FR2692269A1 - Peptides immunogènes et/ou neutralisants de vif de souche WO et leurs applications au diagnostic et à la prévention de l'immunodéficience féline. - Google Patents
Peptides immunogènes et/ou neutralisants de vif de souche WO et leurs applications au diagnostic et à la prévention de l'immunodéficience féline. Download PDFInfo
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Abstract
Peptides et leurs fragments, spécifiques du virus de l'immunodéficience féline (VIF) et utilisation desdits fragments comme réactif de diagnostic et comme agent induisant une réponse immune (cellulaire et/ou production d'anticorps), notamment pour la prévention de l'immunodéficience féline. Ces peptides et/ou fragments de peptide, sont codés par une séquence nucléotidique ou une combinaison de plusieurs segments nucléotidiques choisie dans le groupe qui comprend les séquences env et les séquences gag issues de n'importe quelle souche de VIF, en ce qu'il sont reconnus par les anticorps dirigés contre au moins une souche différente de celle dont provient ledit peptide et/ou par les anticorps produits par des chats infectés naturellement et en ce qu'ils présentent une capacité d'induction d'une réponse immune cellulaire et/ou de production d'anticorps protecteurs vis-à-vis d'au moins une souche de VIF, chez des chats non infectés.
Description
La présente invention est relative à des peptides et à leurs fragments, spécifiques du virus de l'immunodéficience féline (VIF) ainsi qu'à l'utilisation desdits fragments comme réactif de diagnostic et comme agent induisant une réponse immune (cellulaire et/ou production d'anticorps), notamment pour la prévention de l'immunodéficience féline.
L'immunodéficience féline est due à un lentivirus, le virus de l'immunodéficience féline (VIF), qui présente une structure génétique similaire à celle des lentivirus des primates (VIH et VIS).
L'immunodéficience féline pose un problème important de santé vétérinaire, dans la mesure où un nombre important de chats infectés par le VIF a été décelé aux Etats-Unis, au Japon et en Europe (5 à 25 % des animaux).
A l'heure actuelle, l'immunodéficience féline est essentiellement diagnostiquée lors de l'apparition des signes cliniques (lymphadénopathie généralisée et survenue d'infections opportunistes), alors qu'un diagnostic très précoce aurait des avantages importants tant dans le traitement que dans la prévention de cette maladie.
Plusieurs isolats viraux indépendants ont été mis en évidence à travers le monde et un certain nombre de travaux pour mettre en évidence la structure des souches isolées ont été réalisés, notamment en ce qui concerne la souche américaine Petaluma [R.L. TALBOTT et al. (Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 5743-5747)
T.R. PHILIPPS et al. (J. Virol., 1990, 64, 10, 46054613)], les souches japonaises (souches TM1 et TM2) [T.
T.R. PHILIPPS et al. (J. Virol., 1990, 64, 10, 46054613)], les souches japonaises (souches TM1 et TM2) [T.
MIYAZAWA et al. (Arch. Virol., 1989, 108, 59-68)] ou les isolats suisses (FIVZ1 et FIVZ2) [S. MORIKAWA et al., (Virus Research, 1991, 21, 53-63)].
Les séquences nucléotidiques de trois clones proviraux, dérivés des isolats de VIF américains (souche
Petaluma) ont été décrites (clones FIV34TF10, FIV14 et isolat PPR) [R.A. OLMSTED et al., (Proc. Natl. Acad. Sci.
Petaluma) ont été décrites (clones FIV34TF10, FIV14 et isolat PPR) [R.A. OLMSTED et al., (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 1989, 86, 2448-2452) ; T.R. PHILIPPS et al., 1990 R.fi TALBOTT et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 5743-5747) et comparées aux deux isolats suisses (S.
MORIKAWA et al.). Cette comparaison a conduit S. MORIKAWA et al. à préciser la présence de certaines régions conservées et de certaines régions variables dans le gène env du VIF.
Des souches françaises ont également été isolées (souches WO et ME) [A. MORAILLON et al., 1992, Vet.
Mic., 31, 41-45].
Les protéines d'enveloppe du VIF sont considérées comme étant au centre de la relation hôte-virus; leur étude est donc essentielle pour comprendre l'interaction du virus avec le système immunitaire (épitopes de neutralisations, épitopes B et T) et avec les cellules-cibles de l'infection, et mettre au point aussi bien des réactifs de diagnostic performants que des vaccins efficaces, constitués de protéines virales à action immunogène et protectrice, vis-à-vis de l'ensemble des souches de VIF.
La protéine env du VIF peut fournir, après clivage, deux fragments glycoprotéiques, dénommés SU (glycoprotéine de surface) et TM (glycoprotéine transmembranaire).
I1 a été montré que des fragments peptidiques issus d'une protéine env du VIF contiennent des déterminants majeurs de la protection (Demande PCT/FR91/00917 au nom de la Demanderesse).
Poursuivant ses travaux, la Demanderesse a trouvé qu'il était nécessaire, pour optimiser aussi bien le diagnostic que la prévention (vaccins sous-unités), de sélectionner des peptides viraux de petites tailles, particulièrement adaptés au diagnostic et à la prévention et permettant de former un pool de réactifs pour la détec tion de groupe (ensemble des souches de VIF) et/ou la détection de type (détection sélective de certaines souches).
La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à une composition à pouvoir immunogène et/ou protecteur, spécifique du virus de l'immunodéficience féline, obtenue en exprimant des fragments sélectionnés pour leur capacité neutralisante et/ou la présence d'épitopes de reconnaissance de groupe et/ou de type ; l'obtention par génie génétique ou synthèse chimique de tels peptides spécifiques, a pour avantage de résoudre le problème de production de virus et d'obtenir directement les peptides désirés.
La présente invention a pour objet un peptide et/ou un fragment de peptide, caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence nucléotidique ou une combinaison de plusieurs segments nucléotidiques choisis dans le groupe qui comprend les séquences env et les séquences gag issues de n'importe quelle souche de VIF, en ce qu'il est reconnu par les anticorps dirigés contre au moins une souche différente de celle dont provient ledit peptide et/ou par les anticorps produits par des chats infectés naturellement et en ce qu'il présente une capacité d'induction d'une réponse immune cellulaire et/ou de production d'anticorps protecteurs vis-à-vis d'au moins une souche de VIF, chez des chats non infectés.
Selon un mode de réalisation avantageux desdits peptides, ils sont exprimés par des séquences nucléotidiques issues de la souche WO du VIF.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit peptide comprend 854 aminoacides, présente un poids moléculaire apparent d'environ 90 kDa et correspond à la protéine env du VIF WO.
Un tel peptide comprend entre 10 et 25 sites de glycosylation.
Selon une modalité avantageuse de cette disposition, ledit peptide présente une séquence en acides aminés qui répond à la formule I ci-après
Met-Ala-Glu-Gly-Phe-Ala-Ala-Asn-Arg-Gln-Trp-Ile-Gly-Phe-
Glu-Glu-Ala-Glu-Glu-Leu-Leu-Asp-Phe-Asp-Ile-Ala-Ile-Gln
Met-Asn-Glu-Glu-Gly-Pro-Leu-Asn-Pro-Gly-Val-Asn-Pro-Phe Arg-Val-Pro-Gly-Ile-Thr-Glu-Ala-Glu-Lys-Gln-Glu-Tyr-Cys
Asn-Ile-Leu59-Gln-Pro-Lys-Leu-Gln-Asp-Leu-Lys-Gly-Lys-
Ile-Gln-Glu-Val-Lys-Leu-Glu-Glu-Gly-Asn-Ala-Gly-Lys-Phe-
Arg-Arg-Ala-Arg-Phe-Leu-Arg-Tyr-Ser-Asp-Glu-Thr-Val-Leu-
Ser-Leu-Ile-Hisl0l-Leu-Phe-Ile-Gly-Tyr-Cys-Pro-Hisl09 -
Leu-Cys-Arg-Arg-His114-Glu-Leu-Gly-Ser-Leu19-Arg-His121
Asp-Ile-Asp-Ile-Glu-Ala-Leu-Gln-Glu-Glu-Arg-Tyr-Asn-Asp
Arg-Glu-Lys-Gly-Ile-Thr-Asp-Asn-Ile-Lys-Tyr-Gly-Lys-Arg-
Cys * -Leu-Ile-Gly-Thr-Ala-Val -Leu-Tyr-Leu-Leu-Leu-Ser-Leu-
Gly-Ile-Ile-Ile-His168-Thr-Cys-Lys-Ala-Gln-Val-Val-Trp Arg177-Leu-Pro-Pro-Leu-Val-Val-Pro-Val-Glu-Glu-Ser-Glu-
* Ile-Ile-Phe-Trp-Asp-Cys -Trp-Ala-Pro -Glu-Glu-Pro-Ala-
Cys * -Gln-Asp-Phe-Leu-Gly-Ala-Met -Ile-His -Leu-Lys -Ala-Ser-
Thr-Asn-Ile-Ser-Ile-Gln-Glu-Gly-Pro-Thr-fieu-Gly-Asn-Trp-
Ala-Arg-Glu-Ile-Trp-Gly-Thr237 -fieu-Phe-fiys-fiys-Ala-Thr-
Arg-Gln-Cys *-Arg-Arg-Gly-Arg-Ile-Trp-Arg-Arg-Trp-Asn-Glu-
Thr-Ile-Thr-Gly-Pro-Leu-Gly-Cys * -Ala-Asn-Asn-Thr-Cys *
Tyr-Asn-Ile-Ser-Val-Ile-Val-Pro-Asp-Tyr-Gln-Cys* -Tyr-Leu
Asp-Arg-Val-Asp-Thr-Trp-Leu-Gln-Gly-Lys-Val-Asn-Ile297
Ser-Leu-Cys -Leu-Thr-Gly-Gly-Lys-Met-Leu-Tyr-Asn-Lys-Glu-
Thr-Lys -Gln-Leu-Ser-Tyr-Cys* -Thr-Asp-Pro-Leu-Gln-Ile-Pro-
Leu-Ile-Asn-Tyr-Phe-Gly-Pro-Asn-Gln-Thr-Cys -Met-Trp-Asn
Thr-Ser-Gln-Ile-Gln-Asp-Pro-Glu-Ile-Pro-Lys-Cys*-Gly-Gly
Asn-Gln357-Asn-Ala-Tyr-Tyr-Asn-Ser-Cys -Arg-Trp-Glu-His
Thr-Asp-Val-Gln-Phe-Gln-Cys* -Gln-Arg-Thr-Gln-Ser-Gln-Pro
Gly-Ser-Trp-Ile-Arg-Ala-Ile-Ser-Ser-Trp-fiys -Gln-Arg-Asn-
Arg-Trp-Glu-Trp-Arg-Pro-Asp-Phe-Glu-Ser-Glu-fiys -Val-flys-
Val-Ser-Leu-Gln-Cys*-Asn-Ser417-Thr-Lys-Asn-Leu-Thr-Phe
Ala-Met-Arg-Ser-Ser-Gly-Asp-Tyr-Gly-Glu-Val-Thr-Gly-Ala-
Trp-Ile-Glu-Phe-Gly-Cys*-His-Arg-Thr-Lys-Ser-Lys-Tyr-His Thr-Glu-Ala-Arg-Phe-Arg-Ile-Arg-Cys * -Arg-Trp-Asn-Val-Gly
Asp-Asn-Thr-Ser-Leu-Ile-Asp-Thr-Cys -Gly-Glu-Thr477-Gln
Asn-Val-Ser-Arg-Ala-Asn-Pro-Val-Asp-Cys -Thr-Met-Tyr-Ala
Asn-Arg-Met-Tyr-Asn-Cys -Ser-Leu-Gln-Asn-Gly-Phe-Thr-Met
Lys -Val -Asp-Asp-Leu-Ile-Met-His -Phe-Asn-Lys -Thr-Lys -Ala-
Val-Glu-Met-Tyr-Asn-Ile-Ala-Gly-Asn-Trp-Ser-Cys*-Lys-Ser Asp-Leu-Pro537-Pro-Thr-Trp-Gly-Tyr-Met-Asn-Cys -Asn-Cys Thr-Asn-Ser-Thr-Asn-Ser-Gly-Thr-Gly-Ile-Arg-Met-Ala-Cys
Pro-Arg-Asn-Gln-Gly-Ile-Leu-Arg-Asn-Trp-Tyr-Asn-Pro-Val
Ala-Gly-Leu-Arg-Gln-Ser-Leu-Glu-Lys-Tyr-Gln-Val-Val-Lys-
Gln-Pro-Asp-Tyr-Leu-Val595-Val-Pro-Gly-Glu-Val-Met-Glu
Tyr-fiys-Pro-Arg-Arg-fiys-Arg-Ala-Ala-Ile-His-Val-Met-fieu-
Ala-Leu-Ala-Thr-Val-Leu-Ser-Met-Ala-Gly-Ala-Gly-Thr-Gly
Ala-Thr-Ala-Ile-Gly-Met-Val-Thr-Gln-Tyr-Gln-Gln-Val-Leu-
Ala-Thr-His-Gln-Glu-Ala-Ile-Glu-Lys-Val-Thr655-Glu-Ala
Leu-Lys-Ile-Asn-Asn-Leu-Arg-Leu-Val-Thr-Leu-Glu-His-Gln-
Val-Leu-Val-Ile-Gly-Leu-Lys-Val-Glu-Ala-Met-Glu-Lys-Phe-
Leu-Tyr-Thr-Ala-Phe-Ala-Met-Gln-Glu-Leu-Gly-Cys -Asn-Gln
Asn-Gln-Phe-Phe-Cys*-fiys-Val-Pro-Ser-Ala-fiys-Trp-Glu-Arg-
Tyr-Asn715-Met-Thr-Ile-Asn-Gln-Thr-Ile-Trp-Asn-His-Gly-
Asn-Ile-Thr-Leu-Gly-Glu-Trp-Tyr-Asn-Gln-Thr-Lys-Asp-Leu-
Gln-Gln-Arg-Phe-Tyr-Glu-Ile-Ile-Met-Asp-Ile-Glu-Gln-Asn
Asn-Val-Gln-Gly-Lys-Lys-Gly-Leu-Gln-Gln-Leu-Gln-Glu-Trp-
Glu-Asp-Trp-Val-Gly-Trp-Ile775-Gly-Asn-Ile-Pro-Gln-Tyr-
Leu-Lys-Gly-Leu-Leu-Gly-Gly-Ile-Leu-Gly-Ile-Gly-Leu-Gly-
Met-Leu-Leu-Leu-Ile-Leu-Cys -Leu-Pro-Thr-Leu-Val-Asp-
Cys*-Ile-Arg-Asn-Cys*-Ile-His-Lys-Ile-Leu-Gly-Tyr-Thr Val-Ile-Ala-Met -Pro-Glu-Val-Glu-Glu-Glu-Glu-Ile-Gln-
Pro835-Gln-Met-Glu-Leu-Arg-Arg-Asn-Gly-Arg-Gln-Cys -Gly
Met-Ser-Glu-Lys-Glu-Glu-Glu854
(I)
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit peptide comprend 450 aminoacides, présente un poids moléculaire apparent environ 50 kDa et correspond à la protéine gag du VIF WO.
Met-Ala-Glu-Gly-Phe-Ala-Ala-Asn-Arg-Gln-Trp-Ile-Gly-Phe-
Glu-Glu-Ala-Glu-Glu-Leu-Leu-Asp-Phe-Asp-Ile-Ala-Ile-Gln
Met-Asn-Glu-Glu-Gly-Pro-Leu-Asn-Pro-Gly-Val-Asn-Pro-Phe Arg-Val-Pro-Gly-Ile-Thr-Glu-Ala-Glu-Lys-Gln-Glu-Tyr-Cys
Asn-Ile-Leu59-Gln-Pro-Lys-Leu-Gln-Asp-Leu-Lys-Gly-Lys-
Ile-Gln-Glu-Val-Lys-Leu-Glu-Glu-Gly-Asn-Ala-Gly-Lys-Phe-
Arg-Arg-Ala-Arg-Phe-Leu-Arg-Tyr-Ser-Asp-Glu-Thr-Val-Leu-
Ser-Leu-Ile-Hisl0l-Leu-Phe-Ile-Gly-Tyr-Cys-Pro-Hisl09 -
Leu-Cys-Arg-Arg-His114-Glu-Leu-Gly-Ser-Leu19-Arg-His121
Asp-Ile-Asp-Ile-Glu-Ala-Leu-Gln-Glu-Glu-Arg-Tyr-Asn-Asp
Arg-Glu-Lys-Gly-Ile-Thr-Asp-Asn-Ile-Lys-Tyr-Gly-Lys-Arg-
Cys * -Leu-Ile-Gly-Thr-Ala-Val -Leu-Tyr-Leu-Leu-Leu-Ser-Leu-
Gly-Ile-Ile-Ile-His168-Thr-Cys-Lys-Ala-Gln-Val-Val-Trp Arg177-Leu-Pro-Pro-Leu-Val-Val-Pro-Val-Glu-Glu-Ser-Glu-
* Ile-Ile-Phe-Trp-Asp-Cys -Trp-Ala-Pro -Glu-Glu-Pro-Ala-
Cys * -Gln-Asp-Phe-Leu-Gly-Ala-Met -Ile-His -Leu-Lys -Ala-Ser-
Thr-Asn-Ile-Ser-Ile-Gln-Glu-Gly-Pro-Thr-fieu-Gly-Asn-Trp-
Ala-Arg-Glu-Ile-Trp-Gly-Thr237 -fieu-Phe-fiys-fiys-Ala-Thr-
Arg-Gln-Cys *-Arg-Arg-Gly-Arg-Ile-Trp-Arg-Arg-Trp-Asn-Glu-
Thr-Ile-Thr-Gly-Pro-Leu-Gly-Cys * -Ala-Asn-Asn-Thr-Cys *
Tyr-Asn-Ile-Ser-Val-Ile-Val-Pro-Asp-Tyr-Gln-Cys* -Tyr-Leu
Asp-Arg-Val-Asp-Thr-Trp-Leu-Gln-Gly-Lys-Val-Asn-Ile297
Ser-Leu-Cys -Leu-Thr-Gly-Gly-Lys-Met-Leu-Tyr-Asn-Lys-Glu-
Thr-Lys -Gln-Leu-Ser-Tyr-Cys* -Thr-Asp-Pro-Leu-Gln-Ile-Pro-
Leu-Ile-Asn-Tyr-Phe-Gly-Pro-Asn-Gln-Thr-Cys -Met-Trp-Asn
Thr-Ser-Gln-Ile-Gln-Asp-Pro-Glu-Ile-Pro-Lys-Cys*-Gly-Gly
Asn-Gln357-Asn-Ala-Tyr-Tyr-Asn-Ser-Cys -Arg-Trp-Glu-His
Thr-Asp-Val-Gln-Phe-Gln-Cys* -Gln-Arg-Thr-Gln-Ser-Gln-Pro
Gly-Ser-Trp-Ile-Arg-Ala-Ile-Ser-Ser-Trp-fiys -Gln-Arg-Asn-
Arg-Trp-Glu-Trp-Arg-Pro-Asp-Phe-Glu-Ser-Glu-fiys -Val-flys-
Val-Ser-Leu-Gln-Cys*-Asn-Ser417-Thr-Lys-Asn-Leu-Thr-Phe
Ala-Met-Arg-Ser-Ser-Gly-Asp-Tyr-Gly-Glu-Val-Thr-Gly-Ala-
Trp-Ile-Glu-Phe-Gly-Cys*-His-Arg-Thr-Lys-Ser-Lys-Tyr-His Thr-Glu-Ala-Arg-Phe-Arg-Ile-Arg-Cys * -Arg-Trp-Asn-Val-Gly
Asp-Asn-Thr-Ser-Leu-Ile-Asp-Thr-Cys -Gly-Glu-Thr477-Gln
Asn-Val-Ser-Arg-Ala-Asn-Pro-Val-Asp-Cys -Thr-Met-Tyr-Ala
Asn-Arg-Met-Tyr-Asn-Cys -Ser-Leu-Gln-Asn-Gly-Phe-Thr-Met
Lys -Val -Asp-Asp-Leu-Ile-Met-His -Phe-Asn-Lys -Thr-Lys -Ala-
Val-Glu-Met-Tyr-Asn-Ile-Ala-Gly-Asn-Trp-Ser-Cys*-Lys-Ser Asp-Leu-Pro537-Pro-Thr-Trp-Gly-Tyr-Met-Asn-Cys -Asn-Cys Thr-Asn-Ser-Thr-Asn-Ser-Gly-Thr-Gly-Ile-Arg-Met-Ala-Cys
Pro-Arg-Asn-Gln-Gly-Ile-Leu-Arg-Asn-Trp-Tyr-Asn-Pro-Val
Ala-Gly-Leu-Arg-Gln-Ser-Leu-Glu-Lys-Tyr-Gln-Val-Val-Lys-
Gln-Pro-Asp-Tyr-Leu-Val595-Val-Pro-Gly-Glu-Val-Met-Glu
Tyr-fiys-Pro-Arg-Arg-fiys-Arg-Ala-Ala-Ile-His-Val-Met-fieu-
Ala-Leu-Ala-Thr-Val-Leu-Ser-Met-Ala-Gly-Ala-Gly-Thr-Gly
Ala-Thr-Ala-Ile-Gly-Met-Val-Thr-Gln-Tyr-Gln-Gln-Val-Leu-
Ala-Thr-His-Gln-Glu-Ala-Ile-Glu-Lys-Val-Thr655-Glu-Ala
Leu-Lys-Ile-Asn-Asn-Leu-Arg-Leu-Val-Thr-Leu-Glu-His-Gln-
Val-Leu-Val-Ile-Gly-Leu-Lys-Val-Glu-Ala-Met-Glu-Lys-Phe-
Leu-Tyr-Thr-Ala-Phe-Ala-Met-Gln-Glu-Leu-Gly-Cys -Asn-Gln
Asn-Gln-Phe-Phe-Cys*-fiys-Val-Pro-Ser-Ala-fiys-Trp-Glu-Arg-
Tyr-Asn715-Met-Thr-Ile-Asn-Gln-Thr-Ile-Trp-Asn-His-Gly-
Asn-Ile-Thr-Leu-Gly-Glu-Trp-Tyr-Asn-Gln-Thr-Lys-Asp-Leu-
Gln-Gln-Arg-Phe-Tyr-Glu-Ile-Ile-Met-Asp-Ile-Glu-Gln-Asn
Asn-Val-Gln-Gly-Lys-Lys-Gly-Leu-Gln-Gln-Leu-Gln-Glu-Trp-
Glu-Asp-Trp-Val-Gly-Trp-Ile775-Gly-Asn-Ile-Pro-Gln-Tyr-
Leu-Lys-Gly-Leu-Leu-Gly-Gly-Ile-Leu-Gly-Ile-Gly-Leu-Gly-
Met-Leu-Leu-Leu-Ile-Leu-Cys -Leu-Pro-Thr-Leu-Val-Asp-
Cys*-Ile-Arg-Asn-Cys*-Ile-His-Lys-Ile-Leu-Gly-Tyr-Thr Val-Ile-Ala-Met -Pro-Glu-Val-Glu-Glu-Glu-Glu-Ile-Gln-
Pro835-Gln-Met-Glu-Leu-Arg-Arg-Asn-Gly-Arg-Gln-Cys -Gly
Met-Ser-Glu-Lys-Glu-Glu-Glu854
(I)
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit peptide comprend 450 aminoacides, présente un poids moléculaire apparent environ 50 kDa et correspond à la protéine gag du VIF WO.
Selon une modalité avantageuse de cette disposition, ledit peptide présente une séquence en amino acides qui répond à la formule II ci-après
Met gly asn gly gln gly arg asp trp lys met ala ile lys arg cys ser asn gly ala val gly val gly gly lys ser lys lys phe gly glu gly asn phe arg trp ala ile arg met ala asn val ser thr gly arg glu pro gly asp ile pro glu thr leu asp gln leu arg leu val ile cys asp leu gln glu arg arg glu lys phe gly ser ser lys glu ile asp met ala ile ala ala leu lys val phe ala val val gly leu leu asn met thr val ser thr ala ala ala ala glu asn met tyr thr gln met gly leu asp thr arg pro ser thr lys glu ala gly gly lys glu glu gly pro pro gln ala tyr pro ile gln thr val asn gly thr thr gln tyr val ala leu asp pro lys met val ser ile phe met glu lys ala arg glu gly leu gly gly glu glu val gln leu trp phe thr ala phe ser ala asn leu thr pro thr asp met ala thr leu ile met ala arg pro gly cys leu thr gln glu gln gln ala glu ala arg phe ala pro ala arg met gln cys arg ala trp tyr leu glu ala leu gly lys leu ala ala ile lys ala lys ser pro arg ala val gln leu arg gln gly ala lys glu asp tyr ser ser phe ile asp arg leu phe ala gln ile asp gln glu gln asn thr ala glu val lys leu tyr leu lys gln ser leu ser ile ala asn ala asn ala asp cys lys lys ala met ser his leu lys pro glu ser thr leu glu glu lys leu arg ala cys gln glu ile gly phe pro gly tyr lys met gln leu leu ala glu ala leu thr lys val gln val val gln ser lys gly pro gly pro val cys phe asn cys lys arg pro gly his leu ala arg gln cys arg asp val lys lys cys asn lys cys gly lys pro gly his leu ala ala lys cys trp gln gly gly lys lys asn ser gly asn trp lys ala gly arg ala ala ala pro val asn gln val gln gln ala val met pro ser ala pro pro met glu glu lys leu leu asp leu (Il)
La présente invention a également pour objet des fragments ou des combinaisons de fragments incluant des segments du peptide conforme à l'invention, comprenant entre 5 et 80 aminoacides et au moins un épitope.
Met gly asn gly gln gly arg asp trp lys met ala ile lys arg cys ser asn gly ala val gly val gly gly lys ser lys lys phe gly glu gly asn phe arg trp ala ile arg met ala asn val ser thr gly arg glu pro gly asp ile pro glu thr leu asp gln leu arg leu val ile cys asp leu gln glu arg arg glu lys phe gly ser ser lys glu ile asp met ala ile ala ala leu lys val phe ala val val gly leu leu asn met thr val ser thr ala ala ala ala glu asn met tyr thr gln met gly leu asp thr arg pro ser thr lys glu ala gly gly lys glu glu gly pro pro gln ala tyr pro ile gln thr val asn gly thr thr gln tyr val ala leu asp pro lys met val ser ile phe met glu lys ala arg glu gly leu gly gly glu glu val gln leu trp phe thr ala phe ser ala asn leu thr pro thr asp met ala thr leu ile met ala arg pro gly cys leu thr gln glu gln gln ala glu ala arg phe ala pro ala arg met gln cys arg ala trp tyr leu glu ala leu gly lys leu ala ala ile lys ala lys ser pro arg ala val gln leu arg gln gly ala lys glu asp tyr ser ser phe ile asp arg leu phe ala gln ile asp gln glu gln asn thr ala glu val lys leu tyr leu lys gln ser leu ser ile ala asn ala asn ala asp cys lys lys ala met ser his leu lys pro glu ser thr leu glu glu lys leu arg ala cys gln glu ile gly phe pro gly tyr lys met gln leu leu ala glu ala leu thr lys val gln val val gln ser lys gly pro gly pro val cys phe asn cys lys arg pro gly his leu ala arg gln cys arg asp val lys lys cys asn lys cys gly lys pro gly his leu ala ala lys cys trp gln gly gly lys lys asn ser gly asn trp lys ala gly arg ala ala ala pro val asn gln val gln gln ala val met pro ser ala pro pro met glu glu lys leu leu asp leu (Il)
La présente invention a également pour objet des fragments ou des combinaisons de fragments incluant des segments du peptide conforme à l'invention, comprenant entre 5 et 80 aminoacides et au moins un épitope.
On entend par épitope, au sens de la présente invention, aussi bien les épitopes communs à toutes les souches de VIF (zones conservées), reconnus par tous les anticorps anti-env (reconnaissance de groupe), que les épitopes propres à certaines souches de VIF (zones variables), reconnus par certains anticorps seulement (reconnaissance de type) ; de plus, tous ces fragments induisent une production d'anticorps et/ou une réponse cellulaire.
Ces fragments ont l'avantage de présenter une sélectivité et/ou une spécificité importante vis-à-vis du
VIF, tout en étant de petite taille (prix de revient nettement diminué).
VIF, tout en étant de petite taille (prix de revient nettement diminué).
Parmi ces fragments, l'invention englobe, entre autres, des fragments incluant des segments de peptides conformes à l'invention, correspondant à des épitopes + conservés, tels que
- un fragment incluant un segment de 37 aminoacides, dénommé SU1, qui correspond aux positions 253-289 de la séquence de formule I (souche WO)
- un fragment incluant un segment de 37 aminoacides, dénommé SU2, qui correspond aux positions 388-424 de la séquence de formule I, lequel segment contient au moins un épitope correspondant à la séquence : : Trp-Glu-Trp-Arg-Pro-Asp-Phe-Glu-Ser-Glu-
- un fragment incluant un segment de 26 aminoacides, dénommé SU3, qui correspond aux positions 467-492 de la séquence de formule I
- un fragment incluant un segment de 21 aminoacides, dénommé SU4, qui correspond aux positions 508-528 de la séquence de formule I
- un fragment incluant un segment de 35 aminoacides, dénommé SU5, qui correspond aux positions 572-606 de la séquence de formule I
- un fragment incluant un segment de 51 aminoacides, dénommé TM1, qui correspond aux positions 595-647 de la séquence de formule I
- un fragment incluant un segment de 31 aminoacides, dénommé TM2, qui correspond aux positions 681-711 de la séquence de formule I, lequel segment contient un épi tope correspondant à la séquence :Gln Asn-Gln-Phe-Phe-Cys-Lys ;
- un fragment incluant un segment de 45 aminoacides, dénommé TM3, qui correspond aux positions 744-788 de la séquence de formule I, lequel segment contient un épi tope correspondant à la séquence : Gln- Leu-Gln-Glu-Trp-Asp-Trp-Val-Gly-Trp-Ile-Gly-Asn-Ile
- un fragment incluant un segment de 29 aminoacides, dénommé TM4, qui correspond aux positions 826-854 de la séquence de formule I.
- un fragment incluant un segment de 37 aminoacides, dénommé SU1, qui correspond aux positions 253-289 de la séquence de formule I (souche WO)
- un fragment incluant un segment de 37 aminoacides, dénommé SU2, qui correspond aux positions 388-424 de la séquence de formule I, lequel segment contient au moins un épitope correspondant à la séquence : : Trp-Glu-Trp-Arg-Pro-Asp-Phe-Glu-Ser-Glu-
- un fragment incluant un segment de 26 aminoacides, dénommé SU3, qui correspond aux positions 467-492 de la séquence de formule I
- un fragment incluant un segment de 21 aminoacides, dénommé SU4, qui correspond aux positions 508-528 de la séquence de formule I
- un fragment incluant un segment de 35 aminoacides, dénommé SU5, qui correspond aux positions 572-606 de la séquence de formule I
- un fragment incluant un segment de 51 aminoacides, dénommé TM1, qui correspond aux positions 595-647 de la séquence de formule I
- un fragment incluant un segment de 31 aminoacides, dénommé TM2, qui correspond aux positions 681-711 de la séquence de formule I, lequel segment contient un épi tope correspondant à la séquence :Gln Asn-Gln-Phe-Phe-Cys-Lys ;
- un fragment incluant un segment de 45 aminoacides, dénommé TM3, qui correspond aux positions 744-788 de la séquence de formule I, lequel segment contient un épi tope correspondant à la séquence : Gln- Leu-Gln-Glu-Trp-Asp-Trp-Val-Gly-Trp-Ile-Gly-Asn-Ile
- un fragment incluant un segment de 29 aminoacides, dénommé TM4, qui correspond aux positions 826-854 de la séquence de formule I.
Lesdits peptides peuvent avantageusement être obtenus soit par clonage, soit par synthèse, notamment par synthèse de Merrifield.
- D'un point de vue diagnostic
Parmi les peptides SU et TM, l'invention permet de sélectionner des fragments universels (notamment
SU2, TM2 et TM3), reconnaissant les anticorps produits par un VIF, s'il est présent, quelle que soit la souche et des fragments spécifiques de souche WO (notamment SU3 et TM4).
Parmi les peptides SU et TM, l'invention permet de sélectionner des fragments universels (notamment
SU2, TM2 et TM3), reconnaissant les anticorps produits par un VIF, s'il est présent, quelle que soit la souche et des fragments spécifiques de souche WO (notamment SU3 et TM4).
- D'un point de vue protecteur (vaccin en particulier)
les fragments SU et les fragments TM induisent plus spécifiquement la production d'anticorps, et éventuellement une réponse cellulaire ; en conséquence le pool de peptides conforme à l'invention assure soit une protection spécifique vis-à-vis de la souche d'origine, soit une protection plus large (plusieurs souches de
VIF).
les fragments SU et les fragments TM induisent plus spécifiquement la production d'anticorps, et éventuellement une réponse cellulaire ; en conséquence le pool de peptides conforme à l'invention assure soit une protection spécifique vis-à-vis de la souche d'origine, soit une protection plus large (plusieurs souches de
VIF).
De plus, la sélection d'un tel ensemble de fragments permet de choisir le vaccin le plus proche possible de la souche infectante en cas d'immunothérapie active ou passive, ou de déterminer les souches présentes dans une région donnée, pour le choix d'un vaccin préventif, le plus approprié.
Au sens de la présente invention, le terme fragment peptidique comprend tous les fragments incluant un segment de peptide conforme à l'invention ainsi que les segments de peptides homologues ; on entend par peptides homologues, les peptides qui ne perdent pas les propriétés de reconnaissance des anticorps dirigés contre le peptide de référence (notamment les peptides TM2, TM3 et SU2). On entend également par peptide homologue, un peptide présentant une position et une fonction équivalentes au sein du VIF.
La présente invention a également pour objet une composition à pouvoir immunogène et/ou protecteur, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un peptide conforme à l'invention, éventuellement associé à au moins une autre substance immunogène ou immunostimulante et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention, a, de plus, pour objet un procédé de détection d'anticorps anti-VIF, caractérisé en ce qu'il consiste à détecter les anticorps anti-VIF éventuellement présents dans un échantillon biologique à l'aide d'un peptide ou fragment de peptide conforme à l'invention, éventuellement fixé sur un support solide approprié, en mettant en présence ledit échantillon biologique avec ledit/lesdits peptides ou fragment(s) de peptides, auxquels se lient les anticorps anti-VIF si de tels anticorps sont présents dans l'échantillon à analyser, la lecture du résultat étant révélée par un moyen approprié, notamment EIA, RIA, fluorescence.
Ce procédé permet notamment de vérifier la séroconversion des animaux vaccinés ou de procéder à des enquêtes sérologiques à visée épidémiologique.
Selon le choix du peptide, ledit procédé permet de déterminer une infection à VIF, quelle que soit la souche (réactif universel tel que précisé ci-dessus), ou bien permet de spécifier la souche infectante afin de mieux déterminer le vaccin à mettre en oeuvre.
La présente invention a, en outre, pour objet un kit, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé de détection d'anticorps anti-VIF, caractérisé en ce qu'il comprend, outre des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection, des doses appropriées d'au moins un peptide et/ou un fragment peptidique conforme à l'invention.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : Peptides conformes à l'invention.
a) Construction d'une banque d'exoression des peptides conformes à l'invention
Le clonage du gène env du VIF WO dans un vecteur Bluescript KS+ fournissant la construction pKSe ou dans un vecteur Bluescripts SK+ fournissant la construction pKSel ont été décrits dans une Demande de Brevet déposée le même jour.
Le clonage du gène env du VIF WO dans un vecteur Bluescript KS+ fournissant la construction pKSe ou dans un vecteur Bluescripts SK+ fournissant la construction pKSel ont été décrits dans une Demande de Brevet déposée le même jour.
Des fragments chevauchants du plasmide pKSe sont générés par digestion à la DNase I en présence d'ions manganèse. Les fragments d'ADN obtenus, après un temps optimal d'incubation avec la DNase (temps donnant des fragments de longueur d'environ 200 pb) sont traités avec le fragment de Klenow de la DNa polymérase d'E. coli, de manière à obtenir des extrémités à bouts francs, pour une ligature efficace avec la séquence de liaison. Le marquage au phosphore 32 des fragments d'ADN permet le contrôle des étapes ultérieures.
Des séquences de liaison de 10 paires de base (pb), ayant un site EcoRI (Pharmacia), sont utilisées pour la ligature avec les fragments pKSe obtenus. Les produits de la ligature sont alors digérés avec l'enzyme de restriction EcoRI et séparés par électrophorèse dans des gels d'agarose LMP NUSieve 2 %, de manière à sélectionner un ensemble de fragments comprenant entre 100 et 200 pb et à éliminer les séquences de liaison libres.
Les fragments sélectionnés sont extraits au phénol à partir de l'agarose et ligaturés avec un vecteur kgtll digéré à l'enzyme de restriction EcoRI (Promega).
Les produits de la ligature sont encapsidés en utilisant un kit Packagene (Promega) et étalés sur une souche d'E. coli Y1090. Les phages recombinants sont sélectionnés par détection d'une couleur en présence de 25 Fl d'IPTG 1 M et de 25 Al de Xgal 80 mg/ml. L'étalement de la banque kgtll fournit 105 clones indépendants. L'ADN de phage, obtenu à partir des plaques non colorées, est analysé par PCR en utilisant des amorces kgtll 1218 et 1222, complémentaires du fragment ss-galactosidase de la matrice de kgtll : 8 des 10 clones contiennent des inserts de dimension moyenne d'environ 160 pb. La banque est alors amplifiée pour obtenir un titre de 3 x 109 par ml.
Une hybridation in situ de 37 phages avec des sondes d'ADN marquées au phosphore 32, représentant une amplification PCR des 3 régions E1, E2 et E3 du gène env WO (fragments 1-977 ; 978-2016 ; 2017-2562), indiquent que la banque est représentative du gène env entier.
b) Criblage de la banaue
- La banque env kgtll est criblée en utilisant des sérums de deux chats expérimentalement infectés avec l'isolat VIF WO. La banque est étalée à une concentration approximative de 3x104 pfu sur E. coli Y1090 et les plaques sont incubées à 42 C pendant 3 à 4 heures. Les plaques sont alors recouvertes de filtres de nitrocellulose saturés d'IPTG 10 mM et incubés pendant 3 heures à 37 C. Les filtres sont traités pour un criblage immunologique avec des sérums félins, dénommés CTF 1915 et CTF 1916, dilués au 300ème en utilisant des méthodes standards [procédure au lait dégraissé (MANIATIS)]. Des IgG de chèvre anti-chat (H+L) couplées à la peroxydase (KIL} et diluées au 1000ème, sont utilisées comme deuxième anticorps.Une réaction positive est révélée par du 4chloro-l-naphtol (Merck) (bruit de fond peu important).
- La banque env kgtll est criblée en utilisant des sérums de deux chats expérimentalement infectés avec l'isolat VIF WO. La banque est étalée à une concentration approximative de 3x104 pfu sur E. coli Y1090 et les plaques sont incubées à 42 C pendant 3 à 4 heures. Les plaques sont alors recouvertes de filtres de nitrocellulose saturés d'IPTG 10 mM et incubés pendant 3 heures à 37 C. Les filtres sont traités pour un criblage immunologique avec des sérums félins, dénommés CTF 1915 et CTF 1916, dilués au 300ème en utilisant des méthodes standards [procédure au lait dégraissé (MANIATIS)]. Des IgG de chèvre anti-chat (H+L) couplées à la peroxydase (KIL} et diluées au 1000ème, sont utilisées comme deuxième anticorps.Une réaction positive est révélée par du 4chloro-l-naphtol (Merck) (bruit de fond peu important).
Des fragments d'agar, contenant les particules de phages obtenues à partir de régions correspondant à des signaux positifs sur le filtre, sont prélevés et incubés avec un 1 ml de SM qui comprend
NaCl 2,9 g
MgSO4 2 g
Tris 1M pH 7,5 2,5 ml
Gélatine 2 % 2,5 ml
H2O 500 ml
Les phages sélectionnés sont réensemencés pour un deuxième criblage. Les plaques de phages positives sont prélevées et incubées avec 1 ml de SM. La réactivité des phages sélectionnés est finalement confirmée par une troisième procédure de criblage. Les lysats de phages X obtenus à partir de phages positifs sont préparés par une méthode d'étalement standard (protocole Promega) et stockés à 4 C en présence de chloroforme 0,3 %.L'analyse subséquente des inserts env est réalisée soit par séquen çage direct des amplifications PCR ou par hybridation in situ en utilisant des sondes marquées au phosphore 32, comme précisé à l'exemple 1.
NaCl 2,9 g
MgSO4 2 g
Tris 1M pH 7,5 2,5 ml
Gélatine 2 % 2,5 ml
H2O 500 ml
Les phages sélectionnés sont réensemencés pour un deuxième criblage. Les plaques de phages positives sont prélevées et incubées avec 1 ml de SM. La réactivité des phages sélectionnés est finalement confirmée par une troisième procédure de criblage. Les lysats de phages X obtenus à partir de phages positifs sont préparés par une méthode d'étalement standard (protocole Promega) et stockés à 4 C en présence de chloroforme 0,3 %.L'analyse subséquente des inserts env est réalisée soit par séquen çage direct des amplifications PCR ou par hybridation in situ en utilisant des sondes marquées au phosphore 32, comme précisé à l'exemple 1.
- Le criblage immunologique proprement dit de la banque est réalisé avec les deux sérums cités cidessus. 170 plaques positives sont détectées au premier criblage, 108 de ces plaques sont isolées après le troisième criblage ; 60 clones sur les 108 sont séquencés et les autres sont analysés par une hybridation in situ avec des sondes radioactives correspondant aux régions immunogéniques majeures déjà séquencées, comme spécifié cidessus.
Pour l'hybridation in situ, 1'ADN de bactériophage est transféré sur un filtre de nitrocellulose et hybridé avec des sondes marquées au phosphore 32 à 58 C, pendant une nuit, après le blocage des liaisons non spécifiques avec une solution de Denhardt. Comme sondes, on utilise des produits de l'amplification des clones de VIF 1, 2, 9, 35, 44, 90, 133, 147 et 170 marqués avec du dATP [32]p, en utilisant la méthode de translation de coupure.
En utilisant cette double stratégie, 85 inserts ont été sélectionnés comme correspondant à 6 régions immunologiques de l'enveloppe comme visible dans les Tableaux I et II ci-après, dans lesquels le Tableau I présente les séquences des peptides antigéniques exprimés par les clones de bactériophages recombinants et le
Tableau II précise la distribution des clones positifs, dans les régions immunogènes.
Tableau II précise la distribution des clones positifs, dans les régions immunogènes.
TABLEAU I
<tb> Protéine <SEP> Numéro <SEP> de <SEP> Réacti- <SEP> Séquence(a) <SEP> Séquence(b)
<tb> virale <SEP> clone <SEP> vité <SEP> nucléotidiqu <SEP> peptidique
<tb> gp100 <SEP> SU1 <SEP> 96 <SEP> + <SEP> (C) <SEP> 727-873 <SEP> 244-291
<tb> (père <SEP> 147 <SEP> ++ <SEP> 735-890 <SEP> 246-296
<tb> région)(d) <SEP> 14 <SEP> ++ <SEP> 747-872 <SEP> 250-290
<tb> <SEP> 97 <SEP> + <SEP> 750-870 <SEP> 251-289
<tb> <SEP> 54 <SEP> ++ <SEP> 755-872 <SEP> 253-290
<tb> gp120 <SEP> SU2 <SEP> 93 <SEP> ++ <SEP> 1093-1274 <SEP> 365-424
<tb> (2ème <SEP> 69 <SEP> ++ <SEP> 1113-1274 <SEP> 372-424
<tb> région) <SEP> FIV1 <SEP> ++ <SEP> 1122-1274 <SEP> 375-424
<tb> <SEP> 12 <SEP> ++ <SEP> 1142-1273 <SEP> 382-424
<tb> <SEP> 133 <SEP> ++ <SEP> 1160-1274 <SEP> 387-424
<tb> <SEP> 75 <SEP> ++ <SEP> 1163-1274 <SEP> 388-424
<tb> gp120 <SEP> SU3 <SEP> 73 <SEP> ++ <SEP> 1377-1536 <SEP> 460-512
<tb> (3ème <SEP> 148 <SEP> + <SEP> 1386-1506 <SEP> 463-502
<tb> région) <SEP> 154 <SEP> ++ <SEP> 1387-1538 <SEP> 463-512
<tb> <SEP> 170 <SEP> +/++ <SEP> 1398-1478 <SEP> 467-492
<tb> <SEP> 48 <SEP> + <SEP> 1452-1585 <SEP> 485-528
<tb> <SEP> SU4 <SEP> 131 <SEP> + <SEP> 1452-1599 <SEP> 485-533
<tb> <SEP> 136 <SEP> + <SEP> 1458-1598 <SEP> 487-532
<tb> <SEP> 64 <SEP> + <SEP> 1460-1597 <SEP> 488-532
<tb> <SEP> 44 <SEP> +/++ <SEP> 1492-1597 <SEP> 498-532
<tb> <SEP> 100 <SEP> +/- <SEP> 1502-1637 <SEP> 502-545
<tb> <SEP> 158 <SEP> + <SEP> 1506-1637 <SEP> 503-545
<tb> <SEP> 130 <SEP> + <SEP> 1521-1701 <SEP> 508-567
<tb> gp120 <SEP> SU5 <SEP> 23 <SEP> + <SEP> 1654-1820 <SEP> 552-606
<tb> (4ème <SEP> 103 <SEP> + <SEP> 1657-1820 <SEP> 553-606
<tb> région) <SEP> 35 <SEP> ++ <SEP> 1683-1823 <SEP> 562-607
<tb> <SEP> 91 <SEP> ++ <SEP> 1700-1822 <SEP> 568-607
<tb> <SEP> 51 <SEP> ++ <SEP> 1714-1822 <SEP> 572-607
<tb> gp120 <SEP> SU/ <SEP> 42 <SEP> ++ <SEP> 1719-1872 <SEP> 574-623
<tb> 41 <SEP> TM1 <SEP> 124 <SEP> + <SEP> 1782-1944 <SEP> 595-647
<tb> (4ème <SEP> 20 <SEP> +/- <SEP> 1789-1939 <SEP> 597-646
<tb> région)
<tb>
<tb> virale <SEP> clone <SEP> vité <SEP> nucléotidiqu <SEP> peptidique
<tb> gp100 <SEP> SU1 <SEP> 96 <SEP> + <SEP> (C) <SEP> 727-873 <SEP> 244-291
<tb> (père <SEP> 147 <SEP> ++ <SEP> 735-890 <SEP> 246-296
<tb> région)(d) <SEP> 14 <SEP> ++ <SEP> 747-872 <SEP> 250-290
<tb> <SEP> 97 <SEP> + <SEP> 750-870 <SEP> 251-289
<tb> <SEP> 54 <SEP> ++ <SEP> 755-872 <SEP> 253-290
<tb> gp120 <SEP> SU2 <SEP> 93 <SEP> ++ <SEP> 1093-1274 <SEP> 365-424
<tb> (2ème <SEP> 69 <SEP> ++ <SEP> 1113-1274 <SEP> 372-424
<tb> région) <SEP> FIV1 <SEP> ++ <SEP> 1122-1274 <SEP> 375-424
<tb> <SEP> 12 <SEP> ++ <SEP> 1142-1273 <SEP> 382-424
<tb> <SEP> 133 <SEP> ++ <SEP> 1160-1274 <SEP> 387-424
<tb> <SEP> 75 <SEP> ++ <SEP> 1163-1274 <SEP> 388-424
<tb> gp120 <SEP> SU3 <SEP> 73 <SEP> ++ <SEP> 1377-1536 <SEP> 460-512
<tb> (3ème <SEP> 148 <SEP> + <SEP> 1386-1506 <SEP> 463-502
<tb> région) <SEP> 154 <SEP> ++ <SEP> 1387-1538 <SEP> 463-512
<tb> <SEP> 170 <SEP> +/++ <SEP> 1398-1478 <SEP> 467-492
<tb> <SEP> 48 <SEP> + <SEP> 1452-1585 <SEP> 485-528
<tb> <SEP> SU4 <SEP> 131 <SEP> + <SEP> 1452-1599 <SEP> 485-533
<tb> <SEP> 136 <SEP> + <SEP> 1458-1598 <SEP> 487-532
<tb> <SEP> 64 <SEP> + <SEP> 1460-1597 <SEP> 488-532
<tb> <SEP> 44 <SEP> +/++ <SEP> 1492-1597 <SEP> 498-532
<tb> <SEP> 100 <SEP> +/- <SEP> 1502-1637 <SEP> 502-545
<tb> <SEP> 158 <SEP> + <SEP> 1506-1637 <SEP> 503-545
<tb> <SEP> 130 <SEP> + <SEP> 1521-1701 <SEP> 508-567
<tb> gp120 <SEP> SU5 <SEP> 23 <SEP> + <SEP> 1654-1820 <SEP> 552-606
<tb> (4ème <SEP> 103 <SEP> + <SEP> 1657-1820 <SEP> 553-606
<tb> région) <SEP> 35 <SEP> ++ <SEP> 1683-1823 <SEP> 562-607
<tb> <SEP> 91 <SEP> ++ <SEP> 1700-1822 <SEP> 568-607
<tb> <SEP> 51 <SEP> ++ <SEP> 1714-1822 <SEP> 572-607
<tb> gp120 <SEP> SU/ <SEP> 42 <SEP> ++ <SEP> 1719-1872 <SEP> 574-623
<tb> 41 <SEP> TM1 <SEP> 124 <SEP> + <SEP> 1782-1944 <SEP> 595-647
<tb> (4ème <SEP> 20 <SEP> +/- <SEP> 1789-1939 <SEP> 597-646
<tb> région)
<tb>
<tb> Protéine <SEP> Numéro <SEP> d <SEP> Réacti- <SEP> Séquence(a) <SEP> Séquence(b)
<tb> virale <SEP> clone <SEP> vité <SEP> nucléotidiqu <SEP> peptidique
<tb> gp41 <SEP> TM2 <SEP> 88 <SEP> + <SEP> 1961-2134 <SEP> 654-711
<tb> (5ème <SEP> 53 <SEP> + <SEP> 1299-2153 <SEP> 667-717
<tb> région) <SEP> 163 <SEP> + <SEP> 2002-2215 <SEP> 668-738
<tb> <SEP> 84 <SEP> + <SEP> 2011-2176 <SEP> 671-725
<tb> <SEP> 157 <SEP> ++ <SEP> 2019-2176 <SEP> 674-725
<tb> <SEP> FIV2 <SEP> ++ <SEP> 2019-2179 <SEP> 674-726
<tb> <SEP> 87 <SEP> + <SEP> 2020-2167 <SEP> 674-722
<tb> <SEP> 160 <SEP> + <SEP> 2020-2140 <SEP> 674-713
<tb> <SEP> 108 <SEP> ++ <SEP> 2039-2209 <SEP> 681-736
<tb> <SEP> 63 <SEP> ++ <SEP> 2092-2285 <SEP> 698-761
<tb> <SEP> 11 <SEP> ++ <SEP> 2097-2282 <SEP> 700-760
<tb> <SEP> 68 <SEP> ++ <SEP> 2118-2272 <SEP> 707-757
<tb> <SEP> 33 <SEP> ++ <SEP> 2175-2365 <SEP> 726-788
<tb> <SEP> 9 <SEP> ++ <SEP> 2226-2366 <SEP> 743-788
<tb> <SEP> TM3 <SEP> 158 <SEP> ++ <SEP> 2230-2369 <SEP> 744-789
<tb> gp41 <SEP> TM4 <SEP> 27 <SEP> ++ <SEP> 2427-2562 <SEP> 810-854
<tb> (6ème <SEP> 90 <SEP> + <SEP> 2475-2562 <SEP> 826-854
<tb> région)
<tb> (a) séquences inserts déterminées à partir des clones d'ADN. La numération des nucléotides commence à partir du codon d'initiation ATG.
<tb> virale <SEP> clone <SEP> vité <SEP> nucléotidiqu <SEP> peptidique
<tb> gp41 <SEP> TM2 <SEP> 88 <SEP> + <SEP> 1961-2134 <SEP> 654-711
<tb> (5ème <SEP> 53 <SEP> + <SEP> 1299-2153 <SEP> 667-717
<tb> région) <SEP> 163 <SEP> + <SEP> 2002-2215 <SEP> 668-738
<tb> <SEP> 84 <SEP> + <SEP> 2011-2176 <SEP> 671-725
<tb> <SEP> 157 <SEP> ++ <SEP> 2019-2176 <SEP> 674-725
<tb> <SEP> FIV2 <SEP> ++ <SEP> 2019-2179 <SEP> 674-726
<tb> <SEP> 87 <SEP> + <SEP> 2020-2167 <SEP> 674-722
<tb> <SEP> 160 <SEP> + <SEP> 2020-2140 <SEP> 674-713
<tb> <SEP> 108 <SEP> ++ <SEP> 2039-2209 <SEP> 681-736
<tb> <SEP> 63 <SEP> ++ <SEP> 2092-2285 <SEP> 698-761
<tb> <SEP> 11 <SEP> ++ <SEP> 2097-2282 <SEP> 700-760
<tb> <SEP> 68 <SEP> ++ <SEP> 2118-2272 <SEP> 707-757
<tb> <SEP> 33 <SEP> ++ <SEP> 2175-2365 <SEP> 726-788
<tb> <SEP> 9 <SEP> ++ <SEP> 2226-2366 <SEP> 743-788
<tb> <SEP> TM3 <SEP> 158 <SEP> ++ <SEP> 2230-2369 <SEP> 744-789
<tb> gp41 <SEP> TM4 <SEP> 27 <SEP> ++ <SEP> 2427-2562 <SEP> 810-854
<tb> (6ème <SEP> 90 <SEP> + <SEP> 2475-2562 <SEP> 826-854
<tb> région)
<tb> (a) séquences inserts déterminées à partir des clones d'ADN. La numération des nucléotides commence à partir du codon d'initiation ATG.
(b) les positions des aminoacides sont numérotées à partir de la méthionine N-terminale.
(c) l'intensité des réactions immunologiques est évaluée de faible (+/-) à forte (++).
(d) les régions immunogènes de l'enveloppe déterminées à l'aide des séquences chevauchantes des clones réactifs.
I1 faut noter que la protéine SU (glycoprotéine d'enveloppe externe de surface) présente un poids moléculaire de 100 à 120 et que la protéine TM (glycoprotéine virale d'enveloppe transmembranaire) présente un poids moléculaire compris entre 35 et 45.
Le Tableau I et la figure 1 précisent les séquences nucléotidiques des différents inserts ainsi que les séquences peptidiques correspondantes.
Les séquences chevauchantes mettent en valeur la présence de 8 domaines immunogènes (épitopes), dont 5 sont situées dans la glycoprotéine extramembranaire (gp)
SU (SU1, aminoacides 253-289 ; SU2, aminoacides 388-424 ;
SU3, aminoacides 467-492 ; SU4, aminoacides 508-528 et
SU5, aminoacides 572-606) et 3 dans la gp transmembranaire TM (TM2, aminoacides 681-711 ; TM3, aminoacides 744-788 et TM4, aminoacides 826-854) (figure 1).La séquence peptidique 597-646, qui est définie par les clones 20 et 124, chevauche le 5ème épitope SU (574-606) et représente, sans doute, un épitope TM NH2-terminal (TM1). Cette hypothèse est confirmée par le criblage immunologique avec les sérums de chats, qui montre les différentes réactivités entre le clone 51 (épitope SU5) et le clone 124 (épitope TM1).
SU (SU1, aminoacides 253-289 ; SU2, aminoacides 388-424 ;
SU3, aminoacides 467-492 ; SU4, aminoacides 508-528 et
SU5, aminoacides 572-606) et 3 dans la gp transmembranaire TM (TM2, aminoacides 681-711 ; TM3, aminoacides 744-788 et TM4, aminoacides 826-854) (figure 1).La séquence peptidique 597-646, qui est définie par les clones 20 et 124, chevauche le 5ème épitope SU (574-606) et représente, sans doute, un épitope TM NH2-terminal (TM1). Cette hypothèse est confirmée par le criblage immunologique avec les sérums de chats, qui montre les différentes réactivités entre le clone 51 (épitope SU5) et le clone 124 (épitope TM1).
Cette figure 1 illustre la localisation des régions épitopiques des glycoprotéines (gp) d'enveloppe du VIF, avec SU:gp100 ; TM:gp40. Dans cette figure, les sites de clivages sont représentés par des flèches verticales ; les clones principaux sont représentés par des lignes épaisses et les différents rectangles indiquent les épi topes correspondants aux séquences chevauchantes minimales (rectangle de couleur sombreoépitopes avec réactivité plus importante).
Le Tableau II, ci-après, illustre le nombre de clones présentant les régions immunogéniques telles que précisées au Tableau I ci-dessus.
TABLEAU II
<tb> Régions <SEP> immunogéniques <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> clones
<tb> <SEP> 1ère <SEP> 7
<tb> <SEP> 2ème <SEP> 11
<tb> <SEP> 3ème <SEP> 22
<tb> <SEP> 4ème <SEP> 10
<tb> <SEP> 5ème <SEP> 31
<tb> <SEP> 6ème <SEP> 4 <SEP>
<tb>
Les phages présentant la même séquence sont comptés une fois et les phages contenant un ou plusieurs inserts ou qui hybrident avec plus d'une sonde sont éliminés.
<tb> <SEP> 1ère <SEP> 7
<tb> <SEP> 2ème <SEP> 11
<tb> <SEP> 3ème <SEP> 22
<tb> <SEP> 4ème <SEP> 10
<tb> <SEP> 5ème <SEP> 31
<tb> <SEP> 6ème <SEP> 4 <SEP>
<tb>
Les phages présentant la même séquence sont comptés une fois et les phages contenant un ou plusieurs inserts ou qui hybrident avec plus d'une sonde sont éliminés.
- Le criblage sérologique des épitopes identifiés est réalisé à partir de sérums de 24 chats infectés expérimentalement avec différents isolats de VIF et à partir de 24 chats naturellement infectés (2 de ceux-ci étant également co-infectés par le virus de la leucémie féline) (Tableau III). Tous les sérums ont été considérés comme réactifs avec les protéines structurales virales lorsqu'ils sont testés en Western blot. 8 sérums de chats
SPF sont utilisés comme contrôle.Les clones de bactériophages 54, 133, 154, 44, 51, 124, 157, 9 et 27, du
Tableau I, contenant les inserts correspondant aux domaines épitopiques identifiés, ont été également criblés en utilisant un essai dot-phage, (figures 2A et 2B) comme suit
Approximativement 100 pfu de chaque phage dans 1 A1 de SM sont étalés sur une couche de E. coli Y1090 et mis en culture jusqu'à ce que des plaques apparaissent.
SPF sont utilisés comme contrôle.Les clones de bactériophages 54, 133, 154, 44, 51, 124, 157, 9 et 27, du
Tableau I, contenant les inserts correspondant aux domaines épitopiques identifiés, ont été également criblés en utilisant un essai dot-phage, (figures 2A et 2B) comme suit
Approximativement 100 pfu de chaque phage dans 1 A1 de SM sont étalés sur une couche de E. coli Y1090 et mis en culture jusqu'à ce que des plaques apparaissent.
Pour le criblage immunologique, un filtre de nitrocellulose imprégné d'IPTG est placé sur la couche et on réalise les étapes comme décrit précédemment pour le criblage de la banque.
Les résultats sont illustrés sur le Tableau
III ci-après et sur les figures 2.
III ci-après et sur les figures 2.
A la figure 2A, chaque filtre de nitrocellulose correspond à un test sérique.
Les tests sont réalisés comme précisés cidessus et la révélation de la réaction se fait avec du 4chloro-l-naphtol jusqu'à ce que le bruit de fond des échantillons contrôle devienne visible (filtre X : phage non recombinant utilisé comme contrôle négatif).
Les numéros de clones sont indiqués en haut de la figure (54, 51, 44, 27, 9 et h, 157, 154, 133, 124).
Deux tests sont plus particulièrement représentés à cette figure (1-5 et 6-10), NC1 et NC2 étant des contrôles négatifs (chats SPF) ; 1, 7 et 10 : chats inoculés par du VIF Villefranche ; 2 et 3 : chats infectés naturellement ; 4 et 9 : chats inoculés avec du VIF
ENVNIP ; 5 : chats inoculés par du VIF Petaluma ; 6 chats inoculés par un VIF ME ; 8 : chat inoculé par un
VIF WO.
ENVNIP ; 5 : chats inoculés par du VIF Petaluma ; 6 chats inoculés par un VIF ME ; 8 : chat inoculé par un
VIF WO.
TABLEAU III
<SEP> n <SEP> EPITOPE
<tb> Origine <SEP> du <SEP> SU1 <SEP> SU2 <SEP> SU3 <SEP> SU4 <SEP> SU5 <SEP> TM1 <SEP> TM2 <SEP> TM3 <SEP> TM4
<tb> sérum <SEP> (C.54)+ <SEP> (C.133) <SEP> (C.154) <SEP> (C44) <SEP> (C.51) <SEP> (C.124) <SEP> (C.157) <SEP> (C.9) <SEP> (C.27)
<tb> WO <SEP> IV <SEP> 4 <SEP> 3++ <SEP> 4 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 3
<tb> ME <SEP> IV <SEP> 6 <SEP> 2 <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 5 <SEP> 4 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 4
<tb> PET <SEP> IV <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 0
<tb> <SEP> IC <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 0
<tb> VILLEFR <SEP> IV <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 0
<tb> <SEP> IC <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 0
<tb> ENVNIP <SEP> IV <SEP> 3 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 0
<tb> Exp.Inf.Tot. <SEP> 24 <SEP> 7 <SEP> 24 <SEP> 3 <SEP> 6 <SEP> 10 <SEP> 7 <SEP> 24 <SEP> 24 <SEP> 7
<tb> NAT.INF.1st <SEP> 10 <SEP> 2 <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 10 <SEP> 8 <SEP> 1
<tb> NAT.INF.2nd <SEP> 12 <SEP> 5 <SEP> 12 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> 12 <SEP> 9 <SEP> 2
<tb> <SEP> FIV+FELV <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> Nat.Inf.Tot.<SEP> 24 <SEP> 7 <SEP> 23 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 9 <SEP> 6 <SEP> 24 <SEP> 18 <SEP> 3
<tb> <SEP> Total <SEP> 43 <SEP> 14 <SEP> 47 <SEP> 3 <SEP> 9 <SEP> 19 <SEP> 13 <SEP> 48 <SEP> 42 <SEP> 10
<tb> Sérum <SEP> normal <SEP> 8 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
Le Tableau III, dans lequel PET = Petaluma Villefr = Villefranche ; NAT. INF. îst = chats naturellement infectés provenant de l'école vétérinaire de
Nantes ; NAT.INF. 2nd = chats naturellement infectés provenant de l'école vétérinaire de Maisons-Alfort ; IV = inoculation intraveineuse ; IC = inoculation intracérébrale, montre la réactivité des régions épitopiques avec des sérums de chats SPF et infectés : le clone 133 (épitope SU2) est réactif avec tous les sérums de chats infectés expérimentalement et avec 23/24 sérums de chats naturellement infectés. Le clone 157 (épitope TM2) est reconnu par la totalité des sérums de chats infectés.
<tb> Origine <SEP> du <SEP> SU1 <SEP> SU2 <SEP> SU3 <SEP> SU4 <SEP> SU5 <SEP> TM1 <SEP> TM2 <SEP> TM3 <SEP> TM4
<tb> sérum <SEP> (C.54)+ <SEP> (C.133) <SEP> (C.154) <SEP> (C44) <SEP> (C.51) <SEP> (C.124) <SEP> (C.157) <SEP> (C.9) <SEP> (C.27)
<tb> WO <SEP> IV <SEP> 4 <SEP> 3++ <SEP> 4 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 3
<tb> ME <SEP> IV <SEP> 6 <SEP> 2 <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 5 <SEP> 4 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 4
<tb> PET <SEP> IV <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 0
<tb> <SEP> IC <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 0
<tb> VILLEFR <SEP> IV <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 0
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<tb> NAT.INF.1st <SEP> 10 <SEP> 2 <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 10 <SEP> 8 <SEP> 1
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<tb> Nat.Inf.Tot.<SEP> 24 <SEP> 7 <SEP> 23 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 9 <SEP> 6 <SEP> 24 <SEP> 18 <SEP> 3
<tb> <SEP> Total <SEP> 43 <SEP> 14 <SEP> 47 <SEP> 3 <SEP> 9 <SEP> 19 <SEP> 13 <SEP> 48 <SEP> 42 <SEP> 10
<tb> Sérum <SEP> normal <SEP> 8 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
Le Tableau III, dans lequel PET = Petaluma Villefr = Villefranche ; NAT. INF. îst = chats naturellement infectés provenant de l'école vétérinaire de
Nantes ; NAT.INF. 2nd = chats naturellement infectés provenant de l'école vétérinaire de Maisons-Alfort ; IV = inoculation intraveineuse ; IC = inoculation intracérébrale, montre la réactivité des régions épitopiques avec des sérums de chats SPF et infectés : le clone 133 (épitope SU2) est réactif avec tous les sérums de chats infectés expérimentalement et avec 23/24 sérums de chats naturellement infectés. Le clone 157 (épitope TM2) est reconnu par la totalité des sérums de chats infectés.
Pour ces deux clones, l'intensité de réaction est très importante. Le clone 9 (épitope TM3) est réactif avec 100 % des sérums de chats infectés expérimentalement et avec 75 % des sérums de chats infectés naturellement ; le clone 27 (TM4) réagit avec 29 % des sérums de chats infectés expérimentalement (1 WO et 4 ME) mais seulement avec 12,5 % de chats infectés naturellement. Le clone 44 (SU4) réagit avec 25 % des sérums de chats infectés expérimentalement et avec 12,5 % des chats infectés naturellement.
Les autres épitopes montrent une réactivité variable sans différence significative entre les infections naturelles et expérimentales : 29 % SU1, 39,5 % SU5 et 27 % TM1. SU3, qui est détecté par les deux sérums de chats infectés WO utilisés pour le criblage de la banque, réagit seulement avec un seul des deux autres sérums testés (des chats infectés par WO) et ne réagit du tout avec les sérums d'autre origine. Aucune réactivité n'est détectée avec les sérums normaux.
- La réactivité en dot-phage des sérums de chats infectés avec les peptides exprimés par les clones sus-dits est confirmée par le Western blot (figure 2B) réalisé avec des lysats d'E. coli, contenant les antigènes recombinants exprimés par les phages lysogènes. La figure 2B illustre cette réactivité. Les sérums utilisés sont les mêmes que ceux de la figure 2A n 6 et n 8. Les numéros de clones sont indiqués en haut de la figure.
De manière plus précise, les clones recombinant kgtll 54, 133, 73, 154, 44, 51, 124, 157, 9 et 27 sont exprimés en tant que lysogènes dans E. coli Y1089, comme décrit par HUYNH et al. (1985). Du lysat brut, contenant les protéines de fusion, est préparé à partir de culture lysogénique induite par IPTG en faisant des cycles congélation-décongélation et sonication du culot cellulaire, remis en suspension dans 200 A1 d'un tampon
TEP (Tris-HCl 100 mM, pH 7,4, EDTA 10 mM, PMSF 1 mM).
TEP (Tris-HCl 100 mM, pH 7,4, EDTA 10 mM, PMSF 1 mM).
Les extraits sont portés à ébullition dans un tampon Laemmli et remis en suspension dans des gels de
SDS polyacrylamide 5-10 % (40 Rg/puits) en utilisant un appareil Mini PII (BIO-RAD). Après le transfert des protéines sur un filtre de nitrocellulose et le blocage des sites non spécifiques par incubation avec du lait délipidé à 3 % dans du Tris 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 0,1 % (tampon TNT), des bandes de nitrocellulose sont incubées avec le sérum de chats (dilué au 300ème) pendant 2 heures à 37 C. Les anticorps liants sont révélés par incubation avec des IgG de chèvre couplés à de la peroxydase anti-chat (dilution au 1 000ème) suivie par une révélation avec du 4 -chloro-l -naphtol (Merck).Les contrôles sont constitués par un lysat de E. coli Y1089 infecté par du kgtll et par un pool de sérums normaux.
SDS polyacrylamide 5-10 % (40 Rg/puits) en utilisant un appareil Mini PII (BIO-RAD). Après le transfert des protéines sur un filtre de nitrocellulose et le blocage des sites non spécifiques par incubation avec du lait délipidé à 3 % dans du Tris 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 0,1 % (tampon TNT), des bandes de nitrocellulose sont incubées avec le sérum de chats (dilué au 300ème) pendant 2 heures à 37 C. Les anticorps liants sont révélés par incubation avec des IgG de chèvre couplés à de la peroxydase anti-chat (dilution au 1 000ème) suivie par une révélation avec du 4 -chloro-l -naphtol (Merck).Les contrôles sont constitués par un lysat de E. coli Y1089 infecté par du kgtll et par un pool de sérums normaux.
c) Analvse comtarative des séouences
L'analyse des séquences est réalisée sur ordinateur avec le programme "Salsa".
L'analyse des séquences est réalisée sur ordinateur avec le programme "Salsa".
Les multiples alignements comparant la séquence du gag VIF WO avec d'autres séquences de VIF et notamment VIF34TF10 (USA) (TALBOTT et al., 1989), VIF 14 (USA) (OLMSTED et al., 1989), VIF PPR (USA) (PHILLIPS et al., 1990), VIF TM2/GVEPX (JAPON) (KIYOMASU et al., 1991 ; MIYAZAWA et al.), VIF Z1 et VIF Z2 (SUISSE) (MORIKAWA et al., 1991), et FIV 19K1 et FIV 19K2 (SIEBELINK et al., 1992) obtenus à partir de la banque de gènes "GenBank", sont illustrés à la figure 3a et à la figure 3b, dans lesquelles il apparaît que les variations sont, pour la plupart, situées dans la séquence protéique env et sont - séquence FIV WO/séquence FIVZ2 : 8,9 % - séquence FIV WO/séquence isolat Petaluma : 10,2-10,9 % - séquence FIV WO/séquence FIV 19 : 10,8 % - séquence FIV WO/séquence FIVZ1 : 11 % - séquence FIV WO/séquence FIVPPR : 13,6 % - séquence FIV WO/séquence FIVGVEPX : 19 %.
Dans la glycoprotéine SU de env, l'hypervaria- bilité concerne successivement les segments 361-377, qui s'étend de part et d'autre d'une cystéine conservée en position 367, 4 fragments courts 452-455, 466-471, 479485 et 494-496, le dipeptide 541-542 et le segment 553570, qui comprend une cystéine conservée en position 566.
Deux zones hypervariables ont également été localisées dans la protéine TM : résidus 710-718 et 832-842. Des régions variables se trouvent dans le domaine N-terminal rev-like, dans la portion C-terminale de la SU et dans la portion C-terminale du domaine transmembranaire hydrophobe de la TM (entre les positions 220 et 286) et présentent une variabilité en dessous du seuil de 10 %.
De manière plus précise, de tels peptides comprennent avantageusement, 9 régions variables (régions hypervarialbes+régions variables adjacentes): V1 (résidus 26-72), V2 (résidus 96-174, 23 % de divergence), V3 (résidus 361-422, comprenant la région hypervariable 361391 et la région variable 392-422, 12 % de divergence),
V4 (résidus 452-497, 13 % de divergence), V5 (résidus 541-570, 30 % de divergence), V6 (résidus 586-612, 10 % de divergence), V7 (résidus 710-718, 26 % de divergence),
V8 (résidus 765-778, 12 % de divergence) et V9 (résidus 832-842, 21 % de divergence), comme le montre la figure 4 qui illustre les domaines variables et les domaines conservés : les domaines conservés sont représentés en blanc, les régions variables en gris, et les régions hypervariables en noir.
V4 (résidus 452-497, 13 % de divergence), V5 (résidus 541-570, 30 % de divergence), V6 (résidus 586-612, 10 % de divergence), V7 (résidus 710-718, 26 % de divergence),
V8 (résidus 765-778, 12 % de divergence) et V9 (résidus 832-842, 21 % de divergence), comme le montre la figure 4 qui illustre les domaines variables et les domaines conservés : les domaines conservés sont représentés en blanc, les régions variables en gris, et les régions hypervariables en noir.
EXEMPLE 2 : Test de dépistage d'une infection à VIF.
Des peptides correspondants aux épitopes immunodominants (SU2, TM2 et TM3) sont absorbés dans les puits d'une plaque ELISA.
Le sérum à tester est incubé à une dilution optimale (prédéterminée lors de la mise au point de 1'ELISA, en utilisant une série de sérums de chats infectés et de chats SPF). La présence d'anticorps anti-VIF est révélée par des anticorps anti-Ig de chat couplés à de la peroxydase de raifort, en présence d'un substrat chromogène.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention.
Claims (4)
1') Peptide et/ou un fragment de peptide, caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence nucléotidique ou une combinaison de plusieurs segments nucléotidiques choisie dans le groupe qui comprend les séquences env et les séquences gag issues de n'importe quelle souche de VIF, en ce qu'il est reconnu par les anticorps dirigés contre au moins une souche différente de celle dont provient ledit peptide et/ou par les anticorps produits par des chats infectés naturellement et en ce qu'il présente une capacité d'induction d'une réponse immune cellulaire et/ou de production d'anticorps protecteurs vis-à-vis d'au moins une souche de VIF, chez des chats non infectés.
2 ) Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites séquences nucléotidiques sont issues de la souche WO du VIF.
3 ) Peptide selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend 854 aminoacides, présente un poids moléculaire apparent d'environ 90 kDa et correspond à la protéine env du VIF WO.
5 ) Peptide selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend 450 aminoacides et présente un poids moléculaire apparent d'environ 50 kDa et correspond à la protéine gag du VIF WO.
(I)
Met-Ser-Glu-Lys-Glu-Glu-Glu854
Pro835-Gln-Met-Glu-Leu-Arg-Arg-Asn-Gly-Arg-Gln-Cys -Gly
Val-Ile-Ala-Met-Pro-Glu-Val-Glu-Glu-Glu-Glu-Ile-Gln
Cys * -Ile-Arg-Asn-Cys * -Ile-His -Lys -Ile-Leu-Gly-Tyr-Thr-
Met-Leu-Leu-Leu-Ile-Leu-Cys*-Leu-Pro-Thr-Leu-Val-Asp
Leu-Lys-Gly-Leu-Leu-Gly-Gly-Ile-Leu-Gly-Ile-Gly-Leu-Gly-
Glu-Asp-Trp-Val-Gly-Trp-Ile775-Gly-Asn-Ile-Pro-Gln-Tyr
Asn-Val-Gln-Gly-Lys-Lys-Gly-Leu-Gln-Gln-Leu-Gln-Glu-Trp-
Gln-Gln-Arg-Phe-Tyr-Glu-Ile-Ile-Met-Asp-Ile-Glu-Gln-Asn-
Asn-Ile-Thr-Leu-Gly-Glu-Trp-Tyr-Asn-Gln-Thr-Lys-Asp-Leu-
Tyr-Asn715-Met-Thr-Ile-Asn-Gln-Thr-Ile-Trp-Asn-His-Gly-
Asn-Gln-Phe-Phe-Cys*-fiys-Val-Pro-Ser-Ala-fiys-Trp-Glu-Arg-
Leu-Tyr-Thr-Ala-Phe-Ala-Met-Gln-Glu-Leu-Gly-Cys -Asn-Gln
Val-Leu-Val-Ile-Gly-Leu-Lys-Val-Glu-Ala-Met-Glu-Lys-Phe-
Ala-Thr-His-Gln-Glu-Ala-Ile-Glu-Lys-Val-Thr655-Glu-Ala Leu-Lys-Ile-Asn-Asn-Leu-Arg-Leu-Val-Thr-Leu-Glu-His-Gln-
Ala-Thr-Ala-Ile-Gly-Met-Val-Thr-Gln-Tyr-Gln-Gln-Val-Leu-
Ala-Leu-Ala-Thr-Val-Leu-Ser-Met-Ala-Gly-Ala-Gly-Thr-Gly
Tyr-Lys-Pro-Arg-Arg-Lys-Arg-Ala-Ala-Ile-His-Val-Met-Leu
Gln-Pro-Asp-Tyr-Leu-Val595-Val-Pro-Gly-Glu-Val-Met-Glu
Ala-Gly-Leu-Arg-Gln-Ser-Leu-Glu-Lys-Tyr-Gln-Val-Val-Lys-
Pro-Arg-Asn-Gln-Gly-Ile-Leu-Arg-Asn-Trp-Tyr-Asn-Pro-Val
Thr-Asn-Ser-Thr-Asn-Ser-Gly-Thr-Gly-Ile-Arg-Met-Ala-Cys*
Asp-Leu-Pro537-Pro-Thr-Trp-Gly-Tyr-Met-Asn-Cys -Asn-Cys -
Val-Glu-Met-Tyr-Asn-Ile-Ala-Gly-Asn-Trp-Ser-Cys*-Lys-Ser
Lys-Val-Asp-Asp-Leu-Ile-Met-His-Phe-Asn-Lys-Thr-Lys-Ala-
Asn-Arg-Met-Tyr-Asn-Cys -Ser-Leu-Gln-Asn-Gly-Phe-Thr-Met
Asp-Asn-Thr-Ser-Leu-Ile-Asp-Thr-Cys -Gly-Glu-Thr477-Gln Asn-Val-Ser-Arg-Ala-Asn-Pro-Val-Asp-Cys* -Thr-Met-Tyr-Ala
Thr-Glu-Ala-Arg-Phe-Arg-Ile-Arg-Cys*-Arg-Trp-Asn-Val-Gly-
Trp-Ile-Glu-Phe-Gly-Cys*-Hiy-Arg-Thr-Lys-Ser-Lys-Tyr-His
Ala-Met-Arg-Ser-Ser-Gly-Asp-Tyr-Gly-Glu-Val-Thr-Gly-Ala-
Val-Ser-fieu-Gln-Cys*-Asn-Ser417-Thr-fiys-Asn-fieu-Thr-Phe-
Arg-Trp-Glu-Trp-Arg-Pro-Asp-Phe-Glu-Ser-Glu-fiys -Val -fiys -
Gly-Ser-Trp-Ile-Arg-Ala-Ile-Ser-Ser-Trp-fiys-Gln-Arg-Asn-
Asn-Gln357-Asn-Ala-Tyr-Tyr-Asn-Ser-Cys -Arg-Trp-Glu-His Thr-Asp-Val-Gln-Phe-Gln-Cys* -Gln-Arg-Thr-Gln-Ser-Gln-Pro
Thr-Ser-Gln-Ile-Gln-Asp-Pro-Glu-Ile-Pro-Lys-Cys*-Gly-Gly
Leu-Ile-Asn-Tyr-Phe-Gly-Pro-Asn-Gln-Thr-Cys -Met-Trp-Asn
Thr-Lys-Gln-Leu-Ser-Tyr-Cys*-Thr-Asp-Pro-Leu-Gln-Ile-Pro
Ser-Leu-Cys -Leu-Thr-Gly-Gly-Lys-Met-Leu-Tyr-Asn-Lys-Glu-
Asp-Arg-Val-Asp-Thr-Trp-Leu-Gln-Gly-Lys-Val-Asn-Ile297-
Tyr-Asn-Ile-Ser-Val-Ile-Val-Pro-Asp-Tyrl-Gln-Cys*-Tyr-Leu
Thr-Ile-Thr-Gly-Pro-Leu-Gly-Cys * -Ala-Asn-Asn-Thr-Cys*
Arg-Gln-Cys * -Arg-Arg-Gly-Arg-Ile-Trp-Arg-Arg-Trp-Asn-Glu
Ala-Arg-Glu-Ile-Trp-Gly-Thr237-Leu-Phe-Lys-Lys-Ala-Thr
Thr-Asn-Ile-Ser-Ile-Gln-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Gly-Asn-Trp-
Cys f-Gn-Asp-Phe-Leu-G1y-Ala-Met -Ile-His -Leu-Lys -Ala-Ser-
Ile-Ile-Phe-Trp-Asp-Cys -Trp-Ala-Pro-Glu-Glu-Pro-Ala
Gly-Ile-Ile-Ile-Hisl68-Thr-Cys-Lys-Ala-Gln-Val-Val-Trp Argl77-Leu-Pro-Pro-Leu-Val-Val-Pro-Val-Glu-Glu-Ser-Glu-
Cys * -Leu-Ile-Gly-Thr-Ala-Val -Leu-Tyr-Leu-Leu-Leu-Ser-Leu-
Arg-Glu-Lys-Gly-Ile-Thr-Asp-Asn-Ile-Lys-Tyr-Gly-Lys-Arg-
Asp-Ile-Asp-Ile-Glu-Ala-Leu-Gln-Glu-Glu-Arg-Tyr-Asn-Asp
Leu-Cys-Arg-Arg-Hisll4-Glu-Leu-Gly-Ser-Leull9-Arg-Hisl2l-
Ser-Leu-Ile-Hisl0l-Leu-Phe-Ile-Gly-Tyr-Cys -Pro-His109
Arg-Arg-Ala-Arg-Phe-Leu-Arg-Tyr-Ser-Asp-Glu-Thr-Val-Leu-
Ile-Gln-Glu-Val-Lys-Leu-Glu-Glu-Gly-Asn-Ala-Gly-Lys-Phe-
Asn-Ile-Leu59-Gln-Pro-Lys-Leu-Gln-Asp-Leu-Lys-Gly-Lys-
Arg-Val-Pro-Gly-Ile-Thr-Glu-Ala-Glu-fiys -Gîn-Glu-Tyr-Cys* -
Met-Asn-Glu-Glu-Gly-Pro-Leu-Asn-Pro-Gly-Val-Asn-Pro-Phe-
Glu-Glu-Ala-Glu-Glu-Leu-Leu-Asp-Phe-Asp-Ile-Ala-Ile-Gln
Met-Ala-Glu-Gly-Phe-Ala-Ala-Asn-Arg-Gln-Trp-Ile-Gly-Phe-
4 ) Peptide selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il présente une séquence en acides aminés qui répond à la formule I ci-après
7 ) Fragments ou combinaisons de fragments de peptide, caractérisés en ce qu'ils incluent des segments du peptide de formule I selon la revendication 4, comprenant entre 5 et 80 aminoacides et au moins un épitope.
(11)
Met gly asn gly gln gly arg asp trp lys met ala ile lys arg cys ser asn gly ala val gly val gly gly lys ser lys lys phe gly glu gly asn phe arg trp ala ile arg met ala asn val ser thr gly arg glu pro gly asp ile pro glu thr leu asp gln leu arg leu val ile cys asp leu gln glu arg arg glu lys phe gly ser ser lys glu ile asp met ala ile ala ala leu lys val phe ala val val gly leu leu asn met thr val ser thr ala ala ala ala glu asn met tyr thr gln met gly leu asp thr arg pro ser thr lys glu ala gly gly lys glu glu gly pro pro gln ala tyr pro ile gln thr val asn gly thr thr gln tyr val ala leu asp pro lys met val ser ile phe met glu lys ala arg glu gly leu gly gly glu glu val gln leu trp phe thr ala phe ser ala asn leu thr pro thr asp met ala thr leu ile met ala arg pro gly cys leu thr gln glu gln gln ala glu ala arg phe ala pro ala arg met gln cys arg ala trp tyr leu glu ala leu gly lys leu ala ala ile lys ala lys ser pro arg ala val gln leu arg gln gly ala lys glu asp tyr ser ser phe ile asp arg leu phe ala gln ile asp gln glu gln asn thr ala glu val lys leu tyr leu lys gln ser leu ser ile ala asn ala asn ala asp cys lys lys ala met ser his leu lys pro glu ser thr leu glu glu lys eu arg ala cys gln glu ile gly phe pro gly tyr lys met gln leu leu ala glu ala leu thr lys val gln val val gln ser lys gly pro gly pro val cys phe asn cys lys arg pro gly his leu ala arg gln cys arg asp val lys lys cys asn lys cys gly lys pro gly his leu ala ala lys cys trp gln gly gly lys lys asn ser gly asn trp lys ala gly arg ala ala ala pro val asn gln val gln gln ala val met pro ser ala pro pro met glu glu lys leu leu asp leu
6 ) Peptide selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il présente une séquence en aminoacides qui répond à la formule II ci-après
8 ) Fragment selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 37 aminoacides, dénommé SU1, et correspondant aux positions 253-289 de la séquence de formule I (souche WO).
g ) Fragment selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 37 aminoacides, dénommé SU2, et correspondant aux positions 388-424 de la séquence de formule I, lequel segment contient au moins un épitope correspondant à la séquence : Trp-Glu-Trp-Arg Pro-Asp-Phe-Glu-Ser-Glu-Lys.
10-) Fragment selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 26 aminoacides, dénommé SU3, et correspondant aux positions 467-492 de la séquence de formule I.
11') Fragment selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 21 aminoacides, dénommé SU4, et correspondant aux positions 508-528 de la séquence de formule I.
12 ) Fragment selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 35 aminoacides, dénommé SU5, et correspondant aux positions 572-606 de la séquence de formule I.
13-) Fragment selon la revendication 7, caractérisé en ce qu il inclut un segment de 51 aminoacides, dénommé TM1, et correspondant aux positions 595-647 de la séquence de formule I.
Lys.
14-) Fragment selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 31 aminoacides, dénommé TM2, et correspondant aux positions 681-711 de la séquence de formule I, lequel segment contient un épitope correspondant à la séquence : Gln-Asn-Gln-Phe-Phe-Cys
Trp-Val-Gly-Trp-Ile-Gly-Asn-Ile.
15-) Fragment selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 45 aminoacides, dénommé TM3, et correspondant aux positions 744-788 de la séquence de formule I, lequel segment contient un épitope correspondant à la séquence : Gln-Leu-Gln-Glu-Trp-Asp
16-) Fragment selon la revendication 7, caractérisé en ce qu il inclut un segment de 29 aminoacides, dénommé TM4, et correspondant aux positions 826-854 de la séquence de formule I.
17-) Composition à pouvoir immunogène et/ou protecteur, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, éventuellement associé à au moins une autre substance immunogène ou immunostimulante et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
VIF, caractérisé en ce qu'il consiste à détecter les anticorps anti-VIF éventuellement présents dans un échantillon biologique à l'aide d'un peptide ou fragment de peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, éventuellement fixé sur un support solide approprié, en mettant en présence ledit échantillon biologique avec ledit/lesdits peptides ou fragment(s) de peptides, auxquels se lient les anticorps anti-VIF si de tels anticorps sont présents dans l'échantillon à analyser, la lecture du résultat étant révélée par un moyen approprié, notamment EIA, RIA, fluorescence.
18-) Procédé de détection d'anticorps anti
19') Kit, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé de détection d'anticorps anti-VIF selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comprend, outre des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection, des doses appropriées d'au moins un peptide et/ou un fragment peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 16.
20') Réactif de diagnostic de l'immunodéficience féline, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par les fragments SU selon l'une quelconque des revendications 8 à 12 et les fragments TM selon l'une quelconque des revendications 13 à 16.
VIF.
21-) Réactif de diagnostic selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par le fragment SU2 selon la revendication 9, le fragment TM2 selon la revendication 14 et le fragment TM3 selon la revendication 15 et en ce qu'il constitue un réactif de diagnostic universel de souche de
22 ) Réactif de diagnostic selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par le fragment SU3 selon la revendication 10 et le fragment TM4 selon la revendication 16 et en ce qu'il constitue un réactif de diagnostic spécifique de la souche WO de VIF.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9207258A FR2692269B1 (fr) | 1992-06-16 | 1992-06-16 | Peptides immunogènes et/ou neutralisants de vif de souche WO et leurs applications au diagnostic et à la prévention de l'immunodéficience féline. |
| FR9214026A FR2692270A1 (fr) | 1992-06-16 | 1992-11-23 | Peptides immunogènes et/ou neutralisants de vif de souche WO et leurs applications au diagnostic et à la prévention de l'immunodéficience féline. |
| DE69333636T DE69333636T2 (de) | 1992-06-16 | 1993-06-16 | Nukleotid- und Peptidsequenzen des Immunschwächevirus der Katze, Isolat WO und Anwendungen der Sequenzen in der Diagnostik und zur Verhinderung der Infektion |
| EP93401538A EP0577458B1 (fr) | 1992-06-16 | 1993-06-16 | Séquences nucléotidiques et peptidiques issues de la souche Wo du VIF et applications desdites séquences au diagnostic et à la prévention de l'immunodéficience féline |
| AT93401538T ATE278018T1 (de) | 1992-06-16 | 1993-06-16 | Nukleotid- und peptidsequenzen des immunschwächevirus der katze, isolat wo und anwendungen der sequenzen in der diagnostik und zur verhinderung der infektion |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9207258A FR2692269B1 (fr) | 1992-06-16 | 1992-06-16 | Peptides immunogènes et/ou neutralisants de vif de souche WO et leurs applications au diagnostic et à la prévention de l'immunodéficience féline. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2692269A1 true FR2692269A1 (fr) | 1993-12-17 |
| FR2692269B1 FR2692269B1 (fr) | 1995-05-19 |
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ID=9430778
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9207258A Expired - Lifetime FR2692269B1 (fr) | 1992-06-16 | 1992-06-16 | Peptides immunogènes et/ou neutralisants de vif de souche WO et leurs applications au diagnostic et à la prévention de l'immunodéficience féline. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2692269B1 (fr) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2669338A1 (fr) * | 1990-11-21 | 1992-05-22 | Centre Nat Rech Scient | Fragments peptidiques issus de la proteine externe du vif, anticorps antifragments, application de ceux-ci au diagnostic et/ou au traitement de l'immunodeficience feline. |
-
1992
- 1992-06-16 FR FR9207258A patent/FR2692269B1/fr not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2669338A1 (fr) * | 1990-11-21 | 1992-05-22 | Centre Nat Rech Scient | Fragments peptidiques issus de la proteine externe du vif, anticorps antifragments, application de ceux-ci au diagnostic et/ou au traitement de l'immunodeficience feline. |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ARCH. VIROL. vol. 123, no. 1-2, 11 Mars 1992, SPRINGER VERLAG, VIENNE, AUSTRICHE; pages 29 - 45 N. MAKI ET AL. 'Molecular characterization and heterogeneity of feline immunodeficiency virus' * |
| MOLECULAR IMMUNOLOGY vol. 29, no. 5, Mai 1992, BPCC WHEATONS, EXETER, GB; pages 565 - 572 A. AVRAMEAS ET AL. 'Localization of three epitopes of the ENV protein of feline immunodeficiency virus' * |
| VETERINARY MICROBIOLOGY vol. 31, no. 1, Avril 1992, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL; pages 41 - 54 A. MORAILLON ET AL. 'In vitro properties and experimental pathogenic effect of three strains of feline immunodeficiency virus (FIV) isolated from cats with terminal disease' * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2692269B1 (fr) | 1995-05-19 |
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