ES2224603T3 - Procedimiento de seleccion de tumores que expresan hla-g sensibles a un tratamiento anticanceroso y sus aplicaciones. - Google Patents
Procedimiento de seleccion de tumores que expresan hla-g sensibles a un tratamiento anticanceroso y sus aplicaciones.Info
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Abstract
Procedimiento para establecer el perfil de transcripción de las isoformas membranares y solubles de HLA-G de un tumor sólido con vistas a la selección de un tratamiento adaptado a dicho tumor y/o con vistas a la vigilancia de la evolución de dicho tumor, caracterizado porque comprende: (i) la extracción del ARNm, a partir de una muestra tumoral; (ii) la Transcripción Inversa (RT) de dicho ARN; (iii) las amplificaciones sucesivas o concomitantes de los ADNc obtenidos en (ii), en presencia de cebadores específicos de cada isoforma de HLA-G y el análisis de los productos de amplificación obtenidos por electroforesis y/o hibridación específica y (iv) el establecimiento del perfil de transcripción de las isoformas membranares y solubles HLA-G de dicha muestra.
Description
Procedimiento de selección de tumores que
expresan HLA-G sensibles a un tratamiento
anticanceroso y sus aplicaciones.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de selección de tumores que expresan
HLA-G sensibles a un tratamiento anticanceroso, que
inhibe o previene la actividad HLA-G de dichos
tumores sólidos y sus aplicaciones.
Los antígenos del complejo mayor de
histocompatibilidad (CMH), se dividen en varias clases, los
antígenos de clase I (HLA-A, HLA-B y
HLA-C) que presentan 3 dominios globulares
(\alpha1, \alpha2 y \alpha3) y cuyo dominio \alpha3 está
asociado a la \beta2 microglobulina, los antígenos de clase II
(HLA-DP, HLA-DQ y
HLA-DR) y los antígenos de clase III
(complemento).
Los antígenos de clase I comprenden, además de
los antígenos mencionados anteriormente, llamados antígenos de clase
I no clásicos, y particularmente los antígenos
HLA-E, HLA-F y
HLA-G, este último, en particular, se expresa por
los trofoblastos extravillosos de la placenta humana normal y las
células epiteliales tímicas.
La secuencia del gen HLA-G (gen
HLA-6,0) se ha descrito por GERAGHTY et al.,
(Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU, 1987, 84,
9145-9149); Comprende 4396 pares de bases y presenta
una organización intrón/exón homóloga a la de los genes
HLA-A, -B y -C. De manera más precisa, este gen
comprende 8 exones, 7 intrones y un extremo no traducido 3'; los 8
exones corresponden respectivamente a: exón 1: secuencia señal,
exón 2: dominio extracelular \alpha1, exón 3: dominio
extracelular \alpha2, exón 4: dominio extracelular \alpha3, exón
5: región transmembrana, exón 6: dominio citoplasmático I, exón 7:
dominio citoplasmático II (no traducido), exón 8: dominio
citoplasmático (III) no traducido) y región 3' no traducida
(GERAGHTY et al., anteriormente citado; ELLIS et al.,
J. Immunol., 1990, 144, 731-735; KIRSZENBAUM
M. et al., Oncogeny of hematopoyesis. Aplastic anemia Eds. E.
Gluckman, L. Coulombel, Colloque INSERM/John Libbey Eurotext Ltd).
Sin embargo el gen HLA-G difiere de los otros genes
de clase I, en que el codón de terminación de traducción, en fase,
se localiza en el segundo codón del exón 6, por consiguiente, la
región citoplasmática de la proteína codificada por este gen
HLA-6,0 es considerablemente más corta que la de las
regiones citoplasmáticas de las proteínas HLA-A, -B
y -C.
Estos antígenos HLA-G son
esencialmente expresados por las células citotrofoblásticas de la
placenta y se considera que desempeñan un papel en la protección
del feto (ausencia de rechazo por la madre). Además, en la medida en
que el antígeno HLA-G es monomórfico, también puede
estar implicado en el crecimiento o la función de las células
placentarias (KOVATS et al., Science, 1990, 240,
220-223).
Otras investigaciones relativas a este antígeno
no clásico de clase I (ISHITANI et al., Proc. Natl. Acad. Sci
EE.UU, 1992, 89, 3947-3951) han demostrado
que el transcrito primario del gen HLA-G se puede
empalmar de diversas maneras y producir al menos 3 ARNm maduros
distintos: el transcrito primario de HLA-G
proporciona una copia completa (G1) de 1.200 pb, un fragmento de 900
pb (G2) y un fragmento de 600 pb (G3).
El transcrito G1 no comprende el exón 7 y
corresponde a la secuencia descrita por Ellis et al.,
(anteriormente mencionado), es decir, que codifica una proteína que
comprende una secuencia líder, tres dominios externos, una región
transmembrana y una secuencia citoplásmica. El ARNm G no comprende
el exón 3, es decir que codifica una proteína en la cual los
dominios \alpha1 y \alpha3 están directamente unidos; el ARNm G3
no contiene ni el exón 3 ni el exón 4, es decir que codifica una
proteína en la cual el dominio \alpha1 y la secuencia
transmembrana están directamente unidos.
El corte y empalme que prevalece para la
obtención del antígeno HLA-G2 conlleva la unión de
una adenina (A) procedente de un dominio que codifica \alpha1) con
una secuencia AC) derivada del dominio que codifica \alpha3), lo
que conlleva la creación de un codón AAC (asparagina) en lugar del
codón GAC (ácido aspártico), encontrado al inicio de la secuencia
que codifica el dominio \alpha3 en HLA-G1.
El corte y empalme generado para la obtención de
HLA-G3 no conlleva la formación de un nuevo codón en
la zona de corte y empalme.
Los autores de este artículo también han
analizado las diferentes proteínas expresadas: los ARNm se traducen
en proteína en la línea celular 221-G.
Moreau et al. (C.R. Acad. Sci., Sciences
de la vie/Lifesciences, 1999: 318; 837-842) describe
(cf. páginas 838 y 839, material y métodos) un procedimiento de
establecimiento del perfil de transcripción HLA-G
basado en la extracción del ARN de células del feto humano, seguido
de la transcripción inversa y de la amplificación por cebadores
específicos de HLA-G (tabla I). Los fragmentos
obtenidos se analizan por electroforesis y permiten identificar el
perfil de transcripción HLA-G de las células
fetales.
Yang et al. (The Journal of Immunology,
1996, 156: 4224-4231 describe (cf. 4225, material y
métodos) un procedimiento inmunohistoquímico que permite la
detección de la expresión del antígeno HLA-G en
células citrofoblásticas por un anticuerpo monoclonal.
Rouss et al. (PNAS, vol. 84 pp.
5249-5254, 1997) describe (cf. Páginas 5250, segunda
columna, segundo párrafo) un procedimiento de detección de los
antígenos HLA-G1 y HLA-G2 por
inmunoprecipitación efectuada sobre células transformadas por
transfección y que expresan HLA-G1 o
HLA-G2.
Algunos de los inventores han demostrado la
existencia de otras formas cortadas y empalmadas de ARNm de
HLA-G: el transcrito HLA-G4, que no
incluye el exón 4; el transcrito HLA-G5, que incluye
el intrón 4, entre los exones 4 y 5, provocando de este modo una
modificación del marco de lectura, durante la traducción de este
transcrito y en particular la aparición de un codón de terminación,
después del aminoácido 21 del intrón 4; y el ranscrito
HLA-G6, que posée el intrón 4, pero que ha perdido
el exón 3 (KIRSZENBAUM M. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. EE.UU, 1994, 91, 4209-4213; Solicitud
Europea EP 0877 582; KIRSZENBAUM M. et al., Human Immunol.,
1995, 43, 237-241; MOREAU P. et al., Human
Immunol. 1995, 43, 231-236); Estos autores
también han demostrado que estos diferentes transcritos se expresan
en diversos tipos de células humanas fetales y adultas,
particularmente en los linfocitos (KIRSZENBAUM M. et al., Human
Immunol., 1995, anteriormente mencionado; MOREAU P. et al.,
Human Immunol. 1995, anteriormente mencionado).
Algunos de los inventores también han demostrado
que las células NK no expresan ningún transcrito
HLA-G (TEYSSIER M. et al., Natl Immunol.,
1995, 14, 252-270; MOREAU P. et al., Human
Immunol. 1997, 52, 41-46).
Por lo tanto existen al menos 6 ARNm
HLA-G diferentes que codifican potencialmente 6
isoformas proteicas de HLA-G, de las cuales 4 son
membranares (HLA-G1, G2, G3 y G4) y 2 son solubles
(G5, G6).
Aunque el feto se pueda considerar como un
semialoinjerto, las células fetales sobreviven y no son rechazadas
por la madre; parece que las moléculas HLA-G,
expresadas en la superficie de los trofoblastos protegen las células
fetales de la lisis por los linfocitos citolíticos naturales o
natural killer (NK) maternas de la decidua uterina y
de la sangre periférica (CAROSELLA E.D. et al., C.R. Acad.
Sci., 318, 827-830; CAROSELLA E.D. et al.,
Immunol. Today, 1996, 407-409;
ROUAS-FREISS N. Et al., PNAS, 1997, 94
5249-5254).
Estudios anteriores han demostrado que la
expresión de las moléculas HLA-G en la superficie de
células diana transfectadas permite proteger dichas células diana de
la actividad lítica de las células NK de la capa decidual del
endometrio materno (CHUMBLEY G. Et al., Cell Immunol., 1994,
155, 312-322; DENIZ G. Et al., J. Immunol.,
1994, 152, 4255, 4281; ROUAS-FREISS N. Et
al.Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, 94: 5249-5254).
Hay que subrayar que estas células diana se obtienen por
transfección con vectores que comprenden bien el ADN genómico de la
HLA-G, generando potencialmente todos los
transcritos alternativos, bien con vectores que contienen los ADNc
HLA-G1 y HLA-G2 codificando las
isoformas proteicas HLA-G1 y HLA-G2
(Solicitud de Patente Europea nº 0 677 582 y Solicitud de
PCT/FR98/00333).
Las células NK que expresan los receptores de las
moléculas del CMH de clase I (Killer inhibitory receptors o
KIR o NKIR para receptores inhibidores NK), que son responsables de
la inhibición de la citotoxicidad, cuando estas moléculas HLA, que
actúan como ligandos, son reconocidas por estos receptores; por
ejemplo, N. ROUAS-FREISS et al. Proc. Natl. Acad.
Sci., 1987, 94, 5249-5254) han demostrado que la
expresión de HLA-G protegía de la lisis, las células
diana K562 (línea celular eritroleucémica humana), transfectadas por
las isoformas HLA-G1 y G2. Estas células son
habitualmente sensibles a las células NK.
Estos resultados demuestran el papel fundamental
de la molécula HLA-G como antígeno de
inmunotolerancia. Estos resultados se han trasladado al conjunto de
las isoformas membranares. Los ADNc que codifican las isoformas
HLA-G1, G2, G3, G4 expresadas después de la
transfección en diferentes tipos celulares, en particular, las
células K562 y las células tumorales M8 transfectadas inhiben las
funciones citotóxicas NK y CTL.
Teniendo en cuenta el importante papel que puede
desempeñar la molécula HLA-G, los inventores, en el
transcurso de sus trabajos, han estudiado más en particular las
células tumorales y se han marcado particularmente como objetivo,
conseguir herramientas de selección de los tumores sólidos sensibles
a un tratamiento que inhibe los antígenos HLA-G,
presentes en particular en determinados tumores.
La presente invención tiene como objeto un
procedimiento de establecimiento del perfil de transcripción
HLA-G de un tumor sólido con vistas a la selección
de un tratamiento adaptado a dicho tumor y/o con vistas a la
vigilancia de la evolución de dicho tumor, caracterizado porque
comprende:
- (i)
- la extracción del ARNm, a partir de una muestra tumoral; se puede utilizar particularmente un procedimiento modificado de Chomczynski y Sacchi, utilizando el reactivo RNA NOW (Ozyme, Francia);
- (ii)
- la transcripción inversa (RT) de dicho ARN;
- (iii)
- las amplificaciones sucesivas o concomitantes de los ADNc obtenidos en (ii), en presencia de cebadores específicos de cada isoforma de HLA-G y el análisis de los productos de amplificación obtenidos, por electroforesis y/o hibridación específica y
- (iv)
- el establecimiento del perfil de transcripción HLA-G de dicha muestra.
Preferiblemente, las transcripciones inversas se
ceban con oligo-dT en el ARNm, previamente
desnaturalizado, por ejemplo a 65ºC, en presencia de una
transcriptasa inversa, tal como la transcriptasa inversa
M-MLV (Gico-BRL, Life
technologies).
También preferiblemente, la amplificación de los
ADNc se realiza por polimerización en cadena (PCR), utilizando
cebadores específicos de las diferentes isoformas de
HLA-G, conforme a las siguientes Tablas:
\vskip1.000000\baselineskip
Los inventores han descubierto, de manera
sorprendente, que al menos algunos tumores sólidos expresan el
antígeno HLA-G y han demostrado que este antígeno
HLA-G desempeña un papel funcional en la protección
de las células tumorales (tumores sólidos) de la destrucción por las
células NK. Además, han demostrado la presencia efectiva de algunas
de las isoformas de HLA-G en la superficie de dichas
células tumorales.
Sin embargo, también de manera sorprendente,
según las líneas tumorales, el perfil HLA-G
(transcritos y proteínas) será diferente.
Por ejemplo, en algunas líneas de melanoma, se
puede observar la presencia de las isoformas
HLA-G2/G4 y G3, que protegen estas líneas de la
lisis celular inducida por las células NK, como lo hace la isoforma
HLA-G1, en otras líneas.
En otras líneas, se detecta el conjunto de los
transcritos HLA-G. Se detecta la forma proteicas
HLA-G1 por inmunofluorescencia con un anticuerpo
anti-HLA-G y ésta inhibe la lisis
NK.
El análisis de biopsias de pacientes que padecen
melanomas revela una tasa de trascritos elevada
HLA-G en algunos tumores (primitivos y metástasis)
asociada a una fuerte expresión de la proteína
HLA-G1 detectable por inmunohistoquímica en cortes
congelados con un anticuerpo
anti-HLA-G1.
Esta transcripción y expresión elevada
HLA-G es específica del tejido tumoral y no se
detecta en el tejido sano.
En algunos melanomas, se observa una disociación
de la transcripción de las isoformas solubles (G5) y membranares. El
análisis de los pacientes revela 4 perfiles de transcripción y de
expresión HLA-G.
La expresión de la proteína soluble se detecta
por inmunohistoquímica en los pacientes que presentan el perfil
P4.
La presente invención también tiene como objeto
un procedimiento de establecimiento del perfil de expresión
HLA-G de un tumor sólido, con vistas a la selección
de un tratamiento adaptado a dicho tumor y/o con vistas a la
vigilancia de la evolución de dicho tumor, caracterizado porque
comprende:
- (i)
- la preparación de un corte histológico a partir de una muestra tumoral,
- (ii)
- la marcación de las células de la muestra obtenida en (ii) con anticuerpos específicos de isoformas membranares y solubles HLA-G, y
- (iii)
- el establecimiento del perfil de expresión HLA-G de dicha muestra, por detección de las células marcadas.
La presente invención tiene también como objeto
un procedimiento de establecimiento del perfil de expresión
HLA-G de un tumor sólido, con vistas a la selección
de un tratamiento adaptado a dicho tumor y/o con vistas a la
vigilancia de la evolución de dicho tumor, caracterizado porque
comprende:
- (i)
- eventualmente la marcación de las células de una muestra tumoral,
- (ii)
- la lisis de las células,
- (iii)
- la puesta en contacto de las células rotas con diferentes anticuerpos dirigidos contra antígenos HLA de clase 1, para formar, eventualmente complejos de isoforma de HLA-G/anticuerpos, y
- (iv)
- el establecimiento del perfil de expresión HLA-G de dicha muestra, por detección de los complejos formados en la etapa (III).
Preferiblemente, en la etapa (III), se obtienen
inmunoprecipitados, que en la etapa (iv) son separados por
electroforesis, transferidos sobre membrana y detectados.
Conforme a la invención, dichos anticuerpos son
preferiblemente anticuerpos monoclonales.
La búsqueda de una expresión de los
HLA-G por algunas células tumorales y/o células que
infiltran el tumor (macrófagos, células dendríticas) permite evaluar
mejor el tipo de tratamiento potencialmente eficaz.
En efecto, el conocimiento del perfil de
transcripción de la expresión HLA-G de un tumor
sólido es crucial para elegir el mejor tratamiento posible y hace un
seguimiento de la evolución del tumor en función de dicho
tratamiento.
La presente invención tiene también como objeto
una vacuna antitumoral, que se puede utilizar en los tumores sólidos
que expresan al menos una isoforma de HLA-G,
caracterizada porque se selecciona ente el grupo constituido por
células tumorales autólogas o un antígeno HLA-G5
soluble o un fragmento de éste; tales vacunas inducen la formación
de linfocitos T citotóxicos, específicos de tumores y de anticuerpos
anti-HLA-G.
Cuando dicha vacuna está constituida por células
autólogas (particularmente células tumorales del individuo que se va
a tratar, que expresan al menos una isoforma
anti-HLA-G), dichas células se
modifican preferiblemente para inducir efectivamente la producción
de anticuerpos anti-HLA-G. Las
células se someten, por ejemplo, a un tratamiento de colesterol o a
un tratamiento hiperbárico.
Ventajosamente, dicho antígeno
HLA-G soluble o un fragmento de éste se acopla a una
proteína apropiada y se asocia eventualmente a un adyuvante tal
como hidróxido de aluminio o fosfato cálcico.
Dicha vacuna se administra preferiblemente por
vía subcutánea o intradérmica.
La presente invención tiene también como objeto
una composición antitumoral, que se puede utilizar en tumores
sólidos que expresan al menos una isoforma de HLA-G,
caracterizada porque está esencialmente constituida por anticuerpos
anti-HLA-G (inmunoterapia
pasiva).
La presente invención tiene también como objeto
una composición antitumoral, que se puede utilizar en tumores
sólidos que expresan al menos una isoforma de HLA-G,
caracterizada porque está esencialmente constituida por al menos un
factor de regulación de la transcripción y/o de la expresión de los
HLA-G.
Según una realización ventajosa de dicha
composición, dicho factor de regulación se selecciona entre el grupo
constituido por los factores de regulación obtenidos mediante el
procedimiento tal como se define anteriormente, los factores
antagonistas de los agentes de activación de los
HLA-G, identificados por los inventores
interleuquina-10, glucocorticoide, interferones,
acción del estrés (radiaciones, choque térmico, metales pesados,
estrés oxidante)], los ácidos nucleicos antisentido y los
inhibidores hormonales de la transcripción y/o de la expresión de
dichos HLA-G.
La presente invención tiene, además, como objeto
productos que contienen anticuerpos
anti-HLA-G y factores de regulación
de la expresión de los HLA-G, como productos de
combinación para una utilización simultánea, separada o dilatada en
el tiempo, en el tratamiento de los tumores sólidos que expresan al
menos una isoforma de HLA-G.
Dichos factores de regulación son tales como los
definidos anteriormente.
Además de las disposiciones que preceden, la
invención comprende también otras disposiciones, que se harán
evidentes a partir de la siguiente descripción, que se refiere a
ejemplos de realización de la presente invención así como a los
dibujos anexos en los que:
- -
- la figura 1 muestra:
- (A): el análisis RT-PCT de los ARNm de las isoformas de HLA-G en las células de melanoma. Se utilizan cebadores pan-HLA-G [cebador G.257 (exón 2) y 3G.U (extremo 3' no traducido)] para la amplificación PCR de los transcritos HLA-G correspondientes a las diferentes isoformas conocidas de HLA-G. El ADNc de las células de corlocarcinoma JEG-3, los trofoblastos del primer trimestre (TRO) y las células monocluedas de la sangre periférica (PBMC) se utilizan como células control respectivamente para las tasas de transcripción elevadas y las tasas de transcripción basales de HLA-G. IgR, DRAN y M74 corresponden a la amplificación del ADNc de líneas celulares de melanomas. Las bandas HLA-G específicas son reveladas por hibridación con la sonda GR-específica, localizada en el exón 2. Las bandas que corresponden a los transcritos HLA-G1, G2, G3, G4 y G5 se indican mediante flechas. Los productos de la PCR, coamplificados a lo largo de la misma reacción, con los cebadores de la \beta-actina se detectan en la misma membrana con la ayuda de una sonda \beta-actina;
- (B): esta figura corresponde a la detección RT-PCR de los transcritos alternativos en las células de melanoma. El cebador 3 es específico de las isoformas HLA-G y HLA-G soluble (G6) que no poseen el exón 3. El cebador 3.4 permite distinguir los transcritos ARNm HLA-G3. Los cebadores G.526 y 14b amplifican de manera específica el transcrito HLA-G5, que corresponde a la forma soluble. Los productos de la PCR, coamplificados en la misma reacción con los cebadores de la \beta-actina, se detectan en la misma membrana por una sonda específica de la \beta-actina.
- (C): Esta figura corresponde al análisis RT-PCR del ARNm HLA-G en las células de melanoma. Se utilizan cebadores pan-HLA-G [cebador G.257 (exón 2) y 3G.U (extremo 3' no traducido)] para la amplificación PCR de los transcritos HLA-G correspondientes a las diferentes isoformas conocidas de HLA-G. El ADNc de las células de corlocarcinoma JEG-3 se utilizan como células control para las tasas de transcripción elevadas. IgR, M8 y DRAN corresponden a la amplificación del ADNc de líneas celulares de melanoma. Las bandas HLA-G específicas son reveladas por hibridación con la sonda GR-específica, localizada en el exón 2. Las bandas que corresponden a los transcritos HLA-G1, G2, G3, G4 y G5 se indican mediante flechas. Los productos de la PCR, coamplificados a lo largo de la misma reacción, con los cebadores de la \beta-actina se detectan en la misma membrana con la ayuda de una sonda \beta-actina;
- -
- La figura 2 muestra el análisis RT-PCR de las isoformas de HLA-G en las biopsias de metástasis de melanoma (análisis in vivo y ex vivo de la piel). Los cebadores pan-HLA-G G.257 y 3G.U se utilizan para la amplificación RT-PCR de los transcritos HLA-G, a partir de metástasis de piel ex vivo (MEL) y a partir de biopsias de piel sana, del mismo paciente (HS); se utilizan células JEG-3 y trofoblastos del primer trimestre como células control (tasa elevada de transcripción HLA-G): Las bandas específicas HLA-G se revelan por hibridación con una sonda GR-específica, localizada en el exón 2. Las bandas que corresponden a los transcritos HLA-G1, G2, G3, G4 y G5 se indican mediante flechas.
- -
- La figura 3 muestra la detección de las proteínas HLA-G en las células JEG-3 pero no en las células de melanomas IGR y M8 con la ayuda del anticuerpo monoclonal W6/32; las proteínas de superficie biotiniladas de melanoma y las células JEG-3 se inmunoprecipitan con el anticuerpo monoclonal W6/32; los inmunoprecipitados se separan por SDS-PAGE al 12% y se transfieren sobre membrana de celulosa. Las moléculas de superficie de clase I se detectan con la peroxidasa conjugada con estraptavidina.
- -
- La figura 4 muestra la inmunoprecipitación de las isoformas HLA-G de las células de melanomas IGR por un anticuerpo monoclonal dirigido contra la cadena pesada de HLA-G libre y por los anticuerpos monoclonales 4H84 y HCA2. Las células se marcan durante 30 minutos, se inmunoprecipitan con los anticuerpos específicos y los inmunoprecipitados se analizan por SDS-PAGE al 10%. El anticuerpo 4H84, que reacciona con la cadena pesada HLA-G (banda de 39 kDa en las células JEG-3) presenta reacciones cruzadas con las cadenas pesadas de HLA-A, B y/o C (banda de 45 kDa en todas las células ensayadas).
- (A): El efecto de la expresión HLA-G en el melanoma IGR sobre la sensibilidad a la lisis por el clón YT2C2-PR- Las células K562 transfectadas, bien con el vector sólo, bien con el vector HLA-G que contiene el ADNc o el vector HLA-G2 y las líneas M8, M74 e IGR, DRAN se utilizan como células diana (I). El clón YT2C2-PR se utiliza como célula efectora (E) en una relación de célula efectora/célula diana (E/T) de 50/1. Los resultados se expresan como el porcentaje de lisis registrado en 4 horas en un ensayo de liberación del cromo 51. La liberación espontánea no sobrepasa nunca el 10% de la liberación máxima. Este experimento se realiza al menos 5 veces y produce cada vez los mismos resultados;
- (B): La inhibición de la lisis inducida por el clón YT2C2-PR es debida a una señal "off" transmitida por las células IGR y DRAN. La línea Ma se utiliza como célula diana (T), marcadas con cromo. El clón YT2C2-PR se utiliza como célula efectora (E) en una relación E/T de 50:1. Las células IGR y DRAN se añaden como células inhibidoras en una relación célula inhibidora/célula diana de 100, 50 y 25:1. = indica que no se ha añadido ninguna célula IGR en el ensayo;
- (C): La inhibición de la lisis inducida por las células de melanoma HLA-G positivas (células diana T). Esta figura muestra más particularmente el efecto de la expresión HLA-G por células de melanoma IGR y DRAN sobre la sensibilidad a la lisis por el clón YT2C2-PR. Se rompen diversas líneas celulares B-EBV HLA-G negativas [HOM (A3, B27, Cw1), BM (A29, B61, Cw2), SPO (A3, B7, Cw7), SWE (A2, B44, Cw5) por el clón YT2C2-PR. Este clón se utiliza como célula efectora (E) en una relación E/T de 50:1. Los resultados se expresan como el porcentaje de lisis registrado en 4 horas en un ensayo de liberación del cromo 51. La liberación espontánea no sobrepasa nunca el porcentaje de liberación máxima;
- (D) y (E): Estas figuras muestran que las células tumorales HLA-G negativas Ma transfectadas por los ADNc que codifican las moléculas G1, G2, G3, G4 inhiben la lisis NK (figura 5E) y las respuestas T citotóxicas (figura 5D). La figura 5D comprende en la abscisa las relaciones células efectoras (E) (líneas HLA-A2 restringidas específicas de un péptido de la gripe)/células diana (T) (líneas Ma transfectadas) y en la ordenada el porcentaje de lisis específico. La siguiente Tabla corresponde a los valores obtenidos en esta figura.
- -
- La figura 5E comprende en abscisa las relaciones células efectoras (E) (clón YT2C2-PR)/células diana (T) (líneas M8 transfectadas) y en ordenadas el porcentaje de lisis específico.
- -
- La figura 6 muestra la detección de transcritos HLA-G en biopsias de melanomas humanos. Las amplificaciones RT-PCR se realizan utilizando los cebadores G.257 y G.3U anteriormente mencionados, a partir de biopsias de piel sana (HS) y de ganglios linfáticos sanos (HLN) por una parte y de biopsias de metástasis de ganglios linfáticos (LNM1 y LNM2). Las células de corlocarcinoma JEG-3 se utilizan como células control para las tasas de transcripción elevadas. Unas bandas HLA-G específicas se revelan por hibridación con la sonda GR-específica, localizada en el exón 2. Las bandas que corresponden a los transcritos HLA-G1, G2, G3, G4 y G5 se indican mediante flechas. Los productos de la PCR coamplificados durante la misma reacción con los cebadores de la \beta-actina se detectan en la misma membrana, con la ayuda de una sonda \beta-actina.
- -
- La figura 7 muestra el análisis RT-PCR de los transctritos HLA-G en las biopsias de tumores primitivos de melanomas y en los cultivos de células primarias MPP5 derivadas (análisis ex vivo) Los cebadores pan-HLA-G anteriormente mencionados se utilizan para la amplificación a partir de biopsias de piel sana (HS1), de tumores primarios de piel (SPT1) y de tumores en regresión
- (R1) obtenidos a partir del mismo paciente y a partir de células primarias derivadas obtenidas a partir de un tejido tumoral de piel (MPP5). Las células MPP5 y la biopsia STP1 presentan tasas de transcritos HLA-G similares. Se utilizan células JEG-3 como células control de tasas elevadas de transcripción HLA-G. Las bandas específicas HLA-S se revelan por hibridación con una sonda GR-específica, localizada en el exón 2. Las bandas que corresponden a los transcritos HLLA-G1, G2, G3, G4 y G5 se indican mediante flechas. Los productos de la PCR coamplificados en la misma reacción con los cebadores de la \beta-actina se detectan en la misma membrana por una sonda específica de la \beta-actina.
- -
- La figura 8 muestra:
- (A) la detección específica de los transcritos HLLA-G5 por RT-PCR en biopsias de melanomas. La amplificación del transcrito HLA-G5 a partir de ganglios linfáticos sanos (HLN), de un tumor primario de piel (STP1) y de dos biopsias de metástasis de ganglios linfáticos (LNM1 y LNM2) se realiza con la ayuda de los cebadores G..56 y G.14b. La banda que corresponde al transcrito HLA-G5 se detecta por hibridación con una sonda 14F, localizada en el intrón 4; se utilizan células JEG-3 como células control (tasas elevadas de transcripción HLA-G5). La banda que corresponde al transcrito HLA-G5 se indica mediante flechas. Los productos de la PCR coamplificados en la misma reacción con los cebadores de la \beta-actina se detectan en la misma membrana por una sonda específica de la \beta-actina.
- (B) El análisis inmunohistoquímico de la expresión HLA-G soluble en la biopsia LNM1. Se colorean positivamente secciones de la biopsia LNM1 congeladas y fijadas en acetona con el anticuerpo anti-melanoma HMB45 (DAKO) y el anticuerpo anti-HLA-G soluble, mientras que el control negativo no se colorea utilizando el sistema peroxidasa anti-ratón Envision (DAKO) y el AEC como sustrato.
Sin embargo se ha de entender que estros ejemplos
se dan únicamente a título ilustrativo del objeto de la invención,
y que no constituyen en modo alguno una limitación.
La línea celular eritroleucémica humana K562
(ATCC) y la línea celular leucémica T inmadura (clón
YT2C2-PR) con actividad NK) se mantienen en un medio
RPMI 1840 complementado con suero de ternera fetal al 10%,
inactivado por el calor de la L-glutamina 2 mM de la
gentamicina a 1 \mug/ml y fungizona (Sigma,
Saint-Quentin, Francia) y se cultivan a 37ºC en una
incubadora, humidificada con atmósfera enriquecida al 5% en
CO_{2}. Los transfectantes K862 se seleccionan en un medio que
contiene geneticina a 1 mg/ml (G418 sulfato, Sigma).
La línea celular humana de corlocarcinoma
HLA-G positiva denominada JEG-3
(ATCC) se cultiva en un medio (DMEM) (Sigma) suplementado con suero
de ternera fetal al 10%, inactivado al calor, antibióticos y
L-glutamina 2 mM. Las líneas celulares no contienen
micoplasmas.
Además de las líneas anteriormente mencionadas,
se utilizan:
- -
- líneas de melanoma IGR (HLA-A2, A3, B58/macho), M74 (HLA-A1, A2, B8, B14/hembra), M8 (HLA-A1, A2, B12 y B40/macho) y DRAN (HLA-A2, A3, B7, B35, CW5, CW7),
- -
- tejidos trofoblásticos del primer trimestre, obtenidos después de IVG; estos tejidos se cortan en finas láminas y se utilizan inmediatamente para extraer el ARN, y
- -
- células mononucleadas de la sangre periféricas (PBMC) obtenidas a partir de voluntarios sanos y aisladas en un gradiente de densidad Ficol-Hypaque 1077.
Se utilizan los siguientes anticuerpos:
W6/32: IgG2a, anti-cadenas
\alpha de HLA de clase I asociadas a la \beta2-m
(Sigma) HCA2 : IgG anti-HLA-A y G y
IgG anti-HLA-G, 87G, 4H84 y
16G1.
El ARN total se extrae a partir de 10^{7}
células con la ayuda del reactivo RNA NOW (Biogentex, Inc) conforme
a las recomendaciones del fabricante. La calidad del ARN se verifica
por electroforesis sobre gel de agarosa al 1,5% desnaturalizante.
Los ADNc se preparan a partir de 10 \mug de ARN total tratados
con DNAsa I (Boerhinger Mannheim) utilizando un cebador
oligo(dT)_{12-18} y la transcriptasa
inversa M-MLV (GIBCO-BRL). Las
amplificaciones
RT-PCR-HLA-G
específicas se realizan utilizando los siguientes cebadores: G.257
(exón 2) y G3.U (3'UT) (Ishitani A et al., Proc. Natl. Acad.
Sci., 1992, 89, 3947-3951; Kirszenbaum M et
al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1994, 91,
4209-42143 y Moreau P. Et al., C.R. Acad.
Sci, 1995, 318, 837.842), para detectar todas las isoformas de ARNm
de HLA-G. Se realiza una amplificación específica de
cada forma de ARNm de HLA-G con los conjuntos de los
siguientes cebadores:
- -
- G.526 (exón 3) y G3.U (3'UT) para las isoformas G1, G4 y G5;
- -
- G.526 (exón 3) y G.14b) (intrón 4) para la isoforma G5;
- -
- G..-3 (cubriendo parcialmente los exones 2 y 4) y G3.U (3'UT) para las isoformas G2 y G6;
- -
- G.3-4 (cubriendo parcialmente los exones 2 y 5) y G3.U (3'UT) para la isoforma G3.
Los ADNc de los HLA clásicos de clase 1 se
amplifican como se describe en King et al., (J.
Immunol., 1996, 156, 2068-2076), utilizando un
cebador 5' único HLA-5P2 y 3 cebadores 3',
HLA-3pA, HLA-3pB y
HLLA-3pC que amplifican respectivamente los ARNm
HLA-A, HLA-B y
HLA-C.
Los cebadores específicos DRA se describen en
King et al., anteriormente mencionado.
Se realiza una coamplificación del ADNc de
\beta-actina en cada experimento con el ensayo
Clontech (16 ciclos), para evaluar las cantidades comparativas de
ARN en las muestras. Los productos PCR se analizan por
electroforesis sobre gel de agarosa al 1% y se colorean con la ayuda
de bromuro de etidio. La especificidad de los productos PCR se
confirma por transferencia alcalina de los fragmentos en NaOH 0,4 N
en las membranas de Nylon (Hybond N+, Amersham, Francia).
Las sondas HLA-G específicas son
las siguientes:
- GR específico del exón 2,
- G.647 F (5'CCACCACCCTGTCTTTGACT: específica del
exón 4),
- G.14 F (GAGGCATCATGTCTGTTAGG: específica del
intrón 4), y
- G.927 F
(5'-ATCATGGGTATCGTTGCTGG: específica del exón
5).
Las otras sondas son las siguientes:
- sonda específica HLA-
(5'GGAGGACCAGACCCAGGACACG)
- sonda específica HLA-B
(5'AGCTCCGATGACCACAACTGC)
- sonda específica HLA-C
(5'TGTCCTAGCTGCCTAGGAG) y
- sonda específica HLA-DRA
(TGTGATCATCCAGGCCAG).
Los filtros se exponen sobre películas Kodak
(Biomax) con pantallas amplificadoras durante 4 a 16 horas a
-80ºC.
Las proteínas de superficie se marcan con
biotina. Después del lavado con PBS, 1,5.10^{7} células se incuban
en 1 ml de PBS frío que contiene 5 ml de
NHS-SS-biotina (Pierce, Rockford,
IL) durante 15 minutos a 4ºC. Los grupos activos residuales se
inhiben en 50 mM de NH_{4}Cl durante 10 minutos a 4ºC. Las células
se rompen en un 1% de Triton X100/PBS. Las proteínas precipitadas
con el anticuerpo W6/32 se separan sobre SDS/PAGE al 12%, se
transfieren sobre membrana de nitrocelulosa y se ponen en presencia
de un conjugado de peroxidasa de
raifort-estreptavidina. Después de un lavado
extensivo de la membrana, se realiza la reacción coloreada
utilizando el reactivo de detección de transferencia Western ECL
(Arnersham, Francia), después de lo cual la membrana se expone a una
película Kodak a temperatura ambiente.
La actividad citolítica de las células
mononucleadas de la sangre periférica, de las células NK y de las
células YT2C2-PR (células efectoras o E) contra
transfectantes HLA-G (células diana o T) se evalúa
con la ayuda de pruebas de liberación durante 4 horas del cromo 51,
en las que las células efectoras se mezclan con 5.10^{3} células
diana marcadas con cromo 51 (100 \muCi de
^{51}Cr-cromato de sodio, Amersham, UK) en
diferentes relaciones E/T, en placas de microtitración cuyo fondo
tiene forma de U.
Después de 4 horas a 37ºC en una incubadora
humidificada que contiene un 5% de CO_{2}, se toman 100 \mul de
sobrenadante para un conteo por centelleo en fase líquida (Wallac,
1450 Microbeta, Pharmacia, Francia). El porcentaje de lisis
específica se calcula de la siguiente manera:
porcentaje de
lisis específica = [cpm en el pocillo experimental - cpm de
liberación espontánea/cpm de liberación máxima - cpm de
liberación espontánea)] \times
100
La liberación espontánea se determina por
incubación de las células diana (T) marcadas con el medio. La
liberación máxima se determina por solubilización de las células
diana en HCL 0,1 M. En todos los experimentos, la liberación
espontánea es inferior al 10% respecto a la liberación máxima. Los
resultados se presentan como medias de tres muestras. En los
experimentos en los que los anticuerpos monoclonales se utilizan
para bloquear la interacción
HLA-G-NK, las células diana se
incuban con el anticuerpo monoclonal correspondiente, y a
continuación se lavan e incuban con un anticuerpo
(F(ab')_{2} de cabra anti-ratón (Jackson
Immuno-research, EE.UU) para evitar la citotoxicidad
celular dependiente de los anticuerpos (DAC) por interacción de los
receptores para el fragmento F_{c} de las inmunoglobulinas,
expresados en las células NK con el primer anticuerpo utilizado. Las
toxicidades de los anticuerpos monoclonales también se verifican en
cada ensayo y siempre son inferiores al 3%.
Los ADNc de HLA-G de 4 líneas
celulares de melanoma (IGR, M8, M74 y DRAN) se amplifican, con la
ayuda de los cebadores anteriormente descritos (A. Ishitani et
al.,Proc. Natl. Aca. Sci. EE.UU, 1992, 89,
3947-3951; M. KIRSZENBAUM et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU, 1994, 91, 4209-4213)
derivados de las secuencias específicas del exón 2 y de la región 3'
no traducida (véase Material y Métodos) figura 1).
La línea JEG-3 de coriocarcinoma
y de las células trofoblásticas, que presentan tasas elevadas de
transcritos de HLA-G, se utilizan como testigos
positivos y las células mononucleadas de la sangre periférica
(PBMC) de voluntarios sanos se utilizan como controles negativos
(tasas reducidas de transcritos HLA-G).
La hibridación de los productos de la PCR ha
permitido identificar importantes tasas de ARNm de
HLLA-G en 2 líneas celulares de melanoma, a saber
IGR y M74, mientras que no se puede detectar ninguna señal en la
línea celular de melanoma M8.
En las células JEG-3 y los
trofoblastos, se detectan todos los transcritos de
HLA-G (figuras 1A y 1C).
En las células de melanoma IGR y DRAN, también se
detectan todos los transcritos por cebadores
pan-HLA-G (figura 1A).
Sin embargo, los cebadores
pan-HLA-G no permiten distinguir
entre las señales HLA-G1 y HLA-G5,
que están presentes ambas, en una banda correspondiente a 1.000 pb,
ni entre las señales HLA-G2 y
HLA-G1, que migran conjuntamente en forma de un
fragmento de 600 pb. Una identificación RT-PCR
permite aislar las isoformas con la ayuda de cebadores específicos
(P. Moreau et al., C.R. Acad. Sci., 1995, 318,
837-842) véase Material y Métodos).
Las células IGR y Dran expresan todas las
isoformas de HLA-G en forma de transcritos,
expresándose HLA-G4 y HLA-G5 en
tasas reducidas (figura 1B).
En las líneas celulares de melanoma M74, los
cebadores pan-HLA-G detectan bandas
que corresponden a HLA-G1 y HLA-G5
(1.000 pb) (señales intensas), una señal para HLA-G2
y HLA-G4 (600 pb), pero ninguna señal para
HLA-G3 (300 pb) (figura 1A). Los cebadores para las
isoformas específicas revelan que en estas células, las isoformas G1
y G4 son más abundantes que en las PBMC mientras que la tasa de
transcritos G5 es comparable a la observada en las PBMC.
Se detectan tasas reducidas de ARNm
HLA-G2 y HLA-G6 (forma soluble de
HLA-G2) en estas células M74, mientras que una
amplificación específica del transcrito HLA-G3
confirma la ausencia de HLA-G3 observada con los
cebadores pan-HLA-G en estas células
(figuras 1A y 1B).
No se observa ninguna señal de hibridación
HLA-G en las células M8 (figuras 1A y 1B).
Para determinar si los transcritos de
HLA-G detectados en los melanomas se traducen en
proteínas HLA-G, se han efectuado estudios de
inmunoprecipitación con diferentes anticuerpos monoclonales
anti-HLA de clase I.
La comparación se realiza en presencia de un
control positivo (célula JEG-3) y de un control
negativo (células de melanoma M8).
Los resultados de inmunoprecipitación con el
anticuerpo monoclonal W6/32 se muestran en la figura 3.
Con las células JEG-3, el
anticuerpo W6/32 inmunoprecipita dos proteínas de 45 kDa (molécula
HLA-C) y de 39 kDa (Isoforma HLA-G1
unida a la membrana).
En las células IGR y M8, sólo se detecta una
proteína de 45 kDa.
Se obtienen resultados similares por
inmunoprecipitación de proteínas de superficie biotiniladas (figura
3).
Estos datos muestran que las proteínas
HLA-G1 no se expresa en las células IGR, incluso si
estas últimas expresan el ARNm correspondiente.
Sin embargo, la ausencia de proteína
HLA-G1 en las células IGR no excluye la expresión de
3 otras isoformas de HLA-G (HLA-G2,
G3 y G4).
Estas proteínas no puede ser reveladas por el
anticuerpo monoclonal W6/32, por su incapacidad para asociarse con
la \beta2m.
Para identificar estas proteínas, la
inmunoprecipitación de proteínas marcadas con metionina (^{35}S-
metionina) se realiza utilizando anticuerpos monoclonales que
reconocen la HLA-G libre, la HLA-G
desnaturalizada y la HLA-G (anticuerpo HCA2) y un
epítope localizado en el dominio \alpha1 presente en todas las
isoformas de la proteína HLA-G (anticuerpo
monoclonal Ig anti-HLA-G).
El anticuerpo monoclonal revela la presencia de
la proteína HLA-G1 de 39 kDa en las células
JEG-3 y DRAN y su ausencia en las células IGR
(figura 4).
Se detectan bandas adicionales, que migran a
32-34 kDa y a 18 kDa, que corresponden
respectivamente a la dimensión de la proteína HLA-G2
y/o de la proteína HLA-G4 o G3, en las células IGR
tanto con el anticuerpo monoclonal Ig
anti-HLA-g como con el anticuerpo
HCA (figura 4).
No se observan las bandas adicionales,
específicas de la proteína HLA-G en las células M74
y M8 que no presentan los transcritos de HLA-G
correspondientes (figura 4).
Las células YT2C2-PR se utilizan
como células efectoras NK.
La línea celular IGR, que expresa las isoformas
HLA-G2 y/o G4 y G3 y la línea DRAN, que expresa
HLA-G1 (figura 5), anulan la lisis inducida por el
clón YTC2C-PR.
La línea celular de melanoma M74, que expresa los
antígenos clásicos del CMH de clase I, pero que presenta un defecto
selectivo en la transcripción y la expresión de las isoformas
HLA-G2 y HLA-G3 se rompe por el clón
YT2C2-PR.
Se observa igualmente una lisis con la línea
celular M8, que expresa los antígenos clásicos del CMH de clase I,
pero que no transcribe ningún ARNm de HLA-G (figuras
1 y 5).
Para mostrar que sólo las HLA-G
están implicadas en esta inhibición de la lisis inducida por las
células NK, se han utilizado diversas líneas celulares
EBV-B que no expresan ninguna HLA-G
pero que comparten al menos un alelo HLA-a, B o C
con la línea IGR como células diana.
Todas estas líneas EBV-B se
rompen por el clón YT2C2-PR, mostrando que los
antígenos HLA-A, B y C no están implicados en la
protección de los melanomas IGR y DRAN, de la lisis
YT2C2-PR (figura 5).
Para mostrar que la inhibición de la lisis,
inducida por el clón YT2C2-PR por las células IGR,
no es debida a una señal transmitida por esta línea celular sino que
está efectivamente unida a una resistencia intrínseca de estas
células IGR a las células NK, las células IGR se han utilizado como
inhibidores, en una prueba de citotoxicidad en la que las células
diana (T) son células M8 y las células YT2C2-PR, las
células efectoras (E).
La figura 5B muestra que las células IGR inhiben
eficazmente la lisis de las células M8 por el clón
YT2C2-PR; esta inhibición es proporcional al número
de células IGR utilizadas para la prueba competitiva.
Se efectúan biopsias a partir de muestras
tisulares de pacientes.
Inmediatamente después de la toma de muestras, se
congelan las muestras en nitrógeno líquido y se conservan hasta la
extracción del ARN.
Se utilizan métodos estándar para realizar la
inmunohistoquímica en cortes realizados a partir de las biopsias de
melanoma, fijadas con acetona, lavadas en PBS y bloqueadas en suero
de conejo normal (DAKO) en PBS.
Las muestras se incuban con el anticuerpo
primario durante 1 hora a temperatura ambiente, y a continuación se
incuban con un anticuerpo secundario (Ig de conejo
anti-ratón conjugado con FITO) (DAKO).
Las secciones se contracolorean con un colorante
nuclear (DAPI, Sigma) y se preparan en un medio apropiado. La
fluorescencia se analiza con un microscopio confocal lo24MRC
(Bio-Rad). Se utilizan los siguientes anticuerpos:
W6/32: IgG2a anti-cadenas pesadas de
HLA-G de clase I asociadas a la
\beta2-micro-globulina (Sigma) y
87G: IgG anti-HLA-G que detecta la
isoforma HLA-G1.
Las otras técnicas son idénticas a las del
ejemplo 1.
Todos los transcritos de HLA-G se
detectan con tasas importantes en algunas biopsias de melanoma,
mientras que sólo se detecta la banda de 1.000 pb en la piel humana
sana (figuras 2 y 6). Estos resultados han sido confirmados en otras
biopsias y muestran que las tasas importantes de transcripción
observadas en las células de melanoma, son específicas de estos
últimos y no se pueden observar en el tejido sano.
De manera más concreta, se detectan tasas
elevadas de transcripción de HLA-G de manera
específica en tumores primarios y en metástasis, mientras que se
observan tasas basales de transcritos HLA-G y una
ausencia de expresión de proteína HLA-G en la piel
sana o en ganglios linfáticos normales (figura 6A).
El análisis de la piel sana (HS1), de los tumores
primarios de la piel (SP1) y de una región de regresión tumoral
(R1) en un tumor primario de piel de un mismo paciente permite la
detección de una tasa elevada de transcrito HLA-G y
de expresión de proteínas en la región tumoral primaria, mientras
que tanto la piel sana como la región de regresión tumoral presentan
tasas basales de transcritos HLA-G y la completa
ausencia de la expresión de proteínas HLA-G1 (figura
7).
Las células primarias cultivadas (MPP5) derivadas
del tumor primario SP1 presentan también tasas elevadas de
transcritos HLA-G (figura 7).
Una amplificación específica de los transcritos
(ARNm) que corresponden a la isoforma soluble
HLA-G5, en las biopsias de melanomas muestran que se
detectan tasas elevadas de transcritos HLA-G5 en
algunas biopsias de melanomas en las cuales se ha demostrado que
presentan tasas elevadas de transcritos que corresponden a las
isoformas membranares de HLA-G (figura 8).
Por otra parte, en otros casos, se observa una
disociación entre las tasas de HLA-G5 y las tasas de
los otros transcritos HLA-G: en las biopsias de
melanomas en las que se ha observado previamente tasas elevadas de
HLA-G1, G2, G3 y G4, no se observan transcritos de
HLA-G5.
El tumor primario de piel SP1 y las células en
cultivo correspondientes MPP5 así como las metástasis de ganglios
linfáticos LNM2 presentan tasas elevadas de transcritos
HLA-G que corresponden a isoformas de
HLA-G unidas a la membrana (figura 8), mientras que
no se detectan transcritos HLA-G5 en la misma
muestra.
Se correlacionan tasas elevadas de transcritos
HLA-G con la detección específica de la expresión de
proteína HLA-G por un anticuerpo monoclonal
anti-HLA-G (anticuerpo 87G) en
biopsias de melanomas. En efecto, el análisis inmunohistoquímico de
la expresión HLA-G en una biopsia de ganglios
linfáticos metastáticos (LNM2) permite observar una marcación
positiva de LNM2 tanto con el anticuerpo 87G como con el anticuerpo
W6/32, mientras que el control negativo constituido por la piel
humana sana del mismo paciente no se colorea por el anticuerpo
anti-HLA-G.
Con el fin de clarificar este estudio, un
anticuerpo que detecta específicamente la proteína
HLA-G soluble, el anticuerpo 16G1 (Lee et
al., Immunity, 1995, 3, 591-800), permite
demostrar la expresión de la proteína HLA-G soluble
en la biopsia de ganglios linfáticos de un paciente que presenta
tasas elevadas de transcritos HLA-G5 (figura 5).
El análisis inmunohistoquímico permite la
marcación de esta biopsia mientras que no se observa ninguna
expresión detectable utilizando el miso anticuerpo en una biopsia de
melanomas de un paciente que presenta tasas elevadas de las otras
isoformas de HLA-G.
En efecto, el análisis inmunohistoquímico de la
expresión de HLA-G soluble en la biopsia LNM2,
muestra que secciones de biopsias LNM2 fijadas con acetona se
colorean positivamente con el anticuerpo
anti-melanoma HMB45 (DAKO, Glostrup; SKELTON et
al., Am. J. Dermatopathol., 1991, 13,
543-550) y el anticuerpo
anti-HLA-G soluble 16G1, mientras
que el control negativo no se colorea.
Al igual que se desprende de lo que precede, la
invención no se limita en ninguna caso a los modos de ejecución, de
realización y de aplicación que se acaban de describir de manera
más explícita; sino que por en contrario abarca todas las variantes
que se le pueden ocurrir al técnico en la materia, sin separarse
del marco, ni del alcance de la presente invención.
Claims (11)
1. Procedimiento para establecer el perfil de
transcripción de las isoformas membranares y solubles de
HLA-G de un tumor sólido con vistas a la selección
de un tratamiento adaptado a dicho tumor y/o con vistas a la
vigilancia de la evolución de dicho tumor, caracterizado
porque comprende:
- (i)
- la extracción del ARNm, a partir de una muestra tumoral;
- (ii)
- la Transcripción Inversa (RT) de dicho ARN;
- (iii)
- las amplificaciones sucesivas o concomitantes de los ADNc obtenidos en (ii), en presencia de cebadores específicos de cada isoforma de HLA-G y el análisis de los productos de amplificación obtenidos por electroforesis y/o hibridación específica y
- (iv)
- el establecimiento del perfil de transcripción de las isoformas membranares y solubles HLA-G de dicha muestra.
2. Un procedimiento para establecer el perfil de
expresión de las isoformas membranares y solubles de
HLA-G de un tumor sólido, con vistas a la selección
de un tratamiento adaptado a dicho tumor y/o con vistas a la
vigilancia de la evolución de dicho tumor, caracterizado
porque comprende:
- (i)
- la preparación de un corte histológico a partir de una muestra tumoral,
- (ii)
- el marcado de las células de la muestra obtenida en (i) con anticuerpos específicos de isoformas membranares y solubles HLA-G, y
- (iii)
- el establecimiento del perfil de expresión de las isoformas membranares y solubles HLA-G de dicha muestra, por detección de las células marcadas.
3. Un procedimiento para establecer el perfil de
expresión de las isoformas membranares y solubles
HLA-G de un tumor sólido, con vistas a la selección
de un tratamiento adaptado a dicho tumor y/o con vistas a la
vigilancia de la evolución de dicho tumor, caracterizado
porque comprende:
- (i)
- eventualmente el marcado de las células de una muestra tumoral,
- (ii)
- la lisis de las células de una muestra tumoral,
- (iii)
- la puesta en contacto de las células lisadas con diferentes anticuerpos dirigidos contra los antígenos HLA de clase 1, para formar, eventualmente complejos de isoforma de HLA-G/anticuerpos, y
- (iv)
- el establecimiento del perfil de expresión de las isoformas membranares y solubles HLA-G de dicha muestra, por detección de los complejos formados en la etapa (iii).
4. Vacuna antitumoral, que se puede utilizar en
tumores sólidos que expresan al menos una isoforma de
HLA-G, caracterizada porque comprende células
tumorales autólogas que expresan al menos una isoforma de
HLA-G.
5. Antígeno HLA-G soluble o uno
de sus fragmentos para una utilización como vacuna antitumoral, que
se puede utilizar en tumores sólidos que expresan al menos una
isoforma de HLA-G.
6. Utilización de un antígeno
HLA-G5 soluble o de uno de sus fragmentos para la
preparación de una vacuna destinada al tratamiento de tumores
sólidos que expresan al menos una isoforma de
HLA-G.
7. Utilización según la reivindicación 6,
caracterizada porque dicho antígeno HLA-G5
soluble o uno de sus fragmentos está acoplado a una proteína
apropiada y eventualmente asociado a un adyuvante tal como el
hidróxido de aluminio o el fosfato cálcico.
8. Utilización de un anticuerpo
anti-HLA-G para la preparación de un
medicamento antitumoral, destinado al tratamiento de tumores sólidos
que expresan al menos una isoforma de HLA-G.
9. Utilización de un factor inhibidor de la
transcripción y/o de la expresión de HLA-G para la
preparación de un medicamento antitumoral, destinado al tratamiento
de tumores sólidos que expresan al menos una isoforma de
HLA-G.
10. Utilización según la reivindicación 9,
caracterizada porque dicho factor se selecciona entre el
grupo constituido por factores antagonistas de los agentes de
activación de las HLA-G, los ácidos nucleicos
antisentido y los inhibidores hormonales de la transcripción y/o de
la expresión de dichas HLA-G.
11. Productos que contienen anticuerpos
anti-HLA-G y factores inhibidores
de la expresión de las HLA-G, como productos de
combinación para una utilización simultánea, separada o dilatada en
el tiempo, en el tratamiento de tumores sólidos que expresan al
menos una isoforma de HLA-G.
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