FR2810047A1

FR2810047A1 - Nouvelle isoforme d'hla-g et ses applications

Info

Publication number: FR2810047A1
Application number: FR0007529A
Authority: FR
Inventors: Edgardo Delfino Carosella; Pascale Paul
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2000-06-13
Filing date: 2000-06-13
Publication date: 2001-12-14
Anticipated expiration: 2020-06-13
Also published as: WO2001096564A3; WO2001096564A2; FR2810047B1

Abstract

Nouvelle isoforme d'HLA-G soluble (HLA-G7) et ses applications, liées à ses propriétés immunomodulatrices, pour le diagnostic des maladies autoimmunes et des risques d'avortement à répétition et le traitement, chez l'homme de troubles liés à l'immunité.

Description

La présente invention est relative à une nouvelle isoforme d'HLA-G soluble (HLA-G7) et à ses applications, liées à ses propriétés immunomodulatrices, pour le diagnostic des maladies autoimmunes et des risques d'avortement à répétition et le traitement, chez l'homme de troubles liés à l'immunité.

Les antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH), se divisent en plusieurs classes, les antigènes de classe I (HLA-A,
HLA-B et HLA-C) qui présentent 3 domaines globulaires (a1, a2 et a3), et dont le domaine a3 est associé à la ss2 microglobuline, les antigènes de classe Il (HLA-DP, HLA-DQ et HLA-DR) et les antigènes de classe III (complément).

Les antigènes de classe 1 comprennent, outre les antigènes précités, d'autres antigènes, dits antigènes de classe 1 non classiques, et notamment les antigènes HLA-E, HLA-F et HLA-G ; ce dernier, en particulier, est exprimé par les trophoblastes extravilleux du placenta humain normal.

La séquence du gène HLA-G (gène HLA-6. 0) a été décrite par
GERAGHTY et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987,84, 9145-9149) : il comprend 4396 paires de bases et présente une organisation intron/exon homologue à celle des gènes HLA-A, -B et -C. De manière plus précise, ce gène comprend 8 exons, 7 introns et une extrémité non traduite 3' ; les 8 exons correspondent respectivement à : 1 : séquencesignal, exon 2 : domaine extracellulaire a1, exon 3: domaine extracellulaire a2, exon 4: domaine extracellulaire a3, exon 5: région transmembranaire, exon 6: domaine cytoplasmique I, exon 7 : domaine cytoplasmique Il (non traduit), exon 8: domaine cytoplasmique III (non traduit) et région 3' non traduite (GERAGHTY et al., précité ; ELLIS et al., J. Immunol., 1990, 144, 731-735 ; KIRSZENBAUM M. et al., Oncogeny of hematopoiesis. Aplastic anemia Eds.

E. Gluckman, L. Coulombel, Colloque INSERM/John Libbey Eurotext Ltd).

Toutefois, le gène HLA-G diffère des autres gènes de classe I, en ce que le codon de, terminaison de traduction, en phase, est localisé au niveau du deuxième codon de l'exon 6 ; en conséquence, la région cytoplasmique de la

protéine codée par ce gène HLA-6. 0 est plus courte que celle des régions cytoplasmiques des protéines HLA-A, -B et -C.

Ces antigènes HLA-G sont essentiellement exprimés par les cellules cytotrophoblastiques du placenta et sont considérés comme jouant un rôle dans la protection du f#tus (absence de rejet par la mère). En outre, dans la mesure où l'antigène HLA-G est monomorphique, il peut également être impliqué dans la croissance ou la fonction des cellules placentaires (KOVATS et al., Science, 1990, 248, 220-223).

D'autres recherches concernant cet antigène non classique de classe # (ISHITANI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89,3947-3951) ont montré que le transcrit primaire du gène HLA-G peut être épissé de plusieurs manières et produit au moins 3 ARNm matures distincts : le transcrit primaire d'HLA-G fournit une copie complète (G1) de 1 200 pb, un fragment de 900 pb (G2) et un fragment de 600 pb (G3).

Le transcrit G1 ne comprend pas l'exon 7 et correspond à la séquence décrite par ELLIS et al. (précité), c'est-à-dire qu'il code une protéine qui comprend une séquence signal, trois domaines externes, une région transmembranaire et une séquence cytoplasmique. L'ARNm G2 ne comprend pas l'exon 3, c'est-à-dire qu'il code une protéine dans laquelle les domaines [alpha]1 et a3 sont directement joints ; l'ARNm G3 ne contient ni l'exon 3, ni l'exon 4, c'est-à-dire qu'il code une protéine dans laquelle le domaine a1 et la séquence transmembranaire sont directement joints.

L'épissage qui prévaut pour l'obtention de l'antigène HLA-G2 entraîne la jonction d'une adénine (A) (provenant du domaine codant a1) avec une séquence AC (issue du domaine codant a3), ce qui entraîne la création d'un codon AAC (asparagine) à la place du codon GAC (acide aspartique), rencontré au début de la séquence codant le domaine a3 dans HLA-G1.

L'épissage généré pour l'obtention de HLA-G3 n'entraîne pas la formation d'un nouveau codon dans la zone d'épissage.

Les Auteurs de cet article ont également analysé les différentes protéines exprimées : les 3 ARNm sont traduits en protéine dans la lignée cellulaire .221-G.

Les Auteurs de cet article concluent à un rôle fondamental de la molécule HLA-G dans la protection du f#tus vis-à-vis d'une réponse immune maternelle (induction d'une tolérance immune). Toutefois, il est précisé que le rôle de la protéine G3, qui ne contient pas le domaine a3 n'est pas établi.

Certains des Inventeurs ont montré l'existence d'autres formes épissées d'ARNm d'HLA-G : le transcrit HLA-G4, qui n'inclut pas l'exon 4 ; le transcrit HLA-G5, qui inclut l'intron 4, entre les exons 4 et 5, provoquant ainsi une modification du cadre de lecture, lors de la traduction de ce transcrit et en particulier l'apparition d'un codon stop, après l'acide aminé 21 de l'intron 4 ; et le transcrit HLA-G6, possédant l'intron 4, mais ayant perdu l'exon 3 (KIRSZENBAUM M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 4209-4213 ; Demande Européenne EP 0 677 582 ; KIRSZENBAUM M. et al., Human Immunol., 1995,43, 237-241 ; MOREAU P. et al., Human Immunol.

1995,43, 231-236) ; ils ont également montré que ces différents transcrits sont exprimés dans plusieurs types de cellules humaines foetales et adultes, notamment dans les lymphocytes (KIRSZENBAUM M. et al., Human Immunol., 1995, précité ; MOREAU P. et al., Human Immunol. 1995, précité).

Il existe donc au moins 6 ARNms HLA-G différents qui codent potentiellement 6 isoformes d'HLA-G dont 4 membranaires (HLA-G1, G2, G3 et G4) et 2 solubles G5 et G6.

Bien que le f#tus puisse être considéré comme une semiallogreffe, les cellules f#tales survivent et ne sont pas rejetées, par la mère ; il est apparu que les molécules HLA-G, exprimées à la surface des trophoblastes protègent les cellules f#tales de la lyse par les cellules natural killer (NK) maternelles (CAROSELLA E. D. et al., C. R. Acad. Sci., 318,827- 830 ;CAROSELLA E. D. et al ; Immunol. Today, 1996, 407-409).

Des études antérieures ont montré que l'expression des molécules HLA-G à la surface de cellules cibles permet de protéger lesdites cellules cibles de l'activité lytique des cellules NK de la couche déciduale de l'endomètre maternel (CHUMBLEY G. et al., Ce// Immunol., 1994, 155, 312- 322 ;DENIZ G. et al., J. Immunol., 1994, 152, 4255-4261). Il est à noter que

ces cellules cibles sont obtenues par transfection avec des vecteurs comprenant l'ADN génomique de HLA-G, générant potentiellement tous les transcrits alternatifs.

Les cellules NK expriment des récepteurs des molécules du
CMH de classe 1 (killer inhibitory receptors ou KIR ou NKIR pour récepteurs inhibiteurs NK), qui sont responsables de l'inhibition de la cytotoxicité, lorsque ces molécules HLA, agissant comme ligands, sont reconnues par ces récepteurs ; par exemple, N. ROUAS-FREISS et al. (PNAS, 1997,94, 5249-
5254) ont montré que l'expression de HLA-G protégeait de la lyse, les cellules cibles K562 (lignée cellulaire érythroleucémique), transfectées par le gène
HLA-G ; ces cellules sont habituellement sensibles aux cellules NK. Dans cet article, certains des inventeurs ont également montré que l'expression du domaine a1 d'HLA-G, dans lesdites cellules cibles transfectées, était nécessaire et suffisant pour inhiber la fonction NK. Certains des Inventeurs ont aussi montré que les cellules NK n'expriment aucun transcrit HLA-G, ce résultat confirmant que les produits d'expression du gène HLA-G jouent un rôle dans l'immunotolérance (TEYSSIER M. et al., Nat. Immunol., 1995,14, 262-270).

Les Inventeurs, poursuivant leurs travaux ont montré que certaines tumeurs solides exprimaient l'antigène HLA-G, que selon les lignées tumorales, le profil d'expression des isoformes d'HLA-G membranaires et solubles était différent et que la présence des formes membranaires HLA-G1G4 protégeait les cellules tumorales de la lyse induite par les cellules NK (demande FR 2 775 294).

Poursuivant leurs travaux, certains des Inventeurs ont maintenant trouvé un nouveau transcrit alternatif du gène HLA-G, codant une nouvelle isoforme soluble d'HLA-G, dénommée HLA-G7.

La présente invention a pour objet, une séquence d'ADNc, issue d'un ARNm du gène HLA-G humain du complexe majeur d'histocompatibilité, isolé à partir de cellules humaines de type trophoblastique, caractérisée :

# en ce qu'elle code une isoforme d'HLA-G soluble dénommée isoforme HLA-G7 et # en ce qu'elle présente la séquence SEQ ID NO :1, qui comprend de 5' en 3' : - une séquence codant le peptide signal (exon 1), - une séquence codant le domaine a1 (exon 2), - une séquence correspondant à l'extrémité 5' de l'intron 2 codant 2 acides aminés, respectivement (Ser et Glu), immédiatement suivie d'un codon stop.

Cet ADNc code une nouvelle isoforme d'HLA-G, comportant uniquement le domaine [alpha]1 de la molécule HLA-G ainsi que deux acides aminés C-terminaux codés par l'intron 2 du gène HLA-G, qui sont spécifiques de cette isoforme ; fait de l'arrêt prématuré de la traduction au sein de l'intron 2, cette nouvelle isoforme ne comporte pas les domaines a2 et a3 codés respectivement par l'exon 3 et l'exon 4, ni le domaine transmembranaire codé par l'exon 5, permettant son ancrage à la membrane cellulaire, ni le domaine cytoplasmique codé par l'exon 6, ce qui l'assimile à une isoforme HLA-G3 soluble, ne comportant que le domaine fonctionnel a1 de la molécule HLA-G3 additionné de deux acides aminés codés par l'intron 2.

La présente invention a également pour objet un fragment d'un ARNm du gène HLA-G humain du complexe majeur d'histocompatibilité, isolé à partir de cellules humaines de type trophoblastique, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence SEQ ID NO : 1 telle que définie ci-dessus et en ce qu'il présente la SEQ ID NO : 2 qui contient successivement de 5' en 3' : 17nucléotides non-codants, l'exon 1, l'exon 2 et 85 nucléotides de l'extrémité 5' de l'intron 2 d'HLA-G.

L'ARNm codant l'isoforme HLA-G7 (transcrit HLA-G7) résulte d'un épissage alternatif nouvellement caractérisé et inclut l'intron 2, provoquant ainsi une modification du cadre de lecture, lors de la traduction de ce transcrit et l'apparition d'un codon stop après l'acide aminé 2 de l'intron 2.

Les Inventeurs ont montré que de manière inattendue, un tel transcrit est détecté abondamment dans les cellules de trophoblaste, de placenta, de la membrane amniotique, dans les cellules épithéliales du thymus humain ainsi que dans les biopsies de lésions tumorales de mélanomes, de cancer du rein et de cancer du sein. Ce transcrit n'est pas détecté dans d'autres types de tissus sains de l'adulte, en particulier la peau et les cellules mononucléées du sang périphérique, ainsi que dans des tissus d'origine materno-f#tale tels que le cordon ombilical et le foie foetal de premier trimestre de gestation.

La présente invention a également pour objet des fragments de la séquence SEQ ID NO :2, caractérisés en ce qu'ils permettent la détection spécifique du transcrit HLA-G7 (sonde ou amorce) et en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par : a) la SEQ ID NO :3 qui correspond à la jonction exon 2intron 2 spécifique du transcrit HLA-G7 (positions 348 à 453) de la SEQ ID NO :2), b) les séquences SEQ ID NO : 5 et 6 et c) les séquences nucléotidiques complémentaires des séquences précédentes, les fragments d'au moins 15 nucléotides issus des séquences précédentes et leurs séquences complémentaires.

Au sens de la présente invention, on entend par séquence nucléique ou séquence nucléotidique, l'une des séquences telle que définie ci-dessus, sous forme ARN ou ADN ainsi que leurs séquences complémentaires (séquences anti-sens).

Ces fragments sont utilisés comme sonde ou comme amorce pour détecter ou pour amplifier spécifiquement le transcrit HLA-G7.

Des paires d'amorces préférées sont les suivantes : - paire A : SEQ ID NO :4 et SEQ ID NO : 5 qui génère un produit d'amplification de 346 pb et - paire B : SEQ ID NO :4 et SEQ ID NO :6 qui génère un produit d'amplification de 311pb.

La présente invention a également pour objet un oligonucléotide antisens, caractérisé en ce qu'il est apte à inhiber la transcription d'un transcrit HLA-G et en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences d'au moins 15 nucléotides complémentaires de la
SEQ ID NO : 2.

La présente invention a également pour objet l'utilisation de l'oligonucléotide tel que défini ci-dessus pour la préparation d'un médicament apte à rompre la tolérance immune, destiné au traitement des tumeurs exprimant au moins un transcrit HLA-G.

La présente invention a également pour objet une protéine
HLA-G isolée et éventuellement purifiée, dénommée protéine HLA-G7 soluble, caractérisée : - en ce qu'elle est codée par la séquence SEQ ID NO :1 telle que définie ci-dessus, - en ce qu'elle est constituée par le domaine [alpha]1 de la molécule HLA-G, suivi de 2 acides aminés codés par l'intron 2 du gène HLAG, - en ce qu'elle est soluble et - en ce qu'elle correspond à la séquence SEQ ID NO :7.

Les Inventeurs ont montré que le transcrit HLA-G7, inséré dans un vecteur d'expression et transfecté dans des cellules humaines, produit une protéine dont la taille correspond à celle d'une protéine ne possédant que le domaine [alpha]1 d'HLA-G.

Les Inventeurs ont trouvé, de manière inattendue, que ladite protéine, dénommée isoforme HLA-G7 soluble, qui ne comprend que le domaine [alpha]1 présente néanmoins des propriétés immunomodulatrices et joue un rôle important dans l'inhibition des fonctions immunes, associée aux états de tolérance physiologiques (tolérance foeto-maternelle) ou pathologiques (tumeurs, maladies autoimmunes).

Les Inventeurs ont ainsi montré que : chez des femmes qui, du fait d'une mutation à l'état homozygote, ont perdu la capacité de coder pour les isoformes HLA-G

comportant des domaines autres que le domaine a1, le maintien de la grossesse est lié à la capacité de coder pour les isoformes HLA-G3 et HLA-
G7. Chez ces patientes, ces deux isoformes comportant uniquement le domaine a1, parmi les domaines extracellulaires, inhibent les fonctions immunes et permettent l'établissement de la tolérance foeto-maternelle, - chez des patientes présentant une pathologie de grossesse telle que la pré-éclampsie, on observe un déficit d'HLA-G, - le transcrit HLA-G7 est abondant dans le thymus, le trophoblaste, la membrane amniotique, dans certaines tumeurs du sein, en particulier chez des patientes jeunes, ainsi que dans certains mélanomes et - la transcription de cette isoforme HLA-G7 est activée sous l'effet de divers stimuli, dont l'IL 10, l'interféron p, le stress (thermique et métaux lourds), le traitement au butyrate et aux agents déméthylants.

L'isoforme HLA-G7 présente les avantages suivants : - elle est soluble et donc facile à produire et à purifier et - contrairement aux autres isoformes HLA-G solubles (HLAG5 et HLA-G6), elle ne comprend que le domaine effecteur de l'inhibition des fonctions immunes et notamment de l'inhibition de l'activité cytotoxique des lymphocytes T et des cellules NK, - contrairement aux autres isoformes HLA-G solubles, elle ne comprend pas le domaine a3 et n'est pas associée à la p2 microglobuline ; elle peut donc être purifiée sous sa forme native, sans avoir besoin de coexprimer la ss2 microglobuline.

En conséquence, l'isoforme HLA-G7 isolée, telle que définie ci-dessus est parfaitement adaptée à la préparation d'un médicament immunomodulateur, vis-à-vis des cellules NK, T cytotoxiques, des monocytes, des macrophages, des cellules dendritiques, des cellules B ou bien d'autres cellules effectrices possédant un récepteur qui utilise le domaine [alpha]1 d'HLA-G comme ligand. En outre, elle peut-être utilisée dans des procédés de détection, de ciblage, de déplétion, d'isolement et de modulation (activation ou inhibition) de l'activité des dites cellules effectrices qui reposent sur

l'interaction récepteur/ligand desdites cellules avec le domaine a1 de ladite protéine HLA-G isolée.

La présente invention a également pour objet des peptides spécifiques d'HLA-G7 caractérisés en ce qu'ils présentent la séquence X-Ala-
Ser-Glu, où X est un fragment de 3 à 112 acides aminés issu de la séquence de la protéine HLA-G7 (SEQ ID NO :7), de préférence ledit fragment correspond à la séquence C-terminale de l'exon 2 d'HLA-G.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite protéine HLA-G7, les peptides tels que définis ci-dessus ou des peptides d'au moins 6 acides aminés issus de la séquence de ladite protéine HLA-G7 (SEQ
ID NO :7) ne comprenant pas la séquence Ala-Ser-Glu sont muftimérisés sous-forme de tétramère; la forme multimérique présente une meilleure affinité pour ses récepteurs que la forme monomérique de ladite protéine ou desdits peptides.

Au sens de la présente invention on entend par peptide aussi bien la protéine HLA-G7 sous forme monomérique ou multimérique, que des fragments de ladite protéine : soit des fragments d'au moins 6 acides aminés comprenant la séquence Ala-Ser-Glu sous forme monomérique ou multimérique ou bien des fragments d'au moins 6 acides aminés ne comprenant pas la séquence Ala-Ser-Glu uniquement sous forme multimérique.

La préparation dudit peptide multimérisé peut par exemple être obtenue par formation d'un complexe entre des peptides d'HLA-G7 biotinylés et l'extravidine-phycoérythrine (extravidine-PE) ou la streptavidinePE, qui comportent 4 sites de liaison à la biotine, selon les techniques décrites dans Yee et al., J. Immunol., 1999,162, 2227-2234 et Allan et al., J. Exp.

Med., 1999, 1149-1155.

Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit peptide est couplé à une molécule (protéine de fusion d'HLA-G7 ou bien liaison physique ou chimique) sélectionnée dans le groupe constitué par : un marqueur tel qu'un épitope antigénique (par exemple l'épitope V5 :Gly-Lys- Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr), une séquence

polyhistidine ou une molécule de biotine, une molécule cytotoxique (par exemple une toxine bactérienne (toxine diphtérique), une toxine végétale (ricine ou une toxine synthétique) ou des liposomes.

Par exemple, une protéine de fusion d'HLA-G7 avec un peptide antigénique permet, à l'aide d'un anticorps spécifique dudit peptide antigénique, de trier des cellules effectrices possédant un récepteur qui utilise le domaine a1 d'HLA-G comme ligand, à partir d'une population cellulaire hétérogène. Lorsque ladite protéine HLA-G7 est couplée à une molécule toxique, elle permet la destruction spécifique des dites cellules.

Selon encore un mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit peptide est immobilisé sur un support solide. Par exemple, ledit peptide est couplé à des billes magnétiques ou bien il est immobilisé sur une colonne ou une matrice de nickel ou bien sur tout autre support solide capable de lier des séquences polyhistidines.

Le peptide selon l'invention est apte à être reconnu par des anticorps dirigés contre le domaine a1 d'HLA-G ou par des anticorps spécifiques de l'isoforme HLA-G7 et/ou à induire la production de tels anticorps.

Un tel peptide est également apte à se lier au récepteur des cellules effectrices, telles que définies ci-dessus et peut être avantageusement utilisé dans des procédés de détection, de ciblage, de déplétion, d'isolement desdites cellules effectrices et comme médicament immunomodulateur capable d'activer ou d'inhiber l'activité desdites cellules effectrices.

Par exemple, ledit peptide peut être utilisé pour moduler une réponse des cellules NK ou T cytotoxiques, des monocytes, des macrophages, des cellules dendritiques ou des cellules B, notamment : pour limiter le rejet de greffe lors de transplantation d'organe ou de pathologies de la grossesse (avortements à répétition, pré-éclampsie), pour enrayer une réaction auto-immune ou virale, ou bien pour rétablir une réponse antitumorale efficace en cas de cancer.

Afin d'évaluer le rôle de la nouvelle isoforme soluble d'HLA-G (HLA-G7) par rapport aux autres isoformes solubles HLA-G5 et HLA-G6, les
Inventeurs ont cloné dans des vecteurs d'expression, l'ADNc et des fragments issus de cette séquence, codant respectivement la protéine soluble et des peptides HLA-G7, puis ils ont analysé ladite protéine et lesdits peptides produits à partir de cellules contenant lesdits vecteurs.

La présente invention a pour objet une cassette d'expression d'un peptide HLA-G7, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un promoteur convenable lié de façon opérationnel à une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par la séquence SEQ ID NO : 1 et les fragments d'au moins 18 nucléotides issus de cette séquence.

Selon un mode de réalisation avantageux de ladite cassette d'expression, ladite séquence est constituée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par une séquence codant un peptide d'HLA-G7 apte à trier des cellules effectrices ou bien une séquence codant un peptide d'HLAG7 apte à moduler (inhiber ou activer) l'activité desdites cellules effectrices.

Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite cassette d'expression, ladite séquence est associée à au moins une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par : les séquences codant un marqueur tel qu'un épitope antigénique, une séquence polyhistidine ou un site de biotinylation ou bien les séquences codant un peptide cytotoxique.

La cassette d'expression telle que définie ci-dessus peut-être insérée dans des vecteurs d'expression (eucaryote ou procaryote) et dans des vecteurs de recombinaison homologue.

En conséquence, la présente invention a également pour objet un vecteur d'expression (eucaryote ou procaryote) d'un peptide HLA-G7 tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend au moins : une origine de réplication procaryote et/ou eucaryote, un marqueur permettant la sélection des cellules procaryotes et/ou eucaryotes tel qu'un gène de résistance à un antibiotique et la cassette d'expression telle que définie cidessus.

Selon un mode de réalisation avantageux dudit vecteur, la cassette d'expression contient la SEQ ID NO : 1.

Selon encore un autre mode de réalisation avantageux dudit vecteur, il est sélectionné dans le groupe constitué par les vecteurs d'expression procaryotes et les baculovirus recombinants.

La présente invention a également pour objet des cellules procaryotes ou eucaryotes transformées exprimant un peptide HLA-G7 tel que défini ci-dessus, contenant un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus.

De manière avantageuse, les peptides HLA-G7, tels que définis ci-dessus, sont produits et purifiés à partir desdites cellules ; de manière non-limitative la présence d'une séquence polyhistidine permet leur purification, par exemple, sur une colonne de Nickel immobilisé.

Dans le cas où ledit peptide est la protéine HLA-G7 soluble, celle-ci est avantageusement sécrétée dans le milieu extracellulaire des cellules eucaryotes transfectées par les vecteurs d'expression tels que définis ci-dessus, ce qui facilite sa purification.

La présente invention a également pour objet une méthode d'induction de tolérance, chez l'homme ou l'animal, pour le traitement des rejets de greffe et des maladies autoimmunes, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins les étapes suivantes : - le prélèvement d'un échantillon biologique comprenant des cellules à traiter, - la mise en culture desdites cellules, - la transfection desdites cellules par un vecteur d'expression ou un peptide tel que défini ci-dessus et éventuellement la sélection desdites cellules transfectées et - l'injection, chez le patient, des dites cellules transfectées contenant le vecteur d'expression ou le peptide tels que définis ci-dessus .

La présente invention a également pour objet un vecteur de recombinaison homologue, caractérisé en ce qu'il comprend la cassette d'expression tel que défini ci-dessus.

La présente invention a également pour objet un mammifère non-humain recombinant, obtenu à partir du vecteur de recombinaison homologue tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il exprime un peptide
HLA-G7 tel que défini ci-dessus et qu'il porte, intégrée dans son génome, au moins une copie de la cassette d'expression telle que définie ci-dessus
La présente invention a également pour objet des cellules et des organes isolés, issus d'un mammifère non-humain recombinant tel que défini ci-dessus.

Les peptides HLA-G7 tels que définis ci-dessus, qui possèdent des propriétés immunomodulatrices, trouve des applications dans les domaines suivants : - le traitement du rejet de greffe, de pathologies de la grossesse telles que la pré-éclampsie et les avortements à répétition, des maladies autoimmunes et des pathologies inflammatoires telles que les pathologies inflammatoires de la peau (psoriasis) comme décrit pour d'autres isoformes d'HLA-G solubles dans la demande FR 9907736 du 18 juin 1999, - le traitement du cancer, par exemple les tumeurs du sein, du rein et mélanomes, - le diagnostic des mélanomes et des tumeurs du sein (recherche de la protéine HLA-G7 soluble dans le sérum), - le diagnostic des risques d'avortement spontané et des maladies autoimmunes (recherche des anticorps anti-domaine [alpha]1 des isoformes HLA-G) et - la détection, le tri, le ciblage, la déplétion et la modulation de l'activité des cellules effectrices de la réponse immune qui possèdent un récepteur capable de se lier spécifiquement au domaine [alpha]1 des isoformes HLA-G.

En conséquence, la présente invention a également pour objet, l'utilisation d'un peptide HLA-G7 pour l'obtention d'un médicament immunomodulateur (activateur ou suppresseur), vis-à-vis des cellules effectrices de la réponse immune qui possèdent un récepteur capable de se lier spécifiquement au domaine a1 des isoformes HLA-G.

Conformément à l'invention, ledit peptide HLA-G7 est particulièrement adapté au traitement du rejet de greffe, de la pré-éclampsie, du rejet de la grossesse (avortements à répétition), des maladies auto- immunes ou des pathologies inflammatoires.

Selon un mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ledit peptide HLA-G7 soluble est associé à un facteur apte à stimuler son expression.

Selon une disposition avantageuse de ladite utilisation, ledit peptide HLA-G7 est associé à l'interféron p et/ou à l'IL 10.

La présente invention a également pour objet l'utilisation dudit peptide HLA-G7 pour la préparation d'un vaccin anti-tumoral, destiné à la prévention et au traitement des tumeurs exprimant au moins une isoforme d'HLA-G, de tels vaccins induisent la formation d'anticorps dirigés contre le domaine a1 des isoformes HLA-G (HLA-G1 à G7).

La présente invention a également pour objet un anticorps anti-HLA-G7 caractérisé en ce qu'il est obtenu par immunisation de mammifères non-humains avec un peptide HLA-G7, tel que défini ci-dessus.

La présente invention a également pour objet l'utilisation dudit anticorps anti-HLA-G7 pour la préparation d'un médicament anti-tumoral, destiné au traitement des tumeurs exprimant au moins une isoforme d'HLA-G (immunothérapie passive).

La présente invention a en outre pour objet l'utilisation dudit anticorps anti-HLA-G7 soluble, en association avec des facteurs aptes à inhiber l'expression d'HLA-G pour la préparation d'un médicament antitumoral, destiné au traitement des tumeurs exprimant au moins une isoforme d'HLA-G.

La présente invention a en outre pour objet un procédé de détection d'anticorps spécifiques du domaine a1 des isoformes HLA-G solubles dans un échantillon de liquide biologique, notamment le sérum, le liquide amniotique, pleural, péritonéal, séminal ou l'urine, pour la surveillance de patientes enceintes présentant un risque d'avortement spontané et pour la

détection et la surveillance de patients atteints de maladies autoimmunes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) immobilisation sur un support solide, d'un peptide HLA-G7 tel que défini ci-dessus, de préférence multimérisé, purifié et/ou immobilisé sur un support solide, b) mise en contact avec l'échantillon à tester et c) détection du complexe antigène-anticorps éventuellement formé, par une méthode immunochimique.

Parmi les méthodes immunochimiques on peut citer par exemple l'ELISA, le Westem-blot ou une technique mettant en #uvre une puce.

La protéine HLA-G7 qui contrairement aux autres isoformes solubles HLA-G5 et HLA-G6, ne possède que le domaine a1, permet de : détecter, trier, dépléter et moduler l'activité, des cellules qui possèdent un récepteur apte à interagir spécifiquement avec ledit domaine, notamment les cellules NK, les lymphocytes B ou T, les monocytes/macrophages et les cellules dendritiques.

En conséquence, la présente invention a également pour objet un procédé de détection, de tri, de déplétion et de modulation de l'activité, des cellules qui possèdent un récepteur apte à se lier au domaine [alpha]1 des isoformes HLA-G, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact de la population cellulaire à analyser avec un peptide HLA-G7 tel que défini ci-dessus, de préférence multimérisé, purifié et/ou immobilisé sur un support solide, b) addition d'un anticorps anti-HLA-G7 tel que défini cidessus marqué et/ou éventuellement associée à des moyens permettant d'améliorer la sensibilité de la détection du complexe antigène-anticorps formé. c) détection et éventuellement tri des cellules marquées.

Ledit anticorps peut par exemple être couplé à une molécule fluorescente et les cellules marquées sont détectées en microscopie de fluorescence et/ou triées en cytométrie de flux.

La présente invention a également pour objet une méthode de surveillance de l'évolution d'une tumeur exprimant HLA-G7, caractérisée en ce qu'elle comprend le dosage de l'isoforme HLA-G7 soluble à partir du sérum, selon les étapes suivantes : a) incubation du sérum à analyser avec un anticorps anti-
HLA-G7 éventuellement marqué et b) détection du complexe antigène-anticorps formé par une méthode immunochimique, telle que définie ci-dessus.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 illustre la structure du gène HLA-G et des transcrits alternatifs HLA-G1 à G7: la position des amorces utilisées pour l'amplification de ces transcrits est représentée par des flèches et celle des sondes par un trait épais.

- la figure 2 illustre la séquence de l'ADNc codant l'isoforme
HLA-G7 soluble (SEQ ID NO :1): l'ATG et le codon stop sont encadrés, la séquence des amorces et des sondes spécifiques : -22 ATG (SEQ ID NO :8), G. 53F (SEQ ID NO :4), G257, G. i2R (SEQ ID NO :5) et G7E212R (SEQ ID NO : 6) ainsi que le site BamH1de clonage de l'ADNc sont soulignés.

- la figure 3 illustre la détection simultanée du transcrit HLAG7 et des autre transcrits d'HLA-G (HLA-G1 à-G6) dans le foie foetal, le trophoblaste, le placenta, les membranes amniotiques, la peau saine et les cellules mononucléées du sang périphérique de patients), par RT-PCR, en utilisant les amorces spécifiques d'HLA-G7 G.53F (SEQ ID NO :4) et G.i2R (12R; SEQ ID NO :5) ou les amorces communes d'HLA-G G. 257 et G.1004 (1004 ; SEQ ID NO:11). Les produits d'amplification sont séparés par électrophorèse en gel d'agarose et visualisés par Southern blot à l'aide de la sonde G. 257 (exon 2) radiomarquée. Ligne 1 : marqueur de poids moléculaire : ligne 2 et 3 : échantillons distincts de foies foetaux de premier trimestre de gestation ; ligne 4 : trophoblaste de premier trimestre de

gestation ; ligne 5 : trophoblaste de second trimestre de gestation ; ligne 6 : placenta à terme ; lignes 7,8 et 9 : échantillons distincts de membrane amniotique à terme, ligne 10 : échantillon de peau saine, ligne 11 : sang de cordon ombilical et ligne 12 : cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC).

- la figure 4 illustre la détection du transcrit HLA-G7 dans des biopsies de mélanomes issues de six patients (M1 à M6), par RT-PCR, en utilisant les amorces spécifiques d'HLA-G7, G. 53F (SEQ ID NO :4) et
G.i2R (12R SEQ ID NO :5). Les produits d'amplification sont séparés par électrophorèse en gel d'agarose et visualisés par coloration au bromure d'éthidium. HS = peau saine, SM = métastase, HLN = ganglion sain, SPT = tumeur primitive, LNM = ganglion métastatique. Le transcrit ss-actine est utilisé pour normaliser les résultats des différents échantillons.

- la figure 5 correspond à l'exemple de la figure 4 aux seules différences que les autres transcrits d'HLA-G (HLA-G1 à G6) sont détectés simultanément par RT-PCR à l'aide des amorces communes d'HLAG1 à G6, G. 257 et GA. 3U (3. GU) et que la détection des produits d'amplification de tous les transcrits d'HLA-G est effectuée par Southern Blot à l'aide de la sonde G. R (exon 2) radiomarquée. HS = peau saine, SM = métastase, HLN = ganglion sain, SPT = tumeur primitive, LNM = ganglion métastatique. Le transcrit p-actine est utilisé pour normaliser les résultats des différents échantillons.

- la figure 6 illustre la séquence en acides aminés de l'isoforme HLA-G7 : la position des exons 1 et 2 est indiquée et les 2 acides aminés spécifiques de HLA-G7 codés par l'intron 2 sont encadrés.

- la figure 7 illustre la détection en Western blot, à l'aide d'un anticorps spécifique d'un peptide de l'exon 2 d'HLA-G, de la protéine recombinante HLA-G7 exprimée dans les cellules de mélanome M8 (M8-G7) transfectées par le plasmide B4C2. Les cellules de choriocarcinome (JEG-3) et les cellules M8 transfectées par un vecteur contenant un ADNc codant l'ensemble des isoformes HLA-G (M8-gen) sont utilisées comme témoin

positif. Les cellules M8 transfectées par un vecteur vide (M8-pcDNA) sont utilisées comme témoin négatif.

Exemple 1 : Clonage et séquençage d'un ADNc codant l'isoforme HLA-
G7 soluble.

1. 1 Matériels et méthodes
L'ADNc correspondant à l'ensemble des transcrits HLA-G est isolé par RT-PCR à partir de l'ARN extrait de la lignée de choriocarcinome
JEG-3 , provenant de l'ATCC, en utilisant les amorces : -22ATG en 5' (SEQ ID NO :9) :
5' GCTCTAGAGCTCCCCAGACGCCAAGGATG 3'
Xbal et
G3s en 3' [SEQ ID NO :10, (figure 1)] :
5'CGGGATCCGTTAAAGGTCTTCAGAGAGGCTCCT 3
BamH1
Les produits d'amplification sont ensuite digérés par les enzymes de restriction Xbal et BamH1 dont les séquences sont comprises dans les amorces -22ATG et G3s comme indiqué ci-dessus, puis ils sont insérés par ligation dans les sites compatibles du vecteur d'expression eucaryote pcDNA 3.1 Hygro' (Invitrogen). Ce vecteur comprend le promoteur CMV, le gène de résistance à l'ampicilline, pour la sélection des bactéries recombinantes et le gène de résistance à l'hygromycine, pour la sélection des cellules eucaryotes transfectées par un plasmide recombinant.

Après transformation de bactéries E.coli avec le produit de ligation, les colonies contenant le plasmide recombinant, comprenant l'ADNc de l'isoforme HLA-G7 soluble, sont sélectionnées par hybridation avec la sonde G.R localisée dans l'exon 2 du gène HLA-G (figure 1).

L'ADN des colonies positives est extrait et digéré par les enzymes de restriction Nhe # et Hindlll permettant d'exciser l'insert HLA-G7.

La taille du fragment obtenu avec les différents clones est vérifiée par électrophorèse du produit de digestion sur gel d'agarose et coloration au bromure d'éthidium. Puis, la séquence double-brin des clones contenant des

inserts de taille correspondant à celle attendue est déterminée en utilisant les amorces universelles T7 et pcDNA3. 1 BGH (Invitrogen).

1. 2 Résultats
Le clone B4C2 contient un ADNc correspondant à un nouveau transcrit HLA-G, dénommé HLA-G7 dont la séquence (SEQ ID NO : 2) est représentée dans la figure 2. Cet ADNc code pour une nouvelle isoforme d'HLA-G qui comporte uniquement le domaine [alpha]1 de la molécule HLA-G (exon 1), additionné de deux acides aminés C-terminaux codés par l'intron 2 du gène HLA-G qui sont spécifiques de cette isoforme. Cet ADNc ne comporte pas le domaine transmembranaire codé par l'exon 5, ni de domaine cytoplasmique codé par l'exon 6, permettant son ancrage à la membrane cellulaire ; il code pour une nouvelle forme HLA-G7 soluble qui est équivalente à une isoforme HLA-G3 soluble.

Cet ADNc est issu d'un transcrit qui résulte d'un nouvel épissage alternatif d'HLA-G et inclut l'intron 2, provoquant ainsi une modification du cadre de lecture, lors de la traduction de ce transcrit et l'apparition d'un codon stop après l'acide aminé 2 de l'intron 2 (figure 2).

Exemple 2 : Détection des transcrits HLA-G7 dans des tissus normaux ou tumoraux
2. 1 Matériels et méthodes
L'ARN est extrait de différents tissus normaux et tumoraux et les transcrits HLA-G7 sont analysés par RT-PCR; selon le protocole décrit dans la demande WO 98/37098, en utilisant un couple d'amorces spécifiques : # Amorce 5' localisée dans l'exon 1 du gène : G. 53F (SEQ ID NO : 4) 5' CCCTGACCCTGACCGAGACCTGGG 3' # Amorce 3' spécifique du transcrit HLA-G7 localisé dans l'intron 2 : G. i2R (SEQ ID NO :5) 5' GCA TGG AGG TGG GGG TCG TGA 3'
Le produit de 346 pb, généré par RT-PCR, est séparé par électrophorèse en gel d'agarose et visualisé par coloration au bromure d'éthidium. Alternativement, la spécifité des produits amplifiés est confirmé, par Southern Blot, après transfert de l'ADN sur une membrane de

nitrocellulose et hybridation avec la sonde G. 257 (demande FR 2 775 294) spécifique de l'exon 2, radiomarquée (figure 1).

Les autres transcrits d'HLA-G sont analysés en parallèle à l'aide des couples d'amorces suivants qui amplifient les autres transcrits HLAG (G1 à G6), (figure 1):
Couple 1 : - G. 257 (demande FR 98 0207), spécifique de l'exon 2 et - GA. 3U (demande 2 775 294), spécifique de la région 3' non traduite ou
Couple 2 : - G.257 et - G.1004: 5' CCTTTTCAATCTGAGCTCTTCTTT 3' (SEQ ID NO :11), spécifique de la jonction exon 5-exon 6.

De préférence, on utilise le couple G. 257 et G.1004 (couple 2) qui est plus spécifique que le couple 1 car il n'amplifie que les transcrits épissés d'HLA-G. En revanche, le couple 1 amplifie également l'ADN génomique d'HLA-G qui peut éventuellement contaminer les préparations d'ARNm.

Pour la réaction d'amplification PCR, le couple 2 est utilisé dans les conditions suivantes : 1 min à 94 C, 1 min 30 s à 61 C et 2 min à 72 C, pendant 35 cycles.

L'amplification simultanée du transcrit de la p-actine permet de normaliser les résultats obtenus avec les différents échantillons d'ARN.

2.2 Résultats :
2. 2.1 Tissus normaux : Les résultats sont illustrés dans le tableau # et la figure 3.

Tableau I

<tb>
<tb> Tissus <SEP> HLA-G7 <SEP> Autres <SEP> transcrits <SEP> HLA-G
<tb> Membrane <SEP> + <SEP> +
<tb> amniotique
<tb> Trophoblaste <SEP> 1 <SEP> er <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb> trimestre
<tb> Placenta <SEP> à <SEP> + <SEP> +
<tb> terme
<tb> Ganglion- <SEP> G1 <SEP> faible <SEP>
<tb> lymphatique
<tb> Foie <SEP> foetal <SEP> 1er <SEP> - <SEP> trimestre
<tb> Peau <SEP> G1 <SEP> faible
<tb> Thymus <SEP> + <SEP> +
<tb> Sang <SEP> de <SEP> cordon <SEP> - <SEP> @ <SEP> G1 <SEP> faible
<tb> ombilical
<tb> PBMC- <SEP> G1 <SEP> faible
<tb>
<tb>

La distribution du transcrit HLA-G7 suit celle des autres transcrits HLA-G ; le transcrit HLA-G7 est détecté dans les tissus normaux où les autres transcrits HLA-G sont abondamment transcrits (membrane amniotique, placenta, trophoblaste et thymus). En revanche, chez des individus sains, il est absent de tissus ou les autres transcrits d'HLA-G sont détectables (sang de cordon ombilical, ganglions lymphatiques, peau, cellules mononucléées du sang périphérique).

2. 2.2 Tissus tumoraux :
Les résultats sont illustrés dans les figures 4 et 5.

Le transcrit HLA-G7 est détecté dans les biopsies de tumeurs primitives, de ganglions et de tumeurs métastatiques de mélanomes. Dans ces biopsies, la répartition du transcrit HLA-G7 suit celle des autres transcrits HLA-G. ,
Le transcrit est également détecté dans des biopsies de tumeurs du sein.

Ces résultats montrent que dans l'ensemble des tissus tumoraux testés, la répartition du transcrit HLA-G7 suit celle des autres transcrits HLA-G (HLA-G1 à G6).

Exemple 3 : Modulation du taux de transcrits HLA-G7
3. 1 Matériels et méthodes
Les cellules (cultures primaires ou lignées cellulaires) sont traitées par différents agents, dans les conditions suivantes: - L'Interféron p (1000 Ul/ml), pendant 24 h - Le stress thermique : 2 heures à 42 C - Un agent qui modifie le taux d'acétylation des histones ; incubation pendant 24 h, en présence de butyrate (3mM), - Un agent déméthylant ; incubation pendant 72 h, en présence de 5 Aza 2' déoxycitidine (1 M).

L'ARNm total est extrait des cellules 24 heures après l'arrêt du traitement sauf dans le cas du stress thermique où les cellules sont remises en culture pendant 6h ou 30h, avant l'extraction de l'ARNm total. Puis les transcrits spécifiques d'HLA-G7 sont amplifiés par RT-PCR, quantifiés par rapport aux transcrits de l'actine, selon le protocole expérimental décrit à l'exemple 2 et l'augmentation du taux de transcrits HLA-G7, après les différents traitements, est déterminée par rapport au contrôle (échantillon de cellules non-traitées).

3. 2 Résultats
Dans les cultures primaires de mélanomes, les cellules épithéliales thymiques, les cellules amniotiques, les cellules d'explants trophoblastiques issus de placenta de premier trimestre de grossesse et les cellules de ligneé de mélanome M8, la transcription de l'isoforme HLA-G7 est activée par l'interféron p, le stress thermique, et le traitement au butyrate et aux agents déméthylants.

Exemple 4 : Expression et caractérisation de la protéine HLA-G7.

4. 1 Matériels et méthodes
Les ADNc codant les isoformes HLA-G solubles, HLA-G5,
HLA-G6 et HLA-G7 sont clonés dans deux types de vecteurs d'expression eucaryotes :
1) Un vecteur pcDNA3.1 (hygro'. Invitrogen) permettant l'expression des protéines sous le contrôle du promoteur CMV, la sélection des cellules transfectées en présence d'hygromycine et la détection des protéines exprimées.

2) Un vecteur (pEF6/V5-His, Invitrogen) permettant l'expression des protéines sous contrôle du promoteur EF-1alpha, la sélection des cellules transfectées en présence de blasticidine et la purification des protéines recombinantes exprimées grâce aux séquences C-terminales (polyhistidine et épitope V5). En outre, l'introduction d'un site entérokinase entre la séquence d'HLA-G7 et lesdites séquences C-terminales permet, d'éliminer lesdites séquences après la purification de la protéine HLA-G7, par digestion à l'entérokinase.

Les vecteurs recombinants contenant respectivement les ADNc codant les isoformes HLA-G5, G6 et G7 sont construits selon la méthode, décrite à l'exemple 1 pour le vecteur d'expression de l'isoforme HLA-G7 (B4C2). Puis, ils sont transfectées dans deux types de cellules n'exprimant aucun des transcrits HLA-G ;les cellules de mélanome M8 qui expriment uniquement les molécules de classe # classiques et les cellules de Teratocarcinome Tera-2 (ATCC), ainsi que les cellules érythroleucémiques humaines K562 (ATCC) qui n'expriment aucune molécule HLA.

Les extraits protéiques des cellules transfectées sont séparés par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et la protéine HLAG7 est détectée par Western blot à l'aide d'un anticorps spécifique d'un peptide localisé dans l'exon 2 (domaine [alpha]1).

4. 2 Résultats
Ils sont illustrés dans les figures 6 et 7.

Afin de caractériser la protéine codée par le transcrit HLA-G7 (figure 6) et d'évaluer les propriétés de cette nouvelle isoforme par rapport aux autres isoformes solubles, les isoformes solubles HLA-G5, G6 et G7 ont été exprimées dans des cellules eucaryotes. Dans les extraits protéiques de cellules de mélanome M8 transfectées par B4C2, le vecteur d'expression de l'isoforme HLA-G7 soluble, une protéine HLA-G7 de poids moléculaire identique à celui de la protéine HLA-G7 exprimée dans les cellules témoins JEG-3, est détectée en Western-blot, à l'aide d'un anticorps spécifique d'un peptide localisé dans l'exon 2 d'HLA-G (peptide EEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRG, demande WO 96/31604) qui permet la détection spécifique de toutes les isoformes d'HLA-G (figure 7).

Claims

REVENDICATIONS 1 ) Séquence d'ADNc, issue d'un ARNm du gène HLA-G humain du complexe majeur d'histocompatibilité, isolé à partir de cellules humaines de type trophoblastique, caractérisée : # en ce qu'elle code une isoforme d'HLA-G soluble dénommée isoforme HLA-G7 et # en ce qu'elle présente la séquence SEQ ID NO :1.
2 ) Fragment d'un ARNm du gène HLA-G humain du complexe majeur d'histocompatibilité, isolé à partir de cellules humaines de type trophoblastique, caractérisé en ce qu'il comprend la SEQ ID NO : 1 et en ce qu'il présente la SEQ ID NO : 2.
3 ) Fragments de la séquence SEQ ID NO : 2, caractérisés en ce qu'ils permettent la détection spécifique du transcrit HLA-G7 et en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par : a) la SEQ ID NO :3 b) les séquences SEQ ID NO :5 et 6 et c) les séquences nucléotidiques complémentaires des séquences précédentes, les fragments d'au moins 15 nucléotides issus des séquences précédentes et leurs séquences complémentaires.
4 ) Paires d'amorces, caractérisées en ce qu'elles permettent l'amplification spécifique du transcrit HLA-G7 et en ce qu'elles sont sélectionnées dans le groupe constitué par : la paire A : amorces SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 5 et la paire B : amorcesSEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 6.
5 ) Oligonucléotide antisens, caractérisé en ce qu'il est apte à inhiber la transcription d'un transcrit HLA-G et en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences d'au moins 15 nucléotides complémentaires de la SEQ ID NO : 2.
6 ) Utilisation d'un oligonucléotide selon la revendication 5 pour la préparation d'un médicament apte à rompre la tolérance immune, destiné au traitement des tumeurs exprimant au moins un transcrit HLA-G.

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7 ) Protéine isolée, dénommée protéine HLA-G7 caractéri- sée : - en ce qu'elle est codée par la séquence SEQ ID NO :1, en ce qu'elle est constituée par le domaine [alpha]1 de la molé- cule HLA-G, suivi de 2 acides aminés codés par l'intron 2 du gène HLA-G, - en ce qu'elle est soluble et - en ce qu'elle correspond à la séquence SEQ ID NO : 7.
8 ) Peptide caractérisé en ce qu'ils présente la séquence XAla-Ser-Glu, où X est un fragment de 3 à 112 acides aminés issu de la séquence SEQ ID NO :7.
9 ) Protéine selon la revendication 7 ou peptide selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite protéine ou ledit peptide est multimérisé sous-forme de tétramère.
10 ) Peptide, caractérisé en ce qu'ils correspond à un fragment d'au moins 6 acides aminés de la séquence SEQ ID NO : 7 et en ce qu'il est multimérisé sous-forme de tétramère.
11 ) Protéine ou peptide selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que ladite protéine ou ledit peptide est associé à une molécule sélectionnée dans le groupe constitué par : un marqueur, un agent cytotoxique, ou des liposomes.
12 ) Protéine ou peptide selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce ledit peptide est immobilisé sur un support solide.
13 ) Cassette d'expression d'une protéine ou d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un promoteur convenable lié de façon opérationnelle à la séquence SEQ ID NO : 1 ou à un fragment d'au moins 18 nucléotides issu de cette séquence.
14 ) Cassette d'expression selon la revendication 13, caractérisée en ce que ladite séquence comprend au moins une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par : les séquences codant un marqueur ou les séquences codant un peptide cytotoxique.

<Desc/Clms Page number 27>
15 ) Vecteur d'expression d'une protéine ou d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend au moins : une origine de réplication procaryote et/ou eucaryote, un marqueur permettant la sélection de cellules procaryotes et/ou eucaryotes et une cassette d'expression selon la revendication 13 ou la revendication 14.
16 ) Vecteur d'expression selon la revendication 15, caracté- risé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les vecteurs d'expression procaryotes et les baculovirus recombinants.
17 ) Vecteur d'expression selon la revendication 15 ou la revendication 16, caractérisé en ce que ladite cassette d'expression correspond à la séquence SEQ ID NO : 1.
18 ) Cellules transformées, caractérisées en ce qu'elles expriment une protéine ou un peptide selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 et en ce qu'elles contiennent un vecteur d'expression d'HLA-G selon l'une quelconque des revendications 15 à 17.
19 ) Vecteur de recombinaison homologue, caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression selon la revendication 13 ou la revendication 14.
20 ) Mammifère non-humain recombinant, caractérisé en ce qu'il exprime une protéine ou un peptide selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 et en ce qu'il porte, intégré dans son génome, au moins une copie de la cassette d'expression selon la revendication 13 ou la revendication 14.
21 ) Organes isolés, caractérisés en ce qu'ils expriment une protéine ou un peptide selon l'une quelconque des revendications 7 à 11et en ce qu'ils sont issus d'un mammifère non-humain recombinant selon la revendication 20.
22 ) Cellules isolées, caractérisées en ce qu'elles expriment une protéine ou un peptide selon l'une quelconque des revendications 7 à 11 et en ce qu'elles sont issues d'un mammifère non-humain recombinant selon la revendication 20.

<Desc/Clms Page number 28>
23 ) Utilisation d'une protéine ou d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 7 à 11 pour l'obtention d'un médicament à visée immunomodulatrice.
24 ) Utilisation selon la revendication 23, caractérisée en ce que ledit médicament est destinée au traitement du rejet de greffe, du rejet de grossesse, de la pré-éclampsie, des maladies auto-immunes ou des patho- logies inflammatoires.
25 ) Utilisation selon la revendication 23 ou la revendication

24, caractérisée en ce que ladite protéine ou ledit peptide est associé à un facteur apte à stimuler son expression.
26 ) Utilisation selon la revendication 25, caractérisée en ce que ladite protéine ou ledit peptide est associée à l'interféron ss et/ou à l'IL 10.
27 ) Utilisation d'une protéine ou d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 7 à 11 pour la préparation d'un vaccin antitumoral, destiné à la prévention et au traitement des tumeurs exprimant au moins une isoforme d'HLA-G.
28 ) Anticorps, caractérisé en ce qu'il reconnaît spécifiquement le domaine [alpha]1 d'HLA-G et en ce qu'il est obtenu par immunisation de mammifères non-humains avec la protéine ou le peptide selon l'une quelconque des revendications 7 à 11.
29 ) Utilisation d'un anticorps selon la revendication 28 pour la préparation d'un médicament anti-tumoral, destiné au traitement des tumeurs exprimant au moins une isoforme d'HLA-G.
30 ) Utilisation selon la revendication 29, caractérisée en ce que ledit anticorps est associé à des facteurs aptes à inhiber l'expression d'une isoforme d'HLA-G.
31 ) Procédé de détection d'anticorps spécifiques du domaine [alpha]1 des isoformes HLA-G solubles dans un échantillon de liquide biologique, pour la surveillance de patientes enceintes présentant un risque d'avortement spontané et pour la détection, la surveillance et le monitoring de patients atteints de maladies autoimmunes, caractérisé en ce qu'il comprend les étape suivantes :

<Desc/Clms Page number 29>

a) immobilisation sur un support solide, d'une protéine ou d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 7 à 12, b) mise en contact avec l'échantillon à tester et c) détection du complexe antigène-anticorps éventuellement formé, par une méthode immunochimique.
32 ) Procédé de détection, de tri, de déplétion et de modulation de l'activité, des cellules qui possèdent un récepteur apte à se lier au domaine [alpha]1 des isoformes d'HLA-G, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact de la population cellulaire à analyser avec une protéine ou un peptide HLA-G selon l'une quelconque des revendications 7 à 12, b) addition d'un anticorps anti-HLA-G selon la revendication 28 marqué et/ou éventuellement associée à des moyens permettant d'améliorer la sensibilité de la détection du complexe antigène-anticorps formé et c) détection et éventuellement tri des cellules marquées.
33 ) Méthode de surveillance de l'évolution d'une tumeur exprimant une protéine selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle comprend le dosage de ladite protéine HLA-G7 soluble à partir du sérum, selon les étapes suivantes: a) incubation du sérum à analyser avec un anticorps selon la revendication 28, éventuellement marqué et b) détection du complexe antigène-anticorps formé par une méthode immunochimique.