DE69918413T2

DE69918413T2 - Auswahlverfahren von hla-g exprimierenden tumoren, die durch antikrebsmittel behandelbar sind, und deren verwendungen

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Publication number: DE69918413T2
Application number: DE69918413T
Authority: DE
Inventors: Delfino Edgardo CAROSELLA; Jean Dausset; Philippe Moreau; Pascale Paul; Nathalie Rouas-Freiss
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 1998-02-20
Filing date: 1999-02-19
Publication date: 2005-08-04
Anticipated expiration: 2019-02-20
Also published as: JP2002503497A; CA2321222A1; EP1054688B1; US20040209296A1; JP4470007B2; DE69918413D1; US6790638B1; ES2224603T3; WO1999042128A1; EP1054688A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auswahl von soliden Tumoren, die auf eine Antikrebsbehandlung ansprechen, die die HLA-G-Aktivität der soliden Tumore inhibiert oder verhindert und Anwendungen davon.
Die Antigene des Histokompatibilität Hauptkomplexes (CMH) werden in verschiedene Klassen eingeteilt, nämlich in die Antigene der Klasse I (HLA-A, HLA-B und HLA-C), die drei globuläre Domänen darstellen (α1, α2 und α3) und bei denen die Domänen α3 mit dem β2-Mikroglobulin assoziiert ist, in die Antigene der Klasse II (HLA-DB, HLA-DQ und HLR-DR) und in die Antigene der Klasse III (Ergänzung).
Die Antigene der Klasse I umfassen neben den vorerwähnten Antigenen weitere Antigene, die als nicht klassische Antigene der Klasse I bezeichnet werden und insbesondere die Antigene HLA-E, HLA-F und HLA-G; letzteres wird insbesondere durch dieextravillösen Trophoblasten der normalen menschlichen Plazenta exprimiert und durch Thymus Epithelzellen.
Die Sequenz des HLA-G Gens (HLA-6.0 Gen) wurde von Geraghty et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 9145–9149) beschrieben: es umfasst 4396 Basenpaare und stellt eine Intron/Exon-Organisation dar, die zu derjenigen der Gene HLA-A, -B und -C homolog ist. Noch genauer umfasst dieses Gen 8 Exons, 7 Introns und ein nicht translatiertes 3'-Ende; die 8 Exons entsprechen jeweils: Exon 1: der Signalsequenz, Exon 2: der extrazellulären Domäne α1, Exon 3: der extrazellulären Domäne α2, Exon 4: der extrazellulären Domäne α3, Exon 5: der transmembranen Region, Exon 6: der cytoplasmischen Domäne I, Exon 7: der cytoplasmischen Domäne II (nicht translatiert), Exon 8: der cytoplasmischen Domäne III (nicht translatiert) und der nicht translatierten Region 3' (Geraghty et al., vostehend erwähnt, ELLIS et al., J. Immunol., 1990, 144, 731–735; KIRSZENBAUM M. et al., Oncogency of hematopoiesis. A plastic anemia Eds. E. Gluckman, L. Coulombel, Colloque IN-SERM/John Libbey Eurotext Ltd.). Das Gen HLA-G unterscheidet sich jedoch von anderen Genen der Klasse I darin, dass das Codon des Translationsabbruchs in der Phase auf dem Niveau des zweiten Codons des Exons 6 lokalisiert ist; als Konsequenz daraus, ist die cytoplasmische Region des durch dieses HLA-6.0 Gen codierten Proteins beträchtlich kürzer als diejenige der cytoplasmischen Region der Proteine HLA-A-, -B und -C.
Diese HLA-G Antigene werden im Wesentlichen durch die cytotrophoblastischen Zellen der Plazenta exprimiert und es wird angenommen, dass sie eine Rolle bei dem Schutz des Fötus (Fehlen der Abstoßung durch die Mutter) spielen. In dem Ausmaß, wie das HLA-G Antigen monomorph ist, kann es außerdem ebenfalls in das Wachstum oder in die Funktion der Plazentazellen einbezogen sein (KOVATS et al., Science, 1990, 248, 220–223).
Andere Forschungen betreffend dieses nicht klassische Antigen der Klasse I (ISHITANI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 3947–3951) haben gezeigt, dass das primäre Transkript des HLA-G Gens auf verschiedene Arten gespleißt werden kann und wenigstens 3 verschiedene reife mRNA erzeugt: das primäre Transkript von HLA-G liefert eine vollständige Kopie (G1) von 1200 pb, ein Fragment von 900 pb (G2) und ein Fragment von 600 pb (G3).
Das G1 Transkript umfasst nicht das Exon 7 und entspricht der von ELLIS et al. (vorstehend erwähnt) beschriebenen Sequenz, d. h. dass es ein für Protein codiert, das eine Signalsequenz umfasst, drei externe Domänen, eine Transmembranregion und eine cytoplasmische Sequenz. Die G2 mRNA umfasst nicht das Exon 3, d. h. dass es für ein Protein codiert, in dem die Domänen α1 und α3 direkt verbunden sind; die mRNA G3 enthält weder das Exon 3 noch das Exon 4, d. h. dass es für ein Protein codiert, bei dem die Domäne α1 und die Transmembransequenz direkt verbunden sind.
Die Spleißung, die für das Erhalten des HLA-G2 Antigens maßgeblich ist, hat die Verbindung eines Adenins (A) (das von der Domäne stammt, die für α1 codiert) mit einer AC-Sequenz (die von der Domäne stammt, die für α3 codiert) zur Folge, was die Erzeugung eines AAC (Asparagin) Codons anstelle des GAC (Aspartinsäure) Codons zur Folge hat, die am Anfang der Sequenz, die für die Domäne α3 in HLA-G1 codiert, angetroffen wird.
Die für das Erhalten von HLA-G3 erzeugte Spleißung ruft keine Bildung eines neuen Codons in der Spleißungszone hervor.
Die Autoren dieses Artikels haben ebenfalls die verschiedenen exprimierten Proteine untersucht: die 3 mRNA werden in der Zelllinie 221-G in das Protein translatiert.
Moreau et al. (C. R. Acad. Sci., Sciences de la vie/Lifesciences, 1995; 318: 837–842) beschreiben (siehe Seiten 838 und 839, Materialien und Methoden) ein Verfahren zur Er stellung eines Transkriptionsprofils von HLA-G, was auf der Extraktion von RNA von Zellen des menschlichen Fötus beruht, gefolgt von der inversen Transkription und der Amplifikation von spezifischen Teilstücken des HLA-G (Tabelle 1). Die erhaltenen Fragmente werden mittels Elektrophorese analysiert und erlauben es, das HLA-G Transkriptionsprofil von fötalen Zellen zu identifizieren.
Yang et al. (The Journal of Immunology, 1996, 156: 4224–4231) beschreiben (siehe Seiten 4225, Materialien und Methoden) ein immunohistochemisches Verfahren, das den Nachweis der Expression des HLA-G Antigens auf cytotrophoblastischen Zellen durch einen monoklonalen Antikörper erlaubt.
Rouas et al. (PNAS, Vol. 94, S. 5249–5254, 1997) beschreibt (siehe Seiten 5250, zweite Spalte, zweiter Absatz) ein Verfahren zum Nachweis der HLA-G1 und HLA-G2 Antigene durch Immunopräzipitation, die mit durch Transfektion transformierten und HLA-G1 oder HLA-G2 exprimierenden Zellen durchgeführt wurde.
Einige der Erfinder haben die Existenz anderer gespleißter Formen der mRNA von HLA-G gezeigt: das HLA-G4 Transkript, das nicht das Exon 4 einschließt; das HLG-G6 Transkript, das das Intron 4 zwischen den Exons 4 und 5 einschließt, die somit eine Modifizierung des Leserahmens während der Translation dieses Transkripts hervorrufen und insbesondere beim Auftauchen eines Stoppcodons nach der Aminosäure 21 des Introns 4; und das HLG-G6 Transkript, das das Intron 4 aufweist, jedoch das Exon 3 verloren hat (KIRSZENBAUM M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 4209–4213; Europäische Patentanmeldung EP 0 677 582; KIRSZENBAUM M. et al., Human Immunol., 1995, 43, 237–241; MOREAU P. et al., Human Immunol., 1995, 43, 231–236); sie haben ebenfalls gezeigt, dass verschiedene Transkripte in verschiedenen menschlichen fötalen und erwachsenen Zellen exprimiert werden, insbesondere in Lymphozyten (KIRSZENBAUM M. et al., Human Immunol., 1995, wie vorstehend erwähnt; MOREAU P. et al., Human Immunol., 1995, wie vorstehend erwähnt).
Einige der Erfinder haben ebenfalls gezeigt, dass die NK Zellen kein HLA-G Transkript exprimieren (TEYSSIER M. et al., Nat. Immunol., 1995, 14, 262–270; MOREAU P. et al., Human Immunol., 1997, 52, 41–46).
Es existieren daher wenigstens sechs verschiedene HLA-G mRNAs, die potenziell für 6 proteinische Isoformen von HLA-G codieren, von denen 4 Membranformen sind (HLR-G1, G2, G3 und G4) und 2 löslich (G5, G6).
Obwohl der Fötus als ein Semiallotransplantat betrachtet werden kann, überleben die fötalen Zellen und werden nicht von der Mutter abgestoßen; es scheint, dass die HLA-G Moleküle, die auf der Oberfläche von Trophoblasten exprimiert werden, die Fötuszellen vor der Lyse durch die mütterlichen natürlichen Killerzellen (NK) der uterinen Decidua und des umgebenden Blutes schützen (CAROSELLA E. D. et al., C. R. Acad. Sci. 318, 827–830; CAROSELLA E. D, et al., Immunol. Today, 1996, 407–409; ROUAS-FREISS N. et al., PNAS, 1997, 94, 5249–5254).
Frühere Studien haben gezeigt, dass die Expression von HLA-G Molekülen auf der Oberfläche von transfizierten Zielzellen, die den Schutz dieser Zielzellen vor der Lyseaktivität der NK Zelle der decidualen Schicht des mütterlichen Endometriums ermöglichen (CHUMBLEY G. et al., Cell. Immunol., 1994 155, 312–322; DENIZ G. et al., J. Immunol., 1994, 152, 4255–4261; ROUAS-FREISS N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, 94; 5249–5254). Es ist anzumerken, dass einige Zielzellen durch Transfektion mit Vektoren erhalten werden, die entweder die genomische DNA von HLA-G umfassen, und potenziell alle alternativen Transkripte erzeugen, oder mit Vektoren, die die cDNR von HAL-G1 und HLA-G2 enthalten, die für die proteinischen Isoformen HLA-G1 und HLA-G2 codieren (europäische Patentanmeldung Nr. 0 677 582 und die Anmeldung PCT/FR98/00333).
Die NK Zellen exprimieren die Rezeptoren der CMH Moleküle der Klasse I (Killer Inhibitory Receptors oder KIR oder NKIR für die NK Inhibitorrezeptoren), die für die Inhibierung der Cytotoxizität verantwortlich sind, während die HLA-Moleküle, die als Liganden fungieren, von den Rezeptoren erkannt werden; beispielsweise haben N. ROUAS-FREISS et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, 94, 5249–5254) gezeigt, dass die Expression des HLA-G die Zielzellen K562 (erythroleukämische menschliche Zelllinie), die durch die Isoform HLA-G1 und G2 transfiziert sind vor der Lyse schützt. Diese Zellen reagieren im Allgemeinen empfindlich auf die NK-Zellen.
Diese Ergebnisse bestätigen die fundamentale Rolle des HLA-G Moleküls als Immunotoleranzantigen. Diese Ergebnisse wurden auf die Gesamtheit der Membranisoformen ausgedehnt. Die cDNA, die für die Isoformen HLA-G1, G2, G3, G4 codieren und die nach der Transfektion in verschiedenen Zelltypen exprimiert wurden, und insbesondere die K562-Zellen und die transfizierten M8 Tumorzellen inhibieren die cytotoxischen NK und CTL Funktionen.
In Anbetracht der wichtigen Rolle, die das HLA-G Molekül spielen kann, haben die Erfinder unter Fortführung ihrer Arbeiten insbesondere die Tumorzellen studiert, und haben sich insbesondere als Ziel gesetzt, Auswahlwerkzeuge für solide Tumore zur Verfügung zu stellen, die auf eine Behandlung ansprechen, die die HLA-G Antigene inhibiert, die insbesondere in verschiedenen Tumoren vorhanden sind.
Die vorliegende Erfindung hat als Ziel, ein Verfahren zur Feststellung des Transkriptionsprofils von HLA-G eines soliden Tumors im Hinblick auf die Auswahl einer auf den Tumor abgestimmten Behandlung und/oder im Hinblick auf die Überwachung der Entwicklung dieses Tumors, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst:

(i) die Extraktion von mRNA ausgehend von einer Tumorprobe; man kann insbesondere eine Methode verwenden, die von Chomczynski und Sacchi modifiziert wurde, unter Verwendung des RNR NOW Reaktivs (Ozyme, Frankreich);
(ii) die reverse Transkription (RT) der RNA;
(iii) aufeinander folgende oder gleichzeitige Amplifikationen der in (ii) erhaltenen cDNAs in Anwesenheit von Primern, die für jede HLA-G-Isoform spezifisch sind und Analyse der erhaltenen Amplifikationsprodukte durch Elektrophorese und/oder spezifische Hybridisierung und
(iv) die Feststellung des Transkriptionsprofils der Membran und löslichen Isoform von HLA-G der Probe.

Vorzugsweise werden die reversen Transkriptionen mit Oligo-dT Primern auf der mRNA durchgeführt, die vorher denaturiert wurde, beispielsweise bei 65°C in Gegenwart einer reversen Transkriptase wie die reverse M-MLV Transkriptase (Gibco-BRL, Life Technologies).
Die Amplifikation der cDNA wird insbesondere ebenfalls bevorzugt durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt unter Verwendung von spezifischen Primern der verschiedenen HLA-G-Isoformen, entsprechend den nachfolgenden Tabellen:
Die Erfinder haben überraschenderweise gefunden, dass wenigstens bestimmte solide Tumore das HLA-G Antigen exprimieren und haben weiter gezeigt, dass dieses HLA-G-Antigen eine funktionelle Rolle beim Schutz der Tumorzellen (solide Tumore) bei der Zerstörung durch die NK-Zellen spielt. Sie haben weiterhin das effektive Vorhandensein von bestimmten HLA-G-Isoformen auf der Oberfläche der Tumorzellen gezeigt.
Jedoch wurde ebenfalls überraschenderweise gefunden, dass gemäß den Tumorlinien das HLA-G-Profil (Transkripte und Proteine) verschieden ist.
Beispielsweise kann man in verschiedenen Melanomlinien das Vorhandensein der HLA-G2/G4 und G3-Isoformen beobachten, die diese Linien vor der Zelllyse schützen, die durch die NK-Zellen induziert wird, wie es die Isoform HLA-G1 in anderen Linien ebenso macht.
In anderen Linien wird die Gesamtheit der HLA-G-Transkripte nachgewiesen. Die proteinische HLA-G1 Form wird durch Immunofluoreszenz mit einem anti-HLG-G-Antikörper nachgewiesen und inhibiert die NK-Lyse.
Die Analyse von Biopsinen von Patienten, die an Melanomen leiden, zeigt einen erhöhten Gehalt der HLA-G1-Transkripte in bestimmten Tumoren an (primitiven und Metastasen), der mit einer starken Expression des HLA-G1-Proteins verknüpft ist, die mittels Immunohistochemie auf gefrorenen Schnitten mit einem anti-HLA-G1-Antikörper nachgewiesen werden können.
Diese Transkription und erhöhte HLA-G Expression ist für ein Tumorgewebe spezifisch und kann nicht in einem gesunden Gewebe nachgewiesen werden.
In verschiedenen Melanomen beobachtet man eine Dissoziierung der Transkription der löslichen Isoformen (G5) von den Membranformen. Die Analyse der Patienten offenbart 4 Transkriptions- und Expressionsprofile von HLA-G.
Die Expression des löslichen Proteins wird immunohistochemisch bei Patienten, die das Profil P4 aufwiesen, nachgewiesen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Feststellung des Expressionsprofils der Membran und der löslichen Isoform von HLA-G eines soliden Tumors im Hinblick auf die Auswahl einer auf diesen Tumor abgestimmten Behandlung und/oder im Hinblick auf die Überwachung dieses Tumors, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst:

(i) die Herstellung eines histologischen Schnitts ausgehend von einer Tumorprobe,
(ii) die Markierung der Zellen der in (i) erhaltenen Probe mit für die Membran- und die lösliche Isoform von HLA-G spezifischen Antikörpern und
(iii) die Feststellung des Expressionsprofils der Membran und der löslichen Isoform von HLA-G der Probe mittels Nachweis der markierten Zellen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Feststellung des Expressionsprofils der Membran und der löslichen Isoform von HLA-G eines festen Tumors im Hinblick auf die Auswahl einer auf den Tumor abgestimmten Behandlung und/oder im Hinblick auf die Überwachung der Entwicklung dieses Tumors, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst:

(i) gegebenenfalls die Markierung der Zellen einer Tumorprobe,
(ii) die Lyse der Zellen einer Tumorprobe,
(iii) das In-Kontakt-Bringen der lysierten Zellen mit verschiedenen Antikörpern, die gegen die HLA-Antigene der Klasse I gerichtet sind, um gegebenenfalls HLR-G-Isoform/Antikörper-Komplexe zu erhalten, und
(iv) die Feststellung des Expressionsprofils der Membran- und der löslichen Isoform von HLA-G der Probe mittels Nachweis der im Schritt (iii) gebildeten Komplexe.

Vorzugsweise erhält man im Schritt (iii) die Immunopräzipitate, die im Schritt (iv) durch Elektrophorese separiert werden, die membrantransferiert und nachgewiesen werden.
Erfindungsgemäß sind die Antikörper vorzugsweise monoklonale Antikörper.
Die Suche nach einer Expression des HLA-G durch bestimmte Tumorzellen und/oder Zellen, die den Tumor infiltrieren (Makrophagen, dendritische Zellen) erlaubt es besser, die Art der potenziell wirksamen Behandlung zu bestimmen.
Insbesondere ist die Kenntnis des Transkriptionsprofils der Expression von HLA-G eines festen Tumors wesentlich zur Aus wahl der bestmöglichen Behandlung und folgt der Evolution des Tumors in Abhängigkeit von der Behandlung.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls einen Antitumorimpfstoff, der an die Verwendung in soliden Tumoren angepasst ist, die mindestens eine Isoform von HLA-G exprimieren, dadurch gekennzeichnet, dass er ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus autologen Tumorzellen oder einem löslichen HLA-G5-Antigen oder einem Fragment davon, wobei diese Impfstoffe die Bildung von cytotoxischen T-Lymphozyten hervorrufen, die auf Tumoren und Anti-HLA-G-Antikörper spezifisch sind.
Während der Impfstoff aus autologen Zellen besteht (insbesondere Tumorzellen des zu behandelnden Individuums und die wenigstens einer Isoform des HLA-G exprimieren) werden diese Zellen bevorzugt derart modifiziert, dass sie die Herstellung von Anti-HLA-G-Antikörpern wirksam induzieren. Die Zellen werden beispielsweise einer Chlosterinbehandlung oder einer Druckkammerbehandlung unterzogen.
Vorteilhafterweise ist das lösliche HLA-G oder ein Fragment davon an ein geeignetes Protein gekoppelt und gegebenenfalls mit einem Adjuvans zusammengebracht wird, wie beispielsweise Aluminiumhydroxid oder Calciumphosphat.
Dieser Impfstoff wird vorzugsweise subkutan oder intradermisch verabreicht.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls eine Antitumorzusammensetzung die in soliden Tumoren verwendet werden kann, die wenigstens eine HLA-G-Isoform exprimieren, dadurch gekenn zeichnet, dass sie im Wesentlichen aus einem Anti-HLA-G-Antikörper besteht (passive Immunotherapie).
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls eine antitumorale Zusammensetzung, die in der Lage ist, in festen Tumoren verwendet zu werden, die wenigstens eine HLA-G-Isoform exprimieren, dadurch gekennzeichnet, dass sie im Wesentlichen aus wenigstens einem Regulationsfaktor für die Transkription und/oder Expression der HLA-G besteht.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Zusammensetzung, ist der Regulationsfaktor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Regulationsfaktoren, die mit Hilfe des vorstehend definierten Verfahrens erhalten werden, den Antagonisten der HLA-G-Aktivierungsmittel, die durch die Erfinder identifiziert wurden [Interleukin 10, Glukocorticoide, Interferone, Stresswirkungen (Bestrahlungen, thermischer Schock, Schwermetalle, oxidativer Stress)], Antisense-Nukleinsäuren und die hormonellen Inhibitoren der Transkription und/oder Expression dieser HLA-G.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Produkte, die Anti-HLA-G-Antikörper enthalten und Regulationsfaktoren der Expression der HLA-G als Kombinationsprodukte für eine gleichzeitige Verwendung, getrennt oder gleichzeitig bei der Behandlung von festen Tumoren, die wenigstens eine HLA-G-Isoform exprimieren.
Die Regulationsfaktoren sind nachstehend definiert:
Neben den vorhergehenden Ausführungsformen umfasst die Erfindung noch weitere Ausführungsformen, die aus der nachfolgenden Beschreibung, die sich auf die Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung und ebenso auf die beigefügten Zeichnungen bezieht ersichtlich sind, worin:
1 folgendes veranschaulicht:
(A): die PCR-RT-Analyse der mRNA der HLA-G-Isoformen in den Melanomzellen. Die pan-HLA-G-Primer [Primer G.257 (Exon 2) und 3G.U (nicht translatiertes 3'-Ende)] werden für die PCR-Amplifizierung der HLA-G-Transkripte verwendet, die verschiedenen Isoformen entsprechen, die unter HLA-G bekannt sind. Die cDNA der choriokarzinomen JIEG-3-Zellen, der Trophoblasten des ersten Trimesters (TRO) und der einkernigen Zellen des Umgebungsblutes (PBMC) werden entsprechend für die erhöhten Transkriptionsgehalte und die basalen HLA-G-Transkriptionsgehalte als Kontrollzellen verwendet. IGR, M8, DRAN und M74 entsprechen der Amplifizierung der cDNA der Melanomzelllinien. Die spezifischen HLA-G-Banden werden durch Hybridisierung mit einer GR-spezifischen Sonde offenbart, die im Bereich des Exon 2 lokalisiert ist. Die entsprechenden Banden für die HLA-G1, G2, G3, G4 und GS-Transkripte werden durch die Pfeile angezeigt. Die PCR-Produkte, die während der gleichen Reaktion mit den Primern des β-Actins coamplifiziert werden, werden auf der gleichen Membran mit Hilfe eines β-Actin Primers nachgewiesen;
(B): diese Abbildung entspricht dem PCR-RT-Nachweis der alternativen Transkripte in Melanomzellen. Der Primer 3 ist für HLA-G2 und löslicher HLA-G2 (G6), die nicht das Exon 3 aufweisen isoformspezifisch. Der Primer 3.4 erlaubt es, die Transkripte der mRNA HLA-G4 zu unterscheiden. Die Primer G.526 und 14b amplifizieren spezifisch das HLA-G5-Transkript, das der löslichen Form entspricht. Die PCR-Produkte, die in der gleichen Reaktion mit den Teilen β-Actins amplifiziert werden, werden auf der gleichen Membran durch einen spezifischen Primer für β-Actin nachgewiesen sind;
(C): die Abbildung entspricht der PCR-RT-Analyse von mRNA HLA-G in Melanomzellen. Die pan-HLA-G-Teile [Teil G.257 (Exon 2) und 3G.U (das nicht über das 3'-Ende)] werden für die PCR-Amplifizierung der HLA-G-Transkripte, die verschiedenen Isoformen, die unter HLA-G bekannt sind, verwendet. Die cDNA der Choriokarzinomzellen JEG-3 werden als Kontrollzellen für den erhöhten Transkriptionsspiegel verwendet. IGA, M8 und DRAN entsprechen der Amplifizierung der cDNA der Melanomzelllinien. Die spezifischen HLA-Banden werden durch Hybridisierung mit einer GR-spezifischen Sonde offenbart, die im Bereich des Exons 3 lokalisiert ist. Die entsprechenden Banden für die HLA-G1, G2, G3, G4 und G5-Transkripte werden durch die Pfeile angezeigt. Die PCR-Produkte, die während der gleichen Reaktion coamplifiziert sind, mit den Teilen des β-Actins werden von der gleichen Membran mit Hilfe einer β-Actinsonde nachgewiesen.
2 veranschaulicht die PCR-RT-Analyse von mRNR von Isoformen von HLA-G in Biopsien der Melanommetastasen (in vivo und ex vivo Analyse der Haut). Die pan-HLA-G G.257 und 3G.U-Primer werden für die PCR-RT-Amplifikation der HLA-G-Transkripte verwendet, ausgehend von ex vivo Hautmetastasen (MEL) und ausgehend von gesunden Hautbiopsien des gleichen Patienten (H5); JEG-3-Zellen und Trophoblasten des ersten Tri mesters werden als Kontrolle verwendet (erhöhter Transkriptionsgehalt von HLA-G). Spezifische HLA-G-Banden werden durch Hybridisierung mit einer GR-spezifischen Sonde offenbart, die im Exon 2 lokalisiert ist. Die den Transkripten HLA-G1, G2, G3, G4 und G5 entsprechenden Banden werden durch die Pfeile angezeigt.
3 veranschaulicht den Nachweis der HLA-G1-Proteine in JEG-3-Zellen, aber nicht in den IGR und M8-Melanomzellen mit Hilfe des monoklonalen Antikörper W6/32: die biotinylierten Oberflächenproteine des Melanoms und der JEG-3-Zellen werden mit dem monoklonalen Antikörper W6/32 immunopräzipitiert; die Immunopräzipitate werden durch SDS-PAGE bei 12% getrennt und auf eine Cellulosemembran transferiert. Die Oberflächenmoleküle der Klasse I werden durch Peroxidase nachgewiesen, die mit Streptavidin konjugiert ist.
4 veranschaulicht die Immunopräzipitation von HLA-G-Isoformen der IGR-Melanomzellen durch einen monoklonalen Antikörper, der gegen die schwere Kette des freien HLA-G gerichtet ist und durch die monoklonalen Antikörper 4H84 und HCA2. Die Zellen werden während 30 Minuten markiert, mit spezifischen Antikörpern immunopräzipitiert und die Immunopräzipitate werden durch SDS-PAGE bei 10% analysiert. Der 4H84-Antikörper, der mit der schweren HLA-G Kette reagiert (eine Bande von 39 kDa in den JEG-3-Zellen) weist Kreuzreaktionen mit den schweren Ketten von HLA-A, B und/oder C auf (eine Bande von 45 kDa in allen getesteten Zellen).
5 veranschaulicht:
(A): die Wirkung der HLA-G-Expression im IGR-Melanom in Bezug auf die Empfindlichkeit gegenüber Lyse durch den Klon YT2C2-PR. Die transfizierten K562-Zellen, entweder mit einem einzelnen Vektor, oder mit dem HLA-G1-Vektor der cDNA enthält oder mit dem HLR-G2-Vektor und den M8, M64 und IGR, DRAN Linien werden als Zielzellen verwendet (T). Der YT2C2-PR-Klon wird als wirksame Zelle (E) in einem Verhältnis von wirksamer Zelle/Zielzelle (E/T) von 50/1 verwendet. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz der Lyse ausgedrückt, die während 4 Stunden in einem Freisetzungstest von Chrom 51 aufgezeichnet wurde. Die spontane Freisetzung übersteigt niemals 10% der maximalen Freisetzung. Dieses Experiment wird wenigstens fünfmal durchgeführt und liefert jedesmal die gleichen Ergebnisse;
(B): die Inhibierung der Lyse, die durch den Klon YT2C2-PR induziert wird, wird aufgrund eines "off"-Signals erhalten, das durch die IGR und DRAN-Zellen übermittelt wird. Die M8-Linie wird als Zielzelllinie verwendet (T), die mit Chrom markiert ist. Der YT2C2-PR-Klon wird als wirksame Zelle (E) in einem Verhältnis von E/T von 50 : 1 verwendet. Die IGR-Zellen und DRAN-Zellen werden als Inhibitorzellen in einem Verhältnis von Inhibitorzelle/Zielzelle von 100, 50 und 25 : 1 zugegeben. 0 zeigt an, dass keine IGR-Zelle zu dem Test zugegeben wurde;
(C): die Inhibierung der von den Melanomzellen induzierten Lyse von positiven HLA-G (Zielzellen T). Diese Figur veranschaulicht insbesondere die Auswirkung der HLA-G-Expression durch IGR- und DRAN-Melanomzellen in Bezug auf die Empfindlichkeit der Lyse durch den YT2C2-PR-Klon. Verschiedene Zelllinien B-EBV HLA-G, die negativ sind [HOM(A3, B27, Cw1), BM(A29, B61, Cw12), SPO(A3, B7, Cw7), SWE(A2, B44, Cw5)] werden durch den Klon YT2C2-PR lysiert. Dieser Klon wird als wirksame Zelle (E) in einem Verhältnis von E/T von 50/1 verwendet. Die Ergebnisse werden als der Prozentsatz der Lyse ausgedrückt, die während 4 Stunden in einem Freisetzungstest von Chrom 51 aufgezeichnet wurde. Die spontane Freisetzung übersteigt niemals 10% der maximalen Freisetzung;
(D) und (E): diese Figuren zeigen, dass die M8 negativen HLA-G-Tumorzellen, die durch cDNA transfiziert sind und die für die Moleküle G1, G2, G3, G4 codieren, die NK-Lyse inhibieren (5E) und die T-cytotoxischen Reaktionen (5D). 5D umfasst an der Abszisse die Verhältnisse der wirksamen-Zellen (E) (HLA-A2-Linien, die spezifisch auf ein Grippepeptid beschränkt sind)/Zielzellen (T) (transfizierte M8-Linien) und auf der Ordinate den Prozentsatz der spezifischen Lyse. Die nachfolgende Tabelle entspricht den aus dieser Abbildung erhaltenen Werten.
5E umfasst in der Abszisse die Verhältnisse der effektiven Zellen (E) (Klon YT2C2-PR)/Zielzellen/T) (transfizierte M8-Linien) und in der Ordinate den Prozentsatz der spezifischen Lyse.
6 veranschaulicht den Nachweis der HLA-G-Transkripte in Biopsien von menschlichen Melanomen. Die PCR-RT- Amplifizierungen unter Verwendung der vorstehend erwähnten G.257- und G.3U-Primer durchgeführt ausgehend von Biopsien gesunder Haut (HS) und von gesunden lymphatischen Ganglionen (HLN) einerseits und von Biopsien von Metastasen der lymphatischen Ganglionen (LNM1 und LNM2) andererseits. Die Choriokarzinomzellen JEG-3 werden als Kontrollzellen für das Ausmaß der erhöhten Transkription verwendet. Die spezifischen HLA-G-Banden werden durch Hybridisierung einer GR-spezifischen Sonde angezeigt, die auf dem Niveau des Exon 2 lokalisiert ist. Die entsprechenden Banden der Transkripte HLA-G1, G2, G3, G4 und G5 werden durch Pfeile angezeigt. Die coamplifizierten Produkte der PCR, die während der gleichen Reaktion mit den β-Actin Primern entstehen, werden auf der gleichen Membran mit Hilfe eines β-Actin Primers nachgewiesen.
7 veranschaulicht die PCR-RT-Analyse der HLA-G-Transkripte in den Biopsien von primitiven Tumoren von Melanomen und in primären, von MPP5 abgeleiteten Zellkulturen (ex vivo Analyse). Die pan-HLA-G-Primer, wie sie vorstehend erwähnt wurden, werden für die Amplifikation ausgehend von Biopsien gesunder Haut (H51), von primären Hauttumoren (SPT1) und von Regressionstumoren (R1) verwendet, die vom gleichen Patienten ausgehend von primären Zellen, die von einem tumoralen Gewebe der Haut (MPP5) abgeleitet wurden. Die MPP5-Zellen der Biopsie SPT1 weisen ähnliche HLA-G-Transkripte auf. JEG-3-Zellen werden als Kontrollen für erhöhte Gehalte der HLA-G-Transkription verwendet. Die HLA-G spezifischen Banden werden durch Hybridisierung mit einer GR-spezifischen Sonde, die im Exon 2 lokalisiert ist, veranschaulicht. Die Banden entsprechen den HLA-G1, G2, G3, G4 und G5-Transkripten und werden durch Pfeile angezeigt. Die coamplifizierten PCR-Produkte der gleichen Reaktion mit den β-Actin Primern werden auf der gleichen Membran durch eine auf β-Actin spezifische Sonde nachgewiesen.
8 veranschaulicht:
(A) den spezifischen Nachweis der HLA-G5-Transkripte durch RT-PCR in Melanombiopsien. Die Amplifikation des HLA-GS-Transkripts ausgehend von gesunden lymphatischen Ganglionen (HLN) eines primären Hauttumors (SPT1) und von zwei Biopsien von Metastasen der lymphatischen Ganglionen (LNM1 und LNM2) wird mit Hilfe der Primer G.256 und G.i4b realisiert. Die für den HLA-G5-Transkript entsprechende Bande wird durch Hybridisierung mit einem 14F-Primer nachgewiesen, der im Intron 4 lokalisiert ist; die JEG-3-Zellen werden als Kontrollen verwendet (erhöhter Transkriptionsspiegel von HLA-G5). Die dem Transkript HLA-G5 entsprechende Bande wird durch Pfeile angezeigt. Die in der gleichen Reaktion mit den β-Actin Primern coamplifizierten PCR-Produkte werden auf der gleichen Membran durch eine auf β-Actin spezifische Sonde nachgewiesen.
(B) immunohistochemische Analyse der Expression der löslichen HLA-G in der LNM1-Biopsie. Die Schnitte der eingefrorenen mittels Aceton fixierten LNM1-Biopsie werden positiv mit Antikörpern des Antimelanoms HMB45 (DAKO) gefärbt und mit dem Antikörper Anti-HLA-G löslich 16G1, während die negative Kontrolle sich nicht unter Verwendung des Peroxidasesystems Anti-Maus Envision (DAKO) und AEC als Substrat verfärbt.
Es versteht sich jedoch, dass die Beispiele nur zur Veranschaulichung des Gegenstandes angegeben sind und dass sie in keinster Weise eine Beschränkung darstellen.
Beispiel 1: Analyse der HLA-G-Profile verschiedener Tumorlinien und Studie der Lyseinhibierung durch NK-Zellen
A MATERIALIEN UND METHODEN
1. Zelllinien
Die erythroleukämische menschliche K562 (ATCC) Zelllinie und die T-leukämische nicht reife Zelllinie (YT2C2-PR-Klon) mit NK Aktivität werden in einem RPMI 1640 Milieu gehalten, ergänzt mit einem 10%igen Serum eines Kalbsfötus, durch Hitze inaktiviert, mit L-Glutamin 2 mM, Gentamicin mit 1 μg/ml und Fungizone (Sigma, Saint-Quentin, Frankreich) versetzt und bei 37°C in einem Inkubator kultiviert und in einer Atmosphäre, die mit 5% CO₂ angereichert ist befeuchtet. Die K562-Transfektionsprodukte werden in einem Milieu ausgewählt, das einen Geneticingehalt von 1 mg/ml enthält (G418 Sulfat, Sigma).
Die menschliche Choriokarzinome HLA-G positive Zelllinie, die als JEG-3 bezeichnet wird (ATCC)) wird in einem DMEM (Sigma) Milieu kultiviert, ergänzt durch 10%iges Kalbsserum, durch Hitze, Antiobiotika und durch 2 mM L-Glutamin inaktiviert. Die Zelllinien enthalten keine Mycoplasmen.
Neben den vorerwähnten Linien verwendet man:

– Melanomlinien IGR (HLA-A2, A3, B58/männlich), M74 (HLA-A1, A2, B8, V14/weiblich), M8 (HLA-A1, A2, B12 und B40/männlich) und DRAN (HLA-A2, A3, B7, B35, CW5, CW7),
– trophoblastische Gewebe des ersten Trimesters, die nach IVG erhalten wurden; diese Gewebe werden in feine Lamellen geschnitten und sofort zur Extraktion der RNA verwendet und
– einkernige Zellen des umgebenden Blutes (PBMC), die von gesunden Freiwilligen erhalten wurden und auf einem Dichtegradient von Ficoll-Hypaque 1077 isoliert wurden.

2. Monoklonale Antikörper
Die folgenden Antikörper wurden verwendet:
W6/32: IgG2a, αAntiketten von HLA der Klasse I, die mit β2-m (Sigma) assoziiert sind; HCA2: IgG Anti-HLA-A und G und IgG Anti-HLA-G, 87G, 4H84 und 16G1.
3. RT-PCR
Die Gesamt-RNA wird ausgehend von 10⁷ Zellen mit Hilfe des RNA NOW (Biogentex, Inc.) Reaktivs entsprechend den Empfehlungen des Herstellers extrahiert. Die Qualität der RNA wird durch Elektrophorese auf einem zu 1,5% denaturierten Agraosegel verifiziert. Die cDNA werden ausgehend von 10 μg gesamter RNA hergestellt, die mit DNAse I (Boehringer Mannheim) unter Verwendung eines Oligo-(dT)_12–18-Primers und reverser Transkriptase M-MLV (GIBCO-BRL) behandelt wurde. Die PCR-RT-Amplifikationen der spezifischen HLA-G werden unter Verwendung der folgenden Primer durchgeführt: G.257 (Exon 2) und G3.U (3'UT) (Ishitani A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1992, 89, 3947–3951; Kirszenbaum M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1994, 91, 4209–4213 und Moreau P. et al., C. R. Acad. Sci. 1995, 318, 837–842) zum Nachweis aller Isoformen der mRNA von HLA-G. Eine spezifische Amplifizierung aller Formen von mRNA von HLA-G wird unter Verwendung der nachfolgenden Primer Ensembles durchgeführt:

– G.526 (Exon 3) und G3.U (3'UT) für die G1, G4 und G5-Isoformen;
– G.526 (Exon 3) und G.i4b (Intron 4) für die G5-Isoform;
– G.-3 (umfassend teilweise die 2 und 4 Exons) und G3.U (3'UT) für die G2- und G6-Isoformen;
– G.3–4 (umfassend teilweise die 2 und 5 Exons) und G3.U (3'UT) für die G3-Isoform.

Die cDNA der klassischen HLA der Klasse I werden wie bei King et al. (J. Immunol. 1996, 156, 2068–2076) unter Verwendung eines einzigartigen 5'-HLA-5P2 Primers und dreier 3'-Primer, HLA-3pA, HLA-3pB und HLA-3pC, die jeweils die mRNA HLA-A, HLA-B und HLA-C amplifizieren, amplifiziert.
Die spezifischen DRA-Primer sind bei King et al. – wie vorstehend erwähnt – beschrieben.
Eine Coamplifizierung der cDNA des β-Actins wird bei jedem Experiment durch den Clontech-Test (16 Zyklen) erreicht, indem die Vergleichsmengen von RNA in den Proben bestimmt werden. Die PCR-Produkte werden durch Elektrophorese auf 1% Agaraosegel analysiert und mit Hilfe von Ethidiumbromid gefärbt. Die Spezifität der PCR-Produkte wird durch alkalisches Blotting der Fragmente in NaOH 0,4 N auf Nylonmembran (Hybond N+, Amersham, Frankreich) bestätigt.
Die spezifischen HLA-G-Sonden sind die folgenden:

– GR-spezifisch für Exon 2,
– G.647 F (5'-CCACCACCCTGTCTTTGACT: spezifisch für Exon 4)
– G.i4 F (GAGGCATCATGTCTGTTRGG: spezifisch für Intron 4); und
– G.927 F (5'-ATCATGGGTATCGTTGCTGG: spezifisch für Exon 5).

Die anderen Sonden sind die folgenden:

– spezifische HLA-A Sonde (5'GGAGGACCAGACCCAGGACACG),
– spezifische HLA-B Sonde (5'AGCTCCGATGACCRCAACTGC),
– spezifische HLA-C Sonde (5'TGTCCTAGCTGCCTAGGAG) und
– spezifische HLA-DRA Sonde (TGTGATCATCCAGGCCGAG).

Die Filter werden auf Kodak-Filme (Biomax) mit Amplifikationsschirmen während 4 bis 16 Stunden bei –80°C exponiert.
4. Immunopräzipitation von biotinylierten Oberflächenproteinen und Western Blot
Die Oberflächenproteine werden mit Biotin markiert. Nach dem Waschen in PBS, werden 1,5·10⁷ Zellen in 1 ml kaltem PBS, das 5 ml NHS-SS-Biotin 8 (Pierce, Rockford, IL) enthält, während 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Die aktiven Restgruppen werden in 50 mM NH₄Cl während 10 Minuten bei 4°C inhibiert. Die Zellen werden in 1% Triton X100/PBS lysiert. Die präzipitierten Proteine mit dem Antikörper W6/32 werden auf SDS-PAGE mit 12 getrennt, auf eine Nitrocellulosemembran transferiert und in Gegenwart eines Peroxidasekonjugats aus Meerrettich-Streptavidin aufgetragen. Nach ausführlichem Waschen der Membran, wird die Farbreaktion unter Verwendung eines Detektions reaktivs für Western Blotting ECL (Amersham, Frankreich) durchgeführt, nachdem die Membran einem Kodak-Film bei Raumtemperatur ausgesetzt wurde.
5. Cytotoxizitätsversuche
Die cytolytische Aktivität der Mononukleinzellen des Umgebungsblutes der NK-Zellen und der YT2C2-PR-Zellen (wirksame Zellen oder E) gegenüber HLA-G-Transfektionsprodukten (Zielzellen oder T) wird mit Hilfe von Freisetzungstests von Chrom 51 während 4 Stunden bestimmt, wobei die wirksamen Zellen mit 5·10³ Zielzellen, die mit Chrom 51 markiert sind, gemischt werden (100 μCi von ⁵¹Cr-Natriumchromat, Amersham, UK) mit verschiedenen Verhältnissen von E/T in Mikrotiterplatten, bei denen Mikrotiterplatten am unteren Ende eine U-Form besitzen.
Nach 4 Stunden bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator der 5 CO₂ enthält, werden 100 μl des Überstehenden, für die Szintillationszählung in flüssiger Phase (Wallac 1450 Mikrobeta, Pharmacia, Frankreich) entnommen. Der Prozentsatz der spezifischen Lyse wird wie nachfolgend berechnet: Prozentsatz spezifischer Lyse = [(cpm im Experimentgefäß – cpm der spontanen Freisetzung)/(cpm der maximalen Freisetzung – cpm der spontanen Freisetzung)] × 100.
Die spontane Freisetzung wird durch Inkubierung der Zielzellen (T) die mit dem Milieu markiert sind, bestimmt. Die maximale Freisetzung wird durch die Löslichkeit der Zielzellen in HCl 0,1 M bestimmt. In allen Experimenten ist die spontane Freisetzung niedriger als 10% in Bezug auf die maximale Freiset zung. Die Ergebnisse werden als Mittelwerte aus drei Proben dargestellt. In den Experimenten, bei denen die monoklonalen Antikörper dazu verwendet werden, die Wechselwirkung HLA-G-NK zu blockieren, werden die Zielzellen mit dem entsprechenden monoklonalen Antikörper inkubiert, anschließend gewaschen und mit einem Anti-Maus Ziege Antikörper inkubiert F(ab')₂ (Jackson Immuno-research, USA), um die abhängige zelluläre Cytotoxizität der Antikörper (ADCC) durch Wechselwirkung der Rezeptoren für das Fragment Fc der Immunoglobuline zu vermeiden, die auf den NK-Zellen mit dem ersten verwendeten Antikörper exprimiert werden. Die Toxizität der monoklonalen Antikörper wird ebenfalls in jedem Versuch verifiziert und ist jedes Mal niedriger als 3%.
II. Ergebnisse
1. Identifizierung der verschiedenen HLA-G-Transkripte in Melanomzelllinien
Die cDNAs von HLA-G von 4 Melanomzelllinien (IGR, M8, M74 und DRAN) werden mit Hilfe der vorstehend beschriebenen Primer amplifiziert (A. Ishitani et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 3946–3951; M. Kirszenbaum et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 4209–4213), die von spezifischen Sequenzen des Exons 2 der nicht translatierten 3'-Region abgleitet sind (siehe Material und Methoden) (1).
Die Choriokarzinomlinie JEG-3 und die trophoblastischen Zellen, die erhöhte Spiegel der HLA-G-Transkripte aufweisen, werden als positive Nachweise verwendet und die Einkernzellen des peripheren Bluts (PBMC) gesunder Freiwilliger werden als nega tive Kontrollen verwendet (niedrige Gehalte an HLA-G-Transkripten).
Die Hybridisierung der PCR-Produkte ermöglichten die Identifikation wichtiger mRNA Gehalte von HLA-G in zwei Melanomzellen, insbesondere von IGR und M74, während kein einziges Signal in der Zelllinie des M8-Melanoms nachgewiesen werden kann.
In JEG-3-Zellen und den Trophoblasten werden alle HLA-G-Transkripte nachgewiesen (1A und 1C).
In den IGR- und DRAN-Melanomzellen werden alle Transkripte ebenfalls durch die pan-HLA-G-Primer nachgewiesen (1A).
Jedoch erlauben es die pan-HLA-G-Primer nicht, zwischen den HLA-G1- und HLA-G5-Signalen zu unterscheiden, die beide auf dem Niveau einer Bande, die 1000 pb entspricht vorhanden sind, und noch zwischen den HLA-G2-Signalen und HLA-G1, die in Form eines Fragments von 600 pb mitwandern. Eine PCR-RT-Identifizierung erlaubt es, die Isoformen mit Hilfe von spezifischen Primern zu isolieren (P. Moreau et al., C. R. Acad. Sci., 1995, 318, 837–842) (siehe Material und Methoden).
Die IGR- und DRAN-Zellen exprimieren alle Isoformen von HLA-G in Form von Transkripten, HLA-G4 und HLA-G5 wurden in geringen Mengen exprimiert (1B).
In der Zelllinie des Melanoms M74 weisen die pan-HLA-G-Primer entsprechende Banden für HLA-G1 und HLA-G5 (1000 pb) (intensive Signale) nach, ein Signal für HLA-G2 und G4 (600 pb), jedoch kein Signal für HLA-G3 (300 pb) (1A). Die Primer für die spezifischen Isoformen offenbaren, dass diese Zellen der Isoformen von G1 und G4 in PBMC vorherrschen, während die Transkriptionsgehalte von G5 mit denjenigen, die in PBMC beobachtet wurden, vergleichbar sind.
Geringe Gehalte an mRNA HLA-G2 und HLA-G6 (lösliche Form von HLA-G2) wurden in M74-Zellen nachgewiesen, während eine spezifische Amplifikation des HLA-G3-Transkripts die Abwesenheit von HLA-G3 bestätigt, die bei den pan-HLA-G Primern in den Zellen beobachtet wird (1A und 1B).
Es wurde kein Hybridisierungssignal von HLA-G in den M8-Zellen beobachtet (1A und 1B).
2. Analyse der HLA-G-Proteine in Melanomzellen
Zum Nachweis, ob die HLA-G Transkripte, die in den Melanomen nachgewiesen wurden durch die Proteine HLA-G translatiert wurden, wurden Immunopräzipitationsstudien mit verschiedenen monoklonalen Antikörpern der Anti-HLA der Klasse I durchgeführt.
Der Vergleich wird in Gegenwart einer positiven Kontrolle (JEG-3-Zelle) und einer negativen Kontrolle (Melanom M8-Zellen) durchgeführt.
Die Immunopräzipitationsergebnisse mit monoklonalen Antikörpern W6/32 sind in 3 veranschaulicht.
Mit den JEG-3-Zellen, immunopräzipitiert der W6/32-Antikörper zwei Proteine von 45 kDa (Molekül HLA-C) und von 39 kDa (Isoform von HLA-G1), die an die Membran gebunden sind.
In den IGR- und M8-Zellen wurde nur ein Protein von 45 kDa nachgewiesen.
Ähnliche Ergebnisse werden durch die Immunopräzipitation von biotinylierten Oberflächenproteinen erhalten (3).
Diese Daten zeigen, dass das HLA-G1-Protein nicht in den IGR-Zellen exprimiert wird, selbst wenn die letzteren die entsprechende mRNA exprimieren.
Jedoch schließt die Abwesenheit des HLA-G1-Proteins in den IGR-Zellen nicht die Expression der drei anderenen Isoformen von HLA-G (HLA-G2, G3 und G4) aus.
Diese Proteine können nicht durch die monoklonalen W6/32-Antikörper offenbart werden, aufgrund ihrer Unfähigkeit sich mit β2m zu assoziieren.
Um diese Proteine genau zu untersuchen wurde die Immunopräziptierung von mit Methionin markierten Proteinen (³⁵S-Methionin) unter Verwendung der monoklonalen Antikörper durchgeführt, die das freie HLA-G erkennen, das denaturierte HLA-G und HLA-A (Antikörper HCA2) und ein Epitop, das im Bereich der Domäne α1 lokalisiert ist, die in allen Isoformen des Proteins HLA-G vorhanden ist (Ig Anti-HLA-G monoklonaler Antikörper).
Der monoklonale Antikörper offenbart die Gegenwart des HLA-G1-Proteins von 39 kDa in den JEG-3-Zellen und DRAN und seine Abwesenheit in den IGR-Zellen (4).
Zusätzliche Banden, die bei 32–34 kDa und bei 18 kDa wandern und der Größe der jeweiligen Proteine HLA-G2 und/oder des HLA-G4 der G3-Proteins entsprechen, werden in den IGR-Zellen nachgewiesen, und zwar sowohl mit dem monoklonalen IGR Anti-HLA-G Antikörper und mit dem HCA2 Antikörper (4).
Weitere Banden, die für das Protein HLA-G spezifisch sind, werden nicht in den M74- und M8-Zellen beobachtet, die die Transkripte der entsprechenden HLA-G nicht aufweisen ( 4).
3. Schutz der IGR-Linie vor Cytolyse die durch NK-Zellen induziert wird
Die YT2C2-PR-Zellen werden als wirksame NK-Zellen verwendet.
Die IGR-Zelllinie, die die Isoformen HLR-G2 und/oder G4 und G4 exprimiert und die DRAN-Linie, die HLA-G2 exprimiert (1) unterdrücken die durch den Klon YR2C2-PR induzierte Lyse.
Die Zelllinie des Melanoms M7, das die klassischen Antigene des CMH der Klasse I exprimiert, jedoch einen selektiven Fehler bei der Transkription und Expression der HLA-G2 und HLA-G3-Isoform aufweist, wird durch den Klon YT2C2-PR lysiert.
Es wird ebenfalls eine Lyse bei der Zelllinie M8 beobachtet, die die klassischen Antigene von CMH der Klasse I exprimiert, die jedoch keine mRNA der HLA-G (1 und 5) transkribiert.
Um zu zeigen, dass nur die HLA-G in dieser Inhibierung der durch die NK-Zellen hervorgerufenen Lyse impliziert sind, werden verschiedene Zelllinien des EBV-B Typus, die keine HLA-G exprimieren, jedoch wenigstens ein HLA-A, B oder C Allel mit der IGR-Linie teilen, als Zielzellen verwendet.
Alle EBV-B-Linien werden durch den YT2C2-PR-Klon lysiert, und dies zeigt, dass die HLA-A, B und C-Antigene beim Schutz der IGR- und DRAN-Melanome vor YT2C2-PR-Lyse (5) keine Rolle spielen.
Um zu zeigen, dass die Inhibierung der durch den Klon YT2C2-PR induzierten Lyse, nicht auf einem Signal beruht, dass durch diese Zelllinie übertragen wird, sondern auf einer intrinsische Widerstandsfähigkeit der IGR-Zellen gegenüber den NK-Zellen, werden die IGR-Zellen, die als Inhibitoren verwendet werden, in einem Cytotoxizitätstest, bei dem die Zielzellen (T) M8-Zellen und YT2C2-PR-Zellen sind, die wirksamen Zellen darstellen.
5B zeigt, dass die IGR-Zellen in effizienter Weise die Lyse der M8-Zellen durch den Klon YT2C2-PR inhibieren; diese Inhibierung ist proportional zur Zahl der IGR-Zellen, die für den Konkurrenztest verwendet wurden.
BEISPIEL 2: Nachweis der Transkripte und der HLA-G-Proteine in Melanombiopsien
A. MATERIAL UND VERFAHREN
1. Tumorproben
Es wurden Biopsien ausgehend von Gewebeproben von Patienten durchgeführt.
Direkt nach der Entnahme wurden die Proben in flüssigen Stickstoff eingefroren und bis zur Extraktion der RNA aufbewahrt.
2. Immunohistochemie
Es wurden Standardmethoden zur Durchführung der Immunohistochemie auf den Schnitten, die ausgehend von Melanombiopsien hergestellt wurden, verwendet, die in Aceton fixiert, mit PBS gewaschen und in normalem Kaninchenserum (DAKO) in PBS blockiert wurden.
Die Proben wurden mit dem primären Antikörper während 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend mit einem sekundären Antikörper (Ig des Kaninchen Anti-Maus Antikörpers, konjugiert mit FITC) (DAKO) inkubiert.
Die Schnitte werden mit einem Kernfarbstoff (DAPI, Sigma) gegengefärbt und in einer entsprechenden Umgebung hergestellt. Die Fluoreszenz wird mit einem konfokalen Mikroskop Io24 MRC (Bio-Rad) analysiert. Die nachfolgenden Antikörper wurden verwendet: W6/32: IgG2a schwere Antiketten von HLA-G der Klasse I, die mit β2-Mikroglobulin (Sigma) und 87G assoziiert sind: IgG2b Anti-HLA-G der das isoforme HLA-G1 nachweist.
Andere Techniken sind mit denjenigen aus Beispiel 1 identisch.
B. ERGEBNISSE
1. Transkriptionsanalyse von HLA-G in Biopsien von ex vivo Melanomen
Alle HLA-G-Transkripte werden in großen Mengen in bestimmten Melanombiopsien nachgewiesen, während nur die Bande bei 1000 pb in der menschlichen gesunden Haut nachgewiesen wird ( 2 und 6). Diese Ergebnisse wurden durch andere Biopsien bestätigt und zeigen, dass die wichtigen beobachteten Transkriptionsgehalte in Melanomzellen spezifisch für die letzteren sind und nicht in einem gesunden Gewebe beobachtet werden können.
Um genauer zu sein, werden erhöhte Gehalte der HLA-G-Transkriptionen auf spezifische Weise in Primärtumoren und in Metastasen nachgewiesen, während die Grundgehalte der HLR-G-Transkripte und eine Abwesenheit der Expression des HLA-G-Proteins in gesunder Haut oder in normalen lymphatischen Ganglionen beobachtet werden (6A).
Die Analyse gesunder Haut (H51), von primären Tumoren der Haut (SP1) und einer Stelle der tumoralen Regression (R1) in einem primären Hauttumor des gleichen Patienten erlaubt den Nachweis eines erhöhten Gehalts der HLA-G-Transkripte und der Expression der Proteingehalte der primären Tumorstelle, während die gesunde Haut und die Stelle der tumoralen Regression Grundgehalte der Transkripte HLA-G und die vollständige Abwesenheit der Expressionsproteine HLA-G1 (7) aufweisen.
Die Primärzellen in der Kultur (MPP5), die vom primären Tumor SP1 abgeleitet sind, weisen ebenfalls erhöhte Gehalte der Transkripte HLA-G (7) auf.
2. Analyse der Transkription von HLA-G- löslich in ex vivo Melanombiopsien
Eine spezifische Amplifizierung der Transkripte (mRNA), die der löslichen HLR-G5-Isoform entspricht, in Biopsien von Melanomen zeigt, dass man erhöhte Gehalte der HLA-G5-Transkripte in bestimmten Biopsien von Melanomen nachweist, bei denen gezeigt wurde, dass sie erhöhte Gehalte der Transkripte enthalten, die bestimmten Membranisoformen von HLA-G entsprechen (8).
Selbstverständlich beobachtet man in anderen Fällen eine Dissoziierung zwischen den Gehalten von HLA-G5 und den Gehalten der anderen Transkripte von HLA-G: in den Biopsien der Melanome, bei denen man vorab erhöhte Gehalte an HLA-A1, G2, G3, G3 und G4 beobachtet hat, beobachtet man keine HLA-G5-Transkripte.
Der primäre Tumor der Haut SP1 und die entsprechenden Zellkulturen MPP5, ebenso wie die Metastasen der lymphatischen Ganglionen LNM2 weisen erhöhte Gehalte des HLR-G-Transkripts auf, die den Isoformen von HLA-G entsprechen, die an die Membran gebunden sind (8), während man keine HLA-G5 Transkripte in der gleichen Probe nachweist.
3. Analyse der Membranproteine und Löslichkeit in den Biopsien von Melanomen
Erhöhte Gehalte der HLA-G-Transkripte sind mit dem spezifischen Nachweis der Expression des HLA-G-Proteins durch einen Anti-HLA-G (Antikörper 87G) monoklonalen Antikörper in Melanombiopsien korreliert. Die immunohistochemische Analyse der HLA-G-Expression ermöglicht in einer Biopsie der metatasischen lymphatischen Ganglionen (LNM2) die Beobachtung einer positiven Markierung von LNM2 sowohl mit dem Antikörper 87G wie mit dem Antikörper W6/32, während die negative Kontrolle, die aus gesunder Haut des gleichen Patienten besteht nicht durch den Anti-HLA-G-Antikörper gefärbt wird.
Zur Verbesserung dieser Studie, erlaubt ein Antikörper, der spezifisch das lösliche HLA-G-Protein nachweist, nämlich der Antikörper 16G1 (Lee et al., Immunity, 1995, 3, 591–600), die Expression des löslichen HLA-G-Proteins in der Biopsie der lymphatischen Ganglion eines Patienten zu zeigen, der erhöhte Gehalte der HLA-G5 (8) Transkripte aufweist.
Die immunohistchemische Analyse erlaubt die Markierung dieser Biopsie, während man keine nachweisbare Expression beobachtet unter Verwendung des gleichen Antikörpers in einer Melanombiopsie eines Patienten, der erhöhte Gehalte von anderen Isoformen von HLA-G aufweist.
Die immunohistochemische Analyse der Expression von HLA-G löslich in der Biopsie LNM2, zeigt, dass die Biopsieschnitte LNM2, die in Aceton fixiert sind, mit einem Antikörper des Antimelanoms HMB45 (DAKO, Glostrup,; SKELTON et al., Am. J. Dermatopathol., 1991, 13, 543–550) positiv gefärbt werden und der lösliche Anti-HLA-G-Antikörper 16G1 ebenso wie die negative Kontrolle nicht gefärbt ist.
Genauso wie das vorstehende beschränkt sich die Erfindung nicht nur auf ihre Ausführungsformen, ihren realisierten Ausführungsformen und ihren Anwendungsformen die genauer beschrieben wurden; sie umfasst im Gegenteil alle Varianten, die auf den Überlegungen eines Durchschnittsfachmanns beruhen ohne den Rahmen und den Umfang der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Claims

Verfahren zur Feststellung des Transkriptionsprofils der Membran- und der löslichen Isoform von HLA-G eines soliden Tumors im Hinblick auf die Auswahl einer auf den Tumor abgestimmten Behandlung und/oder im Hinblick auf die Überwachung der Entwicklung dieses Tumors, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: (i) die Extraktion von mRNA ausgehend von einer Tumorprobe; (ii) die reverse Transkription (RT) der RNA; (iii) aufeinander folgende oder gleichzeitige Amplifikationen der in (ii) erhaltenen cDNAs in Anwesenheit von Primern, die für jede HLA-G-Isoform spezifisch sind, und Analyse der erhaltenen Amplifikationsprodukte durch Elektrophorese und/oder spezifische Hybridisierung und (iv) die Feststellung des Transkriptionsprofils der Membran- und der löslichen Isoform von HLA-G der Probe.
Verfahren zur Feststellung des Expressionsprofils der Membran- und der löslichen Isoform von HLA-G eines soliden Tumors im Hinblick auf die Auswahl einer auf diesen Tumor abgestimmten Behandlung und/oder im Hinblick auf die Überwachung der Entwicklung dieses Tumors, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: (i) die Herstellung eines histologischen Schnitts ausgehend von einer Tumorprobe; (ii) die Markierung der Zellen der in (i) erhaltenen Probe mit für die membran- und die lösliche Isoform von HLA-G spezifischen Antikörpern und (iii) die Feststellung des Expressionsprofils der Membran- und der löslichen Isoform von HLA-G der Probe mittels Nachweis der markierten Zellen.
Verfahren zur Feststellung des Expressionsprofils der Membran- und der löslichen Isoform von HLA-G eines soliden Tumors im Hinblick auf die Auswahl einer auf den Tumor abgestimmten Behandlung und/oder im Hinblick auf die Überwachung der Entwicklung dieses Tumors, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: (i) gegebenenfalls die Markierung der Zellen einer Tumorprobe; (ii) die Lyse der Zellen einer Tumorprobe; (iii) das In-Kontakt-Bringen der lysierten Zellen mit verschiedenen Antikörpern, die gegen die HLA-Antigene der Klasse I gerichtet sind, um gegebenenfalls HLA-G-Isoform/Antikörper-Komplexe zu erhalten, und (iv) die Feststellung des Expressionsprofils der Membran- und der löslichen Isoform von HLA-G der Probe mittels Nachweis der im Schritt (iii) gebildeten Komplexe.
Anti-Tumor-Impfstoff, der an die Verwendung in soliden Tumoren angepasst ist, die mindestens eine Isoform von HLA-G exprimieren, dadurch gekennzeichnet, dass er autologe Tumorzellen umfasst, die mindestens eine Isoform von HLA-G exprimieren.
Lösliches HLA-G5-Antigen oder eines seiner Fragmente zur Verwendung als Anti-Tumor-Impfstoff, der an die Verwendung in soliden Tumoren angepasst ist, die mindestens eine Isoform von HLA-G exprimieren.
Verwendung eines löslichen HLA-G5-Antigens oder eines seiner Fragmente zur Herstellung eines Impfstoffs, der zur Behandlung solider Tumoren, die mindestens eine Isoform von HLR-G exprimieren, bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das lösliche HLA-G5-Antigen oder eines seiner Fragmente mit einem geeigneten Protein gekoppelt und gegebenenfalls mit einem Adjuvans, wie Aluminiumhydroxid oder Calciumphosphat, zusammengebracht wird.
Verwendung eines Anti-HLA-G-Antikörpers zur Herstellung eines Anti-Tumor-Medikaments, das zur Behandlung solider Tumoren, die mindestens eine Isoform von HLA-G exprimieren, bestimmt ist.
Verwendung eines Inhibitors der Transkription und/oder der Expression von HLA-G zur Herstellung eines Anti-Tumor-Medikaments, das zur Behandlung solider Tumoren, die mindestens eine Isoform von HLA-G exprimieren, bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Antagonisten und Aktivierungsmitteln von HLA-G, Antisense-Nucleinsäuren und hormonellen Inhibitoren der Transkription und/oder Expression dieser HLA-G besteht.
Produkte, die Anti-HLA-G-Antikörper und Inhibitoren der Expression von HLA-G enthalten, als Kombinationsprodukte zur gleichzeitigen, getrennten oder zeitlich ausgedehnten Verwendung zur Behandlung solider Tumoren, die mindestens eine Isoform von HLA-G exprimieren.