JP2004504816A - 幹細胞を同定および／または単離し、白血病治療に対する応答性を予後判定する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＢＣＲＰの発現に基づいて、幹細胞を同定および／または単離する方法を含む。本発明はまた、幹細胞について富化された細胞集団を得、および／または用いる方法を記載する。さらに、白血病細胞におけるＢＣＲＰ発現をアッセイすることによる、白血病、特にヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を診断、および／または予後判定するための方法を提供する。

Description

【０００１】
研究支援
本発明に至る研究は、部分的に、国立衛生研究所グラント番号：ＰＯｌ ＨＬ ５３７４９−０４および癌センター支援グラントＰ３０ ＣＡ２１７６５により、支援された。政府は、本発明において、一定の権利を有し得る。本発明についての支援は、また、アメリカレバノンシリア関連慈善団体（ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＬＥＢＡＮＥＳＥ ＳＹＲＩＡＮ ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＣＨＡＲＩＴＩＥＳ）およびメンフィス社のアッシジ協会（ＡＳＳＩＳＩ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ ＯＦ ＭＥＭＰＨＩＳ ＩＮＣ）により提供された。
【０００２】
発明の分野
本発明は、幹細胞を同定および／または単離する方法を提供する。本発明はまた、幹細胞について富化した細胞集団を用いる方法を提供する。さらに、本発明は、ヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を診断および／または予後判定するための方法を提供する。
【０００３】
発明の背景
個別の成体哺乳類の細胞および細胞タイプのすべては、単一の細胞、接合子から誘導される。しかし、細胞が成熟し、分化するに従って、これらは、異なる細胞タイプに転化するこれらの能力を失う。従って、ほとんどの成体細胞は、完全に分化し、通常は他の細胞タイプに転化し得ない。１つの特定の例外は、成体幹細胞である。成体幹細胞は、他の細胞タイプに分化する能力を維持するが、この分化は、一般的に、単一の組織タイプの細胞の形成に限定される。例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、血液および免疫系の任意の細胞タイプに分化することができ、一方脳幹細胞は、脳の種々の細胞タイプに分化することができる。近年、幹細胞を用いる、退行性疾患および／または癌（例えば白血病）を治療するための療法が設計された。しかし、現在まで、ヒトドナーからの幹細胞を単離することは、幹細胞が比較的稀少であるため、極度に困難であることが明らかになった。
【０００４】
造血幹細胞は、動物の生涯にわたり、新たなＨＳＣの連続的な産生をもたらす、自己複製的分裂についてのこれらの能力に基づいて、および多能性造血分化についてのこれらの能力により、機能的に定義される。造血幹細胞が分裂する際に、得られる娘細胞についての、３種の可能な一般的な結果がある：（ｉ）分化、（ｉｉ）自己複製または（ｉｉｉ）アポトーシス。骨髄移植、遺伝子療法および基本的造血に対するその関連性による、ＨＳＣの広範な研究にもかかわらず、これらの３種の密に調節される結果を制御する機構は、よく分かっていない。
【０００５】
ＨＳＣについての純化方策は、マウス［Ｓｐａｎｇｒｕｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１： ５８−６２ （１９８８）：（刊行された正誤表は、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４ （４９０８）：１０３０ （１９８９）中に見出される）； Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７５： １７５−１８４ （１９９２）］およびヒトＨＳＣ［Ｚａｎｊａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９３： １０５１−１０５５ （１９９４）、コメント参照；Ｌａｒｏｃｈｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ２： １３２９−１３３７ （１９９６）； Ｃｉｖｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８８： ４１０２−４１０９ （１９９６）］の両方のために開発された。これらの方策のほとんどは、種々の細胞表面抗原に向けられた抗体およびマルチパラメーター細胞選別を用いて、表現型的に定義された細胞集団を単離する。この方法は、十分に高い純度を有するマウス幹細胞集団の単離を可能にして、１０個より少ない細胞で照射されたレシピエントの再構成を可能にし［Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２： １０３０２−１０３０６ （１９９５）； Ｏｓａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３： ２４２−２４５ （１９９６）］、一方顕著に大きい数の選別されたヒト細胞が、異種移植レシピエントを再構成するために必要であった［Ｌａｒｏｃｈｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ２： １３２９−１３３７ （１９９６）； Ｚａｎｊａｎｉ ｅｔ ａｌ， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ２６： ３５３−３６０ （１９９８）、コメント参照］。
【０００６】
ヒトＭＤＲ１遺伝子およびこのマウスホモログは、集合的にＰ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）と呼ばれる、これらの発現産物の、広範囲の細胞毒性薬剤を細胞内部から押し出す能力に基づいて、最初に同定された［Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ４７： ３７１−３８０ （１９８６）およびＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ４７： ３８１−３８９ （１９８６）］。現在では、ＭＤＲ１遺伝子が、ポンプ機能に必要である、保存されたＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）を含む輸送タンパク質のスーパーファミリーに属することが、知られている［Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ５： １６４９−１６５５ （１９９６）］。多くの研究は、Ｐ−ｇｐ発現が、ヒト腫瘍細胞の、癌化学療法に対する耐性において重要な作用を奏することを明らかに示した［ＰａｓｔａｎおよびＧｏｔｔｅｓｍａｎ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｍｅｄ． ４２： ２７７−２８６ （１９９１）］。
【０００７】
Ｐ−ｇｐがまた、広範囲の正常な組織において発現されることを考慮して、一層最近の研究は、ＭＤＲ１様遺伝子の正常な生理学的機能を検討した。マウス遺伝子破壊実験は、種々のＰ−ｇｐの発現が、胆汁中排泄［Ｓｍｉｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ７５： ４５１−４６２ （１９９３）］、脳血液関門の維持［Ｓｃｈｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ７７： ４９１−５０２ （１９９４）］および薬剤の除去［Ｓｃｈｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９４： ４０２８−４０３３ （１９９７）］に必要であることを例証した。Ｐ−ｇｐはまた、細胞膜を貫通する脂質のトランスロケーション［ｖａｎ Ｈｅｌｖｏｏｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ８７： ５０７−５１７ （１９９６）］および特定のアポトーシス経路の調節［Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ９３： １０７５−１０８５ （１９９９）およびＳｍｙｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９５： ７０２４−７０２９ （１９９８）］を含む、一層基本的な細胞機能を媒介することができる。
【０００８】
Ｐ−ｇｐは、ヒトＣＤ３４^＋幹細胞［ＣｈａｕｄｈａｒｙおよびＲｏｎｉｎｓｏｎ， Ｃｅｌｌ， ６６： ８５−９４ （１９９１）］およびマウスｃ−ｋｉｔ^＋幹細胞［Ｓｏｒｒｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ８６： ４９１−５０１ （１９９５）］を含む、種々の造血細胞タイプ［Ｄｒａｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ８０： ２７２９−２７３４ （１９９２）］において発現される。文献証拠のいくつかの行は、Ｐ−ｇｐ発現が、造血幹細胞において機能的に保存されることを示唆する。
【０００９】
保存されたＡＴＰ結合カセットを含む他のＡＴＰ輸送タンパク質は、Ｂｃｒｐ１／Ｍｘｒ／Ａｂｃｐ／ＡＢＣＧ２遺伝子の遺伝子産物である（ここで、任意の哺乳類ソースから得られた際には、ＢＣＲＰと呼ぶが、具体的なマウスまたはヒトの遺伝子または１または２以上の遺伝子産物が、特定的に参照される際には、ｍＢＣＲＰおよびｈｕＢＣＲＰと呼ぶ）。ｈｕＢＣＲＰｃＤＮＡは、ドキソルビシン、トポテカンおよびマイトキサントロンを含む多数の薬剤に耐性である、複数の異なるヒト腫瘍細胞系から最初にクローン化された［Ｄｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１５６６５−１５６７０ （１９９８）：（刊行された正誤表は、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６（５）： ２５６９ （１９９９）中に見出される）；Ｍａｌｉｅｐａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９： ４５５９−４５６３ （１９９９）； Ｍｉｙａｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９： ８−１３ （１９９９）］。
【００１０】
高度に関連するマウスホモログ（ｍＢｃｒｐ１）が、多剤耐性について選択された線維芽細胞からクローン化された［Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９： ４２３７−４２４１ （１９９９）］。２つの重複した半分の部分からなるＭＤＲ１遺伝子の構造とは対照的に、ＢＣＲＰの予測された構造は、単一のＡＴＰ結合カセットおよび膜貫通領域を有する「半輸送体」のものである。ヒトＢＣＲＰ（ｈｕＢＣＲＰ）の発現パターンは、正常なヒト組織において高度に制限され、最高のレベルのｍＲＮＡは、胎盤において検出され、はるかに低いレベルは、成体の器官において検出される［Ｄｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１５６６５−１５６７０ （１９９８）：（刊行された正誤表は、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６（５）： ２５６９ （１９９９）中に見出される）；Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８： ５３３７−５３３９ （１９９８）］。
【００１１】
造血幹細胞は、Ｐ−ｇｐに対する基質である蛍光色素、例えばローダミン（Ｒｈｏ）１２３［ＳｐａｎｇｒｕｄｅおよびＪｏｈｎｓｏｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＳＡ， ８７： ７４３３−７４３７ （１９９０）； Ｆｌｅｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １２２： ８９７−９０２ （１９９３）； Ｏｒｌｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ８２： ７６２−７７０ （１９９３）；およびＺｉｊｌｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９２： ８９０１−８９０５ （１９９５）］およびヘキスト３３３４２［ＭｃＡｌｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ７５： １２４０−１２４６ （１９９０）； Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．， ２１： ６１４−６２２ （１９９３）；およびＬｅｅｍｈｕｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．， ２４： １２１５−１２２４ （１９９６）］を排出するこれらの能力に基づいて、同定することができる。
【００１２】
幹細胞を純化するための１つの特定の方法は、骨髄細胞をヘキスト色素染色して、再構築活性が高度に富化された側方集団（ｓｉｄｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）（ＳＰ）細胞の小さいフラクションを同定することに基づく［Ｇｏｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８３： １７９７−１８０６ （１９９６）］。このＳＰ表現型は、多数の哺乳類種中に存在する幹細胞の原始サブセットを同定し［Ｇｏｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， ３： １３３７−１３４５ （１９９７）］、ベラパミル阻害研究に基づくが、それは、Ｐ−ｇｐまたは他のＡＢＣ輸送体の発現によるのかも知れない［Ｇｏｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８３： １７９７−１８０６ （１９９６）］。
【００１３】
血管内皮増殖因子レセプターの発現について選別することが、ヒト幹細胞をほぼ純粋状態にまで富化させ得ることを例証する最近の報告［Ｚｉｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５： １５５３−１５５８ （１９９９）］にもかかわらず、ヒトＨＳＣの一層良好かつ特異的なマーカーに対する一般的な必要性が、なお存続する。さらに、幹細胞を単離する新たな方法論に対して、大きい必要性がある。
本明細書中でのすべての参考文献の引用は、このような参考文献が、本発明に対する従来技術として入手可能であるという是認として見なされるべきではない。
【００１４】
発明の概要
本発明は、特異的膜貫通排出ポンプを発現する細胞を検出および／または選択することにより、幹細胞を同定および／または純化する方法を提供する。より詳しくは、本発明は、ＢＣＲＰ発現が、すべての現在入手可能なマーカーよりも、幹細胞に対して一層特異的なマーカーであることを開示する。このような幹細胞は、造血幹細胞および他の器官からの側方集団（ＳＰ）幹細胞を含む。従って、本発明は、本明細書中に開示するように、種々の組織からの幹細胞に対する機能的決定因子である、ＢＣＲＰ発現の検出に基づく原始幹細胞を単離するための方法を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、ＢＣＲＰを発現する細胞を同定する方法を提供する。このような態様の１つは、幹細胞を含む（または含むと疑われる）細胞試料を得ること、および細胞試料中の細胞によるＢＣＲＰの発現を検出することを含む。細胞は、ＢＣＲＰが細胞により発現される場合に、幹細胞として同定される。ＢＣＲＰの発現の検出を、この特異的ポンプ活性により実施することができ、即ち、これは、ヘキスト３３３４２色素を除去し得るが、ローダミン１２３色素は除去し得ない（以下の例１参照）。好ましくは、ＢＣＲＰの発現の検出は、ＢＣＲＰ（一層好ましくは、ＢＣＲＰの細胞外部分）に結合する抗ＢＣＲＰ抗体を用いて実施する。次に、幹細胞を、抗ＢＣＲＰ抗体へのこれらの結合により同定することができる。このような態様の１つにおいて、抗体は、ポリクローナル抗体である。他の態様において、抗体は、モノクローナル抗体である。あるいはまた、ＢＣＲＰの発現の検出を、ＢＣＲＰを発現する核酸配列について誘導されるＰＣＲプローブを用いたＰＣＲにより実施する（以下の例１参照）。
【００１６】
他の態様において、本発明は、さらに、１または２以上の追加の幹細胞マーカー、即ち幹細胞により発現されたタンパク質の発現を検出することを含む、幹細胞を同定するための方法を提供する。次に、ＢＣＲＰを発現し、１または２以上のこのような幹細胞マーカーを発現する細胞を、幹細胞として確認する。このような態様の１つにおいて、幹細胞マーカーは、ＥＭ１０である。他の態様において、幹細胞マーカーは、ＣＤ３４である。このタイプの好ましい態様において、幹細胞はまた、ＣＤ３８⁻である（即ち、ＣＤ３８を発現しない）。さらに他の態様において、幹細胞マーカーは、Ｔｈｙ−１である。また他の態様において、幹細胞マーカーは、Ｐ−ｇｐである。さらに他の態様において、幹細胞マーカーは、ｃ−ｋｉｔである。また他の態様において、幹細胞マーカーは、Ａｃ１３３である。
【００１７】
本発明はまた、他の幹細胞マーカーについて選択することにより予め富化された、細胞の混合物の幹細胞集団をさらに富化する方法を提供する。このタイプの特定の態様において、細胞は、ＣＤ３４マーカーの発現について予め選択されている。次に、このような富化された幹細胞集団を、ＢＣＲＰをも発現する細胞について選択することにより、さらに富化することができる。ＢＣＲＰを発現する細胞を同定／選択するための、本発明により教示する方法のすべてを、用いることができる。
【００１８】
代替的に、またはＢＣＲＰの発現の検出と共に、本発明の幹細胞を同定するための方法は、さらに、１または２以上の系列特異的マーカーの発現を検出することを含むことができる。ＢＣＲＰ（および好ましくは、１または２以上の追加の幹細胞マーカー）を発現するが、１または２以上の系列特異的マーカーを発現しない細胞を、次に幹細胞として同定する。
【００１９】
特定の態様において、幹細胞は、造血幹細胞である。１つのこのような態様において、その不存在により幹細胞同定を確認する系列特異的マーカーは、ＣＤ１４である。他の態様において、系列特異的マーカーは、ＣＤ１５である。また他の態様において、系列特異的マーカーは、ＣＤ３８である。さらに他の態様において、系列特異的マーカーは、ＨＬＡ−ＤＲである。また他の態様において、系列特異的マーカーは、ＣＤ７１である。さらに他の態様において、系列特異的マーカーは、ＣＤ３３である。また他の態様において、系列特異的マーカーは、ＣＤ２である。さらに他の態様において、系列特異的マーカーは、ＣＤ１６である。また他の態様において、系列特異的マーカーは、ＣＤ１９である。さらに他の態様において、系列特異的マーカーは、ＣＤ２０である。また他の態様において、系列特異的マーカーは、グリコホリンＡである。さらに他の態様において、系列特異的マーカーは、ＣＤ３である。また他の態様において、系列特異的マーカーは、ＣＤ４である。さらに他の態様において、系列特異的マーカーは、ＣＤ８である。また他の態様において、系列特異的マーカーは、ＣＤ５６である。
【００２０】
従って、本発明はまた、幹細胞を単離する方法を提供する。このような態様の１つは、ＢＣＲＰを発現する細胞を含む（または含むと疑われる）細胞試料を得ること、および、細胞試料中の細胞によるＢＣＲＰの発現を検出することを含む、ＢＣＲＰを発現する細胞を単離する方法を含む。検出した後に、ＢＣＲＰを発現する細胞を単離する。前に示したように、系列特異的マーカーおよび幹細胞マーカーのそれぞれの不存在および／または存在をまた、幹細胞の検出において用いることができる。
【００２１】
細胞試料は、すべての動物から得ることができるが、好ましくは哺乳類からであり、一層好ましくはヒトからである。好ましくは、これらの試料は、すでに、事前に幹細胞について富化した細胞集団を有する。
【００２２】
１つの特定の態様は、幹細胞を含む（または含むと疑われる）細胞試料を得ること、および、これらを、ＢＣＲＰ（好ましくは細胞外部分ＢＣＲＰ）に結合する抗体と接触させることを含む。抗体に結合する細胞を、次に単離する。これらの単離された細胞を、これらの抗ＢＣＲＰ抗体への結合により、単離された幹細胞として同定する。本発明の好ましい態様において、幹細胞の単離は、フローサイトメトリーにより実施する。１つの特定の態様において、抗体は、蛍光標識を有し、幹細胞の単離を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により実施する。
【００２３】
他の態様において、抗ＢＣＲＰ抗体を、固体支持体上に配置する。次に、固体支持体を、細胞の試料と接触／インキュベートして、細胞が固体支持体と、抗ＢＣＲＰ抗体に結合することにより会合することができるようにすることができる。次に、固体支持体を洗浄して、非特異的に結合する細胞を除去する。残留する細胞を、固体支持体から（例えば過剰の遊離抗体により）抽出する。抗ＢＣＲＰ抗体に特異的に結合するこれらの能力に基づいて、抽出した細胞を、単離された幹細胞として同定する。
【００２４】
特定の態様において、固体支持体は、免疫磁性ビーズ（例えばミルテニーミニマックス（ＭＩＬＴＥＮＹＩ ＭＩＮＩＭＡＣＳ）（登録商標）、ダイナビーズ（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ）（登録商標））である。抗ＢＣＲＰ抗体を、免疫磁性ビーズ上に配置し、これを次に、前に示したように、細胞の試料と接触／インキュベートして、細胞が、抗ＢＣＲＰ抗体に結合することによりビーズと会合することができるようにする。好ましくは、適切なインキュベーション期間の後に、次に、免疫磁性ビーズを、細胞の試料から、磁石により分離することができる。次に、免疫磁性ビーズを洗浄して、非特異的に結合する細胞を除去する。残留した細胞を、前に示したように、免疫磁性ビーズから抽出する。再び、抗ＢＣＲＰ抗体に結合するこれらの能力に基づいて、単離された細胞を、幹細胞として同定する。
【００２５】
１つの態様において、ＢＣＲＰは、配列番号９のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号１０のアミノ酸配列を有する、ｈｕＢＣＲＰ遺伝子産物である。他の態様において、ＢＣＲＰは、配列番号２６のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号２７のアミノ酸配列を有する、ｈｕＢＣＲＰ遺伝子産物である。さらに他の態様において、ＢＣＲＰは、配列番号１３のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号１４のアミノ酸配列を有する、マウスＢＣＲＰ（ｍＢＣＲＰ）である。また他の態様において、ＢＣＲＰは、配列番号１１を含むヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号１２を含むアミノ酸配列を有する、ｍＢＣＲＰである。
【００２６】
さらに、幹細胞を単離および／または同定するための任意の方法における任意の段階を繰り返して、単離／同定プロセスを増強することができる。さらに、個別の方法を、また組み合わせて、単離／同定プロセスを増強することができる。
【００２７】
本発明の方法論から得られる、純化／単離された幹細胞もまた、本発明の一部である。さらに、本発明の方法により得られた、幹細胞について富化した細胞集団が、また提供される。このような富化された集団の１つを、幹細胞および幹細胞ではない細胞の両方を含む細胞の混合された集団から得る。次に、細胞の混合された集団の細胞を、これらがＢＣＲＰを発現するか否かに基づいて、２つの個別の細胞の群に分離する。ＢＣＲＰを発現していることについて選択された細胞の群は、幹細胞が富化された細胞集団である。前に示したように、選択プロセスを、１回または２回以上繰り返して、さらに、細胞の集団を、幹細胞について富化することができる。
【００２８】
本発明の方法による幹細胞の同定および単離は、造血幹細胞を超えて拡大し、筋幹細胞、肝臓幹細胞、胃腸幹細胞、脳幹細胞および胚性幹細胞を含むが、これには限定されないすべての幹細胞を含む。本発明はまた、例えば筋ジストロフィー、退行性肝臓障害（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、心筋梗塞、パーキンソン病、脳の退行性障害などの疾患の治療における、および組織再生／置換のための、筋幹細胞の使用を含む、これらの単離された幹細胞を用いる方法を提供する。さらに、造血幹細胞を、骨髄移植（例えば白血病の治療のために）において、並びに、血液疾患、例えば鎌状赤血球貧血およびサラセミアの治療のためのエクスビボ遺伝子療法のために、用いることができる。
【００２９】
本発明はまた、ＢＣＲＰの細胞外部分をその天然のコンフォメーションで認識する、抗体およびその部分を提供する。好ましい態様において、本発明の抗体は、ＢＣＲＰを、生存幹細胞の表面上で認識する。特定の態様において、抗体は、ポリクローナル抗体である。他の態様において、抗体は、モノクローナル抗体である。他の態様において、抗体は、キメラ抗体である。このタイプの好ましい態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。
【００３０】
本発明はまた、白血病細胞、例えばＡＭＬを有するかまたは有することが疑われる個体からの芽細胞におけるＢＣＲＰ発現の決定により、ヒト白血病、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を予後判定する方法を提供する。細胞からＢＣＲＰにより排出することができる化学療法剤の有効性は、白血病細胞上のＢＣＲＰの存在により、予測可能に減少する。従って、個体の白血病におけるＢＣＲＰ発現の存在およびレベルの決定は、医師が、このような剤の予測された効果を考慮した治療計画の開発を助けることができ、ＢＣＰＲ発現が存在する場合にＢＣＲＰの悪影響（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｅｆｆｅｃｔｓ）が疑われない代替の療法または剤の適切な考慮を可能にする。
【００３１】
従って、本発明の主な目的は、純化された幹細胞を得る方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、純化された幹細胞を提供することにある。
本発明の他の目的は、１または２以上の特定の細胞タイプが、不利に欠乏し、および／または機能不全になる疾患の治療において、純化された幹細胞を用いる方法を提供することにある。
【００３２】
本発明の他の目的は、純化された幹細胞を、遺伝子療法に用いる方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、幹細胞を、細胞および／または組織の混合された集団から、インビトロ、インサイチュおよびインビボで同定する方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、ＢＣＲＰを、ＡＭＬの進行を予後判定するためのマーカーとして用いることにある。
本発明のこれらのおよび他の観点は、以下の図面および詳説を参照することにより、一層良好に理解される。
【００３３】
発明の詳説
本発明は、哺乳類幹細胞を同定および／または単離するための特異的なＡＴＰ輸送体、ＢＣＲＰの使用を提供する。実際に、本明細書中に示すように、ＢＣＲＰ遺伝子は、原始的なＣＤ３４−マウスＨＳＣおよび骨髄からのＳＰ細胞の両方において、比較的高いレベルで発現する。対照的に、高度に富化されたＣＤ３４−幹細胞集団における他の既知のＡＢＣ輸送体の発現は低く、ないしは存在しない。ｈｕＢＣＲＰｃＤＮＡを発現するレトロウイルスベクターは、ｈｕＢＣＲＰの機能的な特性を研究するために、以下に記載するように構築された。このベクターを発現する線維芽細胞は、ＳＰ表現型の確率に必要な特性である、ヘキスト色素を排出させる能力を獲得する。
【００３４】
さらに、初代骨髄細胞が、ＢＣＲＰベクターで形質導入された際には、培養期間中ＳＰ細胞の幅広い増殖が見られる。筋肉からのＳＰ細胞はまた、ＢＣＲＰを高レベルで発現する。実際に、ＢＣＲＰｍＲＮＡ発現は、正常な組織において高度に制限される。さらに、本明細書中に開示されるように、ＢＣＲＰ発現は、比較的、マウスにおいて造血幹細胞画分に制限される。これらのデータにおいて、ＢＣＲＰ発現は、種々の器官からの幹細胞についての普遍的なマーカーであると予測され、十分に色素排出表現型を幹細胞に付与するための重要な分子であることができる。従って、本発明は、幹細胞をＢＣＲＰのこれらの発現により同定する方法を提供する。従って、このような同定を用いて、幹細胞を単離することができる。
【００３５】
アントラサイクリン薬剤に対する耐性を付与するＢＣＲＰの能力を考慮すると［Ｍｉｙａｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９： ８−１３ （１９９９）］、ＢＣＲＰ発現は、ＡＭＬ導入化学療法に対する耐性を直接付与し得る。実際に、ＡＭＬ芽球におけるＢＣＲＰ発現は、薬剤耐性表現型と関連すると考えられ、従って不良な予後を予測する。従って、本発明はまた、例えば、小児患者からの芽細胞を試験／モニタリングすることにより、ＡＭＬを有する小児患者を予後判定する方法を提供する。
【００３６】
以下の例において例証されているように、骨髄、骨格筋および他の組織からの幹細胞を、「側方集団」（ＳＰ）表現型により同定することができる。以前、ＡＢＣ輸送体の発現が、この表現型の原因であると推測された一方、関わっている具体的な分子は、同定されていなかった。本明細書において、Ｂｃｒｐ１（ｍＢＣＲＰ）／ＡＢＣＧ２（ｈｕＢＣＲＰ）遺伝子の発現が、種々の組織ソースからの幹細胞の保存された特徴であることが例証される。実際に、ｍＢＣＲＰｍＲＮＡは、未分化マウス造血幹細胞において高レベルで発現され、幹細胞分化と共に鋭敏に下方調節される。ｈｕＢＣＲＰｃＤＮＡの強制された発現は、ＳＰ表現型を骨髄細胞に直接付与し、インビトロおよび移植に基づくアッセイの両方を用いて、分化の抑制を生じる。これらの結果は、ＢＣＲＰ遺伝子発現を、新規な幹細胞マーカーとして同定し、その観察された発現は、幹細胞分化を阻害する機能的役割を反映することを確認するものである。従って、本発明は、ＢＣＲＰの発現を検出することができるアッセイにより幹細胞を同定する方法を提供する。
【００３７】
従って、本明細書中に開示する研究は、ＢＣＲＰ輸送体の発現が、種々のソースからの未分化幹細胞において高度に保存されていることを例証する。発現は、マウス骨髄、骨格筋、培養したＥＳ細胞からのＳＰ細胞およびアカゲザル骨髄において記録された。マウス骨髄細胞の系列陰性（ｌｉｎｅａｇｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ）画分内で、ＢＣＲＰ発現は、未分化ＣＤ３４−幹細胞に比較的制限され、発現は、分化に伴って鋭敏に下方調節された。ＢＣＲＰ発現とＳＰ細胞との間の関連は、骨髄細胞における強制された発現が、インビトロおよびインビボの両方において、ＳＰ表現型を保有する細胞の顕著な増殖をもたらすという観察により、さらに強化された。
【００３８】
総合的に、これらの発見は、ＢＣＲＰ発現が、幹細胞についての広範囲に保存された、かつ特異的なマーカーであるという構想を支持し、この輸送体が、幹細胞機能および／または幹細胞表現型の維持に役割を果たすことを示す。適切な抗体を用いたＢＣＲＰ発現についての細胞選別により、種々の器官ソースからの細胞に適用可能な幹細胞純化のための新たな方策が提供される。ＢＣＲＰ発現は、さらに、マウス骨髄［Ｌａｇａｓｓｅ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ６： １２２９−１２３４ （２０００）］および骨格筋［Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｋ． Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ ９６： １４４８２−１４４８６ （１９９９）； Ｇｕｓｓｏｎｉ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４０１： ３９０−３９４ （１９９９）］において見出される、最近記載された分化転換する幹細胞のためのマーカーとして考えられている。
【００３９】
従って、本明細書中に出現する場合には、以下の用語は、以下に述べる定義を有する。
「造血幹細胞」は、自己複製的分裂を伴ってそれ自体複製されるかまたは多数の経路に沿って分化し、これにより赤血球、顆粒球、単球、肥満細胞、リンパ球および巨核球を発生することができる、多能性細胞である。これらの幹細胞は、１０^４個の骨髄細胞あたり約１個の幹細胞の頻度で出現する。
【００４０】
本明細書中で用いる「異種遺伝子」は、分子生物学的操作により幹細胞（例えば造血幹細胞）中に導入される遺伝子である。本明細書中で定義するように、この分子生物学的操作は、異種遺伝子が幹細胞中に挿入されるように実施する。異種遺伝子は、これが幹細胞の子孫において発現される限りは、幹細胞において発現される必要はない。異種遺伝子のコード配列は、発現制御配列に作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）結合している。一般的に、異種遺伝子は、先ずベクター中に配置される。異種遺伝子は、必ずしもベクターにより天然に含有されていないが、異種遺伝子は、幹細胞に本来的であるタンパク質をコードすることができる。例えば、異種遺伝子は、機能的タンパク質をコードし、エクスビボ遺伝子療法において、幹細胞、例えば造血幹細胞中の対応する欠陥を有する遺伝子を置換するために用いることができる。異種遺伝子は、通常、ソース生物のゲノムにおけるゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡに隣接している。あるいはまた、異種遺伝子は、例えばマウス造血幹細胞中に導入されるヒトＭＤＲ１についての遺伝子などのように、幹細胞中には天然に見出され得ない。
【００４１】
細胞は、遺伝子が細胞の内部に導入され、遺伝子のコード配列が、発現制御配列に作動可能に結合した場合に、異種遺伝子、例えばＭＤＲ１遺伝子（すなわち、ＭＤＲ１をコードする核酸）により「形質導入」される。形質導入遺伝子は、ベクターにより担持され、遺伝子は、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡ中に統合（共有結合）されてもよくまたはされなくてもよい。安定的に形質導入された細胞は、形質導入遺伝子が、染色体中に統合され、従ってこれが、染色体複製により娘細胞に遺伝するものである。この安定性は、細胞の、形質導入遺伝子を含む娘細胞の集団から構成された細胞系またはクローンを確立する能力により、例証される。「クローン」は、単一の細胞または共通の先祖から有糸分裂により由来する細胞の集団である。「細胞系」は、多くの世代にわたりインビトロで安定に増殖することができる初代細胞のクローンである。
【００４２】
本明細書中で用いる「遺伝子改変造血幹細胞」は、異種遺伝子により形質導入された造血幹細胞である。
本明細書中で用いる造血幹細胞の「増殖」は、即ち細胞の培養の間に、造血幹細胞の絶対数の増大があることを示す。同様に、このような増殖を経験した造血細胞は、「増殖した」。
【００４３】
本明細書中で用いる、幹細胞、好ましくは増殖した造血幹細胞の「移植」は、幹細胞を動物中に、例えば注射により配置し、ここで、幹細胞が、インビボで生存することを意味する。これは、造血幹細胞の、例えば進行する血液形成に寄与する能力により、容易に測定することができる。
【００４４】
本明細書中で用いる、「ＡＢＣ輸送体」は、従来の意味で用い、輸送体ＡＴＰアーゼであるタンパク質を記載するために用いる。ＡＢＣ輸送体は、ＡＴＰ依存性である輸送タンパク質の大きいファミリーのメンバーである。名称は、すべてのメンバーに含まれる高度に保存されたＡＴＰ結合カセットから由来する。［Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ， 第３版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ． （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ） ５１９〜５２２頁（１９９４）参照］。ＭＤＲ１およびＢＣＲＰは、ＡＢＣ輸送体のファミリーの一部である２種の膜貫通型排出ポンプである。
【００４５】
乳癌耐性タンパク質は、多くの種々の細胞系および哺乳類組織から単離された、保存されたＡＴＰ結合カセットを含む、ＡＴＰ輸送体タンパク質である。このタンパク質をコードする遺伝子の文献における名称は、Ｂｃｒｐ１、Ｍｘｒ、ＡｂｃｐおよびＡＢＣＧ２遺伝子を含む。一方、マウス遺伝子は、一般的に、Ｂｃｒｐ１遺伝子と称され、対応するヒト遺伝子は、ＡＢＣＧ２遺伝子と称され、本明細書中で用いるように、「ＢＣＲＰ」は、任意の哺乳類ソースから得られるこのようなＡＴＰ輸送体タンパク質をすべて含むことを意味する。特定のマウスまたはヒト遺伝子あるいは１または２以上の遺伝子産物が、特定的に言及される際には、マウスタンパク質はまた、本明細書中で、ｍＢＣＲＰと称され、一方ヒトタンパク質は、本明細書中では、「ｈｕＢＣＲＰ」と称される。
【００４６】
１つのｈｕＢＣＲＰ遺伝子産物は、配列番号９のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号１０のアミノ酸配列を有する一方、他の変種は、配列番号２６のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号２７のアミノ酸配列を有する。１つのｍＢＣＲＰは、配列番号１３のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号１４のアミノ酸配列を有し、他のｍＢＣＲＰは、配列番号１１を含むヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号１２を含むアミノ酸配列を有する。
【００４７】
「レプリコン」は、インビボでのＤＮＡ複製の自律的単位として機能し、即ちこれ自体の制御の下で複製されることができる、すべての遺伝子要素（例えばプラスミド、染色体、ウイルス）である。
「ベクター」は、他のＤＮＡセグメントが、付着されたセグメントの複製を生じるように付着され得る、レプリコン、例えばプラスミド、ファージまたはコスミドである。用語「ベクター」はまた、他のＤＮＡセグメントが付着し得るレプリコンを含む組み換えウイルスまたは欠損ウイルスを意味し得る。
【００４８】
「ＤＮＡ分子」は、一本鎖形態または二重鎖らせんのいずれかにおける、デオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）のポリマー形態を意味する。この用語は、分子の一次および二次構造のみを意味し、これを、いずれの特定の三次形態にも限定しない。従って、この用語は、特に線状ＤＮＡ分子（例えば制限断片）、ウイルス、プラスミドおよび染色体中に見出される二重鎖ＤＮＡを含む。特定の二重鎖ＤＮＡ分子の構造を討議するにあたり、本明細書中では、ＤＮＡの転写されていない鎖（即ち、ｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）に沿った５’から３’方向の配列のみを与える通常の慣例に従って、配列を記載することができる。
【００４９】
「コード配列」は、逆転写し（即ち、レトロウイルスベクターの一部である場合に）および／または転写し、および次に適切な調節配列の制御下に置いた際に、インビトロおよび／またはインビボでポリペプチドに翻訳することができる核酸配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端における翻訳停止コドンにより定められる。コード配列は、原核配列、真核ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核（例えば哺乳類）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列およびさらに合成ＤＮＡ配列を含むことができるが、これらには限定されない。ポリアデニル化シグナルおよび転写終了配列は、通常、コード配列に対して３’に位置する。
【００５０】
核酸配列は、発現制御配列が当該核酸配列の転写および／または翻訳を制御し、調節する場合、発現制御配列に「作動可能に結合している」。用語「作動可能に結合する」は、発現されるべき核酸配列の前に適切な開始シグナル（例えばＡＴＧ）を有すること、および、正確な読みとりフレームを維持して、発現制御配列の制御下における核酸配列の発現および核酸配列によりコードされる所望の産物の生成を可能にすることを含む。組み換えＤＮＡ分子中に挿入することが望まれる遺伝子が、例えば適切な開始シグナルを含まない場合には、このような開始シグナルを、遺伝子の前に挿入することができる。
【００５１】
転写および翻訳制御配列は、ホスト細胞におけるコード配列の発現を提供するＤＮＡ調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター等である。
【００５２】
「プロモーター配列」は、細胞中のＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的のために、プロモーター配列には、その３’末端に転写開始部位が結合し、上流（５’方向）に延在して、バックグラウンド上に検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含む。プロモーター配列内に、転写開始部位（例えばヌクレアーゼＳ１でのマッピングにより好都合に定義されている）およびＲＮＡポリメラーゼの結合の原因であるタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出されるだろう。真核プロモーターは、しばしばであるが、常にではなく、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含む。
【００５３】
コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、これが次に、コード配列によりコードされるタンパク質に翻訳される場合、細胞中の転写および翻訳制御配列の「制御下に」ある。
【００５４】
広範囲の発現制御配列−−それに作動可能に結合したＤＮＡ配列の発現を制御する配列−−のすべてを、これらのベクターにおいて用い、本発明のＤＮＡ配列を発現させることができる。このような有用な発現制御配列には、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ワクシニア、ポリオーマ、アデノウイルス、ヘルペスウイルスの初期または後期プロモーターおよび、哺乳類細胞の遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列およびこれらの種々の組み合わせが含まれる。
【００５５】
発現制御配列の選択にあたり、種々の因子が、通常考慮されるだろう。これらには、例えば、系の相対的強度、その制御可能性および、特に潜在的二次構造に関しての、発現されるべき特定のＤＮＡ配列または遺伝子とのその適合性が含まれる。これらのおよび他の因子を考慮して、当業者は、本発明において用いられる異種遺伝子を発現する種々のベクター／発現制御配列の組み合わせを構築することができるだろう。
【００５６】
用語「薬学的に許容し得る」は、ヒトに投与した際に、生理学的に耐容可能であり、典型的にはアレルギー性または同様の不都合な反応、例えば胃腸の不調、めまい感等を生じない分子実在物（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｎｔｉｔｉｅｓ）および組成物を意味する。好ましくは、本明細書中に用いる際には、用語「薬学的に許容し得る」は、連邦または州政府の監督官庁により承認されているか、あるいは米国薬局方または動物およびさらに特にヒトにおいて用いるための他の一般的に認識されている薬局方において列挙されていることを意味する。用語「担体」は、化合物がそれと共に投与される希釈剤、補助剤、補形剤または賦形剤を意味する。このような薬学的担体は、無菌の液体、例えば水および、石油、動物、植物の油、または合成的起源、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等を含む油であることができる。水または水性溶液食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、好ましくは、特に注射可能な溶液用の担体として用いられる。
【００５７】
用語「治療的に有効な量」は、本明細書中で、宿主の活性、機能および応答における臨床的に顕著な欠損を、少なくとも約１５％減少させ、好ましくは少なくとも５０％減少させ、一層好ましくは少なくとも９０％減少させ、および最も好ましくは予防および／または治療するのに十分な量を意味するために用いられる。あるいはまた、治療的に有効な量は、宿主中の臨床的に顕著な症状における改善を生じるのに十分な量である。
【００５８】
核酸プローブ
一本鎖形態の核酸分子を、他の核酸分子に、温度および溶液イオン強度の適切な条件下でアニールすることができる場合、核酸分子は、他の核酸分子、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡに「ハイブリダイズ可能」である［Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ， 第２版（１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （本明細書中では、”Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９”）および、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第３版（２００１） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照］。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリッド形成の「厳格さ（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」を決定する。５５℃のＴ_ｍに相当する特定のハイブリッド形成条件、例えば５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルクおよびホルムアミドなし、または３０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを、用いることができる。
【００５９】
中程度の厳格さのハイブリッド形成条件は、一層高いＴ_ｍ、例えば４０％ホルムアミド、および５ｘまたは６ｘＳＳＣに相当する。高い厳格さのハイブリッド形成条件は、最も高いＴ_ｍ、例えば５０％ホルムアミド、５ｘまたは６ｘＳＳＣに相当する。これらの条件は、アニーリングおよび洗浄段階の両方に用いることができる。ハイブリッド形成は、２種の核酸が、相補的配列を含むことを必要とするが、ハイブリッド形成の厳格さに依存して、塩基間の不整合が可能である。核酸をハイブリダイズするための適切な厳格さは、当該技術分野において十分知られている変数である核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列の間の類似性または相同性の程度が大きくなるに従って、これらの配列を有する核酸のハイブリッドについてのＴ_ｍの値は大きくなる。
【００６０】
核酸ハイブリッド形成の相対的安定性（一層高いＴ_ｍに相当する）は、以下の順序において減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００ヌクレオチドより大きいハイブリッドについて、Ｔ_ｍを計算するための方程式が、導き出された［Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， 前記、９．５０−１０．５１参照］。一層短い核酸、即ちオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成については、不整合の位置は、一層重要になり、オリゴヌクレオチドの長さが、この特異性を決定する［Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， 前記、１１．７−１１．８参照］。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸（プローブおよび／またはプライマー）についての最小の長さは、少なくとも約１２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１８ヌクレオチドであり、そして一層好ましくは、長さは、少なくとも約２７ヌクレオチド、最も好ましくは、少なくとも約３６ヌクレオチドである。ＢＣＲＰ、およびｍｄｒ１ａ、ｍｄｒ１ｂおよびｍｄｒ２についての特定のプライマーを、以下の例１で提供する。
【００６１】
放射活性標識、例えば^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐまたは^３５Ｓ、蛍光標識、ホウ素標識［その全体が、参照により組み込まれる米国特許第５，５９５，８７８号、１９９７年１月２１日刊行および米国特許第５，８７６，９３８号、１９９９年３月２日刊行］および酵素タグ、例えばウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼを用いることを含む、当該技術分野において十分知られている任意の多くの方法により、このようなヌクレオチドプローブおよびプライマーを標識すること、またはそれを用いて相補的ＤＮＡ（適切な場合）を標識することができる。酵素タグの場合に、ヒトの目にまたは分光光度計的に可視的な手段を提供し、相補的核酸含有試料との特異的ハイブリッド形成を確認するために用いることができる、比色指示基質が知られている。
【００６２】
本発明のＡＢＣ輸送体に対する抗体
本発明において、組み換えソースにより、または化学的合成により生成したＡＢＣ輸送体または天然のソースから単離されたＡＢＣ輸送体、および、融合タンパク質を含むこの誘導体または類似体を、ＢＣＲＰなどのＡＢＣ輸送体を認識する抗体を産生する免疫原として用いることができる。このような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化キメラを含むキメラ、一本鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーを含むが、これに限定されない。
【００６３】
特定的な態様において、抗体は、ＢＣＲＰの外部エピトープに対して産生される。特定の態様において、エピトープは、ＢＣＲＰの細胞外部分に由来する。このような抗体を用いて、生存細胞を、フローサイトメーターにおいて選別することができる。これらの抗体を用いて、例えば、ＢＣＲＰ（ｂｃｒｐ）発現に基づき造血細胞を選別することができる。また、このような抗体を用いて、ＢＣＲＰを、再構築活性についてのマーカーとして検出することができる。
【００６４】
本発明の抗ＢＣＲＰ抗体は、交差反応性であることができ、即ち、これらは、異なるソースから誘導されたＢＣＲＰを認識することができ、例えば抗ヒトＢＣＲＰ抗体は、ヒトおよびマウスＢＣＲＰを共に認識することができる。ポリクローナル抗体は、交差反応性の一層大きい可能性を有する。あるいはまた、本発明の抗体は、ＢＣＲＰの単一の形態、例えば配列番号１０のアミノ酸配列を有するｈｕＢＣＲＰに特異的であってもよい。
【００６５】
当該技術分野において知られている種々の手順を、例えばＢＣＲＰまたはこの誘導体または類似体に対するポリクローナル抗体を生成するために用いることができる。抗体の生成のために、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ等を含むが、これらには限定されない種々の宿主動物を、ＢＣＲＰまたはこの誘導体（例えばまたは融合タンパク質）での注射により免疫することができる。１つの態様において、ＢＣＲＰを、免疫原性担体、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合することができる。宿主種に依存して種々のアジュバントを用い、免疫学的応答を増大させることができ、これには、フロイント（完全および不完全）、鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールおよび潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびコリネバウテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が含まれるが、これらには限定されない。
【００６６】
ＢＣＲＰまたは類似体またはこの誘導体に向けられたモノクローナル抗体の製造のために、培養中の連続的な細胞系により抗体分子の生成をもたらす任意の手法を用いることができる。これらには、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ［Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５−４９７ （１９７５）］により最初に開発されたハイブリドーマ手法、およびトリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）手法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ手法［Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ， ４： ７２ （１９８３）； Ｃｏｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８０： ２０２６−２０３０ （１９８３）］およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ手法［Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ７７〜９６頁中（１９８５）］が含まれるが、これらには限定されない。本発明の追加の態様において、モノクローナル抗体を、微生物非保有動物において、最近の技術［ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５］を用いて生成することができる。
【００６７】
実際に、本発明において、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と共に、ＢＣＲＰに特異的なマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の生成のために開発された手法［Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １５９： ８７０ （１９８４）； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３１２： ６０４−６０８ （１９８４）； Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３１４： ４５２−４５４ （１９８５）］を用いることができる。このような抗体は、本発明の範囲内である。このようなヒトまたはヒト化されたキメラ抗体は、ヒト疾患または障害（以下に記載する）の療法において用いるのに好ましい。その理由は、ヒトまたはヒト化された抗体は、異種移植抗体よりも、これら自体免疫応答、特にアレルギー応答を誘発する傾向がはるかに低いからである。特定の態様において、本発明のＢＣＲＰ発現細胞を用いて、外部細胞表面エピトープに対するモノクローナル抗体が産生される。抗体産生クローンを、産生細胞のそのパッケージング親細胞に対する分染によりスクリーニングすることができる（図１参照）。
【００６８】
本発明において、一本鎖抗体の生成について記載された手法［Ｈｕｓｔｏｎによる米国特許第５，４７６，７８６号および同第５，１３２，４０５号；米国特許第４，９４６，７７８号］を、例えばＢＣＲＰ特異一本鎖抗体を生成するために適合させることができる。本発明の追加の態様は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築について記載されている手法［Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４６： １２７５−１２８１ （１９８９）］を用いて、ＢＣＲＰ、またはこの誘導体または類似体への所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にする。
【００６９】
抗体分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントを、既知の手法により産生することができる。例えば、このようなフラグメントは、抗体分子のペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより産生することができるＦａｂ’フラグメント、並びにパパインおよび還元剤で抗体分子を処理することにより産生することができるＦａｂフラグメントを含むが、これらに限定されない。
【００７０】
抗体の生成において、所望の抗体についてのスクリーニングを、当該技術分野において知られている手法、例えばラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射線測定法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュイムノアッセイ（例えば金コロイド、酵素または放射性同位体標識を用いる）、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えばゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体固定アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、フローサイトメトリーおよび免疫電気泳動アッセイ等により、達成することができる。
【００７１】
１つの態様においては、抗体結合を、一次抗体上の標識を検出することにより検出する。他の態様において、一次抗体を、二次抗体または試薬の一次抗体への結合を検出することにより、検出する。さらなる態様において、二次抗体を標識する。多くの手段が、イムノアッセイにおいて結合を検出するために、当該技術分野において知られており、本発明の範囲内である。例えば、ＢＣＲＰの特定のエピトープを認識する抗体を選択するために、このようなエピトープを含むＢＣＲＰフラグメントに結合する産物について発生したハイブリドーマをアッセイし、ＢＣＲＰと交差反応しないものを選択することができる。特定のソースからのＢＣＲＰに特異的な抗体の選択について、特定のソースにより発現された、またはこれから単離されたＢＣＲＰとの正の結合に基づいて、選択することができる。
【００７２】
本発明はまた、生存する幹細胞を単離するために用いることができる、ＢＣＲＰモノクローナル抗体を生成するための方法を提供する（図１参照）。このタイプの好ましい態様において、生存する幹細胞を、細胞選別手法により単離する。１つの最初の段階は、ＢＣＲＰをコードするｃＤＮＡ配列を得、次にこれをベクター構築物（好ましくはレトロウイルスベクター）中に挿入するものであることができる。次に、この構築物を、パッケージング細胞（例えばレトロウイルスパッケージング細胞）中に導入して、形質導入ベクター粒子を生成することができる。ＧＰＥ８６パッケージング細胞を用いる際には、エコトロピックＡＢＣＧ２（即ちｈｕＢＣＲＰ）ベクターが、上清液中に生成し、これを用いて、マウス３Ｔ３細胞に形質導入することができる。
【００７３】
対数的に増殖する細胞に上清液を適用した後、ｈｕＢＣＲＰを発現する形質導入された３Ｔ３細胞を、蛍光色素ヘキスト３３３４２を排出するこれらの能力に基づいて、フローサイトメトリーにより単離することができる。次に、ｈｕＢＣＲＰを発現する３Ｔ３細胞（楕円形の細胞、図１参照）を、マウスの腹腔内に注射することができる。ベクターで形質導入された生存細胞を用いる方策により、免疫系が、細胞中に内部に位置するエピトープまたは変性したタンパク質中にのみ存在するエピトープよりむしろ、外部ｈｕＢＣＲＰエピトープを、これらの生来の形態で、検出する可能性が増大する。
【００７４】
数回の免疫の後に、末梢血清において抗ｈｕＢＣＲＰ活性を示すマウスを、屠殺することができる。次に、これらの脾臓を分離し、約５００のハイブリドーマクローンが、標準的な手法を用いて、骨髄腫細胞との融合により得られる。次に、これらの増殖する融合クローンからの上清液を、抗ｈｕＢＣＲＰ抗体の存在についてスクリーニングする。このスクリーニングプロセスは、ヒトＭＣＦ７乳癌細胞にｈｕＢＣＲＰベクターで形質導入することを含む。
【００７５】
図１に示すように、ヒト乳癌細胞が好ましい理由は、生来の３Ｔ３細胞タンパク質（四角および三角）と反応する不所望なモノクローナル抗体（小さい細胞＃３）が、ＭＣＦ７細胞上に存在するヒトタンパク質に結合する傾向がないからである。次に、上清液を、ｈｕＢＣＲＰを発現する形質導入したＭＣＦ７細胞と共にインキュベートする。次に、これらの細胞を、マウス免疫グロブリンを認識するフィコエリスリン（ＰＥ）結合二次抗体で染色する。次に、フローサイトメトリーを用いて、ＰＥ蛍光を有する細胞試料、即ちハイブリドーマ上清液からのマウス抗体に結合する細胞を検出する。
【００７６】
これらの上清液は、これらのそれぞれのモノクローナルハイブリドーマからの抗ｈｕＢＣＲＰ抗体を含む傾向がある（細胞＃１）。しかし、また、観察された反応性は、抗ｈｕＢＣＲＰ活性によるものではなく、むしろＭＣＦ７細胞上に見出された表面タンパク質と交差反応するマウス抗体による可能性がある（ハイブリドーマクローン２）。このようなクローンを同定し、除外するために、すべての陽性の上清液を、親（形質導入されていない）ＭＣＦ７細胞で逆スクリーニングすることができる。これらの細胞は、ｈｕＢＣＲＰを発現せず、形質導入されたＭＣＦ７細胞上に存在する生来の表面タンパク質をすべて発現する。従って、親（形質導入されていない）ＭＣＦ７細胞と反応することが見出されたすべてのクローンを、廃棄する。
【００７７】
次に、このスクリーニングプロセスを通過したハイブリドーマクローンを、増殖させ、再サブクローン化し、再分析する。次に、２回目のスクリーニングを通過したサブクローンを用いて、エクスビボローラーボトル生成系でモノクローナル抗体含有上清液を作製する。次に、抗体を、アフィニティーカラム上で精製することができ、アイソタイプを決定し、抗体の濃度を測定することができる。次に、この調製物を用いて、これらの表面上でｈｕＢＣＲＰ遺伝子産物を発現する生来の幹細胞を同定し、このような細胞を、フローサイトメトリー、免疫アフィニティーカラムまたは磁性ビーズ手順を含むが、これらには限定されない方法により単離することができる。
【００７８】
ＢＣＲＰの局在および活性に関する当該技術分野において知られている方法、例えばウエスタンブロット、インサイチュでのＢＣＲＰのイメージング、適切な生理学的試料中のこのレベルの測定等において、本明細書中に述べたかまたは当該技術分野において知られている検出手法のいずれかを用いて、前記の抗体を用いることができる。特定的な態様において、ＢＣＲＰの活性を作働させるかまたは拮抗する抗体を、産生することができる。このような抗体を、例えばＢＣＲＰの薬剤ポンプ能力を測定するアッセイを用いて試験することができる。
【００７９】
ＡＢＣ輸送体に対する抗体を、標識することができる。好適な標識には、酵素、発蛍光団（発蛍光団の例として、例えば蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、テキサスレッド（ＴＲ）、ローダミン、遊離またはキレート化ランタニド系塩、特にＥｕ^３＋がある、）、発色団、放射性同位体、キレート化剤、色素、金コロイド、ラテックス粒子、リガンド（例えばビオチン）、および化学発光剤が含まれる。放射性標識、例えば同位体^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１２５Ｉおよび^１３１Ｉを用いる例において、既知の現在入手可能な計数手順を用いることができる。標識が酵素である例において、検出は、現在用いられている当該技術分野において知られている比色的、分光光度計的、蛍光分光光度計的、電流的またはガス圧的手法のいずれかにより達成することができる。
【００８０】
直接的な標識は、本発明において用いることができる標識の１つの例である。直接的な標識は、この天然の状態において、肉眼で、または光学的フィルター、および／または適用された刺激、例えば蛍光を促進するための紫外線光の補助により容易に可視できる物質として定義された。本発明において用いることができる着色した標識の例としては、金属ゾル粒子、例えば金ゾル粒子、例えばＬｅｕｖｅｒｉｎｇ（米国特許第４，３１３，７３４号）により記載されたもの、色素ゾル粒子、例えばＧｒｉｂｎａｕ ｅｔ ａｌ．（米国特許第４，３７３，９３２号）およびＭａｙ ｅｔ ａｌ． （ＷＯ ８８／０８５３４）により記載されたもの、染色ラテックス、例えばＭａｙ（前記）、Ｓｎｙｄｅｒ（ＥＰ−Ａ ０ ２８０ ５５９および０ ２８１ ３２７）により記載されたもの、またはＣａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（米国特許第４，７０３，０１７号）に記載されたリポソーム中にカプセル封入された色素が含まれる。
【００８１】
他の直接標識には、放射性ヌクレオチド、蛍光部分または発光部分が含まれる。これらの直接的な標識デバイスに加えて、酵素を含む間接標識を、本発明において用いることができる。種々のタイプの酵素結合イムノアッセイ、例えばアルカリホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ、リゾチーム、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、ウレアーゼが、当該技術分野において十分知られており、これらのものおよび他のものは、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ７０： ４１９−４３９ （１９８０）中の Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ＥＬＩＳＡ ａｎｄ ＥＭＩＴおよび米国特許第４，８５７，４５３号中でＥｖａ Ｅｎｇｖａｌｌにより詳細に討議されている。
【００８２】
好適な酵素は、アルカリホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼを含むが、これには限定されない。さらに、抗体を、マーカータンパク質、例えば米国特許第５，６２５，０４８号、１９９７年４月２９日出願、ＷＯ ９７／２６３３３、１９９７年７月２４日刊行およびＷＯ ９９／６４５９２（これらすべてを、これらの全体において参照により本明細書中に組み込む）に記載されている緑色蛍光タンパク質を含むように改変することができる。本発明において用いるための他の標識は、磁性ビーズまたは磁気共鳴イメージング標識を含む。
【００８３】
他の態様において、リン酸化部位を、例えばＳｉｄｎｅｙ Ｐｅｓｔｋａによる欧州特許第０３７２７０７号（出願番号８９３１１１０８．８）またはＦｏｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，４５９，２４０号、１９９５年１０月１７日刊行に記載されているように、^３２Ｐでの標識のために、本発明の抗体において作成することができる。
【００８４】
また、抗体を、代謝標識により標識することができる。代謝標識は、タンパク質を発現する細胞を、代謝標識、例えば［^３５Ｓ］−メチオニンまたは［^３２Ｐ］−オルトリン酸塩を加えた培養培地の存在下でのインビトロインキュベーションの間に生じる。［^３５Ｓ］−メチオニンでの代謝（または生合成）標識に加えて、本発明はさらに、［^１４Ｃ］−アミノ酸および［^３Ｈ］−アミノ酸（トリチウムは、不安定でない位置において置換されている）で標識することを検討している。
【００８５】
幹細胞純化
適切な抗体を同定した後に、例えばマウス骨髄細胞から、系列陽性細胞を欠乏させ、ｌｉｎ⁻細胞を、ＢＣＲＰ発現について選別することができる。次に、競合的再構築アッセイを用いて、ＢＣＲＰ発現フラクション中の幹細胞活性の富化を例証することができる。また、ＢＣＲＰ選別実験を、ｌｉｎ⁻、ｃｋｉｔ^＋、ｓｃａｌ^＋細胞において、およびＣＤ３４細胞において実施して、これらの集団が、さらに幹細胞活性について富化できるか否かを決定することができる。同様の手順を、他の細胞ソース、例えばヒト臍帯血細胞を用いて実施することができる。
【００８６】
従って、ＢＣＲＰ選別実験を、ｌｉｎ⁻、ＣＤ３４細胞およびＣＤ３４^＋、ＣＤ３８⁻細胞を用いて実施して、これらの幹細胞集団における再構築活性についてＢＣＲＰ発現が富化する量を決定することができる。次に、限界希釈分析において、選別された細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注入して、これらの集団における幹細胞頻度を定量することができる。骨髄細胞およびサイトカイン動員末梢血幹細胞を用いてこの手順を繰り返し、種々の臨床的幹細胞ソースにおける該手順の有用性を例証することができる。例えば、ＳＰ細胞を、マウス筋肉衛星細胞から単離し、ＲＴ−ＰＣＲおよびＦＡＣＳ分析を用いて、ＢＣＲＰがまた、これらの細胞において発現されることを例証した（以下の例１参照）。また、再構成研究を、選別されたＢＣＲＰ発現筋肉細胞を用いて実施することができる。選別されたドナー細胞は、例えばドナー細胞にＧＦＰトランスジェニックマウス系を用い、レシピエントを筋肉中のＧＦＰ^＋ＳＰ細胞について分析することで、移植後に同定できる。
【００８７】
従って、本発明は、ＳＰ幹細胞を同定するための機能的基準を提供し、さらに、研究および臨床的用途の両方のための幹細胞を単離する新たな方法を提供する。例えば、本発明は、抗ＢＣＲＰ抗体を用いて幹細胞を単離する方法を提供する。これらの幹細胞は、骨髄細胞、筋細胞およびさらに脳細胞からのものを含む幹細胞を含む、すべての組織に由来することができる。特定の抗体に結合するこれらの能力により区別することができる細胞の分離を可能にする、すべての方法を、用いることができる。例えば、造血幹細胞を単離するために、骨髄細胞を、対象動物（好ましくはヒト）から得ることができる。次に、単細胞浮遊液を、調製することができる。抗ＢＣＲＰ抗体を、細胞と共にインキュベートすることができ、細胞を、標準的な細胞選別法を用いて、例えば蛍光細胞選別［Ｂｈａｔｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ４： １０３８−１０４５ （１９９８）］により単離することができる。関連する態様において、筋幹細胞を、筋細胞試料から単離することができる［Ｇｕｓｓｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４０１： ３９０ （１９９９）］。あるいはまた、幹細胞を、非幹細胞から、ＢＣＲＰの薬剤ポンプ活性の特異性により区別することができる。
【００８８】
骨髄細胞を、ヒト対象を含む１動物からいくつものソースから得ることができる。例えば、細胞を、実験動物からの腸骨骨随から回収することができる。あるいはまた、造血幹細胞を、臍帯細胞から得ることができる。造血幹細胞についての他のソースは、胎児循環血液細胞からのものである。さらに、例えばヒト対象を、細胞毒性薬剤および／または造血幹細胞刺激サイトカイン（例えばＧ−ＣＳＦ）で処理することができる。次に、単核細胞を、ロイコフォレシス（ｌｅｕｋｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）により採集し、造血幹細胞を、末梢血細胞から、ＣＤ３４に対して作製した抗体へのこれらの選択的結合により単離することができる。胚性幹細胞の１つのソースは、胚／胎児組織である。特定の組織タイプ（例えば脳または肝臓）から幹細胞を得るためのソースには、生検試料および死体が含まれるが、これには限定されない。
【００８９】
ＢＣＲＰ富化幹細胞を、現在入手可能な富化幹細胞、例えばＣＤ３４富化幹細胞と同様の方法で、そして同一の目的のために用いることができる。実際に、提供される胚性幹細胞は、一般的に用いることができ、一方本発明の方法により得られた特定の成体幹細胞は、特定の幹細胞移植のために、例えば造血幹細胞は骨髄移植のための、膵臓幹細胞は、ＩＩ型糖尿病を治療するために、脳幹細胞は、パーキンソン病を治療するために用いることができる。また、本発明により提供される幹細胞を、遺伝子療法プロトコルにおいて標的細胞として用いることができる。重要なことに、本明細書中に開示する方法によりＢＣＲＰ発現について富化するために同定／選択された細胞試料は、任意の代替の幹細胞マーカー（例えばＣＤ３４の発現のために選択された細胞試料）に基づいて単離された、いずれの他の現在入手可能な幹細胞のソースよりも、高度に純化された幹細胞の集団を含む。従って、本発明により提供される富化幹細胞調製物は、一層少ない有害な抗宿主反応細胞を含み、従って、これらの使用により、移植片対宿主疾患および／または移植拒絶の危険が顕著に低下し、所与の患者についての入手可能なドナーの数を拡大し得る。
【００９０】
従って、本発明のＢＣＲＰ富化細胞試料は、治療用途のための純化された幹細胞の好ましいソースを提供する。これらの一層高度に富化された幹細胞試料はまた、以前まで、従来の幹細胞調製物中の比較的高いレベルの混入非幹細胞のために、正確に実施し得なかった、幹細胞の治療用途、例えば同種異系移植を可能にする。
さらに、これらの高度に富化された幹細胞は、遺伝子療法に好ましい。その理由は、これらの使用により、形質導入効率が増大し、形質導入に必要なベクターの量が減少するためである。
【００９１】
ＢＣＲＰ発現および白血病
顕著な数の白血病細胞、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）芽球は、ＭＤＲ１およびＭＲＰ１発現の不存在にもかかわらず、蛍光色素およびある種の化学療法剤、例えばミトザントロンおよびダウノマイシンを排出することができる。これらのケースのかなりの割合は、ＢＣＲＰの発現によると考えられる。新たに診断された小児患者からのＡＭＬ芽球を、幹細胞同定および純化との関連において本明細書中に記載するように、種々の手法を用いてＢＣＲＰ発現についてアッセイすることができる。好適な手法は、特に、特異的な抗ＢＣＲＰ抗体での染色後のフローサイトメトリー、免疫細胞化学、タンパク質溶解液のＢＣＲＰ抗体でのウエスタンブロット分析における染色、およびＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロット分析およびリボヌクレアーゼプロテクションアッセイ等のＢＣＲＰｍＲＮＡレベルを測定する方法の使用を含む。顕著なレベルのＢＣＲＰ発現が見出された場合において、ＢＣＲＰの発現が、プロモーターにおける突然変異、プロモーター配列の低メチル化によるか、転写因子環境における変化によるかを決定することができる。
【００９２】
白血病細胞、特にＡＭＬ芽球中でのＢＣＲＰの決定により、ＢＣＲＰを介して排出されることが疑われる化学療法剤の投与の有効性の予測に関して、医師に有用な情報が提供される。このような情報が、医師により用いられて、白血病、特にＡＭＬを患っている患者の治療の最適過程が決定され得る。例えば、患者の白血病細胞が、顕著なレベルのＢＣＲＰを発現していると決定された場合において、ＢＣＲＰ排出を介して有効性が低下しやすい剤に依存しない治療の過程、例えば骨髄移植または免疫療法を、用いることができる。さらに、ＢＣＲＰ発現が、標準的な治療での不良な予後を予測する場合において、一層攻撃的な治療計画を、最初に実施することができ、これには、一層攻撃的な化学療法または骨髄移植方法が含まれる。
【００９３】
本発明を、本発明の例として提供される以下の非限定的な例を参照することにより、一層良好に理解することができる。これらの例を、本発明の好ましい態様を一層完全に例示するために提示する。しかし、これらは、いかなる方法によっても本発明の広い範囲を限定すると考慮するべきではない。
【００９４】
例
例１
ＢＣＲＰは、広範囲の側方集団幹細胞において発現され、形質導入された造血幹細胞の分化をブロックし、幹細胞の純化のためのマーカーとして用いることができる
導入
造血幹細胞（ＨＳＣ）を、蛍光色素、例えばローダミン（Ｒｈｏ）１２３での染色により同定し、このような色素［Ｏｒｌｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８２： ７６２−７７０ （１９９３）； Ｆｌｅｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２２： ８９７−９０２ （１９９３）； ＳｐａｎｇｒｕｄｅおよびＪｏｈｎｓｏｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７： ７４３３−７４３７ （１９９０）； Ｚｉｊｌｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２： ８９０１−８９０５ （１９９５）］およびヘキスト３３３４２［ＭｃＡｌｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ７５： １２４０−１２４６ （１９９０）； Ｌｅｅｍｈｕｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ２４： １２１５−１２２４ （１９９６）； Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ２１： ６１４−６２２ （１９９３）］の排出に基づいて純化することができる。最も原始的なＨＳＣは、これらの色素での染色の後における、低い程度の蛍光を特徴とし、この特性は、色素排出のためのこれらの能力および比較的低い程度のミトコンドリア染色の両方に帰される［Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９１： ４１０６−４１１７ （１９９８）］。幹細胞同定についての関連する方法は、全骨髄細胞のヘキスト色素染色、それに続くフローサイトメトリーによる二重発光波長分析に基づいた。この手法は、再構築活性が高度に富化された側方集団（ＳＰ）の小さいフラクションを同定する［Ｇｏｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８３： １７９７−１８０６ （１９９６）］。
【００９５】
このＳＰ集団は、再構築細胞が高度に富化されており、試験したすべての種の骨髄中に存在する［Ｇｏｏｄｅｌｌ， Ｍ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ３： １３３７−１３４５ （１９９７）］。ＳＰ表現型を、細胞の色素排出機構を阻害する薬剤によりブロックすることができる。ＳＰ表現型の原因である排出活性は、Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）、哺乳類多剤耐性遺伝子の産物（ヒトにおけるＭＤＲ１並びにマウスにおけるｍｄｒ１ａおよび１ｂ）の発現のためであろうと考えられた［Ｓｏｒｒｅｎｔｉｎｏ， Ｂ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８６：４９１−５０１ （１９９５）］。この可能性は：（ｉ）Ｒｈｏ１２３およびヘキスト３３３４２は、Ｐ−ｇｐのための基質であり、（ｉｉ）未分化ヒト造血細胞は、高レベルのＰ−ｇｐを発現し［ＣｈａｕｄｈａｒｙおよびＲｏｎｉｎｓｏｎ， Ｃｅｌｌ ６６： ８５−９４ （１９９１）］、および（ｉｉｉ）ＳＰ細胞の表現型は、ベラパミル、Ｐ−ｇｐの競合的阻害剤によりブロックされ得る［Ｇｏｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８３： １７９７−１８０６ （１９９６）］という事実により示唆される。
【００９６】
一層最近の証拠は、筋肉が、ＳＰ表現型により同定することができる再構成細胞を含むことを示し［Ｇｕｓｓｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４０１： ３９０−３９４ （１９９９）； Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ ９６： １４４８２−１４４８６ （１９９９）、コメント参照］、ＡＢＣ輸送体の発現が、一般的な幹細胞特性であり得ることを示唆する［Ｏｒｋｉｎ， Ｓ．Ｈ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ６： １２１２−１２１３ （２０００）］。実際、これらの正確な機能が何であろうと、ＡＢＣ輸送体の発現が、幹細胞において進化的に保存されたことは明らかである。広範囲の幹細胞における輸送体発現の保存は、幹細胞における重要な機能的役割と整合する。
【００９７】
ＡＢＣ輸送体をコードする遺伝子の多くが、先ず、腫瘍細胞における薬剤耐性を付与するこれらの能力に基づいて同定されたが、これらが、細胞機能に対して一層一般的な効果を奏し得ることが、最近明らかになった。例えば、ＭＤＲ１遺伝子発現は、造血細胞［Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９３： １０７５−１０８５ （１９９９）］を含む種々の細胞において、カスパーゼ依存性アポトーシスを阻害することが示された［Ｓｍｙｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５： ７０２４−７０２９ （１９９８）］。Ｐ−ｇｐはまた、細胞膜の内部から外部リーフレットまでの膜リン脂質を再分布させることにより、脂質トランスロカーゼとして機能することができる［ｖａｎ Ｈｅｌｖｏｏｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ８７： ５０７−５１７ （１９９６）］。
【００９８】
ＡＢＣ輸送体が、ＨＳＣにおける機能的効果を有し得るという直接的な根拠は、マウスにおけるＭＤＲ１遺伝子導入の研究に由来する［Ｂｕｎｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９２： ２２６９−２２７９ （１９９８）； 米国特許出願第０９／５８４，５８６号、２０００年５月３１日出願の例１、この開示の全体を本明細書中に参照により組み込む］。マウス骨髄細胞に、ＭＤＲ１発現レトロウイルスベクターで形質導入した際には、再構築幹細胞の劇的な増殖が、１２日の培養期間の間に記録された［Ｂｕｎｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９２： ２２６９−２２７９ （１９９８）； 米国特許出願第０９／５８４，５８６号、２０００年５月３１日出願の例１、この開示の全体を本明細書中に参照により組み込む］。
【００９９】
対照的に、再構築活性は、対照培養物において、時間が経つと失われた［Ｂｕｎｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９６： ９０２−９０９ （２０００）； 米国特許出願第０９／５８４，５８６号、２０００年５月３１日出願の例２、この開示の全体を本明細書中に参照により組み込む］。これらの結果は、ＭＤＲ１の強制された発現が、長い培養期間の間の幹細胞自己複製および増殖をもたらすことを例証する。再構築細胞のこの増殖は、ＳＰ細胞の平行する増加を伴い、一方ＳＰ細胞は、対照培養物において、時間が経つと失われた。これらの結果は、ＳＰ幹細胞表現型を、ＡＢＣ輸送体発現または少なくともＭＤＲ１発現と直接関連づける。
【０１００】
幹細胞増殖のための１つの可能な機構は、Ｐ−ｇｐ発現が、エクスビボ培養期間中のＨＳＣからの有毒な培地組成物の排出をもたらし得ることであった。この可能性は、ＭＤＲ１形質導入幹細胞が、インビボで直接的な増殖上の利点を有していたという観察により、除外された［米国特許出願第０９／５８４，５８６号、２０００年５月３１日出願の例２、この開示の全体を本明細書中に参照により組み込む］。形質導入された骨髄細胞が、照射されたマウス中に、エクスビボ増殖局面を伴わずに、直接移植された際には、対照移植片に対して、ＭＤＲ１形質導入細胞の漸進的な成長があった。
【０１０１】
これらの結果は、ＭＤＲ１発現が、幹細胞分裂に対して、一層一般的な効果を付与し、単にエクスビボ培養に特異的な解毒機構により作用しないことを示す。突然変異体Ｐ−ｇｐ構築物での実験により、ＨＳＣの増殖が、Ｐ−ｇｐの分子ポンプ機能を必要とすることが例証され、これは、増殖の機構が、ＨＳＣ内のいくつかの内因性分子基質の調節を伴ったことを示唆した［米国特許出願第０９／５８４，５８６号、２０００年５月３１日出願の例２、この開示の全体を本明細書中に参照により組み込む］。全体として、これらの研究は、ＭＤＲ１遺伝子発現が、ＨＳＣ自己複製および増幅を促進できることを示す。以前は、この特性が、ＭＤＲ１遺伝子に特有であるか否か、または他のＡＢＣ輸送体が、同様の機能を奏することができるか否かは、知られていなかった。
【０１０２】
結果
ＨＳＣ中の内因性Ｐ−ｇｐの調節された発現は、幹細胞区画を長期間にわたり維持する自己複製分裂を容易にするにあたり重要であることが明らかになり［米国特許出願第０９／５８４，５８６号、２０００年５月３１日出願の例１および２参照、この開示の全体を本明細書中に参照により組み込む］、実際に、１種または２種以上の天然に存在する内因性ＡＢＣ輸送体は、明らかに、幹細胞ホメオスタシスにおいて重要な機能的役割を奏する。この前提は、２つの観察と整合する：（ｉ）ＨＳＣは、普遍的に色素排出輸送体を発現する；および（ｉｉ）ＭＤＲ１の強制された発現は、幹細胞の増幅および骨髄増殖（ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）をもたらす［米国特許出願第０９／５８４，５８６号、２０００年５月３１日出願の例１参照、この開示の全体を本明細書中に参照により組み込む］。
【０１０３】
本明細書中に開示するように、１または２以上の代替のＡＢＣ輸送体は、ｍｄｒ１ａ／１ｂノックアウトマウスに由来するＳＰ幹細胞において発現される。選別されたＳＰ幹細胞からのｍＲＮＡの分析は、ＳＰ　ＨＳＣにおいて発現される、いくつかの新たにクローン化された輸送体を同定し、これは、場合によっては、ＨＳＣの自己複製プロセスにおいて役割を奏し得る。最も高度に発現されるのは、Ｂｃｒｐ１／Ｍｘｒ／Ａｂｃｐ／ＡＢＣＧ２遺伝子産物、ＢＣＲＰである。重要なことに、ノーザンブロット分析のレベルにおいて、末梢血白血球、脾臓または胸腺におけるＢＣＲＰの検出可能な発現はない一方、小さいが検出可能な量のＢＣＲＰｍＲＮＡが、ヒト胎児肝臓において発現された。
【０１０４】
Ｐ−ｇｐ以外のＡＢＣ輸送体は、マウスＳＰ　ＨＳＣにおいて発現される：定量的再構築アッセイを、ドナーとして市場で入手できるｍｄｒ１ａ／ａｂ−−／−−マウスを用いて実施した。その理由は、Ｗ／Ｗ_ｖマウスなどのように重大な幹細胞の定量的な異常が、比較的正常な末梢血球数と、共に存在していることが十分知られているからである。正常な数の再構築細胞が、骨髄において存在することが見出された。次に、骨髄細胞を、ヘキスト色素での染色の後に、ＳＰ細胞の含量について分析した。ノックアウトマウスが、予測された表現型を有することを確認するために、前に記載されたようにＲｈｏ１２３排出についての能力が、末梢血白血球において失われたことが立証された［Ｓｃｈｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：４０２８−４０３３ （１９９７）］。このＰ−ｇｐ関連輸送体機能の損失にもかかわらず、ＳＰ細胞は、同一系統の野生型マウスと比較した際に、骨髄中に正常な数で存在した。このことは、他のＡＢＣ輸送体が発現され、Ｐ−ｇｐ機能の損失を潜在的に補償している可能性があることを示す。
【０１０５】
この可能性をさらに試験するために、生化学的研究を、ノックアウト骨髄細胞について、ＡＢＣ輸送体排出機能の既知の阻害剤を用いて実施した。細胞を、ベラパミルまたは２−デオキシグルコースのいずれかで処理した。ベラパミルは、ＭＤＲ１を含むいくつかの既知のＡＢＣ輸送体の競合的阻害剤である一方、２−デオキシグルコースは、ＡＢＣ輸送体機能に必要な細胞ＡＴＰレベルを消耗させる、ＡＴＰ合成の阻害剤である。ヘキスト３３３４２染色前および染色中の、これらの化合物のいずれかでの処理により、表現型的に同定可能なＳＰ細胞が消失した。これらの結果は、結論として、１または２以上の他のＡＢＣ輸送体が、ｍｄｒ１ａ／１ｂノックアウトマウスの骨髄からのＳＰ細胞において発現し、ＳＰ表現型の原因であることを例証する。
【０１０６】
造血幹細胞において発現されたＡＢＣ輸送体としてのＢｃｒｐの同定：マウス骨髄ＳＰ細胞中の他の既知のＡＢＣ輸送体のｍＲＮＡ発現を検出するためにＲＴ−ＰＣＲアッセイを構築した。ＭＲＰ１［Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｉｃｅｎｃｅ ２５８： １６５０−１６５４ （１９９２）；コメント参照］、ＭＲＰ２、３、４［Ｋｏｏｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７： ３５３７−３５４７ （１９９７）］およびＢＣＲＰ［Ｄｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１５６６５−１５６７０ （１９９８）：刊行された正誤表は、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６（５）： ２５６９ （１９９９）中に見出される］についての刊行されたヒト配列に基づいて、マウスＥＳＴデータベースからの相同配列を同定して、ｃＤＮＡ増幅のためのＰＣＲプライマーを設計した。複数のプライマーセットを、鋳型としてマウス肝臓ｃＤＮＡを用いて試験し、予測された大きさの特異的バンドを与えるプライマーセットを選択した。
【０１０７】
ＦＡＣＳを用いて、骨髄ＳＰ細胞を、正常なマウスおよびｍｄｒ１ａ／１ｂノックアウトマウスの両方から選別した。総細胞ＲＮＡを、５０，０００および１００，０００の純化されたＳＰ細胞から調製し、次にＲＴ−ＰＣＲ分析用に用いた。これらの実験は、Ｂｃｒｐ１（ｍＢＣＲＰ）ｍＲＮＡが、試験したすべての輸送体のうちで、最も高度に発現されたことを示した。中程度の発現レベルが、ｍｒｐ４およびｍｒｐ１について観察され、一方ｍｒｐ３は、極めて低いレベルで発現され、ｍｒｐ２の検出可能な発現は観察されなかった。肝臓におけるｍｒｐ１の低レベルの発現は、ヒト肝臓におけるＭＲＰ１の前に記載された低レベルの発現と相関した［Ｋｏｏｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７： ３５３７−３５４７ （１９９７）］。事実上同一の結果が、正常なマウスから選別されたＳＰ細胞を用いて得られた。
【０１０８】
ＳＰ細胞は、再構築細胞について高度に富化されているが、少なくとも２５０のＳＰ細胞が、マウスにおいて顕著な再構築を達成するために必要であることを指摘するのは重要であり［Ｇｏｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８３： １７９７−１８０６ （１９９６）］、このことは、ほとんどのＳＰ細胞が、真の幹細胞ではないことを示している。対照的に、骨髄からのＣＤ３４⁻、ｃ−ｋｉｔ^＋、Ｓｃａ１^＋、系列陰性（ＣＤ３４−ＫＳＬ）細胞は、再構築細胞の比較的純粋なサブセットであり、単一の選別された細胞を移植されたマウスの約２０％において、再構築がなされていた［Ｏｓａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３： ２４２−２４５ （１９９６）］ことは、前に示されている。従って、輸送体発現が、高度に純化されたＣＤ３４−ＫＳＬ集団において、および多数の他の異なる選別された集団から研究された。
【０１０９】
ＳＰ細胞と同様に、ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞は、比較的高レベルのｍＢＣＲＰｍＲＮＡを発現したが、ＳＰ細胞とは対照的に、他のＡＢＣ輸送体の発現は、ほとんどないか、ないしはなかった。一層分化されたＣＤ３４^＋ＫＳＬ細胞フラクションにおいて、ｍｒｐ１、２および４の顕著な発現の出現を伴うｍＢＣＲＰ発現の顕著な下方調節があった。Ｓ^＋Ｋ^＋Ｌｉｎ⁻集団は、ＣＤ３４⁻および＋細胞の混合物であり、ＣＤ３４^＋と−サブフラクションとの中間である結果を示した。ｍＢＣＲＰ発現は、顆粒球、マクロファージ、Ｂ細胞または胸腺リンパ球において検出可能ではなかった。検出可能なｍＢＣＲＰ発現を有する唯一の他の細胞集団は、赤血球前駆体（Ｔｅｒ１１９^＋）およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ１．１^＋）であった。
【０１１０】
これらの結果は、ｍＢＣＲＰ発現が、骨髄の系列陰性区画中の再構築幹細胞に高度に特異的であること、および選別されたＳＰ細胞集団中の他の輸送体の発現が、比較的低い程度の再構築能力を有する一層分化された細胞の存在による可能性があることを示唆する。これらのデータは、ＢＣＲＰ発現が、幹細胞同定および純化のための有用なマーカーであることを示す。また、発現データは、再構築造血幹細胞および、おそらく筋組織および他の組織からのＳＰ幹細胞におけるＢＣＲＰ遺伝子発現に必要な機能的役割と整合する。
【０１１１】
アカゲザル骨髄からの選別ＳＰ細胞におけるＢＣＲＰｍＲＮＡの高レベルの発現：霊長類ＳＰ細胞が、ＢＣＲＰを発現したか否かを決定するために、骨髄吸引試料を、正常なアカゲザルから得た。赤血球の溶解の後、白血球集団を、ヘキスト色素で染色し、ＳＰ細胞についてフローサイトメトリーにより分析した。フローパターンは、マウス骨髄を用いて得られたものと極めて類似しており、約０．０５％の細胞は、ＳＰゲート中にあった（前記参照）。選別を実施し、これにより、２０００のＳＰ細胞、およびＳＰ領域の外側の別個のゲートからの１０，０００の細胞（非ＳＰ細胞）の単離が得られた。ＲＮＡを抽出し、内部対照としてβ−アクチンプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲサイクル曲線は、非ＳＰ細胞について３５のサイクルおよびＳＰ細胞について６０のサイクルにおいて、およそ同等のシグナルを示した。これらのＰＣＲ条件を、β−アクチンプライマーの代わりにＢＣＲＰ特異プライマーを用いて繰り返した。
【０１１２】
強力なシグナルが、ＳＰ細胞試料で、６０サイクルにおいて、ＢＣＲＰプライマーを用いて得られ、はるかに弱いシグナルが、５０サイクルにおいて検出された。非ＳＰ試料においては、この試料に用いた最高のサイクル数である３５サイクルにおいて、ＢＣＲＰシグナルは検出されなかった。これらの結果は、サルＳＰ細胞におけるＢＣＲＰｍＲＮＡの、比較的特異的な、高レベルの発現を例証する。その理由は、３５サイクルにおける非ＳＰ細胞についてのβ−アクチンシグナルが、６０サイクルにおけるＳＰ細胞についてのシグナルよりも実際に大きかったからである。マウスのデータと一緒に考慮すると、（前述の）これらの結果は、ＢＣＲＰ輸送体相同分子種の発現が、別個の種からのＳＰ幹細胞において保存されることを示す。加えて、これらの結果は、さらに、ヒト幹細胞を、これらの独特のＢＣＲＰ発現を監視／利用することにより、同定および／または純化することができることを確認するものである。
【０１１３】
マウス筋芽ＳＰ細胞およびマウスＥＳ細胞におけるＢｃｒｐ１の発現：また、ＳＰ表現型を有する幹細胞が、マウス筋肉において同定され、それが筋線維の周辺に位置する衛星細胞に関連していると思われる。整合して、これらの細胞はまた、筋再生に関連していると思われる。
【０１１４】
従って、ＳＰ細胞を、マウス筋肉から単離し、ＲＴ−ＰＣＲによりｍＢＣＲＰ発現についてアッセイして、さらに、Ｂｃｒｐ１（ｍＢＣＲＰ）発現をＳＰ表現型と相関させた。筋組織を、切開し、細分し、コラゲナーゼで消化し、単細胞浮遊液を、ＳＰ細胞分析のために、ヘキスト色素で染色した。細胞のＳＰ集団をＦＡＣＳ分析により観察すると、骨髄細胞で見られるプロフィルに対して顕著な類似性を有した。ゲートをかけた筋芽ＳＰ細胞を選別し、ＲＮＡを、２０，０００の細胞のフラクションから調製した。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、比較的高いレベルのｍＢＣＲＰ発現を示した。しかし、サル骨髄を用いた結果とは異なり、別個の非ＳＰ細胞フラクションは、分析について入手可能ではなかった。これらの結果は、さらに、ｍＢＣＲＰ発現を用いて、種々の器官からのＳＰ幹細胞を同定することができるという結論を支持する。
【０１１５】
上記の結果とは対照的に、マウスＥＳ細胞からの非ＳＰ集団は、ＳＰフラクションと同等のレベルで、ｍＢＣＲＰを発現した。このことは、ＥＳ細胞が、クローン的に誘導され、遺伝子発現に関して均一であると予測されるため、驚異的ではない。これらの結果は、ｍＢＣＲＰ発現が、研究したすべてのＳＰ集団において保存されることを示し、幹細胞機能におけるｍＢＣＲＰの可能な必要な役割を示唆する。
【０１１６】
ＡＢＣＧ２（ｈｕＢＣＲＰ）のベクター媒介発現は、ＳＰ表現型を直接付与する。
ｐｃＤＮＡに基づくＢＣＲＰベクターを用いて、Ｓｏａｓ２細胞をトランスフェクトし、これを次に、これらの色素排出特性について分析した。トランスフェクトされたクローンは、ヘキスト色素を容易に排出したが、ｒｈｏを排出せず、排出活性は、レセルピンにより完全に阻害された。さらに、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）Ａモチーフにおける不活性化突然変異は、ヘキスト色素排出活性を消失させ、このことは、色素排出における輸送体ポンプ機能の必要性を示す。これらの発見は、ｍｄｒ１ａ／１ｂ^−／−マウスからの骨髄ＳＰ細胞のヘキスト低、ｒｈｏ明表現型と完全に整合する。
【０１１７】
次に、レトロウイルスプロデューサー細胞系を、ハーベイ（Ｈａｒｖｅｙ）マウス肉腫ウイルスバックボーン（ＨａＢＣＲＰ）に基づいて用いて、正常なマウス骨髄細胞に形質導入した。１２日にわたる骨髄サイトカイン（ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）中での培養の後に、ベクターにより形質導入された細胞は、ＳＰ細胞の数の大幅な増大を示し、６０％より多い細胞は、ＳＰ領域内にあった。比較により、模擬形質導入された細胞のわずか０．０５％が、ＳＰ表現型を示した。また、ＨａＢＣＲＰ形質導入骨髄細胞を、致死的に照射されたレシピエント中に移植して、ＳＰ増殖が、インビボで直接得られ得るか否かを決定した。３匹のマウスを、移植の５週間後に屠殺し、すべてが、ＳＰ細胞が１．４〜１１．４％の範囲内である、骨髄中のＳＰ細胞の増大した比率を示した。総合的に、これらの結果は、ＨｕＢＣＲＰ輸送体の発現が、形質導入された未分化骨髄細胞にＳＰ表現型を直接付与することができることを示す。
【０１１８】
マウス骨髄細胞におけるＨｕＢＣＲＰの強制的な発現は、分化をブロックする。
強制的なＨｕＢＣＲＰ発現の機能的効果を決定するために、ＨａＢＣＲＰ形質導入骨髄細胞を、骨髄前駆体コロニーを生じさせるこれらの能力についてアッセイした。形質導入の直後に分析した細胞において、ＣＦＵ−ＣおよびＣＦＵ−Ｓ形成における顕著な減少が、ＨａＢＣＲＰ形質導入集団において見られた。ＣＦＵ−Ｃのコロニー形成率は、２つの独立した実験において、４〜６倍の間で減少した。対照細胞は、コンフルエントＣＦＵ−Ｓを、１×１０^５細胞の量で与え、一方ＨａＢＣＲＰ形質導入細胞は、いくつかの別個のコロニーを与えたのみであった。形質導入の共培養局面の間の、プロデューサー細胞におけるＨｕＢＣＲＰ発現の非特異的効果について制御するために、また、骨髄細胞を、ＨａＢＣＲＰ形質導入３Ｔ３細胞と共培養した。前駆体含量に対する効果は、この対照では見られなかった。
【０１１９】
次に、致死的に照射されたＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスに、ＨａＢＣＲＰ形質導入細胞を移植し、造血再構成に対する効果を研究した。すべての３つの場合における骨髄中でのＳＰ細胞の増幅にもかかわらず、ＨａＢＣＲＰでの形質導入は、５週間における末梢白血球数の顕著な減少および骨髄中でのＣＦＵ−Ｃ含量における平行する減少を伴った。次に、競合的再構築アッセイを実施して、骨髄成熟に対するベクター発現の効果を一層精密に定量した。模擬形質導入された骨髄細胞を、ＨａＢＣＲＰ形質導入細胞または対照ＭＳＣＶ−ＧＦＰベクターで形質導入された細胞のいずれかと等しい比率で、競合させた。
【０１２０】
移植の９週間後に、赤血球区画に対する末梢性の寄与（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を、ドナー特異的ヘモグロビン多形を区別する電気泳動アッセイを用いて測定した［Ｂｕｎｔｉｎｇ， Ｋ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９６： ９０２−９０９ （２０００）； 米国特許出願第０９／５８４，５８６号、２０００年５月３１日出願、この開示の全体を本明細書中に参照により組み込む］。これらの研究は、ＨａＢＣＲＰベクターが、模擬対照においては見られなかった赤血球再構築の顕著な阻害を生じることを示した。総合的に、これらの結果は、ＨｕＢＣＲＰの強制的な発現が、造血分化をブロックすることができることを示し、内因的に発現されたＢＣＲＰ　ＨｕＢＣＲＰが、未分化な多能性状態に、幹細胞を維持するように機能し得ることを示唆する。
【０１２１】
ヒトＡＢＣＧ２（ｈｕＢＣＲＰ）遺伝子産物に対するマウスモノクローナル抗体の誘導：ヒトＢＣＲＰｃＤＮＡを、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯのＧｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓから、全長ＥＳＴとして得た（下記の方法参照）。このｃＤＮＡを、前記したように、ハーベイマウス肉腫ウイルスバックボーン中にクローン化して、ＨａＢＣＲＰレトロウイルスベクターを作製した。次に、このベクターを、エコトロピックなパッケージング細胞系ＧＰＥ８６中に導入し、ベクター含有上清液を用いて、ＮＩＨ　３Ｔ３細胞を形質導入した。細胞のポリクローナル集団（３Ｔ３−ＢＣＲＰと称する）を、フローサイトメトリーにより単離し、蛍光色素ヘキスト３３３４２を排出する細胞上にゲートをかけた。これらの細胞におけるＨｕＢＣＲＰ遺伝子産物の発現を、ウサギにおいて内部ペプチドエピトープに対して上昇させたポリクローナル血清を用いて、ウエスタンブロット分析により確認した。
【０１２２】
３Ｔ３−ＢＣＲＰ細胞を用いて、マウスを免疫した。２０匹のＢＡＬＢ−Ｃマウスを、完全な生存３Ｔ３−ＢＣＲＰ細胞で、４００万個の細胞を腹腔空間中に直接注射することにより、免疫した。１４日後、これらの細胞を、免疫ブーストとして、再注射した。血清中に抗体反応性を示した個別のマウスを屠殺し、ハイブリドーマクローンを、細胞融合およびＨＡＴ培地での選択の後に単離した。各々のハイブリドーマクローンからの上清液を、フローサイトメトリーにより、広宿主性ＨａＢＣＲＰベクターで形質導入したヒト乳癌細胞系（ＭＣＦ−７）を用いてスクリーニングした。次に、このアッセイにおいて反応性を示したすべての上清液を、親ＭＣＦ−７系列に対して逆スクリーニングし、ＭＣＦ−７ＨａＢＣＲＰ細胞と反応したが、親ＭＣＦ−７系列と反応しなかったクローンを、陽性で特異的であるとして記録した。次に、これらの細胞をサブクローン化し、指示細胞系に基づいて再スクリーニングした（図１参照）。
【０１２３】
次に、ＭＣＦ−７　ＨａＢＣＲＰ細胞について比較的大きいシフトを示すが、親対照細胞については示さない、独立したサブクローンを、単離する。次に、前に移植したマウスからの骨髄細胞中へのＨａＢＣＲＰベクターの発現を検出することができるクローンを、増殖させて、ローラーボトル産生系を用いて、エクスビボで大量の上清液を産生させる。次に、抗体を、アフィニティーカラム上で精製する。次に、これらの抗体を、ヒト臍帯血試料中で内因的に発現されたｈｕＢＣＲＰ遺伝子産物を検出するこれらの能力について、試験することができる。次に、ヒト臍帯血試料中で内因的に発現されたＡＢＣＧ２遺伝子産物を検出する抗体を用いて、幹細胞を同定および／または単離することができる。
【０１２４】
討議
ヘキストおよびｒｈｏ色素染色が、造血幹細胞純化のための方法として、長期間にわたり用いられてきたが、この表現型についての分子的基準は定義されていなかった。本明細書中に提供した結果は、Ｂｃｒｐ１およびＭＤＲ１ホモログが、共に、未分化幹細胞において、比較的限定された方式で発現されることを示す。ＳＰ細胞が、ｍｄｒ１ａ／ｂ^−／−マウスにおいて減少しないという事実は、Ｂｃｒｐ１発現により提供された代償的なヘキスト排出活性により説明される。ｍｄｒ１ａ／ｂ^−／−マウスにおいてｒｈｏ鈍（ｄｕｌｌ）ＳＰ細胞が欠如していることは、Ｐｇｐがｒｈｏを排出することができるが、ＢＣＲＰポンプは排出することができないという事実により同様に説明される。これらの色素排出活性が、分子的に区別可能であるという発見は、幹細胞純化方策のための顕著な意味を有する。例えば、マウスＥＳ細胞は、ｒｈｏを排出せず、このことは、ヘキスト色素排出（ｍＢＣＲＰ発現）が、一層特異的な幹細胞マーカーであることを示す。
【０１２５】
本明細書中に開示したデータのいくつかの観点は、ＢＣＲＰが、幹細胞における重要な機能的役割を奏することを示す。広範囲のソースからのＳＰ幹細胞中でのこの輸送体の保存された発現は、所要の機能と整合する。第２に、発現が、分化の初期の段階において顕著に減少する、マウス造血におけるＢｃｒｐ１の密に調節された発現パターンは、幹細胞特異的な役割と整合する。他の根拠は、過剰発現研究により提供され、ここで、強制されたｈｕＢＣＲＰ発現は、造血分化における欠陥をもたらす。インビボで、ＨａＢＣＲＰベクターは、骨髄中でのＳＰ細胞の蓄積を生じたが、これらの細胞からの成熟した子孫は、骨髄および末梢血液において顕著に減少し、ＣＦＵ−ＣおよびＣＦＵ−Ｓ形成に対する直接的な阻害効果が観察された。
【０１２６】
総合的に、これらの結果は、幹細胞中でのＢｃｒｐ１発現が、拘束および分化に対する相対的耐性を付与し、これにより、未分化な、多能性状態の維持に寄与するモデルにより、最良に説明される。次に、この潜在的抗分化効果は、初期の拘束の間に生じる発現の観察された減少に伴って軽減される。これらの系列に沿って、強制された発現の結果は、ここで、内因性発現が、通常発生しない一層成熟した区画におけるＢｃｒｐ１の不規則な発現により説明することができる。発育に対するブロックは、これらの区画において、脱調節された（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅｄ）Ｂｃｒｐ１発現の結果として生じ得る。
【０１２７】
これらの効果についての機構を考慮するにあたり、ＢＣＲＰの正常な生理学的機能が未だ定義されていないことは、注目すべきことである。遺伝子は、先ずヒト腫瘍細胞系から単離され、薬剤耐性に関わることが示された［Ｄｏｙｌｅ， Ｌ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ ９５：１５６６５−１５６７０ （１９９８）： Ｍｉｙａｋｅ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９： ８−１３ （１９９９）； Ｍａｌｉｅｐａａｒｄ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９： ４５５９−４５６３ （１９９９）］。ｈｕＢＣＲＰの一次構造は、ドロソフィラ・ホワイト（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｗｈｉｔｅ）遺伝子産物との最大の相同性を共有する。これらの「半輸送体」は、１つのみのＡＴＰ結合カセットを有し、ＡＴＰ加水分解および機能のために、ホモまたはヘテロ二量体化を必要とすると考えられる。ホワイト遺伝子産物は、２種の他の半輸送体とヘテロ二量体化し、これらの相互作用は、特異的にドロソフィラにおける目の色を規定する［Ｅｗａｒｔ， Ｇ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９： １０３７０−１０３７７ （１９９４）］。ＢＣＲＰはまた、今のところは定義されていない他のパートナーと哺乳類細胞中で、ヘテロ二量体を形成することができ、これらの相互作用は、基質特異性に影響し得る。
【０１２８】
造血分化に対するｈｕＢＣＲＰ発現の効果についての機構が知られていない一方、いくつかの一般的な可能性を、提案することができる。ＡＢＣ輸送体の、下等生物における幹細胞原始性を維持する能力についての前例がある。ジクチオステリウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）細胞は、細胞を原始的未分化状態に維持するｒｈｏ排出により規定される輸送活性を発現する［Ｇｏｏｄ， Ｊ．Ｒ． ＆ Ｋｕｓｐａ， Ａ．， Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ２２０： ５３−６１ （２０００）］。この効果は、予定胞子細胞の内部からの分化誘発因子、ＤＩＦ−１の排出により与えられる。Ｂｃｒｐ１が、哺乳類細胞における同様の基質を調節することは可能である。
【０１２９】
第２の可能性は、Ｂｃｒｐ１ポンプが、微小環境との幹細胞相互作用に影響する細胞外シグナルを媒介する役割を奏し得ることである。細胞外シグナリングに対するこのタイプの効果は、最近ｍｒｐ１^−／−マウスにおいて例証されており、ここで、この輸送体は、ロイコトリエンの細胞外空間への輸送を介した、正常な樹状細胞の移動に必要であることが示されている［Ｒｏｂｂｉａｎｉ， Ｄ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ １０３： ７５７−７６８ （２０００）］。第３の可能性は、Ｂｃｒｐ１が、ｍｄｒ１ａと冗長的な機能を提供し得、従ってｍｄｒ１ａ／１ｂ^−／−ノックアウトマウスにおける幹細胞中での潜在的な抗アポトーシスシグナルの損失が、Ｂｃｒｐ１発現により代償され得ることである。
【０１３０】
方法
マウス造血幹細胞中へのレトロウイルス媒介性遺伝子導入：骨髄細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６またはＢ６．Ｃｈ−１＜ｂ＞／Ｂｙ（「ＨＷ８０」と呼ぶ）コンジェニックマウス系統（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ， ＭＥ）から、標準的な方法により採取することができる。単離に続いて、細胞を、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ， Ｌｏｇａｎ ＵＴ）、２０ｎｇ／ｍｌのマウスインターロイキン（ＩＬ）−３（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）、５０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−６（Ａｍｇｅｎ， Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ， ＣＡ）および５０ｎｇ／ｍｌのマウス幹細胞因子（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ）中での液体浮遊培養に付する。
【０１３１】
細胞を、最初に、１０ｍｌの培地中に、１×１０^６細胞／ｍｌで蒔く。４８時間にわたる前刺激（ｐｒｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）に続いて、細胞を、照射したエコトロピックプロデューサー細胞系のコンフルエントな単層上に再び蒔く。骨髄細胞を、前刺激局面において用いた同一の密度で、および６μｇ／ｍｌのポリブレンを加えた同一の培地に蒔いた。プロデューサー細胞との共培養を、４８時間継続し、続いて骨髄細胞を採取する。骨髄細胞の小試料を、メチルセルロース中に蒔いて、薬剤耐性骨髄前駆体を記録する。
【０１３２】
サザンブロット分析：ＤＮＡを、前に記載されたように調製することができる［Ｓｏｒｒｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７： ９９−１０３ （１９９２）］。典型的には、１０〜２０ｍｇのゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲ１またはＮｈｅＩのいずれかで制限消化し、１％アガロースゲル上で分離する。ゲルを、ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）Ｎ^＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上に一晩ブロットし、ＵＶ架橋させ、ＭＤＲ１またはヘモグロビン特異［^３２Ｐ］標識プローブのいずれかとハイブリッド形成することができる。ブロットを、６５℃で十分に洗浄し、一晩暴露し、フォスファイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）上で分析することができる。
【０１３３】
ローダミン１２３（Ｒｈｏ１２３）染色：Ｒｈｏ１２３染色を、細胞をトリプシン処理し、細胞を、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地中に、１×１０^６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、Ｒｈｏ１２３（Ｓｉｇｍａ）を、１μｇ／ｍｌの最終濃度で加えることにより、実施することができる。次に、細胞を、３７℃で１時間暗中でインキュベートし、１０ｍｌのＰＢＳで１回洗浄し、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中に再懸濁させる。次に、細胞を、３７℃で１時間インキュベートして、排出させ、遠沈し、次にＦＡＣＳ分析のために１ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁した。
【０１３４】
４Ｅ３抗体およびローダミン１２３染色：プロデューサー細胞を、ＡＢＣ輸送体、例えばＰ−ｇｐ発現について、モノクローナルマウス抗ヒトＰ−糖タンパク質抗体（クローン４Ｅ３、ＤＡＫＯ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ， ＣＡ）での染色により、分析することができる。接着性細胞を、トリプシン処理し、２％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ_３を含む５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁する。次に、５μｌの４Ｅ３抗体を加え、室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートし、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、次に２％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ_３を含む５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁する。一次抗体染色の後、５μｌのＰＥ結合ウサギ抗マウス抗体（ＤＡＫＯ）を、二次染色として加える。次に、細胞を、ＲＴで３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ分析のためにＰＢＳ中に再懸濁する。
【０１３５】
ヘキスト３３３４２ＳＰ細胞アッセイ：マウス骨髄細胞を回収し、１×１０^６細胞／ｍｌで、１０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび２％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ中に再懸濁する。水浴中で、細胞を、３７℃で放置して平衡にし、続いて、前に記載されたように［Ｇｏｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８３： １７９７−１８０６ （１９９６）］、５μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ）を９０分間加える。次に、細胞を、４℃で遠心分離し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび２％ＦＢＳ加氷冷ＨＢＳＳ中に、１×１０^７細胞／ｍｌで再懸濁する。フローサイトメトリー分析または選別のために、ベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）ＦＡＣＳバンテージ（Ｖａｎｔａｇｅ）フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）を、前に記載されたように［Ｇｏｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８３： １７９７−１８０６ （１９９６）］、二発光波長分析（ｄｕａｌ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ａｎａｌｙｓｉｓ）のために設定することができる。細胞を、前方および側方散乱光に基づいてゲートをかけ、残骸を除外する。ヨウ化プロピジウム染色（２μｇ／ｍｌ）を用いて、死細胞を排除するゲートを得ることができる。１×１０^６細胞からのデータが採集されるまで、細胞を約５，０００細胞／秒で分析する。ＳＰ細胞のゲートを、正常な新鮮骨髄細胞（例えばＣ５７ＢＬ／６）に基づいて定義することができる。
【０１３６】
マウス：ＦＶＢ背景について戻し交配した、雄および雌両方のｍｄｒ１ａ／１ｂ^−／−マウスを、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｓ （Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ， ＮＹ）から入手した。移植研究のために、雌Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＢ６．Ｃ−Ｈ１ｂ／ＢｙＪマウス（ＨＷ８０と呼ぶ）を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ， ＭＥ）から入手し、８〜１４週齢の間に用いた。
【０１３７】
ＳＰ細胞分析。マウスおよびアカゲザルＳＰ細胞分析を、正確に前に記載されたとおりに［Ｇｏｏｄｅｌｌ， Ｍ．Ａ．． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８３： １７９７−１８０６ （１９９６）； Ｇｏｏｄｅｌｌ， Ｍ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ３： １３３７−１３４５ （１９９７）］実施した。阻害剤実験のために、２−デオキシグルコースおよびアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ）またはレセルピン（Ｓｉｇｍａ）を、細胞に、それぞれ５０および１５ｍＭまたは５μＭの最終濃度で加えた。次に、細胞を、３７℃で１５分間インキュベートし、続いてヘキスト３３３４２色素を加えた。他の実験において、骨髄細胞を、０．１μｇ／ｍｌのローダミン１２３（Ｓｉｇｍａ）の存在下、３７℃で２０分間インキュベートし、次にヘキスト３３３４２を含む培地中に、ＳＰ分析のために再懸濁した。
【０１３８】
細胞選別およびＲＮＡ抽出。フローサイトメトリー選別のために、ＦＡＣＳバンテージ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）を用いて、約３００，０００および１６０，０００のＳＰ細胞を、それぞれｍｄｒ１ａ／１ｂ^−／−および野生型のマウスの骨髄から単離した。２ｍｌの吸引液からのアカゲザル骨髄細胞を、フローサイトメトリーにより選別し、約２，０００のＳＰおよび１０，０００の非ＳＰ細胞を、単離した。マウス骨格筋細胞の単細胞浮遊液を、前に記載されたように［Ｇｕｓｓｏｎｉ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４０１： ３９０−３９４ （１９９９）］、ＳＰ分析のために調製し、１０，０００のＳＰおよび非ＳＰ細胞を選別した。マウスＣＤ３４⁻幹細胞を純化するための手順は、前に記載されている［Ｏｓａｗａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３： ２４２−２４５ （１９９６）］。すべての場合において、選別された細胞からの全ＲＮＡを、製造者の推奨に従って、ＲＮＡ　ＳＴＡＴ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ， ＩＮＣ． Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ， ＴＸ）を用いて単離した。
【０１３９】
ＲＴ−ＰＣＲアッセイ。ＰＣＲ増幅のために用いるプライマーは、以下の通りである：
マウスｂｃｒｐ１：３２７ｂｐのフラグメントについて５’−ＣＣＡＴＡＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴ−３’、配列番号１７および５’−ＧＧＧＣＣＡＣＡＴＧＡＴＴＣＴＴＣＣＡＣ−３’、配列番号１８；
アカゲザルＢＣＲＰ：３４２ｂｐのフラグメントについて５’−ＧＧＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＡＣＴＴＡＴＧＴ−３’、配列番号１９および５’−ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＴＡＧＣＴＧＡＴ−３’、配列番号２０。
【０１４０】
ＭＤＲ１様遺伝子のための多重ＰＣＲは、ｍｄｒ１ａおよびｍｄｒ２についてのフォワードプライマー
５’−ＡＧＣＴＧＧＡＧＡＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣ−３’、配列番号２１、ｍｄｒ１ｂについてのフォワードプライマー
５’−ＡＧＣＣＧＧＡＧＡＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣ−３’、配列番号２２およびそれぞれｍｄｒ１ａ、ｍｄｒ１ｂおよびｍｄｒ２についてのリバースプライマー：５’−ＣＴＧＴＡＧＣＴＧＴＣＡＡＴＣＴＣＧＧＧ−３’、配列番号２３、
５’−ＣＴＧＴＡＧＣＴＧＴＣＡＡＴＣＴＣＡＧＧ−３’、配列番号２４および５’−ＣＴＧＴＡＧＣＴＧＴＣＡＡＴＣＡＧＡＧＧ−３’、配列番号２５を用いた。これらのプライマーは、すべての３つのｃＤＮＡについて、７３０ｂｐのフラグメントを増幅する。
【０１４１】
ＰＣＲ産物を、ＢｓｔＸＩ、ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩの混合物で、３７℃で消化して、各々のｃＤＮＡ種（ｍｄｒ１ａ　ＢｓｔＸＩ消化：６１９＋１１１ｂｐ、ｍｄｒ１ｂ　ＢｇｌＩＩ消化：３０５＋４２５ｂｐ、ｍｄｒ２　ＥｃｏＲＩ消化：４５２＋２７８ｂｐ）からの相対的寄与を区別した。
【０１４２】
ＲＮＡを、ＲＱ１ＲＮＡ分解酵素非含有ＤＮＡ分解酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）で処理し、ｃＤＮＡに、製造者の指示に従って、スーパースクリプト（ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＩＩＲＴ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）、およびオリゴｄＴプライマーおよびランダムヘキサマーの混合物を用いることにより、逆転写した。先ず、ＧＡＰＤＨを標準として用いて、すべてのｃＤＮＡを標準化した。マウスＳＰ集団に関する実験において、ＡＢＣ輸送体増幅を、３２サイクルで実施した。ＣＤ３４⁻の実験において、ＧＡＰＤＨ標準化ｃＤＮＡアリコートを、ｍＢＣＲＰプライマーで、３５サイクルにわたり増幅した。
【０１４３】
アカゲザルでの実験において、これらの種々の条件が、各々の試料から同等のβ−アクチンシグナルを生じるという観察に基づいて、２０００のＳＰ細胞からのＲＮＡを、ＨｕＢＣＲＰまたはβ−アクチンについて、６０サイクルで増幅し、一方１０，０００の非ＳＰ細胞からのＲＮＡを、３５サイクルで増幅した。すべてのＰＣＲ反応を、反応混合物中で８００μＣｉ／ｍｍｏｌ／Ｌの０．２μｌのＰ^３２標識ＣＴＰを用いて実施した。増幅後、２０μｌの反応混合物を、５％非変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。
【０１４４】
ＨｕＢＣＲＰ発現ベクター、形質導入および移植。
ヒトＢＣＲＰｃＤＮＡを、全長ＥＳＴ＃５２１７６、配列番号２６として得た（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）。このｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ_３発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）中にクローン化、または、ＨａＭＤＲ１ｓｃベクター中のＭＤＲ１ｃＤＮＡと置換した［Ｂｕｎｔｉｎｇ， Ｋ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９２： ２２６９−２２７９ （１９９８）； Ｂｕｎｔｉｎｇ， Ｋ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９６： ９０２−９０９ （２０００）； 米国特許出願第０９／５８４，５８６号、２０００年５月３１日出願、この開示の全体を本明細書中に参照により組み込む］。エコトロピックプロデューサー細胞のポリクローナル集団を、前に記載されたように［Ｐｅｒｓｏｎｓ， Ｄ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ Ｍｏｌ． Ｄｉｓ． ２４：１６７−１８２ （１９９８）］、トランスフェクトした２９３Ｔ細胞から得られた一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）上清液を用いて、ＧＰ^＋Ｅ８６パッケージング細胞に形質導入することにより、発生させた［Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２： １１２０−１１２４ （１９８８）］。
【０１４５】
次に、ベクター形質導入プロデューサー細胞を、ヘキスト３３３４２弱染色（ｄｉｍ）細胞についての細胞選別により、単離した。骨髄細胞の形質導入、細胞のインビトロ増殖、マウス移植および競合的再構築アッセイのための方法は、前に記載されている［Ａｌｌａｙ， Ｊ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ４：１１３６−１１４３ （１９９８）］。ＣＦＵ−ＣおよびＣＦＵ−Ｓアッセイを、前に記載したように実施した［Ａｌｌａｙ， Ｊ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９０： ３５４６−３５５４ （１９９７）； Ｐｅｒｓｏｎｓ， Ｄ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９０： １７７７−１７８６ （１９９７）］。
【０１４６】
例２
小児急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）からの芽球におけるＢＣＲＰ発現
臨床的証拠は、無調節なＡＢＣ輸送体発現とヒト白血病との間の関連を示す。慢性骨髄性白血病において、約６０％の慢性相患者は、骨髄からの白血病細胞におけるＰ−ｇｐ発現を示す［Ｇｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ ８６： ８０５−８１３ （１９９９）］。急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を患っている患者において、３５〜７０％の症例が、診断において白血病芽球におけるＰ−ｇｐ発現を例証し、Ｐ−ｇｐ発現は、強度にネガティブな予後判定因子であった［Ｌｅｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９４： １０８６−１０９９ （１９９９）］。対照的に、ヒトにおける正常な後期骨髄細胞は、Ｐ−ｇｐを発現しない［Ｄｒａｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８０： ２７２９−２７３４ （１９９２）、コメント参照］。
【０１４７】
いくつかの場合において、芽細胞における増大したＰ−ｇｐ発現は、ＭＤＲ１プロモーターにおける配列の低メチル化によるものであった［Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９２： ４２９６−４３０７ （１９９８）］。他のＡＢＣ輸送体の発現は、多剤耐性タンパク質（ＭＲＰ１）および肺耐性タンパク質（ｌｕｎｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＬＲＰ）について記録されているように、ヒトＡＭＬにおいて生じ得る［Ｌｅｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９４： １０８６−１０９９ （１９９９）； Ｍｉｃｈｉｅｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌ． １０４： ３２８−３３５ （１９９９）］。重要なことに、顕著な数のＡＭＬの症例は、ＭＤＲ１、ＭＲＰ１またはＬＲＰに関連しない阻害可能な色素排出活性を示した［Ｍｉｃｈｉｅｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌ． １０４： ３２８−３３５ （１９９９）； Ｌｅｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８６： ２３２９−２３４２ （１９９５）］。
【０１４８】
ＢＣＲＰ発現が、ＡＭＬを患っている小児患者からの白血病細胞において検出され得るか否かを決定するために、ＲＴ−ＰＣＲ分析を、４つの個別の症例からの白血病骨髄から由来するＲＮＡについて実施した。２つの症例では、ＢＣＲＰｍＲＮＡについて強度に陽性であり、ＢＣＲＰ増幅フラグメントは、２５サイクルの増幅において検出された。興味深いことに、これら両方の「高度発現」の症例は、Ｍ１ＦＡＢ表現型と関連した。Ｍ５表現型を有する２つの他の症例は、２５サイクルにおいて検出可能なシグナルを示さず、ＢＣＲＰは、３０サイクルにおいて検出し得た。β−アクチン対照は、この変動が、ｍＲＮＡロードにおける差異のためではないことを例証した。Ｍ５の症例において見られる低レベルシグナルは、ＢＣＲＰを発現し得る混入赤血球前駆体のため、または芽細胞中の低レベルＢＣＲＰ発現のためであるかも知れない。これらのデータは、ＢＣＲＰｍＲＮＡ発現が、少なくともいくつかの初代（ｐｒｉｍａｒｙ）ＡＭＬ試料において検出することができることを確認する。さらに、これらの結果は、ＡＭＬの診断／予後判定において芽細胞試料を探索する抗ＢＣＲＰ抗体を用いることへのさらなる刺激を提供する。
【０１４９】
本発明は、特定の態様、種々の特定の材料、手順および例を参照することにより、本明細書中で記載および例示されているが、本発明が、当該目的のために選択された材料の特定の材料組み合わせおよび手順に限定されないことを理解するべきである。実際に、本明細書中に記載されたものに加えて、本発明の種々の変更が、前記記載から、当業者に明らかになる。このような変更は、添付した特許請求の範囲の範囲内にあることを意図する。
【０１５０】
さらに、核酸またはポリペプチドについて与えられた、すべての塩基の大きさまたはアミノ酸の大きさおよびすべての分子量または分子質量値は、概数であり、記載のために提供されていることを理解するべきである。
種々の刊行物、特許出願および特許を、本明細書中で引用し、この開示の全体を、参照により組み込む。
【図面の簡単な説明】
【図１】
細胞選別により生存幹細胞を単離するために用いることができる、抗ＢＣＲＰモノクローナル抗体を生成する方法の模式図である。

Claims (20)

1. 幹細胞を同定する方法であって、
   （ａ）幹細胞を含む細胞試料を得ること、および
   （ｂ）細胞試料中の細胞によるＢＣＲＰの発現を検出することを含み、ここで、ＢＣＲＰを発現する細胞を幹細胞として同定する、前記方法。
2. 検出がＢＣＲＰに結合する抗体により行われ、ここで、幹細胞が前記抗体に結合する場合に幹細胞が同定される、請求項１に記載の方法。
3. 検出がＢＣＲＰを発現する核酸のためのＰＣＲプローブにより行われる、請求項１に記載の方法。
4. 検出が細胞のポンプ活性を測定することにより行われ、ここで、幹細胞がヘキスト３３３４２色素を除去することができるが、ローダミン１２３色素を除去することができない場合に幹細胞が同定される、請求項１に記載の方法。
5. さらに
   （ｃ）幹細胞に関連する細胞マーカーの発現を検出することを含み、ここで、ＢＣＲＰを発現し、該細胞マーカーを発現する細胞が幹細胞として同定される、請求項１に記載の方法。
6. 細胞マーカーがＥＭ１０、ＣＤ３４、Ｔｈｙ−１、Ｐ−ｇｐ、Ａｃ１３３およびｃ−ｋｉｔからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
7. 細胞マーカーがＣＤ３４であり、ここで、細胞がまたＣＤ３８⁻でもある、請求項５に記載の方法。
8. さらに、
   （ｃ）系列特異的マーカーの発現を検出することを含み、ここで、ＢＣＲＰを発現するが、系列特異的マーカーを発現しない細胞が幹細胞として同定される、請求項１に記載の方法。
9. 幹細胞が造血幹細胞であり、系列特異的マーカーが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ７１、ＨＬＡ−ＤＲおよびグリコホリンＡからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
10. ＢＣＲＰを発現する細胞を単離する方法であって、
    （ａ）ＢＣＲＰを発現する細胞を含む細胞試料を得ること、
    （ｂ）細胞試料中の細胞によるＢＣＲＰの発現を検出すること、および
    （ｃ）ＢＣＲＰを発現する細胞を単離すること、
    を含む、前記方法。
11. ＢＣＲＰを発現する細胞を単離する方法であって、
    （ａ）ＢＣＲＰを発現する細胞を含む細胞試料を得ること、
    （ｂ）細胞試料を、ＢＣＲＰに結合する抗体と接触させること、および
    （ｃ）前記抗体に結合する細胞を、細胞試料から単離すること、
    を含み、ここで、単離された細胞がＢＣＲＰを発現する細胞である、前記方法。
12. 単離がフローサイトメトリーにより行われる、請求項１１に記載の方法。
13. 抗体が蛍光標識を有し、単離が蛍光活性化細胞選別によって行われる、請求項１２に記載の方法。
14. 請求項１１に記載の方法により得られた、単離された幹細胞。
15. （ａ）幹細胞および幹細胞ではない細胞の両方を含む、混合細胞集団を得ること、および
    （ｂ）混合細胞集団の細胞を、ＢＣＲＰを発現するか発現しないかに基づいて、２つの個別の細胞群に分離すること（ここで、ＢＣＲＰを発現する細胞群が、幹細胞について富化された細胞集団である）、
    を含む方法により得られた、幹細胞について富化された細胞集団。
16. ＢＣＲＰの細胞外部分を認識する抗体であって、ＢＣＲＰの前記細胞外部分が、その天然のコンフォメーションにある、前記抗体。
17. ＢＣＲＰが生存幹細胞の表面上にある、請求項１６に記載の抗体。
18. 白血病を有するか、またはこれを有することが疑われるヒト対象において発現されたＢＣＲＰの量を決定するための方法であって、
    （ａ）白血病細胞を、対象から得ること、および
    （ｂ）白血病細胞において発現されるＢＣＲＰの量を決定すること、
    を含む、前記方法。
19. 白血病が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項１８に記載の方法。
20. 白血病細胞が芽細胞である、請求項１９に記載の方法。

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