JP2002500884A

JP2002500884A - リーサスウィークｄ表現型と相関する新規核酸分子

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Publication number: JP2002500884A
Application number: JP2000528671A
Authority: JP
Inventors: フレーゲル，ヴィリー，アー．; ワーグナー，フランツ，エフ．
Original assignee: デーエルカーブルーツペンデディーンストバーデン−ヴュルテンベルクゲーゲーエムベーハー
Priority date: 1998-01-23
Filing date: 1998-12-18
Publication date: 2002-01-15
Also published as: AU748222B2; CA2318486A1; EP1047777B1; ES2241195T3; DE69829587D1; EP1047777A2; IL137424A0; PT1047777E; BR9815090A; WO1999037763A2; DE69829587T2; WO1999037763A9; BRPI9815090B1; CA2318486C; AU2274699A; ATE292176T1; WO1999037763A3; US7005276B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、１つのミスセンス突然変異またはミスセンス突然変異の組合せか、ＲＨＤおよびＲＨＣＥ遺伝子の第６〜第９エキソンが関係する遺伝子変換を特徴とするウィークＤ表現型の一因となるリーサス（Ｒｈｅｓｕｓ）Ｄ抗原をコードする新規核酸分子に関する。さらに本発明は、本発明の核酸分子を含むベクター、そのベクターで形質転換された宿主、上記核酸分子によってコードされるタンパク質、およびそれらのポリペプチドを生産する方法に関する。上記のミスセンス突然変異と遺伝子変換をウィークＤ表現型に直接相関させうるという事実は、血液検体の日常検査に著しい影響を持つ。例えば検体中のウィークＤ表現型の検出を広く可能にするオリゴヌクレオチドと抗体を今では設計することができる。そのようなオリゴヌクレオチド、抗体と、種々の診断方法は全て、本発明の範囲に包含される。本新規核酸分子によってコードされるＲｈＤ抗原はモノクローナルおよびポリクローナル抗Ｄ抗血清の特徴づけ、標準化および品質管理に利用できる。最後に本発明はウィークＤ表現型の存在について検査するのに役立つキットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、１つのミスセンス突然変異またはミスセンス突然変異の組合せか、
ＲＨＤおよびＲＨＣＥ遺伝子の第６〜第９エキソンが関係する遺伝子変換を特徴
とするウィークＤ表現型の一因となるリーサス（Ｒｈｅｓｕｓ）Ｄ抗原をコード
する新規核酸分子に関する。さらに本発明は、本発明の核酸分子を含むベクター
、そのベクターで形質転換された宿主、上記核酸分子によってコードされるタン
パク質、およびそれらのポリペプチドを生産する方法に関する。上記のミスセン
ス突然変異と遺伝子変換をウィークＤ表現型に直接相関させうるという事実は、
血液検体の日常検査に著しい影響を持つ。例えば検体中のウィークＤ表現型の検
出を広く可能にするオリゴヌクレオチドと抗体を今では設計することができる。
そのようなオリゴヌクレオチド、抗体と、種々の診断方法は全て、本発明の範囲
に包含される。本新規核酸分子によってコードされるＲｈＤ抗原はモノクローナ
ルおよびポリクローナル抗Ｄ抗血清の特徴づけ、標準化および品質管理に利用で
きる。最後に本発明はウィークＤ表現型の存在について検査するのに役立つキッ
トに関する。

【０００２】ＲｈＤタンパク質が持っているリーサスＤ抗原（ＩＳＢＴ００４．００１；
ＲＨ１）は、タンパク質によって決定される最も重要な血液型抗原である。これ
は今も新生児溶血性疾患の主要原因である（Ｍｏｌｌｉｓｏｎら，１９９３）。
白人の約０．２％〜１％は、Ｄ抗原の発現が低下している（ウィークＤ（以前は
Ｄ^uといった））赤血球を持っている（Ｍｏｕｒａｎｔら，１９７６；Ｓｔｒａｔｔｏｎ，１９４６；Ｗａｇｎｅｒら，１９９５）。ウィークＤ検体のごく一部
は、質的に変化したＲｈＤタンパク質（これはパーシャル（ｐａｒｔｉａｌ）Ｄ
と呼ばれる（Ｓａｌｍｏｎら，１９８４）により説明され、それはしばしばＲＨ
Ｄ／ＲＨＣＥ雑種対立遺伝子によって引き起こされる（最近、Ｈｕａｎｇ（１９
９７）に概説されている）。また別の一部はトランス位にあるＣｄｅハプロタイ
プの抑制作用によって引き起こされる（Ｃｅｐｐｅｌｌｉｎｉら，１９５５）。
これらのウィークＤは、その保因者の両親と子供がしばしば正常なＲｈＤ抗原密
度を発現することから、おそらく正常なＲＨＤ対立遺伝子を持つ。このようなウ
ィークＤは、ＲｈＤ抗原発現の軽微な低下しか示さず、大雑把に「ハイグレード
（ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ）Ｄ^u」と呼ばれていたが、モノクローナル抗Ｄ抗体の感度の向上ゆえに、現在ではしばしば正常ＲｈＤとして型別される。

【０００３】中等度ないし強度に弱められた抗原Ｄの大部分は、その弱いＤ発現がそのＲｈ
Ｄ表現型と一緒に遺伝されることから（Ｓｔｒａｔｔｏｎ，１９４６）、リーサ
ス遺伝子座そのものか、その近傍に位置する１つまたは複数の遺伝子型によるも
のである。単なる量的低下の他には、この最も一般的なタイプのウィークＤのＲ
ｈＤ抗原に質的な相違を認めることはできなかった。最近行なわれた２つの研究
ではこの一般的なウィークＤ表現型の分子的原因が扱われた。Ｒｏｕｉｌｌａｃ
ら（１９９６）とＢｅｃｋｅｒｓら（１９９７）の両グループはＲＴ−ＰＣＲを
行い、ウィークＤ検体中のＲＨＤｃＤＮＡを配列決定したが、突然変異は何も
見つからなかった。Ｒｏｕｉｌｌａｃら（１９９６）は、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
を用いて、ウィークＤ検体中のＲＨＤ転写物の定常状態レベルが低下しているこ
とを報告し、彼らの観察が正常な赤血球とウィークＤ赤血球との間のＲｈＤの単
に量的な相違の直接的な証拠になると発表した。しかしＢｅｃｋｅｒｓら（１９
９５と１９９７）は、同様のアプローチで、ＲＨＤ転写物の量に相違を見出さず
、その産物が赤血球膜中に不十分にしか（または全く）組み込まれえないスプラ
イスバリアント（variant ）（Ｂｅｃｋｅｒｓら，１９９７）の過剰について排
除した（Ｋａｊｉｉら，１９９５）。彼らは、ウィークＤは転写過程の調節欠損
によって引き起こされるのではないと結論し、ウィークＤの考えうる原因として
、Ｒｈ関連複合体に関与する未同定の調節遺伝子または因子を挙げた。それゆえ
に、弱いＤ発現の機序はあいまいなままであり、分子的原因は何も確立されなか
った。

【０００４】ランダムなウィークＤ検体をＰＣＲによりＲＨＤ特異的多形に関してスクリー
ニングしたところ、正常なＲＨＤ対立遺伝子に典型的なＰＣＲ増幅パターンが確
認された（Ａｖｅｎｔら，１９９７ｂ；Ｌｅｇｌｅｒら，１９９７）。しかし、
パーシャルＤに相当することが知られていない極めてわずかなウィークＤが構造
的に異常なＲＨＤ対立遺伝子を保有するらしいという証拠が蓄積しつつあった。
すなわち、イギリスでの４４例のウィークＤのうち４例はＲＨＤ特異的な第４イ
ントロンのＰＣＲアンプリコンを欠き（Ａｖｅｎｔら，１９９７ｂ）、ドイツ北
部での９４例のウィークＤのうち１例はＲＨＤ特異的な第５エキソンのＰＣＲア
ンプリコンを欠いていた（Ｌｅｇｌｅｒら，１９９７）。後者の例では、６６７
位のヌクレオチドＴが、Ｆ２２３Ｖアミノ酸置換をコードするＲＨＣＥ特異的な
Ｇによって置換されていた（ＴＪＬｅｇｌｅｒとＡＨｕｍｐｅの私信）。

【０００５】このように、異常対立遺伝子はウィークＤ表現型のごく一部でしか観測されず
、そのことが、分子レベルでのこれらの変化が実際にウィークＤ表現型の一般的
現象の原因であるという可能性を疑わしいものにしていた（Ａｕｂｉｎら，１９
９７；Ａｖｅｎｔら，１９９７ｂ；Ｆｕｋｕｍｏｒｉら，１９９７；Ｈｕａｎｇ
，１９９７；ＩｓｓｉｔｔおよびＴｅｌｅｎ，１９９６；Ｒｏｕｂｉｎｅｔら，
１９９６も参照されたい）。結果として、先行技術を総合しても、検体中のウィ
ークリーサスＤ表現型の検出に簡便に応用できて信頼できる手段を、今まで提供
することができないでいた。

【０００６】したがって、本発明の根底にある技術的課題は、リーサスウィークＤ表現型の
分析に簡便に広く使用できる、そのような手段と方法を確立することであった。

【０００７】上述の技術的課題の解決は、本特許請求の範囲に特徴づける態様を提供するこ
とによって達成される。したがって本発明は、ウィークＤ表現型の一因となるか
それを指し示すリーサスＤ抗原をコードする核酸分子であって、野生型リーサス
Ｄ抗原と比較してその膜貫通領域および／または細胞内領域に少なくとも１つの
ミスセンス突然変異を保持するものに関する。

【０００８】本発明によれば、「ウィークＤ表現型の一因となる」という用語がアミノ酸交
換によって引き起こされるであろうその突然変異の積極的役割を含意するのに対
して、「ウィークＤ表現型を指し示す」という用語は必ずしもそのような役割を
意味するのではなく、サイレント突然変異も指しうる。そのようなサイレント突
然変異は、例えば、以下に詳述するミスセンス突然変異などの他の突然変異と共
に生じてもよい。

【０００９】本発明によれば、観察されたミスセンス突然変異は、赤血球膜へのＲｈＤタン
パク質組み込みの減少と関連するだけでなく、実際にそれを引き起こすことが見
出された。したがって本発明により、（ｉ）ウィークＤ対立遺伝子は異なるハプ
ロタイプで独立して生成したものであって、それぞれ別個の事象がＲｈＤコード
配列中のある変化と関連すること；（ｉｉ）１６４検体中に１６種類の対立遺伝
子が観察されたにもかかわらず、正常なコード配列を持つ検体は存在しなかった
こと；および（ｉｉｉ）観察されたヌクレオチド置換のタイプと分布はランダム
変化の帰無仮説には合致しなかったこと、が実証される。

【００１０】ＲＨＤ中のミスセンス突然変異がＤ抗原発現の低下につながるという発見は、
ＲｈＤ膜組み込みの最新のモデルに合致した（Ｔａｂｌｅ７参照）。両Ｒｈタン
パク質は、ＬＷ、ＣＤ４７、およびグリコホリンＢのようないくつかの付加的タ
ンパク質によって結合されうるＲｈ５０タンパク質との複合体中に見出される（
Ｈｕａｎｇ，１９９７）。Ｒｈ複合体全体の発現は、少なくとも一つのＲｈタン
パク質（ＩＳＢＴ／ＤＧＴＩ会議（１９９７年９月フランクフルト）でのＪＰ
Ｃａｒｔｏｎによる口頭発表）とＲｈ５０タンパク質（Ｃｈｅｒｉｆ−Ｚａｈａ
ｒら，１９９６）の完全性に依存する。ミスセンス突然変異によって引き起こさ
れるＲｈ５０タンパク質の微細な構造上の変化は、Ｒｈ複合体の発現を妨げるの
に充分である（Ｃｈｅｒｉｆ−Ｚａｈａｒら，１９９６）。同様に、ＲｈＤタン
パク質中のそのような微細な構造上の変化もまた、ＲｈＤが関わるＲｈ複合体の
発現に影響を及ぼすようである。

【００１１】アミノ酸置換の分布と種類に基づいて、ＲｈＤ構造とＲｈＤ発現の関係の一般
像をここに確立できる。すなわち、上記の最新モデルに従ってアラインメントを
行なった場合、ウィークＤ中の全てのアミノ酸置換は、ＲｈＤタンパク質の細胞
内または膜貫通部分に位置する（Ｔａｂｌｅ７参照）。外部表面（ｅｘｏｆａｃ
ｉａｌ）置換を持つ既知のＲＨＤ対立遺伝子（Ａｖｅｎｔら，１９９７ａ；Ｊｏ
ｎｅｓら，１９９７；Ｌｉｕら，１９９６；Ｒｏｕｉｌｌａｃら，１９９５）は
それらのパーシャルＤ抗原ゆえに発見されたが、それらは離散的（ＤＮＵおよび
Ｄ^VII）ないし中等度（Ｄ^II、ＤＨＲおよびＤＨＭｉ）のＲｈＤ発現の低下を示しうる（ＦｌｅｇｅｌおよびＷａｇｎｅｒ，１９９６；Ｊｏｎｅｓら，１９９７
；Ｊｏｎｅｓら，１９９６）。本発明に従って報告される大半の置換は非保存的
であり、導入されたアミノ酸（特にプロリン）はおそらく二次または三次構造を
破壊しているだろう。２つのウィークＤ対立遺伝子（２型と１１型）は保存的置
換を伴い、２９５位と３８５位の関与アミノ酸領域が最適なＲｈＤ膜組み込みに
とって極めて重要であることを示した。２つの対立遺伝子（４型と１４型）では
、第４と第５エキソンの一部がＲＨＣＥ遺伝子の対応する部分で置換されていた
。同様の交換は、ＲｈＤタンパク質発現のかなりの低下を示すＤ^VIＩ型とＤ^VIＩ
Ｉ型にも見出された（Ｊｏｎｅｓら，１９９６）。第３エキソン中のＮ１５２Ｔ
置換が膜組み込みを容易にすると考えると、先の逆説的観察を説明できる。つま
り、（ｉ）Ｎ１５２Ｔ置換をウィークＤ４型との唯一の相違点とするＤ^IIIa（Ｈ
ｕａｎｇら，１９９７）は正常なＲｈＤ抗原密度を持ち（Ｊｏｎｅｓら，１９９
６）、（ｉｉ）Ｎ１５２Ｔ置換を保有するＤ^IIIc、Ｄ^IVaおよびＤ^VIＩＩＩ型は、それらの適当な対照（正常ＲｈＤおよびＤ^VIＩＩ型）と比較して、抗原密度が
増加している（Ｆｌｅｇｅｌら，１９９７；Ｊｏｎｅｓら，１９９６）。

【００１２】Ｄ^VI、Ｄ^V、ＤＢＴ、一部のＤ^IVとＤＦＲのような、弱いＤ発現を伴ういくつかの表現型は、ずっと以前に、抗Ｄを産生するというそれらの保因者の性質によ
り、別々の物として認識された（Ｌｏｍａｓら，１９９４；Ｔｉｐｐｅｔｔおよ
びＳａｎｇｅｒ，１９７７；ＴｉｐｐｅｔｔおよびＳａｎｇｅｒ，１９６２）。
その後、モノクローナル抗Ｄとの異なる反応パターンによってこれらの表現型が
確認されグループ分けされた（Ｌｏｍａｓら，１９９３；Ｌｏｍａｓら，１９８
９；Ｓｃｏｔｔ，１９９６）。しかし、大部分のウィークＤ表現型はモノクロー
ナル抗Ｄとの一貫した反応パターンを持たず、それらの保因者は抗Ｄ免疫化を起
こしにくいようであったため、その血清学的分類は成功していない（Ｍｏｏｒｅ
，１９８４）。また、正常なＤとウィークＤの間の境界線さえ明確にされていな
かった（Ａｇｒｅら，１９９２；Ｍｏｏｒｅ，１９８４；Ｎｅｌｓｏｎら，１９
９５）。それにもかかわらず、ウィークＤ表現型でのＲｈＤ抗原密度（１細胞あ
たりの抗原数）の変動性（Ｈａｓｅｋｕｒａら，１９９０；Ｊｏｎｅｓら，１９
９６；Ｎｅｌｓｏｎら，１９９５；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら，１９９１；Ｔａｚｚ
ａｒｉら，１９９４；Ｗａｇｎｅｒ，１９９４）と、ＲＨＤＰＣＲでの稀な異
常パターン（Ａｖｅｎｔら，１９９７ｂ；Ｌｅｇｌｅｒら，１９９７）から、そ
の根底にある分子的多様性は排除されなかった。本発明は、ウィークＤの簡便な
分類を始めて可能にし、別個の対立遺伝子の臨床データとの明瞭な相関を初めて
可能にするものである。先に定義された稀なＲＨＤ対立遺伝子と共に、低下した
Ｄ抗原密度を持つ表現型の大部分の正確な分子的定義が、ここに可能になる。特
定の分子タイプのウィークＤを保有する患者が抗Ｄを発達させやすい場合は、本
発明によって可能になった分類が、リーサス陰性輸血方針を誘導する助けになる
だろう。分子構造とＲｈＤ抗原密度に関して特徴づけられたウィークＤ検体を入
手できることは、抗Ｄ試薬の品質保証を促進するだろう。それらは、発端者（pr
oband ）を、そのＲｈＤタンパク質が頻繁な抗Ｄ免疫化を起こしにくいＲｈＤ陽
性として、確実に型別するはずである（Ｗａｇｎｅｒら，１９９５）。したがっ
て、抗Ｄ免疫化の推定上の可能性によって正当化されてきた、ウィークＤ患者へ
の輸血のためのＲｈＤ陰性赤血球ユニットの使用は、最終的に、科学的に演繹で
きる最小限まで減らすことができる。

【００１３】また、本発明によれば、当該突然変異は、リーサスＤポリペプチドの一定の区
間（certain stretches ）に密集することが見出された。さらに、ウィークＤ表
現型と相関する遺伝子変換も検出された。このように本発明は、ウィークＤ表現
型の一因となるかそれを指し示すリーサスＤ抗原をコードする核酸分子であって
、（ａ）野生型リーサスＤ抗原と比較して、アミノ酸位置２〜１６、１１４〜１４
９、１７９〜２２５または／および２６７〜３９７に、少なくとも一つのミスセ
ンス突然変異を保持する（ただし、そのＤ抗原はアミノ酸位置２２３にあるフェ
ニルアラニンのバリンによる置換または位置２８３にあるトレオニンのイソロイ
シンによる置換につながる単一ミスセンス突然変異を保持しないものとする）か
、もしくは、（ｂ）第６〜第９エキソンが関わり、それらがＲＨＣＥ遺伝子の対応するエキソ
ンによって置換される遺伝子変換を保持するもの、に関する。

【００１４】本発明に従って見出され上記の領域中に位置するミスセンス突然変異はすべて
、上に示したＲｈＤの最新モデルを使用すると、そのポリペプチドの膜貫通領域
か細胞内部分と関係する。しかし、異なるモデルを使用すると、ウィークＤ表現
型と関係する突然変異が細胞外領域に見出される場合もある。上記の領域は、最
新モデルを適用した場合に細胞外領域に位置するアミノ酸位置も含んでいる。そ
れらの位置も突然変異を起こし、ウィークＤ表現型と相関させうるかもしれない
。そのような突然変異も本願の範囲に包含される。

【００１５】ミスセンス突然変異の他に、ウィークＤを指し示す遺伝子変換も同定された。
その遺伝子変換は、基本的にミスセンス突然変異と同じ程度に、診断目的に使用
できる。本発明によれば、切断点（ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ）は第５と第９イント
ロンにあると決定される（Ｆｉｇ．３も参照されたい）。

【００１６】上記の、また本明細書のあらゆる部分で言及する、突然変異体は、ＲｈＤ診断
、予防および治療に関連して使用されるモノクローナルおよびポリクローナル抗
体の特徴づけに、簡便に使用できる。例えば、そのような突然変異体をコードす
る所望の核酸分子を適当な系で発現させることにより、上記の抗体または抗血清
の反応性プロフィールを確立することができる。当該突然変異体は、二次抗体と
して使用されるモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体（例えば抗グロブ
リンおよび抗ヒトグロブリン抗血清）の特徴づけにも使用できる。

【００１７】上記ミスセンス突然変異は、３、１０、１６、１１４、１４９、１８２、１９
８、２０１、２２０、２２３、２７０、２７６、２７７、２８２、２９４、２９
５、３０７、３３９、３８５または３９３位でのアミノ酸置換、もしくはそれら
置換の組み合わせ、またはそれら置換を含む置換を引き起こすことが好ましい。

【００１８】この好ましい態様は、上に示した単一突然変異の他に、これらの置換の組み合
わせを含んでもよい。また、上述した置換の１つまたはそれ以上を含み、かつ、
置換につながる突然変異などの追加の突然変異が存在する可能性も考えられる。
本発明によれば、そのような追加の突然変異は、検体中のＲｈＤ状態を評価する
時に検査できると理解される。そのような突然変異の発見により、当業者は、上
記の第一突然変異と組み合わせて見出される本明細書に同定する他の突然変異が
存在すると結論できるだろう。したがって、本明細書に同定する突然変異と組み
合わせて見出される追加の突然変異の検出を反映したそれらの態様も、本発明に
包含される。

【００１９】本発明の核酸分子のとりわけ好ましい態様として、上記のアミノ酸置換は、３
位ではＳｅｒからＣｙｓ、１０位ではＡｒｇからＧｌｎ、１６位ではＴｒｐから
Ｃｙｓ、１１４位ではＡｒｇからＴｒｐ、１４９位ではＡｌａからＡｓｐ、１８
２位ではＳｅｒからＴｈｒ、１９８位ではＬｙｓからＡｓｎ、２０１位ではＴｈ
ｒからＡｒｇ、２２０位ではＴｒｐからＡｒｇ、２２３位ではＰｈｅからＶａｌ
、２７０位ではＶａｌからＧｌｙ、２７６位ではＡｌａからＰｒｏ、２７７位で
はＧｌｙからＧｌｕ、２８２位ではＧｌｙからＡｓｐ、２９４位ではＡｌａから
Ｐｒｏ、２９５位ではＭｅｔからＩｌｅ、３０７位ではＧｌｙからＡｒｇ、３３
９位ではＧｌｙからＧｌｕ、３８５位ではＧｌｙからＡｌａ、３９３位ではＴｒ
ｐからＡｒｇへの置換である。

【００２０】本発明の核酸分子のさらに好ましい一態様では、上記ミスセンス突然変異がヌ
クレオチド位置８、２９、４８、３４０、４４６、５４４、５９４、６０２、６
５８、６６７、８０９、８１９、８２６、８３０、８４５、８８０、８８５、９
１９、１０１６、１１５４および１１７７、もしくはそれらの位置の組み合わせ
で起こる。

【００２１】上記のミスセンス突然変異は、８位ではＣからＧ、２９位ではＧからＡ、４８
位ではＧからＣ、３４０位ではＣからＴ、４４６位ではＣからＡ、５４４位では
ＴからＡ、５９４位ではＡからＴ、６０２位ではＣからＧ、６５８位ではＴから
Ｃ、６６７位ではＴからＧ、８０９位ではＴからＧ、８１９位ではＧからＡ、８
２６位ではＧからＣ、８３０位ではＧからＡ、８４５位ではＧからＡ、８８０位
ではＧからＣ、８８５位ではＧからＴ、９１９位ではＧからＡ、１０１６位では
ＧからＡ、１１５４位ではＧからＣ、１１７７位ではＴからＣであることが、と
りわけ好ましい。

【００２２】ミスセンス突然変異の組み合わせがウィークＤ表現型の発生に関与する場合、
その置換の組み合わせは１８２位、１９８位および２０１位にあって好ましくは
Ｓ１８２Ｔ、Ｋ１９８Ｎ、Ｔ２０１Ｒであるか、２０１位と２２３位にあって好
ましくはＴ２０１ＲとＦ２２３Ｖであるか、１６位、２０１位および２２３位に
あって好ましくはＷ１６Ｃ、Ｔ２０１ＲおよびＦ２２３Ｖであることが好ましい
。

【００２３】最も好ましくは、ミスセンス突然変異の上記の組み合わせが５４４位、５９４
位および６０２位を含んで、好ましくは５４４位がＴ→Ａ、５９４位がＡ→Ｔ、
６０２位がＣ→Ｇであるか、または６０２位、６６７位および８１９位を含んで
、好ましくは６０２位がＣ→Ｇ、６６７位がＴ→Ｇ、８１９位がＧ→Ａであるか
、または４８位、６０２位、６６７位および８１９位を含んで、好ましくは４８
位がＧ→Ｃ、６０２位がＣ→Ｇ、６６７位がＴ→Ｇ、８１９位がＧ→Ａである。

【００２４】本発明の核酸分子は（半）合成によるものを含めて様々な起源を持ちうるが、
本核酸分子はｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡであることが好ましい。上記の核酸は
いずれも標準的な方法を使って得ることができる。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら「
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕ
ａｌ」（第二版，１９８９，ＣＳＨＰｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプ
リングハーバー）を参照されたい。

【００２５】また本発明は、本発明の核酸分子を含んでなるベクターに関する。

【００２６】本ベクターは増殖および／または発現に使用でき、また遺伝子導入や遺伝子タ
ーゲティング用にも設計できる。そのようなベクターを作成する方法は、当技術
分野でよく知られている。突然変異の核酸を上記のベクターにクローニングする
ことや、適当な宿主におけるベクターの増殖などにも、同じことが言える。

【００２７】具体的には、本ベクターは、従来から遺伝子操作に使用されているプラスミド
、コスミド、ウイルスまたはバクテリオファージであって、本発明の核酸分子を
含んでなるものでありうる。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴
ウイルス、ヘルペスウイルス、ウシパピローマウイルスなどのウイルスに由来す
る発現ベクターは、本発明の核酸分子またはベクターを、標的細胞集団に送達す
るために使用できる。組換えウイルスベクターの構築には、当業者によく知られ
ている方法を使用できる。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」（コールドスプリング
ハーバー研究所（１９８９）ニューヨーク州）やＡｕｓｕｂｅｌ「Ｃｕｒｒｅｎ
ｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」（Ｇｒ
ｅｅｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓａｎｄＷｉｌｅｙ
Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ニューヨーク州（１９８９））に記載の技術を参照
されたい。もう一つの選択肢として、標的細胞に送達するために、本発明のポリ
ヌクレオチドとベクターをリポソーム中に再構成することもできる。本発明の核
酸分子を含有するベクターは、細胞宿主のタイプに応じて変わる周知の方法によ
って宿主細胞に導入できる。例えば、原核細胞には塩化カルシウムトランスフェ
クションがよく使用されるのに対して、他の細胞宿主にはリン酸カルシウム処理
やエレクトロポレーションを使用できる。例えば上記Ｓａｍｂｒｏｏｋの著書を
参照されたい。

【００２８】このようなベクターは、適当な条件下に適当な宿主細胞でのそのベクターの選
択を可能にするマーカー遺伝子などといった、さらなる遺伝子を含みうる。本発
明の核酸分子は、原核細胞または真核細胞での発現を可能にする発現制御配列に
作動可能に連結されることが好ましい。上記ポリヌクレオチドの発現には、その
ポリヌクレオチドの翻訳可能なｍＲＮＡへの転写が含まれる。真核細胞（好まし
くは哺乳類細胞）での発現を確実にする調節配列は当業者によく知られている。
それらは通常、転写の開始を確実にする調節配列と、随意に転写の終結と転写物
の安定化を確実にするポリＡシグナルとを含む。その他の調節配列としては転写
および翻訳エンハンサーおよび／または天然に付随しているまたは異種のプロモ
ーター領域が挙げられる。原核宿主細胞での発現を可能にする調節配列としては
、例えば大腸菌でのＰＬ、ｌａｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモーターが考えられ
、真核宿主細胞での発現を可能にする調節配列の例は、酵母でのＡＯＸ１または
ＧＡＬ１プロモーターや、哺乳類細胞と他の動物細胞でのＣＭＶ−、ＳＶ４０−
、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）−プロモーター、ＣＭＶ−エンハンサー、ＳＶ
４０−エンハンサー、グロビンイントロンである。これらの調節配列には、転写
の開始を担う配列の他に、当該核酸分子の下流にあるＳＶ４０−ポリＡ部位やｔ
ｋ−ポリＡ部位などの転写終結シグナルも含まれうる。さらにまた、使用する発
現系に依存して、そのポリペプチドをある細胞区画に導いたりそれを培地中に分
泌させる能力を持つリーダー配列を、本発明のポリヌクレオチドのコード配列に
付加してもよく、それらのリーダー配列は当技術分野でよく知られている。その
（それらの）リーダー配列は、適当な相で翻訳、開始および終結配列と共に組み
立てられ、好ましくはペリプラズムスペースまたは細胞外培地中に翻訳されたタ
ンパク質またはその一部を分泌させる能力を持つリーダー配列である。随意に、
その異種配列が、所望の特徴（例えば発現された組換え産物の安定化や、その精
製の簡略化）を付与するＣ−またはＮ−末端識別ペプチドを含む融合タンパク質
をコードしてもよい。この関連で好適な発現ベクターは、例えばＯｋａｙａｍａ
−ＢｅｒｇｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐＣ
ＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎ−ｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ社）またはｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社）など、当技術分野で知ら
れている。

【００２９】発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトできるベク
ター中の真核プロモーター系であることが好ましいが、原核宿主用の制御配列も
使用できる。

【００３０】上述のように、本発明のベクターは、遺伝子導入ベクターまたは遺伝子ターゲ
ティングベクターであってもよい。エクスビボ法またはインビボ法による細胞へ
の治療用遺伝子の導入に基づく遺伝子治療は、遺伝子導入の最も重要な応用の一
つである。インビトロまたはインビボ遺伝子治療に好適なベクターと方法は文献
に記述されており、当業者に知られている。例えば、Ｇｉｏｒｄａｎｏ，Ｎａｔ
ｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ２（１９９６），５３４−５３９；Ｓｃｈａｐｅｒ
，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７９（１９９６），９１１−９１９；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，
Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６（１９９２），８０８−８１３；Ｉｓｎｅｒ，Ｌａｎｃ
ｅｔ３４８（１９９６），３７０−３７４；Ｍｕｈｌｈａｕｓｅｒ，Ｃｉｒｃ
．Ｒｅｓ．７７（１９９５），１０７７−１０８６；Ｗａｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ２（１９９６），７１４−７１６；ＷＯ９４／２９４６９；
ＷＯ９７／００９５７またはＳｃｈａｐｅｒ，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎ
ｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７（１９９６），６３５−６４０と、そ
れらに引用されている文献を参照されたい。本発明のポリヌクレオチドとベクタ
ーは細胞に直接導入するように設計してもよいし、リポソームやウイルスベクタ
ー（例えばアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター）を使って導入す
るように設計してもよい。その細胞は生殖系列細胞、胚細胞または卵細胞または
そこから派生した細胞であることが好ましく、その細胞は幹細胞であることが最
も好ましい。

【００３１】さらに本発明は、本発明のベクターで形質転換された宿主に関する。

【００３２】適切な宿主には、トランスジェニック動物や、細菌、酵母細胞、動物（好まし
くは哺乳類）細胞、真菌細胞または昆虫細胞などの細胞が含まれる。トランスフ
ェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどの形質転
換プロトコールも当技術分野ではよく知られている。

【００３３】また本発明は、ウィークＤ表現型の一因となるリーサスＤ抗原を生産する方法
であって、本発明の宿主を適当な条件下に培養する工程、産生されたリーサスＤ
抗原を単離する工程を含む方法に関する。

【００３４】抗原は培養培地中に導出されることが好ましく、その場合はそれを慣例／方法
に従って集めることができる。本発明で使用する場合、「培養（する）」という
用語には、トランスジェニック動物の飼育も含まれる。適切なベクター構造と、
随意に適切な飼料とを使用することにより、例えばトランスジェニック乳牛の乳
から抗原を単離することなどができる。

【００３５】さらに本発明は、本発明の核酸分子によってコードされる、または本発明の方
法によって生産される、リーサスＤ抗原に関する。

【００３６】その抗原は、天然の抗原と同じように翻訳後修飾され、天然の抗原と同じ化学
構造を持つことが好ましい。したがって、本発明の方法によって生産される場合
、上記の抗原はヒト細胞で生産されることが好ましい。

【００３７】さらにまた、本発明は、ストリンジェントな条件で、上記少なくとも一つのミ
スセンス突然変異を含む本発明核酸分子の一部またはその相補部分にハイブリッ
ド形成する、もしくは上に同定した遺伝子変換の切断点にハイブリッド形成する
、オリゴヌクレオチドに関する。

【００３８】本発明のこの態様では、当該オリゴヌクレオチドは、突然変異配列または切断
点に直接ハイブリッド形成すると解される。ストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件の設定は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＨａｎｄｂｏｏｋ」（ＣＳＨＰｒ
ｅｓｓ，コールドスプリングハーバー，１９８９）やＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇ
ｉｎｓ「Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ａｐｒ
ａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ」（ＩＲＬＰｒｅｓｓ，オクスフォード（
１９８５））などに詳述されている。したがって、特異的にハイブリッド形成す
る配列の検出には、通常、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃などのハイ
ブリダイゼーションおよび洗浄条件が必要だろう。よく知られているように、プ
ローブの長さと、決定しようとする核酸の組成は、ストリンジェントなハイブリ
ダイゼーション条件のさらなるパラメーターを構成する。本オリゴヌクレオチド
はデオキシヌクレオチドであることが好ましい。また、本オリゴヌクレオチドは
１２〜５０ヌクレオチド、好ましくは１５〜２４ヌクレオチドからなることが、
さらに好ましい。切断点へのハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条
件または非ストリンジェントな条件で行ないうる。非ストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件の一例は、４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０℃でのハイ
ブリダイゼーションと洗浄である。

【００３９】さらに本発明は、本発明のリーサスＤ抗原に特異的に結合する抗体またはアプ
タマーに関する。

【００４０】本抗体は、チューブ、ゲル、固相での凝集技術や二次抗体を使うまたは使わな
い捕捉技術のような、当技術分野でよく知られている任意の血清学的技術や、免
疫蛍光強化法を使うまたは使わないフローサイトメトリーで、試験および使用で
きる。

【００４１】本発明の抗体はモノクローナル抗体でもよいし、ポリクローナル抗血清から得
られる抗体またはポリクローナル抗血清に含まれる抗体でもよい。本明細書で使
用する場合、「抗体」という用語には、その抗体の断片（例えばＦａｂ、Ｆ（ａ
ｂ’）₂、ＦｖまたはｓｃＦｖ断片など）も含まれる。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ」（ＣＳＨＰｒｅｓｓ１９８８，ニューヨーク州コールドスプリングハー
バー）を参照されたい。本抗体またはその断片は自然界に由来してもよいし、（
半）合成的に生産されてもよい。そのような合成産物には、本発明の抗体と同じ
または本質的に同じ結合特異性を有する半タンパク質物質として、非タンパク質
も含まれる。そのような産物は例えばペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｅｍｉｍｅ
ｔｉｃｓ）によって得ることができる。

【００４２】さらに本発明は、野生型リーサスＤ抗原または異常Ｄリーサス抗原に特異的に
結合するが、本発明のリーサスＤ抗原には特異的に結合しない抗体またはアプタ
マーまたはファージに関する。本抗体は、チューブ、ゲルおよび固相法での凝集
技術や、捕捉技術、または免疫蛍光法を使うまたは使わないフローサイトメトリ
ーのような、当技術分野でよく知られている任意の血清学的技術で、試験および
使用できる。

【００４３】抗体またはアプタマーの定義、試験および起源については、上記と同じ定義が
ここにも当てはまる。

【００４４】「異常リーサスＤ抗原」という用語に関して、この用語には、ＲＨＤ遺伝子と
、それに対応する抗原とに見出される先行技術のミスセンス突然変異および先行
技術の遺伝子変換が含まれる。

【００４５】「アプタマー」という用語は当技術分野ではよく知られており、例えばＯｓｂ
ｏｒｎｅら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｉ（１９９７），５−
９や、ＳｔａｌｌおよびＳｚｏｋａ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１２（１９９５），
４６５−４８３などに定義されている。

【００４６】さらにまた、本発明は、検体中の、ウィークＤ表現型の一因となるかそれを指
し示すリーサスＤ抗原をコードする核酸分子の存在について検査する方法であっ
て、本発明のオリゴヌクレオチド、またはウィークＤ表現型の一因となるかそれ
を指し示すリーサスＤ抗原をコードする核酸分子にハイブリッド形成するオリゴ
ヌクレオチド（ここに、該核酸分子は野生型リーサスＤ抗原と比較して少なくと
も一つのミスセンス突然変異を保持し、該ミスセンス突然変異は２２３位または
２８３位でのアミノ酸置換（２２３位ではＰｈｅからＶａｌへの置換が好ましく
、２８３位ではＴｈｒからＩｌｅへの置換が好ましい）を引き起こし、該ミスセ
ンス突然変異はヌクレオチド位置６６７または８４８で起こることがさらに好ま
しく、その場合、その突然変異は６６７位ではＴからＧへ、また８４８位ではＣ
からＴへの突然変異であることが最も好ましい）を、ストリンジェントな条件で
、あるヒトから得た検体中に含まれる核酸分子にハイブリッド形成させる工程、
そのハイブリダイゼーションを検出する工程を含んでなる方法に関する。

【００４７】この本発明の方法は、上記ハイブリダイゼーションの産物を制限エンドヌクレ
アーゼで消化する工程か、上記ハイブリダイゼーションの産物を制限エンドヌク
レアーゼによる消化にさらし、その消化の産物を分析する工程を、さらに含むこ
とが好ましい。

【００４８】本発明のこの好ましい態様は、簡便な手段によって、効果的なハイブリダイゼ
ーションと、非効果的なハイブリダイゼーションの識別を可能にする。例えば、
野生型リーサスＤ抗原がエンドヌクレアーゼ制限部位を含む場合、そのハイブリ
ッド形成産物は適切な制限酵素によって切断され得るのに対し、突然変異配列は
二本鎖産物を与えないか、もしくは認識可能な制限部位を含まず、したがって切
断されないことになろう。もう一つの選択肢として、ハイブリッド形成するオリ
ゴヌクレオチドが突然変異配列だけにハイブリッド形成してもよい。この場合は
、突然変異配列を含むハイブリッドだけが、適切な制限酵素によって切断され、
野生型配列は切断されないことになる。消化産物の分析は、慣例の手段で、例え
ばゲル電気泳動（これは随意に、例えば臭化エチジウムなどによる核酸の染色と
組み合わせてもよい）などによって、達成できる。サザンブロット法などの他の
技術との組み合わせも考えられる。

【００４９】上記ハイブリダイゼーションの検出は、例えば抗ＤＮＡ二本鎖抗体によって、
または標識オリゴヌクレオチドを使用することなどによって、達成できる。本発
明の方法は、サザンブロット法やノーザンブロット法などのブロット技術および
その関連技術と共に使用すると簡便である。標識は例えば標準的プロトコールで
達成でき、標識には放射活性マーカー、蛍光標識、燐光標識、化学発光標識、酵
素標識などによる標識が含まれる。

【００５０】さらに本発明は、検体中の、ウィークＤ表現型の一因となるかそれを指し示す
リーサスＤ抗原をコードする核酸分子の存在について検査する方法であって、本
発明の核酸分子の少なくとも一部〔ここに、該部分は上記ミスセンス突然変異ま
たは上記遺伝子変換の切断点またはウィークＤ表現型の一因となるかそれを指し
示すリーサスＤ抗原をコードする核酸分子（ここに、該核酸分子は野生型リーサ
スＤ抗原と比較して少なくとも一つのミスセンス突然変異を保持し、該ミスセン
ス突然変異は２２３位または２８３位でのアミノ酸置換（２２３位ではＰｈｅか
らＶａｌへの置換が好ましく、２８３位ではＴｈｒからＩｌｅへの置換が好まし
い）を引き起こし、該ミスセンス突然変異はヌクレオチド位置６６７または８４
８で起こることがさらに好ましく、その場合、その突然変異は６６７位ではＴか
らＧへ、また８４８位ではＣからＴへの突然変異であることが最も好ましい）の
少なくとも１つをコードする〕の核酸配列を決定する工程を含んでなる方法に関
する。

【００５１】この本発明の方法は、上記の核酸配列を決定する工程の前に、上記核酸分子の
少なくとも上記部分の増幅工程を、さらに含むことが好ましい。

【００５２】増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって達成することが好ましい。
リガーゼ連鎖反応などの他の増幅法も使用してよい。

【００５３】さらにまた、本発明は、検体中の、ウィークＤ表現型の一因となるかそれを指
し示すリーサスＤ抗原をコードする核酸分子の存在について検査する方法であっ
て、増幅反応を行なう工程（ここに、その増幅反応で使用されるプライマーの少
なくとも一つは、本発明のオリゴヌクレオチドであるか、もしくはウィークＤ表
現型の一因となるリーサスＤ抗原をコードする核酸分子（ここに、該核酸分子は
野生型リーサスＤ抗原と比較して少なくとも一つのミスセンス突然変異を保持し
、該ミスセンス突然変異は２２３位または２８３位でのアミノ酸置換（２２３位
ではＰｈｅからＶａｌへの置換が好ましく、２８３位ではＴｈｒからＩｌｅへの
置換が好ましい）を引き起こし、該ミスセンス突然変異はヌクレオチド位置６６
７または８４８で起こることがさらに好ましく、その場合、その突然変異は６６
７位ではＴからＧへ、また８４８位ではＣからＴへの突然変異であることが最も
好ましい）にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドである）、その増幅産物
についてアッセイする工程を含む方法に関する。

【００５４】この本発明の方法は、標的配列がその突然変異または少なくとも一つの突然変
異を保持する場合、その標的配列のみの増幅をもたらすであろう。これは、その
オリゴヌクレオチドが、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件で、野生型配列にはハイブリッド形成せず（その結果、増幅産物は何も得ら
れない）、突然変異配列にのみハイブリッド形成するからである。当然、この本
発明の方法では、１つまたはそれ以上の、例えば２つの突然変異配列にハイブリ
ッド形成するプライマーオリゴヌクレオチドを使用してよい。後者の態様は、突
然変異の組み合わせについて検査する場合に、好都合だろう。全ての上記突然変
異が必ずしもミスセンス突然変異ではなく、もしくは全ての上記突然変異が必ず
しもミスセンス突然変異でないことに注意することが重要である。このことは、
他のタイプの突然変異が上記のミスセンス突然変異または上記の遺伝子変換と組
み合わせて見出される場合に、当てはまりうる。

【００５５】本発明の方法では、上記の増幅または増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）であるか、ポリメラーゼ連鎖反応によって達成されることが好ましい。リガ
ーゼ連鎖反応などの他の増幅法も使用してよい。

【００５６】さらに本発明は、検体中の、ウィークＤ表現型の一因となるかそれを指し示す
リーサスＤ抗原の存在について検査する方法であって、あるヒトから得られた検
体を、本発明の抗体またはアプタマーまたはファージへの、もしくはウィークＤ
表現型の一因となるかそれを指し示すリーサスＤ抗原であって、野生型リーサス
Ｄ抗原と比較して少なくとも一つのミスセンス突然変異を保持する核酸分子（該
ミスセンス突然変異は２２３位または２８３位でのアミノ酸置換（２２３位では
ＰｈｅからＶａｌへの置換が好ましく、２８３位ではＴｈｒからＩｌｅへの置換
が好ましい）を引き起こし、該ミスセンス突然変異はヌクレオチド位置６６７ま
たは８４８で起こることがさらに好ましく、その場合、その突然変異は６６７位
ではＴからＧへ、また８４８位ではＣからＴへの突然変異であることが最も好ま
しい）によってコードされる抗原に対する抗体またはアプタマーまたはファージ
への、特異的結合についてアッセイする工程を含んでなる方法に関する。

【００５７】結合に関する検査は、やはり、ＥＬＩＳＡなどの標準的技術の使用を伴いうる
。例えばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」（ＣＳＨＰｒｅｓｓ１９８８，コールドスプリ
ングハーバー）を参照されたい。

【００５８】また本発明は、野生型リーサスＤ抗原の存在と本発明のリーサスＤ抗原の非存
在について検体を検査する方法であって、あるヒトから得た検体を、野生型リー
サスＤ抗原または異常Ｄリーサス抗原には特異的に結合するが本発明のリーサス
Ｄ抗原には特異的に結合しない本発明の抗体またはアプタマーまたはファージへ
の特異的結合についてアッセイする工程を含む方法に関する。

【００５９】本発明の方法に従って得られる結果は、上に概論したように、輸血の方策に利
用されるだろう。

【００６０】本発明の方法では、上記の検体は血液、血清、血漿、胎児組織、唾液、尿、粘
膜組織、粘液、膣組織、膣から得られる胎児組織、皮膚、毛髪、毛包または他の
ヒト組織であることが好ましい。

【００６１】さらにまた、本発明の方法は、胎児細胞の濃縮工程を含むことが好ましい。こ
の濃縮は、胎児細胞を特異的に結合する適切な抗体、レクチンまたは他の試薬を
使用することによって、または例えば密度勾配によるなどの、母体細胞と胎児細
胞の弁別的分離を図る任意の技術によって達成できる。また好ましくは、上記の
方法では、末梢血、血清または血漿などの材料組織から胎児ＤＮＡまたはｍＲＮ
Ａを抽出できる（従来の方法に従うとよい）。

【００６２】本発明方法のもう一つの好ましい態様では、上記の検体に由来する上記の核酸
分子またはタンパク質材料が固体支持体に固定される。

【００６３】上記固体支持体はチップであることが好ましい。

【００６４】チップの利点は当技術分野ではよく知られており、ここで詳細に論じる必要は
ない。それらの利点には、サイズが小さいことと、コンピューターによる分析物
の分析を行いやすいことがある。

【００６５】さらにまた本発明は、ウィークリーサスＤ表現型の分析に、本発明の核酸分子
、またはウィークＤ表現型の一因となるかそれを指し示すリーサスＤ抗原をコー
ドする核酸分子（ここに、該核酸分子は野生型リーサスＤ抗原と比較して少なく
とも一つのミスセンス突然変異を保持し、該ミスセンス突然変異は２２３位また
は２８３位でのアミノ酸置換（２２３位ではＰｈｅからＶａｌへの置換が好まし
く、２８３位ではＴｈｒからＩｌｅへの置換が好ましい）を引き起こし、該ミス
センス突然変異はヌクレオチド位置６６７または８４８で起こることがさらに好
ましく、その場合、その突然変異は６６７位ではＴからＧへ、また８４８位では
ＣからＴへの突然変異であることが最も好ましい）もしくはそれらの組み合わせ
の使用に関する。

【００６６】この分析は例えば上述した方法に基づいて達成できる。

【００６７】また本発明は、モノクローナル抗Ｄ抗体またはポリクローナル抗Ｄ抗血清もし
くは抗グロブリンまたは抗ヒトグロブリン抗血清もしくはそれらの製剤のアフィ
ニティー、アビジチーおよび／または反応性の評価のための、本発明の核酸分子
、本発明のベクターまたは本発明のリーサスＤ抗原の使用に関する。

【００６８】また本発明は、モノクローナル抗Ｄ抗体またはポリクローナル抗Ｄ抗血清もし
くは抗グロブリンまたは抗ヒトグロブリン抗血清もしくはそれらの製剤のアフィ
ニティー、アビジチーおよび／または反応性の評価のための、発端者から得た細
胞（好ましくは赤血球）の使用に関する。

【００６９】上記の製剤は当技術分野で周知の技術に従って提供できる。上記の製剤は、ア
ルブミンなどの安定化剤、さらにはアジ化ナトリウム、塩イオン、緩衝液などを
含んでもよい。製剤の処方は、当技術分野でよく知られているように抗体の結合
特性に影響を及ぼしうる。

【００７０】例えば、第一工程として、保因者または血液ドナーのリーサスＤ遺伝子とその
対立遺伝子状態を分析し、その遺伝子が、本発明に従って見出された突然変異を
含むかどうかを決定する。第二工程として、その突然変異を、赤血球表面の一定
のＲｈＤ抗原密度に相関させる。好都合なことに、この相関は、本発明で提供さ
れるデータ（例えば突然変異そのもの）と当技術分野で周知の技術（例えばＪｏ
ｎｅｓら（１９９６）やＦｌｅｇｅｌおよびＷａｇｎｅｒ（１９９６）を参照さ
れたい）によって確立できる。第三工程として、反応性、感度、アフィニティー
、アビジチーおよび／または特異性などといった抗体または抗血清の特徴を、適
当な血液型血清学的技術により、好ましくは分子的にまたＲｈＤ抗原表面密度に
関して第２工程に記述したように特徴づけられた赤血球を使って、決定する。そ
のようなデータは、例えば品質管理や標準化などに使用できる。

【００７１】本発明は、モノクローナルおよびポリクローナル抗血清（好ましくは抗Ｄモノ
クローナル抗体または抗血清）の特徴づけ、標準化および品質管理に最も有用で
ある。さらに、例えば抗グロブリンおよび抗ヒトグロブリン抗血清を、本発明の
教示するところに基づいて特徴づけることができる。適切に特徴づけられた抗Ｄ
モノクローナル抗体は、ＲｈＤ診断法に簡便に使用できる。例えば、適当に特徴
づけられたモノクローナル抗体は、血球表面のウィークＤ抗原密度を決定するの
に役立つだろう。診断に有用なモノクローナル抗体に関するカットオフ（Cut-of
f ）値はこのように確立できる。このことは、ＲｈＤ診断に使用される抗体の品
質管理にとって重要である。

【００７２】したがってまた本発明は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清も
しくはその製剤を特徴づける方法であって、（ａ）発端者の検体の核酸を、本発明に従って定義されるような突然変異の存在
について検査する工程、（ｂ）ＲＨＤ遺伝子の突然変異状態と対立遺伝子状態に基づいて、その核酸を、
上記発端者の赤血球の表面のＲｈＤ抗原密度と相関させる工程、（ｃ）上記モノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清もしくは上述したそ
の製剤を、ＲｈＤ抗原をその表面に保持する細胞と反応させる工程、（ｄ）上記モノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清もしくは上述したそ
の製剤を、工程（ｃ）で得た結果に基づいて特徴づける工程、を含む方法に関する。

【００７３】「対立遺伝子状態（ａｌｌｅｌｉｃｓｔａｔｕｓ）」という用語に関して、
この用語は、発端者中のＲＨＤ対立遺伝子がホモ接合状態、ヘテロ接合状態また
はヘミ接合状態で存在する可能性を記述するものである。またこの用語は、２つ
の対立遺伝子が上に定義した２つの異なる突然変異（遺伝子変換を含む）を保有
する可能性も包含する。

【００７４】本発明の方法の好ましい態様では、上記の特徴づけに、反応性、感度、アビジ
チー、アフィニティー、特異性および／または抗体および抗血清の他の特徴が含
まれる。

【００７５】さらにまた、ＲｈＤ抗原をその表面に保持する上記細胞が赤血球である方法が
好ましい。

【００７６】また本発明は、輸血を必要する患者にドナーから得たＲｈＤ陰性血液を輸血す
べきかどうかを判断する方法であって、その患者から得た検体を１つまたはそれ
以上の本発明のＲｈＤ抗原の存在について検査する工程を含み、それら抗原の少
なくとも１つについて陽性の検査結果であればＲｈ陰性血液を輸血する必要が示
されるという方法に関する。本発明はヒトの輸血治療を考案する際に重大な意味
を持つ。例えば、患者がＲｈＤ陰性血液の輸血を実際に必要としているかどうか
、またはそのような予防策をとる必要がないかどうかを、簡便に検査できるよう
になる。

【００７７】野生型リーサスＤ抗原、異常Ｄ抗原または本発明の別のウィークＤ型の保因者
がウィークＤ表現型のある亜群によって輸血される場合、上述の方法によって決
定されるウィークＤ表現型の分子的に定義づけられるいくつかの亜群の赤血球の
輸血は免疫原性を示すかもしれない。そのような保因者（例えば血液ドナー）は
、当技術分野の既に確立された方法によって、または本発明で確立された方法に
よって決定でき、それに続いてウィークＤ表現型のいくつかの亜群の輸血を避け
ることができる。

【００７８】さらに本発明は、ドナーの血液が、輸血を必要とする患者への輸血に使用でき
るかどうかを判断する方法であって、そのドナーから得た検体を、１つまたはそ
れ以上の本発明のＲｈＤ抗原の存在について検査する工程を含み、それら抗原も
しくは少なくとも１つの抗原について陽性の検査結果であれば、野生型ＲｈＤ抗
原またはそのドナーの（１つまたは複数の）ウィークＤ型以外の（１つまたは複
数の）ウィークＤ型を持つと型別される患者の輸血を排除するという方法に関す
る。

【００７９】本発明の方法に基づいて、ドナーとレシピエントの両方のウィークＤ抗原が完
全には同一でないのであれば、ドナーから得られるウィークＤ型血液による患者
の輸血は避けることが有益であり望ましい。

【００８０】上に挙げた方法で言及した検体は、例えば血液や血清など、本明細書のいたる
ところで挙げる検体であってよい。

【００８１】上に挙げた方法のいずれかに基づく患者の輸血に関する指針については、最適
でない輸血方針を避けるように最大限の注意を払わなければならない。主治医は
常に危険因子を考慮すべきである。その患者に関する潜在的危険はすべからく最
小限に抑えられるべきである。

【００８２】本発明は輸血方針について将来の方策を導く基準を確立するのにとりわけ好適
である。ウィークＤ表現型は、本発明が確立した分子的基準に従って、グループ
分けできる。上述の方法によって決定されるウィークＤ表現型の分子的に定義づ
けられるいくつかの亜群は、その保因者に野生型リーサスＤ抗原、異常Ｄ抗原ま
たは本発明の別のウィークＤ型を輸血した場合には、免疫化を起こしやすく、抗
Ｄを産生するかもしれない。そのような保因者は、本発明で確立された方法によ
って決定でき、引き続いて、赤血球、血小板および血漿血液単位などのリーサス
陰性血液成分で輸血できる。ウィークＤ表現型を持つ保因者の大半はリーサスＤ
陽性血輸血によってそのようにして免疫化されやすいとは現行の技術によってみ
なされておらず、それゆえに、彼等が本発明に従って明瞭なウィークＤ型に分類
されることから、本発明が確立した手段によって、それらの保因者にリーサスＤ
陽性を安全に輸血できる。

【００８３】また本発明は、本発明で特徴づけられるようなファージ、アプタマー、モノク
ローナル抗体またはポリクローナル抗血清もしくはそれらの製剤の、ＲｈＤ抗原
決定への使用に関する。

【００８４】上記の使用の好ましい態様では、上記のＲｈＤ抗原決定が血液型の決定との関
連で達成される。

【００８５】さらにまた本発明は、本発明の抗体またはアプタマーまたはファージを含む製
剤に関する。

【００８６】本発明によって定義づけられるウィークＤ型は、一定のＲｈＤエピトープおよ
びＲｈＤ抗原密度（すなわち赤血球表面に発現された１細胞あたりのＲｈＤ抗原
数）と相関する（ＦｌｅｇｅｌおよびＷａｇｎｅｒ１９９６）（数例から得ら
れたデータをＴａｂｌｅ８に記載する）。抗体とその製剤は、１つまたはそれ以
上の本発明のウィークＤ型を使って、任意の標準的血液型血清学技術で検査でき
る。反応性、感度、アビジチー、アフィニティー、特異性および／または当技術
分野で知られている抗体および抗血清の他の特徴は、当技術分野で周知の標準的
血液型血清学技術で、所定の条件下に、１つまたはそれ以上の本発明のウィーク
Ｄ型との反応によって決定できる。本製剤は診断用製剤または医薬製剤でありう
る。

【００８７】本発明の医薬組成物は薬学上許容できる担体および／または希釈剤をさらに含
みうる。好適な医薬担体の例は当技術分野でよく知られており、リン酸緩衝食塩
溶液、水、油／水型エマルションなどのエマルション、様々なタイプの湿潤剤、
滅菌溶液などがある。そのような担体を含む組成物は、周知の従来法で調剤でき
る。これらの医薬組成物は適当な用量で対象に投与できる。適当な組成物の投与
は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、皮内、鼻腔内または気管支内投与な
ど、様々な方法で達成しうる。投与計画は、担当医と臨床上の因子によって決定
されるだろう。医療技術の分野ではよく知られているように、ある患者に関する
投薬量は、その患者の大きさ、体表面積、年齢、投与しようとする化合物、性別
、投与の時間と経路、身体全体の健康、同時に投与されている他の薬物など、多
くの因子に依存する。典型的用量は例えば０．００１〜１０００μｇの範囲にあ
りうるが、この典型的範囲より低いまたは高い用量も特に上述の因子を考慮する
と考えられる。一般的には、本医薬組成物の通常の投与としての投薬計画は、１
日あたり１μｇから１０ｍｇ単位の範囲にあるべきである。その投薬計画が持続
注入である場合は、それぞれ体重１ｋｇあたり毎分１μｇ〜１０ｍｇ単位の範囲
にもあるべきである。経過は定期的評価によって監視できる。本発明の組成物は
局所的にも全身的にも投与できる。投与は一般的には非経口的投与、例えば静脈
内投与になるだろうが、ＤＮＡは標的部位に直接的に、例えば内部または外部標
的部位への微粒子銃（バイオリスティック）送達や、動脈内部位へのカテーテル
などによっても投与できる。非経口投与用の製剤には、滅菌した水性または非水
性の溶液、懸濁液およびエマルションがある。非水性溶媒の例はプロピレングリ
コール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチル
などの注射可能な有機エステルである。水性担体には、食塩水や緩衝媒質などの
水、アルコール／水溶液、エマルションまたは懸濁液がある。非経口用賦形剤に
は、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースと塩化ナト
リウム、乳酸加リンゲル、不揮発性油などがある。静脈内用賦形剤には、水分お
よび栄養補給剤、電解質補給剤（例えばリンゲルデキストロースに基づくもの）
などがある。例えば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどの保存
剤と他の添加物が存在してもよい。さらに本発明の医薬組成物は、インターロイ
キンやインターフェロンなどの薬剤を、その医薬組成物の使用目的に応じて含ん
でもよい。

【００８８】抗体とその製剤は、一定のＲｈＤエピトープ密度を持つ表面に対するその反応
または反応の欠如によって特徴づけることができる。例えば抗体製剤は１細胞あ
たり１，０００個のＲｈＤ抗原（品質管理の目的に合わせて慎重に選ばれたＲｈ
Ｄ抗原密度）を持つ赤血球を凝集させることを特徴としうる。

【００８９】また本発明は、妊婦がリーサスＤ陰性であるか上に定義した突然変異に関して
ヘミ接合体であって、その子供がリーサスＤ陽性であるか上に定義した別の突然
変異をヘミ接合状態で保持する場合に、その妊婦に抗Ｄを投与する工程を含む、
その妊婦の治療に関する。

【００９０】リーサス陰性の母親がＲｈＤ陽性の胎児を妊娠している場合、妊婦は現在、抗
Ｄ予防処置を受けうる。本発明は、抗Ｄ予防の必要性を、母親および／または胎
児の本発明ＲｈＤタンパク質の保有状態に応じて識別することを可能にする。１
つまたはそれ以上の本発明ＲｈＤタンパク質は、それらの保因者の免疫化を起こ
しやすく、それゆえに、その母親の治療が指示されるだろう。同様に、１つまた
はそれ以上の本発明のＲｈＤタンパク質は、胎児がそれを保持する場合は、母親
にとって低い免疫原性を示すことがわかる場合があり、それゆえに、現在の臨床
治療に反して抗Ｄ予防の省略が指示されるだろう。

【００９１】投与は、担当医によって決定されうる標準的な経路と用量で行なうことができ
る（Ｍｏｌｌｉｓｏｎ，１９９３）。静脈内投与または筋肉内投与については、
モノクローナル抗Ｄまたはモノクローナル抗Ｄの組み合わせ／混合物を、抗Ｄ抗
体／抗血清５０μｇ〜５００μｇまたはそれ以上の用量で投与することが好まし
い（Ｂｏｗｍａｎ，１９９８）。これら抗Ｄ抗体／抗血清の品質管理には、本発
明が提供する結果と方法を有利に使用できる。

【００９２】また本発明は、本発明のあるウィークＤポリペプチドに特異的に結合する抗体
Ｖ_H鎖もしくはＶ_L鎖またはそれらの組み合わせ、もしくはアプタマーを同定する
方法であって、（ａ）本発明のウィークＤポリペプチドを、ファージ表面にＶ_H鎖もしくはＶ_L鎖
またはそれらの組み合わせをディスプレイ（displaying）しているファージライ
ブラリーか、アプタマーと接触させる工程、（ｂ）上記のウィークＤポリペプチドに結合するファージまたはアプタマーを同
定する工程；ならびに随意に、（ｃ）工程（ａ）と（ｂ）を１回以上繰返す工程を含む方法に関する。

【００９３】ファージライブラリーの調製と所望の抗体（鎖）のスクリーニング／同定自体
は当技術分野でよく知られており、例えばＷｉｎｔｅｒら「Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１２（１９９４），４３３−４５５とそこに引用されている文献
に概説されている。またアプタマーも、従来のプロトコールに従って調製し、フ
ァージにクローニングできる。単独のＶ_HまたはＶ_L鎖が本発明のウィークＤポリ
ペプチドに結合することを本発明の方法により確認してもよいのだが、ファージ
によって発現されるＶ_H−Ｖ_Lの組み合わせを同定することが好ましい。なぜなら
、この状況は天然抗体の結合状況に似ているからである。工程（ａ）と（ｂ）を
１回以上繰返すことにより、より良い結合特異性が確認されうる。アフィニティ
ーなどの結合特性を最適化するためのプロトコールは、結合したファージを除去
するための溶出工程を含めて、当技術分野では確立されている。例えば、いった
ん好都合な結合能を持つＶ_H鎖が見つかったら、例えば最初の選択工程でそのＶ_H 鎖と会合していたＶ_L鎖をより好適なＶ_L鎖で置き換えることによって、抗体の結
合能を有意に向上させるＶ_L鎖を同定できる。

【００９４】また本発明は、本発明のあるウィークＤポリペプチド／抗原に特異的に結合す
るモノクローナル抗体を同定する方法であって、（ａ）本発明のウィークＤポリペプチドを、１つまたはそれ以上のモノクローナ
ル抗体と接触させる工程、（ｂ）上記のウィークＤポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を同定する
工程；ならびに随意に、（ｃ）工程（ａ）と（ｂ）を１回以上繰返す工程を含む方法に関する。

【００９５】また本発明は、本発明のあるウィークＤポリペプチド／抗原に特異的に結合す
る抗体Ｖ_H鎖もしくはＶ_L鎖またはそれらの組み合わせもしくはアプタマーを同定
する方法であって、（ａ）そのウィークＤポリペプチドと、（ａａ）第２のまたはそれ以上のウィークＤウィークＤポリペプチド、および／
または、（ａｂ）正常リーサスＤポリペプチド（ここに、上記第２のまたはそれ以上のウィークＤポリペプチドおよび／または
正常リーサスＤポリペプチドは、（ａ）のウィークＤポリペプチドより高いか、
それに等しいか、またはそれより低いモル量（molar mass）で存在する）を、そのファージ表面にＶ_H鎖もしくはＶ_L鎖またはそれらの組み合わせをディス
プレイしているファージライブラリーか、アプタマーと接触させる工程、（ｂ）上記（ａ）のウィークＤポリペプチドに結合するファージまたはアプタマ
ーを同定する工程；ならびに随意に、（ｃ）工程（ａ）と（ｂ）を１回以上繰返す工程を含む方法に関する。

【００９６】工程（ａｂ）では、上記第２のウィークＤポリペプチドと正常リーサスＤポリ
ペプチドのモル量が（ａ）のウィークＤポリペプチドのモル量よりも高いことが
、とりわけ好ましい。

【００９７】同定のために選択を１回だけ使用する場合（すなわち工程（ｃ）を適用しない
場合）、（ａ）のウィークＤポリペプチド分子の数は、ファージ粒子の数に対し
てモル過剰であることが好ましい。先に記述した抗体Ｖ_H鎖もしくはＶ_L鎖または
それらの組み合わせ、もしくはアプタマーを同定する方法の好ましい態様は、本
発明のこの態様にも同様に当てはまる。

【００９８】また本発明は、本発明のあるウィークＤポリペプチド／抗原に特異的に結合す
るモノクローナル抗体を同定する方法であって、（ａ）そのウィークＤポリペプチドと、（ａａ）第２のまたはそれ以上のウィークＤポリペプチド、および／または、（ａｂ）正常Ｄポリペプチド（ここに、上記第２のまたはそれ以上のウィークＤポリペプチドおよび／または
正常Ｄポリペプチドは、（ａ）のウィークＤポリペプチドより高いか、それに等
しいか、またはそれより低いモル量で存在する）を、１つまたはそれ以上のモノクローナル抗体と接触させる工程、（ｂ）上記（ａ）のウィークＤポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を同
定する工程；ならびに随意に、（ｃ）工程（ａ）と（ｂ）を１回以上繰返す工程を含む方法に関する。

【００９９】上記のウィークＤポリペプチドは細胞の表面に露出していることが好ましい。
適当な表面は赤血球の表面である。しかし、他の宿主細胞をそのウィークＤポリ
ペプチドの発現に適したベクターでトランスフェクトして、それをその表面に発
現させてもよい。抗体は、ウィークＤの組換えタンパク質またはウィークＤのタ
ンパク質の一部および精製タンパク質にも結合しうる。

【０１００】本ポリペプチドまたは宿主細胞は固体支持体に固定することがさらに好ましい
。固体支持体の好適例はマイクロタイタープレートやビーズである。

【０１０１】さらに好ましいアンチボディ（antibody）では、工程（ｂ）または（ｃ）の後
に、下記の工程を行なう：（ｄ）Ｖ_HまたはＶ_L鎖のアミノ酸配列を同定し、かつ／または、そのアミノ酸配
列をコードする核酸配列を同定する工程。

【０１０２】アミノ酸／核酸配列の同定は従来のプロトコールに従って達成できる。例えば
前述のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照されたい。

【０１０３】最後に、本発明は、（ａ）本発明のオリゴヌクレオチド；および／または、（ｂ）本発明の抗体；（ｃ）本発明のアプタマー；および／または、（ｄ）本発明のファージ、を含んでなるキットに関する。

【０１０４】上述した様々なタイプの抗体を含みうる本発明のキットは、ヒトから得た検体
中のウィークＤの分析にとりわけ好適である。本キットの構成要素は適宜包装し
てよい。好ましくは、異なる構成要素は異なるバイアルに包装する。

【０１０５】本明細書で言及した文書の開示内容は参照によりここに組み込まれるものとす
る。

【０１０６】以下の実施例で本発明を例証する。

【０１０７】実施例：ウィークＤ表現型の検体の分子分析１０個のＲＨＤエキソンとそれらのスプライス部位のＲＨＤ特異的配列決定法
を開発した（Ｔａｂｌｅ１と２）。逐次分析法で、抗原Ｄの弱い発現を持つ血液
検体をこの方法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Ｔａｂｌｅ３）およびＲＨＤＰＣＲ−Ｓ
ＳＰ（Ｇａｓｓｎｅｒら，１９９７）で調べた。そのために、既述の如く（Ｗａ
ｇｎｅｒら，１９９５）、ＥＤＴＡまたはクエン酸塩で抗凝固処理した血液検体
が白人ドナーから集められ、公開された基準（「Ｄ^Uテスト」）（ＷｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｌｉｃｈｅｒＢｅｉｒａｔｄｅｒＢｕｎｄｅｓａｅｒｚｔｅ
ｋａｍｍｅｒａｎｄＢｕｎｄｅｓｇｅｓｕｎｄｈｅｉｔｓａｍｔ（ドイツ連
邦医師会および連邦衛生局の学術的助言）１９９２）に準じたドナー型別でウィ
ークＤと特徴づけられた。ＤカテゴリーＶＩ検体はこの研究からは除外した。

【０１０８】ウィークＤ表現型中のＲＨＤのコード配列。ゲノムＤＮＡからの１０個のＲＨ
Ｄエキソンの配列決定。ＤＮＡは以前記述したように調製した（Ｇａｓｓｎｅｒ
ら，１９９７）。ヌクレオチド配列決定はＤＮＡ配列決定ユニットを使って行な
った（ＰｒｉｓｍダイターミネーターサイクルシークエンシングキットとＡｍｐ
ｌｉＴａｑＦＳＤＮＡポリメラーゼ；ＡＢＩ３７３Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（ドイツ・バイテルシュタット））。１０個のＲＨＤエ
キソンの全てとプロモーターの一部（下記参照）に相当するゲノムＤＮＡの区間
のヌクレオチド配列決定は、プライマー（Ｔａｂｌｅ１）とサブクローニング工
程を不要にする増幅法（Ｔａｂｌｅ２）を使って達成した。

【０１０９】ＲＨＤ特異性の対照。ＲＨＤの第３〜第７および第９エキソンは少なくとも１
つのＲＨＤ特異ヌクレオチドを持ち、それらを使って各配列がＲＨＤ由来である
ことを確認した。第１エキソンについては、第１イントロンの隣接部分にある特
徴的ヌクレオチドを使用した（ＥＭＢＬヌクレオチド配列データベースのアクセ
ッション番号Ｚ９７３６２とＺ９７３６３）。第８と第９エキソンは単一のＰＣ
Ｒアンプリコンとして増幅されるので（Ｔａｂｌｅ２）、第８エキソンについて
は、ＰＣＲ増幅のＲＨＤ特異性を、情報源となる第９エキソンのＲＨＤ非特異的
配列決定によってチェックした。第２と第１０エキソンは、使用した公表済ＲＨ
Ｄ特異ヌクレオチド配列（ＥＭＢＬヌクレオチド配列データベースのアクセッシ
ョン番号Ｕ６６３４０とＵ６６３４１；Ｋｅｍｐら，１９９６；ＬｅＶａｎ
Ｋｉｍら，１９９２）に基づいてＲＨＤ特異的に増幅され（表２）、ＲｈＤ陰性
対照ではＰＣＲアンプリコンは得られなかった。正常Ｄ検体とウィークＤ検体は
すべて６５４位にＧ（Ａｒｃｅら，１９９３）と１０３６位にＣ（ＬｅＶａｎ
Ｋｉｍら，１９９２）を示し、これらの代わりに記述されていたそれぞれＣ（
ＬｅＶａｎＫｉｍら，１９９２）とＴ（Ａｒｃｅら，１９９３）は配列決定
エラーであるという意見（Ｃａｒｔｒｏｎ，１９９６）を裏付けた。

【０１１０】ＰＣＲ−ＲＦＬＰとＰＣＲ−ＲＦＬＰによるウィークＤ特異的突然変異の検出
。ＰＣＲ−ＲＦＬＰとＲＨＰＣＲ−ＳＳＰ（Ｇｓｓｎｅｒら，１９９７）を開
発または応用して、５つのＲＨＤ対立遺伝子に検出された別個のヌクレオチド置
換を特徴づけた（Ｔａｂｌｅ３と４も参照されたい）：８位でのＣからＧへの置
換は、ｒｅ０１とｒｅ１１ｄで得られるアンプリコン中のＳａｃＩ制限部位の喪
失をもたらした（２９位でのＧからＡ、ＭｓｐＩ部位の喪失、ｒｅ０１／ｒｅ１
１ｄ；４４６位でのＣからＡ、ＡｌｕＩ部位の喪失、ｒｂ２０ｄ／ｒｂ２１ｄ、
８０９位でのＴからＧ、Ａｌｗ４４Ｉ部位の喪失、ｒｆ５１／ｒｅ７１；１１５
４位でのＧからＣ、ＡｌｕＩ部位の導入、ｒｅ８２／ｒｅ９３）。ｒｆ５１／ｒ
ｅ７１ＰＣＲ反応の条件はＴａｂｌｅ２に示すとおりである。ｒｂ２０ｄ／ｒ
ｂ２１ｄ反応は非校正機構付（non-proofreading）Ｔａｑポリメラーゼ（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ社またはＱｉａｇｅｎ社）を使って、９４℃
で２０秒の変性、６０℃で３０秒のアニーリングおよび７２℃で３０秒の伸長に
よって行なった。他のＰＣＲ反応は非校正機構付Ｔａｑポリメラーゼを使って、
９４℃で２０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリングおよび７２℃で１分間の
伸長によって行なった。

【０１１１】さらに４つのＲＨＤ対立遺伝子を、標準的なＲＨＰＣＲ−ＳＳＰ¹⁵によって
検出した。ＲＨＤ（Ｔ２０１Ｒ，Ｆ２２３Ｖ）対立遺伝子とＲＨＤ（Ｓ１８２Ｔ
，Ｋ１９８Ｎ，Ｔ２０１Ｒ）対立遺伝子はＲＨＤの第４エキソンに特異的なアン
プリコンを欠き、ＲＨＤ（Ｇ３０７Ｒ）対立遺伝子とＲＨＤ（Ａ２７６Ｐ）対立
遺伝子はＲＨＤの第６エキソンに特異的なアンプリコンを欠いた。他のウィーク
Ｄ型はいずれについても、点突然変異の確実性を、独立したＰＣＲアンプリコン
のヌクレオチド配列決定によってチェックした。

【０１１２】Ｄ^IVＩＩＩ型中の第６〜第９エキソンの配列決定。ＲＨＣＥとＲＨＤに特異的
なプライマーを使って、Ｄ^IVＩＩＩ型の第６〜第９エキソンを増幅し、配列決定
した。それゆえに、プライマーｒｅ７１（Ｔａｂｌｅ２）をプライマーｒｂ７で
置き換え、またプライマーｒｅ６２１をｒｂ２６で、プライマーｒｅ５２をｒｅ
７４で置き換えた。

【０１１３】アミノ酸置換をコードする別個のヌクレオチド変化を持つ１６種類のＲＨＤ対
立遺伝子が同定された（Ｔａｂｌｅ４）。一つの対立遺伝子は典型的な、まだ未
公表のＲＨＤ−ＣＥ−Ｄ雑種対立遺伝子（ここにＤ^IVＩＩＩ型という）に相当し
た。もう一つの対立遺伝子はＤＨＭｉだった（Ｌｉｕら，１９９６）。残り１４
種類の対立遺伝子のうち、１２種類は単一の、しかし全く異なる、今までに知ら
れていないミスセンス突然変異を示した。コードされている変異アミノ酸はいず
れも、ＲｈＣＥタンパク質中の対応する位置には見出されなかった。２種類の対
立遺伝子は、ＲＨＣＥ遺伝子に特有の複数ヌクレオチド変化を示し、それらはＲ
ＨＤ特異配列の間に散在していた。

【０１１４】白人におけるウィークＤ対立遺伝子の分布。抗原Ｄの発現が弱い１６１検体か
らなる一セットを、ドイツ南西部のランダムな血液ドナーから選んだ。Ｄカテゴ
リーＶＩ検体は血清学的方法で排除したが、他のパーシャルＤは排除しなかった
。したがって３つの検体が既知のパーシャルＤ（ＤＨＭｉ（Ｌｉｕら，１９９６
）とＤカテゴリーＩＶ（Ｌｏｍａｓら，１９８９））に相当した。例外なくすべ
ての検体を、異常コード配列を持つ別個のＲＨＤ対立遺伝子に割り当てることが
できた（Ｔａｂｌｅ５）。本発明の目的のために、これら新しい分子ウィークＤ
型は、慣用名（例えばウィークＤ１型）で呼ぶか、それらの分子構造（例えばＲ
ＨＤ（Ｖ２７０Ｇ））で呼ぶべきだと提案する。ウィークＤ１型は、異常コード
配列を持つ最も頻繁に出現する既知のＲＨＤ対立遺伝子（ｆ＝１：２７７）であ
り、Ｄ^VII対立遺伝子頻度さえ上回る（Ｗａｇｎｅｒら，１９９７）。

【０１１５】ウィークＤ対立遺伝子中のアミノ酸置換は密集している。単一ミスセンス突然
変異を持つウィークＤ型中に観察されるアミノ酸置換はＲｈＤタンパク質中に均
等には分布していなかった（Ｆｉｇ．１）。置換の大半はアミノ酸位置２６７〜
３９７の領域で起こっていた。ウィークＤ対立遺伝子には、２〜１３位、１４９
位および１７９〜２２５位（ウィークＤ４型および１４型）付近のＲｈＤタンパ
ク質のより小さい部分にも単一または複数（multiple）のアミノ酸置換が見つか
った。最新のＲｈＤループモデルによると、関与するアミノ酸は膜貫通タンパク
質セグメントと細胞内タンパク質セグメントに位置していた。

【０１１６】正常ＲｈＤ表現型対照とＲＨＤプロモーター。正常ＲｈＤ表現型を持つ６つの
対照検体は、１０個のＲＨＤエキソンのＲＨＤ特異的配列決定によって、正常な
ＲｈＤタンパク質配列を示した。ＲＨＤプロモーター中の突然変異を調べるため
に、プライマー対ｒｂ１３とｒｂ１１ｄを使って６７５ｂｐ領域を増幅した（Ｔ
ａｂｌｅ２）。プロモーター領域は、プライマーｒｅ０２とｒｅ０１を使って、
開始コドンの第１ヌクレオチドに対して−５４５位のヌクレオチドから配列決定
した。各ウィークＤ型、ＤＨＭｉとＤ^IVＩＩＩ型について一つの検体を使用した
。公表されたＲＨＤプロモーター配列（Ｈｕａｎｇ，１９９６）からの逸脱は見
つからなかった。

【０１１７】ミスセンス突然変異がウィークＤ表現型を引き起こしうることの統計学的証拠
。ウィークＤ検体（１５８検体中１５８）と正常Ｄ検体（６検体中０）中の変異
ＲｈＤタンパク質の頻度は、統計学的に有意に相違した（ｐ＜０．０００１、２
×２分割表、フィッシャーの正確検定）。ウィークＤ表現型中の正常ＲｈＤコー
ド配列は１．９％未満で見出されると予測された（９５％信頼区間の上限、ポア
ソン分布）。さらに、これらのアミノ酸置換がランダムヌクレオチド変異を反映
したものに過ぎないという可能性は、次の２つの観察から排除された。（ｉ）Ｒ
ＨＤ遺伝子の４１７コドンには、２７６６種類のミスセンス突然変異と、９１９
種類のサイレント突然変異が起こりうる。仮にウィークＤ対立遺伝子中のヌクレ
オチド変化がランダムだとすると、サイレント突然変異は０．２４９の頻度で期
待される。ウィークＤ対立遺伝子中の合計１８の突然変異のうち、サイレント突
然変異は一つ観察された（ｐ＝０．０３９、二項分布）。ナンセンス突然変異は
ＲｈＤ発現を妨げると仮定して（Ａｖｅｎｔら，１９９７ｂ）、この計算から除
外した。（ｉｉ）１２５１ｂｐのコード配列と５４５ｂｐの非コード配列に相当
する１７９６ｂｐのＲＨＤ遺伝子が配列決定された。仮にヌクレオチド変異がラ
ンダムだとすると、ウィークＤ対立遺伝子の非コード配列中でのそれらの出現は
０．３０３の頻度で期待される。しかし１８個の突然変異はすべてコード配列中
にあった（ｐ＝０．００５、二項分布）。

【０１１８】ハプロタイプ特異的なＲＨＤ多形。第３と第６イントロンを分析した。ＲＦＬ
ＰでＲＨＤの第３イントロンを調べるために、第３イントロンの３’部分をＲＨ
Ｄ特異的プライマー対ｒｂ４６とｒｂ１２を使って増幅し、そのＰＣＲ産物をＨ
ａｅＩＩＩで消化した。ＲＨＤの第６イントロン中のＴＡＴＴタンデムリピート
を調べるために、全長の第６イントロンをＲＨＤ特異的プライマー対ｒｆ５１と
ｒｅ７１およびプライマーｒｇ６２を使って増幅し、配列決定に使用した。

【０１１９】ＣＤｅおよびｃＤＥハプロタイプの一般的ＲＨＤ対立遺伝子の間で異なる多形
ＲＨＤ配列が検出された（Ｔａｂｌｅ６）。ＲＨＤの第３イントロンには、第３
イントロン／第４エキソン連結点に対して−３７１位にあるＨａｅＩＩＩ−ＲＦ
ＬＰを決定するＧ／Ｃ多形があった。ＲＨＤの第６イントロンには、第６エキソ
ンの１９１５ｂｐ３’側から始まる可変的な長さのＴＡＴＴタンデムリピート
があった。ＣＤｅハプロタイプの一般的ＲＨＤ対立遺伝子には、ＨａｅＩＩＩ制
限部位が存在し、ＴＡＴＴリピート領域が９回の反復からなっていた。ｃＤＥハ
プロタイプの一般的ＲＨＤ対立遺伝子にはＨａｅＩＩＩ制限部位がなく、ＴＡＴ
Ｔリピート領域が８回の反復からなっていた。ウィークＤ対立遺伝子は、第３と
第６イントロン中のこれらの多形に関して、ウィークＤ４型が１３回のＴＡＴＴ
リピートを示したというただ一つの例外を除いて、同じＲＨハプロタイプの一般
的対立遺伝子と同一だった。ウィークＤ対立遺伝子は異なるＲＨハプロタイプ中
で独立して発生したと結論された。

【０１２０】

【表１】

【０１２１】

【表２】

【０１２２】

【表３】

【０１２３】

【表４】

【０１２４】

【表５】

【０１２５】

【表６】

【０１２６】

【表７】

【０１２７】

【表８】

【０１２８】

【表９】

【０１２９】

【表１０】

【０１３０】参照文献 Agre, P. C., Davies, D. M., Issitt, P. D., Lamy, B. M., Schmidt, P. J.,
Treacy, M., and Vengelen-Tyler, V. 1992.「ウィークＤ抗原の術語標準化の提
案」 [Letter]. Transfusion 32:86-87.

【０１３１】 Arce, M. A., Thompson, E. S., Wagner, S., Coyne, K. E., Ferdman, B. A.,
and Lublin, D. M. 1993. 「ＲｈＤ陽性個体に存在するがＲｈＤ陰性個体に存在
しない遺伝子由来のＲｈＤｃＤＮＡの分子クローニング」Blood 82:651-655.

【０１３２】 Aubin, J. T., Le Van Kim, C., Mouro, I., Colin, Y., Bignozzi, C., Brossa
rd, Y., and Cartron, J. P. 1997.「ＰＣＲによるＤＮＡ増幅によるＲＨＤ遺伝
子型分法の特異性と感度」 British Journal of Haematology 98:356-364.

【０１３３】 Avent, N. D., Butcher, S. K., Liu, W., Mawby, W. J., Mallinson, G., Pars
ons, S. F., Anstee, D. J., Tanner, M. J. 1992.「ヒト赤血球膜の細胞質面に
対するＲｈ（リーサス）ポリペプチドのＣ末端位置」 J. Biol. Chem. 267:1513
4-15139.

【０１３４】 Avent, N. D., Jones, J. W., Liu, W., Scott, M. L., Voak, D., Flegel, W.
A., Wagner, F. F., and Green, C. 1997a. 「Ｄバリアント表現型であるＤＮＵ
とＤＩＩの分子基盤はＲｈＤタンパク質の第６外部ドメインに対するＲｈＤエピ
トープであるｅｐＤ３、４と９の発現に必要な重要なアミノ酸の配置を可能にす
る」British Journal of Haematology 97:366-371.

【０１３５】 Avent, N. D., Martin, P. G., Armstrong-Fisher, S. S., Liu, W., Finning,
K. M., Maddocks, D., and Urbaniak, S. J. 1997b. 「ＲＨＤ遺伝子の多様なＰ
ＣＲ解析により決定されたＲｈＤ陰性表現型、ウィークＤ（Ｄ^U）表現型とパー
シャルＤ表現型の根底にある遺伝多様性の証拠」Blood 89:2568-2577.

【０１３６】 Avent, N. D., Rigwell, K., Mawby, W. J., Tanner, M. J., Anstee, D. J., K
umpel, B. 1988. 「Ｒｈ関連ポリペプチドに関するタンパク質配列研究はヒト赤
血球膜に結合する少なくとも２群のタンパク質の存在を示唆する」Biochem. J.
256:1043-1046.

【０１３７】 Beckers, E. A., Faas, B. H., Ligthart, P., Overbeeke, M. A., von dem Bor
ne, A. E., van der Schoot, C. E., and van Rhenen, D. J. 1997. 「より低い
抗原部位密度およびウィークＤ免疫原性はＲＨＤ遺伝子の構造的ゲノム異常また
は調節欠損により説明され得ない」Transfusion 37:616-623.

【０１３８】 Beckers, E. A. M., Faas, B. H. W., Overbeeke, M. A. M., von dem Borne, A
. E. G. K., van Rhenen, D. J., and van der Schoot, C. E. 1995.「ウィーク
Ｄ表現型の分子的側面」 Transfusion 35:50S

【０１３９】 Bowman, J. M. 1998. 「新生児のＲｈＤ溶血性疾患」N. Engl. J. Med. 339:177
5-1777

【０１４０】 Cartron, J.-P. 1996.「ＲｈＤＮＡ−コーディネーターズレポート」 Transfu
sion Clinique et Biologique 3:491-495.

【０１４１】 Ceppellini, R., Dunn, L. C., and Turry, M. 1955.「Ｒｈｏ因子（Ｄ^U）の反
応性を弱める、ヒトにおけるＲｈ遺伝子座における対立遺伝子間の相互作用」 P
roceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 41:283-288.

【０１４２】 Cherif-Zahar, B., Raynal, V., Gane, P., Mattei, M. G., Bailly, P., Gibbs
, B., Colin, Y., and Cartron, J.-P. 1996. 「Ｒｈ欠損のほとんどの場合にＲ
Ｈ遺伝子座のサプレッサーとして機能する候補遺伝子」Nature Genetics 12:168
-173.

【０１４３】 Flegel, W. A., M⁷ller, T. H., Schunter, F., Gassner, C., Sch⁶nitzer, D.,
and Wagner, F. F. 1997.「ＤカテゴリーＶＩＩＩＩ型：赤血球上の正常Ｒｈ
Ｄ抗原密度を有するＡＤ−Ｃｅ（３−６）−Ｄハイブリッドタンパク質」 [Ab
stract]. Transfusion 37S:101S

【０１４４】 Flegel, W. A., and Wagner, F. F. 1996.「フローサイトメトリーにより解析さ
れたＲＨＤバリアント赤血球のＲＨＤエピトープ密度プロファイル」 Transfusi
on Clinique et Biologique 3:429-431.

【０１４５】 Fukumori, Y., Hori, Y., Ohnoki, S., Nagao, N., Shibata, H., Okubo, Y., a
nd Yamaguchi, H. 1997.「ＲＨＤ遺伝子特異的プライマーを用いたポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤｅｌ（Ｄ−ｅｌｕｔｅ）のさらなる解析」 Transfu
sion Medicine 7:227-231.

【０１４６】 Gassner, C., Schmarda, A., Kilga-Nogler, S., Jenny-Feldkircher, B., Rain
er, E., M⁷ller, T. H., Wagner, F. F., Flegel, W. A., and Sch⁶nitzer, D.
1997. 「配列特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によるリーサスＤ
／ＣＥタイピング」Transfusion 37:1020-1026.

【０１４７】 Hasekura, H., Ota, M., Ito, S., Hasegawa, Y., Ichinose, A., Fukushima, H
., and Ogata, H. 1990.「Ｄ^UおよびＤ^elに対する特定の参照を用いた種々のＲ
ｈ表現型のＤ抗原のフローサイトメトリーによる研究」 Transfusion 30:236-23
8.

【０１４８】 Hermand, P., Mouro, I., Huet, M., Bloy, C., Suyama, K., Goldstein, J., C
artron, J. P., Bailly, P. 1993. 「合成ペプチドに対して調製した抗体を用い
たリーサスタンパク質の免疫化学特性」Blood 82:669-676.

【０１４９】 Huang, C. H. 1996.「ヒトｄＣＣｅｅおよびＤＣＷ赤血球におけるＲＨ遺伝子構
造と発現の変化：遺伝子型ヘテロ接合対表現型ホモ接合」 Blood 88:2326-2333.

【０１５０】 Huang, C. H. 1997.「Ｒｈタンパク質ファミリーと関連抗原への分子的洞察」 C
urrent Opinion in Hematology 4:94-103.

【０１５１】 Huang, C. H., Chen, Y., and Reid, M. 1997.「ヒトＤ（ＩＩＩａ）赤血球：Ｒ
ｈＤタンパク質は多様に散在するアミノ酸変化に関連する」 Am. J Hematol. 55
:139-145.

【０１５２】 Issitt, P. D. and Telen, M. J. 1996.「Ｄ、ウィークＤ（Ｄ^U）、およびパー
シャルＤ：分子物語を説明する」 Transfusion 36:97-100.

【０１５３】 Jones, J. W., Finning, K. M., Mattock, R., Voak, D., Scott, M. L., and A
vent, N. D. 1997. 「新規パーシャルＤ表現型であるＤＨＲの血清学的プロファ
イルと分子基盤」Vox Sanguinis 73:252-256.

【０１５４】 Jones, J. W., Lloyd-Evans, P., and Kumpel, B. M. 1996.「フローサイトメト
リーによるウィークＤおよびＤバリアント赤血球上のＲｈＤ抗原部位の定量」 V
ox Sanguinis 71:176-183.

【０１５５】 Kajii, E., Umenishi, F., Omi, T., and Ikemoto, S. 1995. 「エキソンスプラ
イシングの複雑なコンビナトリアルパターンはヒト赤血球における多様なＲｈ関
連アイソフォームを生ずる」Human Genetics 95:657-665.

【０１５６】 Kemp, T. J., Poulter, M., and Carritt, B. 1996. 「稀なＤ表現型を有する無
関係なドナーの解析により明らかにされたＲｈ遺伝子における組換えホットスポ
ット」American Journal of Human Genetics 59:1066-1073.

【０１５７】 Le Van Kim, C., Mouro, I., Cherif-Zahar, B., Raynal, V., Cherrier, C., C
artron, J. P., and Colin, Y. 1992.「ヒト血液型ＲｈＤポリペプチドの分子ク
ローニングと一次構造」 Proceedings of the National Academy of Sciences U
.S.A. 89:10925-10929.

【０１５８】 Leader, K. A., Kumpel, B. M., Poole, G. D., Kirkwood, J. T., Merry, A. H
., and Bradley, B. A. 1990. 「血液型判定およびＤＵ集団におけるカテゴリー
ＤＶＩ表現型の発生の決定に使用されるカテゴリーＤＶＩ細胞に対して反応活性
を有するヒトモノクローナル抗Ｄ」Vox Sang 58:(2):106-11

【０１５９】 Legler, T. J., Blaschke, V., Bustami, N., Malekan, M., Schwartz, D. W. M
., Mayr, W. R., Panzer, S., and K⁶hler, M. 1997.「Ｄ^WEAK、Ｄ^VI、ＤＦＲお
よびＤ個体における第２、５、７エキソン、第４イントロンおよび３’非コード
領域におけるＲＨＤ遺伝子タイピング」 Transfusion 37:100S

【０１６０】 Liu, W., Jones, J. W., Scott, M. L., Voak, D., and Avent, N. D. 1996. 「
２つのＤバリアントであるＤ^HMiとＤ^HMiiの分子解析」 [Abstract].Transfusio
n Medicine 6 (suppl 2):21

【０１６１】 Lomas, C., Gr³ssmann, W., Ford, D., Watt, J., Gooch, A., Jones, J., Beol
et, M., Stern, D., Wallace, M., and Tippett, P. 1994. 「ＦＰＴＴは「新規
」パーシャルＲｈＤ表現型であるＤＦＲに関連するＲｈ抗原の発生を低下する」
Transfusion 34:612-616.

【０１６２】 Lomas, C., MacColl, K., and Tippett, P. 1993. 「モノクローナル抗Ｄによる
カテゴリーＤ^II細胞の試験により開示されたＲｈ抗原Ｄのさらなる複雑性」Tran
sfusion Medicine 3:67-69.

【０１６３】 Lomas, C., Tippett, T., Thompson, K. M., Melamed, M. D., and Hughes-Jone
s, N. C. 1989.「ヒトモノクローナル抗Ｄ抗体およびＤカテゴリー由来の赤血球
を用いたＲｈ抗原Ｄ上の７つのエピトープの証明」 Vox Sanguinis 57:261-264.

【０１６４】 Mollison, P. L., Engelfriet, C. P. and Contreras, M. 1993. Blood transfu
sion in clinical medicine. 9th ed. London:Blackwell Scientific Publicati
ons.

【０１６５】 Moore, B. P. L. 1984. 「Ｄ^U状態の知識は有効に働くのか？」Vox Sanguinis
46S1:95-97.

【０１６６】 Mourant, A. E., Kopec, A. C., and Domaniewska-Sobczak, K. 1976. The dist
ribution of the human blood groups and other polymorphisms. 2nd ed. Lond
on: Oxford University Press.

【０１６７】 Nelson, M., Barrow, L. A., Popp, H., and Gibson, J. 1995. 「フローサイト
メトリーにより評価したＤ陽性および「ウィークＤ陽性」赤血球のＤ抗原発現に
関するいくつかの観察」Vox Sanguinis 69:152-154.

【０１６８】 Nicholson, G., Lawrence, A., Ala, F. A., and Bird, G. W. G. 1991. 「フロ
ーサイトメトリーによる解析によるＤ抗原部位密度の半定量アッセイ」Transfus
ion Medicine 1:87-90.

【０１６９】 Poulter, M., Kemp, T. J., and Carritt, B. 1996. 「ＤＮＡによるリーサスタ
イピング：ポリメラーゼ連鎖反応を用いたＲＨＣおよびＲＨＤ状態の同時測定」
Vox Sanguinis 7:164-168.

【０１７０】 Roubinet, F., Apoil, P. A., and Blancher, A. 1996.「フランスの南西部にお
けるパーシャルＤ表現型の頻度」 Transfusion Clinique et Biologique 3:247-
255.

【０１７１】 Rouillac, C., Gane, P., Cartron, J.-P., Le Pennec, P. Y., and Colin, Y.
1996. 「ウィークＤ（Ｄ^U）におけるＲｈＤおよびＲ^N表現型におけるＲｈＣ／
ｅの変化した抗原発現の分子基盤」Blood 87:4853-4861.

【０１７２】 Rouillac, C., Le Van Kim, C., Beolet, M., Cartron, J. P., and Colin, Y.
1995.「ＲｈＤポリペプチドにおけるＬｅｕ１１０Ｐｒｏ置換はＤ^VIIカテゴリ
ー血液型表現型を担う」 American Journal of Hematology 49:87-88.

【０１７３】 Salmon, C., Cartron, J.-P., and Rouger, P. 1984. The human blood groups,
New York: Masson.

【０１７４】 Scott, M. 1996. 「Ｒｈ血清学−コーディネーターズレポート」Transfusion Cl
inique et Biologique 3:333-337.

【０１７５】 Siegal, D. L., Silberstein, L. E. 1994. 「繊維状ファージにおける組換え抗
Ｒｈ（Ｄ）抗体の発現と特徴付け：レパートリークローニングによるヒト赤血球
抗体を単離するためのモデル系」Blood Apr. 15:83(8):2334-44

【０１７６】 Stratton, F. 1946.「新規なＲｈ対立遺伝子多型」 Nature 158:25

【０１７７】 Tazzari, P. L., Bontadini, A., Belletti, D., Malferrari, F., and Conte,
R. 1994.「フローサイトメトリー：Ｄ＋^W（Ｄ^U）抗原評価のための免疫血液学
における道具か？」 Vox Sanguinis 67:382-386.

【０１７８】 Tippett, P. and Sanger, R. 1962.「Ｒｈ抗原Ｄの再分に関する観察」 Vox San
guinis 7:9-13.

【０１７９】 Tippett, P. and Sanger, R. 1977.「Ｒｈ抗原Ｄの再分に関するさらなる観察」 Das ⁰rzliche Laboratorium 23:476-480.

【０１８０】 Wagner, F. F. 1994. 「Ｃ、ｃ、およびＤの抗原密度に対するＲｈ表現型の影響
：凍結標準赤血球を用いたフローサイトメトリーによる研究」Transfusion 34:6
71-676.

【０１８１】 Wagner, F. F., Hillesheim, B., and Flegel, W. A. 1997. D-Kategorie VII b
eruht einheitlich auf der Aminos³uresubstitution Leu(110)Pro. Beitr³ge z
ur Infusionstherapie und Transfusionsmedizin 34:220-223.

【０１８２】 Wagner, F. F., Kasulke, D., Kerowgan, M., and Flegel, W. A. 1995. 「血液
型ＡＢＯ、リーサス、ＤカテゴリーＶＩ、Ｋｅｌｌの頻度、およびドイツ北西部
における臨床的に関連する高頻度抗原の頻度」Infusionstherapie und Transfus
ionsmedizin 22:285-290.

【０１８３】 Wissenschaflicher Beirat der Bundes³rztekammer and Bundesgesundheitsamt.
1992. Richtlinien zur Blutgruppenbestimmung und Bluttransfusion. K⁶ln:D
eutscher ⁰rzte-Verlag.

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｆｉｇｕｒｅ１。単一ミスセンス突然変異を持つウィークＤ型にみられるアミ
ノ酸変異の略図。一般的正常ＲｈＤタンパク質の、変異を受けたアミノ酸と、そ
れらの位置を上部に示す。ウィークＤ型に見出されるそれらの置換を線の下に示
す。

【図２】Ｆｉｇｕｒｅ２。ＲＨＤ遺伝子の一般的対立遺伝子のｃＤＮＡヌクレオチド配
列と予想アミノ酸配列。ＡｖｅｎｔらによってＥＭＢＬヌクレオチド配列データ
ベースにアクセッション番号Ｘ５４５３４として寄託され、その説明に注記され
ているように改変（１，０３６位のＣ）されたコンセンサス配列を示す。ヌクレ
オチドとアミノ酸の位置は、それぞれ配列の上と下の数字で示す。

【図３】Ｆｉｇｕｒｅ３。ＲＨＣＥ遺伝子とＲＨＤ遺伝子の第５イントロンの一部。Ｒ
ＨＣＥ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。数字は、ＲＨＣＥ遺伝子の第５エキソ
ンの第１塩基に対する相対的位置を示す。ダッシュ記号は、ＲＨＣＥ遺伝子と同
一なＲＨＤ遺伝子中のヌクレオチドを表す。ＤカテゴリーＩＶＩＩＩ型に特有
な遺伝子変換の５’切断点領域（１７８ｂｐ）を星印で示す。全第５イントロン
のヌクレオチド配列はＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋにアクセッション番号Ｚ９７３
３３（ＲＨＣＥ）およびＺ９７３３４（ＲＨＤ）として寄託されている。

【図４】Ｆｉｇｕｒｅ４。ＰＣＲ−ＲＦＬＰによるウィークＤ型の検出。４つのウィー
クＤ型が、制限部位を消滅させる点突然変異を含んでいた。すなわち、ウィーク
Ｄ１型はＡｌｗ４４部位を（Ａ欄）、ウィークＤ３型はＳａｃＩ部位を（Ｃ欄）
、ウィークＤ４型はＡｌｕＩ部位を（Ｄ欄）、そしてウィークＤ６型はＭｓｐＩ
部位を（Ｅ欄）、それぞれ欠いている。第五のウィークＤ型では点突然変異が制
限部位を導入していた。すなわち、ウィークＤ２型はＡｌｕＩ部位を獲得してい
た（Ｂ欄）。ゲルの左側には１００ｂｐラダーを示し、５００ｂｐ断片と１００
ｂｐ断片の位置を各欄の右側に示す。Ａ欄のＰＣＲ反応については、およそ３，
０００ｂｐの最も大きい制限断片を示してしない。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年４月１７日（２０００．４．１７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３２】適切な宿主には、トランスジェニック非ヒト動物や、細菌、酵母細胞、動物（
好ましくは哺乳類）、真菌細胞または昆虫細胞などの細胞が含まれる。トランス
フェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどの形質
転換プロトコールも当技術分野ではよく知られている。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 21/08 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/566 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＧ０１Ｎ 33/566 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】野生型リーサスＤ抗原と比較して膜貫通領域および／または
細胞内領域に少なくとも１つのミスセンス変異を有する、ウィークＤ表現型の一
因となるまたはウィークＤ表現型を示すリーサスＤ抗原をコードする核酸分子。
【請求項２】ウィークＤ表現型の一因となるまたはウィークＤ表現型を示
すリーサスＤ抗原をコードする核酸分子であって、（ａ）前記Ｄ抗原が、バリンによる２２３位のアミノ酸のフェニルアラニンの置
換またはイソロイシンによる２８３位のトレオニンの置換に導く単一のミスセン
ス変異を有さない条件の下で、野生型リーサスＤ抗原と比較して、２位〜１６位
、１１４位〜１４９位、１７９位〜２２５位または／および２６７位〜３９７位
のアミノ酸に少なくとも１つのミスセンス変異を有する；あるいは（ｂ）ＲＨＣＥ遺伝子の対応するエキソンにより置き換わる第６〜第９エキソン
にかかわる遺伝子変換を有する、核酸分子。
【請求項３】前記ミスセンス変異が３位、１０位、１６位、１１４位、１
４９位、１８２位、１９８位、２０１位、２２０位、２２３位、２７０位、２７
６位、２７７位、２８２位、２９４位、２９５位、３０７位、３３９位、３８５
位および３９３位のアミノ酸置換または前記置換の組み合わせ／または前記置換
を含む置換を生ずるものである請求項１または２記載の核酸分子。
【請求項４】３位の前記アミノ酸置換がＳｅｒからＣｙｓであり、１０位
の前記アミノ酸置換がＡｒｇからＧｌｎであり、１６位の前記アミノ酸置換がＴ
ｒｐからＣｙｓであり、１１４位の前記アミノ酸置換がＡｒｇからＴｒｐであり
、１４９位の前記アミノ酸置換がＡｌａからＡｓｐであり、１８２位の前記アミ
ノ酸置換がＳｅｒからＴｈｒであり、１９８位の前記アミノ酸置換がＬｙｓから
Ａｓｎであり、２０１位の前記アミノ酸置換がＴｈｒからＡｒｇであり、２２０
位の前記アミノ酸置換がＴｒｐからＡｒｇであり、２２３位の前記アミノ酸置換
がＰｈｅからＶａｌであり、２７０位の前記アミノ酸置換がＶａｌからＧｌｙで
あり、２７６位の前記アミノ酸置換がＡｌａからＰｒｏであり、２７７位の前記
アミノ酸置換がＧｌｙからＧｌｕであり、２８２位の前記アミノ酸置換がＧｌｙ
からＡｓｐであり、２９４位の前記アミノ酸置換がＡｌａからＰｒｏであり、２
９５位の前記アミノ酸置換がＭｅｔからＩｌｅであり、３０７位の前記アミノ酸
置換がＧｌｙからＡｒｇであり、３３９位の前記アミノ酸置換がＧｌｙからＧｌ
ｕであり、３８５位の前記アミノ酸置換がＧｌｙからＡｌａであり、および３９
３位の前記アミノ酸置換がＴｒｐからＡｒｇである、請求項３記載の核酸分子。
【請求項５】前記ミスセンス変異が８位、２９位、４８位、３４０位、４
４６位、５４４位、５９４位、６０２位、６５８位、６６７位、８０９位、８１
９位、８２６位、８３０位、８４５位、８８０位、８８５位、９１９位、１０１
６位、１１５４位または１１７７位のヌクレオチドまたは前記位置の組み合わせ
に生ずるものである、請求項１〜４いずれか１つに記載の核酸分子。
【請求項６】８位の前記ミスセンス変異がＣからＧであり、２９位の前記
ミスセンス変異がＧからＡであり、４８位の前記ミスセンス変異がＧからＣであ
り、３４０位の前記ミスセンス変異がＣからＴであり、４４６位の前記ミスセン
ス変異がＣからＡであり、５４４位の前記ミスセンス変異がＴからＡであり、５
９４位の前記ミスセンス変異がＡからＴであり、６０２位の前記ミスセンス変異
がＣからＧであり、６５８位の前記ミスセンス変異がＴからＣであり、６６７位
の前記ミスセンス変異がＴからＧであり、８０９位の前記ミスセンス変異がＴか
らＧであり、８１９位の前記ミスセンス変異がＧからＡであり、８２６位の前記
ミスセンス変異がＧからＣであり、８３０位の前記ミスセンス変異がＧからＡで
あり、８４５位の前記ミスセンス変異がＧからＡであり、８８０位の前記ミスセ
ンス変異がＧからＣであり、８８５位の前記ミスセンス変異がＧからＴであり、
９１９位の前記ミスセンス変異がＧからＡであり、１０１６位の前記ミスセンス
変異がＧからＡであり、１１５４位の前記ミスセンス変異がＧからＣであり、お
よび１１７７位の前記ミスセンス変異がＴからＣである、請求項５記載の核酸分
子。
【請求項７】前記置換の組み合わせが、１８２位、１９８位および２０１
位であり、好ましくはＳ１８２Ｔ、Ｋ１９８Ｎ、Ｔ２０１Ｒであり、または２０
１位および２２３位であり、好ましくはＴ２０１ＲおよびＦ２２３Ｖであり、ま
たは１６位、２０１位および２２３位であり、好ましくはＷ１６Ｃ、Ｔ２０１Ｒ
およびＦ２２３Ｖである、請求項３または４記載の核酸分子。
【請求項８】前記ミスセンス変異の組み合わせが、５４４位、５９４位お
よび６０２位を含んでなるものであり、好ましくは５４４位でのＴ→Ａ、５９４
位でのＡ→Ｔおよび６０２位でのＣ→Ｇであり、または６０２位、６７７位およ
び８１９位を含んでなるものであり、好ましくは６０２位でのＣ→Ｇ、６６７位
でのＴ→Ｇおよび８１９位でのＧ→Ａであり、または４８位、６０２位、６６７
位および８１９位を含んでなるものであり、好ましくは４８位でのＧ→Ｃ、６０
２位でのＣ→Ｇ、６６７位でのＴ→Ｇおよび８１９位でのＧ→Ａである、請求項
５または６記載の核酸分子。
【請求項９】ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡである請求項１〜８いずれか１
つに記載の核酸分子。
【請求項１０】請求項１〜９いずれか１つに記載の核酸分子を含有してな
るベクター。
【請求項１１】請求項１０記載のベクターで形質転換した宿主。
【請求項１２】好適な条件下に請求項１１記載の宿主を培養する工程およ
び産生されたリーサスＤ抗原を単離する工程を含む、ウィークＤ表現型の一因と
なるリーサスＤ抗原の生産方法。
【請求項１３】請求項１〜９いずれか１つに記載の核酸分子によりコード
されるまたは請求項１２記載の方法により生産されるリーサスＤ抗原。
【請求項１４】ストリンジェントな条件下に、前記少なくとも１つのミス
センス変異を含んでなる請求項１〜９いずれか１つに記載の核酸分子の一部また
はその相補的な部分にハイブリダイズする、または請求項２において規定される
遺伝子変換の切断点にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】請求項１３記載のリーサスＤ抗原に特異的に結合する抗体
またはアプタマーまたはファージ。
【請求項１６】請求項１３記載のリーサスＤ抗原に特異的に結合しないが
、野生型リーサスＤ抗原または異常型リーサスＤ抗原に特異的に結合する抗体ま
たはアプタマーまたはファージ。
【請求項１７】請求項１４記載のオリゴヌクレオチド、または野生型リー
サスＤ抗原と比較して、少なくとも１つのミスセンス変異を有するものであり、
前記ミスセンス変異が２２３位または２８３位にアミノ酸置換を生ずるものであ
って、２２３位において好ましくはＰｈｅからＶａｌであり、かつ２８３位にお
いて好ましくはＴｈｒからＩｌｅであり、前記ミスセンス変異がさらに好ましく
は６６７位または８４８位のヌクレオチドに生ずるものであって、最も好ましく
は６６７位における前記変異がＴからＧであり、かつ８４８位における前記変異
がＣからＴである、ウィークＤ表現型の一因となるもしくはウィークＤ表現型を
示すリーサスＤ抗原をコードする核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオ
チドを、ストリンジェントな条件下に、ヒトから得られた検体に含まれる核酸分
子にハイブリダイズする工程ならびに前記ハイブリダイゼーションを検出する工
程を含む、検体におけるウィークＤ表現型の一因となるリーサスＤ抗原をコード
する核酸分子の存在について検査する方法。
【請求項１８】制限エンドヌクレアーゼにより前記ハイブリダイゼーショ
ンの産物を消化する工程ならびに前記消化の産物を解析する工程をさらに含む請
求項１７記載の方法。
【請求項１９】請求項１〜９いずれか１つに記載の核酸分子の少なくとも
一部の核酸配列を決定する工程を含み、前記部分が前記ミスセンス変異または前
記遺伝子変換の切断点またはウィークＤ表現型の一因となるリーサスＤ抗原をコ
ードする核酸分子の少なくとも１つをコードするものであり、前記核酸分子が野
生型リーサスＤ抗原と比較して少なくとも１つのミスセンス変異を有するもので
あり、前記ミスセンス変異が２２３位または２８３位にアミノ酸置換を生ずるも
のであって、２２３位において好ましくはＰｈｅからＶａｌであり、かつ２８３
位において好ましくはＴｈｒからＩｌｅであり、前記ミスセンス変異がさらに好
ましくは６６７位または８４８位のヌクレオチドに生ずるものであって、最も好
ましくは６６７位における前記変異がＴからＧであり、かつ８４８位における前
記変異がＣからＴである、検体におけるウィークＤ表現型の一因となるまたはウ
ィークＤ表現型を示すリーサスＤ抗原をコードする核酸の存在について検査する
方法。
【請求項２０】前記核酸配列を決定する工程の前に、前記核酸分子の少な
くとも前記部分を増幅する工程をさらに含む請求項１９記載の方法。
【請求項２１】増幅反応を行なう工程ならびに増幅産物をアッセイする工
程を含み、前記増幅反応において使用するプライマーの少なくとも１つが請求項
１４記載のオリゴヌクレオチドまたはウィークＤ表現型の一因となるもしくはウ
ィークＤ表現型を示すリーサスＤ抗原をコードする核酸分子にハイブリダイズす
るオリゴヌクレオチドであり、前記核酸分子が、野生型リーサスＤ抗原と比較し
て、少なくとも１つのミスセンス変異を有するものであり、前記ミスセンス変異
が２２３位または２８３位におけるアミノ酸置換を生ずるものであって、２２３
位において好ましくはＰｈｅからＶａｌであり、かつ２８３位において好ましく
はＴｈｒからＩｌｅであり、前記ミスセンス変異がさらに好ましくは６６７位ま
たは８４８位のヌクレオチドに生ずるものであって、最も好ましくは６６７位に
おける前記変異がＴからＧであり、かつ８４８位における前記変異がＣからＴで
ある、検体におけるウィークＤ表現型の一因となるまたはウィークＤ表現型を示
すリーサスＤ抗原をコードする核酸分子の存在について検査する方法。
【請求項２２】前記増幅または増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ
）によるものであるまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行なわれるも
のである、請求項２０または２１記載の方法。
【請求項２３】請求項１５記載の抗体またはアプタマーまたはファージあ
るいはウィークＤ表現型の一因となるもしくはウィークＤ表現型を示し、かつ野
生型リーサスＤ抗原と比較して、少なくとも１つのミスセンス変異を有する核酸
分子によりコードされるリーサスＤ抗原に対する抗体またはアプタマーまたはフ
ァージへの特異的な結合についてヒトから得られた検体をアッセイする工程を含
み、前記ミスセンス変異が２２３位または２８３位におけるアミノ酸置換を生ず
るものであって、２２３位において好ましくはＰｈｅからＶａｌであり、かつ２
８３位において好ましくはＴｈｒからＩｌｅであり、前記ミスセンス変異がさら
に好ましくは６６７位または８４８位のヌクレオチドに生ずるものであって、最
も好ましくは６６７位における前記変異がＴからＧであり、かつ８４８位におけ
る前記変異がＣからＴである、検体におけるウィークＤ表現型の一因となるまた
はウィークＤ表現型を示すリーサスＤ抗原の存在について検査する方法。
【請求項２４】請求項１６記載の抗体またはアプタマーまたはファージへ
の特異的な結合についてヒトから得られた検体をアッセイする工程を含む、野生
型リーサスＤ抗原の存在および請求項１３記載のリーサスＤ抗原の非存在につい
て検体を検査する方法。
【請求項２５】前記検体が血液、血清、血漿、胎児組織、唾液、尿、粘膜
組織、粘液、膣組織、膣から得られる胎児組織、皮膚、毛髪、毛包または他のヒ
ト組織である、請求項１７〜２４いずれか１つに記載の方法。
【請求項２６】胎児細胞を濃縮する工程または末梢血、血清または血漿等
の材料組織から胎児ＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出する工程を含む請求項２５記載
の方法。
【請求項２７】前記検体由来の前記核酸分子またはタンパク質材料を固体
支持体に固定する請求項１７〜２６いずれか１つに記載の方法。
【請求項２８】前記固体支持体がチップである請求項２７記載の方法。
【請求項２９】請求項１〜９いずれか１つに記載の核酸分子、または、野
生型リーサスＤ抗原と比較して、少なくとも１つのミスセンス変異を有するもの
であり、前記ミスセンス変異が２２３位または２８３位におけるアミノ酸置換を
生ずるものであって、２２３位において好ましくはＰｈｅからＶａｌであり、か
つ２８３位において好ましくはＴｈｒからＩｌｅであり、前記ミスセンス変異が
さらに好ましくは６６７位または８４８位のヌクレオチドに生ずるものであって
、最も好ましくは６６７位における前記変異がＴからＧであり、かつ８４８位に
おける前記変異がＣからＴであり、またはそれらの組み合わせである、ウィーク
Ｄ表現型の一因となるまたはウィークＤ表現型を示すリーサスＤ抗原をコードす
る核酸分子のウィークリーサスＤ表現型の解析のための使用。
【請求項３０】モノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清、好まし
くは抗Ｄ抗血清、抗グロブリンまたは抗ヒトグロブリン抗血清のアフィニティー
、アビジチーおよび／または反応性の評価のための請求項１〜９いずれか１つに
記載の核酸分子、請求項１０記載のベクターまたは請求項１３記載のリーサスＤ
抗原の使用。
【請求項３１】（ａ）請求項１〜２４いずれか１つにおいて規定される変
異の存在について発端者の検体の核酸を検査する工程、（ｂ）ＲＨＤ遺伝子の変異状態と対立遺伝子状態に基づいて、その核酸を、前記
発端者の赤血球の表面のＲｈＤ抗原密度と相関させる工程、（ｃ）前記モノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清もしくはそれらの前
記製剤を、ＲｈＤ抗原をその表面に保持する細胞と反応させる工程、（ｄ）前記モノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清もしくはそれらの前
記製剤を、工程（ｃ）で得た結果に基づいて特徴づける工程、を含む、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清もしくはそれらの製剤
を特徴づける方法。
【請求項３２】前記特徴付ける工程が抗体および抗血清の反応性、感度、
アビジチー、アフィニティー、特異性および／または他の特徴を決定する工程を
含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】ＲｈＤ抗原をその表面に保持する前記細胞が赤血球である
請求項３１または３２記載の方法。
【請求項３４】ＲｈＤ抗原決定のための請求項１５または１６において特
徴付けられたアプタマー、ファージ、モノクローナル抗体またはポリクローナル
抗血清またはそれらの製剤の使用。
【請求項３５】前記ＲｈＤ抗原決定が血液型の決定との関連で行なわれる
請求項３４の使用。
【請求項３６】請求項１５または１６記載の抗体またはアプタマーまたは
ファージを含んでなる製剤。
【請求項３７】（ａ）請求項１３記載のウィークＤポリペプチドを、ファ
ージ表面にＶ_H鎖もしくはＶ_L鎖またはその組み合わせをディスプレイするファ
ージライブラリーまたはアプタマーと接触させる工程；（ｂ）前記ウィークＤポリペプチドに結合するファージまたはアプタマーを同定
する工程；ならびに任意に（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回またはそれ以上繰り返す工程、を含む、請求項１３記載のウィークＤポリペプチドに特異的に結合する抗体Ｖ_H 鎖もしくはＶ_L鎖またはその組み合わせあるいはアプタマーを同定する方法。
【請求項３８】（ａ）請求項１３記載のウィークＤポリペプチドを１つま
たはそれ以上のモノクローナル抗体と接触させる工程；（ｂ）前記ウィークＤポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を同定する工
程；ならびに任意に（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回またはそれ以上繰り返す工程、を含む、請求項１３記載のウィークＤポリペプチド／抗原に特異的に結合するモ
ノクローナル抗体を同定する方法。
【請求項３９】（ａ）ウィークＤポリペプチドおよび（ａａ）第２またはそれ以上のウィークＤポリペプチドおよび／または（ａｂ）標準Ｄポリペプチドを、ファージ表面にＶ_H鎖もしくはＶ_L鎖またはそ
の組み合わせをディスプレイするファージライブラリーまたはアプタマーと接触
させる工程、ここで、第２またはそれ以上のウィークＤポリペプチドおよび／ま
たは標準Ｄポリペプチドは（ａ）のウィークＤポリペプチドより多い、等しいま
たは少ないモル量で存在するものである；（ｂ）（ａ）の前記ウィークＤポリペプチドに結合するファージまたはアプタマ
ーを同定する工程；ならびに任意に（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回またはそれ以上繰り返す工程、を含む、請求項１３記載のウィークＤポリペプチド／抗原に特異的に結合する抗
体Ｖ_H鎖もしくはＶ_L鎖またはその組み合わせあるいはアプタマーを同定する方
法。
【請求項４０】（ａ）ウィークＤポリペプチドおよび（ａａ）第２またはそれ以上のウィークＤポリペプチドおよび／または（ａｂ）標準Ｄポリペプチドを、１つまたはそれ以上のモノクローナル抗体と接
触させる工程、ここで、第２またはそれ以上のウィークＤポリペプチドおよび／
または標準Ｄポリペプチドは（ａ）のウィークＤポリペプチドより多い、等しい
または少ないモル量で存在するものである；（ｂ）（ａ）の前記ウィークＤポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を同
定する工程；ならびに任意に（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回またはそれ以上繰り返す工程、を含む、請求項１３記載のウィークＤポリペプチド／抗原に特異的に結合するモ
ノクローナル抗体を同定する方法。
【請求項４１】ウィークＤポリペプチドを細胞の表面に曝す請求項３７〜
４０いずれか１つに記載の方法。
【請求項４２】ポリペプチドまたは宿主細胞を固体支持体に固定する請求
項３７〜４１いずれか１つに記載の方法。
【請求項４３】工程（ｂ）または（ｃ）に続いて以下の工程：（ｄ）Ｖ_H鎖もしくはＶ_L鎖のアミノ酸配列を同定する工程および／または前記
アミノ酸配列をコードする核酸配列を同定する工程、を行なう、請求項３７〜４２いずれか１つに記載の方法。
【請求項４４】同定のためにたった１回の選抜が行なわれる場合に、（ａ
）のウィークＤポリペプチド分子の数がファージ粒子の数に対してモル過剰であ
る、請求項３９〜４３いずれか１つに記載の方法。
【請求項４５】モノクローナル抗Ｄ抗体またはポリクローナル抗Ｄ抗血清
または抗グロブリンまたは抗ヒトグロブリン抗血清またはそれらの製剤のアフィ
ニティー、アビジチーおよび／または反応性の評価のための発端者由来の細胞、
好ましくは赤血球の使用。
【請求項４６】請求項１３記載の１つまたはそれ以上のＲｈＤ抗原の存在
について輸血の必要な患者由来の検体を検査する工程を含み、前記抗原の少なく
とも１つの陽性検査がＲｈＤ陰性血液による輸血の必要性を示す、輸血の必要な
患者がドナーからのＲｈＤ陰性血液で輸血されるべきか否かを決定する方法。
【請求項４７】請求項１３記載の１つまたはそれ以上のＲｈＤ抗原の存在
についてドナー由来の検体を検査する工程を含み、前記抗原の少なくとも１つの
陽性検査が野生型ＲｈＤ抗原または前記ドナーの１つまたは複数のウィークＤ型
以外の１つまたは複数のウィークＤ型（ａ）を有するとタイプ分けされる患者の
輸血を排除する、ドナーの血液がその必要のある患者への輸血に使用されてよい
か否かを決定する方法。
【請求項４８】（ａ）請求項１４記載のオリゴヌクレオチド；および／ま
たは（ｂ）請求項１５記載の抗体；および／または（ｃ）請求項１６記載の抗体；（ｄ）請求項１５または１６記載のアプタマー；および／または（ｅ）請求項１５または１６記載のファージ、を含むキット。