JP2004208695A - レンチウィルス関連疾病から動物を保護するための組成物及び方法、並びに新規ネコ免疫不全ウィルス - Google Patents
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Abstract
【課題】ネコ免疫不全ウィルス(FIV) に対する安全且つ効果的なワクチンの開発に関する。
【解決手段】特定のゲノム核酸配列を有するネコ免疫不全ウィルスの新規株(FIV-141)及びそれにより生成されるワクチンに関する。
【選択図】なし
【解決手段】特定のゲノム核酸配列を有するネコ免疫不全ウィルスの新規株(FIV-141)及びそれにより生成されるワクチンに関する。
【選択図】なし
Description
本発明は、ネコ免疫不全ウィルス(FIV)の新規株、及びこのウィルスの種々の突然変異誘発された形に向けられる。レンチウィルス関連疾病からの動物の保護に使用され得る組成物及び方法が開示される。
ネコにおけるネコ免疫不全ウィルス(FIV)感染は、ヒトにおけるヒト免疫不全ウィルス−1(HIV-1) 感染により引き起こされる症状に類似する疾病症状をもたらす。疾病の進行は、過渡的急性期 (transient acute phase)(8〜10週)で開始し、続いて延長された無症候性期(prolonged asymptomatic phase) (数週間〜数年続く)、及び最終症候性期(ferminal symptomatic phase)が続く(Ishidaなど.、1990, Jan. J. Vet. Sci. 52 : 645-648)。血漿におけるウィルス負荷は、感染されたネコにおける疾病段階と相互関連することが示されており、そして促進されたFIV感染における疾病進行を予測するために使用され得る( Diehlなど. 、1996, J. Virol. 70 : 2503-2507)。
構造的に、FIV タンパク質は2種の長い末端反復体(long terminol repeat)(LTR)(ゲノムのいづれかの端で1つの反復体)を含む( Talbottなど. 、1989, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86 : 5743-5747 )。3種の大きなオープンリーディングフレーム(Gag)(グループ抗原); Pol(ポリメラーゼ);及び ENV(エンベロープ))、及び調節タンパク質をコードする3種の小さなオープンリーディングフレーム(Rev(regulaton of expression of virion)(ビリオンの発現のレギュレーター、すなわちすべてのウィルス転写体に存在する“RRE”要素に結合し、そして感染された宿主細胞の細胞質への核からのそれらのトランスロケーションを促進せしめるタンパク質);Vif(virion infectivify factor)(ビリオン感染性因子);及びORF(2)(オープンリーディングフレーム2))。FIV の Gag前駆体ポリペプチドは、3種の成熟構造タンパク質:マトリックスタンパク質(MA)、カプシドタンパク質(CA)及びヌクレオカプシドタンパク質(NC)にプロセッシングされる。Pol 遺伝子は次の4種の酵素タンパク質:プロテアーゼ(PR)、逆転写酵素(RT)、デオキシウリジントリホスファターゼ(DU)及びインテグラーゼ(IN)、をコードする。
最後に、 ENV駆体ポリペプチドは、次の2種のエンベロープタンパク質:表面タンパク質(SU)及びトランスメンブラン(TM)タンパク質、にプロセッシングされる。
FIV に対する安全且つ効果的なワクチンを開発するいくつかの試みが存在する。 Matteucciは、従来の固定された細胞ワクチンにより接種されたネコが、ワクチン接種の後、中和抗体の見かけ上の不存在にもかかわらず、相同ウィルス(homologous virus)による攻撃から保護されたことを見出した。保護は、短く続き、そして追加免疫することが困難であることが見出された( Matteucciなど.、1996, J. Virol. 70 : 617-622 ; Matteucciなど. 、1997, J. Virol. 71 : 8308-8376)。これらの結果は、固定された細胞ワクチンの投与の後、保護を観察しなかった Verschourの結果と対比され得る ( Verschourなど.、1995, Vet. Immunol. Immunopathol. 46 : 139-149)。
FIV に対する安全且つ効果的なワクチンを開発するいくつかの試みが存在する。 Matteucciは、従来の固定された細胞ワクチンにより接種されたネコが、ワクチン接種の後、中和抗体の見かけ上の不存在にもかかわらず、相同ウィルス(homologous virus)による攻撃から保護されたことを見出した。保護は、短く続き、そして追加免疫することが困難であることが見出された( Matteucciなど.、1996, J. Virol. 70 : 617-622 ; Matteucciなど. 、1997, J. Virol. 71 : 8308-8376)。これらの結果は、固定された細胞ワクチンの投与の後、保護を観察しなかった Verschourの結果と対比され得る ( Verschourなど.、1995, Vet. Immunol. Immunopathol. 46 : 139-149)。
試験されたもう1つのタイプの従来のワクチンは、全(whole)不活性化された(ateruatert)FIVウィルスから構成される。Yamamotoは、このタイプのワクチンを投与されたネコの90%以上が、相同性攻撃(homologous challenge) に対しての実質的に完全な保護及び異種ウィルスに対するわずかな保護を示したことを報告している(Yamamotoなど.、1993, J. Virol. 67 : 601-605)。FIV に対する体液性(humoral)及び細胞性(cellular)免疫性が誘発され、そして高レベルの抗−ENV 、抗−コア及びウィルス中和(VN)抗体が、ワクチン接種されたネコに観察された。対照的に、免疫刺激複合体(immune stimulating complexs)(ISCOMs)中に組込まれた不活性化された(inactivated)全(whole)FIVによるネコの予防接種は、相同性攻撃から動物を保護するのに失敗した( Hosieなど. 、1992, Vet. Immunol. Immunopathol. 35 : 191-197)。
ワクチン開発のためのもう1つのアプローチは、組換えコアタンパク質、合成V3タンパク質及び組換え ENVタンパク質を含むサブユニットワクチンの使用を包含した( Elyarなど.、1997, Vaccine 15 : 1437-1444)。有意なレベルの抗体がそのようなワクチンにより誘発されたが、相同FIV攻撃に対してネコを保護し得たことは、同定されなかった( Huismanなど.、1998, Vaccine 16 : 181-187 ; Flynnなど. 、1997, J. Virol. 71 : 7586-7592 ; Tijhaarなど.、1997, Vaccine 15 : 587-596)。その結果は、サブユニットタイプワクチンを用いてFIVに対する保護免疫を得ることはたぶん困難であることを示唆する。
最近、 Cuisinierは、 FIVのためのDNAワクチンに対して行なわれた試験を報告している( Cuisinierなど.、1997, Vaccine 15 : 1085-1094)。ネコが、ENV 及び p10を含む、 FIV構造遺伝子を担持するプラスミドによりワクチン接種された。強い体液性免疫応答が観察されたが、すべてのネコは結果的に、相同性攻撃に負けた。
本発明は、FIV-141 として本明細書において命名されるネコ免疫不全ウィルスの新規株の単離及び特徴化に一部、基づいている。前記ウィルスの完全なゲノム配列が決定され、そしてそれはすべての他の既知 FIV配列と異なる。FIV-141 をコードするプラスミドは、ATCC No.203001として寄託された。
A. FIV-141ウィルスに基づく組成物及び方法
第1の観点において、本発明は、配列番号1のゲノム配列に対応するゲノム配列を有する、実質的に精製された FIV-141ウィルス、前記ウィルスにより感染された宿主細胞、及び宿主細胞において生成される子孫ウィルスに向けられる。用語“実質的に精製された”とは、FIV-141 がすべての他のウィルス株及び特に、FIV のすべての他の株から分離されていることを意味する。ウィルスを増殖するために使用され得る宿主細胞は、末梢血単核細胞(PBMC)を包含する。子孫ウィルスは、下記に論ぜられるような標準的方法を用いて単離され得る。
第1の観点において、本発明は、配列番号1のゲノム配列に対応するゲノム配列を有する、実質的に精製された FIV-141ウィルス、前記ウィルスにより感染された宿主細胞、及び宿主細胞において生成される子孫ウィルスに向けられる。用語“実質的に精製された”とは、FIV-141 がすべての他のウィルス株及び特に、FIV のすべての他の株から分離されていることを意味する。ウィルスを増殖するために使用され得る宿主細胞は、末梢血単核細胞(PBMC)を包含する。子孫ウィルスは、下記に論ぜられるような標準的方法を用いて単離され得る。
FIV-141ウィルス及びそのウィルスにより感染された宿主細胞は、1又は複数の FIV株と選択的に反応する抗体の生成の誘発のために動物に感染せしめるために使用され得る。抗体の“選択的結合”とは、本明細書において使用される場合、いづれかの他ウィルス又は非−FIV タンパク質に対してよりもFIVに対して少なくとも100倍以上の親和性を有する抗体を意味する。抗体は、この目的のために通常使用されるいづれかの動物(たとえば、マウス、ウサギ、ヤギ又はヒツジ)において生成され得るが、しかし好ましくは、抗体はネコにおいて生成されるであろう。
ウィルスが抗体生成を誘発するために使用される場合、それは、所望には、感染の前に不活性化され得る。不活性化方法は、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、フェノール、ラクトプロピオネート、紫外線、加熱、プソルレン(psorlen)、白金錯体、オゾン又は他の殺ウィルス剤によるウィルスの処理を包含する。FIV-141 を発現する宿主細胞が抗体生成を誘発するために使用される場合、細胞は、感染の前に固定され得る。
典型的には、これは、本明細書に記載されるようなパラホルムアルデヒドにより細胞を処理することを包含するが、しかし他の方法もまた使用され得る。FIV-141 に対して生産される抗体は、それら自体、本発明の範囲内に包含され、そして当業界においてよく知られている技法を用いて精製され得る(たとえば、Harlowなど.、1988, Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. を参照のこと)。
もう1つの観点において、本発明は、不活性化された FIV-141ウィルスを含んで成る全(whole)ウィルスワクチンに向けられる。免疫応答は、FIV-141 による続く感染に対して保護免疫を誘発するのに十分な用量で及び十分な期間、このワクチンを投与することによって、ネコにおいて誘発され得る。典型的には、ワクチンは非経口投与され、そして複数回の接種がたとえば2〜8週の間隔で与えられる。本発明はまた、 FIV-141ウィルスにより感染された宿主細胞から構成される、固定された細胞ワクチンも包含する。このワクチンの投与は、全(whole)ウィルスワクチンのために使用されるのと同じ一般的な方法に従うであろう。当業界においてよく知られている標準的方法が、免疫化プロトコールを最適化するために使用され得る。
B. FIV-141ゲノム核酸に基づく組成物及び方法
もう1つの観点においては、本発明は、配列番号1の配列に対応する配列を有する、実質的に精製された核酸分子(DNA又はRNA)に向けられる。この文脈において使用される場合、“実質的に精製された”とは、所望の生成物が汚染性細胞成分を実質的に有さないことを意味する。“実質的に純粋な”核酸は典型的には、サンプルの少なくとも85%を構成し、そしてより高い百分率が好ましい。汚染物は、タンパク質、炭水化物又は脂質を包含する。
もう1つの観点においては、本発明は、配列番号1の配列に対応する配列を有する、実質的に精製された核酸分子(DNA又はRNA)に向けられる。この文脈において使用される場合、“実質的に精製された”とは、所望の生成物が汚染性細胞成分を実質的に有さないことを意味する。“実質的に純粋な”核酸は典型的には、サンプルの少なくとも85%を構成し、そしてより高い百分率が好ましい。汚染物は、タンパク質、炭水化物又は脂質を包含する。
核酸の純度を決定するための1つの方法は、マトリックス、たとえばポリアクリルアミド又はアガロースにおける調製物の電気泳動による。純度は、染色の後、単一のバンドの出現により明らかにされる。純度を評価するための他の方法は、クロマトグラフィー及び分析遠心分離を包含する。 FIV-141核酸が、宿主細胞をトランスフェクトし、そしてそれにより、子孫ウィルス又はウィルスタンパク質の生成を誘発するために、全(whole)ウィルスの代わりに使用され得る。
本発明はまた、核酸を動物中に直接的に注射し、又は核酸によりトランスフェクトされた宿主細胞を投与することによって、FIV-141 に対する抗体の生成を誘発する方法も包含する。完全ウィルスに関して上記に論ぜられる方法に関しては、宿主細胞が、投与の前に固定され得る。抗体は、動物から精製され得、そして培養培地又は生物学的流体中の FIVの存在を検出するために企画されたアッセイにおいて使用され得る。
FIV-141ゲノムDNAによりトランスフェクトされた宿主細胞はまた、ネコを免疫化するためにワクチンにおいても使用され得る。所望により、そのような細胞は、たとえばホルムアルデヒドのような剤による処理により、ウィルス感染性を低めるために固定され得る。この態様で製造されたワクチンは、ネコにおいて免疫応答を誘発するために使用され得る。ワクチンは、FIV-141 又は所望により、FIV のいくつかの他の株による続く感染に対する保護免疫の誘発のために最適化された標準的免疫化プロトコールを用いて投与され得る。
C.弱毒化された FIV-141ウィルス及びワクチン
全(whole)ウィルスがワクチンとして動物に投与される前、それは非病原体形に転換されるべきである。上記で論ぜられたように、これは、ウィルスを不活性化し、又は宿主細胞を固定することによって達成され得る。他の方法は、ウィルスを弱毒化された形に形質転換するためにウィルス中への突然変異を導入することを包含する。用語“弱毒化されたウィルス”(atteruated virus)とは、本明細書において使用される場合、その野生型対応物と比較して、実質的に低められた感染性を有するウィルスを意味する。感染性は、下記例のセクションに記載されるように、PBMCにおいて測定され得る。
全(whole)ウィルスがワクチンとして動物に投与される前、それは非病原体形に転換されるべきである。上記で論ぜられたように、これは、ウィルスを不活性化し、又は宿主細胞を固定することによって達成され得る。他の方法は、ウィルスを弱毒化された形に形質転換するためにウィルス中への突然変異を導入することを包含する。用語“弱毒化されたウィルス”(atteruated virus)とは、本明細書において使用される場合、その野生型対応物と比較して、実質的に低められた感染性を有するウィルスを意味する。感染性は、下記例のセクションに記載されるように、PBMCにおいて測定され得る。
従って、本発明は、野生型(すなわち突然変異誘発されていない)ウィルスに比べてネコTリンパ球のための有意に低められた感染性を示す弱毒化された FIV-141ウィルスに向けられる。弱毒化されたウィルスは、Vif, MA, ORF(2), ENV, CA, NC, SU, TMf, CT, IN, DU, V3/4, V7/8 及びRRE から成る群から選択された FIV-141ゲノムにおいて1又は複数の遺伝子を突然変異誘発することによって生成される。
それらの遺伝子の個々のための適切な突然変異が本明細書において記載されている。弱毒化されたウィルスの製造に使用され得るいくつかの特定の突然変異の例は、MA del, ENV del, V3/4 del, V7/8 del, TMf del, CT del, Vif del, Vifc del, Vifn del, ORF(2) del, CA del, NC del, IN del, DU del, SU del 、及び RRE delを包含する。本発明はまた、弱毒化されたウィルスにより感染された宿主細胞、及びそのような細胞により生成された孫ウィルスを包含する。生成されるとすぐに、弱毒化されたウィルスは、標準的方法を用いて、宿主細胞から精製され得る。
抗体生成は、弱毒化されたウィルスを動物に感染せしめることによって誘発され得、あるいは、感染された宿主細胞が使用され得る。所望により、動物への投与の前に、ウィルスは不活性化され、又は宿主細胞は固定され、そして抗体が標準的方法を用いて動物から精製され得る。
さらに、本発明は、上記に論ぜられる弱毒化された全ウィルス又はそれらのウィルスの1つにより感染された宿主細胞を用いるワクチンを包含する。再び、弱毒化されたウィルスは、不活性化されてもよく、そして宿主細胞は固定されてもよい。そのような処理は、ワクチンがそれら自体、感染を引き起こさないであろう追加の保証を提供することができる。1又は複数の弱毒化された FIV-141ウィルスに基づくワクチンは、ネコにおいて保護免疫性を誘発するために使用され得る。標準的免疫化プロトコールは、 FIV-141による続く攻撃に対する保護免疫性の誘発を最適化するためにワクチンを投与することを包含する。
D.突然変異誘発された FIV-141ゲノムDNAに基づく組成物及び方法
もう1つの観点において、本発明は、配列番号1に対応する配列を有するが、しかし弱毒化されたウィルスをコードするよう突然変異誘発されている、実質的に精製された FIV-141核酸(DNA又はRNA)に向けられる。突然変異は、Vif, MA, CA, NC, SU, TMf, ORF(2), CT, ENV, Vifn, Vifc, IN, DU, V3/4, V7/8 及びRRE から成る群から選択された1又は複数の遺伝子に対してであるべきであり、そして宿主細胞中への導入の後に、野生型ウィルスに対してネコTリンパ球(又は他の感受性細胞型)のために有意に低められた感染性を有するウィルスが生産されるような態様で生成されるべきである。
もう1つの観点において、本発明は、配列番号1に対応する配列を有するが、しかし弱毒化されたウィルスをコードするよう突然変異誘発されている、実質的に精製された FIV-141核酸(DNA又はRNA)に向けられる。突然変異は、Vif, MA, CA, NC, SU, TMf, ORF(2), CT, ENV, Vifn, Vifc, IN, DU, V3/4, V7/8 及びRRE から成る群から選択された1又は複数の遺伝子に対してであるべきであり、そして宿主細胞中への導入の後に、野生型ウィルスに対してネコTリンパ球(又は他の感受性細胞型)のために有意に低められた感染性を有するウィルスが生産されるような態様で生成されるべきである。
適切な弱毒化されたウィルスを生成するであろういくつかの特定の突然変異の例は、本明細書において記載されており、そして MA del, ENV del, V3/4 del,V7/8 del, TMf del, CT del, Vif del, Vifc del, Vifn del, ORF(2) del, SU del, CA del, NC del, IN del, DU del,及び RRE delを包含する。本発明は、突然変異誘発された核酸によりトランスフェクトされた宿主細胞、及び該宿主細胞により生成された FIV子孫ウィルスを包含する。
上記のようにして突然変異誘発された核酸又は前記核酸によりトランスフェクトされた宿主細胞のいづれかを注射することによって、動物においてFIVに対する抗体の生成を誘発する方法もまた、本発明の範囲内に包含される。所望により、宿主細胞は、投与の前に固定され得る。生成される抗体は、標準的方法を用いて精製され得、そして FIVの存在を検出するよう企画されたアッセイに使用され得る。
突然変異誘発されている核酸、好ましくはDNAは、それがネコへの投与の後に保護免疫性を誘発するのに十分な濃度で存在するワクチンにおいて使用され得る。あるいは、ワクチンは、そのようなDNAによりトランスフェクトされた宿主細胞を含むことができ、そして所望により、宿主細胞は、ウィルスタンパク質が発現された後に固定され得る。ワクチンはネコにおいて免疫応答を誘発するのに十分な用量で且つ十分な期間にわたり投与され得、そして免疫化プロトコールは FIV-141による続く感染に対して保護免疫性を誘発するために最適化され得る。
E.弱毒化されたレンチウィルスの製造及び使用方法
弱毒化された FIV-141の生成に関して本明細書に開示される方法は、他のFIV株の弱毒化及び他のタイプのレンチウィルスにも効果的に適用され得る。その突然変異誘発されていない野生型対応物に比べて有意に低められた感染性を有するウィルスは、MA, CA, NC, DU, ENV, SU, TMf, CT, Vif, ORF(2), Vifn, Vifc, IN, V3/4, V7/8 、及び RREから成る群から選択された1又は複数の遺伝子を突然変異誘発することによって製造され得る。突然変異は、遺伝子生成物の活性を排除し、又は実質的に低めるよう企画されるべきである。
弱毒化された FIV-141の生成に関して本明細書に開示される方法は、他のFIV株の弱毒化及び他のタイプのレンチウィルスにも効果的に適用され得る。その突然変異誘発されていない野生型対応物に比べて有意に低められた感染性を有するウィルスは、MA, CA, NC, DU, ENV, SU, TMf, CT, Vif, ORF(2), Vifn, Vifc, IN, V3/4, V7/8 、及び RREから成る群から選択された1又は複数の遺伝子を突然変異誘発することによって製造され得る。突然変異は、遺伝子生成物の活性を排除し、又は実質的に低めるよう企画されるべきである。
これは、完全な遺伝子を欠失するか、又は完全な遺伝子の大きな(たとえば1/4)部分を欠失することによって達成され得る。本発明は、開示される方法を用いて製造された弱毒化されたレンチウィルス、それらのウィルスにより感染された宿主細胞、及び哺乳類中に弱毒化されたウィルスを注射することによって抗体生成を誘発する方法を包含する。抗体は、感染された哺乳類から精製され、そしてイムノアッセイに使用され得る。他方では、精製された抗体、又は弱毒化されたウィルスにより感染された動物に由来する抗体含有血清は、ウィルス感染を治療するために使用され得る。
本明細書において使用される場合、用語“保護免疫(性)の誘発”及び同様の用語は、特定のレンチウィルスに対してワクチン接種された哺乳類を保護するために作用する、抗体もしくは細胞介在免疫応答のいづれか、又は両者を包含する、ワクチン接種に応答してのいづれかの免疫に基く応答(immune-based response)の誘発を包含するよう広く使用される。用語“保護免疫性”、“保護応答”、“保護する”、及び同様の用語は、本明細書において使用される場合、特定のレンチウィルスによる感染に起因する、哺乳類における徴候もしくは症状のいづれかの絶対的保護のみならず、さらに、そのようないづれかの徴候もしくは症状の開始のいづれかの検出できる遅延、特定のレンチウィルスによる感染の程度もしくは速度のいづれかの検出できる低下、又は特定のレンチウィルスによる感染に起因する疾病、又はいづれかの徴候もしくは症状の重症度のいづれかの検出できる低下も意味する。
本発明のワクチン調製物は、哺乳類の感染に関連する1又は複数の臨床学的徴候及びウィルス負荷を減じるのに十分な用量で及び十分な期間にわたり投与されるべきである。レンチウィルスがFIV株である場合、処理される哺乳類はネコであり、そしてその感染に関連する徴候は、免疫学的異常、たとえば異常に低レベルの CD4+ T −リンパ球、又は異常に高められた数の CD8+ T −リンパ球を包含するであろう。他の臨床学的徴候は典型的には、脱毛症、貧血、慢性鼻炎、結膜炎、下痢、るいそう(emaciation)、腸炎、歯肉炎、血便排泄、神経学的異常性及び皮膚炎を包含するであろう。
弱毒化されたレンチウィルス(たとえば、弱毒化された FIV株)、又はそのようなウィルスにより感染された宿主細胞は、哺乳類(たとえばネコ)に投与される場合、免疫性を誘発するのに十分な濃度でワクチンにおいて使用され得る。次に、少なくとも1つのレンチウィルス株による続く感染に対する保護免疫性を誘発するのに十分な用量で及び十分な期間、そのようなワクチンを投与することによって免疫応答が誘発され得る。
F.突然変異誘発されたレンチウィルス核酸の製造及び使用方法
本発明はまた、レンチウィルス、たとえば FIV感染に対するワクチンへの使用のために適切な核酸を生成するための方法にも向けられる。これは、レンチウィルスのゲノムRNAを逆転写し;その逆転写物をクローニングし;MA, CA, NC, SU, TMf, ORF(2), CT, ENV, Vif, Vifn, Vifc, V3/4, V7/8, IN, DU 、及びRRE から成る群から選択された1又は複数の遺伝子を突然変異誘発し;そして次に、その突然変異誘発された核酸をクローニングする、ことによって達成される。好ましくは、突然変異は、宿主細胞中への導入の後に、突然変異誘発されていない野生型核酸により生成されるレンチウィルスに対して有意に低められた感染性を有する弱毒化されたウィルスが生産されるよう実施されるべきである。FIV の場合、感染性はネコT−リンパ球に関して低められるか又は排除されるべきである。
本発明はまた、レンチウィルス、たとえば FIV感染に対するワクチンへの使用のために適切な核酸を生成するための方法にも向けられる。これは、レンチウィルスのゲノムRNAを逆転写し;その逆転写物をクローニングし;MA, CA, NC, SU, TMf, ORF(2), CT, ENV, Vif, Vifn, Vifc, V3/4, V7/8, IN, DU 、及びRRE から成る群から選択された1又は複数の遺伝子を突然変異誘発し;そして次に、その突然変異誘発された核酸をクローニングする、ことによって達成される。好ましくは、突然変異は、宿主細胞中への導入の後に、突然変異誘発されていない野生型核酸により生成されるレンチウィルスに対して有意に低められた感染性を有する弱毒化されたウィルスが生産されるよう実施されるべきである。FIV の場合、感染性はネコT−リンパ球に関して低められるか又は排除されるべきである。
突然変異誘発されたレンチウィルス核酸は、精製され、そして FIV-141について上記に記載されるのと同じ手段で、宿主細胞をトランスフェクトし、子孫ウィルスを生成せしめ、そして抗体を製造するために使用され得る。さらに、核酸、又はその核酸によりトランスフェクトされた宿主細胞が、ワクチン中に導入され、そして哺乳類に保護免疫性を誘発するために使用され得る。好ましくは、核酸は、T−リンパ球、たとえばFeP2細胞を包含するネコPBMCにおいて有意に低められた感染性を有する弱毒化された FIV株をコードするであろう。それらの環境下で、免疫応答がネコにおいて誘発されるであろう。
図1:トランスフェクトされた細胞からの FIV生成。クランデル(Crandell)ネコ腎臓(CRFK)細胞を、十分な長さの FIV-141ゲノムを含んで成るプラスミドによりトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、細胞上清液が収穫され、そして酵素イムノアッセイを用いて、FIV p26 カプシドタンパク質の存在についてアッセイされた。
図2:同時培養による FeP2Tリンパ球の感染。CRFK細胞が6個のウェルプレートにおいて増殖され、そして十分な長さの FIV-141ゲノムをコードするプラスミドDNAによりトランスフェクトされた。トランスフェクションの48時間後、2×106 個のFeP2細胞が個々のウェル中に導入された。同時培養の72時間後、FeP2細胞が分離され、そしてそれらの上清液が ELISAにより FIV p26カプシドタンパク質の存在について試験された。
図3:FeP2細胞の吸着による感染。FeP2細胞が、十分な長さの感染性 FIV-141クローンによりトランスフェクトされたCRFK細胞に由来する、 FIV-141ウィルス含有ならし培地200μlに懸濁された。感染の4日後、FeP2細胞上清液が、 p26 ELISAアッセイを用いて、 FIV-141ウィルスの存在について試験された。
図4:欠失クローンによる FIV-141ウィルスタンパク質の発現。 FIV遺伝子又は調節領域を欠失するように突然変異誘発された種々のクローンが製造され、そしてCRFK細胞中にトランスフェクトされた。48時間後、細胞上清液が ELISAにより FIV p26カプシドタンパク質の存在についてアッセイされた。個々の欠失クローン、及び野生型 FIV-141分子クローンについての結果が示される。
図5〜10: FIV-141変異体によるFeP2 Tリンパ球の感染。CRFK細胞が6個のウェルプレート上で増殖され、そして次の3種の異なった FIV-141欠失クローン: TMf del, ENV del 又は NC del の1つにより感染された。48時間後FeP2細胞が個々のウェルに添加され、そしてさらに72時間、同時培養が維持された。次に、FeP2細胞がCRFK細胞から分離され、そして ELISAアッセイを用いてp26抗原の存在についてアッセイされた。 p26レベルのモニターが、3〜4日ごとに反復され、そして結果が図5に示される。実験が次のものを用いて反復された: Vifn del, Vifc del 及び Vif del(図6);MA del及び CA del(図7);V3/4 del, V7/8 del 及び CT del (図8);ORF(2) del(図9);及びDU del, SU del, IN del及びRRE del(図10)。
本発明の詳細な記載
A. FIV-141の生産、及びこのウィルスをコードするDNA
本発明は、そのゲノム核酸配列及び生物学的機能に基づいてのすべての類似する株とは区別されるネコ免疫不全ウィルスの新規株(本明細書において“FIV-141 ”と命名される)に向けられる。 FIV-141のゲノムはRNAから成るが、これはDNA中に逆転写され、そして感染された宿主のゲノム中に組込まれる。FIVの配列、及びそのような配列の突然変異誘発された形に関する本明細書における言及が、逆転写されたウィルスRNA配列及びその対応するDNA自体の両者を包含することが理解されるであろう。
A. FIV-141の生産、及びこのウィルスをコードするDNA
本発明は、そのゲノム核酸配列及び生物学的機能に基づいてのすべての類似する株とは区別されるネコ免疫不全ウィルスの新規株(本明細書において“FIV-141 ”と命名される)に向けられる。 FIV-141のゲノムはRNAから成るが、これはDNA中に逆転写され、そして感染された宿主のゲノム中に組込まれる。FIVの配列、及びそのような配列の突然変異誘発された形に関する本明細書における言及が、逆転写されたウィルスRNA配列及びその対応するDNA自体の両者を包含することが理解されるであろう。
部位特定突然変異誘発のような技法が核酸の構造体中に変動を導入するために使用され得ることは、よく知られている。この方法又はいくつかの類似する方法により導入される FIV-141核酸配列における突然変異は、本発明により包含され、但し得られるウィルスの少なくとも1つの主要生物学的特徴、たとえばその抗原性はそれが由来するウィルスの抗原性と実質的に同じに存続する。好ましい非制限的態様においては、野生型株の感染性に比較して、 FIV-141の感染性を検出できるほどに低める突然変異誘発は、本発明の範囲内である。たとえば、複製するが、しかし非常に低められた感染性を示すウィルスを生成する、ENV遺伝子における特定の突然変異が下記に記載されている。本発明は、この突然変異、及び実質的に低められたウィルス感染性をもたらす他の突然変異の両者を包含する。
実験セクションにおいて論ぜられるように、完全な FIV-141ゲノムがクローン化され、そして十分な長さの配列を含むプラスミドが ATCC No.203001 として寄託されている。このプラスミドを単離し、そしてそれを、ウィルス生成を支持することができる宿主細胞中にトランスフェクトするために、標準的方法が使用され得る。
クランデル(Crandell)ネコ腎臓(CRFK)細胞が、この目的のために適切であることが見出されているが、しかし他の細胞型、たとえばネコTリンパ球細胞が同様に使用され得る。いくつかの場合、ウィルスを発現する宿主細胞は直接的に使用され得、たとえばそれらは収穫され、そして抗体を生成するために、又はワクチンに使用され得る。他方では、前記細胞において生成されるウィルスは、既知の分離技法、たとえばスクロース−グラジエント遠心分離を用いて、高度に精製された形で単離され得る。そのような方法は、野生型ウィルス及びそのウィルスの変異形の両者のために効果的である。
FIV-141ゲノムを得るための他の方法は、配列番号1での配列要素に対応するプライマーを用いて、PCR増幅を実施することである。一般的に、プライマーは、約20〜50個の長さの塩基であるべきである。完全な FIV-141ゲノムを増幅するための方法が企画され得、又は他方では、前記ゲノムの一部が別々に増幅され、そして次に、十分な長さの配列を形成するために一緒に連結され得る。下記実施例のセクションは、効果的であることが見出されている特定のプライマー及び方法を記載しているが、しかし他の方法も同様に開発され、そして使用され得る。
ウィルスが天然源から単離される場合、PCRのためのプライマーは、FIV-141 に対してユニークな配列に対応すべきである。そのようなプライマーを用いての好都合な増幅は、感染を担当するウィルスが実際、FIV-141 であることを示すであろう。従って、PCRは、診断的に、及びウィルスを単離するための方法において使用され得る。
B.不活性化されたウィルス及び固定された宿主細胞の生成
FIV-141 ウィルスは、適切な宿主及びワクチンにおいて抗体を生成するために使用され得る。いづれの場合においても、動物へのその投与の前にウィルスを不活性化することが通常所望されるであろう。不活性化は、当業界において知られているいづれかの手段により達成され得る。たとえば、ウィルスが精製され、そして次に、0.8%ホルマリン又は1.25%パラホルムアルデヒド中での約24時間のインキュベーションにより不活性化される。そのような方法は、野生型又は変異ウィルスのいづれかにより使用され得る。
FIV-141 ウィルスは、適切な宿主及びワクチンにおいて抗体を生成するために使用され得る。いづれの場合においても、動物へのその投与の前にウィルスを不活性化することが通常所望されるであろう。不活性化は、当業界において知られているいづれかの手段により達成され得る。たとえば、ウィルスが精製され、そして次に、0.8%ホルマリン又は1.25%パラホルムアルデヒド中での約24時間のインキュベーションにより不活性化される。そのような方法は、野生型又は変異ウィルスのいづれかにより使用され得る。
FIV-141 により又はそのウィルスの突然変異誘発された形により感染された宿主細胞を用いて、抗体がまた生成され、又は免疫化が達成され得る。ウィルス複製を支持することができるいづれかの宿主細胞、たとえば末梢血液単核細胞(PBMC)が使用され得る。通常、細胞は、動物への投与の前に固定されるべきである。固定化は、パラホルムアルデヒド(たとえば1.25%)により37℃で約24時間、細胞を処理することによって実施され得る。ウィルスを不活性化するための上記に論ぜられる他の方法はまた、当業界において開示されるいづれか他の方法と同じように、細胞を固定するためにも使用され得る。
C.弱毒化されたウィルスの生成
上記で論じられたように、ワクチンは、不活性化されたウィルス又は固定された宿主細胞のいづれかを用いて生成され得る。他の方法は、ウィルスゲノム中の1又は複数の遺伝子を突然変異誘発することによって弱毒化されているウィルスを使用する。目的は、ネコに投与される場合、感染性でないウィルスを生成することである。
上記で論じられたように、ワクチンは、不活性化されたウィルス又は固定された宿主細胞のいづれかを用いて生成され得る。他の方法は、ウィルスゲノム中の1又は複数の遺伝子を突然変異誘発することによって弱毒化されているウィルスを使用する。目的は、ネコに投与される場合、感染性でないウィルスを生成することである。
ウィルス複製の速度は、ウィルスにより細胞(たとえば、PBMC)を感染し、そして次に、時間と共にいかにしてウィルスレベルが変化するかを決定することによって、インビトロで決定され得る。複製は、定量PCRにより、又はウィルスに対して特異的な酵素(たとえば逆転写酵素)の活性を測定することによって、FIVに対して特異的な抗原を測定する免疫学的アッセイを用いて追跡され得る。感染性は、ウィルスにネコTリンパ球(たとえばFeP2細胞)を暴露し、そして細胞がウィルスを摂取し、そして複製を支持する程度を決定することによって決定され得る(下記例4を参照のこと)。
FIV-141ゲノムにおける突然変異は、部位特定突然変異誘発により行なわれ得る。これを実施するための1つの手段は、正常な遺伝子配列中に変更を導入するプライマーによりウィルス遺伝子を増幅することである。たとえば、ユニーク制限部位がゲノムの選択された領域において導入され得、そして次に、そのような部位間の配列が制限酵素消化により切除され得る。切除の後、残るゲノムDNAの部分が再連結され、そして次に、適切な宿主細胞中に導入され、突然変異誘発されたウィルスが生成され得る、突然変異誘発されたウィルス及び突然変異誘発されたウィルスゲノムの製造及び試験の詳細な記載は、下記例3及び4に提供される。導入されている種々の突然変異の要約が表1及び表2に見出され得る。
抗体生成を誘発するために動物への投与のために又はワクチンへの使用のために適切な弱毒化されたウィルスを生成するいくつかの特定の突然変異の例は、MA del, ENV del, V3/4 del, V7/8 del, TMf del, CT del, Vif del, Vifc del, Vifn del, ORF(2) del, CA del, NC del, SU del, IN del, DU del 、及び RRE delである。従って、Vif, MA, ORF(2), ENV, Vifn,Vifc, V3/4, V7/8, TMf, CT, SU, CA, NC, IN, DU又は RRE遺伝子のいづれかにおいて突然変異誘発されたウィルスが弱毒化され、そしてそれらの遺伝子を不活性化する他のヌクレオチド欠失又は変更が、類似する特徴を有するウィルスを生成すべきである。
D.FIV-141 に対する抗体の生成、及び感染されたネコの処理
FIV-141 に対する抗体は、抗体生成のために典型的に使用される動物、たとえばマウス、ウサギ、等のいづれかにおいて生成され得る。しかしながら、好ましくは、抗体はネコにおいて生成される。野生型ウィルスが抗原として使用される場合、ウィルスは、投与の前に不活性化されるべきである。弱毒化されたウィルス、たとえばそれらの感染性を低め又は排除するために突然変異誘発されたウィルスが使用される場合、宿主細胞の不活性化、又は固定化は必要とされないが、但し、それらの方法は、所望により実施され得る。
FIV-141 に対する抗体は、抗体生成のために典型的に使用される動物、たとえばマウス、ウサギ、等のいづれかにおいて生成され得る。しかしながら、好ましくは、抗体はネコにおいて生成される。野生型ウィルスが抗原として使用される場合、ウィルスは、投与の前に不活性化されるべきである。弱毒化されたウィルス、たとえばそれらの感染性を低め又は排除するために突然変異誘発されたウィルスが使用される場合、宿主細胞の不活性化、又は固定化は必要とされないが、但し、それらの方法は、所望により実施され得る。
ウィルスを含む組成物は、いづれかの経路により動物に投与され得るが、動物は典型的には、筋肉内、皮下又は静脈内注射され得る。一般的に、ウィルス調製物は、アジュバント、たとえば完全又は不完全フロイントアジュバントを含むであろう。注射のための適切な調製法、注射スケジュール、及び同様のことは、当業界においてよく知られており、そして FIV-141及びその変異体のために使用され得る(たとえば、Harlowなど.、1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. ; Klein, 1982, Immunology : The Science of Self-Nonself Discrimination を参照のこと)。モノクローナル抗体もまた使用され得、そして標準的方法を用いて製造され得る( Kennettなど.、1980, Monoclonal Antibodies and Hybridomas : A New Dimension in Biological Analysis ; Campbell, 1984, "Monoclonal Antibody Technology,", Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology) 。
FIV-141 に対する特異性を伴って反応する(すなわち、いづれかの他のウィルスに対してよりも FIV-141に対して少なくとも100倍以上の親和性を有する)抗体又は抗体フラグメントはまた、いづれかの種々のイムノアッセイにも使用され得る。たとえば、抗体は、“2−部位”又は“サンドイッチ”アッセイとしても知られている、ラジオイムノアッセイ又は免疫計量アッセイにおいて FIV-141を検出するために使用され得る(Chard, 1978, "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques," Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, North Holland Publishing Co. N.Y.を参照のこと) 。
典型的な免疫計量アッセイにおいては、多量のラベルされていない抗体が、試験される流体、たとえば血液、リンパ、細胞抽出物、等に不溶性である固体支持体に結合される。固定された抗体への抗原の初期結合の後、多量の検出可能的にラベルされた第2抗体(第1抗体と同じであっても、同じでなくてもよい)が添加され、抗原の検出及び/又は定量化を可能にされる(たとえば、 Kirkhamなど.(ed.), 1970, Radioimmune Assay Methods, pp.199-206, E & S Livingstone, Edinburgh を参照のこと) 。それらのタイプのアッセイの多くの変法が当業界において知られており、そして FIVの検出のために使用され得る。
E.従来のワクチン及び予防接種方法
異なった FIV株又は密接に関連するウィルスを用いる、ワクチン及び予防接種方法は、多くの著者により論じられて来た( Elyarなど. 、1997, Vaccine 15 : 1437-1444 ; Yamamotoなど.、1993, J. Virol. 67 : 601-605 ; Murphey-Corbなど.、1989, Science 240 : 1293-1297 ; Jarrettなど. 、1990, AIDS 4 : S163-S165;及び Destrosiersなど.、1989, Proc. Nat‘l Acad. Sci. USA 86 : 6353-6357 )。FIV-141 の場合、使用され得る次の3種のタイプのワクチンが存在する:不活性化された完全ウィルスワクチン、固定された細胞ワクチン、及び弱毒化されたウィルスワクチン。
異なった FIV株又は密接に関連するウィルスを用いる、ワクチン及び予防接種方法は、多くの著者により論じられて来た( Elyarなど. 、1997, Vaccine 15 : 1437-1444 ; Yamamotoなど.、1993, J. Virol. 67 : 601-605 ; Murphey-Corbなど.、1989, Science 240 : 1293-1297 ; Jarrettなど. 、1990, AIDS 4 : S163-S165;及び Destrosiersなど.、1989, Proc. Nat‘l Acad. Sci. USA 86 : 6353-6357 )。FIV-141 の場合、使用され得る次の3種のタイプのワクチンが存在する:不活性化された完全ウィルスワクチン、固定された細胞ワクチン、及び弱毒化されたウィルスワクチン。
典型的には、ワクチンは、約0.5〜5mlの体積に、約1×106 〜1×108 個のウィルス粒子を含むであろう。配合は、標準的方法、たとえばRemington‘s Pharmaceutical Sciences, 1982, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 16th ed.に記載される方法を用いて行われる。調製物は、キャリヤー及び1又は複数のアジュバントと共に、不活性化されたウィルス、固定された宿主細胞又は弱毒化されたウィルスを含むことができる。ワクチンは一般的に、非経口投与のために企画されているが、但し本発明は他の形の投与と適合できる。最も好ましいワクチンは、ネコに投与される場合、完全に、又は実質的に完全に非感染性である弱毒化されたウィルスを含むであろう。
免疫化方法は典型的には、3〜10週の間隔により分離されたワクチンによる数回の接種(たとえば、3回の接種)を包含する。接種スケジュール及び免疫化に関連する他のパラメーターを最適化するための方法は、当業界においてよく知られている。
F.DNAワクチン
核酸(DNA又はmRNA)を用いるワクチン及び予防接種方法を記載する文献は、アメリカ特許第 5,703,055号、第 5,580,859号及び第 5,589,466号を包含する。この態様で供給される免疫原は典型的には、体液性及び細胞毒性免疫応答の両者を誘発する。
それらの方法は、弱毒化された FIV-141に対応する核酸をネコに投与するための、FIV に対するワクチンを生成するために利用され得る。
核酸(DNA又はmRNA)を用いるワクチン及び予防接種方法を記載する文献は、アメリカ特許第 5,703,055号、第 5,580,859号及び第 5,589,466号を包含する。この態様で供給される免疫原は典型的には、体液性及び細胞毒性免疫応答の両者を誘発する。
それらの方法は、弱毒化された FIV-141に対応する核酸をネコに投与するための、FIV に対するワクチンを生成するために利用され得る。
弱毒化された FIV-141ゲノムをコードするDNA又はRNAのいづれかがワクチンに使用され得るが、しかしDNAが一般的に好ましいであろう。DNAは“裸の”形で存在することができ、又はそれは細胞摂取を促進する剤(たとえばリポソーム又はカチオン性脂質)と共に投与され得る。投与の典型的な経路は、約0.1〜5mlのワクチンの筋肉内注射による。ワクチン中の合計ポリヌクレオチドは一般的に、約0.1μg/ml〜約5.0mg/mlであるべきである。ポリヌクレオチドは懸濁液、溶液又はエマルジョンの一部として存在することができるが、しかし水性キャリヤーが一般的に好ましい。
DNAワクチンを用いてのネコの免疫化は、3〜10週の間隔で分離された、分割された用量の一回の接種又は複数回の接種として実施され得る。所望により、血清が接種された動物から集められ、そして FIV-141又は他の FIV株に対する抗体の存在について試験され得る。
G.他のレンチウィルスへの方法論の拡張
ワクチンへの使用のために適切な、FIV-141 を弱毒化するための及び突然変異誘発されたウィルス核酸を生成するための上記に論じられる方法は、他の FIV株及び他のタイプのレンチウィルスに拡張され得る。個々の場合、ウィルスゲノムがクローン化され、そして MC, CA, NC, DU, ENV, SU, TMf, CT, ORF(2), Vif, Vifn, Vifc, V3/4, V7/8, IN 及び RREから成る群から選択された1又は複数の遺伝子において突然変異誘発される。
ワクチンへの使用のために適切な、FIV-141 を弱毒化するための及び突然変異誘発されたウィルス核酸を生成するための上記に論じられる方法は、他の FIV株及び他のタイプのレンチウィルスに拡張され得る。個々の場合、ウィルスゲノムがクローン化され、そして MC, CA, NC, DU, ENV, SU, TMf, CT, ORF(2), Vif, Vifn, Vifc, V3/4, V7/8, IN 及び RREから成る群から選択された1又は複数の遺伝子において突然変異誘発される。
突然変異は、遺伝子生成物を不活性化するために企画されるべきである。これは通常、完全な遺伝子又は遺伝子の実質的な部分のいづれかを欠失することによって、最とも容易に達成され得る。突然変異を誘発するために使用される特定の方法論は、ウィルスに依存して変化するが、基本的技術は当業界において通常であり、そしてガイドとして本明細書に開示される方法を用いて、当業者により容易に実施され得る。抗体生成、ワクチンの製造及び投与、等は、必要なら、マイナーな調節を行なって、本明細書における FIV-141に関して論ぜられるようにして達成され得る。
さらに、一定のレンチウィルスに対する抗体がウィルスにより感染された動物又はヒトに受動的免疫性を提供するために使用され得る。精製された抗体又は抗体−含有血清のいづれかがこの目的のために使用され得、そして調製物が、ウィルス感染に関連する1又は複数の徴候の改善が観察されるまで、定期的に投与され得る。
例1:感染性 FIVプロウィルスDNAクローンの構成
A.FIV-141 の単離及びクローニング
ウィルス単離
FIV-141 を、FIV-感染されたネコの血漿から単離した。感染された動物からの血漿を特定の病原体フリー(SPF)ネコに投与することによって、ウィルスを増幅した。接種されたネコの感染を、ウィルス単離及び血清転換により確かめた。ネコを12週間の攻撃の後、安楽死せしめ、組織を集め、そして脾臓を、 FIV-141ゲノムの分子クローニングのためのウィルス源として使用した。ゲノムDNAを、製造業者により提供されるプロトコールに従って、DNA拡大キット(Stratagene, La Jolla, CA) を用いて、感染された脾臓から単離した。精製されたゲノムDNAを、1μg/mlの濃度でTE緩衝液に溶解し、そして−70℃で貯蔵した。
A.FIV-141 の単離及びクローニング
ウィルス単離
FIV-141 を、FIV-感染されたネコの血漿から単離した。感染された動物からの血漿を特定の病原体フリー(SPF)ネコに投与することによって、ウィルスを増幅した。接種されたネコの感染を、ウィルス単離及び血清転換により確かめた。ネコを12週間の攻撃の後、安楽死せしめ、組織を集め、そして脾臓を、 FIV-141ゲノムの分子クローニングのためのウィルス源として使用した。ゲノムDNAを、製造業者により提供されるプロトコールに従って、DNA拡大キット(Stratagene, La Jolla, CA) を用いて、感染された脾臓から単離した。精製されたゲノムDNAを、1μg/mlの濃度でTE緩衝液に溶解し、そして−70℃で貯蔵した。
FIV-141ゲノムの3種のセグメントのPCR増幅及びクローニング
3組のオリゴヌクレオチドを、他のFIV単離物の公開された配列に基づいて企画した( Talbottなど.、1989, Proc. Nat‘l Acad. Sci. USA 86 : 5743-5747 ; Miyazawaなど.、1991, J. Virol. 65 : 1572-1577 ; Talbottなど.、1990, J. Virol. 64 : 4605-4613)。それらのオリゴヌクレオチドを用いて、FIV−141ゲノムの3種のセグメントを増幅、ここで1つはゲノムの5′末端で、1つは3′末端で、及び1つは中央に存在する。感染された組織における低コピー数のFIVプロウィルスゲノムのために、2回のPCR増幅を、個々のセグメントのために半−入れ子セットのプライマー組を用いて実施した。
3組のオリゴヌクレオチドを、他のFIV単離物の公開された配列に基づいて企画した( Talbottなど.、1989, Proc. Nat‘l Acad. Sci. USA 86 : 5743-5747 ; Miyazawaなど.、1991, J. Virol. 65 : 1572-1577 ; Talbottなど.、1990, J. Virol. 64 : 4605-4613)。それらのオリゴヌクレオチドを用いて、FIV−141ゲノムの3種のセグメントを増幅、ここで1つはゲノムの5′末端で、1つは3′末端で、及び1つは中央に存在する。感染された組織における低コピー数のFIVプロウィルスゲノムのために、2回のPCR増幅を、個々のセグメントのために半−入れ子セットのプライマー組を用いて実施した。
3種のプライマーを用いて、ヌクレオチド118からヌクレオチド646まで延びる、 FIV-141プロウィルスゲノムの5′末端からのセグメントをクローン化した。この領域は、5′末端の長い末端反復配列、5′末端の長い末端反復配列とGagオープンリーディングフレームとの間の介在配列、及びGag遺伝子のN−末端部分のほとんどを包含する。プライマーの配列は次の通りであった:プライマー pr-1 (117−CCGCAAAACCACATCCTATGTAAAGCTTGC−146 、配列番号2)並びに2種の逆方向プライマー、pr-2 (646 −CGCCCCTGTCCATTCCCCATGTTGCTGTAG−617 、配列番号3)及び pr-8 (1047 −TTACTGTTTGAATAGGATATGCCTGTGGAG−1018、配列号4)。
最初のPCR増幅を、プライマーとしてのそれぞれ200ngの pr-1 及び pr-8 並びに鋳型としての1μgのゲノムDNA、並びに0.5単位の Taq DNAポリメラーゼ(Gibco, BRL Gaithersburg, MD )及び1単位の Pfn DNAポリメラーゼ(Stratagene, La Jolla, CA)の混合物を用いて実施した。94℃で1分間の増幅;続いて、94℃で45秒間の変性;52℃で45秒間のアニーリング;及び72℃で2分間の延長、を30回行なった。2回目の増幅を、鋳型として2μlの第1回目のPCR生成物と共に、プライマーpr−1及びpr−2を用いて行なった。第1回目の増幅に使用される同じ条件を第2回目にも適用し、但しアニーリングは55℃の温度で実施された。
3種のオリゴヌクレオチドを用いて、 FIV-141プロウィルスゲノムの3′末端からのセグメントをクローン化した。このセグメントは、3′末端の長い末端反復配列、及び3′末端の長い末端反復体とENV遺伝子との間の介在配列のほとんどから成る、ヌクレオチド8874〜9367を包含する。3種のプライマーの配列は、次の通りである:2つの前方プライマー pr-5 (8793 −GCAATGTGGCATGTCTGAAAAAGAGGAGGA−8822、配列番号5)及び pr-7 (8874 −TCTTCCCTTTGAGGAAGATATGTCATATGAATCC−8907、配列番号6)、及び逆方向プライマー pr-6 (9367 −TCTGTGGGAGCCTCAAGGGAGAACTC−9342、配列番号7)。プライマー pr-5 及び pr-6 を用いて最初の回の増幅を行ない、そして pr-6 及び pr-7 を用いて、第2回目の増幅を行なった。5′末端からのセグメント及び上記 FIV-141の増幅に使用される条件と同じ条件がこの増幅に適用された。
ヌクレオチド5147からヌクレオチド5631に延長し、そしてIN遺伝子のC−末端部分及び Vif遺伝子のN−末端部分を包含する、 FIV-141ゲノムの中央部分からのセグメントをクローン化するために、最初の増幅を、前方向プライマー、 pr-3 (4738 −ACAAACAGATAATGGACCAAATTTTAAAAA−4767、配列番号8)及び逆方向プライマー、 pr-10 (5631−TTTCAATATCATCCCACATAAATCCTGT−5604、配列番号9)を用いて実施した。第2回目の増幅を、前方向プライマー、 pr-7 (1547 −TTAAAGGATGAAGAGAAGGGATATTTTCTT−5176、配列番号10)及び逆方向プライマー、pr-10 を用いて実施した。
第2回目のPCR増幅の完結の後、生成物を1%アガロースゲルに適用し、そしてすべての3種の領域のための予測されるバンドを、Wizard PCR Prepsキット (Promega, Madison, WI)により増幅した。精製されたPCRフラグメントを、製造業者により推薦される方法に従って、 PCR-Script Amp SK(+)ベクター(Stratagene, La Jolla, CA)中にクローン化した。挿入体を、制限酵素消化、続くプラスミドDNAの2つの鎖の配列決定により確かめた(Advanced Genetic Analysis Center, St. Paul, MN)。増幅の間、DNAポリメラーゼにより生成されるFIV配列における“誤差”を排除するために、3種の独立したPCR増幅からの3種のクローンを個々の領域について配列決定した。3種の独立したクローンからのコンセンサス配列は、確実な FIV-141配列として見なされた。
5′及び3′末端セグメントからの配列の組合せは、FIV-141 の長い末端反復体がU3領域における208個の塩基、R領域における79個の塩基及びU5領域における67個の塩基を包含する354個の塩基から成ることを示唆する。末端の2−塩基の逆方向反復体、TATAボックス、ポリアデニル化シグナル、及び多くの推定上のcis−作用性エンハンサー−プロテーター要素は他の FIV単離物に対して完全に保存された。
FIV-141 の完全なプロウィルスゲノムのPCR増幅及びクローニング
上記の3種のクローン化されたセグメントを用いて得られた配列情報を用いて、2種の断片、すなわち5′側半分及び3′側半分において完全なプロウィルスゲノムを増幅し、そしてクローン化するために使用され得る FIV-141特異的プライマーを企画した。個々の半分を、半−入れ子セットのプライマーによる2回の増幅により増幅した。
上記の3種のクローン化されたセグメントを用いて得られた配列情報を用いて、2種の断片、すなわち5′側半分及び3′側半分において完全なプロウィルスゲノムを増幅し、そしてクローン化するために使用され得る FIV-141特異的プライマーを企画した。個々の半分を、半−入れ子セットのプライマーによる2回の増幅により増幅した。
FIV-141ゲノムの5′側半分(ヌクレオチド1〜5460)を増幅するために、第1回目の増幅を、前方プライマー、pr-11 (1−TGGGAAGATTATTGGGATCCTGAAGAAATA−30、配列番号11)及び逆方向プライマー pr-10を用いて実施した。Clonetech (Palo Alto, CA)からの Advantage Genomic PCRキットにより提供される増幅プロトコールに従った。手短に言及すれば、PCR反応を、1μlのゲノムDNA鋳型(1μg/μl)、1μlの個々のプライマー(100ng/μl)、5μlの10×Tth PCR反応緩衝液、2.2μlの25mMのMg(OAc)2 、1μlの50×dNTP混合物(それぞれ10mM)、1μlの50×Advantage Tth Polymerase混合物、1μlの Pfnポリメラーゼ(2.5U/μl)及び36.8μlの無菌水を含む合計体積50μlにおいて企画した。
反応混合物を94℃で2分間、加熱し、続いて30サイクルの増幅を実施した:94℃で30秒間及び68℃で6分間。第2回目の増幅を、鋳型として第1回目のPCR生成物2μl、同じ前方プライマーpr-11 及び逆方向プライマー、pr-12 (5460 − CATATCCTATATAATAATCACGCGTATGAAAGCTCCACCT −5421、配列番号12)を用いて実施した。2種の半分部分からの十分な長さの FIV-141ゲノムの構成を促進するために、制限酵素部位MlnI(下線が引かれている)を、プライマー12中に導入した。第1回目の増幅において使用されるのと同じPCR条件を第2回目に適用し、そして5460個の塩基対サイズの増幅フラグメントの生成をもたらした。
FIV-141プロウィルスゲノムの3′側半分をクローン化するために、3種のプライマー、pr-9, pr-13 及び pr-14をまず使用し、増幅を行なった。第1回目のPCR増幅を、前方プライマー pr-9 及び逆方向プライマー pr-14 (9464−TGCGAGGTCCCTGGCCCGGACTCC−9441、配列番号13)を用いて実施した。第2回目の増幅を、前方プライマー pr-13(5421− AGGTGGAGCTTTCATACGCGTGATTATTATATAGGATATG −5460、配列番号14)、及び同じ逆方向プライマーpr-14 を用いて行なった。
プライマーpr-13 を、ゲノムの5′側半分の増幅に使用される pr-12プライマーとオーバーラップするよう企画した。 pr-12プライマーにおけるように、MlnI制限酵素部位(下線が引かれている)を、十分な長さの FIVクローンの構成を促進するために pr-13中に組込んだ。不運なことには、2回目のPCR増幅の後、特定のDNAバンドは観察されなかった。 FIV-141ゲノムの3′側半分を増幅することの失敗は、たぶん、プライマー pr-14における高いGC含有率及び非常に安定した二次構造体によることが結論づけられた。
従って、新たなプライマー pr-16 (9444−CTCCAGGGATTCGCAGGTAAGAGAAATTA −9416,配列番号15)を企画した。この配列は、 FIV-141ゲノムにおける最後の塩基の上流の20個の塩基で終結する。第1回目のPCR増幅を、前方プライマー pr-9 及び逆方向プライマー pr-16を用いて実施した。この後、前方プライマー pr-13及び再び、逆方向プライマー pr-16を用いて増幅を行なった。予測されるサイズを有するDNAフラグメントを、2回目の増幅の後に得た。
FIV-141ゲノムの5′側半分及び3′側半分のフラグメントを、Wizard PCR Preps DNA精製キット (Promega, Madison, WI)を用いて精製し、そして PCR-Script Amp SK(+)クローニングベクター(Stratagene, La Jolla, CA)中にクローン化した。3種の独立したPCR反応からの3種のククローンを、5′側半分及び3′側半分のクローンの個々について配列決定した。プラスミドDNAの両鎖を配列決定し、そして完全なゲノムのための確実なコンセンサス配列を、前記3種の独立したクローンについて得られた結果を比較することによって得た。DNAStar プログラム(DNAStar Inc., Madison, WI )を用いて、配列アセンブリー、比較及び分析を実施した。
B.クローン化された FIV-141ウィルスの分子的性決定
完全な FIV-141ゲノムの配列結果及び分析
FIV-141 の完全なプロウィルスゲノムは、9464個の塩基を含むことが見出された。前記ゲノムは、典型的なレンチウィルスに構成され、そして5′及び3′側の長い末端反復体;Gag, Pol及び ENV遺伝子を含む3種の大きなオープンリーディングフレーム(ORF);及び Vif, Rev 及び ORF(2)調節タンパク質を含む3種の小さなオープンリーディングフレームから成る。
完全な FIV-141ゲノムの配列結果及び分析
FIV-141 の完全なプロウィルスゲノムは、9464個の塩基を含むことが見出された。前記ゲノムは、典型的なレンチウィルスに構成され、そして5′及び3′側の長い末端反復体;Gag, Pol及び ENV遺伝子を含む3種の大きなオープンリーディングフレーム(ORF);及び Vif, Rev 及び ORF(2)調節タンパク質を含む3種の小さなオープンリーディングフレームから成る。
長い末端反復体はそれぞれ、 FIV-Petaluma (Olmstedなど.、1989, Proc. Nat‘l Acad. Sci. USA 86 : 2448-2452)及び FIV-USIL (Sodora など. 、1995, AIDS Res. Hum. Retrovirnses 11 : 531-533)単離物と78.0%及び93.9%の配列相同性を共有する。Gagポリタンパク質は、それぞれ FIV-Petaluma 及び FIV-USIL と88.4%、及び94.4%のアミノ酸相同性を共有する。
Gag遺伝子は、マトリックス(MA)タンパク質(塩基627〜1031)、カプシド(CA)タンパク質(塩基1032〜1724)及びヌクレオカプシト(NC)タンパク質(塩基1725〜1976)をコードする。Gag 及び Polポリタンパク質は、ヌクレオチド1880で始まり、そしてヌクレオチド5239で終結する Pol ORFと97個の塩基でオーバーラップする。ヘプタヌクレオチドフレームシフトシグナル(5′−GGGAAAC −3′)は、前記オーバーラップの3′末端の上流の100個の塩基部分に位置する。翻訳の間の−1フレームシフトの結果として、 Gag/Pol ポリタンパク質融合が生成される。
FIV-Petaluma 及び FIV-USIL 単離物と比較すれば、FIV-141 の Polポリタンパク質はそれぞれ、85.7%及び92.2%のアミノ酸同一性を示す。 Pol遺伝子は、ヌクレオチド1880〜1978の先導配列;ヌクレオチド1979〜2326のプロテアーゼ(PR);ヌクレオチド2327〜3994の逆転写酵素(RT);ヌクレオチド3995〜4393のデオキシウリジントリホスファターゼ(DU);及びヌクレオチド4394〜5239のインテグラーゼ(IN)をコードする。
Vif ORF は、 Pol遺伝子と8個の塩基でオーバーラップし、そしてそれぞれ、FIV-Petaluma及びFIV-USIL単離物と80.2%及び91.3%のアミノ酸相同性を共有する。直後、 Vif遺伝子は、それぞれ FIV-Petaluma 及び FIV-USIL 単離物と62%及び92.4%の配列相同性を明示する、ヌクレオチド5988から開始し、そして6224で終結するORF(2)遺伝子である。
ENVポリタンパク質は、それぞれ、 FIV-Petaluma 及び FIV-USIL との79.3%及び88.6%のアミノ酸同一性を共有する。ENV遺伝子は、ヌクレオチド6262〜8088からの表面(SU)タンパク質;及びヌクレオチド8089〜8826からのトランスメンブラン(TM)タンパク質をコードする。
Revタンパク質は、複数スプライシングmRNAの翻訳に起因する。推定上の Rev遺伝子の第1エキソンは明らかに、ヌクレオチド6262で始まり、そしてヌクレオチド6505で終結するENV遺伝子と初期コドンを共有する。第2のRevエキソンは、ヌクレオチド8947で始まり、3′側の長い末端反復体のU3領域中に延び、そしてヌクレオチド9161で終結する。
Revタンパク質は、複数スプライシングmRNAの翻訳に起因する。推定上の Rev遺伝子の第1エキソンは明らかに、ヌクレオチド6262で始まり、そしてヌクレオチド6505で終結するENV遺伝子と初期コドンを共有する。第2のRevエキソンは、ヌクレオチド8947で始まり、3′側の長い末端反復体のU3領域中に延び、そしてヌクレオチド9161で終結する。
FIV-141 の Revタンパク質は、それぞれ、 FIV-Petaluma 及びFIV-USIL単離物と67.3%及び83.9%のアミノ酸相同性を有する。151塩基のRev応答要素(RRE)は、ヌクレオチド8775で始まり、そしてヌクレオチド8925で終結するENV遺伝子と52個の塩基でオーバーラップする。
SU糖タンパク質のV3領域内の配列比較に基づけば、FIV-141 はタイプB単離物である。明らかに、 FIV-141は FIV-USIL 、すなわちもう1つのタイプBの FIV単離物に最とも密接に関連している。
SU糖タンパク質のV3領域内の配列比較に基づけば、FIV-141 はタイプB単離物である。明らかに、 FIV-141は FIV-USIL 、すなわちもう1つのタイプBの FIV単離物に最とも密接に関連している。
C.FIV-141 の十分な長さの分子クローンの構成
十分な長さの FIV-141クローンを構成するために、ゲノムの3′側の極末端での20個の塩基が3′側半分クローンに付加されるべきであった。さらに、コンセンサス配列を、3種の独立したクローンからの配列を比較することによって同定した。次に、特定部位の突然変異誘発(SDM)を用いて、5′及び3′側半分クローンの配列を調整し、十分な長さのウィルスクローンの構成の前、コンセンサスの配列に適合せしめた。
十分な長さの FIV-141クローンを構成するために、ゲノムの3′側の極末端での20個の塩基が3′側半分クローンに付加されるべきであった。さらに、コンセンサス配列を、3種の独立したクローンからの配列を比較することによって同定した。次に、特定部位の突然変異誘発(SDM)を用いて、5′及び3′側半分クローンの配列を調整し、十分な長さのウィルスクローンの構成の前、コンセンサスの配列に適合せしめた。
FIV-141 の3′側の極末端で欠失する20個の塩基の付加
FIV-141 の3′側半分クローンに20個の塩基を付加するために、長い末端反復体をまず増幅し、そして鋳型として5′側の半分クローン、及び前方プライマー pr-21(5′−TTACAAGAATTCAACTGCAGTGGGAAGATTATTGGGATCCTGAAGAAAT −3′、配列番号16)及び逆方向プライマー pr-20(5′−TTCAAGGAGCTCTTTTGTCGACAACTGCGAGGTCCCTGGCCC−3′、配列番号17)を用いて、PCR-Script Amp SK(+)クローンベクター中にクローン化した。
FIV-141 の3′側半分クローンに20個の塩基を付加するために、長い末端反復体をまず増幅し、そして鋳型として5′側の半分クローン、及び前方プライマー pr-21(5′−TTACAAGAATTCAACTGCAGTGGGAAGATTATTGGGATCCTGAAGAAAT −3′、配列番号16)及び逆方向プライマー pr-20(5′−TTCAAGGAGCTCTTTTGTCGACAACTGCGAGGTCCCTGGCCC−3′、配列番号17)を用いて、PCR-Script Amp SK(+)クローンベクター中にクローン化した。
PCRフラグメントのクローニングを促進するために、2種の制限酵素部位(下線が引かれている)、すなわちEcoRI及びPstIを前方プライマーpr−21中に組込み、そして2種の部位(下線が引かれている)、すなわちSacI及びSalIを逆方向プライマー pr-20中に組込んだ。プライマー中の FIV-141特異的配列は、イタリック体で示されている。得られるクローンを配列決定し、そして PCR-LTRとして命名した。SacI及びNheIによる消化により生成される pFIV-LTR の制限フラグメントを、 FIV-141の−3′側半分クローンの1つ中にクローン化した。得られるクローンを、 pFIV 3′-2A-1+ として命名し、そして FIV-141の3′側の極末端での20個の塩基の存在を、ヌクレオチド配列決定により確かめた。
5′及び3′側の半分クローンにおけるコンセンサス配列の構成
FIV-141 の存在する5′及び3′側半分クローンにおいてコンセンサス配列を確立するために、SDMを実施した。ゲノムの最初の半分に配列変化を導入するために、5′側半分クローンの1つ(“pFIV5′−D−11”と称する)を、鋳 として使用した。コンセンサス配列に比較して、pFIV5′−D−11に合計15個のヌクレオチド変化が存在した。2種の変化は、5′側非コード領域、A602G及びA612Gに位置し、そしてコード領域における7個のヌクレオチドの変化はサイレント突然変異であった。
FIV-141 の存在する5′及び3′側半分クローンにおいてコンセンサス配列を確立するために、SDMを実施した。ゲノムの最初の半分に配列変化を導入するために、5′側半分クローンの1つ(“pFIV5′−D−11”と称する)を、鋳 として使用した。コンセンサス配列に比較して、pFIV5′−D−11に合計15個のヌクレオチド変化が存在した。2種の変化は、5′側非コード領域、A602G及びA612Gに位置し、そしてコード領域における7個のヌクレオチドの変化はサイレント突然変異であった。
コード領域における他の6種の変化は、個々の変化のためにアミノ酸置換をもたらし、3種はRT領域に存在し(IからMへのアミノ酸置換をもたらすA2890Gヌクレオチド変化;EからKへの置換をもたらすG3461A変化;及びEからKへの置換をもたらすG3737A変化)、1種はDUタンパク質に存在し(TからIへの置換をもたらすC4383T変化)、そして2種はINタンパク質に存在した(IからMへの置換をもたらすA4579G変化;及びQからLへの置換をもたらすA5007T変化)。7個のオリゴヌクレオチドを、非コード領域における2種の変化、及びアミノ酸置換を導びくコード領域における6種の変化をもたらすよう企画した。
オリゴヌクレオチドは次の通りである(ミスマッチは下線が引かれている):A602G及びA612Gエラーを修復するよう企画されたオリゴpF−1:5′GATTCGTCGGGGGACAGCCAACA AGGTAGGAG A GATTCTACAGCAACATGGGG−3′(配列番号18);
A2890Gエラーを固定するよう企画されたオリゴpF−2:5′−TCAATATATGGATGATATC TATATAGGATCAAATTTAAGTAA −3′(配列番号19);
G3461Aエラーを修復するよう企画されたオリゴpF−3:5′− GTGATATAGCTCTAAGGGCATGTTACAAAATAAGAG AAGAATCCATTATAAGAATAGG−3′(配列番号20);
A2890Gエラーを固定するよう企画されたオリゴpF−2:5′−TCAATATATGGATGATATC TATATAGGATCAAATTTAAGTAA −3′(配列番号19);
G3461Aエラーを修復するよう企画されたオリゴpF−3:5′− GTGATATAGCTCTAAGGGCATGTTACAAAATAAGAG AAGAATCCATTATAAGAATAGG−3′(配列番号20);
G3737Aエラーを修復するよう企画されたオリゴpF−4:5′−CGGGCAGATGGCAGGTAATGG AAATAGAAGGAAGTAATCAAAAAGC −3′(配列番号21);
C4383Tエラーを修復するよう企画されたオリゴpF−5:5′− AGAAAGGGATTTGGGTCAAC TGGAGTCTTTTCTTCATGGGTGGA−3′(配列番号22);
A4579Gエラーを修復するよう企画されたオリゴpF−6:5′− GGGGGACAATTAAAGATTGGACCTGGCATA TGGCAAATGGACTGTACACAC −3′(配列番号23);及び
A5007Tエラーを修復するよう企画されたpF−7:5′−GGCTCCTTATGAATTATACATACAACA GGAATCATTAAGAATACAAGAC−3′(配列番号24)。
C4383Tエラーを修復するよう企画されたオリゴpF−5:5′− AGAAAGGGATTTGGGTCAAC TGGAGTCTTTTCTTCATGGGTGGA−3′(配列番号22);
A4579Gエラーを修復するよう企画されたオリゴpF−6:5′− GGGGGACAATTAAAGATTGGACCTGGCATA TGGCAAATGGACTGTACACAC −3′(配列番号23);及び
A5007Tエラーを修復するよう企画されたpF−7:5′−GGCTCCTTATGAATTATACATACAACA GGAATCATTAAGAATACAAGAC−3′(配列番号24)。
ゲノムの3′側半分において配列変化をもたらすために、3′側半分クローン“pFIV3′-2A-1+ ”を、SDSの実施における鋳型として使用した。pFIV3′-2A-1+ クローンに、コンセンサス配列に比較して、9種の変化が存在した。コード領域における2種のヌクレオチド変化はサンレントであった。他の7種の変化はすべてアミノ酸置換をもたらした:1つはVifタンパク質に存在し(T5508C、HからY);1つはORF(2)領域に存在し(A6041T、DからE);3種はSUタンパク質に存在し(A6922G、VからI;G7007T、TからR;及びA7814G、SからN);1つはTM領域に存在し(A8405T,IからN);そして1つはRev領域に存在した(A8976G、EからK)、7種の突然変異誘発オリゴヌクレオチドが、それらの7種のアミノ酸置換を修復するために企画された:
T5508Cエラーを修復するよう企画されたオリゴ pF-8:5′−CAAAATAGTTTAAGATTGT ATGTTTATATAAGCAAT −3′(配列番号25);
A6041Tエラーを修復するよう企画されたオリゴ pF-9:5′−CAGAAAAGTTAGATAGAGA AGCAGCTATTAGATTGTTTAT −3′(配列番号26);
A6922Gエラーを修復するよう企画されたオリゴ pF-10:5′− TAAAAGCAAATGTTAATA TAAGTATACAAGAAGGACCTAC−3′(配列番号27);
G7007Tエラーを修復するよう企画されたオリゴ pF-11:5′−AAAAGCTACAAGGCAATGCAG AAGGGGAAGGATATGGAAG −3′(配列番号28);
A7814Gエラーを修復するよう企画されたオリゴ pF-12:5′− AGAGGACCTTATTGTACAATTTAA TATGACAAAAGCAGTGGAAA−3′(配列番号29);
A8405Tエラーを修復するよう企画されたオリゴ pF-13:5′−CCCTCAATCTGTGGACAATGTATAA CATGACTATAAATCA −3′(配列番号30);
A8976Gエラーを修復するよう企画されたオリゴ pF-14:5′− GACAACGCAGAAGAAGAA AGAAGAAGGCCTTCAAAAAATT−3′(配列番号31)。
A6041Tエラーを修復するよう企画されたオリゴ pF-9:5′−CAGAAAAGTTAGATAGAGA AGCAGCTATTAGATTGTTTAT −3′(配列番号26);
A6922Gエラーを修復するよう企画されたオリゴ pF-10:5′− TAAAAGCAAATGTTAATA TAAGTATACAAGAAGGACCTAC−3′(配列番号27);
G7007Tエラーを修復するよう企画されたオリゴ pF-11:5′−AAAAGCTACAAGGCAATGCAG AAGGGGAAGGATATGGAAG −3′(配列番号28);
A7814Gエラーを修復するよう企画されたオリゴ pF-12:5′− AGAGGACCTTATTGTACAATTTAA TATGACAAAAGCAGTGGAAA−3′(配列番号29);
A8405Tエラーを修復するよう企画されたオリゴ pF-13:5′−CCCTCAATCTGTGGACAATGTATAA CATGACTATAAATCA −3′(配列番号30);
A8976Gエラーを修復するよう企画されたオリゴ pF-14:5′− GACAACGCAGAAGAAGAA AGAAGAAGGCCTTCAAAAAATT−3′(配列番号31)。
両クローン pFIV 5′−D−11及び pFIV 3′−2A−1+ のための一本鎖DNA鋳型調製物を、製造業者(Promega, Madison, WI)により提供されるプロトコールに実質的に従って製造した。手短に言及すれば、前記2種のクローンのDNAプラスミドを、E.コリ株CJ236中にトランスフェクトした。一本鎖(SS)DNAをヘルパーファージR408を用いて解放し、そしてフェノール/クロロホルム抽出により精製した。精製されたSS DNAをTE緩衝液に溶解し、そしてその濃度を、1%アガロースゲル上で鋳型調製物のサンプル2μlを走行することによって推定した。オリゴヌクレオチドを、製造業者(Gibco BRL, Gaithersburg, MD )により提供されるプロトコールに従って、リン酸化した。
オリゴヌクレオチドを、合計30μlの反応体積において、鋳型にアニーリングした。これは、0.2pモルの一本鎖DNA鋳型(pFIV5′−D−11又は pFIV 3′−2−A−1+ )、4pモルの個々のオリゴヌクレオチド(すなわち、 pFIV 5′−D−11鋳型のために pF-1〜 pF-7、及び pFIV 3′−2−A−1+ 鋳型のためにpF−8〜pF−14)、3μlのアニーリング緩衝液(0.2Mのトリス−HCl、pH7.4、20mMのMgCl2 、及び0.5MのNaCl)を含んだ。その混合物を85℃で5分間インキュベートし、そして次に、約1℃/分の速度で、室温に徐々に冷却した。
相補的DNA鎖を合成するために、次の成分をアニーリング混合物に添加した:3μlの合成緩衝液(4mMの個々のdNTP、7.5mMのATP、175mMのトリス−HCl、pH7.4、37.5mMのMgCl2 、215mMのDTT)、3μlのT4 DNAリガーゼ(3U/μl)、及び3μlの希釈されたT7 DNAポリメラーゼ(0.5U/μl)。反応物を37℃で3時間インキュベートし、続いて、68℃で10分間、加熱不活性化した。2μlのSDM反応混合物を用いて、E.コリDHα−5コンピテント細胞をトランスフェクトした。
5′側半分クローンpFIV5′−D−11に関しては、突然変異誘発オリゴヌクレオチドの1つのPF−5の組込みは、HincII部位の付加をもたらした。HincIIによる予備スクリーニングは、pFIV5′−D−11/M−4、pFIV5′−D−11/M−22、pFIV5′−D−11/M−28及びpFIV5′−11/M−52として命名された4種の陽性変異体の同定をもたらした。それらの4種の変異体を完全に配列決定し、他の7種の所望する突然変異の組込みを確かめた。配列決定結果は、4種のクローンのうち3種のクローンがすべての8種の突然変異を含んだことを示した。1つのクローンpFIV5′−D−11/M−28は、突然変異誘発された7種の位置のみを有した。
クローンpFIV5′−D−11/M−52を、5′側半分クローンとして選択し、それを用いて、十分な長さの FIV-141クローンを構成した。3′側半分クローンpFIV3′−2−A−1+ に関しては、BspHI消化による予備スクリーニングは、BspHI制限部位が突然変異誘発オリゴヌクレオチドpF13の組込みのために排除されている10種の変異体を同定した。完全な配列決定は、10種のクローンのうち8種がすべての7種の所望する位置を含むことを示した。変異体の1つ、すなわち“pFIV3′−2−A−1+ /M−21”は、8種の変化のすべてを含み、そして十分な長さの FIV-141クローンを構成する場合の3′側半分クローンとして使用するために選択された。
十分な長さの FIV-141クローンの構成
十分な長さの FIV-141クローンを構成するために、5′側半分クローン、pFIV5′−D−11/M−52に由来する5.5kbのMluI/XhoIフラグメントを、同じ2種の制限酵素により消化された3′側半分クローンpFIV3′−2−A−1+ /M−21に連結した。十分な長さの連結生成物を、5′側半分クローンに向けられた前方プライマー、及び3′側半分クローンに向けられた逆方向プライマーを用いて、PCR増幅によりスクリーニングした。
十分な長さの FIV-141クローンを構成するために、5′側半分クローン、pFIV5′−D−11/M−52に由来する5.5kbのMluI/XhoIフラグメントを、同じ2種の制限酵素により消化された3′側半分クローンpFIV3′−2−A−1+ /M−21に連結した。十分な長さの連結生成物を、5′側半分クローンに向けられた前方プライマー、及び3′側半分クローンに向けられた逆方向プライマーを用いて、PCR増幅によりスクリーニングした。
前方プライマーpr9は、配列:5′−(5147)−TTAAAGGATGAAGAGAAGGGATATTTTCTT−(5176)−3′(配列番号10)を有した。逆方向プライマーpr10は、配列:5′−(5631)−TTTCAATATCATCCCACATAAATCCTGT−(5604)3′(配列番号9)を有した。陽性クローンを、制限消化及び配列決定により確かめた。十分な長さのクローンの1つを、“pFIV−141B−1”と命名し、そしてインビトロ及びインビボの両者での特徴化のために選択した。
例2:十分な長さの分子クローンが感染性であることの証明
トランスフェクション
クランダルネコ腎臓(CRFK)細胞を、40〜60%の集密性まで、6ウェルプレートにおいて増殖せしめた。トランスフェクションを、Trans IT Polyamina Transfection Reagents (Mirns, Madison, WI)により推薦される基本的プロトコールに従って、2μgのプラスミドDNAを導入することによって達成した。手短に言及すれば、10μlのTrans IT Lt-1(Panvera )を、1mlのRPMI 1840 培地と共に混合し、そして室温で15分間インキュベートした。
トランスフェクション
クランダルネコ腎臓(CRFK)細胞を、40〜60%の集密性まで、6ウェルプレートにおいて増殖せしめた。トランスフェクションを、Trans IT Polyamina Transfection Reagents (Mirns, Madison, WI)により推薦される基本的プロトコールに従って、2μgのプラスミドDNAを導入することによって達成した。手短に言及すれば、10μlのTrans IT Lt-1(Panvera )を、1mlのRPMI 1840 培地と共に混合し、そして室温で15分間インキュベートした。
2μgのプラスミドDNAを、前記RPMI/Lt-1溶液に添加し、そして室温でさらに15分間インキュベートした。培地をウェルから除去し、細胞をPBSにより1度洗浄し、そしてDNAカクテルを細胞単層に添加した。CO2 インキュベーターにおいて37℃で4時間インキュベーションの後、DNAカクテルをウェルから除き、そして3%ウシ血清(FS)により補充されたRPMI1650培地2mlを個々のウェルに添加した。24時間のトランスフェクションの後、細胞上清液を、FIV生成、逆転写酵素(RT)活性及びウィルス感染性についてアッセイした。
トランスフェクトされたCRFK細胞からの FIV生成
トランスフェクトされたCRFK細胞からの上清液を、トランスフェクションの後、毎日収穫し、そして製造業者により推薦されるプロトコールに従って、FIV Antigen Fest Kit (IDEXX, Portland, ME )を用いて、FIV カプシド生成についてアッセイした。この酵素イムノアッセイは、 FIV p26カプシドタンパク質の優性グループ関連抗原を検出するよう企画された。 FIV抗原 p26を、24時間の後−トランスフェクション(PT)で検出し、72時間のPTでピークに達し、そして次に、11日のPTでバックグラウンドレベルに低下した(図1を参照のこと)。
トランスフェクトされたCRFK細胞からの上清液を、トランスフェクションの後、毎日収穫し、そして製造業者により推薦されるプロトコールに従って、FIV Antigen Fest Kit (IDEXX, Portland, ME )を用いて、FIV カプシド生成についてアッセイした。この酵素イムノアッセイは、 FIV p26カプシドタンパク質の優性グループ関連抗原を検出するよう企画された。 FIV抗原 p26を、24時間の後−トランスフェクション(PT)で検出し、72時間のPTでピークに達し、そして次に、11日のPTでバックグラウンドレベルに低下した(図1を参照のこと)。
トランスフェクトされた(CRFK)細胞からのウィルス生成を確かめるために、逆転写酵素(RT)活性アッセイ(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN )を実施し、トランスフェクトされた細胞上清液におけるビリオン−関連RT活性を検出した。手短に言及すれば、200μlの細胞上清液を収穫し、そして微小管において5分間、回転せしめ、細胞及び細胞残骸をペレット化した。上清液を4℃で20分間、20,000gで、スウィングバケットローターにおいて遠心分離し、 FIVウィルス粒子をペレット化した。ウィルス粒子ペレットを、キットからの40μlの溶解緩衝液に再懸濁し、そして次に、アッセイを製造業者により推薦されるように実施した。トランスフェクトされた細胞からのウィルス生成を、48時間の後−トランスフェクション(PT)での細胞上清液において示した。
CRFK細胞の感染
FIV-141野生型ウィルスは、CRFK細胞に感染しない。分子クローンウィルスが類似する挙動を示すかどうかを決定するために、CRFK細胞を6ウェルプレートにおいて増殖せしめ、そしてトランスフェクトされたCRFK細胞からのp26+ならし培地200μlにより接種した。37℃で2時間のインキュベーションの後、細胞をPBSにより1度洗浄し、そして3%FSにより補充された RPMI 1640培地2mlを個々のウェルに添加した。次に、上清液を、3〜4日の後−トランスフェクションごとに、 FIV p26 ELISAによりウィルス生成についてモニターした。野生型ウィルスと同様に、 FIV-141クローンはCRFK細胞を感染しないことが見出された。
FIV-141野生型ウィルスは、CRFK細胞に感染しない。分子クローンウィルスが類似する挙動を示すかどうかを決定するために、CRFK細胞を6ウェルプレートにおいて増殖せしめ、そしてトランスフェクトされたCRFK細胞からのp26+ならし培地200μlにより接種した。37℃で2時間のインキュベーションの後、細胞をPBSにより1度洗浄し、そして3%FSにより補充された RPMI 1640培地2mlを個々のウェルに添加した。次に、上清液を、3〜4日の後−トランスフェクションごとに、 FIV p26 ELISAによりウィルス生成についてモニターした。野生型ウィルスと同様に、 FIV-141クローンはCRFK細胞を感染しないことが見出された。
トランスフェクトされたCRFK細胞による同時培養によるFeP2細胞の感染
CRFK細胞を6ウェルプレートにおいて増殖せしめ、そして上記のようにしてトランスフェクトせしめた。48時間の後−トランスフェクションで、2×106 個のFeP2細胞を、個々のp26+トランスフェクトされたウェルに添加した。72時間の細胞の同時培養の後、FeP2細胞(非付着性)をCRFK細胞(付着性)から分離した。FeP2細胞からの上清液を収穫し、そして3〜4日ごとに、FIV p26 ELISA によりウィルス生成についてモニターした。4日間の同時培養の後、高レベルのウィルス生成がFeP2細胞上清液に示された(図2を参照のこと)。
CRFK細胞を6ウェルプレートにおいて増殖せしめ、そして上記のようにしてトランスフェクトせしめた。48時間の後−トランスフェクションで、2×106 個のFeP2細胞を、個々のp26+トランスフェクトされたウェルに添加した。72時間の細胞の同時培養の後、FeP2細胞(非付着性)をCRFK細胞(付着性)から分離した。FeP2細胞からの上清液を収穫し、そして3〜4日ごとに、FIV p26 ELISA によりウィルス生成についてモニターした。4日間の同時培養の後、高レベルのウィルス生成がFeP2細胞上清液に示された(図2を参照のこと)。
ウィルス力価は、6日の後−トランスフェクションでプラトーに達し、これは、 FIV-141分子クローンウィルスがFeP2細胞において感染性であることを示唆する。この結果はまた、CRFK細胞の感染がウィルス感染の初期段階で、すなわち細胞中へのウィルスの侵入時点で阻止されることを示唆した。
全体的に、CRFK細胞中へのトランスフェクションに基づいて、 FIV-141分子クローンが細胞中で複製することができ、そしてその細胞から放されるウィルス粒子がFeP2 Tリンパ球に対して感染性であることが結論づけられた。
全体的に、CRFK細胞中へのトランスフェクションに基づいて、 FIV-141分子クローンが細胞中で複製することができ、そしてその細胞から放されるウィルス粒子がFeP2 Tリンパ球に対して感染性であることが結論づけられた。
吸着によるFeP2細胞の感染
FeP2細胞(2×106 個)を、トランスフェクトされたCRFK細胞から得られたP26+ならし培地200μlに懸濁し、そして37℃で2時間インキュベートした。細胞をPBSにより洗浄し、熱不活性化された10%FCSにより補充されたOpti-MEM培地2mlに懸濁し、そして37℃でインキュベートした。上清液を収穫し、そして3〜4日ごとに、FIV p26 ELISA によりウィルス生成についてモニターした。
FeP2細胞(2×106 個)を、トランスフェクトされたCRFK細胞から得られたP26+ならし培地200μlに懸濁し、そして37℃で2時間インキュベートした。細胞をPBSにより洗浄し、熱不活性化された10%FCSにより補充されたOpti-MEM培地2mlに懸濁し、そして37℃でインキュベートした。上清液を収穫し、そして3〜4日ごとに、FIV p26 ELISA によりウィルス生成についてモニターした。
4日間の後−感染で、感染されたFeP2細胞からのウィルス開放が、上清液において検出され、そして感染後3週までにピークに達した(図3)。その結果は、FIV-141 によるFeP2細胞の生産的感染が、トランスフェクトされたCRFK細胞による吸着又は同時培養のいづれかを通して達成され得ることを示す。同時培養による感染に比較して、ウィルス感染は、感染が吸着により起こる場合よりも、より一層遅くプラトーに達した(図2及び3)。
例3:変異体 FIV-141クローン及びワクチンへのそれらの使用
FIV-141ワクチン候補体を開発するために、感染性 FIV-141野生型クローンを用いて、多くの遺伝子−欠失されたクローンを構成した。変異体クローンを製造するための一般的な基準は、次の通りである:
1. FIV-141ゲノム中に導入される欠失又は突然変異は、ウィルス感染性が、クローンがインビトロで培養された細胞中にトランスフェクトされ、又はインビボでネコに投与された後、実質的に低められる(弱毒化される)よう十分に厳密であるべきであり;
FIV-141ワクチン候補体を開発するために、感染性 FIV-141野生型クローンを用いて、多くの遺伝子−欠失されたクローンを構成した。変異体クローンを製造するための一般的な基準は、次の通りである:
1. FIV-141ゲノム中に導入される欠失又は突然変異は、ウィルス感染性が、クローンがインビトロで培養された細胞中にトランスフェクトされ、又はインビボでネコに投与された後、実質的に低められる(弱毒化される)よう十分に厳密であるべきであり;
2. FIV-141ゲノム中に導入される欠失又は突然変異は、ウィルスゲノムの複製能力、又は高レベルでウィルスタンパク質を発現する能力を破壊すべきでない。
考慮されるべき他の要因は、遺伝子欠失されたゲノムが宿主染色体中に組込むかどうか、欠損性ウィルス粒子が形成するかどうか、及び発現されるであろうウィルス構造タンパク質のレベルである。それらの考慮に基づいて、多くの遺伝子及び要素が欠失のために標的化された。ウィルスゲノムの複製が保持されたので、 FIV-141のRT遺伝子もPR遺伝子も突然変異誘発されなかった。
考慮されるべき他の要因は、遺伝子欠失されたゲノムが宿主染色体中に組込むかどうか、欠損性ウィルス粒子が形成するかどうか、及び発現されるであろうウィルス構造タンパク質のレベルである。それらの考慮に基づいて、多くの遺伝子及び要素が欠失のために標的化された。ウィルスゲノムの複製が保持されたので、 FIV-141のRT遺伝子もPR遺伝子も突然変異誘発されなかった。
A.Gag 領域における欠失
Gagポリタンパク質は、次の3種のビリオン構造タンパク質を含む:MA,CA及びNC。それらのタンパク質の個々に欠失を有する3種の遺伝子−欠失クローンが構成された。
MA del突然変異
特定部位の突然変異誘発を、鋳型として5′側半分クローンpFIV5′−D−11/M−52、及び突然変異誘発プライマー:Mpma-1(5′−AGTAAAGAAATTGACATGGCGATTACTAGTTTAAAAGTTTTTGCAGTGGC−3′、配列番号32);及びMpma-2(5′− CCATCTATAAAAGAAAGTGGGACTAGTGAAGAAGGACCTCCACAGGC−3′、配列番号33)を用いて、MAタンパク質のC−末端部分に2つのSpeI制限部位を創造するために実施した。
Gagポリタンパク質は、次の3種のビリオン構造タンパク質を含む:MA,CA及びNC。それらのタンパク質の個々に欠失を有する3種の遺伝子−欠失クローンが構成された。
MA del突然変異
特定部位の突然変異誘発を、鋳型として5′側半分クローンpFIV5′−D−11/M−52、及び突然変異誘発プライマー:Mpma-1(5′−AGTAAAGAAATTGACATGGCGATTACTAGTTTAAAAGTTTTTGCAGTGGC−3′、配列番号32);及びMpma-2(5′− CCATCTATAAAAGAAAGTGGGACTAGTGAAGAAGGACCTCCACAGGC−3′、配列番号33)を用いて、MAタンパク質のC−末端部分に2つのSpeI制限部位を創造するために実施した。
プライマーにより導入されたSpeI部位は、配列において下線が引かれている。SDMを、5′及び3′側半分クローンにおける推定上のエラーを修復するために、前記で論ぜられたようにして実施した。変異体をSpeI制限消化によりスクリーンし、そして陽性クローンを用いて、欠失クローンを構成した。SpeI消化を行ない、SpeIフラグメントを開放し、そしてクローンの残る部分を自己連結し、欠失クローンを創造した。それらを、欠失された領域を端に有するプライマー組を用いて、PCR増幅によりスクリーンし、そして確認をヌクレオチド配列決定により得た。欠失を有する5′側半分クローンを、3′側半分クローンpFIV3′−2A−1+ /M−21に連結し、欠失を有する十分な長さのクローンを生成した。このクローンを FIV-141欠失クローンと命名し、そしてMAのC−末端で残基85〜125の41個のアミノ酸に対応する、ヌクレオチド879〜ヌクレオチド1001の123個の塩基の欠失を含んだ。
CA del突然変異
SDMを、鋳型として5′側半分クローンpFIV5′−D−11/M−52、及びプライマーとして、Mpca-1(5′− ATTCAAACAGTAAATGGAGCAACTAGTTATGTAGCCCTTGATCCAAAAATG−3′、配列番号34)及びMpca-2(5′− ACAGCCTTTTCAGCTAATTTAACTAGTACTGATATGGCTACATTAATTATG−3′、配列番号35)を用いて、 FIV-141のCA領域に2つのSpeI部位を創造するために実施した。SpeI制限フラグメントの欠失の後、5′側半分クローンをpFIV3′−2A−1+ /M−21に連結し、遺伝子欠失された十分な長さのクローンを生成した。このクローンは、CAタンパク質のN−末端での位置9〜46の38個のアミノ酸に対応する、ヌクレオチド1056〜1169の114個の塩基対の欠失を有する。
SDMを、鋳型として5′側半分クローンpFIV5′−D−11/M−52、及びプライマーとして、Mpca-1(5′− ATTCAAACAGTAAATGGAGCAACTAGTTATGTAGCCCTTGATCCAAAAATG−3′、配列番号34)及びMpca-2(5′− ACAGCCTTTTCAGCTAATTTAACTAGTACTGATATGGCTACATTAATTATG−3′、配列番号35)を用いて、 FIV-141のCA領域に2つのSpeI部位を創造するために実施した。SpeI制限フラグメントの欠失の後、5′側半分クローンをpFIV3′−2A−1+ /M−21に連結し、遺伝子欠失された十分な長さのクローンを生成した。このクローンは、CAタンパク質のN−末端での位置9〜46の38個のアミノ酸に対応する、ヌクレオチド1056〜1169の114個の塩基対の欠失を有する。
NC del突然変異
5′側半分クローンは、それぞれ、ヌクレオチド1635及び1876でユニークScaI及びSmaI部位を有する。クローンをScaI及びSmaIにより消化し、242個の塩基対フラグメントを開放した。5′側半分クローンの残る部分を自己−連結し、そして次に、3′側半分クローンに連結し、遺伝子欠失された十分な長さのクローンを生成した。欠失は、CA領域における63個の塩基(21個のアミノ酸残基)、CAとNCタンパク質との間の27個の塩基(9個のアミノ酸残基)、及びNCタンパク質のN−末端部分での152個の塩基(51個のアミノ酸残基)から成る。欠失はまた、−1オープンリーディングフレームシフトを引き起こし、そして従って、NCタンパク質のC−末端部分はこのクローンにより発現され得ない。
5′側半分クローンは、それぞれ、ヌクレオチド1635及び1876でユニークScaI及びSmaI部位を有する。クローンをScaI及びSmaIにより消化し、242個の塩基対フラグメントを開放した。5′側半分クローンの残る部分を自己−連結し、そして次に、3′側半分クローンに連結し、遺伝子欠失された十分な長さのクローンを生成した。欠失は、CA領域における63個の塩基(21個のアミノ酸残基)、CAとNCタンパク質との間の27個の塩基(9個のアミノ酸残基)、及びNCタンパク質のN−末端部分での152個の塩基(51個のアミノ酸残基)から成る。欠失はまた、−1オープンリーディングフレームシフトを引き起こし、そして従って、NCタンパク質のC−末端部分はこのクローンにより発現され得ない。
B.ENV 領域における欠失
ENV前駆体糖タンパク質を、次の2種の成熟タンパク質中にプロセッシングした:SU及びTM。6種の欠失クローンを、ENV領域において構成した。
ENV del 突然変異
SDM を、鋳型として3′側半分クローンpFIV3′−2A−1+ /M−21及び突然変異誘発プライマーとして、 Mpenv-1(5′− ACTATAGTCTATTTACTAACTGGTTACC TGAGATATTTAATAAGCCATAG−3′、配列番号36)及び Mpenv-2(5′− TACTTATATGCTTGCCTACATTGGGTTACC GTATAAGAAACTGTACTAATAAAA−3′、配列番号37)を用いて、ENV領域において2つのBstEII部位を創造するために実施した。
ENV前駆体糖タンパク質を、次の2種の成熟タンパク質中にプロセッシングした:SU及びTM。6種の欠失クローンを、ENV領域において構成した。
ENV del 突然変異
SDM を、鋳型として3′側半分クローンpFIV3′−2A−1+ /M−21及び突然変異誘発プライマーとして、 Mpenv-1(5′− ACTATAGTCTATTTACTAACTGGTTACC TGAGATATTTAATAAGCCATAG−3′、配列番号36)及び Mpenv-2(5′− TACTTATATGCTTGCCTACATTGGGTTACC GTATAAGAAACTGTACTAATAAAA−3′、配列番号37)を用いて、ENV領域において2つのBstEII部位を創造するために実施した。
プライマーにおけるBstEII部位は下線が引かれている。BstEIIフラグメントの欠失の後、自己−連結されたクローンを、pFIV5′−D−11/M−52に連結した。その得られるクローンは、ENVタンパク質(残基106〜806)の中間の701個のアミノ酸に対応する、ヌクレオチド6577〜8679の2103個の塩基の欠失を有する。N−末端の105個の残基、Revタンパク質の第1エキソンをオーバーラップする主要部分、及びRev応答要素(RRE)とオーバーラップするC−末端の45個の残基が、欠失クローンに維持された。
SU del突然変異
2つのSpeI部位を、鋳型として、クローンpFIV3′−2A−1+ /M−21、及び突然変異誘発プライマーとして、Mpsu-1(5′−GAGGTATAAAGGTAAACAAAAAACTAGTGCCATTCATATTATGTTAGCCCTTGC−3′、配列番号38)及びMpsu-2(5′− ACTAACTATAGTCTATTTACTAACAACTAGTTTGAGATATTTAATAAGCCATAGAAAC −3′、配列番号39)を用いて、SDMによりFIV−141のSU領域に生成した。SpeIフラグメントをSpeI消化により欠失し、続いて大きな残るフラグメントを自己連結した。得られるクローンを、pFIV5′−D−11/M−52に連結した。このクローンは、SUタンパク質の503個のアミノ酸(残基106〜808)の欠失に対応する、ヌクレオチド6577〜8085の1509個の塩基の欠失を有する。
2つのSpeI部位を、鋳型として、クローンpFIV3′−2A−1+ /M−21、及び突然変異誘発プライマーとして、Mpsu-1(5′−GAGGTATAAAGGTAAACAAAAAACTAGTGCCATTCATATTATGTTAGCCCTTGC−3′、配列番号38)及びMpsu-2(5′− ACTAACTATAGTCTATTTACTAACAACTAGTTTGAGATATTTAATAAGCCATAGAAAC −3′、配列番号39)を用いて、SDMによりFIV−141のSU領域に生成した。SpeIフラグメントをSpeI消化により欠失し、続いて大きな残るフラグメントを自己連結した。得られるクローンを、pFIV5′−D−11/M−52に連結した。このクローンは、SUタンパク質の503個のアミノ酸(残基106〜808)の欠失に対応する、ヌクレオチド6577〜8085の1509個の塩基の欠失を有する。
V3/4 del 突然変異
SDMを、SUタンパク質のV3及びV4領域を端に有する2種のSphI部位を創造するために実施した。クローンpFIV3′−2A−1+ /M−21を、鋳型として、及び次の突然変異誘発プライマーを用いた: Mpenv-5(5′− ATACCGAAATGTGGATGGTGGAATCAGGCATGCTATTATAATAATTGTAAATGGGAAGAAGC −3′、配列番号40)及び Mpenv-6(5′−GCACTATGTACAATTGTTCCTTACAGGCATGCTTCACTATGAAAATAGAGGACCTTAT−3′、配列番号41)。SphI部位は下線が引かれている。SphIフラグメントを除去するために消化した後、クローンを自己−連結し、そして次に、pFIV5′−D−11/M−52に連結した。クローンは、V3及びV4領域を包含する、SUタンパク質の144個のアミノ酸(残基306〜503)の欠失に対応する、位置7339〜7770の432個の塩基の欠失を含む。
SDMを、SUタンパク質のV3及びV4領域を端に有する2種のSphI部位を創造するために実施した。クローンpFIV3′−2A−1+ /M−21を、鋳型として、及び次の突然変異誘発プライマーを用いた: Mpenv-5(5′− ATACCGAAATGTGGATGGTGGAATCAGGCATGCTATTATAATAATTGTAAATGGGAAGAAGC −3′、配列番号40)及び Mpenv-6(5′−GCACTATGTACAATTGTTCCTTACAGGCATGCTTCACTATGAAAATAGAGGACCTTAT−3′、配列番号41)。SphI部位は下線が引かれている。SphIフラグメントを除去するために消化した後、クローンを自己−連結し、そして次に、pFIV5′−D−11/M−52に連結した。クローンは、V3及びV4領域を包含する、SUタンパク質の144個のアミノ酸(残基306〜503)の欠失に対応する、位置7339〜7770の432個の塩基の欠失を含む。
V7/8 del 突然変異
SDMを用いて、TMタンパク質のV7及びV8領域を端に有する2種のSphI部位を創造した。これは、鋳型としてpFIV3′−2A−1+ /M−21、及び突然変異誘発プライマー Mpenv-7(5′−GAATCAATTCTTTTGTAAGATCGCATGCAATCTGTGGACAATGTATAACATGACTA−3′、配列番号42)及び Mpenv-8(5′−GGGAAAATTGGGTGGGATGGATAGGTAAGATCGCATGCTATTTAAAAGGACTTCTTGGTAG −3′、配列番号43)を用いて達成された。
SDMを用いて、TMタンパク質のV7及びV8領域を端に有する2種のSphI部位を創造した。これは、鋳型としてpFIV3′−2A−1+ /M−21、及び突然変異誘発プライマー Mpenv-7(5′−GAATCAATTCTTTTGTAAGATCGCATGCAATCTGTGGACAATGTATAACATGACTA−3′、配列番号42)及び Mpenv-8(5′−GGGAAAATTGGGTGGGATGGATAGGTAAGATCGCATGCTATTTAAAAGGACTTCTTGGTAG −3′、配列番号43)を用いて達成された。
SphI部位は下線が引かれている。SphIによる消化は、ヌクレオチド8380〜8595からの216個の塩基の欠失をもたらし、そして続いて、大きなフラグメントに連結した。次に、その得られるクローンを、5′側半分クローンpFIV5′−D−11/M−52に連結し、“V7/8 del ”を生成した。これは、V7及びV8の種々の領域を包含する、TMタンパク質の72個のアミノ酸(残基98〜169)の欠失を含む。
TMf del 突然変異
FIV-141の3′側半分クローンは、ヌクレオチド8145でユニークAgeI部位を有する。SDMを、位置8071で第2のAgeI部位を創造するために実施した。その3′側半分クローンを鋳型として、及び突然変異誘発プライマーとして Mpenv-3(5′−GGAAGAAGTTATGAGGTATACCGGTAAACAAAAAAGGGCC−3′、配列番号44)を使用した。2つのAgeI部位間の75−塩基のフラグメントを、制限酵素消化により欠失し、続いて大きな制限フラグメントを自己−連結せしめた。得られるクローンを、5′側半分クローンに連結し、“TMf del ”を生成した。
FIV-141の3′側半分クローンは、ヌクレオチド8145でユニークAgeI部位を有する。SDMを、位置8071で第2のAgeI部位を創造するために実施した。その3′側半分クローンを鋳型として、及び突然変異誘発プライマーとして Mpenv-3(5′−GGAAGAAGTTATGAGGTATACCGGTAAACAAAAAAGGGCC−3′、配列番号44)を使用した。2つのAgeI部位間の75−塩基のフラグメントを、制限酵素消化により欠失し、続いて大きな制限フラグメントを自己−連結せしめた。得られるクローンを、5′側半分クローンに連結し、“TMf del ”を生成した。
これは、SUとTMタンパク質との間の切断連結部に25個のアミノ酸の欠失を含む。欠失されたアミノ酸は、SUタンパク質の6個のC−末端残基(このうち4個は、塩基性であり(K又はRのいづれか)、そしてSU/TM切断部位のプロセッシングのために必要とされる)、及びTMタンパク質の融合ペプチドの19個のN−末端残基(ビリオンエンベロップと細胞膜との間の膜融合のために必要とされる)を含む。
CT del突然変異
SDMを、鋳型として3′側半分クローンpFIV3′−2A−1+ /M−21、及び突然変異誘発プライマーとして Mpenv-4(5′−CTACTTATATGCTTGCCTACATTGGTCGACTGATAGTGAAACTGTACTAATAAAATATTGGG−3′、配列番号45)を用いて、TMタンパク質の細胞質末端を切断するために実施した。SalI制限部位(下線が引かれている)を、変異体のスクリーニングを促進するために、サイレント突然変異によりオリゴヌクレオチド中に組込んだ。
SDMを、鋳型として3′側半分クローンpFIV3′−2A−1+ /M−21、及び突然変異誘発プライマーとして Mpenv-4(5′−CTACTTATATGCTTGCCTACATTGGTCGACTGATAGTGAAACTGTACTAATAAAATATTGGG−3′、配列番号45)を用いて、TMタンパク質の細胞質末端を切断するために実施した。SalI制限部位(下線が引かれている)を、変異体のスクリーニングを促進するために、サイレント突然変異によりオリゴヌクレオチド中に組込んだ。
3個のタンデム反復翻訳停止コドン(イタリック形)を、TMタンパク質のトランスメンブラン ドメインの後のプライマーの右側に組込んだ。その得られるクローンを5′側半分クローンに連結し、“CT del”を生成した。これは、ヌクレオチド8686〜8823からの138−塩基切断(TMタンパク質の細胞質ドメインからの46個のアミノ酸の切断に対応する)を有する。
C.Pol領域における欠失
Polポリタンパク質は、次の4種の酵素タンパク質から成る:PR,RT,DU及びIN。2種の欠失クローンを、Pol領域において構成した。
Polポリタンパク質は、次の4種の酵素タンパク質から成る:PR,RT,DU及びIN。2種の欠失クローンを、Pol領域において構成した。
DU del突然変異
鋳型として5′側半分クローンpFIV5′−D−11/M−52、及び突然変異誘発プライマーとして、Mpdu-1(5′−GATGGTTATAGAAGGTGAAGGAATTACTAGTAAAAGATCAGAAGATGCAGGATATG−3′、配列番号46)及び Mpdu-2 (5′−GAAATAATAATGGATTCAGAAAGAGGAACTAGTGGATTTGGGTCAACTGGAGTCTTTTC −3′、配列番号47)を用いて、DU領域に2つのSpeI部位を創造するために、SDMを実施した。プライマーにおけるSpeI部位は下線が引かれている。ヌクレオチド4019〜4363からの345個の塩基の欠失を、SpeI消化により達成し、続いて、大きな制限フラグメントの自己連結を行なった。その得られるクローンを、クローンpFIV3′−2A−1+ /M−21に連結し、“DU del”を生成した。そのクローンは、完全なDUタンパク質のほとんどに対応する115個のアミノ酸の欠失を含む。
鋳型として5′側半分クローンpFIV5′−D−11/M−52、及び突然変異誘発プライマーとして、Mpdu-1(5′−GATGGTTATAGAAGGTGAAGGAATTACTAGTAAAAGATCAGAAGATGCAGGATATG−3′、配列番号46)及び Mpdu-2 (5′−GAAATAATAATGGATTCAGAAAGAGGAACTAGTGGATTTGGGTCAACTGGAGTCTTTTC −3′、配列番号47)を用いて、DU領域に2つのSpeI部位を創造するために、SDMを実施した。プライマーにおけるSpeI部位は下線が引かれている。ヌクレオチド4019〜4363からの345個の塩基の欠失を、SpeI消化により達成し、続いて、大きな制限フラグメントの自己連結を行なった。その得られるクローンを、クローンpFIV3′−2A−1+ /M−21に連結し、“DU del”を生成した。そのクローンは、完全なDUタンパク質のほとんどに対応する115個のアミノ酸の欠失を含む。
IN del突然変異
鋳型として、pFIV5′−D−11/M−52、及び突然変異誘発プライマーとして、Mpin-1(5′−CTTCATGGGTGGACAGAATTGAAACTAGTGTATTAAATCATGAAAAATTTCACTCAG −3′、配列番号48)及びMpin-2(5′−GCAATGGGTGTATTATAAAGATCAGACTAGTAAAAAGTGGAAGGGACCAATGAGAGTAG −3′、配列番号49)を用いて、2つのSpeI部位を、FIV-141 のIN領域に、SDMにより創造した。プライマー中のSpeI部位は下線が引かれている。SpeIフラグメントの欠失及び自己連結の後、その得られるクローンを、pFIV3′−2A−1+ /M−21に連結し、“IN del”を生成した。これは、完全なINタンパク質のほとんどに対応するヌクレオチド4418〜5036の669個の塩基(INの残基9〜231の223個のアミノ酸)の欠失を含む。
鋳型として、pFIV5′−D−11/M−52、及び突然変異誘発プライマーとして、Mpin-1(5′−CTTCATGGGTGGACAGAATTGAAACTAGTGTATTAAATCATGAAAAATTTCACTCAG −3′、配列番号48)及びMpin-2(5′−GCAATGGGTGTATTATAAAGATCAGACTAGTAAAAAGTGGAAGGGACCAATGAGAGTAG −3′、配列番号49)を用いて、2つのSpeI部位を、FIV-141 のIN領域に、SDMにより創造した。プライマー中のSpeI部位は下線が引かれている。SpeIフラグメントの欠失及び自己連結の後、その得られるクローンを、pFIV3′−2A−1+ /M−21に連結し、“IN del”を生成した。これは、完全なINタンパク質のほとんどに対応するヌクレオチド4418〜5036の669個の塩基(INの残基9〜231の223個のアミノ酸)の欠失を含む。
D.調節遺伝子又は要素における欠失
FIV において固定された3種の調節タンパク質は、 Rev,Vif 及び ORF2である。 Rev−応答要素は、 FIVゲノムの3′末端で報告されている。5個の欠失クローンを、それらの領域において構成した。
FIV において固定された3種の調節タンパク質は、 Rev,Vif 及び ORF2である。 Rev−応答要素は、 FIVゲノムの3′末端で報告されている。5個の欠失クローンを、それらの領域において構成した。
Vifn del突然変異
ユニークMluI部位を、5′側半分クローンpFIV5′−D−11/M−52におけるVif遺伝子の中央に導入した。鋳型としてpFIV3′−D−11/M−52、及び突然変異誘発プライマーとして、 Mpvif-1(5′−AGAAGACTCTTTGCAGTTCTCCAATGAACGCGTTAGAGTGCCATGTTATACATATCG −3′、配列番号50)を用いて、Vif遺伝子のN−末端で第2のMluI部位を創造するために、SDMを実施した。プライマー中のMluI部位は下線が引かれている。ヌクレオチド5286〜5435の150個の塩基の制限フラグメントを、MluI消化により欠失し、続いて、大きなフラグメントに自己連結した。得られる欠失クローンをpFIV3′−2A−1+ /M−21に連結し、“Vifn del”を生成した。これは、 Vifタンパク質のN−末端部分で50個のアミノ酸(残基19〜68)の欠失を含む。
ユニークMluI部位を、5′側半分クローンpFIV5′−D−11/M−52におけるVif遺伝子の中央に導入した。鋳型としてpFIV3′−D−11/M−52、及び突然変異誘発プライマーとして、 Mpvif-1(5′−AGAAGACTCTTTGCAGTTCTCCAATGAACGCGTTAGAGTGCCATGTTATACATATCG −3′、配列番号50)を用いて、Vif遺伝子のN−末端で第2のMluI部位を創造するために、SDMを実施した。プライマー中のMluI部位は下線が引かれている。ヌクレオチド5286〜5435の150個の塩基の制限フラグメントを、MluI消化により欠失し、続いて、大きなフラグメントに自己連結した。得られる欠失クローンをpFIV3′−2A−1+ /M−21に連結し、“Vifn del”を生成した。これは、 Vifタンパク質のN−末端部分で50個のアミノ酸(残基19〜68)の欠失を含む。
Vifc del突然変異
3′側半分クローンpFIV3′−2A−1+ /M−21は、Vif領域内にユニークMluI部位を有する。鋳型としてpFIV3′−2A−1+ /M−21、及び突然変異誘発プライマーとして、 Mpvif-2(5′−CGTGTGGCAAAGAGGCTAAAACGCGTAGAGGCTGTTGTAATCAG−3′、配列番号51)を用いて、Vifタンパク質のC−末端で、第2のMluI部位をSDMにより創造した。プライマー中のMluI部位は下線が引かれている。MluIフラグメントの欠失の後、その得られるクローンを5′側半分クローンpFIV5′−D−11/M−52に連結し、“Vifc del”を生成した。これは、 Vifタンパク質のC−末端部分で、146個のアミノ酸(残基69〜214)の欠失に対応する、ヌクレオチド5436〜5873の438個の塩基の欠失を含む。
3′側半分クローンpFIV3′−2A−1+ /M−21は、Vif領域内にユニークMluI部位を有する。鋳型としてpFIV3′−2A−1+ /M−21、及び突然変異誘発プライマーとして、 Mpvif-2(5′−CGTGTGGCAAAGAGGCTAAAACGCGTAGAGGCTGTTGTAATCAG−3′、配列番号51)を用いて、Vifタンパク質のC−末端で、第2のMluI部位をSDMにより創造した。プライマー中のMluI部位は下線が引かれている。MluIフラグメントの欠失の後、その得られるクローンを5′側半分クローンpFIV5′−D−11/M−52に連結し、“Vifc del”を生成した。これは、 Vifタンパク質のC−末端部分で、146個のアミノ酸(残基69〜214)の欠失に対応する、ヌクレオチド5436〜5873の438個の塩基の欠失を含む。
Vif del 突然変異
“Vif del ”を構成するために、Vifc delのXhoI/MluI制限フラグメントを、Vifn delの5.3kbのXhoI/MluIフラグメントにより置換した。その得られるクローンは、完全な Vifタンパク質のほとんどである196個のアミノ酸(残基19〜214)の欠失に対応する、ヌクレオチド5286〜5873の588個の塩基の欠失を含む。
“Vif del ”を構成するために、Vifc delのXhoI/MluI制限フラグメントを、Vifn delの5.3kbのXhoI/MluIフラグメントにより置換した。その得られるクローンは、完全な Vifタンパク質のほとんどである196個のアミノ酸(残基19〜214)の欠失に対応する、ヌクレオチド5286〜5873の588個の塩基の欠失を含む。
ORF(2) del突然変異
2つのMluI部位を、ヌクレオチド5988及び6224(ORF(2)のN−及びC−末端で)で、SDMにより創造した。これは、鋳型として、pFIV3′−2A−1+ /M−21、及び突然変異誘発プライマーとして、 Mporf-1(5′−GTGGACGGGAGAATTATGAACGCGTGAACTAATCCCACTGTTTAATAAGGTTACAG−3′、配列番号52)、及び Mporf-2(5′−CTACATTATCCATAAATACTGCCTAGACGCGTTTCTTTTAATATTTCATCTGCAG −3′、配列番号53)を用いて達成された。プライマー中のMluI部位は、下線が引かれている。
2つのMluI部位を、ヌクレオチド5988及び6224(ORF(2)のN−及びC−末端で)で、SDMにより創造した。これは、鋳型として、pFIV3′−2A−1+ /M−21、及び突然変異誘発プライマーとして、 Mporf-1(5′−GTGGACGGGAGAATTATGAACGCGTGAACTAATCCCACTGTTTAATAAGGTTACAG−3′、配列番号52)、及び Mporf-2(5′−CTACATTATCCATAAATACTGCCTAGACGCGTTTCTTTTAATATTTCATCTGCAG −3′、配列番号53)を用いて達成された。プライマー中のMluI部位は、下線が引かれている。
SDMにより創造される2つのMluI部位の他に、クローンにおけるヌクレオチド5436でMluI部位が存在する。“ORF(2) del ”を構成するために、5′側半分クローンpFIV5′−D−11/M−52からの5.4kbのMluI/XhoIフラグメントを、3′側半分クローンpFIV3′−2A−1+ /M−21の大きなMluI/XhoIフラグメントに連結した。次に、位置5436〜5988の552個の塩基のMluIフラグメントを、その得られるクローンに挿入した。 ORF(2) del は、完全な ORF(2) 遺伝子を包含する、237個の塩基の欠失を含む。
RRE del 突然変異
鋳型として、pFIV3′−2A−1+ /M−21、及び突然変異誘発プライマーとして、 Mprre-1(5′−GGCATATCTGAAAAAGAGGAGGAATGAACTAGTATATCAGACCTGTAGAATACA−3′、配列番号54)及び Mprre-2(5′−GAGGAGGATGTGTCATATGAATCAAATACTAGTCAAAAATAACAGTAAAATCTATATTG −3′、配列番号55)を用いて、 RRE領域に2つのSpeI部位を創造するために、SDMを実施した。プライマー中のSpeI部位は下線が引かれている。SpeIフラグメントの欠失を、SpeI消化により達成し、続いて、大きなフラグメントに自己連結した。得られる欠失クローンをpFIV5′−D−11/M−52に連結し、“RRE del ”を生成した。これは、ヌクレオチド8827〜8910の84個の塩基の欠失を含む。
鋳型として、pFIV3′−2A−1+ /M−21、及び突然変異誘発プライマーとして、 Mprre-1(5′−GGCATATCTGAAAAAGAGGAGGAATGAACTAGTATATCAGACCTGTAGAATACA−3′、配列番号54)及び Mprre-2(5′−GAGGAGGATGTGTCATATGAATCAAATACTAGTCAAAAATAACAGTAAAATCTATATTG −3′、配列番号55)を用いて、 RRE領域に2つのSpeI部位を創造するために、SDMを実施した。プライマー中のSpeI部位は下線が引かれている。SpeIフラグメントの欠失を、SpeI消化により達成し、続いて、大きなフラグメントに自己連結した。得られる欠失クローンをpFIV5′−D−11/M−52に連結し、“RRE del ”を生成した。これは、ヌクレオチド8827〜8910の84個の塩基の欠失を含む。
例4:FIV-141 遺伝子欠失クローンの特性決定
A.ウィルスタンパク質発現及び/又は欠損ウィルス生成
欠失クローンの個々のプラスミドを、前記のようにして、CRFK細胞中にトランスフェクトした。FIV p26 ELISA アッセイを実施し、トランスフェクトされた細胞上清液におけるウィルスタンパク質発現及び/又はウィルス種子生成を検出した。トランスフェクションの48時間後で、13の構造体からのサンプルは、野生型 FIV-141分子クローンに関して観察されるシグナルに相当する強い陽性シグナルを生成することが見出された(図4を参照のこと)。最高レベルのウィルス粒子生成が、ENV del. TMf del, SU del, CT del, V3/4 del 、及びV7/8 del を包含する、 ENV領域における6種の欠失クローンに関して観察された。
A.ウィルスタンパク質発現及び/又は欠損ウィルス生成
欠失クローンの個々のプラスミドを、前記のようにして、CRFK細胞中にトランスフェクトした。FIV p26 ELISA アッセイを実施し、トランスフェクトされた細胞上清液におけるウィルスタンパク質発現及び/又はウィルス種子生成を検出した。トランスフェクションの48時間後で、13の構造体からのサンプルは、野生型 FIV-141分子クローンに関して観察されるシグナルに相当する強い陽性シグナルを生成することが見出された(図4を参照のこと)。最高レベルのウィルス粒子生成が、ENV del. TMf del, SU del, CT del, V3/4 del 、及びV7/8 del を包含する、 ENV領域における6種の欠失クローンに関して観察された。
同等レベルのウィルス粒子生成が、Vif領域における3種の欠失クローン( Vifn del, Vifc del 及び Vif del)、MA del, DU del, IN del、及びORF(2) delを包含する、7種の他の欠失クローンに関して観察された。この結果は、それらの13のクローンにより担持される欠失がトランスフェクトされた細胞からのウィルス粒子の形成及び開放を妨げないことを示す。比較的弱い陽性シグナルがNC delに関して検出され、これは、この領域における欠失がウィルス粒子アセンブリー又は開放に影響を及ぼすことを示す。
ウィルス粒子生成は、CA del又は RRE delによりトランスフェクトされた細胞の上清液に検出されなかった。CAタンパク質のC−末端における欠失は、ウィルス粒子形成を破壊し、又は p26 ELISAキットに使用されるモノクローナル抗体(MAb)により認識されるエピトープの損失をもたらすことができる。予測されるように、RRE領域における欠失は、核から細胞質へのスプライスされていないウィルスRNAの輸送の阻止をもたらし、ウィルス構造タンパク質の発現の完全な欠失、又はその劇的な低下のいづれかを導びく。
B.ウィルスRNA発現を検出するためへの細胞内RT−PCR
細胞内RT-PCRを実施し、2種の欠失クローン、CA del及び RRE delにおけるウィルスRNA発現を検出した。個々のクローンについてのプラスミドDNAを、異なった CRFIC細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、全RNAを、RNeasyキット(Qiagen, Chatsworth, CA)を用いて、トランスフェクトされた細胞から単離した。そのRNAをDEPC水50μlに溶出し、そして個々のRNAサンプル2μlを、 SuperscriptII(Gibco BRL, Gaithersburg, MD)を用いてcDNAの第1鎖を合成するために使用した。
細胞内RT-PCRを実施し、2種の欠失クローン、CA del及び RRE delにおけるウィルスRNA発現を検出した。個々のクローンについてのプラスミドDNAを、異なった CRFIC細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、全RNAを、RNeasyキット(Qiagen, Chatsworth, CA)を用いて、トランスフェクトされた細胞から単離した。そのRNAをDEPC水50μlに溶出し、そして個々のRNAサンプル2μlを、 SuperscriptII(Gibco BRL, Gaithersburg, MD)を用いてcDNAの第1鎖を合成するために使用した。
ヌクレオチド2956〜3542の585個の塩基対フラグメントを、前方プライマー、Sp-8(5′−TATTATGGTGGGGATTTGAAAC−3′、配列番号56)及び逆方向プライマー、Sp−20(5′−TAATTAGATTTGATTCCCAGGC−3′、配列番号57)として用いて、増幅した。個々の反応からのcDNA2μl、及び対照としての個々の調製物からの全RNA2μlを、PCR反応における鋳型として使用した。個々の反応を、PCR増幅キット(Gipco BRL, Gaithersburg)を用いて、100μlの体積において実施した。反応は次の通りに進行した:94℃で30秒間;55℃で30秒間;及び72℃でさらに30秒間、25サイクル、個々の反応物10μlを、1%アガロースゲル上に負荷した。
予測されるサイズを有する特定のバンドを、CA del及びRRE delクローンについて観察し、これは、ウィルスRNA発現がそれらのクローンによりトランスフェクトされた細胞において生じたことを示す。その結果は、CA delに関しての ELISAによるp26タンパク質発現を検出することの失敗は、たぶん、ウィルス粒子形成の失敗又はp26 ELISAアッセイに使用される抗体により認識されるエピトープの欠失のいづれかによることを示唆する。RRE欠失クローンに関しては、ウィルス遺伝子発現が細胞内 RT-PCR により示されたが、しかしp26タンパク質発現は ELISAアッセイを用いて検出されなかった。この矛盾は、 ELISAに比較される場合、RT-PCRアッセイのより高い感度を表わすことができる。
C.欠陥ウィルス粒子におけるウィルスゲノム及びRT酵素のカプシド封入
FIV-141 欠失クローンの大部分によるCRFK細胞のトランスフェクションは、欠陥ウィルス粒子の生成及び開放をもたらした。遺伝子欠失されたウィルスゲノム及びRTタンパク質がウィルス粒子中にカプシド封入されたかどうかを決定するために、ビリオン関連のRT PCR及びRT活性アッセイを実施した。手短に言及すれば、トランスフェクションの48時間後、個々のトランスフェクトされたCRFK培養物からの上清液200μlを収穫し、微小管において5分間、回転せしめ、細胞及び細胞残骸をペレット化した。
FIV-141 欠失クローンの大部分によるCRFK細胞のトランスフェクションは、欠陥ウィルス粒子の生成及び開放をもたらした。遺伝子欠失されたウィルスゲノム及びRTタンパク質がウィルス粒子中にカプシド封入されたかどうかを決定するために、ビリオン関連のRT PCR及びRT活性アッセイを実施した。手短に言及すれば、トランスフェクションの48時間後、個々のトランスフェクトされたCRFK培養物からの上清液200μlを収穫し、微小管において5分間、回転せしめ、細胞及び細胞残骸をペレット化した。
上清液におけるウィルス粒子を、スウィングバケットローターを用いて、4℃で20分間、20,000gで、超遠心分離によりペレット化した。カプシド封入について試験するために、ウィルスペレットを、RNeasyキットからの RLT緩衝液350μlに再懸濁し、そしてウィルスRNAを、製造業者により推薦されるようにして、 DEPC 50μlへの溶出により精製した。第1鎖cDNAを SuperscriptIIを用いて製造し、そしてPCR増幅を、Sp-8及び Sp-20プライマー組を用いて、前記のようにして実施した。
16個の欠失クローンのうち14個は、RT-PCR増幅の後、特定のバンドを示し、これは、それらのクローンによるCRFK細胞のトランスフェクションが欠陥ウィルス粒子を生成し、そして遺伝子−欠失されたウィルスゲノムがカプシド封入されたことを示す。それらの14個のクローンは、 ENV領域からの6個のクローン(ENV del, TMf del, CT del,V3/4 del,及びV7/8 del を包含する); Vif領域からの3個のクローン(Vifn del, Vifc del及び Vif delを包含する); Pol領域からの2個のクローン(DU del及びIN delを包含する);調節遺伝子/要素領域からの2個のクローン(ORF(2) del及び RRE del);及び Gag領域からの1個のクローン(MA del)から構成された。
CA delがビリオン−関連 RT-PCR アッセイにおいて負のシグナルを示したことは、p26 ELISA データと一致する。NCタンパク質はビリオン中へのウィルスゲノムのパッケージングのために必要とされ、そして予測されるように、ビリオン−関連遺伝子−欠失ウィルスRNAゲノムは NC del に関して、RT-PCRにより検出されなかった。RRE del に関しては、ビリオン−関連遺伝子−欠失ウィルスRNAは、存在するが、しかしウィルス粒子生成はp26 ELISAアッセイを用いて検出されなかったことを示された。それらの結果の柔値は再び、 ELISAよりもRT-PCRアッセイのより高い感度を示すことができる。
欠陥ウィルス粒子におけるRT(すなわち逆転写酵素)酵素のカプシド封入を試験するために、ウィルスペレットをRT ELISAキットからの溶解緩衝液40 lに再懸濁し、そしてアッセイを、製造業者により推薦されるようにして、進行せしめた。ビリオン−関連RT活性が次の14個の欠失クローンに関して検出されたことは、 p26 ELISAアッセイ及びビリオン−関連RT−PCRアッセイを用いて得られたデータと一致した:ENV del;SU del;TMf del ; V3/4 del ;V7/8 del;CT del;MA del;DU del;IN del;Vifn del;Vifc del; Vif del;ORF(2) del;及びNC del。ビリオン−関連RT活性は、CA又はRRE欠失クローンにおいては検出されなかった。
D.インビトロでの FIV-141遺伝子−欠失クローンの感染性
CRFK細胞を6ウェルプレートにおいて増殖せしめ、そして前記のようにしてトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、2×106 個の細胞を、個々のウェルに添加した。72時間の細胞の同時培養の後、FeP2細胞をCRFK細胞から分離し、そしてFeP2細胞培養物からの上清液を収穫し、そして3〜4日ごとに、合計4〜6週間、FIV p26 ELISA アッセイを用いて、ウィルス生成についてモニターした。
CRFK細胞を6ウェルプレートにおいて増殖せしめ、そして前記のようにしてトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、2×106 個の細胞を、個々のウェルに添加した。72時間の細胞の同時培養の後、FeP2細胞をCRFK細胞から分離し、そしてFeP2細胞培養物からの上清液を収穫し、そして3〜4日ごとに、合計4〜6週間、FIV p26 ELISA アッセイを用いて、ウィルス生成についてモニターした。
12個の欠失クローンが、モニター期間の間、有意なレベルのp26カプシドタンパク質発現を有さないことが見出された。それらは次のものを包含した: ENV del; TMf del;及びNC del(図5); Vif領域からの3個の欠失クローン(Vifn del;Vifc del;及び Vif del(図6);MA及びCA欠失クローン(図7);V3/4, V7/8 及びCT欠失クローン(図8);及び ORF(2) 欠失クローン(図9)。それらの結果は、それらのクローン中に導入される欠失がFeP2細胞におけるウィルスの感染性を完全に破壊することを示す。中位のレベルのウィルス複製が、4種の欠失クローン、たとえばDU del;SU del;IN del;及び RRE delに関して検出された(図10)。
E.結論
ENV del
ENVタンパク質の中央における701個のアミノ酸(残基106〜806)の欠失を有する ENV欠失クローンは、FeP2細胞を感染する能力を完全に失なった。それにもかかわらず、それは、欠陥ウィルス粒子をアセンブルし、そして開放する能力、ウィルスゲノムをカプシド封入する能力、及びRNAを逆転写する能力を保持した。 ENVタンパク質の一次機能は、感染の初期段階の間、標的細胞中へのウィルス侵入を仲介することである。大部分のENVタンパク質の欠失は、ウィルス侵入を阻止し、そして従って、ウィルス感染性を阻止する。
ENV del
ENVタンパク質の中央における701個のアミノ酸(残基106〜806)の欠失を有する ENV欠失クローンは、FeP2細胞を感染する能力を完全に失なった。それにもかかわらず、それは、欠陥ウィルス粒子をアセンブルし、そして開放する能力、ウィルスゲノムをカプシド封入する能力、及びRNAを逆転写する能力を保持した。 ENVタンパク質の一次機能は、感染の初期段階の間、標的細胞中へのウィルス侵入を仲介することである。大部分のENVタンパク質の欠失は、ウィルス侵入を阻止し、そして従って、ウィルス感染性を阻止する。
TMf del
SUタンパク質とTMタンパク質との間の切断連結部に25個のアミノ酸欠失を含む TMf欠失クローンは、FeP2細胞において非感染性である。この欠失は、 ENV前駆体タンパク質の切断プロセッシングを阻止し、そしてこれは標的細胞に結合し、そしてそれに侵入するウィルス粒子の失敗をもたらすことができる。FIV の ENV糖タンパク質の切断部位の除去が切断されていないENV前駆体タンパク質の発現をもたらすことが報告されている。
SUタンパク質とTMタンパク質との間の切断連結部に25個のアミノ酸欠失を含む TMf欠失クローンは、FeP2細胞において非感染性である。この欠失は、 ENV前駆体タンパク質の切断プロセッシングを阻止し、そしてこれは標的細胞に結合し、そしてそれに侵入するウィルス粒子の失敗をもたらすことができる。FIV の ENV糖タンパク質の切断部位の除去が切断されていないENV前駆体タンパク質の発現をもたらすことが報告されている。
しかしながら、発現された組換えタンパク質は、ウェスターンブロット及びラジオイムノ沈殿アッセイを用いて決定される場合、モノクローナル抗体とのその相互作用により明らかなように、その抗原性質を保持する( Rimmelzwaanなど.、1994,J. Gen. Virol. 75 : 2012-2097)。CRFK細胞中へのトランスフェクションに基づいて、欠失クローンは、野生型 FIV-141クローンに相当するレベルで、欠陥ウィルス粒子を生成する。その欠陥ウィルスゲノム及びRT酵素は欠陥ビリオンにカプシド封入された。
SU del
SU delは、SUタンパク質の残基106〜608からの503個のアミノ酸の欠失を有した。野生型クローンのウィルス粒子生成レベルにほぼ等しいレベルのウィルス粒子生成を維持することが見出された。遺伝子−欠失されたウィルスゲノム及びRT酵素の両者はカプシド封入された。しかしながら、ENV del と比較すると、SU delによりトランスフェクトされた細胞は、野生型ウィルスよりもかなり低い程度ではあるが、FeP2細胞において感染性であるウィルス粒子を生成した。
SU delは、SUタンパク質の残基106〜608からの503個のアミノ酸の欠失を有した。野生型クローンのウィルス粒子生成レベルにほぼ等しいレベルのウィルス粒子生成を維持することが見出された。遺伝子−欠失されたウィルスゲノム及びRT酵素の両者はカプシド封入された。しかしながら、ENV del と比較すると、SU delによりトランスフェクトされた細胞は、野生型ウィルスよりもかなり低い程度ではあるが、FeP2細胞において感染性であるウィルス粒子を生成した。
従って、 FIV-141ゲノムからのSUタンパク質の欠失がウィルスを弱毒化すると思われる。ウィルス感染における最初の段階である、細胞受容体への FIV結合は、TMタンパク質に関連する場合、SUタンパク質により仲介されると思われる。変異体ウィルスが標的細胞に結合し、そして侵入する機構は未知である。変異体ウィルスが宿主細胞に侵入するためのもう1つの経路は、欠失クローンに関連する、観察される低い感染性を担当することができる。
V3/4 del 及びV7/8 del
SUタンパク質の残基360〜503からの144個のアミノ酸(V3及びV4可変領域を包含する)、及びTMタンパク質の残基98〜169からの72個のアミノ酸(V7及びV8領域を包含する)を、それぞれV3/4 del 及びV7/8 del において欠失せしめた。CRFK細胞中へのトランスフェクションに基づいて、個々のクローンは、野生型クローンに関して観察されるレベルに類似するレベルで欠陥ウィルスを生成した。
SUタンパク質の残基360〜503からの144個のアミノ酸(V3及びV4可変領域を包含する)、及びTMタンパク質の残基98〜169からの72個のアミノ酸(V7及びV8領域を包含する)を、それぞれV3/4 del 及びV7/8 del において欠失せしめた。CRFK細胞中へのトランスフェクションに基づいて、個々のクローンは、野生型クローンに関して観察されるレベルに類似するレベルで欠陥ウィルスを生成した。
他の ENV−関連の欠失クローンに関しては、V3/4 del 及びV7/8 del は、それらの遺伝子−欠失されたウィルスゲノム及びRT酵素をビリオン中にカプシド封入した。感染性のアッセイは、SUのV3及びV4領域の欠失、及びTMタンパク質におけるV7及びV8領域の欠失がFeP2細胞におけるウィルス感染性を完全に破壊したことを示した。V3可変領域は、免疫優性ドメインであり、そして複数の機能、たとえばウィルス向性、ウィルス病因及び中和エピトープに包含されることが報告されている。この段階で、ウィルス感染がそれらの2種の欠失クローンにおいて阻止されたことは、現在、明白ではない。
CT del
FIV のTMタンパク質は比較的長い細胞質末端(46個の長さのアミノ酸)を有する。CT delクローンにおけるこの末端の切断は、FeP2細胞におけるウィルスの感染性の欠損をもたらした。しかしながら、切断は、ウィルスゲノム及びRTタンパク質のウィルス粒子形成及びカプシド封入に対して効果を有さなかった。MA及びTM細胞質末端間の特定の機能的相互作用が、FIV 及び HIV-1に関して報告されている。この相互作用は、ビリオン中への ENVタンパク質の組込みのために重要であることが提案されている。CT delにおける細胞質ドメインの切断は、MAタンパク質とTMタンパク質との間の機能的相互作用を排除することができ、それにより、ENV の組込みを阻止する。
FIV のTMタンパク質は比較的長い細胞質末端(46個の長さのアミノ酸)を有する。CT delクローンにおけるこの末端の切断は、FeP2細胞におけるウィルスの感染性の欠損をもたらした。しかしながら、切断は、ウィルスゲノム及びRTタンパク質のウィルス粒子形成及びカプシド封入に対して効果を有さなかった。MA及びTM細胞質末端間の特定の機能的相互作用が、FIV 及び HIV-1に関して報告されている。この相互作用は、ビリオン中への ENVタンパク質の組込みのために重要であることが提案されている。CT delにおける細胞質ドメインの切断は、MAタンパク質とTMタンパク質との間の機能的相互作用を排除することができ、それにより、ENV の組込みを阻止する。
MA del
MA delは、MAタンパク質のC−末端で残基85〜125の41個のアミノ酸欠失を含む。CRFK細胞中へのトランスフェクションに基づいて、クローンは、野生型FIV−141クローンを用いて生成されるレベルに相当するレベルで欠陥ウィルスを生成した。これは、C−末端ドメインでの欠失がウィルス粒子アセンブリー及び開放に対して有意な効果を有さないことを示す。遺伝子−欠失されたウィルスゲノム及びRTタンパク質は、欠陥ウィルス粒子にカプシド封入された。それらのウィルス粒子がトランスフェクトされたCRFK細胞から開放される場合、それらはFeP2細胞に対して非感染性であった。
MA delは、MAタンパク質のC−末端で残基85〜125の41個のアミノ酸欠失を含む。CRFK細胞中へのトランスフェクションに基づいて、クローンは、野生型FIV−141クローンを用いて生成されるレベルに相当するレベルで欠陥ウィルスを生成した。これは、C−末端ドメインでの欠失がウィルス粒子アセンブリー及び開放に対して有意な効果を有さないことを示す。遺伝子−欠失されたウィルスゲノム及びRTタンパク質は、欠陥ウィルス粒子にカプシド封入された。それらのウィルス粒子がトランスフェクトされたCRFK細胞から開放される場合、それらはFeP2細胞に対して非感染性であった。
CA del
CAタンパク質のN−末端での残基9〜46の38個のアミノ酸の欠失は、p26 ELISAアッセイ、ビリオン内RT PCRアッセイ及びRT活性アッセイにおける負のシグナルにより明らかなように、ウィルス粒子形成を破壊した。しかしながら、トランスフェクトされたCRFK細胞からの細胞内RT PCRは、欠失がウィルス RNA発現を阻止しなかったことを示した。従って、トランスフェクトされた細胞の上清液におけるp26タンパク質又は欠陥ウィルス生成を検出することの失敗は、ウィルス粒子アセンブリーにおける阻止のためであって、ウィルスタンパク質発現における阻止のためではない。
CAタンパク質のN−末端での残基9〜46の38個のアミノ酸の欠失は、p26 ELISAアッセイ、ビリオン内RT PCRアッセイ及びRT活性アッセイにおける負のシグナルにより明らかなように、ウィルス粒子形成を破壊した。しかしながら、トランスフェクトされたCRFK細胞からの細胞内RT PCRは、欠失がウィルス RNA発現を阻止しなかったことを示した。従って、トランスフェクトされた細胞の上清液におけるp26タンパク質又は欠陥ウィルス生成を検出することの失敗は、ウィルス粒子アセンブリーにおける阻止のためであって、ウィルスタンパク質発現における阻止のためではない。
NC del
完全なNCタンパク質は、NC delクローンにおいて欠失された。このクローンによりトランスフェクトされた細胞は、野生型クローンに比較して、有意に低められたレベルで欠陥ウィルスを生成し、これは、欠失がウィルス粒子のアセンブリー又は開放を害したことを示す。HIV-1のNCタンパク質はウィルス−株粒子のアセンブリーのために必要とされないことが報告されている。NCクローンにおける欠失は、欠陥ビリオン中へのRT酵素のパッケージングに影響を及ぼさなかった。予測されるように、ウィルスゲノムは、ウィルス粒子にカプシド封入されなかった。
完全なNCタンパク質は、NC delクローンにおいて欠失された。このクローンによりトランスフェクトされた細胞は、野生型クローンに比較して、有意に低められたレベルで欠陥ウィルスを生成し、これは、欠失がウィルス粒子のアセンブリー又は開放を害したことを示す。HIV-1のNCタンパク質はウィルス−株粒子のアセンブリーのために必要とされないことが報告されている。NCクローンにおける欠失は、欠陥ビリオン中へのRT酵素のパッケージングに影響を及ぼさなかった。予測されるように、ウィルスゲノムは、ウィルス粒子にカプシド封入されなかった。
Vif del, Vifc del 及び Vifn del
3種の欠失クローン、すなわち Vifn del, Vifc del 及びVif del を、 Vif遺伝子において構成した。Vifnは、 Vifタンパク質のN−末端部分で50個のアミノ酸の欠失を有した。 Vifc は、そのタンパク質のC−末端領域で146個のアミノ酸の欠失を有し、そしてVif del はほとんど完全な Vifタンパク質の欠失を有した。すべての3種のクローンは、類似する性質を示した。
3種の欠失クローン、すなわち Vifn del, Vifc del 及びVif del を、 Vif遺伝子において構成した。Vifnは、 Vifタンパク質のN−末端部分で50個のアミノ酸の欠失を有した。 Vifc は、そのタンパク質のC−末端領域で146個のアミノ酸の欠失を有し、そしてVif del はほとんど完全な Vifタンパク質の欠失を有した。すべての3種のクローンは、類似する性質を示した。
それらの3種のクローンのいづれかによりトランスフェクトされた細胞は、野生型 FIV-141クローンに相当する速度でウィルス粒子を生成した。ウィルスゲノム及びRT酵素の両者は、すべての3種のクローンのためにビリオンにカプシド封入された。前記3種のクローンによりトランスフェクトされたCRFK細胞から開放されるビリオンは、FeP2細胞に対して非感染性であり、このことは、 VifがTリンパ球におけるウィルス複製のために必要とされることを示す。
ORF(2) del
ORF(2)の完全なオープンリーディングフレームを、ORF(2)欠失クローンにおいて欠失せしめた。前記クローンによりトランスフェクトされた細胞は、野生型クローンに相当する速度で、ウィルス粒子をアセンブリーし、そして開放した。ウィルスゲノム及びRT酵素の両者はウィルス粒子にパッケージングされるが、クローンはFeP2細胞において複製することを失敗し、このことは、ORF(2)の遺伝子生成物がそれらの細胞におけるウィルス生成のために必要とされることを示す。
ORF(2)の完全なオープンリーディングフレームを、ORF(2)欠失クローンにおいて欠失せしめた。前記クローンによりトランスフェクトされた細胞は、野生型クローンに相当する速度で、ウィルス粒子をアセンブリーし、そして開放した。ウィルスゲノム及びRT酵素の両者はウィルス粒子にパッケージングされるが、クローンはFeP2細胞において複製することを失敗し、このことは、ORF(2)の遺伝子生成物がそれらの細胞におけるウィルス生成のために必要とされることを示す。
RRE del
FIV の RRE配列を含んで成る全150個の塩基のうち84個を、RRE del において欠失せしめた。この欠失は、トランスフェクトされた細胞におけるウィルス構造タンパク質の発現及び生成を害した。トランスフェクトされたCRFK細胞の上清液におけるp26生成は検出されなかった。同様に、パッケージされたRT活性は測定されなかった。それらの結果は、 RRE配列が核から細胞の細胞質へのスプライスされていない及び単一スプライスされたウィルスRNAの輸送のために必要とされる提案と良好に一致した。
FIV の RRE配列を含んで成る全150個の塩基のうち84個を、RRE del において欠失せしめた。この欠失は、トランスフェクトされた細胞におけるウィルス構造タンパク質の発現及び生成を害した。トランスフェクトされたCRFK細胞の上清液におけるp26生成は検出されなかった。同様に、パッケージされたRT活性は測定されなかった。それらの結果は、 RRE配列が核から細胞の細胞質へのスプライスされていない及び単一スプライスされたウィルスRNAの輸送のために必要とされる提案と良好に一致した。
しかしながら、ビリオン−関連ウィルスゲノムRNAは、RT PCRにより付与されることが示されており、そして ウィルス粒子はFeP2細胞において感染性であるが、但し、野生型 FIV-141クローンに比較して、著しく低められたレベルであった。全体的に考慮すると、それらの結果は、RRE配列の欠失がウィルス構造タンパク質の発現を劇的に低めることを示す。しかしながら、欠失は発現を完全には破壊せず、そして微量の感染性ビリオン粒子がトランスフェクトされた細胞により生成されたように見える。
IN del
ほとんど完全なINタンパク質を、IN delクローンにおいて欠失した。CRFK細胞中へのトランスフェクションに基づいて、クローンは、野生型クローンのレベルに相当するレベルのウィルスタンパク質発現及びウィルス粒子生成を示した。ビリオン−関連RT PCR及びRT活性アッセイは、ウィルスゲノムRNA及びRT酵素の両者がウィルス粒子中にパッケージされることを示した。
ほとんど完全なINタンパク質を、IN delクローンにおいて欠失した。CRFK細胞中へのトランスフェクションに基づいて、クローンは、野生型クローンのレベルに相当するレベルのウィルスタンパク質発現及びウィルス粒子生成を示した。ビリオン−関連RT PCR及びRT活性アッセイは、ウィルスゲノムRNA及びRT酵素の両者がウィルス粒子中にパッケージされることを示した。
驚くべきことには、クローンによりトランスフェクトされた細胞から回収されたビリオンは感染性であり、そして野生型ウィルスに比較して低いレベルではあるが、FeP2細胞において複製できた。組込みは、多くのレトロウィルス、たとえば HIV-1の生産性感染のために必要とされる必須段階である。データは、HIV に比較して、FIV のINタンパク質はFeP2細胞におけるウィルスタンパク質発現及びウィルス複製のための必須必要条件ではないことを示唆する。
DU del
ほとんど完全なDU遺伝子を、DU delクローンにおいて欠失せしめた。この遺伝子の生成物は、dUTPをdUMPに転換する。クローンにおけるDU遺伝子の欠失は、トランスフェクトされたCRFK細胞におけるウィルスタンパク質発現又はウィルス粒子生成に影響を及ぼさなかった。ウィルスゲノム及びRT酵素の両者はカプシド封入され、そしてトランスフェクトされた細胞から生成されるビリオンはFeP2細胞に対して感染性であった。
ほとんど完全なDU遺伝子を、DU delクローンにおいて欠失せしめた。この遺伝子の生成物は、dUTPをdUMPに転換する。クローンにおけるDU遺伝子の欠失は、トランスフェクトされたCRFK細胞におけるウィルスタンパク質発現又はウィルス粒子生成に影響を及ぼさなかった。ウィルスゲノム及びRT酵素の両者はカプシド封入され、そしてトランスフェクトされた細胞から生成されるビリオンはFeP2細胞に対して感染性であった。
しかしながら、欠失クローンは、野生型 FIV-141ウィルスよりも遅い速度で、FeP2において複製した。これは、DU遺伝子がウィルスの最大複製のために必要とされることを示す。このデータは、DU欠失された FIVがTリンパ球において増殖するその能力を保持する報告と一致する。
生物学的材料の寄託
次の生物学的材料が、1998年7月1日、12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA のAmerican Type Culture Collection(ATCC)に寄託され、そして次の受託番号を割り当てられた:
ATCC受託番号
ウィルス株 FIV-141 VR-2619
プラスミド pFIV-141-B1 203001
上記に引用されるすべての特許、特許出願及び出版物は、引用により本明細書に組込まれる。
本発明は、本発明の個々の観点の単一の例示として意図される、記載される特定の態様により、発明の範囲において制限されるものではない。機能的に同等の組成物及び方法は、本発明の範囲内である。
次の生物学的材料が、1998年7月1日、12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA のAmerican Type Culture Collection(ATCC)に寄託され、そして次の受託番号を割り当てられた:
ATCC受託番号
ウィルス株 FIV-141 VR-2619
プラスミド pFIV-141-B1 203001
上記に引用されるすべての特許、特許出願及び出版物は、引用により本明細書に組込まれる。
本発明は、本発明の個々の観点の単一の例示として意図される、記載される特定の態様により、発明の範囲において制限されるものではない。機能的に同等の組成物及び方法は、本発明の範囲内である。
Claims (84)
- 配列番号1に対応するゲノム核酸配列を有する、実質的に精製されたネコ免疫不全ウィルス−141(FIV-141)。
- 請求項1記載のウィルスにより感染された宿主細胞。
- 請求項2記載の宿主細胞において生成される FIV-141子孫ウィルス。
- FIV-141 に対する抗体の生成を誘発する方法であって、請求項1記載のウィルスを動物に感染せしめることを含んで成る方法。
- 前記ウィルスが、接種の前に不活性化される請求項4記載の方法。
- FIV-141 に対する抗体の生成を誘発する方法であって、請求項2記載の宿主細胞を動物に感染せしめることを含んで成る方法。
- 前記細胞が、感染の前に固定される請求項6記載の方法。
- 前記動物から前記抗体を単離することをさらに含んで成る請求項4〜7のいづれか1項記載の方法。
- 請求項4〜7のいづれか1項記載の方法により生成される抗体。
- 不活性化されている、請求項1記載の FIV-141ウィルスを含んで成る全ウィルスワクチン。
- 請求項1記載のウィルスにより感染された、固定されている宿主細胞を含んで成る固定された細胞ワクチン。
- ネコにおいて免疫応答を誘発するための方法であって、請求項10又は11記載のワクチンを、FIV-141 による続く感染に対しての保護免疫性を誘発するのに十分な用量で前記ネコに投与することを含んで成る方法。
- 配列番号1に対応する配列を有する実質的に精製された核酸分子。
- 前記核酸がDNAである請求項13記載の核酸分子。
- 請求項13記載の核酸によりトランスフェクトされた宿主細胞。
- 請求項15記載の宿主細胞により生成されるFIV子孫ウィルス。
- 動物においてFIV−141に対する抗体の生成を誘発する方法であって、請求項13記載の核酸分子を前記動物に注射することを含んで成る方法。
- 動物において抗体の生成を誘発する方法であって、請求項15記載の宿主細胞を前記動物に注射することを含んで成る方法。
- 前記宿主細胞が、感染の前に固定される請求項18記載の方法。
- 前記動物から前記抗体を単離することをさらに含んで成る請求項17〜19のいづれか1項記載の方法。
- 請求項17〜19のいづれか1項記載の方法により生成される抗体。
- 請求項13記載の核酸によりトランスフェクトされた、固定されている宿主細胞を含んで成る固定された細胞ワクチン。
- ネコにおいて免疫応答を誘発する方法であって、請求項22記載のワクチンを、FIV−141による続く感染に対して保護免疫を誘発するのに十分な用量で、前記ネコに投与することを含んで成る方法。
- 宿主細胞中への侵入の後に複製するが、しかし野生型ウィルスに比較して、ネズミTリンパ球に対して有意に低められた感染性を示す弱毒化されたFIV−141ウィルスであって、ビリオン感染因子 (Vif)、マトリックスタンパク質(MA)、オープンリーディングフレーム2(ORF(2))、エンベロープ(ENV)、カプシドタンパク質(CA)、ヌクレオカプシドタンパク質(NC)、表面タンパク質(SU)、トランスメンブラン因子(TMf)、トランスメンブランの細胞質ドメイン(CT)、インテグラーゼ(IN)、デオキシウリジントリホスファターゼ(DU)、表面タンパク質のV3及びV4領域(V3/4)、表面タンパク質のV7及びV8領域(V7/8)、並びにRev応答要素(RRE)から成る群から選択されたFIV-141 ゲノムにおける遺伝子を突然変異誘発することによって生成される弱毒化された FIV-141ウィルス。
- 前記遺伝子が Vif, MA, ORF(2)及び ENVから成る群から選択される請求項24記載の弱毒化された FIV-141ウィルス。
- 請求項24記載の弱毒化されたウィルスによりトランスフェクトされた宿主細胞。
- 請求項26記載の宿主細胞において生成される弱毒化された FIV-141ウィルス。
- FIV-141 に対する抗体の生成を誘発する方法であって、請求項24記載の弱毒化された FIV-141ウィルスを動物に感染せしめることを含んで成る方法。
- 前記弱毒化された FIV-141ウィルスが、感染の前に不活性化される請求項28記載の方法。
- FIV-141 に対する抗体の生成を誘発する方法であって、請求項26記載の宿主細胞を動物に感染せしめることを含んで成る方法。
- 前記宿主細胞が、感染の前に固定される請求項30記載の方法。
- 前記動物から前記抗体を精製することをさらに含んで成る請求項28〜31のいづれか1項記載の方法。
- 請求項28〜31のいづれか1項記載の方法により生成される抗体。
- 請求項24又は25のいづれか1項記載のウィルスを含んで成る弱毒化された全ウィルスワクチン。
- ネコにおいて免疫応答を誘発する方法であって、請求項34記載のワクチンを、FIV-141 による続く感染に対して保護免疫を誘発するのに十分な用量で、前記ネコに投与することを含んで成る方法。
- 請求項26記載の宿主細胞を含んで成る弱毒化された宿主細胞ワクチン。
- 請求項25記載のウィルスにより感染された宿主細胞を含んで成る弱毒化された宿主細胞ワクチン。
- ネコにおいて免疫応答を誘発する方法であって、請求項36又は37のいづれか1項記載のワクチンを、FIV-141 による続く感染に対して保護免疫性を誘発するのに十分な用量で、前記ネコに投与することを含んで成る方法。
- 配列番号1に対応する配列を有するが、しかし Vif, MA, CA, NC, SU, TMf, ORF(2), CT, ENV, Vifn (Vif タンパク質のN−末端部分),Vifc(Vif タンパク質のC−末端部分),IN, DU, V3/4,V7/8、及びRRE から成る群から選択された遺伝子において突然変異誘発されている実質的に精製された FIV-141核酸分子であって、宿主細胞中への導入後に、複製するウィルスを生成するが、しかし野生型FIV-141 に対して、末梢血液単核細胞(PBMC)において有意に低められた感染性を有するウィルスを生成する核酸分子。
- 前記遺伝子が、MA, Vif, ORF (2)、及びENV から成る群から選択される請求項39記載の核酸分子。
- 前記核酸がDNAである請求項39又は40のいづれか1項記載の核酸分子。
- 請求項39記載の核酸分子によりトランスフェクトされた宿主細胞。
- 請求項42記載の宿主細胞により生成されるFIV子孫ウィルス。
- 動物において FIV-141に対する抗体の生成を誘発する方法であって、請求項39記載の核酸分子を前記動物に注射することを含んで成る方法。
- 動物において FIV-141に対する抗体の生成を誘発する方法であって、請求項42記載の宿主細胞を前記動物に注射することを含んで成る方法。
- 前記宿主細胞が、感染の前に固定される請求項45記載の方法。
- 前記動物から前記抗体を単離することをさらに含んで成る請求項44〜46のいづれか1項記載の方法。
- 請求項44〜46のいづれか1項記載の方法により生成される抗体。
- ネコに投与される場合、免疫性を誘発するのに十分な濃度での請求項39記載の核酸分子を含んで成るワクチン。
- 前記核酸がDNAである請求項49記載のワクチン。
- 請求項39記載の核酸分子によりトランスフェクトされた宿主細胞を含んで成るワクチン。
- 前記宿主細胞が固定されている請求項51記載のワクチン。
- ネコにおいて免疫応答を誘発する方法であって、請求項49〜52のいづれか1項記載のワクチンを、FIV-141 による続く感染に対して保護免疫を誘発するのに十分な用量で、前記ネコに投与することを含んで成る方法。
- 宿主細胞において複製するが、しかしその野生型対応物に対して有意に低められた感染性を有する弱毒化されたレンチウィルスを製造するための方法であって、MA, CA, NC, DU, ENV, SU, TMf, CT, V3/4 、V7/8 、Vif, Vifn, Vifc, IN, RRE、及び ORF(2)から成る群から選択された1又は複数の遺伝子を突然変異誘発することを含んで成る方法。
- 前記遺伝子が MA, ORF(2) 及びENV から成る群から選択される請求項54記載の方法。
- 前記レンチウィルスが FIVの株である請求項54又は55のいづれか1項記載の方法。
- 請求項54又は55のいづれか1項記載の方法により生成される弱毒化されたレンチウィルス。
- 請求項57記載の弱毒化されたウィルスにより感染された宿主細胞。
- レンチウィルスに対する抗体の生成を誘発する方法であって、請求項57記載の弱毒化されたウィルスにより哺乳類を感染せしめることを含んで成る方法。
- レンチウィルスに対する抗体の生成を誘発する方法であって、請求項58記載の宿主細胞を哺乳類に感染せしめることを含んで成る方法。
- 前記哺乳類から前記抗体を精製することをさらに含んで成る請求項60記載の方法。
- 請求項59又は60のいづれか1項記載の方法により生成される抗体。
- レンチウィルス感染に対して哺乳類を治療する方法であって、請求項62記載の抗体を、前記感染に関連する1又は複数の症状を減じるのに十分な用量で、前記哺乳類に投与することを含んで成る方法。
- 請求項54又は55のいづれか1項記載のウィルスを含んで成る弱毒化された全ウィルスワクチン。
- 哺乳類に免疫応答を誘発する方法であって、請求項64記載のワクチンを、前記レンチウィルスの少なくとも1つの株による続く感染に対する保護免疫を誘発するのに十分な用量で、前記哺乳類に投与することを含んで成る方法。
- 請求項58記載のレンチウィルスにより感染された宿主細胞を含んで成る弱毒化された宿主細胞ワクチン。
- 哺乳類に免疫応答を誘発する方法であって、請求項66記載のワクチンを、前記レンチウィルスの少なくとも1つの株による続く感染に対する保護免疫を誘発するのに十分な用量で、前記哺乳類に投与することを含んで成る方法。
- レンチウィルス感染のためのワクチンへの使用のために適切な核酸を製造する方法であって、
a)前記レンチウィルスのゲノムRNAを逆転写し;
b)段階a)の逆転写されたRNAをクローニングし;
c)段階b)のクローン化された核酸における遺伝子を突然誘発し、ここで前記遺伝子がMA, CA, NC, SU, TMf, ORF(2), CT, ENV, V3/4, V7/8, Vif, Vifn, Vifc, IN, DU及びRRE から成る群から選択され;そして
d)段階c)の突然変異誘発された核酸をクローニングする;
ことを含んで成る方法。 - 前記突然変異誘発された分子が、宿主細胞中への導入の後複製するが、しかし突然変異誘発されていない野生型核酸から生成されたレンチウィルスに比べて有意に低められた感染性を有する弱毒化されたウィルスを生成する請求項68記載の方法。
- 前記レンチウィルスが FIVの株であり、そして前記弱毒化されたウィルスは複製するが、しかし突然変異されていない野生型核酸から生成されるFIVに比べてネズミT−リンパ球において有意に低められた感染性を有する請求項69記載の方法。
- 前記遺伝子が、MA, ORF(2)及び ENV(2) から成る群から選択される請求項69又は70のいづれか1項記載の方法。
- 請求項71記載の核酸分子によりトランスフェクトされた宿主細胞。
- 請求項72記載の宿主細胞により生成される子孫レンチウィルス。
- レンチウィルスの少なくとも1つの株に対する抗体の生成を誘発する方法であって、請求項68記載の核酸分子を動物に注射することを含んで成る方法。
- 請求項74記載の方法により生成される抗体。
- 請求項69記載の核酸分子を、哺乳類に投与される場合に免疫性を誘発するのに十分な濃度で含んで成るワクチン。
- 哺乳類において免疫応答を誘発する方法であって、請求項76記載のワクチンを、前記レンチウィルスによる続く感染に対して保護免疫を誘発するのに十分な用量で前記哺乳類に投与することを含んで成る方法。
- 請求項70記載の核酸分子を、ネコに投与される場合に免疫性を誘発するのに十分な濃度で含んで成るワクチン。
- ネコにおいて免疫応答を誘発する方法であって、請求項78記載のワクチンを、FIVの少なくとも1つの株による続く感染に対して保護免疫を誘発するのに十分な用量で、前記ネコに投与することを含んで成る方法。
- 請求項72記載の宿主細胞を含んで成るワクチン。
- 哺乳類において免疫応答を誘発する方法であって、請求項80記載のワクチンを、前記レンチウィルスによる続く感染に対して保護免疫を誘発するのに十分な用量で、前記哺乳類に投与することを含んで成る方法。
- 前記哺乳類がネコであり、そして前記レンチウィルスがFIVの株であり、そして前記ワクチンが、FIV の少なくとも1つの株による続く感染に対して保護免疫を誘発するのに十分な用量で投与される請求項81記載の方法。
- ATCC受託番号VR-2619 を有するネコ免疫不全ウィルスの株、及びそれから調製される子孫ウィルス。
- pFIV-141-B1 として命名され、そしてATCC受託番号203001を有するプラスミド。
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