JP2004529624A - 間葉細胞中で発現されるｔ細胞受容体変種とその使用 - Google Patents

間葉細胞中で発現されるｔ細胞受容体変種とその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子の新規ポリヌクレオチド転写体、ならびにこれらの転写体によりコードされるアミノ酸配列、および間葉細胞増殖の調節におけるこれらの使用に関する。本発明はさらに、これらの転写体によりコードされる新規タンパク質またはペプチドに関する。本発明はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子によりコードされるｃＤＮＡ分子、Ｖ領域配列が欠如しており、定常（Ｃ）ドメインと結合（Ｊ）領域配列、およびフレーム内メチオニンコドンを含むＪ領域配列の上流に５’イントロンＪ配列とを含むこれらの新規ｃＤＮＡ分子に関する。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉細胞中で発現されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子のイントロン配列を含むポリヌクレオチド転写体、これらのアンチセンスポリヌクレオチド、および間葉細胞増殖の調節におけるこれらの使用に関する。本発明はさらに、これらの転写体によりコードされる新規タンパク質またはペプチド、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞受容体
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ遺伝子産物は、種々の型の細胞により広く発現されるが、ＭＨＣクラスII分子は、より少数のしかし多様な型の細胞（例えば、樹状細胞、Ｂリンパ球、マクロファージおよび血管内皮細胞）で構成的に発現されるかまたは誘導性である。これに対して、Ｔ細胞受容体複合体は、Ｔ細胞のみにより発現されると考えられており、これはさらに、ＴＣＲ遺伝子再配列に関与する複雑なシグナルカスケードならびに特異的酵素を有する。すなわち、ＭＨＣに提示されたペプチドの認識は、非常に特異的なＴ細胞機能であるようである。
【０００３】
ＭＨＣに制限されるＴ細胞は、ヘテロダイマー性の表面タンパク質受容体（αβＴＣＲ）を発現し、これは、最大５つの追加の非変種膜受容体とともに局在化する（Strominger， 1989；Abbasら, 1994；Jamesonら、1995）。このＴＣＲ複合体は、ＭＨＣ分子に結合した処理されたペプチド抗原に特異的に結合する。種々の標的細胞上のＴＣＲとＭＨＣ結合ペプチドとの相互作用は、Ｔ細胞増殖と、標的細胞死滅、移植片拒絶、および他の生物学的作用を引き起こすエフェクター機能の活性化との点から、重要な意味を有する可能性がある。
【０００４】
ポリペプチドとして発現されることができる機能性ＴＣＲ α鎖とβ鎖遺伝子は、通常Ｔリンパ球系統の細胞中にのみ存在する。これらの機能性ＴＣＲ遺伝子は、生殖細胞系遺伝子セグメントの体細胞性再配列により形成される。各ＴＣＲ遺伝子座は、可変（Ｖ）、結合（Ｊ）、および定常（Ｃ）領域遺伝子からなり、β鎖は、多様性（Ｄ）遺伝子セグメントを含有する。マウスでは、ＣセグメントとＪセグメントの２つのクラスターの５’に位置する２０〜３０のＶβ遺伝子セグメントがある。最大５０の異なるＪセグメントと約７５のＶαとＪαエキソンの大きな５’クラスターに結合した単一のＣα遺伝子があり、これは、全ＴＣＲ δ鎖遺伝子座を含む。胸腺でのＴ細胞の成熟中に、ＴＣＲセグメントは、規定の順序で再配列され、Ｖ、Ｄ、ＪおよびＣセグメントが互いに近接している機能性のＴＣＲαおよびβ遺伝子が形成される。
【０００５】
β鎖遺伝子座は、α遺伝子座の前に再配列される。１次転写体は、ＶＤＪとＣ遺伝子の間に非コード性イントロン配列を含有し、これは後にスプライス除去される。機能性Ｔ細胞受容体は、２つのポリペプチド（α鎖は、４０〜６０kDの酸性糖タンパク質であり、β鎖は、４０〜５０kDの非荷電または塩基性糖タンパク質である）からなる。α鎖とβ鎖のＶ領域とＣ領域は、３次構造形成に寄与する可能性のある鎖内ジスルフィド結合ループを形成し、これは、細胞膜上に存在する。Ｃ領域は、膜貫通ドメインと短い細胞質テイル（これは、内因性シグナル伝達性を有するには小さすぎると考えられている）を含有する。
【０００６】
Ｔ細胞（Qianら、1993；Yoshikaiら、1984）ならびにＢ細胞（CalmanとPeterlin、1986）は、サイズと構造が異なるＴＣＲαとβの一連の不完全な転写体を発現する。これらの転写体は、フレーム外にあるか、またはその配列が多くの停止コドンを含有してもよい。上流のスプライスされたＪセグメントによりフランクされる定常領域をコードするｍＲＮＡが同定されたことがある。メチオニンのフレーム内コドンを含有するヒトＴＣＲβのそのような転写体が報告されている（Fagioliら、1991）。しかし、Ｔ細胞中でこれらの転写体によりコードされるタンパク質の存在は証明されていない。
【０００７】
ＴＣＲ転写体はまた、Ｔリンパ球またはＢリンパ球以外の細胞系でも報告されている。すなわち、マウス腎臓中でＴＣＲα ｍＲＮＡが同定された（Madrenasら、1991；Madrenasら、1992；Madrenasら、1994）。最近の研究で、上皮腫瘍細胞中で、Ｖ領域が欠如した部分的ＴＣＲγ鎖ｍＲＮＡが同定された。このｍＲＮＡは、７kDaのタンパク質であるＴＡＲＰをコードし、これは、代替読みとり枠から翻訳され、従ってＴＣＲγタンパク質と相同的ではない（Essandら、1999；Wolfgangら、2000）。この研究では、ＴＣＲαβもしくはＴＣＲδ転写体またはタンパク質の証拠は、見いだされなかった。従って、ＴＣＲβ転写体は、リンパ球系の外には見いだされず、細胞表面で発現されるＴＣＲタンパク質はＴ細胞形質に特異的であると、一般に認識されている。
【０００８】
間葉細胞
間葉細胞は、器官形成を指令することにより胚発生において重要な役割を果たす。成体生物では、組織リモデリング（例えば、創傷治癒で起きるようなもの）は、間葉上皮細胞により開始される。造血制御の研究は、血球形成が、間質性間葉により局所的に制御されることを証明した（Zipori, 1989；Zipori, 1989；Zipori, 1990；Weintroubら, 1996）。実際、骨髄由来の初代間質ならびに初代骨髄培養物由来の種々の間葉細胞系は、インビトロで造血を支持する能力を示し、移植されると、移植部位でインビボで骨と造血活性のある組織の形成を促進する。間質活性を仲介する分子は、種々のサイトカインと接着分子であることが証明されている。しかし、これまで同定された分子は、広範な間質細胞機能を説明できず、間質構築、幹細胞再生、および他の必須の間質機能を説明できない。
【０００９】
本明細書における文献の引用は、そのような文献が関連する先行技術であることを認めるものではなく、本出願の特許性に重要であると考えているものでもない。文献の内容や日付に関する記載は、出願時に本出願人が入手できた情報に基づくものであり、そのような記載の正確性を認めるものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
（発明の要約）
本発明は、以下に記載されるように、新規ポリヌクレオチド転写体と、コードされるタンパク質（Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のα鎖とβ鎖の短い変種である）、およびこれらの分子の使用に関する。
本発明において、骨髄由来間質性間葉細胞は、ユニークな末端切断型Ｔ細胞受容体遺伝子転写体を発現することが開示される。さらに、これらのユニークな転写体は、イントロンＪ配列を含むが、可変（Ｖ）領域配列が欠如している。
本発明は、ある態様において、非造血細胞、特に間質性間葉細胞、中のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子によりコードされるｃＤＮＡ分子に関し、該ｃＤＮＡ分子は、Ｖ領域配列が欠如しており、定常（Ｃ）ドメインと結合（Ｊ）領域配列と、フレーム内メチオニンコドンを含むＪ領域配列の上流に５’イントロンＪ配列とを含む。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書に開示の新規ポリヌクレオチド配列、およびこれらのポリヌクレオチド配列によりコードされる対応するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、ヒト遺伝物質を含む哺乳動物種から誘導される。
本発明のある実施態様において、ｃＤＮＡ分子は、マウスＴＣＲβ遺伝子によりコードされる。結合（Ｊ）遺伝子配列は、特に限定されないが、Ｊβ２．１とＪβ２．６から選択される。
【００１２】
本発明のある実施態様において、結合（Ｊ）遺伝子配列はＪβ２．１でもよく、フレーム内メチオニンコドンを含む該５’イントロンＪ配列は、配列ＭＥＮＶＳＮＰＧＳＣＩＥＥＧＥＥＲＧＲＩＬＧＳＰＦＬ［配列番号１］のペプチドをコードする。
別の実施態様において、結合（Ｊ）遺伝子配列はＪβ２．６であり、フレーム内メチオニンコドンを含む該５’イントロンＪ配列は、配列ＭＧＥＹＬＡＥＰＲＧＦＶＣＧＶＥＰＬＣ［配列番号２］のペプチドをコードする。
本発明の別の実施態様において、ｃＤＮＡ分子は、マウスＴＣＲα遺伝子によりコードされる。この場合、結合（Ｊ）遺伝子配列は、特に限定されないが、ＪαＴＡ３１、ＪαＴＡ４６、ＪαＮｅｗ０５、ＪαＳ５８、ＪαＮｅｗ０６、ＪαＮｅｗ０８、ＪαＬＢ２Ａ、ＪαＤＫ１、およびＪαＴＡ３９から選択される。
【００１３】
本発明のこの実施態様において、ｃＤＮＡ分子は、以下よりなる群から選択されるフレーム内メチオニンコドンを含む５’イントロンＪ配列を含む：
（ｉ）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＴＡ３１遺伝子配列：
ＭＡＷＨ［配列番号３］；
（ii）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＴＡ４６遺伝子配列：
ＭＥＡＧＷＥＶＱＨＷＶＳＤＭＥＣＬＴＶ［配列番号４］；
（iii）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＴＡ４６遺伝子配列：
ＭＥＣＬＴＶ［配列番号５］；
（iv）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＮｅｗ０５遺伝子配列：
ＭＴＶ［配列番号６］；
（ｖ）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＳ５８遺伝子配列：
ＭＣＧＳＥＥＶＦＶＶＥＳＡ［配列番号７］；
（vi）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＮｅｗ０６遺伝子配列：
ＭＡＣＹＱＭＹＦＴＧＲＫＶＤＥＰＳＥＬＧＳＧＬ
ＥＬＳＹＦＨＴＧＧＳＳＱＡＶＧＬＦＩＥＮＭＩＳＴ
ＳＨＧＨＦＱＥＭＱＦＳＩＷＳＦＴＶＬＱＩＳＡＰＧ
ＳＨＬＶＰＥＴＥＲＡＥＧＰＧＶＦＶＥＨＤＩ［配列番号８］；
（vii）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＮｅｗ０６遺伝子配列：
ＭＹＦＴＧＲＫＶＤＥＰＳＥＬＧＳＧＬＥＬＳＹＦＨ
ＴＧＧＳＳＱＡＶＧＬＦＩＥＮＭＩＳＴＳＨＧＨＦＱＥ
ＭＱＦＳＩＷＳＦＴＶＬＱＩＳＡＰＧＳＨＬＶＰＥＴＥ
ＲＡＥＧＰＧＶＦＶＥＨＤＩ［配列番号９］；
（viii）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＮｅｗ０６遺伝子配列：
ＭＩＳＴＳＨＧＨＦＱＥＭＱＦＳＩＷＳＦＴＶＬＱＩＳ
ＡＰＧＳＨＬＶＰＥＴＥＲＡＥＧＰＧＶＦＶＥＨＤＩ［配列番号１０］；
（IX）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＮｅｗ０６遺伝子配列：
ＭＱＦＳＩＷＳＦＴＶＬＱＩＳＡＰＧＳＨ
ＬＶＰＥＴＥＲＡＥＧＰＧＶＦＶＥＨＤＩ［配列番号１１］；
（ｘ）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＮｅｗ０８遺伝子配列：
ＭＷＷＧＬＩＬＳＡＳＶＫＦＬＱＲＫＥＩＬＣ［配列番号１２］；
（xi）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＬＢ２Ａ遺伝子配列：
ＭＶＧＡＤＬＣＫＧＧＷＨＣＶ［配列番号１３］；
（xii）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＤＫ１遺伝子配列：
ＭＲＥＰＶＫＮＬＱＧＬＶＳ［配列番号１４］；
（xiii）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＴＡ３９遺伝子配列：
ＭＥＶＹＥＬＲＶＴＬＭＥＴＧＲＥＲＳＨＦＶＫＴＳＬ［配列番号１５］；および
（xiv）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＴＡ３９遺伝子配列：
ＭＥＴＧＲＥＲＳＨＦＶＫＴＳＬ［配列番号１６］。
【００１４】
別のより好適な実施態様において、新規イントロン配列とその対応するペプチドは、ヒトの遺伝物質から誘導される。既知の配列、例えば腫瘍細胞で公知のヒトＪβ２．３遺伝子の結合セグメントのイントロン配列（Kimoto, 1998）は、請求された新規配列から明確に排除される。
【００１５】
本発明の実施態様において、ｃＤＮＡ分子は、ペプチドＭＧＬＳＡＶＧＲＴＲＡＥＳＧＴＡＥＲＡＡＰＶＦＶＬＧＬＱＡＶ［配列番号１７］をコードするヒトイントロンＪβ２．３遺伝子配列からなるフレーム内メチオニンコドンを含む５’イントロンＪ配列を含む。
本発明の別の実施態様において、ｃＤＮＡ分子は、ヒトＴＣＲα遺伝子によりコードされる。この場合、結合（Ｊ）遺伝子配列は、特に限定されないが、Ｊα２、Ｊα３、Ｊα６、Ｊα８、Ｊα９、Ｊα１１、Ｊα１３、Ｊα１４、Ｊα２４、Ｊα２５、Ｊα３１、Ｊα３６、Ｊα４０、Ｊα４１、およびＪα４４から選択される。
【００１６】
本発明のさらに別の実施態様において、ｃＤＮＡ分子は、以下よりなる群から選択されるフレーム内メチオニンコドンを含む５’イントロンＪ配列を含む：
１）フレーム内ＭをコードするイントロンＪα２遺伝子配列（このアミノ酸は、単離されたアミノ酸残基としては現れず、上記のより大きなＴＣＲ分子の一部（Ｊ領域とＣ領域）であり、本発明の新規転写体で転写されるイントロン配列によりコードされる、単一のフレーム内メチオニンを意味することは、当業者により理解されるであろう）
２）以下のペプチドをコードするイントロンＪα３遺伝子配列：
ＭＬＬＷＤＰＳＧＦＱＱＩＳＩＫＫＶＩＳＫＴＬＰＴ［配列番号１８］；
３）以下のペプチドをコードするイントロンＪα６遺伝子配列：
ＭＬＰＮＴＭＧＱＬＶＥＧＧＨＭＫＱＶＬＳＫＡＶＬＴＶ［配列番号１９］；
４）以下のペプチドをコードするイントロンＪα６遺伝子配列：
ＭＧＱＬＶＥＧＧＨＭＫＱＶＬＳＫＡＶＬＴＶ［配列番号２０］；
５）以下のペプチドをコードするイントロンＪα６遺伝子配列：
ＭＫＱＶＬＳＫＡＶＬＴＶ［配列番号２１］；
６）以下のペプチドをコードするイントロンＪα８遺伝子配列：
ＭＳＥＣ［配列番号２２］；
７）以下のペプチドをコードするイントロンＪα９遺伝子配列：
ＭＡＨＦＶＡＶＱＩＴＶ［配列番号２３］；
８）以下のペプチドをコードするイントロンＪα１１遺伝子配列：
ＭＧＩＣＹＳ［配列番号２４］；
９）以下のペプチドをコードするイントロンＪα１３遺伝子配列：
ＭＫＲＡＧＥＧＫＳＦＣＫＧＲＨＹＳＶ［配列番号２５］；
１０）以下のペプチドをコードするイントロンＪα１４遺伝子配列：
ＭＬＴＴＬＩＹＹＱＧＮＳＶＩＦＶＲＱＨＳＡ［配列番号２６］；
１１）以下のペプチドをコードするイントロンＪα２４遺伝子配列：
ＭＱＬＰＨＦＶＡＲＬＦＰＨＥＱＦＶＦＩＱＱＬＳＳＬＧＫＰＦＣＲＧＶＣＨＳＶ［配列番号２７］；
１２）以下のペプチドをコードするイントロンＪα２５遺伝子配列：
Ｍ（上記１のコメントを参照）；
１３）以下のペプチドをコードするイントロンＪα３１遺伝子配列：
ＭＧＦＳＫＧＲＫＣＣＧ［配列番号２８］；
１４）以下のペプチドをコードするイントロンＪα３６遺伝子配列：
ＭＫＫＩＷＬＳＲＫＶＦＬＹＷＡＥＴＬ［配列番号２９］；
１５）以下のペプチドをコードするイントロンＪα４０遺伝子配列：
ＭＧＫＶＨＶＭＰＬＬＦＭＥＳＫＡＡＳＩＮＧＮＩＭＬＶＹＶＥＴＨＮＴＶ［配列番号３０］；
１６）以下のペプチドをコードするイントロンＪα４０遺伝子配列：
ＭＰＬＬＦＭＥＳＫＡＡＳＩＮＧＮＩＭＬＶＹＶＥＴＨＮＴＶ［配列番号３１］；
１７）以下のペプチドをコードするイントロンＪα４０遺伝子配列：
ＭＥＳＫＡＡＳＩＮＧＮＩＭＬＶＹＶＥＴＨＮＴＶ［配列番号３２］；
１８）以下のペプチドをコードするイントロンＪα４０遺伝子配列：
ＭＬＶＹＶＥＴＨＮＴＶ［配列番号３３］；
１９）以下のペプチドをコードするイントロンＪα４１遺伝子配列：
ＭＥＥＧＳＦＩＹＴＩＫＧＰＷＭＴＨＳＬＣＤＣＣＶＩＧＦＱＴＬＡＬＩ
ＧＩＩＧＥＧＴＷＷＬＬＱＧＶＦＣＬＧＲＴＨＣ［配列番号３４］；
２０）以下のペプチドをコードするイントロンＪα４１遺伝子配列：
ＭＴＨＳＬＣＤＣＣＶＩＧＦＱＴＬＡＬＩＧＩＩＧＥＧＴＷＷＬＬＱＧＶ
ＦＣＬＧＲＴＨＣ［配列番号３５］；
２１）以下のペプチドをコードするイントロンＪα４４遺伝子配列：
ＭＥＳＱＡＴＧＦＣＹＥＡＳＨＳＶ［配列番号３６］。
【００１７】
別の態様において本発明は、上記の本発明のｃＤＮＡ分子のいずれかのアンチセンスＤＮＡ分子に関する。
本発明はさらに、本発明のｃＤＮＡとアンチセンス分子を含む発現ベクター、該ベクターを含む宿主細胞、特に哺乳動物細胞、に関する。好適な実施態様において、宿主細胞は、トランスフェクトされた間葉ヒト細胞である。
本発明のｃＤＮＡは、間葉細胞増殖を誘導するために、間葉ヒト細胞をトランスフェクトするのに使用することができる。本発明は、間葉細胞増殖の誘導が必要な疾患（例えば、創傷治癒）で使用するためのトランスフェクトされた間葉ヒト細胞を含む組成物に関する。
【００１８】
本発明はさらに、間葉細胞増殖を誘導する方法であって、必要な被験体に、本発明のｃＤＮＡ分子を含むトランスフェクトされた間葉ヒト細胞を、間葉細胞増殖を誘導するのに有効な量で投与する工程を含む方法に関する。この方法は、好ましくは創傷治癒の増強に適用される。
本発明のアンチセンスＤＮＡ分子は、間葉細胞増殖を阻害または抑制するために、間葉ヒト細胞をトランスフェクトするのに使用することができる。すなわち本発明は、間葉細胞増殖の阻害または抑制を必要とする疾患（例えば、癌）で使用するためのトランスフェクトされた間葉ヒト細胞を含む組成物に関する。
本発明はさらに、間葉細胞増殖を抑制する方法であって、必要な被験体に、本発明のアンチセンスＤＮＡ分子、および／または本発明のアンチセンスＤＮＡ分子を含む自己のトランスフェクトされた間葉ヒト細胞を、間葉細胞増殖を抑制（例えば、癌の抑制）するのに有効な量で投与する工程を含む方法に関する。
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドに関する。ある実施態様において該ポリペプチドは、間葉細胞中で、細胞表面または細胞内で、発現されることができるタンパク質である。ある実施態様においてポリヌクレオチドは、図１に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ポリペプチドは、図１に記載のアミノ酸配列を含む。
【００１９】
本発明はさらに、ＴＣＲのイントロンＪ配列から推定される合成ペプチドに関する。
非ヒト動物から誘導されるそのようなペプチドの例には、特に限定されないが、以下がある：
（ａ）ＭＥＮＶＳＮＰＧＳＣＩＥＥＧＥＥＲＧＲＩＬＧＳＰＦＬ［配列番号１］；
（ｂ）ＭＧＥＹＬＡＥＰＲＧＦＶＣＧＶＥＰＬＣ［配列番号２］
（ｃ）ＭＡＷＨ［配列番号３］；
（ｄ）ＭＥＡＧＷＥＶＱＨＷＶＳＤＭＥＣＬＴＶ［配列番号４］；
（ｅ）ＭＥＣＬＴＶ［配列番号５］；
（ｆ）ＭＴＶ［配列番号６］；
（ｇ）ＭＣＧＳＥＥＶＦＶＶＥＳＡ［配列番号７］；
（ｈ）ＭＡＣＹＱＭＹＦＴＧＲＫＶＤＥＰＳＥＬＧＳＧＬ
ＥＬＳＹＦＨＴＧＧＳＳＱＡＶＧＬＦＩＥＮＭＩＳＴ
ＳＨＧＨＦＱＥＭＱＦＳＩＷＳＦＴＶＬＱＩＳＡＰＧ
ＳＨＬＶＰＥＴＥＲＡＥＧＰＧＶＦＶＥＨＤＩ［配列番号８］；
（ｉ）ＭＹＦＴＧＲＫＶＤＥＰＳＥＬＧＳＧＬＥＬＳＹＦＨ
ＴＧＧＳＳＱＡＶＧＬＦＩＥＮＭＩＳＴＳＨＧＨＦＱＥ
ＭＱＦＳＩＷＳＦＴＶＬＱＩＳＡＰＧＳＨＬＶＰＥＴＥ
ＲＡＥＧＰＧＶＦＶＥＨＤＩ［配列番号９］；
（ｊ）ＭＩＳＴＳＨＧＨＦＱＥＭＱＦＳＩＷＳＦＴＶＬＱＩＳ
ＡＰＧＳＨＬＶＰＥＴＥＲＡＥＧＰＧＶＦＶＥＨＤＩ［配列番号１０］；
（ｋ）ＭＱＦＳＩＷＳＦＴＶＬＱＩＳＡＰＧＳＨ
ＬＶＰＥＴＥＲＡＥＧＰＧＶＦＶＥＨＤＩ［配列番号１１］；
（ｌ）ＭＷＷＧＬＩＬＳＡＳＶＫＦＬＱＲＫＥＩＬＣ［配列番号１２］；
（ｍ）ＭＶＧＡＤＬＣＫＧＧＷＨＣＶ［配列番号１３］；
（ｎ）ＭＲＥＰＶＫＮＬＱＧＬＶＳ［配列番号１４］；
（ｏ）ＭＥＶＹＥＬＲＶＴＬＭＥＴＧＲＥＲＳＨＦＶＫＴＳＬ［配列番号１５］；および
（ｐ）ＭＥＴＧＲＥＲＳＨＦＶＫＴＳＬ［配列番号１６］。
ヒト起源から誘導される本発明の有用なペプチドの例には、特に限定されないが、以下がある：
ｉ）ＭＧＬＳＡＶＧＲＴＲＡＥＳＧＴＡＥＲＡＡＰＶＦＶＬＧＬＱＡＶ［配列番号１７］
ii）ＭＬＬＷＤＰＳＧＦＱＱＩＳＩＫＫＶＩＳＫＴＬＰＴ［配列番号１８］；
iii）ＭＬＰＮＴＭＧＱＬＶＥＧＧＨＭＫＱＶＬＳＫＡＶＬＴＶ［配列番号１９］；
iv）ＭＧＱＬＶＥＧＧＨＭＫＱＶＬＳＫＡＶＬＴＶ［配列番号２０］；
ｖ）ＭＫＱＶＬＳＫＡＶＬＴＶ［配列番号２１］；
vi）ＭＳＥＣ［配列番号２２］；
vii）ＭＡＨＦＶＡＶＱＩＴＶ［配列番号２３］；
viii）ＭＧＩＣＹＳ［配列番号２４］；
ix）ＭＫＲＡＧＥＧＫＳＦＣＫＧＲＨＹＳＶ［配列番号２５］；
ｘ）ＭＬＴＴＬＩＹＹＱＧＮＳＶＩＦＶＲＱＨＳＡ［配列番号２６］；
xi）ＭＱＬＰＨＦＶＡＲＬＦＰＨＥＱＦＶＦＩＱＱＬＳＳＬＧＫＰＦＣＲＧＶＣＨＳＶ［配列番号２７］；
xii）ＭＧＦＳＫＧＲＫＣＣＧ［配列番号２８］；
xiii）ＭＫＫＩＷＬＳＲＫＶＦＬＹＷＡＥＴＬ［配列番号２９］；
xiv）ＭＧＫＶＨＶＭＰＬＬＦＭＥＳＫＡＡＳＩＮＧＮＩＭＬＶＹＶＥＴＨＮＴＶ［配列番号３０］；
xv）ＭＰＬＬＦＭＥＳＫＡＡＳＩＮＧＮＩＭＬＶＹＶＥＴＨＮＴＶ［配列番号３１］；
xvi）ＭＥＳＫＡＡＳＩＮＧＮＩＭＬＶＹＶＥＴＨＮＴＶ［配列番号３２］；
xvii）ＭＬＶＹＶＥＴＨＮＴＶ［配列番号３３］；
xviii）ＭＥＥＧＳＦＩＹＴＩＫＧＰＷＭＴＨＳＬＣＤＣＣＶＩＧＦＱＴＬＡＬＩＧＩＩＧＥＧＴＷＷＬＬＱＧＶＦＣＬＧＲＴＨＣ［配列番号３４］；
xix）ＭＴＨＳＬＣＤＣＣＶＩＧＦＱＴＬＡＬＩＧＩＩＧＥＧＴＷＷＬＬＱＧＶＦＣＬＧＲＴＨＣ［配列番号３５］；および
xx）ＭＥＳＱＡＴＧＦＣＹＥＡＳＨＳＶ［配列番号３６］。
【００２０】
さらなる態様において本発明は、ＴＣＲ遺伝子のイントロン配列によりコードされる配列を有する合成ペプチドに結合する抗体に関する。ある好適な実施態様において、抗体は、配列ＬＡＥＰＲＧＦＶＣＧＶＥ［配列番号３７］を有する合成ペプチドに結合する。これらの抗体は、例えば癌の診断目的および予後のための、間葉細胞のマーカーとして有用である。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
Ｉ．末端切断型Ｔ細胞受容体ｍＲＮＡとタンパク質発現
本発明は、新しいｍＲＮＡ転写体、これらの転写体にコードされる、詳細に説明されるαとβＴＣＲの短い変種であるタンパク質、およびこれらの分子の使用に関する。
間質細胞株と胸腺Ｔ細胞との相互作用を調べている時、我々は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用してＴＣＲ遺伝子断片を増幅した。予想外にも、マウス骨髄から誘導されるＭＢＡ−１３間葉性間質細胞株は、一貫してＴＣＲβ定常（Ｃβ）領域を発現し、一方、陰性対照組織（すなわち、肝臓）およびいくつかの対照細胞株（例えば、プレＢ細胞、形質細胞腫細胞、肥満細胞腫細胞）は、ＴＣＲ遺伝子からのプライマーを使用してＰＣＲ産物を産生しないことを見いだした。
【００２２】
本発明に従って、種々の間質細胞株でさらに試験すると、定常（Ｃ）ドメイン（これは、Ｔ細胞受容体のものと同一である）、結合（Ｊ）領域（これは、いくつかの代替物の１つである）、および５’ドメイン（これは、メチオニンのフレーム内コドンを含むイントロンＪ配列（再度いくつかの代替物の１つ）に比較したヌクレオチド配列からなる）からなるＴＣＲの末端切断型をコードする、ＴＣＲ遺伝子由来ｍＲＮＡの存在が証明された。このｍＲＮＡは、Ｖ領域配列が欠如している。そのような分子の１つ（すなわち、ＴＣＲβ２．６の新しい変種）は、間葉細胞中に存在し、細胞表面間葉性タンパク質をコードすることが証明されている。ｍＲＮＡレベルの発現もまた、胸腺で観察されている。Ｈ５７−５９７抗体によるこの間質細胞表面ＴＣＲ様抗原の同定は、野生型マウスからのＭＥＦでさらに証明されたが、ＴＣＲβ-/-変異体マウスからのＭＥＦ（これは、Ｊint−Ｊβ２．６−Ｃ ｍＲＮＡを発現しなかった）では観察されず、間葉細胞中のこのＴＣＲタンパク質の存在の遺伝的支持を与えている。
我々はさらに、これらの新規末端切断型ＴＣＲ変種が、間葉細胞増殖に機能的に関与していることを開示する。
【００２３】
II．アンチセンス配列
以下に例示されるように、間葉性ＴＣＲの発現または発現の欠如は、間葉細胞増殖を調節するようである。従って本発明はさらに、間質／間葉細胞増殖を調節することを目的とする細胞および組織中の発現のために、間葉性ＴＣＲ ｍＲＮＡから誘導される本発明のｃＤＮＡとアンチセンス分子の使用に関する。
この目的のために、ｃＤＮＡまたはアンチセンス分子は、例えば、特に限定されないが、臨床治験で遺伝子治療（Bordingnonら、1995）で使用されているようなレトロウイルスベクターＤＣＡｌおよびＤＣＭｍのような適切なベクター中に挿入される。好ましくは、適切なプロモーター（例えば、ｃＤＮＡ自体のプロモーター）の制御下にある、ｃＤＮＡまたはアンチセンス分子を含有するベクターは、適当な哺乳動物、好ましくはヒト、最も好ましくは患者の自己間葉細胞を、感染またはトランスフェクトするのに使用されるであろう。次に、遺伝子修飾された間葉細胞は、適切な経路で必要な患者に投与され、所望の部位または組織で発現されるであろう。
【００２４】
好ましくない遺伝子の発現を操作するためには、細胞中でアンチセンスＲＮＡを産生することが必要である。このために、本発明に従って、好ましくない遺伝子の完全なまたは部分的なｃＤＮＡが、プロモーターを含む発現ベクター中に挿入される。こうして、ｃＤＮＡの３’末端は、プロモーターの３’末端に隣接して挿入され、ｃＤＮＡの５’末端は、該ｃＤＮＡによりプロモーターの３’末端からは分離される。従って、細胞中でｃＤＮＡが発現されると、タンパク質をコードすることができないアンチセンスＲＮＡが産生される。細胞中のアンチセンスＲＮＡの存在は、好ましくない遺伝子の細胞（ゲノム）コピーの発現を低下させる。
【００２５】
アンチセンスＲＮＡの産生のために、完全なｃＤＮＡを使用してもよい。あるいは、その断片を使用してもよく、これは、好ましくは約９〜１，０００ヌクレオチドの長さ、さらに好ましくは１５〜５００ヌクレオチド、および最も好ましくは３０〜１５０ヌクレオチドの長さである。
断片は、好ましくはｃＤＮＡの５’半分内の領域、さらに好ましくは５’非翻訳領域および／または第１のエキソン領域、および最も好ましくはＡＴＧ翻訳開始部位を含む、５’領域に対応する。あるいは、断片は、５’非翻訳領域のＤＮＡ配列にのみ対応してもよい。
【００２６】
合成オリゴヌクレオチドを、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用してもよい。このオリゴヌクレオチドは、好ましくはＤＮＡオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは９〜１５０ヌクレオチド、さらに好ましくは１２〜６０、および最も好ましくは１５〜５０ヌクレオチドである。そのコードするｍＲＮＡからの、本発明のタンパク質の産生を阻害する適当なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知の「遺伝子歩行」法に類似の一連の重複オリゴヌクレオチドの使用により、ルーチンの実験を用いて容易に測定することができる。アンチセンス開発の当該分野で公知のそのような「歩行」法は、９０〜１５０ヌクレオチドの長さのオーダーで、セグメント中のｍＲＮＡに相補的な配列の全長を歩行するための、合成オリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。この「遺伝子歩行」法は、標的ｍＲＮＡ上のアクセス可能な領域に相補的であり阻害アンチセンス活性を示す、オリゴヌクレオチドを同定するであろう。
【００２７】
あるいは、好ましくない遺伝子に結合できるタンパク質またはこれにコードされるタンパク質のコード配列に基づくオリゴヌクレオチドを、Ｏｌｉｇｏ４．０（ナショナルバイオサイエンス（National Bioscience, Inc.））を使用して設計することができる。アンチセンス分子はまた、コード配列の５’末端のほぼ−１０〜＋１０ヌクレオチドにまたがる領域で結合するアンチセンスを調製することにより、ポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳を阻害するように設計してもよい。
【００２８】
所望の性質を増強するオリゴヌクレオチドの修飾は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する時に、一般的に使用される。例えば、主にホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、細胞の酵素による分解を受けにくいため、ＤＮＡ中に天然に存在するホスホエステル結合の代わりにホスホロチオエート結合が使用される。好ましくは、オリゴヌクレオチドの６０％で２’−メトキシリボヌクレオチド修飾が使用される。そのような修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドで観察される効果に匹敵するアンチセンス効果を誘発することができる。
【００２９】
従って、本発明の好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、混合ホスホジエステル−ホスホロチオエート骨格を有する。好ましくは、約３０％〜８０％、さらに好ましくは約６０％のオリゴヌクレオチド中で、２’−メトキシリボヌクレオチド修飾が使用される。
本発明の実施において、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスＲＮＡを使用してもよい。アンチセンスＲＮＡの長さは、好ましくは約９〜約３，０００ヌクレオチド、さらに好ましくは約２０〜約１，０００ヌクレオチド、最も好ましくは約５０〜約５００ヌクレオチドである。
【００３０】
有効であるためには、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞膜を移動できなければならない。一般にアンチセンスオリゴヌクレオチドは、おそらく特異的受容体を介する取り込みにより、細胞膜を通過する能力を有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドが１本鎖分子であるため、これらはある程度疎水性であり、膜を介する受動的拡散を増強する。アンチセンスオリゴヌクレオチドに修飾を導入して、膜を通過する能力を改良してもよい。例えば、オリゴヌクレオチド分子を、部分的に不飽和の脂肪族炭化水素鎖および１つ以上の極性もしくは荷電基（例えば、カルボン酸基、エステル基、およびアルコール基）を含む基に結合してもよい。あるいは、オリゴヌクレオチドは、好ましくは膜向性のペプチドであるペプチド構造に結合してもよい。そのような修飾オリゴヌクレオチドは、より容易に膜を貫通し、これはその機能にとって決定的に重要であり、従って、その活性を実質的に増強させる。
【００３１】
III．タンパク質、ペプチドおよびＤＮＡの細胞への導入
本発明は、末端切断型ＴＣＲ遺伝子によりコードされるタンパク質、そこから誘導されるペプチド、およびＴＣＲ転写体に基づくアンチセンスＤＮＡ分子を提供する。これらの手段の治療的または研究関連の使用は、これらを、生きた生物の細胞または培養細胞中に導入することを必要とする。このために、ペプチド、タンパク質、およびアンチセンス分子の膜透過性を改良することが好ましい。膜透過性が向上したペプチドやタンパク質を作成するのに、同じ原理（すなわち、親油性構造体による誘導体化）も使用される。例えば、既知の膜向性ペプチドの配列を、ペプチドまたはタンパク質の配列に付加してもよい。さらにペプチドまたはタンパク質は、少なくとも１つの極性基または荷電基で置換した、上記の炭化水素鎖のような部分的に親油性の構造体で、誘導体化してもよい。例えば、ペプチドのラウロイル誘導体が、当該分野で記載されている。ペプチドおよびタンパク質のさらなる修飾には、スルホキシド基および誘導体を作成するためのメチオニン残基の酸化があり、ここで比較的疎水性のペプチド結合は、ケトメチレンイソエステル（ＣＯＣＨ2）により置換される。これらおよび他の修飾が膜透過性を向上させることは、タンパク質およびペプチド化学の当業者には公知である。
【００３２】
膜透過性を向上させる別の方法は、細胞表面上の受容体（例えば、ウイルス受容体）を使用して、ペプチドまたはタンパク質の細胞取り込みを誘導することである。この機構は、ウイルスによりしばしば利用され、これはいくつかの細胞表面分子に特異的に結合する。結合すると、細胞はウイルスをその内部に取り込む。細胞表面分子は、ウイルス受容体と呼ばれる。例えば、インテグリン分子ＣＡＲとＡｄＶは、アデノウイルスのウイルス受容体として記載されている。ＣＤ４、ＧＰＲ１、ＧＰＲ１５、およびＳＴＲＬ３３分子は、ＨＩＶの受容体／共受容体として同定されている。
【００３３】
細胞表面受容体に結合することが知られている分子にペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドを結合させることにより、該ペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドの膜透過性が向上する。結合体を形成するための適当な基の例には、糖、ビタミン、ホルモン、サイトカイン、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質などの分子がある。Lowら、米国特許第５，１０８，９２１号は、ペプチド、タンパク質およびオリゴヌクレオチドの膜透過性、および該結合体の調製を向上させるためのこれらの分子の使用を記載する。
【００３４】
Lowと共同研究者は、葉酸やビオチンのような分子の受容体の豊富で非特異的な発現のために、生物中の多数の細胞に結合体を標的化するのに、これらの分子が使用されることをさらに教示している。
本発明のペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドの膜透過性を向上させるための細胞表面タンパク質の上記使用はまた、本発明のペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドを、いくつかの型の細胞または組織に標的化するのに使用される。例えば、神経細胞を標的化したいなら、これらの細胞の表面により豊富に発現される細胞表面タンパク質を使用することが好ましい。
【００３５】
従って上記結合法を使用して、本発明のタンパク質、ペプチド、またはオリゴヌクレオチドを、間葉細胞に標的化してもよい。例えば、自己もしくは同種骨髄移植または創傷治癒を増強するために間葉細胞増殖を増強することが好ましいなら、ＴＣＲ変種遺伝子を、遺伝子治療の形で、間葉細胞中に挿入してもよい。この実施態様において、ｃＤＮＡ分子を含有する細胞の局所的移植を使用して、間葉細胞増殖を誘導し、こうして創傷治癒過程を増強することができる。
【００３６】
これに対して、腫瘍の場合のように、間葉細胞増殖を阻害したいなら、腫瘍間葉の退縮と以後の腫瘍の退縮を達成するために、腫瘍の間葉細胞をアンチセンスｃＤＮＡでトランスフェクトすることができ、次に局在化固形腫瘍の治療に使用することができる。
本発明のｍＲＮＡによりコードされるタンパク質は、間葉細胞の細胞表面受容体であり、おそらく隣接する造血または非造血細胞により提示されるリガンドと相互作用するであろう。すなわち、結合型または可溶性型で、そこから誘導されるこれらのタンパク質またはペプチドは、該リガンドを有する細胞への調節作用を有してもよい。
【００３７】
IV．抗体
本発明はまた、上記の本発明の一部である末端切断型ＴＣＲ転写体によりコードされるタンパク質に特異的な抗体を包含する。本発明のタンパク質とペプチドは、間葉細胞のマーカーとして使用される抗体産生のための免疫原として使用される。そのような抗体は、そのような天然に存在するタンパク質の存在を同定するための診断目的に使用される。そのような抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でも、またはそのようなタンパク質に特異的なモノクローナル抗体の抗原結合部分を取り込む他の分子でもよい。そのような他の分子は、１本鎖抗体、ヒト化抗体、Ｆ(ab)もしくはＦ(ab')2断片、キメラ抗体、標識物（蛍光または放射活性標識物、または、毒性分子が抗体の抗原結合部分に結合した免疫毒素）が結合した抗体でもよい。この例は、非限定性である。しかし、そのような分子が抗体の抗原結合部分を含む限り、これはタンパク質に結合すると予測され、従って、モノクローナル抗体が使用されるものと同じ診断目的に使用することができる。
【００３８】
Ｖ．医薬組成物
これらの組成物は、注射、局所投与、または経口摂取により使用される。注射による本発明の医薬組成物の好適な使用は、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射である。あまり便利でない投与経路には、腹腔内、硬膜内、クモ膜下投与または必要であれば動脈内投与がある。
本発明の医薬組成物は、一般に緩衝物質（その浸透圧を調整する物質）、および場合により１つ以上の担体、賦形剤および／または当該分野で公知の添加物を、例えば、医薬組成物に香り、色、潤滑性などを付加するために、含む。
担体は当該分野で公知であり、デンプンとその誘導体、セルロースとその誘導体（例えば、微結晶セルロース、キサンタンガムなど）がある。滑沢剤は、水素化ヒマシ油などを含んでよい。
【００３９】
好適な緩衝物質は、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）であり、この溶液もまた、浸透圧について調整される。
好適な医薬組成物は、担体が欠如したものである。そのような製剤は、注射（静脈内注射を含む）により投与するのに使用することが好ましい。
医薬組成物の調製は、当該分野で公知であり、多くの文献や教科書に記載されている。
【００４０】
細胞膜を通過するアンチセンスオリゴヌクレオチドの取り込みを増強するために、添加物が選択される。そのような物質は一般に、２本鎖ＤＮＡ分子の細胞取り込みを増強する物質である。例えば、この目的のために、トランスフェクション試薬ＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim））、リポフェクチン、リポフェクタム、およびトランスフェクタム（これらは市販されている）を含むいくつかの脂質分子が開発されている。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた、リポソーム内に封入することができる。
リポソーム（例えば、上記のトランスフェクション試薬の使用）の調製と使用は当該分野で公知である。リポソームを得るための他の方法には、センダイウイルスおよび他のウイルスがある。
上記の陽イオン性または非イオン性脂質物質は、オリゴヌクレオチドの細胞内への取り込みを増強するのに機能し、しかし細胞により取り込まれたオリゴヌクレオチドの安定性も改良する。
本発明を一般的に記載したが、これは、以下の例を参照することにより、さらに容易に理解され、これは例示のためのみであり、本発明を限定するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
（実施例）
ヒト細胞培養物
２９３Ｔ細胞株を、１０％胎児牛血清（ＦＣＳ）、２０mM Ｌ−グルタミン、６０μg/mlペニシリン、１００μg/mlストレプトマイシン、および５０mg/lカナマイシンを補足したダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ベスヘメック（Beth Haemek）、イスラエル）中で増殖させた。羊水細胞を、ＡＭＦ培地（バイオロジカルインダストリーズ（Biological industries）、ベイトヘメック（Beit Haemek）、イスラエル）中で増殖させた。
【００４２】
ＧＦＰ−ＴＣＲ Ｊ２．３−Ｃβ発現ベクター
ヒトＴＣＲ Ｊ２．３−ＣβのｃＤＮＡを、センスプライマー５’ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＧＧＣＴＣＴＣＡＧＣＧＧＴＧＧとアンチセンスプライマー５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＡＴＣＣＴＴＴＣＴＣを使用して、羊水細胞と臍帯血単核細胞のｃＤＮＡから増幅し、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化しウシ小腸アルカリホスファターゼ処理したｐＥＧＦＰＣ１（クロンテク（Clontech）、パロアルト（Palo Alto）、カリホルニア州）に結合させた。ＧＦＰ−ＴＣＲ Ｊ２．３−ＣβのＤＮＡ配列解析は、目的の読みとり枠を確認した。Ｎ末端からＣ末端に進むと、得られる融合タンパク質は、ＧＦＰ、１０アミノ酸のリンカー配列、およびＴＣＲ Ｊ２．３−Ｃβからなる。
【００４３】
トランスフェクション
２９３Ｔ細胞を、７０％のコンフルエンスで６ウェルプレートに蒔き、リン酸カルシウムトランスフェクション法を使用して、１．６μgのＧＦＰ−ＴＣＲ Ｊ２．３−Ｃβでトランスフェクトした。
【００４４】
ウェスタンブロット解析と蛍光分析
免疫ブロッティング分析のために、トランスフェクションの２４時間後、５×１０5２９３Ｔ細胞を、１％トリトン、１４０mM ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１mM ＥＧＴＡ、１．５mM ＭｇＣｌ2、および１mMバナジウム酸ナトリウムを含有するトリス（ｐＨ８）２０mM中で、氷上で溶解させた。細胞溶解物を、１５，０００ｇで１０分、４℃で遠心分離して清澄化し、ＳＤＳ試料緩衝液（５％グリセロール、２％ ＳＤＳ、６２．５mMトリス塩酸（ｐＨ６．８）、２％ ２−メルカプトエタノール、０．０１％ブロモフェノールブルー）を添加した後沸騰させた。
抽出物を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ブロットし、抗ＧＦＰモノクローナル抗体ＪＬ−８（クロンテク（Clontech）、パロアルト（Palo Alto）、カリホルニア州）とプローブ結合させ、第２抗体ヤギ抗マウスＨＲＰ（シグマ（Sigma））を使用して視覚化した。ＥＣＬ試薬とインキュベートして化学発光シグナルを発生させ、ゲルをＸ線フィルムに露光させた。
【００４５】
細胞株と培養物
本明細書の実施例に記載のいくつかの細胞株は、本発明者らの実験室のものか、または他の供給源から得られた：間葉性ＭＢＡ−１３、ＭＢＡ−１５、１４Ｆ１．１、ＮＩＨ／３Ｔ３、ＡＣ−６、ＡＣ−１１およびＦＢＭＤ−１細胞；対照Ｃ２Ｃ１２、１Ｃ８、ＭＰＣ−１１およびＡＢ−８細胞；およびＭＣ／９肥満細胞腫細胞。
細胞株を、標準的方法で、例えば１０％ ＦＣＳ含有ＤＭＥＭまたは７％ ＦＣＳ、２mM Ｌ−グルタミン、５×１０-5Ｍ ２−メルカプトエタノールおよび１mMピルビン酸ナトリウム含有ＲＰＭＩ１６４０（ギブコ（Gibco））中で培養した。他の細胞株は、１０％ ＦＣＳ含有ＤＭＥＭおよびＩＬ−３とＩＬ−４含有Ｄ−９培地中、または２０％ ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中で培養した。
【００４６】
初代細胞培養物
（ｉ）骨髄。１〜２週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨と脛骨から、マウス骨髄を得た。２７ゲージ針の付いた１mlシリンジを使用して、骨髄腔を介して培地をフラッシュすることにより、骨髄細胞を無菌的に取り出した。１×１０7細胞／mlを２０％ＦＣＳ（バイオラブ（Bio Lab）、イスラエル）含有ＤＭＥＭに接種し、３７℃で５％ＣＯ2雰囲気中で４〜５日間培養した。プレートを洗浄し、新鮮な培地で覆った。３週間後、単層が形成された。細胞を、０．０２％ＥＤＴＡ含有０．５％トリプシン（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）を使用して１：１０の分割比で、毎月継代した。
（ii）胎児繊維芽細胞：マウス胚をＰＢＳ溶液中で小片に切断し、０．５％トリプシンと０．０２％ＥＤＴＡで３７℃で１５分処理した。上清を採取し、再度トリプシンで３０分処理した。得られた細胞懸濁物を、数回洗浄し、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中に最終濃度１０6細胞／mlで再懸濁し、３７℃で５％ＣＯ2雰囲気中で４〜５日間培養した。繊維芽細胞単層が形成された時、これを５分間トリプシン処理し、細胞を洗浄し、前記したように再懸濁した。この細胞懸濁液（２×１０5細胞／ml）を、再度４〜５日間培養し、次に採取した。
（iii）胸腺と肝臓細胞を、６〜１０週齢のＢａｌｂ／ｃマウスから得た。
【００４７】
増殖測定法
間質細胞を、９６丸底ウェルプレート（ファルコン（Falcon）、カリホルニア州）に１×１０5細胞／mlで、３７℃で１０％ＣＯ2雰囲気で４８時間培養した。サブコンフルエントな培養物に、関連する抗体を補足し、さらに４８時間インキュベートした。次に細胞に、１μCi／ウェルの［3Ｈ］チミジン（ヌクレアリサーチセンター（Nuclear Research Center）、Negev、イスラエル）をパルスした。２４時間後、細胞を採取し、トリチウム化チミジンの取り込みを調べた。簡単に説明すると、上清を吸引し、細胞単層を繰り返し洗浄して、過剰のチミジンを除去し、０．１Ｎ ＮａＯＨ ０．２ml／ウェルで抽出した。０．１ml容量の細胞抽出物を、３mlのシンチレーション液／バイアル（クイックセーフ（Quicksafe）、A. Zinsser、ドイツ）に加え、液体シンチレーションアナライザー（１６００ＴＲ、パッカード（Packard）、コネチカット州）で計測した。ＤＮＡ合成を反映する［3Ｈ］チミジン取り込みを刺激指数として表し、実験試料の平均cpm と対照試料の平均cpm の比として計算した。未処理細胞または無関係の抗体で処理した細胞を、対照とした。
【００４８】
抗体
以下のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を実験で使用した：フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−ｍＡｂ抗ＣＤ３ε（クローン１４５−２Ｃ１１）；低アジド、エンドトキシン無しまたはＦＩＴＣ結合ハムスター抗マウスＴＣＲγδ（クローンＧＬ−３）。すべての抗体は、ファーミンゲン（PharMingen）（サンジエゴ、カリホルニア州）から購入した。ヤギ抗ヒトＩｇＭ（カレスタブ（Kalestab）、デンマーク）、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウス（シグマ（Sigma）、イスラエル）およびマウス抗ラットＩｇＧ（ジャクソンイムノリサーチラボズ（Jackson Immunoresearch Labs）、West Grove、ペンシルバニア州）を、対照抗体とした。抗ＴＣＲβ（クローンＨ５７−５９７）と抗ＣＤ３ε（クローン１４５−２Ｃ１１）のハイブリドーマ上清を、活性測定法に使用した。ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ハムスターＩｇＧを、ジャクソンイムノリサーチラボズ（Jackson Immunoresearch Labs）から購入した。抗ウサギＦＩＴＣ Ｆａｂ断片を第２抗体として使用して、ウサギポリクローナル抗ペプチド１１２１および抗Ｊβ２．６［配列番号３７］ペプチド抗体による染色を検出した。
【００４９】
フローサイトメトリー
細胞を、Ｃａ+2とＭｇ+2を含まない０．０２％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣ結合抗マウス抗ＣＤ３ε（クローン１４５−２Ｃ１１）またはＦＩＴＣ結合ＴＣＲβ（クローンＨ５７−５９７）または抗Ｊβ２．６［配列番号３７］ペプチド抗体と、４℃で３０分間インキュベートした。抗Ｊβ２．６［配列番号３７］ペプチド抗体の第２抗体として、ＦＩＴＣ結合ロバ抗ウサギＩｇＧを使用した（ジャクソンイムノリサーチラボズ（Jackson Immunoresearch Labs））。細胞内染色のために、細胞を固定し、ＴＣＲβによりCytopermキット（セロテック（Serotec）、英国）を使用して染色した。すべての実験で、イソタイプ一致対照免疫グロブリンで染色した細胞を、表面染色および細胞内染色の陰性対照として調製した。ＰＢＳで洗浄後、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson））を用いて対数強度スケールで、細胞の蛍光を分析した。多くの場合に、５×１０3細胞を、ＬｙｓｉｓIIソフトウェア（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson））を使用してスコアを付けた。
【００５０】
免疫蛍光
間質細胞を、１０5細胞／mlでチャンバースライド（ラボテック（Labtec）スライド；ヌンク（Nunc）、アメリカ合衆国）に接種し、１０％ＣＯ2の加湿雰囲気中で３７℃で２４時間インキュベートした。スライドをＰＢＳ（Ｃａ+2とＭｇ+2を含まない）で洗浄し、固定しなかったかまたはＰＢＳ中３．７％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、固定溶液中の０．５％トリトンＸ−１００で２分間透過性にした。細胞をＰＢＳで５分間洗浄し、正常ヒツジ血清で４５分間ブロックし、次に、関連抗体で３０分間染色した。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、蛍光第２抗体で３０分間染色し、洗浄し、ＰＢＳ中５０％グリセロールで包埋し、カバーガラスのせ、密封した。ツァイス（Zeiss）蛍光顕微鏡（ツァイス（Zeiss）、Oberkochen、ドイツ）を使用して観察した。
【００５１】
ＲＮＡ単離とノーザンブロッティング
総ＲＮＡをTri-Reagent（モレキュラーリサーチセンター（Molecular Research Center）、シンシナチ、オハイオ州）で抽出した。ノーザンブロッティングのために、オリゴｄＴ磁性カラム（プロメガ（Promega）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して、ポリＡ＋ｍＲＮＡを得た。５〜３０μgのｍＲＮＡをノーザンブロットし、標準的方法を使用して以下の領域についてプローブと結合させた：ＴＣＲ Ｃβ、ＴＣＲ ＣαおよびＣＤ３ε。プローブをランダムプライミング（Prime-a-Gene、プロメガ（Promega）、マジソン、ウィスコンシン州）により［32Ｐ］−ｄＣＴＰで標識し、４２℃で５０％脱イオン化ホルムアミド、２×デンハルツ溶液、０．１％ＳＤＳ、５×ＳＳＣＥ、１００mg/ml沸騰サケ精子ＤＮＡでプレハイブリダイズさせた。同じ条件で１×１０6cpm/ml標識プローブでハイブリダイゼーションを行った。フィルターを、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４２℃で３０分間洗浄し、次に０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５５℃で３０分間洗浄した。
【００５２】
ＰＣＲ分析
精製した総ＲＮＡをＭＭＬＶ逆転写酵素の存在下で６０分間インキュベートして、ｃＤＮＡに逆転写した。ＣＤ３ε用に使用したプライマー対は以下の通りである：センスプライマー、５’−ＴＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＧ−３’およびアンチセンスプライマー５’−ＣＴＴＣＣＧＧＴＴＣＣＧＧＴＴＣＧＧＡ−３’。使用したＴＣＲ由来プライマー対は以下の通りである：
Ｃβ５：１’−ＡＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＴＧＴＴＴＧ−３’；
Ｃβ５：２’−ＡＡＧＧＣＴＡＣＣＣＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＣ−３’；
Ｃβ５：３’−ＣＡＴＣＣＴＡＴＣＡＴＣＡＧＧＧＧＧＴＴＣＴＧＴＣＴＧＣＡＡ−３’；
Ｃβ５：５’−ＣＡＴＣＣＴＡＴＣＡＴＣＡＧＧＧＧＧＴＴＣＴＧＴＣＴＧＣＡＡ−３’；
Ｃβ５：６’−ＴＴＣＡＧＡＧＴＣＡＡＧＧＴＧＴＣＡＡＣＧＡＧＧＡＡＧＧ−３’；
Ｃα１：５’−ＡＡＧＡＴＣＣＴＣＧＧＴＣＴＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣ−３’；
Ｃα２：５’−ＡＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＡＡＡＧＣＴＡＴＧＧＡＴＴＣＣ−３’；または
Ｔｍ：５’−ＧＡＴＴＴＡＡＣＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＣＧ−３’。
ＰＣＲのために、各サイクルについて以下の条件を使用して３０サイクルの増幅を行った：９４℃で５分変性、５８℃で２分アニーリング、および７２℃で２分伸長。
【００５３】
５’末端と３’末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）
Marathon ｃＤＮＡ増幅キット（クロンテク（Clontech）、パロアルト（Palo Alto）、カリホルニア州）を使用して、ＭＢＡ−１３細胞のＴＣＲ Ｃβ鎖のクローニングについて、５’および３’ＲＡＣＥを行った。製造業者の説明書に従ってＭＢＡ−１３ ｍＲＮＡからアダプター結合ｃＤＮＡを調製した。Hotstart-Touchdoen ＰＣＲを以下のように行った：９４℃で５分（×１サイクル）、９４℃で１分と７４℃で３分（×５サイクル）、９４℃で１分（×１０サイクル）と７０℃で３分（×１５サイクル）、９４℃で１分と６８℃で３分（×１０サイクル）。特異的プライマーを使用して、キットのアダプタープライマーと対合させた。ＲＡＣＥ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔプラスミド（プロメガ（Promega））中にクローン化し、大腸菌（E. coli）ＪＭ１０９細胞（プロメガ（Promega））中にトランスフェクトした。ＤＮＡを精製し、自動ＤＮＡシーケンサー（アプライドバイオシステムズ（Applided Biosystems）３７３Ａ、ニューイングランドヌクレア（New England Nuclear）、ボストン、マサチューセッツ州）を使用して配列決定した。
【００５４】
統計
データは、平均±平均の標準誤差として示す。スチューデントｔ検定を行って有意性を調べた。
【実施例１】
【００５５】
Ｊβ２．６ヌクレオチド配列
図１は、イントロンＪ（Ｊint−Ｊβ２．６−Ｃ）によりフランクされたＪβ２．６を示す間質／間葉細胞株からクローン化したｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
Ｊint−Ｊβ２．６−Ｃ ｍＲＮＡは、入手できる文献（Irving、1998）によると、細胞表面上で発現されることができる推定タンパク質をコードする。従って我々は、以下のようにＪβ２．６イントロンペプチド配列に基づく合成ペプチドＬＡＥＰＲＧＦＶＣＧＶＥ［配列番号３７］を用いて免疫して、ポリクローナルウサギ抗体を作成した。免疫のために、ペプチド配列番号３７をＫＬＨに結合させ、最初の免疫には完全フロイントアジュバントを使用し、追加免疫には不完全フロイントアジュバントを使用して２匹のニュージーランドウサギに注射した。免疫前に免疫前血清を採取し、追加免疫後に免疫血清を採取した。血清とペプチド配列番号３７との反応をＥＬＩＳＡにより試験した。血清をペプチド親和性カラムで精製した（０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）で溶出し、ＰＢＳに透析した）。精製した抗ペプチド配列番号３７抗体もまた、ＥＬＩＳＡにより試験した。
【実施例２】
【００５６】
ＪintＪ−Ｃβ2表面タンパク質発現とｍＲＮＡ転写のサイトメトリック分析
免疫化ペプチド配列番号３７のカラムを使用して、免疫したウサギ血清を処理した。次に、抗体を種々の型の細胞（図２に示すＭＢＡ−１３細胞、株１、２および３、マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）、および胸腺細胞）を認識する能力について試験した。ＦＡＣＳ分析から明らかなように胸腺細胞は染色されなかった（図２Ｆ）が、ＭＢＡ−１３間葉細胞の２つの株は、ポリクローナル抗体による顕著な細胞表面の染色を示した（図２Ａ、２Ｂ）。一方、ＭＢＡ−１３細胞株の１つのクローンは陰性であった（図２Ｃ）。目立ったことは、我々は、Ｊint−Ｊβ２．６−Ｃ ｍＲＮＡ（図３）の発現および抗血清の反応性と間質細胞との間に相関を見いだしたことである。すなわち、Ｊint−Ｊβ２．６−Ｃ ｍＲＮＡを発現した２つの細胞の株は、抗体とも反応したが、Ｊint−Ｊβ２．６−Ｃ ｍＲＮＡを示さなかった株の１つは、イントロンペプチド［配列番号３７］に対する抗体を使用するフローサイトメトリー分析で、何のシグナルも示さなかった（図２Ｃ、クローン３）。
【００５７】
抗血清が細胞を染色する能力を低下させた可溶性免疫ペプチドを用いる競合測定法を使用して、抗血清による抗体の検出の特異性をさらに証明した（図２Ｄ）。これは、ＭＢＡ−１３細胞の表面上にＪint−Ｊβ２．６−Ｃタンパク質が存在することを強く支持する。ｍＲＮＡレベルで胸腺細胞がＪint−Ｊβ２．６−Ｃを発現するが、抗体とは反応しないことが顕著である（図２Ｆと３）。実際、ほとんどの胸腺細胞が生産的にＴＣＲβを再配列させ、他の転写体の発現の抑制が起きるため、これは予測すべきである。一方、リコンビナーゼが欠如した間葉細胞では、ＴＣＲβ分子は形成されず、これは、Ｊint−Ｊβ２．６−Ｃタンパク質の発現を可能にする。
【００５８】
上記知見は、我々の実験室で得られた永久細胞株（ＭＢＡ−１３）を使用して得られた。我々はさらに、１次間葉細胞がまた、Ｊint−Ｊβ２．６−Ｃ ｍＲＮＡを発現するかどうかを見つけようとした。図２Ｅと図３に示すように、マウス胚からの１次繊維芽細胞は、タンパク質とｍＲＮＡレベルでこの遺伝子を明らかに発現する。
【実施例３】
【００５９】
マウスとヒト末端切断型ＴＣＲαβ配列
データベース調査は、既知の７つのＪβの中で、Ｊβ２．１もＪint−Ｊβ２．６−Ｃのような分子をコードできることを示した。実際、適切なプライマーを使用するＰＣＲ分析は、ＭＢＡ−１３細胞株中にこのｍＲＮＡを検出した。４７個の可能なＪαのうち９個は理論的に、フレーム内メチオニンコドンを有するイントロンＪの組成物を有する。これらの配列は図４に示し、以下の通りである：ＪαＴＡ３１、ＪαＴＡ４６、ＪαＮｅｗ０５、ＪαＳ５８、ＪαＮｅｗ０６、ＪαＮｅｗ０８、ＪαＬＢ２Ａ、ＪαＤＫ１およびＪαＴＡ３９。予備ＰＣＲ分析は、α鎖のこれらの変種の少なくとも一部が存在することを示す。さらに、エキソンコード領域内からのメチオニンにより開始される３つの可能なＪα分子がある（データは示していない）。
以下は、本発明のヒト配列である。この例では、読みとり枠を開始するメチオニンを太い斜体で示し、Ｊセグメントの上流のイントロン配列から翻訳されるアミノ酸を斜体で示し、Ｊセグメントはまた太字で示し、３つの点は、Ｃ１セグメントの開始を示す（図５）。
【実施例４】
【００６０】
ＭＢＡ−１３細胞株のサブクローニング
本発明において、非クローン化間質／間葉マウスＭＢＡ−１３細胞株を、ｍＲＮＡレベルと抗原タンパク質レベルで、目的の分子（すなわち、Ｊint−Ｊβ２．６−Ｃタンパク質とｍＲＮＡ）を発現するかまたはしないサブクローンに分けた。従って我々は、ＭＢＡ−１３を単一細胞クローン化し、標準的方法により８つの異なるクローン集団を得た。これらのうち４つがＪint−Ｊβ２．６−Ｃタンパク質（Ｍ−ＴＣＲ+ クローンＣ４、Ｄ１０、Ｂ１０、Ｂ１）を発現し、４つが陰性であった（Ｍ−ＴＣＲ- クローンＥ４、Ｃ６、Ｇ１、Ｂ７）。
図６は、Ｊint−Ｊβ２．６−Ｃが陽性のすべての細胞が、集団世代時間（倍加時間）が１５時間またはそれ以下であり、これは新生物細胞にとっては非常に速いと考えられる。一方、陰性クローンは種々の結果を示したが、すべてが増殖がはるかに遅く、２つのクローンは非常に遅い増殖速度で、倍加時間が３６〜３８時間であった。従って目的の遺伝子の発現が、速い増殖速度と相関し、発現の欠如が増殖の遅延をもたらすことが示唆される。これらの結果は、ＴＣＲβ定常領域に対する抗体が間葉細胞の増殖を妨害することを示す予備データにより支持される。
【実施例５】
【００６１】
ＴＣＲ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析
Ｔ細胞研究から、ＴＣＲβが機能性受容体として機能し、これが発現される細胞のアポトーシスを引き起こすことが、当該分野で知られている。しかし、ｐＴαがＴＣＲβと同時発現される時、ｐＴαはＴＣＲβの機能を強化する。我々のシステムでこれをチェックするために、我々は、間葉細胞中のｐＴαの発現を調べた。実際、ＲＴ−ＰＣＲで判定すると、ｐＴαはＭＢＡ−１３細胞株により発現される。従って、これらの間葉細胞は、ｐＴαと実験的に末端切断したＴＣＲ（Irving, 1998）を含有する報告されているＴＣＲ複合体に、構造的に関連するｐＴα／Ｊint−Ｊβ２．６−Ｃ複合体を発現するようである。後者の複合体は、細胞内シグナル伝達に充分であることが証明されており、ＭＢＡ−１３中の複合体は、シグナル伝達に有効である可能性があることを示唆している。
【００６２】
ＴＣＲの発現の研究を、本発明者らの実験室で得られるかまたは他の実験で得られる種々の間質細胞株、ならびに骨髄からの１次間質細胞およびマウス胚からの１次間葉細胞に拡大した。特定の間質細胞クローン（しかし、試験したすべてのクローンではない）が、ＴＣＲβを発現した。同様に、ＴＣＲαは、特定の間質細胞クローン中に見いだされ、例えばＭＢＡ−１３間質細胞株は、ＣβとＣαの両方を発現したが、ＭＢＡ−１５間質細胞株はＣβを発現せず、しかしＣαは陽性であった（図７Ａ〜７Ｃ）。同様のＴＣＲ増幅したＰＣＲ産物が、培養初代胚繊維芽細胞中で観察され（図７Ａ〜７Ｃ）、ＴＣＲの発現が、インビトロで継代した間質細胞株の奇異性質ではないことを示している。むしろ、ＴＣＲ遺伝子発現は、ＰＣＲ増幅により判断すると、１次間葉およびこれを起源とするインビトロ継代細胞に共通であった。実際、インビトロで接種し継代して混入造血細胞を除去した骨髄間葉細胞はまた、ＰＣＲ分析で予測されるサイズのＴＣＲαβ断片を示した。ＴＣＲ遺伝子発現は、Ｂ細胞、肥満細胞、および肝細胞中で見いだされなかった（図７Ａ〜７Ｂ）。
【実施例６】
【００６３】
ＴＣＲＣβ、ＴＣＲＣα、およびＣＤ３εのｍＲＮＡ発現
図８Ａ〜８Ｂに示すように、ＴＣＲαβ ｍＲＮＡが、ＭＢＡ−１３間質細胞株と１次胎児および骨髄繊維芽細胞培養物中にも検出された。ＴＣＲα転写体のサイズは、胸腺Ｔ細胞中のものに対応したが、胸腺中で検出された１．０kbと１．３kbと比較して、ＴＣＲβプローブにより検出されたｍＲＮＡのサイズは、約１．１kbであった。この短いｍＲＮＡ変種が、種々の間質細胞株中ならびに１次間葉細胞中で一貫して見つかったことは重要である。１．０kbのｍＲＮＡ種は、骨髄由来の未成熟前駆体Ｔ細胞中で報告されている。間葉性１．１kb ｍＲＮＡ種と初期骨髄胸腺細胞中に存在するものとの関係は、まだ不明である。
従って上記データは、間葉性起源の細胞がｍＲＮＡレベルでＴＣＲ受容体複合体を発現することを示す。ＴＣＲαβ ｍＲＮＡの発現以外に、ＣＤ３ε（これは、機能的ＴＣＲ複合体の必須成分である）の発現が観察された（図８Ｄ）。ＰＣＲ増幅産物とノーザンブロッティングにより検出されるｍＲＮＡのサイズの両方は、対照Ｔ細胞由来ｃＤＮＡ中で検出されるサイズとわずかに異なっていた。
【実施例７】
【００６４】
ＭＢＡ−１３細胞によるＣＤ３ε、ＴＣＲαβおよびＴＣＲγδ抗原発現のサイトメトリック分析
ＴＣＲαβ定常領域に対する抗体を使用する間質細胞のフローサイトメトリー分析は、ＭＢＡ−１３細胞集団の３４％が、低強度蛍光で染色されたことを示した（図９）。これらの間質細胞は、ＴＣＲγδに対する抗体とプローブ結合させると陰性であった。ＴＣＲαβ ｍＲＮＡを示さなかった細胞株では、ＴＣＲαβが観察されなかったことは重要である。これらのデータは、Ｊβ２．６のイントロン配列に対する抗体を使用する上記結果を支持する。
【実施例８】
【００６５】
抗ＴＣＲβ抗体と反応性の間葉細胞表面抗原のサイトメトリック分析
さらに、間葉細胞中で転写されたＴＣＲβからのＰＣＲ産物の配列決定データは、ＴＣＲβがＴ細胞中に存在するような完全なＣ領域を含有することを確認した。間葉細胞がＴＣＲタンパク質を発現するかどうかを試験するために、我々は、Ｃ領域を同定するＨ５７−５９７モノクローナル抗体を使用した。この抗体を使用するＭＥＦのフローサイトメトリー分析は、野生型マウスからのＭＥＦ細胞が明らかに陽性であり、細胞表面でこの抗原を発現することを示した（図１０）。これに対して、ＴＣＲβ ｍＲＮＡを発現しないＴＣＲβ-/-突然変異マウスからのＭＥＦでは同様の抗原は観察されず、間葉細胞中のこのＴＣＲタンパク質の存在に対する遺伝的支持を提供している。
【実施例９】
【００６６】
ヒトＴＣＲ ＧＦＰ−ＴＣＲ Ｊβ２．３−Ｃβ
ヒトの系からのさらなる支持は、臍帯血単核細胞および羊水細胞のｃＤＮＡからのヒトＴＣＲ Ｊβ２．３−Ｃβ転写体のクローニングから得られる（図１１）。クローン化した転写体を配列決定すると同一であることがわかった。配列の上の線は各セグメントの境界を示す。予測されるタンパク質産物を、配列の下に示す。太字は、両方のクローンで見つかったＡからＤへの移行を示す。
【実施例１０】
【００６７】
ＧＦＰ−ＴＣＲ Ｊβ２．３−Ｃβと組換え間葉性ＴＣＲβ（ＧＦＰ−Ｊint−Ｊβ２．６−Ｃ）の発現
上記で得られた結果の拡張として、２９３Ｔトランスフェクション細胞中の融合タンパク質ＧＦＰ−ＴＣＲ Ｊβ２．３−Ｃβの発現を、ウェスタンブロット解析により調べた。各レーンに、５×１０5細胞をのせた。ＧＦＰ−ＴＣＲ Ｊβ２．３−Ｃβは、抗ＧＦＰモノクローナル抗体ＪＬ−８を用いて検出された（図１２）。
【００６８】
次に我々は、Ｊint−Ｊβ２．６−Ｃβの過剰発現の結果を調べた。Ｎ末端が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に結合したＪint−Ｊβ２．６−Ｃの融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ構築体を、ｐＴαとともに、２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした（図１３）。こうして、細胞膜に結合していると思われる繊細な点で、組換えＪint−Ｊβ２．６−Ｃβの過剰発現が起きた（図１３Ａ）。ＧＦＰ−Ｊint−Ｊβ２．６−Ｃβ単独によるトランスフェクションは、同様の点の発現パターンを産生するのに不充分であり、タンパク質の発現は少なかった（レーン１とレーン４を比較されたい、図１３Ｂ）（しかし、異なる条件下で行ったさらなる実験は、自体がトランスフェクトされる時Ｊint−Ｊβ２．６−Ｃβの過剰発現が得られことを証明した）。ＭＢＡ−１３間葉細胞株で同様の結果が得られたが、トランスフェクション効率ははるかに低かった（データは示していない）。これらの結果は、ＴＣＲβの細胞表面局在化は、プレＴ細胞中のｐＴαとの複合体形成に依存するという事実に一致する。ＧＦＰ−Ｊint−Ｊβ２．６−ＣβとｐＴαとともに同時トランスフェクトした細胞のフローサイトメトリー分析は、５９％の集団のサブＧ１への劇的なシフトを示し、大規模なアポトーシスを示している（図３Ｃ-II）。これは、細胞シグナル細胞運命中のこのタンパク質の相対的とその発現の正しいタイミングを示す。これらの実験は、ｐＴαとＪint−Ｊβ２．６−Ｃβが最小の機能性受容体複合体を形成するが、間葉性のプレＴ細胞様受容体の他の可能な成分を決定するのにさらに研究が必要である。
【実施例１１】
【００６９】
ＭＢＡ−１３サブクローンの腫瘍形成
最後に我々は、間葉細胞によるＴＣＲ発現とその生物学的機能との関連の可能性を調べた。上記したように、ＭＢＡ−１３細胞株を、限界希釈により単一クローン化し、各クローンを、ＴＣＲβ ｍＲＮＡの発現について調べた。高発現クローン（Ｄ１０、Ｂ１０、およびＣ４）もまたインビボで発癌性があることが観察された（図１４）。これらの間質細胞クローンをヌードＣＤ１受容体マウスに皮内注射すると、増殖の速いクローン（Ｄ１０、Ｂ１０、およびＣ４）でのみ数週間以内に腫瘍形成を引き起こした。マウスに注射した増殖の遅いクローン（Ｃ６とＢ７）は、腫瘍形成の頻度は低く、接種後１ヶ月であった。
【実施例１２】
【００７０】
インビボ有用性
本発明の医薬組成物は、間葉性増殖の調節が関与する疾患の治療に使用することができる。疾患の治療とは、疾患または疾患に関連する症状の予防もしくは改善、または疾患もしくは疾患に関連する症状の意義の悪化を最小にすることを意味する。治療すべき疾患および症状には、間葉性増殖を阻害することが好ましい症状であり、以下を含む：癌、特に任意の臓器（特に骨髄）への転移の場合、任意の臓器（特に骨髄）の非悪性増殖性疾患、血液疾患（例えば、貧血白血病）および任意の臓器（特に骨髄）が関与する自己免疫疾患を引き起こす骨髄欠陥。
さらに、本発明は、間葉性増殖を増強することが好ましい症状（自己または同種骨髄移植、創傷治癒、および自己または同種臓器移植を含む）の治療に使用することができる。
本発明の医薬組成物の最適な投与は、治療される障害、疾患または症状の型に依存することは理解されるであろう。すなわち、急性イベントの治療は、障害の誘導後に比較的速やかに、活性組成物の全身性投与を必要とするであろう。一方、慢性の変性疾患の減少は、持続的投与法を必要とするであろう。
【００７１】
本発明を詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく、および過度の実験をすることなく、広範な同等のパラメータ、濃度、および条件内で、本発明を行うことができることは、当業者により理解されるであろう。
本発明を具体例に関連して説明してきたが、さらなる修飾が可能であることは理解されるであろう。本出願は、一般に本発明の原理に従い、本発明の任意の変更、使用、または適用を包含するものであり、本発明が関係する分野内で公知のまたは一般的な慣習にあるような、および請求の範囲に記載の基本的な特徴に応用されるような、本開示からの逸脱を含むものである。
公知の方法の工程、従来法の工程、公知の方法または従来法への言及は、関連分野において本発明の態様、記載または実施態様が、開示、教示または示唆されていることを、決して認めるものではない。
具体例の前記記載は、本発明の一般的性質を完全に開示するものであり、従って、当該分野の技術知識（本明細書に引用された文献の内容を含む）を応用することにより、過度の実験をすることなく、本発明の一般的概念から逸脱することなく、かかる具体例の種々の応用を容易に修飾および／または改変できるであろう。従って、本明細書に記載の教示と指針に基づき、かかる応用や修飾は、開示された実施態様の相当物の意味および範囲内にあると企図される。本明細書の表現または用語は、説明のためであって決して本発明を限定するものではなく、本明細書の用語または表現は、本明細書の教示と指針を考慮して、当業者の知識と組合せて理解すべきものである。
【００７２】
文献
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【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】間質／間葉細胞株［配列番号３８］ＭＢＡ−１３のＪintＪ−Ｃβ2ｍＲＮＡ転写体のヌクレオチド配列、およびこれにコードされる推定アミノ酸配列［配列番号３９］を示す。ｃＤＮＡ産物は、ＴＣＲプライマーを使用して逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ分析により得られ、配列決定された。
【図２】２Ａ〜２Ｆは、間葉細胞によるＪintＪ−Ｃβ2発現のフローサイトメトリー分析を示す。マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）（２Ｅ）と種々のＭＢＡ−１３細胞株（１〜３；それぞれ２Ａ〜２Ｃ）を、ウサギ血清からのプレ免疫（ヒストグラムＩ）または免疫（ヒストグラムII）精製抗体で染色した。ウサギは、配列番号２の合成セグメント、すなわち配列ＬＡＥＰＲＧＦＶＣＧＶＥを有する配列番号３７で免疫した。第２抗体として、我々は、ＦＩＴＣ結合ロバ抗ウサギＩｇＧを使用した。第２抗体により染色は、ヒストグラムIIIに示すヒストグラムのみを与えた。同様に産生し精製した、配列ＲＧＧＧＧＧＲＧＧＬＨＤの無関係なペプチド１１２１に対するウサギポリクローナル抗体で染色した細胞を、陰性対照とした（ヒストグラムIV）。精製した免疫血清を、特異的免疫化ペプチド配列番号３７と室温で３０分プレインキュベートすることにより、抗体結合の競合を行った（２Ｄ、ヒストグラム）。３回行った実験のうちの１つの実験の結果を示す。
【図３】ＭＢＡ−１３間葉細胞株と胎児初代細胞培養物から得られた、ＪintＪ−Ｃβ2と呼ぶフレーム内イントロンＪ配列を含む新規ＴＣＲＣβ２ ｃＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ｃＤＮＡは、マウス胚繊維芽細胞と種々のＭＢＡ−１３細胞株（１〜３）から抽出された総ＲＮＡから得られた。ＲＴ−ＰＣＲは、以下のセンス対を使用して行った： エキソンＪβ２．６：５’−ＣＴＡＴＧＡＡＣＡＧＴＡＣＴＴＣＧＧＴＣ−３’；または イントロンＪβ２．６：５’−ＡＴＧＧＧＡＧＡＡＴＡＣＣＴＣＧＣＴＧー３’；または５−ＣＣＣＴＡＡＡＴＧＧＧＡＧＡＡＴＡＣＣ；および アンチセンスプライマーＣβ３：５’−ＣＡＴＣＣＴＡＴＣＡＴＣＡＧＧＧＧＧＴＴＣＴＧＴＣＴＧＣＡＡ−３’。それぞれ４６５bpと５２４bpの生成物が産生された。
【図４】利用可能なデータベースから集めた、フレーム内Ｍｅｔコドンを含むイントロン５’末端を含有するマウスＴＣＲαβのすべて可能な変種の配列を示す：イントロンＪβ配列Ｊβ２．１とＪβ２．６、およびイントロンＪα配列ＪαＴＡ３１、ＪαＴＡ４６、ＪαＮｅｗ０５、ＪαＳ５８、ＪαＮｅｗ０６、ＪαＮｅｗ０８、ＪαＬＢ２Ａ、ＪαＤＫ１およびＪαＴＡ３９。
【図５】利用可能なデータベースから集めた、フレーム内Ｍｅｔコドンを含むイントロン５’末端を含有するヒトＴＣＲαβのすべて可能な変種の配列を示す：イントロンＪβ配列Ｊβ２．３、およびイントロンＪα配列Ｊα２、Ｊα３、Ｊα６、Ｊα８、Ｊα９、Ｊα１１、Ｊα１３、Ｊα１４、Ｊα２４、Ｊα２５、Ｊα３１、Ｊα３６、Ｊα４０、Ｊα４１、およびＪα４４。
【図６】ＭＢＡ−１３細胞株の種々のクローンの世代時間の測定を示す。Ｍ−ＴＣＲ（ＴＣＲβ Ｊint−Ｊ2.6Ｃ ）の発現について、８つの個々のクローンをＰＣＲにより調べた。これらのうち、４つは陰性（Ｍ−ＴＣＲ-クローンＥ４、Ｃ６、Ｇ１、Ｂ７）で、４つは陽性（Ｍ−ＴＣＲ+クローンＣ４、Ｄ１０、Ｂ１０、Ｂ１）であった。細胞を異なる濃度（１０3、５×１０3および１０4/ml）で接種し、４４〜４６時間後に細胞増殖を測定した。集団世代時間を計算した。
【図７】７Ａ〜７Ｃは、種々の細胞株と初代細胞培養物中のＴＣＲ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ｃＤＮＡは、以後の材料と方法欄に記載するように、種々の型の細胞から抽出した総ＲＮＡから得られ、ＲＴ−ＰＣＲは、以下のプライマー対を使用して行った：ＴＣＲＣβ２のＣβ１とＣβ２プライマーは、４１０bpの生成物を与えた（図７Ａ）；ＴＣＲＣαのＣα１とＴｍまたはＣα１とＣα２は、それぞれ３５６bpまたは１３８bpの生成物を産生した（図７Ｂと７Ｃ）。
【図８】８Ａ〜８Ｄは、ＴＣＲＣβ（８Ａ〜８Ｂ）、ＴＣＲＣα（８Ｃ）、およびＣＤ３ε（８Ｄ）ｍＲＮＡ転写体のｍＲＮＡ発現を示す。間葉細胞（ＭＢＡ−１３、ＡＣ−６、ＮＩＨ３Ｔ３、胸腺、およびＭＥＦ）、上皮細胞（１Ｃ８）、および内皮細胞−脂肪細胞（１４Ｆ１．１）株からの、ポリＡ＋ｍＲＮＡを、以後の材料と方法欄に記載するように、ノーザンブロットし、以下のプローブとプローブ結合させた：ＴＣＲＣβ、ＴＣＲＣα、およびＣＤ３ε。ＴＣＲＣβ鎖について、胸腺ＲＮＡは、１．３kb（完全長）と１．０kb（末端切断型）転写体を示し、間葉性ＭＢＡ−１３、ＡＣ−６、およびＭＥＦ細胞は、１．１kbを示した（図８Ａと８Ｂ）。ＴＣＲＣα鎖について、胸腺ＲＮＡと非Ｔ細胞株は、１．６kbの転写体を示した（図８Ｃ）。ＣＤ３ε鎖について、胸腺ＲＮＡは１．ｌ５kb転写体を示し、非Ｔ細胞は、わずかに大きいサイズの転写体を示した（図８Ｄ）。ＴＣＲＣβのハイブリダイゼーションシグナルを、デンシトメータースキャニングにより定量すると、ＭＢＡ−１３のシグナル値は、胸腺細胞より６０倍小さかった。
【図９】ＭＢＡ−１３細胞による、ＣＤ３ε、ＴＣＲαβおよびＴＣＲγδ抗原発現のフローサイトメトリー分析を示す。ＭＢＡ−１３細胞を、ＦＩＴＣ結合ＴＣＲαβ、ＣＤ３εで、およびＰＥ結合ＴＣＲγδ（実線）で染色した。細胞内染色のために、Cytopermキットを使用して、細胞を固定し、ＦＩＴＣ結合ＴＣＲαβで染色した。すべての実験で、イソタイプ一致ＦＩＴＣ結合ラット抗マウスＩｇＧで染色した細胞を、陰性対照として調製した（点線）。一回の実験の結果を示す。
【図１０】抗ＴＣＲβ抗体に反応性の間葉細胞表面抗原の検出。ＦＩＴＣ結合ハムスター抗マウスＴＣＲβ Ｈ５７−５９７モノクローナル抗体で染色した野生型（黒の実線）またはＴＣＲ-/-変異マウス（*** 灰色の実線）からのＭＥＦのフローサイトメトリー分析。点線は、イソタイプ対照を示す。
【図１１】臍帯血単核細胞と羊水細胞のｃＤＮＡからクローン化したヒトＴＣＲ Ｊβ２．３−Ｃβ。クローン化した転写体を配列決定すると、同一であった。配列の上の線は、各セグメントの境界を示す。予測されるタンパク質産物を、配列の下に示す。太字は、両方のクローンで見つかったＡからＧへの移行を示す。
【図１２】２９３Ｔトランスフェクション細胞中のＧＦＰ−ＴＣＲ Ｊβ２．３−Ｃβの発現。ウェスタンブロット解析。各レーンに、５×１０5個の細胞の溶解物をのせ、ＧＦＰ−ＴＣＲ Ｊβ２．３−Ｃβを、抗ＧＦＰモノクローナル抗体ＪＬ−８で検出した。
【図１３】プレＴＣＲ様複合体中の組換え間葉性ＴＣＲβ（ＧＦＰ−Ｊint−Ｊβ２．６−Ｃ）は、過剰発現するとアポトーシス性細胞死を引き起こす。（Ａ）ｐＴαＨＡベクターとともに、ＧＦＰに結合したＪint−Ｊβ２．６−Ｃの融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ構築体でトランスフェクトした細胞の免疫蛍光分析。（Ｂ）ＨＡ−ｐＴαとともに、ＧＦＰ−Ｊint−Ｊβ２．６−Ｃでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞からの抽出物のウェスタンブロット解析（レーン１）。対照ＧＦＰとＨＡベクター（レーン２）、ＧＦＰベクターとＨＡ−ｐＴα（レーン３）、ＨＡベクターとＧＦＰ−Ｊint−Ｊβ２．６−Ｃ（レーン４）、および非トランスフェクション細胞（レーン５）。抗ＧＦＰモノクローナル抗体を用いて免疫ブロッティングを行った。融合タンパク質ＧＦＰ−Ｊint−Ｊβ２．６−Ｃの位置（ＧＦＰ−Ｊint）を、ＧＦＰを含まないタンパク質の位置（ＧＦＰ）として示す。（Ｃ）記載のベクターでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の細胞サイクルフローサイトメトリー分析。ＧＦＰ−Ｊint−Ｊβ２．６−ＣとｐＴαで処理したがトランスフェクトされないままであった（Ｃ−Ｉ）ＧＦＰ陰性細胞の細胞サイクル分析は、代表的対照として機能する；空のベクターまたはＧＦＰ−Ｊint−Ｊβ２．６−ＣとｐＴαでトランスフェクトした後に、同様のパターンが観察された。
【図１４】ヌードＣＤ１マウス中に１０6細胞／部位で皮内注射した後に、高（Ｄ１０、Ｂ１０、Ｃ４）または低（Ｃ６、Ｂ７）ＴＣＲβ発現ＭＢＡ−１３クローンの腫瘍形成を調べた、ＭＢＡ−１３細胞株の個々のクローンの性質。

Claims (30)

  1. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子の転写体を含む単離されたポリヌクレオチドであって、Ｖ領域配列が欠如しており、定常（Ｃ）ドメインと結合（Ｊ）領域配列と、フレーム内メチオニンコドンを含むＪ領域配列の上流に５’イントロンＪ配列とを含む上記ポリヌクレオチド。
  2. 遺伝子はＴＣＲβ遺伝子である請求項１のポリヌクレオチド。
  3. 結合（Ｊ）領域配列は、Ｊβ２．１とＪβ２．６から選択される請求項２のポリヌクレオチド。
  4. 結合（Ｊ）遺伝子配列はＪβ２．１であり、フレーム内メチオニンコドンを含む該５’イントロンＪ配列は、配列ＭＥＮＶＳＮＰＧＳＣＩＥＥＧＥＥＲＧＲＩＬＧＳＰＦＬ［配列番号１］のペプチドをコードする請求項３のポリヌクレオチド。
  5. 結合（Ｊ）遺伝子配列はＪβ２．６であり、フレーム内メチオニンコドンを含む該５’イントロンＪ配列は、配列ＭＧＥＹＬＡＥＰＲＧＦＶＣＧＶＥＰＬＣ［配列番号２］のペプチドをコードする請求項３のポリヌクレオチド。
  6. 配列番号１〜３７のいずれか一つから選択されるペプチドをコードする５’イントロンＪ配列を含む請求項１のポリヌクレオチド。
  7. 結合（Ｊ）遺伝子配列は、ペプチドＭＧＬＳＡＶＧＲＴＲＡＥＳＧＴＡＥＲＡＡＰＶＦＶＬＧＬＱＡＶ［配列番号１７］をコードするイントロンＪβ２．３遺伝子配列である請求項２のポリヌクレオチド。
  8. 遺伝子はＴＣＲα遺伝子である請求項１のポリヌクレオチド。
  9. 結合（Ｊ）遺伝子配列は、ヒトまたはマウスＪα遺伝子から選択される請求項８のｃＤＮＡ分子。
  10. フレーム内メチオニンコドンを含む５’イントロンＪ配列は、以下よりなる群から選択される請求項９のｃＤＮＡ分子：
    （ｉ）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＴＡ３１遺伝子配列：
    ＭＡＷＨ［配列番号３］；
    （ii）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＴＡ４６遺伝子配列：
    ＭＥＡＧＷＥＶＱＨＷＶＳＤＭＥＣＬＴＶ［配列番号４］；
    （iii）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＴＡ４６遺伝子配列：
    ＭＥＣＬＴＶ［配列番号５］；
    （iv）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＮｅｗ０５遺伝子配列：
    ＭＴＶ［配列番号６］；
    （ｖ）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＳ５８遺伝子配列：
    ＭＣＧＳＥＥＶＦＶＶＥＳＡ［配列番号７］；
    （vi）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＮｅｗ０６遺伝子配列：
    ＭＡＣＹＱＭＹＦＴＧＲＫＶＤＥＰＳＥＬＧＳＧＬ
    ＥＬＳＹＦＨＴＧＧＳＳＱＡＶＧＬＦＩＥＮＭＩＳＴ
    ＳＨＧＨＦＱＥＭＱＦＳＩＷＳＦＴＶＬＱＩＳＡＰＧ
    ＳＨＬＶＰＥＴＥＲＡＥＧＰＧＶＦＶＥＨＤＩ［配列番号８］；
    （vii）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＮｅｗ０６遺伝子配列：
    ＭＹＦＴＧＲＫＶＤＥＰＳＥＬＧＳＧＬＥＬＳＹＦＨ
    ＴＧＧＳＳＱＡＶＧＬＦＩＥＮＭＩＳＴＳＨＧＨＦＱＥ
    ＭＱＦＳＩＷＳＦＴＶＬＱＩＳＡＰＧＳＨＬＶＰＥＴＥ
    ＲＡＥＧＰＧＶＦＶＥＨＤＩ［配列番号９］；
    （viii）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＮｅｗ０６遺伝子配列：
    ＭＩＳＴＳＨＧＨＦＱＥＭＱＦＳＩＷＳＦＴＶＬＱＩＳ
    ＡＰＧＳＨＬＶＰＥＴＥＲＡＥＧＰＧＶＦＶＥＨＤＩ［配列番号１０］；
    （ix）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＮｅｗ０６遺伝子配列：
    ＭＱＦＳＩＷＳＦＴＶＬＱＩＳＡＰＧＳＨ
    ＬＶＰＥＴＥＲＡＥＧＰＧＶＦＶＥＨＤＩ［配列番号１１］；
    （ｘ）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＮｅｗ０８遺伝子配列：
    ＭＷＷＧＬＩＬＳＡＳＶＫＦＬＱＲＫＥＩＬＣ［配列番号１２］；
    （xi）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＬＢ２Ａ遺伝子配列：
    ＭＶＧＡＤＬＣＫＧＧＷＨＣＶ［配列番号１３］；
    （xii）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＤＫ１遺伝子配列：
    ＭＲＥＰＶＫＮＬＱＧＬＶＳ［配列番号１４］；
    （xiii）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＴＡ３９遺伝子配列：
    ＭＥＶＹＥＬＲＶＴＬＭＥＴＧＲＥＲＳＨＦＶＫＴＳＬ［配列番号１５］；および
    （xiv）以下のペプチドをコードするイントロンＪαＴＡ３９遺伝子配列：
    ＭＥＴＧＲＥＲＳＨＦＶＫＴＳＬ［配列番号１６］。
  11. フレーム内メチオニンコドンを含む５’イントロンＪ配列は、以下よりなる群から選択される請求項８のｃＤＮＡ分子：
    （ｉ）以下のペプチドをコードするイントロンＪα３遺伝子配列：
    ＭＬＬＷＤＰＳＧＦＱＱＩＳＩＫＫＶＩＳＫＴＬＰＴ［配列番号１８］；
    （ii）以下のペプチドをコードするイントロンＪα６遺伝子配列：
    ＭＬＰＮＴＭＧＱＬＶＥＧＧＨＭＫＱＶＬＳＫＡＶＬＴＶ［配列番号１９］；
    （iii）以下のペプチドをコードするイントロンＪα６遺伝子配列：
    ＭＧＱＬＶＥＧＧＨＭＫＱＶＬＳＫＡＶＬＴＶ［配列番号２０］；
    （iv）以下のペプチドをコードするイントロンＪα６遺伝子配列：
    ＭＫＱＶＬＳＫＡＶＬＴＶ［配列番号２１］；
    （ｖ）以下のペプチドをコードするイントロンＪα８遺伝子配列：
    ＭＳＥＣ［配列番号２２］；
    （vi）以下のペプチドをコードするイントロンＪα９遺伝子配列：
    ＭＡＨＦＶＡＶＱＩＴＶ［配列番号２３］；
    （vii）以下のペプチドをコードするイントロンＪα１１遺伝子配列：
    ＭＧＩＣＹＳ［配列番号２４］；
    （viii）以下のペプチドをコードするイントロンＪα１３遺伝子配列：
    ＭＫＲＡＧＥＧＫＳＦＣＫＧＲＨＹＳＶ［配列番号２５］；
    （ix）以下のペプチドをコードするイントロンＪα１４遺伝子配列：
    ＭＬＴＴＬＩＹＹＱＧＮＳＶＩＦＶＲＱＨＳＡ［配列番号２６］；
    （ｘ）以下のペプチドをコードするイントロンＪα２４遺伝子配列：
    ＭＱＬＰＨＦＶＡＲＬＦＰＨＥＱＦＶＦＩＱＱＬＳＳＬＧＫＰＦＣＲＧＶＣＨＳＶ［配列番号２７］；
    （xi）以下のペプチドをコードするイントロンＪα３１遺伝子配列：
    ＭＧＦＳＫＧＲＫＣＣＧ［配列番号２８］；
    （xii）以下のペプチドをコードするイントロンＪα３６遺伝子配列：
    ＭＫＫＩＷＬＳＲＫＶＦＬＹＷＡＥＴＬ［配列番号２９］；
    （xiii）以下のペプチドをコードするイントロンＪα４０遺伝子配列：
    ＭＧＫＶＨＶＭＰＬＬＦＭＥＳＫＡＡＳＩＮＧＮＩＭＬＶＹＶＥＴＨＮＴＶ［配列番号３０］；
    （xiv）以下のペプチドをコードするイントロンＪα４０遺伝子配列：
    ＭＰＬＬＦＭＥＳＫＡＡＳＩＮＧＮＩＭＬＶＹＶＥＴＨＮＴＶ［配列番号３１］；
    （xv）以下のペプチドをコードするイントロンＪα４０遺伝子配列：
    ＭＥＳＫＡＡＳＩＮＧＮＩＭＬＶＹＶＥＴＨＮＴＶ［配列番号３２］；
    （xvi）以下のペプチドをコードするイントロンＪα４０遺伝子配列：
    ＭＬＶＹＶＥＴＨＮＴＶ［配列番号３３］；
    （xvii）以下のペプチドをコードするイントロンＪα４１遺伝子配列：
    ＭＥＥＧＳＦＩＹＴＩＫＧＰＷＭＴＨＳＬＣＤＣＣＶＩＧＦＱＴＬＡＬＩ
    ＧＩＩＧＥＧＴＷＷＬＬＱＧＶＦＣＬＧＲＴＨＣ［配列番号３４］；
    （xviii）以下のペプチドをコードするイントロンＪα４１遺伝子配列：
    ＭＴＨＳＬＣＤＣＣＶＩＧＦＱＴＬＡＬＩＧＩＩＧＥＧＴＷＷＬＬＱＧＶ
    ＦＣＬＧＲＴＨＣ［配列番号３５］；
    （xix）以下のペプチドをコードするイントロンＪα４４遺伝子配列：
    ＭＥＳＱＡＴＧＦＣＹＥＡＳＨＳＶ［配列番号３６］。
  12. 配列番号１〜１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチド。
  13. 配列番号１〜１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  14. 宿主は哺乳動物細胞である、請求項１３のベクターを含む宿主細胞。
  15. 請求項１４のトランスフェクトされた間葉ヒト細胞。
  16. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
  17. 配列番号３８を含むポリヌクレオチド。
  18. 配列番号３９を含むポリペプチド。
  19. ＴＣＲのイントロンＪ配列から推定される合成ペプチド。
  20. 配列番号１〜１６のいずれか一つよりなる群から選択される請求項１９の合成ペプチド。
  21. 配列番号１７〜３６のいずれか一つよりなる群から選択される請求項１９の合成ペプチド。
  22. 請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のペプチドに対して作成した抗体。
  23. 請求項２０のペプチドに対して作成した請求項２２の抗体。
  24. 請求項２１のペプチドに対して作成した請求項２２の抗体。
  25. 間葉細胞のマーカーとしての請求項２２〜２４の抗体の使用。
  26. 間葉細胞のトランスフェクションのための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの使用。
  27. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むトランスフェクトされた間葉ヒト細胞を、必要な被験体に、間葉細胞増殖を誘導するのに有効な量で投与する工程を含む、間葉細胞増殖を誘導する方法。
  28. 創傷治癒のための請求項２７の方法。
  29. 請求項１２のＤＮＡ分子を含むトランスフェクトされた間葉ヒト細胞を、必要な被験体に、間葉細胞増殖を抑制するのに有効な量で投与する工程を含む、間葉細胞増殖を抑制する方法。
  30. 癌の抑制のための請求項２９の方法。
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