JP2002503497A

JP2002503497A - Ｈｌａ−ｇを発現する、抗癌治療に感受性な腫瘍を選択する方法およびその使用

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Publication number: JP2002503497A
Application number: JP2000532142A
Authority: JP
Inventors: エドガードデルフィノカロセラ; ジャンドーセ; フィリップモロー; パスカルポール; ナタリールアー−フレイス
Original assignee: コミサリア・ア・レネルジー・アトミーク
Priority date: 1998-02-20
Filing date: 1999-02-19
Publication date: 2002-02-05
Anticipated expiration: 2019-02-19
Also published as: CA2321222A1; EP1054688B1; US20040209296A1; JP4470007B2; DE69918413T2; DE69918413D1; US6790638B1; ES2224603T3; WO1999042128A1; EP1054688A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、HLA-Gを発現し抗癌治療に感受性な固形腫瘍を選択する方法に関し、該治療は該腫瘍のHLA-G活性を抑制または予防する、およびその使用に関する。該方法は、固形腫瘍のHLA-G転写プロフィールまたは固形腫瘍のHLA-G発現プロフィールのいずれかを確立可能である。HLA-G転写プロフィールを確立する方法は、(i)腫瘍サンプルの取り出し；(ii)mRNAの抽出；(iii)該RNAの逆転写(RT)；(iv)各HLA-Gイソ型に特異的なプライマーの存在下に(iii)で得られたcDNAの連続する又は同時的な増幅、および電気泳動および／または特異的ハイブリダイゼーションによる得られた増幅産物の分析、および(v)該サンプルのHLA-G転写プロフィールの確立、を包含する。HLA-G発現プロフィールを確立する方法は、(i)腫瘍サンプルの取り出し；(ii)必要に応じて、該サンプルの細胞の標識化；(iii)細胞の溶解の実行；(iv)溶解に供された細胞を、クラスI HLA-G抗原に対する様々な抗体と接触させて、必要に応じてHLA-Gイソ型／抗体コンプレックスを形成させること、および(v)該サンプルのHLA-G発現プロフィールを、工程(iv)で形成されたコンプレックスを検出することにより確立すること、を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、抗癌治療に感受性な固形腫瘍を選択する方法、該抗癌治療は該固形
腫瘍のHLA-G活性を阻害または予防する、およびその使用に関する。

【０００２】（発明の背景）主要組織適合遺伝子複合体(MHC)抗原は、幾つかのクラス、つまり、３種の球状ドメイン(α1、α2およびα3)を示し、そのα3ドメインがβ2ミクログロブリンと会合するクラスI抗原(HLA-A、HLA-BおよびHLA-C)、クラスII抗原(HLA-DP、H
LA-DQおよびHLA-DR)およびクラスIII抗原(補体)に分けられる。

【０００３】クラスI抗原は、上記の抗原に加えて、他の抗原、いわゆる非慣用的なクラスI
抗原、および特にHLA-E、HLA-FおよびHLA-G抗原を含む；後者は、特に、正常なヒト胎盤の絨毛外栄養膜および胸腺上皮細胞によって発現される。

【０００４】 HLA-G遺伝子(HLA-6.0遺伝子)の配列は、Geraghtyら(Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 1987, 84, 9145-9149)により記載された：それは、4396塩基対を含み、HLA
-A、-Bおよび-C遺伝子のものに相同であるイントロン／エクソン機構を示す。よ
り詳細には、この遺伝子は、８エクソン、７イントロンおよび3'非翻訳末端を含
む；８エクソンは、それぞれ、エクソン１：シグナル配列、エクソン２：α1細胞外ドメイン、エクソン３：α2細胞外ドメイン、エクソン４：α3細胞外ドメイ
ン、エクソン５：貫膜領域、エクソン６：細胞質ドメインI、エクソン７：細胞質ドメインII(非翻訳)、エクソン８：細胞質ドメインIII(非翻訳)および3'非翻訳領域に対応する(Geraghtyら、上記；Ellisら、J. Immunol. , 1990, 144, 731
-735；Kirszenbaum M.ら、Oncogeny of hematopoiesis. Aplastic anemia編 E.
Gluckman, L. Coulombel, Colloque INSERM/John Libbey Eurotext Ltd.)。しか
しながら、HLA-G遺伝子は、インフレーム翻訳停止コドンがエクソン６の第２コドンに位置する点で他のクラスI遺伝子とは異なる；結果として、このHLA-6.0遺
伝子にコードされるタンパク質の細胞質領域は、HLA-A、-Bおよび-Cタンパク質の細胞質領域よりもかなり短い。

【０００５】これらのHLA-G抗原は、本質的に胎盤の細胞栄養膜細胞によって発現され、胎児を保護する役割を果たす(母親による拒絶の不存在)と考えられている。さらに
、HLA-G抗原は単形態性であるので、それは胎盤細胞の増殖または機能にも関与し得る(Kovatsら、Science、1990 248、220-223)。

【０００６】この非慣用的クラスI抗原に関する他の研究(Ishitaniら、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1992, 89, 3947-3951)は、HLA-G遺伝子の一次転写産物が幾つかの方法でスプライスされ得、少なくとも３つの異なる成熟mRNAを生じることを示した
：該HLA-Gの一次転写産物は1200-bpの完全なコピー(G1)、900-bpフラグメント(G
2)および600-bpフラグメント(G3)を生じる。

【０００７】 G1転写物は、エクソン７を含まず、Ellisら(上記)に記載される配列に対応する、即ち、それは、リーダー配列、３つの外部ドメイン、貫膜領域および細胞質
配列を含むタンパク質をコードする。G2 mRNAは、エクソン３を含まない、即ち、それは、α1ドメインとα3ドメインが直接的に結合しているタンパク質をコー
ドしている；G3 mRNAは、エクソン３もエクソン４も含まない、即ち、それは、 α1ドメインと貫膜配列が直接的に結合しているタンパク質をコードしている。

【０００８】 HLA-G2抗原を得るために効果のあるスプライシングは、アデニン(A)(α1をコードするドメインから生じる)とAC配列(α3をコードするドメインに由来する)の
結合をもたらし、それは、HLA-G1中のα3ドメインをコードする配列の開始で遭遇するGAC(アスパラギン酸)コドンの代わりに、AAC(アスパラギン)コドンの作製
をもたらす。

【０００９】 HLA-G3を得るために生じたスプライシングは、スプライシング・ゾーン中に新
しいコドンの形成をもたらさない。

【００１０】この論文の著者はまた、発現された様々なタンパク質を分析をした：３つのmR
NAは、221-G細胞系中のタンパク質に翻訳される。

【００１１】発明者の或る者は、HLA-G mRNAの他のスプライスされた形態の存在を示した；
エクソン４を含まないHLA-G4転写物；エクソン４と５との間にイントロン４を含
むHLA-G5転写物、従って、この転写物の翻訳の間にリーディングフレームの修飾
および特にイントロン４のアミノ酸21の後に停止コドンの出現を生じる；および
イントロン４を有するがエクソン３を失ったHLA-G6転写物(Kirszenbaum M.ら、P roc. Natl. Acad. Sci. USA , 1994, 91, 4209-4213；ヨーロッパ出願EP 0 677 5
82；Kirszenbaum M.ら、Human Immunol. , 1995, 43, 237-241；Moreau P.ら、H uman Immunol ., 1995, 43, 231-236)；彼らは、これらの様々な転写物が、胎児および成人のヒト細胞の幾つかのタイプ、特にリンパ球で発現されることも示し
た(Kirszenbaum M.ら、Human Immunol. , 1995, 上記；Moreau P.ら、Human Imm unol ., 1995, 上記)。

【００１２】一部の発明者は、NK細胞がHLA-G転写物を発現しないことも示した(Teyssier M
.ら、Nat. Immunol. , 1995, 14, 262-270；Moreau P.ら、Human Immunol., 199
7, 52, 41-46)。

【００１３】従って、少なくとも６つの異なるHLA-G mRNAが存在し、これらは可能性として
HLA-Gの６つのタンパク質イソ型をコードしており、うち４つは、膜結合しており(HLA-G1、G2、G3およびG4)、２つは可溶性である(G5およびG6)。

【００１４】胎児は、半同種異系移植であると考えられ得るけれども、胎児細胞は生残し母
親によって拒絶されない；栄養膜の表面で発現されるHLA-G分子は、子宮の脱落膜から及び末梢血からの母親のナチュラルキラー(NK)細胞による溶解に対して胎
児細胞を保護することが明らかになった(Carosella E.D.ら、C.R. Acad. Sci.,
318, 827-830；Carosella E.D.ら、Immunol. Today, 1996, 407-409；Rouas-Fre
iss N.ら、PNAS, 1997, 94, 5249-5254)。

【００１５】以前の研究は、トランスフェクトされた標的細胞の表面でのHLA-G分子の発現は、母親の子宮内膜の脱落膜層からのNK細胞の溶解活性に対して該標的細胞を保
護可能にさせることを示した(Chumbley G.ら、Cell Immunol., 1994, 155, 312-
322；Deniz G.ら、J. Immunol., 1994, 152, 4255-4261；Rouas-Freiss N.ら、P
roc. Natl. Acad. Sci., 1997, 94, 5249-5254)。これらの標的細胞は、全ての代替的転写物を生じる可能性のあるHLA-GゲノムDNAを含むベクターによる、又は
HLA-G1およびHLA-G2タンパク質イソ型をコードするHLA-G1およびHLA-G2のcDNAを
含むベクターのいずれかによるトランスフェクションによって得られることが注
目されるべきである(ヨーロッパ特許出願第0 677 582号および出願PCT/FR98/003
33)。

【００１６】 NK細胞は、クラスI MHC分子に関するレセプター(キラー抑制性レセプターまた
はKIR、或いは、NK抑制性レセプターに関するNKIR)を発現し、該レセプターは、
リガンドとして作用するこれらのHLA分子が、これらのレセプターによって認識されるとき、細胞障害性の抑制に関連する；例えば、N. Rouas-Freissら(Proc.
Natl. Acad. Sci. , 1997, 94, 5249-5254)は、HLA-Gの発現が、HLA-G1およびG2
イソ型でトランスフェクトされたK562(ヒト赤白血病細胞系)標的細胞を溶解に対
して保護することを示した。これらの細胞は、通常は、NK細胞に対して感受性で
ある。

【００１７】これらの結果は、免疫耐性抗原としてのHLA-G分子の基本的役割を証明する。これらの結果は、膜結合したイソ型の全てに広げられた。様々な細胞タイプ、特
にトランスフェクトされたK562細胞およびM8腫瘍細胞中で、トランスフェクショ
ン後に発現されるHLA-G1、G2、G3およびG4イソ型をコードするcDNAは、NKおよび
CTL細胞障害性機能を抑制する。

【００１８】 HLA-G分子が果たし得る重要な役割を仮定すれば、本発明者は、彼らの仕事を続けながら、より詳細には腫瘍細胞を研究し、特に特定の腫瘍上に存在するHLA-
G抗原を阻害する治療に感受性である、固形腫瘍を選択するツールを提供する目標を特に自らに与えた。

【００１９】本発明の主題は、固形腫瘍のHLA-G転写プロフィールを、該腫瘍に好適な治療を選択するために、および／または該腫瘍の進行をモニターするために、確立す
る方法であり、それは、 (i)腫瘍サンプルの取り出し； (ii)該サンプルからmRNAの抽出；RNA試薬NOW(Ozyme、フランス)を用いる改変されたChomczynskiおよびSacchiの方法が特に使用され得る； (iii)該RNAの逆転写(RT)； (iv)各HLA-Gイソ型に特異的なプライマーの存在下に(iii)で得られたcDNAの連
続する又は同時的な増幅、および電気泳動および／または特異的ハイブリダイゼ
ーションで得られた増幅産物の分析、および (v)該サンプルのHLA-G転写プロフィールの確立、を包含することを特徴とする。

【００２０】好ましくは、逆転写は、mRNA上でオリゴdTsによりプライムされ、該mRNAは、予め例えば65℃で、M-MLV逆転写酵素(Gibco-BRL、Life technologies)のような逆転写酵素の存在下に変性される。

【００２１】また好ましくは、cDNA増幅は、下記の表に従い、様々なHLA-Gイソ型に特異的なプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって行われる：

【００２２】

【表１】

【００２３】

【表２】

【００２４】驚くべきことに、本発明者は、少なくとも幾つかの固形腫瘍が、HLA-G抗原を発現することを見い出し、このHLA-G抗原が、NK細胞による破壊に対して腫瘍細胞(固形腫瘍)を保護するのに機能的役割を果たすことを示した。彼らは、該腫瘍
細胞表面で、特定のHLAイソ型の有効な存在も示した。

【００２５】しかしながら、また驚くべきことに、腫瘍系に依存して、HLA-Gプロフィール(
転写物およびタンパク質)は異なる。

【００２６】例えば、幾つかの黒色腫系では、HLA-G2/G4およびG3イソ型の存在が観察され得、該イソ型は、他の系でHLA-G1イソ型がするように、NK細胞に誘発される細胞
溶解に対して、これらの系を保護する。

【００２７】他の系では、全てのHLA-G転写物が検出される。HLA-G1タンパク質形態は、抗H
LA-G抗体を用いた免疫蛍光法によって検出され、NK溶解を抑制する。

【００２８】黒色腫を有する患者からの生検の分析は、抗HLA-G1抗体を用いる凍結切片上で
の免疫組織化学によって検出可能であるHLA-G1タンパク質の高い発現と関連する
、幾つかの腫瘍(原発性および転移性)において高レベルのHLA-G転写物を示す。

【００２９】この高いHLA-Gの転写および発現は、腫瘍組織に特異的であり、健康な組織では検出されない。

【００３０】特定の黒色腫では、可溶性(G5)および膜結合イソ型の転写の解離が観察される
。患者の分析は、４つのHLA-G転写および発現プロフィールを示す。

【００３１】

【表３】

【００３２】可溶性タンパク質の発現は、プロフィールP4を示す患者で免疫組織化学によっ
て検出される。

【００３３】本発明の主題はまた、固形腫瘍のHLA-G発現プロフィールを、該腫瘍に好適な治療を選択するために、および／または該腫瘍の進行をモニターするために、確
立する方法であり、それは、 (i)腫瘍サンプルの取り出し； (ii)該サンプルからの組織学的切片の調製； (iii)HLA-Gの膜結合および可溶性イソ型に特異的な抗体を用い、(ii)で得られ
たサンプルの細胞の標識化；および (iv)標識細胞を検出することによる該サンプルのHLA-G発現プロフィールの確立、を包含することを特徴とする。

【００３４】本発明の主題はまた、固形腫瘍のHLA-G発現プロフィールを、該腫瘍に好適な治療を選択するために、および／または該腫瘍の進行をモニターするために、確
立する方法であり、それは、 (i)腫瘍サンプルの取り出し； (ii)必要に応じて、該サンプルの細胞の標識化； (iii)細胞の溶解； (iv)溶解した細胞を、クラスI HLA抗原に対する様々な抗体と接触させること、その結果おそらくHLA-Gイソ型／抗体コンプレックスを形成すること、および (v)該サンプルのHLA-G発現プロフィールの、工程(iv)で形成されたコンプレッ
クスを検出することによる確立、を包含することを特徴とする。

【００３５】好ましくは、工程(iv)において、免疫沈降物が得られ、それは工程(v)で電気泳動により分離され、膜上に移され、そして検出される。

【００３６】本発明に従うと、該抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。

【００３７】特定の腫瘍細胞および／または腫瘍を浸潤する細胞(マクロファージ、樹状細胞)によるHLA-G発現の研究は、可能性として有効なタイプの治療をより良く評価
可能にさせる。

【００３８】特に、固形腫瘍のHLA-G発現転写プロフィールの知識は、最良の可能な治療を選択し、該治療の機能として腫瘍の進行をフォローするのに重要である。

【００３９】本発明の主題はまた、腫瘍細胞によるHLA-Gsの転写および／または発現を調節
する(抑制)ファクターを選択する方法であり、それは、 (i)腫瘍サンプルの取り出し、 (ii)該サンプルから腫瘍細胞の単離、 (iii)(ii)で得られた腫瘍細胞の一次培養、 (iv)テストされる物質の添加、 (v)該テストされる物質による治療後の該腫瘍細胞のHLA-G転写および／または
発現プロフィールを確立することによる、得られた効果の視覚化、および (vi)抗腫瘍反応(NKおよびCTL反応)に対するその治療効果をインビトロでテストすること、を包含することを特徴とする。

【００４０】有利には、生検に由来する細胞系は、HLA-G陽性腫瘍細胞の場合に、より優れた抗腫瘍反応を再確立する目標で、インビトロでの治療に対する感受性を評価し
、HLA-G発現を減少させ得る薬剤(スクリーニングツール)を決定することを可能にする。

【００４１】そのような細胞は、HLA-Gsの転写および／または発現を研究するモデルとして
有利に使用される。

【００４２】本発明の主題は、HLA-Gを発現する腫瘍の進行をモニターする方法でもあり、それは、患者の血清中のHLA-Gの可溶性形態を、腫瘍播種または転移を形成する腫瘍の能力に関する予後的ファクターとしてアッセイすることを包含することを
特徴とする。

【００４３】該アッセイは、好ましくは、抗可溶性HLA-G抗体を用いて、慣用されている免疫学的方法により行われる。

【００４４】本発明の主題はまた、少なくとも１種のHLA-Gイソ型を発現する固形腫瘍に使用され得る抗腫瘍ワクチンであり、それは、オートロガス腫瘍細胞および可溶性
HLA-G5抗原もしくはそのフラグメントからなる群から選択されることを特徴とし
、そのようなワクチンは、腫瘍特異的細胞障害性Tリンパ球および抗HLA-G抗体の
形成を誘発する。

【００４５】該ワクチンがオートロガス細胞(特に、少なくとも１種のHLA-Gイソ型を発現す
る、治療される個体からの腫瘍細胞)からなるとき、該細胞は、好ましくは抗HLA
-G抗体の産生を効果的に誘発するように修飾される。細胞は、例えば、コレステ
ロール治療または高圧の治療(hyperbaric treatment)に供される。

【００４６】有利には、該可溶性HLA-G抗原、或いは、そのフラグメントは、好適なタンパク質と結合され、必要に応じて、水酸化アルミニウムまたはリン酸カルシウムの
ようなアジュバントと混合される。

【００４７】該ワクチンは、好ましくは、皮下または皮内に投与される。

【００４８】本発明の主題はまた、少なくとも１種のHLA-Gイソ型を発現する固形腫瘍に使用され得る抗腫瘍組成物であり、それは本質的に抗HLA-G抗体からなる(受動免疫
療法)ことを特徴とする。

【００４９】本発明の主題はまた、少なくとも１種のHLA-Gイソ型を発現する固形腫瘍に使用され得る抗腫瘍組成物であり、それは本質的にHLA-Gsの転写および／または発
現を調節する少なくとも１種のファクターからなることを特徴とする。

【００５０】該組成物の１つの有利な実施態様によれば、該調節ファクターは、上記方法を
用いて得られる調節ファクターからなる群から選択され、該ファクターは、HLA-
G活性化剤のアンタゴニストであり、該ファクターは、本発明者によって同定されたもの[インターロイキン-10、グルココルチコイド、インターフェロン、スト
レス作用(放射線、熱ショック、重金属、酸化性ストレス)]であり、アンチセンス核酸および該HLA-Gsの転写および／または発現のホルモン性阻害剤である。

【００５１】本発明の主題はまた、少なくとも１種のHLA-Gイソ型を発現する固形腫瘍の治療において、同時的な使用または別々の使用、或いは、拡大された時間にわたる
使用のための組合せ製品としての、抗HLA-G抗体およびHLA-Gsの発現を調節するファクターを含む製品である。

【００５２】該調節ファクターは、先に記載されたものである。

【００５３】先述のアレンジメントに加えて、本発明は、以下に続く説明から生じる、本発
明の実行の例ならびに添付の図面を参照する他のアレンジメントも含む。

【００５４】しかしながら、これらの実施例は本発明の主題の説明としてのみ示されるもの
であり、決してこれにより限定を構成するものではないことは十分に理解される
べきである。実施例１：種々の腫瘍系のＨＬＡ-Ｇプロフィール分析及びＮＫ細胞による溶解阻害の研究Ａ／材料及び方法１／細胞系Ｋ５６２ヒト赤白血病細胞系（ＡＴＣＣ）及びＮＫ活性を有する未成熟なＴ細
胞白血病系（クローンＹＴ２Ｃ２−ＰＲ）を、１０％の熱不活化したウシ胎児血
清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１μｇ/ｍｌのゲンタマイシン及びfungizone（シ
グマ、サン−クァンタン、フランス）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中に維持し、ＣＯ₂を５％に高めた空気中、加湿したインキュベーター内で３７℃で培養する。１ｍｇ／ｍｌのgeneticin（Ｇ４１８サルフェート、シグマ）を含む培地中でＫ５６２トランスフェクタントを選抜する。

【００５５】ＪＥＧ−３（ＡＴＣＣ）と称するＨＬＡ-Ｇ-陽性ヒト絨毛癌細胞系を、１０％
の熱不活化したウシ胎児血清、抗生物質及び２ｍＭのＬ−グルタミンを添加した
ＤＭＥＭ培地（シグマ）中で培養する。該細胞系はマイコプラズマを含まない。

【００５６】上記系の他に使用されたものは： −ＩＧＲ（ＨＬＡ-Ａ２、Ａ３、Ｂ５８／オス）、Ｍ７４（ＨＬＡ-Ａ１、Ａ２
、Ｂ８、Ｂ１４／メス）、Ｍ８（ＨＬＡ-Ａ１、Ａ２、Ｂ１２及びＢ４０／オス）及びＤＲＡＮ（ＨＬＡ-Ａ２、Ａ３、Ｂ７、Ｂ３５、ＣＷ５、ＣＷ７）黒色腫系、 −流産後に得た第１トリメスター栄養膜組織；これら組織を薄片に切り分け、
直ちにＲＮＡ抽出のために用いる、及び −健常ボランティアより得られ、Ficoll-Hypaque１０７７密度勾配により単離
された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）。

【００５７】２／モノクローナル抗体以下の抗体を使用する：Ｗ６／３２：抗-β２-ｍ-関連クラスIＨＬＡα鎖ＩｇＧ２ａ（シグマ）；ＨＣＡ
２：抗-ＨＬＡ-Ａ及びＧＩｇＧ及び抗-ＨＬＡ-ＧＩｇＧ、８７Ｇ、４Ｈ８４及
び１６Ｇ１。

【００５８】３／ＲＴ−ＰＣＲＲＮＡ試薬ＮＯＷ（Biogentex, Inc.）を製造業者の使用説明書に従って用い、１０⁷細胞より全ＲＮＡを抽出する。変性用１．５％アガロースゲル上の電気泳動でＲＮＡ量を確認する。オリゴ（ｄＴ）_12-18プライマー及びＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（GIBCO-BRL）を用いて、デオキシリボヌクレアーゼＩ(DNAse I）（ベーリンガー・マンハイム）処理した１０μｇの全ＲＮＡよりｃＤＮＡを調製する
。ＨＬＡ-ＧｍＲＮＡイソ型を全て検出するために、以下のプライマー：Ｇ.２５７（エキソン２）及びＧ３.Ｕ（３'ＵＴ）（Ishitani A. et al., Proc. Natl
. Acad. Sci., 1992, 89, 3947-3951; Kirszenbaum M. et al., Proc. Natl. Ac
ad. Sci., 1994, 91, 4209-4213及びMoreau P. et al., C. R. Acad. Sci., 199
5, 318, 837-842）を用いてＨＬＡ-Ｇ特異的ＲＴ−ＰＣＲ増幅を行なう。以下の
プライマーセット： −イソ型Ｇ１，Ｇ４及びＧ５についてＧ．５２６（エキソン３）及びＧ３．Ｕ
（３'ＵＴ）； −イソ型Ｇ５についてＧ．５２６（エキソン３）及びＧ．ｉ４ｂ（イントロン
４）； −イソ型Ｇ２及びＧ６についてＧ．-３（エキソン２及び４を一部カバー）及びＧ３．Ｕ（３'ＵＴ）； −イソ型Ｇ３についてＧ．３-４（エキソン２及び５を一部カバー）及びＧ３．Ｕ（３'ＵＴ）；を用いて各ＨＬＡ-ＧｍＲＮＡフォームに特異的な増幅を行なう。

【００５９】 Kingら（J. Immunol., 1996, 156, 2068-2076）に記載のように、ユニークな５'プライマーＨＬＡ-５Ｐ２、及び各々ＨＬＡ-Ａ、ＨＬＡ-Ｂ及びＨＬＡ-ＣのｍＲＮＡを増幅する３つの３'プライマー、ＨＬＡ-３ｐＡ、ＨＬＡ-３ｐＢ、ＨＬＡ-３ｐＣを用いて、通常のクラスIＨＬＡのｃＤＮＡを増幅する。

【００６０】ＤＲＡ特異的プライマーが上記Kingらに記載されている。

【００６１】各々の実験においてClontechテストを用いてβアクチンｃＤＮＡの共増幅を行
ない（１６サイクル）、サンプル中のＲＮＡ相対量を評価する。１％アガロース
ゲル上の電気泳動によりＰＣＲ産物を分析し、エチジウムブロマイドで染色する
。０．４ＮのＮａＯＨ中ナイロンメンブレン（Hybond N+、アマシャム、フランス）上でのフラグメントのアルカリブロッティングによりＰＣＲ産物の特異性を
確認する。

【００６２】特異的ＨＬＡ-Ｇプローブは以下の通りである： −ＧＲ、エキソン２特異的、 −Ｇ.６４７Ｆ（5'-CCACCACCCTGTCTTTGACT ：エキソン４特異的）、 −Ｇ.Ｉ４Ｆ（GAGGCATCATGTCTGTTAGG：イントロン４特異的）、及び −Ｇ.９２７Ｆ（5'-ATCATGGGTATCGTTGCTGG：エキソン５特異的）。

【００６３】他のプローブは以下の通りである： −ＨＬＡ-Ａ特異的プローブ（5'GGAGGACCAGACCCAGGACACG）、 −ＨＬＡ-Ｂ特異的プローブ（5'AGCTCCGATGACCACAACTGC） −ＨＬＡ-Ｃ特異的プローブ（5'TGTCCTAGCTGCCTAGGAG）及び −ＨＬＡ−ＤＲＡ特異的プローブ（TGTGATCATCCAGGCCGAG）。

【００６４】フィルターを、増幅用スクリーンと共にKodakフィルム（Biomax）上に４から１６時間、−８０℃で露光する。

【００６５】４／表面ビオチン化タンパク質の免疫沈降及びウェスタンブロット。

【００６６】表面タンパク質をビオチンで標識する。ＰＢＳ中で洗浄後、１．５×１０⁷細胞を、５ｍｌのＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン（Pierce、ロックフォード、ＩＬ）を含
む１ｍｌの冷ＰＢＳ中で１５分間４℃でインキュベートする。残存活性グループ
は５０ｍＭのＮＨ₄Ｃｌ中、１０分間４℃で阻害する。該細胞を１％トリトンＸ１００／ＰＢＳ中で溶解する。Ｗ６／３２抗体で沈殿したタンパク質を１２％Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースメンブレン上に移し、セイヨウワサ
ビペルオキシダーゼ−ストレプトアビジン複合体と共に配置する。

【００６７】メンブレンを完全に洗浄した後、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬（
アマシャム、フランス）を用いて染色反応を行ない、その後メンブレンを室温で
Kodakフィルムに露光する。

【００６８】５／細胞障害性アッセイ末梢血単核細胞、ＮＫ細胞及びＹＴ２Ｃ２−ＰＲ細胞（エフェクター細胞又は
Ｅ）のＨＬＡ−Ｇトランスフェクタント（標的細胞又はＴ）に対する細胞障害活
性を、クロム５１の４時間放出アッセイを用いて評価する。このアッセイにおい
て、Ｕ字底をもつマイクロ滴定プレート中、エフェクター細胞を、クロム５１（
１００μＣｉの⁵¹Ｃｒ−クロム酸ナトリウム、アマシャム、ＵＫ）で標識した５
×１０³標的細胞と、種々のＥ／Ｔ比で混合する。

【００６９】５％ＣＯ₂を含む加湿インキュベーター中３７℃で４時間後、１００μｌの上清を液相シンチレーションカウンティング（Wallac 1450 Microbeta、ファルマシア、フランス）のために移す。特異的溶解の割合は以下のように算出する：特異的溶解の割合＝［（実験ウェル中ｃｐｍ−自然放出ｃｐｍ）／（最大放出ｃ
ｐｍ−自然放出ｃｐｍ）］×１００。

【００７０】標識した標的細胞（Ｔ）を培地とインキュベートすることにより、自然放出を
測定する。標的細胞を０．１ＭのＨＣｌ中に可溶化することにより、最大放出を
測定する。全ての実験において、自然放出は最大放出の１０％に満たない。結果
を３つのサンプルの平均として示す。ＨＬＡ−Ｇ−ＮＫ相互作用をブロックする
ためにモノクローナル抗体を用いた実験では、標的細胞を対応するモノクローナ
ル抗体とインキュベートし、その後洗浄し、ヤギ抗マウスＦ（ａｂ'）₂抗体（ジ
ャクソンイムノリサーチ、ＵＳＡ）とインキュベートし、ＮＫ細胞で発現した
免疫グロブリンＦｃフラグメントのレセプターと、最初に用いた抗体との相互作
用による、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を避ける。モノクローナル抗体細胞
障害はまた、各アッセイで検証し、常に３％に満たない。

【００７１】 II−結果１／黒色腫細胞系における種々のＨＬＡ−Ｇ転写物の同定。

【００７２】以前に記載のあるプライマー（A. Ishitani et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 1992, 89, 3947-3951; M. Kirszenbaum et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 1994, 91, 4209-4213）を用いて４つの黒色腫細胞系（ＩＧＲ、Ｍ８，Ｍ７４及びＤＲＡＮ）のＨＬＡ−ＧｃＤＮＡを増幅し、これらプライマーはエキソン２及び非翻訳３'領域に特異的な配列に由来する（材料及び方法参照）（図１）。

【００７３】高レベルのＨＬＡ−Ｇ転写物を示すＪEＧ−３絨毛癌系及び栄養膜細胞をポジティブコントロールとして用い、健常ボランティアの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ
）をネガティブコントロール（低レベルのＨＬＡ−Ｇ転写物）として用いる。

【００７４】ＰＣＲ産物のハイブリダイゼーションにより、２つの黒色腫細胞系すなわちＩ
ＧＲ及びＭ７４において、有意なレベルのＨＬＡ−ＧｍＲＮＡを同定することが可能になった。一方、Ｍ８黒色腫細胞系ではシグナルを全く検出し得ない。

【００７５】ＪＥＧ−３細胞及び栄養膜においては、すべてのＨＬＡ−Ｇ転写物が検出され
る（図１Ａ及び１Ｃ）。

【００７６】ＩＧＲ及びＤＲＡＮ黒色腫細胞においてもまた、すべての転写物がｐａｎ-ＨＬＡ-Ｇプライマーにより検出される（図１Ａ及び１Ｃ）。

【００７７】しかしながら、ｐａｎ-ＨＬＡ-Ｇプライマーでは、１０００ｂｐに対応するバ
ンドに両方存在するＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５シグナル間の区別も、６００
ｂｐフラグメントの形態で共移動するＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ１シグナル間
の区別も不可能である。ＲＴ−ＰＣＲ同定により、特異的プライマー（P. Morea
u et al., C. R. Acad. Sci., 1995, 318, 837-842）を用いてイソ型を単離する
ことが可能になる（材料及び方法参照）。

【００７８】ＩＧＲ及びＤＲＡＮ細胞は、すべてのＨＬＡ−Ｇイソ型を転写物の形で発現し
、ＨＬＡ−Ｇ４及びＨＬＡ−Ｇ５は低いレベルで発現される（図１Ｂ）。

【００７９】Ｍ７４黒色腫細胞系において、ｐａｎ-ＨＬＡ-ＧプライマーはＨＬＡ−Ｇ１及
びＨＬＡ−Ｇ５（１０００ｂｐ）（強いシグナル）、ＨＬＡ−Ｇ２及びＧ４のシ
グナル（６００ｂｐ）に対応するバンドを検出するが、ＨＬＡ−Ｇ３（３００ｂ
ｐ）のシグナルは検出しない（図１Ａ）。特異的イソ型のプライマーは、これら
の細胞においてＧ１及びＧ４イソ型がＰＢＭＣにおけるより多量であり、一方、
Ｇ５転写物のレベルはＰＢＭＣにおいて認められるものと同等であることを明ら
かにする。

【００８０】これらＭ７４細胞では、低いレベルのＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６（ＨＬＡ
−Ｇ２の可溶性形態）ｍＲＮＡが検出され、一方、ＨＬＡ−Ｇ３転写物の特異的
増幅により、これらの細胞でｐａｎ-ＨＬＡ-Ｇプライマーにより観察されるＨＬ
Ａ−Ｇ３の欠如が確認される（図１Ａ及び１Ｂ）。

【００８１】Ｍ８細胞では、ＨＬＡ−Ｇハイブリダイゼーションシグナルは全く認められな
い（図１Ａ及び１Ｂ）。

【００８２】２／黒色腫細胞におけるHLA-G蛋白質の分析黒色腫中に検出されるHLA-G転写物が HLA-G蛋白質に翻訳されるかどうかを決定するために、様々な抗HLAクラスIモノクローナル抗体を用いて免疫沈降研究が
行われた。

【００８３】ポジティブコントロール（JEG-3細胞）及びネガティブコントロール（M8黒色腫細胞）の存在下に、比較が行われる。

【００８４】 W6/32モノクローナル抗体を用いた免疫沈降の結果は、図３に示されている。

【００８５】 JEG-3細胞を用いると、W6/32抗体は、45kDa（HLA-C分子）及び39kDa（膜結合H
LA-G1イソ型）の2つの蛋白質を免疫沈降した。

【００８６】 IGR及びM8細胞において、45kDaの１つの蛋白質のみが検出される。

【００８７】ビオチン化された表面蛋白質の免疫沈降によって、同様の結果が得られる（図
3）。

【００８８】これらのデータは、後者が対応するmRNAを発現するとしても、IGR細胞においては、HLA-G1蛋白質が発現されていないことを示す。

【００８９】しかし、IGR細胞におけるHLA-G1蛋白質の欠如は、3つの他のHLA-Gイソ型（HLA
-G2,G3及びG4）の発現を排除するわけではない。

【００９０】これらの蛋白質は、β2mに結合できないので、W6/32モノクローナル抗体によって明らかにされ得ない。

【００９１】これらの蛋白質を明らかにするために、遊離HLA-G、変性したHLA-G及びHLA-A を認識するモノクローナル抗体（HCA2抗体）、及びHLA-G蛋白質の全イソ型中に存在するα1ドメイン中に局在するエピトープ（抗HLA-G Igモノクローナル抗体）を使用して、メチオニン標識（³⁵S-メチオニン）された蛋白質の免疫沈降が行
われる。

【００９２】モノクローナル抗体は、JEG-3及びDRAN細胞中で39-kDaのHLA-G1蛋白質が存在すること、及びIGR細胞には存在しないことを明らかにする（図4）。

【００９３】 32〜34kDa及び18kDaに移動し、HLA-G2蛋白質及び／又はHLA-G4又はG3蛋白質の
サイズにそれぞれ対応する付加的なバンドは、IGR細胞中に抗HLA-G Igモノクローナル抗体及びHCA2抗体を用いて検出される（図4）。

【００９４】 HLA-G蛋白質に特異的な付加的なバンドは、M74及びM8細胞中では観察されない
し、対応するHLA-G転写物を示さない（図4）。

【００９５】３／NK細胞誘導された細胞溶解に対するIGR系の防御 YT2C2-PR細胞は、NKエフェクター細胞として使用される。

【００９６】 HLA-G2及び／又はG4及びG3イソ型を発現するIGR細胞系、及びHLA-G1を発現するDRAN系は、クローンYT2C2-PR誘導された細胞溶解を廃止する。

【００９７】従来のMHCクラスI抗原を発現するが、HLA-G2及びHLA-G3イソ型の転写及び発現
の選択的欠如を示すM74黒色腫細胞系は、クローンYT2C2-PRによって溶解される。

【００９８】溶解はまた、従来のMHCクラスI抗原を発現するが、HLA-G mRNAを転写しないM8
細胞系を用いて観察される（図1及び5）。

【００９９】 HLA-GsのみがNK細胞誘導溶解のこの阻害に関与することを示すために、HLA-G を発現しないが、IGR系と少なくとも１つのHLA-A, B又はCの対立遺伝子を共有す
るいくつかのEBV-B細胞系が標的細胞として使用される。

【０１００】これら全てのEBV-B系は、クローンYT2C2-PRによって溶解され、HLA-A, B及びC
抗原が、YT2C2-PR溶解に対するIGR及びDRAN黒色腫の保護に関与していないことを示す（図5）。

【０１０１】 IGR細胞によるクローンYT2C2-PR誘導溶解がこの細胞系によって伝達されるシグナルではないが、実際にNK細胞に対するこれらのIGR細胞の固有の耐性につながっていることを示すために、IGR細胞は、標的細胞（T）がM8細胞であり、YT2C
2-PR細胞がエフェクター細胞（E）である、細胞障害性のアッセイにおける阻害剤として使用された。

【０１０２】図5Bは、IGR細胞がクローンYT2C2-PRによるM8細胞の溶解を効率的に阻害することを示す；この阻害は、競合的アッセイに使用されるIGR細胞の数に比例する。実施例２：黒色腫の生検におけるHLA-G転写物及び蛋白質の検出Ａ／材料及び方法１／腫瘍サンプル生検は、患者からの組織のサンプルについて行われた。

【０１０３】取り出した直後、サンプルを液体窒素中で凍結し、RNAを抽出するまで貯蔵する。

【０１０４】２／免疫組織化学黒色腫生検から調製され、アセトンで固定され、PBSでリンスされ、PBS中正常
ウサギ血清（DAKO）でブロックされた切片上で免疫組織化学を行うために、標準
の方法が用いられる。

【０１０５】サンプルを1次抗体と共に室温で1時間インキュベートし、次いで2次抗体（FIT
C-結合ウサギ抗マウスIg）（DAKO）と共にインキュベートする。

【０１０６】切片を核染料（DAPI, Sigma）で対比染色し、適当な培地中で調製する。Io24
MRC共焦点顕微鏡（Bio-Rad）を用いて蛍光が分析される。以下の抗体が使用され
る：W6/32：抗-β２-ミクログロブリン結合HLA-GクラスI重鎖IgG2a（Sigma）及び87G：HLA-G1イソ型を検出する抗HLA-G IgG2b。

【０１０７】他の技術は実施例1と同様である。

【０１０８】 B／結果１／ex vivoでの黒色腫生検におけるHLA-G転写の分析いくつかの黒色腫生検において、全HLA-G転写物が有意なレベルで検出され、一方健康なヒトの皮膚では1000-bpバンドのみ検出される（図2及び6）。これらの結果は他の生検で確認され、黒色腫細胞で観察される有意な転写レベルは後者
に特異的であり、健康な組織中では観察できないことを示す。

【０１０９】より正確には、高いレベルのHLA-G転写物は、特に原発腫瘍及び転移において検出される一方、HLA-G転写物の基礎レベル及びHLA-G蛋白質の発現の欠如は、健
康な皮膚又は通常のリンパ節において観察される（図6A）。

【０１１０】同じ患者からの健康な皮膚（HS1）、皮膚原発腫瘍（SP1）及び皮膚原発腫瘍に
おける腫瘍退縮部分（R1）の分析により、原発腫瘍部位の高いレベルのHLA-G転写物及び蛋白質発現の検出が可能となる一方、健康な皮膚及び腫瘍退縮部位のど
ちらも、基本レベルのHLA-G転写物及びHLA-G1蛋白質発現の完全な欠如を示す（図7）。

【０１１１】原発腫瘍SP1由来の培養された一次細胞（MPP5）もまた、高いレベルのHLA-G転
写物を示す（図7）。

【０１１２】２／ex vivo黒色腫生検における可溶性HLA-G転写の分析黒色腫生検におけるHLA-G5可溶性イソ型に対応する転写物（mRNA）の特異的な
増幅は、高いレベルのHLA-G5の転写物が、HLA-Gの膜結合イソ型に対応した高いレベルの転写物を現すことが示された特定の黒色腫生検において検出されること
を示す（図8）。

【０１１３】更に他の場合において、HLA-G5レベル及び他のHLA-G転写物のレベルの間に解離が観察される：高いHLA-G1, G2, G3及びG4レベルが以前に観察された黒色腫生
検において、HLA-G5転写物は観察されない。

【０１１４】リンパ節転移LNM2だけでなく、皮膚原発腫瘍SP1及びそれに対応する培養細胞M
PP5は、膜結合HLA-Gイソ型に対応する高いレベルのHLA-G転写物を示すが（図8）
、HLA-G5転写物は同じサンプル中には検出されない。

【０１１５】３／黒色腫生検における膜結合及び可溶性蛋白質の分析高いレベルのHLA-G転写物は、黒色腫生検において、抗HLA-Gモノクローナル抗
体（抗体87G）によるHLA-G蛋白質の発現の特異的な検出に相関する。特に、転移
リンパ節（LNM2）生検におけるHLA-G発現の免疫組織化学的な分析によって、抗体87G及び抗体W6/32の両方を用いてLNM2の陽性の染色を観察することが可能にな
る。一方、同じ患者からの健康な皮膚からなるネガティブコントロールは、抗HL
A-G抗体では染色されない。

【０１１６】この研究を更に精密にするために、可溶性HLA-G蛋白質を特異的に検出する抗体、すなわち抗体16G1（Lee et al., Immunity, 1995, 3, 591-600）は、高いレ
ベルのHLA-G5の転写物を示す患者のリンパ節生検において可溶性HLA-G蛋白質の発現を実証することが可能となる（図8）。

【０１１７】免疫組織化学的分析は、この生検の染色を可能とするが、一方、高いレベルの
他のHLA-Gイソ型を示す患者の黒色腫生検において、同じ抗体を使用しても、検出可能な発現が観察されなかった。

【０１１８】特に、LNM2生検における可溶性HLA-Gの発現の免疫組織化学的分析は、アセトン固定LNM2生検切片が抗黒色腫抗体HMB45（DAKO, Glostrup,; Skelton, et al.,
Am. J. Dermatopathol., 1991, 13, 543-550）及び抗可溶性HLA-G抗体16G1によ
って陽性に染色されるが、ネガティブコントロールは染色されないことを示す。

【０１１９】上記から現れるように、本発明は、より明確に記載された実行、完成及び応用
の様式に限定されない。それとは対照的に、本発明の文脈又は範囲から離れずに
当業者に起こり得るその全ての変形を含む。

【図面の簡単な説明】

【図１】 −図１に示すのは：（Ａ）：黒色腫細胞におけるＨＬＡ-Ｇイソ型ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析。ｐａｎ-ＨＬＡ-Ｇプライマー［プライマーＧ．２５７（エキソン２）及び３
Ｇ．Ｕ（非翻訳３'末端）］を、種々の公知ＨＬＡ-Ｇイソ型に対応するＨＬＡ- Ｇ転写物のＰＣＲ増幅のために用いる。ＪＥＧ−３絨毛癌細胞及び第１トリメス
ター栄養膜（ＴＲＯ）、及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来のｃＤＮＡを用い
、これらの細胞は、ＨＬＡ-Ｇの高転写レベル及び基礎転写レベル各々のためのコントロール細胞として用いられる。ＩｇＲ，Ｍ８，ＤＲＡＮ及びＭ７４は黒色
腫細胞系のｃＤＮＡの増幅に対応する。ＧＲ特異的プローブとのハイブリダイゼ
ーションにより、特異的なＨＬＡ-Ｇバンドが現れ、これはエキソン２上に位置する。ＨＬＡ-Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４及びＧ５転写物に対応するバンドを矢印で示す。βアクチンプライマーを用いた同一反応中に共増幅したＰＣＲ産物を、
βアクチンプローブを用いて同一メンブレン上で検出する；（Ｂ）：この図は黒色腫細胞中の択一的転写物のＲＴ−ＰＣＲ検出に対応
する。プライマー３はＨＬＡ−Ｇ２及びエキソン３をもたない可溶性ＨＬＡ-Ｇ２（Ｇ６）イソ型に特異的である。プライマー３．４はＨＬＡ-Ｇ３ｍＲＮＡ転
写物の識別を可能にしている。プライマーＧ．５２６及びＩ４ｂは特にＨＬＡ- Ｇ５転写物を増幅し、これは可溶型に対応する。βアクチンプライマーを用いた
同一反応中に共増幅したＰＣＲ産物を、βアクチンプローブを用いて同一メンブ
レン上で検出する；（Ｃ）：この図は黒色腫細胞中のＨＬＡ-ＧｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析
に対応する。ｐａｎ-ＨＬＡ-Ｇプライマー［プライマーＧ．２５７（エキソン２
）及び３Ｇ．Ｕ（非翻訳３'末端）］を、種々の公知のＨＬＡ-Ｇイソ型に対応す
るＨＬＡ-Ｇ転写物のＰＣＲ増幅のために用いる。ＪＥＧ−３絨毛癌細胞由来のｃＤＮＡを用い、これらの細胞は、高転写レベルのためのコントロール細胞とし
て用いられる。ＩｇＲ，Ｍ８，及びＤＲＡＮが黒色腫細胞系ｃＤＮＡの増幅に対
応する。ＧＲ特異的プローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特異的な
ＨＬＡ-Ｇバンドが現れ、これはエキソン２上に位置する。ＨＬＡ-Ｇ１、Ｇ２、
Ｇ３、Ｇ４及びＧ５転写物に対応するバンドを矢印で示す。βアクチンプライマ
ーを用いた同一反応中に共増幅したＰＣＲ産物を、βアクチンプローブを用いて
同一メンブレン上で検出する。

【図２】 −図２は、黒色腫転移の生検（皮膚のin vivo及びex vivo分析）におけるＨＬ
Ａ-Ｇイソ型ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ｐａｎ-ＨＬＡ-ＧプライマーＧ．２５７及び３Ｇ．Ｕを、ex vivo転移皮膚由来（ＭＥＬ）及び同一患者の健常皮膚生検由来（ＨＳ）のＨＬＡ-Ｇ転写物のＲＴ−ＰＣＲ増幅に用いる；ＪＥＧ−３細胞及び第１トリメスター栄養膜をコントロール（高レベルのＨＬＡ-Ｇ転写）として用いる。エキソン２に位置するＧＲ特異的プローブを用いたハイブ
リダイゼーションにより、ＨＬＡ-Ｇ特異的なバンドが現れる。転写物ＨＬＡ-Ｇ
１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４及びＧ５に対応するバンドを矢印で示す。

【図３】 −図３は、Ｗ６／３２モノクローナル抗体を用い、ＪＥＧ−３細胞においてＨ
ＬＡ-Ｇ１タンパク質が検出されるが、ＩＧＲ及びＭ８黒色腫細胞ではされないことを示す：黒色腫及びＪＥＧ−３細胞のビオチン化表面タンパク質を、モノク
ローナル抗体Ｗ６／３２を用いて免疫沈降する；免疫沈降物を１２％のＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより分離し、セルロースメンブレン上に移す。クラスIの表面分子をストレプトアビジン−複合ペルオキシダーゼにより検出する。

【図４】 −図４に、遊離ＨＬＡ-Ｇの重鎖に対する抗体及びモノクローナル抗体４Ｈ８４及びＨＣＡ２を用いた、ＩＧＲ黒色腫細胞のＨＬＡ-Ｇイソ型の免疫沈降を示す。細胞を３０分間標識し、特異的抗体により免疫沈降し、免疫沈降物を１０％
のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。ＨＬＡ-Ｇ重鎖（ＪＥＧ−３細胞において３９ −ｋＤａのバンド）と反応する抗体４Ｈ８４は、ＨＬＡ-Ａ、-Ｂ及び／又はＣ重
鎖（テストした全ての細胞において４５ｋＤａのバンド）との交差反応を示す。

【図５】 −図５に示すのは：（Ａ）：クローンＹＴ２Ｃ２−ＰＲによる溶解への感受性に対する、ＩＧＲ黒
色腫でのＨＬＡ-Ｇ発現の影響。ベクターのみ、またはｃＤＮＡを含むＨＬＡ-Ｇ
１ベクター、或いはＨＬＡ-Ｇ２ベクターでトランスフェクトされたＫ５６２細胞、及びＭ８、Ｍ７４，ＩＧＲ及びＤＲＡＮ系を標的細胞（Ｔ）として用いる。
クローンＹＴ２Ｃ２−ＰＲをエフェクター細胞／標的細胞（Ｅ／Ｔ）比５０／１
でエフェクター細胞（Ｅ）として用いる。結果を４時間のクロム５１−放出アッ
セイを記録した溶解の割合として表示する。自然放出は最大放出の１０％を決し
て超えない。この実験は少なくとも５回行い、その度、同じ結果を生じる；（Ｂ）：クローンＹＴ２Ｃ２−ＰＲにより誘導される溶解の阻害は、ＩＧＲ及
びＤＲＡＮ細胞によって伝達された「オフ」シグナルによる。Ｍ８系を標的細胞
（Ｔ）として用い、クロム標識する。クローンＹＴ２Ｃ２−ＰＲをＥ／Ｔ比５０
：１でエフェクター細胞（Ｅ）として用いる。ＩＧＲ及びＤＲＡＮ細胞を阻害細
胞として加え、阻害細胞／標的細胞比を１００、５０、及び２５：１とする。０
はＩＧＲ細胞がアッセイに全く加えられなかったことを示す；（Ｃ）：ＨＬＡ-Ｇ-陽性黒色腫細胞（標的細胞Ｔ）により誘導される溶解の阻
害。本図は、クローンＹＴ２Ｃ２−ＰＲによる溶解への感受性に対する、ＩＧＲ
及びＤＲＡＮ黒色腫細胞によるＨＬＡ-Ｇ発現の影響を、より詳しく示す。Ｂ− ＥＢＶ、ＨＬＡ-Ｇ陰性［ＨＯＭ（Ａ３、Ｂ２７、Ｃｗ１）、ＢＭ（Ａ２９、Ｂ６１、Ｃｗ２）、ＳＰＯ（Ａ３、Ｂ７、Ｃｗ７）、ＳＷＥ（Ａ２、Ｂ４４、Ｃｗ
５）］である各々の細胞系は、クローンＹＴ２Ｃ２−ＰＲにより溶解される。こ
のクローンを５０／１のＥ／Ｔ比でエフェクター細胞（Ｅ）として用いる。結果
を４時間のクロム５１放出アッセイを記録した溶解の割合として表示する。自然
放出は最大放出の１０％を決して超えない；（Ｄ）及び（Ｅ）：これらの図は、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３及びＧ４分子をコードす
るｃＤＮＡでトランスフェクトされたＨＬＡ-Ｇ陰性Ｍ８腫瘍細胞が、ＮＫ溶解（図５Ｅ）及び細胞障害性Ｔ応答（図５Ｄ）を阻害することを示す。図５Ｄは、
Ｘ軸上にエフェクター細胞（Ｅ）（インフルエンザペプチドに特異的な制限され
たＨＬＡ-Ａ２系）／標的細胞（Ｔ）（トランスフェクトされたＭ８系）比を、またＹ軸上に特異的溶解の割合を包含する。下表はこの図で得られた値に対応す
る。

【表４】 −図５Ｅは、Ｘ軸上にエフェクター細胞（Ｅ）（クローンＹＴ２Ｃ２−ＰＲ）
／標的細胞（Ｔ）（トランスフェクトされたＭ８系）比を、またＹ軸上に特異的
溶解の割合を包含する。

【図６】 −図６はヒト黒色腫の生検におけるＨＬＡ-Ｇ転写物の検出を示す。健常皮膚（ＨＳ）生検につき及び健常リンパ節（ＨＬＮ）につき、一方でまたリンパ節転
移生検（ＬＮＭ１及びＬＮＭ２）について、上記プライマーＧ.２５７及びＧ．３Ｕを用いてＲＴ−ＰＣＲ増幅を行なう。ＪＥＧ−３絨毛癌細胞を、高転写レベ
ルのためのコントロール細胞として用いる。エキソン２に位置するＧＲ特異的プ
ローブとのハイブリダイゼーションにより、特異的ＨＬＡ-Ｇバンドが現れる。転写物ＨＬＡ-Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４及びＧ５に対応するバンドを矢印で示す。βアクチンプライマーを用いた同一反応中に共増幅したＰＣＲ産物を、βアク
チンプローブを用いて同一メンブレン上で検出する。

【図７】 −図７は原発黒色腫瘍の生検における、また誘導ＭＰＰ５一次細胞培養におけ
る（ex vivo分析）、ＨＬＡ-Ｇ転写物のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。同一患者より
得られる健常皮膚（ＨＳ１）生検から、皮膚原発腫瘍（ＳＰＴ１）から、及び退
縮中の腫瘍（Ｒ１）からの、これらは同じ患者から得られる、また、皮膚腫瘍組
織（ＭＰＰ５）より得られる誘導一次細胞からの増幅のために、上記ｐａｎ-ＨＬＡ-Ｇプライマーを用いる。ＭＰＰ５細胞及びＳＰＴ１生検は類似のＨＬＡ-Ｇ
転写レベルを示す。ＪＥＧ−３細胞を高レベルのＨＬＡ-Ｇ転写のコントロールとして用いる。エキソン２に位置するＧＲ特異的プローブとのハイブリダイゼー
ションにより、ＨＬＡ-Ｇ特異的バンドが明らかになる。転写物ＨＬＡ-Ｇ１、Ｇ
２、Ｇ３、Ｇ４及びＧ５に対応するバンドを矢印で示す。βアクチンプライマー
を用いた同一反応中に共増幅したＰＣＲ産物を、βアクチン特異的プローブを用
いて同一メンブレン上で検出する。

【図８】 −図８が示すのは：（Ａ）黒色腫生検におけるＲＴ−ＰＣＲによるＨＬＡ-Ｇ５転写物の特異的検出。健常リンパ節（ＨＬＮ）から、皮膚原発腫瘍（ＳＰＴ１）から、及びリンパ
節転移の２生検（ＬＮＭ１及びＬＮＭ２）からのＨＬＡ-Ｇ５転写物の増幅を、プライマーＧ.５２６及びＧ.ｉ４ｂを用いて行なう。イントロン４に位置するＩ
４Ｆプローブとのハイブリダイゼーションにより、ＨＬＡ-Ｇ５転写物に対応するバンドを検出する；ＪＥＧ−３細胞をコントロールとして用いる（高レベルの
ＨＬＡ-Ｇ５転写）。ＨＬＡ-Ｇ５転写物に対応するバンドを矢印で示す。βアク
チンプライマーを用いた同一反応中に共増幅したＰＣＲ産物を、βアクチン特異
的プローブを用いて同一メンブレン上で検出する；（Ｂ）ＬＮＭ１生検における可溶性ＨＬＡ-Ｇ発現の免疫組織化学分析。ＬＮＭ１生検の凍結及びアセトン−固定切片は、抗黒色腫抗体ＨＭＢ４５（ＤＡＫＯ
）及び抗可溶性ＨＬＡ-Ｇ抗体１６Ｇ１でポジティブに染色されるのに対し、エンビジョン(Envision)抗マウス、ペルオキシダーゼシステム（ＤＡＫＯ）及びＡ
ＥＣを基質として用いたネガティブコントロールは染色しない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 16/28 16/28 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ａ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/574 ＡＧ０１Ｎ 33/574 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者ポールパスカルフランス国エフ−75010 パリリュドゥラグランジォベル 29 (72)発明者ルアー−フレイスナタリーフランス国エフ−75013 パリブールバールアラゴ 44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】固形腫瘍のHLA-G転写プロフィールを、該腫瘍に好適な治療を選択するために、および／または該腫瘍の進行をモニターするために確立する
方法であり、それは、 (i)腫瘍サンプルの取り出し； (ii)mRNAの抽出； (iii)該RNAの逆転写(RT)； (iv)各HLA-Gイソ型に特異的なプライマーの存在下に(iii)で得られたcDNAの連
続する又は同時的な増幅、および電気泳動および／または特異的ハイブリダイゼ
ーションで得られた増幅産物の分析、および (v)該サンプルのHLA-G転写プロフィールの確立、を包含することを特徴とする。
【請求項２】固形腫瘍のHLA-G発現プロフィールを、該腫瘍に好適な治療を選択するために、および／または該腫瘍の進行をモニターするために確立する
方法であり、それは、 (i)腫瘍サンプルの取り出し； (ii)該サンプルからの組織学的切片の調製； (iii)HLA-Gの膜結合および可溶性イソ型に特異的な抗体を用い、(ii)で得られ
たサンプルの細胞の標識化；および (iv)標識細胞を検出することによる該サンプルのHLA-G発現プロフィールの確立、を包含することを特徴とする。
【請求項３】固形腫瘍のHLA-G発現プロフィールを、該腫瘍に好適な治療を選択するために、および／または該腫瘍の進行をモニターするために確立する
方法であり、それは、 (i)腫瘍サンプルの取り出し； (ii)必要に応じて、該サンプルの細胞の標識化； (iii)細胞の溶解； (iv)溶解した細胞を、クラスI HLA抗原に対する様々な抗体と接触させること、その結果おそらくHLA-Gイソ型／抗体コンプレックスを形成する、および (v)該サンプルのHLA-G発現プロフィールの、工程(iv)で形成されたコンプレッ
クスを検出することによる確立、を包含することを特徴とする。
【請求項４】腫瘍細胞によるHLA-Gsの転写および／または発現を調節する
ファクターを選択する方法であり、この方法は、 (i)腫瘍サンプルの取り出し、 (ii)該サンプルからの腫瘍細胞の単離、 (iii)(ii)で得られた腫瘍細胞の一次培養、 (iv)テストされる物質の添加、 (v)テストされる該物質による治療後の該腫瘍細胞のHLA-G転写および／または
発現プロフィールを確立することによる得られた効果の視覚化、および (vi)抗腫瘍反応に対するその治療効果をインビトロでテストすること、を包含することを特徴とする。
【請求項５】少なくとも１種のHLA-Gイソ型を発現する固形腫瘍に使用され得る抗腫瘍ワクチンであって、オートロガス腫瘍細胞および可溶性HLA-G5抗原
またはそのフラグメントからなる群から選択されることを特徴とする、抗腫瘍ワ
クチン。
【請求項６】該ワクチンが少なくとも１種のHLA-Gイソ型を発現する治療されるべき個体からの腫瘍細胞からなるとき、該細胞は抗HLA-G抗体の産生を誘発するように修飾されることを特徴とする、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】前記可溶性HLA-G抗原、またはそのフラグメントが好適なタンパク質に結合され、必要に応じて水酸化アルミニウムまたはリン酸カルシウム
のようなアジュバントと組合せられることを特徴とする、請求項５に記載のワク
チン。
【請求項８】少なくとも１種のHLA-Gイソ型を発現する固形腫瘍に使用され得る抗腫瘍組成物であって、本質的に抗HLA-G抗体からなることを特徴とする組成物。
【請求項９】少なくとも１種のHLA-Gイソ型を発現する固形腫瘍に使用され得る抗腫瘍組成物であって、本質的に抗HLA-Gsの転写および／または発現を調
節する少なくとも１種のファクターからなることを特徴とする組成物。
【請求項１０】前記調節ファクターが、請求項４に記載の方法を用いて得
られる調節ファクターからなる群から選択され、該ファクターは、HLA-G活性化剤のアンタゴニスト、アンチセンス核酸および該HLA-Gsの転写および／または発
現のホルモン性阻害剤である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】少なくとも１種のHLA-Gイソ型を発現する固形腫瘍の治療において、同時的な使用または別々の使用、或いは拡大された時間にわたる使用
のための組合せ製品としての、抗HLA-G抗体およびHLA-Gsの発現を調節するファクターを含む製品。
【請求項１２】 HLA-Gsの転写および／または発現を研究する方法であって
、腫瘍組織生検から確立される細胞培養からなることを特徴とする、方法。
【請求項１３】 HLA-Gを発現する腫瘍の進行をモニターする方法であって、腫瘍播種または転移を形成する腫瘍の能力に関する予後的ファクターとして患
者の血清中のHLA-Gの可溶性形態をアッセイすることを包含することを特徴とする、方法。