PT2352509E - Proteínas hla-g e suas utilizações farmacêuticas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "PROTEÍNAS HLA-G E SUAS UTILIZAÇÕES FARMACÊUTICAS" A presente invenção refere-se a novas proteínas e suas utilizações farmacêuticas. A invenção refere-se mais especificamente a novas proteínas de fusão que compreendem um domínio de um antigénio HLA-G fundido com um domínio Fc de uma imunoglobulina. A invenção também se refere a métodos de produção desses polipéptidos, composições farmacêuticas que os compreendem, assim como às suas utilizações para o tratamento de várias doenças incluindo a rejeição de órgãos/tecidos.

ANTECEDENTES

Os antigénios do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) são divididos em (até) três classes principais, nomeadamente os antigénios de classe I, os antigénios de classe II (HLA-DP, HLA-DQ e HLA-DR), e os antigénios de classe III.

Os antigénios de classe I compreendem os antigénios convencionais, HLA-A, HLA-B e HLA-C, que apresentam 3 domínios globulares ([alphajl, [alpha]2 e [alpha]3), assim como os antigénios não convencionais HLA-E, HLA-F, e HLA-G. 0 HLA-G é uma molécula de HLA de classe I não clássica expressa pelos trofoblastos extravilosos da placenta humana normal e células epiteliais do timo. Os - 2 - ΡΕ2352509 antigénios HLA-G são expressos essencialmente pelas células citotrofoblásticas da placenta e funcionam como agentes imunomoduladores que protegem o feto do sistema imunitário materno (ausência de rejeição pela mãe). A sequência do gene HLA-G foi descrita (e. g., Geraghty et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1987, 84, 9145-9149; Ellis; et al., J.

Immunol., 1990, 144, 731-735) e compreende 4396 pares de bases. Este gene é composto por 8 exões, 7 intrões e uma extremidade 3' não traduzida, que corresponde respetivamente aos seguintes domínios: exão 1: sequência sinal, exão 2: domínio extracelular alpha 1, exão 3: domínio extracelular alpha 2, exão 4: domínio extracelular alpha 3, exão 5: região transmembranar, exão 6: domínio citoplásmico I, exão 7: domínio citoplásmico II (não traduzido), exão 8: domínio citoplásmico III (não traduzido) e região 3' não traduzida. Foram identificadas sete isoformas de HLA-G, entre as quais 4 estão ligadas à membrana (HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3 e HLA-G4) e 3 são solúveis (HLA-G5, HLA-G6 e HLA-G7) (ver e. g. , Carosella et al., Blood 2008, vol. 111, p 4862). A isoforma da proteína HLA-G1 madura compreende os três domínios externos (oí1-oí3), a região transmembranar e o domínio citoplásmico. A isoforma da proteína HLA-G2 não compreende o domínio oí2, i. e., os domínios al e a3 estão ligados diretamente, seguido pelo domínio de transmembrana e o domínio citoplásmico. A isoforma da proteína HLA-G3 não possui os domínios a2 e a3, i. e., compreende o domínio al ligado -3- ΡΕ2352509 diretamente ao domínio de transmembrana e ao domínio citoplásmico. A isoforma da proteína HLA-G4 não possui o domínio oí3, i. e., compreende o domínio al, o domínio a2, o domínio de transmembrana e o domínio citoplásmico.

As isoformas solúveis de HLA-G têm todas a falta dos domínios de transmembrana e citoplásmico. Mais especificamente: A isoforma da proteína HLA-G5 contém os domínios al, cx2 e cx3, Assim como uma sequência peptídica extra C-terminal de 21 resíduos de aminoácidos codificados pelo intrão 4 (como resultado da retenção do intrão 4 após a excisão do transcrito e a maturação do RNA). A isoforma da proteína HLA-G6 corresponde ao HLA-G5 sem a2, i. e., a HLA-G6 contém os domínios al e a3, assim como uma sequência peptídica extra C-terminal de 21 resíduos de aminoácidos codificados pelo intrão 4 (como resultado da retenção do intrão 4 após a excisão do transcrito e maturação do RNA. A isoforma da proteína HLA-G7 contém apenas o domínio alpha 1, assim como 2 resíduos de aminoácidos adicionais C-terminal codificados pelo intrão 2 (como resultado da retenção do intrão 2 após a excisão do transcrito e a maturação do RNA).

Todas estas isoformas foram descritas e. g. , em Kirszenbaum M. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1994, 91, 4209-4213; Pedido Europeu EP 0 677 582; Kirszenbaum M. -4- ΡΕ2352509 et al., Human Immunol., 1995, 43, 237-241; Moreau P. et al., Human Immunol., 1995,43,231-236).

Estudos anteriores demonstraram que as proteínas HLA-G são capazes de inibir respostas alogénicas tais como respostas de células de linfócitos T proliferativas, citólise mediada por linfócitos T citotóxicos, e citólise mediada por células NK (Rouas-Freiss N. et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 1997, 94, 5249-5254; Semin Câncer Biol 1999, vol 9, p. 3) . Como resultado, as proteínas HLA-G foram propostas para o tratamento da rejeição de enxerto no transplante alogénico ou xenogénico de órgãos/tecidos. Também foram propostas as proteínas HLA-G para o tratamento de cancros (EP1 054 688), distúrbios inflamatórios (EP1 189 627) e, mais geralmente, doenças relacionadas com o sistema imunitário. Também foi proposto fundir proteínas HLA-G com ligandos específicos de modo a dirigir HLA-G a células ou tecidos particulares (W02007091078). Deve ser observado, todavia, que não foram fornecidos resultados ou dados experimentais para demonstrar que essas fusões de direcionamento são ativas.

As isoformas de HLA-G parecem adotar uma conformação de dímero como resultado da formação de uma ligação persulfureto intermolecular entre o resíduo de Cisteína 42 dos domínios al das duas moléculas HLA-G (Apps et al. , Eur. J. Immunol. 2007, vol. 37 p. 1924; W02007/011044). Foi proposto que os sítios de ligação ao recetor dos dímeros de HLA-G estão mais acessíveis do que aqueles dos monómeros correspondentes, de modo a que os dímeros possuíssem uma afinidade mais elevada e uma taxa de dissociação mais lenta do que os monómeros. Contudo, não é -5- ΡΕ2352509 claro que a conformação seja mais ativa para efeitos farmacêuticos, especialmente em relação às formas solúveis de HLA-G, nem de que forma apropriada podem ser produzidos os dímeros ou oligómeros de HLA-G.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a novas proteínas ou polipéptidos, composições farmacêuticas que os compreendem, e as suas utilizações. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a novos polipéptidos de fusão que compreendem uma sequência derivada de HLA-G e uma sequência derivada do fragmento Fc da imunoglobulina como definido na Reivindicação 1. Estes polipéptidos são capazes de formar complexos diméricos funcionalmente ativos e são capazes de inibir eficientemente a rejeição de órgãos in vi vo.

Estes polipéptidos representam por isso candidatos a fármacos para o tratamento desses distúrbios, assim como outras doenças relacionadas com o sistema imunitário.

Um objetivo da presente invenção reside por isso num polipéptido de fusão que compreende: um primeiro polipéptido que compreende a sequência de um domínio de um antigénio HLA-G, ligado a um segundo polipéptido que compreende a sequência de um domínio Fc de uma imunoglobulina e não possuindo um sítio de ligação ao antigénio funcional da imunoglobulina. -6- ΡΕ2352509

Como será revelado, o domínio de HLA-G contido no polipéptido de fusão pode compreender a totalidade ou parte da porção extracelular de um antigénio HLA-G, tipicamente a totalidade ou uma parte funcional dos domínios al, a2 e/ou a3 de HLA-G. Numa forma de realização específica, o domínio Fc compreende uma sequência que é suficiente para permitir a formação de um dimero (homodímero ou heterodímero) entre dois polipéptidos de fusão desta invenção e/ou não contém um domínio da imunoglobulina específico para o epitopo/antigénio.

Numa forma de realização particular, o polipéptido de fusão da invenção compreende ainda um terceiro domínio de polipéptido que compreende a sequência de uma microglobulina β2.

Outro objetivo desta invenção é uma forma prematura de um polipéptido como descrito acima, compreendendo ainda uma sequência de péptido sinal que provoca a secreção.

Um outro objetivo desta invenção reside numa molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido de fusão como acima revelado. A invenção também se refere a um vetor que compreende uma molécula de ácido nucleico como definido acima.

Outro objetivo desta invenção é uma célula hospedeira recombinante que compreende uma molécula de ácido nucleico ou um vetor como definido acima. -7- ΡΕ2352509

Um outro objetivo desta invenção é um método de produção de um polipéptido como definido acima, que compreende cultivar uma célula hospedeira recombinante da invenção em condições que permitem a expressão da molécula de ácido nucleico, e a recuperação do polipéptido produzido. A invenção refere-se ainda a um dímero (e. g., um homodímero ou um heterodímero) de um polipéptido da invenção. A invenção também se refere a um anticorpo que se liga especificamente a um polipéptido de fusão desta invenção ou um seu dimero. A invenção também se refere a uma composição farmacêutica que compreende um polipéptido como definido acima, seja como um monómero ou como um multímero. A invenção também se refere a uma composição farmacêutica que compreende um ácido nucleico que codifica um polipéptido como definido acima, ou uma célula recombinante que expressa um tal polipéptido. A invenção refere-se ainda a esses polipéptidos ou composições farmacêuticas para o tratamento de rejeição de órgão ou tecido, doenças inflamatórias ou doenças autoimunes.

Um outro objetivo desta invenção também se refere a proporcionar um método de tratamento da rejeição de órgão/tecido, compreendendo o método administrar a um -8- ΡΕ2352509 indivíduo que dela necessite, uma quantidade eficaz de um polipéptido ou composição desta invenção. Mais especificamente, o método compreende administrar o polipéptido ou composição ao indivíduo, antes de, durante e/ou após o transplante do tecido/órgão.

Um outro objetivo desta invenção é proporcionar um método de promoção da tolerância ao enxerto num indivíduo, compreendendo o método administrar a um indivíduo que dela necessite uma quantidade eficaz de um polipéptido ou composição como definido acima. A invenção pode ser utilizada em qualquer indivíduo mamífero, preferencialmente em indivíduos humanos. Como será ainda discutido abaixo, os polipéptidos desta invenção são capazes de inibir substancialmente a rejeição de tecido in vivo após transplante.

LEGENDA DAS FIGURAS

Figura 1: As proteínas de fusão HLA-G-F c podem formar dímeros.

Figura 2: As proteínas de fusão HLA-G-Fc induzem sinalização através do recetor ILT2.

Figura 3: HLA-G6-F c promove a sobrevivência do enxerto in vivo.

Figura 4: HLA-Gl-B2M-Fc promove a sobrevivência do enxerto in vivo.

Figura 5: HLA-Gal-Fc promove a sobrevivência do enxerto in vivo. ΡΕ2352509 -9-

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a polipéptidos de fusão que compreendem um antigénio HLA-G ou uma porção deste. Os polipéptidos de fusão desta invenção podem formar dimeros biologicamente ativos e demonstraram inibir eficazmente a rejeição do enxerto in vivo. Mais especificamente, os inventores descobriram que, através da fusão de um tal antigénio HLA-G a um domínio Fc de uma imunoglobulina, podem ser criadas proteínas biologicamente ativas, que possuem a capacidade para induzir uma forte tolerância imunitária e podem adotar uma conformação biologicamente ativa in vivo. Estes resultados são surpreendentes uma vez que os domínios HLA-G nunca foram fundidos com essas unidades de formação de dímero e uma vez que a posição espacial dos domínios HLA-G nesses dimeros difere daquela dos complexos de HLA-G que ocorrem naturalmente. Os resultados obtidos demonstram que os polipéptidos de fusão desta invenção apresentam elevada atividade de imunorregulação in vivo e por isso representam novos medicamentos para tratar distúrbios imunorrelacionados, particularmente para reduzir respostas indesejáveis ou prejudiciais num indivíduo.

Um primeiro objetivo da presente invenção reside assim num polipéptido de fusão que compreende: um primeiro polipéptido que sequência de um domínio de um G, ligado a um segundo polipéptido que sequência de um compreende a antigénio HLA- compreende a domínio Fc de uma - 10- ΡΕ2352509 imunoglobulina e não possui um sítio de ligação ao antigénio funcional da imunoglobulina.

No contexto da presente invenção, os termos "polipéptido" e "proteína" designam, indistintamente, uma molécula que compreende um polímero de resíduos de aminoácidos, que podem estar ligados em conjunto através de uma ligação amina, ou através de ligações modificadas, peptidomiméticas. Os resíduos de aminoácidos nas referidas proteínas ou polipéptidos podem ser resíduos e aminoácidos naturais, ou resíduos de aminoácidos não naturais ou modificados. Estes podem estar na conformação L e/ou D. Também, o polipéptido ou a proteína pode ser protegido terminalmente e/ou modificado, e. g., através da alteração química ou física das funções laterais, por exemplo.

Num polipéptido de fusão desta invenção, os vários domínios de polipéptido estão ligados covalentemente em conjunto de modo que são, muito preferencialmente, produzidos como uma molécula única através de técnicas recombinantes. São possíveis vários arranjos nas proteínas de fusão desta invenção. Em particular, os vários domínios podem estar posicionados C-ter ou N-ter, e ligados em conjunto quer diretamente ou através de grupos espaçadores. Numa forma de realização muito preferida, o primeiro polipéptido (i. e., a sequência derivada de HLA-G) está localizada N-ter do segundo polipéptido (a sequência derivada de Fc) , que está localizado C-ter do polipéptido de fusão. Como apresentado nos exemplos, essa conformação - 11 - ΡΕ2352509 permite a dimerizaçao do polipéptido e a atividade biológica eficiente in vivo. 0 acoplamento entre os vários domínios de polipéptido pode ser direto, i. e., sem sequência interveniente (embora os resíduos de aminoácidos intervenientes possam estar presentes para o objetivo de acoplagem/clonagem ou como um resultado dos passos de clonagem, e. g., correspondendo ao(s) sítio(s) de restrição, ou indireto, i. e., com uma sequência interveniente (grupo espaçador). Neste ultimo caso, o grupo espaçador pode possuir um comprimento variável, tipicamente entre 4 e 20 resíduos de aminoácidos, e deve ser preferencialmente biologicamente inerte. Um exemplo desse grupo espaçador é o motivo (G4S)n, sendo n um inteiro de 1 até 4.

Numa forma de realização preferida de um polipéptido de fusão desta invenção, o primeiro e o segundo polipéptidos estão ligados diretamente. Mais precisamente, o resíduo C-terminal da sequência derivada de HLA-G está ligado ao resíduo N-terminal da sequência derivada de Fc. O domínio HLA-G contido no polipéptido de fusão pode compreender a totalidade ou parte da porção extracelular de um antigénio HLA-G, tipicamente a totalidade ou uma parte funcional dos domínios al, a2 e/ou a3 de um antigénio HLA-G. A sequência de aminoácidos de HLA-G1 foi descrita em, e. g., Geraghty et al. ou; Ellis; et al., J. Immunol., 1990, 144, 731-735, referenciados acima. As sequências de aminoácidos dos domínios al, oí2 e a3 podem ser derivadas diretamente a partir das referidas - 12 - ΡΕ2352509 publicações. Estas sequências estão também disponíveis Online (ver por exemplo os números Genebank para HLA-G: primeira clonagem da sequência genómica: Geraghty et al. al, PNAS 1987: PubMed ID: 3480534, GenelD: 3135; Primeira clonagem de cDNA de HLA-G1: Ellis et al. Journal of Immunology 1990. PubMed ID: 2295808). Para além disso, as sequências de HLA-G5, HLA-G6 e HLA-G7 também estão disponíveis em US5 856 442, US6 291 659, FR2 810 047, ou Paul et al., Hum. Immunol 2000; 61: 1138).

Como indicado, os polipéptidos de fusão desta invenção compreendem pelo menos uma porção de um domínio extracelular de um antigénio HLA-G. Numa forma de realização preferida, o antigénio HLA-G é um antigénio HLA-G humano.

Numa forma de realização particular, o polipéptido de fusão desta invenção compreende pelo menos a sequência de aminoácidos do domínio al de um antigénio HLA-G humano.

De acordo com outras formas de realização específicas, o primeiro polipéptido dos polipéptidos de fusão desta invenção é selecionado a partir de: — a sequência de aminoácidos dos domínios al, a2 e a3 de um antigénio HLA-G; — a sequência de aminoácidos dos domínios al e a3 de um antigénio HLA-G; — a sequência de aminoácidos dos domínios al e a2 de um antigénio HLA-G; — a sequência de aminoácidos de HLA-G5; - 13 - ΡΕ2352509 - a sequência de aminoácidos de HLA-G6; ou - a sequência de aminoácidos de HLA-G7. É fornecido um exemplo especifico da sequência de aminoácidos de um domínio al de HLA-G humana na SEQ ID NO: 6 (resíduos de aminoácidos 21 até 110). Um exemplo específico da sequência de aminoácidos de HLA-G6 humana é fornecido na SEQ ID NO: 2 (resíduos de aminoácidos 25 até 227). Um exemplo específico da sequência de aminoácidos dos domínios al, a2 e a3 de uma HLA-G humana é fornecido na SEQ ID NO: 4 (resíduos de aminoácidos 135-412). Deve ser entendido que existem variantes naturais dos antigénios HLA-G, e. g., com um resultado do polimorfismo, que estão incluídas no presente pedido. Também, as variantes das sequências acima que não possuem certos resíduos de aminoácidos (e. g., entre 1 e 10, preferencialmente entre 1-5, mais preferencialmente 1, 2, 3, 4 ou 5), e/ou contêm certas substituições ou inserções de aminoácidos (e. g., entre 1 e 10, preferencialmente entre 1-5, muito preferencialmente 1, 2, 3, 4 ou 5) também estão incluídas na presente invenção. O segundo domínio de polipéptido dos polipéptidos de fusão desta invenção compreende a sequência de aminoácidos de um domínio Fc de uma imunoglobulina. A região Fc de uma imunoglobulina tipicamente compreende os domínios CH2 e CH3 da cadeia pesada, assim como a região da dobra. O domínio Fc preferencialmente compreende uma sequência que é suficiente para permitir a formação de um dímero (homodímero ou heterodímero) entre dois polipéptidos de fusão desta invenção. O domínio Fc pode ser derivado de uma imunoglobulina de origem humana ou animal, tal como, - 14- ΡΕ2352509 sem limitação, roedores, equinos ou primatas. 0 segundo polipéptido não compreende um dominio especifico de epitopo/antigénio da referida imunoglobulina. 0 segundo polipéptido compreende a sequência de aminoácidos de um dominio Fc de uma imunoglobulina e não contém um sitio de ligação ao antigénio funcional da imunoglobulina. 0 dominio Fc pode ser derivado de uma imunoglobulina de vários serotipos, tais como a partir de uma IgG, uma IgA, uma IgM, uma IgD ou uma IgE. A sequência do dominio Fc deriva preferencialmente de uma IgG. Exemplos dessas sequências do dominio Fc são apresentados no presente pedido. Em particular, um exemplo especifico do dominio Fc de uma IgG humana é apresentado na SEQ ID NO: 2 (resíduos de aminoácidos 235 até 452). Um exemplo específico do domínio Fc de uma IgG de murino é fornecido na SEQ ID NO: 6 (resíduos de aminoácidos 120 até END). Deve ser entendido que podem ser toleradas variações na sequência na sequência do domínio Fc, desde que a sequência resultante retenha a capacidade para formar dímeros. A sequência de um domínio Fc de uma imunoglobulina pode ser obtida a partir da sequência de qualquer imunoglobulina conhecida, de acordo com técnicas conhecidas na técnica. Deve ser entendido que a sequência dos domínios Fc também pode ser obtida a partir das bases de dados e testada quanto à sua capacidade para dimerizar in vitro.

Uma forma de realização particular desta invenção refere-se assim a um polipéptido de fusão que compreende um primeiro polipéptido e um segundo polipéptido ligados em conjunto através de ligação peptídica, em que o primeiro polipéptido está localizado em N-ter do segundo - 15- ΡΕ2352509 polipéptido, que está localizado em C-ter do polipéptido de fusão, e em que o primeiro polipéptido compreende pelo menos a sequência de um domínio al de um antiqénio HLA-G e o segundo polipéptido compreende a sequência de um domínio Fc de uma imunoglobulina.

Exemplos específicos desses polipéptidos de fusão da invenção são: - HLA-GoíI-Fc de SEQ ID NO: 6 (ou seus resíduos 21-351), e - HLA-Gô-Fc de SEQ ID NO: 2 (ou seus resíduos 25-452).

Em HLA-Gal-Fc, o domínio al de HLA-G é fundido diretamente com o domínio Fc de uma IgG2a de murganho. Os resíduos de aminoácidos intervenientes 111 até 119 estão presentes entre os dois domínios. Os resíduos de aminoácidos 1-20 correspondem à sequência do péptido sinal da proteína interleuquina-2. HLA-Gal-Fc, na forma madura, compreende por isso os resíduos de aminoácidos 21-351 da SEQ ID NO: 6.

Na HLA-G6-Fc, a sequência de HLA-G6 é fundida diretamente com o domínio Fc de uma IgG2 humana. Os resíduos de aminoácidos intervenientes 228-234 estão presentes entre os dois domínios. Os resíduos de aminoácidos 1-24 correspondem à sequência do péptido sinal de HLA-G. A HLA-G6-Fc, na forma madura, compreende por isso os resíduos de aminoácidos 25-452 de SEQ ID NO: 2. - 16 - ΡΕ2352509

Como mencionado nos exemplos, ambos estes polipéptidos são capazes de promover tolerância ao enxerto in vivo. Em particular, HLA-Gal-Fc, que compreende apenas o domínio al de HLA-G, foi inesperadamente o mais eficaz no retardar da rejeição de enxerto in vivo.

Como discutido acima, os polipéptidos de fusão desta invenção podem compreender domínio(s) funcional adicional. A este respeito, numa forma de realização particular, os polipéptidos de fusão desta invenção compreendem um terceiro domínio de polipéptido que compreende a sequência de uma microglobulina β2. É conhecido que a isoforma HLA-Gl de HLA-G forma um complexo com a microglobulina β2 na superfície celular. De modo a mimetizar este complexo, a invenção propõe incluir, nos polipéptidos de fusão, uma sequência da microglobulina β2, disposta de modo a permitir a formação de um complexo biologicamente ativo. Quando presente, a sequência de polipéptido da microglobulina β2 está localizada mais preferencialmente na parte N-terminal do polipéptido de fusão, e está ligada à sequência do primeiro polipéptido, de acordo com o seguinte esquema:

Sequência de B2M - sequência de HLA-G - domínio Fc

Para além disso, numa forma de realização muito preferida, a sequência de B2M está ligada à sequência de HLA-G através de um grupo espaçador, permitindo a redobragem apropriada do polipéptido. Muito preferencialmente, o grupo espaçador compreende desde 8 até 20 resíduos de aminoácidos, mais preferencialmente desde 8 até 15, ainda mais preferencialmente desde 8 até 12. Numa - 17- ΡΕ2352509 forma de realizaçao específica, o grupo espaçador possui a sequência (G4S)n, em que n é 2 ou 3.

Um exemplo específico de um tal polipéptido de fusão desta invenção é: - HLA-G1-B2M-FC de SEQ ID NO: 4 (ou seus resíduos 21-656).

Em HLA-G1-B2M-FC, a sequência de B2M é fundida com os domínios al-a2-o3 de HLA-G1 através de um ligante peptídico (resíduos 120-134), e o domínio HLA-G1 é ligado à sequência Fc de uma IgG2 humana. Os resíduos de aminoácidos 1-20 correspondem à sequência de péptido sinal de B2M. A HLA-G1-B2M-FC, na forma madura, compreende por isso os resíduos de aminoácidos 21-656 de SEQ ID NO: 4.

Um outro objetivo desta invenção é um dímero de um polipéptido como definido acima. O dímero pode ser um homodímero, e. g., entre dois polipéptidos de fusão idênticos, ou um heterodímero, e. g., entre dois polipéptidos de fusão distintos compreendendo um domínio Fc.

Os polipéptidos de fusão desta invenção podem ser obtidos utilizando técnicas conhecidas per se na técnica, tais como síntese artificial, técnicas recombinantes, e/ou suas combinações. Numa forma de realização típica, como ilustrado nos exemplos, os domínios são produzidos através de técnicas recombinantes, preferencialmente diretamente na forma de um polipéptido de fusão, começando num polinucleótido codificante quimérico. - 18- ΡΕ2352509 A este respeito, um outro objetivo desta invenção é uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido de fusão, como definido acima. 0 ácido nucleico pode ser e. g., RNA ou DNA, de cadeia simples ou dupla. Pode ser produzido através de técnicas conhecidas per se na técnica, tais como engenharia genética, síntese química ou enzimática, etc. Numa forma de realização particular, o ácido nucleico compreende ainda uma sequência que codifica um péptido líder para secreção, ligado operacionalmente à sequência que codifica o polipéptido de fusão. Como resultado, a expressão desse ácido nucleico conduz à secreção do polipéptido de fusão pela célula hospedeira selecionada. 0 péptido líder pode ter várias origens, tais como genes humanos ou de mamífero, e. g., B2M, interleuquina, HLA-, etc. Exemples específicos de ácidos nucleicos desta invenção são moléculas de ácidos nucleicos, compreendendo as SEQ ID NO: 1, 3, ou 5.

Um outro objetivo desta invenção também reside num vetor que compreende um ácido nucleico como definido acima. 0 vetor pode ser um vetor de clonagem e/ou de expressão, tal como um plasmídeo, cosmídeo, fago, um vetor virai, um cromossoma artificial, etc. Exemplos específicos desses vetores incluem os plasmídeos pFUSE, plasmídeos pUC, plasmídeos pcDNA, plasmídeos pBR, vetores retrovirais, vetores adenovirais, vetores baculovirais, vetores de fago lambda, etc. 0 vetor pode compreender sequências reguladoras, tais como um promotor, um terminador, uma origem de replicação, etc. 0 vetor pode ser utilizado para produzir polipéptidos desta invenção in vitro, através de técnicas recombinantes, ou diretamente in vivo, em abordagens de terapia génica. - 19- ΡΕ2352509

Um outro objetivo desta invenção é uma célula hospedeira recombinante que compreendendo um ácido nucleico ou um vetor como definido acima. A célula hospedeira pode ser procariótica ou eucariótica. Exemplos de hospedeiros procarióticos incluem qualquer bactéria, tal como E. coli. Exemplos de células eucarióticas incluem leveduras, fungos, células de mamíferos, células de plantas ou células de insetos. Células recombinantes desta invenção podem ser preparadas através de técnicas de transformação conhecidas per se na técnica, tais como transfeção, lipofeção, electroporação, transformação de protoplastos, etc. Estas células podem ser mantidas e cultivadas em qualquer meio de cultura adequado.

Podem ser utilizadas células recombinantes desta invenção e. g. , para produzir polipéptidos desta invenção in vitro ou ex vivo, ou como produtos de terapia celular, para produzir os polipéptidos in vivo. A este respeito, um objetivo desta invenção também reside num método de produzir um polipéptido como revelado acima, compreendendo o método cultivar uma célula hospedeira recombinante da invenção em condições que permitem a expressão da molécula de ácido nucleico, e recuperar o polipéptido produzido. 0 polipéptido pode ser recuperado e/ou purificado utilizando técnicas conhecidas per se na técnica, tais como centrifugação, filtração, técnicas cromatográficas, etc.

Após a produção, os polipéptidos desta invenção podem ser modificados para melhorar as suas propriedades, por exemplo para melhorar as suas propriedades - 20 - ΡΕ2352509 farmacocinéticas. A este respeito, elas podem ser modificadas para aumentar a sua estabilidade ou resistência à protease, tal como através da adição de grupos de proteção terminal (e. g., amida, éster). Elas também podem ser revestidas num suporte veiculo para aumentar a densidade do polipéptido.

Um outro objetivo desta invenção é uma composição farmacêutica que compreende um polipéptido como definido acima e, preferencialmente, um excipiente ou veiculo farmaceuticamente aceitável.

Um outro objetivo desta invenção é uma composição farmacêutica que compreende um ácido nucleico como definido acima e, preferencialmente, um excipiente ou veiculo farmaceuticamente aceitável.

Um outro objetivo desta invenção é uma composição farmacêutica que compreende uma célula recombinante como definido acima e, preferencialmente, um excipiente ou veiculo farmaceuticamente aceitável.

Excipientes ou veículos adequados incluem qualquer veículo farmaceuticamente aceitável tal como agentes tamponantes, agentes estabilizantes, diluentes, sais, conservantes, agentes emulsificantes, adoçantes, etc. 0 excipiente compreende tipicamente uma solução isotónica aquosa ou não aquosa, que pode ser preparada de acordo com técnicas conhecidas. Soluções adequadas incluem solutos tamponados, tais como solução tamponada com fosfato, soluções de cloreto, solução de Ringer, e semelhantes. A preparação farmacêutica está tipicamente na forma de uma -21 - ΡΕ2352509 composição injetável, preferencialmente uma composição injetável liquida, embora também possam estar contempladas outras formas, tais como comprimidos, gélules, cápsulas, xaropes, etc. As composições desta invenção podem ser administradas através de várias vias diferentes, tais como por via sistémica, parentérica, oral, retal, nasal ou vaginal. Elas são preferencialmente administradas por injeção, tal como injeção intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intraperitoneal, ou subcutânea. A administração transdérmica também está contemplada. A dosagem especifica pode ser ajustada pelo especialista na técnica, dependendo do estado patológico, o indivíduo, a duração do tratamento, a presença de outros ingredientes ativos, etc. Tipicamente, as composições compreendem doses unitárias entre 10 ng e 100 mg de polipéptido de fusão, mais preferencialmente entre 1 mg e 50 mg, ainda mais preferencialmente entre 100 mg e 50 mg.

As composições da presente invenção são preferencialmente administradas em quantidades eficazes, i. e., em quantidades que são, ao longo do tempo, suficientes para pelo menos reduzir ou prevenir a progressão da doença. A este respeito, as composições desta invenção são preferencialmente utilizadas em quantidades que permitem a redução de uma resposta imunitária prejudicial ou indesejável num indivíduo.

Como mencionado acima, os polipéptidos de fusão desta invenção possuem forte atividade reguladora imunitária e podem ser utilizados para tratar uma variedade de estados de doença associados com resposta imunitária anormal ou indesejada. Mais especificamente, os - 22 - ΡΕ2352509 polipéptidos desta invenção são adequados para tratar distúrbios relacionados com o sistema imunitário tais como, particularmente, rejeição de órgão ou tecido, doenças inflamatórias ou doenças autoimunes.

Como revelado na seção experimental, os polipéptidos desta invenção podem inibir substancialmente a rejeição de enxerto alogénico ou xenogénico in vivo.

Um objetivo da presente invenção reside assim num polipéptido ou composição como revelado acima para o tratamento da rejeição de enxerto.

Um outro objetivo desta invenção reside em providenciar um método de tratamento de rejeição de enxerto num indivíduo, compreendendo o método administrar a um indivíduo que dela necessite uma quantidade eficaz de uma composição como revelado acima. 0 termo tratamento designa por exemplo a promoção da tolerância ao enxerto no indivíduo recetor. 0 tratamento pode ser realizado antes de, durante e/ou após o enxerto, e pode ser utilizado como uma terapia alternativa aos agentes imunossupressores existentes ou, como uma terapia combinada com os agentes imunossupressores atuais. A invenção é aplicável a transplantes alogénicos, semi-alogénicos ou mesmo transplante xenogénico, e pode ser utilizada para qualquer tipo de órgãos ou tecidos transplantados incluindo, sem limitação, tecidos sólidos, tecidos líquidos ou células, incluindo coração, pele, rim, fígado, pulmão, fígado-rim, etc. -23- ΡΕ2352509

Um outro objetivo desta invenção é proporcionar um método melhorado para transplantar um órgão ou tecido num indivíduo, compreendendo o melhoramento administrar ao indivíduo, antes de, durante e/ou após transplante, uma quantidade eficaz de uma composição como revelado acima.

Um outro objetivo desta invenção é proporcionar um método para promover a tolerância ao enxerto num indivíduo, compreendendo o método administrar ao indivíduo, antes de, durante e/ou após transplante, uma quantidade eficaz de uma composição como revelado acima.

Um outro objetivo desta invenção é proporcionar um método para reduzir a rejeição de enxerto num indivíduo, compreendendo o método administrar ao indivíduo, antes de, durante e/ou após transplante, uma quantidade eficaz de uma composição como revelado acima.

Um outro objetivo da presente invenção reside num polipéptido ou composição como revelado acima para tratar uma doença autoimune. A invenção também proporciona um método de tratamento de uma doença autoimune num indivíduo, compreendendo o método administrar a um indivíduo que dela necessite uma quantidade eficaz de uma composição como revelado acima. A doença autoimune pode ser Artrite reumatoide, doença de Crohn ou esclerose múltipla. Nesses estados de doença, a invenção permite reduzir a resposta imunitária prejudicial que é responsável pela patologia. - 24 - ΡΕ2352509

Outro objetivo da presente invenção reside num polipéptido ou composição como revelado acima para o tratamento de uma doença inflamatória.

Um outro objetivo desta invenção reside no fornecimento de um método de tratamento de uma doença inflamatória num indivíduo, compreendendo o método administrar a um indivíduo que dela necessite uma quantidade eficaz de uma composição como revelado acima.

Deve ser entendido que a quantidade da composição na verdade administrada deve ser determinada e adaptada por um médico, à luz das circunstâncias relevantes incluindo o estado ou estados a serem tratados, a composição exata administrada, a idade, peso, e resposta do doente individual, a gravidade dos sintomas do doente, e a via de administração escolhida. Por isso, os intervalos de dosagem acima destinam-se a proporcionar guias gerais e suporte para os ensinamentos aqui apresentados, nas não pretendem limitar o âmbito da invenção.

Outros aspetos e vantagens desta invenção serão revelados nos exemplos seguintes, que devem ser considerados como ilustrativos e não limitando o âmbito deste pedido.

EXEMPLOS

Materiais e Métodos

Amplificação por PCR - 25 - ΡΕ2352509

As reações de PCR foram realizadas num GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer) num volume final de 50 μΐ contendo 20 ng de DNA, 200 nM de cada iniciador, 200 μΜ de dNTP (Invitrogen) , 2,5 μΐ de Tampão de PCR 10X (Perkin

Elmer), 2,5 Unidades de Taq polimerase (Perkin Elmer) e 27 μΐ de água. 0 programa utilizado foi o seguinte:

Desnaturação de DNA durante 5 minutos a 94 °C seguido por 30 ciclos de:

30 segundos a 94 °C

30 segundos a 58 °C

1 minuto a 72 °C

No final do último ciclo foi realizado um passo de 5 minutos a 72 °C.

Vetores

Os vetores pFUSE-hFcl e pFuse-mFc2 foram adquiridos à companhia InvivoGen.

Digestão enzimática

Foram realizadas digestões com enzimas de restrição como recomendado pelo fabricante (invitrogen). Tipicamente, as digestões fora realizadas durante 1 hora a 37 °C com 1 mg de DNA e 5 unidades de enzimas de restrição no tampão adequado. ΡΕ2352509 -26-

Ligações A ligação dos fragmentos de PCR ao vetor de expressão foi realizada com a T4 DNA ligase da Promega seguindo as recomendações do fabricante. Para a construção da HLA-G5-beta-2 microglobulina a ligação do fragmento de PCR em pcDNA 3.1 D/V.5-His-Topo (Invitrogen) foi realizada diretamente com o 3.1 Directional TOPO® Expression Kit (Invitrogen).

Purificação de Plasmídeos A purificação dos plasmídeos foi realizada com o GenElute™ Plasmid Midiprep (Sigma) seguindo as recomendações do fabricante.

Produção de proteína

Para a produção da proteína de fusão, foram transfetadas células HEK293T ou HELA pelas diversas construções com o método da lipofectamina (invitrogen) e mantidas a 37 °C, 5% C02 em DMEM (Meio Eagle Modificado por Dulbeco) suplementado com soro de bovino fetal a 10% e 0,3 M de glutamina. Após 48 horas os sobrenadantes foram recolhidos, filtrados através de um filtro de 0,2 μΜ e depois utilizados para experiências ou para preparar stocks.

Exemplo 1: Clonagem e síntese de HLA-G6-FC A sequência de cDNA de HLA-G da sequência líder, ai, a3 e intrão 4 foi amplificada por PCR com molde de - 27 - ΡΕ2352509 pcDNA de HLA-G6. Esta sequência foi amplificada por PCR para introduzir os sitios de restrição de Age I e de Xho I com os seguintes iniciadores: 5'AAAACCGGTATGGTGGTCATGGCGCCCCG 3' (SEQ ID NO: 7) e 5'AAACTCGAGAGGTCTTCAGAGAGGCTCCTGCTT' (SEQ ID NO: 8).

Esta sequência amplificada foi digerida com as enzimas de restrição Age I e Xho I e depois ligada ao vetor pFUSE-hFcl previamente digerido com Age I e Xho I. A sequência de cDNA resultante é descrita na SEQ ID NO: 1 e a sequência de aminoácidos é descrita na SEQ ID NO: 2. A proteína foi produzida como revelado nos materiais e métodos.

Exemplo 2: Clonagem e síntese de HLA—Gl—B2M—Fc

A sequência codificante para a Beta-2 microglobulina humana foi amplificada por PCR com os iniciadores B2M Sig Mlu I Sph IS cgtc GCATGC ACGCGT CG ATG TCT CGC TCC GTG GCC (SEQ ID NO: 9) e B2M-L-al AS TCATGGAGTGGGAGCC GGATCCGCCACCTCC GGATCCGCCACCTCC

GGATCCGCCACCTCC CATGTCTCGATCCCACTT (SEQ ID NO: 10) que permitiu remover o codão de terminação e introduzir um espaçador que corresponde à sequência de aminoácidos (GGGS)x2. Em paralelo, a sequência de cDNA que corresponde ao domínio al, a2 e a3 de HLA-G 1 foi amplificada por PCR com os iniciadores HLA-Ga3 Xho Sal AS tatg GTCGAC CTCGAG CGC AGC TGC CTT CCA TCT CAG CAT GAG (SEQ ID NO: 11) e HLA-G -28- ΡΕ2352509 al Mlu Sph S acgtc GCATGC ACGCGT CG GGC TTC CAC TCC ATG A (SEQ ID NO: 12) que permitiram remover a sequência do péptido lider e o codão de terminação. A Beta-2 microglobulina e o dominio al, a2, a3 dos fragmentos de PCR de HLA-G1 foram ambos digeridos com a enzima de restrição Eag I purificada e ligada em conjunto. A sequência de fusão de Beta-2 microglobulina/dominio al, a2, a3 obtida foi então digerida com a enzima de restrição Mlu I e Xho I e ligada ao vetor PGEMT/easy (Promega) previamente digerido com Mlu I e Xho 1. Esta construção foi então amplificada por PCR com os iniciadores B2M Sig Mlu I Sph I IS cgtc GCATGC ACGCGT CG ATG TCT CGC TCC GTG GCC (SEQ ID NO: 13) e HLA-Ga3 Xho Sal AS tatg GTCGAC CTCGAG CGC AGC TGC CTT CCA TCT CAG CAT GAG (SEQ ID NO: 14) . 0 fragmento amplificado obtido foi então digerido com Age I e Xho I e introduzido no sitio de clonagem Age I e Xho I do vetor pFUSE-hFcl de modo a ficar em fase com o cDNA que codifica para Fc IgG2 humana (InVivogen, Toulouse, França). A sequência de cDNA resultante é descrita na SEQ ID NO: 3 e a sequência de aminoácidos é descrita na SEQ ID NO: 4. A proteína foi produzida como revelado nos materiais e métodos.

Exemplo 3: Clonagem e síntese de HLA-Gal-Fc A sequência de cDNA do domínio HLA-G alpha-1 foi amplificada por PCR utilizando os iniciadores 5ΆΑΑ GAA TTC GGG CTC CCA CTC CAT GAG GT 3' (SEQ ID NO: 15) e 5ΆΑΑ GAT ATC CCA CTG GCC TCG CTC TGG TTG3 ' (SEQ ID NO: 16). Após digestão com a enzima de restrição do fragmento de PCR de alpha-1 e do vetor pFUSE-mFc2 (Invivogen) com a enzima de - 29 - ΡΕ2352509 restrição EcoRI e EcoRV, o fragmento de PCR alpha-1 foi ligado ao vetor pFUSE-mFc2 que continha a sequência sinal de IL-2 e a região Fc de IgG2a de murganho. A sequência de cDNA resultante é descrita na SEQ ID NO: 5 e a sequência de aminoácidos é descrita na SEQ ID NO: 6. A proteína foi produzida como revelado nos materiais e métodos.

Exemplo 4: As proteínas de fusão HLA-G/Fc formam dímeros A Figura 1 representa a migração de proteínas de dímeros HLA-G-beta-2-microglobulina/Fc ("não-reduzidos" (à esquerda)) e monómeros ("reduzidos" (à direita)) por Eletroforese em Gel de PoliAcrilamida. As proteínas HLA-G/Fc presentes no sobrenadante foram imunoprecipitadas com esferas de proteína G sepharose (GE Healthcare). Os imunoprecipitados foram lavados três vezes com PBS IX. As proteínas foram então eluídas por incubação com tampão da amostra contendo 10 mM de ditiotreitol ("reduzidas") ou não ("não-reduzidas"), fervidas, sujeitas a eletroforese em géis de poliacrilamida e transferidas para membranas de nitrocelulose Hybond ECL (Amersham Pharmacia Biosciences). Após incubação com 5% de leite magro em PBS IX, a membrana foi incubada durante a noite com anticorpo anti-HLA-G (4H84) e revelada utilizando anticorpo secundário anti-murganho de cabra conjugado com peroxidase de rábano. As membranas foram reveladas com o sistema de deteção ECL (Amersham Pharmacia Biosciences). - 30 - ΡΕ2352509

Os resultados apresentados demonstram a capacidade das proteínas HLA-G/Fc desta invenção para formar dímeros.

Exemplo 5: proteínas de fusão HLA-G-Fc induzem sinalização através do recetor ILT2

Este exemplo descreve o efeito das proteínas de fusão HLA-G-Fc desta invenção num ensaio de células repórter NFAT para determinar a ligação ao recetor ILT2 e subsequente sinalização.

Material

Esferas de látex com sulfato 4% p/v 5 pm (Invitrogen)

AffiniPure Coat Anti-mouse IgG Fc Fragment 1,8 mg/ml (Jackson ImmunoResearch)

AffiniPure Coat Anti-human IgG Fc Fragment 1,3 mg/ml (Jackson ImmunoResearch)

Hela Controlo Negativo HLA-Gl-b2m/hFcl 1,5 pg/ml HLA-G6/FC 0,5 pg/ml Células repórter NFATGFP Método

As células repórter NFATGFP foram cultivadas durante 2 dias antes do teste. Resumidamente, o repórter e a as esferas revestidas com proteína de fusão HLA-G/Fc foram co-cultivados a uma proporção de 1:5 durante 16 h e - 31 - ΡΕ2352509 depois analisados para expressão de GFP por citometria de fluxo.

Resultados

Os resultados são apresentados na Figura 2 e demonstram que as proteínas de fusão são capazes de induzir a expressão de GFP, indicando que estão funcionalmente ativas.

Exemplo 6: Efeito das proteínas de fusão HLA-G/Fc nos transplantes de pele alogénicos

Materiais

Esferas de látex com sulfato 4% p/v 5 pm (Invitrogen)

AffiniPure Coat Anti-mouse IgG Fc Fragment 1,8 mg/ml (Jackson ImmunoResearch)

AffiniPure Coat Anti-human IgG Fc Fragment 1,3 mg/ml (Jackson ImmunoResearch)

Controlo Negativo HeLa HLA- Gl-b2m/hFcl 1,5 pg/ml, alphal/mfc2 1,5 pg/ml HLA-Gô/Fc 0,5 pg/ml. Método

Para cada proteína de fusão HLA-G/Fc, foram revestidas 108 esferas de látex com sulfato revestidas com 20 pg/ml de AffiniPure Coat Anti-mouse (ou anti-humano) IgG Fc Fragment 2 h a 37 °C seguido por 2 h de incubação com - 32 - ΡΕ2352509 BSA (2 mg/ml). Após lavagem, as esferas foram incubadas com 0,5 pg/ml de proteínas de fusão HLA-G/Fc a 4 °C durante 16 h. Subsequentemente, as esferas foram lavadas 2 vezes com lx PBS. Foram utilizados 5 ml de proteínas de fusão HLA-G/Fc (1 pg/ml) para 5x 106 esferas de látex com sulfato. Como um controlo negativo, as esferas de látex com sulfato foram preparadas de um modo idêntico exceto que foi utilizado lxPBS ou Controlo Negativo HeLa em vez de proteínas de fusão HLA-G/Fc. AS esferas de látex com sulfato (5xl06) foram injetadas intraperitonealmente na véspera do enxerto da pele.

Foram utilizados murganhos C57BL/6 sem agentes patogénicos específicos (H-2b) e murganhos ILT4-transgénicos (H-2b) (8-10 semanas de idade) como recipientes de enxerto de pele ao longo do estudo. Os murganhos recipientes receberam microesferas acopladas a HLA-G. A pele do dador foi de murganhos B6.CH-2bml2 (bml2, H-2b) de MHC classe II-disparate. Os enxertos alogénicos de pele foram realizados através de métodos convencionais. Resumidamente, a pele (1,0 cm2) da cauda dos murganhos dadores (12-14 semanas de idade) foi enxertada no flanco de murganhos recipientes, anestesiados. O enxerto foi coberto com gaze e gesso, que foi removido no dia 10. Os enxertos foram classificados diariamente até à rejeição (definido como 80% do tecido enxertado se ter tornado necrótico e reduzido em tamanho). Todos os resultados de sobrevivência de enxerto da pele foram testados por Kaplan Meier Survival Analysis. ΡΕ2352509 - 33 -

Resultados

Os resultados são apresentados nas Figuras 3-5. Eles demonstram que todas as proteínas de fusão foram capazes de melhorar substancialmente a tolerância ao enxerto in vivo. Em particular, eles demonstram que as proteínas de fusão são capazes de melhorar até 50% a tolerância ao enxerto (ver e. g. , fig. 5), que é muito surpreendente e substancial. Deve ser referido que cada dia de sobrevivência do enxerto no modelo corresponde a aproximadamente pelo menos um mês de sobrevivência do enxerto em indivíduos humanos, de modo a que se crê que as proteínas desta invenção melhorem a sobrevivência do enxerto em pelo menos 10 meses em indivíduos humanos.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

SEQ ID NO: 1 - sequência de cDNA para HLA-G6-hFc IgG2 Sequência de DNA alpha-1 seq sinal/alpha-1/apha-3/intrão-4/MCS/hFc IgG -34- :gcc ΡΕ2352509 ACCGGTATCGTG 1 Vj/Vv*V*A*· 1 Vi

TTTCAG CGCCGCCG

ATGGGCTACGTGGACGArArGCAGTíCGTGCGGTTCGACAGCGACTCGGCG GT ATTG GGAÀG ΑΏΟ A GA Γ AGGG A AC A.CX^.AAGGCCGACG^O\<^ClO ACA^

GCGGGATGGGGAGGACrAGACCCAGGACGTGGAGCTCGTGGAG.AÇCAGjGC CKjCAGGGGATGGAACCTTCCAGAAGTGGGCAGCI

AGGGAAAGCAGGAfíf:CTCTCTGAAGACCT€T€GAOCACCATGGTTAGATCT

GTGGAGTGCCCACCTTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCTTCAGTC

TTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGAACCC

CTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGÀGG

TCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCATGGAGGTGCATAATGCCAAGA

CAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCG

I vmv. I ftVAAVP J

GCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAirCT

CCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCC U 1 uuau 1 IrtJlUÍ

GGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCG ACGG€TC€TT€TT€CT€TACAGCAAGCTCACCGTGGA€AAGAGCAGGT G GC AG C AGGGG A A CG TCTTCT C ATGCTCCGTG ATGC ATG AGGCTCTGC ACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA SEQ ID NO: 2: sequência de proteína de HLA-G6-hFc IgG2

Sequência sinal: aminoácidos 1-24 G6: aminoácidos 25-227 MCS: aminoácidos 228-234

Fc: aminoácidos 235-452

KVVMAPRTLF&X,LSGAX.T£T£TWAGSaSMR

FFSAAVSRPGRGRPRFIAHGYVDDTQFVRF ΡΕ2352509 - 35 - D S D S A C P R M E P R A P w V E Q E G P E Y W E E E T R N T K A H & Q T D R M H I* Q T L R G Y Y N Q 3 E A » P P K Ϊ H ¥ T H H P ¥ F D Y E A T L R C W A β ¢3 ff Y P A E I I L Y W α R D G E D Q T 0 D ¥ E L V I T R P A G D G T F Q K W Â A V ¥ V P S G £ E 0 R. Y T C H V Q H E G L P E P L M X. R w S K E G D G G I M S V R E S R S L S E D L S S T M ¥ R S ¥ E C P P C P A P P V A G P S ¥ F L F P P K P K D Y L M I S R T p E V Y C ¥ V V D ¥ S H E D P E ¥ Q F N W Y ¥ D G M E ¥ H N A K Ί* K P R £ E 0 F Sf 3 Y F R ¥ ¥ S ¥ í* Ϊ ¥ ¥ H Q D W β N G E E Y K C K ¥ S N K G L P A P I E K T I 3 K T K G Q P R E P Q ¥ Y T L Ι P S K E E M K N Q ¥ s L T C L ¥ X G F Y P S D I A ¥ E W Ε S N G Q P E N N Y K T P P M L D s D G s F F L Y S K L T V β X S R W Q α G N ¥ F s C s ¥ M H E A L H H K Y T Q K S L S L s P 6 K Sfcoj j SEQ ID NO: 3: sequência de DNA de HLA-G1 β2πι hFc IgG2 seq sinal B2m/Beta 2m/linker/α!/α2/α3/ hFc IgG2 -36- ΡΕ2352509

ACCGGTAT GTCTCG CTCCGTGO CCTTAGCTOTGCTCGCGCT ACT CTCTCT1T CT GGCCTGGAG GCT AT CC AGCG TACT CC AAAG ATTC A GG TTTACTC ACGT catccagcagagaatggaaagtcaaatttcctgaattgctatctgtctg

GGTTT C A TCCATCCGAC ATTG A AG TTG ACTTACTG AAGAATGG AG AG AG AATTGAAAAÀGTGGAGCATTCAGACTTGTCTTTCAGCAAGGACTGGTCT

TTCTATCTCTYGT ACT AC ACTG A ATT C ACCCCC ACTG AA AAAGATG AGT ATG CC TG CCGTG TG A ACC ATGTG ACCTTGTCAC AG CCCÁ AG A TAGTT AA GTGG G ATCG A G AC AT GGGAGGTGG CGG AT CCGG AGGTGGCGG AT CCGG A ggtggcggatcx:ggctcccactccatgaggtatttcagcgccgccgtgt CCCGGí

GAAGACGAGACACGGAACACCAAGGCCCACGCACAGACTGACAGAATG

AACCrCCAGACCCTCCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCAGTTCT

C AC ACCCT CC AG TGG A TG A TTGGCTG C G AC CTGGGG TCCGACGC ACGC

CTCC TCCGCGG GT ATG A AC AGT A TGCC T ACC A TGGC A AGG ATT ACC TC

GCCCTGAACGAGGACCTGCGCTCCTGGACCGCAGCGGACACTGCGGCT

CAGATCfCCAAGCCCAAGTGTGAGGCGGCCAATCTGGCTGAACAAAGG

AGAGCCTACCTGCAGGGCACGTGCGTGGAGTGGCTCCACAGATACCTG

GAGAACGGGAAGGAGATCCTCCAGCGCQCGGACCCCCCCAACACACA

CGTGACCCACCACCCTGTCTTTGACTATGAGGCCACCCTGAGGTGCTG

GGCCCTGGGCTTCTACCCTCCGGAGATCATACTGACXrrGGCAGCGGGA

TGGGGAGGACCAGACCCAGGACGTGGAGCTCGTGGAGACCAGGCCTO

GAGAGGAGCAGAGATACACGTGCCATGTGCAGCATGAGGGGCTGCCG

A rCTGTGÚAOTGCCCACCTTGCCCÁ TCGAGCACCA TGGTTA GA FC7GTGGAGTG uvnvA/uv, i u > uGCAGG^ iTGCAT.

1 V.» I I VlVtVAA n J VA A.UV

AGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCT

TCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGG agaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctcctt CTTCC'

ϋιΛΛν-MR. 1 IV. I V.H i UVI I «A i Ut-A I UAUUl/ 1 V, I VM

ACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA SEQ ID NO: 4: proteína HLA-G1 β2πι hFc IgG2 seq sinal B2m: aminoácidos 1-20 Beta 2m: aminoácidos 21-119 -37- ΡΕ2352509

Ligante: aminoácidos 120-134 α1/α2/α3: aminoácidos 135-412 hFc IgG2 aminoácidos 413-END

M s R s V A L A V y λ«ι A L S L s G L K A I Q R T P K I Q V Y S R H P A E $ G K s N F L N C Y V S G F H P 5 D I E V D L L K N G E R I E K V E H S D L s yí i. s K D W S F Y L Y Y m E F T P T s K D E Y A C R V N H V T L s Q P K I V K W D R D M G G G G Q G Or G G s G rt Vf G G S G s H s M. R Y F A A V S R P G R G E P R E I A M G Y V D D T Q F V S F D S D s A C P R M E P B h p W V E E G P E Y W E E fgt T R N K A H A 0 T 0 R M N L Q T L R G Y Y N Ώ S E A S S H T L Q w 1 G C D L G S D Ca R L L R G Y E Q Y A Y D G K D Y L A. y N B D L R S W T A A D A A Q I S K R K C E A A N V A E Q R R A Y L E G T c V E W L H R Y L E N G K E M i_l 0 R A D P P K T H. V T H H P V F D Y E A T L R C W A AJ G F Y P A E 1 I L T w 0 R D G E D Q Q D V E L V E T R £> A D G T F Q K fc? A A V V V P S G E E Q R Y cp H V Q H E G L P E p L M L R $ K A V A s s T M V R s V E C P P c P S 3 T M V R S V E C P P c p A Ε P V A G P 3 V L F P P K P K D T L M I s R P E V T C V ν V D V S H E D P E V Q H W Y V D G M V H N A K T K P R E E Q F N S T F R V V S V L T V V H G D w L N G K E Y K c K V S N K G L P A P I E K T I s K T K G G P R E P Q V Y T L P P s R E E M T K N Q V s L T c h V K G F Y P S D I A V E w E s N G Q P E N Y K T T P P M L D s D G s F P L Y S K L T V 0 K S R w ' Q Q G N V F s c s V M K E A L H N H Y W K S L s L s P G K SEQ ID NO: 5: sequência de DNA da seq sinal IL2/alpha-1/MCS/Mouse IgG2a Fc -38- ΡΕ2352509 ATgÍi>XACigfA£<KvvACTC^

GTTCGTCCGGTTCGACAGC6ACTCGGCGTGTCCGAGGATGGAGCCGCGGGC GCCGTGGGTGGAGCAGGAGGGGCCAGAGTATTGGGAAGAGGAGÁCACGGA ACACCAÃGGCCCACGC AC AG ACTG ACAG AAT 0 AACCTGC A G ACCCTG CGCG gcyactacáaccãgãgcgãggccagtggga ta tcggcca tggttâgá tctccc agagggcccacaatcaagccctgtcctccatgcaaatgcccagcacct

AACCTCTTGGG TG GA CC ATCCGTCTTC ATC TTCCC TCC AAAG ATC AAGG ATGTAC-TCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTCGTGGTGGA TGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTCTGAACAA

CAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTG

G AT G AG TG G C A AG G AGTTC AAATGC AÀG G T C AACÂAC A AAGÁCCT CCC

AGCGCCCATCG AG A G A ACC ATCTC AA AACCC A A A GGG TC AGTAAG AG C TCC A.C AGGTAT ATG TCTTGCCTC CAC C AG A AG AAG A GATGACTAAGAÂA

C AG GTC ACT CTG ACCTG CATGGTC AC AG AC TTC ATGCCTG AAG AC ATTT

CTG AÂCC AGT CCTGG ACTCTGATG GTTCTT ACTTC ATGTAC A GC A ACCT G AG AGTGG AAAAG AAGAACTGGGTGG AA AG AAAT AGC T ACT CCT GTTC SEQ ID NO: 6: seq sinal IL2: aminoácidos 1-20 alpha-1: aminoácidos 21-110 MCS: aminoácidos 111-119

IgG2a Fc de murganho: aminoácidos 120-END M ¥ R M Q L X> S c I A L B L A L V Y 8 S G S H S M R ¥ F s A A V S R P G R G E P a F I A M G y V D 0 Y Q F Y R F D S D $ A C F R M E P R A P W V E Q E G P E Y 8 E E E Y R 8 Y K A H A Q «p P a M N L Q ¥ L R G y Y 8 Q S E A S G I s A M Y R ε P R G P T X K P C P P C K C P A P 8 L h G G P S V F X P P P K I K D V L M I S L S P I V Y C Y V V 0 V S E D D P D V Q ϊ $ W F V 8 a V ε V H T A Q T 0 Y H R E D y 8 S Y L R Y V B A L P I Q a Q D w M S G K E F K C K V 8 8 K D L P A P I E R T X S K P K G $ V R A P Q V Y V L P P P E E E M Y K K Q V Y X» T C M Y T 0 F M P E D I Y V £ K T 8 8 G K T E L 8 Y K 8 Y 1 P V L 0 s D G s y F H y s K L R V E K K 8 8 V E R 8 s y s c s Y V H E 6 L H H H H Y Y K S F s R T P G K Stoj p

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS - 39 - ΡΕ2352509

<110> HLA-G TECHNOLOGIES <120> proteínas HLA-G e suas utilizações farmacêuticas <130> B795PC00 <160> 16 <170> Patentln versão 3.3

<210> 1 <211> 1380 <212> DNA <213> sequência artificial <220> <223> sequência de cDNA para HLA-G6-hFc IgG2 <220> <221> caraterística misc <223> sequência de DNA de alpha-1 seq sinal/alpha-l/alpha-3/intrão-4/MCS/hFc IgG2 <400> 1 -40- ΡΕ2352509 accggtafcgg fcggtcatggc gccccgaaoc ctcttcctgc taetctcggg ggccctgacc 60 ctgaccgaga cctgggcggg ctcccactcc atgaggtatt tcagcgccgc cgtgtcccgg 120 occggccgcg gggagccccg çtfrcategcc atgggcfc&cg tggacgacac gcagttogtg 180 cggttcgaea gegactcggc gtgtecgagg atggagcegc gggcgccgtg ggtggagcag 240 gaggggccag agtattggga agaggagaca cggsacacca aggcccacgc acagactgac 300 agaâtçsacc tgcagaccct gcgcggctac tacaaccaga gcgaggccaa cccccccaag 360 acacaegtga cccaccaccc tgtctttgac tatgaggcca ecctgaggtg ctgggccctg 420 ggcttct&ce ctgcggagat catactgacc tggcagcggg atggggagga ccagacccag 4 80 gacgtggagc tcgtgyagaç çaggçctgca ggggatggaa cettccagaa gtgggcagct 540 gtggtggtgc cttctqgaga ggageagaga tacacgtgce atgtgcagca tgaggggetg 600 ccggagcccc te&tgctgag atggagfcaag gagggagatg gaggcatcat gtctgttagg 660 gaaagcagga geetctctga agacctctcg agcaccafcgg ttagatctgt ggagtgccca 720 ccttgcccag caocacctgt ggcaggacct tcagtcttcc tcttcccccc aa&âcccMg 780 gaeaccctga tgatctccag aacccctgag gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccac 84 0 gaagacceeg aggtccagtt caactggtac gtggaeggca fcggaqgtgca taatgccaag 900 acaaag c esc ggçaggagca gtteaacãíjc scgtteegtg tggtcagcgt cctcaccgtc 960 gtgcaccagç actggctgaa çggcaaggag tacaagtgea aggtctccaa caaaggcctc 1020 ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa accaaagggc agccccgaga accacaggtg 1080 taeaccctge ccccatcccg ggaggagatq accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 1140 gtoaaagget tctaccccag cgaeatcgcc gtggagtggg agagcaatgç gcaçccggag 1200 aacaactaca agaccacacc tcccatgctg gactr.r.gar.g gctccttctt cctctacagc 1260 aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tetteteatg ctccgtgatg 1320 catgaggctc ctacacacag aagagcctct ecctgtctcc gggtaaatga 1380

<210> 2 <211> 457 <212> PRT <213> sequência artificial <220> - 41 - ΡΕ2352509 <223> sequência da proteína de HLA-G6-hFc IgG2 <220> <221> CARATERÍSTICA_MISC <222> (1)..(24) <223> Sequência sinal <220> <221> CARATERÍ STICA_MISC <222> (25)..(227) <223> G6 <220> <221> CARATERÍ STICA_MISC <222> (228)..(234)

<223> MCS <220> <221> CARATERÍ STICA_MISC <222> (235)..(457) <223> Fc <400> 2 - 42 - ΡΕ2352509

Met Vai Vai Met Ala Pro Arg Thr 1 5

Leu Phe Leu Leu Leu Ser Gly Ala 10 15

Leu Thr Leu Thr Glu Thr Trp Ala 20

Gly Ser Bis Ser Met Arg Tyr Phe 25 30

Ser Ala Ala. Vai Ser Arg Pr o Gly 35 40

Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala 45'

Met Gly Tyr Vai Asp Asp Thr Gin 50 55

Phe Vai Arg Phe Asp Ser Asp Ser 60

Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg

Ala Pro Trp Vai Glu Gin Glu Gly -43- ΡΕ2352509 65 O 03 tíl r*» o r- Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr Arg ftsn Thr Lys Ala His Ala Gin 85 90 95 Thr Asp Arg M&t Asrt Leu Gin Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gin Ser 100 105 110 Glu Ala Asm 115 Pro Pro Lys Thr Hás Vai Thr His His Pro Vai Phe Asp 120 125 Tyr Glu Ala 130 Thr Leu Arg Cys Trp Al® Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu 135 140 lie Ile Leu 145 Thr Trp Gin Arg Asp Gly Glu Asp Glu Thr Gin Asp Vai 150 155 160 Glu Leu Vai Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gin Lys Trp 165 170 175 Ala Ala Vai Vai Vai Pro Ser Gly Glu Glu Gin Arg Tyr Thr Cys His 180 185 190 Vai Gin Bis 195 Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Arg Trp Ser Lys 200 205 Glu Gly Asp 210 Gly Gly 11® 54® t, Ser Vai Arg Glu Ser Arg Ser Leu Ser 215 220 Glu Asp Leu 225 Ser Ser Thr Met Vai Arg Ser Vai Glu Cys Pro Pro Cys 230 235 240 Pro Ala Pro Fr© Vai Ala Gly Fr© Ser Vai Phe Leu Fhe Pro Pro Lys 245 250 255 Pro Lys Asp Thr Leu Met ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai 260 265 270 Vai Vai Asp 275 Vai Ser His Glu Asp Pr© Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr 280 285 Vai Asp Gly 290 Met Glu Vai Hla Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 295 300

Gln Phô Aan. Ser Thr Phe Aro Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Vai Hla -44- ΡΕ2352509

Gln Asp Trp Leu Asn Giy Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys 325 330 335

Gly Leu Pro Ala Fro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin 340 345 350 fro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 355 360 365

Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro 370 375 380

Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Glu Pro Glu Asn Asn 3B5 390 395 400

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 405 410 415

Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai 420 425 430

Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin 435 440 445

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455

<210> 3 <211> 1977 <212> DNA <213> sequência artificial <220> <223> sequência DE DNA de HLA-G1 Beta2m hFc IgG2 <220> <221> caraterística misc -45- ΡΕ2352509 <223> seq sinal B2m/Beta 2m/linker/alphal/alpha2/alpha3/ hFc IgG2 <400> 3 -46- ΡΕ2352509 aceggtstgt cfccgctecgt ggccfctagct gtgctcgcge tacfcctctct ttctggcctg 60 gaggctatcc agcgtactcc aaagattcag gtttactcac gtcatecagc agagaatgga '120 aagtcasatt txctgaattg ctatgtgtct gggtttcatc catccgacat fcgaagttgac 180 ttactgaaga atggagagag aattgaaaaa gtggagcatt cagacttgtc tttcagcaag 240 gactggtcfct tctatctctt gtactaeact gaatt-cac.ee eeactgaaaa agatg&gtat 300 - 47 - ΡΕ2352509 gcctgccgtg tgaaccafcgt gaccttgtca cagcccaaga tagtfcaagtg ggatcgagac 360 atgggaggtç gcçgateegg aggtggcgga tccggaggtg gcggatccgg ctcccactcc 420 atgaggtatt fccagcgccgc cgtgteccgg cccggccgcg gggagccccg cttcatcgcc 480 atgggctacg tgçaegacac gcagttcgtg cggttcgaca gcgactcggc gtgtccgagg 540 atggagccgc gggcgcegtg ggtggaggag gaggggccgg agtattggga aq&ggag&ca 600 cggaaGâccs aggcceacgc aeagactgac agaatgaacc tgcagaccct gegcggctae 660 gcgaggccag ttctcacacc ctccagtgga tg&ttggctg cgacctgggg 720 teegaeggae gcctcctccg cgggtatgaa cagtatgcct acgatggcaa ggattacctc 780 gcectgaacg aggacctgc.g ctcc.tgga.ec: gc&gcggaca ctgcggctca gatctceaag 840 egcaagtgtg aggcggccaa tgtggcfcgaa caaaggagag cctâcctgga gggcacgtge 900 gtggagtggc teeacagata cctggagaac gggaaggaga fcgctgcagcg cgcggaccce 960 cççaagacac acgtgaccca ecaecctgte •tttgactatg âggccaceefc gaggtgetgg 1020 gccctgggcfc tetacectge ggagatcata ctgacctggc agcgggatgg ggaggaccag 1080 accçaggacg tggagctcgt ggagaceagg ccfcgcagggg atggaacctfc ccagaagtgg 1140 gcagctgtgg tggtgccttc tggagaggag cagagatacã cgtgccatgt gcageatgag 1200 gggctgccgg agcccctcat getgagatgg asggcagttg cctcgagcac catggttaga 1260 tctgtggagt gcccaccttg cccatcgagc accatggtta gatetgtgga gtgcccacct 1320 tgeceagcae cacctgtggc sggaccttea gtcttcctct tccccccaaa aeccaaggac 1380 aacctgatga tctccagaac eectgaggfce acgtgcgtgg tggtggacgt gagccaegaa 1440 gaceecgagg tccagttcaa ctggtacgtg gacggcatgg aggtgcataa tgccaaçaea 1500 aagecacggg aggagcagt.t caacagcacg ttccgtgtgg teagcgtcct caccgvcgtg 1560 caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa aggcctccca 1.620 gcccccatcq agaaaaccat çtcçaaaacc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1680 accctgcccc caecccçgga ggagatgacc aagaaecagg ccagcctgae ctgcctggtc 1740 aaaggcttct accccagcga cafccgcegtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaaO 1800 sactacaaga ccacaectcc catgctggac tcogacggct ccttcttcct ctacagcaag 1860 ctcaccgtgg âcaaga^cag gtggcagcag gggaacgtct tcte.ctgete cgtgatgcat 1920 gaggctctgc acaaccacta cacacagaag agcctctccc tgtctccggg fcaaatga 1977 <210> 4 -48- ΡΕ2352509

<211> 656 <212> PRT <213> sequência artificial <22 0> <223> proteína HLA-G1 Beta2m hFc IgG2 <22 0> <221> CARATERÍSTICA_MISC <222> (D · , . (20) <223> seq sinal B2m <22 0> <221> CARATERÍSTICA_MISC <222> (21) . •·(119) <223> Beta 2m <22 0> <221> CARATERÍSTICA_MISC <222> (120) .. (134) <223> Ligante <22 0> <221> CARATERÍSTICA_MISC <222> (135) . . (912) <223> alphal/alpha2/alpha3 <22 0> <221> CARATERÍSTICA_MISC <222> (413) . . (656) <223> hFc IgG2 <400> 4 -49- ΡΕ2352509

Met Ser Arg Ser Vai Ala Leu Ala 1 5

Vai Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 10 15

Gly Leu Glu Ala He Gin Arg Thr

2Q

Fro Lys He Gin Vai Tyr Ser Arg 25 30

His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser 35 40

Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Vai Ser 45

Gly Phe His Pro Ser Asp lie Glu 50 55

Vai Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu 60

Arg He Glu Lys Vai Glu Bis Ser 65 70 Ãsp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp 75 B0

Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr 85

Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp 90 95

Glu Tyr Ala Cys Arg Vai Asn His 100

Vai Thr Leu Ser Gin Pro Lys lie 105 110 ΡΕ2352509 - 50 -

Val Lys Trp Asp Arg Asp Het Gly Gly Gly Giy Ser Gly Gly dy Gly 115 120 125 Ser Gly Gly oiy Gly Ser ciy Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala 130 135 140 Ala Val Ser Arg Pr o Gly Arg Gly Glu Pro Arg phe Ile Ala Met Gly 145 ISO 155 160 Tyr Val Asp Asp Thr Gin Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Cys 165 170 175 Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Val Glu Glu Glu Gly Pro Glu 180 185 190 Tyr Trp Glu Glu Glu Thr Arg As.n Thr Lys Ala His Ala Gin Thr Asp 195 200 205 Arg Met Asn Leu Glu Thr L@a Arg Gly Tyr Tyr Asn Gin Ser Glu Ala 210 2:15 220 Ser Ser His Thr 'Leu Gin. ΟΓ1 vv\ A i Het lie Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp 225 230 235 240 Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Glu Gin Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp 245 250 .255 Tyr Leu Ala Leu Asm Gm. Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr 260 265 270 Ala Ala Gin 11© Ser Lys Arg Lys Cys Glu Ala Ala Asn val Ala Glu 275 280 285 Gin Arg Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr , * -v v y Os Val Glu Trp Leu His Arg 250 295 300 Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Met. Leu Gin Arg Ala Asp Pro Pre? Lys 305 310 315 320 Thr His Val Thr His His Pr o Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg 325 330 335 Cys Trp Ala Leu Gly Fie Tyr Pro .Ala Glu Ua II e Leu Thr Trp· Gin 340 345 350 ΡΕ2352509 - 51 - 355 360 365

Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gin 370 375 Ser Gly Glu Glu Gin Arg 'Tyr Thr 385 3SQ Pro Glu Pro Leu Met 405 Leu Arg Trp Vai Arg Ser Vai Glu Cys Pro Pro 420 Ser Vai Glu Cys Pro Pro Cys Pro 435 440 Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 450 455 Thr Pro Glu Vo 1 Thr Cvs Vai 465 470 Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr V &-3. 485 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin. 500 Sar Vai Leu Thr v a 1 Vai H i. 3 Gin 515 520 Lys Cys Lys vai Ser Asn Lys Gly 530 535 lie 545 Ser Lys Thr Lys Gly 550 Gin Pro Pro Pro Ser Arcj Glu Glu mt Thr 565 Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 580 Asa Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 593 600

Lys Trp Ala. Ala Vai. Vai Vai Pro 3&0

Cys Mis Vai Glrs His Glu Gly Leu

395 4 0Q

Lys Ala Vai Ala S®r Ser Thr Hefc 410 415

Cys Pro Ser Ser Thr Met Vai Arg 42S 4 30

Ala Pro F.ro Vai Ala Gly Pro Ser 445

Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg 460

Vai A»p Vai Ser Mia Glu Asp Pro 47S 480

Asp Gly ffet Glu Vai His Asn Ala 490 495

Phe Asft Ser Thr Phe Arg Vai Vai 505 510

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

Leu Pro Ala Pro IX® Glu Lys Thr: 540

Arg Glu Pro Gin Vai Tyr 'Thr Leu

Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys 570 575

Asp lie Ala Vai Glu Trp Glu Ser 5S5 590

Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp 605 - 52 - ΡΕ2352509

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser 610 615 620 Mq Trp Gin Gin. Gly Asa Vai rh© Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala 625 630 635 64 0 Leu His Asn Hí s Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Sar Pro Gly Lys 645 650 655

<210> 5 <211> 1056 <212> DNA <213> sequência artificial <22 0> <223> sequência de DNA da seq sinal IL2/alpha-I/MCS/Mouse IgG2a Fc <400> 5 -53- ΡΕ2352509 atgtacagga tgcaacbcct gfccttgcatt geactaagtc ttgcacfctgt cacgaattcg €0 ggctcccacfc ccatgaggta tfctcagcgcc çfccgtgtccc ggcccggccg cggggagccc 120 cgcttcatcg ccatgggcta cgtggacgacr acgcagttcg tgcggttcga cagcgactcg 180 gcgtgtccga ggatggsgcc gcgggcgccg tgggtggagc aggaggggcc agagtattgg 240 gaagaggaga cacggaacac caaggcceac gcacagactg aeagaatgaa cctgcagacc 300 cigcgcggct aet-acascca gagcgaggcc agtgggatat eggceatggt tagatctccc 360 agagggccca caatcaagcG Gtgtceteca tqcaaatgcc cagcacctaa cctcttgggt 420 ggaccatccg tcttcatctt ccctccaaag atcaaggatg tactcatgat ctcectgagc 480 cceatagtca cafcgtgtggt ggtggatgtg agcgaggatg acccagatgt ecagatcagc 540 tggtttgtga acaacgtgga agtacacsca gctcagacac aaacccatag agaggattac 600 aacagtactc tecgggtggt cagtgccctc cccatecsgc accsggactg gatgagtggo 660 aaggagttca aatgcaaggt eaacaaeaaa gaecteccag cgcceatcga gagaaccacc 720 tcaaaaccca aagggtcsgt aagagctcca caggtatatg tcttgcctcc accagaagaa 7&0 gagatgacta agaaacaggt cactctgscc t.gcatggtca cagaetteat gcctgaagac 840 atttacgtgg agtggaccaa csacgggaaa acagagctaa actacaagaa cactgaacca 800 gtcctggact ctgatggttc ttacttcatg tacagcaagc tgagagtgga aaagaágáac 9S0 tgggtggsaa gaaatagcta ctcctgttca gtggtccacg agggtctgca caatcaceac 1020 acgactaaga gcttctcccg gactccgggt: aaatga 1056 <210> 6 <211> 351

<212> PRT <213> sequência artificial <22 0> <223> sequência da proteína da seq sinal IL2/alpha-1/MCS/Mouse IgG2a Fc <220>

<221> CARATERÍSTICA_MISC <222> (1)..(20) -54- ΡΕ2352509 <223> seq signal IL2 <220> <221> CARATERÍSTICA_MISC <222> (21)..(110) <223> alpha-1 <220> <221> CARATERÍ STICA_MISC <222> (111)..(119)

<223> MCS <220> <221> CARATERÍSTICA MISC <222> (120)..(351) <223> Mouse IgG2a Fc <400> 6 -55- ΡΕ2352509

Met Tyr Arg Met Gin Leu Leu Ser Cys ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15

Vai fhr As π Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Vai 20 25 30

Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Vai 35 40 45

Asp Asp Thr Gin Phe Vai Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Cys Pro Arg 50 55 60

Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Vai Glu Gin Glu Gly Pro Glu Tyr Trp 65 70 75 80

Glu Glu Glu Thr Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gin Thr Asp Arg Met 85 90 95

Asn Leu Gin Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr A$n Gin Ser Glu Ala Ser Gly 100 105 110 11« Ser Ala Met Vai Arg Ser Pro Arg Gly Pro Thr lie Lys Pro Cys 115 120 ' 125 ΡΕ2352509

Pro Peo Cys Lys Cys Pro Ala 130 135 Phe lie Pha Pro Pro Lys ile 145 150 Pro Ile Vai Thr Cys Vai Vai 165 Vâl Gin Ile Ser Trp Phe Val 150 Thr Gin Thr 135 His Arg Glu Asp Ala. Leu Pro Ile Gin His Gin 210 •5 e, ^1· ^ 'tJ* Cys Lys Vai Asn Agrt Lys Asp 225 230 Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val 245 Pro Pro Glu Glu 260 Glu Met Thr Vai Thr Asp Fhe Met Pro Glu 275 Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr 290 235 Asp Giy Ser Tyr Phe Met Tyr 305 310 Trp Vai Glu Arg Asn Ser Tyr 325 Ris Asn His His Thr Thr Lys 340

Leu Leu GXy Gly Pro Ser Val 140 Val Leu Met 11© Ser Leu Ser 155 160 Vai Ser Glu Asp Asp Pro Asp 170 175 Val Glu Val sis Thr Ala Gin 100 Ser Thr Leu Arg Val Val Ser 205 Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys 220 Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile 235 240 Pro Gin Val Tyr Val Leu Pro 250 255 Gin Val Thr Leu Thr Cys Met 270 Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn 283 Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser 300 Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn 315 320 Ser Val Val His Glu Gly Leu 330 335 Ser Arg Thr Pro Giy Lys 350 -57- ΡΕ2352509 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> sequência artificial <220> <223> iniciadores <400> 7 aaaaccggta tggtggtcat ggcgccccg 29 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> sequência artificial <220> <223> iniciadores <400> 8 aaactcgaga ggtcttcaga gaggctcctg ctt 33 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> sequência artificial <220> <223> iniciadores - 58 - ΡΕ2352509 <400> 9 cgtcgcatgc acgcgtcgat gtctcgctcc gtggcc 36 <210> 10 <211> 79 <212> DNA <213> seguência artificial <220> <223> iniciadores <400> 10 tcafcgg&gtg ggagccggat ccgccacctc eggatecgce acebccggat ccgccacctc 60 ccatgtctcg atcccactt <210> 11 <211> 43 <212> DNA <213> seguência artificial <22 0> <223> iniciadores <40 0> 11 tatggtcgac ctcgagcgca gctgccttcc atctcagcat gag 43 <210> 12 <211> 35 - 59 - ΡΕ2352509 <212> DNA <213> sequência artificial <220> <223> iniciadores <400> 12 acgtcgcatg cacgcgtcgg gcttccactc catga 35 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> sequência artificial <220> <223> iniciadores <400> 13 cgtcgcatgc acgcgtcgat gtctcgctcc gtggcc 36 <210> 14 <211> 43 <212> DNA <213> sequência artificial <220> <223> iniciadores <400> 14 - 60 - ΡΕ2352509 tatggtcgac ctcgagcgca gctgccttcc atctcagcat gag 43 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> sequência artificial <220> <223> iniciadores <400> 15 aaagaattcg ggctcccact ccatgaggt 29 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> sequência artificial <220> <223> iniciadores <400> 16 aaagatatcc cactggcctc gctctggttg 30

Lisboa, 12 de Agosto de 2013

Claims (17)

1. ΡΕ2352509 - 1 - REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido de fusão que compreende (i) um primeiro polipéptido que compreende a sequência de um domínio de um antigénio HLA-G ligado a (ii) um segundo polipéptido que compreende a sequência de um domínio Fc de uma imunoglobulina e não contendo um sítio de ligação ao antigénio funcional da imunoglobulina.
2. 2. Polipéptido de fusão da reivindicação 1, em que o primeiro polipéptido é N-ter do polipéptido de fusão, e o segundo polipéptido é C-ter.
3. 3. Polipéptido de fusão da reivindicação 1 ou 2, em que o segundo polipéptido compreende a sequência de um domínio Fc de uma imunoglobulina humana ou de murino. de fusão de qualquer uma das em que a imunoglobulina é uma uma IgE, preferencialmente uma de fusão de qualquer uma das em que o antigénio HLA-G é um de fusão de qualquer uma das em que o domínio do referido pelo menos o domínio al.
4. 3. Polipéptido reivindicações anteriores, IgG, uma IgA, uma IgM ou IgG.
5. 5. Polipéptido reivindicações anteriores, antigénio HLA-G humano.
6. 6. Polipéptido reivindicações anteriores, antigénio HLA-G compreende -2- ΡΕ2352509
7. 7. Polipéptido de fusão de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido primeiro polipéptido é selecionado a partir de: - uma sequência de aminoácidos dos domínios al, a2 e a3 de um antiqénio HLA-G; - uma sequência de aminoácidos dos domínios al e a3 de um antiqénio HLA-G; ou - uma sequência de aminoácidos dos domínios al e a2 de um antiqénio HLA-G.
8. 8. Polipéptido de fusão de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que os referidos primeiro e segundo polipéptidos estão ligados diretamente ou através de um espaçador.
9. 9. Polipéptido de fusão de qualquer uma das reivindicações anteriores, que compreende ainda um terceiro polipéptido que compreende a sequência de uma microglobulina β2.
10. 10. Polipéptido de fusão, que é selecionado a partir de: HLA-Gl-B2M-Fc que compreende a SEQ ID NO: 4, ou os seus resíduos de aminoácidos 21-656, HLA-Gal-Fc que compreende a SEQ ID NO: 6, ou os seus resíduos de aminoácidos 21-351, e HLA-G6-Fc que compreende a SEQ ID NO: 2, ou os seus resíduos de aminoácidos 25-452. -3- ΡΕ2352509
11. 11. Molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido de fusão de qualquer uma das reivindicações 1 até 10.
12. 12. Vetor que compreende uma molécula de ácido nucleico da reivindicação 11.
13. 13. Célula hospedeira recombinante que compreende uma molécula de ácido nucleico da reivindicação 11 ou um vetor da reivindicação 12.
14. 14. Método de produção de um polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1 até 10, que compreende cultivar uma célula hospedeira recombinante da reivindicação 13 em condições que permitem a expressão da molécula de ácido nucleico, e recuperação do polipéptido produzido. 15. Dímero de um polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1 até 10.
15. 16. Composição farmacêutica que compreende um polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1 até 10.
16. 17. Composição farmacêutica da reivindicação 16, para o tratamento de rejeição de órgão ou de tecido.
17. 18. Composição farmacêutica da reivindicação 16, para o tratamento de uma doença inflamatória ou uma doença autoimune. Lisboa, 12 de Agosto de 2013