DE69829587T2

DE69829587T2 - Nukleinsäuremoleküle, die mit dem schwachen rhesus-d phänotyp korrelieren

Info

Publication number: DE69829587T2
Application number: DE69829587T
Authority: DE
Inventors: A. Willy FLEGEL; F. Franz WAGNER
Original assignee: Drk Blutspendedienst Bw; DRK Blutspendedienst Baden Wuerttermberg Hessen gGmbH
Current assignee: DRK Blutspendedienst Baden Wuerttermberg Hessen gGmbH
Priority date: 1998-01-23
Filing date: 1998-12-18
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2018-12-19
Also published as: ES2241195T3; AU2274699A; CA2318486A1; US7005276B1; WO1999037763A3; EP1047777B1; WO1999037763A9; EP1047777A2; IL137424A0; AU748222B2; WO1999037763A2; ATE292176T1; BR9815090A; PT1047777E; CA2318486C; DE69829587D1; JP2002500884A; BRPI9815090B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Nucleinsäuremoleküle, die ein Rhesus-D-Antigen codieren, das zu dem schwachen D-Phänotyp beiträgt, und die durch eine oder eine Kombination von Missense-Mutationen gekennzeichnet sind. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Vektoren, die die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle umfassen, mit den Vektoren transformierte Wirte, durch die Nucleinsäuremoleküle codierte Proteine und Verfahren zur Produktion solcher Polypeptide. Die Tatsache, dass Missense-Mutationen und die vorstehend angesprochene Konversion direkt mit dem schwachen D-Phänotyp korrelieren können, hat eine bedeutende Auswirkung auf das routinemäßige Testen von Blutproben. Zum Beispiel können nun Oligonucleotide und Antikörper entworfen werden, die im Allgemeinen den Nachweis von schwachen D-Phänotypen in einer Probe erlauben. Solche Oligonucleotide und Antikörper gehören ebenso wie eine Vielzahl von diagnostischen Verfahren zum Umfang der vorliegenden Erfindung. Durch die neuartigen Nucleinsäuremoleküle codierte RhD-Antigene können für die Charakterisierung, Standardisierung und Qualitätskontrolle von monoclonalen und polyclonalen anti-D-Antiseren verwendet werden. Schließlich betrifft die Erfindung einen Kit, der bei dem Testen auf die Anwesenheit von schwachen D-Phänotypen von Nutzen ist.
Das durch das RhD-Protein getragene Rhesus D-Antigen (ISBT 004.001; RH1) ist das wichtigste durch ein Protein bestimmte Blutgruppenantigen. Es ist immer noch die häufigste Ursache für die hämolytische Erkrankung von Neugeborenen (Mollison et al., 1993). Etwa 0,2% bis 1% der weißen Bevölkerung weisen Erythrocyten mit einer reduzierten Expression des D-Antigens auf (schwaches D, früher D^u) (Mourant et al., 1976; Stratton, 1946; Wagner et al., 1995). Ein kleiner Anteil von schwachen D-Proben wird durch qualitativ veränderte RhD-Proteine erklärt, die partielles D genannt (Salmon et al., 1984) und häufig durch RHD/RHCE-Hybridallele verursacht werden (kürzlich zusammengefasst in Huang, 1997). Ein weiterer Anteil wird durch die unterdrückenden Wirkungen von Cde-Haplotypen in trans-Position verursacht (Ceppellini et al., 1955). Diese schwachen D besitzen wahrscheinlich das normale RHD-Allel, da die Eltern und Kinder der Träger oft eine normale RhD-Antigendichte zeigen. Solche schwachen D zeigen nur eine geringe Reduktion der RhD-Antigen-Expression, werden unpräzise als „hochgradige D^u" bezeichnet und werden heutzutage aufgrund der erhöhten Sensitivität von monoclonalen anti-D-Antikörpern oft als normale RhD typisiert.
Die Mehrzahl des moderat bis stark geschwächten Antigens D wird wegen seines/ihrer Genotyps/Genotypen entweder in dem Rhesus-Genlocus selbst oder in der Nähe lokalisiert, weil die schwache D-Expression gemeinsam mit dem RhD-Phänotyp vererbt wird (Stratton, 1946). Neben der rein quantitativen Reduzierung konnten keine qualitativen Unterschiede in dem RhD-Antigen dieses am häufigsten vorkommenden schwachen D beobachtet werden. Zwei neuere Untersuchungen zielten auf die molekulare Ursache für die vorherrschenden schwachen D-Phänotypen ab. Beide Gruppen, Rouillac et al. (1996) und Beckers et al. (1997), führten RT-PCR durch und fanden bei der Sequenzierung der RHD-cDNA aus schwachen D-Proben keine Mutationen. Unter der Verwendung von semiquantitativer RT-PCR berichteten Rouillac et al. (1996) von reduzierten Dauerzustandsmengen von RHD-Transkripten in schwachen D-Proben und offenbarten, dass ihre Beobachtungen direkte Hinweise dafür lieferten, dass zwischen normalen und schwachen D-Erythrocyten ausschließlich quantitative Unterschiede hinsichtlich RhD bestehen. In einem ähnlichen Ansatz fanden jedoch Beckers et al. (1995 und 1997) keine Unterschiede in den Mengen der RHD-Transkripte und schlossen einen Überschuss an Spleißvarianten aus (Kajii et al., 1995), deren Produkte in unzureichender Weise oder überhaupt nicht in die Membran der Blutkörperchen eingebaut werden können (Beckers et al., 1997). Sie schlossen daraus, dass schwaches D nicht durch regulatorische Defekte des Transkriptionsvorganges verursacht wird und vermuteten unidentifizierte regulatorische Gene oder Faktoren, die an dem Rh-verwandten Komplex beteiligt sind, als mögliche Ursachen für schwaches D. Da somit der Mechanismus der schwachen D-Expression fragwürdig blieb, war keine molekulare Ursache etabliert.
Die Durchsuchung von zufälligen schwachen D-Proben durch PCR auf RHD-spezifische Polymorphismen bestätigte die PCR-Amplifikationsmuster, die ein normales RHD-Allel repräsentieren (Avent et al., 1997b; Legler et al., 1997). Es häuften sich jedoch die Hinweise, dass sehr wenige schwache D, von denen nicht bekannt war, dass sie partielles D repräsentieren, strukturell anomale RHD-Allele tragen könnten: Vier von 44 schwachen D aus England fehlten RHD-spezifische Intron 4-PCR-Amplikons (Avent et al., 1997b) und einem von 94 schwachen D aus dem Norden Deutschlands fehlten RHD-spezifische Exon 5-PCR-Amplikons (Legler et al., 1997). In der letzteren Probe war das Nucleotid T an Position 667 durch das RHCE-spezifische G substituiert, was einen F223V-Aminosäureaustausch codiert (TJ Legler und A Humpe, persönliche Mitteilung).
Somit wurden fehlerhafte Allele nur in einem kleinen Anteil von schwachen D-Phänotypen beobachtet, was die Möglichkeit unwahrscheinlich macht, dass diese Veränderungen auf molekularer Ebene tatsächlich für das allgemeine Phänomen des schwachen D-Phänotyps verantwortlich sind; siehe auch Aubin et al., 1997; Avent et al., 1997b; Fukumori et al., 1997; Huang, 1997; Issitt und Telen, 1996; Roubinet et al., 1996. Folglich ist der zusammengefasste Stand der Technik bis hierhin daran gescheitert, ein in geeigneter Weise anwendbares und verlässliches Mittel bereitzustellen, um den schwachen D-Phänotyp in einer Probe nachzuweisen.
Dementsprechend war es das technische Problem, das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, ein solches Mittel ebenso wie Verfahren zu etablieren, die in geeigneter und breiter Weise bei der Analyse des schwachen Rhesus D-Phänotyps angewendet werden können.
Die Lösung des technischen Problems wird durch die Bereitstellung der in den Ansprüchen charakterisierten Ausführungsformen erreicht. Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Nucleinsäuremolekül, das ein Rhesus-D-Antigen codiert, welches zu dem schwachen D-Phänotyp beiträgt oder Indikativ dafür ist, wobei das Nucleinsäuremolekül verglichen mit dem Wildtyp-Rhesus-D-Antigen mindestens eine Missense-Mutation in seinen Transmembran- und/oder seinen intrazellulären Bereichen trägt.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung impliziert der Ausdruck „zu dem schwachen D-Phänotyp beiträgt" eine aktive Rolle der Mutation, welche durch einen Aminosäureaustausch hervorgerufen sein kann, wohingegen der Ausdruck „indikativ für den schwachen D-Phänotyp" nicht notwendigerweise eine solche Rolle impliziert, sondern sich auch auf eine stille Mutation beziehen kann. Eine solche stille Mutation kann zum Beispiel in Verbindung mit anderen Mutationen wie Missense-Mutationen vorkommen, welche hier nachstehend genauer betrachtet werden.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass die beobachteten Missense-Mutationen mit einer reduzierten Integration von RhD-Protein in die Membranen von Erythrocyten nicht nur in Zusammenhang stehen, sondern diese wirklich verursachen. Somit wird durch die vorliegende Erfindung gezeigt, dass (i) sich schwache D-Allele unabhängig in den verschiedenen Haplotypen entwickelt haben, wobei jedes einzelne Ereignis mit einer Veränderung in der codierenden RhD-Sequenz in Zusammenhang steht; (ii) trotz der Beobachtung von 16 verschiedenen Allelen in 164 Proben keine Probe mit einer normalen codierenden Sequenz vorkam; und (iii) die Art und die Verteilung der beobachteten Nucleotidaustausche nicht mit den Null-Hypothesen von zufälligen Veränderungen vereinbar waren.
Die Erkenntnis, dass Missense-Mutationen in RHD zu einer reduzierten D-Antigen-Expression führten, passte in das gegenwärtige Modell der RhD-Membranintegration; siehe Tabelle 7. Beide Rh-Proteine kommen in einem Komplex mit dem Rh50-Protein vor, an welchen verschiedene weitere Proteine wie LW, CD47 und Glycophorin B binden können (Huang, 1997). Die Expression des gesamten Rh-Komplexes hängt von der Unversehrtheit von mindestens einem Rh-Protein (JP Cartron, mündliche Präsentation auf der ISBT/DGTI-Konferenz, Frankfurt, September 1997) und dem Rh50-Protein ab (Cherif-Zahar et al., 1996). Durch Missense-Mutationen hervorgerufene geringe strukturelle Änderungen in dem Rh50-Protein reichen aus, um die Expression des Rh-Komplexes zu verhindern (Cherif-Zahar et al., 1996). In ähnlicher Weise scheinen auch geringe strukturelle Veränderungen in dem RhD-Protein die Expression des Rh-Komplexes einschließlich RhD zu beeinflussen.
Auf der Basis der Verteilung und der Art der Aminosäureaustausche kann nun ein allgemeines Bild der Beziehung zwischen der RhD-Struktur und der RhD-Expression erstellt werden: Alle Aminosäureaustausche im schwachen D befinden sich in den intrazellulären oder Transmembran-Bestandteilen des RhD-Proteins, bei dem die Anordnung in Übereinstimmung mit dem vorstehend erwähnten gegenwärtigen Modell durchgeführt wurde (siehe Tabelle 7). Bekannte RHD-Allele mit exofazial gelegenen Substitutionen (Avent et al., 1997a; Jones et al., 1997; Liu et al., 1996; Rouillac et al., 1995) wurden aufgrund ihres partiellen D-Antigens entdeckt, können aber deutliche (DNU und D^VII) bis moderate (D^II, DHR und DHMi) Abnahmen in der RhD-Expression zeigen (Flegel und Wagner, 1996; Jones et al., 1997; Jones et al., 1996). Die meisten in Zusammenhang mit dieser Erfindung berichteten Substitutionen waren nicht konservativ und die eingeführten Aminosäuren, besonders Prolin, zerstörten wahrscheinlich die Sekundär- oder Tertiärstruktur. Zwei schwache D-Allele (Typ 2 und 11) wurden mit konservativen Substitutionen in Verbindung gebracht, was darauf hindeutet, dass die betroffenen Aminosäureregionen an den Positionen 295 und 385 für eine optimale Integration von RhD in die Membran sehr wichtig sind. In zwei Allelen (Typ 4 und Typ 14) wurden Teile der Exons 4 und 5 gegen die entsprechenden Teile des RHCE-Gens ausgetauscht. Ähnliche Austausche kamen auch in D^VI Typ I und D^VI Typ II vor, die eine deutlich reduzierte RhD-Proteinexpression zeigten (Jones et al., 1996). Frühere paradoxe Beobachtungen können erklärt werden, wenn man annimmt, dass die N152T-Substitution in Exon 3 die Integration in die Membran erleichtert: (i) D^IIIa (Huang et al., 1997), das sich von dem schwachen D Typ 4 nur durch die N152T-Substitution unterscheidet, weist eine normale Dichte von RhD-Antigen auf (Jones et al., 1996) und (ii) D^IIIc, D^IVa und D^VI Typ III, die die N152T-Substitution tragen, weisen im Vergleich zu ihren geeigneten Kontrollen (normales RhD und D^VI Typ II) erhöhte Antigendichten auf (Flegel et al., 1997; Jones et al., 1996).
Einige Phänotypen mit schwacher D-Expression wie D^VI, D^V, DBT, einige D^IV und DFR wurden vor langer Zeit durch die Neigung ihrer Träger, anti-D zu produzieren, als separate Einheiten erkannt (Lomas et al., 1994; Tippett und Sangen, 1977; Tippett und Sangen, 1962). Diese Phänotypen wurden nach und nach bestätigt und aufgrund ihrer unterschiedlichen Reaktionsmuster mit monoclonalem anti-D gruppiert (Lomas et al., 1993; Lomas et al., 1989; Scott, 1996). Eine serologische Charakterisierung der meisten schwachen D-Phänotypen war jedoch nicht erfolgreich, weil ihnen ein konsistentes Reaktionsmuster mit monoclonalen anti-D fehlte und ihre Träger schienen nicht zu einer anti-D-Immunisierung zu neigen (Moore, 1984). Es gab nicht einmal eine definierte Grenzlinie zwischen normalem D und schwachem D (Agre et al., 1992; Moore, 1984; Nelson et al., 1995). Nichtsdestotrotz schlossen die Variabilität der RhD-Antigendichte (Antigene pro Zelle) bei schwachen D-Phänotypen (Hasekura et al., 1990; Jones et al., 1996; Nelson et al., 1995; Nicholson et al., 1991; Tazzari et al., 1994; Wagner, 1994) und die seltenen abweichenden Muster bei einer RHD-PCR (Avent et al., 1997b; Legler et al., 1997) eine zugrunde liegende molekulare Diversität nicht aus. Die vorliegende Erfindung erlaubt zum ersten Mal die geeignete Klassifizierung von schwachem D und die eindeutige Korrelation von einzelnen Allelen mit klinischen Daten. Im Zusammenhang mit vorher definierten seltenen RHD-Allelen ist nun die genaue molekulare Definition der meisten Phänotypen mit reduzierter D-Antigendichte möglich geworden. Für den Fall, dass Patienten, die bestimmte molekulare Typen von schwachem D tragen, zur Entwicklung von anti-D neigen, wird die durch die vorliegende Erfindung möglich gemachte Klassifizierung dabei helfen, eine Rhesusnegative Transfusionsstrategie durchzuführen. Die Erhältlichkeit von schwachen D-Proben, die hinsichtlich ihrer molekularen Struktur und ihrer RhD-Antigendichten charakterisiert sind, wird die Qualitätssicherheit der anti-D-Reagenzien fördern. Sie sollten Probanden, deren RhD-Proteine nicht zu einer häufigen anti-D-Immunisierung neigen, verlässlich als RhD-positiv typisieren (Wagner et al., 1995). Deshalb kann die Verwendung von RhD-negativen Einheiten von Erythrocyten bei der Transfusion von Patienten mit schwachem D, was aufgrund eines angenommenen Potentials für eine anti-D-Immunisierung als gerechtfertigt bewertet wurde, letztlich auf ein Minimum reduziert werden, was wissenschaftlich abgeleitet werden kann.
Darüber hinaus wurde in Übereinstimmung mit der Erfindung festgestellt, dass die Mutationen in bestimmten Bereichen des Rhesus-D-Polypeptids gehäuft auftreten. Weiterhin wurde eine Genkonversion, die mit dem schwachen D-Phänotyp korreliert, nachgewiesen. Somit betrifft die Erfindung auch ein Nucleinsäuremolekül, das ein Rhesus-D-Antigen codiert, welches zu dem schwachen D-Phänotyp beiträgt oder Indikativ dafür ist, wobei das Nucleinsäuremolekül verglichen mit dem Wildtyp-Rhesus-D-Antigen mindestens eine Missense-Mutation an den Aminosäurepositionen 2-16, 114-149, 179-225 oder/und 267-397 trägt, mit der Maßgabe, dass das D-Antigen keine einzelne Missense-Mutation trägt, die zu einer Substitution von Phenylalanin an Aminosäureposition 223 durch Valin oder von Threonin an Position 283 durch Isoleucin führt.
Alle Missense-Mutationen, die in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung gefunden wurden und sich in den vorstehenden Regionen befinden, sind mit der Transmembranregion oder dem intrazellulären Anteil des Polypeptids assoziiert, wenn das vorstehend angezeigte gegenwärtige Modell von RhD zur Anwendung kommt.
Zusätzlich zu den Missense-Mutationen wurde eine für schwaches D indikative Genkonversion nachgewiesen. Die Konversion kann im Wesentlichen im gleichen Ausmaß wie die Missense-Mutationen für diagnostische Zwecke verwendet werden. Es wurde festgestellt, dass sich die Bruchstellen in den Introns 5 und 9 befinden, siehe auch 3.
Die Mutanten, auf die sich vorstehend und im weiteren durch diese Patentschrift hindurch bezogen wird, können in geeigneter Weise bei der Charakterisierung von monoclonalen und polyclonalen Antikörpern, die im Zusammenhang mit der Diagnose, Prophylaxe und Behandlung von RhD verwendet werden, eingesetzt werden. Indem zum Beispiel die gewünschten Nucleinsäuremoleküle, die solche Mutanten codieren, in einem geeigneten System exprimiert werden, können Reaktivitätsprofile der Antikörper oder Antiseren erstellt werden. Die Mutanten können auch für die Charakterisierung von monoclonalen und polyclonalen Antikörpern eingesetzt werden, die als sekundäre Antikörper, zum Beispiel anti-Globulin und anti-Mensch-Globulin-Antiseren, verwendet werden.
Vorzugsweise verursacht die Missense-Mutation eine Aminosäuresubstitution an Position 3, 10, 16, 114, 149, 182, 198, 201, 220, 223, 270, 276, 277, 282, 294, 295, 307, 339, 385 oder 393 oder eine Kombination davon oder sie schließt die Substitutionen ein, mit der Maßgabe, dass die Substitution nicht auf einer einzelnen Missense-Mutation basiert, die zu einer Substitution von Phenylalanin an der Aminosäureposition 223 durch Valin führt.
Diese bevorzugte Ausführungsform kann außer den angezeigten einzelnen Mutationen eine Kombination dieser Substitutionen umfassen. Darüber hinaus enthält sie die Möglichkeit, dass eine oder mehrere der Substitutionen beteiligt sind und weitere Mutationen wie Mutationen, die zu Substitutionen führen, vorliegen. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist klar, dass auf solche zusätzlichen Mutationen hin getestet werden kann, wenn der RhD-Zustand in einer Probe bewertet wird. Das Auffinden einer solchen Mutation wird es einem Fachmann erlauben, zu folgern, dass andere in dieser Patentschrift identifizierten Mutationen, die in Kombination mit der ersten Mutation auftreten, vorhanden sein werden. Dementsprechend sind solche Ausführungsformen, die den Nachweis von zusätzlichen Mutationen, die in Kombination mit den in dieser Patentschrift identifizierten Mutationen auftreten, betreffen, auch durch die Erfindung umfasst.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls ist die Aminosäuresubstitution an Position 3 von Ser zu Cys, an Position 10 von Arg zu Gln, an Position 16 von Trp zu Cys, an Position 114 von Arg zu Trp, an Position 149 von Ala zu Asp, an Position 182 von Ser zu Thr, an Position 198 von Lys zu Asn, an Position 201 von Thr zu Arg, an Position 220 von Trp zu Arg, an Position 223 von Phe zu Val, mit der Maßgabe, dass die Substitution nicht auf einer einzelnen Missense-Mutation basiert, die zu einer Substitution von Phenylalanin an Aminosäureposition 223 zu Valin führt, an Position 270 von Val zu Gly, an Position 276 von Ala zu Pro, an Position 277 von Gly zu Glu, an Position 282 von Gly zu Asp, an Position 294 von Ala zu Pro, an Position 295 von Met zu Ile, an Position 307 von Gly zu Arg, an Position 339 von Gly zu Glu, an Position 385 von Gly zu Ala und an Position 393 von Trp zu Arg.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls tritt die Missense-Mutation an Nucleotidposition 8, 29, 48, 340, 446, 544, 594, 602, 658, 667, 809, 819, 826, 830, 845, 880, 885, 919, 1016, 1154 und 1177 oder in einer Kombination dieser Positionen auf, mit der Maßgabe, dass das codierte D-Antigen keine einzelne Missense-Mutation trägt, die zu einer Substitution von Phenylalanin durch Valin an der Aminosäureposition 223 führt.
Besonders bevorzugt ist es, dass die Missense-Mutation an Position 8 von C zu G, an Position 29 von G zu A, an Position 48 von G zu C, an Position 340 von C zu T, an Position 446 von C zu A, an Position 544 von T zu A, an Position 594 von A zu T, an Position 602 von C zu G, an Position 658 von T zu C, an Position 667 von T zu G, an Position 809 von T zu G, an Position 819 von G zu A, an Position 826 von G zu C, an Position 830 von G zu A, an Position 845 von G zu A, an Position 880 von G zu C, an Position 885 von G zu T, an Position 919 von G zu A, an Position 1016 von G zu A, an Position 1154 von G zu C und an Position 1177 von T zu C ist.
Für den Fall, dass Kombinationen von Missense-Mutationen an der Erzeugung von schwachen D-Phänotypen beteiligt sind, ist es bevorzugt, dass die Kombination von Substitutionen an den Positionen 182, 198 und 201 ist, und vorzugsweise S182T, K198N, T201R ist, oder an Position 201 und 223 und vorzugsweise T201 R und F223V ist, oder an Position 16, 201 und 223 und vorzugsweise W16C, T201R und F223V ist.
Am meisten bevorzugt umfasst die Kombination von Missense-Mutationen die Positionen 544, 594 und 602 und ist vorzugsweise T→A an Position 544, A→T an Position 594 und C→G an Position 602, oder sie umfasst die Positionen 602, 667 und 819 und ist vorzugsweise C→G an Position 602, T→G an Position 667 und G→A an Position 819, oder sie umfasst die Positionen 48, 602, 667 und 819 und ist vorzugsweise G→C an Position 48, C→G an Position 602, T→G an Position 667 und G→A an Position 819.
Obwohl das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül verschiedenen Ursprungs, einschließlich (semi-)synthetischen Ursprungs, sein kann, ist es bevorzugt, dass das Nucleinsäuremolekül mRNA oder genomische DNA ist. Standardverfahren können angewendet werden, um jegliche der vorstehenden Nucleinsäuren zu erhalten; siehe zum Beispiel Sambrook et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2. Ausg. 1989, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY.
Die Erfindung betrifft auch einen Vektor, der das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül umfasst.
Der Vektor kann für die Propagierung und/oder Expression verwendet werden oder kann zum Zweck des Gentransfer oder des Targeting entworfen werden. Verfahren zur Herstellung solcher Vektoren sind im Fachgebiet gut bekannt. Das gleiche trifft zu für die Clonierung der mutierten Nucleinsäuren in Vektoren ebenso wie die Propagierung der Vektoren in geeigneten Wirten usw.
Der Vektor kann im Besonderen ein herkömmlich in der Gentechnik verwendetes Plasmid, Cosmid, Virus oder Bakteriophage sein, das/der das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül umfasst. Expressionsvektoren, die von Viren wie Retroviren, dem Vaccinia-Virus, dem adenoassoziierten Virus, Herpes-Viren oder dem Rinder-Papillom-Virus stammen, können für den Transfer der Nucleinsäuremoleküle oder des Vektors der Erfindung in die Ziel-Zellpopulationen verwendet werden. Verfahren, welche Fachleuten gut bekannt sind, können verwendet werden, um rekombinante virale Vektoren zu konstruieren; siehe zum Beispiel die in Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y und Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989) beschriebenen Techniken. In einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Polynucleotide und Vektoren für den Transfer in die Zielzellen in Liposomen rekonstituiert werden. Die die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthaltenden Vektoren können mit Hilfe gut bekannter Verfahren, die in Abhängigkeit vom Typ des zellulären Wirtes variieren, in die Wirtszelle transferiert werden. Zum Beispiel wird für prokaryontische Zellen häufig die Calciumchlorid-Transfektion verwendet, wohingegen für andere zelluläre Wirte die Calciumphosphat-Behandlung oder die Elektroporation verwendet werden kann; siehe Sambrook, vorstehend.
Solche Vektoren können weitere Gene wie Markergene umfassen, die die Selektion des Vektors in einer geeigneten Wirtszelle und unter geeigneten Bedingungen erlauben. Das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül ist vorzugsweise mit Expressions-Kontrollsequenzen, die eine Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen erlauben, funktionell verknüpft. Die Expression des Polynucleotids umfasst die Transkription des Polynucleotids in eine translatierbare mRNA. Regulatorische Elemente, die die Expression in eukaryontischen Zellen, vorzugsweise Säugerzellen, sicherstellen, sind Fachleuten gut bekannt. Sie umfassen normalerweise regulatorische Sequenzen, die die Inititation der Transkription sicherstellen, und gegebenenfalls PolyA-Signale, die die Termination der Transkription und die Stabilisierung des Transkriptes sicherstellen. Zusätzliche regulatorische Elemente können transkriptionelle ebenso wie translationale Enhancer und/oder natürlich assoziierte oder heterologe Promotorregionen einschließen. Mögliche regulatorische Elemente, die die Expression in prokaryontischen Wirtszellen zulassen, umfassen z.B. den PL-, lac-, trp- oder tac-Promotor in E. coli und Beispiele für regulatorische Elemente, die eine Expression in eukaryontischen Wirtszellen zulassen, sind der AOX1- oder GAL1-Promotor in Hefe oder der CMV-, SV40, RSV-Promotor (Rous-Sarcom-Virus), CMV-Enhancer, SV40-Enhancer oder ein Globin-Intron in Säuger- und anderen tierischen Zellen. Neben Elementen, die für die Initiation der Transkription verantwortlich sind, können solche regulatorischen Elemente auch Transkriptions-Terminationssignale wie die SV40-PolyA-Stelle oder die tk-PolyA-Stelle stromabwärts des Nucleinsäuremoleküls umfassen. In Abhängigkeit von dem verwendeten Expressionssystem können der codierenden Sequenz des erfindungsgemäßen Polynucleotids Leader-Sequenzen, die befähigt sind, das Polypeptid in ein zelluläres Kompartiment zu lenken oder in das Medium zu sekretieren, hinzugefügt werden und sie sind im Fachgebiet gut bekannt. Die Leader-Sequenz(en) ist (sind) in geeigneter Phase mit Translations-, Initiations- und Terminationssequenzen verknüpft und vorzugsweise ist eine Leader-Sequenz befähigt, die Sekretion des translatierten Proteins oder eines Teils davon in den periplasmatischen Raum oder in das extrazelluläre Medium herbeizuführen. Gegebenenfalls kann die heterologe Sequenz ein Fusionsprotein einschließlich eines C- oder N-terminalen Identifikationspeptides codieren, das erwünschte Charakteristika, z.B. die Stabilisierung oder die vereinfachte Reinigung des exprimierten rekombinanten Produktes vermittelt. In diesem Zusammenhang sind geeignete Expressionsvektoren wie der Okayama-Berg-cDNA-Expressionsvektor pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen) oder pSPORT1 (GIBCO BRL) im Fachgebiet bekannt.
Die Expressions-Kontrollsequenzen werden vorzugsweise eukaryontische Promotorsysteme in Vektoren sein, die eukaryontische Wirtszellen transformieren oder transfizieren können, aber Kontrollsequenzen für prokaryontische Wirte können auch verwendet werden.
Wie vorstehend erwähnt, kann der Vektor der vorliegenden Erfindung auch ein Gentransfer- oder Targeting-Vektor sein. Die Gentherapie, die auf der Einführung von therapeutischen Genen in Zellen durch ex-vivo- oder in-vivo-Techniken basiert, ist eine der wichtigsten Anwendungen des Gentransfers. Geeignete Vektoren und Verfahren für die in-vitro- oder in-vivo-Gentherapie sind in der Literatur beschrieben und sind Fachleuten bekannt; siehe z.B. Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957 oder Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640 und dort zitierte Referenzen. Die erfindungsgemäßen Polynucleotide und Vektoren können für eine direkte Einbringung oder für eine Einbringung über Liposomen oder vitale Vektoren (z.B. adenovirale, retrovirale) in die Zelle entworfen werden. Vorzugsweise ist diese Zelle eine Keimbahnzelle, eine Embryonalzelle oder eine Eizelle oder sie stammt von diesen ab, am meisten bevorzugt ist diese Zelle eine Stammzelle.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung einen nicht-menschlichen Wirt, der mit dem erfindungsgemäßen Vektor transformiert wurde.
Geeignete Wirte umfassen nicht-menschliche transgene Tiere, Zellen wie Bakterien, Hefezellen, tierische, vorzugsweise Säuger-Zellen, Pilzzellen oder Insektenzellen. Transformationsprotokolle einschließlich Transfektion, Mikroinjektion, Elektroporation usw. sind ebenfalls im Fachgebiet gut bekannt.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Rhesus-D-Antigens, das zu dem schwachen D-Phänotyp beiträgt, was das Züchten des erfindungsgemäßen Wirtes unter geeigneten Bedingungen und das Isolieren des hergestellten Rhesus-D-Antigens umfasst.
Es ist bevorzugt, dass das Antigen in das Kulturmedium exportiert wird, wo es Konventionen/Verfahren entsprechend gewonnen werden kann. Der Ausdruck „Züchten", wie er in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfasst auch die Aufzucht von transgenen Tieren. Unter der Verwendung von geeigneten Vektorkonstruktionen und gegebenenfalls geeignetem Futter kann z.B. das Antigen aus Milch von z.B. transgenen Kühen isoliert werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin das Rhesus-D-Antigen, das durch das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül codiert oder durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wird.
Das Antigen ist vorzugsweise auf die gleiche Art und Weise post-translational modifiziert und weist die gleiche chemische Struktur auf wie das natürlich vorkommende Antigen. Dementsprechend wird das Antigen, wenn es durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wird, vorzugsweise in menschlichen Zellen hergestellt.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Oligonucleotid, das spezifisch mit einem Teil des erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls, das mindestens eine Missense-Mutation beinhaltet, oder mit dem komplementären Teil davon hybridisiert.
In dieser Ausführungsform der Erfindung ist es klar, dass die Oligonucleotide direkt mit der mutierten Sequenz hybridisieren. Das Festlegen von stringenten Hybridisierungsbedingungen ist gut beschrieben, zum Beispiel in Sambrook et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Handbook" CSH Press, Cold Spring Harbor 1989 oder Hames und Higgins, „Nucleic acid hybridization, a practical approach", IRL Press, Oxford (1985). Demnach wird der Nachweis von spezifisch hybridisierenden Sequenzen üblicherweise Hybridisierungs- und Waschbedingungen wie 0,1×SSC, 0,1 % SDS bei 65°C benötigen. Wie gut bekannt ist, stellen die Länge der Sonde und die Zusammensetzung der zu ermittelnden Nucleinsäure weitere Parameter für die stringenten Hybridisierungsbedingungen dar. Das Oligonucleotid ist vorzugsweise ein Desoxynucleotid. Es ist weiterhin bevorzugt, dass das Oligonucleotid 12 bis 50 Nucleotide und mehr bevorzugt 15 bis 24 Nucleotide umfasst. Ein Beispiel für nichtstringente Hybridisierungsbedingungen ist Hybridisierung und Waschen bei 50°C in 4×SSC, 0,1 % SDS.
Weiterhin betrifft die Erfindung einen Antikörper oder ein Aptamer, der/das spezifisch an das erfindungsgemäße Rhesus-D-Antigen bindet.
Der Antikörper kann in jeder im Fachgebiet gut bekannten serologischen Technik wie Agglutinierungstechniken in Röhrchen und Gelen, Festphasen- und Einfangtechniken mit oder ohne sekundäre Antikörper oder in Durchflusszytometrie mit oder ohne Verstärkung der Immunfluoreszenz gestestet und verwendet werden.
Der erfindungsgemäße Antikörper kann ein monoclonaler Antikörper oder ein Antikörper sein, der von einem polyclonalen Antiserum stammt oder in diesem enthalten ist. Der Ausdruck „Antikörper", wie er in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfasst des Weiteren Fragmente des Antikörpers wie Fab-, F(ab')₂-, Fv- oder scFv-Fragmente; siehe zum Beispiel Harlow und Lane, „Antibodies, A Laboratory Manual" CSH Press 1988, Cold Spring Harbor, N.Y. Der Antikörper oder das Fragment davon können natürlichen Ursprungs oder (semi-)synthetisch hergestellt sein. Solche synthetischen Produkte umfassen auch nicht-proteinartiges wie semi-proteinartiges Material, das die gleiche oder nahezu die gleiche Bindungsspezifität wie der erfindungsgemäße Antikörper aufweist. Solche Produkte können zum Beispiel durch Peptidomimetika erhalten werden.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung einen Antikörper oder ein Aptamer oder einen Phagen, der/das spezifisch an das Wildtyp-Rhesus-D-Antigen oder an abweichende Rhesus-D-Antigene, jedoch nicht an das erfindungsgemäße Rhesus-D-Antigen bindet. Der Antikörper kann in jeder im Fachgebiet gut bekannten serologischen Technik wie Agglutinierungstechniken in Röhrchen und Gelen und Festphasentechniken, Einfangtechniken oder in Durchflusszytometrie mit Immunfluoreszenz gestestet und verwendet werden.
Was die Definition, das Testen und den Ursprung des Antikörpers oder des Aptamers angeht, gelten hier die gleichen Definitionen wie vorstehend.
Was den Ausdruck „abweichende Rhesus-D-Antigene" angeht, umfasst der Ausdruck Missense-Mutationen nach dem Stand der Technik ebenso wie Konversionen nach dem Stand der Technik, die in RHD-Genen und den entsprechenden Antigenen gefunden wurden.
Der Ausdruck „Aptamer" ist im Fachgebiet gut bekannt und z.B. in Osborne et al., Curr. Opin. Chem. Biol. I (1997), 5-9 oder in Stall und Szoka, Pharm. Res. 12 (1995), 465-483 definiert.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Testen auf die Anwesenheit eines Nucleinsäuremoleküls in einer Probe, das ein Rhesus-D-Antigen codiert, welches zu dem schwachen D-Phänotyp beiträgt oder Indikativ dafür ist, umfassend das Hybridisieren des erfindungsgemäßen Oligonucleotids oder eines Oligonucleotids, das mit einem Nucleinsäuremolekül hybridisiert, das ein Rhesus-D-Antigen codiert, welches zu dem schwachen D-Phänotyp beiträgt oder Indikativ dafür ist, wobei das Nucleinsäuremolekül im Vergleich zum Wildtyp-Rhesus-D-Antigen mindestens eine Missense-Mutation trägt, wobei die Missense-Mutation eine Aminosäuresubstitution an Position 223 oder 283 verursacht, die an Position 223 vorzugsweise von Phe zu Val und an Position 283 vorzugsweise von Thr zu Ile ist, wobei die Missense-Mutation weiterhin vorzugsweise an Nucleotidposition 667 oder 848 auftritt, wobei am meisten bevorzugt die Mutation an Position 667 von T zu G und an Position 848 von C zu T ist, unter stringenten Bedingungen mit Nucleinsäuremolekülen, die in der Probe eines Menschen enthalten sind, und den Nachweis der Hybridisierung.
Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße Verfahren weiterhin den Verdau des Produktes der Hybridisierung mit einer Restriktionsendonuclease oder dass das Produkt der Hybridisierung einem Verdau mit einer Restriktionsendonuclease unterworfen und das Produkt des Verdaus analysiert wird.
Diese bevorzugte Ausführungsform der Erfindung erlaubt unter Anwendung geeigneter Mittel die Differenzierung zwischen einer wirksamen und einer unwirksamen Hybridisierung. Wenn zum Beispiel das Wildtyp-Rhesus-D-Antigen eine Endonuclease-Restriktionsstelle enthält, wird das hybridisierte Produkt durch ein geeignetes Restriktionsenzym spaltbar sein, wohingegen eine mutierte Sequenz kein doppelsträngiges Produkt ergeben oder nicht die erkennbare Restriktionsstelle enthalten wird und dementsprechend nicht gespalten werden wird. In einer anderen Ausführungsform kann das hybridisierende Oligonucleotid nur mit der mutierten Sequenz hybridisieren. In diesem Fall wird nur ein Hybrid, das die mutierte Sequenz, aber nicht die Wildtyp-Sequenz umfasst, durch das geeignete Restriktionsenzym gespalten werden. Die Analyse des Spaltungsproduktes kann auf herkömmliche Art und Weise wie durch Gelelektrophorese ausgeführt werden, welche gegebenenfalls mit dem Anfärben der Nucleinsäuren, zum Beispiel mit Ethidiumbromid, kombiniert werden kann. Kombinationen mit weiteren Techniken wie Southern-Transfer werden ebenfalls in Betracht gezogen.
Der Nachweis der Hybridiserung kann zum Beispiel durch einen anti-DNA-Doppelstrang-Antikörper oder durch Verwendung eines markierten Oligonucleotids erreicht werden. In geeigneter Weise wird das erfindungsgemäße Verfahren zusammen mit Transfer-Techniken wie Southern- oder Northern-Blottechniken und verwandten Techniken durchgeführt. Eine Markierung kann zum Beispiel unter der Verwendung von Standard-Protokollen bewirkt werden und schließt Markierungen mit radioaktiven Markern, fluoreszierenden, phosphoreszierenden, chemoluminiszierenden, enzymatischen Markierungen usw. ein.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Testen auf die Anwesenheit eines Nucleinsäuremoleküls in einer Probe, das ein Rhesus-D-Antigen codiert, welches zu dem schwachen D-Phänotyp beiträgt oder indikativ dafür ist, umfassend das Bestimmen der Nucleinsäuresequenz von mindestens einem Teil des erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls, wobei der Teil mindestens eine Missense-Mutation oder eine Bruchstelle der Genkonversion oder ein Nucleinsäuremolekül codiert, das ein Rhesus-D-Antigen codiert, welches zu dem schwachen D-Phänotyp beiträgt oder indikativ dafür ist, wobei das Nucleinsäuremolekül im Vergleich zum Wildtyp-Rhesus-D-Antigen mindestens eine Missense-Mutation trägt, wobei die Missense-Mutation eine Aminosäuresubstitution an Position 223 oder 283 verursacht, die an Position 223 vorzugsweise von Phe zu Val und an Position 283 vorzugsweise von Thr zu Ile ist, wobei die Missense-Mutation weiterhin vorzugsweise an Nucleotidposition 667 oder 848 auftritt, wobei am meisten bevorzugt die Mutation an Position 667 von T zu G und an Position 848 von C zu T ist.
Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße Verfahren weiterhin vor der Bestimmung der Nucleinsäuresequenz eine Amplifikation von mindestens einem Teil des Nucleinsäuremoleküls.
Vorzugsweise wird die Amplifikation mittels einer Polymerasekettenreaktion (PCR) erreicht. Andere Amplifikationsverfahren wie die Ligasekettenreaktion können ebenfalls angewendet werden.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Testen auf die Anwesenheit eines Nucleinsäuremoleküls in einer Probe, das ein Rhesus-D-Antigen codiert, welches zu dem schwachen D-Phänotyp beiträgt oder Indikativ dafür ist, umfassend die Durchführung einer Amplifikationsreaktion, wobei mindestens einer der in der Amplifikationsreaktion verwendeten Primer ein erfindungsgemäßes Oligonucleotid ist oder ein Oligonucleotid, das mit einem Nucleinsäuremolekül hybridisiert, das ein Rhesus-D-Antigen codiert, welches zu dem schwachen D-Phänotyp beiträgt, wobei das Nucleinsäuremolekül im Vergleich zum Wildtyp-Rhesus-D-Antigen mindestens eine Missense-Mutation trägt, wobei die Missense-Mutation eine Aminosäuresubstitution an Position 223 oder 283 verursacht, die an Position 223 vorzugsweise von Phe zu Val und an Position 283 vorzugsweise von Thr zu Ile ist, wobei die Missense-Mutation weiterhin vorzugsweise an Nucleotidposition 667 oder 848 auftritt, wobei am meisten bevorzugt die Mutation an Position 667 von T zu G und an Position 848 von C zu T ist, und das Untersuchen des Amplifikationsprodukts.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird zu einer Amplifikation von ausschließlich der Zielsequenz führen, wenn die Zielsequenz die oder zumindest eine Mutation trägt. Das liegt daran, weil das Oligonucleotid unter vorzugsweise stringenten Hybridisierungsbedingungen nicht mit der Wildtyp-Sequenz (mit der Folge, dass kein Amplifikationsprodukt erhalten wird), sondern nur mit der mutierten Sequenz hybridisieren wird. Natürlich können Primeroligonucleotide, die mit einer oder mehr als einer, z.B. zwei, mutierten Sequenzen hybridisieren in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Letztere Ausführungsform kann in Fällen vorzuziehen sein, in denen auf Kombinationen von Mutationen getestet wird. Es ist wichtig, zu erwähnen, dass nicht notwendigerweise alle oder keine der Mutationen Missense-Mutationen sind. Das kann für solchen Fälle zutreffen, in denen andere Arten von Mutationen in Kombination mit den vorstehenden Missense-Mutationen oder mit der vorstehenden Genkonversion vorkommen.
Vorzugsweise ist in dem erfindungsgemäßen Verfahren die Amplifikation oder die Amplifikationsreaktion die Polymerasekettenreaktion (PCR) oder wird durch sie erreicht. Andere Amplifikationsverfahren wie die Ligasekettenreaktion können ebenfalls angewendet werden.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Testen auf die Anwesenheit eines Rhesus-D-Antigens in einer Probe, welches zu dem schwachen D-Phänotyp beiträgt oder indikativ dafür ist, umfassend das Testen einer Probe eines Menschen auf die spezifische Bindung an einen/ein erfindungsgemäßen/s Antikörper oder Aptamer oder Phagen oder an einen/ein Antikörper oder Aptamer oder Phagen gegen das Rhesus-D-Antigen, das zu dem schwachen D-Phänotyp beiträgt oder dafür indikativ ist und durch ein Nucleinsäuremolekül codiert wird, welches im Vergleich zum Wildtyp-Rhesus-D-Antigen mindestens eine Missense-Mutation trägt, wobei die Missense-Mutation eine Aminosäuresubstitution an Position 223 oder 283 verursacht, die an Position 223 vorzugsweise von Phe zu Val und an Position 283 vorzugsweise von Thr zu Ile ist, wobei die Missense-Mutation weiterhin vorzugsweise an Nucleotidposition 667 oder 848 auftritt, wobei am meisten bevorzugt die Mutation an Position 667 von T zu G und an Position 848 von C zu T ist.
Das Testen auf Bindung kann wiederum die Anwendung von Standard-Techniken wie ELISA beinhalten; siehe zum Beispiel Harlow und Lane, „Antibodies, A Laboratory Manual" CSH Press 1988, Cold Spring Harbor.
Die Erfindung betrifft auch das Verfahren zum Testen einer Probe auf die Anwesenheit des Wildtyp-Rhesus-D-Antigens und auf die Abwesenheit des erfindungsgemäßen Rhesus-D-Antigens, umfassend das Testen einer Probe eines Menschen auf die spezifische Bindung an einen/ein erfindungsgemäßen/s Antikörper oder Aptamer oder Phagen, wobei der/das Antikörper oder Aptamer oder Phage spezifisch an das Wildtyp-Rhesus-D-Antigen oder an das abweichende Rhesus-D-Antigen, aber nicht an das erfindungsgemäße Rhesus-D-Antigen bindet.
Ergebnisse, die in Übereinstimmung mit ihrem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden, können gut bei Bluttransfusions-Strategien, wie vorstehend dargestellt, angewendet werden.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist die Probe vorzugsweise Blut, Serum, Plasma, Fötusgewebe, Speichel, Urin, Schleimhautgewebe, Schleim, Vaginalgewebe, Fetalgewebe von der Vagina, Haut, Haar, Haarfollikel oder anderes menschliches Gewebe.
Weiterhin umfasst das erfindungsgemäße Verfahren vorzugsweise den Schritt des Anreicherns von Fetalzellen. Dieses Anreichern kann unter der Verwendung von geeigneten Antikörpern, Lektinen oder anderen Reagenzien, die spezifisch an Fetalzellen binden, erreicht werden oder durch jede andere Technik, die eine differentielle Trennung von mütterlichen Zellen und Fetalzellen anstrebt, wie zum Beispiel durch Dichtegradienten. In dem Verfahren ist es ebenfalls bevorzugt, fetale DNA oder mRNA aus mütterlichem Gewebe wie peripherem Blut, Serum oder Plasma in vorteilhafter Weise nach herkömmlichen Verfahren zu extrahieren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Nucleinsäuremolekül oder das proteinartige Material aus der Probe auf einem festen Träger fixiert.
Vorzugsweise ist der feste Träger ein Chip.
Die Vorteile von Chips sind im Fachgebiet gut bekannt und müssen hier nicht genau dargelegt werden. Diese schließen die kleine Größe ebenso wie einen einfachen Zugang zu einer computerbasierten Analyse der Analyten ein.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls oder eines Nucleinsäuremoleküls, das ein Rhesus-D-Antigen codiert, welches zu dem schwachen D-Phänotyp beiträgt oder Indikativ dafür ist, wobei das Nucleinsäuremolekül im Vergleich zum Wildtyp-Rhesus-D-Antigen mindestens eine Missense-Mutation trägt, wobei die Missense-Mutation eine Aminosäuresubstitution an Position 223 oder 283 verursacht, die an Position 223 vorzugsweise von Phe zu Val und an Position 283 vorzugsweise von Thr zu Ile ist, wobei die Missense-Mutation weiterhin vorzugsweise an Nucleotidposition 667 oder 848 auftritt, wobei am meisten bevorzugt die Mutation an Position 667 von T zu G und an Position 848 von C zu T ist, oder einer Kombination davon für die Analyse eines schwachen Rhesus-D-Phänotyps.
Die Analyse kann zum Beispiel auf der Basis der hier vorstehend beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.
Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung des erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls, des erfindungsgemäßen Vektors oder des erfindungsgemäßen Rhesus-D-Antigens für die Bewertung der Affinität, Avidität und/oder Reaktivität von monoclonalen anti-D-Antikörpern oder von polyclonalen anti-D-Antiseren oder von Antiglobulin oder von anti-Mensch-Globulin-Antiseren oder von den Präparationen davon.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Zellen, vorzugsweise Erythrocyten, von Probanden für die Bewertung der Affinität, Avidität und/oder Reaktivität von monoclonalen anti-D-Antikörpern oder von polyclonalen anti-D-Antiseren oder von Antiglobulin oder von anti-Mensch-Globulin-Antiseren oder von den Präparationen davon.
Die Präparationen können entsprechend der im Fachgebiet gut bekannten Techniken bereitgestellt werden. Die Präparationen können Stabilisatoren wie Albumine, des Weiteren Natriumazid, Salzionen, Puffer usw. umfassen. Die Formulierung der Präparation kann einen Einfluss auf die Bindungscharakteristika der Antikörper ausüben, wie im Fachgebiet gut bekannt ist.
In einem ersten Schritt wird zum Beispiel das Rhesus-D-Gen eines Trägers oder eines Blutspenders und dessen Allelstatus analysiert und es wird bestimmt, ob das Gen eine Mutation enthält, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung gefunden wurde. In einem zweiten Schritt wird die Mutation mit einer bestimmten RhD-Antigendichte auf der Oberfläche von Erythrocyten korreliert. Geeigneterweise kann diese Korrelation durch Daten, die in der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden (wie Mutationen an sich), und durch im Fachgebiet gut bekannte Techniken bestätigt werden (siehe z.B. Jones et al., 1996, Flegel und Wagner, 1996). In einem dritten Schritt werden die Eigenschaften eines Antikörpers oder eines Antiserums wie Reaktivität, Sensitivität, Affinität, Avidität und/oder Spezifität mittels geeigneter serologischer Blutgruppentechniken bestimmt, vorzugsweise unter der Verwendung von Erythrocyten, die molekular und hinsichtlich ihrer RhD-Antigenoberflächendichte, wie in Schritt 2 beschrieben, charakterisiert wurden. Solche Daten können zum Beispiel in Qualitätskontrollen, Standardisierungen usw. verwendet werden.
Die Erfindung wird bei der Charakterisierung, Standardisierung und Qualitätskontrolle von monoclonalen und polyclonalen Antiseren, vorzugsweise monoclonalen anti-D-Antikörpern oder anti-D-Antiseren, am meisten Nutzen bringen. Des Weiteren können zum Beispiel anti-Globulin- und anti-Mensch-Globulin-Antiseren auf der Basis der Vorgaben der vorliegenden Erfindung charakterisiert werden. Ein in geeigneter Weise charakterisierter monoclonaler anti-D-Antikörper kann in günstiger Weise in der RhD-Diagnostik eingesetzt werden. Zum Beispiel wird ein in geeigneter Weise charakterisierter monoclonaler Antikörper bei der Bestimmung der Dichte des schwachen D-Antigens auf der Oberfläche von Erythrocyten von Nutzen sein. Grenzwerte für monoclonale Antikörper, die in der Diagnose nützlich sind, können somit festgelegt werden. Dies ist bei der Qualitätskontrolle von in der RhD-Diagnose verwendeten Antikörpern von Wichtigkeit.
Somit betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Charakterisierung von monoclonalen Antikörpern oder polyclonalen Antiseren oder eines Präparats davon, wobei das Verfahren umfasst

(a) das Testen der Nucleinsäure der Probe eines Probanden auf die Anwesenheit einer Mutation, wie sie in Übereinstimmung mit der Erfindung definiert wurde;
(b) das Korrelieren der Nucleinsäure mit der RhD-Antigendichte auf der Oberfläche der Erythrocyten des Probanden auf der Basis des Mutationsstatus und des Allelstatus des RHD-Gens;
(c) das Reagieren der monoclonalen Antikörper oder der polyclonalen Antiseren oder des Präparats davon mit einer Zelle, die das RhD-Antigen auf ihrer Oberfläche trägt;
(d) das Charakterisieren der monoclonalen Antikörper oder der polyclonalen Antiseren oder des Präparats davon auf der Basis der in Schritt (c) erhaltenen Ergebnisse.

Was den Ausdruck „Allelstatus" betrifft, beschreibt dieser Ausdruck die Möglichkeiten, dass die RHD-Allele in einem Probanden in einem homozygoten, heterozygoten oder hemizygoten Status vorliegen können. Ebenfalls in diesem Ausdruck umfasst ist die Möglichkeit, dass die zwei Allele zwei unterschiedliche Mutationen (einschließlich der Konversion), wie hier vorstehend beschrieben, tragen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die Charakterisierung die Bestimmung der Reaktivität, Sensitivität, Avidität, Affinität, Spezifität und/oder anderer Charakteristika der Antikörper und Antiseren.
Weiterhin bevorzugt ist ein Verfahren, in dem die Zelle, die das RhD-Antigen auf ihrer Oberfläche trägt, ein Erythrocyt ist.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Patient, der eine Bluttransfusion braucht, eine Transfusion mit RhD-negativem Blut eines Spenders erhalten soll, umfassend den Schritt des Testens einer Probe des Patienten auf die Anwesenheit von einem oder mehreren erfindungsgemäßen RhD-Antigenen, wobei ein positives Testergebnis für mindestens eines der Antigene Indikativ dafür ist, dass ein Bedarf an einer Transfusion mit RhD-negativem Blut besteht. Die Erfindung hat wichtige Auswirkungen für das Entwickeln einer Transfusionstherapie bei Menschen. Zum Beispiel kann nun auf geeignete Weise getestet werden, ob der Patient eine Transfusion mit RhD-negativem Blut wirklich braucht oder ob solche Vorsichtsmassnahmen nicht getroffen werden müssen.
Die Transfusion von Erythrocyten von einigen molekular definierten Untergruppen des schwachen D-Phänotyps, die durch solche Verfahren bestimmt wurden, könnte immunogen sein, wenn Träger des Wildtyp-Rhesus-D-Antigens, eines abweichenden D-Antigens oder eines anderen erfindungsgemäßen schwachen D-Typs eine Transfusion einer Untergruppe des schwachen D-Phänotyps erhalten. Solche Träger, wie zum Beispiel Blutspender, können durch die Verwendung von früher im Fachgebiet etablierten Verfahren oder von in der Erfindung etablierten Verfahren bestimmt werden und nachfolgend kann die Transfusion von einigen Untergruppen des schwachen D-Phänotyps vermieden werden.
Des Weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung, ob Blut eines Spenders zur Transfusion eines Patienten, der sie braucht, verwendet werden kann, umfassend den Schritt des Testens einer Probe des Spenders auf die Anwesenheit von einem oder mehreren erfindungsgemäßen RhD-Antigenen, wobei ein positives Testergebnis für mindestens eines der Antigene die Transfusion der Patienten ausschließt, die typisiert wurden, dass sie Wildtyp-RhD-Antigen oder (einen) schwache(n) D-Typ(en) haben, der/die anders als der/die schwache(n) D-Typ(en) des Spenders ist/sind.
Auf der Basis des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es vorteilhaft und wünschenswert, die Transfusion eines Patienten mit Blut eines Spenders mit schwachem D-Typ zu vermeiden, wenn die schwachen D-Antigene in Spender und Empfänger nicht absolut identisch sind.
Die Proben, auf die in den vorstehend beschriebenen Verfahren Bezug genommen wird, können Proben sein, auf die in der gesamten Patentschrift Bezug genommen wird, wie Blut, Serum, usw.
Was die Richtlinien für die Transfusion eines Patienten auf der Basis eines jeden der vorstehend beschriebenen Verfahren betrifft, muss man äußerste Sorgfalt walten lassen, damit eine suboptimale Transfusionsstrategie vermieden wird. Der Risikofaktor muss immer von dem verantwortlichen Arzt beurteilt werden. In jedem Fall muss das mögliche Risiko für den Patienten minimiert werden.
Die vorliegende Erfindung ist besonders für die Festlegung von Kriterien geeignet, die zukünftige Strategien für die Vorgehensweise bei einer Transfusion leiten sollen. Entsprechend der molekularen Kriterien, die durch die Erfindung festgelegt werden, kann der schwache D-Phänotyp in Gruppen eingeteilt werden. Einige molekular definierte Untergruppen des schwachen D-Phänotyps, die durch solche Verfahren bestimmt wurden, könnten zu einer Immunisierung neigen, wenn die Träger eine Transfusion mit dem Wildtyp-Rhesus-D-Antigen, einem abweichenden D-Antigen oder einem anderen erfindungsgemäßen schwachen D-Typ erhalten haben, und könnten einen anti-D produzieren. Solche Träger können durch Verfahren, die in der Erfindung festgelegt wurden, bestimmt werden und nachfolgend eine Transfusion mit Rhesus-negativen Blutbestandteilen wie Erythrocyten, Thrombocyten und Blutplasmaeinheiten erhalten. Von der Mehrzahl der Träger mit schwachem D-Phänotyp wird nach dem gegenwärtigen Stand der Technik nicht angenommen, dass sie dazu neigen, auf solche Art und Weise durch Rhesus-D-positive Bluttransfusionen immunisiert zu werden, und sie können daher mittels der durch die Erfindung festgelegten Mittel aufgrund ihrer Klassifizierung zu einem bestimmten schwachen D-Typ entsprechend der vorliegenden Erfindung auf sichere Weise eine Rhesus-D-positive Transfusion erhalten.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Phagen, Aptamers, monoclonalen Antikörpers oder eines polyclonalen Antiserums oder einer Präparation davon, wie in der vorliegenden Erfindung charakterisiert, zur RhD-Antigenbestimmung.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Verwendung wird die RhD-Antigenbestimmung in Verbindung mit einer Blutgruppentypisierung durchgeführt.
Des Weiteren betrifft die Erfindung eine Präparation, die den Antikörper oder das Aptamer oder den Phagen der Erfindung umfasst.
Die durch die Erfindung definierten schwachen D-Typen korrelieren mit bestimmten Rhd-Epitop- und RhD-Antigendichten, d.h. RhD-Antigene pro Zelle, die auf der Oberfläche von Erythrocyten exprimiert werden (Flegel und Wagner, 1996) (Daten von wenigen Beispielen werden in Tabelle 8 bereitgestellt). Antikörper und Präparationen davon können durch jede serologische Blutgruppen-Standardtechnik mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen schwachen D-Typen getestet werden. Die Reaktivität, Sensitivität, Avidität, Affinität, Spezifität und/oder andere Charakteristika der im Fachgebiet bekannten Antikörper und Antiseren können durch ihre Reaktion mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen schwachen D-Typen unter vorher festgelegten Bedingungen durch die im Fachgebiet gut bekannten serologischen Blutgruppen-Standardtechniken getestet werden. Die Präparation kann eine diagnostische oder pharmazeutische Präparation sein.
Das Arzneimittel der vorliegenden Erfindung kann weiterhin einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel umfassen. Beispiele für geeignete pharmazeutische Träger sind im Fachgebiet gut bekannt und schließen Phosphat-gepufferte Salzlösungen, Wasser, Emulsionen wie Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene Arten von Benetzungsmitteln, sterile Lösungen usw. ein. Solche Träger umfassende Zusammensetzungen können durch herkömmliche im Fachgebiet gut bekannte Verfahren formuliert werden. Diese Arzneimittel können dem Patienten in einer geeigneten Dosierung verabreicht werden. Die Verabreichung der geeigneten Zusammensetzungen kann auf verschiedenen Wegen durchgeführt werden, z.B. durch intravenöse, intraperitoneale, subkutane, intramuskuläre, topische, intradermale, intranasale oder intrabronchiale Verabreichung. Das Dosierungsschema wird durch den behandelnden Arzt und klinische Faktoren bestimmt. Wie in der Medizin gut bekannt ist, hängen die Dosierungen jedes einzelnen Patienten von vielen Faktoren ab, einschließlich der Größe des Patienten, der Körperoberfläche, dem Alter, der bestimmten zu verabreichenden Verbindung, dem Geschlecht, der Zeit und dem Weg der Verabreichung, des allgemeinen Gesundheitszustandes und der anderen gegenwärtig verabreichten Arzneistoffe. Eine typische Dosierung kann zum Beispiel in dem Bereich von 0,001 bis 1000 μg liegen; jedoch sind auch Dosierungen unterhalb und oberhalb dieses beispielhaften Bereichs vorgesehen, besonders, wenn man die vorher erwähnten Faktoren in Betracht zieht. Im Allgemeinen sollte das Behandlungsschema bei einer regelmäßigen Verabreichung des Arzneimittels den Bereich von 1 μg bis 10 mg Einheiten pro Tag beinhalten. Wenn das Behandlungsschema eine kontinuierliche Infusion beinhaltet, sollte es ebenfalls den Bereich von 1 μg bis 10 mg Einheiten pro Kilogramm Körpergewicht pro Minute beinhalten. Der Verlauf kann durch eine regelmäßige Bewertung verfolgt werden. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können lokal oder systemisch verabreicht werden. Die Verabreichung wird im Allgemeinen parenteral, z.B. intravenös, sein; DNA kann auch direkt an der Zielstelle verabreicht werden, z.B. durch biolistische Abgabe an eine interne oder externe Zielstelle oder durch einen Katheter an eine Stelle in einer Arterie. Präparationen für eine parenterale Verabreichung schließen sterile wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen ein. Beispiele für nicht-wässrige Lösungsmittel sind Propylenglycol, Polyethylenglycol, Gemüseöle wie Olivenöl und injizierbare organische Ester wie Ethyloleat. Wässrige Träger schließen Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich Salzlösung und gepufferte Medien, ein. Parenterale Vehikel schließen Natriumchloridlösung, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, mit Laktat versetzte Ringer oder fixierte Öle ein. Intravenöse Vehikel schließen Flüssigkeits- und Nährstoff-Auffüllmittel, Elektrolyt-Auffüllmittel (wie die auf Ringer-Dextrose basierenden) und ähnliche ein. Konservierungsmittel und andere Zusätze können ebenfalls vorhanden sein, wie zum Beispiel antimikrobielle Substanzen, Antioxidantien, Chelatbildner und inerte Gase und ähnliche. Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Arzneimittel in Abhängigkeit von der beabsichtigten Verwendung des Arzneimittels weitere Mittel wie Interleukine oder Interferone umfassen.
Ein Antikörper und seine Präparation können durch ihre Reaktion oder fehlende Reaktion mit Oberflächen mit bestimmten RhD-Epitopdichten charakterisiert werden. Zum Beispiel können Antikörperpräparationen charakterisiert werden, indem sie mit Erythrocyten mit 1000 RhD-Antigenen pro Zelle agglutinieren – eine RhD-Antigendichte, die mit Bedacht gewählt wurde, um dem Zweck der Qualitätskontrolle zu entsprechen.
Die Erfindung erlaubt auch die Behandlung einer schwangeren Frau, die Rhesus D-negativ ist oder hemizygot für eine hier vorstehend definierte Mutation, wobei das Kind Rhesus D-positiv ist oder eine unterschiedliche hier vorstehend definierte Mutation in einem hemizygoten Zustand trägt, umfassend eine Verabreichung von anti-D an diese Frau.
Schwangere Frauen können gegenwärtig mit einer anti-D-Prophylaxe behandelt werden, wenn eine Rhesus-negative Frau einen RhD-positiven Fötus trägt. Die Erfindung erlaubt eine Beurteilung der Notwendigkeit einer anti-D-Prophylaxe in Abhängigkeit von dem Zustand, ob die Mutter und/oder der Fötus ein erfindungsgemäßes RhD-Protein tragen. Eines oder mehrere der erfindungsgemäßen RhD-Proteine können zu einer Immunisierung ihrer Träger neigen und wären daher für eine Therapie der Mutter indikativ. In ähnlicher Weise könnte von einem oder mehreren erfindungsgemäßen RhD-Proteinen, falls sie vom Fötus getragen werden, bekannt sein, dass sie eine niedrige Immunogenität bei der Mutter hervorrufen und sie wären daher im Unterschied zu der gegenwärtigen klinischen Therapie für eine Nichtdurchführung der anti-D-Prophylaxe indikativ.
Die Verabreichung kann auf Standard-Wegen und mit Standard-Dosierungen durchgeführt werden, die durch den behandelnden Arzt festgelegt werden können; Mollison, 1993. Vorzugsweise wird/werden ein monoclonaler anti-D oder Kombinationen/Gemische von monoclonalen anti-Ds in Dosierungen von 50 μg bis über 500 μg anti-D-Antikörper/Antiseren für eine intravenöse oder intramuskuläre Verabreichung verabreicht (Bowman, 1998). Für die Qualitätskontrolle dieser anti-D-Antikörper/Antiseren können die Ergebnisse und Verfahren, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, in vorteilhafter Weise angewendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifizierung einer Antikörper-V_H- oder -V_L-Kette oder einer Kombination davon oder eines Aptameren, die/das spezifisch an ein erfindungsgemäßes schwaches D-Polypeptid bindet, umfassend

(a) das Inkontaktbringen des erfindungsgemäßen schwachen D-Polypeptids mit einer Phagenbank, die V_H- oder -V_L-Ketten oder Kombinationen davon auf der Oberfläche des Phagen aufweist, oder mit Aptameren;
(b) das Identifizieren von Phagen oder Aptameren, die an das schwache D-Polypeptid binden; und gegebenenfalls
(c) das einmalige oder mehrmalige Wiederholen der Schritte (a) und (b).

Die Präparation einer Phagenbank und das Durchmustern/Identifizieren von gewünschten Antikörpern (Ketten) an sich ist im Fachgebiet gut bekannt und zum Beispiel in Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12 (1994), 433-455 und den dort zitierten Referenzen zusammengefasst. Auch Aptamere können herkömmlichen Protokollen entsprechend präpariert und in Phagen cloniert werden. Obwohl einzelne V_H- oder -V_L-Ketten durch das erfindungsgemäße Verfahren als an das erfindungsgemäße schwache D-Polypeptid bindend identifiziert werden können, ist es bevorzugt, durch den Phagen exprimierte V_H-V_L-Kombinationen zu identifizieren, weil diese Situation der Situation einer natürlichen Antikörperbindung ähnelt. Durch das einmalige oder mehrmalige Wiederholen der Schritte (a) und (b) können bessere Bindungsspezifitäten identifiziert werden. Protokolle für die Optimierung von Bindungseigenschaften wie Affinitäten, einschließlich der Elutionsschritte zur Freisetzung der gebundenen Phagen, sind im Fachgebiet gut etabliert. Wenn zum Beispiel einmal eine V_H-Kette mit einer günstigen Bindungskapazität gefunden wurde, können V_L-Ketten identifiziert werden, die die Bindungskapazität des Antikörpers signifikant verbessern, indem z.B. die V_L-Kette, die in dem ersten Selektionsschritt mit der V_H-Kette assoziiert war, durch eine besser geeignete V_L-Kette ersetzt wird.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Identifizierung eines monoclonalen Antikörpers, der spezifisch an ein erfindungsgemäßes schwaches D-Polypeptid/Antigen bindet, umfassend

(a) das Inkontaktbringen des erfindungsgemäßen schwachen D-Polypeptids mit einem oder mehreren monoclonalen Antikörpern,
(b) das Identifizieren von monoclonalen Antikörpern, die an das schwache D-Polypeptid binden, und gegebenenfalls
(c) das einmalige oder mehrmalige Wiederholen der Schritte (a) und (b)

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifizierung einer Antikörper-V_H- oder -V_L-Kette oder einer Kombination davon oder eines Aptameren, die/das spezifisch an das erfindungsgemäße schwache D-Polypeptid/Antigen bindet, umfassend

(a) das Inkontaktbringen des schwachen D-Polypeptids und (aa) eines zweiten oder weiterer schwacher D-Polypeptide und/oder (ab) eines normalen Rhesus-D-Polypeptids, wobei das zweite oder weitere schwache D-Polypeptide und/oder das normale Rhesus-D-Polypeptid in einer molaren Masse vorliegen, die höher, gleich oder geringer als die des schwachen D-Polypeptids aus (a) ist, mit einer Phagenbank, die V_H- oder -V_L-Ketten oder Kombinationen davon auf der Oberfläche eines Phagen aufweist, oder mit Aptameren;
b) das Identifizieren von Phagen oder Aptameren, die an das schwache D-Polypeptid aus (a) binden, und gegebenenfalls
c) das einmalige oder mehrmalige Wiederholen der Schritte (a) und (b).

Besonders bevorzugt in dem Schritt (ab) ist, dass die molare Masse des zweiten schwachen D-Polypeptids und des normalen Rhesus-D-Polypeptids höher ist als die des schwachen Polypeptids von (a).
Für den Fall, dass nur eine Selektionsrunde für die Identifikation durchgeführt wird (d.h. wenn Schritt (c) nicht zur Anwendung kommt), ist es bevorzugt, dass die Anzahl der schwachen D-Polypeptid-Moleküle von (a) in einem molaren Überschuss gegenüber der Anzahl der Phagenpartikel ist. Die hier vorstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens zur Identifizierung einer Antikörper-V_H- oder -V_L-Kette oder einer Kombination davon oder eines Aptameren tragen in gleichem Maße zu dieser Ausführungsform der Erfindung bei.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifizierung eines monoclonalen Antikörpers, der spezifisch an ein erfindungsgemäßes schwaches D-Polypeptid/Antigen bindet, umfassend

(a) das Inkontaktbringen des schwachen D-Polypeptids und (aa) eines zweiten oder weiterer schwacher D-Polypeptide und/oder (ab) eines normalen D-Polypeptids, wobei das zweite oder weitere schwache D-Polypeptide und/oder das normale D-Polypeptid in einer molaren Masse vorliegt, die höher, gleich oder geringer als die des schwachen D-Polypeptids aus (a) ist, mit einem oder mehreren monoclonalen Antikörpern;
b) das Identifizieren von monoclonalen Antikörpern, die an das schwache D-Polypeptid aus (a) binden, und gegebenenfalls
c) das einmalige oder mehrmalige Wiederholen der Schritte (a) und (b).

Vorzugsweise ist schwache D-Polypeptid an der Oberfläche einer Zelle exponiert. Eine geeignete Oberfläche ist die Oberfläche eines Erythrocyten. Andere Wirtszellen können jedoch mit einem Vektor, der für die Expression des schwachen D-Polypeptids geeignet ist, transfiziert werden und es auf ihrer Oberfläche exprimieren. Antikörper können auch an rekombinante Proteine oder an Teile von Proteinen von schwachem D und an gereinigte Proteine binden.
Es ist weiterhin bevorzugt, dass das Polypeptid oder die Wirtszelle auf einem festen Träger fixiert ist. Geeignete Beispiele für feste Träger sind Mikrotiterplatten oder Kügelchen.
In einem zusätzlich bevorzugten Antikörper wird anschließend an die Schritte (b) oder (c) der folgende Schritt ausgeführt:

(d) die Identifizierung der Aminosäuresequenz der V_H- oder V_L-Ketten und/oder die Identifizierung der Nucleinsäuresequenzen, die die Aminosäuresequenz codieren.

Die Identifizierung der Aminosäure-/Nucleinsäuresequenzen kann entsprechend herkömmlicher Protokolle durchgeführt werden; siehe z.B. Sambrook et al., loc. cit.
Letztlich betrifft die Erfindung einen Kit, umfassend

(a) das Oligonucleotid der Erfindung; und/oder
(b) den Antikörper der Erfindung;
(c) das Aptamer der Erfindung; und/oder
(d) den Phagen der Erfindung.

Der erfindungsgemäße Kit, welcher verschiedene Typen von hier vorstehend beschriebenen Antikörpern umfassen kann, ist für die Analyse von schwachen Ds in Proben von Menschen besonders geeignet. Die Bestandteile des Kits können verpackt werden, wie es angemessen ist. Vorzugsweise werden die verschiedenen Bestandteile in verschiedene Fläschchen verpackt.
Die Figuren zeigen
1. Schematische Darstellung der Aminosäurevariationen, die in schwachen D-Typen mit einzelnen Missense-Mutationen beobachtet werden. Die betroffenen Aminosäuren des vorherrschenden normalen RhD-Proteins und ihre Positionen sind oben angezeigt. Ihre in den schwachen D-Typen auftretenden Substitutionen sind unterhalb des Balkens gezeigt.
2. Die cDNA-Nucleotid- und vorhergesagten Aminosäuresequenzen des vorherrschenden Allels des RHD-Gens. Gezeigt sind die Konsensus-Sequenzen, die in der EMBL-Nucleotidsequenzdatenbank unter der Zugangsnummer X54534 von Avent et al. hinterlegt und, wie in der Beschreibung bemerkt, modifiziert wurden (C bei 1036). Die Positionen der Nucleotide und Aminosäuren sind durch die Nummern oberhalb bzw. unterhalb der Sequenzen angezeigt.
3. Teil des Introns 5 der RHCE- und RHD-Gene. Die Nucleotidsequenz des RHCE-Gens ist gezeigt. Die Zahlen bezeichnen die Position in Bezug auf die erste Base von Exon 5 in dem RHCE-Gen. Striche kennzeichnen Nucleotide in dem RHD-Gen, die zu dem RHCE-Gen identisch sind. Die 5'-Bruchstellen-Region (178 bp) der Genkonversion, die für die D-Kategorie IV Typ III charakteristisch ist, ist durch Sternchen angezeigt. Die vollständigen Intron 5-Nucleotidsequenzen sind in EMBL/Genbank unter den Zugangsnummern Z97333 (RHCE) und Z97334 (RHD) hinterlegt.
4. Nachweis der schwachen D-Typen durch PCR-RFLP. Vier schwache D-Typen enthielten Punktmutationen, die Restriktionsstellen entfernen: Dem schwachen D-Typ 1 fehlt eine Alw44-Stelle (Bild A), dem schwachen D-Typ 3 eine SacI-Stelle (Bild C), dem schwachen D-Typ 4 eine AluI-Stelle (Bild D) und dem schwachen D-Typ 6 eine MspI-Stelle (Bild E). In einem fünften schwachen D-Typ führte eine Punktmutation eine Restriktionsstelle ein: Schwacher D-Typ 2 erhielt eine AluI-Stelle (Bild B). Auf der linken Seite des Gels sind 100 bp-Leitern gezeigt; die Position der 500 bp- und der 1000 bp-Fragmente sind auf der rechten Seite der Bilder angezeigt. Bei der PCR-Reaktion des Bildes A ist das größte Restriktionsfragment von ungefähr 3000 bp nicht gezeigt.
Das Beispiel veranschaulicht die Erfindung.
Beispiel: Molekulare Analyse von Proben des schwachen D-Phänotyps
Ein Verfahren für die RHD-spezifische Sequenzierung von den zehn RHD-Exons und ihren Spleißstellen wurde entwickelt (Tabelle 1 und 2). In einer sequentiellen Analysestrategie wurden Blutproben mit schwacher Expression des Antigens D mit Hilfe dieses Verfahrens, PCR-RFLP (Tabelle 3) und RHD-PCR-SSP überprüft (Gassner et al., 1997). Zu diesem Zweck wurden durch EDTA oder Citrat anticoagulierte Blutproben von weißen Blutspendern gesammelt und während der Typisierung des Spenders in Übereinstimmung mit den veröffentlichten Standards („D^u-Test") (Wissenschaftlicher Beirat der Bundesärztekammer und Bundesgesundheitsamt, 1992), wie beschrieben, als schwache D charakterisiert (Wagner et al., 1995). D-Proben der Kategorie VI wurden von dieser Studie ausgeschlossen.
Codierende Sequenz von RHD in schwachen D-Phänotypen. Sequenzierung der zehn RHD-Exons aus genomischer DNA. DNA wurde, wie vorher beschrieben, präpariert (Gassner et al., 1997). Die Nucleotidsequenzierung wurde mit einer DNA-Sequenzierungseinheit (Prism dye terminator cycle-Sequenzierungskit mit AmpliTaq FS-DNA-Polymerase; ABI 373A, Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland) durchgeführt. Die Nucleotidsequenzierung der genomischen DNA-Bereiche, die alle zehn RHD-Exons und Teile des Promotors repräsentieren (siehe nachstehend), wurde unter der Verwendung von Primern (Tabelle 1) und Amplifikationsprozeduren (Tabelle 2) durchgeführt, die die Notwendigkeit von Subclonierungs-schritten vermeiden.
Kontrolle der RHD-Spezifität. Die RHD-Exons 3 bis 7 und 9 tragen mindestens ein RHD-spezifisches Nucleotid, welches verwendet wurde, um den RHD-Ursprung der Sequenzen zu verifizieren. Für Exon 1 wurden charakteristische Nucleotide in den benachbarten Teilen von Intron 1 verwendet (EMBL-Nucleotidsequenzdatenbank-Zugangsnummern Z97362 und Z97363). Für Exon 8 wurde die RHD-Spezifität der PCR-Amplifikation durch RHD-unspezifische Sequenzierung des aussagekräftigen Exons 9 überprüft, da die Exons 8 und 9 als gemeinsames PCR-Amplikon amplifiziert wurden (Tabelle 2). Die Exons 2 und 10 wurden auf der Basis von veröffentlichten RHD-spezifischen Nucleotidsequenzen (EMBL-Nucleotidsequenzdatenbank-Zugangsnummern 066340 und 066341; Kemp et al., 1996; Le Van Kim et al., 1992) auf eine RHD-spezifische Art amplifiziert; in den RhD-Negativkontrollen wurden keine PCR-Amplikons erhalten. Alle normalen D- und schwachen D-Proben zeigten ein G an Position 654 (Arce et al., 1993) und ein C an Position 1036 (Le Van Kim et al., 1992), was die Annahme unterstützt (Cartron, 1996), dass das alternativ beschriebene C (Le Van Kim et al., 1992) bzw. T (Arce et al., 1993) Sequenzfehler darstellen.
Nachweis von für schwaches D spezifischen Mutationen durch PCR-RFLP und RHD-PCR-SSP. PCR-RFLP ebenso wie RHD-PCR-SSP (Gassner et al., 1997) wurden entwickelt oder angewendet, um in fünf RHD-Allelen nachgewiesene unterschiedliche Nucleotidsubstitutionen zu charakterisieren (siehe auch Tabellen 3 und 4): Die Substitution von C zu G an Position 8 führte zum Verlust einer SacI-Restriktionsstelle in Amplikons, die mit re01 und re11d erhalten wurden (G zu A bei 29, Verlust einer MspI-Stelle, re01/re11d; C zu A bei 446, Verlust einer AluI-Stelle, rb20d/rb21d, T zu G bei 809, Verlust einer Alw44I-Stelle, rf51/re71; G zu C bei 1154, Einführung einer AluI-Stelle, re82/re93). Die Bedingungen für die rf51/re71-PCR-Reaktion waren, wie in Tabelle 2 gezeigt. Die rb20d/rb21d-Reaktion wurde mit einer Taq-Polymerase ohne Korrekturlesung (Boehringer Mannheim oder Qiagen) mit 20 s Denaturierung bei 94°C, 30 s Anelierung bei 60°C und 30 s Extension bei 72°C durchgeführt. Die anderen PCR-Reaktionen wurden mit einer Taq-Polymerase ohne Korrekturlesung mit 20 s Denaturierung bei 94°C, 30 s Anelierung bei 55°C und 1 min Extension bei 72°C durchgeführt.
Weitere vier RHD-Allele wurden durch eine Standard-RHD-PCR-SSP¹⁵ nachgewiesen: Den RHD(T201R, F223V)- und RHD(S182T, K198N, T201R)-Allelen fehlten spezifische Amplikons des RHD-Exons 4, den RHD(G307R)- und RHD(A276P)-Allelen die des RHD-Exons 6. Bei allen anderen schwachen D-Typen wurde die Authentizität der Punktmutationen durch Nucleotidsequenzierung von unabhängigen PCR-Amplikons überprüft.
Sequenzierung der Exons 6 bis 9 in D^IV Typ III. In dem D^IV Typ III wurden die Exons 6 bis 9 unter der Verwendung von RHCE- und RHD-spezifischen Primern amplifiziert und sequenziert. Dafür wurde der Primer re71 (Tabelle 2) durch den Primer rb7 ersetzt; Primer re621 durch rb26 und Primer re52 durch re74.
16 RHD-Allele mit unterschiedlichen Nucleotidaustauschen, die Aminosäuresubstitutionen codieren, wurden identifiziert (Tabelle 4). Ein Allel stellte ein typisches, noch unveröffentlichtes RHD-CE-D-Hybridallel dar, das D^IV Typ III genannt wurde. Ein weiteres Allel war DHMi (Liu et al., 1996). Von den verbleibenden 14 Allelen zeigten 12 einzelne, aber unterschiedliche bisher unbekannte Missense-Mutationen. Keine der codierten Aminosäurevarianten traten an den entsprechenden Positionen in den RhCE-Proteinen auf. Zwei Allele zeigten für das RHCE-Gen typische mehrfache Nucleotidaustausche, welche mit RHD-spezifischen Sequenzen durchsetzt waren.
Verteilung von schwachen D-Allelen bei Weißen. Ein Satz von 161 Proben mit schwacher Expression des D-Antigens wurde aus zufälligen Blutspendern in Südwest-Deutschland ausgewählt. D-Proben der Kategorie VI, aber keine anderen partiellen D wurden durch serologische Verfahren ausgeschlossen. Somit repräsentierten drei Proben bekanntes partielles D (DHMi (Liu et al., 1996) und D der Kategorie IV (Lomas et al., 1989)). Ohne jegliche Ausnahme konnten alle Proben bestimmten RHD-Allelen mit abweichenden codierenden Sequenzen zugeordnet werden (Tabelle 5). Zum Zweck der vorliegenden Erfindung wird vorgeschlagen, dass die neuen molekularen schwachen D-Typen mit Trivialnamen bezeichnet werden sollten, z.B. schwaches D Typ I, oder mit ihren molekularen Strukturen, z.B. RHD (V270G). Schwaches D Typ I war das häufigste bekannte RHD-Allel (f=1:277) mit einer abweichenden codierenden Sequenz, wobei die Häufigkeit sogar höher als bei dem D^VII-Allel war (Wagner et al., 1997).
Aminosäuresubstitutionen in schwachen D-Allelen kommen gehäuft vor. Die Aminosäuresubstitutionen, die in schwachen D-Typen mit einzelnen Missense-Mutationen beobachtet wurden, waren nicht gleichmäßig in dem RhD-Protein verteilt (1). Die Mehrzahl der Substitutionen trat in dem Bereich der Aminosäurepositionen 267 bis 397 auf. Einzelne und mehrfache Aminosäuresubstitutionen in kleineren Teilbereichen des RhD-Proteins um die Positionen 2 bis 13, 149 und 179 bis 225 herum (schwaches D Typ 4 und 14) wurden ebenfalls in schwachen D-Allelen gefunden. Dem gegenwärtigen RhD-Schleifenmodell entsprechend wurden die beteiligten Aminosäuren in den Transmembran- und den intrazellulären Proteinsegmenten positioniert.
Kontrollen mit normalem RhD-Phänotyp und RHD-Promotor. Sechs Kontrollproben mit normalem RhD-Phänotyp zeigten nach RHD-spezifischer Sequenzierung der zehn RHD-Exons eine normale RhD-Proteinsequenz. Um den RHD-Promotor auf Mutationen zu überprüfen, wurde eine 675 bp-Region unter der Verwendung des Primerpaars rb13 und rb11d amplifiziert (Tabelle 2). Die Promotorregion wurde unter der Verwendung der Primer re02 und re01 beginnend mit der Nucleotidposition –545 in Bezug auf das erste Nucleotid des Startcodons sequenziert. Eine Probe von jedem schwachen D-Typ, DHMi, und D^IV Typ III wurde eingesetzt. Es wurde keine Abweichung von der veröffentlichten RHD-Promotorsequenz (Huang, 1996) gefunden.
Statistische Evidenz, dass Missense-Mutationen schwache D-Phänotypen verursachen können. Die Häufigkeit von veränderten RhD-Proteinen in schwachen D-Proben (158 von 158) und normalen D-Proben (0 von 6) war statistisch signifikant unterschiedlich (p<0,0001, 2×2 Kontingenz-Tabelle, genauer Fisher-Test). Das Auftreten einer normalen RhD codierenden Sequenz bei einem schwachen D-Phänotyp wurde zu weniger als 1,9% erwartet (Obergrenze von 95% Konfidenzintervall, Poisson-Verteilung). Aufgrund von zwei Beobachtungen wurde weiterhin ausgeschlossen, dass diese Aminosäuresubstitutionen nur zufällige Nucleotidaustausche wiedergeben: (i) In den 417 Codons des RHD-Gens können 2766 Missense- und 919 stille Mutationen auftreten. Wenn die Nucleotidaustausche in schwachen D-Allelen zufällig wären, würden stille Mutationen mit einer Häufigkeit von 0,249 erwartet werden. Unter insgesamt 18 Mutationen in schwachen D-Allelen wurde eine stille Mutation beobachtet (p=0,039, binomiale Verteilung). Es wurde angenommen, dass Nonsense-Mutationen die RhD-Expression verhindern (Avent et al., 1997b) und sie wurden daher aus der Berechnung ausgeschlossen. (ii) 1796 bp des RHD-Gens wurden sequenziert, was 1251 bp codierende Sequenz und 545 bp nicht-codierende Sequenz darstellt. Wenn die Nucleotidaustausche zufällig wären, würde ihr Auftreten in der nicht-codierenden Sequenz der schwachen D-Allele mit einer Häufigkeit von 0,303 erwartet werden. Alle 18 Mutationen befanden sich jedoch in der codierenden Sequenz (p=0,005, binomiale Verteilung).
Haplotyp-spezifische RHD-Polymorphismen. Die Introns 3 und 6 wurden analysiert. Um das RHD-Intron 3 durch RFLP zu überprüfen, wurde der 3'-Teil von Intron 3 unter der Verwendung von dem RHD-spzifischen Primerpaar rb46 und rb12 amplifiziert und die PCR-Produkte mit HaeIII gespalten. Um TATT-Tandemwiederholungen in dem RHD-Intron 6 zu untersuchen, wurde das Intron 6 in voller Länge unter der Verwendung des RHD-spezifischen Primerpaars rf51 und re71 und des Primers rg62 für die Verwendung in einer Sequenzierung amplifiziert.
Polymorphe RHD-Sequenzen, die zwischen den vorherrschenden RHD-Allelen der CDe- und cDE-Haplotypen verschieden waren, wurden nachgewiesen (Tabelle 6). In dem RHD-Intron 3 gab es einen G/C-Polymorphismus, der einen HaeIII-RFLP an Position –371 in Bezug auf den Intron 3/Exon 4-Übergang bestimmte. In dem RHD-Intron 6 gab es eine TATT-Tandemwiederholung mit variabler Länge, die 1915 bp 3' von Exon 6 begann. In dem vorherrschenden RHD-Allel des CDe-Haplotyps war die HaeIII-Restriktionsstelle vorhanden und die TATT-Wiederholungsregion umfasste 9 Wiederholungen. In dem vorherrschenden RHD-Allel des cDE-Haplotyps war die HaeIII-Restriktionsstelle nicht vorhanden und die TATT-Wiederholungsregion umfasste 8 Wiederholungen. Die schwachen D-Allele waren hinsichtlich dieser Polymorphismen in Intron 3 und 6 zu den vorherrschenden Allelen des gleiche RHD-Haplotyps identisch, mit der einzigen Ausnahme des schwachen D Typ 4, das 13 TATT-Wiederholungen zeigte. Es wurde geschlossen, dass die schwachen D-Allele in den verschiedenen RHD-Haplotypen in unabhängiger Weise evolvierten. Tabelle 1. Verwendete Primer
Tabelle 2. Sequenzierungsverfahren für alle zehn RHD-Exons aus genomischer DNA
Tabelle 3. PCR-RFLP-Analyse von fünf RHD-Allelen

Tabelle 7. Vorhersage der Lokalisierung der RhD-Proteinsegmente in Bezug auf die Erythrocytenmembran
Tabelle 8. RhD-Epitopdichte der Proben für schwache D-Typen.
Eine Probe jedes schwachen D-Typs wurde mit einem polyclonalen anti-D (Lorne Laboratories Ltd., Redding, Berkshire, England) getestet, wie vorher beschrieben (Flegel und Wagner, 1996). Ähnliche Ergebnisse wurden mit monoclonalem anti-D erhalten (BS228, Biotest AG, Dreieich, Deutschland; und p3x290, Diagast, Lille, Frankreich).
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nucleinsäuremolekül, das ein Rhesus-D-Antigen codiert, welches zu dem schwachen D-Phänotyp beiträgt oder indikativ dafür ist, wobei das Nucleinsäuremolekül verglichen mit dem Wildtyp-Rhesus-D-Antigen mindestens eine Missense-Mutation in seinen Transmembran- und/oder seinen intrazellulären Bereichen trägt.
Nucleinsäuremolekül, das ein Rhesus-D-Antigen codiert, welches zu dem schwachen D-Phänotyp beiträgt oder indikativ dafür ist, wobei das Nucleinsäuremolekül verglichen mit dem Wildtyp-Rhesus-D-Antigen mindestens eine Missense-Mutation an den Aminosäurepositionen 2-16, 114-149, 179-225 und/oder 267-397 trägt, mit der Maßgabe, dass das D-Antigen keine einzelne Missense-Mutation trägt, die zu einer Substitution von Phenylalanin an Aminosäureposition 223 durch Valin oder von Threonin an Position 283 durch Isoleucin führt.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Missense-Mutation eine Aminosäuresubstitution an Position 3, 10, 16, 114, 149, 182, 198, 201, 220, 223, 270, 276, 277, 282, 294, 295, 307, 339, 385 oder 393 oder eine Kombination davon verursacht oder die Substitutionen einschließt, mit der Maßgabe, dass das D-Antigen keine einzelne Missense-Mutation trägt, die zu einer Substitution von Phenylalanin an der Aminosäureposition 223 durch Valin führt.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 3, wobei die Aminosäuresubstitution an Position 3 von Ser zu Cys, in Position 10 von Arg zu Gln, in Position 16 von Trp zu Cys, in Position 114 von Arg zu Trp, in Position 149 von Ala zu Asp, in Position 182 von Ser zu Thr, in Position 198 von Lys zu Asn, in Position 201 von Thr zu Arg, in Position 220 von Trp zu Arg, in Position 223 von Phe zu Val ist, mit der Maßgabe, dass Substitution nicht auf einer einzelnen Missense-Mutation basiert, die zu einer Substitution von Phenylalanin in Aminosäureposition 223 durch Valin, in Position 270 von Val zu Gly, in Position 276 von Ala zu Pro, in Position 277 von Gly zu Glu, in Position 282 von Gly zu Asp, in Position 294 von Ala zu Pro, in Position 295 von Met zu Ile, in Position 307 von Gly zu Arg, in Position 339 von Gly zu Glu, in Position 385 von Gly zu Ala und in Position 393 von Trp zu Arg führt.
Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Missense-Mutation an Nucleotidposition 8, 29, 48, 340, 446, 544, 594, 602, 658, 667, 809, 819, 826, 830, 845, 880, 885, 919, 1016, 1154 oder 1177 oder in einer Kombination dieser Positionen auftritt, mit der Maßgabe, dass das codierte D-Antigen keine einzelne Missense-Mutation trägt, die zu einer Substitution von Phenylalanin durch Valin an der Aminosäureposition 223 führt.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 5, wobei die Missense-Mutation in Position 8 von C zu G, in Position 29 von G zu A, in Position 48 von G zu C, in Position 340 von C zu T, in Position 446 von C zu A, in Position 544 von T zu A, in Position 594 von A zu T, in Position 602 von C zu G, in Position 658 von T zu C, in Position 667 von T zu G, in Position 809 von T zu G, in Position 819 von G zu A, in Position 826 von G zu C, in Position 830 von G zu A, in Position 845 von G zu A, in Position 880 von G zu C, in Position 885 von G zu T, in Position 919 von G zu A, in Position 1016 von G zu A, in Position 1154 von G zu C und in Position 1177 von T zu C ist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Kombination von Substitutionen in den Positionen 182, 198 und 201 ist, und vorzugsweise S182T, K198N, T201R ist, oder in Position 201 und 223 ist, und vorzugsweise T201R und F223V ist, oder in Position 16, 201 und 223 und vorzugsweise W16C, T201R und F223V ist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Kombination von Missense-Mutationen die Positionen 544, 594 und 602 umfasst und vorzugsweise T→A an Position 544, A→T an Position 594 und C→G an Position 602 ist, oder die Positionen 602, 667 und 819 umfasst, und vorzugsweise C→G an Position 602, T→G an Position 667 und G→A an Position 819 ist, oder die Positionen 48, 602, 667 und 819 umfasst und vorzugsweise G→C an Position 48, C→G an Position 602, T→G an Position 667 und G→A an Position 819 ist.
Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das mRNA oder genomische DNA ist.
Vektor, der das Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 9 umfasst.
Nicht-menschlicher Wirt, der mit dem Vektor nach Anspruch 10 transformiert ist.
Verfahren zu Herstellung eines Rhesus-D-Antigens, das zu dem schwachen D-Phänotyp beiträgt, umfassend das Züchten des Wirts nach Anspruch 11 unter geeigneten Bedingungen und Isolieren des hergestellten Rhesus D-Antigens.
Rhesus-D-Antigen, das durch das Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 9 codiert wird, oder das durch das Verfahren nach Anspruch 12 hergestellt wird.
Oligonucleotid, das mit einem Teil des Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder mit dem komplementären Strang davon spezifisch hybridisiert, wobei der Teil mindestens eine Missense-Mutation umfasst.
Antikörper oder Aptamer oder Phage, der/das spezifisch an das Rhesus-D-Antigen nach Anspruch 13 bindet.
Antikörper oder Aptamer oder Phage, der/das spezifisch an das Wildtyp-Rhesus-D-Antigen oder an abweichende Rhesus-D-Antigene, jedoch nicht an das Rhesus-D-Antigen nach Anspruch 13 bindet.
Verfahren zum Testen auf die Anwesenheit eines Nucleinsäuremoleküls in einer Probe, das ein Rhesus-D-Antigen codiert, welches zu dem schwachen D-Phänotyp beiträgt, umfassend das Hybridisieren des Oligonucleotids nach Anspruch 14 unter stringenten Bedingungen mit Nucleinsäuremolekülen, die in der menschlichen Probe enthalten sind, und Nachweis der Hybridisierung.
Verfahren nach Anspruch 17, das weiterhin das Verdauen des Produkts der Hybridisierung mit einer Restriktionsendonuclease und das Analysieren des Produkts des Verdauens umfasst.
Verfahren zum Testen der Anwesenheit eines Nucleinsäuremoleküls in einer Probe, das ein Rhesus-D-Antigen codiert, welches zu dem schwachen D-Phänotpy beiträgt oder indikativ dafür ist, umfassend das Bestimmen der Nucleinsäuresequenz von mindestens einem Teil des Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Teil mindestens eine der Missense-Mutationen codiert, oder eines Nucleinsäuremoleküls, das ein Rhesus-D-Antigen codiert, welches zu dem schwachen D-Phänotyp beiträgt, wobei das Nucleinsäuremolekül im Vergleich zum Wildtyp-Rhesus-D-Antigen eine Kombination von Missense-Mutationen trägt, wobei eine der Missense-Mutationen eine Aminosäuresubstitution in Position 223 oder 283 verursacht, die in Position 223 vorzugsweise von Phe zu Val und in Position 283 vorzugsweise von Thr zu Ile ist, wobei die Missense-Mutation weiterhin vorzugsweise an Nucleotidposition 667 oder 848 auftritt, wobei am meisten bevorzugt die Mutation in Position 667 von T zu G und in Position 848 von C zu T ist.
Verfahren nach Anspruch 19, das weiterhin das Amplifizieren mindestens des Teils des Nucleinsäuremoleküls vor der Bestimmung der Nucleinsäuresequenz umfasst.
Verfahren zum Testen auf die Anwesenheit eines Nucleinsäuremoleküls in einer Probe, das ein Rhesus-D-Antigen codiert, das zu dem schwachen D-Phänotyp beiträgt oder indikativ dafür ist, umfassend das Ausführen einer Amplifikationsreaktion, wobei mindestens einer der verwendeten Primer in der Amplifikationsreaktion das Oligonucleotid nach Anspruch 14 ist, und Untersuchen des Amplifikationsprodukts.
Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, wobei die Amplifikation durch Polymerasekettenreaktion (PCR) bewirkt wird oder die Polymerasekettenreaktion ist.
Verfahren zum Testen auf die Anwesenheit eines Rhesus-D-Antigens in einer Probe, das zu dem schwachen D-Phänotyp beiträgt oder indikativ dafür ist, umfassend das Untersuchen einer menschlichen Probe auf die spezifische Bindung an den Antikörper oder Aptamer oder Phagen nach Anspruch 15.
Verfahren zum Testen einer Probe auf die Anwesenheit eines Wildtyp-Rhesus-D-Antigens und die Abwesenheit des Rhesus-D-Antigens nach Anspruch 13 umfassend das Untersuchen einer menschlichen Probe auf die spezifische Bindung an einen Antikörper oder Aptamer oder Phagen nach Anspruch 16.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 24, wobei die Probe Blut, Serum, Plasma, Fötusgewebe, Speichel, Urin, Schleimhautgewebe, Schleim, Vaginalgewebe, Fetalgewebe von der Vagina, Haut, Haar, Haarfollikel oder anderes menschliches Gewebe ist.
Verfahren nach Anspruch 25, umfassend das Anreichern von Fetalzellen oder die Extraktion von fetaler DNA oder mRNA aus mütterlichem Gewebe, wie peripheres Blut, Serum oder Plasma.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 26, wobei das Nucleinsäuremolekül oder das proteinartige Material von der Probe auf einem festen Träger fixiert ist.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei der feste Träger ein Chip ist.
Verwendung des Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder eines Nucleinsäuremoleküls, das ein Rhesus-D-Antigen codiert, welches zu dem schwachen D-Phänotyp beiträgt oder indikativ dafür ist, wobei das Nucleinsäuremolekül im Vergleich zu dem Wildtyp-Rhesus-D-Antigen eine Kombination von Missense-Mutationen trägt, wobei eine der Missense-Mutationen eine Aminosäuresubstitution in Position 223 oder 283 verursacht, die in Position 223 vorzugsweise von Phe zu Val und in Position 283 vorzugsweise von Thr zu Ile ist, wobei die Missense-Mutation weiterhin vorzugsweise in den Nucleotidpositionen 667 oder 848 auftritt, wobei am meisten bevorzugt die Mutation an Position 667 von T zu G und in Position 848 von C zu T ist, oder einer Kombination davon zur Analyse eines schwachen Rhesus-D-Phänotyps.
Verwendung des Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 9, des Vektors nach Anspruch 10 oder des Rhesus-D-Antigens nach Anspruch 13 zur Bewertung der Affinität, Avidität und/oder Reaktivität von monoclonalen Antikörpern oder polyclonalen Antiseren, vorzugsweise Anti-D-Antiseren, Antiglobulin oder Anti-Mensch-Globulin-Antiseren.
Verfahren zur Charakterisierung von monoclonalen Antikörpern oder polyclonalen Antiseren oder eines Präparats davon, wobei das Verfahren umfasst: (a) Testen der Nucleinsäure der Probe eines Probanden auf die Anwesenheit einer Mutation gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 8; (b) Korrelieren der Nucleinsäure mit der RhD-Antigendichte auf der Oberfläche der Erythrocyten des Probanden auf der Grundlage des Mutationsstatus und des Allelstatus des RhD-Gens; (c) Reagieren der monoclonalen Antikörper oder der polyclonalen Antiseren oder des Präparats davon mit einer Zelle, die das RhD-Antigen auf ihrer Oberfläche trägt; (d) Charakterisieren der monoclonalen Antikörper oder polyclonalen Antiseren oder des Präparats davon auf der Grundlage der in Schritt (c) erhaltenen Ergebnisse.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Charakterisierung die Bestimmung der Reaktivität, Sensitivität, Avidität, Affinität, Spezifität und/oder anderer Charakteristika der Antikörper und Antiseren umfasst.
Verfahren nach Anspruch 31 oder 32, wobei die Zelle, die das RhD-Antigen auf ihrer Oberfläche trägt, ein Erythrocyt ist.
Verwendung eines Aptameren, Phagen, monoclonalen Antikörpers oder von polyclonalen Antiseren wie in den Ansprüchen 15 oder 16 charakterisiert oder eines Präparats davon zur RhD-Antigenbestimmung.
Verwendung nach Anspruch 34, wobei die RhD-Antigenbestimmung in Zusammenhang mit der Blutgruppenbestimmung durchgeführt wird.
Präparat, das den Antikörper oder das Aptamer oder den Phagen nach Anspruch 15 oder 16 umfasst.
Verfahren zur Identifizierung einer Antikörper-V_H- oder -V_L-Kette oder einer Kombination davon oder eines Aptameren, die spezifisch an ein schwaches D-Antigen nach Anspruch 13 binden, umfassend: (a) Inkontaktbringen des schwachen D-Antigens nach Anspruch 13 mit einer Phagenbank, die V_H- oder V_L-Ketten oder Kombinationen davon auf der Oberfläche des Phagen aufweist, oder mit Aptameren, (b) Identifizieren von Phagen oder Aptameren, die an das schwache D-Antigen binden, und gegebenenfalls (c) einmaliges oder mehrmaliges wiederholen der Schritte (a) und (b).
Verfahren zur Identifizierung eines monoclonalen Antikörpers, der spezifisch an ein schwaches D-Polypeptid/Antigen nach Anspruch 13 bindet, umfassend: (a) Inkontaktbringen des schwachen D-Polypeptids nach Anspruch 13 mit einem oder mehreren monoclonalen Antikörpern, (b) Identifizieren von monoclonalen Antikörpern, die an das schwache D-Polypeptid binden, und gegebenenfalls (c) einmaliges oder mehrmaliges Wiederholen der Schritte (a) und (b).
Verfahren zur Identifizierung einer Antikörper-V_H- oder -V_L-Kette oder einer Kombination davon oder eines Aptameren, die spezifisch an das schwache D-Polypeptid/Antigen nach Anspruch 13 binden, umfassend: (a) Inkontaktbringen des schwachen D-Polypeptids und (aa) eines zweiten oder weiterer schwacher D-Polypeptide und/oder (ab) eines normalen D-Polypeptids, wobei das zweite oder weitere schwache Polypeptide und/oder das normale Polypeptid in einer molaren Masse vorliegen, die höher, gleich oder geringer als die des schwachen D-Polypeptids aus (a) ist, mit einer Phagenbank, die V_H- oder V_L-Ketten oder Kombinationen davon auf der Oberfläche des Phagen aufweist, oder mit Aptameren; (b) Identifizieren von Phagen oder Aptameren, die an das schwache D-Polypeptid aus (a) binden, und gegebenenfalls (c) einmaliges oder mehrmaliges Wiederholen der Schritte (a) und (b).
Verfahren zur Identifizierung eines monoclonalen Antikörpers, der spezifisch an ein schwaches D-Polypeptid/Antigen nach Anspruch 13 bindet, umfassend: (a) Inkontaktbringen des schwachen D-Polypeptids und (aa) eines zweiten oder weiterer schwacher D-Polypeptide und/oder (ab) eines normalen D-Polypeptids, wobei das zweite oder weitere schwache D-Polypeptide und/oder das normale D-Polypeptid in einer molaren Masse vorliegt, die höher, gleich oder geringer als das schwache D-Polypeptid aus (a) ist, mit einem oder mehreren monoclonalen Antikörpern; (b) Identifizieren von monoclonalen Antikörpern, die an das schwache D-Polypeptid aus (a) binden, und gegebenenfalls (c) einmaliges oder mehrmaliges Wiederholen der Schritte (a) und (b).
Verfahren nach einem der Ansprüche 37 bis 40, wobei das schwache D-Polypeptid an der Oberfläche einer Zelle exponiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 37 bis 41, wobei das Polypeptid oder die Wirtszelle auf einem festen Träger fixiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 37 bis 42, wobei anschließend an die Schritte (b) oder (c) der folgende Schritt ausgeführt wird: (d) Identifizieren der Aminosäuresequenz der V_H- oder V_L-Ketten und/oder Identifizieren der Nucleinsäuresequenz, die die Aminosäuresequenz codiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 41 bis 43, wobei, wenn nur eine Selektionsrunde zur Identifizierung durchgeführt wird, die Anzahl der schwachen D-Polypeptidmoleküle aus (a) im molaren Überschuss gegenüber der Anzahl der Phagenpartikel vorliegt.
Verfahren zur Bewertung der Affinität, Avidität und/oder Reaktivität der monoclonalen Anti-D-Antikörper oder der polyclonalen Anti-D-Antiseren oder von Antiglobulin oder von Anti-Mensch-Globulin-Antiseren oder Präparaten davon, wobei Zellen von Probanden, vorzugsweise Erythrocyten, die das RhD-Antigen nach Anspruch 13 umfassen, verwendet werden, und wobei in einem ersten Schritt das Rhesus-D-Gen eines Trägers oder eines Blutspenders und sein Allelstatus analysiert werden, ob eine Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 anwesend ist.
Verfahren zur Bestimmung, ob ein Patient, der eine Bluttransfusion braucht, eine Transfusion mit RhD-negativem Blut eines Spenders erhalten soll, umfassend den Schritt: Testen einer Probe des Patienten auf die Anwesenheit von einem oder mehreren RhD-Antigenen nach Anspruch 13, wobei ein positives Testergebnis für mindestens eines der Antigene Indikativ dafür ist, dass ein Bedarf an einer Transfusion mit RhD-negativem Blut besteht.
Verfahren zur Bestimmung, ob Blut eines Spenders zur Transfusion für einen Patienten verwendet werden kann, der sie braucht, umfassend den Schritt: Testen einer Probe des Spenders auf die Anwesenheit von einem oder mehreren RhD-Antigenen nach Anspruch 13, wobei ein positives Testergebnis für mindestens eines der Antigene die Transfusion von Patienten ausschließt, die typisiert wurden, dass sie Wildtyp-RhD-Antigen oder (einen) schwache(n) D-Typ(en) haben, der/die anders sind als der/die schwache(n) D-Typ(en) des Spenders.
Kit, umfassend: (a) das Oligonucleotid nach Anspruch 14; und/oder (b) den Antikörper nach Anspruch 15; und/oder (c) den Antikörper nach Anspruch 16 (d) das Aptamer nach Anspruch 15 oder 16 und/oder (e) den Phagen nach Anspruch 15 oder 16.