KR20150037959A - 단량체 및 다량체 분자의 제조 방법 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
식 (Bn-CSo-Is-CSp-FC-CSq-It-CSr-Bm)u {B 는 n-량체로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드를 나타내고, FC 는 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드를 나타내고, CS 는 절단 부위를 나타내고, I 는 개재 아미노산 서열을 나타내고, FC 는 Fc-수용체에 실질적으로 결합하지 않음} 에 따른 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 n-량체로서 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 생성하는 방법으로서, 세포 또는 배양 배지로부터 융합 폴리펩티드를 회수하고, 임의로는 프로테아제로 융합 폴리펩티드를 절단하고, 이로써 n-량체로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드가 생성되는 방법이 보고된다.
Description
본 발명은 면역글로불린 Fc-부위를 갖는 융합 폴리펩티드로서의 단량체 및 다량체 분자의 제조 방법, 및 검정, 크로마토그래피 컬럼 또는 질환 동물 모델의 생성에서의 치료제와 같은 이의 용도를 보고하고 있다.
면역글로불린은 일반적으로 2 개의 폴리펩티드 경쇄 및 2 개의 폴리펩티드 중쇄를 함유한다. 각각의 폴리펩티드 중쇄 및 경쇄는 항원과 상호작용할 수 있는 결합 도메인을 함유하는 가변부 (일반적으로 폴리펩티드 사슬의 아미노 말단 부분) 를 포함한다. 각각의 폴리펩티드 중쇄 및 경쇄는 또한 불변부 (일반적으로 카르복실 말단 부분) 를 포함한다. 중쇄의 불변부는 면역글로불린의 예를 들어 Fc 감마 수용체 (FcγR) 를 갖는 세포, 예컨대 식세포, 또는 신생아 Fc-수용체 (FcRn) (또한 브람벨 (Brambell) 수용체로도 공지됨) 를 갖는 세포에 대한 결합을 중재하며, 또한 고전적 보체 시스템의 인자 예컨대 보체 (C1q) 를 포함하는 일부 인자에 대한 결합을 중재한다.
Hulett 과 Hogarth (Hulett, M.D. and Hogarth, P.M., Adv. Immunol. 57 (1994) 1-127) 는 클래스 G 의 면역글로불린의 Fc 부분에 대한 세포외 수용체가 상이한 결합 특이성을 갖는 3 개의 상이한 수용체 유형을 포함하는 트랜스멤브레인 당단백질의 패밀리(: FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII) 라는 것을 보고하였다. 유형 I 의 수용체는 비-복합화 IgG 와 상호작용하는 한편, 유형 II 및 III 의 수용체는 바람직하게는 복합화 IgG 와 상호작용한다.
특정 면역글로불린-기재 사이토카인 융합 단백질은 시판된다 (예를 들어 Biomol 사에서). FC-부위 융합은 일반적으로 "Therapeutic monoclonal antibodies - from bench to clinic" (Wiley, Edited by Zhiqiang An, 2009) 에서 보고되어있다.
WO 01/03737 에 면역글로불린 융합 단백질이 보고되어있다. 감소된 세포내 단백질분해를 기반으로 한 항체-인터류킨 2 면역사이토카인의 향상된 순환 반감기 및 효능이 [Gillies, S.D., et al. (Clin. Cancer Res. 8 (2002) 210-216)] 에 의해 보고되어있다. [Dumont, J.A., et al. (Biodrugs 20 (2006) 151-160)] 은 단량체 Fc 융합을 보고하고있다. 포유동물 세포에서의 Fc-X 융합 단백질의 고수준 발현 및 분비는 [Lo, K-M., et al. (Prot. Eng. 11 (1998) 495-500)] 에 보고되어있다. WO 00/40615 에 Fc 융합 단백질로서 항-비만 단백질의 발현 및 이출이 보고되어있다.
발명의 개요
n-량체로서 생물학적으로 활성이며 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드가, 이들 폴리펩티드를 Fc-수용체에 실질적으로 결합하지 않는 Fc-부위를 갖는 융합 폴리펩티드로서 발현시켜 가용성 형태로 수득될 수 있다는 것이 발견되었다. 폴리펩티드의 발현을 위해 융합 폴리펩티드를 사용하는 것은 융합 폴리펩티드 또는 단리된 폴리펩티드 형태로의 폴리펩티드의 수득가능 수율을 증가시킨다. 폴리펩티드가 Fc-부위의 절단 및 제거 후에도 규정된 n-량체 형태로 남아 있다는 것이 추가로 발견되었다.
본원에 보고된 바와 같은 한 양태는, 하기 단계를 포함하는, n-량체로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하에 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드의 생성 방법이며;
a) 하기 식 I 에 따른 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계:
(Bn-CSo-Is-CSp-FC-CSq-It-CSr-Bm)u (식 I)
[식 중,
B 는 n-량체로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하에 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드를 나타내고,
FC 는 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드를 나타내고,
CS 는 절단 부위를 나타내고,
I 는 개재 아미노산 서열을 나타내고,
n=1 이고 m=0 이거나, n=0 이고 m=1 이고,
n=1 인 경우 o=0 또는 1 이고, o=0 인 경우 p=0 또는 1 이고, o=1 인 경우 p=0, 및 s=0 또는 1, 및 q=0, 및 t=0, 및 r=0 이고,
m=1 인 경우 q=0 또는 1 이고, q=0 인 경우 r=0 또는 1 이고, q=1 인 경우 r=0, 및 t=0 또는 1, 및 o=0, 및 s=0, 및 p=0 이고,
u=1 또는 2 이고,
FC 는 Fc-수용체에 실질적으로 결합하지 않음],
b) 세포 또는 배양 배지로부터 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계,
c) 임의로는 프로테아제로 융합 폴리펩티드를 절단하는 단계,
이로써 n-량체로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드가 생성된다.
본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 하기 식 I 의 융합 폴리펩티드이다:
(Bn-CSo-Is-CSp-FC-CSq-It-CSr-Bm)u (식 I)
[식 중,
B 는 n-량체로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드를 나타내고,
FC 는 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드를 나타내고,
CS 는 절단 부위를 나타내고,
I 는 개재 아미노산 서열을 나타내고,
n=1 이고 m=0 이거나, n=0 이고 m=1 이고,
n=1 인 경우 o=0 또는 1 이고, o=0 인 경우 p=0 또는 1 이고, o=1 인 경우 p=0, 및 s=0 또는 1, 및 q=0, 및 t=0, 및 r=0 이고,
m=1 인 경우 q=0 또는 1 이고, q=0 인 경우 r=0 또는 1 이고, q=1 인 경우 r=0, 및 t=0 또는 1, 및 o=0, 및 s=0, 및 p=0 이고,
u=1 또는 2 이고,
FC 는 Fc-수용체에 실질적으로 결합하지 않음].
본원에서 보고된 바와 같은 한 양태는 본원에 보고된 바와 같은 방법에 따른 방법에 의해 수득된 본원에 보고된 바와 같은 융합 폴리펩티드의 절단에 의해 수득된 n-량체 폴리펩티드이다.
한 구현예에서 B 는 사이토카인의 군 예컨대 IL17, IL18 및 IL33, 사이토카인 수용체 예컨대 IL18R 및 IL33R, TNF 패밀리 멤버 예컨대 TNF, TWEAK 및 TL1a 의 군에서 선택된다.
한 구현예에서 FC 는 인간 IgG1 중쇄 폴리펩티드, 인간 IgG2 중쇄 폴리펩티드, 인간 IgG3 중쇄 폴리펩티드, 인간 IgG4 중쇄 폴리펩티드, 쥐과 IgG1 중쇄 폴리펩티드, 쥐과 IgG2 중쇄 폴리펩티드, 쥐과 IgG2a 중쇄 폴리펩티드, 쥐과 IgG3 중쇄 폴리펩티드, 토끼 IgG 중쇄 폴리펩티드의 군에서 선택되는 중쇄 폴리펩티드의 변이체이다. 이는 모든 자연 발생적 동종이인자형을 포함한다.
한 구현예에서 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드는 위치 234, 235, 236, 237, 238, 239, 253, 254, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 288, 297, 298, 299, 307, 311, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 434 및 435 중 하나 이상에서 아미노산 돌연변이를 갖는다. 한 구현예에서 Fc-수용체 중 하나 이상은 Fc 감마 수용체이다.
한 구현예에서 인간 IgG1 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 위치 233, 234, 235, 236, 265, 297, 329 및 331 중 하나 이상에서 돌연변이를 갖는다.
한 구현예에서 인간 IgG1 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 돌연변이 E233P, L234A, L235A, L235E, △G236, D265A, N297A, N297D, P329A, P329G 및 P331S 중 하나 이상을 갖는다.
한 구현예에서 인간 IgG1 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 돌연변이 L234A 및 L235A, 및 E233P, L235E, △G236, D265A, N297A, N297D, P329A, P329G 및 P331S 중 하나 이상을 갖는다.
한 구현예에서 인간 IgG1 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 돌연변이 L234A 및 L235A 및 P329A 또는 P329G 를 갖는다.
한 구현예에서 인간 IgG2 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 위치 233, 234, 235, 236, 265 및 329 중 하나 이상에서 돌연변이를 갖는다.
한 구현예에서 인간 IgG4 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 위치 228, 235, 265 및 329 중 하나 이상에서 돌연변이를 갖는다.
한 구현예에서 인간 IgG4 중쇄 폴리펩티드는 돌연변이 S228P, L235E, D265A, P329A 및 P329G 중 하나 이상을 갖는다.
한 구현예에서 인간 IgG4 중쇄 폴리펩티드는 돌연변이 S228P 및 L235E 및 P329A 또는 P329G 를 갖는다.
한 구현예에서 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드는 위치 248, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 272, 285, 288, 290, 291, 308, 309, 310, 311, 314, 385, 386, 387, 428, 433, 434, 435 및 436 중 하나 이상에서 아미노산 돌연변이를 갖는다. 한 구현예에서 Fc-수용체 중 하나 이상은 FcRn 이다.
한 구현예에서 인간 IgG 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 위치 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 및/또는 447 중 하나 이상에서 돌연변이를 갖는다.
한 구현예에서 FcRn 에 대한 감소된 결합을 갖는 인간 IgG 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 위치 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 및/또는 447 에서 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는다.
한 구현예에서 FcRn 에 대한 감소된 결합을 갖는 인간 IgG 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A 를 갖는다.
한 구현예에서 u=2 이고 제 1 FC 는 돌연변이 T366W 및 임의로는 돌연변이 S354C 를 포함하고, 제 2 FC 는 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V 및 임의로는 돌연변이 Y349C 를 포함한다.
한 구현예에서 u=2 이고,
a) n=1 및 m=0 이고 제 1 FC 에 융합된 B 및 제 2 FC 에 융합된 B 는 동일하거나,
b) n=1 및 m=0 이고 제 1 FC 에 융합된 B 및 제 2 FC 에 융합된 B 는 상이하거나,
c) n=0 및 m=1 이고 제 1 FC 에 융합된 B 및 제 2 FC 에 융합된 B 는 동일하거나,
d) n=0 및 m=1 이고 제 1 FC 에 융합된 B 및 제 2 FC 에 융합된 B 는 상이하다.
한 구현예에서 u=1 이고 융합 폴리펩티드는 제 2 의 디술피드-연결 FC 를 포함한다.
한 구현예에서 u=1 이고 융합 폴리펩티드는 제 2 디술피드-연결 FC 를 포함하며, 이때 하나의 FC 는 돌연변이 T366W 및 임의로는 돌연변이 S354C 를 포함하고 다른 FC 는 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V 및 임의로는 돌연변이 Y349C 를 포함한다.
한 구현예에서 본원에서 보고한 바와 같은 방법은 하기 단계를 포함하는, 1-량체 (단량체) 로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드의 생성을 위한 것이며:
a) 하기 식 II 에 따른 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계;
Bn-CSo-Is-CSp-FC1-CSq-It-CSr-Bm : FC2 (식 II)
[식 중,
B 는 1-량체로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드를 나타내고,
FC1 은 제 1 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드를 나타내고,
FC2 는 제 2 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드를 나타내고,
CS 는 절단 부위를 나타내고,
I 는 개재 아미노산 서열을 나타내고,
n=1 이고 m=0 이거나, n=0 이고 m=1 이고,
n=1 인 경우 o=0 또는 1 이고, o=0 인 경우 p=0 또는 1 이고, o=1 인 경우 p=0, 및 s=0 또는 1, 및 q=0, 및 t=0, 및 r=0 이고,
m=1 인 경우 q=0 또는 1 이고, q=0 인 경우 r=0 또는 1 이고, q=1 인 경우 r=0, 및 t=0 또는 1, 및 o=0, 및 s=0, 및 p=0 이고,
FC1 및 FC2 는 하나 이상의 디술피드 결합(들)(:) 에 의해 공유 결합되고,
FC1 및 FC2 는 Fc-수용체에 실질적으로 결합하지 않음],
b) 세포 또는 배양 배지로부터 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계,
c) 임의로는 프로테아제로 융합 폴리펩티드를 절단하는 단계,
이로써 1-량체로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위 하에 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드가 생성된다.
한 구현예에서 본원에 보고한 바와 같은 방법은 하기 단계를 포함하는, 2-량체 (이량체) 로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드의 생성을 위한 것이며;
a) 하기 식 II 의 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계:
Bn-CSo-Is-CSp-FC1-CSq-It-CSr-Bm : FC2 (식 II)
[식 중,
B 는 2-량체로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드를 나타내고,
FC1 은 제 1 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드를 나타내고,
FC2 는 제 2 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드를 나타내고,
CS 는 절단 부위를 나타내고,
I 는 개재 아미노산 서열을 나타내고,
n=1 이고 m=0 이거나, n=0 이고 m=1 이고,
n=1 인 경우 o=0 또는 1 이고, o=0 인 경우 p=0 또는 1 이고, o=1 인 경우 p=0, 및 s=0 또는 1, 및 q=0, 및 t=0, 및 r=0 이고,
m=1 인 경우 q=0 또는 1 이고, q=0 인 경우 r=0 또는 1 이고, q=1 인 경우 r=0, 및 t=0 또는 1, 및 o=0, 및 s=0, 및 p=0 이고,
FC1 및 FC2 는 하나 이상의 디술피드 결합(들)(:) 에 의해 공유 결합되고,
FC1 및 FC2 는 Fc-수용체에 실질적으로 결합하지 않음],
b) 세포 또는 배양 배지로부터 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계,
c) 임의로는 프로테아제로 융합 폴리펩티드를 절단하는 단계,
이로써 2량체로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하에 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드가 생성된다.
한 구현예에서 본원에서 보고한 바와 같은 방법은 하기 단계를 포함하는, 3-량체 (삼량체) 로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드의 생성을 위한 것이며;
a) 하기 식 II 에 따른 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계:
Bn-CSo-Is-CSp-FC1-CSq-It-CSr-Bm : FC2 (식 II)
[식 중,
B 는 3-량체로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 발현하는 폴리펩티드를 나타내고,
FC1 은 제 1 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드를 나타내고,
FC2 는 제 2 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드를 나타내고,
CS 는 절단 부위를 나타내고,
I 는 개재 아미노산 서열을 나타내고,
n=1 이고 m=0 이거나, n=0 이고 m=1 이고,
n=1 인 경우 o=0 또는 1 이고, o=0 인 경우 p=0 또는 1 이고, o=1 인 경우 p=0, 및 s=0 또는 1, 및 q=0, 및 t=0, 및 r=0 이고,
m=1 인 경우 q=0 또는 1 이고, q=0 인 경우 r=0 또는 1 이고, q=1 인 경우 r=0, 및 t=0 또는 1, 및 o=0, 및 s=0, 및 p=0 이고,
FC1 및 FC2 는 하나 이상의 디술피드 결합(들)(:) 에 의해 공유 결합되고,
FC1 및 FC2 는 Fc-수용체에 실질적으로 결합하지 않음],
b) 세포 또는 배양 배지로부터 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계,
c) 임의로는 프로테아제로 융합 폴리펩티드를 절단하는 단계,
3-량체로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드가 생성된다.
한 구현예에서 개재 아미노산 서열은 (G3S)3, (G3S)4, (G3S)5, (G3S)6, (G4S)3, (G4S)4, (G4S)5, (G5S)2, (G5S)3, (G5S)4, 및 이의 임의의 조합을 포함하는 제 1 군 또는 Arg-태그, Avi-태그, His-Avi-태그, His-태그, Flag-태그, 3xFlag-태그, Strep-태그, Nano-태그, SBP-태그, c-myc-태그, S-태그, 칼모듈린-결합-펩티드, 셀룰로오스-결합-도메인, 키틴-결합-도메인, GST-태그, 또는 MBP-태그를 포함하는 제 2 군, 또는 이들 군의 2 개 요소의 조합에서 선택된다.
한 구현예에서 절단 부위는 IgA-프로테아제 프로테아제 절단 부위, 그란자임 B 프로테아제 절단 부위, Tev 프로테아제 절단 부위, 선절단 (PreScission) 프로테아제 절단 부위, 트롬빈 절단 부위, Factor10a 프로테아제 부위, Ides 프로테아제 절단 부위, 엔테로키나아제 절단 부위, 또는 SUMO 프로테아제 (Ulp1 (사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 로부터의 Ubl-특이적 프로테아제 1)) 절단 부위에서 선택된다.
한 구현예에서 융합 폴리펩티드는 추가적인 프로테아제 절단 부위를 포함하지 않으나 내재하는 프로테아제 절단 부위, 예를 들어 파파인 절단 부위, 펩신 절단 부위, 또는 Ides 프로테아제 절단 부위를 포함한다.
한 구현예에서 FC-부위(들) 에서의 C-말단 리신 잔기는 결실되었다. 이는 프로테아제 절단 부산물의 양을 감소시킨다 (인공적 프로테아제 절단 부위의 제거).
본원에 보고한 바와 같은 한 양태는 본원에 보고한 바와 같은 고정 융합 폴리펩티드 및 친화성 크로마토그래피 리간드로서 본원에 보고한 바와 같은 n-량체 폴리펩티드의 용도이다.
본원에 보고한 바와 같은 한 양태는 본원에 보고한 바와 같은 고정 융합 폴리펩티드 또는 면역검정에서 본원에 보고한 바와 같은 n-량체 폴리펩티드의 용도이다.
한 구현예에서 융합 폴리펩티드 또는 n-량체 폴리펩티드는 고체상에 결합한다.
본원에 보고한 바와 같은 한 양태는 본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드 또는 본원에 보고한 바와 같은 n-량체 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물이다.
본원에 보고한 바와 같은 한 양태는 본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드 또는 본원에 보고한 바와 같은 n-량체 폴리펩티드의 약제 제조에 있어서의 용도이다.
본원에 보고한 바와 같은 한 양태는 본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드 또는 본원에 보고한 바와 같은 n-량체 폴리펩티드의 면역원으로서의 용도이다.
본원에 보고한 바와 같은 한 양태는 본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드 또는 본원에 보고한 바와 같은 n-량체 폴리펩티드의 본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드 또는 본원에 보고한 바와 같은 n-량체 폴리펩티드를 실험 동물에게 적용함으로써 질환의 동물 모델을 수득하기 위한 용도이다.
본원에 보고한 바와 같은 한 양태는 융합 폴리펩티드 또는 본원에 보고한 바와 같은 n-량체 폴리펩티드의 B 또는 B 의 n-량체에 특이적으로 결합하는 항체를 선택하기 위한 용도이다.
본원에 보고한 바와 같은 한 양태는 본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드 또는 본원에 보고한 바와 같은 n-량체 폴리펩티드의 B 의 디술피드-연결 2-량체를 생성하기 위한 용도이다.
도 1: Fc-수용체 융합 폴리펩티드 발현 플라스미드의 플라스미드 맵.
도 2: Fc-수용체 융합 폴리펩티드의 파파인 절단의 분석적 SDS-PAGE 겔.
도 3: 12% Bis Tris 겔 + / -DTT; 각각 선절단 프로테아제 (레인 4, 8) IgA 프로테아제 (레인 3, 7) 로의 Fc감마RIIIaV158-Avi-Fc LALA P239G 의 절단: PP 로의 비특이적 절단을 관찰할 수 있음 (레인 2, 6).
도 4: 항-Her 항체 (야생형, 상부) 및 당조작 항-Her 항체의 상이한 글리코실화 형태의 분리 및 정량.
도 5: Fc감마RIIIaV158 및 Fc 태그 Fc감마RIIIaV158 을 사용하는 친화성 컬럼의 비교.
도 6: Fc감마RIIIaV158-Fc LALA P329G 융합 폴리펩티드의 반응의 BIAcore 센서그램은 Fc감마RIIIaV158 (40 반응 단위 (RU)) 과 비교하여 100 초과 RU 를 나타냄; FcgRIIIa V 158_008 은 비-절단된 융합 폴리펩티드를 나타내고, FcgRIIIa V 158_007 은 FcgRIIIa (=대조군) 의 단축 비-기능적 변이체를 나타내고, FcgRIIIa V 158_jf323 은 FcgRIIIa 의 기능적 변이체를 포함하는 미손상 HisAvi-태그를 나타낸다.
도 7: Fc감마 수용체 V158-Fc LALA P329G 융합 폴리펩티드 (도 7a), Fc감마 수용체 V158 (도 7b), 절단된 Fc감마 수용체 V158-Fc LALA P329G 융합 폴리펩티드 (도 7c), 비-기능적 Fc감마 수용체 V158-Fc LALA P329G 융합 폴리펩티드 (도 7d) (=대조군) 의 센서그램.
도 8: Fc-TWEAK 융합 폴리펩티드 발현 플라스미드의 플라스미드 맵.
도 9: Fc-IL17A 융합 폴리펩티드 발현 플라스미드의 플라스미드 맵.
도 10: 인간 TNF 알파 변이체의 적정 곡선.
도 11: 상이한 이량체 Fc IL17 융합 폴리펩티드 셋업 및 상태의 모식도.
도 12: 삼량체 Fc-부위-인간 TWEAK 융합 폴리펩티드.
도 13: IL-33 의 전체 길이 (1-270) 및 단 길이 (112-270) 형태는 기능적으로 활성이고; IgG-Fc 가 IL-33 의 나머지 (1-112) 대신 첨가되어 기능적으로 활성인 IL-33 을 수득할 수 있고; 단량체; 단량체 IgG1-Fc_IL-33 으로서 작용함.
도 14: IgG1-Fc-KiH_선절단 프로테아제 부위_shTNFa 융합 폴리펩티드로서의 삼량체 인간 TNF 알파.
도 15: Fc-shTNF알파 융합 폴리펩티드 (놉) 발현 플라스미드의 플라스미드 맵.
도 16: 인간 IgG1 Fc-부위 (홀) 발현 플라스미드의 플라스미드 맵.
도 17: 이량체 IL18R-Fc-융합 폴리펩티드와 비교한, 본원에 보고한 바와 같은 단량체 IL18R-Fc-융합 폴리펩티드의 BIAcore 데이터.
도 2: Fc-수용체 융합 폴리펩티드의 파파인 절단의 분석적 SDS-PAGE 겔.
도 3: 12% Bis Tris 겔 + / -DTT; 각각 선절단 프로테아제 (레인 4, 8) IgA 프로테아제 (레인 3, 7) 로의 Fc감마RIIIaV158-Avi-Fc LALA P239G 의 절단: PP 로의 비특이적 절단을 관찰할 수 있음 (레인 2, 6).
도 4: 항-Her 항체 (야생형, 상부) 및 당조작 항-Her 항체의 상이한 글리코실화 형태의 분리 및 정량.
도 5: Fc감마RIIIaV158 및 Fc 태그 Fc감마RIIIaV158 을 사용하는 친화성 컬럼의 비교.
도 6: Fc감마RIIIaV158-Fc LALA P329G 융합 폴리펩티드의 반응의 BIAcore 센서그램은 Fc감마RIIIaV158 (40 반응 단위 (RU)) 과 비교하여 100 초과 RU 를 나타냄; FcgRIIIa V 158_008 은 비-절단된 융합 폴리펩티드를 나타내고, FcgRIIIa V 158_007 은 FcgRIIIa (=대조군) 의 단축 비-기능적 변이체를 나타내고, FcgRIIIa V 158_jf323 은 FcgRIIIa 의 기능적 변이체를 포함하는 미손상 HisAvi-태그를 나타낸다.
도 7: Fc감마 수용체 V158-Fc LALA P329G 융합 폴리펩티드 (도 7a), Fc감마 수용체 V158 (도 7b), 절단된 Fc감마 수용체 V158-Fc LALA P329G 융합 폴리펩티드 (도 7c), 비-기능적 Fc감마 수용체 V158-Fc LALA P329G 융합 폴리펩티드 (도 7d) (=대조군) 의 센서그램.
도 8: Fc-TWEAK 융합 폴리펩티드 발현 플라스미드의 플라스미드 맵.
도 9: Fc-IL17A 융합 폴리펩티드 발현 플라스미드의 플라스미드 맵.
도 10: 인간 TNF 알파 변이체의 적정 곡선.
도 11: 상이한 이량체 Fc IL17 융합 폴리펩티드 셋업 및 상태의 모식도.
도 12: 삼량체 Fc-부위-인간 TWEAK 융합 폴리펩티드.
도 13: IL-33 의 전체 길이 (1-270) 및 단 길이 (112-270) 형태는 기능적으로 활성이고; IgG-Fc 가 IL-33 의 나머지 (1-112) 대신 첨가되어 기능적으로 활성인 IL-33 을 수득할 수 있고; 단량체; 단량체 IgG1-Fc_IL-33 으로서 작용함.
도 14: IgG1-Fc-KiH_선절단 프로테아제 부위_shTNFa 융합 폴리펩티드로서의 삼량체 인간 TNF 알파.
도 15: Fc-shTNF알파 융합 폴리펩티드 (놉) 발현 플라스미드의 플라스미드 맵.
도 16: 인간 IgG1 Fc-부위 (홀) 발현 플라스미드의 플라스미드 맵.
도 17: 이량체 IL18R-Fc-융합 폴리펩티드와 비교한, 본원에 보고한 바와 같은 단량체 IL18R-Fc-융합 폴리펩티드의 BIAcore 데이터.
정의
용어 "Fc-수용체에 대한 결합" 은 예를 들어 BIAcore(R) 검정 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden) 에서의, Fc-수용체에 대한 Fc-부위의 결합을 나타낸다.
BIAcore(R) 검정에서 Fc-수용체는 표면에 결합하며 분석물, 예를 들어 융합 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 Fc-부위의 결합은 표면 플라스몬 공명 (SPR) 에 의해 측정된다. 결합의 친화성은 용어 ka (결합 상수: Fc-부위/Fc-수용체 복합체를 형성하기 위한 Fc-부위 융합 폴리펩티드 또는 접합체의 결합에 대한 속도 상수), kd (분리 상수; Fc-부위/Fc-수용체 복합체로부터의 Fc-부위 융합 폴리펩티드 또는 접합체의 분리에 대한 속도 상수) 및 KD (kd/ka) 에 의해 정의된다. 대안적으로, SPR 센서그램의 결합 신호는 공명 신호 높이 및 분리 거동에 대해 참조물의 반응 신호와 직접적으로 비교될 수 있다.
용어 "CH2 도메인" 은 대략 EU 위치 231 에서 EU 위치 340 (EU 번호화 시스템은 Kabat 에 따름) 으로 연장되는 항체 중쇄 폴리펩티드의 부분을 나타낸다. 한 구현예에서 CH2 도메인은 SEQ ID NO: 01 의 아미노산 서열 (APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQESTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK) 을 갖는다. CH2 도메인은 또 다른 도메인과 밀접하게 페어링되지 않는다는 점에 있어서 고유하다. 오히려, 2 개의 N-연결 분지형 탄수화물 사슬은 미손상 선천적 Fc-부위의 2 개의 CH2 도메인 사이에 삽입된다. 도메인-도메인 페어링에 대한 대체물을 제공할 수 있으며 CH2 도메인을 안정화시키는 것을 돕는다는 것이 추측된다 (Burton, Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206).
용어 "CH3 도메인" 은 대략 EU 위치 341 ~ EU 위치 446 에서 연장되는 항체 중쇄 폴리펩티드의 부분을 나타낸다. 한 구현예에서 CH3 도메인은 SEQ ID NO: 02 의 아미노산 서열 (GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG) 을 갖는다.
용어 항체의 "클래스" 는 그의 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변부의 유형을 나타낸다. 항체의 5 개 주요 클래스가 존재하며: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (동형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2 로 추가 분화될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ 로 지칭된다.
용어 "Fc-부위" 는 면역글로불린의 C-말단 부위를 나타낸다. Fc-부위는 2 개 디술피드-연결 항체 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드 (Fc-부위 폴리펩티드 사슬) 를 포함하는 이량체 분자이다. Fc-부위는 미손상 (전체 길이) 항체의 파파인 소화, 또는 IdeS 소화, 또는 트립신 소화에 의해 생성될 수 있거나 재조합적으로 생성될 수 있다.
전체 길이 항체 또는 면역글로불린으로부터 수득가능한 Fc-부위는 잔기 226 (Cys) 에서 전체 길이 중쇄의 C-말단을 포함하며, 따라서 힌지 부위 및 2 또는 3 개 불변 도메인, 즉 CH2 도메인, CH3 도메인 및 임의로는 CH4 도메인의 부분을 포함한다. Fc-부위에서의 규정된 아미노산 잔기의 개질이 표현형 결과를 초래한다는 것이 US 5,648,260 및 US 5,624,821 에서 공지된다.
2 개의 동일하거나 비-동일한 항체 중쇄 단편을 포함하는 이량체 Fc-부위의 형성이 CH3 도메인의 비-공유 이량체화에 의해 매개된다 (관련된 아미노산 잔기에 대해서는 예를 들어 Dall'Acqua, Biochem. 37 (1998) 9266-9273 참조). Fc-부위는 힌지 부위에서의 디술피드 결합의 형성에 의해 공유적으로 안정화된다 (예를 들어 Huber, et al., Nature 264 (1976) 415-420; Thies, et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 67-79 참조). CH3-CH3 도메인 상호작용의 이량체화를 방해하기 위한 CH3 도메인 내의 아미노산 잔기 변화의 도입은, CH3-CH3-도메인 이량체화 포함 잔기의 장소가 CH3 도메인의 내부 인터페이스 상에 위치하는 한편 Fc-부위-FcRn 상호작용에 포함된 잔기가 CH2-CH3 도메인 외부에 위치하기 때문에, FcRn 결합에 불리하게 영향을 주지 않는다.
Fc-부위 연관 효과기 기능은 Fc-부위와 효과기 기능 특이적 세포 표면 수용체의 상호작용에 의해 개시된다. 일반적으로 IgG1 동형의 항체는 수용체 활성화에 영향을 줄 수 있는 한편, IgG2 및 IgG4 동형의 항체는 효과기 기능을 갖지 않거나 제한된 효과기 기능을 갖는다.
효과기 기능을 이끌어내는 수용체는 Fc-수용체 유형 (및 하위-유형) FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 이다. IgG1 동형과 연관된 효과기 기능은, FcγR 및 C1q 결합에 포함되는 L234A 및/또는 L235A 와 같은 낮은 힌지 부위에서의 특정 아미노산 변화 도입에 의해 감소될 수 있다. 또한 특히 CH2 및/또는 CH3 도메인에 위치한 특정 아미노산 잔기는 혈류 중 항체 분자 또는 Fc-부위 융합 폴리펩티드의 순환 반감기와 연관된다. 순환 반감기는 Fc-부위의 신생아 Fc-수용체 (FcRn) 에 대한 결합에 의해 측정된다.
항체의 불변부에서의 아미노산 잔기 번호화는 Kabat 의 EU 지수에 따라 생성된다 (Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.).
용어 "인간 기원의 Fc-부위" 는 힌지 부위, CH2 도메인 및 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함하는 인간 기원의 면역글로불린 중쇄의 C-말단 부위를 나타낸다. 한 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-부위는 Cys226, 또는 Pro230 에서, 중쇄의 카르복실-말단으로 연장된다. 그러나, Fc-부위의 C-말단 리신 (Lys447) 은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 다르게 명기하지 않는 한, Fc-부위 또는 불변부에서의 아미노산 잔기 번호화는 [Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242] 에서 기재한 바와 같이 EU 지수로도 지칭하는 EU 번호화 시스템에 따른다.
용어 "Fc-부위의 FcRn 결합부" 는 대략 EU 위치 243 에서 EU 위치 261, EU 위치 275 에서 EU 위치 293, 대략 EU 위치 302 에서 EU 위치 319, 대략 EU 위치 336 에서 EU 위치 348, 대략 EU 위치 367 에서 EU 위치 393 및 EU 위치 408, 대략 EU 위치 424 에서 EU 위치 440 까지 연장되는 항체 중쇄 폴리펩티드의 부분을 나타낸다. 한 구현예에서 Kabat 의 EU 번호화에 따른 하기 아미노산 잔기 중 하나 이상은 변경된 F243, P244, P245 P, K246, P247, K248, D249, T250, L251, M252, I253, S254, R255, T256, P257, E258, V259, T260, C261, F275, N276, W277, Y278, V279, D280, V282, E283, V284, H285, N286, A287, K288, T289, K290, P291, R292, E293, V302, V303, S304, V305, L306, T307, V308, L309, H310, Q311, D312, W313, L314, N315, G316, K317, E318, Y319, I336, S337, K338, A339, K340, G341, Q342, P343, R344, E345, P346, Q347, V348, C367, V369, F372, Y373, P374, S375, D376, I377, A378, V379, E380, W381, E382, S383, N384, G385, Q386, P387, E388, N389, Y391, T393, S408, S424, C425, S426, V427, M428, H429, E430, A431, L432, H433, N434, H435, Y436, T437, Q438, K439 및 S440 (EU 번호화) 이다.
IgG1 동형의 야생형 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
돌연변이 L234A, L235A 를 갖는 IgG1 동형의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖는 IgG1 동형의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
T366W 돌연변이를 갖는 IgG1 동형의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
L234A, L235A 및 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖는 IgG1 동형의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
L234A, L235A 및 T366W 돌연변이를 갖는 IgG1 동형의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
P329G 돌연변이를 갖는 IgG1 동형의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
L234A, L235A 및 P329G 돌연변이를 갖는 IgG1 동형의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
P239G 및 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖는 IgG1 동형의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
P329G 및 T366W 돌연변이를 갖는 IgG1 동형의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
L234A, L235A, P329G 및 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖는 IgG1 동형의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
L234A, L235A, P329G 및 T366W 돌연변이를 갖는 IgG1 동형의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
IgG4 동형의 야생형 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
S228P 및 L235E 돌연변이를 갖는 IgG4 동형의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
S228P, L235E 및 P329G 돌연변이를 갖는 IgG4 동형의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
용어 "Fc-수용체", 줄여서 "FcR" 은 Fc-부위에 결합하는 수용체를 나타낸다. 한 구현예에서 FcR 은 선천적 서열 인간 FcR 이다. 또한, 한 구현예에서 FcR 은 IgG 항체 (Fc 감마 수용체) 에 결합하는 FcR 이며 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체 (대립형질 변이체 및 대안적으로는 이의 스플라이싱 형태 포함) 를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("저해 수용체") 를 포함하며, 이는 그의 세포질 도메인에 있어서 주로 상이한 유사 아미노산 서열을 갖는다. FcR 은 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9 (1991) 457-492, Capel, et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34, de Haas, et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341] 에서 검토되어있다. 기타 FcR 이 본원에서 용어 "FcR" 에 의해 포함된다. 상기 용어는 또한, 모계 IgG 의 태아로의 이동에 있어서 그 역할을 하는 신생아 수용체 FcRn 을 포함한다 (예를 들어 Guyer, et al., J. Immunol. 117 (1976) 587; Kim, et al., J. Immunol. 24 (1994) 249 참고).
용어 "Fc 감마 수용체", 줄여서 "FcγR" 또는 "Fc감마R" 은 IgG 항체 Fc-부위에 결합하며 FcγR 유전자에 의해 인코딩되는 단백질 패밀리의 임의의 멤버를 나타낸다. 인간에서 이러한 패밀리는 비제한적으로 FcγRI (CD64), 예컨대 아형 FcγRIA, FcγRIB 및 FcγRIC, FcγRII (CD32), 예컨대 아형 FcγRIIA (동종이인자형 H131 및 R131), FcγRIIB (FcγRIIB-1 및 FcγRIIB-2 포함), 및 FcγRIIc, 및 FcγRIII (CD16), 예컨대 아형 FcγRIIIA (동종이인자형 V158 및 F158; Swiss-Prot 엔트리 P08637; N-말단-MRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQ-C-말단; SEQ ID NO: 18 포함) 및 FcγRIIIb (동종이인자형 FcγRIIB-NA1 및 FcγRIIB-NA2 포함) (예를 들어, 전체가 본원에 참조로 포함되는 Jefferis et al., Immunol. Lett. 82 (2002) 57-65 참고) 뿐 아니라 FcγR 아형 또는 동종이인자형을 포함한다. FcγR 은 인간, 마우스, 랫트, 토끼 및 원숭이와 같은 임의의 유기체로부터의 것일 수 있다. 마우스 FcγR 은 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16) 및 FcγRIII-2 (CD16-2) 뿐 아니라 또한 FcγR 아형 또는 동종이인자형을 비제한적으로 포함한다. Fc-부위-FcγR 상호작용이 관여된 아미노산 잔기는 234-239 (하부 힌지 부위), 265-269 (B/C 루프), 297-299 (D/E 루프) 및 327-332 (F/G) 루프 (Sondermann, et al., Nature 406 (2000) 267-273) 이다. FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB 및/또는 FcγRIIIA 에 대한 결합/친화성을 감소시키는 아미노산 돌연변이는 N297A (감소된 면역원성 및 연장된 반감기 결합/친화성에 부수적으로 따름) (Routledge, et al., Transplantation 60 (1995) 847; Friend et al., Transplantation 68 (1999) 1632; Shields et al., J. Biol. Chem. 276 (1995) 6591), 잔기 233-236 (Ward and Ghetie, Ther. Immunol. 2 (1995) 77; Armour et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613) 을 포함한다. 일부 예시적 아미노산 치환은 US 7,355,008 및 US 7,381,408 에 기재되어있다.
용어 "신생아 Fc-수용체", 줄여서 "FcRn" 은 IgG 항체 Fc-부위에 결합하며 FcRn 유전자에 의해 적어도 일부분 인코딩되는 단백질을 나타낸다. FcRn 은 임의의 유기체, 예컨대 비제한적으로 인간, 마우스, 랫트, 토끼 및 원숭이로부터의 것일 수 있다. 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 기능적 FcRn 단백질은 종종 중쇄 및 경쇄로 지칭하는 2 개의 폴리펩티드를 포함한다. 경쇄는 베타-2-마이크로글로불린이고 중쇄는 FcRn 유전자에 의해 인코딩된다. 본원에서 다르게 나타내지 않는 한, FcRn 또는 FcRn 단백질은 FcRn 중쇄와 베타-2-마이크로글로불린의 복합체를 의미한다. FcRn 과 상호작용하는 Fc-부위의 아미노산 잔기는 CH2 및 CH3 도메인의 접합부 근처에 있다. Fc-부위-FcRn 접촉 잔기는 모두 단일 IgG 중쇄 내에 있다. 관여된 아미노산 잔기는 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311, 및 314 (모두 CH2 도메인에 있음) 및 아미노산 잔기 385-387, 428, 및 433-436 (모두 CH3 도메인에 있음). FcRn 에 대한 결합성/친화성을 증가시키는 아미노산 돌연변이는 T256A, T307A, E380A 및 N434A 를 포함한다 (Shields et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591).
종 전체에 걸쳐 보존되는 FcRn 의 아미노산 잔기는 Fc-부위에서 위치 310 및 435 에서의 히스티딘 잔기이다. 이들 잔기는 Fc-부위 FcRn 상호작용의 pH 의존도에 책임이 있다 (예를 들어, Victor, G., et al., Nature Biotechnol. 15 (1997) 637-640); Dall'Acqua, W. F., et al. J. Immunol. 169 (2002) 5171-5180 참고). FcRn 과의 상호작용을 약화시키는 Fc-부위 돌연변이는 항체 반감기를 감소시킬 수 있다.
용어 "힌지 부위" 는 CH1 도메인 및 CH2 도메인이 연결되는 항체 중쇄 폴리펩티드 부분 (예를 들어 Kabat 의 EU 번호 시스템에 따라 약 위치 216 ~ 위치 약 230) 을 나타낸다. 힌지 부위는 보통 동일한 아미노산 서열을 갖는 2 개의 폴리펩티드로 이루어지는 이량체 분자이다. 힌지 부위는 일반적으로 약 25 개 아미노산 잔기를 포함하며 항원 결합 부위가 독립적으로 움직일 수 있도록 유연성이 있다. 힌지 부위는 3 개 도메인: 상부, 중간 및 하부 힌지 도메인으로 세분화될 수 있다 (Roux, et al., J. Immunol. 161 (1998) 4083).
힌지 부위는 보통 동일한 아미노산 서열을 갖는 2 개의 폴리펩티드로 이루어지는 이량체 분자이다. 힌지 부위는 일반적으로 약 25 개 아미노산 잔기를 포함하며 항원 결합 부위가 독립적으로 움직일 수 있도록 유연성이 있다. 힌지 부위는 3 개 도메인: 상부, 중간 및 하부 힌지 도메인으로 세분화될 수 있다 (예를 들어 Roux, et al., J. Immunol. 161 (1998) 4083 참고).
용어 Fc-부위의 "하부 힌지 부위" 는 힌지 부위에 대해 바로 C-말단인 아미노산 잔기의 스트레치를 나타낸다 (즉, Kabat 의 EU 번호화에 따른 Fc-부위의 잔기 233 ~ 239).
용어 "야생형 Fc-부위" 는 자연계에서 발견된 Fc-부위의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 나타낸다. 야생형 인간 Fc-부위는 선천적 인간 IgG1 Fc-부위 (비-A 및 A 동종이인자형), 선천적 인간 IgG2 Fc-부위, 선천적 인간 IgG3 Fc-부위 및 선천적 인간 IgG4 Fc-부위 뿐 아니라 이의 자연 발생적 변이체를 포함한다.
용어 "약학 조성물" 은 그에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태이며 제형을 투여하는 대상에게 허용불가하게 독성인 추가적인 성분을 함유하지 않는 제제를 의미한다.
"약학적으로 허용가능한 담체" 는 대상에게 비독성인, 활성 성분 외의 약학 조성물 중 성분을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 비제한적으로, 완충액, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함한다.
용어 "폴리펩티드" 는 자연적으로 또는 합성적으로 생성되는, 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산으로 이루어지는 중합체를 의미한다. 약 20 개 미만의 아미노산 잔기의 폴리펩티드는 "펩티드" 로서 지칭될 수 있는 한편, 100 개 초과의 아미노산 잔기의 하나의 폴리펩티드를 포함하거나 둘 이상의 폴리펩티드로 이루어지는 분자는 "단백질" 로서 지칭될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 비-아미노산 성분, 예컨대 탄수화물기, 금속 이온 또는 카르복실 산 에스테르를 포함할 수 있다. 비-아미노산 성분은 폴리펩티드가 발현되는 세포에 의해 첨가될 수 있으며, 세포 유형에 따라 가변적일 수 있다. 폴리펩티드는 본원에서 그의 아미노산 골격 구조 또는 이를 인코딩하는 핵산의 측면에서 정의된다. 탄수화물기와 같은 부가물은 일반적으로 명시되지 않으나, 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.
용어 "아미노산 서열 태그" 는 특이적 결합 특성을 갖는 펩티드 결합을 통해 서로 연결된 아미노산 잔기의 서열을 나타낸다. 한 구현예에서 아미노산 서열 태그는 친화성 또는 정제 태그이다. 한 구현예에서 아미노산 서열 태그는 Arg-태그, His-태그, Avi-태그, His-Avi-태그, Flag-태그, 3xFlag-태그, Strep-태그, Nano-태그, SBP-태그, c-myc-태그, S-태그, 칼모듈린-결합-펩티드, 셀룰로오스-결합-도메인, 키틴-결합-도메인, GST-태그 및 MBP-태그를 포함하는 군에서 선택된다. 한 구현예에서 아미노산 서열 태그는 SEQ ID NO: 19 (RRRRR), SEQ ID NO: 20 (RRRRRR), SEQ ID NO: 21 (Avi-태그), SEQ ID NO: 22 (His-Avi-태그), SEQ ID NO: 23 (HHHHHH), SEQ ID NO: 24 (KDHLIHNVHKEFHAHAHNK), SEQ ID NO: 25 (DYKDDDDK), SEQ ID NO: 26 (DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK), SEQ ID NO: 27 (AWRHPQFGG), SEQ ID NO: 28 (WSHPQFEK), SEQ ID NO: 29 (MDVEAWLGAR), SEQ ID NO: 30 (MDVEAWLGARVPLVET), SEQ ID NO: 31 (MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP), SEQ ID NO: 32 (EQKLISEEDL), SEQ ID NO: 33 (KETAAAKFERQHMDS), SEQ ID NO: 34 (KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL), SEQ ID NO: 35 (셀룰로오스 결합 도메인), SEQ ID NO: 36 (셀룰로오스 결합 도메인), SEQ ID NO: 37 (TNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEP SNVPALWQLQ), SEQ ID NO: 38 (GST-태그) 및 SEQ ID NO: 39 (MBP-태그) 를 포함하는 군에서 선택된다.
용어 "효소 절단 부위" 는 프로테아제에 의해 특이적으로 절단될 수 있는 펩티드 결합을 통해 서로 연결된 아미노산 잔기의 서열을 나타낸다. 한 구현예에서 프로테아제는 IgA-프로테아제, 그란자임 B, Tev 프로테아제, 선절단 프로테아제, 트롬빈, Faktor10a, Ides 프로테아제 또는 엔테로키나아제이다.
용어 "IgA-프로테아제" 는 하기 서열 중 하나를 포함하는 인지 부위를 갖는 네이세리아 고노로에아에 (Neisseria gonorrhoeae) 에서 유래한 프로테아제를 나타내며, 이때 "↓" 는 절단된 결합의 위치를 나타낸다:
Pro-Ala-Pro ↓ Ser-Pro (SEQ ID NO: 40),
Pro-Pro ↓ Ser-Pro (SEQ ID NO: 41),
Pro-Pro ↓ Ala-Pro (SEQ ID NO: 42),
Pro-Pro ↓ Thr-Pro (SEQ ID NO: 43),
Pro-Pro ↓ Gly-Pro (SEQ ID NO: 44),
Pro-Arg-Pro-Pro ↓ Thr-Pro (SEQ ID NO: 45),
Val-Val-Ala-Pro-Pro ↓ Ala-Pro (SEQ ID NO: 46),
Val-Val-Ala-Pro-Pro ↓ Ser-Pro (SEQ ID NO: 47),
Val-Val-Ala-Pro-Pro ↓ Thr-Pro (SEQ ID NO: 48),
Val-Val-Ala-Pro-Pro ↓ Gly-Pro (SEQ ID NO: 49),
Pro-Arg-Pro-Pro ↓ Thr-Pro (SEQ ID NO: 50),
Ala-Pro-Pro-Ala ↓ Ala-Pro (SEQ ID NO: 51),
Pro-Arg-Pro-Pro ↓ Ala-Pro (SEQ ID NO: 52),
Pro-Arg-Pro-Pro ↓ Ser-Pro (SEQ ID NO: 53),
Pro-Arg-Pro-Pro ↓ Gly-Pro (SEQ ID NO: 54).
본 명세서 내에서 사용한 바와 같은 용어 "링커" 또는 "펩티드 링커" 는 자연적 및/또는 합성 기원의 펩티드 링커를 나타낸다. 이들은 20 개의 자연 발생적 아미노산이 단량체 빌딩 블록인 선형 아미노산 사슬로 이루어진다. 사슬은 1 내지 50 개 아미노산, 바람직하게는 1 내지 28 개 아미노산, 특히 바람직하게는 3 내지 25 개 아미노산의 길이를 갖는다. 링커는 반복 아미노산 서열 또는 힌지-기능을 갖는 폴리펩티드와 같은 자연 발생적 폴리펩티드의 서열을 포함할 수 있다. 링커는 항-CD4 항체에 접합된 펩티드가, 상기 펩티드가 올바르게 폴딩 (folding) 되고 적절히 제공될 수 있게 함으로써 그의 생물학적 활성을 수행할 수 있다는 것을 확실하게 하는 기능을 갖는다. 바람직하게는 상기 링커는 글리신, 글루타민 및/또는 세린 잔기에 풍부하도록 지정되는 "합성 펩티드 링커" 이다. 이들 잔기는 예를 들어 5 개 이하의 아미노산의 소 반복 단위, 예컨대 GGGGS, QQQQG 또는 SSSSG 로 배열된다. 이러한 소 반복 단위는 2 내지 5 회 반복되어 다량체 단위를 형성할 수 있다. 다량체 단위의 아미노- 및/또는 카르복시-말단 끝에서, 6 개 이하의 추가적인 임의의, 자연 발생적 아미노산이 부가될 수 있다. 기타 합성 펩티드 링커는 10 내지 20 회 반복되는 단일 아미노산으로 구성되며 아미노- 및/또는 카르복시-말단 끝에서 6 개 이하의 추가적인 임의의, 자연 발생적 아미노산을 포함할 수 있다. 모든 펩티드 링커는 핵산 분자에 의해 인코딩될 수 있으며 따라서 재조합적으로 발현될 수 있다.
본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드
Fc-부위 융합 폴리펩티드로서 폴리펩티드의 발현은 종종 비-규정된 조성물의 다량체 응집체를 형성시킨다. 또한, 2 개 사슬 사이의 입체 장애로 인해 Fc-부위 융합 폴리펩티드의 발현은 어려운 일이다.
n-량체로서 생물학적으로 활성이며 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드가, Fc-수용체에 실질적으로 결합하지 않는 Fc-부위를 갖는 융합 폴리펩티드로서 이들 폴리펩티드를 발현시킴으로써 가용성 형태로 수득될 수 있다는 것이 발견되었다. 폴리펩티드의 발현을 위해 융합 폴리펩티드를 사용하는 것은 융합 폴리펩티드 형태로 또는 단리된 폴리펩티드로서 폴리펩티드의 수득가능한 수율을 증가시킨다. 폴리펩티드가 Fc-부위의 절단 및 제거 후에도 규정된 n-량체 형태로 남아있다는 것이 추가로 발견되었다. 특히 적합한 것은 Fc-수용체에 실질적으로 결합하지 않는 Fc-부위이다.
용어 "Fc-수용체에 실질적으로 결합하지 않는" 은 융합 폴리펩티드에 포함된 Fc-부위가 응집체가 형성되는 정도로 Fc-수용체에 결합하지 않는다는 것을 나타낸다.
폴리펩티드는 Fc-부위에 직접적으로, 또는 펩티드 링커를 통해, 또는 프로테아제 절단 부위를 통해, 또는 프로테아제 절단 부위와 조합된 펩티드 링커를 통해 융합될 수 있다.
한 융합 폴리펩티드에 효소 절단 부위를 포함하는 한편 두 번째 융합 폴리펩티드는 효소 절단 부위를 포함하지 않는 비대칭 이량체 융합 폴리펩티드가 수득될 수 있다는 것이 발견되었다. 따라서 한 구현예에서, 이량체 융합 폴리펩티드는 오직 1 개의 융합 폴리펩티드가 생물학적으로 활성인 폴리펩티드와 Fc-부위 사이에 효소 절단 부위를 포함한다는 것을 제외하고는 2 개의 동일한 융합 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드로서 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 발현시켜, 수득가능한 발현 수율이 증가할 수 있거나 생물학적으로 활성인 폴리펩티드의 대규모 생성이 어쨌든 이루어질 수 있다.
마찬가지로, 본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드를 사용하여, 생물학적으로 활성인 폴리펩티드의 약동학적 특성을 향상시킬 수 있다.
마찬가지로, 본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드를 사용하여, 가용성 사이토카인 및 사이토카인 수용체를 제공할 수 있다.
본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드를 사용하여, 사이토카인 수용체를 생물학적으로 활성인 형태로 제공할 수 있다. 이들 사이토카인 수용체는 절단된 형태로는 생물학적으로 활성이 아니다.
본원에서 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드를 사용하여, 기능적이고, 생물학적으로 활성이며 가용성인 멤브레인 수용체 및/또는 도메인을 제공할 수 있다.
본원에서 보고한 바와 같은 이량체 융합 폴리펩티드를 사용하여, 융합 폴리펩티드의 절단 및 이량체 사이토카인의 분리 전에 사이토카인의 디술피드 기재 이량체화를 강제화할 수 있다.
마찬가지로, 본원에서 보고한 바와 같은 이량체 융합 폴리펩티드를 사용하여, 강제적 디술피드 결합에 의한 이형이량체, 디술피드-연결 사이토카인을 제공할 수 있다.
본원에 보고한 바와 같은 한 양태는 하기 식 I 에 따른 융합 폴리펩티드이다:
(Bn-CSo-Is-CSp-FC-CSq-It-CSr-Bm)u (식 I)
[식 중,
B 는 n-량체로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드를 나타내고,
FC 는 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드를 나타내고,
CS 는 절단 부위를 나타내고,
I 는 개재 아미노산 서열을 나타내고,
n=1 이고 m=0 이거나, n=0 이고 m=1 이고,
n=1 인 경우 o=0 또는 1 이고, o=0 인 경우 p=0 또는 1 이고, o=1 인 경우 p=0, 및 s=0 또는 1, 및 q=0, 및 t=0, 및 r=0 이고,
m=1 인 경우 q=0 또는 1 이고, q=0 인 경우 r=0 또는 1 이고, q=1 인 경우 r=0, 및 t=0 또는 1, 및 o=0, 및 s=0, 및 p=0 이고,
u=1 또는 2 이고,
FC 는 Fc-수용체에 실질적으로 결합하지 않음].
본원에 보고한 바와 같은 한 양태는 하기 식 II 에 따른 융합 폴리펩티드이다:
Bn-CSo-Is-CSp-FC1-CSq-It-CSr-Bm : FC2 (식 II)
[식 중,
B 는 n-량체로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드를 나타내고,
FC1 은 제 1 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드를 나타내고,
FC2 는 제 2 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드를 나타내고,
CS 는 절단 부위를 나타내고,
I 는 개재 아미노산 서열을 나타내고,
n=1 이고 m=0 이거나, n=0 이고 m=1 이고,
n=1 인 경우 o=0 또는 1 이고, o=0 인 경우 p=0 또는 1 이고, o=1 인 경우 p=0, 및 s=0 또는 1, 및 q=0, 및 t=0, 및 r=0 이고,
m=1 인 경우 q=0 또는 1 이고, q=0 인 경우 r=0 또는 1 이고, q=1 인 경우 r=0, 및 t=0 또는 1, 및 o=0, 및 s=0, 및 p=0 이고,
제 1 FC 및 제 2 FC 는 하나 이상의 디술피드 결합(들) 에 의해 공유 결합되고,
FC1 및 FC2 는 Fc-수용체에 실질적으로 결합하지 않음].
n-량체로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드는 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 원숭이를 비제한적으로 포함하는 임의의 종으로부터의 것일 수 있다.
한 구현예에서 n-량체로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드 (= 식 I 또는 식 II 에서의 B) 는 IL17, IL18, IL33, IL18R, IL33R, TNF, TWEAK 및 TL1a 의 군에서 선택된다.
한 구현예에서 FC 는 인간 IgG1 중쇄 폴리펩티드, 인간 IgG2 중쇄 폴리펩티드, 인간 IgG3 중쇄 폴리펩티드, 인간 IgG4 중쇄 폴리펩티드, 쥐과 IgG1 중쇄 폴리펩티드, 쥐과 IgG2 중쇄 폴리펩티드, 쥐과 IgG2a 중쇄 폴리펩티드, 쥐과 IgG3 중쇄 폴리펩티드, 토끼 IgG 중쇄 폴리펩티드의 군에서 선택되는 중쇄 폴리펩티드의 변이체이다.
본원에서 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드에 포함된 Fc-부위는 Fc-수용체에 실질적으로 결합하지 않을 것이다.
한 구현예에서 융합 폴리펩티드는 실질적으로 효과기 기능을 갖지 않는데, 이는 특정 효과기 기능이 불필요하거나 해로운 적용물에 대해 바람직한 후보물이 되게 한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정은 효과기 기능의 감소/소모를 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, Fc-수용체 (FcR) 결합 검정은 융합 폴리펩티드가 FcγR 결합이 없다는 것 (따라서 ADCC 활성이 부족할 수 있음) 을 확실히 하기 위해 수행될 수 있다. ADCC, NK 세포를 매개하기 위한 1 차 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 한편, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 을 발현한다. 조혈 세포에서의 FcR 발현은 [Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492] 의 464 페이지의 표 3 에 요약되어있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예는 미국 특허 번호 5,500,362 (예를 들어 Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063; 및 Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502 참고); 미국 특허 번호 5,821,337 (Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361 참고) 에 기재되어있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법이 이용될 수 있다 (예를 들어, 유세포분석기용 ACTITM 비-방사성 세포독성 검정 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 및 CytoTox 96® 비-방사성 세포독성 검정 (Promega, Madison, WI) 참고). 이러한 검정을 위한 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 예를 들어, [Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656] 에서 개시된 바와 같은 동물 모델에서 생체내 평가될 수 있다. FcRn 결합 및 생체내 청소율/반감기 측정이 또한 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769 참고).
그의 리간드에 대한 Fc-부위의 친화성 및 결합 특성은 Fc-부위/FcR 상호작용 (즉, Fc-부위의 FcγR 에 대한 특이적 결합) 을 측정하기 위한 당업계에 공지된 다양한 시험관내 검정 방법 (생화학적 또는 면역학적 기반 검정), 예컨대 비제한적으로, 평형 방법 (예를 들어 효소-연결 면역 흡착제 검정 (ELISA) 또는 방사선면역검정 (RIA)), 또는 반응속도 (예를 들어 BIACORE® 분석), 및 기타 방법 예컨대 간접 결합 검정, 경쟁적 저해 검정, 형광 공명 에너지 전달 (FRET), 겔 전기영동 및 크로마토그래피 (예를 들어, 겔 여과) 에 의해 측정될 수 있다. 이러한 방법 및 기타 방법은 검사하는 하나 이상의 성분 상의 표지를 활용하고/하거나 색원체, 형광체, 발광체 또는 동위원소 표지를 비제한적으로 포함하는 다양한 검출 방법을 이용할 수 있다. 결합 친화성 및 반응속도의 상세한 설명은 [Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)] 에서 발견할 수 있다.
한 구현예에서 FC 는, 또는 FC1 및 FC2 는 서로 독립적으로 서브클래스 IgG4 의 인간 기원의 Fc-부위 또는 서브클래스 IgG1, IgG2 또는 IgG3 의 인간 기원의 Fc-부위이다 (이는 Fcγ 수용체 (예를 들어 FcγRIIIa) 결합이 없는 방식으로 변형됨). 한 구현예에서 FC 는, 또는 FC1 및 FC2 는 서로 독립적으로 인간 기원의 Fc-부위, 특히 인간 IgG4 서브클래스로부터의 Fc-부위 또는 인간 IgG1 서브클래스로부터의 돌연변이된 Fc-부위이다. 한 구현예에서 FC 는, 또는 FC1 및 FC2 는 서로 독립적으로 돌연변이 L234A 및 L235A 를 갖는 인간 IgG1 서브클래스의 것이다. 한 구현예에서 FC 는, 또는 FC1 및 FC2 는 서로 독립적으로 돌연변이 S228P 를 갖는 인간 IgG4 서브클래스의 것이다. IgG4 가 감소된 Fcγ 수용체 (FcγRIIIa) 결합을 나타내는 경우, 다른 IgG 서브클래스의 항체는 강력한 결합을 나타낸다. 그러나 Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (Fc 탄수화물의 손실), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 및/또는 His435 는 변경된 경우, 또한 감소된 Fcγ 수용체 결합을 제공하는 잔기이다 (Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0 307 434). 한 구현예에서 FC 는, 또는 FC1 및 FC2 는 서로 독립적으로 IgG4 서브클래스, 또는 IgG1 또는 IgG2 서브클래스 (L234, L235 및/또는 D265 에 돌연변이를 갖고/갖거나 PVA236 돌연변이를 포함함) 의 Fcγ 수용체 결합에 관련된다. 한 구현예에서 FC 는, 또는 FC1 및 FC2 는 서로 독립적으로 돌연변이 S228P, L234A, L235A, L235E 및/또는 PVA236 중 하나 이상을 포함한다 (PVA236 은 IgG1 의 아미노산 위치 233 ~ 236 의 아미노산 서열 ELLG (1 글자 아미노산 코드로 주어짐) 또는 IgG4 의 IgG4 가 PVA 에 의해 대체된 것을 의미함). 한 구현예에서 돌연변이는 IgG4 에 대해 S228P 이고, IgG1 에 대해 L234A 및 L235A 이다.
Fc-부위 결합 부위는 당업계에 공지되어 있으며 예를 들어 Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; 및 EP 0 307 434 에 기재되어있다. Fc-부위 결합 부위는 예를 들어, 아미노산 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329 (Kabat 의 EU 지수에 따른 번호화) 에 의해 특징지어진다.
감소된 효과기 기능을 갖는 Fc-부위는 Fc-부위 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 잔기 265 의 치환을 갖는 소위 "DA" Fc 돌연변이체 및 잔기 265 및 297 의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하는, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 둘 이상에서의 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).
FcR 에 대한 향상되거나 감소된 결합을 갖는 특정 Fc-부위 변이체가 기재되어있다 (예를 들어, US 6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 참고).
일부 구현예에서, 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642, 및 Idusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184 에서 기재된 바와 같이, Fc-부위에서 변경이 이루어져, 변경된 (즉, 향상되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC) 이 초래된다.
또한, Fc 부위 변이체의 다른 예에 대해서 Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5,648,260; US 5,624,821; 및 WO 94/29351 을 참고한다.
한 구현예에서 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드는 위치 234, 235, 236, 237, 238, 239, 253, 254, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 288, 297, 298, 299, 307, 311, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 434 및 435 중 하나 이상에서 아미노산 돌연변이를 갖는다. 한 구현예에서 Fc-수용체 중 하나 이상은 Fc 감마 수용체이다.
한 구현예에서 인간 IgG1 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 위치 233, 234, 235, 236, 265, 297, 329 및 331 중 하나 이상에서 돌연변이를 갖는다.
한 구현예에서 인간 IgG1 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 돌연변이 E233P, L234A, L235A, L235E, ?G236, D265A, N297A, N297D, P329A, P329G 및 P331S 중 하나 이상을 갖는다.
한 구현예에서 인간 IgG1 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 돌연변이 L234A 및 L235A 및 E233P, L235E, ?G236, D265A, N297A, N297D, P329A, P329G 및 P331S 중 하나 이상을 갖는다.
한 구현예에서 인간 IgG1 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 돌연변이 L234A 및 L235A 및 P329A 또는 P329G 를 갖는다.
한 구현예에서 인간 IgG2 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 위치 233, 234, 235, 236, 265 및 329 중 하나 이상에서 돌연변이를 갖는다.
한 구현예에서 인간 IgG4 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 위치 228, 235, 265 및 329 중 하나 이상에서 돌연변이를 갖는다.
한 구현예에서 인간 IgG4 중쇄 폴리펩티드는 돌연변이 S228P, L235E, P329A 및 P329G 중 하나 이상을 갖는다.
한 구현예에서 인간 IgG4 중쇄 폴리펩티드는 돌연변이 S228P 및 L235E 및 P329A 또는 P329G 를 갖는다.
한 구현예에서 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드는 위치 248, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 272, 285, 288, 290, 291, 308, 309, 310, 311, 314, 385, 386, 387, 428, 433, 434, 435 및 436 중 하나 이상에서 아미노산 돌연변이를 갖는다. 한 구현예에서 Fc-수용체 중 하나 이상은 FcRn 이다.
한 구현예에서 인간 IgG 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 위치 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 및/또는 447 중 하나 이상에서 돌연변이를 갖는다.
한 구현예에서 FcRn 에 대해 감소된 결합을 갖는 인간 IgG 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 위치 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 및/또는 447 에서 하나 이상의 아미노산 변경을 갖는다.
융합 폴리펩티드는 생물학적 활성 폴리펩티드와 Fc-부위 사이에 링커 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 이러한 링커 폴리펩티드는 생물학적 활성 폴리펩티드와 Fc-부위 사이의 거리를 두 부위 모두 의도된 방식으로 기능할 수 있도록 조정하는데 사용될 수 있다.
한 구현예에서 링커 폴리펩티드는 (G3S)3, (G3S)4, (G3S)5, (G3S)6, (G4S)3, (G4S)4, (G4S)5, (G5S)2, (G5S)3, (G5S)4, 및 이의 임의의 조합을 포함하는 군에서 선택된다.
추가적으로, 융합 폴리펩티드는 생물학적 활성 폴리펩티드와 Fc-부위 사이에 태그, 예를 들어 친화성 정제 또는 고정화에 적합한 태그를 포함할 수 있다.
한 구현예에서 태그는 Arg-태그, Avi-태그, His-Avi-태그, His-태그, Flag-태그, 3xFlag-태그, Strep-태그, Nano-태그, SBP-태그, c-myc-태그, S-태그, 칼모듈린-결합-펩티드, 셀룰로오스-결합-도메인, 키틴-결합-도메인, GST-태그, MBP-태그, 스트렙타비딘 또는 아비딘, 비오틴, 렉틴, 다당류, 스테로이드, 스테로이드 결합 단백질, 호르몬 및 호르몬 수용체를 포함하는 군에서 선택된다.
링커 폴리펩티드 및 태그는 생물학적 활성 폴리펩티드와 Fc-부위 사이에 위치하는 개재 아미노산 서열 내로 조합될 수 있다.
한 구현예에서 개재 아미노산 서열은 (G3S)3, (G3S)4, (G3S)5, (G3S)6, (G4S)3, (G4S)4, (G4S)5, (G5S)2, (G5S)3, (G5S)4, 및 이의 임의의 조합을 포함하는 제 1 군, 또는 Arg-태그, Avi-태그, His-Avi-태그, His-태그, Flag-태그, 3xFlag-태그, Strep-태그, Nano-태그, SBP-태그, c-myc-태그, S-태그, 칼모듈린-결합-펩티드, 셀룰로오스-결합-도메인, 키틴-결합-도메인, GST-태그 또는 MBP-태그를 포함하는 제 2 군, 또는 이들 군의 2 개 요소의 조합에서 선택된다.
개재 아미노산 서열은 융합 폴리펩티드에서의 절단 부위 이전 또는 이후에 위치할 수 있다.
한 구현예에서 절단 부위는 효소 절단 부위이다. 한 구현예에서 효소 절단 부위는 IgA-프로테아제 프로테아제 절단 부위, 그란자임 B 프로테아제 절단 부위, Tev 프로테아제 절단 부위, 선절단 프로테아제 절단 부위, 트롬빈 절단 부위, Factor10a 프로테아제 부위, Ides 프로테아제 절단 부위, SUMO 프로테아제 (사카로마이세스 세레비지에로부터의 Ulp1 (Ubl-특이적 프로테아제 1)) 절단 부위 및 엔테로키나아제 절단 부위를 포함하는 군에서 선택된다. 한 구현예에서 절단 부위는 IgA 프로테아제 절단 부위, 선절단 프로테아제 절단 부위, 그란자임 B 절단 부위 및 Ides 프로테아제 절단 부위의 군에서 선택된다.
한 구현예에서 융합 폴리펩티드는 프로테아제 파파인, 또는 프로테아제 펩신, 또는 Ides 프로테아제의 내재 절단 부위를 포함한다.
본원에 보고한 바와 같은 한 양태는 본원에 보고한 바와 같은 2 개의 융합 폴리펩티드를 포함하는 이량체 융합 폴리펩티드이다.
본원에 보고한 바와 같은 한 양태는 본원에 보고한 바와 같은 1 개의 융합 폴리펩티드 및 Fc-부위를 포함하는 이량체 폴리펩티드이다.
본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드가 Fc-부위를 포함함으로써 면역글로불린 힌지 부위를 포함하기 때문에, 이량체 융합 폴리펩티드는 제 1 융합 폴리펩티드를 제 2 융합 폴리펩티드와 공유 결합시키는 하나 이상의 디술피드 브릿지 (bridge) 를 포함한다.
본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드가 Fc-부위를 포함함으로써 면역글로불린 힌지 부위를 포함하기 때문에, 이량체 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드를 Fc-부위와 공유 결합시키는 하나 이상의 디술피드 브릿지를 포함한다.
이량체 융합 폴리펩티드는 동형이량체 융합 폴리펩티드 또는 이형이량체 융합 폴리펩티드일 수 있다.
본원에 보고한 바와 같은 한 양태는 하기 식 I 에 따른 융합 폴리펩티드이다:
(Bn-CSo-Is-CSp-FC-CSq-It-CSr-Bm)u (식 I)
[식 중,
B 는 n-량체로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드를 나타내고,
FC 는 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드를 나타내고,
CS 는 절단 부위를 나타내고,
I 는 개재 아미노산 서열을 나타내고,
n=1 이고 m=0 이거나, n=0 이고 m=1 이고,
n=1 인 경우 o=0 또는 1 이고, o=0 인 경우 p=0 또는 1 이고, o=1 인 경우 p=0, 및 s=0 또는 1, 및 q=0, 및 t=0, 및 r=0 이고,
m=1 인 경우 q=0 또는 1 이고, q=0 인 경우 r=0 또는 1 이고, q=1 인 경우 r=0, 및 t=0 또는 1, 및 o=0, 및 s=0, 및 p=0 이고,
u=2 이고,
FC 는 Fc-수용체에 실질적으로 결합하지 않음].
본원에 보고한 바와 같은 한 양태는 하기 식 II 에 따른 융합 폴리펩티드를 포함하는 이량체 폴리펩티드이다:
Bn-CSo-Is-CSp-FC1-CSq-It-CSr-Bm : FC2 (식 II)
[식 중,
B 는 1-량체, 2-량체 또는 3-량체로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드를 나타내고,
FC1 은 제 1 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드를 나타내고,
FC2 는 제 2 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드를 나타내고,
CS 는 절단 부위를 나타내고,
I 는 개재 아미노산 서열을 나타내고,
n=1 이고 m=0 이거나, n=0 이고 m=1 이고,
n=1 인 경우 o=0 또는 1 이고, o=0 인 경우 p=0 또는 1 이고, o=1 인 경우 p=0, 및 s=0 또는 1, 및 q=0, 및 t=0, 및 r=0 이고,
m=1 인 경우 q=0 또는 1 이고, q=0 인 경우 r=0 또는 1 이고, q=1 인 경우 r=0, 및 t=0 또는 1, 및 o=0, 및 s=0, 및 p=0 이고,
FC1 및 FC2 는 하나 이상의 디술피드 결합(들) 에 의해 공유 결합되고,
FC1 및 FC2 는 Fc-수용체에 실질적으로 결합하지 않음].
이량체 폴리펩티드가 2 개의 상이한 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드 및 융합 폴리펩티드 (본원에 보고한 바와 같은), 또는 2 개의 상이한 융합 폴리펩티드 (본원에서 보고한 바와 같은) 의 조합에 의해 형성될 수 있기 때문에, 이형이량체화를 확실히 하기 위한 메커니즘이 사용되어야만 한다.
한 구현예에서 제 1 FC 는 돌연변이 T366W 및 임의로는 돌연변이 S354C 를 포함하고 제 2 FC 는 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V 및 임의로는 돌연변이 Y349C 를 포함한다.
한 구현예에서 융합 폴리펩티드는
a) 제 1 및 제 2 융합 폴리펩티드의 B 가 동일하거나,
b) 제 1 융합 폴리펩티드의 B 및 제 2 융합 폴리펩티드의 B 가 상이한 것을 특징으로 한다.
한 구현예에서 Fc-부위(들) 에서의 C-말단 리신 잔기가 결실된다. 이는 추정 효소 절단 부위의 결실을 초래한다.
본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드의 적용
본원에 보고한 바와 같은 한 양태는 친화성 크로마토그래피 리간드로서 본원에 보고한 바와 같은 고정화 융합 폴리펩티드 또는 본원에 보고한 바와 같은 고정화 이량체 융합 폴리펩티드의 용도이다.
한 구현예에서 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드는 고체상에 결합한다. 한 구현예에서 고체상은 크로마토그래피 물질이다. 한 구현예에서 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드는 비오틴화되며 고체상은 스트렙타비딘으로 유도체화된다.
한 구현예에서 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드는 Fc-수용체와 Fc-부위 사이에 절단 부위를 포함한다. 한 구현예에서 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드는 비오틴화 전에 절단된다.
한 구현예에서 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드는 생물학적 활성 폴리펩티드와 절단 부위 사이에 고정화 태그를 포함한다. 한 구현예에서 고정화 태그는 His-Avi-태그 또는 Avi-태그이다.
또한 보고되는 것은 매트릭스 및 매트릭스 결합 크로마토그래피 관능기를 포함하는 친화성 크로마토그래피로서, 매트릭스 결합 크로마토그래피 관능기가 본원에서 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 구현예에서 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드는 생물학적 활성 폴리펩티드와 Fc-부위 사이에 절단 부위를 포함한다. 한 구현예에서 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드는 비오틴화 전에 절단된다.
한 구현예에서 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드는 생물학적 활성 폴리펩티드와 절단 부위 사이에 고정화 태그를 포함한다. 한 구현예에서 고정화 태그는 His-Avi-태그 또는 Avi-태그이다.
본원에 보고한 바와 같은 한 양태는 1-량체 (단량체), 2-량체 (이량체) 또는 3-량체 (삼량체) 생물학적 활성 폴리펩티드의 생성을 위한 본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드의 용도이며, 이로써 1-량체 (단량체), 2-량체 (이량체) 또는 3-량체 (삼량체) 생물학적 활성 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드의 효소 절단 후에 수득되고, 1-량체 (단량체), 2-량체 (이량체) 또는 3-량체 (삼량체) 생물학적 활성 폴리펩티드는 절단 후에도 1-량체 (단량체), 2-량체 (이량체) 또는 3-량체 (삼량체) 형태로 남아있다.
본원에 보고한 바와 같은 한 양태는 벌키 (bulky) (입체 장애) 이량체 사이토카인을 생성을 위한 하기 식 III 의 이량체 융합 폴리펩티드의 용도이다:
Bn-CSo-Is-CSp-FC1-CSq-It-CSr-Bm : Bn-Is-FC2-It-Bm (식 III)
[식 중,
B 는 2-량체로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드이고,
FC1 은 제 1 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드를 나타내고,
FC2 는 제 2 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드를 나타내고,
CS 는 절단 부위를 나타내고,
I 는 개재 아미노산 서열을 나타내고,
n=1 이고 m=0 이거나, n=0 이고 m=1 이고,
n=1 인 경우 o=0 또는 1 이고, o=0 인 경우 p=0 또는 1 이고, o=1 인 경우 p=0, 및 s=0 또는 1, 및 q=0, 및 t=0, 및 r=0 이고,
m=1 인 경우 q=0 또는 1 이고, q=0 인 경우 r=0 또는 1 이고, q=1 인 경우 r=0, 및 t=0 또는 1, 및 o=0, 및 s=0, 및 p=0 이고,
FC1 및 FC2 는 하나 이상의 디술피드 결합(들) 에 의해 공유 결합되고,
FC1 및 FC2 는 Fc-수용체에 실질적으로 결합하지 않음].
비대칭 이량체 융합 폴리펩티드가 수득될 수 있으며, 이는 하나의 융합 폴리펩티드에 효소 절단 부위를 포함하는 한편, 제 2 융합 폴리펩티드는 효소 절단 부위를 포함하지 않는다는 것이 발견되었다. 따라서, 한 구현예에서 이량체 융합 폴리펩티드는 오직 1 개의 융합 폴리펩티드가 생물학적 활성 폴리펩티드와 Fc-부위 사이에 효소 절단 부위를 포함하는 것을 제외하고는, 2 개의 동일한 융합 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 보고한 바와 같은 한 양태는 n-량체로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드의 생체내 반감기를 증가시키기 위한, 본원에서 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드의 용도이다.
본원에 보고한 바와 같은 한 양태는 가용성 사이토카인 또는 사이토카인 수용체를 제공하기 위한 본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드의 용도이다.
본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드를 사용하여 생물학적 활성 형태로 사이토카인 수용체를 제공할 수 있다. 이들 사이토카인 수용체는 절단된 형태로는 생물학적으로 활성이 아니다.
본원에 보고한 바와 같은 한 양태는 기능적이고, 생물학적으로 활성이며 가용성인 멤브레인 수용체 및/또는 멤브레인 수용체 도메인을 제공하기 위한 본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드의 용도이다.
본원에 보고한 바와 같은 한 양태는 디술피드-연결 이량체 사이토카인을 제공하기 위한 본원에 보고한 바와 같은 이량체 융합 폴리펩티드의 용도이며, 이로써 디술피드-결합은 융합 폴리펩티드의 효소 절단 전에 형성된다.
본원에 보고한 바와 같은 이량체 융합 폴리펩티드를 사용하여, 융합 폴리펩티드의 절단 및 이량체 사이토카인의 분리 전에 사이토카인의 디술피드 기재 이량체화를 강제화할 수 있다.
본원에 보고한 바와 같은 한 양태는 이형이량체, 디술피드-연결 사이토카인을 생성하기 위한 본원에 보고한 바와 같은 이량체 융합 폴리펩티드의 용도이다.
마찬가지로, 본원에서 보고한 바와 같은 이량체 융합 폴리펩티드를 사용하여, 강제적 디술피드 결합에 의한 이형이량체, 디술피드-연결 사이토카인을 제공할 수 있다.
재조합 방법
본원에 보고한 바와 같은 한 양태는 하기 단계를 포함하는, n-량체로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드의 생성 방법이며:
a) 본원에서 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계,
b) 세포 또는 배양 배지로부터 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계,
c) 임의로는 융합 폴리펩티드를 프로테아제로 절단하는 단계,
이로써 n-량체로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드가 생성된다.
본 발명을 실행하기에 유용한, 당업자에게 공지된 방법 및 기술은 예를 들어 [Ausubel, F.M., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997), Wiley and Sons; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] 에 기재되어있다.
본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드 또는 본원에 보고한 바와 같은 이량체 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 재조합 발현 후 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드는 당업자에게 공지된 방법에 의해 정제될 수 있다. 이들 방법은 잘 확립되어있고 면역글로불린 정제에 광범위하게 사용되며 단독으로 또는 조합으로 이용된다. 이러한 방법은 예를 들어, 미생물-유래 단백질을 사용하는 친화성 크로마토그래피 (예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어 양이온 교환 (카르복시메틸 수지), 음이온 교환 (아미노 에틸 수지) 및 혼합-모드 교환 크로마토그래피), 친황성 흡착 (예를 들어 베타-머캅토에탄올 및 기타 SH 리간드 이용), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피 (예를 들어 페닐-세파로오스, 아자-아레노필릭 수지 또는 m-아미노페닐보론산 이용), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피 (예를 들어 Ni(II)- 및 Cu(II)-친화성 물질 이용), 크기 배제 크로마토그래피 및 분취용 전기영동 방법 (예컨대 겔 전기영동, 모세관 전기영동) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102) 이다.
발현 카세트는 프로모터, 분비 신호 서열을 인코딩하는 DNA 부분, 구조 유전자 및 터미네이터/폴리아데닐화 신호를 포함한다. 요소는 모든 필요한 상이한 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 하나의 플라스미드 상에, 또는 하나의 융합 폴리펩티드를 각각 인코딩하는 둘 이상의 플라스미드 상에 작동적으로 연결된 형태로 조립된다. 구조 유전자의 발현을 위해, 플라스미드(들) 는 적합한 숙주 세포에 도입된다. 단백질은 CHO 세포, NS0 세포, Sp2/0 세포, COS 세포, HEK 세포, K562 세포, BHK 세포, PER.C6® 세포 등과 같은 같은 포유동물 세포에서 생성된다. 한 구현예에서 융합 폴리펩티드는 CHO 세포, 또는 BHK 세포, 또는 HEK 세포에서 발현된다. 플라스미드의 조절 요소는 선택된 숙주 세포엥서 이들이 기능적인 방식으로 선택되어야 한다. 발현된 융합 폴리펩티드는 기능적으로 조립된다.
"발현 플라스미드" 는 숙주 세포에서 포함된 구조 유전자(들) 의 발현에 필요한 모든 요소를 제공하는 핵산이다. 통상적으로, 발현 플라스미드는 복제 기원 및 선택 마커, 진핵생물 선택 마커, 및 각각 프로모터, 구조 유전자 및 전사 터미네이터 예컨대 폴리아데닐 신호를 포함하는 관심 구조 유전자(들) 의 발현을 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는, 예를 들어 대장균용 원핵생물 플라스미드 증식 단위를 포함한다. 유전자 발현은 보통 프로모터의 제어 하에 위치하며, 이러한 구조 유전자는 프로모터에 "작동가능하게 연결된다" 로 일컬어진다. 유사하게, 조절 요소 및 코어 프로모터는, 조절 요소가 코어 프로모터의 활성을 조정하는 경우 작동가능하게 연결된다.
항체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567 에서 기재된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생성될 수 있다. 한 구현예에서, 본원에 기재된 융합 폴리펩티드 또는 본원에 기재된 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 한 구현예에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어 발현 벡터) 가 제공된다. 추가 구현예에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 한 구현예에서, 숙주 세포는: (1) 제 1 융합 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열 및 제 2 융합 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 제 1 융합 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터 및 제 2 융합 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터를 포함한다 (예를 들어, 이로 형질전환된다). 한 구현예에서, 숙주 세포는 진핵세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프성 세포 (예를 들어 Y0, NS0, Sp20 세포) 이다. 한 구현예에서, 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드를 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은 상기 제공된 바와 같은 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 배양하고, 임의로는 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지) 로부터 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.
본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드 또는 본원에 보고한 바와 같은 이량체 융합 폴리펩티드의 재조합 생성을 위해서, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산이 단리되고 숙주 세포에서의 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입된다. 이러한 핵산은 종래의 절차 (예를 들어, 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 를 사용하여 용이하게 단리되고 서열분석될 수 있다.
융합 폴리펩티드-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵세포 또는 진핵세포를 포함한다. 예를 들어, 융합 폴리펩티드는 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우, 박테리아에서 생성될 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현을 위해서는, 예를 들어 US 5,648,237, US 5,789,199 및 US 5,840,523 를 참고한다 (또한 Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254 (대장균에서의 항체 단편의 발현 설명) 참고). 발현 후, 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드는 가용성 분획물 중 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있으며 추가 정제될 수 있다.
원핵생물에 추가로, 글리코실 경로가 "인간화" 되어, 부분적 또는 전체 인간 글리코실화 패턴을 갖는 융합 폴리펩티드를 생성시키는 진균 및 효모 균주를 포함하는 진핵 미생물 예컨대 사상균 또는 효모는 융합 폴리펩티드-인코딩 벡터용으로 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다 (Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; 및 Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215 참고).
글리코실화된 융합 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물) 로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는, 특히 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 트랜스펙션을 위한 수많은 바큘로바이러스 균주가 확인된 바 있다.
식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 활용될 수 있다 (예를 들어 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생성하기 위한 PLANTIBODIESTM 기술을 설명함) 참고).
척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 적합화된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40 (COS-7) 에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주; 인간 배아 신장주 (예를 들어 Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74 에서 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 햄스터 새끼 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어 Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252 에서 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부암 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); TRI 세포 (예를 들어 Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68 에서 기재된 바와 같음); MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 기타 유용한 포유동물 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예컨대 DHFR- CHO 세포 (Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); 및 골수종 세포주 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0 를 포함한다. 항체 생성에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는, 예를 들어 [Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268] 을 참고한다.
진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드는 생물학적 샘플 중의 사이토카인 또는 사이토카인 수용체 존재를 검출하기에 유용하다. 본원에 사용한 바와 같은 용어 "검출" 은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다.
한 구현예에서, 진단 또는 검출 방법에서 사용하기 위한 본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드 또는 본원에 보고한 바와 같은 이량체 융합 폴리펩티드가 제공된다. 추가 양태에서, 생물학적 샘플 중의 사이토카인 또는 사이토카인 수용체의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드의 사이토카인 또는 사이토카인 수용체에 대한 결합에 관대한 조건 하에 생물학적 샘플을 본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드 또는 본원에 보고한 바와 같은 이량체 융합 폴리펩티드와 접촉시키고, 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드와 사이토카인 또는 사이토카인 수용체 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다.
특정 구현예에서, 표지된 융합 폴리펩티드 또는 표지된 이량체 융합 폴리펩티드가 제공된다. 표지는 비제한적으로, 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (moiety) (예컨대 형광, 발색, 전자-밀도, 화학발광 및 방사성 표지) 뿐 아니라 예를 들어 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함한다. 예시적 표지는 비제한적으로,방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라아제, 예를 들어 반딧불이 루시페라아제 및 박테리아 루시페라아제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 서양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP), 알칼리성 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다아제, 예를 들어 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제 및 글루코오스-6-포스페이트 데히드로게나아제, 헤테로시클릭 옥시다아제 예컨대 유리카아제 및 잔틴 옥시다아제 (HRP 와 같은 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 이용하는 효소와 커플링됨), 락토퍼옥시다아제, 또는 마이크로퍼옥시다아제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등을 포함한다.
약학 조성물
본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드 또는 본원에 보고한 바와 같은 이량체 융합 폴리펩티드의 약학 조성물은 원하는 정도의 순도를 갖는 상기 융합 폴리펩티드를 하나 이상의 임의적인 약학적으로 허용가능한 담체 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)) 와 혼합함으로써, 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다. 약학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 이용 투약량 및 농도에서 수령자에게 비독성이며, 비제한적으로: 완충액 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 산화방지제 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대 옥타데실 디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10 개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리(비닐피롤리돈); 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물 예컨대 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당류 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어 Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 을 포함한다. 본원의 예시적인 약학적으로 허용가능한 담체는 사이질성 (interstitial) 약물 분산제 예컨대 가용성 중간-활성 히알루로니다아제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다아제 당단백질, 예컨대 rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.) 를 추가로 포함한다. 특정한 예시적 sHASEGP 및 사용 방법 (rhuPH20 포함) 은 US 2005/0260186 및 US 2006/0104968 에 기재되어있다. 한 양태에서, sHASEGP 는 하나 이상의 추가적인 글리코사미노글리카나아제 예컨대 콘드로이티나아제와 조합된다.
예시적인 동결건조 항체 제형은 US 6,267,958 에 기재되어있다. 수성 항체 제형은 US 6,171,586 및 WO 2006/044908 에 기재된 것들을 포함하며, WO 2006/044908 의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.
본원의 제형은 또한 치료하는 특정 조짐에 필요한 바에 따라 하나 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 이러한 활성 성분은 적합하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합으로 존재한다.
활성 성분은 예를 들어 코아세르베이션 (coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해, 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포솜, 알부민 미세구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중의 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸 메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)] 에 개시되어있다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 융합 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반-투과성 매트릭스를 포함하며, 상기 매트릭스는 성형된 물품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균된다. 멸균성은 예를 들어 멸균 여과 멤브레인을 통한 여과에 의해 용이하게 이루어질 수 있다.
치료적 방법 및 조성물
임의의 본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드 또는 본원에 보고한 바와 같은 이량체 융합 폴리펩티드가 치료적 방법에서 사용될 수 있다.
한 양태에서, 약제로서 사용하기 위한 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드가 제공된다. 특정 구현예에서, 치료 방법에서 사용하기 위한 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드가 제공된다. 하나의 이러한 구현예에서, 방법은 개인에게 유효량의 하나 이상의 추가적 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 구현예에 따른 "개인" 은 바람직하게는 인간이다.
추가 양태에서, 본 발명은 약제의 생산 또는 제조에 있어서의 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드의 용도를 제공한다. 하나의 이러한 구현예에서, 방법은 개인에게 유효량의 하나 이상의 추가적 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 구현예에 따른 "개인" 은 인간일 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 예를 들어 임의의 상기 치료적 방법에서 사용하기 위한 본원에 보고한 바와 같은 임의의 융합 폴리펩티드를 포함하는 약? 조성물을 제공한다. 한 구현예에서, 약학 조성물은 임의의 본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 임의의 본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드 및 하나 이상의 추가적 치료제를 포함한다.
본 발명의 융합 폴리펩티드는 치료요법에서 단독으로 또는 기타 작용제와 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 하나 이상의 추가적 치료제와 동시-투여될 수 있다.
상기 나타낸 이러한 조합 치료요법은 조합된 투여 (둘 이상의 치료제가 동일하거나 개별적인 제형에 포함됨) 및 개별 투여 (이러한 경우 본 발명의 융합 폴리펩티드의 투여는 추가적 치료제 및/또는 아쥬반트 전에, 동시에, 및/또는 이후에 발생할 수 있음) 를 포함한다.
본 발명의 융합 폴리펩티드 또는 본 발명의 이량체 융합 폴리펩티드 (및 임의의 추가적 치료제) 는 임의의 적합한 수단, 예컨대 비경구, 폐내 및 비강내, 및 국부 치료에 필요한 경우, 병변내 투여에 의해 투여될 수 있다. 비경구 투입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 투여가 단기적인지 만성적인지 여부에 일부 따라, 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주입, 예컨대 정맥내 또는 피하 주입에 의한 것일 수 있다. 다양한 시간 지점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 볼루스 (bolus) 투여 및 펄스 투입을 비제한적으로 포함하는 각종 투약 스케줄이 본원에서 고려된다.
본 발명의 융합 폴리펩티드 또는 본 발명의 이량체 융합 폴리펩티드는 표준 의료 행위 (good medical practice) 와 일치하는 방식으로 제형화되고, 투약되고, 투여될 수 있다. 이러한 맥락에 있어서의 고려를 위한 인자는 치료하는 특정 장애, 치료하는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄 및 의사에게 공지된 기타 인자를 포함한다. 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드는 의문의 장애를 예방하거나 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제형화될 필요는 없으나 임의로는 제형화된다. 이러한 기타 작용제의 유효량은 제형 중에 존재하는 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 토의한 기타 인자에 따라 좌우된다. 이들은 일반적으로 동일 투약량으로, 본원에 기재된 바와 같은 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투약량의 약 1 내지 99% 로, 또는 경험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정되는 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해서, 본 발명의 융합 폴리펩티드 또는 본 발명의 이량체 융합 폴리펩티드의 적절한 투약량 (단독으로 또는 하나 이상의 기타 추가 치료제와 조합으로 사용되는 경우) 은 치료할 질환의 유형, 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드가 예방용으로 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 치료요법, 환자의 임상적 이력 및 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드에 대한 반응, 및 참여 의사의 재량에 따라 좌우될 것이다. 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드는 적합하게는 일련의 치료에 걸쳐 또는 한번에 환자에게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어 0.5 mg/kg - 10 mg/kg) 의 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드가 예를 들어 하나 이상의 개별 투여에 의한, 또는 연속 투입에 의한 환자에 대한 투여용의 초기 후보 투약량일 수 있다. 하나의 전형적인 1 일 투약량은 상기 언급한 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수일 또는 그 이상에 걸친 반복 투여를 위해서, 상태에 따라, 치료는 일반적으로 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 지속될 수 있다. 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드의 하나의 예시적 투약량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위일 수 있다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이의 임의의 조합) 의 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3 주마다 (예를 들어 환자가 약 2 내지 약 20, 또는 예를 들어 약 6 회 용량의 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드를 받도록) 투여될 수 있다. 초기의 높은 로딩 용량, 이후 하나 이상의 낮은 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투약 계획이 유용할 수 있다. 이러한 치료요법의 진행은 종래의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
임의의 상기 제형 또는 치료적 방법이 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드 대신 또는 이에 추가로 본 발명의 면역접합체를 사용하여 실행될 수 있다는 것이 이해된다.
제조 물품
본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 상기 용기 상의 또는 이와 연관된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 상기 용기는 자체적으로 조성물을 보유하거나 병상을 치료, 예방 및/또는 진단하기에 효과적인 또 다른 조성물과 조합되며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어 상기 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사침에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있음). 조성물 중의 하나 이상의 활성제는 본 발명의 융합 폴리펩티드 또는 본 발명의 이량체 융합 폴리펩티드이다. 표지 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택한 병상의 치료에 사용된다는 것을 나타낸다. 또한, 제조 물품은 (a) 조성물을 함유하는 제 1 용기 (여기서 상기 조성물은 본 발명의 융합 폴리펩티드 또는 본 발명의 이량체 융합 폴리펩티드를 포함함); 및 (b) 조성물을 함유하는 제 2 용기 (여기서 상기 조성물은 추가의 세포독성 또는 다르게는 치료제를 포함함) 를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 구현예의 제조 물품은 상기 조성물이 특정 병상을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 제조 물품은 약학적으로 허용가능한 완충액, 예컨대 세균발육저지 주사용수 (BWFI), 인산완충식염수, 링거액 및 덱스트로오스 용액을 포함하는 제 2 (또는 제 3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질, 예컨대 기타 완충액, 희석제, 필터, 주사바늘 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제조 물품이 융합 폴리펩티드 또는 이량체 융합 폴리펩티드 대신 또는 이에 추가로 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있다는 것이 이해된다.
하기 실시예, 도면 및 서열을 제공하여 본 발명의 이해를 도우며, 이의 참된 범주는 첨부된 특허청구범위에서 설명된다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않고 나타낸 절차에 변형을 가할 수 있다는 것이 이해된다.
실시예
실시예 1
Fc-수용체 함유 융합 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 플라스미드의 생성
a) Fc감마RIIIaV158-Avi-IgA 프로테아제-Fc LALA P239G 융합 폴리펩티드에 대한 발현 플라스미드의 생성
Fc감마RIIIaV158-Avi-IgA 프로테아제-Fc LALA P239G 융합 폴리펩티드 인코딩 유전자를, i) 쥐과 면역글로불린 중쇄 신호 서열 (MGWSCIILFLVATATGVHS: SEQ ID NO: 55), ii) 아미노산 잔기 2-193 로부터의 인간 Fc 감마 수용체 IIIa V158 (즉, 출발 메티오닌 제외) 및 iii) 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G 를 갖는 인간 Fc-감마-1-중쇄 불변부 (힌지-CH2-CH3) 를 코딩하는 화학적으로 합성된 DNA 단편을 융합시켜 어셈블리하였다.
HEK293 세포에서의 Fc감마RIIIaV158-Avi-IgA 프로테아제-Fc LALA P239G 융합 폴리펩티드의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는 Fc감마RIIIaV158-Avi-IgA 프로테아제-Fc LALA P239G 융합 폴리펩티드 발현 카세트 외에 대장균에서 상기 플라스미드 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 기원, 및 대장균에서 암피실린 저항성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자를 포함하였다. 상세하게는, Fc감마RIIIaV158-Avi-IgA 프로테아제-Fc LALA P239G 융합 폴리펩티드 인코딩 유전자의 전사 단위는 하기의 기능적 요소를 포함한다:
- 인트론 A 를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스 (P-CMV) 로부터의 전초기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-미번역 부위 (5'UTR),
- 쥐과 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 야생형 인간 Fc 감마 수용체 III V158 단백질의 아미노산 위치 2-193 으로부터의 가용성 인간 Fc 감마 수용체 III V158 폴리펩티드,
- 인간 Fc-감마-1-중쇄 불변부 (힌지-CH2-CH3, LALA P329G), 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH 폴리 A 신호 서열).
성숙 Fc감마RIIIaV158-Avi-IgA 프로테아제-Fc LALA P239G 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같다:
(SEQ ID NO: 56).
하기의 융합 폴리펩티드가 유사하게 수득될 수 있다:
- Fc감마RIIa-LR(H131)-Avi-IgA 프로테아제-Fc LALA P239G 융합 폴리펩티드:
(SEQ ID NO: 57).
- Fc감마RIIb-Avi-IgA 프로테아제-Fc LALA P239G 융합 폴리펩티드:
(SEQ ID NO: 58).
- Fc감마RIIIb-Avi-IgA 프로테아제-Fc LALA P239G 융합 폴리펩티드:
(SEQ ID NO: 59).
- 최소 Fc감마RIIIa-Avi-Fc LALA p239G 융합 폴리펩티드 (프로테아제 절단 부위 없음):
(SEQ ID NO: 60).
c) 이량체 Fc-수용체 융합 폴리펩티드에 대한 "놉-인투-홀 (knob-into-hole)" 발현 플라스미드의 생성
HEK293 세포에서의 Fc-수용체 Fc-부위 융합 폴리펩티드 (홀) 의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는 상기 항목 a) 에서 기재된 발현 벡터에서 유래하였다. 이는 인간 감마-1 중쇄 불변부 내에 홀 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C 를 갖는 Fc-부위를 코딩하는 DNA 서열에서부터 분화되었다.
HEK293 세포에서의 Fc-수용체 Fc-부위 융합 폴리펩티드 (놉) 의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는 상기 항목 a) 에서 기재된 발현 벡터에서 유래하였다. 이는 인간 감마-1 중쇄 불변부 내에 놉 돌연변이 T366W 및 S354C 를 갖는 Fc-부위를 코딩하는 DNA 서열에서부터 분화되었다.
HEK293 에서의 Fc-수용체 Fc-부위 융합 폴리펩티드 (놉/홀) 의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는 융합 폴리펩티드 (놉/홀) 발현 카세트 외에 대장균에서 상기 플라스미드의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 기원, 및 대장균에서 암피실린 저항성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자를 포함하였다. 상세하게는, 융합 폴리펩티드 (놉/홀) 인코딩 유전자의 전사 단위는 하기의 기능적 요소를 포함한다:
- 인트론 A 를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스 (P-CMV) 로부터의 전초기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-미번역 부위 (5'UTR),
- 쥐과 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 인간 감마-1 중쇄 불변부 내에 홀 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C 또는 놉 돌연변이 T366W 및 S354C 를 갖는 인간 Fc-감마-1-중쇄 불변부 (힌지-CH2-CH3), 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH 폴리 A 신호 서열).
실시예 2
Fc감마RIIIaV158-Avi-IgA 프로테아제-Fc LALA P239G 융합 폴리펩티드의 일시적 발현, 정제 및 분석적 특징화
융합 폴리펩티드를 F17 배지 (Invitrogen Corp.) 에서 배양된 HEK293 세포 (인간 배아 신장 세포주 293-유래) 의 일시적 트랜스펙션에 의해 수득하였다. 트랜스펙션을 위해 "293-Free" 트랜스펙션 시약 (Novagen) 을 사용하였다. 놉-인투-홀 융합 폴리펩티드 페어를 트랜스펙션시 등몰 플라스미드 비를 사용하여 2 개의 상이한 플라스미드로부터 발현시켰다. 트랜스펙션을 제조사 지시사항에 명기된 바와 같이 수행하였다. 융합 폴리펩티드-함유 세포 배양물 상청액을 트랜스펙션 7 일 후 수확하였다. 상청액을 정제할 때까지 감소된 온도에서 보관하였다.
예를 들어 HEK293 세포에서의 인간 면역글로불린의 재조합 발현에 관한 일반적인 정보는 [Meissner, P., et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203] 에 제공된다.
융합 폴리펩티드-함유 배양물 상청액을 여과하고 2 개의 크로마토그래피 단계에 의해 정제하였다. 융합 폴리펩티드를 PBS (1 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl), pH 7.4 로 평형화된 HiTrap MabSelectSuRe (GE Healthcare) 을 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 포획하였다. 미결합 단백질을 평형 완충액으로 세척하여 제거하고, 융합 폴리펩티드를 0.05 M 시트레이트 완충액, pH 3 으로 회수하고, 용리 직후 1 M Tris-염기, pH 9.0 으로 pH 6.5 로 중화시켰다. Superdex 200TM (GE Healthcare) 에서의 크기 배제 크로마토그래피를 제 2 정제 단계로서 사용하였다. 크기 배제 크로마토그래피를 2 mM MOPS 완충액, 0.125 M NaCl, pH 7.2 중에서 수행하였다. 용리된 융합 폴리펩티드를 Biomax-SK 멤브레인 (Millipore, Billerica, MA) 이 장착된 Ultrafree-CL 원심분리 필터 유닛으로 농축하고 -80℃ 에서 보관하였다.
상기 프로토콜에 따라 4 개의 상이한 Fc감마RIIIa-Fc 융합 폴리펩티드를 정제하였다:
a) Fc감마RIIIaV158-Avi-Fc LALA P239G (절단 부위 없음)
b) 최소 Fc감마RIIIaV158-Avi-Fc LALA P239G (절단 부위 없음)
c) Fc감마RIIIaV158-Avi-선절단 프로테아제(PP)-Fc LALA P239G
d) Fc감마RIIIaV158-Avi-IgA 프로테아제-Fc LALA P239G
아미노산 서열을 기반으로 계산한 몰 흡광 계수를 사용하여 280 nm 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정하여, 융합 폴리펩티드의 단백질 농도를 측정하였다. 융합 폴리펩티드의 순도 및 적절한 이량체 형성을 환원제 (5 mM 1. 4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하에 쿠마시 브릴리언트 블루 (Coomassie brilliant blue) 로 염색하여 SDS-PAGE 에 의해 분석하였다. 융합 폴리펩티드 제제의 응집체 함량을 Superdex 200TM 분석적 크기-배제 컬럼 (GE Healthcare) 을 사용하여 고성능 SEC 에 의해 측정하였다. 환원된 융합 폴리펩티드의 아미노산 골격의 무결성을 뉴라미니다아제, O-글리카나아제 및 펩티드-N-글리코시다아제 F (Roche Applied Science) 의 조합으로의 효소 처리에 의해 N-글리칸을 제거한 후 Nano Electrospray QTOF 질량 분석에 의해 확인하였다.
실시예 3
파파인에 의한 Fc-수용체 함유 융합 폴리펩티드의 절단
효소 절단 부위를 포함하지 않는 Fc감마RIIIa-Fc 융합 폴리펩티드는 파파인에 의해 절단될 수 있다. Fc감마RIIIa-Fc 융합 폴리펩티드를, 37℃ 에서 1 시간 동안 시스테인 및 0.1 mU/mg 융합 폴리펩티드 파파인 (Carica papaya, Roche Diagnostics GmbH) 을 첨가하여 절단하였다. 후속 정제를 실시예 2 에서 기재한 바와 같이 수행하였다. 분석적 SDS-PAGE 겔을 도 2 에 나타내었다.
실시예 4
Ides 프로테아제에 의한 Fc-수용체 함유 융합 폴리펩티드의 절단
Ides 프로테아제로의 Fc감마RIIIaV158-Avi-Fc LALA P239G 융합 폴리펩티드의 절단은 매우 비효율적이며, 따라서 이 경우 유용하지 않다.
실시예 5
선절단 프로테아제에 의한 Fc-수용체 함유 융합 폴리펩티드의 절단
50 mM Tris, 150 NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT pH 7.4 에 대한 투석 후, 실온에서 밤새 1-15 U 선절단 프로테아제 (GE Healthcare)/100㎍ 융합 폴리펩티드를 첨가하여 Fc감마RIIIa-(PP)-Fc 융합 폴리펩티드를 절단하였다. 단백질 부분만이 절단될 수 있었다. 한편, PP 절단 부위를 갖지 않는 수용체의 선절단 프로테아제의 비특이적 절단이 관찰되었다.
실시예 6
IgA 프로테아제에 의한 Fc-수용체 함유 융합 폴리펩티드의 절단
Slide-a-lyzer 투석 카세트를 사용한 50 mM Tris pH 8 에 대한 투석 후, 21℃ 에서 밤새 w(프로테아제)/w(융합 폴리펩티드) 1:100 의 비로 IgA 프로테아제 (Roche Diagnostics GmbH) 를 첨가하여 Fc감마RIIIa-Fc 융합 폴리펩티드를 절단하였다. 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (SEC, Superdex 75; GE Healthcare) 에 의해 절단을 제어하였다. 절단 후, Superdex 75TM (GE Healthcare) 에서의 분취용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 IgA 프로테아제로부터, 그리고 HiTrap MabSelectSuRe (GE Healthcare) 컬럼에 의해 Fc-태그로부터 Fc감마RIIIa 수용체를 분리하였다. 분석적 SDS-Page 겔을 도 3 에 나타내었다.
표: 상이한 Fc감마RIIIa V158 포함 융합 폴리펩티드의 발효 및 정제 수율.
실시예 7
Fc감마RIIIaV158 친화성 컬럼의 제조
Fc감마RIIIaV158 을 갖는 친화성 컬럼을 Avi-태그의 시험관내 비오틴화 및 스트렙타비딘 세파로오스에 대한 후속적 커플링에 의해 제조하였다. 이는 Fc-부위를 절단해낸 후에 미손상 융합 폴리펩티드 뿐 아니라 수용체로 수행될 수 있다. 이는 분석용 및 분취용 친화성 컬럼을 제조하기에 매우 신속하며 효과적인 방법이다.
수용체의 비오틴화
HEK293 세포에서 발현된 Avi 태그를 갖는 Fc감마RIIIaV158의 가용성 세포외 도메인을 하기 프로토콜에 따라 정제한 후 비오틴화하였다: 2 mM MOPS 중 태깅된 1.2 내지 12 mg Fc감마RIIIaV158 또는 2.4 내지 24 mg Fc감마RIIIaV158 Fc-부위 융합 폴리펩티드, 125 mM NaCl pH 7.2, 0.02% Tween, 및 3 ml PBS 중 1 정제 Complete 프로테아제 저해제 (Roche) 를 Avidity 사제 비오틴화 키트를 사용하여 제조사 지시사항에 따라 비오틴화하였다. 비오틴화 반응을 실온에서 밤새 수행하였댜. 변형된 폴리펩티드를 4℃ 에서 밤새 20 mM 인산나트륨 완충액, 150 mM NaCl pH 7.5 에 대해 투석하여 과량의 비오틴을 제거하였다.
스트렙타비딘 세파로오스에 대한 커플링
1 g 스트렙타비딘 세파로오스 (GE Healthcare) 를 비오틴화되고 투석된 수용체에 첨가하고, 진탕하면서 2 시간 동안 인큐베이션하고, 최종적으로 1 ml XK 컬럼 (GE Healthcare) 에 충진하였다.
실시예 8
Fc-수용체 함유 융합 폴리펩티드를 발현시켜 수득한 Fc-수용체를 사용한 크로마토그래피 방법
일반적 조건:
평형 완충액 A: 20 mM 시트르산 / 150 mM NaCl pH 6.0
용리 완충액 B: 20 mM 시트르산 / 150 mM NaCl pH 3.0
용리: 5 분 100% A
60 분에 100% B 로,
0.1 분 100% B,
6 분 100% A
샘플량: 50 ㎍ 이상
푸코실화 및 비-푸코실화 항체의 분리
Fc감마RIIIa 컬럼 상의 항체의 크로마토그래피로, 항체의 완전 푸코실화 및 비-푸코실화된 분획을 정량할 수 있다. 항체의 비-푸코실화된 분획은 항체 제제의 ADCC 와 연관된다.
도 4 에서 Fc-Fc감마RIIIa 컬럼 상 항-Her 항체 (야생형, 상부) 및 당조작 항-Her 항체의 상이한 글리코실화 형태의 분리 및 정량을 나타내었다. 분석 시간은 분해능을 유지시키면서 구배를 변형하여 단축될 수 있다.
Fc감마RIIIaV158 및 Fc 태깅된 Fc감마RIIIaV158 을 사용한 친화성 컬럼의 비교
등몰량으로 두 수용체 구축물과 커플링시킨 후, 완전 푸코실화 및 비-푸코실화 항체를 분리하는데 있어서 친화성 컬럼은 동일하게 거동한다 (도 5: 하부 곡선: Fc감마RIIIaV158; 상부 곡선: Fc감마RIIIaV158-Fc).
실시예 9
FcγRIIIaV158-Avi-IgA 프로테아제-Fc LALA P329G - IgG 상호작용 측정
BIAcore® 시스템은 분자 상호작용의 연구를 위해 잘 확립되어있다. 이는 리간드/분석물 결합의 연속 실시간 모니터링 및 그에 따른 결합 속도 상수 (ka), 해리 속도 상수 (kd) 및 평형 상수 (KD) 의 측정이 가능하게 한다. 굴절률에서의 변화는 용액 중 주입된 분석물과 고정화 리간드와의 상호작용에 의한 표면 상 질량 변화를 나타낸다. 표면 상 고정화 리간드와 분자가 결합하는 경우 질량이 증가하고, 해리의 경우 질량이 감소한다.
Fc감마RIIIaV158-Fc LALA P329G 융합 폴리펩티드의 활성 측정을 위해서, 직접 결합 검정을 사용하였다.
포획 시스템 (20 ㎍/ml 인간 Fab 포획 키트 GE Healthcare, 28-9583-25) 의 약 400 공명 단위 (RU) 를 GE 사에서 공급받은 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 5.0 에서 CM5 칩 (GE Healthcare BR1005-30) 에 커플링시켰다. 샘플 및 시스템 완충액은 HBS-P+ pH 7.4 (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) Surfactant P20) 였다. 유동 셀을 25℃ 로 설정하고 샘플 블록을 12℃ 로 설정하였다. 10 ㎕/분의 유속에서 360 초 동안 50 nM 용액을 주입함으로써 항체를 포획하였다. 결합에 대해서는 50 ㎕/분의 유속에서 180 초 동안, 해리에 대해서는 360 초 동안 50 nM 의 Fc감마RIIIa 융합 폴리펩티드를 주입하여 결합을 측정하였다. 20 ㎕/분의 유속에서 글리신 pH 2.1 용액으로 60 초 세척하여 표면을 재생하였다. 구축물의 활성 평가를 위해, 신호 높이 및 해리 거동을 비교하였다.
도 6 에서 나타낸 바와 같이, Fc감마RIIIaV158-Fc LALA P329G 융합 폴리펩티드의 반응은 Fc감마RIIIaV158 (40 반응 단위 (RU)) 과 비교하여 100 RU 초과를 나타내었다.
실시예 10
절단 전 및 후 FcγRIIIaV158-Avi-IgA 프로테아제-Fc LALA P329G 융합 폴리펩티드 IgG 동적 상호작용 측정
절단된 Fc감마RIIIaV158-Fc LALA P329G 융합 폴리펩티드의 활성 측정을 위해, 직접 결합 검정을 사용하였다.
포획 시스템 (20 ㎍/ml 인간 Fab 포획 키트 GE Healthcare, 28-9583-25) 의 약 400 공명 단위 (RU) 를 GE 사에서 공급받은 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 5.0 에서 CM5 칩 (GE Healthcare BR1005-30) 에 커플링시켰다. 샘플 및 시스템 완충액은 HBS-P+ pH 7.4 (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) Surfactant P20) 였다. 유동 셀을 25℃ 로 설정하고 샘플 블록을 12℃ 로 설정하였다. 10 ㎕/분의 유속에서 80 초 동안 50 nM 용액을 주입함으로써 항체를 포획하였다.
0 내지 250 nM (1:2 희석물) 범위의 상이한 농도의 항체를 30 ㎕/분의 유속으로 유동 셀을 통과시켜 25℃ 에서 120 초 동안 결합을 측정하였다. 샘플 용액을 러닝 완충액 (running buffer) 으로 바꾸어, 해리상을 420 초 동안 모니터링하였다. 20 ㎕/분의 유속에서 글리신 pH 2.1 용액으로 60 초 세척하여 표면을 재생하였다.
포획된 FcgRIIIaV158 이 없는 표면으로부터 수득한 반응을 제하여, 벌크 굴절률 차이를 교정하였다. 블랭크 완충액 주입물을 또한 제하였다 (=이중 참조).
BIAevaluation 소프트웨어 패키지를 사용하여 여러 상이한 농도로 수득한 센서그램 곡선을 분석하여, ka/kd 로서 정의되는 평형 해리 상수 (KD) 를 측정하였다. 데이터 피팅 (fitting) 은 적합한 결합 모델에 따랐다. 도 7 에서 Fc감마 수용체 V158-Fc LALA P329G 융합 폴리펩티드 (도 7a), Fc감마 수용체 V158 (도 7b), 절단된 Fc감마 수용체 V158-Fc LALA P329G 융합 폴리펩티드 (도 7c) 의 센서그램을 나타내었다.
실시예 11
Fc-TWEAK 융합 폴리펩티드에 대한 발현 플라스미드의 생성
a) Fc-TWEAK 융합 폴리펩티드에 대한 발현 플라스미드의 생성
Fc-TWEAK 융합 유전자를, i) 인간 Fc-감마-1-중쇄 불변부 (힌지-CH2-CH3; 예시적 서열에 대해서는 SEQ ID NO: 03 ~ 17 참고) {여기서 인간 감마-1 중쇄 불변부는 절두되었음 (마지막 자연적 리신 아미노산 잔기의 제거)}, ii) Gly3Ser 및 Gly4Ser 반복물로 이루어지는 글리신-세린 링커 (중쇄-LSPG--GGGSGGGGS--TWEAK 의 C-말단), iii) PreScissionTM 프로테아제 절단 부위 (GLEVLFQGP; SEQ ID NO: 61) 및 iv) 인간 TWEAK 야생형 단백질의 아미노산 잔기 106-249 로부터의 TWEAK 폴리펩티드 (즉, 세포내 및 트랜스멤브레인 도메인 및 절단 부위 제외) 를 코딩하는 화학적 합성 DNA 단편을 융합시켜 어셈블리하였다.
HEK293 세포에서의 Fc-TWEAK 융합 폴리펩티드의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는 Fc-TWEAK 발현 카세트 외에 대장균에서 상기 플라스미드의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 기원, 및 대장균에서 암피실린 저항성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자를 포함하였다. 상세하게, Fc-TWEAK 융합 유전자의 전사 단위는 하기의 기능적 요소를 포함한다:
- 인트론 A 를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스 (P-CMV) 로부터의 전초기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-미번역 부위 (5'UTR),
- 쥐과 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 인간 Fc-감마-1-중쇄 불변부 (힌지-CH2-CH3),
- 야생형 TWEAK 단백질의 아미노산 위치 106-249 로부터의 TWEAK 폴리펩티드, 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH 폴리 A 신호 서열).
성숙 Fc-TWEAK-융합 폴리펩티드의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 62 에 나타낸다:
b) 이량체 Fc-TWEAK (홀) / Fc (놉) 융합 폴리펩티드에 대한 "놉-인투-홀" 발현 플라스미드의 생성
HEK293 세포에서 Fc (홀) 폴리펩티드의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는 상기 항목 a) 에서 기재된 발현 벡터에서 유래하였다. 이는 인간 감마-1 중쇄 불변부 내에 홀 돌연변이 T366S, L368A, Y407V, Y349C 및 Fc 효과기 기능 감소 돌연변이 L234A 및 L235A 를 갖는 Fc-부위를 코딩하는 DNA 서열에서부터 분화되었다.
성숙 Fc (홀) 폴리펩티드의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 63 에서 나타낸다:
HEK293 에서의 Fc-TWEAK (놉) 융합 폴리펩티드의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는 Fc (놉) 발현 카세트 외에 대장균에서 상기 플라스미드의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 기원, 및 대장균에서 암피실린 저항성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자를 포함하였다. 상세하게는, Fc-TWEAK (놉) 융합 유전자의 전사 단위는 하기의 기능적 요소를 포함한다:
- 인트론 A 를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스 (P-CMV) 로부터의 전초기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-미번역 부위 (5'UTR),
- 쥐과 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 인간 감마-1 중쇄 불변부 내에 놉 돌연변이 T366W 및 S354C 및 Fc 효과기 기능 감소 돌연변이 L234A 및 L235A 를 갖는 인간 Fc-감마-1-중쇄 불변부 (힌지-CH2-CH3),
- 유형 Gly3Ser-Gly4Ser 및 PreScissionTM 프로테아제 절단 부위 (GLEVLFQGP, SEQ ID NO: 61) 의 링커 서열,
- 야생형 TWEAK 단백질의 아미노산 위치 106-249 로부터의 TWEAK 폴리펩티드, 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH 폴리 A 신호 서열).
성숙 Fc-TWEAK (놉) 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 64 에 나타낸다:
실시예 12
Fc-IL17A 융합 폴리펩티드에 대한 발현 플라스미드의 생성
a) Fc-IL17A 융합 폴리펩티드에 대한 발현 플라스미드의 생성
Fc-IL17A 융합 유전자를, i) 인간 Fc-감마-1-중쇄 불변부 (힌지-CH2-CH3; 예시적 서열에 대해서는 SEQ ID NO: 03 ~ 17 참고) {여기서 인간 감마-1 중쇄 불변부는 절두되었음 (마지막 자연적 리신 아미노산 잔기의 제거)}, iia) 2 개의 Gly4Ser 반복물 + 2 개의 Gly3Ser 반복물로 이루어지는 글리신-세린 링커 (중쇄-LSP-GGGGSGGGGSGGGSGGGS-IL17A 의 C-말단), 또는 iib) 2 개의 Gly4Ser 반복물 + IgA 프로테아제 절단 부위로 이루어지는 글리신-세린 링커 (중쇄-LSP-GGGGSGGGGSGSVVAPPA-IL17A 의 C-말단) 및 iii) 사이노몰구스 (cynomolgus) IL17A 야생형 단백질의 아미노산 잔기 24-155 로부터의 IL17A 폴리펩티드 (즉, 출발 메티오닌 및 상동 신호 펩티드 제외) 를 코딩하는 화학적으로 합성된 DNA 단편을 융합시켜 어셈블리하였다.
HEK293 세포에서 Fc-IL17A 융합 폴리펩티드의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는 Fc-IL17A 발현 카세트 외에 대장균에서 상기 플라스미드의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 기원, 및 대장균에서 암피실린 저항성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자를 포함하였다. 상세하게, Fc-IL17A 융합 유전자의 전사 단위는 하기의 기능적 요소를 포함한다:
- 인트론 A 를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스 (P-CMV) 로부터의 전초기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-미번역 부위 (5'UTR),
- 쥐과 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 인간 Fc-감마-1-중쇄 불변부 (힌지-CH2-CH3),
- 2 개의 Gly4Ser 반복물 + 2 개의 Gly3Ser 반복물로 이루어지는 글리신-세린 링커 또는 2 개의 Gly4Ser 반복물 + IgA 프로테아제 절단 부위로 이루어지는 글리신-세린 링커,
- 야생형 IL17A 단백질의 아미노산 위치 24-155 로부터의 IL17A 폴리펩티드, 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH 폴리 A 신호 서열).
성숙 Fc-IL17A-융합 폴리펩티드의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 65:
또는
SEQ ID NO: 66 에 나타낸다:
b) 이량체 Fc-IL17A (놉) / Fc-IL17A (홀) 융합 폴리펩티드에 대한 "놉-인투-홀" 발현 플라스미드의 생성
HEK293 세포에서의 IL17A-Fc (홀) 융합 폴리펩티드의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는 상기 항목 a) 에서 기재된 발현 벡터에서 유래하였다. 이는 인간 감마-1 중쇄 불변부 내에 T366S, L368A, Y407V, Y349C 및 Fc 효과기 기능 감소 돌연변이 L234A 및 L235A 를 갖는 Fc-부위를 코딩하는 DNA 서열에서부터 분화되었다.
성숙 IL17A-Fc (홀) 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 67 에서 나타낸다:
HEK293 세포에서의 Fc-IL17A (놉) 융합 폴리펩티드의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는 상기 항목 a) 에서 기재된 발현 벡터에서 유래하였다. 이는 인간 감마-1 중쇄 불변부 내에 놉 돌연변이 T366W 및 S354C 및 Fc 효과기 기능 감소 돌연변이 L234A 및 L235A 를 갖는 Fc-부위를 코딩하는 DNA 서열에서부터 분화되었다.
성숙 Fc-IL17A (놉) 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 68 에서 나타낸다:
실시예 13
Fc-융합 폴리펩티드의 일시적 발현
Fc-융합 폴리펩티드를 F17 배지 (Invitrogen Corp.) 에서 배양된 HEK293 세포 (인간 배아 신장 세포주 293-유래) 의 일시적 트랜스펙션에 의해 생성시켰다. 트랜스펙션을 위해 "293-Free" 트랜스펙션 시약 (Novagen) 을 사용하였다. 놉-인투-홀 Fc-융합 폴리펩티드를 트랜스펙션시 등몰 플라스미드 비를 사용하여 2 개의 상이한 플라스미드로부터 발현시켰다. 트랜스펙션을 제조사 지시사항에 명기된 바와 같이 수행하였다. Fc-융합 폴리펩티드-함유 세포 배양물 상청액을 트랜스펙션 7 일 후 수확하였다. 상청액을 정제할 때까지 감소된 온도에서 보관하였다.
예를 들어 HEK293 세포에서의 인간 면역글로불린의 재조합 발현에 관한 일반적인 정보는 [Meissner, P., et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203] 에 제공된다.
실시예 14
삼량체 TWEAK-Fc 융합 폴리펩티드의 정제, 처리 및 분석적 특징화
Fc-융합 폴리펩티드-함유 배양물 상청액을 여과하고 2 개의 크로마토그래피 단계에 의해 정제하였다. 상청액을 50% v/v 2 M 글리신, pH 8.6, 600 mM NaCl 과 혼합하고, 1 M 글리신, pH 8.6, 600 mM NaCl 로 평형화된 HiTrap MabSelectSuRe (GE Healthcare) 를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 포획하였다. 미결합 단백질을 평형 완충액으로 세척하여 제거하고, 융합 폴리펩티드를 0.1 M 시트레이트 완충액, pH 3.0 으로 회수하고, 용리 직후 1 M Tris-염기, pH 8.5 로 pH 6.0 으로 중화시켰다. Superdex 200TM (GE Healthcare) 에서의 크기 배제 크로마토그래피를 제 2 정제 단계로서 사용하였다. 크기 배제 크로마토그래피를 2 x PBS (2 mM KH2PO4, 20 mM Na2HPO4, 274 mM NaCl, 5.4 mM KCl), pH 7.4 중에서 수행하였다. 용리된 Fc-융합 폴리펩티드를 Biomax-SK 멤브레인 (Millipore, Billerica, MA) 이 장착된 Ultrafree-CL 원심분리 필터 유닛으로 농축하고 -80℃ 에서 보관하였다.
아미노산 서열을 기반으로 계산한 몰 흡광 계수를 사용하여 280 nm 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정하여, Fc-융합 폴리펩티드의 단백질 농도를 측정하였다. Fc-융합 폴리펩티드의 순도를 환원제 (5 mM 1. 4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하에 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하여 SDS-PAGE 에 의해 분석하였다. Fc-융합 폴리펩티드의 응집체 함량 및 적절한 삼량체 형성을 SEC-MALLS 검출기 (Wyatt) 에 연결된 Superdex 200TM 분석적 크기-배제 컬럼 (GE Healthcare) 을 사용하여 고성능 SEC 에 의해 측정하였다. 환원된 Fc 융합 폴리펩티드의 아미노산 골격의 무결성을 뉴라미니다아제, O-글리카나아제 및 펩티드-N-글리코시다아제 F (Roche Applied Science) 의 조합으로의 효소 처리에 의해 N-글리칸을 제거한 후 Nano Electrospray QTOF 질량 분석에 의해 확인하였다.
Fc-융합이 없는 삼량체 TWEAK 을 수득하기 위해, 삼량체 Fc-융합 폴리펩티드를 PreScission® 프로테아제와 함께 밤새 인큐베이션한 후, 비-절단된 Fc-융합 폴리펩티드 뿐 아니라 유리 Fc-부분의 제거를 위해 통과액 (flow-through) 방식으로 MabSelectSuRe (GE Healthcare) 컬럼을 사용하여 친화성 크로마토그래피 처리하였다. 통과액 분획을, PreScission® 프로테아제를 제거하기 위해 글루타치온 세파로오스 4B (GE Healthcare) 를 사용하여 통과액 방식으로 친화성 크로마토그래피에 의해 추가 정제하였다. 삼량체 TWEAK 를 함유하는 통과액 분획을 Superdex 200TM (GE Healthcare) 상의 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가 정제하였다. 크기 배제 크로마토그래피를 2 x PBS (2 mM KH2PO4, 20 mM Na2HPO4, 274 mM NaCl, 5.4 mM KCl), pH 7.4 중에서 수행하였다. 용리된 삼량체 TWEAK 함유 분획을 Biomax-SK 멤브레인 (Millipore, Billerica, MA) 이 장착된 Ultrafree-CL 원심분리 필터 유닛으로 농축하고 -80℃ 에서 보관하였다.
단백질 농도, 순도, 응집체 함량, 삼량체 형성 및 아미노산 골격의 무결성의 측정을 상기 기재한 방법으로 수행하였다.
실시예 15
이량체 Fc-IL17 융합 폴리펩티드의 정제, 처리 및 분석적 특징화
Fc-융합 폴리펩티드-함유 배양물 상청액을 여과하고 2 개의 크로마토그래피 단계에 의해 정제하였다. Fc-융합 폴리펩티드를 PBS (1 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl), pH 7.4 로 평형화된 HiTrap MabSelectSuRe (GE Healthcare) 를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 포획하였다. 미결합 단백질을 평형 완충액으로 세척하여 제거하고, 융합 폴리펩티드를 0.1 M 시트레이트 완충액, pH 2.8 로 회수하고, 용리 직후 1 M Tris-염기, pH 9.0 으로 pH 6.0 으로 중화시켰다. Superdex 200TM (GE Healthcare) 에서의 크기 배제 크로마토그래피를 제 2 정제 단계로서 사용하였다. 크기 배제 크로마토그래피를 20 mM 히스티딘 완충액, 0.14 M NaCl, pH 6.0 중에서 수행하였다. 용리된 Fc-융합 폴리펩티드를 Biomax-SK 멤브레인 (Millipore, Billerica, MA) 이 장착된 Ultrafree-CL 원심분리 필터 유닛으로 농축하고 -80℃ 에서 보관하였다.
아미노산 서열을 기반으로 계산한 몰 흡광 계수를 사용하여 280 nm 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정하여, Fc-융합 폴리펩티드의 단백질 농도를 측정하였다. Fc-융합 폴리펩티드의 순도 및 적절한 이량체 형성을 환원제 (5 mM 1. 4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하에 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하여 SDS-PAGE 에 의해 분석하였다. Fc-융합 폴리펩티드 제제의 응집체 함량을 Superdex 200TM 분석적 크기-배제 컬럼 (GE Healthcare) 을 사용하여 고성능 SEC 에 의해 측정하였다. 환원된 Fc 융합 폴리펩티드의 아미노산 골격의 무결성을 뉴라미니다아제, O-글리카나아제 및 펩티드-N-글리코시다아제 F (Roche Applied Science) 의 조합으로의 효소 처리에 의해 N-글리칸을 제거한 후 Nano Electrospray QTOF 질량 분석에 의해 확인하였다.
활성화를 위해, Fc-융합 폴리펩티드를 1 M Tris, pH 7.5 중 제형화하고 IgA 프로테아제와 함께 인큐베이션하였다. 절단 후, Superdex 200TM (GE Healthcare) 상 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 IgA 프로테아제를 제거하였다. 크기 배제 크로마토그래피를 20 mM 히스티딘 완충액, 0.14 M NaCl, pH 6.0 중에서 수행하였다. 용리된 Fc-융합 폴리펩티드를 Biomax-SK 멤브레인 (Millipore, Billerica, MA) 이 장착된 Ultrafree-CL 원심분리 필터 유닛으로 농축하고 -80℃ 에서 보관하였다.
단백질 농도, 순도, 응집체 함량, 절단 효율 및 아미노산 골격의 무결성의 측정을 상기 기재한 방법으로 수행하였다.
그 결과를 하기 표 및 도 11 에서 나타낸다.
표
실시예 16
IL18-수용체 함유 융합 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 플라스미드의 생성
a) IL18R-Fc 융합 폴리펩티드에 대한 발현 플라스미드의 생성
IL18R-Fc 융합 폴리펩티드 인코딩 유전자를, i) 쥐과 면역글로불린 중쇄 신호 서열 (MGWSCIILFLVATATGVHS: SEQ ID NO: 55), ii) 인간 IL18R (출발 메티오닌 제외), 및 iii) 인간 Fc-감마-1-중쇄 불변부 (힌지-CH2-CH3) 를 코딩하는 화학적으로 합성된 DNA 단편을 융합시켜 어셈블리하였다.
HEK293 세포에서 IL18R-Fc 융합 폴리펩티드의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는 IL18R-Fc 융합 폴리펩티드 발현 카세트 외에 대장균에서 상기 플라스미드의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 기원, 및 대장균에서 암피실린 저항성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자를 포함하였다. 상세하게, IL18R-Fc 융합 폴리펩티드 인코딩 유전자의 전사 단위는 하기의 기능적 요소를 포함한다:
- 인트론 A 를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스 (P-CMV) 로부터의 전초기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-미번역 부위 (5'UTR),
- 쥐과 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 가용성 인간 IL18R-Fc,
- 인간 Fc-감마-1-중쇄 불변부 (힌지-CH2-CH3), 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH 폴리 A 신호 서열).
성숙 IL18R-Fc 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 70 에 나타낸다:
c) 단량체 IL18R 융합 폴리펩티드에 대한 "놉-인투-홀" 발현 플라스미드의 생성
HEK293 세포에서의 IL18R-Fc 융합 폴리펩티드 (놉) 의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는 상기 항목 a) 에서 기재된 발현 벡터에서 유래하였다. 이는 인간 감마-1 중쇄 불변부 내에 놉 돌연변이 T366W 및 S354C 를 갖는 Fc-부위를 코딩하는 DNA 서열에서부터 분화되었다.
HEK293 세포에서의 Fc-부위 폴리펩티드 (홀) 의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는 상기 항목 a) 에서 기재된 발현 벡터에서 유래하였다. 이는 인간 감마-1 중쇄 불변부 내에 홀 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C 를 갖는 Fc-부위를 코딩하는 DNA 서열에서부터 분화되었다.
HEK293 세포에서 IL18R-Fc 융합 폴리펩티드 (놉/홀) 의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는 융합 폴리펩티드 (놉/홀) 발현 카세트 외에 대장균에서 상기 플라스미드의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 기원, 및 대장균에서 암피실린 저항성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자를 포함하였다. 상세하게, 융합 폴리펩티드 (놉/홀) 인코딩 유전자의 전사 단위는 하기의 기능적 요소를 포함한다:
- 인트론 A 를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스 (P-CMV) 로부터의 전초기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-미번역 부위 (5'UTR),
- 쥐과 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 인간 감마-1 중쇄 불변부 내에 홀 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C, 또는 놉 돌연변이 T366W 및 S354C 를 갖는 인간 Fc-감마-1-중쇄 불변부 (힌지-CH2-CH3), 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH 폴리 A 신호 서열).
실시예 17
IL18R-Fc 융합 폴리펩티드의 일시적 발현, 정제 및 분석적 특징화
융합 폴리펩티드를 F17 배지 (Invitrogen Corp.) 에서 배양된 HEK293 세포 (인간 배아 신장 세포주 293-유래) 의 일시적 트랜스펙션에 의해 수득하였다. 트랜스펙션을 위해 "293-Free" 트랜스펙션 시약 (Novagen) 을 사용하였다. 놉-인투-홀 융합 폴리펩티드 페어를 트랜스펙션시 등몰 플라스미드 비를 사용하여 2 개의 상이한 플라스미드로부터 발현시켰다. 트랜스펙션을 제조사 지시사항에 명기된 바와 같이 수행하였다. 융합 폴리펩티드-함유 세포 배양물 상청액을 트랜스펙션 7 일 후 수확하였다. 상청액을 정제할 때까지 감소된 온도에서 보관하였다.
예를 들어 HEK293 세포에서의 인간 면역글로불린의 재조합 발현에 관한 일반적인 정보는 [Meissner, P., et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203] 에 제공된다.
융합 폴리펩티드-함유 배양물 상청액을 여과하고 2 개의 크로마토그래피 단계에 의해 정제하였다. 융합 폴리펩티드를 PBS (1 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl), pH 7.4 로 평형화된 HiTrap MabSelectSuRe (GE Healthcare) 을 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 포획하였다. 미결합 단백질을 평형 완충액으로 세척하여 제거하고, 융합 폴리펩티드를 0.05 M 시트레이트 완충액, pH 3 으로 회수하고, 용리 직후 1 M Tris-염기, pH 9.0 으로 pH 6.5 로 중화시켰다. Superdex 200TM (GE Healthcare) 에서의 크기 배제 크로마토그래피를 제 2 정제 단계로서 사용하였다. 크기 배제 크로마토그래피를 2 mM MOPS 완충액, 0.125 M NaCl, pH 7.2 중에서 수행하였다. 용리된 융합 폴리펩티드를 Biomax-SK 멤브레인 (Millipore, Billerica, MA) 이 장착된 Ultrafree-CL 원심분리 필터 유닛으로 농축하고 -80℃ 에서 보관하였다.
아미노산 서열을 기반으로 계산한 몰 흡광 계수를 사용하여 280 nm 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정하여, 융합 폴리펩티드의 단백질 농도를 측정하였다. 융합 폴리펩티드의 순도 및 적절한 이량체 형성을 환원제 (5 mM 1. 4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하에 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하여 SDS-PAGE 에 의해 분석하였다. 융합 폴리펩티드 제제의 응집체 함량을 Superdex 200TM 분석적 크기-배제 컬럼 (GE Healthcare) 을 사용하여 고성능 SEC 에 의해 측정하였다. 환원된 융합 폴리펩티드의 아미노산 골격의 무결성을 뉴라미니다아제, O-글리카나아제 및 펩티드-N-글리코시다아제 F (Roche Applied Science) 의 조합으로의 효소 처리에 의해 N-글리칸을 제거한 후 Nano Electrospray QTOF 질량 분석에 의해 확인하였다.
각각의 SPR-센서그램을 단량체와 이량체 사이의 차이를 나타내는 도 17 에서 나타내었다 (결합활성 효과).
실시예 18
Fc-부위-선절단 프로테아제 절단 부위-shTNF알파 융합 폴리펩티드에 대한 발현 플라스미드의 생성
a) Fc-shTNF알파 융합 폴리펩티드에 대한 발현 플라스미드의 생성
Fc-PP-shTNF알파 융합 유전자를, i) 인간 Fc-감마-1-중쇄 불변부 (힌지-CH2-CH3; 예시적 서열에 대해서는 SEQ ID NO: 03 ~ 17 참고) {여기서 인간 감마-1 중쇄 불변부는 절두되었음 (마지막 자연적 리신 아미노산 잔기의 제거)}, ii) Gly3Ser 및 Gly4Ser 반복물로 이루어지는 글리신-세린 링커 (중쇄-LSPG--GGGSGGGGS--TWEAK 의 C-말단), iii) PreScissionTM 프로테아제 절단 부위 (GLEVLFQGP, SEQ ID NO: 61) 및 iv) 인간 TNF알파 야생형 단백질의 shTNF알파 폴리펩티드 (세포내 및 트랜스멤브레인 도메인 및 절단 부위 제외) 를 코딩하는 화학적 합성 DNA 단편을 융합시켜 어셈블리하였다.
HEK293 세포에서의 Fc-PP-shTNF알파 융합 폴리펩티드의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는 Fc-PP-shTNF알파 발현 카세트 외에 대장균에서 상기 플라스미드의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 기원, 및 대장균에서 암피실린 저항성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자를 포함하였다. 상세하게, Fc-PP-shTNF알파 융합 유전자의 전사 단위는 하기의 기능적 요소를 포함한다:
- 인트론 A 를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스 (P-CMV) 로부터의 전초기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-미번역 부위 (5'UTR),
- 쥐과 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 인간 Fc-감마-1-중쇄 불변부 (힌지-CH2-CH3),
- shTNF알파 폴리펩티드, 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH 폴리 A 신호 서열).
성숙 Fc-PP-shTNF알파-융합 폴리펩티드의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 71 에서 나타낸다:
b) 이량체 Fc (홀) / Fc-PP-shTNF알파 (놉) 융합 폴리펩티드에 대한 "놉-인투-홀" 발현 플라스미드의 생성
HEK293 세포에서 Fc-부위 폴리펩티드 (홀) 의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는 상기 기재된 발현 벡터에서 유래하였다. 이는 인간 감마-1 중쇄 불변부 내에 홀 돌연변이 T366S, L368A, Y407V, Y349C 및 Fc 효과기 기능 감소 돌연변이 L234A 및 L235A 를 갖는 Fc-부위를 코딩하는 DNA 서열에서부터 분화되었다.
성숙 Fc-부위 (홀) 폴리펩티드의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 69 에 나타낸다:
HEK293 에서의 Fc-PP-shTNF알파 (놉) 융합 폴리펩티드의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는 Fc (놉) 발현 카세트 외에 대장균에서 상기 플라스미드의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 기원, 및 대장균에서 암피실린 저항성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자를 포함하였다. 상세하게는, Fc-PP-shTNF알파 (놉) 융합 유전자의 전사 단위는 하기의 기능적 요소를 포함한다:
- 인트론 A 를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스 (P-CMV) 로부터의 전초기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-미번역 부위 (5'UTR),
- 쥐과 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 인간 감마-1 중쇄 불변부 내에 놉 돌연변이 T366W 및 S354C 및 Fc 효과기 기능 감소 돌연변이 L234A 및 L235A 를 갖는 인간 Fc-감마-1-중쇄 불변부 (힌지-CH2-CH3),
- 유형 Gly3Ser-Gly4Ser 및 PreScissionTM 프로테아제 절단 부위 (GLEVLFQGP) 의 링커 서열,
- PP-shTNF알파 폴리펩티드, 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH 폴리 A 신호 서열).
성숙 Fc-PP-shTNF알파 (놉) 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 72 에 나타낸다:
실시예 19
삼량체 Fc-PP-shTNF알파 융합 폴리펩티드의 정제, 처리 및 분석적 특징화
Fc-융합 폴리펩티드-함유 배양물 상청액을 여과하고 2 개의 크로마토그래피 단계에 의해 정제하였다. 상청액을 50% v/v 2 M 글리신, pH 8.6, 600 mM NaCl 과 혼합하고, 1 M 글리신, pH 8.6, 600 mM NaCl 로 평형화된 HiTrap MabSelectSuRe (GE Healthcare) 를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 포획하였다. 미결합 단백질을 평형 완충액으로 세척하여 제거하고, 융합 폴리펩티드를 0.1 M 시트레이트 완충액, pH 3.0 으로 회수하고, 용리 직후 1 M Tris-염기, pH 8.5 로 pH 6.0 으로 중화시켰다. Superdex 200TM (GE Healthcare) 에서의 크기 배제 크로마토그래피를 제 2 정제 단계로서 사용하였다. 크기 배제 크로마토그래피를 2 x PBS (2 mM KH2PO4, 20 mM Na2HPO4, 274 mM NaCl, 5.4 mM KCl), pH 7.4 중에서 수행하였다. 용리된 Fc-융합 폴리펩티드를 Biomax-SK 멤브레인 (Millipore, Billerica, MA) 이 장착된 Ultrafree-CL 원심분리 필터 유닛으로 농축하고 -80℃ 에서 보관하였다.
아미노산 서열을 기반으로 계산한 몰 흡광 계수를 사용하여 280 nm 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정하여, Fc-융합 폴리펩티드의 단백질 농도를 측정하였다. Fc-융합 폴리펩티드의 순도를 환원제 (5 mM 1. 4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하에 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하여 SDS-PAGE 에 의해 분석하였다. Fc-융합 폴리펩티드의 응집체 함량 및 적절한 삼량체 형성을 SEC-MALLS 검출기 (Wyatt) 에 연결된 Superdex 200TM 분석적 크기-배제 컬럼 (GE Healthcare) 을 사용하여 고성능 SEC 에 의해 측정하였다. 환원된 Fc 융합 폴리펩티드의 아미노산 골격의 무결성을 뉴라미니다아제, O-글리카나아제 및 펩티드-N-글리코시다아제 F (Roche Applied Science) 의 조합으로의 효소 처리에 의해 N-글리칸을 제거한 후 Nano Electrospray QTOF 질량 분석에 의해 확인하였다.
Fc-융합이 없는 삼량체 PP-shTNF알파를 수득하기 위해, 삼량체 Fc-융합 폴리펩티드를 PreScission® 프로테아제와 함께 밤새 인큐베이션한 후, 비-절단된 Fc-융합 폴리펩티드 뿐 아니라 유리 Fc-부분의 제거를 위해 통과액 방식으로 MabSelectSuRe (GE Healthcare) 컬럼을 사용하여 친화성 크로마토그래피 처리하였다. 통과액 분획을, PreScission® 프로테아제를 제거하기 위해 글루타치온 세파로오스 4B (GE Healthcare) 를 사용하여 통과액 방식으로 친화성 크로마토그래피에 의해 추가 정제하였다. 삼량체 shTNF알파를 함유하는 통과액 분획을 Superdex 200TM (GE Healthcare) 상의 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가 정제하였다. 크기 배제 크로마토그래피를 2 x PBS (2 mM KH2PO4, 20 mM Na2HPO4, 274 mM NaCl, 5.4 mM KCl), pH 7.4 중에서 수행하였다. 용리된 삼량체 shTNF알파 함유 분획을 Biomax-SK 멤브레인 (Millipore, Billerica, MA) 이 장착된 Ultrafree-CL 원심분리 필터 유닛으로 농축하고 -80℃ 에서 보관하였다.
단백질 농도, 순도, 응집체 함량, 삼량체 형성 및 아미노산 골격의 무결성의 측정을 상기 기재한 방법으로 수행하였다.
IgG1-LALA-Fc-KiH_선절단-프로테아제-부위_shTNFa 융합 폴리펩티드로서 TNF 알파를 283 mg/l 에서 HEK 293 세포에서의 일시적 발현에 의해 수득하였다. 선절단 프로테아제에 의한 절단은 100 mg 융합 폴리펩티드 당 15 mg (283 mg 으로부터의 총합 = 43 mg) 을 초래하였다. A375 검정으로 기능적 평가를 수행하였다 (실시예 20 참고).
실시예 20
인간 TNF 알파의 적정
A-375 세포를, 96 웰 F 세포 배양 플레이트 (Costar 3596) 에서 웰 당 200 ㎕ 로, 웰 당 2x104 세포로 시딩하였다. 세포를 37℃, 5% CO2 에서 밤새 배양한 후 배지를 제거하였다.
하기 사이토카인을 웰 당 100 ㎕ (50-0 nM) 로 적정하였다:
- rhTNF-a (R&D Systems 210-TA/CF),
- 본원에 보고한 바와 같은 hTNF알파-Fc 융합 폴리펩티드, 및
- 절단된 hTNF알파-Fc 융합 폴리펩티드.
세포를 24 시간 동안 37℃, 5% CO2 에서 인큐베이션하였다. 상청액을 96 웰 RB 플레이트에 옮기고 -20℃ 에서 보관하였다. 사이토카인 프로파일을 hIL-8 (BD 558277) CBA Flex Set 를 사용하여 분석하였다.
적정 곡선을 도 10 에 나타내었다.
<110> F. Hoffmann-La Roche AG
<120> Method for producing monomeric and multimeric molecules and uses
thereof
<130> 31134 WO
<150> EP12179021
<151> 2012-08-02
<160> 72
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Trp Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
35 40 45
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
50 55 60
Glu Ser Thr Tyr Arg Trp Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
65 70 75 80
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
85 90 95
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105
<210> 2
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
100 105
<210> 3
<211> 227
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 4
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with the mutations
L234A, L235A
<400> 4
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 5
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with a hole mutation
<400> 5
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 6
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with a knob mutation
<400> 6
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 7
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with a L234A, L235A
and hole mutation
<400> 7
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 8
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with a L234A, L235A
and knob mutation
<400> 8
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 9
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with a P329G mutation
<400> 9
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
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Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 10
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with a L234A, L235A
and P329G mutation
<400> 10
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 11
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with a P239G and hole
mutation
<400> 11
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 12
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with a P329G and knob
mutation
<400> 12
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 13
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with a L234A, L235A,
P329G and hole mutation
<400> 13
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 14
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with a L234A, L235A,
P329G and knob mutation
<400> 14
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 15
<211> 229
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
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65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
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Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
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Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
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Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 16
<211> 229
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variant human Fc-region of the IgG4 isotype with a S228P and
L235E mutation
<400> 16
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
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Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
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Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
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Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 17
<211> 229
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> variant human Fc-region of the IgG4 isotype with a S228P, L235E
and P329G mutation
<400> 17
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Gly Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
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Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 18
<211> 191
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro Gln
1 5 10 15
Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln Gly
20 25 30
Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu Ser
35 40 45
Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr Val
50 55 60
Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu Ser
65 70 75 80
Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln Ala
85 90 95
Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys His
100 105 110
Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn Gly
115 120 125
Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro Lys
130 135 140
Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val Gly
145 150 155 160
Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln Gly
165 170 175
Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg-tag
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Arg Arg Arg Arg Arg
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 20
Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Avi-tag
<400> 21
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
1 5 10 15
<210> 22
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His-Avi-tag
<400> 22
His His His His His His Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys
1 5 10 15
Ile Glu Trp His Glu
20
<210> 23
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His-tag
<400> 23
His His His His His His
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid tag
<400> 24
Lys Asp His Leu Ile His Asn Val His Lys Glu Phe His Ala His Ala
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid tag
<400> 25
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
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<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid tag
<400> 26
Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr
1 5 10 15
Lys Asp Asp Asp Asp Lys
20
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 27
Ala Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid tag
<400> 28
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid tag
<400> 29
Met Asp Val Glu Ala Trp Leu Gly Ala Arg
1 5 10
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid tag
<400> 30
Met Asp Val Glu Ala Trp Leu Gly Ala Arg Val Pro Leu Val Glu Thr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid tag
<400> 31
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1 5 10 15
Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro
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Gln Gly Gln Arg Glu Pro
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
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<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid tag
<400> 33
Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser
1 5 10 15
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<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid tag
<400> 34
Lys Arg Arg Trp Lys Lys Asn Phe Ile Ala Val Ser Ala Ala Asn Arg
1 5 10 15
Phe Lys Lys Ile Ser Ser Ser Gly Ala Leu
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid tag
<400> 35
Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr
1 5 10 15
Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val Cys Ala Ser
20 25 30
Gly Thr Thr Cys Gln Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu
35 40 45
<210> 36
<211> 32
<212> PRT
<213> Butyrivibrio fibrisolvens
<400> 36
Met Asp Trp Asn Ala Asn Ile Ala Pro Gly Asn Ser Val Glu Phe Gly
1 5 10 15
Ile Gln Gly Ala Gly Ser Val Gly Asn Val Ile Asp Ile Thr Val Glu
20 25 30
<210> 37
<211> 51
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> chitin-binding-domain
<400> 37
Thr Asn Pro Gly Val Ser Ala Trp Gln Val Asn Thr Ala Tyr Thr Ala
1 5 10 15
Gly Gln Leu Val Thr Tyr Asn Gly Lys Thr Tyr Lys Cys Leu Gln Pro
20 25 30
His Thr Ser Leu Ala Gly Trp Glu Pro Ser Asn Val Pro Ala Leu Trp
35 40 45
Gln Leu Gln
50
<210> 38
<211> 209
<212> PRT
<213> Chondrus crispus
<400> 38
Met Pro Glu Ile Lys Leu Thr Tyr Phe Asp Met Arg Gly Arg Ala Glu
1 5 10 15
Ala Ser Arg Leu Ala Leu Val Val Gly Glu Ile Pro Phe Glu Asp Glu
20 25 30
Arg Val Val Phe Asp His Trp Lys Glu Ala Lys Pro Lys Thr Pro Tyr
35 40 45
Ala Ala Leu Pro Met Leu Thr Val Asp Gly Met Gln Val Ala Gln Ser
50 55 60
Asp Ala Ile Leu Arg Tyr Cys Gly Lys Leu Ala Gly Leu Tyr Pro Ser
65 70 75 80
Asp Pro Leu Glu Ala Ala Lys Val Asp Glu Val Gly Gly Val Ile Asp
85 90 95
Asp Val Thr His Ala Met Tyr Arg Tyr Arg Gly Asp Asp Lys Asp Lys
100 105 110
Leu Arg Glu Glu Arg Asp Lys Phe Ser Lys Val Asp Val Pro Arg Tyr
115 120 125
Val Gly Ala Leu Glu Lys Arg Leu Glu Ala Phe Gly Asp Gly Pro Trp
130 135 140
Ala Val Gly Gly Asn Met Thr Ile Ala Asp Leu His Ile Cys His Leu
145 150 155 160
Val Thr Asn Ile Arg Cys Gly Met Leu Asp Phe Val Asp Lys Asp Leu
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Leu Glu Gly Tyr Val Arg Ile Val Lys Ser Tyr Ser Ala Val Met Glu
180 185 190
His Pro Lys Val Thr Glu Trp Tyr Glu Lys Lys Pro Val Lys Met Phe
195 200 205
Ser
<210> 39
<211> 396
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 39
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Gly Lys
20 25 30
Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu
35 40 45
Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu
50 55 60
His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly
65 70 75 80
Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr
85 90 95
Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln
100 105 110
Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys
115 120 125
Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn
130 135 140
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Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn
165 170 175
Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly
180 185 190
Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly
195 200 205
Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu
210 215 220
Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu
225 230 235 240
Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp
245 250 255
Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val Thr Val
260 265 270
Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu
275 280 285
Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu
290 295 300
Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn
305 310 315 320
Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu
325 330 335
Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys
340 345 350
Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala
355 360 365
Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp
370 375 380
Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Arg Ile Thr Lys
385 390 395
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> protease cleavage site
<400> 40
Pro Ala Pro Ser Pro
1 5
<210> 41
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> protease cleavage site
<400> 41
Pro Pro Ser Pro
1
<210> 42
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> protease cleavage site
<400> 42
Pro Pro Ala Pro
1
<210> 43
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> protease cleavage site
<400> 43
Pro Pro Thr Pro
1
<210> 44
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> protease cleavage site
<400> 44
Pro Pro Gly Pro
1
<210> 45
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> enzymatic cleavage site
<400> 45
Pro Arg Pro Pro Thr Pro
1 5
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> enzymatic cleavage site
<400> 46
Val Val Ala Pro Pro Ala Pro
1 5
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> enzymatic cleavage site
<400> 47
Val Val Ala Pro Pro Ser Pro
1 5
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> enzymatic cleavage site
<400> 48
Val Val Ala Pro Pro Thr Pro
1 5
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> enzymatic cleavage site
<400> 49
Val Val Ala Pro Pro Gly Pro
1 5
<210> 50
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> enzymatic cleavage site
<400> 50
Pro Arg Pro Pro Thr Pro
1 5
<210> 51
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> enzymatic cleavage site
<400> 51
Ala Pro Pro Ala Ala Pro
1 5
<210> 52
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> enzymatic cleavage site
<400> 52
Pro Arg Pro Pro Ala Pro
1 5
<210> 53
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> enzymatic cleavage site
<400> 53
Pro Arg Pro Pro Ser Pro
1 5
<210> 54
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> enzymatic cleavage site
<400> 54
Pro Arg Pro Pro Gly Pro
1 5
<210> 55
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 55
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 56
<211> 443
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mature FcyRIIIaV158-Avi-IgA Protease-Fc LALA P239G fusion
polypeptide
<400> 56
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
1 5 10 15
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
20 25 30
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
50 55 60
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
65 70 75 80
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
85 90 95
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
100 105 110
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
115 120 125
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
130 135 140
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
145 150 155 160
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
165 170 175
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
180 185 190
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Leu
195 200 205
Val Val Ala Pro Pro Ala Pro Glu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290 295 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325 330 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
340 345 350
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
355 360 365
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
370 375 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385 390 395 400
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420 425 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<213> Artificial Sequence
<220>
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polypeptide
<400> 57
Gln Ala Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp
1 5 10 15
Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala
20 25 30
Arg Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu
35 40 45
Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn
50 55 60
Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp
65 70 75 80
Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro
85 90 95
His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser
100 105 110
Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys
115 120 125
Ser Gln Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala
130 135 140
Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr
145 150 155 160
Thr Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro Ser
165 170 175
Met Gly Ser Ser Ser Pro Met Gly Ile Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu
180 185 190
Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Leu Val Val Ala Pro Pro Ala Pro
195 200 205
Glu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
210 215 220
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
225 230 235 240
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
245 250 255
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
260 265 270
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
275 280 285
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
290 295 300
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro
305 310 315 320
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
325 330 335
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
340 345 350
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
355 360 365
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
370 375 380
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
385 390 395 400
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
405 410 415
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
420 425 430
Ser Pro Gly Lys
435
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<211> 423
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FcyRIIb-Avi-IgA Protease-Fc LALA P239G fusion polypeptide
<400> 58
Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gln Trp Ile Asn Val
1 5 10 15
Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr His Ser Pro
20 25 30
Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr
35 40 45
His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly
50 55 60
Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu
85 90 95
Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp
100 105 110
Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Lys Lys
115 120 125
Phe Ser Arg Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser
130 135 140
His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Ala Pro Gly Leu Asn Asp
165 170 175
Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Leu Val Val Ala Pro
180 185 190
Pro Ala Pro Glu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
195 200 205
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
210 215 220
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
225 230 235 240
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
245 250 255
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
260 265 270
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
275 280 285
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
290 295 300
Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
305 310 315 320
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
325 330 335
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
340 345 350
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
355 360 365
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
370 375 380
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
385 390 395 400
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
405 410 415
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
420
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<211> 443
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FcyRIIIb-Avi-IgA Protease-Fc LALA P239G fusion polypeptide
<400> 59
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
1 5 10 15
Gln Trp Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
20 25 30
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
50 55 60
Val Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
65 70 75 80
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
85 90 95
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
100 105 110
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
115 120 125
Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro
130 135 140
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
145 150 155 160
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
165 170 175
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln
180 185 190
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Leu
195 200 205
Val Val Ala Pro Pro Ala Pro Glu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290 295 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325 330 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
340 345 350
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
355 360 365
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
370 375 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385 390 395 400
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420 425 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 60
<211> 346
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> minimal FcgammaRIIIa-Avi-Fc LALA p239G fusion polypeptide
<400> 60
Gly Trp Leu Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp
1 5 10 15
Pro Ile His Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys
20 25 30
Val Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn
35 40 45
Ser Asp Phe Tyr Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr
50 55 60
Phe Cys Arg Gly Leu Val Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Asn Ile Thr Ile Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe
85 90 95
Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys
100 105 110
Ile Glu Trp His Glu Leu Glu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
115 120 125
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
130 135 140
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
145 150 155 160
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
165 170 175
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
180 185 190
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
195 200 205
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
210 215 220
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
225 230 235 240
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
245 250 255
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
260 265 270
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
275 280 285
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
290 295 300
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
305 310 315 320
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
325 330 335
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Precision protease cleavage site
<400> 61
Gly Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro
1 5
<210> 62
<211> 388
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mature Fc-TWEAK-fusion polypeptide
<400> 62
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Leu Glu Val Leu
225 230 235 240
Phe Gln Gly Pro Ala Ile Ala Ala His Tyr Glu Val His Pro Arg Pro
245 250 255
Gly Gln Asp Gly Ala Gln Ala Gly Val Asp Gly Thr Val Ser Gly Trp
260 265 270
Glu Glu Ala Arg Ile Asn Ser Ser Ser Pro Leu Arg Tyr Asn Arg Gln
275 280 285
Ile Gly Glu Phe Ile Val Thr Arg Ala Gly Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys
290 295 300
Gln Val His Phe Asp Glu Gly Lys Ala Val Tyr Leu Lys Leu Asp Leu
305 310 315 320
Leu Val Asp Gly Val Leu Ala Leu Arg Cys Leu Glu Glu Phe Ser Ala
325 330 335
Thr Ala Ala Ser Ser Leu Gly Pro Gln Leu Arg Leu Cys Gln Val Ser
340 345 350
Gly Leu Leu Ala Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu Arg Ile Arg Thr Leu
355 360 365
Pro Trp Ala His Leu Lys Ala Ala Pro Phe Leu Thr Tyr Phe Gly Leu
370 375 380
Phe Gln Val His
385
<210> 63
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mature Fc (hole) polypeptide
<400> 63
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 64
<211> 388
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mature Fc-TWEAK (knob) fusion polypeptide
<400> 64
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Leu Glu Val Leu
225 230 235 240
Phe Gln Gly Pro Ala Ile Ala Ala His Tyr Glu Val His Pro Arg Pro
245 250 255
Gly Gln Asp Gly Ala Gln Ala Gly Val Asp Gly Thr Val Ser Gly Trp
260 265 270
Glu Glu Ala Arg Ile Asn Ser Ser Ser Pro Leu Arg Tyr Asn Arg Gln
275 280 285
Ile Gly Glu Phe Ile Val Thr Arg Ala Gly Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys
290 295 300
Gln Val His Phe Asp Glu Gly Lys Ala Val Tyr Leu Lys Leu Asp Leu
305 310 315 320
Leu Val Asp Gly Val Leu Ala Leu Arg Cys Leu Glu Glu Phe Ser Ala
325 330 335
Thr Ala Ala Ser Ser Leu Gly Pro Gln Leu Arg Leu Cys Gln Val Ser
340 345 350
Gly Leu Leu Ala Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu Arg Ile Arg Thr Leu
355 360 365
Pro Trp Ala His Leu Lys Ala Ala Pro Phe Leu Thr Tyr Phe Gly Leu
370 375 380
Phe Gln Val His
385
<210> 65
<211> 350
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mature Fc-IL17A-fusion polypeptide
<400> 65
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Gly Ile Ala Ile Pro Arg Asn Ser Gly Cys Pro Asn
245 250 255
Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile
260 265 270
His Asn Arg Asn Thr Ser Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr
275 280 285
Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu
290 295 300
Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys
305 310 315 320
Val Lys Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile
325 330 335
Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Arg His Cys
340 345 350
<210> 66
<211> 350
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mature Fc-IL17A-fusion polypeptide
<400> 66
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Val Val
225 230 235 240
Ala Pro Pro Ala Gly Ile Ala Ile Pro Arg Asn Ser Gly Cys Pro Asn
245 250 255
Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile
260 265 270
His Asn Arg Asn Thr Ser Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr
275 280 285
Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu
290 295 300
Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys
305 310 315 320
Val Lys Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile
325 330 335
Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Arg His Cys
340 345 350
<210> 67
<211> 376
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL17A-Fc (hole) fusion polypeptide
<400> 67
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Val Val
225 230 235 240
Ala Pro Pro Ala Gly Ile Ala Ile Pro Arg Asn Ser Gly Cys Pro Asn
245 250 255
Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile
260 265 270
His Asn Arg Asn Thr Ser Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr
275 280 285
Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu
290 295 300
Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys
305 310 315 320
Val Lys Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile
325 330 335
Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Arg His Cys Pro Asn
340 345 350
Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val
355 360 365
Thr Pro Ile Val His His Val Ala
370 375
<210> 68
<211> 376
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mature Fc-IL17A (knob) fusion polypeptide
<400> 68
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Gly Ile Ala Ile Pro Arg Asn Ser Gly Cys Pro Asn
245 250 255
Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile
260 265 270
His Asn Arg Asn Thr Ser Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr
275 280 285
Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu
290 295 300
Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys
305 310 315 320
Val Lys Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile
325 330 335
Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Arg His Cys Pro Asn
340 345 350
Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val
355 360 365
Thr Pro Ile Val His His Val Ala
370 375
<210> 69
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mature Fc-region (hole) polypeptide
<400> 69
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 70
<211> 541
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL18R-Fc fusion polypeptide
<400> 70
Ser Lys Ser Cys Ile His Arg Ser Gln Ile His Val Val Glu Gly Glu
1 5 10 15
Pro Phe Tyr Leu Lys Pro Cys Gly Ile Ser Ala Pro Val His Arg Asn
20 25 30
Glu Thr Ala Thr Met Arg Trp Phe Lys Gly Ser Ala Ser His Glu Tyr
35 40 45
Arg Glu Leu Asn Asn Arg Ser Ser Pro Arg Val Thr Phe His Asp His
50 55 60
Thr Leu Glu Phe Trp Pro Val Glu Met Glu Asp Glu Gly Thr Tyr Ile
65 70 75 80
Ser Gln Val Gly Asn Asp Arg Arg Asn Trp Thr Leu Asn Val Thr Lys
85 90 95
Arg Asn Lys His Ser Cys Phe Ser Asp Lys Leu Val Thr Ser Arg Asp
100 105 110
Val Glu Val Asn Lys Ser Leu His Ile Thr Cys Lys Asn Pro Asn Tyr
115 120 125
Glu Glu Leu Ile Gln Asp Thr Trp Leu Tyr Lys Asn Cys Lys Glu Ile
130 135 140
Ser Lys Thr Pro Arg Ile Leu Lys Asp Ala Glu Phe Gly Asp Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Tyr Ser Cys Val Phe Ser Val His His Asn Gly Thr Arg Tyr Asn
165 170 175
Ile Thr Lys Thr Val Asn Ile Thr Val Ile Glu Gly Arg Ser Lys Val
180 185 190
Thr Pro Ala Ile Leu Gly Pro Lys Cys Glu Lys Val Gly Val Glu Leu
195 200 205
Gly Lys Asp Val Glu Leu Asn Cys Ser Ala Ser Leu Asn Lys Asp Asp
210 215 220
Leu Phe Tyr Trp Ser Ile Arg Lys Glu Asp Ser Ser Asp Pro Asn Val
225 230 235 240
Gln Glu Asp Arg Lys Glu Thr Thr Thr Trp Ile Ser Glu Gly Lys Leu
245 250 255
His Ala Ser Lys Ile Leu Arg Phe Gln Lys Ile Thr Glu Asn Tyr Leu
260 265 270
Asn Val Leu Tyr Asn Cys Thr Val Ala Asn Glu Glu Ala Ile Asp Thr
275 280 285
Lys Ser Phe Val Leu Val Arg Lys Glu Ile Pro Asp Ile Pro Gly His
290 295 300
Val Phe Thr Gly Leu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
305 310 315 320
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
325 330 335
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
340 345 350
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
355 360 365
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
370 375 380
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
385 390 395 400
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
405 410 415
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
420 425 430
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
435 440 445
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
450 455 460
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
465 470 475 480
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
485 490 495
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
500 505 510
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
515 520 525
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
530 535 540
<210> 71
<211> 401
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc-PP-shTNFalpha-fusion polypeptide
<400> 71
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Leu Glu Val Leu
225 230 235 240
Phe Gln Gly Pro Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro
245 250 255
Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp
260 265 270
Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg
275 280 285
Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser
290 295 300
Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu
305 310 315 320
Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn
325 330 335
Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly
340 345 350
Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe
355 360 365
Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp
370 375 380
Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala
385 390 395 400
Leu
<210> 72
<211> 401
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc-PP-shTNFalpha (knob) fusion polypeptide
<400> 72
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Leu Glu Val Leu
225 230 235 240
Phe Gln Gly Pro Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro
245 250 255
Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp
260 265 270
Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg
275 280 285
Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser
290 295 300
Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu
305 310 315 320
Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn
325 330 335
Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly
340 345 350
Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe
355 360 365
Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp
370 375 380
Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala
385 390 395 400
Leu
Claims (18)
- 하기 단계를 포함하는, n-량체로서 생물학적으로 활성인 폴리펩티드의 생성 방법으로서;
a) 하기 식 I 에 따른 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계:
(Bn-CSo-Is-CSp-FC-CSq-It-CSr-Bm)u (식 I)
[식 중,
B 는 n-량체로서 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 나타내고,
FC 는 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드를 나타내고,
CS 는 절단 부위를 나타내고,
I 는 개재 아미노산 서열을 나타내고,
n=1 이고 m=0 이거나, n=0 이고 m=1 이고,
n=1 인 경우 o=0 또는 1 이고, o=0 인 경우 p=0 또는 1 이고, o=1 인 경우 p=0, 및 s=0 또는 1, 및 q=0, 및 t=0, 및 r=0 이고,
m=1 인 경우 q=0 또는 1 이고, q=0 인 경우 r=0 또는 1 이고, q=1 인 경우 r=0, 및 t=0 또는 1, 및 o=0, 및 s=0, 및 p=0 이고,
u=1 또는 2 이고,
FC 는 Fc-수용체에 실질적으로 결합하지 않음],
b) 세포 또는 배양 배지로부터 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계,
c) 임의로는 프로테아제로 융합 폴리펩티드를 절단하는 단계,
이로써 n-량체로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드가 생성되는 방법. - 하기 식 I 에 따른 융합 폴리펩티드:
(Bn-CSo-Is-CSp-FC-CSq-It-CSr-Bm)u (식 I)
[식 중,
B 는 n-량체로서 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 나타내고,
FC 는 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드를 나타내고,
CS 는 절단 부위를 나타내고,
I 는 개재 아미노산 서열을 나타내고,
n=1 이고 m=0 이거나, n=0 이고 m=1 이고,
n=1 인 경우 o=0 또는 1 이고, o=0 인 경우 p=0 또는 1 이고, o=1 인 경우 p=0, 및 s=0 또는 1, 및 q=0, 및 t=0, 및 r=0 이고,
m=1 인 경우 q=0 또는 1 이고, q=0 인 경우 r=0 또는 1 이고, q=1 인 경우 r=0, 및 t=0 또는 1, 및 o=0, 및 s=0, 및 p=0 이고,
u=1 또는 2 이고,
FC 는 Fc-수용체에 실질적으로 결합하지 않음]. - 제 1 항에 따른 방법에 의해 수득된 융합 폴리펩티드의 절단에 의해 수득되는 n-량체 폴리펩티드.
- B 가 IL17, TWEAK, TNF 및 기타 TNF 패밀리 멤버, TL1a, IL18, IL18R, IL33 및 IL33R 의 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 제 1 항에 따른 방법 또는 제 2 항에 따른 융합 폴리펩티드 또는 제 3 항에 따른 n-량체 폴리펩티드.
- FC 가 인간 IgG1 중쇄 폴리펩티드, 인간 IgG2 중쇄 폴리펩티드, 인간 IgG3 중쇄 폴리펩티드, 인간 IgG4 중쇄 폴리펩티드, 쥐과 IgG1 중쇄 폴리펩티드, 쥐과 IgG2 중쇄 폴리펩티드, 쥐과 IgG3 중쇄 폴리펩티드, 토끼 IgG 중쇄 폴리펩티드의 군에서 선택되는 중쇄 폴리펩티드의 변이체인 것을 특징으로 하는, 제 1 항 또는 제 4 항에 따른 방법 또는 제 2 항 또는 제 4 항에 따른 융합 폴리펩티드.
- FC 가 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G 를 갖는 인간 IgG1 중쇄 폴리펩티드, 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G 를 갖는 인간 IgG4 중쇄 폴리펩티드에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 제 1 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 제 2 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩티드.
- u=2 이고 제 1 FC 가 돌연변이 T366W 및 임의로는 돌연변이 S354C 를 포함하고, 제 2 FC 가 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V 및 임의로는 돌연변이 Y349C 를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제 1 항, 제 4 항, 제 5 항 또는 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 제 2 항, 제 4 항, 제 5 항 또는 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩티드.
- 하기를 특징으로 하는, 제 7 항에 따른 방법 또는 제 7 항에 따른 융합 폴리펩티드:
a) n=1 및 m=0 이고, 제 1 FC 에 융합된 B 와 제 2 FC 에 융합된 B 가 동일하고,
b) n=1 및 m=0 이고 제 1 FC 에 융합된 B 와 제 2 FC 에 융합된 B 가 상이하고,
c) n=0 및 m=1 이고 제 1 FC 에 융합된 B 와 제 2 FC 에 융합된 B 가 동일하고,
d) n=0 및 m=1 이고 제 1 FC 에 융합된 B 와 제 2 FC 에 융합된 B 가 상이함. - 제 2 항 및 제 4 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 고정화 융합 폴리펩티드 또는 제 3 항 또는 제 4 항에 따른 n-량체 폴리펩티드의 친화성 크로마토그래피 리간드로서의 용도.
- 제 2 항 및 제 4 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 고정화 융합 폴리펩티드 또는 제 3 항 또는 제 4 항에 따른 n-량체 폴리펩티드의 면역검정에서의 용도.
- 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 융합 폴리펩티드 또는 n-량체 폴리펩티드가 고체상에 결합하는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 2 항 및 제 4 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩티드 또는 제 3 항 또는 제 4 항에 따른 n-량체 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물.
- 제 2 항 및 제 4 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩티드 또는 제 3 항 또는 제 4 항에 따른 n-량체 폴리펩티드의 약제 제조에 있어서의 용도.
- 제 2 항 및 제 4 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩티드 또는 제 3 항 또는 제 4 항에 따른 n-량체 폴리펩티드의 면역원으로서의 용도.
- 제 2 항 및 제 4 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩티드 또는 제 3 항 또는 제 4 항에 따른 n-량체 폴리펩티드의, 제 2 항 및 제 4 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩티드 또는 제 3 항 또는 제 4 항에 따른 n-량체 폴리펩티드를 실험 동물에게 적용함으로써 질환의 동물 모델을 수득하기 위한 용도.
- 제 2 항 및 제 4 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩티드 또는 제 3 항 또는 제 4 항에 따른 n-량체 폴리펩티드의, B 또는 B 의 n-량체에 특이적으로 결합하는 항체를 선택하기 위한 용도.
- 제 2 항 및 제 4 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩티드 또는 제 3 항 또는 제 4 항에 따른 n-량체 폴리펩티드의, B 의 디술피드-연결 2-량체를 생성하기 위한 용도.
- 제 1 항 및 제 4 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계를 포함하는, 2-량체로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드의 생성을 위한 방법으로서:
a) 하기 식 II 에 따른 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계;
Bn-CSo-Is-CSp-FC1-CSq-It-CSr-Bm : FC2 (식 II)
[식 중,
B 는 2-량체로서 생물학적으로 활성이며 융합 Fc-부위의 부재 하 발현시 비-규정된 응집체/다량체를 형성하는 폴리펩티드를 나타내고,
FC1 은 제 1 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드를 나타내고,
FC2 는 제 2 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드를 나타내고,
CS 는 절단 부위를 나타내고,
I 는 개재 아미노산 서열을 나타내고,
n=1 이고 m=0 이거나, n=0 이고 m=1 이고,
n=1 인 경우 o=0 또는 1 이고, o=0 인 경우 p=0 또는 1 이고, o=1 인 경우 p=0, 및 s=0 또는 1, 및 q=0, 및 t=0, 및 r=0 이고,
m=1 인 경우 q=0 또는 1 이고, q=0 인 경우 r=0 또는 1 이고, q=1 인 경우 r=0, 및 t=0 또는 1, 및 o=0, 및 s=0, 및 p=0 이고,
제 1 FC 및 제 2 FC 는 하나 이상의 디술피드 결합(들) 에 의해 공유 결합되고,
FC1 및 FC2 는 Fc-수용체에 실질적으로 결합하지 않음],
b) 세포 또는 배양 배지로부터 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계,
c) 임의로는 프로테아제로 융합 폴리펩티드를 절단하는 단계,
이로써 2-량체로서 생물학적으로 활성인 폴리펩티드가 생성되는 방법.
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