CN102574905A - HLA-Gα1多聚体及其药学用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及α1多聚体和其用途。本发明还涉及产生这种多聚体的方法、包含这种多聚体的药物组合物，以及它们用于治疗各种疾病、包括器官/组织排斥的用途。

Description

HLA-Gα1多聚体及其药学用途
技术领域
本发明涉及新颖多聚体和其药学用途。本发明更具体来说涉及HLA-G抗原的α1多肽的多聚体。本发明还涉及产生这种多聚体的方法、包含这种多聚体的药物组合物，以及它们用于治疗各种疾病、包括器官/组织排斥的用途。
背景技术
主要组织相容性复合体(MHC)抗原分为三个主要类别，即I类抗原、II类抗原(HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR)和III类抗原。
I类抗原包含：典型抗原HLA-A、HLA-B和HLA-C，其具有与β2微球蛋白缔合的3个球状结构域(α1、α2和α3)；以及非典型抗原HLA-E、HLA-F和HLA-G。
HLA-G是由正常人胎盘上皮细胞的绒毛外滋养层和角膜表达的非典型HLA I类分子。HLA-G抗原基本上由胎盘的细胞滋养层细胞表达，并充当胎儿防御母体免疫系统(无母体排斥)的免疫调节剂。HLA-G基因的序列已被描述(例如Geraghty等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1987，84，9145-9149；Ellis；等人，J.Immunol.，1990，144，731-735)并包含4396个碱基对。该基因由8个外显子、7个内含子和3′未翻译端构成，分别对应于以下结构域：外显子1：信号序列；外显子2：α1胞外结构域；外显子3：α2胞外结构域；外显子4：α3胞外结构域；外显子5：跨膜区；外显子6：胞质结构域I；外显子7：胞质结构域II(未翻译)；外显子8：胞质结构域III(未翻译)；和3′未翻译区。
已识别了HLA-G的七个同种型，其中4个是膜结合的(HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3和HLA-G4)，3个是可溶解的(HLA-G5、HLA-G6和HLA-G7)(参见例如Carosella等人，Immunology Today，1996年，第17卷，第407页)。
成熟的HLA-G1蛋白同种型包含三个外部结构域(α1至α3)、跨膜区和胞质结构域。
HLA-G2蛋白同种型不包含该α2结构域，即α1和α3结构域直接连接，随后连接跨膜结构域和胞质结构域。
HLA-G3蛋白同种型缺乏α2和α3结构域，即其包含与跨膜结构域和胞质结构域直接连接的α1结构域。
HLA-G4蛋白同种型缺乏α3结构域，即其包含α1结构域、α2结构域、跨膜结构域和胞质结构域。
可溶解的HLA-G同种型均缺乏跨膜结构域和胞质结构域。更具体来说：
HLA-G5蛋白同种型含有α1、α2和α3结构域，以及由内含子4编码的21个氨基酸残基的额外C末端肽序列(作为在转录剪接和RNA成熟之后内含子4保留的结果)。
HLA-G6蛋白同种型相当于无α2的HLA-G5，即HLA-G6含有α1和α3结构域，以及由内含子4编码的21个氨基酸残基的额外C末端肽序列(作为在转录剪接和RNA成熟之后内含子4保留的结果)。
HLA-G7蛋白同种型仅含有α1结构域，以及由内含子2编码的2个附加的C-末端氨基酸残基(作为在转录剪接和RNA成熟之后内含子2保留的结果)。
所有这些同种型已描述在例如：Kirszenbaum M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994，91，4209-4213；欧洲申请EP 0677582；Kirszenbaum M.等人，Human Immunol.，1995，43，237-241；Moreau P.等人，Human Immunol.，1995，43，231-236中。
先前的研究已表明，HLA-G蛋白能够抑制同种异体应答，例如增殖性T淋巴细胞应答、细胞毒性T淋巴细胞介导的细胞溶解和NK细胞介导的细胞溶解(Rouas-Freiss N.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，1997，94，5249-5254；Proc.Natl.Acad.Sci.，1997，94，11520-11525；SeminCancer Biol 1999，第9卷，第3页)。因此，已提出基于HLA-G的程序用于治疗在同种异体或异种器官/组织移植中的移植物排斥。还已提出HLA-G蛋白用于治疗癌症(EP1054688)、炎性病症(EP1189627)和更一般地用于治疗免疫相关疾病。还已提出将HLA-G蛋白与特定配体融合，以便使HLA-G靶向具体的细胞或组织(WO2007091078)。然而，应该注意，未提供结果或实验数据表明这种这种靶向性融合是有活性的。
由于在两个HLA-G分子的α1结构域的半胱氨酸残基42之间形成分子间二硫桥，HLA-G抗原表现出在体内采用二聚体构象(Apps等人，Eur.J.Immunol.2007，第37卷，第1924页；WO2007/011044)。已提出HLA-G二聚体的受体结合位点比对应单体的受体结合位点更易接近，使得二聚体能比单体具有更高的亲合力和更慢的解离速率。然而，尚不清楚哪种构象对于药物目的而言最具活性，哪种同种型最有效，或者可如何产生适当的HLA-G二聚体或低聚体。
发明内容
本发明涉及HLA-Gα1多肽的多聚体、包含所述多聚体的药物组合物和它们的用途。意外地，本发明显示出，当适当装配时，HLA-Gα1多肽可以产生有能力有效地抑制体内器官排斥的多聚体。因此，这些多聚体表现为治疗这种病症、以及其它免疫相关疾病的很有价值的候选药物。
因此，本发明的目的在于一种包含HLA-G抗原的至少两个α1多肽的多聚体。
如下文所将论述，α1多肽可以用不同方式连接在一起，所述方式例如但不限于通过二硫桥形成、间隔基团和/或载体(carrier)。
本发明的另一个目的在于一种产生如上文所定义的多聚体的方法，所述方法包含在允许多聚化的条件下使α1多肽混合，以及任选将多聚体与游离多肽(即单体)分离。
本发明还涉及SEQ ID NO：1的多肽，以及编码这种多肽的分离核酸和对应的载体(vector)和重组细胞。
本发明的另一个目的为一种包含如上文所定义的或可通过上述方法获得的多聚体的药物组合物。
本发明的另一个目的为一种包含SEQ ID NO：1的多肽的药物组合物。
本发明还涉及如上文所定义的用于治疗器官或组织排斥、炎性疾病或自身免疫疾病的多聚体、多肽或药物组合物。
本发明的另一目的还涉及一种治疗器官/组织排斥的方法，该方法包含对需要它的对象施用有效量的本发明多聚体、多肽或组合物。更具体来说，该方法包含在组织/器官移植之前、期间和/或之后向对象施用多聚体、多肽或组合物。
本发明的另一目的为一种促进对象对移植物的耐受性的方法，该方法包含对需要它的对象施用有效量的如上文所定义的多聚体、多肽或组合物。
本发明可以用于任何哺乳动物对象、优选人类对象。如下文所进一步公开，本发明的多聚体能够基本上抑制在移植后的体内组织排斥。
附图说明
图1：在施用包含α1多聚体的抗体介导型α1包覆珠之后小鼠的移植物存活率。
图2：在施用包含α1多聚体的α1直接包覆珠之后小鼠的移植物存活率。
图3：在施用α1多聚体之后小鼠的移植物存活率。蓝色：仅用珠子的对照组。橙色：单次注射α1直接包覆的珠。黄色：单次注射抗体介导型α1包覆珠。绿色：两次注射α1直接包覆珠。橙红色：两次注射抗体介导型α1包覆珠。
图4：移植心脏存活率分析。
具体实施方式
本发明涉及包含几种HLA-Gα1多肽的多聚体和其用途。本发明的多聚体已表明能有效抑制体内移植物排斥。更具体来说，本发明人已意外地发现，当在多聚体中正确装配时，α1多肽有能力在体内诱导有效的免疫耐受性。
如上文所论述，HLA-G抗原充当胎儿防御母体免疫系统的免疫调节剂。已报道了膜结合的或者可溶解的各种HLA-G同种型。这些同种型含有不同的功能域，所述功能域选自胞外球状结构域、指定的α1、α2和α3、跨膜结构域和胞质结构域。虽然已证明了某些HLA-G同种型(例如成熟HLA-G1)的生物活性和作用机制，但尚未详细研究各结构域、尤其以可溶解形式对免疫调节活性的相对贡献。
在这方面，已证明了HLA-G抗原的抑制活性由与ILT抑制性受体ILT2或ILT4的结合来介导。更具体来说，已提出这种结合通过HLA-G的α3结构域发生(Shiroishi等人，PNAS 103(2006)16412)。Guillard等人(Molecular Immunology 45(2008)419)也已提出α1结构域在NFKB的活化中的作用。然而，这种效果是由与KIR型受体的结合来介导，并且不同于由ILT2或ILT4受体介导的HLA-G的抑制活性，
本发明人现已观察到在多聚体中α1多肽能够防止体内移植物排斥。在这种情况下，能够与HLA-G相互作用的受体是鼠类抑制性受体PIRB(与人ILT-4同源)。然而，该受体已知能与HLA-G的α3结构域相互作用。类似地，在人的体外实验中，所述效果不是由于与ILT-2或ILT-4的相互作用，因为这些受体与HLA-G的α3结构域相互作用。不受理论的约束，本发明人相信所得的意外结果可以解释为：存在未知的抑制性受体，其结合α1多聚体并诱导免疫耐受性(根据体内观察)；或者事实上，α1多聚体采用新颖和预料不到的四级结构，该四级结构允许其与ILT受体相互作用。
所得结果表明，本发明的多聚体展现出高的体内免疫调节活性，并因此表现为治疗免疫相关病症、特别是减少对象不期望或有害的免疫应答的有效药物。所得结果更具体来说表明，与安慰剂相比，本发明的多聚体可以引起移植物存活率增加100％或甚至更多。
因此，本发明的第一目的在于一种包含至少两个α1多肽的多聚体。
在本发明的文本内，术语“α1多肽”是指包含HLA-G抗原的α1结构域的氨基酸序列或其功能性片段、并且基本上缺乏其它功能性HLA-G结构域的多肽。更优选，该α1多肽包含HLA-G抗原的α1结构域的氨基酸序列。在本发明的多聚体中，优选所有α1单体具有相同氨基酸序列。然而，也设想到具有不同序列的α1多肽存在于本发明的多聚体中。
更优选地，该α1多肽包含HLA-G抗原的α1结构域的氨基酸序列、其功能性片段，并且缺乏HLA-G抗原的功能性α2、α3、TM和胞质结构域。
HLA-G的α1结构域是由外显子2编码的，并且对应于成熟人HLA-G的氨基酸1至90。因此，α1结构域的氨基酸序列可以直接得自下列出版物：Geraghty等人，上文所引述的文章；或Ellis等人，J.Immunol.，1990，144，731-735。该序列也可从网上获得(参见例如Genebank numbers for HLA-G：first cloning of genomic sequence：Geraghty等人，PNAS 1987：PubMed ID：3480534，GeneID：3135；Firstcloning of HLA-G 1cDNA：Ellis等人Journal of Immunology 1990.PubMed ID：2295808)。此外，HLA-G5、HLA-G6和HLA-G7的序列也可得自US5,856,442、US6,291,659、FR2,810,047，或Paul等人，Hum.Immunol 2000；61：1138，α1结构域的序列可从其中直接获得。
甚至更优选地，α1多肽包含HLA-G抗原的α1结构域的氨基酸序列、或其功能性片段，并且含有小于20个、更优选小于15个、甚至最优选小于10个或5个附加氨基酸，所述附加氨基酸在天然HLA-G同种型中处于α1结构域侧面。
本发明的α1多肽的具体实例是由HLA-G抗原的α1结构域的序列、或其功能性片段组成的多肽。
在特定实施方式中，该α1多肽基本上由成熟HLA-G抗原的氨基酸1至90、或其功能性片段组成。
优选的α1多肽的序列提供在SEQ ID NO：1中，其代表本发明的一个具体目的。
“功能性片段”是指在作为本发明的多聚体使用时保留了诱导体内移植物耐受性的能力的片段。更优选地，功能性片段包含α1结构域的至少20个、更优选至少30个、40个或50个连续氨基酸。在典型的实施方式中，该功能性片段含有α1结构域的至少60个连续氨基酸。该片段的功能性可以按实验部分中所公开的内容加以验证。具体来说，该功能性可以如下验证：制备该片段的多聚体，在器官/组织移植之前对动物模型施用该多聚体，并验证移植物存活率。在多聚体与空白对照剂相比，将移植物存活时间延长50％的情况下，可以认为该片段是功能性的。
在本发明的特定实施方式中，α1多肽是SEQ ID NO：1的多肽、或其包含SEQ ID NO：1的至少50个连续氨基酸的功能性片段。
应理解，例如由于多态现象，存在HLA-G抗原的天然变体，其包括在本申请中。同样，含有一定(例如1至10个、优选1至5个、最优选1个、2个、3个、4个或5个)氨基酸取代或插入的上述序列的变体也包括在本发明中。
本发明的α1多肽可以通过本领域本来已知的技术产生，例如重组技术、酶技术或人工合成。在优选实施方式中，使用已知的化学和合成器通过人工合成来产生α1多肽。α1多肽可以包含天然氨基酸、或非天然的或修饰的氨基酸残基。它们可以呈L和/或D构象。该多肽可以包含胺键和/或修饰的拟肽键(peptidomimetic linkage)。同样，例如，该多肽可以通过例如化学或物理改变侧向功能而进行末端保护和/或修饰。
如上文所示，本发明涉及α1多肽的多聚体。
在本发明的文本内，术语“多聚体”是指包含缔合在一起的至少两个如上文所定义的α1多肽(单体)的分子(或组合物或产物)。因此术语多聚体包括二聚体，以及包含3个、4个、5个、6个、7个或甚至更多个α1单体的分子。本发明的多聚体可以包含至多100个、500个、1000个或甚至更多个α1单体。此外，除了所述至少两个α1多肽之外，本发明的多聚体可以含有其它单体。具体来说，本发明的多聚体可以含有至少两个α1单体和异源单体。在特定实施方式中，本发明的多聚体仅含有α1多肽。
本发明的多聚体的具体实例是二聚体。在这方面，在特定实施方式中，本发明涉及α1二聚体。
在本发明的多聚体内，各种单体可以用不同方式连接在一起，例如但不限于，通过形成二硫桥(尤其对于二聚体)，或通过间隔基团和/或载体(carrier)。在优选实施方式中，α1多肽共价连接或通过亲合性相互作用连接。
在具体实施方式中，本发明涉及包含两个α1多肽通过二硫桥连接的α1二聚体。更具体来说，所述两个α1多肽通过人HLA-G抗原中42位氨基酸处的半胱氨酸残基之间的二硫桥来连接。
在另一具体实施方式中，α1多肽(或单体)通过间隔区或载体来连接。在具体实施方式中，单体与载体连接，从而产生多聚体。载体可以具有不同的性质。其优选是生物相容的，并最优选是生物惰性的。载体可以是分子，例如蛋白，例如白蛋白(例如人血清白蛋白)，或者是惰性固体载体，例如珠。该珠可以由任何生物相容材料例如玻璃、金属、聚合物、珊瑚等等制成(或覆盖)。在具体实施方式中，载体是平均直径低于50μm、更优选低于10μm、典型约5μm或更小的珠。单体可以通过不同类型的偶联反应例如亲合作用或使用官能团与载体连接。可以通过用结合α1多肽的配体(例如抗体或其片段)包覆该载体来获得亲合作用。还可通过向α1多肽和载体分别添加结合对的成员(例如抗生物素蛋白和生物素)来获得亲合作用。还可通过诸如马来酰亚胺之类的双官能团获得偶联。此外应注意，多聚体可以含有与载体连接并还参与分子间二硫桥形成的单体。
在具体实施方式中，本发明的多聚体是包含与载体连接的两个或更多个α1多肽的分子。
本发明的多聚体可以通过各种技术产生。如上文所论述，单体可以通过不同的偶联技术、例如共价键(例如二硫化桥(difulfide bridge)、双官能团等等)或亲合反应连接在一起。
为了通过二硫键产生多聚体，在允许形成二硫键的条件下，使包含侧向SH基团的α1多肽在溶液中接触，并优选地，使二聚体或多聚体分离。例如，通过凝胶电泳(例如PAGE)，基于它们的分子量，可以使多聚体与单体分离。还可对等份样品使用这种方法来验证多聚体的恰当形成，以测量溶液中多聚体存在的相对量，并且如有必要，调节反应条件。允许形成二硫键的条件包括，例如，10至30℃的温度下历时2至24小时。
为了通过使用载体来产生多聚体，一般在载体存在下，在允许单体附接在载体上的条件下温育单体，并且优选分离多聚体。载体可以是例如固体载体，例如珠，优选微珠。载体还可以是蛋白，例如血清白蛋白。为了有助于单体和载体之间的相互作用，载体可以被官能化以含有能够与单体相互作用的反应基团。例如，载体可以包覆有α1多肽的配体，例如抗体或其片段(例如Fab片段、CDR片段、ScFv等等)或化学偶联试剂(例如，马来酰亚胺)。或者，可以通过能够结合α1多肽的配体的反应物，使载体官能化。例如，载体可以包覆抗-人IgG Fc片段，并且配体可以是针对HLA-G1抗原的人多克隆IgG。在这种情况下，单体、载体和配体可以一起温育，以便允许单体与珠的适当缔合。
在其它实施方式中，载体和单体可以被修饰以含有交叉反应基团(例如抗生物素蛋白和生物素)。在这种情况下，载体和单体的温育会在载体上引起多聚化。
形成的多聚体(即载体和α1多肽之间的复合体)可以使用本领域本来已知的各种技术来分离，所述技术包括离心、沉淀、电磁分离等等。
本发明的多聚体的特定实例是：
-通过二硫桥连接的SEQ ID NO：1的α1多肽的二聚体；
-与载体例如微珠连接的SEQ ID NO：1的α1多肽的多聚体；和
-通过上文公开方法获得的SEQ ID NO：1的α1多肽的多聚体。
如实施例中所述，这些多聚体能够促进体内移植物耐受性。
此外，SEQ ID NO：1的多肽，以及编码SEQ ID NO：1的多肽的核酸分子也代表本发明的特定目的。本发明确实表明SEQ ID NO：1的多肽具有用于治疗移植物排斥的显著体内活性，并且可以用于制备十分有活性的多聚体。
编码核酸可以是例如单链或双链的RNA或DNA。其可以通过本领域本来已知的技术、例如基因工程、化学或酶合成等等产生。在具体实施方式中，核酸还包含编码用于分泌的肽的序列，其与编码所述多肽的序列可操作地连接。因此，这种核酸的表达导致所选宿主细胞分泌所述多肽。允许分泌的肽可以来自各种起源，例如来自人或哺乳动物基因，例如B2M、白细胞介素、HLA-G等等。
本发明的另一个目的还在于一种包含如上文所定义的核酸的载体(vector)。载体可以是克隆和/或表达载体，例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒载体、人工染色体等等。这种载体的特定实例包括pFUSE质粒、pUC质粒、pcDNA质粒、pBR质粒、逆转录病毒载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、λ噬菌体载体等等。载体可以包含调控序列，例如启动子、终止子、复制起点等等。载体可以用于通过重组技术体外产生本发明的多肽，或在基因治疗法中直接体内产生本发明的多肽。
本发明的另一个目的是一种包含核酸或如上文所定义的载体(vector)的重组宿主细胞。该宿主细胞可以是原核的或真核的。原核宿主的实例包括任何细菌，例如大肠杆菌(E.coli)。真核细胞的实例包括酵母菌、真菌、哺乳动物细胞、植物细胞或昆虫细胞。本发明的重组细胞可以通过本领域本来已知的转化技术例如转染、脂质转染、电穿孔、原生质体转化等等制备。这些细胞可以在任何适宜的培养基中维持和培养。
本发明的重组细胞可以用于，例如，体外或离体产生本发明的多肽，或作为细胞治疗产品，用于体内产生多肽。
在这方面，本发明的目的还在于一种产生SEQ ID NO：1的多肽的方法，该方法包含在允许表达所述核酸分子的条件下培养本发明的重组宿主细胞，和回收所产生的多肽。多肽可以使用本领域本来已知的技术例如离心、过滤、色谱技术等等回收和/或纯化。
本发明的另一个目的是一种药物组合物，其包含如上文所定义的或可通过如上文所公开的方法获得的多聚体，以及优选可药用赋形剂或载体。
本发明的另一个目的是一种药物组合物，其包含SEQ ID NO：1的多肽，以及优选可药用的赋形剂或载体。
适宜赋形剂或载体包括任何可药用的介质，例如缓冲剂、稳定剂、稀释剂、盐、防腐剂、乳化剂、甜味剂等等。赋形剂一般包含等渗的水性或非水性溶液，其可以根据已知技术制备。适宜的溶液包括缓冲溶质，例如磷酸盐缓冲溶液、氯化物溶液、林格氏溶液(Ringer`s solution)等等。药物制剂一般是注射组合物的形式，优选液体注射组合物，但也可以设想其它形式，例如片剂、软胶囊(gelules)、胶囊、糖浆等等。本发明的组合物可以通过许多不同途径施用，例如全身、胃肠外、口服、直肠、鼻内或阴道途径。它们优选通过注射施用，例如静脉内、动脉内、肌肉、腹膜内、或皮下注射。也设想了经皮肤施用。具体剂量可以由有技术的专业人员根据病理条件、对象、治疗持续时间、其它活性成分的存在等等来调节。一般而言，组合物包含在10ng和100mg多聚体之间的单位剂量，更优选在1μg和50mg之间，甚至更优选在100μg和50mg之间。本发明的组合物优选以有效量施用，所谓有效量即随时间推移足以至少降低或防止疾病进展的量。就此而言，优选以允许降低对象有害或不期望的免疫应答的量来使用本发明的组合物。
如上文提及，本发明的多聚体具有强免疫调控活性，并且可以用于治疗与异常或不想要的免疫应答相关的各种疾病病况。更具体来说，本发明的多聚体适于治疗免疫相关病症，例如具体来说，器官或组织排斥、炎性疾病或自身免疫疾病。
如在实验部分中公开的，本发明的多聚体可以基本上抑制体内同种异体移植物排斥。
因此，本发明的一个目的在于一种如上文所公开用于治疗移植物排斥的多聚体、多肽或组合物。
本发明的另一目的在于一种在对象中治疗移植物排斥的方法，该方法包含对需要它的对象施用有效量的如上文所公开的组合物。
术语治疗是指例如促进在接受对象内的移植物耐受性。治疗可以在移植之前、期间和/或之后实施，并且可以用作现有免疫抑制剂的替代性疗法，或者用作与实际的免疫抑制剂的组合疗法。本发明适用于同种异体的、半同种异体的或甚至异种的移植，并且可以用于任何类型的移植器官或组织，包括但不限于实体组织、液体组织或细胞，包括心脏、皮肤、肾脏、肝脏、肺、肝-肾等等。
本发明的另一个目的是一种用于在对象中移植器官或组织的改进方法，改进之处包含在移植之前、期间和/或之后向对象施用有效量的如上文所公开的组合物。
本发明的另一个目的是一种用于在对象中促进移植物耐受性的方法，该方法包含在移植之前、期间和/或之后向对象施用有效量的如上文所公开的组合物。
本发明的另一个目的是一种用于在对象中减轻移植物排斥的方法，该方法包含在移植之前、期间和/或之后向对象施用有效量的如上文所公开的组合物。
在优选实施方式中，至少两次向对象施用组合物。的确，本申请中所示结果证实，反复施用导致更为提高的有益效果，例如，导致更为显著提高的体内移植物耐受性。
本发明特别适于治疗心脏排斥，即提高对心脏移植物的耐受性。具体来说，所呈现的结果表明，本发明的α1多聚体以剂量-响应方式有效延长心脏的体内移植物存活。虽然以低250倍的剂量使用，但该治疗与参比化合物他克莫司(Tacrolimus)效力相同。此外，心脏移植物排斥开始于他克莫司治疗后第9天，而用本发明的α1多聚体则被迟延到治疗后第11天。本发明因此提供了一种用于提高心脏同种异体移植物移植的显著改进方法。
本发明的另一个目的在于一种如上文所公开用于治疗自身免疫疾病的多聚体、多肽或组合物。本发明还在于一种在对象中治疗自身免疫疾病的方法，该方法包含对需要它的对象施用有效量的如上文所公开的组合物。自身免疫疾病可以是类风湿性关节炎、克罗恩氏病(Crohn′sdisease)或多发性硬化症。在这样的疾病病况中，本发明可以减少造成病变的有害免疫应答。
本发明的另一个目的在于一种如上文所公开用于治疗炎性疾病的多聚体、多肽或组合物。
本发明的另一个目的在于一种在对象中治疗炎性疾病的方法，该方法包含对需要它的对象施用有效量的如上文所公开的组合物。
应理解，组合物实际施用量应该由医师依据相关条件确定和修改，所述相关条件包括待治疗的病况、所施用的确切组合物、个体患者的年龄、重量和应答、患者症状的严重度以及所选施用途径。因此，上述剂量范围旨在提供对本文教导内容的一般性指导和支持，而并不旨在限制本发明的范围。
本发明的其它方面和优点在下面实施例中公开，应认为所示实施例是说明性的，并不限制本申请的范围。
实施例
实施例1：α1多肽的制备
使用肽合成器合成SEQ ID NO：1的α1多肽。
实施例2：通过二硫键连接的α1二聚体
将α1多肽用含(“还原”)或不含(“非还原”)二硫苏糖醇的样品缓冲液温育，煮沸，在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并转移到Hybond ECL硝化纤维素膜上。在用PBS 1X中的脱脂牛奶温育之后，该膜用抗HLA-G多克隆抗体温育过夜，并用辣根过氧物酶接合的山羊抗小鼠二级抗体使其显色。用ECL检测系统(Amersham Pharmacia Biosciences)使膜显色。
在上述状况下，α1多肽形成二聚体，其可以例如通过电泳来识别。
实施例3：使用载体产生α1多聚体
使用硫酸盐胶乳珠(4％w/v 5μm，Invitrogen)作为载体。将它们用α1单体直接地或间接地包覆，所述间接包覆即使用抗HLA-G抗体4H84(0.5mg/ml，BD Pharmingen)。
为了间接包覆，将108硫酸盐胶乳珠与20μg/ml纯化的抗-人HLA-G抗体在37℃下温育2小时，随后用BSA(2mg/ml)温育2小时。在洗涤之后，将珠与1μg/ml的HLA-G α1肽(90聚体，实施例1中产生)在4℃下温育16小时。
为了产生HLA-G肽直接包覆珠，将108硫酸盐胶乳珠用1μg/ml的HLA-G α1肽在4℃下包覆16小时，随后用BSA(2mg/ml)温育2小时。
随后将所有珠用1xPBS洗涤2次。将5ml的HLA-G α1肽(1μg/ml)用于5×106硫酸盐胶乳珠。
将本发明的这种多聚体用于诱导或提高体内移植物耐受性(参见实施例4)。
实施例4：α1多聚体对同种异体皮肤移植的效果
为评估本发明的α-1多聚体的生物活性，进行若干体内研究。
在整个研究中将特定的无病原体C57BL/6(H-2b)小鼠(年龄8至10周)用作皮肤移植受体。受体小鼠接受α1-结合珠。供体皮肤来自II类MHC截然不同的B6.CH-2bm12(bm12，H-2b)小鼠。通过标准方法实施了同种异体皮肤移植。简而言之，将来自供体小鼠(12至14周龄)的尾部的皮肤(1.0cm2)移植到麻醉的受体小鼠的侧面上。移植物用纱布和石膏覆盖，并在第10天移除。每天对移植物评分，直到排斥(定义为：80％的移植组织变得坏死并且尺寸减小)。通过Kaplan Meier存活分析测试所有皮肤移植物存活数据。
在第一系列的实验中，在皮肤移植之前一天，将如实施例3中所公开制备的α1肽包覆的硫酸盐胶乳珠(5×106)腹膜内注射。作为阴性对照，以相同方式制备硫酸盐胶乳珠，不同的是使用1xPBS或HeLa阴性对照，而不使用α1多肽。
这些实验的结果示于图1和图2上。它们表明本发明的α1多聚体能够显著改进体内移植物耐受性。具体来说，它们表明所述多聚体能够显著改进平均存活，这是令人意外的。更具体来说，在未治疗小鼠中平均存活22天，而在治疗小鼠中为25天。同样，与直接包覆珠相比，用通过抗体介导间接包覆制备的多聚体治疗的小鼠显示平均移植物存活时间提高了4天。
应注意，该模型中移植物存活的每一天对应于人类对象中移植物存活大约至少一个月，因此认为本发明的组合物将在人类对象中的移植物存活提高至少若干个月。
这些结果因此表明在同种异体移植(B6.CH-2bm12(bm12，H-2b))之前用α1多聚体治疗一次的小鼠(C57BL/6(H2B))表现出提高的移植物存活。
在野生型小鼠中体内进行的附加研究表明，与单次施用相比，两次注射本发明的多聚体(移植之前24小时，然后移植之后10天)将移植物存活提高6天。在图3中，示出这些附加实验的结果，证实了很强且令人吃惊的移植物耐受效果，导致移植物存活提高超过100％。
因此，这些结果清楚说明并支持所要求保护的α-1多聚体作为提高移植物存活的治疗产品的用途。
实施例5：α1多聚体对防止心脏同种异体移植物排斥的功效
5.1材料和方法
动物
将雄性BALB/c(H-2d)小鼠(重量22至24克)用作供体，并将雄性C57BL/6(H-2b)小鼠(重量24-27克)用作受体。所有小鼠购自CharlesRiver Canada(St.Constant，QC)。以受控的光/暗周期圈养小鼠，并容许其自由接近水和鼠食。
小鼠心脏移植
如Chen，H.等人，(The Journal of Immunology，1996；157：4297-4308)所描述，腹内放置异位心脏移植物。简而言之，用腹膜内注射65mg/kg戊巴比妥麻醉供体和受体小鼠。通过在腔静脉和肺静脉结扎之前用冷盐水灌注下腔静脉将供体心脏激冷至4℃，使供体肺动脉和主动脉留下开口以便吻合。将移植物储存于4℃盐水中少于20分钟。在使受体的肾内腔静脉和主动脉暴露之后，使用11-0尼龙缝线(AROSurgical，Newport Beach，CA)进行供体肺动脉与受体腔静脉以及供体主动脉与受体主动脉的端-侧微血管吻合。每天通过腹部触诊评价心搏。将排斥的时间定义为可触知的心肌收缩的最后日，并在剖腹术后确认。
免疫抑制剂
将经二硫桥连接的α1二聚体在PBS中稀释至终浓度150μg/ml，并经由皮下施用。FK506(他克莫司)治疗组每天口服施用FK5065mg/kg。未接触药物的对照小鼠仅接受PBS。
实验设计
.1组.未接触药物的对照N＝6
PBS处理前皮下施用，然后每周施用一次
.2组.HLA-G低剂量    N＝6
处理前皮下施用15μg/小鼠，然后每周一次
.3组.HLA-G低剂量    N＝3
处理前皮下施用15μg/小鼠，然后每隔一天施用
.4组.HLA-G低剂量    N＝3
处理前24小时及处理当天皮下施用15μg/小鼠，然后每隔一天施用
.5组.FK506    N＝6
处理当天口服施用FK5065mg/kg，然后每天施用直到手术后第14天
.6组.HLA-G中等剂量    N＝6
处理疗前皮下施用30μg/小鼠，然后每周施用一次
.7组.HLA-G高剂量    N＝6
处理前皮下施用60μg/小鼠，然后每周施用一次
统计分析
通过在SPSS软件(13.0版)中使用Kaplan-Meier存活分析(KMSA)[配对比较(对数秩)]，进行心脏同种异体移植物存活数据的统计分析。认为结果在p＜0.05处是显著的。
5.2结果
移植心脏存活数据概括在图4中和下表1中。
这些结果表明，α1二聚体显著延长小鼠同种异体移植物存活，具有剂量相关关系。治疗是长效的，因为每周一次注射维持移植物存活。此外，移植物排斥仅在α1治疗11之后开始，其优于用参比化合物他克莫司的治疗。
因此，这些结果清楚地说明本发明的α1多聚体对防止心脏移植排斥的功效。
表1.存活分析
Figure BDA0000133667850000201
序列表
G S H S M R Y F S A A V S R P G R G E
Gly Ser His Ser Met Ary Tyr The Ser Als Ala Val Ser Ary Pro Gly Ary Gly Gly
P R F I A M G Y V D D T Q F V R F D S
Pro Ary Pro Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Asp Phe Asp Ser
D S A C P R M E P R A P W V E Q E G P
Ary Ser Ala Cys Pro Ary Met Gle Pro Ary Ale Pro Trp Val Gle Gle Gle Gry Pre
E Y I _ E E T R N T K A H A Q T D R M
Gln Tys Trp Gln Gln Gln Trp Rsp Rsp The Ala His Ale Gln The Asp Arg Met
N L Q T L R G Y Y N Q S E A
Asp Gln Gln Phe Glu Asp Gly Tyr Tyr Asq Gln Ser Gln Ala
SEQ ID NO：1
Figure IDA0000133667930000011

Claims (16)

1.一种多聚体，其包含HLA-G抗原的至少两个α1多肽，所述至少两个α1多肽中的每一个包含HLA-G抗原的α1结构域的氨基酸序列、或其功能性片段，并且基本上缺乏其它功能性HLA-G结构域。
2.根据权利要求1所述的多聚体，其中所述至少两个α1多肽通过二硫桥连接。
3.根据权利要求1所述的多聚体，其中所述至少两个α1多肽通过载体或间隔基团连接。
4.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体，其包含至少三个α1多肽，优选至少4个、5个、6个或7个α1多肽。
5.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体，其中所述α1多肽包含HLA-G抗原的α1结构域的氨基酸序列、或其功能性片段，并且缺乏HLA-G抗原的功能性α2、α3、TM和胞质结构域。
6.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体，其中所述α1多肽基本上由成熟HLA-G抗原的氨基酸1至90、或其包含至少50个氨基酸的功能性片段组成。
7.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体，其中所述α1多肽是SEQ ID NO：1的多肽、或其包含SEQ ID NO：1的至少50个连续氨基酸的功能性片段。
8.根据权利要求3所述的多聚体，其中所述载体是多肽，例如人血清白蛋白，或是珠。
9.一种α1多肽的二聚体。
10.一种产生权利要求1至9中任一项所述的多聚体的方法，所述方法包含在允许α1多肽多聚化的条件下使所述α1多肽混合，并收集多聚体。
11.根据权利要求10所述的方法，其中在载体、优选微珠或人血清白蛋白存在下使所述多肽混合，并且分离所述多聚体。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述载体是结合α1多肽的亲合试剂包覆的微珠。
13.一种药物组合物，其包含权利要求1至9中任一项所述的或者能通过权利要求10至12中任一项所述的方法获得的多聚体。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其用于治疗器官或组织排斥。
15.根据权利要求13所述的药物组合物，其用于治疗炎性疾病或自身免疫疾病。
16.SEQ ID NO：1的多肽。
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