WO2001096564A2 - Isoforme d'hla-g (hla-g7) et ses applications - Google Patents

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WO2001096564A2
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peptide
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Edgardo Delfino Carosella
Pascale Paul
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Commissariat A L'energie Atomique
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Definitions

  • the present invention relates to a new isoform of soluble HLA-G (HLA-G7) and to its applications, linked to its immunomodulatory properties, for the diagnosis of autoimmune diseases and the risks of repeat abortion and the treatment, in immunity-related disorders.
  • the antigens of the major histocompatibility complex are divided into several classes, the class I antigens (HLA-A, HLA-B and HLA-C) which have 3 globular domains ( ⁇ 1, ⁇ 2 and ⁇ 3), and whose ⁇ 3 domain is associated with ⁇ 2 microglobulin, class II antigens (HLA-DP, HLA-DQ and HLA-DR) and class III antigens (complement).
  • class I antigens HLA-A, HLA-B and HLA-C
  • HLA-C 3 globular domains ( ⁇ 1, ⁇ 2 and ⁇ 3), and whose ⁇ 3 domain is associated with ⁇ 2 microglobulin
  • class II antigens HLA-DP, HLA-DQ and HLA-DR
  • class III antigens complement
  • the class I antigens include, in addition to the abovementioned antigens, other antigens, called non-classical class I antigens, and in particular the HLA-E, HLA-F and HLA-G antigens.
  • HLA-G gene (HLA-6.0 gene) has been described by GERAGHTY et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 9145-9149): it comprises 4396 base pairs and has an intron / exon organization homologous to that of the HLA-A, -B and -C genes.
  • this gene includes 8 exons, 7 introns and a 3 * untranslated end; the 8 exons correspond respectively to: exon 1: signal sequence, exon 2 extracellular domain ⁇ 1, exon 3: extracellular domain ⁇ 2, exon 4 extracellular domain ⁇ 3, exon 5: transmembrane region, exon 6 cytoplasmic domain I, exon 7: cytoplasmic domain II (untranslated), exon 8: cytoplasmic domain III (untranslated) and 3 'untranslated region (GERAGHTY et al., cited above; ELLIS et al., J. Immunol., 1990, 144, 731-735; KIRSZENBAUM M.
  • HLA-G gene differs from other class I genes in that the translation termination codon, in phase, is located at the second codon of exon 6; as a result, the cytoplasmic region of the protein encoded by this HLA-6.0 gene is shorter than that of the cytoplasmic regions of the HLA-A, -B and -C proteins.
  • HLA-G antigens are mainly expressed by cytotrophoblastic cells of the placenta and are considered to play a role in the protection of the fetus (absence of rejection by the mother).
  • the HLA-G antigen since the HLA-G antigen is monomorphic, it may also be involved in the growth or function of placental cells (KOVATS et al., Science, 1990, 248, 220-223).
  • the primary transcript of the HLA-G gene can be spliced in several ways and produces at least 3 distinct mature mRNAs: the primary HLA-G transcript provides a complete copy (G1) of 1,200 bp, a fragment of 900 bp (G2) and a fragment of 600 bp (G3).
  • the G1 transcript does not include exon 7 and corresponds to the sequence described by ELLIS et al.
  • the G2 mRNA does not include exon 3, that is to say that it codes for a protein in which the domains ⁇ 1 and ⁇ 3 are directly joined; the G3 mRNA contains neither exon 3 nor exon 4, that is to say that it codes for a protein in which the ⁇ 1 domain and the transmembrane sequence are directly joined.
  • the splicing which prevails for obtaining the HLA-G2 antigen involves the joining of an adenine (A) (originating from the domain coding for ⁇ 1) with an AC sequence (originating from the domain coding for ⁇ 3), which leads to the creation an AAC codon (asparagine) in place of the GAC codon (aspartic acid), encountered at the start of the sequence coding for the ⁇ 3 domain in HLA-G1.
  • A adenine
  • AC sequence originating from the domain coding for ⁇ 3
  • the splicing generated to obtain HLA-G3 does not cause the formation of a new codon in the splicing zone.
  • the Authors of this article have also analyzed the different proteins expressed: the 3 mRNAs are translated into protein in the .221 -G cell line.
  • the Authors of this article conclude that the HLA-G molecule plays a fundamental role in protecting the fetus from a maternal immune response (induction of immune tolerance). Some of the inventors have confirmed this role: the HLA-G molecules, expressed on the surface of the trophoblasts effectively protect fetal cells from lysis by maternal natural killer (NK) cells (CAROSELLA ED et al., CR Acad. Sci., 318, 827-830; CAROSELLA ED et al; ImmunoL Today, 1996, 407-409).
  • NK maternal natural killer
  • HLA-G4 transcript which does not include exon 4
  • HLA-G5 transcript which includes intron 4, between exons 4 and 5, thus causing a modification of the reading frame, during the translation of this transcript and in particular the appearance of a stop codon, after l amino acid 21 of intron 4
  • HLA-G6 transcript having intron 4, but having lost exon 3
  • HLA-G mRNAs which potentially encode 6 isoforms of HLA-G including 4 membranes (HLA-G1, G2, G3 and G4) and 2 soluble G5 and G6.
  • NK cells express receptors for MHC class I molecules (killer inhibitory receptors or KIR or NKIR for NK inhibitor receptors), which are responsible for the inhibition of cytotoxicity, when these HLA molecules, acting as ligands, are recognized by these receivers; for example, N. ROUAS-FREISS et al. (PNAS, 1997, 94, 5249-5254) showed that the expression of HLA-G protected from lysis, the target cells K562 (erythroleukemic cell line), transfected with the HLA-G gene; these cells are usually sensitive to NK cells. In this article, some of the inventors have also shown that the expression of the ⁇ 1 domain of HLA-G, in said transfected target cells, was necessary and sufficient to inhibit NK function.
  • MHC class I molecules killer inhibitory receptors or KIR or NKIR for NK inhibitor receptors
  • NK cells do not express any HLA-G transcript, this result confirming that the expression products of the HLA-G gene play a role in immunotolerance (TEYSSIER M. et al., Nat. ImmunoL, 1995, 14, 262-270).
  • the inventors, continuing their work have shown that certain solid tumors express the HLA-G antigen, that according to the tumor lines, the expression profile of the membrane and soluble HLA-G isoforms was different and that the presence of the membrane forms HLA-G1-G4 protected tumor cells from lysis induced by NK cells (application FR 2 775 294).
  • HLA-G7 a new alternative transcript of the HLA-G gene, encoding a new soluble isoform of HLA-G, called HLA-G7.
  • the subject of the present invention is a cDNA sequence, derived from an mRNA of the human HLA-G gene of the major histocompatibility complex, isolated from human cells of the trophoblastic type, characterized:
  • isoform HLA-G7 • in that it codes for a soluble HLA-G isoform called isoform HLA-G7 and • in that it has the sequence SEQ ID NO: 1, which comprises from 5 'to 3': a sequence coding for the peptide signal (exon 1), a sequence coding for the ⁇ 1 domain (exon 2), a sequence corresponding to the 5 ′ end of intron 2 coding for 2 amino acids, respectively (Ser and Glu), immediately followed by a stop codon.
  • the present invention also relates to a fragment of an mRNA of the human HLA-G gene of the major histocompatibility complex, isolated from human cells of the trophoblastic type, characterized in that 'it includes the sequence SEQ ID NO: 1 as defined above and in that it presents SEQ ID NO: 2 which successively contains from 5' to 3 ': 17 non-coding nucleotides, exon 1, exon 2 and 94 nucleotides from the 5 'end of HLA-G intron 2.
  • HLA-G7 transcript results from a newly characterized alternative splicing and includes intron 2, thus causing a modification of the reading frame, during the translation of this transcript and the appearance of a stop codon after amino acid 2 of intron 2.
  • a transcript is detected abundantly in the cells of trophoblast, placenta, amniotic membrane, in epithelial cells of the human thymus as well as in biopsies of melanoma tumor lesions, kidney cancer and breast cancer.
  • This transcript is not detected in other types of healthy adult tissue, especially the skin and peripheral blood mononuclear cells, as well as in tissues of materno-fetal origin such as the umbilical cord and the fetal liver of first trimester of gestation.
  • the present invention also relates to fragments of the sequence SEQ ID NO: 2, characterized in that they allow the specific detection of the HLA-G7 transcript (probe or primer) and in that they are selected from the group consisting of: a) SEQ ID NO: 3 which corresponds to the specific exon 2- intron 2 junction of the HLA-G7 transcript (positions 348 to 453) of SEQ ID NO: 2), b) SEQ ID NO sequences : 5 and 6 and c) the nucleotide sequences complementary to the preceding sequences, the fragments of at least 15 nucleotides derived from the preceding sequences and their complementary sequences.
  • nucleic sequence or nucleotide sequence means one of the sequences as defined above, in RNA or DNA form, as well as their complementary sequences (antisense sequences).
  • Preferred primer pairs are:
  • the present invention also relates to an antisense oligonucleotide, characterized in that it is capable of inhibiting the transcription of an HLA-G transcript and in that it is selected from the group consisting of the sequences of minus 15 nucleotides complementary to SEQ ID NO: 2.
  • the present invention also relates to the use of the oligonucleotide as defined above for the preparation of a medicament capable of breaking immune tolerance, intended for the treatment of tumors expressing at least one HLA-G transcript.
  • the present invention also relates to the use of the oligonucleotide as defined above for the preparation of a medicament capable of breaking immune tolerance, intended for the treatment of viral infections interfering with the expression of HLA-G , including infection with the CMV virus or the HTLV virus.
  • the present invention also relates to an isolated and optionally purified HLA-G protein, called soluble HLA-G7 protein, characterized: in that it is coded by the sequence SEQ ID NO: 1 as defined above, in that it is constituted by the ⁇ 1 domain of the HLA-G molecule, followed by 2 amino acids encoded by intron 2 of the HLA-G gene,
  • HLA-G7 transcript inserted into an expression vector and transfected into human cells, produces a protein whose size corresponds to that of a protein having only the ⁇ 1 domain of HLA-G.
  • soluble HLA-G7 isoform which only comprises domain 1 has specific immunomodulatory properties and plays an important role in the inhibition of immune functions, associated with the states of physiological tolerance (fetal-maternal tolerance) or pathological tolerance (tumors, autoimmune diseases, viral infections).
  • the inventors have thus shown that: in women who, due to a mutation in the homozygous state, have lost the capacity to code for the HLA-G isoforms comprising domains other than the ⁇ 1 domain, the maintenance of pregnancy is related to the ability to code for the HLA-G3 and HLA- isoforms
  • these two isoforms comprising only the domain ⁇ 1, among the extracellular domains, inhibits immune functions and allows the establishment of fetal-maternal tolerance, in patients with a pathology of pregnancy such as pre-eclampsia, there is a deficit of HLA-G, - the HLA-G7 transcript is abundant in the thymus, the trophoblast, the amniotic membrane, in certain breast tumors, in particular in young patients, as well as in certain melanomas and the transcription of this HLA-G7 isoform is activated under the effect of various stimuli, including I L10, interferon ⁇ , stress (thermal and heavy metals), treatment with butyrate and demethylating agents.
  • I L10 interferon ⁇
  • stress thermal and heavy metals
  • the HLA-G7 isoform has the following advantages: it is soluble and therefore easy to produce and to purify; Unlike other soluble HLA-G isoforms, it is not associated with ⁇ 2 microglobulin and can therefore be produced and purified in active form without the need to co-express ⁇ 2 microglobulin. it has a significantly higher bioavailability than the other soluble HLA-G isoforms, due to a lower molecular weight (17 kDa vs 39 kDa for HLA-G5), which allows it to interact with a larger number of receivers.
  • TcR T cell receptor
  • the isolated HLA-G7 isoform is perfectly suited to the preparation of an immunomodulatory drug, with respect to cytotoxic NK, T cells, monocytes, macrophages, dendritic cells. , B cells or other effector cells having a receptor which uses the ⁇ 1 domain of HLA-G as a ligand.
  • it can be used in detection methods tion, targeting, depletion, isolation and modulation (activation or inhibition) of the activity of said effector cells which are based on the receptor / ligand interaction of said cells with domain 1 of said isolated HLA-G protein.
  • the present invention also relates to specific peptides of HLA-G7 characterized in that they have the sequence X-Ala-Ser-Glu, where X is a fragment of 3 to 112 amino acids derived from the sequence of the protein HLA-G7 (SEQ ID NO: 7), preferably said fragment corresponds to the C-terminal sequence of exon 2 of HLA-G.
  • said HLA-G7 protein, the peptides as defined above or peptides of at least 6 amino acids derived from the sequence of said HLA-G7 protein (SEQ ID NO: 7) not comprising the Ala-Ser-Glu sequence are multimerized in the form of a tetramer; the multimeric form has a better affinity for its receptors than the monomeric form of said protein or of said peptides.
  • the expression peptide is understood to mean both the HLA-G7 protein in monomeric or multimeric form and fragments of said protein: either fragments of at least 6 amino acids comprising the sequence Ala-Ser-Glu in the form monomeric or multimeric or fragments of at least 6 amino acids not comprising the sequence Ala-Ser-Glu only in multimeric form.
  • the preparation of said multimerized peptide can for example be obtained by the formation of a complex between biotinylated HLA-G7 peptides and extravidin-phycoerythrin (extravidin-PE) or streptavidin-PE, which have 4 binding sites biotin, according to the techniques described in Yee et al., J. ImmunoL, 1999, 162, 2227-2234 and Allan et al., J. Exp. Med., 1999, 1149-1155.
  • extravidin-PE extravidin-phycoerythrin
  • streptavidin-PE which have 4 binding sites biotin
  • said peptide is coupled to a molecule (HLA-G7 fusion protein or physical or chemical bond) selected from the group consisting of: a marker such as an antigenic epitope (for example the epitope V5: Gly-Lys- Pro-lle-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr), a polyhistidine sequence or a biotin molecule, a cytotoxic molecule (for example a bacterial toxin (diphtheria toxin), a plant toxin (ricin or a synthetic toxin) or liposomes, for example, a fusion protein of HLA-G7 with an antigenic peptide makes it possible, using an antibody specific for said antigenic peptide, to sort effector cells having a receptor which uses the ⁇ 1 domain of HLA-G as a ligand, from a heterogeneous cell population.
  • a marker such as an antigenic epitope (for example the epi
  • said peptide is immobilized on a solid support.
  • said peptide is coupled to magnetic beads or else it is immobilized on a nickel column or matrix or else on any other solid support capable of linking polyhistidine sequences.
  • the peptide according to the invention is capable of being recognized by antibodies directed against the ⁇ 1 domain of HLA-G or by antibodies specific for the HLA-G7 isoform and / or in inducing the production of such antibodies.
  • Such a peptide is also capable of binding to the receptor for effector cells, as defined above and can be advantageously used in methods of detection, targeting, depletion, isolation of said effector cells and as an immunomodulatory medicament. capable of activating or inhibiting the activity of said effector cells.
  • said peptide can be used to modulate a response of cytotoxic NK or T cells, monocytes, macrophages, dendritic cells or B cells, in particular: to limit transplant rejection during organ transplantation or pathologies pregnancy (repeat abortions, pre-eclampsia), to stop an autoimmune or viral reaction, or to restore an effective antitumor response in the event of cancer or viral infection interfering with the expression of HLA -G, in particular infection with the CMV virus or the HTLV virus.
  • HLA-G7 HLA-G7 soluble isoform of HLA-G
  • HLA-G5 and HLA-G6 the inventors cloned into expression vectors, the cDNA and fragments from this sequence, respectively encoding the soluble protein and HLA-G7 peptides, then they analyzed said protein and said peptides produced from cells containing said vectors.
  • the subject of the present invention is a cassette for expression of an HLA-G7 peptide, characterized in that it contains at least one suitable promoter operably linked to a sequence selected from the group consisting of the sequence SEQ ID NO: 1 and fragments of at least 18 nucleotides from this sequence.
  • said sequence consists of a sequence selected from the group consisting of a sequence coding for an HLA-G7 peptide capable of sorting effector cells or else a sequence coding for a peptide d 'HLA
  • G7 able to modulate (inhibit or activate) the activity of said effector cells.
  • said sequence is associated with at least one sequence selected from the group consisting of: sequences encoding a marker such as an antigenic epitope, a polyhistidine sequence or a biotinylation site or the sequences encoding a cytotoxic peptide.
  • the expression cassette as defined above can be inserted into expression vectors (eukaryotic or prokaryotic) and into homologous recombination vectors. Consequently, the present invention also relates to an expression vector (eukaryotic or prokaryotic) of an HLA-G7 peptide as defined above, characterized in that it comprises at least: an origin of prokaryotic replication and / or eukaryote, a marker allowing the selection of prokaryotic and or eukaryotic cells such as an antibiotic resistance gene and the expression cassette as defined above.
  • the expression cassette contains SEQ ID NO: 1.
  • it is selected from the group consisting of prokaryotic expression vectors and recombinant baculoviruses.
  • the present invention also relates to transformed prokaryotic or eukaryotic cells expressing an HLA-G7 peptide as defined above, containing an expression vector as defined above.
  • the HLA-G7 peptides are produced and purified from said cells; in a nonlimiting manner, the presence of a polyhistidine sequence allows their purification, for example, on an immobilized nickel column.
  • the subject of the present invention is also a method of inducing tolerance, in humans or animals, for the treatment of transplant rejection and autoimmune diseases, characterized in that it comprises at least the following steps: removal of a biological sample comprising cells to be treated,
  • the present invention also relates to a homologous recombination vector, characterized in that it comprises the expression cassette as defined above.
  • the present invention also relates to a recombinant non-human mammal, obtained from the homologous recombination vector as defined above, characterized in that it expresses a peptide HLA-G7 as defined above and that it carries, integrated into its genome, at least one copy of the expression cassette as defined above
  • the present invention also relates to isolated cells and organs, derived from a recombinant non-human mammal as defined above.
  • the subject of the present invention is also the use of an HLA-G7 peptide for obtaining an immunomodulatory drug (activator or suppressor), vis-à-vis effector cells of the immune response which have a receptor capable of specifically binding to the ⁇ 1 domain of the HLA-G isoforms.
  • said HLA-G7 peptide is particularly suitable for the treatment of transplant rejection, pre-eclampsia, rejection of pregnancy (repeat abortions), autoimmune diseases, inflammatory pathologies or infections viruses interfering with the expression of HLA-G, in particular infection with the CMV virus or the HTLV virus.
  • said soluble HLA-G7 peptide is associated with a factor capable of stimulating its expression.
  • said HLA-G7 peptide is associated with interferon ⁇ and / or with NL10.
  • the present invention also relates to the use of said HLA-G7 peptide for the preparation of an anti-tumor vaccine, intended for the prevention and treatment of tumors expressing at least one isoform of HLA-G; such vaccines induce the formation of antibodies directed against the ⁇ 1 domain of the HLA-G isoformed (HLA-G1 to G7).
  • the present invention also relates to the use of said HLA-G7 peptide for the preparation of an anti-viral vaccine, intended for the prevention and treatment of viral infections interfering with the expression of HLA-G.
  • the present invention also relates to an anti-HLA-G7 antibody characterized in that it is obtained by immunization of non-human mammals with an HLA-G7 peptide, as defined above.
  • the present invention also relates to the use of said anti-HLA-G7 antibody for the preparation of an anti-tumor medicament, intended for the treatment of tumors expressing at least one isoform of HLA-G (passive immunotherapy).
  • the present invention also relates to the use of said anti-HLA-G7 antibody for the preparation of an anti-viral medicament, intended for the treatment of viral infections interfering with the expression of HLA-G.
  • the present invention further relates to the use of said soluble anti-HLA-G7 antibody, in combination with factors capable of inhibiting the expression of HLA-G for the preparation of an anti-tumor medicament, intended for the treatment of tumors expressing at least one isoform of HLA-G.
  • the present invention further relates to the use of said soluble anti-HLA-G7 antibody, in combination with factors capable of inhibiting the expression of HLA-G for the preparation of an anti-viral medicament, intended for the treatment viral infections interfering with the expression of HLA-G.
  • the present invention further relates to a method for detecting antibodies specific for domain 1 of the soluble HLA-G isoforms in a sample of biological fluid, in particular serum, amniotic, pleural, peritoneal, seminal fluid or urine, for monitoring pregnant patients at risk of spontaneous abortion and for detecting and monitoring patients with autoimmune diseases, characterized in that it comprises the following steps: a) immobilization on a solid support of a peptide HLA-G7 as defined above, preferably multimerized, purified and / or immobilized on a solid support, b) contacting the test sample and c) detection of the antigen-antibody complex possibly formed, by a method immunochemical.
  • immunochemical methods for example, ELISA, Westem-blot or a technique using a chip.
  • the protein HLA-G7 which, unlike the other soluble isoforms HLA-G5 and HLA-G6, only has the domain ⁇ 1, makes it possible to: detect, sort, deplete and modulate the activity of cells which have a receptor capable of interacting specifically with said domain, in particular NK cells, B or T lymphocytes, monocytes / macrophages and dendritic cells.
  • the present invention also relates to a method for detecting, sorting, depleting and modulating the activity of cells which have a receptor capable of binding to the ⁇ 1 domain of the HLA-G isoforms, characterized in that that it comprises the following stages: a) bringing the cell population to be analyzed into contact with an HLA-G7 peptide as defined above, preferably multimerized, purified and / or immobilized on a solid support, b) addition of an anti-HLA-G7 antibody as defined above, labeled and / or optionally combined with means making it possible to improve the sensitivity of the detection of the antigen-antibody complex formed. c) detection and possibly sorting of the labeled cells.
  • Said antibody can for example be coupled to a fluorescent molecule and the labeled cells are detected by fluorescence microscopy and or sorted by flow cytometry.
  • the present invention also relates to a method for monitoring the development of a tumor expressing HLA-G7 or of a viral infection interfering with the expression of HLA-G, characterized in that it comprises the assay of the HLA-G7 isoform soluble from the serum, according to the following stages: a) incubation of the serum to be analyzed with an anti-HLA-G7 antibody optionally labeled and b) detection of the antigen-antibody complex formed by an immunochemical method, such as defined above.
  • the invention also comprises other provisions, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the present invention as well as to the appended drawings in which: FIG.
  • FIG. 1 illustrates the structure of the HLA-G gene and of the HLA-G1 to G7 alternative transcripts: the position of the primers used for the amplification of these transcripts is represented by arrows and that of the probes by a thick line.
  • Figure 2 illustrates the cDNA sequence encoding the isoform
  • Soluble HLA-G7 (SEQ ID NO: 1): the ATG and the stop codon are boxed, the sequence of the primers and specific probes: -22 ATG (SEQ ID NO: 8),
  • G.53F (SEQ ID NO: 4), G257, G.i2R (SEQ ID NO: 5) and G7E2I2R (SEQ ID NO: 6) as well as the BamH1 cDNA cloning site are underlined.
  • FIG. 4 SEQ ID NO: 4
  • G257 G.i2R
  • G7E2I2R SEQ ID NO: 6
  • HLA-G7 transcript and of the other HLA-G transcripts (HLA-G1 to -G6) in the fetal liver, the trophoblast, the placenta, the amniotic membranes, the healthy skin and the cells peripheral blood mononuclear), by RT-PCR, using the specific primers for HLA-G7: G.53F (SEQ ID NO: 4) and G.i2R (I2R; SEQ ID NO: 5) or the primers HLA-G municipalities: G.257 and G.1004 (1004; SEQ ID NO: 11).
  • the amplification products are separated by agarose gel electrophoresis and visualized by Southern blot using the radiolabelled probe G.257 (exon 2).
  • Line 1 molecular weight marker
  • lanes 2 and 3 separate samples of first trimester gestation fetal livers
  • line 4 first trimester gestation trophoblast
  • line 5 second trimester gestation trophoblast
  • line 6 term placenta
  • lines 7, 8 and 9 separate samples of term amniotic membrane
  • line 10 sample of healthy skin
  • line 11 umbilical cord blood
  • line 12 peripheral blood mononuclear cells (PBMC).
  • FIG. 4 illustrates the detection of the HLA-G7 transcript in biopsies of melanomas from six patients (M1 to M6), by RT-PCR, using the specific primers for HLA-G7, G.53F (SEQ ID NO: 4) and G.i2R (I2R SEQ ID NO: 5).
  • the amplification products are separated by electrophoresis in agarose gel and visualized by staining with ethidium bromide.
  • HS healthy skin
  • SM metastasis
  • HLN healthy node
  • SPT primary tumor
  • LNM metastatic node.
  • the ⁇ -actin transcript is used to normalize the results of the different samples.
  • FIG. 5 corresponds to the example of FIG.
  • HLA-G1 to G6 HLA-G1 to G6
  • product detection amplification of all HLA-G transcripts is carried out by Southern blotting using the radibracked GR probe (exon 2).
  • HS healthy skin
  • SM metastasis
  • HLN healthy node
  • SPT primary tumor
  • LNM metastatic node.
  • the ⁇ -actin transcript is used to normalize the results of the different samples.
  • FIG. 6 illustrates the amino acid sequence of the HLA-G7 isoform: the position of exons 1 and 2 is indicated and the 2 specific amino acids of HLA-G7 encoded by intron 2 are boxed.
  • FIG. 7 illustrates the detection in Western blot, using an antibody specific for a peptide of exon 2 of HLA-G, of the recombinant protein HLA-G7 expressed in the melanoma cells M8 (M8 -G7) transfected with the plasmid B4C2.
  • the choriocarcinoma cells (JEG-3) and the M8 cells transfected with a vector containing a cDNA encoding all of the HLA-G isoforms (M8-gen) are used as a positive control.
  • M8 cells transfected with an empty vector (M8-pcDNA) are used as a negative control.
  • Example 1 Cloning and sequencing of a cDNA encoding the soluble HLA-G7 isoform.
  • cDNA corresponding to all of the HLA-G transcripts is isolated by RT-PCR from the RNA extracted from the JEG-3 choriocarcinoma line, originating from ATCC, using the primers: -22ATG in 5 '(SEQ ID NO: 9):
  • the amplification products are then digested with the restriction enzymes Xbal and BamH1 whose sequences are included in the primers -22ATG and G3s as indicated above, then they are inserted. resided by ligation in the compatible sites of the eukaryotic expression vector pcDNA 3.1 Hygro " (Invitrogen).
  • This vector comprises the promoter CMV, the gene for resistance to ampicillin, for the selection of recombinant bacteria and the gene for resistance to hygromycin, for the selection of eukaryotic cells transfected with a recombinant plasmid.
  • the colonies containing the recombinant plasmid comprising the cDNA of the soluble HLA-G7 isoform, are selected by hybridization with the GR probe located in exon 2 of the HLA gene -G ( Figure 1).
  • the DNA of the positive colonies is extracted and digested with the restriction enzymes Nhe I and Hindlll making it possible to excise the HLA-G7 insert.
  • the size of the fragment obtained with the different clones is checked by electrophoresis of the digestion product on agarose gel and staining with ethidium bromide. Then, the double-stranded sequence of the clones containing inserts of size corresponding to that expected is determined using the universal primers T7 and pcDNA3.1 BGH (Invitrogen).
  • Clone B4C2 contains a cDNA corresponding to a new HLA-G transcript, called HLA-G7, the sequence (SEQ ID NO: 2) is represented in FIG. 2.
  • This cDNA codes for a new HLA-G isoform which comprises only the ⁇ 1 domain of the HLA-G molecule (exon 1), added with two C-terminal amino acids encoded by intron 2 of the HLA-G gene which are specific for this isoform.
  • This cDNA does not contain the transmembrane domain coded by exon 5, nor the cytoplasmic domain coded by exon 6, allowing its anchoring to the cell membrane; it codes for a new soluble HLA-G7 form which is equivalent to a soluble HLA-G3 isoform.
  • This cDNA is derived from a transcript which results from a new alternative splicing of HLA-G and includes intron 2, thus causing a modification of the reading frame, during the translation of this transcript and the appearance a stop codon after amino acid 2 of intron 2 ( Figure 2).
  • Figure 2 Example 2 Detection of HLA-G7 Transcripts in Normal or Tumor Tissues
  • RNA is extracted from various normal and tumor tissues and the HLA-G7 transcripts are analyzed by RT-PCR; according to the protocol described in application WO 98/37098, using a pair of specific primers:
  • G. ⁇ 2R (SEQ ID NO: 5) 5 'GCA TGG AGG TGG GGG TCG TGA 3'
  • the 346 bp product, generated by RT-PCR, is separated by agarose gel electrophoresis and visualized by staining with ethidium bromide. Alternatively, the specificity of the amplified products is confirmed, by Southern blotting, after transfer of the DNA to a nitrocellulose membrane and hybridization with the G.257 probe (application FR 2 775 294) specific for exon 2, radiolabelled (figure 1 ).
  • the other HLA-G transcripts are analyzed in parallel using the following primer pairs which amplify the other HLA-G transcripts (G1 to G6), (FIG. 1):
  • pair G.257 and G.1004 (pair 2) which is more specific as the couple 1 because it only amplifies the transcripts splices of HLA-G.
  • pair 1 also amplifies the genomic DNA of HLA-G which can possibly contaminate the mRNA preparations.
  • couple 2 is used under the following conditions: 1 min at 94 ° C, 1 min 30 s at 61 ° C and 2 min at 72 ° C, for 35 cycles.
  • HLA-G7 transcript The distribution of the HLA-G7 transcript follows that of the other HLA-G transcripts; the HLA-G7 transcript is detected in normal tissues where the other HLA-G transcripts are abundantly transcribed (amniotic membrane, placenta, trophoblast and thymus). On the other hand, in healthy individuals, it is absent from tissues where other HLA-G transcripts are detectable (umbilical cord blood, lymph nodes, skin, peripheral blood mononuclear cells). 2.2.2 Tumor tissues:
  • the results are illustrated in Figures 4 and 5.
  • the HLA-G7 transcript is detected in biopsies of primary tumors, lymph nodes and metastatic melanoma tumors. In these biopsies, the distribution of the HLA-G7 transcript follows that of the other HLA-G transcripts.
  • the transcript is also detected in biopsies of breast tumors.
  • Example 3 Modulation of the HLA-G7 transcript rate 3.1 Materials and methods
  • the cells are treated with different agents, under the following conditions:
  • the total mRNA is extracted from the cells 24 hours after stopping the treatment except in the case of heat stress where the cells are re-cultured for 6 h or 30 h, before the extraction of the total mRNA. Then the specific HLA-G7 transcripts are amplified by RT-PCR, quantified with respect to the actin transcripts, according to the experimental protocol described in Example 2 and the increase in the level of HLA-G7 transcripts, after the different treatments, is determined in relation to the control (sample of untreated cells).
  • HLA-G7 In primary melanoma cultures, thymic epithelial cells, amniotic cells, trophic explant cells blastics derived from placenta of the first trimester of pregnancy and the melanoma line cells M8, the transcription of the isoform HLA-G7 is activated by interferon ⁇ , heat stress, and treatment with butyrate and demethylating agents.
  • Example 4 Expression and characterization of the HLA-G7 protein. 4.1 Materials and methods
  • the cDNAs encoding the soluble HLA-G, HLA-G5, HLA-G6 and HLA-G7 isoforms are cloned into two types of eukaryotic expression vectors: 1) A vector pcDNA3.1 (hygro " , Invitrogen) allowing expression proteins under the control of the CMV promoter, the selection of cells transfected in the presence of hygromycin and the detection of the proteins expressed.
  • a vector pcDNA3.1 hygro " , Invitrogen
  • the recombinant vectors respectively containing the cDNAs encoding the HLA-G5, G6 and G7 isoforms are constructed according to the method described in Example 1 for the expression vector of the HLA-G7 isoform (B4C2). Then, they are transfected into two types of cells expressing none of the HLA-G transcripts; M8 melanoma cells which express only the classical class I molecules and Teratocarcinoma Tera-2 cells (ATCC), as well as human K562 erythroleukemic cells (ATCC) which do not express any HLA molecules.
  • the protein extracts from the transfected cells are separated by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and the protein HLA- G7 is detected by Western blot using an antibody specific for a peptide located in exon 2 (domain ⁇ 1).
  • the soluble isoforms HLA-G5, G6 and G7 were expressed in eukaryotic cells.
  • the expression vector of the soluble HLA-G7 isoform, an HLA-G7 protein of molecular weight identical to that of the HLA-G7 protein expressed in JEG control cells -3 is detected in Westem-blot, using an antibody specific for a peptide located in exon 2 of HLA-G (peptide
  • EEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRG application WO 96/31604 which allows the specific detection of all the HLA-G isoforms (FIG. 7).

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Abstract

Nouvelle isoforme d'HLA-G soluble (HLA-G7) et ses applications, liées à ses propriétés immunomodulatrices, pour le diagnostic des maladies autoimmunes et des risques d'avortement à répétition et le traitement, chez l'homme de troubles liés à l'immunité.

Description

Nouvelle isoforme d'HLA-G et ses applications
La présente invention est relative à une nouvelle isoforme d'HLA-G soluble (HLA-G7) et à ses applications, liées à ses propriétés immunomodulatrices, pour le diagnostic des maladies autoimmunes et des risques d'avortement à répétition et le traitement, chez l'homme de troubles liés à l'immunité.
Les antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH), se divisent en plusieurs classes, les antigènes de classe I (HLA-A, HLA-B et HLA-C) qui présentent 3 domaines globulaires (α1 , α2 et α3), et dont le domaine α3 est associé à la β2 microglobuline, les antigènes de classe II (HLA-DP, HLA-DQ et HLA-DR) et les antigènes de classe III (complément).
Les antigènes de classe I comprennent, outre les antigènes précités, d'autres antigènes, dits antigènes de classe I non classiques, et notamment les antigènes HLA-E, HLA-F et HLA-G.
La séquence du gène HLA-G (gène HLA-6.0) a été décrite par GERAGHTY et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 9145-9149) : il comprend 4396 paires de bases et présente une organisation intron/exon homologue à celle des gènes HLA-A, -B et -C. De manière plus précise, ce gène comprend 8 exons, 7 introns et une extrémité non traduite 3* ; les 8 exons correspondent respectivement à : exon 1 : séquence signal, exon 2 domaine extracellulaire α1 , exon 3 : domaine extracellulaire α2, exon 4 domaine extracellulaire α3, exon 5 : région transmembranaire, exon 6 domaine cytoplasmique I, exon 7 : domaine cytoplasmique II (non traduit), exon 8 : domaine cytoplasmique III (non traduit) et région 3' non traduite (GERAGHTY et al., précité; ELLIS et al., J. Immunol., 1990, 144, 731-735 ; KIRSZENBAUM M. et al., Oncogeny of hematopoiesis. Aplastic anémia Eds. E. Gluckman, L. Coulombel, Colloque INSERM/John Libbey Eurotext Ltd). Toutefois, le gène HLA-G diffère des autres gènes de classe I, en ce que le codon de terminaison de traduction, en phase, est localisé au niveau du deuxième codon de l'exon 6 ; en conséquence, la région cytoplasmique de la protéine codée par ce gène HLA-6.0 est plus courte que celle des régions cytoplasmiques des protéines HLA-A, -B et -C.
Ces antigènes HLA-G sont essentiellement exprimés par les cellules cytotrophoblastiques du placenta et sont considérés comme jouant un rôle dans la protection du fœtus (absence de rejet par la mère). En outre, dans la mesure où l'antigène HLA-G est monomorphique, il peut également être impliqué dans la croissance ou la fonction des cellules placentaires (KOVATS et al., Science, 1990, 248, 220-223).
D'autres recherches concernant cet antigène non classique de classe I (ISHITANI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 3947-3951 ) ont montré que le transcrit primaire du gène HLA-G peut être épissé de plusieurs manières et produit au moins 3 ARNm matures distincts : le transcrit primaire d'HLA-G fournit une copie complète (G1 ) de 1 200 pb, un fragment de 900 pb (G2) et un fragment de 600 pb (G3). Le transcrit G1 ne comprend pas l'exon 7 et correspond à la séquence décrite par ELLIS et al. (précité), c'est-à-dire qu'il code une protéine qui comprend une séquence signal, trois domaines externes, une région transmembranaire et une séquence cytoplasmique. L'ARNm G2 ne comprend pas l'exon 3, c'est-à-dire qu'il code une protéine dans laquelle les domaines α1 et α3 sont directement joints ; l'ARNm G3 ne contient ni l'exon 3, ni l'exon 4, c'est-à-dire qu'il code une protéine dans laquelle le domaine α1 et la séquence transmembranaire sont directement joints.
L'épissage qui prévaut pour l'obtention de l'antigène HLA-G2 entraîne la jonction d'une adénine (A) (provenant du domaine codant α1) avec une séquence AC (issue du domaine codant α3), ce qui entraîne la création d'un codon AAC (asparagine) à la place du codon GAC (acide aspartique), rencontré au début de la séquence codant le domaine α3 dans HLA-G1.
L'épissage généré pour l'obtention de HLA-G3 n'entraîne pas la formation d'un nouveau codon dans la zone d'épissage. ' Les Auteurs de cet article ont également analysé les différentes protéines exprimées : les 3 ARNm sont traduits en protéine dans la lignée cellulaire .221 -G. Les Auteurs de cet article concluent à un rôle fondamental de la molécule HLA-G dans la protection du foetus vis-à-vis d'une réponse immune maternelle (induction d'une tolérance immune). Certains des Inventeurs ont confirmé ce rôle : les molécules HLA-G, exprimées à la surface des trophoblastes protègent effectivement les cellules fœtales de la lyse par les cellules natural killer (NK) maternelles (CAROSELLA E.D. et al., C.R. Acad. Sci., 318, 827-830 ; CAROSELLA E.D. et al ; ImmunoL Today, 1996, 407-409).
Certains des Inventeurs ont montré l'existence d'autres formes épissées d'ARNm d'HLA-G : le transcrit HLA-G4, qui n'inclut pas l'exon 4 ; le transcrit HLA-G5, qui inclut l'intron 4, entre les exons 4 et 5, provoquant ainsi une modification du cadre de lecture, lors de la traduction de ce transcrit et en particulier l'apparition d'un codon stop, après l'acide aminé 21 de l'intron 4 ; et le transcrit HLA-G6, possédant l'intron 4, mais ayant perdu l'exon 3 (KIRSZENBAUM M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91 , 4209-4213 ; Demande Européenne EP 0 677 582 ; KIRSZENBAUM M. et al., Human ImmunoL, 1995, 43, 237-241 ; MOREAU P. et al., Human ImmunoL 1995, 43, 231-236) ; ils ont également montré que ces différents transcrits sont exprimés dans plusieurs types de cellules humaines fœtales et adultes, notamment dans les lymphocytes (KIRSZENBAUM M. et al., Human ImmunoL, 1995, précité ; MOREAU P. et al., Human ImmunoL 1995, précité). Il existe donc au moins 6 ARNms HLA-G différents qui codent potentiellement 6 isoformes d'HLA-G dont 4 membranaires (HLA-G1 , G2, G3 et G4) et 2 solubles G5 et G6. Des études antérieures ont montré que l'expression des molécules HLA-G à la surface de cellules cibles obtenues par transfection avec des vecteurs comprenant l'ADN génomique de HLA-G, générant potentiellement tous les transcrits alternatifs, permet de protéger lesdites cellules cibles de l'activité lytique des cellules NK de la couche déciduale de l'endomètre maternel (CHUMBLEY G. et al., Cell ImmunoL, 1994, 155, 312- 322 ; DENIZ G. et al., J. ImmunoL, 1994, 152, 4255-4261 ). Les cellules NK expriment des récepteurs des molécules du CMH de classe I (killer inhibitory receptors ou KIR ou NKIR pour récepteurs inhibiteurs NK), qui sont responsables de l'inhibition de la cytotoxicité, lorsque ces molécules HLA, agissant comme ligands, sont reconnues par ces récep- teurs ; par exemple, N. ROUAS-FREISS et al. (PNAS, 1997, 94, 5249-5254) ont montré que l'expression de HLA-G protégeait de la lyse, les cellules cibles K562 (lignée cellulaire érythroleucémique), transfectées par le gène HLA-G ; ces cellules sont habituellement sensibles aux cellules NK. Dans cet article, certains des Inventeurs ont également montré que l'expression du domaine α1 d'HLA-G, dans lesdites cellules cibles transfectées, était nécessaire et suffisant pour inhiber la fonction NK. Certains des Inventeurs ont aussi montré que les cellules NK n'expriment aucun transcrit HLA-G, ce résultat confirmant que les produits d'expression du gène HLA-G jouent un rôle dans l'immunotolérance (TEYSSIER M. et al., Nat. ImmunoL, 1995, 14, 262-270). Les Inventeurs, poursuivant leurs travaux ont montré que certaines tumeurs solides exprimaient l'antigène HLA-G, que selon les lignées tumorales, le profil d'expression des isoformes d'HLA-G membranaires et solubles était différent et que la présence des formes membranaires HLA-G1- G4 protégeait les cellules tumorales de la lyse induite par les cellules NK (demande FR 2 775 294).
Poursuivant leurs travaux, certains des Inventeurs ont maintenant trouvé un nouveau transcrit alternatif du gène HLA-G, codant une nouvelle isoforme soluble d'HLA-G, dénommée HLA-G7.
La présente invention a pour objet, une séquence d'ADNc, issue d'un ARNm du gène HLA-G humain du complexe majeur d'histocompatibilité, isolé à partir de cellules humaines de type tropho- blastique, caractérisée :
• en ce qu'elle code une isoforme d'HLA-G soluble dénommée isoforme HLA-G7 et • en ce qu'elle présente la séquence SEQ ID NO :1 , qui comprend de 5' en 3' : une séquence codant le peptide signal (exon 1 ), une séquence codant le domaine α1 (exon 2), une séquence correspondant à l'extrémité 5' de l'intron 2 codant 2 acides aminés, respectivement (Ser et Glu), immédiatement suivie d'un codon stop. Cet ADNc code une nouvelle isoforme d'HLA-G, comportant uniquement le domaine 1 de la molécule HLA-G ainsi que deux acides aminés C-terminaux codés par l'intron 2 du gène HLA-G, qui sont spécifiques de cette isoforme ; du fait de l'arrêt prématuré de la traduction au sein de l'intron 2, cette nouvelle isoforme ne comporte pas les domaines α2 et α3 codés respectivement par l'exon 3 et l'exon 4, ni le domaine transmembranaire codé par l'exon 5, permettant son ancrage à la membrane cellulaire, ni le domaine cytoplasmique codé par l'exon 6, ce qui l'assimile à une isoforme HLA-G3 soluble, ne comportant que le domaine fonctionnel 1 de la molécule HLA-G3 additionné de deux acides aminés codés par l'intron 2. La présente invention a également pour objet un fragment d'un ARNm du gène HLA-G humain du complexe majeur d'histocompatibilité, isolé à partir de cellules humaines de type trophoblastique, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence SEQ ID NO :1 telle que définie ci-dessus et en ce qu'il présente la SEQ ID NO :2 qui contient successivement de 5' en 3' : 17 nucléotides non-codants, l'exon 1 , l'exon 2 et 94 nucléotides de l'extrémité 5' de l'intron 2 d'HLA-G.
L'ARNm codant l'isoforme HLA-G7 (transcrit HLA-G7) résulte d'un épissage alternatif nouvellement caractérisé et inclut l'intron 2, provoquant ainsi une modification du cadre de lecture, lors de la traduction de ce transcrit et l'apparition d'un codon stop après l'acide aminé 2 de l'intron 2.
Les Inventeurs ont montré que de manière inattendue, un tel transcrit est détecté abondamment dans les cellules de trophoblaste, de placenta, de la membrane amniotique, dans les cellules épithéliales du thymus humain ainsi que dans les biopsies de lésions tumorales de méla- nomes, de cancer du rein et de cancer du sein. Ce transcrit n'est pas détecté dans d'autres types de tissus sains de l'adulte, en particulier la peau et les cellules mononucléées du sang périphérique, ainsi que dans des tissus d'origine materno-fœtale tels que le cordon ombilical et le foie fœtal de premier trimestre de gestation.
La présente invention a également pour objet des fragments de la séquence SEQ ID NO :2, caractérisés en ce qu'ils permettent la détec- tion spécifique du transcrit HLA-G7 (sonde ou amorce) et en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par : a) la SEQ ID NO :3 qui correspond à la jonction exon 2- intron 2 spécifique du transcrit HLA-G7 (positions 348 à 453) de la SEQ ID NO :2), b) les séquences SEQ ID NO :5 et 6 et c) les séquences nucléotidiques complémentaires des séquences précédentes, les fragments d'au moins 15 nucléotides issus des séquences précédentes et leurs séquences complémentaires.
Au sens de la présente invention, on entend par séquence nucléique ou séquence nucléotidique, l'une des séquences telle que définie ci-dessus, sous forme ARN ou ADN ainsi que leurs séquences complémentaires (séquences anti-sens).
Ces fragments sont utilisés comme sonde ou comme amorce pour détecter ou pour amplifier spécifiquement le transcrit HLA-G7. Des paires d'amorces préférées sont les suivantes :
- paire A : SEQ ID NO :4 et SEQ ID NO :5 qui génère un produit d'amplification de 346 pb et paire B : SEQ ID NO :4 et SEQ ID NO :6 qui génère un produit d'amplification de 31 1 pb. La présente invention a également pour objet un oligonucléo- tide antisens, caractérisé en ce qu'il est apte à inhiber la transcription d'un transcrit HLA-G et en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences d'au moins 15 nucléotides complémentaires de la SEQ ID NO : 2. La présente invention a également pour objet l'utilisation de l'oligonucléotide tel que défini ci-dessus pour la préparation d'un médicament apte à rompre la tolérance immune, destiné au traitement des tumeurs exprimant au moins un transcrit HLA-G. La présente invention a également pour objet l'utilisation de l'oligonucléotide tel que défini ci-dessus pour la préparation d'un médicament apte à rompre la tolérance immune, destiné au traitement des infections virales interférant avec l'expression d'HLA-G, notamment l'infection par le virus CMV ou le virus HTLV.
La présente invention a également pour objet une protéine HLA-G isolée et éventuellement purifiée, dénommée protéine HLA-G7 soluble, caractérisée : en ce qu'elle est codée par la séquence SEQ ID NO :1 telle que définie ci-dessus, en ce qu'elle est constituée par le domaine α1 de la molécule HLA-G, suivi de 2 acides aminés codés par l'intron 2 du gène HLA- G,
- en ce qu'elle est soluble et - en ce qu'elle correspond à la séquence SEQ ID NO :7.
Les Inventeurs ont montré que le transcrit HLA-G7, inséré dans un vecteur d'expression et transfecté dans des cellules humaines, produit une protéine dont la taille correspond à celle d'une protéine ne possédant que le domaine α1 d'HLA-G. • Les Inventeurs ont trouvé, de manière inattendue, que ladite protéine, dénommée isoforme HLA-G7 soluble, qui ne comprend que le domaine 1 présente des propriétés immunomodulatrices spécifiques et joue un rôle important dans l'inhibition des fonctions immunes, associée aux états de tolérance physiologiques (tolérance foeto-maternelle) ou pathologiques (tumeurs, maladies autoimmunes, infections virales).
Les Inventeurs ont ainsi montré que : chez des femmes qui, du fait d'une mutation à l'état homozygote, ont perdu la capacité de coder pour les isoformes HLA-G comportant des domaines autres que le domaine α1 , le maintien de la grossesse est lié à la capacité de coder pour les isoformes HLA-G3 et HLA-
G7. Chez ces patientes, ces deux isoformes comportant uniquement le domaine α1 , parmi les domaines extracellulaires, inhibent les fonctions immunes et permettent l'établissement de la tolérance foeto-maternelle, chez des patientes présentant une pathologie de grossesse telle que la pré-éclampsie, on observe un déficit d'HLA-G, - le transcrit HLA-G7 est abondant dans le thymus, le trophoblaste, la membrane amniotique, dans certaines tumeurs du sein, en particulier chez des patientes jeunes, ainsi que dans certains mélanomes et la transcription de cette isoforme HLA-G7 est activée sous l'effet de divers stimuli, dont I L10, l'interféron β, le stress (thermique et métaux lourds), le traitement au butyrate et aux agents déméthylants.
L'isoforme HLA-G7 présente les avantages suivants : elle est soluble et donc facile à produire et à purifier ; contrairement aux autres isoformes d'HLA-G solubles, elle n'est pas associée à la β2 microglobuline et peut donc être produite et purifiée sous forme active sans avoir besoin de co-exprimer la β2 microglobuline. elle a une biodisponibilité nettement plus importante que les autres isoformes d'HLA-G solubles, en raison d'un poids moléculaire plus faible (17 kDa vs 39 kDa pour HLA-G5), ce qui lui permet d'interagir avec un plus grand nombre de récepteurs. - elle interagit spécifiquement avec les récepteurs KIR et induit uniquement l'inhibition de l'activité cytotoxique des lymphocytes T et des cellules NK ; contrairement aux autres isoformes d'HLA-G solubles, elle ne comprend ni le domaine α3 qui se lie au récepteur CD8 et induit l'apoptose des lymphocytes T activés, ni la β2 microglobuline qui permet de former la poche nécessaire à la présentation de peptides au récepteur des lymphocytes T (TcR).
En conséquence, l'isoforme HLA-G7 isolée, telle que définie ci-dessus est parfaitement adaptée à la préparation d'un médicament immunomodulateur, vis-à-vis des cellules NK, T cytotoxiques, des monocytes, des macrophages, des cellules dendritiques, des cellules B ou bien d'autres cellules effectrices possédant un récepteur qui utilise le domaine α1 d'HLA-G comme ligand. En outre, elle peut-être utilisée dans des procédés de détec- tion, de ciblage, de déplétion, d'isolement et de modulation (activation ou inhibition) de l'activité des dites cellules effectrices qui reposent sur l'interaction récepteur/ligand desdites cellules avec le domaine 1 de ladite protéine HLA- G isolée. La présente invention a également pour objet des peptides spécifiques d'HLA-G7 caractérisés en ce qu'ils présentent la séquence X-Ala- Ser-Glu, où X est un fragment de 3 à 112 acides aminés issu de la séquence de la protéine HLA-G7 (SEQ ID NO :7), de préférence ledit fragment correspond à la séquence C-terminale de l'exon 2 d'HLA-G. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite protéine HLA-G7, les peptides tels que définis ci-dessus ou des peptides d'au moins 6 acides aminés issus de la séquence de ladite protéine HLA-G7 (SEQ ID NO :7) ne comprenant pas la séquence Ala-Ser-Glu sont multimérisés sous-forme de tétramère; la forme multimérique présente une meilleure affi- nité pour ses récepteurs que la forme monomérique de ladite protéine ou desdits peptides.
Au sens de la présente invention on entend par peptide aussi bien la protéine HLA-G7 sous forme monomérique ou multimérique, que des fragments de ladite protéine : soit des fragments d'au moins 6 acides aminés comprenant la séquence Ala-Ser-Glu sous forme monomérique ou multimérique ou bien des fragments d'au moins 6 acides aminés ne comprenant pas la séquence Ala-Ser-Glu uniquement sous forme multimérique.
La préparation dudit peptide multimérisé peut par exemple être obtenue par formation d'un complexe entre des peptides d'HLA-G7 bioti- nylés et l'extravidine-phycoérythrine (extravidine-PE) ou la streptavidine-PE, qui comportent 4 sites de liaison à la biotine, selon les techniques décrites dans Yee et al., J. ImmunoL, 1999, 162, 2227-2234 et Allan et al., J. Exp. Med., 1999, 1149-1155.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit peptide est couplé à une molécule (protéine de fusion d'HLA-G7 ou bien liaison physique ou chimique) sélectionnée dans le groupe constitué par : un marqueur tel qu'un épitope antigénique (par exemple l'épitope V5 :Gly-Lys- Pro-lle-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr), une séquence poly- histidine ou une molécule de biotine, une molécule cytotoxique (par exemple une toxine bactérienne (toxine diphtérique), une toxine végétale (ricine ou une toxine synthétique) ou des liposomes. Par exemple, une protéine de fusion d'HLA-G7 avec un peptide antigénique permet, à l'aide d'un anticorps spécifique dudit peptide antigénique, de trier des cellules effectrices possédant un récepteur qui utilise le domaine α1 d'HLA-G comme ligand, à partir d'une population cellulaire hétérogène. Lorsque ladite protéine HLA-G7 est couplée à une molécule toxique, elle permet la destruction spécifique des dites cellules.
Selon encore un mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit peptide est immobilisé sur un support solide. Par exemple, ledit peptide est couplé à des billes magnétiques ou bien il est immobilisé sur une colonne ou une matrice de nickel ou bien sur tout autre support solide capable de lier des séquences polyhistidines.
Le peptide selon l'invention est apte à être reconnu par des anticorps dirigés contre le domaine α1 d'HLA-G ou par des anticorps spécifiques de l'isoforme HLA-G7 et/ou à induire la production de tels anticorps.
Un tel peptide est également apte à se lier au récepteur des cellules effectrices, telles que définies ci-dessus et peut être avantageusement utilisé dans des procédés de détection, de ciblage, de déplétion, d'isolement desdites cellules effectrices et comme médicament immuno- modulateur capable d'activer ou d'inhiber l'activité desdites cellules effectrices. Par exemple, ledit peptide peut être utilisé pour moduler une réponse des cellules NK ou T cytotoxiques, des monocytes, des macrophages, des cellules dendritiques ou des cellules B, notamment : pour limiter le rejet de greffe lors de transplantation d'organe ou de pathologies de la grossesse (avortements à répétition, pré-éclampsie), pour enrayer une réac- tion auto-immune ou virale, ou bien pour rétablir une réponse antitumorale efficace en cas de cancer ou d'infection virale interférant avec l'expression d'HLA-G, notamment l'infection par le virus CMV ou le virus HTLV. Afin d'évaluer le rôle de la nouvelle isoforme soluble d'HLA-G (HLA-G7) par rapport aux autres isoformes solubles HLA-G5 et HLA-G6, les Inventeurs ont clone dans des vecteurs d'expression, l'ADNc et des fragments issus de cette séquence, codant respectivement la protéine soluble et des peptides HLA-G7, puis ils ont analysé ladite protéine et lesdits peptides produits à partir de cellules contenant lesdits vecteurs.
La présente invention a pour objet une cassette d'expression d'un peptide HLA-G7, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un promoteur convenable lié de façon opérationnel à une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par la séquence SEQ ID NO :1 et les fragments d'au moins 18 nucléotides issus de cette séquence.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite cassette d'expression, ladite séquence est constituée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par une séquence codant un peptide d'HLA-G7 apte à trier des cellules effectrices ou bien une séquence codant un peptide d'HLA-
G7 apte à moduler (inhiber ou activer) l'activité desdites cellules effectrices.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite cassette d'expression, ladite séquence est associée à au moins une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par : les séquences codant un marqueur tel qu'un épitope antigénique, une séquence polyhistidine ou un site de biotinylation ou bien les séquences codant un peptide cytotoxique.
La cassette d'expression telle que définie ci-dessus peut-être insérée dans des vecteurs d'expression (eucaryote ou procaryote) et dans des vecteurs de recombinaison homologue. En conséquence, la présente invention a également pour objet un vecteur d'expression (eucaryote ou procaryote) d'un peptide HLA-G7 tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend au moins : une origine de réplication procaryote et/ou eucaryote, un marqueur permettant la sélection des cellules procaryotes et ou eucaryotes tel qu'un gène de résis- tance à un antibiotique et la cassette d'expression telle que définie ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit vecteur, la cassette d'expression contient la SEQ ID NO :1. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux dudit vecteur, il est sélectionné dans le groupe constitué par les vecteurs d'expression procaryotes et les baculovirus recombinants.
La présente invention a également pour objet des cellules procaryotes ou eucaryotes transformées exprimant un peptide HLA-G7 tel que défini ci-dessus, contenant un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus.
De manière avantageuse, les peptides HLA-G7, tels que définis ci-dessus, sont produits et purifiés à partir desdites cellules ; de manière non-limitative la présence d'une séquence polyhistidine permet leur purifica- tion, par exemple, sur une colonne de Nickel immobilisé.
Dans le cas où ledit peptide est la protéine HLA-G7 soluble, celle-ci est avantageusement sécrétée dans le milieu extracellulaire des cellules eucaryotes transfectées par les vecteurs d'expression tels que définis ci-dessus, ce qui facilite sa purification. La présente invention a également pour objet une méthode d'induction de tolérance, chez l'homme ou l'animal, pour le traitement des rejets de greffe et des maladies autoimmunes, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins les étapes suivantes : le prélèvement d'un échantillon biologique comprenant des cellules à traiter,
- la mise en culture desdites cellules, la transfection desdites cellules par un vecteur d'expression ou un peptide tel que défini ci-dessus et éventuellement la sélection desdites cellules transfectées et - l'injection, chez le patient, des dites cellules transfectées contenant le vecteur d'expression ou le peptide tels que définis ci-dessus .
La présente invention a également pour objet un vecteur de recombinaison homologue, caractérisé en ce qu'il comprend la cassette d'expression tel que défini ci-dessus. La présente invention a également pour objet un mammifère non-humain recombinant, obtenu à partir du vecteur de recombinaison homologue tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il exprime un peptide HLA-G7 tel que défini ci-dessus et qu'il porte, intégrée dans son génome, au moins une copie de la cassette d'expression telle que définie ci-dessus
La présente invention a également pour objet des cellules et des organes isolés, issus d'un mammifère non-humain recombinant tel que défini ci-dessus.
Les peptides HLA-G7 tels que définis ci-dessus, qui possèdent des propriétés immunomodulatrices, trouve des applications dans les domaines suivants : le traitement du rejet de greffe, de pathologies de la grossesse telles que la pré-éclampsie et les avortements à répétition, des maladies autoimmunes et des pathologies inflammatoires telles que les pathologies inflammatoires de la peau (psoriasis) comme décrit pour d'autres isoformes d'HLA-G solubles dans la demande FR 9907736 du 18 juin 1999, le traitement du cancer, par exemple les tumeurs du sein, du rein et mélanomes, le diagnostic des mélanomes et des tumeurs du sein (recherche de la protéine HLA-G7 soluble dans le sérum), le diagnostic des risques d'avortement spontané et des maladies autoimmunes (recherche des anticorps anti-domaine 1 des iso- formes HLA-G), la détection, le suivi et le traitement d'infections virales interférant avec l'expression d'HLA-G, notamment l'infection par le virus CMV et le virus HTLV, et la détection, le tri, le ciblage, la déplétion et la modulation de l'activité des cellules effectrices de la réponse immune qui possèdent un récepteur capable de se lier spécifiquement au domaine α1 des isoformes HLA-G.
En conséquence, la présente invention a également pour objet, l'utilisation d'un peptide HLA-G7 pour l'obtention d'un médicament immunomodulateur (activateur ou suppresseur), vis-à-vis des cellules effectrices de la réponse immune qui possèdent un récepteur capable de se lier spécifiquement au domaine α1 des isoformes HLA-G. Conformément à l'invention, ledit peptide HLA-G7 est particulièrement adapté au traitement du rejet de greffe, de la pré-éclampsie, du rejet de la grossesse (avortements à répétition), des maladies auto-immunes, des pathologies inflammatoires ou des infections virales interférant avec l'expression d'HLA-G, notamment l'infection par le virus CMV ou le virus HTLV.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ledit peptide HLA-G7 soluble est associé à un facteur apte à stimuler son expression. Selon une disposition avantageuse de ladite utilisation, ledit peptide HLA-G7 est associé à l'interféron β et/ou à NL10.
La présente invention a également pour objet l'utilisation dudit peptide HLA-G7 pour la préparation d'un vaccin anti-tumoral, destiné à la prévention et au traitement des tumeurs exprimant au moins une isoforme d'HLA- G ; de tels vaccins induisent la formation d'anticorps dirigés contre le domaine α1 des isoformés HLA-G (HLA-G1 à G7).
La présente invention a également pour objet l'utilisation dudit peptide HLA-G7 pour la préparation d'un vaccin anti-viral, destiné à la prévention et au traitement des infections virales interférant avec l'expression d'HLA-G.
La présente invention a également pour objet un anticorps anti-HLA-G7 caractérisé en ce qu'il est obtenu par immunisation de mammifères non-humains avec un peptide HLA-G7, tel que défini ci-dessus.
La présenté invention a également pour objet l'utilisation dudit anticorps anti-HLA-G7 pour la préparation d'un médicament anti-tumoral, destiné au traitement des tumeurs exprimant au moins une isoforme d'HLA-G (immunothérapie passive).
La présente invention a également pour objet l'utilisation dudit anticorps anti-HLA-G7 pour la préparation d'un médicament anti-viral, destiné au traitement des infections virales interférant avec l'expression d'HLA-G. La présente invention a en outre pour objet l'utilisation dudit anticorps anti-HLA-G7 soluble, en association avec des facteurs aptes à inhiber l'expression d'HLA-G pour la préparation d'un médicament antitumoral, destiné au traitement des tumeurs exprimant au moins une isoforme d'HLA-G. La présente invention a en outre pour objet l'utilisation dudit anticorps anti-HLA-G7 soluble, en association avec des facteurs aptes à inhiber l'expression d'HLA-G pour la préparation d'un médicament anti-viral, destiné au traitement des infections virales interférant avec l'expression d'HLA-G. La présente invention a en outre pour objet un procédé de détection d'anticorps spécifiques du domaine 1 des isoformes HLA-G solubles dans un échantillon de liquide biologique, notamment le sérum, le liquide amniotique, pleural, péritonéal, séminal ou l'urine, pour la surveillance de patientes enceintes présentant un risque d'avortement spontané et pour la détection et la surveillance de patients atteints de maladies autoimmunes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) immobilisation sur un support solide, d'un peptide HLA-G7 tel que défini ci-dessus, de préférence multimérisé, purifié et/ou immobilisé sur un support solide, b) mise en contact avec l'échantillon à tester et c) détection du complexe antigène-anticorps éventuellement formé, par une méthode immunochimique.
Parmi les méthodes immunochimiques on peut citer par exemple l'ELISA, le Westem-blot ou une technique mettant en œuvre une puce.
La protéine HLA-G7 qui contrairement aux autres isoformes solubles HLA-G5 et HLA-G6, ne possède que le domaine α1 , permet de : détecter, trier, dépléter et moduler l'activité, des cellules qui possèdent un récepteur apte à interagir spécifiquement avec ledit domaine, notamment les cellules NK, les lymphocytes B ou T, les monocytes/macrophages et les cellules dendritiques. En conséquence, la présente invention a également pour objet un procédé de détection, de tri, de déplétion et de modulation de l'activité, des cellules qui possèdent un récepteur apte à se lier au domaine α1 des isoformes HLA-G, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact de la population cellulaire à analyser avec un peptide HLA-G7 tel que défini ci-dessus, de préférence multimérisé, purifié et/ou immobilisé sur un support solide, b) addition d'un anticorps anti-HLA-G7 tel que défini ci- dessus marqué et/ou éventuellement associée à des moyens permettant d'améliorer la sensibilité de la détection du complexe antigène-anticorps formé. c) détection et éventuellement tri des cellules marquées. Ledit anticorps peut par exemple être couplé à une molécule fluorescente et les cellules marquées sont détectées en microscopie de fluo- rescence et ou triées en cytométrie de flux.
La présente invention a également pour objet une méthode de surveillance de l'évolution d'une tumeur exprimant HLA-G7 ou d'une infection virale interférant avec l'expression d'HLA-G, caractérisée en ce qu'elle comprend le dosage de l'isoforme HLA-G7 soluble à partir du sérum, selon les étapes suivantes : a) incubation du sérum à analyser avec un anticorps anti- HLA-G7 éventuellement marqué et b) détection du complexe antigène-anticorps formé par une méthode immunochimique, telle que définie ci-dessus. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels : la figure 1 illustre la structure du gène HLA-G et des transcrits alternatifs HLA-G1 à G7 : la position des amorces utilisées pour l'amplification de ces transcrits est représentée par des flèches et celle des sondes par un trait épais. la figure 2 illustre la séquence de l'ADNc codant l'isoforme
HLA-G7 soluble (SEQ ID NO :1) : l'ATG et le codon stop sont encadrés, la séquence des amorces et des sondes spécifiques : -22 ATG (SEQ ID NO :8),
G.53F (SEQ ID NO :4), G257, G.i2R (SEQ ID NO :5) et G7E2I2R (SEQ ID NO :6) ainsi que le site BamH1 de clonage de l'ADNc sont soulignés. la figure 3 illustre la détection simultanée du transcrit HLA- G7 et des autres transcrits d'HLA-G (HLA-G1 à -G6) dans le foie fœtal, le trophoblaste, le placenta, les membranes amniotiques, la peau saine et les cellules mononucléées du sang périphérique de patients), par RT-PCR, en utilisant les amorces spécifiques d'HLA-G7 : G.53F (SEQ ID NO :4) et G.i2R (I2R ; SEQ ID NO :5) ou les amorces communes d'HLA-G : G.257 et G.1004 (1004 ; SEQ ID NO :11). Les produits d'amplification sont séparés par electrophorese en gel d'agarose et visualisés par Southern blot à l'aide de la sonde G.257 (exon 2) radiomarquée. Ligne 1 : marqueur de poids molécu- laire ; ligne 2 et 3 : échantillons distincts de foies fœtaux de premier trimestre de gestation ; ligne 4 : trophoblaste de premier trimestre de gestation ; ligne 5 : trophoblaste de second trimestre de gestation ; ligne 6 : placenta à terme ; lignes 7, 8 et 9 : échantillons distincts de membrane amniotique à terme, ligne 10 : échantillon de peau saine, ligne 11 : sang de cordon ombilical et ligne 12 : cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC). la figure 4 illustre la détection du transcrit HLA-G7 dans des biopsies de mélanomes issues de six patients (M1 à M6), par RT-PCR, en utilisant les amorces spécifiques d'HLA-G7, G.53F (SEQ ID NO :4) et G.i2R (I2R SEQ ID NO :5). Les produits d'amplification sont séparés par electrophorese en gel d'agarose et visualisés par coloration au bromure d'éthidium. HS = peau saine, SM = métastase, HLN = ganglion sain, SPT = tumeur primitive, LNM = ganglion métastatique. Le transcrit β-actine est utilisé pour normaliser les résultats des différents échantillons. la figure 5 correspond à l'exemple de la figure 4 aux seules différences que les autres transcrits d'HLA-G (HLA-G1 à G6) sont détectés simultanément par RT-PCR à l'aide des amorces communes d'HLA- G1 à G6, G.257 et GA.3U (3.GU) et que la détection des produits d'amplification de tous les transcrits d'HLA-G est effectuée par Southern Blot à l'aide de la sonde G.R (exon 2) radibmarquée. HS = peau saine, SM = métastase, HLN = ganglion sain, SPT = tumeur primitive, LNM = ganglion métastatique. Le transcrit β-actine est utilisé pour normaliser les résultats des différents échantillons. la figure 6 illustre la séquence en acides aminés de l'isoforme HLA-G7 : la position des exons 1 et 2 est indiquée et les 2 acides aminés spécifiques de HLA-G7 codés par l'intron 2 sont encadrés. la figure 7 illustre la détection en Western blot, à l'aide d'un anticorps spécifique d'un peptide de l'exon 2 d'HLA-G, de la protéine recombinante HLA-G7 exprimée dans les cellules de mélanome M8 (M8-G7) transfectées par le plasmide B4C2. Les cellules de choriocarcinome (JEG-3) et les cellules M8 transfectées par un vecteur contenant un ADNc codant l'ensemble des isoformes HLA-G (M8-gen) sont utilisées comme témoin posi- tif. Les cellules M8 transfectées par un vecteur vide (M8-pcDNA) sont utilisées comme témoin négatif.
Exemple 1 : Clonage et séquençaqe d'un ADNc codant l'isoforme HLA- G7 soluble.
1.1 Matériels et méthodes L'ADNc correspondant à l'ensemble des transcrits HLA-G est isolé par RT-PCR à partir de l'ARN extrait de la lignée de choriocarcinome JEG-3 , provenant de l'ATCC, en utilisant les amorces : -22ATG en 5' (SEQ ID NO :9) :
5' GCTCTAGAGCTCCCCAGACGCCAAGGATG 3' Xbal et
G3s en 3' [SEQ ID NO :10, (figure 1 )] :
5'CGGGATCCGTTAAAGGTCTTCAGAGAGGCTCCT 3
BamH1
Les produits d'amplification sont ensuite digérés par les enzymes de restriction Xbal et BamH1 dont les séquences sont comprises dans les amorces -22ATG et G3s comme indiqué ci-dessus, puis ils sont insé- rés par ligation dans les sites compatibles du vecteur d'expression eucaryote pcDNA 3.1 Hygro" (Invitrogen). Ce vecteur comprend le promoteur CMV, le gène de résistance à l'ampicilline, pour la sélection des bactéries recombinantes et le gène de résistance à l'hygromycine, pour la sélection des cellules eucaryotes transfectées par un plasmide recombinant.
Après transformation de bactéries E.coli avec le produit de ligation, les colonies contenant le plasmide recombinant, comprenant l'ADNc de l'isoforme HLA-G7 soluble, sont sélectionnées par hybridation avec la sonde G.R localisée dans l'exon 2 du gène HLA-G (figure 1 ). L'ADN des colonies positives est extrait et digéré par les enzymes de restriction Nhe I et Hindlll permettant d'exciser l'insert HLA-G7. La taille du fragment obtenu avec les différents clones est vérifiée par electrophorese du produit de digestion sur gel d'agarose et coloration au bromure d'éthidium. Puis, la séquence double-brin des clones contenant des inserts de taille correspondant à celle attendue est déterminée en utilisant les amorces universelles T7 et pcDNA3.1 BGH (Invitrogen). 1.2 Résultats
Le clone B4C2 contient un ADNc correspondant à un nouveau transcrit HLA-G, dénommé HLA-G7 dont la séquence (SEQ ID NO :2) est représentée dans la figure 2. Cet ADNc code pour une nouvelle isoforme d'HLA-G qui comporte uniquement le domaine α1 de la molécule HLA-G (exon 1), additionné de deux acides aminés C-terminaux codés par l'intron 2 du gène HLA-G qui sont spécifiques de cette isoforme. Cet ADNc ne comporte pas le domaine transmembranaire codé par l'exon 5, ni de domaine cytoplasmique codé par l'exon 6, permettant son ancrage à la membrane cellulaire ; il code pour une nouvelle forme HLA-G7 soluble qui est équivalente à une isoforme HLA-G3 soluble.
Cet ADNc est issu d'un transcrit qui résulte d'un nouvel épis- sage alternatif d'HLA-G et inclut l'intron 2, provoquant ainsi une modification du cadre de lecture, lors de la traduction de ce transcrit et l'apparition d'un codon stop après l'acide aminé 2 de l'intron 2 (figure 2). Exemple 2 : Détection des transcrits HLA-G7 dans des tissus normaux ou tumoraux
2.1 Matériels et méthodes
L'ARN est extrait de différents tissus normaux et tumoraux et les transcrits HLA-G7 sont analysés par RT-PCR; selon le protocole décrit dans la demande WO 98/37098, en utilisant un couple d'amorces spécifiques :
• Amorce 5' localisée dans l'exon 1 du gène : G.53F (SEQ ID NO :4) 5' CCCTGACCCTGACCGAGACCTGGG 3'
• Amorce 3' spécifique du transcrit HLA-G7 localisé dans l'intron 2 :
G.Ï2R (SEQ ID NO :5) 5' GCA TGG AGG TGG GGG TCG TGA 3'
Le produit de 346 pb, généré par RT-PCR, est séparé par electrophorese en gel d'agarose et visualisé par coloration au bromure d'éthidium. Alternativement, la spécificité des produits amplifiés est confirmé, par Southern Blot, après transfert de l'ADN sur une membrane de nitrocellu- lose et hybridation avec la sonde G.257 (demande FR 2 775 294) spécifique de l'exon 2, radiomarquée (figure 1 ).
Les autres transcrits d'HLA-G sont analysés en parallèle à l'aide des couples d'amorces suivants qui amplifient les autres transcrits HLA- G (G1 à G6), (figure 1 ) :
Couple 1 :
- G.257 (demande FR 98 0207), spécifique de l'exon 2 et
- GA.3U (demande 2 775 294), spécifique de la région 3' non traduite ou
Couple 2 :
- G.257 et
- G.1004 : 5' CCTTTTCAATCTGAGCTCTTCTTT 3' (SEQ ID NO :1 1 ), spécifique de la jonction exon 5-exon 6. De préférence, on utilise le couple G.257 et G.1004 (couple 2) qui est plus spécifique que le couple 1 car il n'amplifie que les transcrits épissés d'HLA-G. En revanche, le couple 1 amplifie également l'ADN géno- mique d'HLA-G qui peut éventuellement contaminer les préparations d'ARNm.
Pour la réaction d'amplification PCR, le couple 2 est utilisé dans les conditions suivantes : 1 min à 94°C, 1 min 30 s à 61 °C et 2 min à 72°C, pendant 35 cycles.
L'amplification simultanée du transcrit de la β-actine permet de normaliser les résultats obtenus avec les différents échantillons d'ARN. 2.2 Résultats :
2.2.1 Tissus normaux : Les résultats sont illustrés dans le tableau I et la figure 3.
Tableau I
Figure imgf000022_0001
La distribution du transcrit HLA-G7 suit celle des autres transcrits HLA-G ; le transcrit HLA-G7 est détecté dans les tissus normaux où les autres transcrits HLA-G sont abondamment transcrits (membrane amniotique, placenta, trophoblaste et thymus). En revanche, chez des individus sains, il est absent de tissus ou les autres transcrits d'HLA-G sont détectables (sang de cordon ombilical, ganglions lymphatiques, peau, cellules mononucléées du sang périphérique). 2.2.2 Tissus tumoraux :
Les résultats sont illustrés dans les figures 4 et 5. Le transcrit HLA-G7 est détecté dans les biopsies de tumeurs primitives, de ganglions et de tumeurs métastatiques de mélanomes. Dans ces biopsies, la répartition du transcrit HLA-G7 suit celle des autres transcrits HLA-G.
Le transcrit est également détecté dans des biopsies de tumeurs du sein.
Ces résultats montrent que dans l'ensemble des tissus tumo- raux testés, la répartition du transcrit HLA-G7 suit celle des autres transcrits HLA-G (HLA-G1 à G6).
Exemple 3 : Modulation du taux de transcrits HLA-G7 3.1 Matériels et méthodes
Les cellules (cultures primaires ou lignées cellulaires) sont traitées par différents agents, dans les conditions suivantes:
- L'Interféron β (1000 Ul/ml), pendant 24 h Le stress thermique : 2 heures à 42°C Un agent qui modifie le taux d'acétylation des histones ; incubation pendant 24 h, en présence de butyrate (3 mM), - Un agent déméthylant ; incubation pendant 72 h, en présence de 5 Aza 2' désoxycytidine (1 μM).
L'ARNm total est extrait des cellules 24 heures après l'arrêt du traitement sauf dans le cas du stress thermique où les cellules sont remises en culture pendant 6 h ou 30 h, avant l'extraction de l'ARNm total. Puis les transcrits spécifiques d'HLA-G7 sont amplifiés par RT-PCR, quantifiés par rapport aux transcrits de l'actine, selon le protocole expérimental décrit à l'exemple 2 et l'augmentation du taux de transcrits HLA-G7, après les différents traitements, est déterminée par rapport au contrôle (échantillon de cellules non-traitées). 3.2 Résultats
Dans les cultures primaires de mélanomes, les cellules épi- théliales thymiques, les cellules amniotiques, les cellules d'expiants tropho- blastiques issus de placenta de premier trimestre de grossesse et les cellules de lignée de mélanome M8, la transcription de l'isoforme HLA-G7 est activée par l'interféron β, le stress thermique, et le traitement au butyrate et aux agents déméthylants. Exemple 4 : Expression et caractérisation de la protéine HLA-G7. 4.1 Matériels et méthodes
Les ADNc codant les isoformes HLA-G solubles, HLA-G5, HLA-G6 et HLA-G7 sont clones dans deux types de vecteurs d'expression eucaryotes : 1 ) Un vecteur pcDNA3.1 (hygro", Invitrogen) permettant l'expression des protéines sous le contrôle du promoteur CMV, la sélection des cellules transfectées en présence d'hygromycine et la détection des protéines exprimées.
2) Un vecteur (pEF6/V5-His, Invitrogen) permettant l'expression des protéines sous contrôle du promoteur EF-1 alpha, la sélection des cellules transfectées en présence de blasticidine et la purification des protéines recombinantes exprimées grâce aux séquences C-terminales (polyhistidine et épitope V5). En outre, l'introduction d'un site entérokinase entre la séquence d'HLA-G7 et lesdites séquences C-terminales permet, d'éliminer lesdites séquences après la purification de la protéine HLA-G7, par digestion à l'entérokinase.
Les vecteurs recombinants contenant respectivement les ADNc codant les isoformes HLA-G5, G6 et G7 sont construits selon la méthode, décrite à l'exemple 1 pour le vecteur d'expression de l'isoforme HLA-G7 (B4C2). Puis, ils sont transfectées dans deux types de cellules n'exprimant aucun des transcrits HLA-G ; les cellules de mélanome M8 qui expriment uniquement les molécules de classe I classiques et les cellules de Teratocarcinome Tera-2 (ATCC), ainsi que les cellules érythroleucémiques humaines K562 (ATCC) qui n'expriment aucune molécule HLA. Les extraits protéiques des cellules transfectées sont séparés par electrophorese en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et la protéine HLA- G7 est détectée par Western blot à l'aide d'un anticorps spécifique d'un peptide localisé dans l'exon 2 (domaine α1 ). 4.2 Résultats
Ils sont illustrés dans les figures 6 et 7. Afin de caractériser la protéine codée par le transcrit HLA-G7
(figure 6) et d'évaluer les propriétés de cette nouvelle isoforme par rapport aux autres isoformes solubles, les isoformes solubles HLA-G5, G6 et G7 ont été exprimées dans des cellules eucaryotes. Dans les extraits protéiques de cellules de mélanome M8 transfectées par B4C2, le vecteur d'expression de l'isoforme HLA-G7 soluble, une protéine HLA-G7 de poids moléculaire identique à celui de la protéine HLA-G7 exprimée dans les cellules témoins JEG-3, est détectée en Westem-blot, à l'aide d'un anticorps spécifique d'un peptide localisé dans l'exon 2 d'HLA-G (peptide
EEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRG, demande WO 96/31604) qui permet la détection spécifique de toutes les isoformes d'HLA-G (figure 7).

Claims

REVENDICATIONS 1 °) Séquence d'ADNc, issue d'un ARNm du gène HLA-G humain du complexe majeur d'histocompatibilité, isolé à partir de cellules humaines de type trophoblastique, caractérisée: • en ce qu'elle code une isoforme d'HLA-G soluble dénommée isoforme HLA-G7 et
• en ce qu'elle présente la séquence SEQ ID NO :1. 2°) Fragment d'un ARNm du gène HLA-G humain du complexe majeur d'histocompatibilité, isolé à partir de cellules humaines de type trophoblastique, caractérisé en ce qu'il comprend la SEQ ID NO :1 et en ce qu'il présente la SEQ ID NO :2.
3°) Fragments de la séquence SEQ ID NO :2, caractérisés en ce qu'ils permettent la détection spécifique du transcrit HLA-G7 et en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par : a) la SEQ ID NO :3 b) les séquences SEQ ID NO :5 et 6 et c) les séquences nucléotidiques complémentaires des séquences précédentes, les fragments d'au moins 15 nucléotides issus des séquences précédentes et leurs séquences complémentaires. 4°) Paires d'amorces, caractérisées en ce qu'elles permettent l'amplification spécifique du transcrit HLA-G7 et en ce qu'elles sont sélectionnées dans le groupe constitué par : la paire A : amorces SEQ ID NO :4 et SEQ ID NO : 5 et la paire B : amorces SEQ ID NO :4 et SEQ ID NO :6. 5°) Oligonucléotide antisens, caractérisé en ce qu'il est apte à inhiber la transcription d'un transcrit HLA-G et en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences d'au moins 15 nucléotides complémentaires de la SEQ ID NO : 2.
6°) Utilisation d'un oligonucléotide selon la revendication 5 pour la préparation d'un médicament apte à rompre la tolérance immune, destiné au traitement des tumeurs exprimant au moins un transcrit HLA-G. 7°) Protéine isolée, dénommée protéine HLA-G7, caractérisée : en ce qu'elle est codée par la séquence SEQ ID NO :1 , en ce qu'elle est constituée par le domaine α1 de la molé- cule HLA-G, suivi de 2 acides aminés codés par l'intron 2 du gène HLA-G,
- en ce qu'elle est soluble et
- en ce qu'elle correspond à la séquence SEQ ID NO :7.
8°) Peptide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence X- Ala-Ser-Glu, où X est un fragment de 3 à 112 acides aminés issu de la séquence SEQ ID NO :7.
9°) Protéine selon la revendication 7 ou peptide selon la revendication 8, sous forme de tétramère.
10°) Peptide, caractérisé en ce qu'ils correspond à un fragment d'au moins 6 acides aminés de la séquence SEQ ID NO :7 et en ce qu'il est multimérisé sous forme de tétramère.
11°) Protéine ou peptide selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce qu'il est associé à une molécule sélectionnée dans le groupe constitué par : un marqueur, un agent cytotoxique, ou des liposomes. 12°) Protéine ou peptide selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce qu'il est immobilisé sur un support solide.
13°) Cassette d'expression d'une protéine ou d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 7 à 1 1 , caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un promoteur convenable lié de façon opérationnelle à la séquence SEQ ID NO :1 ou à un fragment d'au moins 18 nucléotides issu de cette séquence.
14°) Cassette d'expression selon la revendication 13, caractérisée en ce que ladite séquence comprend au moins une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par : les séquences codant un marqueur ou les séquences codant un peptide cytotoxique.
15°) Vecteur d'expression d'une protéine ou d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 7 à 1 1 , caractérisé en ce qu'il comprend au moins : une origine de réplication procaryote et/ou eucaryote, un marqueur permettant la sélection de cellules procaryotes et/ou eucaryotes et une cassette d'expression selon la revendication 13 ou la revendication 14.
16°) Vecteur d'expression selon la revendication 15, caracté- risé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les vecteurs d'expression procaryotes et les baculovirus recombinants.
17°) Vecteur d'expression selon la revendication 15 ou la revendication 16, caractérisé en ce que ladite cassette d'expression correspond à la séquence SEQ ID NO :1. 18°) Cellules transformées, caractérisées en ce qu'elles expriment une protéine ou un peptide selon l'une quelconque des revendications 7 à 1 1 et en ce qu'elles contiennent un vecteur d'expression d'HLA-G selon l'une quelconque des revendications 15 à 17.
19°) Vecteur de recombinaison homologue, caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression selon la revendication 13 ou la revendication 14.
20°) Mammifère non-humain recombinant, caractérisé en ce qu'il exprime une protéine ou un peptide selon l'une quelconque des revendications 7 à 11 et en ce qu'il porte, intégré dans son génome, au moins une copie de la cassette d'expression selon la revendication 13 ou la revendication 14.
21 °) Organes isolés, caractérisés en ce qu'ils expriment une protéine ou un peptide selon l'une quelconque des revendications 7 à 1 1 et en ce qu'ils sont issus d'un mammifère non-humain recombinant selon la reven- dication 20.
22°) Cellules isolées, caractérisées en ce qu'elles expriment une protéine ou un peptide selon l'une quelconque des revendications 7 à 11 et en ce qu'elles sont issues d'un mammifère non-humain recombinant selon la revendication 20. 23°) Utilisation d'une protéine ou d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 7 à 11 pour l'obtention d'un médicament à visée immunomodulatrice. 24°) Utilisation selon la revendication 23, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné au traitement du rejet de greffe, du rejet de grossesse, de la pré-éclampsie, des maladies auto-immunes ou des pathologies inflammatoires. 25°) Utilisation selon la revendication 23 ou la revendication
24, caractérisée en ce que ladite protéine ou ledit peptide est associé à un facteur apte à stimuler son expression.
26°) Utilisation selon la revendication 25, caractérisée en ce que ladite protéine ou ledit peptide est associé à l'interféron β et ou à l'ILIO. 27°) Utilisation d'une protéine ou d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 7 à 1 1 pour la préparation d'un vaccin antitumoral, destiné à la prévention et au traitement des tumeurs exprimant au moins une isoforme d'HLA-G.
28°) Anticorps, caractérisé en ce qu'il reconnaît spécifique- ment le domaine α1 d'HLA-G et en ce qu'il est obtenu par immunisation de mammifères non-humains avec la protéine ou le peptide selon l'une quelconque des revendications 7 à 1 1.
29°) Utilisation d'un anticorps selon la revendication 28 pour la préparation d'un médicament anti-tumoral, destiné au traitement des tumeurs exprimant au moins une isoforme d'HLA-G.
30°) Utilisation selon la revendication 29, caractérisée en ce que ledit anticorps est associé à des facteurs aptes à inhiber l'expression d'une isoforme d'HLA-G.
31 °) Procédé de détection d'anticorps spécifiques du domaine α1 des isoformes HLA-G solubles dans un échantillon de liquide biologique, pour la surveillance de patientes enceintes présentant un risque d'avortement spontané et pour la détection, la surveillance et le monitoring de patients atteints de maladies autoimmunes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) immobilisation sur un support solide, d'une protéine ou d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 7 à 12, b) mise en contact avec l'échantillon à tester et c) détection du complexe antigène-anticorps éventuellement formé, par une méthode immunochimique.
32°) Procédé de détection, de tri, de déplétion et de modulation de l'activité, des cellules qui possèdent un récepteur apte à se lier au domaine α1 des isoformes d'HLA-G, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact de la population cellulaire à analyser avec une protéine ou un peptide HLA-G selon l'une quelconque des revendications 7 à 12, b) addition d'un anticorps anti-HLA-G selon la revendication
28 marqué et/ou éventuellement associée à des moyens permettant d'améliorer la sensibilité de la détection du complexe antigène-anticorps formé et c) détection et éventuellement tri des cellules marquées. 33°) Méthode de surveillance de l'évolution d'une tumeur exprimant une protéine selon la revendication 7 ou d'une infection virale interférant avec l'expression d'HLA-G, caractérisée en ce qu'elle comprend le dosage de ladite protéine HLA-G7 soluble à partir du sérum, selon les étapes suivantes: a) incubation du sérum à analyser avec un anticorps selon la revendication 28, éventuellement marqué et b) détection du complexe antigène-anticorps formé par une méthode immunochimique.
34°) Utilisation d'un oligonucléotide selon la revendication 5, pour la préparation d'un médicament apte à rompre la tolérance immune, destiné au traitement des infections virales.
35°) Utilisation d'une protéine ou d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 7 à 11 , pour la préparation d'un vaccin antiviral, destiné à la prévention et au traitement des infections virales interférant avec l'expression d'HLA-G. 36°) Utilisation d'un anticorps anti-HLA-G7 selon la revendication 28, pour la préparation d'un médicament anti-viral, destiné au traitement des infections virales interférant avec l'expression d'HLA-G.
37°) Utilisation d'un anticorps anti-HLA-G7 soluble, en asso- dation avec des facteurs aptes à inhiber l'expression d'HLA-G pour la préparation d'un médicament anti-viral, destiné au traitement des infections virales interférant avec l'expression d'HLA-G.
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