°8).
18°) Fragment peptidique selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 12 aminoacides, dénommé TM2, qui correspond aux positions 707-718 de la séquence de la protéine Env du VAEC et dont la formule est :
Glu-Ala-Ile-Thr-Asp-Arg-Ile-Met-Leu-Tyr-Gln-Glu (SEQ ID
n°9)
Glu-Ala-Ile-Thr-Asp-Arg-Ile-Met-Leu-Tyr-Gln-Glu (SEQ ID
n°9)
19°) Fragment peptidique selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 15 aminoacides, dénommé TM3, qui correspond aux positions 717-731 de ladite protéine Env, lequel segment présente la séquence :
Xaa-Glu-Leu-Asp-Cys-Trp-His-Tyr-Xaa-Xaa-Tyr-Cys-Xaa-Thr-Ser (SEQ ID n°10), dans laquelle l'aminoacide Xaa en position 1, 9 et 10 représente His ou Gln, l'aminoacide Xaa en position 13 représente Ile ou Val ; de préférence, lorsque l'aminoacide Xaa en position 9 représente His, l'aminoacide Xaa en position 10 et l'aminoacide Xaa en position 1 représentent Gln et l'aminoacide Xaa en position 13 représente Ile et lorsque l'aminoacide Xaa en position 9 représente Gln, l'aminoacide Xaa en position 10 et l'aminoacide Xaa en position 1 représentent His et l'aminoacide Xaa en position 13 représente Val.
Xaa-Glu-Leu-Asp-Cys-Trp-His-Tyr-Xaa-Xaa-Tyr-Cys-Xaa-Thr-Ser (SEQ ID n°10), dans laquelle l'aminoacide Xaa en position 1, 9 et 10 représente His ou Gln, l'aminoacide Xaa en position 13 représente Ile ou Val ; de préférence, lorsque l'aminoacide Xaa en position 9 représente His, l'aminoacide Xaa en position 10 et l'aminoacide Xaa en position 1 représentent Gln et l'aminoacide Xaa en position 13 représente Ile et lorsque l'aminoacide Xaa en position 9 représente Gln, l'aminoacide Xaa en position 10 et l'aminoacide Xaa en position 1 représentent His et l'aminoacide Xaa en position 13 représente Val.
20°) Fragment peptidique selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 14 aminoacides, dénommé TM4, qui correspond aux positions 749-762 de ladite protéine Env, lequel segment présente la séquence :
Cys-Thr-Trp-Gln-Gln-Trp-Glu-Arg-Glu-Leu-Gln-Gly-Tyr-Asp (SEQ ID n°11).
Cys-Thr-Trp-Gln-Gln-Trp-Glu-Arg-Glu-Leu-Gln-Gly-Tyr-Asp (SEQ ID n°11).
21°) Réactif de dépistage d'une infection à
VAEC, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment selon l'une quelconque des revendications 1 à 20.
VAEC, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment selon l'une quelconque des revendications 1 à 20.
22°) Anticorps anti-VAEC, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des anticorps spécifiques d'au moins un fragment peptidique issu de la zone transmembranaire de la protéine Env de VAEC selon l'une quelconque des revendications 11 à 20.
23°) Procédé de dépistage d'une infection à
VAEC et/ou à VISNA, caractérisé en ce qu'il consiste à
détecter les anticorps anti-virus, éventuellement présents dans un échantillon biologique, à l'aide d'au moins un peptide ou fragment de peptide selon l'une quelconque des revendications 11 à 20, éventuellement fixé sur un support solide approprié, en mettant en présence ledit échantillon biologique avec ledit/lesdits peptide(s) ou fragment(s) de peptides, auxquels se lient lesdits anticorps, si de tels anticorps sont présents dans l'échantillon à analyser, la lecture du résultat étant révélée par un moyen approprié, notamment EIA, RIA, fluorescence.
VAEC et/ou à VISNA, caractérisé en ce qu'il consiste à
détecter les anticorps anti-virus, éventuellement présents dans un échantillon biologique, à l'aide d'au moins un peptide ou fragment de peptide selon l'une quelconque des revendications 11 à 20, éventuellement fixé sur un support solide approprié, en mettant en présence ledit échantillon biologique avec ledit/lesdits peptide(s) ou fragment(s) de peptides, auxquels se lient lesdits anticorps, si de tels anticorps sont présents dans l'échantillon à analyser, la lecture du résultat étant révélée par un moyen approprié, notamment EIA, RIA, fluorescence.
24°) Procédé de dépistage selon la revendication 23, caractérisé en ce que le peptide est choisi parmi TM3 et TM4, ou un mélange de ceux-ci.
25°) Procédé de dépistage d'une infection à
VAEC, caractérisé en ce qu'un échantillon biologique convenablement traité pour extraire l'ADN et/ou les produits de transcription du VAEC :
(1) est mis en contact avec au moins un fragment nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, (2) après quoi, l'hybride formé est détecté.
VAEC, caractérisé en ce qu'un échantillon biologique convenablement traité pour extraire l'ADN et/ou les produits de transcription du VAEC :
(1) est mis en contact avec au moins un fragment nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, (2) après quoi, l'hybride formé est détecté.
26°) Procédé de dépistage d'une infection à
VAEC selon la revendication 25, caractérisé en ce que, préalablement à l'étape (1), ledit ADN peut être amplifié.
VAEC selon la revendication 25, caractérisé en ce que, préalablement à l'étape (1), ledit ADN peut être amplifié.
27°) Procédé de dépistage d'une infection à
VAEC, caractérisé en ce qu'il consiste à détecter les glycoprotéines d'enveloppe du VAEC, en mettant en présence un échantillon biologique à tester avec au moins un anticorps anti-peptide selon la revendication 22, la lecture du résultat étant révélée par un moyen approprié.
VAEC, caractérisé en ce qu'il consiste à détecter les glycoprotéines d'enveloppe du VAEC, en mettant en présence un échantillon biologique à tester avec au moins un anticorps anti-peptide selon la revendication 22, la lecture du résultat étant révélée par un moyen approprié.
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| Publication Number | Publication Date |
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