ES2241195T3

ES2241195T3 - Nuevas moleculas de acidos nucleicos correlacionadas con el fenotipo debil d rhesus.

Info

Publication number: ES2241195T3
Application number: ES98966368T
Authority: ES
Inventors: Willy A. Flegel; Franz F. Wagner
Original assignee: DRK BLUTSPENDEDIENST BADEN WUR; DRK Blutspendedienst Baden Wurttemberg gGmbH
Current assignee: DRK BLUTSPENDEDIENST BADEN WUR; DRK Blutspendedienst Baden Wurttemberg gGmbH
Priority date: 1998-01-23
Filing date: 1998-12-18
Publication date: 2005-10-16
Anticipated expiration: 2018-12-18
Also published as: WO1999037763A9; BR9815090A; ATE292176T1; CA2318486A1; EP1047777B1; WO1999037763A2; AU2274699A; CA2318486C; DE69829587D1; BRPI9815090B1; US7005276B1; JP2002500884A; AU748222B2; DE69829587T2; PT1047777E; IL137424A0; EP1047777A2; WO1999037763A3

Abstract

Una molécula de ácido nucleico codificando un antígeno Rhesus D que contribuye a o es indicativo del fenotipo débil D, dicha molécula de ácido nucleico teniendo al menos una mutación sin sentido, como se compara con el antígeno salvaje Rhesus tipo D, en sus regiones transmembrana y/o intracelulares.

Description

Nuevas moléculas de ácidos nucleicos correlacionadas con el fenotipo débil D Rhesus.

La presente invención se refiere a nuevas moléculas de ácido nucleico que codifican para el antígeno D Rhesus, que contribuye al fenotipo D débil que se caracteriza por una o una combinación de mutaciones sin sentido. La presente invención también se refiere a vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico de la invención, a huéspedes transformados con dichos vectores, a proteínas codificadas por dichos ácidos nucleicos y a métodos de producción de polipéptidos. El hecho que mutaciones sin sentido y la conversión antes referida pueden estar directamente relacionadas con el fenotipo D débil tiene un impacto significativo en los análisis rutinarios de muestras de sangre. Por ejemplo, oligonucleótidos y anticuerpos pueden ahora ser diseñados para permitir la detección del fenotipo D débil en una muestra. Al igual que los oligonucleótidos, los anticuerpos como métodos de diagnóstico se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Los antígenos RhD codificados por las nuevas moléculas de ácido nucleico pueden utilizarse para la caracterización, estandarización y control de calidad de antisuero monoclonal y policlonal anti-D. Finalmente, la invención se refiere a un kit útil para detectar la presencia de fenotipos D débiles.

El antígeno D Rhesus (ISBT 004. 001; RH1) asociado a la proteína RhD es el antígeno de grupo sanguíneo más importante determinado por una proteína. Esta es la principal causa de la enfermedad hemolítica del recién nacido (Mollison et al. 1993). Entre el 0, 2% y el 1% de la raza blanca tienen glóbulos rojos con la expresión reducida del antígeno D (D débil, antes D^{u}) (Mourant et al. 1976; Stratton, 1946; Wagner et al. 1995). Una pequeña fracción de muestras D débiles se explican por alteraciones cualitativas de proteínas RhD, llamadas D parciales (Salmon et al. 1984) y frecuentemente causadas por alelos híbridos RHD/RHCE (recientemente revisados en Huang, 1997). Otra fracción es causada por los efectos de supresión de los haplotipos Cde en posición trans (Ceppellini et al. 1955). Estos D débiles prácticamente poseen el alelo normal RHD, porque los portadores paternos y los niños suelen expresar una densidad normal de antígeno RhD. Tales D débiles sólo muestran una pequeña reducción en la expresión del antígeno RhD, llamado "D^{u} alto grado" y actualmente tipado como RhD normal, debido a la incrementada sensibilidad de los anticuerpos monoclonales anti-D.

La mayoría de antígenos D moderadamente o fuertemente debilitados son causados por genotipos localizados en el locus de genes Rhesus o próximos, debido a que la expresión D débil es heredada con el fenotipo RhD (Stratton, 1946). Aparte de esta reducción meramente cuantitativa, no se pueden encontrar diferencias cualitativas en el antígeno D para este tipo de débil D más prevalente. Dos estudios recientes apuntaron a la causa molecular de la prevalencia de fenotipos D débiles. Ambos grupos, Rouillac et al. (1996) y Beckers et al. (1997), realizaron RT-PCR y no encontraron mutaciones al secuenciar el cDNA del RHD en muestras D débiles. Usando RT-PCR semicuantitativas, Rouillac et al. (1996) describieron niveles reducidos de transcritos de RHD en muestras D débiles y revelaron que sus observaciones aportaban evidencia directa de una única diferencia cuantitativa en RhD entre los glóbulos rojos normales y los D débiles. No obstante, en un estudio similar, Beckers et al. (1995 y 1997) no encontraron diferencias en las cantidades de transcritos de RhD y excluyeron un exceso de variantes de corte y empalme (Kajii et al. 1995), cuyos productos pueden resultar inadecuados o no del todo incorporados en la membrana de los glóbulos rojos (Beckers et al. 1997). Concluyeron que la debilidad D no es causada por defectos en la regulación del proceso de transcripción y propusieron genes de regulación no identificados o factores involucrados en el complejo relacionado con Rh como posibles causas de la debilidad D. Entonces, mientras el mecanismo de expresión de la debilidad D permanece incierto, no se estableció la causa molecular.

Cribajes de muestras aleatorias de D débil mediante PCR para polimorfismos específicos de RHD confirmaron la amplificación por PCR de patrones representativos para un alelo RHD normal (Avent et al. 1997b: Legler et al, 1997). No obstante, existen evidencias que muy pocos D débiles que desconocen ser parciales D, podrían ser portadores de alelos RHD estructuralmente anormales: cuatro de cada 44 D débiles en Inglaterra carecen de amplicones de PCR específicos para el intrón 4 de RHD (Avent et al. 1997b) y uno de cada 94 débiles D en el norte de Alemania carecen de amplicones de PCR específicos para el exón 5 de RHD (Legler et al. 1997). En la segunda muestra, el nucleótido T en posición 667 se sustituyó por una G específica de RHCE codificando para la sustitución del aminoácido F223V (TJ Legler y A Humpe, comunicaciones personales).

Por lo tanto, alelos aberrantes se observaron sólo en una pequeña fracción de débiles D son, de hecho, responsables del fenómeno general del fenotipo D débil; ver también Aubin et al. 1997; Avent et al. 1997b; Fukumori et al. 1997; Huang, 1997; Issitt y Telen, 1996; Roubinet et al. 1996. Consecuentemente, los conocimientos previos en el campo fallaron hasta ahora en proporcionar los métodos fiables y convenientemente aplicables para detectar el fenotipo Rhesus D débil en una muestra.

Así, el problema técnico subrayado en la presente invención era establecer los medios y los métodos que puedan convenientemente y ampliamente emplearse en el análisis del fenotipo Rhesus D débil.

La solución a dicho problema técnico se ha conseguido mediante las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Así, la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican el antígeno D Rhesus, indicativo del fenotipo D débil, dicho ácido nucleico es portador de al menos una mutación sin sentido, comparado con el antígeno Rhesus D salvaje, en sus regiones transmembrana y/o intracelular.

En concordancia con la presente invención, el término "contribuyendo al fenotipo D débil" implica un rol activo de la mutación que puede ser causado por un intercambio de aminoácido, mientras el término "indicativo del fenotipo D débil" no necesariamente implica este rol pero puede también referirse a una mutación silenciosa. Tal mutación silenciosa puede, por ejemplo, ocurrir junto con otras mutaciones tales como mutaciones sin sentido que están descritas con más detalle a continuación.

De acuerdo con la presente invención, se ha encontrado que las mutaciones sin sentido observadas no sólo están asociadas con, sino que realmente son causantes de una baja integración de la proteína RhD en las membranas celulares de los glóbulos rojos. Así, por la presente invención se ha demostrado que (i) los alelos D débiles evolucionan independientemente en los diferentes haplotipos, siendo cada evento distinto asociado con un cambio en la secuencia codificante de RhD; (ii) no aparecen secuencias con una secuencia codificante normal a pesar de la observación de 16 alelos diferentes en 164 muestras: y (iii) tipo y distribución de las substituciones de nucleótidos observadas no eran compatibles con la hipótesis nula de los cambios aleatorios.

El hallazgo demutaciones sin sentido en RHD llevan a la expresión reducida del antígeno D, ajustado al modelo actual de integración de membrana de RhD; ver Tabla 7. Ambas proteínas Rh aparecen en un complejo con la proteína Rh50, que puede estar unida mediante otras proteínas adicionales, como LW, CD47, y glicoproteína B (Huang, 1997). La expresión de todo el complejo Rh depende de la integridad de al menos una proteína Rh (JP Cartron, presentación oral en la conferencia ISBT/DGTI, Frankfurt, Septiembre de 1997) y la proteína Rh50 (Cherif-Zahar et al, 1996). Cambios estructurales sutiles en la proteína Rh50 causado por mutaciones sin sentido son suficientes para prevenir la expresión del complejo Rh (Cherif-Zahar et al, 1996). De forma similar, tales cambios estructurales sutiles en la proteína RhD parecen afectar también la expresión del complejo Rh que involucra RhD.

Basado en la distribución y tipo de sustituciones de aminoácidos, un esquema general de la relación de la estructura de RhD y la expresión de RhD puede establecerse ahora: Todas las sustituciones de aminoácidos en débil D están localizadas en las partes intracelular o transmembrana de la proteína RhD donde el alineamiento se llevó a cabo de acuerdo con el modelo actual mencionado antes (ver Tabla 7). Los alelos RHD conocidos con sustituciones exofaciales (Avent et al. 1997a; Jones et al. 1997, Liu et al. 1996; Rouillac et al. 1995) se descubrieron por la virtud de su antígeno D parcial, pero puede mostrar reducciones discretas (DNU y DV^{VII}) a moderadas (D^{II}, DHR y DHMi) en la de expresión RhD (Flegel y Wagner, 1996; Jones et al, 1997; Jones et al, 1996). La mayoría de sustituciones comunicadas de acuerdo con esta invención fueron no conservadoras y los aminoácidos introducidos, en particular prolina, rota probablemente la estructura secundaria o terciaria. Dos alelos D débiles (tipo 2 y 11) se asociaron con sustituciones conservativas indicando que las regiones de aminoácidos involucradas en las posiciones 295 y 385 eran muy importantes para una integración óptima de la membrana RhD. En dos alelos (tipo 4 y tipo 14), partes de los exones 4 y 5 fueron sustituidas por las correspondientes partes del gen RHCE. Cambios similares sucedidos en el tipo I D^{VI} y en el tipo II D^{VI} que presentaron una expresión considerablemente reducida de la proteína RhD (Jones et al, 1996), también. Observaciones paradójicas previas pueden explicarse. Si la sustitución N152T en el exón 3 está considerada para facilitar la integración de membrana: (1) D^{IIIa} (Huang et al, 1997), diferiendo del tipo 4 débil D sólo por la sustitución N152T, posee una densidad normal de antígeno RhD (Jones et al, 1996), y (ii) los tipos D^{IIIc}, D^{IVa}, y D^{VI} III que son portadores de la sustitución N152T poseen densidades de antígeno potenciadas (Flegel et al, 1997; Jones et al, 1996) en comparación con sus controles apropiados (RhD normal y tipo II D^{VI}).

Muchos fenotipos con expresión D débil, como D^{VI}, D^{V}, DBT, algún D^{IV} y DFR, fueron reconocidos hace tiempo como entidades separadas por la propensión de sus portadores de producir anti-D (Lomas et al, 1994; Tippett y Sanger, 1977; Tippett y Sanger, 1962). Estos fenotipos fueron confirmados posteriormente y agrupados mediante distintos patrones de reacción con anti-D monoclonal (Lomas et al. 1993: Lomas et al, 1989; Scott. 1996). Sin embargo, la clasificación serológica de la mayoría de fenotipos D débil no ha tenido éxito, debido a que carecen de un patrón de reacción consistente con anti-D monoclonal y sus portadores parecen no ser propensos a la inmunización anti-D (Moore, 1984). Existe incluso un límite no definido entre D normal y D débil (Agre et al, 1992; Moore, 1984; Nelson et al, 1995). Aún así, la variabilidad de la densidad del antígeno RhD (antígenos por célula) en los fenotipos D débil (Hasekura et al, 1990; Jones et al, 1996; Nelson et al, 1995; Nicholson et al, 1991; Tazzari et al, 1994; Wagner, 1994) y los patrones aberrantes raros en PCR de RHD (Avent et al, 1997b: Legler et al, 1997) no excluyen una diversidad molecular subyacente. La presente invención por primera vez permite la clasificación conveniente de D débil y para la correlación sin ambigüedad de distintos alelos con datos clínicos. Junto con los alelos RHD raros previamente definidos, la definición molecular exacta de la mayoría de fenotipos con densidad reducida de antígeno D ha sido ahora posible. En el caso que los pacientes portadores de tipos moleculares particulares de D débil tendieron a desarrollar anti-D, la clasificación hecha gracias a la presente invención ayudará a llevar una política de transfusión negativa de Rhesus. La disponibilidad de muestras D débil que están caracterizadas considerando la estructura molecular y las densidades del antígeno RhD promoverán el seguro de calidad de los reactivos anti-D. Estos darán fiabilidad a los tipos de probandos como RhD positivos, cuyas proteínas RhD no tienden a una immunización frecuente anti-D (Wagner et al, 1995). Por lo tanto, el uso de unidades de glóbulos rojos RhD negativos para transfusiones a pacientes D débil, que ha sido justificado mediante un supuesto potencial por inmunización anti-D, puede finalmente reducirse a un mínimo, que puede deducirse científicamente.

Adicionalmente, se ha encontrado de acuerdo con la invención que las mutaciones se aglomeran en ciertos tramos del polipéptido Rhesus D. Además, se detectó una conversión génica que correlaciona con el fenotipo D débil. Así, la invención también se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno Rhesus D que contribuye o es indicativo de un fenotipo D débil, dicha molécula de ácido nucleico lleva al menos una mutación sin sentido, en comparación con el Rhesus tipo salvaje. El antígeno D, en las posiciones de aminoácidos 2-16, 114-149, 179-225 o/y 267 a 397 con la condición que dicho antígeno D no lleva una mutación sin sentido sencilla llevando a una sustitución de fenilalanina en la posición de aminoácidos 223 por valina o treonina en la posición 283 mediante isoleucina. Todas las mutaciones sin sentido encontradas de acuerdo con la presente invención y localizadas en las regiones anteriores están asociadas con la región transmembrana o la porción intracelular del polipéptido cuando se emplea el modelo actual de RhD anteriormente indicado.

Además de las mutaciones sin sentido, se identificó una conversión génica indicativa de D débil. Dicha conversión puede utilizarse para propósitos de diagnóstico básicamente en la misma extensión como las mutaciones sin sentido. Los puntos de rotura están determinados de estar entre los intrones 5 y 9; ver también la Fig. 3.

Los mutantes referidos anteriormente y más durante esta especificación pueden usarse convenientemente para la caracterización de anticuerpos monoclonales y policlonales usados en conexión con el diagnóstico, profilaxis y tratamiento de RhD. Por ejemplo, mediante la expresión de moléculas de ácido nucleico deseadas codificando tales mutantes en un sistema adecuado, pueden establecerse los perfiles de reactividad de dichos anticuerpos o antisueros.

Los mutantes también pueden emplearse para la caracterización de anticuerpos monoclonales y policlonales que se usan como anticuerpos secundarios, por ejemplo, antisueros antiglobulina y antiglobulina humana.

Preferiblemente, la mutación sin sentido causa una sustitución de aminoácidos en la posición 3, 10, 16, 114, 149, 182, 198, 201, 220, 223, 270, 276, 277, 282, 294, 295, 307, 339, 385 o 393 o una combinación de/o involucrando dichas sustituciones, con la condición que dicha sustitución no está basada en una mutación sin sentido sencilla llevando a una sustitución de fenilalanina en la posición de aminoácidos 223 por valina.

Esta realización preferida, además de las mutaciones sencillas indicadas, puede comprender una combinación de estas sustituciones. Adicionalmente, contempla la posibilidad que una o más de dichas sustituciones están involucradas, y que mutaciones adicionales como mutaciones que llevan a sustituciones están presentes. De acuerdo con la presente invención, se entiende que tales mutaciones adicionales deben probarse para valorar el estado de RhD en una muestra. El hallazgo de tal mutación permitirá al experto llegar a la conclusión que otras mutaciones identificadas en esta especificación que ocurren en combinación con dicha primera mutación estarán presentes. Por lo tanto, tales realizaciones que reflejan la detección de mutaciones adicionales que ocurren en combinación con las mutaciones identificadas en esta especificación también son comprendidas por la invención.

En una realización particularmente preferida de la molécula de ácido nucleico de la invención, dicha sustitución de aminoácido en la posición 3 es de Ser a Cys, en la posición 10 de Arg a Gln, en la posición 16 de Trp a Cys, en la posición 114 de Arg a Trp, en la posición 149-de Ala a Asp, en posición 182 de Ser a Thr, en la posición 198 de Lis a Asn, en la posición 201 de Thr a Arg, en la posición 220 de Trp a Arg, en la posición 223 de Fe a Va, en la posición 270 de Val a Gly, en la posición 276 de Ala a Pro, en k posición 277 de Gly a Glu, en la posición 282 de Gly a Asp, en la posición 294 de Ala a Pro, en la posición 295 de Met a Ile, en la posición 307 de Gly a Arg, en la posición 339 de Gly a Glu, en la posición 385 de Gly a Ala y en la posición 393 de Trp a Arg.

En una realización más preferida de la molécula de ácido nucleico de la invención, dicha mutación sin sentido ocurre en la posición de nucleótidos 8, 29, 48, 340, 446, 544, 594, 602, 658, 667, 809, 819, 826, 830, 845, 880, 885, 919, 1016, 1154 y 1177 o en una combinación de dichas posiciones, con la condición que el antígeno codificado D no es portador de una mutación sin sentido que lleva a una sustitución de fenilalanina en la posición de aminoácido 223 por valina.

Particularmente preferida es que esta mutación sin sentido en la posición 8 sea de C a G, en la posición 29 de G a A, en la posición 48 de G a C, en la posición 340 de C a T, en la posición 446 de C a A, en la posición 544 de T a A, en la posición 594 de A a T, en la posición 602 de C a G, en la posición 658 de T a C, en la posición 667 de T a G, en la posición 809 de T a G, en la posición 819 de G a A, en la posición 826 de G a C, en la posición 830 de G a A, en la posición 845 de G a A, en la posición 880 de G a C, en la posición 885 de G a T, en la posición 919 de G a A, en la posición 1016 de G a A, en la posición 1154 de G a C y en la posición 1177 de T a C.

En el caso que las combinaciones de mutaciones sin sentido estén involucradas en la generación de fenotipos D débil, es preferido que dicha combinación de sustituciones esté en las posiciones 182, 198 y 201 y es preferiblemente S182T, K198N, T201R o en la posición 201 y 223 y es preferiblemente T201R y F223V, o en la posición 16, 201 y 223 y es preferiblemente W16C, T201R y F223V.

Mas preferiblemente, dicha combinación de mutaciones sin sentido comprende las posiciones 544, 594 y 602 y es preferiblemente T- ->A en la posición 544, A- ->T en la posición 594 y C- ->G en la posición 602 o comprende las posiciones 602, 667 y 819 y es preferiblemente C- ->G en la posición 602, T- ->G en la posición 667 y G- ->A en la posición 819, o comprende las posiciones 48, 602, 667 y 819 y es preferiblemente G- ->C en la posición 48, C- ->G en la posición 602, T- ->G en la posición 667 y G- ->A en la posición 819.

Aunque la molécula de ácido nucleico de la invención puede tener varios orígenes incluyendo origen (semi) sintético, es preferible que la molécula de ácido nucleico sea mRNA o DNA genómico. Los procedimientos estándar pueden emplearse para obtener cualquiera de los anteriores ácidos nucleicos, ver, por ejemplo, Sambrook, et al. "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2ª ed. 1989, CSH Press, Cold Spring Harbor. N. Y.

La invención también se refiere a un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención.

El vector puede usarse para la propagación y/o expresión o puede diseñarse para la transferencia de genes o propósitos de diana. Los métodos para producir tales vectores son bien conocidos en el campo. Lo mismo sucede para clonar los ácidos nucleicos de la mutación en tales vectores, asó como la propagación de vectores en huéspedes adecuados, etc.

El vector puede particularmente ser un plásmido, un cósmido, un virus o un bacteriófago usado convencionalmente en ingeniería genética que comprende esta molécula de ácido nucleico de la invención. Los vectores de expresión derivados de virus tales como retrovirus, virus de la viruela, virus adenoasociado, herpes virus, o papiloma virus bovino pueden utilizarse para la liberación de moléculas de ácido nucleico o vectores de la invención en poblaciones celulares diana. Los métodos que son bien conocidos por los expertos en el campo pueden usarse para construir vectores virales recombinantes; ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y. y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1989). Alternativamente, los polinucleótidos y vectores de la invención pueden reconstituirse en liposomas para la liberación de células diana. Los vectores que contienen las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden transferirse en la célula huésped mediante métodos bien conocidos, que varían dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo, la transfección de cloruro de calcio se usa comúnmente para células procariotas, mientras que el tratamiento de fosfato de calcio o electroporación puede utilizarse para otros huéspedes celulares; ver Sambrook, supra.

Tales vectores pueden comprender además genes tales como genes marcadores que permiten la selección de dicho vector en una célula huésped adecuada y bajo condiciones adecuadas. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico de la invención está unida de forma operativa a las secuencias de control de expresión permitiendo la expresión en células procariotas o eucariotas. La expresión de dicho polinucleótido comprende la transcripción de los polinucleótidos en un mRNA traducible. Los elementos reguladores que aseguran la expresión en células eucariotas preferiblemente células de mamífero, son bien conocidas por los expertos. Normalmente comprenden secuencias reguladoras que aseguran el inicio de transcripción y opcionalmente señales de poli-A que aseguran la terminación de la transcripción y la estabilización del transcrito. Elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores transcripcionales y traduccionales, y/o regiones promotoras heterólogas o asociadas de forma natural. Posibles elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped procariotas comprenden pej., el promotor PL, lac, trp o tac en E. coli, y ejemplos de elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped eucariotas son el promotor AOX1 o GAL1 en levaduras o el promotor CMV-, SV40, RSV- (Virus del Sarcoma de Rous), potenciador CMV, potenciador SV40 o un intrón de globina en mamíferos y otras células animales. Junto a los elementos que son responsables para el inicio de la transcripción tales elementos reguladores pueden también comprender señales de terminación de la transcripción, tales como el sitio SV40-poli-A o el sitio tk-poli-A, corriente abajo de la molécula de ácido nucleico. Además, dependiendo del sistema de expresión usado, las secuencias "leader" capaces de dirigir el polipéptido a un compartimento celular o secretarlo al medio puede añadirse a la secuencia codificante del poli nucleótido de la invención y es bien conocido en el campo. La(s) secuencia(s) leader es(son) ensamblada(s) en la fase apropiada con las secuencias de traducción, iniciación y terminación, y preferiblemente, una secuencia leader capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida, o una porción de la misma, en el espacio periplásmico o en el medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede una proteína de fisión que incluye un péptido de identificación C- o N-terminal dando las características deseadas, pej., estabilización o purificación simplificada de producto recombinante expresado. En este contexto, vectores de expresión adecuados son conocidos en el campo tales como el vector de expresión pcDV1 Okayama-Berg cDNA (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (in-vitrogene), o pSPORT1 (GIBCO BRL).

Preferiblemente, las secuencias de control de expresión serán sistemas promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células huésped eucariotas, pero secuencias de control para células huésped procariotas también pueden usarse.

Tal como se ha mencionado antes, el vector de la presente invención puede también ser un gen de transferencia o un vector diana. La terapia génica, que está basado en la introducción de genes terapéuticos en células mediante técnicas ex-vivo o in-vivo es una de las aplicaciones más importantes de transferencia de genes. Vectores adecuados y métodos para terapia génica in-vitro o in-vivo son descritos en la literatura y son conocidas por personas adiestradas en el arte: ver, pej., Giordano. Nature Medicine 2 (1996), 534-539: Schaper, Circ. Res. 79 (1996). 911-919: Anderson, Science 256 (1992), 808-813: Isner, Lancet 348 (1996), 370-374: Muhlhauser. Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086 Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716: WO94/29469: WO 97/00957 o Schaper. Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640, y las referencias citadas allí. Los poli nucleótidos y vectores de la invención pueden diseñarse para la introducción directa o para la introducción mediante liposomas, o vectores virales (pej. adenoviral, retroviral) en la célula. Preferiblemente, dicha célula es una célula de línea germinal, célula embriónica, u óvulo o farma derivada del mismo, más preferiblemente dicha célula es una célula germinal.

Adicionalemente, la invención se refiere a un huésped no humano transformado con el vector de la invención.

Huéspedes apropiados comprende animales transgénicos humanos, las células tales como bacterias, células de levadura, animal, preferiblemente células de mamífero, células fúngicas o células de insecto. Los protocolos de transformación incluyendo transfección, microinyección, electroporación, etc., son bien conocidos en el campo.

Además, la invención se refiere a un método para producir un antígeno Rhesus D que contribuye al fenotipo D débil que comprende el cultivo del huésped de la invención bajo condiciones adecuadas y aislando el antígeno Rhesus D producido.

Es preferible que el antígeno es exportado en el medio de cultivo donde puede ser recogido a las convenciones/métodos: El término "cultivar" tal como se usa de acuerdo con la presente invención también comprende te la cría de animales transgénicos. Usando construcciones de vectores apropiados y opcionalmente alimentos apropiados, el antígeno puede, pej., aislarse de la leche de, pej. Vacas transgénicas.

La invención adicionalmente se refiere a antígeno Rhesus D codificado por la molécula de ácido nucleico de la invención o producido por el método de la invención.

Preferiblemente, el antígeno está en el camino post transicionalmente modificado y posee la misma estructura química que el antígeno natural. Por lo tanto, dicho antígeno, cuando se produce mediante el método de la invención, es preferiblemente producido en células humanas.

Además, la invención se refiere a un oligonucleótido que hibrida específicamente con una porción de la molécula de ácido nucleico de la invención que comprende al menos una mutación sin sentido o la porción complementaria de la misma.

En esta realización de la invención, se entiende que los oligonucleótidos hibridan directamente con la secuencia mutada. El ajuste de las condiciones de hibridación astringentes están bien descritas por ejemplo en Sambrook et al, "Molecular Cloning, A Laboratory Handbook" CSH Press, Cold Spring Harbor 1989 o Hames y Higgins, "Nucleic acid hybridization, a practical approach", IRL Press, Oxford (1985). Así, la detección de las secuencias específicamente hibridadas requerirán normalmente las condiciones de hibridación y lavado tales como 0, 1xSSC, 0, 1% SDS a 65º. Como es bien conocido, la longitud de la sonda y la composición del ácido nucleico a determinar constituyen más parámetros de las condiciones de hibridación astringentes. Preferiblemente, el oligonucléotido es un desoxinucleótido. Es más preferido que el oligonucleótido comprenda de 12 a 50 nucleótidos y más preferiblemente de 15 a 24 nucleótidos. Un ejemplo de condiciones de hibridización no astringentes es la hibridización y lavado a 50ºC en 4xSSC, 0, 1% SDS.

Además, la invención se refiere a un anticuerpo o un aptámero que se une específicamente al antígeno Rhesus D de la invención.

El anticuerpo puede probarse y usarse en cualquier técnica serológica bien conocida en el campo, como técnicas de aglutinación en tubos, geles, técnica de fase sólida y técnicas de captura con o sin anticuerpos secundarios, o en citometría de flujo con o sin potenciador inmunofluorescente.

El anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo derivado de o que comprende un antisuero policlonal. El término "anticuerpo", tal como se usa de acuerdo con la presente invención, comprende además fragmentos de dicho anticuerpo tales como fragmentos Fab, F(ab')_{2}, Fv o scFv: ver, por ejemplo, Harlow y Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual" CSH Press 1988, Cold Spring Harbor, N. Y. El anticuerpo o el fragmento del mismo puede ser de origen natural o puede ser producido (semi) sintéticamente. Tales productos sintéticos también comprende material no proteináceo como material semi- proteináceo que posee la misma o esencialmente la misma especificidad de unión como el anticuerpo de la invención. Tales productos pueden, por ejemplo, obtenerse mediante peptidomiméticos.

Además, la invención se refiere a un anticuerpo o un aptámero o un fago que se une específicamente al antígeno Rhesus D de tipo salvaje o a los antígenos D Rhesus aberrantes pero no al antígeno Rhesus D de la invención. El anticuerpo puede probarse y usarse en cualquier técnica serológica bien conocida en el campo, como técnicas de aglutinación en tubos, geles y técnicas de fase sólida fase, técnicas de captura o citometría de flujo con inmunofluorescencia.

En cuanto a la definición, pruebas y origen del anticuerpo o el aptámero, las mismas definiciones de antes se aplican aquí.

En cuanto al término "antígeno Rhesus D aberrante", el término comprende mutaciones sin sentido anteriores así como conversiones anteriores encontradas en genes RHD y los correspondientes antígeno s.

El término "aptámero" es bien conocido en el campo y se define, pej., en Osborne et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 1 (1997), 5-9 o en Stall y Szoka, Pharm. Res. 12 (1995), 465-483.

Además, la invención se refiere a un método para probar la presencia de una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno Rhesus D contribuyendo a, o indicando el fenotipo D débil en una muestra que comprende hibridar el oligonucleótido de la invención o un oligonucleótido que hibrida una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno Rhesus D ontribuyendo a, o indicando el fenotipo D débil, dicha molécula de ácido nucleico lleva al menos una mutación sin sentido, si se compara con el antígeno Rhesus D de tipo salvaje, dicha mutación sin sentido causa una sustitución de aminoácido en la posición 223 o 283 que es en la posición 223 preferiblemente de Phe a Val y en la posición 283 preferiblemente de Thr a Ile, dicha mutación sin sentido además ocurre preferiblemente en la posición de nucleótido 667 o 848 en donde más preferiblemente dicha mutación en la posición 667 es de T a G y en la posición 848 de C a T bajo condiciones astringentes a moléculas de ácido nucleico comprendida en la muestra de un humano y detectando dicha hibridación.

Preferiblemente, el método de la invención además comprende digerir el producto de dicha hibridación con una endonucleasa de restricción o sometiendo el producto de dicha hibridación a digestión con una endonucleasa de restricción y analizando el producto de dicha digestión.

Esta realización preferida de la invención permite mediante los medios convenientes, la diferenciación entre una hibridación efectiva y una hibridación no efectiva. Por ejemplo, si el antígeno Rhesus D de tipo salvaje comprende una endonucleasa de restricción, el producto hibridado podrá ser escindido mediante una enzima de restricción adecuada mientras que una secuencia mutada proporcionará un producto que no es de doble cadena o no comprenderá el sitio de restricción reconocible y, por lo tanto, no será cortado, Alternativamente, el oligonucleótido hibridante puede solo hibridar con la secuencia mutada, en este caso, sólo un híbrido que comprende la secuencia mutada, pero no la secuencia de tipo salvaje, será cortada por el enzima de restricción adecuado. El análisis del producto de digestión puede efectuarse mediante métodos convencionales, tales como mediante electroforesis en gel que puede combinarse opcionalmente mediante la tinción del ácido nucleico con, por ejemplo, bromuro de etidio. Las combinaciones con otras técnicas como Southern blotting también pueden concebirse.

La detección de dicha hibridación puede efectuarse, por ejemplo, mediante un anticuerpo anti-DNA de doble-cadena o empleando un oligonucleótido marcado. Convenientemente, el método de la invención se emplea junto con técnicas de blotting tales como Southern o Northern blotting y técnicas relacionadas. El marcaje puede efectuarse, por ejemplo, mediante protocolos estándar e incluye el marcaje con marcadores radioactivos, fluorescentes, fosforescentes, quimioluminiscentes, marcas enzimáticas, etc.

La invención además se refiere a un método para probar la presencia de una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno Rhesus D que contribuye a o es indicativo del fenotipo D débil en una muestra que comprende determinar la secuencia de ácido nucleico de al menos una porción de la molécula de ácido nucleico de la invención, dicha porción codifica al menos una de dichas mutaciones sin sentido o un punto de rotura de dicha conversión génica o una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno Rhesus D que contribuye a o es indicativo del fenotipo D débil, dicha molécula de ácido nucleico lleva al menos una mutación sin sentido, en comparación con el antígeno Rhesus D de tipo salvaje, dicha mutación sin sentido causa una sustitución de aminoácido en la posición 223 o 283 que es en la posición 223 preferiblemente de Phe a Val y en la posición 283 preferiblemente de Thr a Ile, dicha mutación sin sentido ocurre además preferiblemente en la posición de nucleótido 667 o 848 en donde más preferiblemente dicha mutación en la posición 667 es de T a G y en la posición 848 de C a T.

Preferiblemente, el método de la invención además comprende, antes de determinar dicha secuencia de ácido nucleico, amplificación de al menos dicha porción de dicha molécula de ácido nucleico.

Preferiblemente, la amplificación se efectúa mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Otros métodos de amplificación como la reacción en cadena de la ligasa puede también emplearse.

Además, la invención se refiere a un método para probar la presencia de una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno Rhesus D que contribuye a o es indicativo del fenotipo D débil en una muestra que comprende llevar a cabo una reacción de amplificación en donde al menos uno de los cebadores empleados en dicha reacción de amplificación es el oligonucleótido de la invención o un oligonucleótido que hibrida una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno Rhesus D que contribuye al fenotipo D débil, dicha molécula de ácido nucleico llevan al menos una mutación sin sentido, en comparación con el antígeno Rhesus D de tipo salvaje, dicha mutación sin sentido causa una sustitución de aminoácido en la posición 223 o 283 que es en la posición 223 preferiblemente de Phe a Val y en la posición 283 preferiblemente de Thr a Ile, dicha mutación sin sentido ocurre preferiblemente en la posición del nucleótido 667 o 848 en donde más preferiblemente dicha mutación en la posición 667 es de T a G y en la posición 848 de C a T y ensayando para una amplificación de producto.

El método de la invención resultará en una amplificación de sólo la secuencia diana, si dicha secuencia diana lleva al menos una mutación. Esto es debido a que el oligonucleótido no hibridará preferiblemente bajo condiciones de hibridación astringente a la secuencia de tipo salvaje (con la consecuencia que no se obtiene producto de amplificación) sino sólo a la secuencia mutada. Naturalmente, los oligonucleótidos cebadores que hibridan a uno o más de uno, tales como dos secuencias mutadas pueden emplearse en el método de la invención. La última realización será favorable en los casos donde se prueban combinaciones de mutaciones. Es importante resaltar que no todas o ninguna de dichas mutaciones son necesariamente mutaciones sin sentido. Esto, puede ser cierto para los casos en que otros tipos de mutaciones ocurren en combinación con las anteriores mutaciones sin sentido o con la conversión génica anterior.

Preferiblemente, en el método de la invención dicha amplificación o reacción de amplificación es o se efectúa mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Otros métodos de amplificación como la reacción en cadena de la ligasa puede también emplearse.

Además, la invención se refiere a un método para probar la presencia de un antígeno Rhesus D contribuyendo a o indicando el fenotipo D débil en una muestra que comprende probar una muestra de un humano para unir específicamente el anticuerpo o aptámero o fago de la invención o a un anticuerpo o aptámero o fago de un antígeno Rhesus D contribuyendo a, o indicando el fenotipo D débil, y codificando para una molécula de ácido nucleico que lleva al menos una mutación sin sentido, si se compara con el antígeno Rhesus D de tipo salvaje, dicha mutación sin sentido causa una sustitución de aminoácido en la posición 223 o 283 que en la posición 223 preferiblemente es de Phe a Val y en la posición 283 preferiblemente de Thr a Ile, dicha mutación sin sentido además ocurre preferiblemente en la posición de nucleótido 667 o 848 en donde más preferiblemente dicha mutación en la posición 667 es de T a G y en la posición 848 de C a T

Probar para la unión puede de nuevo involucrar el empleo técnicas estándar tales como ELISA; ver, por ejemplo, Harlow y Lane, "Antibodies, A Laboratori Manual" CSH Press 1988, Cold Spring Harbor.

La invención también se refiere al método de probar una muestra para la presencia de antígeno Rhesus D de tipo salvaje y la ausencia del antígeno Rhesus D de la invención que comprende probar una muestra de un humano para la unión específica del anticuerpo o aptámero o fago de la invención, dicho anticuerpo o aptámero o fago se une específicamente al antígeno Rhesus D de tipo salvaje o al antígeno D Rhesus aberrante pero no al antígeno Rhesus D de la invención.

Los resultados obtenidos de acuerdo con su método de invención puede bien emplearse en estrategias de transfusión de sangre, como se ha resaltado antes.

Preferiblemente, en el método de la invención dicha muestra es sangre, suero, plasma, tejido fetal, saliva, orina, tejido mucoso, moco, tejido vaginal, tejido fetal de la vagina, piel, pelo, folículo piloso u otro tejido humano.

Además, el método de la invención preferiblemente comprende el paso de enriquecimiento de células fetales. Este enriquecimiento puede alcanzarse usando anticuerpos apropiados, lectinas u otros reactivos que se unen específicamente a células fetales o mediante cualquier técnica intentando la separación diferencial de células maternales y fetales, como mediante gradientes de densidad. También preferiblemente, en dicho método DNA fetal o mRNA de tejido como sangre periférica, suero o plasma puede extraerse; ventajosamente de acuerdo a procedimientos convencionales.

En una realización preferida adicional del método de la invención, dicha molécula de ácido nucleico o material proteinaceo de dicha muestra se fija a un soporte sólido.

Preferiblemente, dicho soporte sólido es un chip.

Las ventajas de los chips son bien conocidas en el campo y no es necesario discutirlas aquí en detalle. Estos incluyen los de tamaño pequeño así como un acceso fácil a análisis basados en computadoras de analitos.

Además, la presente invención se refiere al uso de la molécula de ácido nucleico de la invención o de una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno Rhesus D que contribuye a o es indicativo del fenotipo D débil, dicha molécula de ácido nucleico lleva al menos una mutación sin sentido, en comparación con el antígeno Rhesus D de tipo salvaje, dicha mutación sin sentido causa una sustitución de aminoácido en la posición 223 o 283 que en la posición 223 preferiblemente es de Phe a Val y en la posición 283 preferiblemente de Thr a Ile, dicha mutación sin sentido además sucede preferiblemente en la posición de nucleótido 667 o 848 en donde más preferiblemente dicha mutación en la posición 667 es de T a G y en la posición 848 de C a T o una combinación de las mismas para el análisis de un fenotipo Rhesus D débil.

El análisis puede efectuarse, por ejemplo, en base a los métodos descritos aquí anteriormente.

La invención también se refiere al uso de la molécula de ácido nucleico de la invención, el vector de la invención o el antígeno Rhesus D de la invención para la evaluación de la afinidad, avidez y/o reactividad de anticuerpos monoclonales o policlonales anti-D, antisuero anti-D o antisuero de anti-globulina o de anti-globulina humana o de preparaciones de los mismos.

La invención también se refiere al uso de células, preferiblemente glóbulos rojos, de probandos para la evaluación de la afinidad, avidez y/o reactividad de anticuerpos monoclonales o policlonales anti-D, antisuero anti-D o antisuero de anti-globulina o de anti-globulina humana o de preparaciones de los mismos.

Dichas preparaciones pueden proporcionarse de acuerdo a técnicas bien conocidas en el campo. Dichas preparaciones pueden comprender estabilizadores tales como albúminas, además de azida sódica, iones salinos, tampones etc. La formulación de la preparación puede tener una influencia sobre las características de unión de los anticuerpos, como es bien conocido en el campo.

Por ejemplo, en un primer paso, el gen Rhesus D de un portador o donante de sangre y su status alélico es analizado y es determinado tanto si dicho gen comprende una mutación que se ha encontrado de acuerdo con la presente invención. En un segundo paso, dicha mutación se correlaciona con cierta densidad de antígeno RhD en la superficie de los glóbulos rojos. Convenientemente, dicha correlación puede establecerse por los datos proporcionados en la presente invención (como tales mutaciones per se) y técnicas que son bien conocidas en el campo (ver, pej. Jones et al. 1996, Flegel y Wagner, 1996). En un tercer paso, las características de un anticuerpo o un antisuero tales como la reactividad, sensibilidad, afinidad, avidez, y/o especificidad están determinadas con técnicas adecuadas de grupos serológicos preferiblemente usando glóbulos rojos que son molecularmente y con respeto a la densidad de superficie de antígeno RhD caracterizado como se describe en el paso 2. Estos datos pueden utilizarse, por ejemplo en controles de calidad, estandarización, etc.

La invención será más útil en la caracterización, estandarización y control de calidad de antisuero monoclonal y policlonal, preferiblemente antisuero o monoclonales anti-D. Además, por ejemplo antisuero anti-globulina y anti- globulina humana puede caracterizarse en base a los enseñamientos de la presente invención. Un anticuerpo monoclonal anti-D apropiadamente caracterizado puede utilizarse convenientemente en el diagnóstico de RhD. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-D apropiadamente caracterizado puede ser útil en la determinación de la densidad del antígeno D débil en la superficie de los glóbulos rojos. Los valores de corte para anticuerpos monoclonales útiles en el en diagnóstico puede así establecerse. Esto es importante para el control de calidad de los anticuerpos usados en el diagnóstico de RhD.

Así, la invención también se refiere a un método para la caracterización de anticuerpos monoclonales o antisuero policlonal o de una preparación de los mismos, dicho método comprende

(a) probar el ácido nucleico de una muestra de un probando para la presencia de una mutación como se ha definido de acuerdo con la invención;

(b) correlacionar, en base al estatus de la mutación y el status alélico del gen RHD, el ácido nucleico con la densidad de antígeno RhD en la superficie de los glóbulos rojos de dicho probando;

(c) reaccionar dichos anticuerpos monoclonales o antisuero policlonal o dicha preparación de los mismos con una célula portadora del antígeno RhD en su superficie;

(d) caracterizando dichos anticuerpos monoclonales o antisuero policlonal o dicha preparación de los mismos en base a los resultados obtenidos en el paso (c).

En cuanto al término "status alélico", este término describe las posibilidades que los alelos RHD en un probando están presentes en un estado homozigoto, heterozigoto o hemizigoto. También se comprende por este término la posibilidad de que dos alelos lleven dos mutaciones diferentes (incluyendo la conversión) definido aquí antes.

En una realización preferida del método de la invención, dicha caracterización comprende la determinación de reactividad, sensibilidad, avidez, afinidad, especificidad y/o otras características de anticuerpos y antisuero.

Más preferido es un método en donde dicha célula portadoradel antígeno RhD en su superficie es un glóbulo rojo.

La invención también se refiere a un método para determinar si un paciente con necesidad de una transfusión sanguínea debe ser transfundido con sangre Rh D negativa de un donante que comprende el paso de probar una muestra de dicho paciente para la presencia de uno o más antígenos Rh D de la invención, en donde una prueba positiva para al menos uno de dicho antígeno es indicativo de la necesidad de transfusión con sangre Rh negativa. La invención posee importantes implicaciones para idear una terapia transfusional en humanos. Por ejemplo, puede ahora convenientemente probarse tanto si el paciente actualmente necesita una transfusión con una sangre Rh D negativa o si tales precauciones no necesitan ser tomadas.

La transfusión de glóbulos rojos de algunos subgrupos definidos molecularmente del fenotipo D débil determinado por tales métodos pueden ser inmunogénicos, si los portadores del antígeno Rhesus D de tipo salvaje, un antígeno D aberrante u otro tipo D débil de la invención es transfusionado mediante algún subgrupo del fenotipo D débil. Tales portadores, como los donantes sanguíneos, pueden determinarse mediante métodos previamente establecidos en el campo o mediante métodos establecidos en la invención y subsecuentemente la transfusión de algunos subgrupos del fenotipo D débil pueden ser evitados.

Además, la invención se refiere a un método para determinar si la sangre de un donante puede utilizarse para transfusión aun paciente que la necesita que comprende el paso de probar una muestra de dicho donante para la presencia de uno o más antígenos Rh D de la invención, en donde una prueba positiva para al menos uno de dichos antígenos excluye la transfusión de pacientes que están tipados como portadores del antígeno Rh D o (a) tipo(s) D débil diferente del tipo(s) D débil de dichos donantes.

En base al método de la invención, es ventajoso y deseable y evitar la transfusión de un paciente con sangre tipada D débil de un donante, si el antígeno D débil en el donante y el receptor no son totalmente idénticos.

Las muestras referidas en los métodos recitados antes pueden ser muestras que son referidas a través de la especificación, como sangre, suero, etc.

Respecto a las directrices para transfundir un paciente en base a cualquiera de los métodos anteriores citados, el máximo cuidado debe tomarse si se evita la política transfusional subóptima. El factor de riesgo debe siempre considerarse por el médico al cuidado. En todos los casos, el riesgo potencial para el paciente debe minimizarse.

La presente invención es particularmente adecuada para establecer criterios que puedan guiar las estrategias de futuro en las políticas transfusionales. De acuerdo con el criterio molecular establecido por la invención, el fenotipo D débil puede agruparse. Algunos subgrupos molecularmente definidos del fenotipo D débil determinado por tales métodos pueden tender a la inmunización, si los portadores son transfundidos con el antígeno Rhesus D de tipo salvaje, un antígeno D aberrante u otro tipo D débil de la invención, y puede producir un anti-D. Tales portadores pueden determinarse mediante métodos establecidos en la invención y consecuentemente transfundidos con componentes sanguíneos Rhesus negativos, como eritrocitos, trombocitos y unidades de plasma sanguíneo. La mayoría de portadores con fenotipo D débil no se considera por la práctica actual ser proclive a inmunizarse de tal forma a las transfusiones de sangre Rhesus D positivas y puede, por lo tanto, por los métodos establecidos por la invención ser transfundido con toda salvedad con Rhesus D positivo, debido a su clasificación en un tipo distinto de D débil de acuerdo con la presente invención.

La invención también se refiere al uso de un fago, aptámero, anticuerpo monoclonal o un antisuero policlonal o una preparación de los mismos como se caracteriza en la presente invención para la determinación del antígeno RhD.

En una realización preferida de dicho uso, dicha determinación de antígeno RhD se efectúa en conexión con el tipaje de grupos sanguíneos.

Además, la invención se refiere a una preparación que comprende el anticuerpo o aptámero o fago de la invención.

Los tipos D débiles definidos mediante la invención se correlaciona con ciertos epítopos RhD y densidades de antígeno RhD, es decir, antígenos RhD por célula expresada en la superficie de glóbulos rojos (Flegel y Wagner 1996) (datos de algunos ejemplos se proporcionan en la Tabla 8) Anticuerpos y preparaciones de las mismas pueden probarse mediante cualquier técnica estándar de serología de grupos sanguíneos con uno o más tipos D débil de la invención. La reactividad, sensibilidad, avidez, afinidad, especificidad y/o otras características de los anticuerpos y antisueros conocidos en el campo pueden determinarse por su reacción con uno o más tipos D débil de la invención bajo condiciones predeterminadas en técnicas estándar de serología de grupos sanguíneos bien conocidas en el campo. La preparación puede ser un diagnóstico o una preparación farmacéutica.

La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o diluyente. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente adecuados son bien conocidos en el campo e incluye soluciones salinas de fosfato tamponadas, agua, emulsiones, tales como emulsiones aceite/agua, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles etc. Composiciones que comprenden tales vehículos pueden formularse mediante métodos convencionales bien conocidos. Estas composiciones farmacéuticas pueden administrarse al sujeto en una dosis adecuada. La administración de las composiciones adecuadas puede efectuarse mediante diferentes vías, pej., administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica, intradérmica, intranasal o intrabronquial. El régimen de dosis se determinará por el médico a cargo y por factores clínicos. Como es bien conocido en la práctica médica, las dosis para cada uno de los pacientes depende de muchos factores, incluyendo la complexión del paciente, la superficie corporal, la edad, el compuesto particular a administrar, el sexo, tiempo y ruta de administración, salud general, y otros fármacos a ser administrados concurrentemente. Una dosis típica puede estar, por ejemplo, en el rango de 0,001 a 1000 \mug; no obstante, las dosis por debajo o por encima de este rango como ejemplo están contempladas, especialmente considerando los factores anteriormente mencionados. Generalmente, el régimen de administración regular de la composición farmacéutica estará en el rango de 1 \mug a 10 mg unidades por día. Si el régimen es una infusión continua, también estará en el rango de 1 \mug a 10 mg unidades por kilogramo de peso corporal por minuto, respectivamente. El progreso puede monitorizarse mediante evaluación periódica. Las composiciones de la invención pueden administrarse localmente o sistémicamente. La administración puede generalmente ser parenteral, pej., intravenosamente: el DNA puede también administrarse directamente a la diana, pej., mediante liberación biolística a una diana interna o externa o mediante un catéter en una arteria. Preparaciones para administración parenteral incluye soluciones estériles acuosas o no acuosas, suspensiones, y emulsiones. Ejemplos de solventes no acuosos son propilen glicol, polietilen glicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo medio salino y tamponado. Vehículos parenterales incluye una solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrose y cloruro sódico, Ringer con lactato, o aceites fijados. Vehículos intravenosos incluyen reabastecedor de fluidos y de nutrientes, reabastecedor de electrolitos (tales como aquellos basados en dextrosa de Ringer), y similares. Los conservantes y otros aditivos deben también estar presentes como, por ejemplo, antimicrobianos, anti-oxidantes, agentes quelantes, y gases inertes y similares. Además, la composición farmacéutica de la invención puede comprender además agentes tales como interleucinas o interferones dependiendo del uso de la composición
farmacéutica.

Un anticuerpo y su preparación puede caracterizarse mediante su reacción o falta de reacción a las superficies con ciertas densidades de epítopos RhD. Por ejemplo, preparaciones de anticuerpos pueden caracterizarse mediante aglutinación de glóbulos rojos con 1000 antígenos RhD por célula - una densidad de antígeno RhD deliberadamente escogido para encontrar el control de calidad.

La invención también permite el tratamiento de una mujer embarazada siendo Rhesus D negativo o siendo hemizigota para una mutación definida aquí anteriormente en donde el hijo es D positivo o es portador de una mutación diferente definida aquí anteriormente en un estado hemizigoto que comprende la administración de anti-D a dicha mujer.

Las mujeres embarazadas pueden actualmente tratarse con una profilaxis anti-D, cuando una madre Rhesus negativa lleva un feto RhD positivo. La invención permite la discriminación de un requisito de profilaxis anti-D dependiendo del estado de la proteína RhD de la invención que la madre y/o el feto poseen. Una o más de las proteínas RhD de la invención puede dar lugar a la inmunización de sus portadores y, por lo tanto, será indicativo para la terapia de la madre. Similarmente, una o más proteínas RhD de la invención, cuando es llevada por el feto, puede saberse si es de baja inmunogenicidad para la madre y, por lo tanto, será indicativo para la omisión de profilaxis anti-D a diferencia de la terapia clínica actual.

La administración puede efectuarse mediante rutas estándar y dosis que pueden definirse mediante el médico al cargo: Mollison, 1993. Preferiblemente. un monoclonal anti-D o combinaciones/mezclas de monoclonal anti-Ds es/son administradas en dosis de 50 \mug a o excediendo los 500 \mug de anticuerpo/antisuero anti-D para la administración intravenosa o intramuscular (Bowman, 1998). Para el control de calidad de estos anticuerpos/antisueros anti-D, los resultados y métodos proporcionados por la presente invención pueden emplearse de forma ventajosa.

La presente invención también se refiere a un método para identificar una cadena de anticuerpo V_{H} o V_{L} o una combinación de las mismas o un aptámero que se une específicamente a un polipéptido D débil de la invención que comprende

(a) contactar el polipéptido D débil de la invención con una librería fágica que presenta cadenas de anticuerpo V_{H} o V_{L} o una combinación de las mismas en la superficie del fago o con aptámeros;

(b) identificar fagos o aptámeros que se unen a dicho polipéptido D débil; y opcionalmente

(c) repetir los pasos (a) y (b) una o más veces.

La preparación de la librería fágica y el cribado/identificación del anticuerpo deseado (cadenas) per se es bien conocido en el campo y revisado, por ejemplo, en Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12 (1994), 433-455 y las referencias citadas allí. También, los aptámeros pueden prepararse y clonarse en fagos de acuerdo con los protocolos convencionales. Mientras que las cadenas simples V_{H} o V_{L} pueden identificarse por el método de la invención al unirse al polipéptido D débil de la invención, es preferido identificar las combinaciones V_{H} -V_{L} expresadas por el fago ya que esta situación es parecida a la situación de unión del anticuerpo natural. Repitiendo los pasos (a) y (b) una o más veces, se pueden identificar las mejores especificidades de unión. Los protocolos para la optimización de propiedades de unión como las afinidades, incluyendo los pasos de elución para eliminar la unión de fagos, están bien establecidas en el campo. Por ejemplo, una vez una cadena V_{H} con una capacidad de unión conveniente ha sido encontrada, las cadenas V_{L} pueden identificarse que mejoran significativamente la capacidad de unión del anticuerpo, p.ej. reemplazando la cadena V_{L} que está asociada la cadena V_{H} en el primer paso de selección con una cadena V_{L} más adecuada.

La invención también se refiere a un método para identificar un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un polipéptido/antígeno D débil de la invención que comprende

(c) repetir los pasos (a) y (b) una o más veces.

La invención también se refiere a un método de identificación de un anticuerpo de cadena V_{H} o V_{L} o una combinación de los mismos o un aptámero que se une específicamente a un polipéptido/antígeno D débil de la invención que comprende

(a) contactar el D débil y

: (aa) un segundo o más polipéptido(s) D débil y/o

: (ab) un polipéptido Rhesus D normal

en donde el segundo o más polipéptido(s) D débil y/o el polipéptido normal Rhesus D están presentes en una masa molar que es mayor, igual o inferior a la del polipéptido D débil de (a) con una librería fágica presentando cadenas V_{H} o V_{L} o combinaciones de las mismas en la superficie del fago o con aptámeros;

(b) identificar fagos o aptámeros que se unen a dicho polipéptido D débil de (a); y opcionalmente

(c) repetir los pasos (a) y (b) una o más veces

Particularmente preferido en el paso (ab) es que la masa molar del segundo polipéptido D débil y el polipéptido normal Rhesus D es mayor que el del polipéptido D débil de (a).

En el caso que sólo una ronda de selección sea empleada en la identificación (es decir, cuando el paso (c) no se aplica), es preferido que el número de moléculas de polipéptido D débil de (a) está en exceso molar sobre el número de partículas fágicas. Las realizaciones preferidas del método de identificar una cadena de anticuerpo V_{H} o V_{L} o de una combinación de las mismas o de un aptámero descrito aquí igualmente se solicita en esta realización de la invención.

La invención también se refiere a un método de identificar un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un polipéptido/antígeno D débil de la invención que comprende

(a) contactar el polipéptido D débil y

: (aa) un segundo o más polipéptido(s) D débil y/o

: (ab) un polipéptido normal D

en donde el segundo o más polipéptido(s) D débil y/o el polipéptido D normal están presentes en una masa molar que es mayor, igual o inferior que la del polipéptido D débil de (a) con uno o más anticuerpos monoclonales,

(b) identificar anticuerpos monoclonales que se unen a dicho polipéptido D débil de (a); y opcionalmente

(c) repetir los pasos (a) y (b) una o más veces.

Preferiblemente, el polipéptido D débil está expuesto en la superficie de una célula. Una superficie apropiada es la superficie de un eritrocito. No obstante, otras células huésped pueden transfectarse con un vector adecuado para la expresión del polipéptido D débil y expresar lo mismo en su superficie. Los anticuerpos pueden también unir las proteínas recombinantes de o partes de proteínas D débil y proteínas purificadas.

Es más preferido que el polipéptido o célula huésped esté fijada a un soporte sólido. Ejemplos adecuados para soportes sólidos son placas microtituladas o cuentas.

En un anticuerpo adicionalmente preferido, tras el paso (b) o (c), el siguiente paso se lleva a cabo:

(d) identificando la secuencia de aminoácido de las cadenas V_{H} o V_{L} y/o identificar las secuencias de ácido nucleico que codifica dicha secuencia de aminoácido.

La identificación de las secuencias de aminoácido/ácido nucleico pueden efectuarse de acuerdo con los protocolos convencionales: ver, p ej., Sambrook et al., loc. cit.

Finalmente, la invención se refiere a un kit que comprende

(a) el oligonucleótido de la invención; y/o

(b) el anticuerpo de la invención:

(c) el aptámero de la invención: y/o

(d) el fago de la invención.

El kit de la invención que puede comprender varios tipos de anticuerpos descritos aquí, es particularmente adecuado para el análisis de D débiles en muestras obtenidas de humanos. Los componentes del kit puede empaquetarse como apropiado. Preferiblemente, diferentes componentes son empaquetados en diferentes viales.

Las figuras muestran

Figura 1. Representación esquemática de las variaciones de aminoácido observadas en tipos D débil con mutaciones sin sentido simples. Los aminoácidos afectados de la proteína prevalente normal RhD y sus posiciones se muestran encima. Las sustituciones de los tipos D débil se muestran debajo de la barra.

Figura 2. El nucleótido de cDNA y las secuencias de aminoácidos predichas del alelo prevalente del gen RHD. Las secuencias consenso se muestran como están depositadas en la base de datos de nucleótidos EMBL bajo el número de acceso X54534 por Avent et al. y modificado tal como se notifica en la descripción (C a 1,036). Las posiciones de los nucleótidos y aminoácidos están indicadas por los números por encima y bajo las secuencias, respectivamente.

Figura 3. Parte del intrón 5 de los genes RHCE y RHD. Las secuencias de nucleótidos del gen RHCE es mostrado. Los números indican la posición relativa a la primera base del exón 5 en el gen RHCE. Las rayas denotan nucleótidos en el gen RHD que son idénticos al gen RHCE. El punto de rotura de la región 5' (178 bp) de la conversión génica característica para la categoría IVD tipo III es indicado por asteriscos. Las secuencias de nucleótidos del intrón completo 5 está depositado en EMBL/Genbank bajo los números de acceso Z97333 (RHCE) y Z97334 (RHD).

Figura 4. La detección de los tipos D débil mediante PCR-RFLP. Cuatro tipos D débil que llevan mutaciones puntuales que hacen desaparecer los sitios de restricción: D débil tipo 1 carece del Alw44 (Panel A), D débil tipo 3 un sitio SacI (Panel C), D débil tipo 4 un sitio AluI (Panel D) y D débil tipo 6 un sitio MspI (Panel E). En un quinto tipo débil D, una mutación puntual introdujo un sitio de restricción: D débil tipo 2 ganó un sitio AluI (Panel B). En el lado izquierdo de los geles, se muestran 100 pb de los laterales "ladders": la posición de los fragmentos de 500 pb y 100 pb están indicados en el lado derecho de los paneles. Para la reacción de PCR del panel A, la mayor aproximación de fragmento de restricción de 3000 pb no se muestra.

El ejemplo ilustra la invención.

Ejemplo Análisis Molecular de Muestras del Fenotipo D débil

Se desarrolló un método para la secuenciación especifica de RHD de los diez exones RHD y sus sitios de corte y empalme (Tabla 1 y 2). En una estrategia de análisis secuencial, las muestras de sangre con expresión débil de antígeno D se chequearon por este método, PCR-RFLP (Tabla 3) y RHD PCR-SSP (Gassner et al. 1997). Para este propósito, se recogieron muestras de sangre anticoaguladas con EDTA o citrato de donantes de sangre blancos y caracterizados como D débil durante el tipado del donante de acuerdo con los estándares publicados ("Dº-test") (Wissenschaftlicher Beirat der Bundesärztekammer and Bundesgesundheitsamt, 1992) como se describe en (Wagner et al, 1995). Muestras de categoría D VI se excluyeron de este estudio.

Secuencia codificante de RHD en Fenotipos D débil. Secuenciación de los diez exones RHD a partir de DNA genómico

El DNA se preparó tal como se ha descrito antes (Gassner et al, 1997). La secuenciación de nucleótidos se realizó con un secuenciador de DNA (tinte Prism del kit terminador de la secuenciación por ciclos con AmpliTaq FS DNA polimerasa; ABI 373A, Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemania). La secuenciación de nucleótidos de los tramos de DNA genómico representativos de los diez exones RHD y partes del promotor (ver a continuación) se cumplió usando cebadores (Tabla 1) y procedimientos de amplificación (Tabla 2) que obviaron la necesidad de los pasos de subclonaje.

Control de la especificidad de RHD

Los exones 3 a 7 y 9 de RHD llevan al menos un nucleótido RHD específico, que se utilizó para verificar el origen RHD de las secuencias. Para el exón 1, se utilizaron los nucleótidos característicos en las partes adyacentes del intrón 1 (números de acceso Z97362 y Z97363 de la base de datos de secuencias de nucleótidos EMBL). Para el exón 8, la especificidad de la amplificación por PCR se chequeó mediante secuenciación no específica de RHD del exón informativo 9, ya que los exones 8 y 9 se amplificaron como un amplicón de PCR sencillo (Tabla 2). El exón 2 y el 10 se amplificaron en una forma específica RHD (Tabla 2) basados en las secuencias de nucleótidos especificas de RHD usadas publicadas (números de acceso U66340 y U66341 de la base de datos de secuencias de nucleótidos EMBL; Kemp et al. 1996; Le Van Kim et al, 1992): no se obtuvieron amplicones de PCR en los controles negativos de RhD. Todas las muestras normales D y débil D mostraron una G en la posición 654 (Arce. et al. 1993) y una C en la posición 1036 (Le Van Kim et al. 1992), apoyando la noción (Cartron, 1996) que los alternativamente descritos C (Le. Van Kim et al. 1992) y T (Arce et al, 1993), respectivamente, son errores de secuencia-
ción.

Detección de mutaciones especificas D débil mediante PCR-RFLP y PCR-RFLP

PCR-RFLP así como RH PCR-SSP (Gassner et al. 1997) se desarrollaron o aplicaron para caracterizar distintas sustituciones de nucleótidos detectados en cinco alelos RHD (ver también Tablas 3 y 4): La sustitución C a G en la posición 8 llevaron a perder el sitio de restricción SacI en los amplicones obtenidos con re01 y re11d (G a A en 29, pérdida del sitio MspI, re01/re11d; C a A en 446, pérdida del sitio AluI, rb20d/rb21d, T a G en 809, pérdida del sitio Alw44I, rf51/re71; G a C en 1154, introducción del sitio AluI, re82/re93). Las condiciones para que la reacción de PCR rf51/re71 son como las que se muestran en la Tabla 2. La reacción rb20d/rb21d se realizó con Taq-polimerasa no correctora (Boehringer Mannhaim o Qiagen) con 20 s de desnaturalización a 94ºC, 30 s de hibridación a 60ºC y 30 s de extensión a 72ºC. Las otras reacciones de PCR se realizaron con Taq-polimerasa sin capacidad de corrección con 20 s de desnaturalización a 94ºC, 30 s de hibridación a 55ºC y 1 min de extensión a 72ºC.

Otros cuatro alelos RHD se detectaron mediante un estándar RH PCR-SSP^{15}: Los alelos RHD(T201 R, F223V) y RHD(S182T, K198N, T201R) carecen de amplicones específicos para el exón 4 RHD, los alelos RHD(G307R) y RHD(A276P) aquellos para el exón 6 RHD. Para todos los otros tipos D débil, la autenticidad de las mutaciones puntuales se chequeó mediante secuenciación de nucleótidos de amplicones de PCR independientes.

La secuenciación de los exones 6 a 9 en D^{IV} tipo III

En los exones 6 a 9 D^{IV} tipo III se amplificaron y secuenciaron usando cebadores que son específicos para RHCE y RHD. Por lo tanto, el cebador re71 (Tabla 2) se sustituyó por el cebador rb7: el cebador re621 por rb26; y el cebador re52 por re74.

Fueron identificados dieciséis alelos RHD con distintos cambios de nucleótidos que codifican para sustituciones de aminoácidos. (Tabla 4). Un alelo representa un típico, aún sin publicar, alelo RHD-CE-D híbrido llamado aquí D^{IV} tipo III. Otro alelo fue DHMi (Liu et al. 1996). De los 14 alelos restantes, 12 mostraron mutaciones sin sentido simples, pero diferentes a las mutaciones sin sentido previamente desconocidas. Ninguna de las variantes de aminoácidos codificadas aparece en las posiciones correspondientes en las proteínas RhCE. Dos alelos presentaron múltiples cambios de nucleótidos típicos para el gen RHCE, que fue, intercalada mediante secuencias RHD específicas.

Distribución de alelos D débil en blancos

Un grupo de 161 muestras con expresión débil del antígeno D se escogieron de donantes de sangre aleatorios en el suroeste de Alemania. Las muestras de categoría VI D pero no otras D parciales fueron excluidas mediante métodos serológicos. Así, tres muestras representaron D parcial conocido (DHMi (Liu et al. 1996) y categoría IV D (Lomas et al. 1989)). Sin ninguna excepción, todas las muestras se pudieron asignar a distintos alelos RHD con secuencias aberrantes codificantes (Tabla 5). Para el propósito de la presente invención, se propone que los nuevos tipos moleculares D débil se referirán mediante nombres triviales, pej. D débil tipo 1, o por sus estructuras moleculares, pej. RHD (V270G). El tipo 1 D débil fue el alelo RHD conocido más frecuente (f=1:277) con secuencia aberrante codificante, excediendo incluso la frecuencia alélica de D^{VII} (Wagner et al. 1997).

Sustituciones de aminoácidos en alelos D débiles están agrupadas

Las sustituciones de aminoácidos observadas en los tipos D débil con mutaciones simples sin sentido no se distribuyeron uniformemente en la proteína RhD (Fig. 1). La mayoría de las sustituciones sucedieron en la región de las posiciones de aminoácido 267 a 397. También se encontraron en los alelos D débil sustituciones de aminoácidos sencillas y múltiples en pequeñas porciones de la proteína RhD alrededor de las posiciones 2 a 13, 149, y 179 a 225 (D débil tipo 4 y 14). De acuerdo con el modelo actual de lazo RhD, los aminoácidos involucrados se situaron en la transmembrana y los segmentos intracelulares de la proteína.

Controles del fenotipo RhD normal y promotor RHD

Seis muestras control con fenotipo RhD normal mostró una secuencia de proteína RhD normal mediante secuenciación especifica de RHD de los diez exones RHD. Para buscar mutaciones en el promotor RHD, fue amplificada una región de 675 pb usando la pareja de cebadores rbl3 y rb11d (Tabla 2). La región promotora se secuenció usando los cebadores re02 y re01 empezando en la posición de nucleótidos 545 relativa al primer nucleótido del codón de inicio. Se empleó una muestra de cada tipo D débil, DHMi, y D^{IV} tipo III. No se encontró desviación respecto a la secuencia publicada del promotor RHD (Huang. 1996).

Evidencias estadísticas indican que las mutaciones sin sentido pueden causar Fenotipos D débil

La frecuencia de proteínas RhD alteradas en D débil (158 de 158) y muestras D normales (0 de 6) fue estadísticamente significativamente diferente (p<0, 0001, 2x2 tabla de contingencia, test exacto de Fisher). Se esperó que apareciera una secuencia codificante normal RhD en el fenotipo D débil en menos del 1, 9% (límite superior de 95% de intervalo de confianza, distribución Poisson). Fue excluido además que estas sustituciones de aminoácidos solamente reflejen cambios de nucleótidos aleatorios, debido a dos observaciones: (i) en los codones 417 del gen RHD, pueden ocurrir 2, 766 mutaciones sin sentido y 919 silentes. Si los cambios de nucleótido en los alelos D débil fueran aleatorios, las mutaciones silentes se esperarían con una frecuencia de 0, 249. Una mutación silente se observó entre un total de 18 mutaciones en alelos D débil (p=0, 039, distribución binomial). Las mutaciones sin sentido se asumieron para prevenir la expresión de RhD (Avent et al. 1997b) y así excluidos del cálculo. (ii) 1, 796 pb del gen RHD fueron secuenciadas representando una secuencia codificante de 1, 251 pb y una secuencia no codificante de 545 pb. Si los cambios de nucleótido fueran aleatorios, su incidencia en la secuencia no codificante de los alelos D débil se esperaría que fuese con una frecuencia de 0, 303. Las 18 mutaciones fueron, no obstante, localizadas en la secuencia codificante (p=0, 005, distribución binomial).

Polimorfismos de RHD específicos de Haplotipo

Se analizaron los intrones 3 y 6. Para comprobar el intrón 3 de RHD por RFLP, la parte 3' del intrón 3 fue amplificada usando la pareja de cebadores específica de RHD rb46 y rb12 y los productos de PCR fueron digeridos con HaeIII. Para examinar las repeticiones TATT en tándem en el intrón 6 de RHD, fue amplificado para secuenciación el intrón 6 de longitud completa usando la pareja de cebadores específica de RHD rf51 y re7l y el cebador rg62.

Las secuencias polimórficas de RHD que difieren entre los alelos RHD prevalentes de los haplotipos CDe y cDE fueron detectados (Tabla 6). En el intrón 3 de RHD, había un polimorfismo G/C que determinó una HaeIII-RFLP en la posición -371 relativa a la unión intrón 3/exón 4. En el intrón 6 de RHD, había una repetición en tándem TATT de longitud variable que comienza 1, 915 pb 3' del exón 6. En el alelo prevalente RHD del haplotipo CDe. El sitio de restricción HaeIII estaba presente y la región TATT repetida comprendía 9 repeticiones. En el alelo RHD prevalente del haplotipo cDE, el sitio de restricción HaeIII estaba ausente y la región TATT repetida comprendía 8 repeticiones. Los alelos D débil eran idénticos a los alelos prevalentes del mismo haplotipo RH respecto a aquellos polimorfismos en el intrón 3 y 6, con la única excepción del D débil tipo 4 que mostró 13 repeticiones TATT. Se concluyó que los alelos D débil evolucionaron independientemente en los diferentes haplotipos RH.

TABLA 1 Cebadores usados

1

2

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ^{1}   \begin{minipage}[t]{155mm} Las posiciones de los
oligonucleótidos  sintéticos están indicados según sus distancias
desde la primera posición del nucleótido del codón de inicio ATG
para todos los cebadores en el promotor y en los exones incluyendo
la parte 3' intraducible del exón 10, o según sus límites adyacentes
exón/intrón para todos los otros cebadores. Cebador ra21 se comunicó
previamente. (Poulter  \mathit{et \ al} . 1995).
\end{minipage} \cr   ^{2}  UTR: región 5' intraducible del 
exón 1. UTR: región 3' intraducible del exón
10.\cr}

TABLA 2 Método de secuenciación para los 10 exones RDH de DNA genómico

3

^{1} \begin{minipage}[t]{155mm} Los cebadores se usaron a concentraciones de 1nM en el Expand High Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim, Mannheim. Alemania). En el exón 10 de \mathit{PCR}, la concentración de MgCl_{2} fue de 20 nM. La desnaturalización fue durante 20 s a 92^{o}C, calentando 30s, temperatura de elongación 68^{o}C. El tiempo de elongación se incrementó 20 s por cada ciclo después del décimo ciclo, excepto para el par de cebadores re12d/re23. \end{minipage}

Para conseguir especificidad RHD para secuencias genómicas de nucleótidos, los pares de cebadores de la PCR o el cebador de la secuencia o ambos no se pueden detectar al mismo tiempo secuencias de nucleótidos derivadas de RHCE. Las secuencias del cebador se dan en la Tabla 1.

TABLA 3 Análisis de PCR-RFLP de cinco alelos de RHD

4

^{1} \begin{minipage}[t]{155mm} Condiciones para la reacción PCR de \mathit{rf51/re71} como se muestra en la Tabla 2. Todas las otras reacciones \mathit{PCR} se dieron sin Taq-polimerasa de corrección de pruebas (Boehringer Mannheim) con 20 s de desnaturalización a 94^{o}C. 30 s calentando a 55^{o}C y 1 min de extensión a 72^{o}C. Ejemplos para estos PCR-RFLPs de débiles D de tipos 1, 2, 3, 5, 6, se muestran en la Fig. 4. \end{minipage}

TABLA 4 Bases moleculares de fenotipos débiles RhD

5

TABLA 5 Nomenclatura propuesta para los alelos RHD codificados por fenotipos D débiles y sus frecuencias mínimas de población

6

\bullet D débil tipo 4 puede ser subdividida en dos formas

\bullet D débil tipo 4a; ver D débil tipo 4, en la tabla

\bullet D débil tipo 4b RIID(W16C, T20IR, F223V)

^{1} \begin{minipage}[t]{155mm} Número de muestras observadas entre las 161 muestras de sangre con expresión del antígeno D débil. Tipos 12 a 17 no fueron detectados entre estas muestras de sangre, pero fueron encontrados independientemente. \end{minipage}

^{2} \begin{minipage}[t]{155mm} Las frecuencias de fenotipo entre las muestras de D débil se calcularon ajustando las frecuencias de los fenotipos serológicos de D débil (Wagner \mathit{et \ al} 1995) muestras de ccDEE D débil se asumieron como cDE/cdE. \end{minipage}

^{3} \begin{minipage}[t]{155mm} Las frecuencias de fenotipo en la población se calcularon a partir de la frecuencia de población del fenotipo D débil en el sur-oeste de Alemania (Wagner \mathit{et \ al} 1995). Esto son estimaciones mínimas, porque algunas muestras con expresión moderadamente débil de D pueden haber sido agrupadas según la fuerza normal de D. Las frecuencias de halotipo se calcularon usando una frecuencia de halotipo de 0,411 para haplotipos RhD negativos (Wagner \mathit{et \ al} 1995) asumiendo que todas las muestras débiles D eran heterozigotas. \end{minipage}

TABLA 6 Polimorfismos RHD en genes RHD de varios haplotipos

7

^{1} \begin{minipage}[t]{155mm} La asociación haplotipo del sitio HaeIII se probó en 10 CCDee, 8 CCDee, 8 ccDEE, 10cc(W16C)De y 10 muestras de ccDee. La asociación haplotipo de la repetición TATT se probó en 3 muestras de CCDee, 3 ccDEE, 1ccDEe, 1ccDEe, 2cc(W16C)De y 2 ccDee. \end{minipage}

^{2} Intrón 6 derivado de RHCE debido a la conversión del gen.

^{3} Seis de siete alelos investigados mostraron 8 repeticiones, uno 9 repeticiones.

^{4} \begin{minipage}[t]{155mm} El sitio HaeIII fue presente en 8 de 10 muestras probadas. Muestras con el sitio HaeIII mostraron 9 repeticiones TATT, muestras sin el sitio HaeIII 8 repeticiones. \end{minipage}

N. D. = No determinado

TABLA 7 Localización prevista de segmentos de la proteína RhD relativos a la membrana de las células rojas de la sangre

8

^{1} \begin{minipage}[t]{145mm} Localización del final proteico amino- y carboxiterminal de acuerdo con Avent \mathit{et \ al}. \{J Biol. Chem. 1992\} y Hermand \mathit{et \ al}. \{Blood 1993\}. Las hélices transmembranosas fueron previstas por PHDhtm \{www. embl-heidelberg. de/predictprotein/predictprotein. html\}, la hélice a las posiciones 371 a 388 por TMPRED \{il. ch/software/TMPRED\_form. html\}. \end{minipage}

^{2} \begin{minipage}[t]{145mm} El aminoácido (metionina) de la posición 1 no se expresa en la proteína RhD madura como se muestra secuenciando los aminoácidos \{Avent \mathit{et \ al}. Biochem J. 1998\}. \end{minipage}

TABLA 8 Densidades del epítope de la muestra de RhD para tipos débiles D

Débil D	Densidad del epítope de RhD
	(AntígenosRhD/células rojas)
Tipo 3	1500
Tipo 1	900
Tipo 2	500
Tipo 12	<100

Una muestra de cada tipo D débil se probó con un anti-D policlonal (Lorne Laboratories Ltd., Redding, Berkshire, England) como se ha descrito previamente (Flegel y Wagner 1996). Se obtuvieron resultados similares por anti-D monoclonal (BS228, Biotest AG, Dreieich, Germany; y P3x290, Diagast, Lille, France).

Referencias

Agre. P. C. Davies, D. M., Issitt. P. D., Lamy, B. M., Schmidt, P. J., Treacy, M., and Vengelen-Tyler, V. 1992. A proposal to standardize terminology for weak D antigen [Letter]. Transfusion 32:86-87.

Arce. M. A., Thompson, E. S., Wagner, S., Coyne, K. E., Ferdman, B. A., and Lublin, D. M. 1993. Molecular cloning of RhD cDNA derived from a gene present in RhDpositive, but not RhD-negative individuals. Blood 82:651-655.

Aubin, J. T., Le Van Kim, C., Mouro, I., Colin, Y., Bignozzi, C., Brossard, Y., and Cartron, J. P. 1997. Specificity and sensitivity of RHD genotyping methods by PCR-based DNA amplification. British Journal of Haematology 98:356-364.

Avent, N. D., Butcher, S. K., Liu, W., Mawby, W. J., Mallinson, G., Parsons, S. F., Anstee, D. J., Tanner, M. J. 1992. Localization of the C termini of the Rh(rhesus) polypeptides to the cytoplasmic face of the human erythrocyte membrane. J. Biol. Chem. 267:15134-15139.

Avent, N. D., Jones, J. W., Liu, W., Scott, M. L., Voak, D., Flegel, W. A., Wagner, F. F., and Green, C. 1997a. Molecular basis of the D variant phenotypes DNU and DII allows localization of critical amino acids required for expression of Rh D epitopes epD3, 4 and 9 to the sixth external domain of the Rh D protein. British Journal of Haematology 97:366-371.

Avent, N. D., Martin, P'. G. Armstrong-Fisher, S. S. Liu, W., Finning, K:M., Maddocks, D. and Urbaniak, S. J. 1997b. Evidence of genetic diversity underlying Rh D negative, weak D (D'') and partial D phenotypes as determined by multiplex PCR analysis of the RHD gene. Blood 89:2568-2577.

Avent, N. D., Rigwell, K., Mawby, W. J., Tanner, M. J., Anstee,. D. J., Kumpel, B. 1988. Protein-sequence studies on Rh-related polypeptides suggest the presence of at least two groups of proteins which associate in the human red-cell membrane. Biochem. 1256:1043-1046.

Beckers, E. A., Faas, B. H., Ligthart, P., Overbeeke, M. A., von dem Borne, A. E., van der Schoot, C. E., and van Rhenen, D. J. 1997. Lower antigen site density and weak D immunogenicity cannot be explained by structural genomic abnormalities or regulatory defects of the RHD gene. Transfusion 37:616-623.

Beckers, E. A. M., Faas, B. H. W., Overbeeke. M. A. M., von dem Borne, A. E. G. K., van Rhenen, D. J., and van der Schoot, C. E. 1995. Molecular aspects of the weak-D phenotype. Transfusion 35.50S

Bowman. J. M. 1998. RhD hemolytic disease of the newborn. N. Engl. J. Med. 339. 1775-1777

Cartron, J.-P. 1996. Rh DNA - coordinator's report. Transfusion Clinique et Biologique 3:491-495.

Ceppellini, R., Dunn. L. C. and Turry, M. 1955. An interaction between alleles at the Rh locus in man which weakens the reactivity of the, Rho factor (D''). Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 41:283-288.

Cherif-Zahar, B., Raynal, V., Gane, P., Mattel, M. G,. Bailly, P., Gibbs, B., Colin, Y., and Cartron, J.-P. 1996. Candidate gene acting as a suppressor of the RH locus in most cases of Rh-deficiency. Nature Genetics 12.
168-173.

\newpage

Flegel, W. A., Müller, T. H., Schunter, F., Gassner, C., Schonitzer, D., and Wagner, F. F. 1997. D category VI type 111: A D-Ce(3-6)-D hybrid protein with normal RhD antigen density on red cells (Abstract). Transfusion 37S: 101 S.

Flegel, W. A. and Wagner, F. F. 1996. RHD epitope density profiles of RHD variant red cells analyzed by flow cytometry. Transfusion Clinique et Biologique 3:429-431.

Fukumori, Y., Hori, Y., Ohnoki, S., Nagao, N., Shibata, H., Okubo, Y., and Yamaguchi, H. 1997. Further analysis of Del (D-elute) using polymerase chain reaction (PCR) with RHD gene-specific primers. Transfusion Medicine 7. 227-231.

Gassner, C., Schmarda, A., Kilga-Nogler, S., Jenny-Feldkircher, B., Rainer, E., Müller, T. H., Wagner, F. F., Flegel, W. A., and Schönitzer, D. 1997. RhesusD/CE typing by polymerase chain reaction using sequence-specific primers. Transfusion 37:1020-1026.

Hasekura, H., Ota, M., Ito.* S., Hasegawa, Y., Ichinose, A., Fukushima, H., and Ogata, H. 1990. Flow cytometric studies of the D antigen of various Rh phenotypes with particular reference to DU and Dº'. Transfusion 30:236-238.

Herrnand, P., Mouro, I., Huet, M., Bloy, C., Suyama, K., Goldstein, J., Cartron, J. P., Bailly, P. 1993. Immunochemical characterization of rhesus proteins with antibodies raised against synthetic peptides. Blood 82:669-676.

Huang, C. H. 1996. Alteration of RH gene structure and expression in human dCCee and DCW- red blood cells: phenotypic homozygosity versus genotypic heterozygosity. Blood 88:2326-2333.

Huang, C. H. 1997. Molecular insights into the Rh protein family and associated antigens. Current Opinion in Hematology 4:94-103.

Huang, C. H., Chen, Y., and Reid, M. 1997. Human D(Illa) erythrocytes: RhD protein is associated with multiple dispersed amino acid variations. Am. J Hematol. 55:139-145.

Issitt. P. D. and Telen, M. J. 1996. D. weak D (D''), and partial D: the molecular story unfolds. Transfusion 36:97-100.

Jones, J. W., Finning, K. M., Mattock, R., Voak, D., Scott, M. L., and Avent, N. D. 1997. The serological profile and molecular basis of a new partial D phenotype, DHR. Vox Sanguinis 73:252-256.

Jones, J. W. Lloyd-Evans, P., and Kumpel, B. M. 1996. Cuantitation of Rh D antigen sites on weak D and D variant red cells by flow cytometry. Vox Sanguinis 71:176-183.

Kajii, E., Umenishi, F., Omi, T., and Ikemoto, S. 1995. Intricate combinatorial patterns of exon splicing generate multiple Rh- related isoforms in human erythroid cells. Human Genetics 95:657-665.

Kemp, T. J., Poulter, M., and Carritt, B. 1996. A recombination hot spot in the Rh. genes revealed by analysis of unrelated donors with the rare D- - phenotype. American Journal of Human Genetics 59:1066-1073.

Le Van Kim, C., Mouro, I., Cherif-Zahar, B., Raynal, V., Cherrier, C., Cartron, J. P., and Colin, Y. 1992. Molecular cloning and primary structure of the human blood group RhD polypeptide. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 89:10925-10929.

Leader, K. A., Kumpel, B. M., Poole G. D., Kirkwood, J. T., Merry A. H. and Bradley, B. A. 1990. Human monoclonal anti-D with reactivity against category DVI cells used in blood grouping and determination of the incidence of the category DVI phenotype in the DU population. Vox Sang 58:(2):106-11

Legler, T. J., Blaschke, V., Bustami, N., Malekan, M., Schwartz, D. W. M., Mayr, W. R., Panzer, S., and Köhler, M. 1997. RHD genotyping on exons 2, 5, 7, intron 4 and the 3' non-coding. region in DWeak D''DFR and D- - individuals. Transfusion 37:100S

Liu,. W., Jones, J. W., Scott, M. L., Voak, D., and Avent, N. D. 1996. Molecular analysis of two D-variants, D'' and D"^{M}" [Abstract]. Transfusion Medicine 6(suppl 2):21

Lomas, C., Grassmann, W., Ford, D., Watt, J., Gooch, A., Jones, J., Beolet, M., Stern, D., Wallace, M., and Tippett, P. 1994. FPTT is a low-incidence Rh antigen associated with a "new" partial Rh D phenotype, DFR. Transfusion 34:612-616.

Lomas, C., McColl, K., and Tippett, P. 1993. Further complexities of the Rh antigen D disclosed by testing category D'' cells with monoclonal anti-D. Transfusion Medicine 3:67-69.

Lomas, C. Tippett, P., Thompson, K. M., Melamed, M. D., and Hughes-Jones, N. C. 1989. Demonstration of seven epitopes on the Rh antigen D using human monoclonal anti-D antibodies and red cells from D categories. Vox Sanguinis 57:261-264. Mollison, P. L., Engeifriet, C. P., and Contreras, M. 1993. Blood transfusion in clinical medicine. 9th ed. London: Blackwell Scientific Publications.

Moore, B. P. L. 1984. Does knowledge of Dº status serve a useful purpose? Vox Sanguinis 46S1:95-97.

Mourant, A. E., Kopec, A. C., and Domaniewska-Sobczak, K. 1976. The distribution of the human blood groups and other polymorphisms. 2nd ed. London: Oxford University Press.

Nelson, M., Barrow, L. A., Popp, H., and Gibson, J. 1995. Some observations on D antigen expression of D-positive and "weak D-positive" red cells as assessed by flow cytometry. Vox Sanguinis 69:152-154.

Nicholson, G., Lawrence, A., Ala, F. A., and Bird, G. W. G. 1991. Semi-quantitative assay of D antigen site density by flow cytometric analysis. Transfusion. Medicine 1:87-90.

Poulter, M., Kemp, T. J., and Carritt, B. 1996. DNA-based Rhesus typing: simultaneous determination of RHC and RHD status using the polymerase chain reaction. Vox Sanguinis 7:164-168.

Roubinet, F., Apoil, P. A., and Blancher, A. 1996. Frequency of partial D phenotypes in the south western region of France. Transfusion Clinique et Biologique 3:247-255.

Rouillac, C., Gane, P., Cartron, J. -P., Le Pennec, P. Y., and Colin, Y. 1996. Molecular basis of the altered antigenic expression of RhD in weak D (D'') and RhC/e in R'' phenotypes. Blood 87:4853-4861.

Rouillac, C., Le Van Kim, C., Beolet, M., Cartron, J. P., and Colin, Y. 1995. Leu11OPro substitution in the RhD polypeptide is responsible for the D^{V}'' category blood group phenotype. American Journal of Hematology 49:87-88.

Salmon, C., Cartron, J.-P., and Rouger, P. 1984. The human blood groups. New York: Masson.

Scott. M. 1996. Rh serology - coordinator's report. Transfusion Clinique et Biologique 3:333-337.

Siegel, D. L. Silberstein, L. E. 1994. Expression and characterization of recombinant anti-Rh(D) antibodies on filamentous phage: a model system for isolating human red blood cell antibodies by repertoire cloning. Blood Apr. 15:83(8):2334-44

Stratton. F. 1946. A new Rh allelomorph. Nature 158:25

Tazzari, P. L., Bontadini, A. Betletti, D., Malferrari, F. and Conte, R. 1994. Flow cytometry: a tool in immunohematology for D+'' (Dº) antigen evaluation? Vox Sanguinis 67:382-386.

Tippett. P. and Sanger. R. 1962. Observations on subdivisions of Rh antigen D. Vox Sanguinis 7:9-13.

Tippett, P. and Sanger, R. 1977. Further observations on subdivisions of the Rh antigen D. Das Arztliche Laboratorium 23:476-480.

Wagner, F. F. 1994. Influence of Rh phenotype on the antigen density of C, c, and D: flow cytometric study using a frozen standard red cell. Transfusion 34:671-676.

Wagner, F. F., Hillesheim, B., and Flegel, W. A. 1997. D-Kategorie VII beruht einheitlich auf der Aminosburesubstitution Leu(110)Pro. Beitr5ge zur Infusionstherapie and Transfusionsmedizin 34:220-223.

Wagner, F. F., Kasulke, D., Kerowgan, M., and Flegel, W. A. 1995. Frequencies of the blood groups ABO, Rhesus, D category VI, Kell, and of clinically relevant highfrequency antigens in South-Western Germany. Infusionstherapie and Transfusionsmedizin 22:285-290.

Wissenschaftlicher Beirat der Bundesarztekammer and Bundesgesundheitsamt. 1992. Richtlinien zur Blutgruppenbesfimmung and Bluttransfusion. K6ln: Deutscher Arzte-Verlag.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: DRK Blutspendedienst Baden-Wuerttemberg gGmbH

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: Helmholzstrasse 10

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Ulm

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: ninguno

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: Alemania

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 89081

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Moléculas nuevas de ácido nucleico correlacionadas con el fenotipo D débil de Rhesus.

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 43

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FORMA DE LEER DEL ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO MEDIO: disquete flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: compatible con PC IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1,0, Versión #1, 30

\vskip0.800000\baselineskip

(EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGCCACTTG ACTTGGGACT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico.

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

ATCTCTCCAA GCAGACCCAG CAAGC.

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SEC NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TACCTTTGAA TTAAGCACTT CACAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCTGAACCT GCTCTGTGAA GTGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGAGCCAA ACCCACATCT CCTT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTATTGGCTA CTTGGTGCC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCTGGCTCT CCCTCTCT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGTCCCTCC TCCAGCAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCAGGTCCC TCCTCCCAGC AC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGATTTT TTCAGCCAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGACCTTTGG AGCAGGAGTG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(D): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(E): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc =. "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCAGGGAGG ATGTTACAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGGGTGGGT AGGGAATATG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTTGAAATA GAAGGGAAAT GGGAGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGCAAGAAC CTGGACCTTG ACTTT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCAGGTTGTT AAGCATTGCT GTACC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATAGAGAGGC CAGCACAA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: .

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAACTATG AGGAGTCAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAAGATGGG GGAATCTTTT TCCT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTAGCCGGG CACGGTGGCA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico .

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTCTAATTT CATACCACCC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAGGATGCA GGAGGAATGT AGGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGATGACCAT CCTCAGGT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC. NO: 24. :

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTCAGCTCA CTGCAACCTC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(E): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(F): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(G): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(H): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATCCCCCTT TGGTGGCC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCCAGCAAG CTGAAGTTGT AGCC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTTTTTGTC CCTGATGACC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TATCCATGAG GTGCTGGGAA C

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(D): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(E): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGTAGGGG CTGGACAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAAATCCTG TGCTCCAAAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGATTAAAA ATCCTGTGCT CCA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA;

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAAGAGATCA AGCCAAAATC AGT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACCCGCATG TCAGACTATT TGGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAAAAACCCA TTCTTCCCG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTATTCCAG GCAGAAGGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCACAGAGAC GGACACAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGTACAAAT GCAGGCAAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC: 38.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTTGGAGAG AGGGGTGATG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGTCTGTTG TTTACCAGAT G

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTTACTGG ATGACCACCA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1254 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (cDNA)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:1. . 1254

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 41:

9

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 418 amino acids

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 42:

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC NO: 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 700 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (cDNA) (ii. i) HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC NO: 43

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 43:

\vskip1.000000\baselineskip

15

Claims

1. Una molécula de ácido nucleico codificando un antígeno Rhesus D que contribuye a o es indicativo del fenotipo débil D, dicha molécula de ácido nucleico teniendo al menos una mutación sin sentido, como se compara con el antígeno salvaje Rhesus tipo D, en sus regiones transmembrana y/o intracelulares.

2. Una molécula de ácido nucleico codificando una antígeno Rhesus D que contribuye a o es indicativo del fenotipo débil D, dicha molécula de ácido nucleico teniendo al menos una mutación sin sentido, como se compara con el antígeno salvaje Rhesus tipo D, en las posiciones aminoacídicas 2-16, 114-149, 179-225 o/y 267 a 397 con la condición que dicho antígeno D no lleve una simple mutación sin sentido dando lugar a una sustitución de fenilalanina en la posición aminoacídica 223 223 por valina o de treonina en la posición 283 por isoleucina.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2 en donde dicha mutación sin sentido causa una sustitución aminoacídica en la posición 3, 10, 16, 114, 149, 182, 198, 201, 220, 223, 270, 276, 277, 282, 294, 295, 307, 339, 385 o 393 o una combinación de/o implicando dichas sustituciones, con la condición que dicho antígeno D no lleve una simple mutación sin sentido dando lugar a una sustitución de fenilalanina en la posición aminoacídica 223 por valina.

4. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3 en donde dicha sustitución aminoacídica en la posición 3 es de Ser a Cis, en la posición 10 de Arg a Gin, en la posición 16 de Trp a Cis, en la posición 114 de Arg a Trp, en la posición 149 de Ala a Asp, en la posición 182 de Ser a Trp, en la posición 198 de Lis a Asn, en la posición 201 de Trp a Arg, en la posición 220 de Trp a Arg, en la posición 223 de Phe a Val, con la condición que dicha sustitución no se base en una simple mutación sin sentido dando lugar a una sustitución de fenilalaninaen la posición aminoacídica 223 por valina, en la posición 270 de Val a Gly, en la posición 276 de Ala a Pro, en la posición 277 de Gly a Glu, en la posición 282 de Gly a Asp, en la posición 294 de Ala a Pro, en la posición 295 de Met a Ile, en posición 307 de Gly a Arg, en la posición 339 de Gly a Glu, en la posición 385 de Gly a Ala y en la posición 393 de Trp a Arg.

5. La molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde dicha mutación sin sentido tiene lugar en las posiciones del nucleótido 8, 29, 48, 340, 446, 544, 594, 602, 658, 667, 809, 819, 826, 830, 845, 880, 885, 919, 1016, 1154 o 1177 o en combinación de dichas posiciones, con la condición que el antígeno D codificado no lleve una simple mutación sin sentido dando lugar a una sustitución de fenilalanina en la posición aminoacídica 223 por valina.

6. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5 en donde dicha mutación sin sentido en la posición 8 es de C a G, en la posición 29 de G a A, en la posición 48 de G a C, en la posición 340 de C a T, en la posición 446 de C a A, en la posición 544 de T a A, en la posición 594 de A a T, en la posición 602 de C a G, en la posición 658 de T a C, en la posición 667 de T a G, en la posición 809 de T a G, en la posición 819 de G a A, en la posición 826 de G a C, en la posición 830 de G a A, en la posición 845 de G a A, en la posición 880 de G a C, en la posición 885 de G a T, en la posición 919 de G a A, en la posición 1016 de G a A, en la posición 1154 de G a C y en la posición 1177 de T a C.

7. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3 o 4 en donde dicha combinación de sustituciones es en las posiciones 182, 198 y 201 y es preferible S182T, K198N, T201R o en la posición 201 y 223 y es preferible T201R y F223V, o en la posición 16, 201 y 223 y es preferible W16C, T201R y F223V.

8. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5 o 6 en donde dicha combinación de mutaciones sin sentido comprende las posiciones 544, 594 y 602 y es preferible T\rightarrowA en la posición 544 A\rightarrowT en la posición 594 y C\rightarrowG en la posición 602 o comprende las posiciones 602, 667 y 819 y es preferible C\rightarrowG en la posición 602, T\rightarrowG en la posición 667 y G\rightarrowA en la posición 819 o comprende posiciones 48, 602, 667 y 819 y es preferible G\rightarrowC en la posición 48, C\rightarrowG en la posición 602, T\rightarrowG en la posición 667 y G\rightarrowA en la posición 819.

9. La molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que es mRNA o DNA genómico.

10. Un vector comprendiendo la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Un huésped no humano transformado con el vector de la reivindicación 10.

12. Un método para producir un antígeno Rhesus D que contribuye al fenotipo débil D que comprende cultivar el huésped de la reivindicación 11 bajo condiciones adecuadas y aislamiento del antígeno Rhesus D producido.

13. Un antígeno Rhesus D codificado por la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o producido por el método de la reivindicación 12.

14. Un oligonucleótido específicamente hibridando a una porción de la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en donde dicha porción comprende al menos una mutación sin sentido o a la hebra complementaria de la misma.

15. Un anticuerpo o aptámero o fago específicamente unido al antígeno Rhesus D de la reivindicación 13.

16. Un anticuerpo o aptámero o fago específicamente unido al antígeno Rhesus D tipo salvaje o a aberrantes antígenos Rhesus D pero no el antígeno Rhesus D de la reivindicación 13.

17. Un método para probar la presencia de una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno Rhesus D que contribuye al fenotipo D débil en una muestra que comprende la hibridación del oligonucleótido de la reivindicación 14 bajo condiciones astringentes a moléculas de ácido nucleico comprendidas en la muestra de humano y detectar dicha hibridación.

18. El método de la reivindicación 17 además comprende la digestión del producto de dicha hibridación con una endonucleasa de restricción y el análisis del producto de dicha digestión.

19. Un método para ensayar la presencia de una molécula de ácido nucleico codificando un antígeno Rhesus D que contribuye a o es indicativo del fenotipo D débil en una muestra que comprende la determinación de la secuencia del ácido nucleico de al menos una porción de la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones de las reivindicaciones 1 a 9, dicha porción codifica al menos dichas mutaciones sin sentido o de una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno Rhesus D que contribuye al fenotipo D débil, dicha molécula de ácido nucleico teniendo una combinación de mutaciones sin sentido, como se compara con el antígeno salvaje Rhesus tipo D, una de dicha mutación sin sentido causando una sustitución aminoacídica en la posición 223 o 283 que es en la posición 223 preferiblemente de Phe a Val y en la posición 283 preferiblemente de Thr a Ile, dicha mutación sin sentido además preferiblemente teniendo lugar en la posición del nucleótido 667 o 848 en donde más preferiblemente dicha mutación en la posición 667 es de T a G y en la posición 848 de C a T.

20. El método de la reivindicación 19 además comprendiendo, previo a determinar dicha secuencia de ácido nucleico, amplificación de al menos dicha porción de dicha molécula de ácido nucleico.

21. Un método para ensayar la presencia de una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno Rhesus D que contribuye a o es indicativo del fenotipo débil D en una muestra que comprende llevando a cabo una reacción de amplificación en donde al menos uno de los cebadores empleados en dicha reacción de amplificación es el oligonucleótido de la reivindicación 14, comprendiendo el ensayo para un producto de amplificación.

22. El método de la reivindicación 20 o 21 en donde dicha amplificación se efectúa por o dicha amplificación es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

23. Un método para ensayar la presencia de un antígeno Rhesus D que contribuye a o es indicativo del fenotipo D débil en una muestra comprendiendo el ensayo de una muestra de un humano para unirse específicamente al anticuerpo o aptámero o fago de la reivindicación 15.

24. Un método de ensayo de una muestra para la presencia del antígeno salvaje Rhesus tipo D y la ausencia del antígeno Rhesus D de la reivindicación 13 comprendiendo el ensayo de una muestra de un humano para unirse específicamente a un anticuerpo o aptámero o fago de la reivindicación 16.

25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24 en donde dicha muestra es sangre, suero, plasma, tejido fetal, saliva, orina, tejido mucoso, moco, tejido vaginal, tejido fetal de la vagina, piel, pelo, folículo piloso u otro tejido humano.

26. El método de la reivindicación 25 comprendiendo enriquecimiento de células fetales o extracción de DNA fetal o mRNA de tejido maternal, como sangre periférica, suero o plasma.

27. El método de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 26 en donde dicha molécula de ácido nucleico o material proteico de dicha muestra se fija a un soporte sólido.

28. El método de la reivindicación 27 en donde dicho soporte sólido es un chip.

29. Uso de la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o de una molécula de ácido nucleico codificando un antígeno Rhesus D que contribuye a o es indicativo del fenotipo débil D, dicha molécula de ácido nucleico llevando una a combinación de mutaciones sin sentido, como se compara con el antígeno salvaje Rhesus, una de dichas mutaciones mutaciones sin sentido causando una sustitución aminocacídica en la posición 223 o 283 que es en la posición 223 preferiblemente de Phe a Val y en la posición 283 preferiblemente de Thr a Ile, dicha mutación sin sentido además preferiblemente tiene lugar en la posición del nucleótido 667 o 848 en donde más preferiblemente dicha mutación en la posición 667 es de T a G y en la posición 848 de C a T o de una combinación de las mismas para el análisis de un fenotipo débil Rhesus D.

30. Uso de la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, el vector de la reivindicación 10 o el antígeno Rhesus D de la reivindicación 13 para la evaluación de la afinidad, avidez y/o reactividad de anticuerpos monoclonales o de antisuero policlonal preferiblemente antisuero anti-D, anti-globulina o antisuero anti-globulina humana.

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31. Un método para la caracterización de anticuerpos monoclonales o anticuerpo policlonal o de una preparación de los mismos dicho método comprende

(a) probar el ácido nucleico de la muestra de un probando para la presencia de una mutación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8;

(b) correlacionar, en la base del estado de la mutación y el estado alélico del gen RhD, el ácido nucleico con la densidad del antígeno RhD en la superficie de células rojas de la sangre de dicho probando;

(c) reaccionar dichos anticuerpos monoclonales o antisuero monoclonal o dicha preparación de los mismos con una célula que lleva el antígeno RhD en su superficie;

(d) caracterizar dichos anticuerpos monoclonales o antisuero policlonal o dicha preparación de los mismos en base de los resultados obtenidos en el paso (c).

32. El método de la reivindicación 31 en donde dicha caracterización comprende la determinación de reactividad, sensibilidad, avidez, afinidad, especificidad y/o otras características de anticuerpos y antisuero.

33. Un método de la reivindicación 31 o 32 en donde dicha célula que lleva el antígeno RhD en la superficie es una célula roja de la sangre.

34. Uso de un aptámero, fago, anticuerpo monoclonal o un antisuero policlonal como se caracteriza en las reivindicaciones 15 o 16 o una preparación de las mismas para la determinación del antígeno RhD.

35. Uso de la reivindicación 34 en donde dicha determinación del antígeno RhD se efectúa en conexión con el grupo sanguíneo.

36. Una preparación que comprende el anticuerpo o aptámero o fago de reivindicaciones 15 o 16.

37. Un método de identificación de un anticuerpo de cadena V_{H} o VL o una combinación de los mismos o un aptámero específicamente uniéndose al antígeno D débil de la reivindicación 13 comprendiendo

(a) contactar el antígeno D débil de la reivindicación 13 con una librería de fagos mostrando las cadenas V_{H} o V_{L} o combinaciones de las mismas en la superficie del fago o con aptámeros;

(b) identificar el fago o aptámeros que se unan a dicho antígeno débil D; y opcionalmente

(c) repetir los pasos (a) y (b) una o más veces.

38. Un método de identificar un anticuerpo monoclonal específicamente uniéndose a un polipéptido/antígeno D débil de la reivindicación 13 comprendiendo

(a) contactar el polipéptido D débil de la reivindicación 13 con uno o más anticuerpos monoclonales;

(b) identificar anticuerpos monoclonales que se unen a dicho polipéptido D débil; y opcionalmente

(c) repetir los pasos (a) y (b) una o más veces.

39. Un método de identificar un anticuerpo de cadena VH o VL o una combinación de los mismos o un aptámero específicamente uniéndose a un polipéptido/antígeno D débil de la reivindicación 13 comprendiendo

(a) contactar el polipéptido D débil y

: (aa) un segundo o más polipéptido(s) y/o

: (ab) a polipéptido D normal

en donde el segundo o más polipéptido(s) D débil y/o el polipéptido normal D están presentes en una masa molar que sea más alta, igual o menor que el polipéptido D débil de (a) con una librería de fagos mostrando las cadenas V_{H} o V_{L} o combinaciones de las mismas en la superficie del fago o con aptámeros;

(b) identificar el fago o los aptámeros que se unan a dicho polipéptido débil D de (a); y opcionalmente

(c) repetir los pasos (a) y (b) uno o más veces.

40. Un método de identificar un anticuerpo monoclonal específicamente uniéndose a un polipéptido/antígeno D débil de la reivindicación 13 comprendiendo

(a) contactar el polipéptido D débil y

: (aa) un segundo o más polipéptido(s) D débil y/o

: (ab) un polipéptido D normal

en donde el segundo o más polipéptido(s) D débil y/o el polipéptido D normal están presentes en la masa molar que es más alta, igual o inferior que el polipéptido D débil de (a) con uno o más anticuerpos monoclonales;

(c) repetir los pasos (a) y (b) una o más veces.

41. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 37 a 40, en donde el polipéptido D débil se expone en la superficie de una célula.

42. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 37 a 41, en donde el polipéptido o células huésped se fijan en un soporte sólido.

43. El método de cualquiera de las reivindicaciones 37 a 42, en donde después del paso (b) o (c), se lleva a cabo el siguiente paso:

(d) identificar la secuencia de aminoácidos de las cadenas VH o VL y/o identificar la secuencia de ácidos nucleicos que codifican dicha secuencia de aminoácidos.

44. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 43, en donde, en el caso que solamente se emplee una ronda de selección para la identificación, el número de moléculas del polipéptido D débil de (a) es un exceso molar sobre el número de partículas de fago.

45. Un método para la evaluación de la afinidad, avidez y/o reactividad de anticuerpos anti-D monoclonales o antisuero anti-D policlonal o de antiglobulinas o de antisuero antiglobulina humana o de preparaciones de los mismos, en donde las células de probandos, preferiblemente células rojas de la sangre, comprendiendo el antígeno RhD de la reivindicación 13 se usan y en donde en un primer paso el gen Rhesus D de un portador o de un donante de sangre y su estado alélico se analiza para la presencia de un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

46. Un método para determinar si un paciente con necesidad de transfusión de sangre puede ser transfundido con sangre RhD negativo de un donante comprendiendo el paso de probar una muestra de dicho paciente para la presencia de uno o más antígenos RhD de la reivindicación 13, en donde una prueba positiva para al menos uno de dichos antígenos sea indicativo de necesidad de una transfusión con sangre RhD negativo.

47. Un método para determinar si la sangre de un donante puede ser usada para la transfusión a un paciente con necesidad de la misma comprendiendo el paso de probar la muestra de dicho donante para la presencia de uno o más antígenos RhD de la reivindicación 13 en donde una prueba positiva para al menos uno de los dichos antígenos excluye la transfusión de pacientes que son tipadas como portadores del antígeno salvaje del grupo Rh D o un grupo(s) débil D diferente del grupo D débil de dicho donante.

48. El kit comprende

(a): el oligonucleótido de la reivindicación 14; y/o

(b): el anticuerpo de la reivindicación 15; y/o

(c): el anticuerpo de la reivindicación 16

(d): el aptámero de la reivindicación 15 o 16 y/o

(e): el fago de la reivindicación 15 o 16.