JP2012507994A - Hla−gタンパク質及びその薬学的使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、新規なタンパク質及びその薬学的使用に関する。本発明は、更に詳しくは、免疫グロブリンのFcドメインに融合されたHLA−G抗原のドメインを含む、新規な融合タンパク質に関する。本発明は、このようなポリペプチドを産生する方法、このようなポリペプチドを含む薬学的組成物、及び器官/組織拒絶反応を含む種々の疾患を処置するためのそれらの使用にも関する。
Description
本発明は、新規なタンパク質及びその薬学的使用に関する。本発明は、更に詳しくは、免疫グロブリンのFcドメインに融合されたHLA−G抗原のドメインを含む新規な融合タンパク質に関する。本発明は、このようなポリペプチドを産生する方法、該ポリペプチドを含む薬学的組成物及び器官/組織拒絶反応を含む種々の疾患を処置するためのその使用にも関する。
技術背景
主要組織適合性複合体(MHC)抗原は、3つの主要なクラス、即ち、クラスI抗原、クラスII抗原、(HLA−DP、HLA−DQ及びHLA−DR)、及びクラスIII抗原に分類される。
主要組織適合性複合体(MHC)抗原は、3つの主要なクラス、即ち、クラスI抗原、クラスII抗原、(HLA−DP、HLA−DQ及びHLA−DR)、及びクラスIII抗原に分類される。
クラスI抗原は、在来の抗原、HLA−A、HLA−B及びHLA−Cを含み、これらは3つの球状ドメイン([α]1、[α]2及び[α]3)を示し、そしてクラスI抗原は非在来の抗原HLA−E、HLA−F及びHLA−Gも含む。
HLA−Gは、正常なヒト胎盤及び胸腺上皮細胞の絨毛外栄養膜(extravillous trophoblasts)により発現されている非クラシックHLA−AクラスI分子である。HLA−G抗原は、本質的に、胎盤の栄養膜細胞層細胞(cytotrophoblastic cells)により発現され、そして母体の免疫系から胎児を保護する(母親による拒絶反応の不存在)免疫モデュレーション剤(immunomodulatory agents)として機能する。HLA−G遺伝子の配列は、記載されており(例えば、 Geraghty et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 9145-9149 ; Ellis; et al., J. Immunol., 1990, 144, 731-735)そして4396塩基対を含む。この遺伝子は、8つのエキソン、7つのイントロン及び3’非翻訳端部からなり、これらは、それぞれ、下記のドメイン:エキソン1:シグナル配列、エキソン2:α1細胞外ドメイン、エキソン3:α2細胞外ドメイン、エキソン4:α3細胞外ドメイン、エキソン5:膜貫通領域、エキソン6:細胞質ドメインI、エキソン7:細胞質ドメインII(非翻訳)、エキソン8:細胞質ドメインIII(非翻訳)及び3’非翻訳領域に対応する。
HLA−Gの7つのアイソフォームが同定されており、その中でも4つは膜結合しており(HLA−G1、HLA−G2、HLA−G3及びHLA−G4)そして3つは可溶性である(HLA−G5、HLA−G6及びHLA−G7)(例えば、Carosella et al., Blood 2008, vol. 111, p 4862参照)。
成熟HLA−G1タンパク質アイソフォームは、3つの細胞外ドメイン(α1〜α3)、膜貫通領域及び細胞質ドメインを含む。
HLA−G2タンパク質アイソフォームはα2ドインを含まない、即ち、α1ドメインとα3ドメインが直接連結されており、次いで膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインが続く。
HLA−G3タンパク質アイソフォームは、α2及びα3ドメインの両方を欠いており、即ち、それは膜貫通ドメインに直接連結されたα1ドメイン及び細胞質ドメインを含む。
HLA−G4タンパク質アイソフォームは、α3ドメインを欠いており、即ち、それはα1ドメイン、α2ドイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む。
可溶性HLA−Gアイソフォームは、すべて膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを欠いている。更に詳しくは:
HLA−G5タンパク質アイソフォームは、α1ドメイン、α2ドイン及びα3ドメイン、ならびにイントロン4によりコードされている21アミノ酸残基の余分のC末端ペプチド配列を含有する(転写スプライシング及びRNA成熟後のイントロン4保存の結果として)。
HLA−G6タンパク質アイソフォームは、α2なしのHLA−G5に相当し、即ち、HLA−G6は、α1ドメイン及びα3ドメイン、ならびにイントロン4によりコードされている21アミノ酸残基の余分のC末端ペプチド配列を含有する(転写スプライシング及びRNA成熟後のイントロン4保存の結果として)。
HLA−G7タンパク質アイソフォームは、α1ドメインのみ及びイントロン2によりコードされている2つの追加のC末端アミノ酸残基を含有する(転写スプライシング及びRNA成熟後のイントロン2保存の結果として)。
HLA−G5タンパク質アイソフォームは、α1ドメイン、α2ドイン及びα3ドメイン、ならびにイントロン4によりコードされている21アミノ酸残基の余分のC末端ペプチド配列を含有する(転写スプライシング及びRNA成熟後のイントロン4保存の結果として)。
HLA−G6タンパク質アイソフォームは、α2なしのHLA−G5に相当し、即ち、HLA−G6は、α1ドメイン及びα3ドメイン、ならびにイントロン4によりコードされている21アミノ酸残基の余分のC末端ペプチド配列を含有する(転写スプライシング及びRNA成熟後のイントロン4保存の結果として)。
HLA−G7タンパク質アイソフォームは、α1ドメインのみ及びイントロン2によりコードされている2つの追加のC末端アミノ酸残基を含有する(転写スプライシング及びRNA成熟後のイントロン2保存の結果として)。
これらのアイソフォームのすべては、例えば、Kirszenbaum M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 4209-4213; European Application EP 0 677 582; Kirszenbaum M. et al., Human Immunol., 1995, 43, 237-241; Moreau P. et al., Human Immunol., 1995, 43, 231-236)に記載されている。
これまでの研究は、HLA−Gタンパク質が、増殖性Tリンパ球応答、細胞傷害性Tリンパ球媒介細胞溶解及びNK細胞媒介細胞溶解などの同種異系応答(allogeneic responses)を阻害することができることを示した(Rouas-Freiss N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, 94, 5249-5254 ; Semin Cancer Biol 1999, vol 9, p. 3)。結果として、HLA−Gタンパク質は、同種異系又は異種の(xenogenic)器官/組織移植における移植片拒絶反応を処置するために提唱された。HLA−Gタンパク質は、癌(EP1 054 688)、炎症性障害(inflammatory disorders) (EP1 189 627)、更に一般的には、免疫関連疾患の処置のためにも提唱された。HLA−Gを特定の細胞又は組織にターゲティングするために、HLA−Gタンパク質を特定のリガンドに融合させることも提唱された(WO2007091078)。しかしながら、このようなターゲティング融合が有効であることを示すための結果又は実験的データは提供されていないことに留意するべきである。
HLA−Gアイソフォームは、2つのHLA−G分子のα1ドメインのシステイン残基42間の分子間ジスルフイド橋の形成の結果として二量体コンホメーションを取ると思われる。(Apps et al., Eur. J. Immunol. 2007, vol. 37 p. 1924; WO2007/011044)。HLA−G二量体のレセプター結合部位は、対応する一量体のレセプター結合部位よりもより近接可能であり(accessible)であり、その結果二量体は一量体よりも高いアフィニティー及び遅い解離速度を有するであろうということが提唱された。しかしながら、特にHLA−Gの可溶性形態に関してどのコンホメーションが薬学的目的に対して最も有功であるかということも、いかに適切なHLA−G二量体又はオリゴマーが産生されうるかも明らかではない。
発明の概要
本発明は、新規なタンパク質又はポリペプチド、該タンパク質又はポリペプチドを含む薬学的組成物、及びその使用に関する。更に詳しくは、本発明は、HLA−G由来の配列及び免疫グロブリンFcフラグメント由来の配列を含む新規な融合ポリペプチドに関する。これらのポリペプチドは、機能的に活性な二量体複合体を形成することができそしてin vivoで器官拒絶反応を効率的に阻害することができる。したがって、これらのポリペプチドは、このような障害及び他の免疫関連の疾患を処置するための薬物候補を表す。
本発明は、新規なタンパク質又はポリペプチド、該タンパク質又はポリペプチドを含む薬学的組成物、及びその使用に関する。更に詳しくは、本発明は、HLA−G由来の配列及び免疫グロブリンFcフラグメント由来の配列を含む新規な融合ポリペプチドに関する。これらのポリペプチドは、機能的に活性な二量体複合体を形成することができそしてin vivoで器官拒絶反応を効率的に阻害することができる。したがって、これらのポリペプチドは、このような障害及び他の免疫関連の疾患を処置するための薬物候補を表す。
したがって、本発明の目的は、免疫グロブリンのFcドメインの配列を含む第2ポリペプチドに連結されたHLA−G抗原のドメインの配列を含む第1ポリペプチドを含む融合ポリペプチドにある。
開示されたとおり、融合ポリペプチドに含有されたHLA−Gドメインは、HLA−G抗原の細胞外部分のすべて又は一部、典型的には、HLA−Gのα1、α2及び/又はα3ドメインのすべて又は機能的部分を含むことができる。特定の態様においては、Fcドメインは、本発明の2つの融合ポリペプチド間の二量体(ホモ二量体又はヘテロ二量体)の形成を可能とするのに十分な及び/又は免疫グロブリンのエピトープ/抗原特異的ドメインを含有しない、配列を含む。
特定の態様においては、本発明の融合ポリペプチドは、β2ミクログロブリンの配列を含む第3ポリペプチドドメインを更に含む。
本発明の他の目的は、分泌を引き起こすシグナルペプチド配列を更に含む、成熟前の形態の上記したポリペプチドである。
本発明の更なる目的は、上記した融合ポリペプチドをコードする核酸分子にある。
本発明は、上記した核酸分子を含むベクターにも関する。
本発明の他の目的は、上記した核酸分子又はベクターを含むリコンビナントホスト細胞である。
本発明の更なる目的は、核酸分子の発現を可能とする条件下に本発明のリコンビナントホスト細胞を培養しそして産生されたポリペプチドを回収することを含む、上記したポリペプチドを産生する方法である。
本発明は、更に、本発明のポリペプチドの二量体(例えば、ホモ二量体又はヘテロ二量体)に関する。
本発明は、本発明の融合ポリペプチド又はその二量体に特異的に結合する抗体にも関する。
本発明は、一量体又は多量体としての上記したポリペプチドを含む薬学的組成物にも関する。
本発明は、上記したポリペプチドをコードする核酸を含む薬学的組成物又はこのようなポリペプチドを発現するリコンビナント細胞にも関する。
本発明は、更に、器官/組織拒絶反応、炎症性疾患又は自己免疫疾患を処置するためのこのようなポリペプチド又は薬学的組成物に関する。
本発明の更なる目的は、器官/組織拒絶反応を処置することを必要とする被検体に、有効量の本発明のポリペプチド又は組成物を投与することを含む、器官/組織拒絶反応を処置する方法にも関する。更に詳しくは、この方法は、組織/器官移植の前、移植期間中及び/又は移植の後に被検体に前記ポリペプチド又は組成物を投与することを含む。
本発明の更なる目的は、移植片に対する免疫寛容を促進することを必要とする被検体に有効量の上記したポリペプチド又は組成物を投与することを含む、被検体における移植片に対する免疫寛容を促進する方法である。
本発明は、任意の哺乳動物被検体において、好ましくはヒト被検体において使用されうる。更に下記するとおり、本発明のポリペプチドは、移植の後in vivoで組織拒絶反応を実質的に阻害することができる。
発明の詳細な説明
本発明は、HLA−G抗原又はその一部を含む融合ポリペプチドに関する。本発明の融合ポリペプチドは、生物学的に活性な二量体を形成することができそしてin vivoで移植片拒絶反応を有効に阻害することが示された。更に詳しくは、本発明者等は、このようなHLA−G抗原を免疫グロブリンのFcドメインに融合させることにより、強い免疫寛容を誘導する能力を有しそしてin vivoで生物学的に活性なコンホメーションを取ることができる生物学的に活性なタンパク質を発生させることができることを見出した。これらの結果は驚くべきことである。なぜならば、HLA−Gドメインはこのような二量体形成性部分に融合されたことは決してないからであり、そしてこのような二量体内のHLA−Gドメインの空間的位置は天然に存在するHLA−G複合体の空間的位置とは異なるからである。得られた結果は、本発明の融合ポリペプチドがin vivoで高い免疫調節活性を示し、したがって免疫関連障害を処置するための、特に被検体における望まれない又は有害な免疫応答を減少させるための新規な医薬を表すことを示す。
本発明は、HLA−G抗原又はその一部を含む融合ポリペプチドに関する。本発明の融合ポリペプチドは、生物学的に活性な二量体を形成することができそしてin vivoで移植片拒絶反応を有効に阻害することが示された。更に詳しくは、本発明者等は、このようなHLA−G抗原を免疫グロブリンのFcドメインに融合させることにより、強い免疫寛容を誘導する能力を有しそしてin vivoで生物学的に活性なコンホメーションを取ることができる生物学的に活性なタンパク質を発生させることができることを見出した。これらの結果は驚くべきことである。なぜならば、HLA−Gドメインはこのような二量体形成性部分に融合されたことは決してないからであり、そしてこのような二量体内のHLA−Gドメインの空間的位置は天然に存在するHLA−G複合体の空間的位置とは異なるからである。得られた結果は、本発明の融合ポリペプチドがin vivoで高い免疫調節活性を示し、したがって免疫関連障害を処置するための、特に被検体における望まれない又は有害な免疫応答を減少させるための新規な医薬を表すことを示す。
したがって、本発明の第1の目的は、
− 免疫グロブリンのFcドメインの配列を含む第2ポリペプチドに連結された
− HLA−G抗原のドメインの配列を含む第1ポリペプチド、
を含む融合ポリペプチドにある。
− 免疫グロブリンのFcドメインの配列を含む第2ポリペプチドに連結された
− HLA−G抗原のドメインの配列を含む第1ポリペプチド、
を含む融合ポリペプチドにある。
本発明に関して、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、アミン結合を介して又は改変されたペプチド模倣結合を介して相互に連結されうるアミノ酸残基のポリマーを含む分子を、相互に交換可能に表す。該タンパク質又はポリペプチドにおけるアミノ酸残基は、天然のアミノ酸残基又は非天然のもしくは改変されたアミノ酸残基であることができる。それらは、L及び/又はDコンホメーションにあることができる。また、ポリペプチド又はタンパク質は、末端で保護されていてもよく及び/又は例えば側部の機能(lateral functions)の化学的もしくは物理的変更により改変されていてもよい。
本発明の融合ポリペプチド内で、種々のポリペプチドドメインが互いに共有結合で連結されており、そのため、それらは最も好ましくはリコンビナント技術による単一の分子として産生される。
本発明の融合タンパク質内で種々の配置が可能である。特に、種々のドメインをC末端もしくはN−末端に位置させることができ、そして直接又はスペーサー基を介して相互に連結させることができる。最も好ましい態様においては、第1のポリペプチド(即ち、HLA−G由来の配列)は、融合ポリペプチドのC末端に位置している第2ポリペプチド(Fc由来の配列)のN−末端に位置している。実施例に示されたとおり、このようなコンホメーションは、ポリペプチドの二量体化及びin vivoで効率的な生物学的な活性を可能とする。
種々のポリペプチドドメイン間のカップリングは、直接、即ち介在配列なしであることができ(介在アミノ酸残基はカップリング/クローニングのために又は例えば制限酵素(1つ又は複数)に対応してクローニング工程の結果として存在することができるけれども)、又は間接的である、即ち、介在する配列(スペーサー基)を伴うことができる。後者の場合に、スペーサー基は、可変長、典型的には4〜20アミノ酸残基を有することができ、そして好ましくは生物学的に不活性であるべきである。このようなスペーサー基の例は、(G4S)nモチーフであり、ここでnは1〜4の整数である。
本発明の融合タンパク質の好ましい態様においては、第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは直接連結されている。更に詳しくは、HLA−G由来の配列のC末端残基は、Fc由来の配列のN−末端残基に連結されている。
融合ポリペプチドに含有されるHLA−Gドメインは、HLA−G抗原の細胞外部分のすべてもしくは一部、典型的には、HLA−G抗原のα1、α2及び/又はα3ドメインのすべて又は機能的部分を含むことができる。HLA−G1のアミノ酸配列は、例えば、上記に引用されたGeraghty et al. 又は; Ellis; et al., J. Immunol., 1990, 144, 731-735,に記載されている。α1、α2及び/又はα3ドメインのアミノ酸配列は、上記刊行物に直接由来することができる。これらの配列は、オンラインでも入手可能である(例えば、Genebank numbers for HLA-G: first cloning of genomic sequence: Geraghty et al, PNAS 1987: PubMed ID : 3480534, GeneID: 3135 ; First cloning of HLA-G1 cDNA: Ellis et al Journal of Immunology 1990. PubMed ID : 2295808参照)。更に、HLA−G5、HLA−G6及びHLA−G7の配列は、US5,856,442, US6,291,659, FR2,810,047, or Paul et al., Hum. Immunol 2000; 61: 1138).からも入手可能である。
示されたとおり、本発明の融合ポリペプチドは、HLA−G抗原の細胞外ドメインの少なくとも一部を含む。好ましい態様においては、HLA−G抗原はヒトHLA−G抗原である。
特定の態様においては、本発明の融合ポリペプチドは、少なくともヒトHLA−G抗原のα1ドメインのアミノ酸配列を含む。
他の特定の態様にしたがえば、本発明の融合ポリペプチドの第1ポリペプチドは:
− HLA−G抗原のα1、α2及びα3ドメインのアミノ酸配列、
− HLA−G抗原のα1及びα3ドメインのアミノ酸配列、
− HLA−G抗原のα1及びα2ドメインのアミノ酸配列、
− HLA−G5のアミノ酸配列、
− HLA−G6のアミノ酸配列、又は
− HLA−G7のアミノ酸配列、
からなる群より選ばれる。
− HLA−G抗原のα1、α2及びα3ドメインのアミノ酸配列、
− HLA−G抗原のα1及びα3ドメインのアミノ酸配列、
− HLA−G抗原のα1及びα2ドメインのアミノ酸配列、
− HLA−G5のアミノ酸配列、
− HLA−G6のアミノ酸配列、又は
− HLA−G7のアミノ酸配列、
からなる群より選ばれる。
ヒトHLA−Gのα1ドメインのアミノ酸配列の特定の例は、配列番号6に与えられる(アミノ酸残基21〜110)。ヒトHLA−G6のアミノ酸配列の特定の例は、配列番号2に与えられる(アミノ酸残基25〜227)。ヒトHLA−Gのα1、α2及びα3ドメインのアミノ酸配列の特定の例は、配列番号4に与えられる(アミノ酸配列135〜412)。HLA−G抗原の天然変異体が、例えば、本願に包含される多形の結果として存在することは理解されるべきである。ある(例えば1〜10、好ましくは1〜5、最も好ましくは1、2、3、4、又は5)アミノ酸残基を欠いているか及び/又はある(例えば1〜10、好ましくは1〜5、最も好ましくは1、2、3、4、又は5)アミノ酸置換又は挿入を含有する上記配列の変異体も本発明に包含される。
本発明の融合ポリペプチドの第2ポリペプチドドメインは、免疫グロブリンのFcドメインのアミノ酸配列を含む。免疫グロブリンのFc領域は、典型的には重鎖のCH2及びCH3ドメイン及びヒンジ領域を含む。Fcドメインは、好ましくは、本発明の2つの融合ポリペプチド間の二量体(ホモ二量体又はヘテロ二量体)の形成を可能とするのに十分な配列を含む。Fcドメインは、ヒト起源又は動物起源の、例えば、限定することなく、げっ歯類、ウマ又は霊長類起源の免疫グロブリンに由来することができる。典型的には、第2ポリペプチドは、前記免疫グロブリンのエピトープ/抗原特異的ドメインを含まない。好ましくは、第2ポリペプチドは、免疫グロブリンのFcドメインのアミノ酸配列を含みそして免疫グロブリンの機能的可変ドメイン又は抗原結合部位を欠いている。
Fcドメインは、種々の血清型の免疫グロブリン、例えば、IgG、IgA、IgM、IgD又はIgEに由来することができる。Fcドメインの配列は、好ましくは、IgGに由来する。このようなFcドメイン配列の例は、本願において与えられる。特に、ヒトIgGのFcドメインの特定の例は、配列番号2(アミノ酸残基235〜452)において与えられる。マウスIgGのFcドメインの特定の例は、配列番号6(アミノ酸残基120〜端部)において与えられる。配列変動は、得られる配列が二量体を形成する能力を保持しているかぎり、Fcドメイン配列内で許容されうることは理解されるべきである。免疫グロブリンのFcドメインの配列は、当技術分野で知られている技術にしたがって任意の既知の免疫グロブリンの配列から得られうる。Fcドメインの配列は、データベースから得ることもできそしてin vitroで二量体化するその能力について試験されうることは理解されるべきである。
したがって、本発明の特定の態様は、ペプチド結合を介して互いに連結された第1ポリペプチド及び第2ポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、第1ポリペプチドが第2ポリペプチドのN−末端に位置しており、第2ポリペプチドは、融合ポリペプチドのC末端に位置しており、そして第1ポリペプチドは少なくともHLA−G抗原のα1ドメインの配列を含みそして第2ポリペプチドは免疫グロブリンのFcドメインの配列を含む、融合ポリペプチドに関する。
本発明のこのような融合ポリペプチドの特定の例は、
− 配列番号6のHLA−Gα1−Fc(又はその残基21〜351)及び
− 配列番号2のHLA−G6−Fc(又はその残基25〜452)、
である。
− 配列番号6のHLA−Gα1−Fc(又はその残基21〜351)及び
− 配列番号2のHLA−G6−Fc(又はその残基25〜452)、
である。
HLA−Gα1−Fcにおいて、HLA−Gのα1ドメインは、マウスIgG2aのFcドメインに直接融合される。介在するアミノ酸残基111〜119が、2つのドメイン間に存在する。アミノ酸残基1〜20は、インターロイキン−2タンパク質のシグナルペプチド配列に対応する。したがって、成熟形態におけるHLA−Gα1−Fcは、配列番号6のアミノ酸残基21〜351を含む。
HLA−G6−Fcにおいて、HLA−G6の配列は、ヒトIgG2のFcドメインに直接融合される。介在するアミノ酸残基228〜234が、2つのドメイン間に存在する。アミノ酸残基1〜24は、HLA−Gのシグナルペプチド配列に対応する。したがって、成熟形態におけるHLA−G6−Fcは、配列番号2のアミノ酸残基25〜452を含む。
実施例に記載のとおり、これらのポリペプチドは両方ともin vivoで移植片免疫寛容を促進することができる。特に、HLA−Gのα1ドメインのみを含むHLA−Gα1−Fcは、意外にも、in vivoでの移植片拒絶反応を遅延させることにおいて最も有功であった。
上記したとおり、本発明の融合ポリペプチドは、追加の機能的ドメイン(1つ又は複数)を含むことができる。これに関して、特定の態様においては、本発明の融合ポリペプチドは、β2ミクログロブリンの配列を含む第3ポリペプチドドメインを含む。HLA−GのHLA−G1アイソフォームは、細胞表面におけるβ2ミクログロブリンと複合体を形成する。この複合体を模倣するために、本発明は、融合ポリペプチドにおいて、生物学的に活性な複合体の形成を可能とするように配置されたβ2ミクログロブリンの配列を含むことを提唱する。
β2ミクログロブリンのポリペプチド配列は、存在するとき、最も好ましくは、融合ポリペプチドのN−末端部分に位置しており、そしてそれは下記のスキーム:
B2M配列−HLA−G配列−Fcドメイン
にしたがって第1ポリペプチド配列に連結されている。
B2M配列−HLA−G配列−Fcドメイン
にしたがって第1ポリペプチド配列に連結されている。
更に、最も好ましい態様においては、B2M配列は、スペーサー基を介してHLA−G配列に連結されて、ポリペプチドの正しいリフォールディングを可能とする。最も好ましくは、スペーサー基は、8〜20アミノ酸残基、更に好ましくは8〜15、なお更に好ましくは8〜12アミノ酸残基を含む。特定の態様においては、スペーサー基は、配列(G4S)n(式中、nは2又は3である)を有する。
本発明のこのような融合ポリペプチドの特定の例は:
− 配列番号4のHLA−G1−B2M−Fc(又はその残基21〜656)
である。
− 配列番号4のHLA−G1−B2M−Fc(又はその残基21〜656)
である。
HLA−G1−B2M−Fcにおいて、B2M配列はペプチドリンカー(120〜134)を介してHLA−G1のα1−α2−α3ドメインに融合されておりそしてHLA−G1ドメインは、ヒトIgG2のFc配列に連結されている。アミノ酸残基1〜20は、B2Mのシグナルペプチド配列に対応する。したがって、成熟形態において、HLA−G1−B2M−Fcは配列番号4のアミノ酸残基21〜656を含む。
本発明の更なる目的は、上記したポリペプチドの二量体である。二量体は、例えば2つの同一融合ポリペプチド間のホモ二量体、又はFcドメインを含む2つの異なる融合ポリペプチド間のヘテロ二量体であることができる。
本発明の融合ポリペプチドは、人工的合成、リコンビナント技術及び/又はそれらの組み合わせなどの、それ自体当技術分野で知られている技術を使用して得ることができる。実施例で示されたとおり、典型的な態様においては、ドメインは、キメラコード化ポリヌクレオチドから出発して、融合ポリペプチドの形態において好ましくは直接に、リコンビナント技術により産生される。
これに関して、本発明の更なる目的は、上記した融合ポリペプチドをコードする核酸分子である。核酸は、例えば、一本鎖又は二本鎖RNA又はDNAであることができる。それは、遺伝子工学、化学的又は酵素的合成等などのそれ自体当技術分野で知られている技術により産生されうる。特定の態様においては、核酸は、更に、融合ポリペプチドをコードする配列に作用可能に連結された(operably linked)、分泌のためのリーダーペプチドをコードする配列を含む。結果として、このような核酸の発現は、選ばれたホスト細胞による融合ポリペプチドの分泌をもたらす。リーダーペプチドは、種々の起源のものによることができ、例えばヒト又は哺乳動物遺伝子、例えばB2M、インターロイキン、HLA−等からのものであることができる。本発明の核酸の特定の例は、配列番号1、3又は5を含む核酸分子である。
本発明の更なる目的は、上記した核酸を含むベクターにある。ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスベクター、人工的染色体等などのクローニング及び/又は発現ベクターであることができる。このようなベクターの特定の例は、pFUSEプラスミド、pUCプラスミド、pcDNAプラスミド、pBRプラスミド、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ラムダファージベクター等を含む。ベクターは、調節配列、例えば、プロモーター、ターミネーター、複製起点等を含むことができる。ベクターは、遺伝子治療アプローチにおいて、リコンビナント技術によりin vitroで、又はin vivoで直接、本発明のポリペプチドを産生するために使用されうる。
本発明の更なる目的は、上記した核酸又はベクターを含むリコンビナントホスト細胞である。ホスト細胞は、真核細胞又は原核細胞であることができる。原核生物ホストの例は、任意のバクテリア、例えばE. coliを含む。真核細胞の例は、酵母、真菌、哺乳動物細胞、植物細胞又は昆虫細胞を含む。本発明のリコンビナント細胞は、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、プロトプロストトランスフォーメーション等などの当技術分野でそれ自体知られているトランスフォーメーション技術により作成されうる。これらの細胞は、任意の適当な培養培地中に維持されそして培養されうる。
本発明のリコンビナント細胞は、例えば、in vitro又はex vivoで本発明のポリペプチドを産生するため、又は細胞治療産物としてin vivoで本発明のポリペプチドを産生するために使用されうる。
これに関して、本発明の目的は、上記したポリペプチドを産生する方法であって、核酸分子の発現を可能とする条件下に本発明のリコンビナントホスト細胞を培養し、産生されたポリペプチドを回収することを含む方法にある。ポリペプチドは、遠心、ろ過、クロマトグラフィー技術等などの当技術分野でそれ自体知られている技術を使用して回収及び/又は精製されうる。
産生されると、本発明のポリペプチドは、それらの性質を改良するため、例えばそれらの薬物動態学的性質を改良するために改変されうる。この点について、本発明のポリペプチドは、例えば末端保護基(例えば、アミド、エステル)を付加することにより、プロテアーゼに対するそれらの安定性又は耐性を増加させるために改変されうる。本発明のポリペプチドは、ポリペプチド密度を増加させるために担体支持体上にコーティングされることもできる。
本発明の更なる目的は、上記したポリペプチド及び好ましくは薬学的に許容されうる賦形剤もしくは担体を含む薬学的組成物である。
本発明の更なる目的は、上記した核酸及び好ましくは薬学的に許容されうる賦形剤もしくは担体を含む薬学的組成物である。
本発明の更なる目的は、上記したリコンビナント細胞及び好ましくは薬学的に許容されうる賦形剤もしくは担体を含む薬学的組成物である。
適当な賦形剤又は担体は、緩衝剤、安定剤、希釈剤、塩、保存剤、乳化剤、甘味料等などの任意の薬学的に許容されうるビヒクルを含む。賦形剤は、典型的には、既知の技術にしたがって調製されうる等張性水性溶液又は非水性溶液を含む。適当な溶液は、例えば、リン酸緩衝溶液、塩化物溶液、リンゲル液などの緩衝液を含む。薬学的調製物は、典型的には、注射可能な組成物、好ましくは液体の注射可能な組成物の形態にあるが、錠剤、ゲルール(gelules)、カプセル剤、シロップ剤などの他の形態を意図することもできる。本発明の組成物は、好ましくは、多数の異なる経路により、例えば、全身系、非経口、経口、直腸、鼻又は膣経路により投与されうる。本発明の組成物は、好ましくは、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内又は皮下注射などの注射により投与される。経皮投与も意図される。特定の投薬量は、病理学的状態、被検体、処置の期間、他の有効成分の存在等に依存して医師により調節されうる。典型的には、組成物は、融合ポリペプチド10ng〜100mg、更に好ましくは、1μg〜50mg、なお更に好ましくは、100μg〜50mgの単位用量を含む。
本発明の組成物は、好ましくは、有効量で、即ち、時間に対して疾患の進行を少なくとも減少させるか又は防止するのに十分な量で投与される。この点で、本発明の組成物は、好ましくは、被検体におる有害なもしくは望まれない免疫応答の減少を可能とする量で使用される。
上記したとおり、本発明の融合ポリペプチドは、強い免疫調節活性を有しそして異常なもしくは望まれない免疫応答と関連した種々の疾患状態を処置するのに使用されうる。更に詳しくは、本発明のポリペプチドは、特に器官/組織拒絶反応、炎症性疾患又は自己免疫疾患などの免疫関連障害を処置するために適当である。
実験の節に開示されたとおり、本発明のポリペプチドは、in vivoでの同種異系の又は異種の移植片拒絶反応を実質的に阻害することができる。
したがって、本発明の目的は、移植片拒絶反応を処置するための上記したポリペプチド又は組成物にある。
本発明の更なる目的は、移植片拒絶反応を処置することを必要とする被検体に有効量の上記した組成物を投与することを含む、被検体における移植片拒絶反応を処置する方法にある。
処置するという用語は、例えば、受け取る被検体内の移植片免疫寛容の促進を表す。処置は、移植の前、移植期間中及び/又は移植の後に行うことができ、そして現存の免疫抑制剤に代わる治療として又は実際の免疫抑制剤との組み合わせた治療として使用されうる。本発明は、同種異系、半同種異系又は異種移植にすら適用可能でありそして、限定するものではないが、心臓、皮膚、腎臓、肝臓、肺、肝臓−腎臓等を含む固体組織、液体組織又は細胞を含む移植された任意のタイプの器官又は組織のために使用されうる。
本発明の更なる目的は、被検体における器官又は組織を移植するための改良された方法であって、この改良が有効量の上記した組成物を、移植の前、移植期間中及び/又は移植の後に被検体に投与することを含む方法である。
本発明の更なる目的は、被検体における移植片免疫寛容を促進するための方法であって、有効量の上記した組成物を、移植の前、移植期間中及び/又は移植の後に被検体に投与することを含む方法である。
本発明の更なる目的は、被検体における移植片拒絶反応を減少させるための方法であって、有効量の上記した組成物を、移植の前、移植期間中及び/又は移植の後に被検体に投与することを含む方法である。
本発明の更なる目的は、自己免疫疾患を処置するための上記したポリペプチド又は組成物にある。本発明は、自己免疫疾患を処置することを必要とする被検体に有効量の上記した組成物を投与することを含む、被検体における自己免疫疾患を処置する方法にもある。自己免疫疾患は、慢性関節リウマチ、クローン病又は多発性硬化症であることができる。このような疾患状態において、本発明は、病理の原因となる有害な免疫応答を減少させることを可能とする。
本発明の他の目的は、炎症性疾患を処置するための上記したポリペプチド又は組成物にある。
本発明の更なる目的は、炎症性疾患を処置することを必要とする被検体に、有効量の上記した組成物を投与することを含む、被検体における炎症性疾患を処置する方法にある。
実際に投与される組成物の量は、処置されるべき状態(1つ又は複数)、投与される正確な組成、個々の患者の年齢、重量及び応答、患者の症状の重症さ及び選ばれる投与経路を含む問題とされる状況に照らして、医師により決定されそして適合されうる。したがって、上記投薬量の範囲は本明細書における教示のための一般的ガイダンス及び支持を与えることを意図するが、本発明の範囲を限定することを意図しない。
本発明の更なる局面及び利点は、本願を説明するものであって本願の範囲を限定するものではないと考えられる下記の実施例において開示される。
実施例
物質及び方法
PCRによる増殖
DNA20ng、各プライマー200nM、dNTP(Invitrogen)200μM、PCRバッファー10X(Perkin Elmer)2.5μl、Taqポリメラーゼ(Perkin Elmer)2.5単位及び水27μlを含有する最終容積50μlにおいて、GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer)でPCRを行った。
物質及び方法
PCRによる増殖
DNA20ng、各プライマー200nM、dNTP(Invitrogen)200μM、PCRバッファー10X(Perkin Elmer)2.5μl、Taqポリメラーゼ(Perkin Elmer)2.5単位及び水27μlを含有する最終容積50μlにおいて、GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer)でPCRを行った。
使用したプログラムは下記のとおりであった:
94℃で5分間のDNA変性,次いで、
94℃で30秒
58℃で30秒
72℃で1分
で30サイクル、であった。
最後のサイクルの終わりに72℃で5分の工程を行った。
94℃で5分間のDNA変性,次いで、
94℃で30秒
58℃で30秒
72℃で1分
で30サイクル、であった。
最後のサイクルの終わりに72℃で5分の工程を行った。
ベクター
pFUSE-hFc1 及び pFuse-mFc2ベクターの両方とも、会社(InvivoGen)から購入した。
pFUSE-hFc1 及び pFuse-mFc2ベクターの両方とも、会社(InvivoGen)から購入した。
酵素による消化
酵素制限消化を、製造者(Invitrogen)により推奨されたとおりに行った。典型的には、適当なバッファー中でDNA1μg及び制限酵素5単位を使用して37℃で1時間消化を行った。
酵素制限消化を、製造者(Invitrogen)により推奨されたとおりに行った。典型的には、適当なバッファー中でDNA1μg及び制限酵素5単位を使用して37℃で1時間消化を行った。
ライゲーション
発現ベクターへのPCRフラグメントのライゲーシヨンを、製造者により推奨されたとおりにPromegaからのT4DNAリガーゼにより行った。HLA-G5-β2ミクログロブリン構築のために、pcDNA3.1D/V.5-His-Topo(Invitrogen)へのPCRフラグメントのライゲーションを、3.1方向性TOPO(登録商標)発現キット(3.1 Directional TOPO(登録商標)Expression Kit)(Invitrogen)により直接行った。
発現ベクターへのPCRフラグメントのライゲーシヨンを、製造者により推奨されたとおりにPromegaからのT4DNAリガーゼにより行った。HLA-G5-β2ミクログロブリン構築のために、pcDNA3.1D/V.5-His-Topo(Invitrogen)へのPCRフラグメントのライゲーションを、3.1方向性TOPO(登録商標)発現キット(3.1 Directional TOPO(登録商標)Expression Kit)(Invitrogen)により直接行った。
プラスミド精製
プラスミド精製を、製造者により推奨されたとおりGenElute(商標)プラスミドミディプレップ(GenEluteTM Plasmid Midiprep) (Sigma)により行った。
プラスミド精製を、製造者により推奨されたとおりGenElute(商標)プラスミドミディプレップ(GenEluteTM Plasmid Midiprep) (Sigma)により行った。
タンパク質産生
融合タンパク質の産生のために、HEK293T又は HELA細胞をリポフェクタミン法(invitrogen)を使用して多様な構築物によりトランスフェクションし、そして10%ウシ胎仔血清及び0.3Mグルタミンを補充されたDMEM(ダルベッコの改変されたイーグル培地)中で37℃、5%CO2に保った。48時間後、上清を回収し、0.2μMフィルターを通してろ過し、次いで実験のため又はストックを作成するために使用した。
融合タンパク質の産生のために、HEK293T又は HELA細胞をリポフェクタミン法(invitrogen)を使用して多様な構築物によりトランスフェクションし、そして10%ウシ胎仔血清及び0.3Mグルタミンを補充されたDMEM(ダルベッコの改変されたイーグル培地)中で37℃、5%CO2に保った。48時間後、上清を回収し、0.2μMフィルターを通してろ過し、次いで実験のため又はストックを作成するために使用した。
実施例1:HLA−G6−Fcのクローニング及び合成
リーダー配列、α1、α3及びイントロン4のHLA−G cDNA配列をHLA−G6からのpcDNAのテンプレートを使用してPCRにより増幅した。この配列をPCRにより増幅して、下記のプライマー:
を使用してAgeI及びXhoI制限部位を導入した。
リーダー配列、α1、α3及びイントロン4のHLA−G cDNA配列をHLA−G6からのpcDNAのテンプレートを使用してPCRにより増幅した。この配列をPCRにより増幅して、下記のプライマー:
を使用してAgeI及びXhoI制限部位を導入した。
この増幅した配列をAgeI及びXhoI制限酵素により消化し、次いでAgeI及びXhoIで前もって消化されたpFUSE−hFc1ベクターにライゲーションした。得られるcDNA配列は配列番号1に記載されておりそしてアミノ酸配列は配列番号2に記載されている。
タンパク質を物質及び方法に開示されているとおりに産生させた。
実施例2:HLA−G1−B2M−Fcのクローニング及び合成
ヒトβ2ミクログロブリンをコードする配列を、停止コドンを除去しそしてアミノ酸配列(GGGS)x2に対応するスペーサーを導入することを可能とするプライマー
を使用してPCRにより増幅した。
ヒトβ2ミクログロブリンをコードする配列を、停止コドンを除去しそしてアミノ酸配列(GGGS)x2に対応するスペーサーを導入することを可能とするプライマー
を使用してPCRにより増幅した。
並行して、HLA−G1のα1、α2、α3ドメインに対応するcDNA配列を、ペプチドリーダー配列及び停止コドンを除去することを可能とするプライマー
を使用してPCRにより増幅した。β2ミクログロブリン及びHLA−G1PCRフラグメントのα1、α2、α3ドメインの両方をEagI制限酵素で消化し、精製しそして相互にライゲーシヨンした。次いで得られたβ2ミクログロブリン/α1、α2、α3ドメイン融合配列を、MluI及びXhoI制限酵素で消化し、そして前もってMluI及びXhoIで消化されているPGEMT/イージーベクター(Promega)にライゲーションした。次いでこの構築物を、プライマー
を使用してPCRにより増幅した。次いで、増幅された得られたフラグメントをAgeI及びXhoIで消化し、そしてヒトFc IgG2(Invitrogen, Toulouse, France)をコードするcDNAと位相を一致させる(in phase)ために、ベクターpFUSE−hFc1のクローニング部位AgeI及びXhoIに導入した。得られるcDNA配列は配列番号3に記載されておりそしてアミノ酸配列は配列番号4に記載されている。
を使用してPCRにより増幅した。β2ミクログロブリン及びHLA−G1PCRフラグメントのα1、α2、α3ドメインの両方をEagI制限酵素で消化し、精製しそして相互にライゲーシヨンした。次いで得られたβ2ミクログロブリン/α1、α2、α3ドメイン融合配列を、MluI及びXhoI制限酵素で消化し、そして前もってMluI及びXhoIで消化されているPGEMT/イージーベクター(Promega)にライゲーションした。次いでこの構築物を、プライマー
を使用してPCRにより増幅した。次いで、増幅された得られたフラグメントをAgeI及びXhoIで消化し、そしてヒトFc IgG2(Invitrogen, Toulouse, France)をコードするcDNAと位相を一致させる(in phase)ために、ベクターpFUSE−hFc1のクローニング部位AgeI及びXhoIに導入した。得られるcDNA配列は配列番号3に記載されておりそしてアミノ酸配列は配列番号4に記載されている。
タンパク質を物質及び方法に開示されたとおりに産生させた。
実施例3:HLA−Gα1−Fcのクローニング及び合成
HLA−Gα1ドメインのcDNA配列を、プライマー
を使用するPCRにより増幅した。制限酵素EcoRI及びEcoRVによるα1PCRフラグメント及びpFUSE−mFC2ベクター(Invitrogen)の制限酵素消化の後、α1PCRフラグメントを、IL−2のシグナル配列及びマウスIgG2aのFc領域を含有するpFUSE−mFC2ベクターにライゲーションした。得られるcDNA配列は配列番号5に記載されておりそしてアミノ酸配列は配列番号6に記載されている。
HLA−Gα1ドメインのcDNA配列を、プライマー
を使用するPCRにより増幅した。制限酵素EcoRI及びEcoRVによるα1PCRフラグメント及びpFUSE−mFC2ベクター(Invitrogen)の制限酵素消化の後、α1PCRフラグメントを、IL−2のシグナル配列及びマウスIgG2aのFc領域を含有するpFUSE−mFC2ベクターにライゲーションした。得られるcDNA配列は配列番号5に記載されておりそしてアミノ酸配列は配列番号6に記載されている。
タンパク質を物質及び方法に開示されたとおりに産生させた。
実施例4:HLA−G/Fc融合タンパク質は二量体を形成する
図1は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による、HLA−G−β2ミクログロブリン/Fc二量体(「還元されていない」(左の)及び一量体(還元された(右の))タンパク質移動を示す。上清に存在するHLA−G/Fcタンパク質を、プロテインGセファロースビーズ(GE Healthcare)により免疫沈降させた。免疫沈降物をPBS1Xで3回洗浄した。次いでタンパク質を、ジチオトレイトール10mMを含有するサンプルバッファーとのインキュベーションにより溶離させ(「還元した」)又は溶離せず(非還元)、煮沸し、ポリアクリルアミドゲルでクロマトグラフィーにかけそしてHybond ECLニトロセルロース膜(Amersham Pharmacia Bioscience)上に転写した。PBS1X中の5%脱脂乳とのインキュベーションの後、膜を抗HLA−G(4H84)抗体と一夜インキュベーションしそしてセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲーションされたヤギ抗マウス二次抗体を使用して現した。膜をECL検出システム(Amersham Pharmacia Bioscience)により現した。
図1は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による、HLA−G−β2ミクログロブリン/Fc二量体(「還元されていない」(左の)及び一量体(還元された(右の))タンパク質移動を示す。上清に存在するHLA−G/Fcタンパク質を、プロテインGセファロースビーズ(GE Healthcare)により免疫沈降させた。免疫沈降物をPBS1Xで3回洗浄した。次いでタンパク質を、ジチオトレイトール10mMを含有するサンプルバッファーとのインキュベーションにより溶離させ(「還元した」)又は溶離せず(非還元)、煮沸し、ポリアクリルアミドゲルでクロマトグラフィーにかけそしてHybond ECLニトロセルロース膜(Amersham Pharmacia Bioscience)上に転写した。PBS1X中の5%脱脂乳とのインキュベーションの後、膜を抗HLA−G(4H84)抗体と一夜インキュベーションしそしてセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲーションされたヤギ抗マウス二次抗体を使用して現した。膜をECL検出システム(Amersham Pharmacia Bioscience)により現した。
示された結果は、本発明のHLA−G/Fcタンパク質の二量体を形成する能力を示す。
実施例5:HLA−G−Fc融合タンパク質はILT2レセプターを介するシグナリングを誘導する
この実施例は、ILT2レセプターへの結合及びその後のシグナリングを決定するための、NFATレポーター細胞アッセイにおける本発明のHLA−G−Fc融合タンパク質の効果を説明する。
この実施例は、ILT2レセプターへの結合及びその後のシグナリングを決定するための、NFATレポーター細胞アッセイにおける本発明のHLA−G−Fc融合タンパク質の効果を説明する。
物質
サルフェートラテックスビーズ4%w/v5μm(Invitrogen)
AffiniPure コート抗マウスIgGFcフラグメント1.8mg/ml(Jackson ImmunoResearch)
AffiniPure コート抗ヒトIgGFcフラグメント1.3mg/ml(Jackson ImmunoResearch)
Helaネガティブコントロール
HLA−G1−b2m/hFc1 1.5μg/ml
HLA−G6/Fc0.5μg/ml
NFATGFPレポーター細胞
サルフェートラテックスビーズ4%w/v5μm(Invitrogen)
AffiniPure コート抗マウスIgGFcフラグメント1.8mg/ml(Jackson ImmunoResearch)
AffiniPure コート抗ヒトIgGFcフラグメント1.3mg/ml(Jackson ImmunoResearch)
Helaネガティブコントロール
HLA−G1−b2m/hFc1 1.5μg/ml
HLA−G6/Fc0.5μg/ml
NFATGFPレポーター細胞
方法
NFATGFPレポーター細胞を、試験の前に2日間培養した。簡単に言えば、レポーター及びHLA−G/Fc融合タンパク質コーテッドビーズを1:5の割合で、16時間共培養し、次いでGFP発現をフローサイトメトリーにより分析した。
NFATGFPレポーター細胞を、試験の前に2日間培養した。簡単に言えば、レポーター及びHLA−G/Fc融合タンパク質コーテッドビーズを1:5の割合で、16時間共培養し、次いでGFP発現をフローサイトメトリーにより分析した。
結果
結果を図2に示しそして融合タンパク質がGFP発現を誘導することができることを示し、これは、融合タンパク質が機能的に活性であることを示す。
結果を図2に示しそして融合タンパク質がGFP発現を誘導することができることを示し、これは、融合タンパク質が機能的に活性であることを示す。
実施例6:同種異系皮膚移植に対するHLA−G/Fc融合タンパク質の効果
物質
サルフェートラテックスビーズ4%w/v5μm(Invitrogen)
AffiniPure コート抗マウスIgGFcフラグメント1.8mg/ml(Jackson ImmunoResearch)
AffiniPure コート抗ヒトIgGFcフラグメント1.3mg/ml(Jackson ImmunoResearch)
Helaネガティブコントロール
HLA−G1−b2m/hFc1 1.5μg/ml
α1/mfc2 1.5μg/ml
HLA−G6/Fc0.5μg/ml
物質
サルフェートラテックスビーズ4%w/v5μm(Invitrogen)
AffiniPure コート抗マウスIgGFcフラグメント1.8mg/ml(Jackson ImmunoResearch)
AffiniPure コート抗ヒトIgGFcフラグメント1.3mg/ml(Jackson ImmunoResearch)
Helaネガティブコントロール
HLA−G1−b2m/hFc1 1.5μg/ml
α1/mfc2 1.5μg/ml
HLA−G6/Fc0.5μg/ml
方法
すべてのHLA−G/Fc融合タンパク質について、108サルフェートラテックスビーズを、AffiniPure コート抗マウス(又は抗ヒト)IgGFcフラグメント20μg/mlで37℃で2時間コーティングし、次いでBSA(2mg/ml)と2時間インキュベーションした。洗浄の後、ビーズをHLA−G/Fc融合タンパク質0.5μg/mlと4℃で16時間インキュベーションした。次いでビーズを、1xPBSにより2回洗浄した。5x106サルフェートラテックスビーズに対して、HLA−G/Fc融合タンパク質(1μg/ml)5mlを使用した。HLA−G/Fc融合タンパク質ではなくて1xPBS又はHeLaネガティブコントロールを使用したことを除いて同じ方法で、ネガティブコントロールとして、サルフェートラテックスビーズを調製した。サルフェートラテックスビーズ(5×106)を、皮膚移植の前の日に腹腔内に注射した。
すべてのHLA−G/Fc融合タンパク質について、108サルフェートラテックスビーズを、AffiniPure コート抗マウス(又は抗ヒト)IgGFcフラグメント20μg/mlで37℃で2時間コーティングし、次いでBSA(2mg/ml)と2時間インキュベーションした。洗浄の後、ビーズをHLA−G/Fc融合タンパク質0.5μg/mlと4℃で16時間インキュベーションした。次いでビーズを、1xPBSにより2回洗浄した。5x106サルフェートラテックスビーズに対して、HLA−G/Fc融合タンパク質(1μg/ml)5mlを使用した。HLA−G/Fc融合タンパク質ではなくて1xPBS又はHeLaネガティブコントロールを使用したことを除いて同じ方法で、ネガティブコントロールとして、サルフェートラテックスビーズを調製した。サルフェートラテックスビーズ(5×106)を、皮膚移植の前の日に腹腔内に注射した。
特定の病原体を含まないC57BL/6(H−2b)(8〜10週齢)マウス及びILT4トランスジェニックマウス(H−2b)(8〜10週齢)を、研究全体にわたり皮膚移植片受容者として使用した。受容者マウスは、HLA−Gカップリングされたミクロスフェアを受け取った。ドナー皮膚は、MHCクラスII異種B6CH−2bm12(bm12、H−2b)マウスからのものであった。同種異系皮膚移植は、標準方法により行われた。簡単に言えば、ドナーマウス(12〜14週齢)の尾部からの皮膚(1.0cm2)を、受容者、麻酔されたマウスの側腹部に移植した。移植片を、ガーゼ及び硬膏剤で被覆し、それらを10日目に除去した。移植片を、拒絶反応(移植された組織の80%が壊死しておりそしてサイズが減少している、と定義される)まで毎日スコアをつけた。すべての皮膚移植生存データをカプラン・マイヤー生存分析(Kaplan Meier Survival Analysis)により検定した。
結果
結果を図3〜5に示す。それらは、すべての融合タンパク質がin vivoでの移植片免疫寛容を実質的に改良することができたことを示す。特に、それらは、融合タンパク質が免疫寛容を50%まで改良することができる(例えば図5参照)ことを示し、これは非常に驚くべきことでありそして本質的である。モデルにおける移植片生存の各日は、ヒト被検体における移植片生存の約少なくとも1カ月に対応し、したがって本発明のタンパク質は、ヒト被検体において少なくとも10カ月移植片生存を改良すると考えられる。
結果を図3〜5に示す。それらは、すべての融合タンパク質がin vivoでの移植片免疫寛容を実質的に改良することができたことを示す。特に、それらは、融合タンパク質が免疫寛容を50%まで改良することができる(例えば図5参照)ことを示し、これは非常に驚くべきことでありそして本質的である。モデルにおける移植片生存の各日は、ヒト被検体における移植片生存の約少なくとも1カ月に対応し、したがって本発明のタンパク質は、ヒト被検体において少なくとも10カ月移植片生存を改良すると考えられる。
Claims (18)
- 免疫グロブリンのFcドメインの配列を含む第2ポリペプチドに連結されたHLA−G抗原のドメインの配列を含む第1ポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。
- 第1ポリペプチドは、融合ポリペプチドのN−末端であり、そして第2ポリペプチドは、C末端である、請求項1に記載の融合ポリペプチド。
- 第2ポリペプチドが、ヒト又はマウス免疫グロブリンの配列を含む、請求項1又は2に記載の融合ポリペプチド。
- 免疫グロブリンがIgG、IgA、IgM、IgE、好ましくはIgGである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
- HLA−G抗原が、ヒトHLA−G抗原である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
- 前記HLA−G抗原のドメインが、少なくともα1ドメインを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
- 前記第1ポリペプチドが、
− HLA−G抗原のα1、α2及びα3ドメインのアミノ酸配列、
− HLA−G抗原のα1及びα3ドメインのアミノ酸配列、又は
− HLA−G抗原のα1及びα2ドメインのアミノ酸配列
から選ばれる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。 - 前記第1ポリペプチドと第2ポリペプチドが、直接又はスペーサーを介して連結されている、請求項1〜7のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
- β2ミクログロブリンの配列を含む第3ポリペプチドを更に含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
- − 配列番号4又はそのアミノ酸残基21〜656を含むHLA−G1−B2M−Fc
− 配列番号6又はそのアミノ酸残基21〜351を含むHLA−Ga1−Fc及び、
− 配列番号2又はそのアミノ酸残基25〜452)を含むHLA−G6−Fc、
から選ばれる融合ポリペプチド。 - 請求項1〜10のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸分子。
- 請求項11に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項11に記載の核酸分子又は請求項12に記載のベクターを含むリコンビナントホスト細胞。
- 請求項13に記載のリコンビナントホスト細胞を核酸分子の発現を可能にする条件下に培養し、そして産生されたポリペプチドを回収することを含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリペプチドを産生するための方法。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリペプチドの二量体。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む薬学的組成物。
- 器官又は組織拒絶反応を処置するための、請求項16に記載の薬学的組成物。
- 炎症性疾患又は自己免疫疾患を処置するための、請求項16に記載の薬学的組成物。
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