FR2775294A1 - Methode de selection de tumeurs sensibles a un traitement anticancereux et ses applications - Google Patents
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Abstract
Méthode de sélection de tumeurs solides sensibles à un traitement anticancéreux, qui inhibe ou prévient l'activité HLA-G desdites tumeurs solides et ses applications.Ladite méthode permet d'établir soit le profil de transcription HLA-G d'une tumeur solide, soit le profil d'expression HLA-G d'une tumeur solide.La méthode d'établissement du profil de transcription HLA-G comprend : (i) le prélèvement d'un échantillon tumoral; (ii) l'extraction de l'ARNm; (iii) la transcription inverse (RT) dudit ARN; (iv) les amplifications successives ou concomitantes des ADNc obtenus en (iii), en présence d'amorces spécifiques de chaque isoforme d'HLA-G et l'analyse des produits d'amplification obtenus, par électrophorèse et/ ou hybridation spécifique et (v) l'établissement du profil de transcription HLA-G dudit échantillon.La méthode d'établissement du profil d'expression HLA-G comprend : (i) le prélèvement d'un échantillon tumoral, (ii) éventuellement le marquage des cellules dudit échantillon, (iii) la lyse des cellules, (iv) la mise en contact des cellules lysées avec différents anticorps dirigés contre les antigènes HLA de classe I, pour former, éventuellement des complexes isoforme d'HLA-G/ anticorps et (v) l'établissement du profil d'expression HLA-G dudit échantillon, par détection des complexes formés à l'étape (iv).
Description
La présente invention est relative à une méthode de sélection de tumeurs solides sensibles à un traitement anticancéreux, qui inhibe ou prévient l'activité HLA-G desdites tumeurs solides et ses applications.
Les antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH), se divisent en plusieurs classes, les antigènes de classe I (HLA-A, HLA-B et HLA-C) qui présentent 3 domaines globulaires (otl, a2 et (x3), et dont le domaine Cl3 est associé à la 2 microglobuline, les antigènes de classe II (HLA-DP, HLA-DQ et HLA-DR) et les antigènes de classe III (complément).
Les antigènes de classe I comprennent, outre les antigènes précités, d'autres antigènes, dits antigènes de classe I non classiques, et notamment les antigènes HLA-E, HLA-F et HLA-G; ce dernier, en particulier, est exprimé par les trophoblastes extravilleux du placenta humain normal.
La séquence du gène HLA-G (gène HLA-6.0) a été décrite par
GERAGHTY et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84 9145-9149): il comprend 4396 paires de bases et présente une organisation intron/exon homologue à celle des gènes HLA-A, -B et -C. De manière plus précise, ce gène comprend 8 exons, 7 introns et une extrémité non traduite 3'; les 8 exons correspondent respectivement à: exon 1 séquence signal, exon 2 : domaine extracellulaire al, exon 3 : domaine extracellulaire a2, exon 4 : domaine extracellulaire cc3, exon 5 : région transmembranaire, exon 6: domaine cytoplasmique I, exon 7 : domaine cytoplasmique II (non traduit), exon 8: domaine cytoplasmique ffl (non traduit) et région 3' non traduite (GERAGHTY et al., précité; ELLIS et al., J. Immunol., 1990, 144, 731-735; KIRSZENBAUM M. et al.,
Oncogeny of hematopoiesis. Aplastic anemia Eds. E. Gluckman, L. Coulombel, Colloque INSERM/John Libbey Eurotext Ltd). Toutefois le gène HLA-G diffère des autres gènes de classe I, en ce que le codon de terminaison de traduction, en phase, est localisé au niveau du deuxième codon de l'exon 6; en conséquence, la région cytoplasmique de la protéine codée par ce gène HLA-6.0 est considérablement plus courte que celle des régions cytoplasmiques des protéines HLA-A, -B et -C.
GERAGHTY et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84 9145-9149): il comprend 4396 paires de bases et présente une organisation intron/exon homologue à celle des gènes HLA-A, -B et -C. De manière plus précise, ce gène comprend 8 exons, 7 introns et une extrémité non traduite 3'; les 8 exons correspondent respectivement à: exon 1 séquence signal, exon 2 : domaine extracellulaire al, exon 3 : domaine extracellulaire a2, exon 4 : domaine extracellulaire cc3, exon 5 : région transmembranaire, exon 6: domaine cytoplasmique I, exon 7 : domaine cytoplasmique II (non traduit), exon 8: domaine cytoplasmique ffl (non traduit) et région 3' non traduite (GERAGHTY et al., précité; ELLIS et al., J. Immunol., 1990, 144, 731-735; KIRSZENBAUM M. et al.,
Oncogeny of hematopoiesis. Aplastic anemia Eds. E. Gluckman, L. Coulombel, Colloque INSERM/John Libbey Eurotext Ltd). Toutefois le gène HLA-G diffère des autres gènes de classe I, en ce que le codon de terminaison de traduction, en phase, est localisé au niveau du deuxième codon de l'exon 6; en conséquence, la région cytoplasmique de la protéine codée par ce gène HLA-6.0 est considérablement plus courte que celle des régions cytoplasmiques des protéines HLA-A, -B et -C.
Ces antigènes HLA-G sont essentiellement exprimés par les cellules cytotrophoblastiques du placenta et sont considérés comme jouant un rôle dans la protection du foetus (absence de rejet par la mère). En outre, dans la mesure où l'anti gène HLA-G est monomorphique, il peut également être impliqué dans la croissance ou la fonction des cellules placentaires (KOVATS et al., Science, 1990, 248, 220223).
D'autres recherches concernant cet antigène non classique de classe I (ISHITANI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89 3947-3951) ont montré que le transcrit primaire du gène HLA-G peut être épissé de plusieurs manières et produit au moins 3 ARNm matures distincts : le transcrit primaire d'HLA-G fournit une copie complète (G1) de 1 200 pb, un fragment de 900 pb (G2) et un fragment de 600 pb (G3).
Le transcrit G1 ne comprend pas l'exon 7 et correspond à la séquence décrite par ELLIS et al. (précité), c'est-à-dire qu'il code une protéine qui comprend une séquence leader, trois domaines externes, une région transmembranaire et une séquence cytoplasmique. L'ARNm G2 ne comprend pas l'exon 3, c'est-à-dire qu'il code une protéine dans laquelle les domaines ctl et a3 sont directement joints ; I'ARNm G3 ne contient ni 1'exon 3, ni l'exon 4, c'est-à-dire qu'il code une protéine dans laquelle le domaine al et la séquence transmembranaire sont directement joints.
L'épissage qui prévaut pour l'obtention de l'antigène HLA-G2 entraîne la jonction d'une adénine (A) (provenant du domaine codant ocl) avec une séquence AC (issue du domaine codant a3), ce qui entraîne la création d'un codon
AAC (asparagine) à la place du codon GAC (acide aspartique), rencontré au début de la séquence codant le domaine a3 dans HLA-G1.
AAC (asparagine) à la place du codon GAC (acide aspartique), rencontré au début de la séquence codant le domaine a3 dans HLA-G1.
L'épissage généré pour l'obtention de HLA-G3 n'entraîne pas la formation d'un nouveau codon dans la zone d'épissage.
Les Auteurs de cet article ont également analysé les différentes protéines exprimées : les 3 ARNm sont traduits en protéine dans la lignée cellulaire .221-G.
Les Auteurs de cet article concluent à un rôle fondamental de l'HLA-G dans la protection du foetus vis-à-vis d'une réponse immune maternelle (induction d'une tolérance immune). Toutefois, il est précisé que le rôle de la protéine
G3, qui ne contient pas le domaine a3 n'est pas établi.
G3, qui ne contient pas le domaine a3 n'est pas établi.
Certains des Inventeurs ont montré l'existence d'autres formes épissées d'ARNm d'HLA-G: le transcrit HLA-G4, qui n'inclut pas l'exon 4; le transcrit HLA-G5, qui inclut l'intron 4, entre les exons 4 et 5, provoquant ainsi une modification du cadre de lecture, lors de la traduction de ce transcrit et en particulier l'apparition d'un codon stop, après l'acide aminé 21 de l'intron 4 ; et le transcrit HLA
G6, possédant l'intron 4, mais ayant perdu l'exon 3 (KIRSZENBAUM M. et al., Proc.
G6, possédant l'intron 4, mais ayant perdu l'exon 3 (KIRSZENBAUM M. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 4209-4213; Demande Européenne EP 0 677 582;
KIRSZENBAUM M. et al., Human Immunol., 1995, 43, 237-241; MOREAU P. et al.,
Human Immunol. 1995, 43, 231-236); ils ont également montré que ces différents transcrits sont exprimés dans plusieurs types de cellules humaines foetales et adultes, notamment dans les lymphocytes (KIRSZENBAUM M. et al., Human Immunol., 1995, précité ; MOREAU P. et al., Human Immunol. 1995, précité).
KIRSZENBAUM M. et al., Human Immunol., 1995, 43, 237-241; MOREAU P. et al.,
Human Immunol. 1995, 43, 231-236); ils ont également montré que ces différents transcrits sont exprimés dans plusieurs types de cellules humaines foetales et adultes, notamment dans les lymphocytes (KIRSZENBAUM M. et al., Human Immunol., 1995, précité ; MOREAU P. et al., Human Immunol. 1995, précité).
I1 existe donc au moins 5 ARNm HLA-G différents qui codent potentiellement 5 isoformes d'HLA-G.
Bien que le foetus puisse être considéré comme une semiallogreffe, les cellules foetales survivent et ne sont pas rejetées par la mère ; il est apparu que les molécules HLA-G, exprimées à la surface des trophoblastes protègent les cellules foetales de la lyse par les cellules natural killer (NK) maternelles (CAROSELLA E.D. et al., C.R. Acad. Sci., 318, 827-830; CAROSELLA E.D. et al; Immunol. Today, 1996, 407-409).
Des études antérieures ont montré que l'expression des molécules
HLA-G à la surface de cellules cibles permet de protéger lesdites cellules cibles de l'activité lytique des cellules NK de la couche déciduale de l'endomètre maternel (CHUMBLEY G. et al., Cell Immunol., 1994, 155, 312-322; DENIZ G. et al., J.
HLA-G à la surface de cellules cibles permet de protéger lesdites cellules cibles de l'activité lytique des cellules NK de la couche déciduale de l'endomètre maternel (CHUMBLEY G. et al., Cell Immunol., 1994, 155, 312-322; DENIZ G. et al., J.
Immunol., 1994, 152, 4255-4261; ROUAS-FREISS N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, 94, 5249-5254). n est à noter que ces cellules cibles sont obtenues par transfection avec des vecteurs comprenant l'ADN génomique de HLA-G, générant potentiellement tous les transcrits alternatifs.
Les cellules NK expriment des récepteurs des molécules du CMFI de classe I (killer inhibitory receptors ou KIR ou NKIR pour récepteurs inhibiteurs NK), qui sont responsables de l'inhibition de la cytotoxicité, lorsque ces molécules HLA, agissant comme ligands, sont reconnues par ces récepteurs ; par exemple,
N. ROUAS-FREISS et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, 94, 5249-5254) ont montré que l'expression de HLA-G protégeait de la lyse, les cellules cibles K562 (lignée cellulaire érythroleucémique humaine), transfectées par le gène HLA-G. Ces cellules sont habituellement sensibles aux cellules NK. Certains des Inventeurs ont montré que les cellules NK n'expriment aucun transcrit HLA-G, ce résultat confirmant que les produits d'expression du gène HLA-G jouent vraisemblablement un rôle dans l'immuno-tolérance (TEYSSIER M. et al., Nat. Immunol., 1995, 14, 262-270).
N. ROUAS-FREISS et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, 94, 5249-5254) ont montré que l'expression de HLA-G protégeait de la lyse, les cellules cibles K562 (lignée cellulaire érythroleucémique humaine), transfectées par le gène HLA-G. Ces cellules sont habituellement sensibles aux cellules NK. Certains des Inventeurs ont montré que les cellules NK n'expriment aucun transcrit HLA-G, ce résultat confirmant que les produits d'expression du gène HLA-G jouent vraisemblablement un rôle dans l'immuno-tolérance (TEYSSIER M. et al., Nat. Immunol., 1995, 14, 262-270).
Compte tenu du rôle important que peut jouer la molécule HLA-G aussi bien dans les pathologies où les cellules NK sont particulièrement actives (maladies autoimmunes, transplantations) ou sont au contraire inhibées (présence anormale de molécules HLA-G, notamment sur certaines tumeurs ou dans les infections virales), les Inventeurs, poursuivant leurs travaux ont plus particulièrement étudiés les cellules tumorales. ns ont trouvé, de manière surprenante, qu'au moins certaines tumeurs solides expriment l'antigène HLA-G et ont montré que cet antigène
HLA-G joue un rôle fonctionnel dans la protection des cellules tumorales (tumeurs solides) de la destruction par les cellules NK. ns ont en outre montré la présence effective de certaines des isoformes d'HLA-G à la surface desdites cellules tumorales.
HLA-G joue un rôle fonctionnel dans la protection des cellules tumorales (tumeurs solides) de la destruction par les cellules NK. ns ont en outre montré la présence effective de certaines des isoformes d'HLA-G à la surface desdites cellules tumorales.
Toutefois, également de manière surprenante, selon les lignées tumorales, le profil HLA-G (transcrits et protéines) sera différent.
Par exemple, dans certaines lignées de mélanome, on peut observer la présence des isoformes HLA-G2/G4 et G3, qui protègent ces lignées de la lyse cellulaire induite par les cellules NK, comme le fait l'isoforme HLA-GI, dans d'autres lignées.
En conséquence, les Inventeurs se sont donné pour but de pourvoir à des outils de sélection des tumeurs solides sensibles à un traitement qui inhibe les antigènes HLA-G.
La présente invention a pour objet une méthode d'établissement du profil de transcription HLA-G d'une tumeur solide, caractérisée en ce qu'elle comprend:
(i) le prélèvement d'un échantillon tumoral
(ii) I'extraction de l'ARNm, à partir dudit échantillon ; on peut utiliser notamment, une méthode modifiée de Chomczynski et Sacchi, en utilisant le réactif RNA NOW (Ozyme, France)
(iii) la transcription inverse (RT) dudit ARN
(iv) les amplifications successives ou concomitantes des ADNc obtenus en (iii), en présence d'amorces spécifiques de chaque isoforme d'HLA-G et l'analyse des produits d'amplification obtenus, par électrophorèse et/ou hybridation spécifique et
(v) I'établissement du profil de transcription HLA-G dudit échantillon.
(i) le prélèvement d'un échantillon tumoral
(ii) I'extraction de l'ARNm, à partir dudit échantillon ; on peut utiliser notamment, une méthode modifiée de Chomczynski et Sacchi, en utilisant le réactif RNA NOW (Ozyme, France)
(iii) la transcription inverse (RT) dudit ARN
(iv) les amplifications successives ou concomitantes des ADNc obtenus en (iii), en présence d'amorces spécifiques de chaque isoforme d'HLA-G et l'analyse des produits d'amplification obtenus, par électrophorèse et/ou hybridation spécifique et
(v) I'établissement du profil de transcription HLA-G dudit échantillon.
De manière préférée, les transcriptions inverses sont amorcées avec des oligo-dT sur de l'ARNm, préalablement dénaturé, par exemple à 65"C, en présence d'une transcriptase inverse, telle que la transcriptase inverse M-MLV (Gibco-BRL, Life technologies).
Également de manière préférée, I'amplification des ADNc est réalisée par polymérisation en chaîne (PCR), en utilisant des amorces spécifiques des différentes isoformes d'HLA-G, conformément aux Tableaux suivants
<tb> Amorces <SEP> Séquences <SEP> nucléotidiques <SEP> Températures <SEP> Isoformes
<tb> <SEP> d'hybridation <SEP> amplifiées
<tb> <SEP> ( C) <SEP>
<tb> G.257 <SEP> 5'-GGAAGAGGAG CACGGAACA <SEP> 61 <SEP> GI, <SEP> G2, <SEP> G3,
<tb> G3.U <SEP> 5'-GGCTGGTCTCTGCACAAAGAGA <SEP> G4, <SEP> G5, <SEP> G6
<tb> G.526 <SEP> 5'-CCAATGTGGCTGAACAAAGG <SEP> 61 <SEP> G1, <SEP> G4, <SEP> G5
<tb> G3 <SEP> . <SEP> U <SEP> 5' <SEP> -GGCTGGTCTCTGCACAAAGAGA
<tb> G.-3-4 <SEP> 5'-ACCAGAGCGAGGCCAAGCAG <SEP> 65 <SEP> G3
<tb> G3.U <SEP> 5' <SEP> -GGCTGGTCTCTGCACAAAGAGA
<tb> G.-3 <SEP> 5'-ACCAGAGCGAGGCCAACCCC <SEP> 65 <SEP> G2, <SEP> G6
<tb> G3.U <SEP> 5'-GGCTGGTCTCTGCACAAAGAGA <SEP>
<tb> G.-3 <SEP> 5'-ACCAGAGCGAGGCCAACCCC <SEP> 61 <SEP> G6
<tb> G.i4b <SEP> 5' <SEP> -AAAGGAGGTGAAGGTGAGGG
<tb> G.526 <SEP> 5'-CCAATGTGGCTGAACAAAGG <SEP> 61 <SEP> G5
<tb> G.i4b <SEP> 5 <SEP> ' <SEP> 5' <SEP> -AAAGGAGGTGAAGGTGAGGG
<tb>
<tb> <SEP> d'hybridation <SEP> amplifiées
<tb> <SEP> ( C) <SEP>
<tb> G.257 <SEP> 5'-GGAAGAGGAG CACGGAACA <SEP> 61 <SEP> GI, <SEP> G2, <SEP> G3,
<tb> G3.U <SEP> 5'-GGCTGGTCTCTGCACAAAGAGA <SEP> G4, <SEP> G5, <SEP> G6
<tb> G.526 <SEP> 5'-CCAATGTGGCTGAACAAAGG <SEP> 61 <SEP> G1, <SEP> G4, <SEP> G5
<tb> G3 <SEP> . <SEP> U <SEP> 5' <SEP> -GGCTGGTCTCTGCACAAAGAGA
<tb> G.-3-4 <SEP> 5'-ACCAGAGCGAGGCCAAGCAG <SEP> 65 <SEP> G3
<tb> G3.U <SEP> 5' <SEP> -GGCTGGTCTCTGCACAAAGAGA
<tb> G.-3 <SEP> 5'-ACCAGAGCGAGGCCAACCCC <SEP> 65 <SEP> G2, <SEP> G6
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<tb>
<tb> <SEP> Sondes <SEP> Séquences <SEP> nucléotidiques <SEP> Températures <SEP> Isoformes
<tb> <SEP> d'hybridation <SEP> détectées
<tb> <SEP> ( C) <SEP>
<tb> GR <SEP> 5'-GGTCTGCAGGTTCATTCTGTC <SEP> 60 <SEP> HLA-G <SEP> 1, <SEP> G2, <SEP>
<tb> <SEP> G3, <SEP> G4, <SEP> G5, <SEP> G6 <SEP>
<tb> G.647 <SEP> F <SEP> 5'-CCACCACCCTGTCTTTGACT <SEP> 60 <SEP> HLA-GI, <SEP>
<tb> <SEP> G2,G5, <SEP> G6 <SEP>
<tb> G.I4 <SEP> F <SEP> GAGGCATCATGTCTGTTAGG <SEP> 55 <SEP> HLA-G5,G6 <SEP>
<tb> G.927F <SEP> 5'-ATCATGGGTATCGTTGCTGG <SEP> 55 <SEP> FILA-G <SEP> 1 <SEP> -G4 <SEP>
<tb>
La présente invention a également pour objet une méthode d'établissement du profil d'expression HLA-G d'une tumeur solide, caractérisée en ce qu'elle comprend:
(i) le prélèvement d'un échantillon tumoral,
(ii) éventuellement le marquage des cellules dudit échantillon,
(iii) la lyse des cellules,
(iv) la mise en contact des cellules lysées avec différents anticorps dirigés contre les antigènes HLA de classe I, pour former, éventuellement des complexes isoforme d'HLA-G/anticorps et
(v) l'établissement du profil d'expression HLA-G dudit échantillon, par détection des complexes formés à l'étape (iv).
<tb> <SEP> d'hybridation <SEP> détectées
<tb> <SEP> ( C) <SEP>
<tb> GR <SEP> 5'-GGTCTGCAGGTTCATTCTGTC <SEP> 60 <SEP> HLA-G <SEP> 1, <SEP> G2, <SEP>
<tb> <SEP> G3, <SEP> G4, <SEP> G5, <SEP> G6 <SEP>
<tb> G.647 <SEP> F <SEP> 5'-CCACCACCCTGTCTTTGACT <SEP> 60 <SEP> HLA-GI, <SEP>
<tb> <SEP> G2,G5, <SEP> G6 <SEP>
<tb> G.I4 <SEP> F <SEP> GAGGCATCATGTCTGTTAGG <SEP> 55 <SEP> HLA-G5,G6 <SEP>
<tb> G.927F <SEP> 5'-ATCATGGGTATCGTTGCTGG <SEP> 55 <SEP> FILA-G <SEP> 1 <SEP> -G4 <SEP>
<tb>
La présente invention a également pour objet une méthode d'établissement du profil d'expression HLA-G d'une tumeur solide, caractérisée en ce qu'elle comprend:
(i) le prélèvement d'un échantillon tumoral,
(ii) éventuellement le marquage des cellules dudit échantillon,
(iii) la lyse des cellules,
(iv) la mise en contact des cellules lysées avec différents anticorps dirigés contre les antigènes HLA de classe I, pour former, éventuellement des complexes isoforme d'HLA-G/anticorps et
(v) l'établissement du profil d'expression HLA-G dudit échantillon, par détection des complexes formés à l'étape (iv).
De manière préférée, à l'étape (iv), on obtient des immunoprécipités, qui sont séparés, à l'étape (v) par électrophorèse, transférés sur membrane et détectés.
Conformément à l'invention, lesdits anticorps sont de préférence des anticorps monoclonaux.
Cette expression des HLA-G par les cellules tumorales permet de mieux évaluer le type de traitement potentiellement efficace.
La présente invention a également pour objet un vaccin anti-tumoral, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par des cellules tumorales autologues ou un antigène HLA-G5 soluble; de tels vaccins induisent la formation de lymphocytes T cytotoxiques, spécifiques de tumeurs et d'anticorps anti-HLA
G.
G.
Lorsque ledit vaccin est constitué de cellules autologues (notamment des cellules tumorales de l'individu à traiter exprimant au moins une isoforme d'HLA
G), lesdites cellules sont de préférence modifiées de manière à induire effectivement la production d'anticorps anti-HLA-G. Les cellules sont par exemple soumises à un traitement au cholestérol ou à un traitement hyperbare.
G), lesdites cellules sont de préférence modifiées de manière à induire effectivement la production d'anticorps anti-HLA-G. Les cellules sont par exemple soumises à un traitement au cholestérol ou à un traitement hyperbare.
De manière avantageuse, ledit antigène anti-HLA-G5 soluble est couplé à une protéine appropriée et éventuellement associé à un adjuvant tel que l'hydroxyde d'aluminium ou le phosphate de calcium.
Ledit vaccin est de préférence administré par voie sous-cutanée ou intra-dermique.
La présente invention a également pour objet une composition antitumorale, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'anticorps anti-HLA-G (immunothérapie passive).
La présente invention a en outre pour objet des produits contenant des anticorps anti-HLA-G et des facteurs de régulation de l'expression des HLA-G, comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, dans le traitement des tumeurs solides exprimant au moins une isoforme d'HLA-G.
Parmi lesdits facteurs de régulation, on peut notamment noter les hormones sexuelles telles que la testostérone.
Outre les dispositions qui précèdent, I'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels
- la figure 1 illustre
(A) : I'analyse RT-PCR des ARNm des isoformes d'HLA-G dans les cellules de mélanome. Des amorces pan-HLA-G [amorce G.257 (exon 2) et 3G.2 (extrémité 3' non-traduite)] sont utilisées pour l'amplification PCR des transcrits
HLA-G correspondants aux différentes isoformes connues d'HLA-G. L'ADNc des cellules de choriocarcinome JEG-3, les trophoblastes du premier trimestre (TRO) et les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) sont utilisés comme cellules contrôles respectivement pour les taux de transcription élevés et les taux de transcrip tion basals d'HLA-G. IgR, M8 et M74 correspondent à l'amplification de l'ADNc de lignées cellulaires de mélanomes. Les bandes HLA-G spécifiques sont révélées par hybridation avec la sonde GR-spécifique, localisée au niveau de l'exon 2. Les bandes correspondant aux transcrits HLA-G 1, G2, G3, G4 et G5 sont indiqués par des flèches.
- la figure 1 illustre
(A) : I'analyse RT-PCR des ARNm des isoformes d'HLA-G dans les cellules de mélanome. Des amorces pan-HLA-G [amorce G.257 (exon 2) et 3G.2 (extrémité 3' non-traduite)] sont utilisées pour l'amplification PCR des transcrits
HLA-G correspondants aux différentes isoformes connues d'HLA-G. L'ADNc des cellules de choriocarcinome JEG-3, les trophoblastes du premier trimestre (TRO) et les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) sont utilisés comme cellules contrôles respectivement pour les taux de transcription élevés et les taux de transcrip tion basals d'HLA-G. IgR, M8 et M74 correspondent à l'amplification de l'ADNc de lignées cellulaires de mélanomes. Les bandes HLA-G spécifiques sont révélées par hybridation avec la sonde GR-spécifique, localisée au niveau de l'exon 2. Les bandes correspondant aux transcrits HLA-G 1, G2, G3, G4 et G5 sont indiqués par des flèches.
Les produits de la PCR, co-amplifiés au cours de la même réaction, avec les amorces de la p-actine sont détectés sur la même membrane à l'aide d'une sonde p-actine
(B): cette figure correspond à la détection RT-PCR des transcrits alternatifs dans les cellules de mélanome. L'amorce 3 est spécifique des isoformes
HLA-G2 et HLA-G2 soluble (G6) qui ne possèdent pas l'exon 3. L'amorce 3.4 permet de distinguer les transcrits ARNm HLA-G4. Les amorces G.526 et I4b amplifient de manière spécifique le transcrit HLA-G5, qui correspond à la forme soluble. Les produits de la PCR, co-amplifiés dans la même réaction avec les amorces de la p-actine, sont détectés sur la même membrane par une sonde spécifique de la -actine;
(C): cette figure correspond à l'analyse RT-PCR de l'ARNm des
HLA classiques de classe I. Les ADNc des PBMC, des trophoblastes et des cellules de mélanome sont amplifiés par RT-PCR, en utilisant des amorces spécifiques HLA-A,
HLA-B, HLA-C ou HLA-DRA. Les bandes spécifiques sont révélées en utilisant des sondes spécifiques (FILA A, HLA-B, KLA-C et HLA-DRA). Les produits de la
PCR, co-amplifiés dans la même réaction avec les amorces de la p-actine, sont détectés sur la même membrane par une sonde spécifique de la B-actine (contrôle quantitatif des taux d'ARN).
(B): cette figure correspond à la détection RT-PCR des transcrits alternatifs dans les cellules de mélanome. L'amorce 3 est spécifique des isoformes
HLA-G2 et HLA-G2 soluble (G6) qui ne possèdent pas l'exon 3. L'amorce 3.4 permet de distinguer les transcrits ARNm HLA-G4. Les amorces G.526 et I4b amplifient de manière spécifique le transcrit HLA-G5, qui correspond à la forme soluble. Les produits de la PCR, co-amplifiés dans la même réaction avec les amorces de la p-actine, sont détectés sur la même membrane par une sonde spécifique de la -actine;
(C): cette figure correspond à l'analyse RT-PCR de l'ARNm des
HLA classiques de classe I. Les ADNc des PBMC, des trophoblastes et des cellules de mélanome sont amplifiés par RT-PCR, en utilisant des amorces spécifiques HLA-A,
HLA-B, HLA-C ou HLA-DRA. Les bandes spécifiques sont révélées en utilisant des sondes spécifiques (FILA A, HLA-B, KLA-C et HLA-DRA). Les produits de la
PCR, co-amplifiés dans la même réaction avec les amorces de la p-actine, sont détectés sur la même membrane par une sonde spécifique de la B-actine (contrôle quantitatif des taux d'ARN).
- la figure 2 illustre l'analyse RT-PCR des ARNm des isoformes d'HLA-G dans les biopsies de métastases de mélanome (analyse in vivo et ex vivo de la peau). Les amorces pan-HLA-G G.257 et 3G.U sont utilisées pour l'amplification
RT-PCR des transcrits HLA-G, à partir de métastases de peau ex vivo (MEL) et à partir de biopsies de peau saine, du même patient (HS); des cellules JEG-3 et des trophoblastes du premier trimestre sont utilisés comme contrôles (taux élevé de transcription HLA-G). Les bandes spécifiques HLA-G sont révélées par hybridation avec une sonde GR-spécifique, localisée dans l'exon 2. Les bandes correspondant aux transcrits HLA-GI, G2, G3, G4 et G5 sont indiquées par des flèches.
RT-PCR des transcrits HLA-G, à partir de métastases de peau ex vivo (MEL) et à partir de biopsies de peau saine, du même patient (HS); des cellules JEG-3 et des trophoblastes du premier trimestre sont utilisés comme contrôles (taux élevé de transcription HLA-G). Les bandes spécifiques HLA-G sont révélées par hybridation avec une sonde GR-spécifique, localisée dans l'exon 2. Les bandes correspondant aux transcrits HLA-GI, G2, G3, G4 et G5 sont indiquées par des flèches.
- la figure 3 illustre la détection des protéines HLA-GI dans les cellules JEG-3 mais pas dans les cellules de mélanomes IGR et M8 à l'aide de l'anticorps monoclonal W6/32
(A) : immunoprécipitation des protéines marquées métaboliquement.
(A) : immunoprécipitation des protéines marquées métaboliquement.
(B) : les protéines de surface biotinylées de mélanome et les cellules
JEG-3 sont immunoprécipitées avec l'anticorps monoclonal W6/32 ; les immunoprécipités sont séparés par SDS-PAGE à 12 No et transférés sur membrane de cellulose. Les molécules de surface de classe I sont détectées avec de la peroxydase conjuguée à de la streptavidine.
JEG-3 sont immunoprécipitées avec l'anticorps monoclonal W6/32 ; les immunoprécipités sont séparés par SDS-PAGE à 12 No et transférés sur membrane de cellulose. Les molécules de surface de classe I sont détectées avec de la peroxydase conjuguée à de la streptavidine.
- la figure 4 illustre l'immunoprécipitation des isoformes HLA-G des cellules de mélanomes IGR par un anticorps monoclonal dirigé contre la chaîne lourde d'HLA-G libre et par les anticorps monoclonaux 4H94 et HCA2. Les cellules sont marquées pendant 30 min, immunoprécipitées avec les anticorps spécifiques et les immunoprécipités sont analysés par SDS-PAGE à 10 %. L'anticorps 4H94, qui réagit avec la chaîne lourde HLA-G (bande de 39 kDa dans les cellules JEG-3), présente des réactions croisées avec les chaînes lourdes d'HLA-A, B et/ou C (bande de 45 kDa dans toutes les cellules testées).
- la figure 5 illustre:
(A): I'effet de l'expression HLA-G dans le mélanome IGR sur la sensibilité à la lyse par le clone YT2C2-PR. Les cellules K562 transfectées, soit avec le vecteur seul (K562-pRc/RSV), soit avec le vecteur HLA-GI (K562-HLA-G1) ou le vecteur HLA-G2 (K562-HLA-G2) et les lignées M8, M74 et IGR sont utilisées comme cellules cibles (T). Le clone YT2C2-PR est utilisé comme cellule effectrice (E) dans un rapport cellule effectrice/cellule cible (E/T) de 50:1. Les résultats sont exprimés comme le pourcentage de lyse enregistré en 4 h dans un test de libération du chrome 51. La libération spontanée n'excède jamais 10 % de la libération maximale.
(A): I'effet de l'expression HLA-G dans le mélanome IGR sur la sensibilité à la lyse par le clone YT2C2-PR. Les cellules K562 transfectées, soit avec le vecteur seul (K562-pRc/RSV), soit avec le vecteur HLA-GI (K562-HLA-G1) ou le vecteur HLA-G2 (K562-HLA-G2) et les lignées M8, M74 et IGR sont utilisées comme cellules cibles (T). Le clone YT2C2-PR est utilisé comme cellule effectrice (E) dans un rapport cellule effectrice/cellule cible (E/T) de 50:1. Les résultats sont exprimés comme le pourcentage de lyse enregistré en 4 h dans un test de libération du chrome 51. La libération spontanée n'excède jamais 10 % de la libération maximale.
Cette expérience est réalisée au moins 5 fois et produit à chaque fois les mêmes résul tats;
(B): I'inhibition de la lyse induite par le clone YT2C2-PR est due à un signal off transmis par les cellules IGR. La lignée M8 est utilisée comme cellule cible (T), marquées au chrome. Le clone YT2C2-PR est utilisé comme cellule effectrice (E) dans un rapport E/T de 50:1. Les cellules IGR sont ajoutées en tant que cellules inhibitrices dans un rapport cellule inhibitrice/cellule cible de 100, 50 et 25:1.
(B): I'inhibition de la lyse induite par le clone YT2C2-PR est due à un signal off transmis par les cellules IGR. La lignée M8 est utilisée comme cellule cible (T), marquées au chrome. Le clone YT2C2-PR est utilisé comme cellule effectrice (E) dans un rapport E/T de 50:1. Les cellules IGR sont ajoutées en tant que cellules inhibitrices dans un rapport cellule inhibitrice/cellule cible de 100, 50 et 25:1.
0 indique qu'aucune cellule IGR n'a été ajoutée dans le test.
II doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1: Analyse des profils KLA-G de différentes lignées tumorales
A/ MATERIEL ET METHODES
1/ Lignées cellulaires
La lignée cellulaire érythroleucémique humaine K562 (ATCC) et la lignée cellulaire leucémique T immature (clone YT2C2-PR) à activité NK) sont maintenues dans un milieu RPMI 1640 complémenté avec du sérum de veau foetal à 10%, inactivé par la chaleur, de la L-glutamine 2mM, de la gentamicine à 1 pg/ml et de la fungizone (Sigma, Saint-Quentin, France) et cultivées à 370C dans un incubateur, humidifié à atmosphère enrichie à 5% en CO2. Les transfectants K562 sont sélectionnés dans un milieu contenant de la généticine à 1 mg/ml (G418 sulfate,
Sigma).
A/ MATERIEL ET METHODES
1/ Lignées cellulaires
La lignée cellulaire érythroleucémique humaine K562 (ATCC) et la lignée cellulaire leucémique T immature (clone YT2C2-PR) à activité NK) sont maintenues dans un milieu RPMI 1640 complémenté avec du sérum de veau foetal à 10%, inactivé par la chaleur, de la L-glutamine 2mM, de la gentamicine à 1 pg/ml et de la fungizone (Sigma, Saint-Quentin, France) et cultivées à 370C dans un incubateur, humidifié à atmosphère enrichie à 5% en CO2. Les transfectants K562 sont sélectionnés dans un milieu contenant de la généticine à 1 mg/ml (G418 sulfate,
Sigma).
La lignée cellulaire humaine de choriocarcinome HLA-G-positive dénommée JEG-3 (ATCC) est cultivée dans un milieu DMEM (Sigma) supplémenté avec du sérum de veau foetal à 10%, inactivé à la chaleur, des antibiotiques et de la Lglutamine 2mM. Les lignées cellulaires ne contiennent pas de mycoplasmes.
Outre les lignées précitées, on utilise
- des lignées de mélanome IGR (HLA-A2, A3, B58/mâle), M74 (HLA-A1, A2, B8, B 14/femelle) et M8 (HLA-A1, A2, B12 et B40/mâle),
- des tissus trophoblastiques du premier trimestre, obtenus après IVG ; ces tissus sont découpés en fines lamelles et immédiatement utilisés pour extraire I'ARN, et
- des cellules mononucléées du sang périphériques (PBMC), obtenues à partir de volontaires sains et isolées sur un gradient de densité Ficoll-Hypaque 1077.
- des lignées de mélanome IGR (HLA-A2, A3, B58/mâle), M74 (HLA-A1, A2, B8, B 14/femelle) et M8 (HLA-A1, A2, B12 et B40/mâle),
- des tissus trophoblastiques du premier trimestre, obtenus après IVG ; ces tissus sont découpés en fines lamelles et immédiatement utilisés pour extraire I'ARN, et
- des cellules mononucléées du sang périphériques (PBMC), obtenues à partir de volontaires sains et isolées sur un gradient de densité Ficoll-Hypaque 1077.
2/ Échantillons tumoraux
Des biopsies sont effectuées à partir d'échantillons tissulaires de patients.
Des biopsies sont effectuées à partir d'échantillons tissulaires de patients.
3/ Anticorps monoclonaux
Les anticorps suivants sont utilisés
W6/32 : IgG2a, anti-chaînes ot de HLA de classe I associées à la 2- m (Sigma) ; HCA2 : IgG anti-HLA-A et G et des IgG anti-HLA-G.
Les anticorps suivants sont utilisés
W6/32 : IgG2a, anti-chaînes ot de HLA de classe I associées à la 2- m (Sigma) ; HCA2 : IgG anti-HLA-A et G et des IgG anti-HLA-G.
4/ RT-PCR
L'ARNm total est extrait à partir de 107 cellules à l'aide du réactif
RNA NOW (Biogentex, Inc.) conformément aux recommandations du fabricant. La qualité de I'ARN est vérifiée par électrophorèse sur gel d'agarose à 1,5% dénaturant.
L'ARNm total est extrait à partir de 107 cellules à l'aide du réactif
RNA NOW (Biogentex, Inc.) conformément aux recommandations du fabricant. La qualité de I'ARN est vérifiée par électrophorèse sur gel d'agarose à 1,5% dénaturant.
Les ADNc sont préparés à partir de 10 ltg d'ARN total traités avec de la DNAse I (Boerhinger Mannheim) en utilisant une amorce oligo-(dT)12.18 et la transcriptase inverse M-MLV (GIBCO-BRL). Les amplifications RT-PCR sont réalisées en utilisant les amorces suivantes : G.257 (exon 2) et G3.U (3'UT) (Ishitani A. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci., 1992, 89, 3947-3951; Kirszenbaum M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1994, 91, 4209-4213 et Moreau P. et al., C.R. Acad. Sci, 1995, 318, 837-842), pour détecter toutes les isoformes d'ARNm d'HLA-G. Une amplification spécifique de chaque forme d'ARNm d'HLA-G est réalisée avec les ensembles d'amorces suivants
- G.526 (exon 3) et G3.U (3' UT) pour les isoformes G1 et G4
- G.526 (exon 3) et G.i4b (intron 4) pour l'isoforme G5
- G.-3 (recouvrant partiellement les exons 2 et 4) et G3.U (3' UT) pour les isoformes G2 et G6
- G.3-4 (recouvrant partiellement les exons 2 et 5) et G3.U (3' UT) pour l'isoforme G3.
- G.526 (exon 3) et G3.U (3' UT) pour les isoformes G1 et G4
- G.526 (exon 3) et G.i4b (intron 4) pour l'isoforme G5
- G.-3 (recouvrant partiellement les exons 2 et 4) et G3.U (3' UT) pour les isoformes G2 et G6
- G.3-4 (recouvrant partiellement les exons 2 et 5) et G3.U (3' UT) pour l'isoforme G3.
Les ADNc des HLA classiques de classe I sont amplifiés comme décrit dans King et al. (J. Immunol., 1996, 156, 2068-2076), en utilisant une amorce 5' unique HLA-5P2 et 3 amorces 3', HLA-3pA, HLA-3pB et HLA-3pC qui amplifient respectivement les ARNm HLA-A, HLA-B et HLA-C.
Les amorces spécifiques DRA sont décrites dans King et al. précité.
Une co-amplification de l'ADNc de ss-actine est réalisée dans chaque expérience avec le test Clontech (16 cycles), de manière à évaluer les quantités comparatives d'ARN dans les échantillons. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose à 1% et colorés à l'aide de bromure d'éthidium. La spécificité des produits PCR est confirmée par blotting alcalin des fragments dans du
NaOH 0,4 N sur des membranes de Nylon (Hybond N+, Amersham, France).
NaOH 0,4 N sur des membranes de Nylon (Hybond N+, Amersham, France).
Les sondes HLA-G spécifiques sont les suivantes
- GR spécifique de l'exon 2,
- G.647 F (5'-CCACCACCCTGTCTTTGACT: spécifique de l'exon 4),
- G.I4 F (GAGGCATCATGTCTGTTAGG: spécifique de l'intron 4), et
- G.927 F (5'-ATCATGGGTATCGTTGCTGG: spécifique de l'exon 5).
- GR spécifique de l'exon 2,
- G.647 F (5'-CCACCACCCTGTCTTTGACT: spécifique de l'exon 4),
- G.I4 F (GAGGCATCATGTCTGTTAGG: spécifique de l'intron 4), et
- G.927 F (5'-ATCATGGGTATCGTTGCTGG: spécifique de l'exon 5).
Les autres sondes sont les suivantes
- sonde spécifique HLA-A (5'GGAGGACCAGACCCAGGACAC
G),
- sonde spécifique HLA-B (5'AGCTCCGATGACCACAACTGC)
- sonde spécifique HLA-C (5'TGTCCTAGCTGCCTAGGAG) et
- sonde spécifique HLA-DRA (TGTGATCATCCAGGCCGAG).
- sonde spécifique HLA-A (5'GGAGGACCAGACCCAGGACAC
G),
- sonde spécifique HLA-B (5'AGCTCCGATGACCACAACTGC)
- sonde spécifique HLA-C (5'TGTCCTAGCTGCCTAGGAG) et
- sonde spécifique HLA-DRA (TGTGATCATCCAGGCCGAG).
Les filtres sont exposés sur des films Kodak (Biomax) avec des écrans amplificateurs pendant 4 à 16 heures à -80 C.
5/ Marquage métabolique, immunoprécipitation et électrophorèse sur gel.
Les cellules sont métaboliquement marquées avec 0,5 mCi de [35S] méthionine +[35S] cystéine (Amersham) pour 2.107 cellules pendant 30 min ou 1 h dans un milieu sans méthionine ni cystéine contenant 5 % de sérum de veau foetal.
Les cellules sont lavées deux fois avec du PBS froid et lysées dans un tampon constitué de I % de Triton X100/PBS pendant 30 min à 4"C. Après préclarification par incubation avec une colonne Sépharose- protéine A CL-4B (Pharmacia) et du sérum normal, les lysats cellulaires préclarifiés sont incubés avec des anticorps spécifiques (W6/32, 4H94 et HCA2). Les produits immunoprécipités sont lavés 5 fois dans un tampon comprenant 0,1 % de Triton X100/20 nM Tris pH 7,5 150 mM de NaCI, 0,05 % de NaN3 (Dunq) et une fois dans un tampon comprenant 0,1 % Triton X100, 0,1 % SDS/Dunq. Les protéines liées sont éluées à partir des billes par chauffage à 100"C pendant 5 min dans un tampon à 2 % de SDS. Les échantillons sont alors analysés sur un gel SDS-PAGE à 12 ou 10 %. Les gels sont séchés et exposés à un film Kodak XAR-5 à -70 C.
6/ Immunoprécipitation des protéines biotinylées de surface et
Western blot.
Western blot.
Les protéines de surface sont marquées avec de la biotine. Après lavage dans du PBS, 1,5.107 cellules sont incubés dans 1 ml de PBS froid contenant 5 ml de NHS-SS-biotine (Pierce, Rockford, IL) pendant 15 min à 4"C. Les groupes actifs résiduels sont inhibés dans 50 mM de NH4CI pendant 10 min à 4"C. Les cellules sont lysées dans I % de Triton X100/PBS. Les protéines précipitées avec l'anticorps
W6/32 sont séparées sur SDS-PAGE à 12 %, transférées sur membrane de nitrocellulose et mises en présence d'un conjugué peroxydase de raifort-streptavidine. Après un lavage extensif de la membrane, la réaction colorée est réalisée en utilisant le réactif de détection de Western blotting ECL (Amersham, France), après quoi la membrane est exposée à un film Kodak à température ambiante.
W6/32 sont séparées sur SDS-PAGE à 12 %, transférées sur membrane de nitrocellulose et mises en présence d'un conjugué peroxydase de raifort-streptavidine. Après un lavage extensif de la membrane, la réaction colorée est réalisée en utilisant le réactif de détection de Western blotting ECL (Amersham, France), après quoi la membrane est exposée à un film Kodak à température ambiante.
7/ Essais de cytotoxicité.
L'activité cytolytique des cellules mononucléées du sang périphérique, des cellules NK et des cellules YT2C2-PR (cellules effectrices ou E) à l'encontre des transfectants HLA-G (cellules cibles ou T) est estimée à l'aide de tests de libération pendant 4 heures du chrome 51, dans lesquels les cellules effectrices sont mélangées avec 5.103 de cellules cibles marquées au chrome 51 (100 ACi de 5tCr-chromate de sodium, Amersham, UK), dans différents rapports E/T, dans des plaques de microtitration dont le fond est en forme de U.
Après 4 heures à 37"C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO2, 100 ul de surnageant sont prélevés pour un comptage par scintillation en phase liquide (Wallac 1450 Microbeta, Pharmacia, France). Le pourcentage de lyse spécifique est calculé comme sont présentés comme des moyennes de trois échantillons. Dans les expériences dans lesquelles les anticorps monoclonaux sont utilisés pour bloquer l'interaction HLA-G
NK, les cellules cibles sont incubées avec l'anticorps monoclonal correspondant, puis lavées et incubées avec un anticorps F(ab')2 de chèvre anti-souris (Jackson
Immunoresearch, USA) pour éviter la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) par interaction des récepteurs pour le fragment Fc des immunoglobulines, exprimés sur les cellules NK avec le premier anticorps utilisé. Les toxicités des anticorps monoclonaux sont également vérifiées dans chaque essai et sont toujours inférieures à 3%.
NK, les cellules cibles sont incubées avec l'anticorps monoclonal correspondant, puis lavées et incubées avec un anticorps F(ab')2 de chèvre anti-souris (Jackson
Immunoresearch, USA) pour éviter la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) par interaction des récepteurs pour le fragment Fc des immunoglobulines, exprimés sur les cellules NK avec le premier anticorps utilisé. Les toxicités des anticorps monoclonaux sont également vérifiées dans chaque essai et sont toujours inférieures à 3%.
Il - Résultats
1/Identification des différents transcrits d'HLA-G dans des lignées cellulaires de mélanome.
1/Identification des différents transcrits d'HLA-G dans des lignées cellulaires de mélanome.
Les ADNc d'HLA-G de 3 lignées cellulaires de mélanome (IGR, M8 et M74) sont amplifiés, à l'aide des amorces précédemment décrites (A. Ishitani et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 3947-3951; M. Kirszenbaum et al., Proc. Natl.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 3947-3951; M. Kirszenbaum et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1994, 91, 4209-4213), dérivées des séquences spécifiques de l'exon 2 et de la région 3' non traduite (voir Matériel et Méthodes).
La lignée JEG-3 de choriocarcinome et des cellules trophoblastiques, qui présentent des taux élevés de transcrits d'HLA-G, sont utilisées comme témoins positifs et les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de volontaires sains sont utilisés comme contrôle négatifs (taux faibles de transcrits HLA-G).
L'hybridation des produits de la PCR ont permis d'identifier des taux importants d'ARNm d'HLA-G dans 2 lignées cellulaires de mélanome, à savoir
IGR et M74, tandis qu'aucun signal ne peut être détecté dans la lignée cellulaire de mélanome M8.
IGR et M74, tandis qu'aucun signal ne peut être détecté dans la lignée cellulaire de mélanome M8.
Dans les cellules JEG-3 et les trophoblastes, tous les transcrits d'HLA-G sont détectés (figure 1A).
Dans les cellules de mélanome IGR, tous les transcrits sont également détectés par les amorces pan-HLA-G (figure 1A).
Cependant, les amorces pan-HLA-G ne permettent pas de distinguer entre les signaux HLA-G1 et HLA-G5, qui sont présents tous les deux, au niveau d'une bande correspondant à 1 000 pb, ni entre les signaux HLA-G2 et HLA-GI, qui comigrent sous la forme d'un fragment de 600 pb. Une identification RT-PCR permet d'isoler les isoformes à l'aide d'amorces spécifiques (P. Moreau et al., C. R. Acad.
Sci., 1995, 318, 837-842) (voir Matériel et Méthodes).
Les cellules IGR expriment toutes les isoformes d'HLA-G sous forme de transcrits, HLA-G4 et HLA-G5 étant exprimés à des taux faibles (figure 1B).
Dans la lignée cellulaire de mélanome M74, les amorces pan-HLA
G détectent des bandes correspondant à HLA-GI et HLA-G5 (1 000 pb) (signaux intenses), un signal pour HLA-G2 et G4 (600 pb), mais aucun signal pour HLA-G3 (300 pb) (figure 1A). Les amorces pour les isoformes spécifiques révèlent que dans ces cellules les isoformes Gl et G4 sont plus abondantes que dans les PBMC tandis que le taux de transcrit G5 est comparable à celui observé dans les PBMC.
G détectent des bandes correspondant à HLA-GI et HLA-G5 (1 000 pb) (signaux intenses), un signal pour HLA-G2 et G4 (600 pb), mais aucun signal pour HLA-G3 (300 pb) (figure 1A). Les amorces pour les isoformes spécifiques révèlent que dans ces cellules les isoformes Gl et G4 sont plus abondantes que dans les PBMC tandis que le taux de transcrit G5 est comparable à celui observé dans les PBMC.
Des taux faibles d'ARNm HLA-G2 et HLA-G6 (forme soluble d'HLA-G2) sont détectés dans ces cellules M74, tandis qu'une amplification spécifique du transcrit HLA-G3 confirme l'absence d'HLA-G3 observée avec les amorces pan-HLA-G dans ces cellules (figures 1A et 1B).
Aucun signal d'hybridation HLA-G n'est observé dans les cellules
M8 (figures 1A et 1B).
M8 (figures 1A et 1B).
L'analyse PCR des transcrits du CMFI classiques, à l'aide d'amorces spécifiques HLA-A, HLA-B, HLA-C (A. King et al., J. Immunol., 1996, 156, 20682076) et HLA-DR (M. Bull et al., Mol. Cell. Biol., 1990, 10, 3792-3796) révèle des taux élevés de transcription des HLA de classe I classiques dans toutes les lignées cellulaires de mélanome, tandis qu'on ne détecte que peu ou pas du tout de transcrits
HLA-DRA dans ces cellules (figure 1C).
HLA-DRA dans ces cellules (figure 1C).
Ces résultats sont confirmés par une analyse en cytométrie de flux, à l'aide d'anticorps monoclonaux dirigés contre les antigènes HLA de classes I et H ; ils montrent que les molécules HLA-A, B et C sont exprimées à la surface des lignées cellulaires de mélanome, alors qu'aucun antigène de classe II ne peut être détecté.
Le Tableau ci-après résume les profils de transcription obtenus avec ces différentes cellules.
JEG-3 PBMC TRO IGR M8 M74 G I ++++ ++ ++++ +++
G2 ++ + ++ - ++
G3 +++ +++ ++ -
G4 +++ + +++ + +
G5 ++++ ++ ++++ + ++
G6 ++ + ++ + - +1
2/ Analyse de la transcription HLA-G dans des bioPsies de mélanome ex-vivo.
G2 ++ + ++ - ++
G3 +++ +++ ++ -
G4 +++ + +++ + +
G5 ++++ ++ ++++ + ++
G6 ++ + ++ + - +1
2/ Analyse de la transcription HLA-G dans des bioPsies de mélanome ex-vivo.
Tous les transcrits d'HLA-G sont détectés à des taux importants dans les biopsies de mélanome, alors que seule la bande de 1 000 pb est détectée dans la peau humaine saine (figure 2). Ces résultats ont été confirmés sur d'autres biopsies et montrent que les taux importants de transcription observés dans les cellules de mélanome, sont spécifiques de ces derniers.
3/ Analyse des Protéines HLA-G dans les cellules de mélanome.
Pour déterminer si les transcrits d'HLA-G détectés dans les mélanomes sont traduits en protéines HLA-G, des études d'immunoprécipitation ont été effectuées avec différents anticorps monoclonaux anti-HLA de classe I, sur des lysats de cellules marquées métaboliquement (35S méthionine/cystéine).
La comparaison est réalisée en présence d'un contrôle positif (cellule
JEG-3) et d'un contrôle négatif (cellules de mélanome M8).
JEG-3) et d'un contrôle négatif (cellules de mélanome M8).
Les résultats d'immunoprécipitation avec l'anticorps monoclonaux
W6/32 sont illustrés à la figure 3.
W6/32 sont illustrés à la figure 3.
Avec les cellules JEG-3, I'anticorps W6/32 immunoprécipite deux protéines de 45 kDa (molécule HLA-C) et de 39 kDa (isoforme HLA-GI liée à la membrane) (figure 3A).
Dans les cellules IGR et M8, seulement une protéine de 45 kDa est détectée.
Des résultats similaires sont obtenus par immunoprécipitation de protéines de surface biotinylées (figure 3B).
Ces données montrent que la protéine HLA-GI n'est pas exprimée dans les cellules IGR, même si ces dernières expriment l'ARNm correspondant.
Cependant, I'absence de protéine HLA-GI dans les cellules IGR n'exclut pas l'expression de 3 autres isoformes d'HLA-G (HLA-G2, G3 et G4).
Ces protéines ne peuvent pas être révélées par l'anticorps monoclonal W6/32, en raison de leur incapacité à s'associer avec la 2m.
Pour mettre en évidence ces protéines, l'immunoprécipitation de protéines marquées à la méthionine (35S-méthionine) est réalisée en utilisant des anticorps monoclonaux qui reconnaissent l'FILA-G libre, l'FILA-G dénaturée et l'HLA-A (anticorps HCA2) et un épitope localisé au niveau du domaine crl présent dans toutes les isoformes de la protéine HLA-G (anticorps monoclonal Ig anti HLA-G).
L'anticorps monoclonal révèle la présence de la protéine HLA-GI de 39 kDa dans les cellules JEG-3 et son absence dans les cellules IGR (figure 4).
Des bandes additionnelles, qui migrent à 32-34 kDa et à 18 kDa, qui correspondent respectivement à la taille de la protéine HLA-G2 et/ou de la protéine
HLA-G4 ou G3, sont détectées dans les cellules IGR aussi bien avec l'anticorps monoclonal Ig anti HLA-G qu'avec l'anticorps HCA2 (figure 4).
HLA-G4 ou G3, sont détectées dans les cellules IGR aussi bien avec l'anticorps monoclonal Ig anti HLA-G qu'avec l'anticorps HCA2 (figure 4).
Les bandes additionnelles, spécifiques de la protéine HLA-G, ne sont pas observées dans les cellules M74 et M8 qui ne présentent pas les transcrits d'HLA-G correspondants (figure 4).
4/ Protection de la lignée IGR de la cytolyse induite par les cellules NK.
Les cellules YT2C2-PR sont utilisées comme cellules effectrices
NK.
NK.
Seule la lignée cellulaire IGR, qui exprime les isoformes HLA-G2 et/ou G4 et G3, abolit la lyse induite par le clone YT2C2-PR.
La lignée cellulaire de mélanome M74, qui exprime les antigènes classiques du CMFI de classe I mais qui présente un défaut sélectif dans la transcription et l'expression des isoformes HLA-G2 et HLA-G3 est lysée par le clone YT2C2
PR.
PR.
Une lyse est également observée avec la lignée cellulaire M8, qui exprime les antigènes classiques du CMFI de classe I, mais qui ne transcrit aucun
ARNm d'HLA-G (figure 13A).
ARNm d'HLA-G (figure 13A).
Pour montrer que seules les HLA-G sont impliquées dans cette inhibition de la lyse induite par les cellules NK, plusieurs lignées cellulaires EBV-B n'exprimant aucune HLA-G mais partageant au moins une allèle HLA-A, B ou C avec la lignée IGR sont utilisées comme cellules cibles.
Toutes ces lignées EBV-B sont lysées par le clone YT2C2-PR, montrant que les antigènes HLA-A, B et C ne sont pas impliqués dans la protection du mélanome IGR, de la lyse YT2C2-PR.
Pour montrer que l'inhibition de la lyse, induite par le clone YT2C2
PR par les cellules IGR, n'est pas due à un signal transmis par cette lignée cellulaire mais est bien liée à une résistance intrinsèque de ces cellules IGR aux cellules NK, les cellules IGR ont été utilisées comme inhibiteurs, dans un test de cytotoxicité dans lequel les cellules cibles (T) sont des cellules M8 et les cellules YT2C2-PR, les cellules effectrices (E).
PR par les cellules IGR, n'est pas due à un signal transmis par cette lignée cellulaire mais est bien liée à une résistance intrinsèque de ces cellules IGR aux cellules NK, les cellules IGR ont été utilisées comme inhibiteurs, dans un test de cytotoxicité dans lequel les cellules cibles (T) sont des cellules M8 et les cellules YT2C2-PR, les cellules effectrices (E).
La figure 5 B montre que les cellules IGR inhibent de manière efficace la lyse des cellules M8 par le clone YT2C2-PR ; cette inhibition est proportionnelle au nombre de cellules IGR utilisé pour le test compétitif.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, I'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.
Claims (2)
1") Méthode d'établissement du profil de transcription HLA-G d'une tumeur solide, caractérisée en ce qu'elle comprend
REVENDICATIONS
(v) l'établissement du profil d'expression HLA-G dudit échantillon, par détection des complexes formés à l'étape (iv).
(iv) la mise en contact des cellules lysées avec différents anticorps dirigés contre les antigènes HLA de classe I, pour former, éventuellement des complexes isoforme d'HLA-G/anticorps et
(iii) la lyse des cellules,
(ii) éventuellement le marquage des cellules dudit échantillon,
(i) le prélèvement d'un échantillon tumoral,
2") Méthode d'établissement du profil d'expression HLA-G d'une tumeur solide, caractérisée en ce qu'elle comprend:
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| ROUAS ET AL.: "Direct evidence to support the role of HLA - G in protecting the fetus from maternal uterine natural killer cytolysis", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, (1997 OCT 14) 94 (21) 11520-5, XP002086261 * |
| ROUAS ET AL.: "The alpha1 domain of HLA-G1 and HLA-G2 inhibits cytotoxicity induced by natural killer cells: is HLA - G the public ligand for natural killer cell inhibitory receptors?", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, (1997 MAY 13) 94 (10) 5249-54, XP002086260 * |
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