FR2692279A1 - Séquences nucléotidiques issues de la souche WO du vif et leurs fragments, applications desdites séquences à l'expression de peptides immunogènes et au diagnostic de l'immunodéficience féline. - Google Patents

Séquences nucléotidiques issues de la souche WO du vif et leurs fragments, applications desdites séquences à l'expression de peptides immunogènes et au diagnostic de l'immunodéficience féline. Download PDF

Info

Publication number
FR2692279A1
FR2692279A1 FR9207257A FR9207257A FR2692279A1 FR 2692279 A1 FR2692279 A1 FR 2692279A1 FR 9207257 A FR9207257 A FR 9207257A FR 9207257 A FR9207257 A FR 9207257A FR 2692279 A1 FR2692279 A1 FR 2692279A1
Authority
FR
France
Prior art keywords
leu
gly
ala
glu
gln
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
FR9207257A
Other languages
English (en)
Other versions
FR2692279B1 (fr
Inventor
Pancino Gian-Franco
Chappey Colombe
Hurtrel Bruno
Moraillon Anne
Klatzmann David
Sonigo Pierre
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority to FR9207257A priority Critical patent/FR2692279B1/fr
Priority to DE69333636T priority patent/DE69333636T2/de
Priority to EP93401538A priority patent/EP0577458B1/fr
Priority to AT93401538T priority patent/ATE278018T1/de
Publication of FR2692279A1 publication Critical patent/FR2692279A1/fr
Application granted granted Critical
Publication of FR2692279B1 publication Critical patent/FR2692279B1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Séquences nucléotidiques issues du virus de l'immunodéficience féline (virus VIF), oligonucléotides compris dans lesdites séquences, produits de transcription de l'ARN génomique dudit virus, utilisation desdites séquences comme sondes ou comme amorces et pour l'expression de peptides immunogènes et/ou neutralisants, plasmides utiles pour ladite expression et procédé de détection, de différenciation et d'identification de souches de VIF à l'aide d'au moins l'une desdites séquences nucléotidiques. Les séquences nucléotidiques issues de l'ARN génomique du virus de l'immunodéficience féline (VIF), comprennent au moins un fragment d'un gène présentant des zones hypervariables, choisi dans le groupe constitué par le gène codant pour la protéine env de la souche WO du VIF et le gène codant pour la protéine gag de la souche WO du VIF.

Description

La présente invention est relative à des séquences nucléotidiques issues du virus de l'immunodéficience féline (virus VIF), à des oligonucléotides compris dans lesdites séquences, aux produits de transcription de L'ART génomique dudit virus, à l'utilisation desdites séquences comme sondes ou comme amorces et pour l'expression de peptides immunogènes et/ou neutralisants, aux plasmides utiles pour ladite expression ainsi qu'à un procédé de détection, de différenciation et d'identification de souches de VIF à l'aide d'au moins l'une desdites séquences nucléotidiques.
L'immunodéficience féline est due à un lentivirus, le virus de l'immunodéficience féline (VIF), qui présente une structure génétique similaire à celle des lentivirus des primates (VIH et VIS).
L'immunodéficience féline pose un problème important de santé vétérinaire, dans la mesure où un nombre important de chats infectés par le VIF a été décelé aux
Etats-Unis, au Japon et en Europe (5 à 25 % des animaux).
A l'heure actuelle, l'immunodéficience féline est essentiellement diagnostiquée lors de l'apparition des signes cliniques (lymphadénopathie généralisée et survenue d'infections opportunistes), alors qu'un diagnostic très précoce aurait des avantages importants tant dans le traitement que dans la prévention de cette maladie.
Plusieurs isolats viraux indépendants ont été mis en évidence à travers le monde et un certain nombre de travaux pour mettre en évidence la structure des souches isolées ont été réalisés, notamment en ce qui concerne la souche américaine Petaluma [R.L. TALBOTT et al. (Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 5743-5747)
T.R. PHILIPPS et al. (J. Virol., 1990, 64, 10, 46054613)], les souches japonaises (souches TM1 et TM2) [T.
MIYAZAWA et al. (Arch. Virol., 1989, 108, 59-68)] ou les isolats suisses (FIVZ1 et FIVZ2) [S. MORIKAWA et al., (Virus Research, 1991, 21, 53-63)].
Les séquences nucléotidiques de trois clones proviraux, dérivés des isolats de VIF américains (souche
Petaluma) ont été décrites (clones FIV34TF10, FIV14 et isolat PPR) [R.A. OLMSTED et al., (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 1989, 86, 2448-2452) ; T.R PHILIPPS et al., 1990
R.L. TALBOTT et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 5743-5747) et comparées aux deux isolats suisses (S.
MORIKAWA et al.). Cette comparaison a conduit S. MORIKAWA et al. à préciser la présence de certaines régions conservées et de certaines régions variables dans le gène env du VIF.
Des souches françaises ont également été isolées (souches WO et ME) [MORAILLON A. et al., 1992, Vet.
Mic., 31, 41-45, In vitro properties and experimental pa thogenic effect of three feline immunodeficiency vu ruses isolated from cats with terminal diseases].
Toutefois, en vue de mettre au point des outils de diagnostic plus performants et des moyens de production de vaccins spécifiquement protecteurs, il était important de sélectionner, à partir de ces souches, des séquences aptes à être performantes dans le diagnostic différentiel précoce de l'immunodéficience féline et aptes à produire des produits dérivés par génie génétique, à fin de vaccination, ou à choisir une immunothérapie adaptée à la souche infectante.
La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à des séquences nucléotidiques issues du VIF et à leurs fragments sélectionnés notamment pour leur spécificité de souche.
La présente invention a pour objet des séquences nucléotidiques issues de 1'ARN génomique du virus de l'immunodéficience féline (VIF), caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un fragment d'un gène présentant des zones hypervariables, choisi dans le groupe constitué par le gène codant pour la protéine env de la souche WO du VIF et le gène codant pour la protéine gag de la souche WO du VIF.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite séquence, celle-ci comprend la séquence en nucléotides et la séquence déduite en amino-acides de formule I ci-après, qui correspond au gène env du VIF, souche WO 1/1 31/11 atg gca gaa ggg ttt gca gct aat aga caa tgg ata ggg cca
Met ala glu gly phe ala ala asn arg gln trp ile gly pro
61/21 gaa gaa gct gaa gag cta tta gat ttt gat ata gca ata caa glu glu ala glu glu leu leu asp phe asp ile ala ile gln
91/31 121/41 atg aat gaa gaa ggg cca cta aat cca gga gta aac cca ttt met asn glu glu gly pro leu asn pro gly val asn pro phe
151/51 agg gta cct gga ata aca gaa gca gaa aag caa gaa tat tgt arg val pro gly ile thr glu ala glu lys gln glu tyr cys
181/61 aac ata tta caa ccc aag tta caa gat cta aag ggg aaa att asn ile leu gln pro lys leu gln asp leu lys gly lys ile 211/71 241/81 caa gag gta aaa ctg gaa gaa gga aat gca ggt aag ttt aga gln glu val lys leu glu glu gly asn ala gly lys phe arg
271/91 aga gca aga ttt tta aga tac tct gat gaa aca gta ttg tcc arg ala arg phe leu arg tyr ser asp glu thr val leu ser
301/101 331/111 cta att cac ttg ttc ata gga tat tgt cca cat tta tgc aga leu ile his leu phe ile gly tyr cys pro his leu cys arg
361/121 cga cat gaa tta gga tct tta aga cat gac ata gat ata gaa arg his glu leu gly ser leu arg his asp ile asp ile glu
391/131 gca ctt caa gaa gag cgt tat aat gat aga gag aag gga ata ala leu gln glu glu arg tyr asn asp arg glu lys gly ile 421/141 451/151 act gac aat ata aaa tat ggt aaa cga tgc tta ata gga aca thr asp asn ile lys tyr gly lys arg cys leu ile gly thr
481/161 gcg gtt ttg tac ctg ctt cta tct ttg gga ata ata ata cat ala val leu tyr leu leu leu ser leu gly ile ile ile his
511/171 541/181 aca tgc aag gct cag gta gta tgg aga ctt cca cca tta gta thr cys lys ala gln val val trp arg leu pro pro leu val
571/191 gtc cca gta gaa gaa tca gaa ata att ttt tgg gat tgt tgg val pro val glu glu ser glu ile ile phe trp asp cys trp
601/201 gca cca gag gaa ccc gcc tgt cag gac ttt ctt ggg gca atg ala pro glu glu pro ala cys gln asp phe leu gly ala met 631/211 661/221 ata cat cta aaa gct agt aca aat ata agt ata caa gag gga ile his leu lys ala ser thr asn ile ser ile gln glu gly
691/231 cct acc ctg ggg aat tgg gct aga gaa ata tgg gga aca tta pro thr leu gly asn trp ala arg glu ile trp gly thr leu
721/241 751/251 ttc aaa aag gct acc aga caa tgt aga aga ggt aga ata tgg phe lys lys ala thr arg gln cys arg arg gly arg ile trp
781/261 aga aga tgg aat gaa act ata aca gga ccg tta gga tgt gct arg arg trp asn glu thr ile thr gly pro leu gly cys ala
811/271 aat aat aca tgt tat aat atc tca gta ata gta cct gat tat asn asn thr cys tyr asn ile ser val ile val pro asp tyr 841/281 871/291 caa tgt tat cta gat aga gta gat act tgg tta caa ggg aaa gln cys tyr leu asp arg val asp thr trp leu gln gly lys
901/301 gta aat ata tca tta tgt cta aca gga gga aaa atg tta tat val asn ile ser leu cys leu thr gly gly lys met leu tyr
931/311 961/321 aat aaa gag aca aaa caa tta agc tat tgt aca gac cca tta asn lys glu thr lys gln leu ser tyr cys thr asp pro leu
991/331 caa atc cca ctg atc aat tat aca ttt gga cct aat caa aca gln ile pro leu ile asn tyr thr phe gly pro asn gln thr
1021/341 tgt atg tgg aac act tca cag atc caa gac cct gag ata cca cys met trp asn thr ser gln ile gln asp pro glu ile pro 1051/351 1081/361 aaa tgt gga tgg tgg aat caa aac gcc tat tat aat agt tgt lys cys gly trp trp asn gln asn ala tyr tyr asn ser cys
1111/371 aga tgg gaa cac aca gat gta cag ttt caa tgt caa agg aca arg trp glu his thr asp val gln phe gln cys gln arg thr
1141/381 1171/391 caa agt caa cca gga tca tgg att aga gca atc tcg tca tgg gln ser gln pro gly ser trp ile arg ala ile ser ser trp
1201/401 aaa caa agg aat aga tgg gaa tgg aga cca gac ttt gaa agt lys gln arg asn arg trp glu trp arg pro asp phe glu ser
1231/411 gaa aaa gta aaa gta tct cta cag tgt aat agc aca aaa aac glu lys val lys val ser leu gln cys asn ser thr lys asn 1261/421 1291/431 cta acc ttt gca atg aga agt tca gga gat tat gga gaa gta leu thr phe ala met arg ser ser gly asp tyr gly glu val
1321/441 aca gga gct tgg ata gag ttt gga tgt cat agg aca aaa tca thr gly ala trp ile glu phe gly cys his arg thr lys ser
1351/451 1381/461 aaa tat cat act gaa gca agg ttt aga att aga tgt aga tgg lys tyr his thr glu ala arg phe arg ile arg cys arg trp
1411/471 aat gta ggg gat aat acc tca ctc att gat aca tgt ggg gaa asn val gly asp asn thr ser leu ile asp thr cys gly glu
1441/481 act caa aat gtt tca aga gca aat cct gta gat tgt acc atg thr gln asn val ser arg ala asn pro val asp cys thr met 1471/491 1501/501 tat gca aat aga atg tat aac tgt tcc tta caa aac ggg ttt tyr ala asn arg met tyr asn cys ser leu gln asn gly phe
1531/511 act atg aag gta gat gac ctt atc atg cat ttt aat aag aca thr met lys val asp asp leu ile met his phe asn lys thr
1561/521 1591/531 aaa gct gta gag atg tat aac att gct gga aat tgg tct tgt lys ala val glu met tyr asn ile ala gly asn trp ser cys
1621/541 aaa tct gac ttg cca cca aca tgg ggg tat atg aat tgt aat lys ser asp leu pro pro thr trp gly tyr met asn cys asn
1651/551 tgt aca aat agt aca aat agt ggt act ggt ata agg atg gca cys thr asn ser thr asn ser gly thr gly ile arg met ala 1681/561 1711/571 tgt ccc aga aat caa ggc atc tta aga aat tgg tat aac cca cys pro arg asn gln gly ile leu arg asn trp tyr asn pro
1741/581 gta gca gga tta aga caa tcc tta gaa aag tat caa gtt gta val ala gly leu arg gln ser leu glu lys tyr gln val val
1771/591 1801/601 aaa caa cca gat tat tta gtg gta cca ggg gaa gtc atg gaa lys gln pro asp tyr leu val val pro gly glu val met glu
1831/611 tat aaa cct aga agg aaa aga gca gct att cat gtt atg tta tyr lys pro arg arg lys arg ala ala ile his val met leu
1861/621 gct ctt gca aca gta tta tct atg gct gga gca ggg acg ggg ala leu ala thr val leu ser met ala gly ala gly thr gly 1891/631 1921/641 gct act gct ata ggg atg gta aca caa tat caa caa gtg ctg ala thr ala ile gly met val thr gln tyr gln gln val leu
1951/651 gca act cat caa gaa gct ata gaa aag gtg act gaa gcc tta ala thr his gln glu ala ile glu lys val thr glu ala leu
1981/661 2011/671 aag ata aac aac tta aga tta gtt aca tta gag cat caa gta lys ile asn asn leu arg leu val thr leu glu his gln val
2041/681 cta gta ata gga tta aaa gta gaa gct atg gaa aaa ttt tta leu val ile gly leu lys val glu ala met glu lys phe leu
2071/691 tat aca gct ttc gct atg caa gaa tta gga tgt aat caa aat tyr thr ala phe ala met gln glu leu gly cys asn gln asn 2101/701 2131/711 caa ttc ttc tgt aaa gtc cct tct gca ttg tgg gaa cgg tat gln phe phe cys lys val pro ser ala leu trp glu arg tyr
2161/721 aat atg act ata aat caa aca ata tgg aat cat gga aat ata asn met thr ile asn gln thr ile trp asn his gly asn ile
2191/731 2221/741 act ttg ggg gaa tgg tat aac caa aca aaa gat tta caa caa thr leu gly glu trp tyr asn gln thr lys asp leu gln gln
2251/751 agg ttt tat gaa ata ata atg gac ata gaa caa aat aat gta arg phe tyr glu ile ile met asp ile glu gln asn asn val
2281/761 caa ggg aaa aaa ggg cta caa caa ctc cag gag tgg gaa gat gln gly lys lys gly leu gln gln leu gln glu trp glu asp 2311/771 2341/781 tgg gta gga tgg ata gga aat att cca caa tat tta aag gga trp val gly trp ile gly asn ile pro gln tyr leu lys gly
2371/791 cta ttg gga ggt atc ttg gga ata gga tta gga atg tta tta leu leu gly gly ile leu gly ile gly leu gly met leu leu
2401/801 2431/811 ttg atc tta tgt tta cct aca ttg gtt gat tgt ata aga aat leu ile leu cys leu pro thr leu val asp cys ile arg asn
2461/821 tgt atc cac aag ata ctg gga tac aca gta att gca atg cct cys ile his lys ile leu gly tyr thr val ile ala met pro
2491/831 gaa gta gaa gaa gaa gaa ata caa cca caa atg gaa ttg agg glu val glu glu glu glu ile gln pro gln met glu leu arg 2521/841 2551/851 aga aat ggt agg caa tgt ggc atg tct gaa aaa gag gag gaa arg asn gly arg gln cys gly met ser glu lys glu glu glu tga tga
OPA OPA (I)
Une telle séquence correspond à l'ADNc de l'ARNm de la protéine env de la souche WO du VIF.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite séquence, celle-ci comprend la séquence en nucléotides et la séquence déduite en amino-acides de formule II ci-après, qui correspond au gène gag du VIF, souche WO 1/1 31/11
ATG GGG AAC GGA CAG GGG CGA GAT TGG AAA ATG GCC ATT AAG
Met gly asn gly gln gly arg asp trp lys met ala ile lys
61/21
AGA TGC AGT AAT GGT GCT GTA GGA GTA GGG GGG AAG AGT AAA arg cys ser asn gly ala val gly val gly gly lys ser lys
91/31 121/41
AAA TTT GGA GAA GGG AAT TTC AGA TGG GCC ATC AGA ATG GCT lys phe gly glu gly asn phe arg trp ala ile arg met ala
151/51
AAC GTA TCT ACA GGA CGA GAA CCT GGT GAT ATA CCA GAG ACT asn val ser thr gly arg glu pro gly asp ile pro glu thr
181/61
TTA GAT CAA CTA AGG TTG GTT ATT TGC GAT TTA CAA GAG AGA leu asp gln leu arg leu val ile cys asp leu gln glu arg 211/71 241/81
AGA GAA AAA TTT GGA TCT AGT AAA GAA ATT GAC ATG GCA ATT arg glu lys phe gly ser ser lys glu ile asp met ala ile
271/91
GCT GCA TTA AAA GTC TTT GCA GTA GTG GGA CTT TTA AAT ATG ala ala leu lys val phe ala val val gly leu leu asn met
301/101 331/111
ACA GTG TCT ACT GCT GCT GCA GCT GAA AAT ATG TAT ACT CAG thr val ser thr ala ala ala ala glu asn met tyr thr gln
361/121
ATG GGT TTA GAC ACC AGA CCA TCT ACA AAA GAG GCA GGA GGA met gly leu asp thr arg pro ser thr lys glu ala gly gly
391/131
AAA GAG GAA GGC CCT CCA CAG GCA TAT CCT ATT CAA ACA GTA lys glu glu gly pro pro gln ala tyr pro ile gln thr val 421/141 451/151
AAT GGA ACA ACA CAA TAT GTA GCA CTT GAC CCA AAA ATG GTG asn gly thr thr gln tyr val ala leu asp pro lys met val
481/161
TCC ATT TTT ATG GAA AAG GCA AGA GAA GGA TTA GGA GGT GAG ser ile phe met glu lys ala arg glu gly leu gly gly glu
511/171 541/181
GAA GTT CAA TTA TGG TTT ACA GCC TTC TCT GCA AAT TTA ACA glu val gln leu trp phe thr ala phe ser ala asn leu thr
571/191
CCT ACT GAC ATG GCC ACA TTA ATA ATG GCT CGA CCA GGG TGC pro thr asp met ala thr leu ile met ala arg pro gly cys
601/201
GCT GCA GAT AAA GAA ATA TTG GAT GAA AGC TTA AAG CAA TTA ala ala asp lys glu ile leu asp glu ser leu lys gln leu 631/211 661/221
ACA GCA GAA TAT GAT CGC ACG CAT CCC CCT GAT GGT CCT AGA thr ala glu tyr asp arg thr his pro pro asp gly pro arg
691/231
CCA TTA CCC TAT TTT ACT GCA GCA GAA ATC ATG GGT ATA GGA pro leu pro tyr phe thr ala ala glu ile met gly ile gly
721/241 751/251
TTA ACT CAA GAA CAA CAA GCA GAA GCA AGA TTT GCA CCA GCT leu thr gln glu gln gln ala glu ala arg phe ala pro ala
781/261
AGG ATG CAG TGT AGA GCA TGG TAT CTC GAG GCA TTA GGA AAA arg met gln cys arg ala trp tyr leu glu ala leu gly lys
811/271
TTG GCT GCC ATA AAA GCT AAA TCT CCT CGA GCT GTG CAG TTA leu ala ala ile lys ala lys ser pro arg ala val gln leu 841/281 871/291
AGA CAA GGA GCC AAA GAA GAT TAT TCA TCC TTT ATA GAT AGA arg gln gly ala lys glu asp tyr ser ser phe ile asp arg
901/301
TTG TTT GCC CAA ATA GAT CAA GAA CAA AAT ACA GCT GAA GTT leu phe ala gln ile asp gln glu gln asn thr ala glu val
931/311 961/321
AAG TTA TAT CTA AAA CAG TCA TTA AGC ATA GCT AAT GCT AAT lys leu tyr leu lys gln ser leu ser ile ala asn ala asn
991/331
GCA GAC TGC AAA AAG GCA ATG AGT CAT CTT AAG CCA GAA AGT ala asp cys lys lys ala met ser his leu lys pro glu ser
1021/341
ACC CTA GAA GAA AAG TTG AGA GCT TGT CAA GAG ATA GGA TTC thr leu glu glu lys leu arg ala cys gln glu ile gly phe 1051/351 1081/361
CCA GGA TAT AAG ATG CAG CTC TTA GCA GAA GCC CTT ACA AAA pro gly tyr lys met gln leu leu ala glu ala leu thr lys
1111/371
GTT CAA GTA GTA CAA TCA AAA GGA CCA GGA CCA GTG TGT TTT val gln val val gln ser lys gly pro gly pro val cys phe
1141/381 1171/391
AAT TGT AAA AGA CCA GGG CAT CTA GCA AGA CAG TGC AGA GAT asn cys lys arg pro gly his leu ala arg gln cys arg asp
1201/401
GTG AAA AAA TGT AAT AAA TGC GGA AAG CCT GGT CAT TTA GCT val lys lys cys asn lys cys gly lys pro gly his leu ala
1231/411
GCC AAA TGT TGG CAA GGT GGT AAA AAG AAT TCG GGA AAC TGG ala lys cys trp gln gly gly lys lys asn ser gly asn trp 1261/421 1291/431
AAG GCG GGA CGA GCT GCA GCC CCA GTG AAT CAA GTG CAG CAA lys ala gly arg ala ala ala pro val asn gln val gln gln
1321/441
GCA GTA ATG CCA TCT GCA CCT CCA ATG GAG GAG AAA CTA TTG ala val met pro ser ala pro pro met glu glu lys leu leu
GAT TTG asp leu (Il)
Une telle séquence correspond à l'ADNc de l'ARNm de la protéine gag de la souche WO du VIF.
La présente invention a également pour objet un produit de transcription du VIF, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un fragment correspondant aux nucléotides 1-2562 de la séquence de formule I.
La présente invention a également pour objet un produit de transcription du VIF, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un fragment correspondant aux nucléotides 1-1350 de la séquence de formule Il.
La présente invention a également pour objet des fragments ou des combinaisons de fragments d'une séquence nucléotidique conforme à l'invention, codant pour un peptide ou un fragment de peptide de la souche WO du
VIF, comprenant un épitope apte à induire une réponse immune, i.e. soit produisant une réponse cellulaire, soit produisant des anticorps (neutralisants et/ou protecteurs), lesquels fragments sont spécifiques de souche, du fait de leur variabilité.
Parmi lesdits fragments, elle englobe entre autres
- un fragment de 141 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 76-216, de la séquence de formule
I, fragment produisant un peptide dénommé V1 (aminoacides 26-72)
- un fragment de 236 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 286-522 de la séquence de formule
I, fragment produisant un peptide dénommé V2 (aminoacides 96-174)
- un fragment de 186 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 1081-1266 de la séquence de formule I, fragment produisant un peptide dénommé V3 (aminoacides 361-422)
- un fragment de 38 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 1354-1491 de la séquence de formule I, fragment produisant un peptide dénommé V4 (aminoacides 452-497)
- un fragment de 90 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 1621-1710 de la séquence de formule I, fragment produisant un peptide dénommé V5 (aminoacides 541-570)
- un fragment de 81 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 1756-1836 de la séquence de formule I, fragment produisant un peptide dénommé V6 (aminoacides 586-612)
- un fragment de 27 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 2128-2154 de la séquence de formule I, fragment produisant un peptide dénommé V7 (aminoacides 710-718)
- un fragment de 61 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 2293-2334 de la séquence de formule I, fragment produisant un peptide dénommé V8 (aminoacides 765-778)
- un fragment de 33 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 2494-2526 de la séquence de formule I, fragment produisant un peptide dénommé Vg (aminoacides 832-842).
La présente invention a également pour objet des sondes nucléotidiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence nucléotidique ou un fragment de celle-ci conforme à l'invention, éventuellement marqué à l'aide d'un marqueur tel qu'un isotope radioactif, une enzyme appropriée ou toute autre substance non radioactive appropriée.
La présente invention a également pour objet des paires d'amorces pour la synthèse d'un ADNc ou d'un
ARN de VIF de souche WO, caractérisé en ce que chaque amorce comprend une séquence homologue ou complémentaire d'une séquence nucléotidique conforme à l'invention.
De telles amorces permettent notamment la synthèse d'une séquence d'ADN ou d'ARN ou d'un fragment de celle-ci conforme à l'invention et/ou de son brin complémentaire.
Au sens de la présente invention, séquence homologue englobe non seulement les séquences identiques aux séquences (I) et (II) ou à un segment de celles-ci, mais également celles n'en différant que par la substitution, la délétion ou l'addition d'un petit nombre de nucléotides, à condition que les séquences ainsi modifiées aient une spécificité d'hybridation équivalente à celle de ces séquences (I) et (II) ou du segment considéré.
Au sens de la présente invention, séquence homologue englobe également les séquences dont la position est homologue.
De même, on entend par séquence complémentaire, non seulement les séquences strictement complémentaires aux séquences (I) et (Il) ou de leurs segments, mais également des séquences modifiées comme indiqué précédemment, possédant une spécificité d'hybridation équivalente à celle desdites séquences strictement complémentaires.
La présente invention a également pour objet des fragments peptidiques, caractérisés en ce qu'ils sont codés par une séquence ou un fragment de séquence nucléotidique conforme à l'invention et en ce qu'ils constituent des zones variables des protéines du VIF.
Parmi lesdits fragments peptidiques, elle englobe, comme précisé ci-dessus (voir séquence de formule I)
- un fragment incluant un segment de 47 aminoacides, dénommé V1 ;
- un fragment incluant un segment de 79 aminoacides, dénommé V2
- un fragment incluant un segment de 62 aminoacides, dénommé V3
- un fragment incluant un segment de 46 aminoacides, dénommé V4
- un fragment incluant un segment de 30 aminoacides, dénommé VS
- un fragment incluant un segment de 27 aminoacides, dénommé V6
- un fragment incluant un segment de 9 aminoacides, dénommé V7
- un fragment incluant un segment de 14 aminoacides, dénommé V8
- un fragment incluant un segment de 11 aminoacides, dénommé V9.
Lesdits peptides peuvent avantageusement être obtenus soit par clonage, soit par synthèse, notamment par synthèse de Merrifield.
Les peptides Vl-V9, conformes à l'invention, permettent notamment de bien différencier les zones variables des zones conservées et autorisent ainsi une différenciation fine des différentes souches de VIF.
Au sens de la présente invention le terme fragment peptidique comprend tous les fragments incluant un segment de peptide conforme à l'invention ainsi que les peptides homologues ; on entend par peptide homologue, les fragments peptidiques dont la position et la fonction sont équivalents, au sein de l'enveloppe du VIF (même localisation que celle définie ci-dessus, sur le génome du VIF).
La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique conforme à l'invention.
On entend, au sens de la présente invention, par vecteur recombinant, aussi bien un plasmide, un cosmide, qu'un phage.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit vecteur, il est constitué par un plasmide approprié comprenant une origine de réplication, au moins un marqueur de sélection et une séquence nucléotidique conforme à l'invention, lequel vecteur est un vecteur de clonage.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit vecteur de clonage est constitué par un plasmide capable de se répliquer dans E. coli, dans lequel est inséré une séquence nucléotidique conforme à 1' invention.
Dans le cas où l'on introduit la séquence de formule I dans un vecteur Bluescripts SK+, ledit vecteur est dénommé pKSeî
Ledit vecteur a été déposé auprès de la
Collection Nationale de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur, le 12 juin 1992 sous le n I-1220.
Lorsque ladite séquence est introduite dans un vecteur BluescriptX KS+, ledit vecteur est dénommé pKSe.
Selon un autre mode de réalisation dudit vecteur, il est constitué par un vecteur recombinant approprié comprenant, en particulier, une origine de réplication dans un microorganisme hôte approprié, notamment une bactérie ou une cellule eucaryote, au moins un gène dont l'expression permet la sélection soit des bactéries, soit des cellules eucaryotes ayant reçu ledit vecteur, un promoteur permettant l'expression des gènes dans lesdites bactéries ou cellules eucaryotes, et dans lequel est insérée une séquence nucléotidique conforme à l'invention, lequel vecteur est un vecteur d'expression d'un peptide, d'un fragment de peptide ou d'une combinaison de fragments de peptides du VIF de souche WO (protéine env ou protéine gag), ayant les propriétés desdites protéines.
Avantageusement, ledit vecteur d'expression est constitué par un phage kgtll dans lequel est inséré, en phase au niveau de son site, EcoRI, des fragments de digestion à la DNAse du plasmide pKSeî.
La présente invention a, en outre, pour objet un procédé de détection d'une infection à VIF, caractérisé en ce qu'il consiste à détecter un VIF, à l'aide d'au moins une sonde nucléotidique ou un fragment de sonde nucléotidique conforme à l'invention, en mettant en présence l'échantillon à analyser avec ladite/lesdites sondes nucléotidiques, à laquelle/auxquelles se lie 1'ARN génomique ou les produits de transcription du virus d'immunodéficience féline, si de tels produits sont présents dans l'échantillon, la lecture du résultat étant révélée par un moyen approprié, notamment EA, RA, fluorescence.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré de ce procédé, préalablement à l'hybridation avec lesdites sondes, on amplifie la séquence nucléique à détecter (ARN génomique ou ARN messager du VIF WO) par la méthode d'amplification dite PCR (réaction de polymérisation en chaîne à l'aide d'une polymérase appropriée, notamment la
Taq polymérase) en utilisant une paire d'amorces conforme à l'invention.
La méthode PCR est notamment décrite par SAIKI et al. dans Science, 1988, 239, 487 ainsi que dans les
Demandes de Brevet européen CETUS n 200 362 et n 201 184.
La présente invention a, de plus, pour objet un kit, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé de détection d'une infection à VIF, caractérisé en ce qu'il comprend outre des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection, des doses appropriées d'au moins une sonde et/ou fragment de sonde nucléotidique conforme à l'invention et éventuellement des doses appropriées d'au moins deux amorces conformes à l'invention.
La sélection de fragments nucléiques cidessus, définissant des zones variables permet de différencier les souches de VIF, ce qui permet de choisir le vaccin le plus proche de la souche infectante, en cas d'immunothérapie active ou passive, ou de déterminer les souches présentes dans une région, pour le choix d'un vaccin préventif le mieux adapté.
La présente invention a en outre pour objet un réactif de différenciation de souche de VIF, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par les fragments V tels que définis ci-dessus.
La présente invention a également pour objet un procédé de différenciation de souche de VIF, caracté risé en ce qu'il met en oeuvre au moins un réactif de différenciation tel que défini ci-dessus.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention.
I1 doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : séquençage du gène env du virus de 1'immuno- déficience féline WO.
a) Echantillons d'ADN
Des cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC), obtenues à partir de chats infectés naturellement par l'isolat français WO, présentant un syndrome d'immunodéficience acquise féline, sont co-cultivées avec des cellules mononucléaires de sang périphérique, obtenues à partir de chats dits contrôle négatif (chats SPF), en présence dtinterleukine-2 humaine recombinante (Genzyme, Boston, USA) et de concanavaline A (Sigma) (MORAILLON A. et al., 1992, Vet. Mic., 31, 41-45,
In vitro properties and experimental pathogenic effect of three feline immunodeficiency viruses isolated from cats with terminal diseases).
L'activité réverse transcriptase (RT) dépendante de Mg++ est plus particulièrement surveillée. Après 15 jours, l'ADN cellulaire total est extrait au phénol (SAMBROOK et al., 1989, Molecular cloning, a laboratory manual), à partir de cultures RT positives et utilisé comme matériel de départ pour l'amplification des gènes du VIF. Ceci permet d'éviter les passages multiples in vitro et l'adaptation à des lignées cellulaires CD4 négatives.
b) PCR
Les gènes env et gag de la souche WO du virus de l'immunodéficience féline sont respectivement amplifiés en trois et deux fragments chevauchants, en utilisant des amorces synthétiques correspondant à des régions conservées dans les séquences de VIF, isolat Petaluma (TALBOTT et al, 1989) et isolat PPR (PHILIPPS et al., 1990)
Les séquences des amorces et les positions (conformément à la numérotation utilisée pour le VIF 34TF10), sont comme suit
* env
- pour le premier fragment env, dénommé E1, on utilise comme amorce 5', le fragment 5'-GCAACAATAAGAATGG
CAGAAGC-3' (6251-6274) et comme amorce 3', le fragment 5' -GTTTAGGGTGACTAGTTAATATGTAAACC-3' (7236-7263)
- pour le second fragment env, dénommé E2, on utilise comme amorce 5', le fragment 5'-CAAATCCCACTGAT
CAATTATACATTTGG-3' (7236-7263), et comme amorce 3', le fragment 5'-CGTAGTTCATGATCATTATCCTAATTTTC-3' (82698298)
- en ce qui concerne le fragment dénommé E3, on utilise comme amorce 5', le fragment 5'-GCATCAAGTAC
TAGTAATAGGATTAAAAG-3' (8269-8298), et comme amorce 3', le fragment 5' -CTTTTTCTCCTCCTTACTACTTC-3' (8809-8833)
* gag
- pour le premier fragment gag, dénommé G1, on utilise comme amorce 5', le fragment 5'-GGAGAGATTCTACAG
CAACATGGGG-3' (608-632) et comme amorce 3', le fragment 5' -GCCAATTTTCCTAATGCCTCGAGATACCATGC-3' (1398-1429)
- pour le second fragment gag, dénommé G2, on utilise comme amorce 5', le fragment 5'-GCATGGTATCTCGAGG
CATTAGGAAAATTGGC63' (1398-1429) et comme amorce 3', le fragment 5' -AATTTACAAATCCAATAGTTTCTCCTCC-3' (1954-2123).
Les oligonucléotides correspondant à l'amorce 5' du fragment E2 contiennent un site de restriction BclI et l'oligonucléotide correspondant à l'amorce 3' du fragment E2 contient un site SpeI, qui permet la reconstruction d'un clone env complet.
Cette PCR comprend 38 cycles, incluant chacun une dénaturation à 94 C pendant une minute, une hybridation à 55 C pendant une minute et une élongation à 72 C pendant une minute, avec 1 Rg d'ADN génomique total, 150 pmol de chaque amorce et 20 nmol de chaque désoxynucléotide triphosphate dans un tampon comprenant du Tris 10 mM, du KC1 50 mM et du MgC12 2 mM.
c) Clonaae et sécuencape
Un vecteur M13mp8 est digéré par l'enzyme
SmAI, de manière à pouvoir y insérer les fragments PCR obtenus ci-dessus [par exemple, pour le gène env frag ments de la séquence de formule I, E1 (nucléotides 1977), E2 (978-2016) et E3 (2017-2562)]. Le vecteur recombinant obtenu est utilisé pour transformer des E. coli
JM101 compétents.
Les clones recombinants sont détectés par une hybridation in situ avec les fragments PCR correspondants, marqués au phosphore 32.
Le séquençage de 1'ADN simple brin à partir de phages recombinants est réalisé par la méthode enzymatique par les didésoxynucléotides, avec un kit de séquen çage Séquenases 2.0 DNA, utilisant, comme amorces, des oligonucléotides complémentaires au vecteur (17 mers, amorce universelle) ou l'insert VIF.
Pour reconstituer le gène env complet, les trois fragments (E1, E2 et E3) sont préparés à partir du vecteur recombinant M13mp8 tel que défini ci-dessus, en utilisant les sites de restriction présents dans la séquence de liaison multisites du M13mp8 ou dans les amorces d'amplification : E1, HindIII-BclI ; E2, BclI
SpeI ; E3, SpeI-EcoRI. Les trois fragments sont ligaturés dans un vecteur KS+ Bluescripte (Stratagène), digéré par les enzymes HindIII et EcoRI, en aval du promoteur T3. La construction obtenue est dénommée pKSe.
Lesdits fragments peuvent également être ligaturés dans un vecteur SK+ Bluescripts (Stratagène), digéré par les enzymes HindIII et EcoRI, en aval du promoteur T7. Cette dernière construction, dénommée pKSel, permet la transcription du gène env dans des cellules de mammifère exprimant le gène de 1'ARN polymérase du phage
T7, alors que la construction pKSe permet la transcription du gène env dans des cellules de mammifère exprimant le gène de l'ARN polymérase du phage T3.
d) Analvse des séquences d'aminoacides corresondantes :
L'analyse des séquences est réalisée sur ordinateur avec le programme "Salsa".
Les multiples alignements comparant la séquence VIF WO avec d'autres séquences de VIF et notamment
VIF34TF10 (USA) (TALBOTT et al., 1989), VIF 14 (USA) (OLMSTED et al., 1989), VIF PPR (USA) (PHILLIPS et al., 1990), VIF TM2/GVEPX (JAPON) (KIYOMASU et al., 1991
MIYAZAWA et al.), VIF Z1 et VIF Z2 (SUISSE) (MORIKAWA et al., 1991), VIF l9Kl et VIF l9K2 (Pays Bas) (SIEBELINK
K.M.J. et al., J.Virol., 1992, 66, 1091-1097) obtenus à partir de la banque de gènes "GenBank", sont illustrés à la figure la et lb, dans lequelles il apparaît que les variations sont, pour la plupart, situées sur le gène env et sont, en référence auxdites séquences en aminoacides - séquence FIV WO/séquence FIVZ2 : 8,9 % - séquence FIV WO/séquence isolat Petaluma : 10,2-10,9 % - séquence FIV WO/ séquence FIVl9 : 10,8 % - séquence FIV WO/séquence FIVZ1 : 11 % - séquence FIV WO/séquence FIVPPR : 13,6 % - séquence FIV WO/séquence FIVGVEPX : 19 %.
Les séquences variables conformes à linven- tion sélectionnées (V1 à Vg, en référence à leurs séquences en aminoacides) sont récapitulées dans le Tableau ci-après ; de manière avantageuse, la sélection de ces fragments permet de définir, par déduction, des zones conservées chez l'ensemble des VIF, et permet de bien mettre en valeur les zones variables et les zones conservées ; ce qui permet de définir des réactifs universels de détection du VIF, des réactifs sélectifs et de faire bénéficier les animaux de la meilleure protection possible
Figure img00190001
<tb> <SEP> Séquence <SEP> Séquence
<tb> <SEP> acides <SEP> nucléiques <SEP> aminoacides
<tb> V1 <SEP> 76- <SEP> 216 <SEP> 26- <SEP> 72
<tb> V2 <SEP> 286- <SEP> 522 <SEP> 96-174
<tb> V3 <SEP> 1081-1266 <SEP> 361-422
<tb> V4 <SEP> 1354-1491 <SEP> 452-497
<tb> V5 <SEP> 1621-1710 <SEP> 541-570
<tb> V6 <SEP> 1756-1836 <SEP> 586-612
<tb> V7 <SEP> 2128-2154 <SEP> 710-718
<tb> V8 <SEP> 2293-2334 <SEP> 765-778
<tb> Vg <SEP> 2494-2526 <SEP> 832-842
<tb>
e) Transcription et traduction in vitro
Pour la synthèse in vitro de 1'ARN, les deux constructions pKSe et pKSel sont utilisées, la transcription étant effectuée dans le premier cas, par la polymérase T3 et dans le deuxième cas, par la polymérase T7, comme précisé ci-dessus.
1 Rg d'ADN des plasmides pKSel et pKSe est linéarisé, en utilisant le site de restriction EcoRI, présent dans la séquence de liaison multisites du vecteur, en aval du gène inséré. Le plasmide linéarisé et traité à la protéinase K est transcrit, en utilisant 1'ARN polymérase T3 pour pKSe et 1'ARN polymérase T7 pour pKSel, conformément au protocole fourni par le fabricant (Stratagène). Après traitement à la DNase et extraction au phénol, le produit de transcription est précipité à méthanol, en présence de 5 g dARNt dE. coli, remis en suspension dans 15 W1 d'eau traitée au DEPC et stocké à -70'C. La taille des transcrits est évaluée par électrophorèse sur gel d'agarose à 1 % dans un tampon phosphate 10 mM, pH 7, après une dénaturation au glyoxal /diméthyl sul foxide.
Environ 10 ng de I'ARN transcrit in vitro est traduit pendant 30 minutes à 30'C, dans un volume final de 12,5 ig contenant 6 Fg de lysat de réticulocytes de lapin (RRL) (Promega), 0,25 1 d'un mélange d'aminoacides dépourvus de méthionine (Promega) et 1,75 W1 de méthionine marquée au soufre 35 en l'absence (-M) ou en présence (+M) de membranes microsomales (1 ou 2 1), pour permettre la glycosylation des protéines (figure 2A). Les 1 ou 2 1 de membranes microsomales pancréatiques de chien (Promega) sont ajoutés par 12,5 A1 de mélange de réaction.Pour les essais de cinétique, 3 1 d'aliquots sont prélevés à des moments différents (15, 30, 60 et 90 minutes, 4 heures). Les échantillons sont stockés à -70 C.
Les études d'inhibition en présence de castanospermine, sont réalisées en incubant le mélange de traduction contenant les membranes microsomales (2 1 pour 12,5 1 de mélange) avec de la castanospermine 5 mM (concentration finale) (Sigma), préparée extemporanément dans de l'eau traitée au DEPC, à 30'C pendant 15 minutes, avant l'addition d'ARN.
Les produits de traduction sont dénaturés par ébullition dans un tampon de Laemmli et évalués par électrophorèse (SDS-PAGE, gradient 5-10 %). Des marqueurs du poids moléculaire sont également utilisés (BIORAD H.M.W.
ou marqueurs Rainbow). Après l'électrophorèse, les gels sont fixés, traités et autoradiographiés sur un film
Kodak XAR-5.
Dans ces conditions, 1'ARN transcrit in vitro à partir du plasmide pKSe (contenant le gène env de VIF
WO complet) migre, dans un gel d'agarose dans des conditions dénaturantes, en une seule bande d'approximativement 2,5 kb, correspondant à la dimension attendue. Après traduction de ce transcrit dans un lysat de réticulocytes de lapin (RRL), le produit obtenu en plus grande quantité, a un poids moléculaire apparent de 90 kDa (figure 2A), compatible avec le poids moléculaire calculé du polypeptide codé, déduit de la séquence (98,079 kDa).
La traduction de 1'ARN en présence de microsomes pancréatiques de chien, qui permet une N-glycosylation de la chaîne polypeptidique obtenue, fournit deux produits de poids moléculaires élevés, respectivement de 150 et 130 kDa (figure 2A). Pour analyser la relation entre les deux produits glycosylés obtenus, on réalise des expérimentations étalées dans le temps ; on réalise également, comme précisé ci-dessus, la traduction en présence de castanospermine, un inhibiteur de lla-glucosi- dase I du réticulum endoplasmique rugueux, de manière à déterminer si le produit de poids moléculaire le plus bas pourrait dériver de la glycoprotéine de 150 kDa par coupure des sucres pendant la glycosylation.La cinétique de la maturation de l'enveloppe protéinique montre l'apparition, au bout de 15 minutes, des deux produits glycosylés, qui augmente quantitativement jusqu'à 90 minutes d'incubation (figure 2B). En présence de castanospermine, les deux molécules migrent à un poids moléculaire plus élevé, respectivement de 160 et 145 kDa, et restent non modifiées pendant les expérimentations étalées dans le temps (figure 2B).
Ces expériences montrent qu'en l'absence de membranes microsomales qui permettent la glycosylation, on observe un produit de poids moléculaire apparent de 90 kDa, correspondant ainsi au précurseur d'enveloppe non glycosylé. Après addition de membranes microsomales, on observe deux espèces glycosylées de poids moléculaires respectifs 150 kDa et 130 kDa, confirmant la glycosylation importante de ce peptide. La séquence env de WO contient 21 sites N-glycosylation potentiels, qui sont probablement utilisés complètement comme le suggère les poids moléculaires des produits de traduction, en présence de membranes microsomales.
f) Immunocrécloltatlon :
Des anti-sérums de VIF sont obtenus à partir de deux chats SPF (chats dépourvus de pathogènes spécifiques), inoculés avec des isolats WO ou Petaluma et à partir également de deux chats infectés naturellement, mais séronégatifs vis-à-vis du virus de la leucémie féline. Des sérums de contrôle sont obtenus à partir des deux chats SPF. Pour l'étape de la préabsorption, un stock de sérums de chats SPF est utilisé. Des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre des peptides synthétiques tels que décrits dans la Demande de Brevet fran çais n"90 14519 sont également utilisés, à des concentrations de 20 mg/ml.Le premier de ces anticorps (P100), d'une longueur de 21 aminoacides, est situé à l'extrémité
C terminale de la glycoprotéine de surface du VIF et inclut le site de coupure entre la glycoprotéine de surface (SU) et la glycoprotéines transmembranaire (TM) ; le deuxième anticorps (P102), d'une longueur de 25 aminoacides, correspond à l'extrémité C terminale de la glycoprotéine TM du VIF. Des sérums de lapin préimmunisés sont utilisés pour l'étape de préabsorption et comme contrôle négatif dans les essais d'immunoprécipitation.
Des aliquots de produits de traduction in vitro (approximativement 100 000 cpm, déterminés après précipitation à l'acide perchlorique) sont dilués dans 200 1 d'un tampon RIPA (Triton X-100 1 %, sodium désoxycholate 0,5 %, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM dans Tris-HCl pH 7,5, 50 mM). Les réactions sont réalisées à 4C. Les échantillons sont préabsorbés pendant 30 minutes avec 4 1 d'un pool de sérums de chats SPF ou avec un sérum de lapin préimmunisé et précipités avec 50 1 de protéine A
Sépharose CL-4B (PrA, Pharmacia).Les surnageants sont alors incubés pendant une nuit avec 4 1 de sérum de chats infectés, de sérum de chats SPF ou d'anticorps po lyclonaux de lapin anti-peptide synthétique tel que défini ci-dessus. 50 1 de PrA sont ajoutés et incubés pendant 1 heure. Après 4 lavages dans un tampon RIPA, les culots des immunocomplexes-PrA sont élués par ébullition pendant 5 minutes dans 50 > 1 de tampon Laemmli. Les échantillons sont analysés sur un gradient SDS-PAGE 510 %.
Des cellules FL-4, dérivées des cellules mononucléaires de sang périphériques (PBMC) infectées par une souche étal puma et produisant spontanément le VIF (Yamamoto,l991), sont lavées dans du PBS froid et lysées dans un tampon RIPA. Les lysats cellulaires sont clarifiés par centrifugation à 17000g pendant 30 min.
Les produits de traduction env mature obtenus in vitro, sont soumis à une immunoprécipitation (figure 3) avec les différents sérums d'animaux précités (sérums
SPF, inoculés expérimentalement avec des isolats WO et Petaluma (bandes 1 et 4), sérums de chats infectés naturellement (bandes 2 et 5), sérums de chats SPF non infectés, comme contrôle négatif (bande 3)). Cette figure 3 illustre les résultats obtenus ; les deux produits glycosylés (150 kDa et 130 kDa) sont immunoprécipités par les sérums de chats infectés, le produit de 130 kDa étant le produit majeur. La bande de 90 kDa représente probablement un matériel non glycosylé résiduel. Le produit de poids moléculaire le plus bas, peut être considéré comme un produit de transcription ou de traduction partielle.
Aucune bande n'est détectée dans les sérums de chats SPF et non infectés
La figure 3b illustre, en comparaison, l'immunoprécipitation de protéines VIF marquées métaboliquement, obtenues à partir de cellules FL-4. Les bandes a, b et c représentent le résultat obtenu avec des sérums de chats SPF non infectés, des sérums de chats infectés avec une souche Petaluma et des sérums de chats infectés par le VIF WO. Les bandes d, e et f correspondent à un sérum de lapin préimmune, des sérums de lapin polyclonaux dirigés contre le peptide C-terminal de la protéine SU (de l'aminoacide 6 à la portion TM(P100)) et des sérums de lapin polyclonaux dirigés contre un peptide C-terminal de la protéine TM (P102).Les bandes b et c permettent la détection de deux protéines (150 kDa et 115-125 kDa), qui correspondent à la protéine précurseur d'enveloppe et à la glycoprotéine SU, respectivement, comme le confirme l'immunoprécipitation avec les deux anticorps de lapin dirigés contre les peptides incluant le site de clivage
SU-TM ou correspondant à la partie C-terminale du précurseur env (bandes e et f).
EXEMPLE 2 : Test de dépistage d'une infection à VIF.
On hybride in situ les fragments d'acide nucléique isolés à partir d'un échantillon à tester et transféré sur un filtre de nitrocellulose, avec un fragment d'acide nucléique conforme à l'invention (sonde marquée avec du dATP 32P), à 58 C pendant une nuit, après blocage des liaisons non spécifiques, avec une solution de Denhardt.
Un tel procédé, mis en oeuvre avec un pool de fragments dits variables (Vl-V9) permet une différenciation spécifique de souche de VIF.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention.

Claims (73)

    REVENDICATIONS 1) Séquences nucléotidiques issues de 1'ARN génomique du virus de l'immunodéficience féline (VIF), caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un fragment d'un gène présentant des zones hypervariables, choisi dans le groupe constitué par le gène codant pour la protéine env de la souche WO du VIF et le gène codant pour la protéine gag de la souche WO du VIF. 2 ) Séquence selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence en nucléotides et la séquence déduite en amino-acides de formule I ciaprès, qui correspond au gène env du VIF, souche WO 1/1 31/11 atg gca gaa ggg ttt gca gct aat aga caa tgg ata ggg cca Met ala glu gly phe ala ala asn arg gln trp ile gly pro
  1. 61/21 gaa gaa gct gaa gag cta tta gat ttt gat ata gca ata caa glu glu ala glu glu leu leu asp phe asp ile ala ile gln
  2. 91/31 121/41 atg aat gaa gaa ggg cca cta aat cca gga gta aac cca ttt met asn glu glu gly pro leu asn pro gly val asn pro phe
  3. 151/51 agg gta cct gga ata aca gaa gca gaa aag caa gaa tat tgt arg val pro gly ile thr glu ala glu lys gln glu tyr cys
  4. 181/61 aac ata tta caa ccc aag tta caa gat cta aag ggg aaa att asn ile leu gln pro lys leu gln asp leu lys gly lys ile 211/71 241/81 caa gag gta aaa ctg gaa gaa gga aat gca ggt aag ttt aga gln glu val lys leu glu glu gly asn ala gly lys phe arg
  5. 271/91 aga gca aga ttt tta aga tac tct gat gaa aca gta ttg tcc arg ala arg phe leu arg tyr ser asp glu thr val leu ser
  6. 301/101 331/111 cta att cac ttg ttc ata gga tat tgt cca cat tta tgc aga leu ile his leu phe ile gly tyr cys pro his leu cys arg
  7. 361/121 cga cat gaa tta gga tct tta aga cat gac ata gat ata gaa arg his glu leu gly ser leu arg his asp ile asp ile glu
  8. 391/131 gca ctt caa gaa gag cgt tat aat gat aga gag aag gga ata ala leu gln glu glu arg tyr asn asp arg glu lys gly ile 421/141 451/151 act gac aat ata aaa tat ggt aaa cga tgc tta ata gga aca thr asp asn ile lys tyr gly lys arg cys leu ile gly thr
  9. 481/161 gcg gtt ttg tac ctg ctt cta tct ttg gga ata ata ata cat ala val leu tyr leu leu leu ser leu gly ile ile ile his
  10. 511/171 541/181 aca tgc aag gct cag gta gta tgg aga ctt cca cca tta gta thr cys lys ala gln val val trp arg leu pro pro leu val
  11. 571/191 gtc cca gta gaa gaa tca gaa ata att ttt tgg gat tgt tgg val pro val glu glu ser glu ile ile phe trp asp cys trp
  12. 601/201 gca cca gag gaa ccc gcc tgt cag gac ttt ctt ggg gca atg ala pro glu glu pro ala cys gln asp phe leu gly ala met 631/211 661/221 ata cat cta aaa gct agt aca aat ata agt ata caa gag gga ile his leu lys ala ser thr asn ile ser ile gln glu gly
  13. 691/231 cct acc ctg ggg aat tgg gct aga gaa ata tgg gga aca tta pro thr leu gly asn trp ala arg glu ile trp gly thr leu
  14. 721/241 751/251 ttc aaa aag gct acc aga caa tgt aga aga ggt aga ata tgg phe lys lys ala thr arg gln cys arg arg gly arg ile trp
  15. 781/261 aga aga tgg aat gaa act ata aca gga ccg tta gga tgt gct arg arg trp asn glu thr ile thr gly pro leu gly cys ala
  16. 811/271 aat aat aca tgt tat aat atc tca gta ata gta cct gat tat asn asn thr cys tyr asn ile ser val ile val pro asp tyr 841/281 871/291 caa tgt tat cta gat aga gta gat act tgg tta caa ggg aaa gln cys tyr leu asp arg val asp thr trp leu gln gly lys
  17. 901/301 gta aat ata tca tta tgt cta aca gga gga aaa atg tta tat val asn ile ser leu cys leu thr gly gly lys met leu tyr
  18. 931/311 961/321 aat aaa gag aca aaa caa tta agc tat tgt aca gac cca tta asn lys glu thr lys gln leu ser tyr cys thr asp pro leu
  19. 991/331 caa atc cca ctg atc aat tat aca ttt gga cct aat caa aca gln ile pro leu ile asn tyr thr phe gly pro asn gln thr
  20. 1021/341 tgt atg tgg aac act tca cag atc caa gac cct gag ata cca cys met trp asn thr ser gln ile gln asp pro glu ile pro 1051/351 1081/361 aaa tgt gga tgg tgg aat caa aac gcc tat tat aat agt tgt lys cys gly trp trp asn gln asn ala tyr tyr asn ser cys
  21. 1111/371 aga tgg gaa cac aca gat gta cag ttt caa tgt caa agg aca arg trp glu his thr asp val gln phe gln cys gln arg thr
  22. 1141/381 1171/391 caa agt caa cca gga tca tgg att aga gca atc tcg tca tgg gln ser gln pro gly ser trp ile arg ala ile ser ser trp
  23. 1201/401 aaa caa agg aat aga tgg gaa tgg aga cca gac ttt gaa agt lys gln arg asn arg trp glu trp arg pro asp phe glu ser
  24. 1231/411 gaa aaa gta aaa gta tct cta cag tgt aat agc aca aaa aac glu lys val lys val ser leu gln cys asn ser thr lys asn 1261/421 1291/431 cta acc ttt gca atg aga agt tca gga gat tat gga gaa gta leu thr phe ala met arg ser ser gly asp tyr gly glu val
  25. 1321/441 aca gga gct tgg ata gag ttt gga tgt cat agg aca aaa tca thr gly ala trp ile glu phe gly cys his arg thr lys ser
  26. 1351/451 1381/461 aaa tat cat act gaa gca agg ttt aga att aga tgt aga tgg lys tyr his thr glu ala arg phe arg ile arg cys arg trp
  27. 1411/471 aat gta ggg gat aat acc tca ctc att gat aca tgt ggg gaa asn val gly asp asn thr ser leu ile asp thr cys gly glu
  28. 1441/481 act caa aat gtt tca aga gca aat cct gta gat tgt acc atg thr gln asn val ser arg ala asn pro val asp cys thr met 1471/491 1501/501 tat gca aat aga atg tat aac tgt tcc tta caa aac ggg ttt tyr ala asn arg met tyr asn cys ser leu gln asn gly phe
  29. 1531/511 act atg aag gta gat gac ctt atc atg cat ttt aat aag aca thr met lys val asp asp leu ile met his phe asn lys thr
  30. 1561/521 1591/531 aaa gct gta gag atg tat aac att gct gga aat tgg tct tgt lys ala val glu met tyr asn ile ala gly asn trp ser cys
  31. 1621/541 aaa tct gac ttg cca cca aca tgg ggg tat atg aat tgt aat lys ser asp leu pro pro thr trp gly tyr met asn cys asn
  32. 1651/551 tgt aca aat agt aca aat agt ggt act ggt ata agg atg gca cys thr asn ser thr asn ser gly thr gly ile arg met ala 1681/561 1711/571 tgt ccc aga aat caa ggc atc tta aga aat tgg tat aac cca cys pro arg asn gln gly ile leu arg asn trp tyr asn pro
  33. 1741/581 gta gca gga tta aga caa tcc tta gaa aag tat caa gtt gta val ala gly leu arg gln ser leu glu lys tyr gln val val
  34. 1771/591 1801/601 aaa caa cca gat tat tta gtg gta cca ggg gaa gtc atg gaa lys gln pro asp tyr leu val val pro gly glu val met glu
  35. 1831/611 tat aaa cct aga agg aaa aga gca gct att cat gtt atg tta tyr lys pro arg arg lys arg ala ala ile his val met leu
  36. 1861/621 gct ctt gca aca gta tta tct atg gct gga gca ggg acg ggg ala leu ala thr val leu ser met ala gly ala gly thr gly 1891/631 1921/641 gct act gct ata ggg atg gta aca caa tat caa caa gtg ctg ala thr ala ile gly met val thr gln tyr gln gln val leu
  37. 1951/651 gca act cat caa gaa gct ata gaa aag gtg act gaa gcc tta ala thr his gln glu ala ile glu lys val thr glu ala leu
  38. 1981/661 2011/671 aag ata aac aac tta aga tta gtt aca tta gag cat caa gta lys ile asn asn leu arg leu val thr leu glu his gln val
  39. 2041/681 cta gta ata gga tta aaa gta gaa gct atg gaa aaa ttt tta leu val ile gly leu lys val glu ala met glu lys phe leu
  40. 2071/691 tat aca gct ttc gct atg caa gaa tta gga tgt aat caa aat tyr thr ala phe ala met gln glu leu gly cys asn gln asn 2101/701 2131/711 caa ttc ttc tgt aaa gtc cct tct gca ttg tgg gaa cgg tat gln phe phe cys lys val pro ser ala leu trp glu arg tyr
  41. 2161/721 aat atg act ata aat caa aca ata tgg aat cat gga aat ata asn met thr ile asn gln thr ile trp asn his gly asn ile
  42. 2191/731 2221/741 act ttg ggg gaa tgg tat aac caa aca aaa gat tta caa caa thr leu gly glu trp tyr asn gln thr lys asp leu gln gln
  43. 2251/751 agg ttt tat gaa ata ata atg gac ata gaa caa aat aat gta arg phe tyr glu ile ile met asp ile glu gln asn asn val
  44. 2281/761 caa ggg aaa aaa ggg cta caa caa ctc cag gag tgg gaa gat gln gly lys lys gly leu gln gln leu gln glu trp glu asp 2311/771 2341/781 tgg gta gga tgg ata gga aat att cca caa tat tta aag gga trp val gly trp ile gly asn ile pro gln tyr leu lys gly
  45. 2371/791 cta ttg gga ggt atc ttg gga ata gga tta gga atg tta tta leu leu gly gly ile leu gly ile gly leu gly met leu leu
  46. 2401/801 2431/811 ttg atc tta tgt tta cct aca ttg gtt gat tgt ata aga aat leu ile leu cys leu pro thr leu val asp cys ile arg asn
  47. 2461/821 tgt atc cac aag ata ctg gga tac aca gta att gca atg cct cys ile his lys ile leu gly tyr thr val ile ala met pro
  48. 2491/831 gaa gta gaa gaa gaa gaa ata caa cca caa atg gaa ttg agg glu val glu glu glu glu ile gln pro gln met glu leu arg 2521/841 2551/851 aga aat ggt agg caa tgt ggc atg tct gaa aaa gag gag gaa arg asn gly arg gln cys gly met ser glu lys glu glu glu tga tga
    OPA OPA (I)
    3 ) Séquence selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence en nucléotides et la séquence déduite en amino-acides de formule II ciaprès, qui correspond au gène gag du VIF, souche WO 1/1 31/11
    ATG GGG AAC GGA CAG GGG CGA GAT TGG AAA ATG GCC ATT AAG
    Met gly asn gly gln gly arg asp trp lys met ala ile lys
  49. 61/21
    AGA TGC AGT AAT GGT GCT GTA GGA GTA GGG CGC AAG AGT AAA arg cys ser asn gly ala val gly val gly gly lys ser lys
  50. 91/31 121/41
    AAA TTT GGA GAA GGG AAT TTC AGA TGG GCC ATC AGA ATG GCT lys phe gly glu gly asn phe arg trp ala ile arg met ala
  51. 151/51
    AAC GTA TCT ACA GGA CGA GAA CCT GGT GAT ATA CCA GAG ACT asn val ser thr gly arg glu pro gly asp ile pro glu thr
  52. 181/61
    TTA GAT CAA CTA AGG TTG GTT ATT TGC GAT TTA CAA GAG AGA leu asp gln leu arg leu val ile cys asp leu gln glu arg 211/71 241/81
    AGA GAA AAA TTT GGA TCT AGT AAA GAA ATT GAC ATG GCA ATT arg glu lys phe gly ser ser lys glu ile asp met ala ile
  53. 271/91
    GCT GCA TTA AAA GTC TTT GCA GTA GTG GGA CTT TTA AAT ATG ala ala leu lys val phe ala val val gly leu leu asn met
  54. 301/101 331/111
    ACA GTG TCT ACT GCT GCT GCA GCT GAA AAT ATG TAT ACT CAG thr val ser thr ala ala ala ala glu asn met tyr thr gln
  55. 361/121
    ATG GGT TTA GAC ACC AGA CCA TCT ACA AAA GAG GCA GGA GGA met gly leu asp thr arg pro ser thr lys glu ala gly gly
  56. 391/131
    AAA GAG GAA GGC CCT CCA CAG GCA TAT CCT ATT CAA ACA GTA lys glu glu gly pro pro gln ala tyr pro ile gln thr val 421/141 451/151
    AAT GGA ACA ACA CAA TAT GTA GCA CTT GAC CCA AAA ATG GTG asn gly thr thr gln tyr val ala leu asp pro lys met val
  57. 481/161
    TCC ATT TTT ATG GAA AAG GCA AGA GAA GGA TTA GGA GGT GAG ser ile phe met glu lys ala arg glu gly leu gly gly glu
  58. 511/171 541/181
    GAA GTT CAA TTA TGG TTT ACA GCC TTC TCT GCA AAT TTA ACA glu val gln leu trp phe thr ala phe ser ala asn leu thr
  59. 571/191
    CCT ACT GAC ATG GCC ACA TTA ATA ATG GCT CGA CCA CGC TGC pro thr asp met ala thr leu ile met ala arg pro gly cys
  60. 601/201
    GCT GCA GAT AAA GAA ATA TTG GAT GAA AGC TTA AAG CAA TTA ala ala asp lys glu ile leu asp glu ser leu lys gln leu 631/211 661/221
    ACA GCA GAA TAT GAT CGC ACG CAT CCC CCT GAT GGT CCT AGA thr ala glu tyr asp arg thr his pro pro asp gly pro arg
  61. 691/231
    CCA TTA CCC TAT TTT ACT GCA GCA GAA ATC ATG GGT ATA GGA pro leu pro tyr phe thr ala ala glu ile met gly ile gly
  62. 721/241 751/251
    TTA ACT CAA GAA CAA CAA GCA GAA GCA AGA TTT GCA CCA GCT leu thr gln glu gln gln ala glu ala arg phe ala pro ala
  63. 781/261
    AGG ATG CAG TGT AGA GCA TGG TAT CTC GAG GCA TTA GGA AAA arg met gln cys arg ala trp tyr leu glu ala leu gly lys
  64. 811/271
    TTG GCT GCC ATA AAA GCT AAA TCT CCT CGA GCT GTG CAG TTA leu ala ala ile lys ala lys ser pro arg ala val gln leu 841/281 871/291
    AGA CAA GGA GCC AAA GAA GAT TAT TCA TCC TTT ATA GAT AGA arg gln gly ala lys glu asp tyr ser ser phe ile asp arg
  65. 901/301
    TTG TTT GCC CAA ATA GAT CAA GAA CAA AAT ACA GCT GAA GTT leu phe ala gln ile asp gln glu gln asn thr ala glu val
  66. 931/311 961/321
    AAG TTA TAT CTA AAA CAG TCA TTA AGC ATA GCT AAT GCT AAT lys leu tyr leu lys gln ser leu ser ile ala asn ala asn
  67. 991/331
    GCA GAC TGC AAA AAG GCA ATG AGT CAT CTT AAG CCA GAA AGT ala asp cys lys lys ala met ser his leu lys pro glu ser
  68. 1021/341
    ACC CTA GAA GAA AAG TTG AGA GCT TGT CAA GAG ATA GGA TTC thr leu glu glu lys leu arg ala cys gln glu ile gly phe 1051/351 1081/361
    CCA GGA TAT AAG ATG CAG CTC TTA GCA GAA GCC CTT ACA AAA pro gly tyr lys met gln leu leu ala glu ala leu thr lys
  69. 1111/371
    GTT CAA GTA GTA CAA TCA AAA GGA CCA GGA CCA GTG TGT TTT val gln val val gln ser lys gly pro gly pro val cys phe
  70. 1141/381 1171/391
    AAT TGT AAA AGA CCA GGG CAT CTA GCA AGA CAG TGC AGA GAT asn cys lys arg pro gly his leu ala arg gln cys arg asp
  71. 1201/401
    GTG AAA AAA TGT AAT AAA TGC GGA AAG CCT GGT CAT TTA GCT val lys lys cys asn lys cys gly lys pro gly his leu ala
  72. 1231/411
    GCC AAA TGT TGG CAA GGT GGT AAA AAG AAT TCG GGA AAC TGG ala lys cys trp gln gly gly lys lys asn ser gly asn trp 1261/421 1291/431
    AAG GCG GGA CGA GCT GCA GCC CCA GTG AAT CAA GTG CAG CAA lys ala gly arg ala ala ala pro val asn gln val gln gln
  73. 1321/441
    GCA GTA ATG CCA TCT GCA CCT CCA ATG GAG GAG AAA CTA TTG ala val met pro ser ala pro pro met glu glu lys leu leu
    GAT TTG asp leu (Il)
    4 ) Produit de transcription du VIF, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment correspondant aux nucléotides 1-2562 de la séquence de formule I selon la revendication 2.
    5 ) Produit de transcription du VIF, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment correspondant aux nucléotides 1-1350 de la séquence de formule II selon la revendication 3.
    6 ) Fragments ou combinaisons de fragments d'une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il code pour un peptide ou un fragment de peptide de la souche WO du
    VIF, comprenant un épitope ayant la capacité d'induire une réponse immune, lesquels fragments sont spécifiques de souche.
    7 ) Fragment selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend 141 paires de bases et en ce qu'il correspond aux nucléotides 76-216, de la séquence de formule I.
    8 ) Fragment selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend 236 paires de bases et en ce qu'il correspond aux nucléotides 286-522 de la séquence de formule I.
    9 ) Fragment selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend 186 paires de bases et en ce qu'il correspond aux nucléotides 1081-1266 de la séquence de formule I.
    10-) Fragment selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend 38 paires de bases et en ce qu'il correspond aux nucléotides 1354-1491 de la séquence de formule I.
    11') Fragment selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend 90 paires de bases et en ce qu'il correspond aux nucléotides 1621-1710 de la séquence de formule I.
    12 ) Fragment selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend 81 paires de bases et en ce qu'il correspond aux nucléotides 1756-1836 de la séquence de formule I.
    13') Fragment selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend 27 paires de bases et en ce qu'il correspond aux nucléotides 2128-2154 de la séquence de formule I.
    14-) Fragment selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend 61 paires de bases et en ce qu'il correspond aux nucléotides 2293-2334 de la séquence de formule I.
    15-) Fragment selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend 33 paires de bases et en ce qu'il correspond aux nucléotides 2494-2526 de la séquence de formule I.
    16-) Sondes nucléotidiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence nucléotidique ou un fragment de celle-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, éventuellement marqué à l'aide d'un marqueur tel qu'un isotope radioactif, une enzyme appropriée ou toute autre substance non radioactive appropriée.
    17-) Paires d'amorces pour la synthèse d'un
    ADNc ou d'un ARN de VIF de souche WO, caractérisé en ce que chaque amorce comprend une séquence homologue ou complémentaire d'une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 15.
    18-) Fragments peptidiques, caractérisés en ce qu'ils sont codés par un fragment de séquence nucléotidique sqelon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et en ce qu'ils constituent des zones variables des protéines du VIF.
    19 ') Fragment selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 47 aminoacides, dénommé V1, et correspondant aux positions d'amino-acides 26-72 de la séquence de formule I.
    20') Fragment selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 79 aminoacides, dénommé V2, et correspondant aux positions d'amino-acides 96-174 de la séquence de formule I.
    21-) Fragment selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 62 aminoacides, dénommé V3, et correspondant aux positions d'amino-acides 361-422 de la séquence de formule I.
    22 ) Fragment selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 46 aminoacides, dénommé V4, et correspondant aux positions d'amino-acides 452-497 de la séquence de formule I.
    23 ) Fragment selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 30 aminoacides, dénommé V5, et correspondant aux positions d'amino-acides 541-570 de la séquence de formule I.
    24 ) Fragment selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 27 aminoacides, dénommé V6, et correspondant aux positions d'amino-acides 586-612 de la séquence de formule I.
    25 ) Fragment selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 9 aminoacides, dénommé V7, et correspondant aux positions d'amino-acides 710-718 de la séquence de formule I.
    26 ) Fragment selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 14 aminoacides, dénommé V8, correspondant aux positions d'aminoacides 765-778 de la séquence de formule I.
    27 ) Fragment selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il inclut un segment de 11 aminoacides, dénommé V9, et correspondant aux positions d'amino-acides 832-842 de la séquence de formule I.
    28 ) Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 15.
    29 ) Vecteur selon la revendication 28, caractérisé en ce qu'il est constitué par un plasmide comprenant une origine de réplication, au moins un marqueur de sélection et une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, lequel vecteur est un vecteur de clonage.
    30') Vecteur selon la revendication 29, caractérisé en ce que ledit vecteur de clonage est constitué par un plasmide capable de se répliquer dans E. coli, dans lequel est inséré une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 15.
    31-) Vecteur selon la revendication 30, caractérisé en ce qu'il a été déposé auprès de la Collection
    Nationale de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur, le 12 juin 1992 sous le n I-1220 et est dénommé pKSel.
    32 ) Vecteur selon la revendication 28, caractérisé en ce qu'il est constitué par un vecteur recombinant comprenant une origine de réplication dans un microorganisme hôte approprié, notamment une bactérie ou une cellule eucaryote, au moins un gène dont l'expression permet la sélection soit des bactéries, soit des cellules eucaryotes ayant reçu ledit vecteur, un promoteur permettant l'expression des gènes dans lesdites bactéries ou cellules eucaryotes, et dans lequel est insérée une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, lequel vecteur est un vecteur d'expression d'un peptide, d'un fragment de peptide ou d'une combinaison de fragments de peptides du VIF de souche WO (protéine env ou protéine gag), ayant les propriétés desdites protéines
    33 ) Vecteur selon la revendication 32, caractérisé en ce qu'il est constitué par un phage kgtll dans lequel est inséré, en phase au niveau de son site, EcoRI, des fragments de digestion à la DNAse du plasmide pKSeî.
    34 ) Procédé de détection d'une infection à
    VIF, caractérisé en ce qu'il consiste à détecter un VIF, à l'aide d'au moins une sonde nucléotidique ou un fragment de sonde nucléotidique selon la revendication 16, en mettant en présence l'échantillon à analyser avec ladite/lesdites sondes nucléotidiques, à laquelle/ auxquelles se lie 1'ARN génomique ou les produits de transcription du virus d'immunodéficience féline, si de tels produits sont présents dans l'échantillon, la lec ture du résultat étant révélée par un moyen approprié, notamment EA, RA, fluorescence.
    35 ) Procédé selon la revendication 34, caractérisé en ce que préalablement à l'hybridation avec lesdites sondes, on amplifie la séquence nucléique à détecter (ARN génomique ou ARN messager du VIF WO) par la méthode d'amplification dite PCR (réaction de polymérisation en chaîne à l'aide d'une polymérase appropriée, notamment la Taq polymérase) en utilisant une paire d'amorces selon la revendication 17.
    36 ) Kit, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé de détection d'une infection à VIF selon la revendication 35, caractérisé en ce qu'il comprend outre des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection, des doses appropriées d'au moins une sonde et/ou fragment de sonde nucléotidique selon la revendication 16 et éventuellement des doses appropriées d'au moins deux amorces selon la revendication 17.
    37 ) Réactif de différenciation de souche de
    VIF, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par les fragments V selon l'une quelconque des revendications 18 à 27.
    38 ) Procédé de différenciation de souche de
    VIF, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre au moins un réactif de différenciation selon la revendication 37.
FR9207257A 1992-06-16 1992-06-16 Séquences nucléotidiques issues de la souche WO du vif et leurs fragments, applications desdites séquences à l'expression de peptides immunogènes et au diagnostic de l'immunodéficience féline. Expired - Lifetime FR2692279B1 (fr)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9207257A FR2692279B1 (fr) 1992-06-16 1992-06-16 Séquences nucléotidiques issues de la souche WO du vif et leurs fragments, applications desdites séquences à l'expression de peptides immunogènes et au diagnostic de l'immunodéficience féline.
DE69333636T DE69333636T2 (de) 1992-06-16 1993-06-16 Nukleotid- und Peptidsequenzen des Immunschwächevirus der Katze, Isolat WO und Anwendungen der Sequenzen in der Diagnostik und zur Verhinderung der Infektion
EP93401538A EP0577458B1 (fr) 1992-06-16 1993-06-16 Séquences nucléotidiques et peptidiques issues de la souche Wo du VIF et applications desdites séquences au diagnostic et à la prévention de l'immunodéficience féline
AT93401538T ATE278018T1 (de) 1992-06-16 1993-06-16 Nukleotid- und peptidsequenzen des immunschwächevirus der katze, isolat wo und anwendungen der sequenzen in der diagnostik und zur verhinderung der infektion

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9207257A FR2692279B1 (fr) 1992-06-16 1992-06-16 Séquences nucléotidiques issues de la souche WO du vif et leurs fragments, applications desdites séquences à l'expression de peptides immunogènes et au diagnostic de l'immunodéficience féline.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FR2692279A1 true FR2692279A1 (fr) 1993-12-17
FR2692279B1 FR2692279B1 (fr) 1995-05-19

Family

ID=9430777

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FR9207257A Expired - Lifetime FR2692279B1 (fr) 1992-06-16 1992-06-16 Séquences nucléotidiques issues de la souche WO du vif et leurs fragments, applications desdites séquences à l'expression de peptides immunogènes et au diagnostic de l'immunodéficience féline.

Country Status (1)

Country Link
FR (1) FR2692279B1 (fr)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990013573A1 (fr) * 1989-05-08 1990-11-15 Idexx Corporation Polypeptides de l'antivirus lymphotropiques de cellules t du chat
EP0403333A2 (fr) * 1989-06-02 1990-12-19 Institut Pasteur Séquences nucléotidiques issues du génome des rétrovirus du typ hiv-1, hiv-2 et siv, et leurs applications notamment pour l'amplification des génomes de ces rétrovirus et pour le diagnostic in-vitro des infections dues à ces virus
JPH04126085A (ja) * 1990-05-11 1992-04-27 Tonen Corp ネコ免疫不全ウイルスの遺伝子ｒｎａに相補性を示すｄｎａ
FR2669338A1 (fr) * 1990-11-21 1992-05-22 Centre Nat Rech Scient Fragments peptidiques issus de la proteine externe du vif, anticorps antifragments, application de ceux-ci au diagnostic et/ou au traitement de l'immunodeficience feline.
WO1992015684A1 (fr) * 1991-02-28 1992-09-17 Cambridge Biotech Corporation Glycoproteine 160 fiv et proteine p24 gag recombinee

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990013573A1 (fr) * 1989-05-08 1990-11-15 Idexx Corporation Polypeptides de l'antivirus lymphotropiques de cellules t du chat
EP0403333A2 (fr) * 1989-06-02 1990-12-19 Institut Pasteur Séquences nucléotidiques issues du génome des rétrovirus du typ hiv-1, hiv-2 et siv, et leurs applications notamment pour l'amplification des génomes de ces rétrovirus et pour le diagnostic in-vitro des infections dues à ces virus
JPH04126085A (ja) * 1990-05-11 1992-04-27 Tonen Corp ネコ免疫不全ウイルスの遺伝子ｒｎａに相補性を示すｄｎａ
FR2669338A1 (fr) * 1990-11-21 1992-05-22 Centre Nat Rech Scient Fragments peptidiques issus de la proteine externe du vif, anticorps antifragments, application de ceux-ci au diagnostic et/ou au traitement de l'immunodeficience feline.
WO1992015684A1 (fr) * 1991-02-28 1992-09-17 Cambridge Biotech Corporation Glycoproteine 160 fiv et proteine p24 gag recombinee

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARCHIVES OF VIROLOGY vol. 123, no. 1-2, 11 Mars 1992, VIENNE, AUTRICHE pages 29 - 45 N. MAKI ET AL. 'Molecular characterization and heterogeneity of feline immunodeficiency virus isolates' *
DATABASE WPIL Week 9223, Derwent Publications Ltd., London, GB; AN 92-189672 (23) & JP-A-4 126 085 (TONEN CORP) 27 Avril 1992 *
DATABASE WPIL Week 9240, Derwent Publications Ltd., London, GB; AN 92-331730 (40) & WO-A-9 215 684 (CAMBRIDGE BIOTECH CORP) 17 Septembre 1992 *
JOURNAL OF VIROLOGY vol. 64, no. 10, Octobre 1990, BALTIMORE, US pages 4605 - 4613 T.R. PHILLIPS ET AL. 'Comparison of two host cell range variants of feline immunodeficiency virus' *
JOURNAL OF VIROLOGY vol. 66, no. 2, Février 1992, BALTIMORE, US pages 1091 - 1097 K.H.J. SIEBELINK ET AL. 'Isolation and partial characterization of infectious molecular clones of feline immunodeficiency virus obtained directly from bone marrow DNA of a naturally infected cat' *
VIRUS RESEARCH vol. 21, no. 1, 1991, AMSTERDAM, NL pages 53 - 63 S. MORIKAWA ET AL. 'Identification of conserved and variable regions in the envelope glycoprotein sequences of two feline immunodeficiency viruses isolated in Zurich, Switzerland' *

Also Published As

Publication number Publication date
FR2692279B1 (fr) 1995-05-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1497467B1 (fr) Oligonucleotide issus des sequences codant pour la composante de surface des proteines d&#39;enveloppe des ptlv et leurs utilisations
EP1916304B1 (fr) Polypeptides antigéniques associés à la sclérose en plaques et utilisations
Kozutsumi et al. Identification of immunoglobulin heavy chain binding protein as glucose-regulated protein 78 on the basis of amino acid sequence, immunological cross-reactivity, and functional activity
EP0577458B1 (fr) Séquences nucléotidiques et peptidiques issues de la souche Wo du VIF et applications desdites séquences au diagnostic et à la prévention de l&#39;immunodéficience féline
CA1340839C (fr) Proteines et leurs procede de preparation, sequences d&#39;adn, anticorps et leur application, poxvirus, cellules transformees ou infectees, compositions pharmaceutiques utiles dans la prevention de la schistosomose et applications a titre d&#39;agent presentant une activite glutathion-s-transferase
WO1997028186A1 (fr) PROTEINE PURIFIEE SR-p70
WO2001031021A9 (fr) Superantigene lie a la sclerose en plaques
CA2298834C (fr) Sequences retroviraux endogenes, associees a des maladies auto-immunes et/ou a des perturbations de la grossesse
EP0550691B1 (fr) Peptides inducteurs d&#39;anticorps inhibant des retrovirus du type hiv et anticorps diriges contre ces peptides
FR2692279A1 (fr) Séquences nucléotidiques issues de la souche WO du vif et leurs fragments, applications desdites séquences à l&#39;expression de peptides immunogènes et au diagnostic de l&#39;immunodéficience féline.
EP1612270B1 (fr) Matérial nucléique retroviral et fragments nucléotidiques, associés à la sclérose en plaques, à des fins de diagnostic, prophylactiques et thérapeutiques
WO2001096564A2 (fr) Isoforme d&#39;hla-g (hla-g7) et ses applications
CA2173957C (fr) Nouvel antigene de trypanosoma cruzi, et gene codant pour cette derniere; leur application a la detection de la maladie de chagas
WO1998030699A1 (fr) Polynucleotide codant pour un polypeptide de 27 kd de mycobacteries appartenant au complexe de mycobacterium tuberculosis, application au diagnostic et a la prevention de la tuberculose
CA2193997A1 (fr) Fragments d&#39;acide nucleique et fragments peptidiques correspondants issus du genome du virus de l&#39;arthrite et de l&#39;encephalite caprine (vaec) et leurs applications
EP1147187B1 (fr) Procédé de détection d&#39;un fragment nucléique endogène associé à une maladie auto-immune
FR2645173A1 (fr) Clonage et expression de genes codant pour des peptides et/ou des fragments de peptides du virus mokola, application a la preparation d&#39;un v
WO1991013987A2 (fr) Adnc codante pour le gene n du virus de la septicemie hemorragique virale et ses utilisations
FR2994193A1 (fr) Souches mutantes de neospora et leurs utilisations
CA2245242C (fr) Proteine purifiee sr-p70
EP1254233A1 (fr) Utilisation d&#39;une proteine de leptospire pour la prevention et/ou le diagnostic et/ou le traitement de la leptospirose animale et/ou humaine
FR2659350A1 (fr) Sequences nucleotidiques issues de l&#39;arn genomique du virus de la septicemie hemorragique virale, applications a la synthese ou a la detection d&#39;acides nucleiques, produits d&#39;expression de ces sequences et application desdits produits a la prevention et au diiagnostic de la septicemie hemorragique virale.
WO2001062937A1 (fr) Sequences retrovirales associees a des affections cutanees
FR2692269A1 (fr) Peptides immunogènes et/ou neutralisants de vif de souche WO et leurs applications au diagnostic et à la prévention de l&#39;immunodéficience féline.
FR2705970A1 (fr) Identification du gène de l&#39;adhésine de M. Pirum.