JP6843062B2 - Ｃａｒ ｔ細胞免疫療法のための新規標的としてのｈｌａ−ｇ - Google Patents

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Description

関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法第§１１９（ｅ）の下、２０１５年３月２７日に出願された米国仮出願第６２／１３９，６１７号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
本開示は一般に、ヒト免疫学の分野、具体的には、がんの免疫療法に関する。
本発明の背景についての以下の考察は、読者が本発明を理解する一助とするために提示するだけであり、本発明に対する先行技術を記載または構成することを容認するものではない。
ＨＬＡ−Ｇとは、特に、阻害性のＮＫ細胞受容体のリガンドとして、主に、細胞傷害性の免疫細胞機能を抑制するように働く非古典的なＭＨＣクラスＩ分子である。
新規の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体、ならびにそれらを診断的および治療的に使用する方法が提供される。この点で、本明細書では、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列と、軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列とを含む単離抗体であって、アミノ酸配列：
ＧＳＨＳＭＲＹＦＳＡ ＡＶＳＲＰＧＲＧＥＰ ＲＦＩＡＭＧＹＶＤＤ ＴＱＦＶＲＦＤＳＤＳ ＡＣＰＲＭＥＰＲＡＰ ＷＶＥＱＥＧＰＥＹＷ ＥＥＥＴＲＮＴＫＡＨ ＡＱＴＤＲＭＮＬＱＴ ＬＲＧＹＹＮＱＳＥＡ ＳＳＨＴＬＱＷＭＩＧ ＣＤＬＧＳＤＧＲＬＬ ＲＧＹＥＱＹＡＹＤＧ ＫＤＹＬＡＬＮＥＤＬ ＲＳＷＴＡＡＤＴＡＡ ＱＩＳＫＲＫＣＥＡＡ ＮＶＡＥＱＲＲＡＹＬ ＥＧＴＣＶＥＷＨＬＡ−Ｇ ＹＬＥＮＧＫＥＭＬＱ ＲＡＤＰＰＫＴＨＶＴ ＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴ ＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰ ＡＥＩＩＬＴＷＱＲＤ ＧＥＤＱＴＱＤＶＥＬ ＶＥＴＲＰＡＧＤＧＴ ＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰ ＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨ ＶＱＨＥＧＬＰＥＰＬ ＭＬＲＷＫＱＳＳＬＰ ＴＩＰＩＭＧＩ ＶＡＧＬＶＶＬＡＡＶ ＶＴＧＡＡＶＡＡＶＬ ＷＲＫＫＳＳＤ（配列番号３０）、またはその同等物を含む、ヒトＨＬＡ−Ｇのエピトープに結合する単離抗体が提示される。一態様では、抗体は、少なくとも１０−６Ｍの特異的結合アフィニティーを有する。ある特定の態様では、抗体は、少なくとも約１０−７Ｍ、好ましくは、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍのアフィニティーで結合する。
本明細書で開示されるある特定の実施形態では、抗体は、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列と、軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列とを含み、ここで、抗体は、ＨＣが、以下：アミノ酸配列ＧＦＮＩＫＤＴＹ（配列番号１）もしくはＧＦＴＦＮＴＹＡ（配列番号２）、またはそれらの各々の同等物を含むＨＣ ＣＤＲＨ１；および／あるいはアミノ酸配列ＩＤＰＡＮＧＮＴ（配列番号３）もしくはＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴ（配列番号４）、またはそれらの各々の同等物を含むＨＣ ＣＤＲＨ２；および／あるいはアミノ酸配列ＡＲＳＹＹＧＧＦＡＹ（配列番号５）もしくはＶＲＧＧＹＷＳＦＤＶ（配列番号６）、またはそれらの各々の同等物を含むＨＣ ＣＤＲＨ３のうちのいずれか１つを含むアミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなり、ヒトＨＬＡ−Ｇのエピトープに結合する。
本明細書で開示されるある特定の実施形態では、抗体は、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列と、軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列とを含み、ここで、抗体は、ＬＣが、アミノ酸ＫＳＶＳＴＳＧＹＳＹ（配列番号１１）もしくはＫＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号１２）、またはそれらの各々の同等物を含むＬＣ ＣＤＲＬ１；および／あるいはアミノ酸配列ＬＶＳ（配列番号１３）もしくはＲＭＳ（配列番号１４）、またはそれらの各々の同等物を含むＬＣ ＣＤＲＬ２；および／あるいはアミノ酸配列ＱＨＳＲＥＬＰＲＴ（配列番号１５）もしくはＭＱＨＬＥＹＰＹＴ（配列番号１６）、またはそれらの各々の同等物を含むＬＣ ＣＤＲＬ３を含むアミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなり、ヒトＨＬＡ−Ｇのエピトープに結合する。
本開示の一部の態様は、ＨＬＡ−Ｇに特異的な抗原結合性ドメイン（例えば、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメイン）を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、それらをコードする核酸のほか、それらを作製および使用するための方法に関する。
本開示の態様は、（ａ）ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメイン；（ｂ）ヒンジドメイン；（ｃ）膜貫通ドメイン；および（ｄ）細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。本開示のさらなる態様は、（ａ）ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメイン；（ｂ）ヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン；（ｄ）ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達領域、４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域、ＩＣＯＳ共刺激性シグナル伝達領域、およびＯＸ４０共刺激性領域から選択される、１または複数の共刺激性領域；ならびに（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインまたはその同等物もしくは代替物を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。
さらなる態様では、本開示は、（ａ）抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達領域および／または４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域；ならびに（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、またはその同等物もしくは代替物を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提示する。
さらなる態様では、本開示は、（ａ）抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、またはその同等物もしくは代替物を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提示する。
本開示のさらなる態様は、抗体をコードする単離核酸配列、ベクター、およびそれらを含有する宿主細胞に関する。
本開示のさらなる態様は、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲを含む単離細胞と、このような細胞を作製する方法とに関する。本開示のさらに他の方法態様は、腫瘍の増殖を阻害し、がん患者を処置するための方法であって、有効量の前記単離細胞を投与するステップを含む方法に関する。
本開示のさらなる態様は、ＨＬＡ−Ｇ抗体およびＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ細胞の一方または両方の使用を介して、患者が、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いのか、高くないのかを決定するための方法およびキットに関する。
本開示のさらなる態様は、担体と、本明細書で開示される実施形態において記載される生成物のうちの１または複数とを含む組成物に関する。一部の態様では、本開示は、担体と、ＨＬＡ−Ｇ抗体；および／またはＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ；および／またはＨＬＡ−Ｇ抗体もしくはＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲをコードする単離核酸；および／またはＨＬＡ−Ｇ抗体もしくはＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲをコードする単離核酸配列を含むベクター；および／またはＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲを含む単離細胞のうちの１または複数とを含む組成物を提示する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列と、軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列とを含む単離抗体であって、アミノ酸配列：
ＧＳＨＳＭＲＹＦＳＡ ＡＶＳＲＰＧＲＧＥＰ ＲＦＩＡＭＧＹＶＤＤ ＴＱＦＶＲＦＤＳＤＳ ＡＣＰＲＭＥＰＲＡＰ ＷＶＥＱＥＧＰＥＹＷ ＥＥＥＴＲＮＴＫＡＨ ＡＱＴＤＲＭＮＬＱＴ ＬＲＧＹＹＮＱＳＥＡ ＳＳＨＴＬＱＷＭＩＧ ＣＤＬＧＳＤＧＲＬＬ
ＲＧＹＥＱＹＡＹＤＧ ＫＤＹＬＡＬＮＥＤＬ ＲＳＷＴＡＡＤＴＡＡ ＱＩＳＫＲＫＣＥＡＡ ＮＶＡＥＱＲＲＡＹＬ ＥＧＴＣＶＥＷＨＬＡ−Ｇ ＹＬＥＮＧＫＥＭＬＱ ＲＡＤＰＰＫＴＨＶＴ ＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴ ＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰ ＡＥＩＩＬＴＷＱＲＤ ＧＥＤＱＴＱＤＶＥＬ ＶＥＴＲＰＡＧＤＧＴ ＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰ ＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨ ＶＱＨＥＧＬＰＥＰＬ ＭＬＲＷＫＱＳＳＬＰ ＴＩＰＩＭＧＩ ＶＡＧＬＶＶＬＡＡＶ ＶＴＧＡＡＶＡＡＶＬ ＷＲＫＫＳＳＤ（配列番号３０）、またはその同等物を含む、ＨＬＡ−Ｇのエピトープに結合し、ここで同等物は、配列番号３０に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するか、あるいは配列番号３０をコードするポリヌクレオチドもしくはその相補体に対して少なくとも８０％同一であるか、または高ストリンジェンシーの条件下で、前記ポリヌクレオチドもしくはその相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、ここで高ストリンジェンシーの条件が、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６倍濃度のＳＳＣ〜約１０倍濃度のＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約４倍濃度のＳＳＣ〜約８倍濃度のＳＳＣの洗浄溶液を含む、単離抗体。
（項目２）
（ａ）前記ＨＣが、ＣＤＲＨ３配列ＡＲＳＹＹＧＧＦＡＹ（配列番号５）もしくはＶＲＧＧＹＷＳＦＤＶ（配列番号６）、またはそれらの各々の同等物を含むか；あるいは
（ｂ）前記ＬＣが、ＣＤＲＬ３配列ＱＨＳＲＥＬＰＲＴ（配列番号１５）もしくはＭＱＨＬＥＹＰＹＴ（配列番号１６）、またはそれらの各々の同等物を含むか；あるいは
（ｃ）前記ＨＣが、ＣＤＲＨ３配列ＡＲＳＹＹＧＧＦＡＹ（配列番号５）またはＶＲＧＧＹＷＳＦＤＶ（配列番号６）を含み、かつ、前記ＬＣが、ＱＨＳＲＥＬＰＲＴ（配列番号１５）もしくはＭＱＨＬＥＹＰＹＴ（配列番号１６）、またはそれらの各々の同等物を含み；
（ｄ）同等物が、前記配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するか、あるいは前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくはその相補体に対して少なくとも８０％同一であるか、または高ストリンジェンシーの条件下で、前記ポリヌクレオチドもしくはその相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、ここで高ストリンジェンシーの条件が、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６倍濃度のＳＳＣ〜約１０倍濃度のＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約４倍濃度のＳＳＣ〜約８倍濃度のＳＳＣの洗浄溶液を含む、
項目１に記載の抗体。
（項目３）
前記ＨＣが、ＣＤＲＨ２配列ＩＤＰＡＮＧＮＴ（配列番号３）もしくはＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴ（配列番号４）、またはそれらの各々の同等物をさらに含み、同等物が、前記配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するか、あるいは前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくはその相補体に対して少なくとも８０％同一であるか、または高ストリンジェンシーの条件下で、前記ポリヌクレオチドもしくはその相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、ここで高ストリンジェンシーの条件が、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６倍濃度のＳＳＣ〜約１０倍濃度のＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約４倍濃度のＳＳＣ〜約８倍濃度のＳＳＣの洗浄溶液を含む、項目１または２に記載の抗体。
（項目４）
前記ＨＣが、ＣＤＲＨ１配列ＧＦＮＩＫＤＴＹ（配列番号１）もしくはＧＦＴＦＮＴＹＡ（配列番号２）、またはそれらの各々の同等物をさらに含み、同等物が、前記配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するか、あるいは前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくはその相補体に対して少なくとも８０％同一であるか、または高ストリンジェンシーの条件下で、前記ポリヌクレオチドもしくはその相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、ここで高ストリンジェンシーの条件が、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６倍濃度のＳＳＣ〜約１０倍濃度のＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約４倍濃度のＳＳＣ〜約８倍濃度のＳＳＣの洗浄溶液を含む、項目１から３のいずれか一項に記載の抗体。
（項目５）
前記ＬＣが、ＣＤＲＬ２配列ＬＶＳ（配列番号１３）もしくはＲＭＳ（配列番号１４）またはそれらの各々の同等物をさらに含み、同等物が、前記配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するか、あるいは前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくはその相補体に対して少なくとも８０％同一であるか、または高ストリンジェンシーの条件下で、前記ポリヌクレオチドもしくはその相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、ここで高ストリンジェンシーの条件が、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６倍濃度のＳＳＣ〜約１０倍濃度のＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約４倍濃度のＳＳＣ〜約８倍濃度のＳＳＣの洗浄溶液を含む、項目１から４のいずれか一項に記載の抗体。
（項目６）
前記ＬＣが、ＣＤＲＬ１配列ＫＳＶＳＴＳＧＹＳＹ（配列番号１１）もしくはＫＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号１２）、またはそれらの各々の同等物をさらに含み、同等物が、前記配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するか、あるいは前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくはその相補体に対して少なくとも８０％同一であるか、または高ストリンジェンシーの条件下で、前記ポリヌクレオチドもしくはその相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、ここで高ストリンジェンシーの条件が、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６倍濃度のＳＳＣ〜約１０倍濃度のＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約４倍濃度のＳＳＣ〜約８倍濃度のＳＳＣの洗浄溶液を含む、項目１から５のいずれか一項に記載の抗体。
（項目７）
前記ＨＣが、
（ａ）アミノ酸配列ＧＦＮＩＫＤＴＹ（配列番号１）もしくはＧＦＴＦＮＴＹＡ（配列番号２）、もしくはそれらの各々の同等物を含むＨＣ ＣＤＲＨ１；および／または
（ｂ）アミノ酸配列ＩＤＰＡＮＧＮＴ（配列番号３）もしくはＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴ（配列番号４）、もしくはそれらの各々の同等物を含むＨＣ ＣＤＲＨ２；および／または
（ｃ）アミノ酸配列ＡＲＳＹＹＧＧＦＡＹ（配列番号５）もしくはＶＲＧＧＹＷＳＦＤＶ（配列番号６）、もしくはそれらの各々の同等物を含むＨＣ ＣＤＲＨ３
を含み；
（ｄ）同等物が、前記配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するか、あるいは前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくはその相補体に対して少なくとも８０％同一であるか、または高ストリンジェンシーの条件下で、前記ポリヌクレオチドもしくはその相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、ここで高ストリンジェンシーの条件が、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６倍濃度のＳＳＣ〜約１０倍濃度のＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約４倍濃度のＳＳＣ〜約８倍濃度のＳＳＣの洗浄溶液を含み；かつ／あるいは
前記ＬＣが、
（ａ）アミノ酸配列ＫＳＶＳＴＳＧＹＳＹ（配列番号１１）もしくはＫＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号１２）、もしくはそれらの各々の同等物を含むＬＣ ＣＤＲ１；および／または
（ｂ）アミノ酸配列ＬＶＳ（配列番号１３）もしくはＲＭＳ（配列番号１４）、もしくはそれらの各々の同等物を含むＬＣ ＣＤＲ２；および／または
（ｃ）アミノ酸配列ＱＨＳＲＥＬＰＲＴ（配列番号１５）もしくはＭＱＨＬＥＹＰＹＴ（配列番号１６）、もしくはそれらの各々の同等物を含むＬＣ ＣＤＲ３
を含み；
（ｄ）同等物が、前記配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するか、あるいは前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくはその相補体に対して少なくとも８０％同一であるか、または高ストリンジェンシーの条件下で、前記ポリヌクレオチドもしくはその相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、ここで高ストリンジェンシーの条件が、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６倍濃度のＳＳＣ〜約１０倍濃度のＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約４倍濃度のＳＳＣ〜約８倍濃度のＳＳＣの洗浄溶液を含む、項目１から６のいずれか一項に記載の抗体。
（項目８）
前記ＨＣが、
（ａ）アミノ酸配列ＧＦＮＩＫＤＴＹ（配列番号１）もしくはＧＦＴＦＮＴＹＡ（配列番号２）、もしくはそれらの各々の同等物を含むＨＣ ＣＤＲＨ１；および／または
（ｂ）アミノ酸配列ＩＤＰＡＮＧＮＴ（配列番号３）もしくはＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴ（配列番号４）、もしくはそれらの各々の同等物を含むＨＣ ＣＤＲＨ２；および／または
（ｃ）アミノ酸配列ＡＲＳＹＹＧＧＦＡＹ（配列番号５）もしくはＶＲＧＧＹＷＳＦＤＶ（配列番号６）、もしくはそれらの各々の同等物を含むＨＣ ＣＤＲＨ３
を含み；
（ｄ）同等物が、前記配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するか、あるいは前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくはその相補体に対して少なくとも８０％同一であるか、または高ストリンジェンシーの条件下で、前記ポリヌクレオチドもしくはその相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、ここで高ストリンジェンシーの条件が、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６倍濃度のＳＳＣ〜約１０倍濃度のＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約４倍濃度のＳＳＣ〜約８倍濃度のＳＳＣの洗浄溶液を含み；かつ／あるいは
前記ＬＣが、
（ａ）アミノ酸ＫＳＶＳＴＳＧＹＳＹ（配列番号１１）もしくはＫＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号１２）、もしくはそれらの各々の同等物を含むＬＣ ＣＤＲＬ１；および／または
（ｂ）アミノ酸配列ＬＶＳ（配列番号１３）もしくはＲＭＳ（配列番号１４）、もしくはそれらの各々の同等物を含むＬＣ ＣＤＲＬ２；および／または
（ｃ）アミノ酸配列ＱＨＳＲＥＬＰＲＴ（配列番号１５）もしくはＭＱＨＬＥＹＰＹＴ（配列番号１６）、もしくはそれらの各々の同等物を含むＬＣ ＣＤＲＬ３
を含み；
（ｄ）同等物が、前記配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するか、あるいは前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくはその相補体に対して少なくとも８０％同一であるか、または高ストリンジェンシーの条件下で、前記ポリヌクレオチドもしくはその相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、ここで高ストリンジェンシーの条件が、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６倍濃度のＳＳＣ〜約１０倍濃度のＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約４倍濃度のＳＳＣ〜約８倍濃度のＳＳＣの洗浄溶液を含む、項目１から６のいずれか一項に記載の抗体。
（項目９）
前記ＨＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、配列番号８もしくは１０のアミノ酸配列、またはそれらの各々の同等物を含み、同等物が、前記配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するか、あるいは前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくはその相補体に対して少なくとも８０％同一であるか、または高ストリンジェンシーの条件下で、前記ポリヌクレオチドもしくはその相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、ここで高ストリンジェンシーの条件が、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６倍濃度のＳＳＣ〜約１０倍濃度のＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約４倍濃度のＳＳＣ〜約８倍濃度のＳＳＣの洗浄溶液を含む、項目１から８のいずれか一項に記載の抗体。
（項目１０）
前記ＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、配列番号１８もしくは２０のアミノ酸配列、またはそれらの各々の同等物を含み、同等物が、前記配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するか、あるいは前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくはその相補体に対して少なくとも８０％同一であるか、または高ストリンジェンシーの条件下で、前記ポリヌクレオチドもしくはその相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、ここで高ストリンジェンシーの条件が、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６倍濃度のＳＳＣ〜約１０倍濃度のＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約４倍濃度のＳＳＣ〜約８倍濃度のＳＳＣの洗浄溶液を含む、項目１から９のいずれか一項に記載の抗体。
（項目１１）
前記ＨＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、配列番号８または１０のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、配列番号１８もしくは２０のアミノ酸配列、またはそれらの各々の同等物を含み、同等物が、前記配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するか、あるいは前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくはその相補体に対して少なくとも８０％同一であるか、または高ストリンジェンシーの条件下で、前記ポリヌクレオチドもしくはその相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、ここで高ストリンジェンシーの条件が、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６倍濃度のＳＳＣ〜約１０倍濃度のＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約４倍濃度のＳＳＣ〜約８倍濃度のＳＳＣの洗浄溶液を含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の抗体。
（項目１２）
モノクローナル抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体の群より選択される、項目１から１１のいずれか一項に記載の抗体。
（項目１３）
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦ ｖ 、およびＦ ｖ からなる群より選択される、項目１から１２のいずれか一項に記載の抗体の抗原結合性断片。
（項目１４）
項目１から１２のいずれか一項に記載の抗体、または項目１３に記載の抗原結合性断片、および任意選択で、検出可能な標識を含む、単離ｅｘ ｖｉｖｏ複合体。
（項目１５）
項目１４に記載の複合体を含む単離ｅｘ ｖｉｖｏ細胞。
（項目１６）
生物学的試料中のＨＬＡ−Ｇを検出する方法であって、前記試料を、項目１から１２のいずれか一項に記載の抗体、または項目１３に記載の抗原結合性断片と接触させるステップと、前記抗体または前記抗原結合性断片の、ＨＬＡ−Ｇへの結合により形成された複合体を検出するステップとを含む、方法。
（項目１７）
前記試料が、細胞試料または組織試料を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記試料を、がんを有すると診断されているか、がんを有すると疑われているか、またはがんを有する危険性がある対象から得る、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記がんが、前立腺がんまたは卵巣がんからなる群より選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記検出が、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ウェスタンブロット法、フローサイトメトリー、またはＥＬＩＳＡのうちの１または複数を含む、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
対象から単離された試料中の病的細胞を検出する方法であって、
（ａ）前記試料中のＨＬＡ−Ｇに結合する、項目１から１２のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片により形成された複合体を検出することにより、前記対象に由来する生物学的試料中のＨＬＡ−Ｇのレベルを検出するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）において観察されたＨＬＡ−Ｇのレベルを、対照の生物学的試料中で観察されるＨＬＡ−Ｇのレベルと比較するステップと
を含み、
ＨＬＡ−Ｇのレベルが、前記対照の生物学的試料中で観察されるレベルと比較して上昇する場合に、前記病的細胞が検出され、ＨＬＡ−Ｇのレベルが、前記対照の生物学的試料中で観察されるレベルと比較して上昇しない場合に、前記病的細胞が検出されない、
方法。
（項目２２）
前記対象の生物学的試料が、前立腺または卵巣から単離された試料のうちの１または複数を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記検出が、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ウェスタンブロット法、フローサイトメトリー、またはＥＬＩＳＡのうちの１または複数を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記生物学的試料を、前記対象から単離するステップをさらに含む、項目２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記対象が、哺乳動物である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記哺乳動物が、マウス、ネコ科動物、イヌ科動物、ヒツジ、ウシ、サル、およびヒトの群より選択される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
項目１から１２のいずれか一項に記載の抗体と同じエピトープ特異性を有する、ＨＬＡ−Ｇ特異的抗体またはその抗原結合性断片。
（項目２８）
ＨＬＡ−Ｇを検出するためのキットであって、項目１から１２のいずれか一項に記載の抗体、または項目１３に記載の抗原結合性断片と、使用のための指示とを含む、キット。
（項目２９）
腫瘍試料中のＨＬＡ−Ｇを検出する方法であって、
（ａ）前記試料を、抗体または前記抗体の抗原結合性断片と接触させるステップであって、前記抗体は、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列と、軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列とを含み、前記抗体は、
前記ＨＣが、
（ｉ）アミノ酸配列ＧＦＮＩＫＤＴＹ（配列番号１）もしくはＧＦＴＦＮＴＹＡ（配列番号２）、またはそれらの各々の同等物を含むＨＣ ＣＤＲＨ１；および
（ｉｉ）アミノ酸配列ＩＤＰＡＮＧＮＴ（配列番号３）もしくはＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴ（配列番号４）、またはそれらの各々の同等物を含むＨＣ ＣＤＲＨ２；および
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＡＲＳＹＹＧＧＦＡＹ（配列番号５）もしくはＶＲＧＧＹＷＳＦＤＶ（配列番号６）、またはそれらの各々の同等物を含むＨＣ ＣＤＲＨ３
を含み；
（ｉｖ）同等物が、前記配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するか、または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくはその相補体に対して少なくとも８０％同一であるか、または高ストリンジェンシーの条件下で、前記ポリヌクレオチドもしくはその相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、ここで高ストリンジェンシーの条件が、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６倍濃度のＳＳＣ〜約１０倍濃度のＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約４倍濃度のＳＳＣ〜約８倍濃度のＳＳＣの洗浄溶液を含み；
前記ＬＣが、
（ｉ）アミノ酸ＫＳＶＳＴＳＧＹＳＹ（配列番号１１）もしくはＫＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号１２）、またはそれらの各々の同等物を含むＬＣ ＣＤＲＬ１；および
（ｉｉ）アミノ酸配列ＬＶＳ（配列番号１３）もしくはＲＭＳ（配列番号１４）、またはそれらの各々の同等物を含むＬＣ ＣＤＲＬ２；および
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＨＳＲＥＬＰＲＴ（配列番号１５）もしくはＭＱＨＬＥＹＰＹＴ（配列番号１６）、またはそれらの各々の同等物を含むＬＣ ＣＤＲＬ３
を含み；
（ｉｖ）同等物が、前記配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するか、あるいは前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくはその相補体に対して少なくとも８０％同一であるか、または高ストリンジェンシーの条件下で、前記ポリヌクレオチドもしくはその相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、ここで高ストリンジェンシーの条件が、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６倍濃度のＳＳＣ〜約１０倍濃度のＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約４倍濃度のＳＳＣ〜約８倍濃度のＳＳＣの洗浄溶液を含む、
アミノ酸配列を含み、ヒトＨＬＡ−Ｇのエピトープに結合する、ステップと；
（ｂ）前記抗体または前記抗原結合性断片の、ＨＬＡ−Ｇへの結合により形成された複合体を検出するステップと
を含む、方法。
（項目３０）
（ａ）抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメイン；（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達領域および／または４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域；ならびに（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
（項目３１）
抗ＨＬＡ−Ｇ重鎖可変領域、および前記抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の前記抗原結合性ドメインを含む抗ＨＬＡ−Ｇ軽鎖可変領域を含む、項目３０に記載のＣＡＲ。
（項目３２）
前記抗ＨＬＡ−Ｇ重鎖可変領域と、前記抗ＨＬＡ−Ｇ軽鎖可変領域との間に配置されたリンカーポリペプチドをさらに含む、項目３１に記載のＣＡＲ。
（項目３３）
前記抗ＨＬＡ−Ｇ重鎖可変領域が、配列番号１〜６またはそれらの各々の同等物のうちのいずれか１つを含むＣＤＲ領域を含む、項目３１または３２に記載のＣＡＲ。
（項目３４）
前記抗ＨＬＡ−Ｇ重鎖可変領域が、配列番号７〜１０またはそれらの各々の同等物のうちのいずれか１つを含む、項目３１または３２に記載のＣＡＲ。
（項目３５）
前記抗ＨＬＡ−Ｇ軽鎖可変領域が、配列番号１１〜１６またはそれらの各々の同等物のうちのいずれか１つを含むＣＤＲ領域を含む、項目３１または３２に記載のＣＡＲ。
（項目３６）
前記抗ＨＬＡ−Ｇ軽鎖可変領域が、配列番号１７〜２０またはそれらの各々の同等物のうちのいずれか１つを含むＣＤＲ領域を含む、項目３１または３２に記載のＣＡＲ。
（項目３７）
前記抗ＨＬＡ−Ｇ重鎖可変領域および前記抗ＨＬＡ−Ｇ軽鎖可変領域が、グリシン−セリンリンカーによって接続される、項目３１から３６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目３８）
検出可能なマーカーまたは精製マーカーをさらに含む、前記項目のいずれかに記載のＣＡＲ。
（項目３９）
同等物が、ポリペプチドに対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補体と高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含み、ここで高ストリンジェンシーの条件が、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６倍濃度のＳＳＣ〜約１０倍濃度のＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約４倍濃度のＳＳＣ〜約８倍濃度のＳＳＣの洗浄溶液を含む、項目３３から３８のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目４０）
項目３０から３９のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする単離核酸配列またはその相補体またはそれらの各々の同等物。
（項目４１）
抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメインまたはＨＬＡ−Ｇリガンドの上流に配置されたＫｏｚａｋコンセンサス配列をさらに含む、項目４０に記載の単離核酸。
（項目４２）
抗生物質耐性ポリヌクレオチドをさらに含む、項目４０または４１に記載の単離核酸配列。
（項目４３）
項目４０から４２のいずれか一項に記載の単離核酸配列を含むベクター。
（項目４４）
プラスミドである、項目４３に記載のベクター。
（項目４５）
レンチウイルスベクターである、項目４３に記載のベクター。
（項目４６）
項目３０から３９のいずれか一項に記載のＣＡＲ；および／または項目４０から４２のいずれか一項に記載の単離核酸；および／または項目４３から４５のいずれか一項に記載のベクターを含む単離細胞。
（項目４７）
Ｔ細胞である、項目４６に記載の単離細胞。
（項目４８）
ＮＫ細胞である、項目４６に記載の単離細胞。
（項目４９）
項目１から２９のいずれか一項に記載の単離抗体をコードする単離核酸またはその相補体。
（項目５０）
担体と、項目３０から３９のいずれか一項に記載のＣＡＲを含む単離細胞；および／
または項目４０から４２もしくは４９のいずれか一項に記載の単離核酸；および／または項目４３から４５のいずれか一項に記載のベクター；および／または項目４６から４８もしくは１５のいずれか一項に記載の単離細胞；および／または項目１から１２のいずれか一項に記載の抗体；および／または項目１３に記載の抗原結合性断片；および／または項目１４に記載の複合体のうちの１または複数とを含む、組成物。
（項目５１）
ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ発現細胞を作製する方法であって、
（ｉ）単離細胞の集団に、項目３０から４９のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする核酸配列を形質導入するステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記核酸配列の形質導入に成功した、前記単離細胞の亜集団を選択し、これにより、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ発現細胞を作製するステップと
を含む、方法。
（項目５２）
前記単離細胞が、Ｔ細胞およびＮＫ細胞からなる群より選択される、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
腫瘍の増殖の阻害を必要とする対象における腫瘍の増殖を阻害する方法であって、前記対象へと、有効量の、項目４６から４８に記載の単離細胞を投与するステップを含む、方法。
（項目５４）
前記単離細胞が、処置される前記対象に対して自家である、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記腫瘍が、充実性腫瘍、任意選択で、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍、または前立腺がん腫瘍である、項目５３または５４に記載の方法。
（項目５６）
前記腫瘍が、充実性腫瘍である、項目５３から５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
腫瘍細胞が、ＨＬＡ−Ｇを発現または過剰発現させる、項目５３から５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
処置を必要とするがん患者を処置する方法であって、対象へと、有効量の、項目４６から４８に記載の単離細胞を投与するステップを含む、方法。
（項目５９）
前記単離細胞が、処置される前記対象に対して自家である、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
腫瘍が、甲状腺がん、卵巣がん、または前立腺がんである、項目５８または５９に記載の方法。
（項目６１）
がん細胞が、ＨＬＡ−Ｇを発現または過剰発現させる、項目５８から６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記対象が、ヒト患者である、項目５８から６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
患者が、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いのか、高くないのかを決定するための方法であって、前記患者から単離された腫瘍試料を、有効量の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体と接触させるステップと、前記腫瘍試料に結合した任意の抗体の存在を検出するステップとを含み、前記腫瘍試料に結合した抗体の存在は、前記患者が、前記ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いことを指し示し、前記腫瘍試料に結合した抗体の非存在は、前記患者が、前記ＨＬＡ−Ｇ療法に応答する可能性が高くないことを指し示す、方法。
（項目６４）
有効量の前記ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ療法を、前記ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いと決定された前記患者へと投与するステップをさらに含む、項目６３に記載の方法。
図１は、新規に作出された、ヒトＨＬＡ−Ｇに対するモノクローナル抗体についての、フローサイトメトリーによるスクリーニングデータを示す。これらの結果に基づき、ＣＡＲ Ｔ細胞を作出するために、陽性のハイブリドーマ（３Ｈ１１−１２および４Ｅ３−１）のサブクローンを選択した。
図２Ａ〜２Ｄは、ＨＬＡ−ＡＢＣ対照染色を伴う、乳頭状甲状腺がんおよび正常甲状腺組織内の、ＨＬＡ−Ｇ反応性についての免疫組織化学を示す。図２Ａは、抗体４Ｅ３−１を使用する、低倍率（１００倍）のＨＬＡ−Ｇ陽性乳頭状甲状腺癌の切片を示す。図２Ｂは、高倍率（２５０倍）の、ＨＬＡ−Ｇについて陽性である、第２の乳頭状甲状腺癌を示す。図２Ｃは、正常甲状腺組織の、ＨＬＡ−Ｇについての陰性反応性を示し（２５０倍）、図２Ｄは、正常甲状腺組織の、ＨＬＡ−ＡＢＣについての陽性反応性を示す（１００倍）。 図２Ａ〜２Ｄは、ＨＬＡ−ＡＢＣ対照染色を伴う、乳頭状甲状腺がんおよび正常甲状腺組織内の、ＨＬＡ−Ｇ反応性についての免疫組織化学を示す。図２Ａは、抗体４Ｅ３−１を使用する、低倍率（１００倍）のＨＬＡ−Ｇ陽性乳頭状甲状腺癌の切片を示す。図２Ｂは、高倍率（２５０倍）の、ＨＬＡ−Ｇについて陽性である、第２の乳頭状甲状腺癌を示す。図２Ｃは、正常甲状腺組織の、ＨＬＡ−Ｇについての陰性反応性を示し（２５０倍）、図２Ｄは、正常甲状腺組織の、ＨＬＡ−ＡＢＣについての陽性反応性を示す（１００倍）。
図３は、細胞膜内の第３世代の抗ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲの、ＤＮＡ配列および理論構造についての概略図を示す。
図４は、さらなる抗体スクリーニングを、図１で記載した通りに示す。
図５は、遺伝子移入ベクターおよび導入遺伝子についての概略を描示する。遺伝子移入ベクターの骨格は、ＨＩＶ−１ ５’末端反復（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）（ＬＴＲ）およびＨＩＶ−１ ３’末端反復、パッケージングシグナル（Ψ）、ＥＦ１αプロモーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、緑色蛍光タンパク質であるＺｓＧｒｅｅｎ、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびサルウイルス４０起点（ＳＶ４０）を含有する、ＨＩＶベースの、バイシストロニックのレンチウイルスベクターである、ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎである。ＥＦ−１αプロモーターの存在により、ＨＬＡ−Ｇに特異的なｓｃＦＶ、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通領域、ならびにＣＤ２８、４−１ＢＢ、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む導入遺伝子が確実に構成的に発現される。検出タンパク質であるＺｓＧｒｅｅｎの発現は、ＩＲＥＳ領域により実行する。ベクターの組込みは、蛍光顕微鏡法を介して、細胞内のＺｓＧｒｅｅｎの存在によりアッセイすることができる。
図６は、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害を示す。ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲを発現させるＴ細胞の細胞傷害は、方法において記載される、ＬＤＨ細胞傷害キットを使用して決定した。アッセイの前に、Ｔ細胞は、αＣＤ３／ＣＤ８ビーズ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；２ｍｌの培地に対して３０ｕｌ）を使用して活性化させた。活性化Ｔ細胞に、ＨＬＡ−Ｇレンチウイルス粒子を用いて形質導入し、これに続き、αＣＤ３／ＣＤ８ビーズを使用して、Ｔ細胞を活性化させた。形質導入されていない活性化Ｔ細胞およびＴＬＢＲ−２ Ｔリンパ腫細胞株を、対照として使用した。ウェル１つ当たり３，０００個のＳＫＯＶ３またはＴＬＢＲ−２細胞を播種した。ＨＬＡ−Ｇを形質導入されたＴ細胞を、２０：１、１０：１、５：１、および１：１の比（細胞６０，０００〜３，０００個）で、ウェルへと添加した。各データ点は、三連の測定値の平均を表す。
図７は、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲのタンパク質発現を示す。ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲレンチウイルス粒子を用いて形質導入されたＴ細胞は、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲのタンパク質を発現させる。ＣＡＲタンパク質の推定サイズは、６０ｋＤａである。ＣＤ３ζ抗体を使用して、タンパク質を検出した。５０μｇのタンパク質を、ウェスタンブロットのために使用した。β−アクチンを、ローディング対照として使用した。
本開示は、当然ながら変動しうるので、記載される特定の態様に限定されないことを理解されたい。また、本開示の範囲は、付属の特許請求の範囲だけによって限定されるので、本明細書で使用される用語法は、特定の態様について記載することだけを目的とするものであり、限定的であることを意図するものではないことも理解されたい。
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本技術が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本技術の実施または試行では、本明細書で記載される方法および材料と類似または同等の、任意の方法および材料を使用しうるが、ここでは、好ましい方法、デバイス、および材料について記載する。本明細書で引用される全ての技術的刊行物および特許公開は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本技術が、先行発明により、このような開示に先行する権利がないことの容認とはみなされないものとする。
本技術の実施では、そうでないことが指し示されない限りにおいて、当技術分野の技量の範囲内にある、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡについての従来の技法を利用する。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ編（２００１年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、３版；Ａｕｓｕｂｅｌら編（２００７年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙシリーズ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９１年）、ＰＣＲ １： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ内、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９５年）、ＰＣＲ ２： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９９９年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２００５年）、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、５版；Ｇａｉｔ編（１９８４年）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；米国特許第４，６８３，１９５号；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４年）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６年））；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４年）、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編（１９８７年）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍａｋｒｉｄｅｓ編（２００３年）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７年）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）；ならびにＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇら編（１９９６年）、Ｗｅｉｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙを参照されたい。
範囲を含む、全ての数値表示、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、必要に応じて、（＋）もしくは（−）１．０もしくは０．１の増分、または代替的に±１５％、または代替的に１０％、または代替的に５％、または代替的に２％の変動で変わる概数である。常に明示的に言明されているわけではないが、全ての数値表示には、「約」という用語を前置することを理解されたい。また、常に明示的に言明されているわけではないが、本明細書で記載される試薬は、単に例示的なものであり、当技術分野では、このような試薬の同等物が公知であることも理解されたい。
明示的な列挙を伴わないが、そうでないことが意図されない限りにおいて、本技術が、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、または抗体に関する場合、このようなポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、または抗体の、同等物または生物学的同等物が、本技術の範囲内にあることが意図されることを推察されたい。
定義
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」は、そうでないことが文脈により明確に指示されない限りにおいて、複数の指示対象を含む。例えば、「細胞」という用語は、それらの混合物を含む、複数の細胞を含む。
本明細書で使用される場合、「動物」という用語は、例えば、哺乳動物および鳥類を含む類別である、生きている多細胞性の脊椎動物を指す。「哺乳動物」という用語は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方を含む。
本明細書では、「対象」、「宿主」、「個体」、および「患者」という用語は、ヒトおよび獣医学的対象、例えば、ヒト、動物、非ヒト霊長動物、イヌ、ネコ、ヒツジ、マウス、ウマ、およびウシを指すように、互換的に使用される。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、例を目的として、限定せずに述べると、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、これらの組合せと、任意の脊椎動物、例えば、ヒト、ヤギ、ウサギ、およびマウスなどの哺乳動物のほか、サメ免疫グロブリンなど、非哺乳動物種における免疫応答中に産生される同様の分子とを含む、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子をまとめて指す。そうでないことが具体的に言及されない限り、「抗体」という用語は、他の分子への結合を実質的に除外して、目的の分子（または目的の分子と酷似する分子の群）に特異的に結合する、無傷の免疫グロブリンおよび「抗体断片」または「抗原結合性断片」（例えば、目的の分子に対する結合定数が、生物学的試料中の他の分子に対する結合定数を、少なくとも１０３Ｍ−１超えるか、少なくとも１０４Ｍ−１超えるか、または少なくとも１０５Ｍ−１超える抗体および抗体断片）を含む。「抗体」という用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（二特異性抗体など）などの遺伝子操作形態も含む。また、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９４〜１９９５年（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）；Ｋｕｂｙ， Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３版、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９７年も参照されたい。
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、抗体分子またはＴ細胞受容体など、特異的な体液性または細胞性免疫の産物が特異的に結合しうる、化合物、組成物、または物質を指す。抗原は、例えば、ハプテン、単純な中間代謝物、糖（例えば、オリゴ糖）、脂質、およびホルモンのほか、複合炭水化物（例えば、多糖）、リン脂質、およびタンパク質などの高分子を含む、任意の種類の分子でありうる。抗原の一般的な類別は、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原虫および他の寄生生物抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患、アレルギー、および移植片拒絶に関与する抗原、毒素、ならびにその他の抗原を含むがこれらに限定されない。
抗体構造との関連で、免疫グロブリンは、ジスルフィド結合により相互接続された、重（Ｈ）鎖と軽（Ｌ）鎖とを有する。ラムダ（λ）およびカッパ（κ）という、２つの種類の軽鎖が存在する。抗体分子の機能的活性を決定する、５つの主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥが存在する。各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域（領域は「ドメイン」としてもまた公知）を含有する。組み合わせて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とは、抗原に特異的に結合する。軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」ともまた呼ばれる、３つの超可変領域により中断される、「フレームワーク」領域を含有する。フレームワーク領域およびＣＤＲの広がりについては、規定されている（参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ． Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９９１年を参照されたい）。今日では、Ｋａｂａｔによるデータベースは、オンラインで維持されている。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。構成要素である軽鎖および重鎖のフレームワーク領域の組合せである、抗体のフレームワーク領域は、大部分、β−シートコンフォメーションを採用し、ＣＤＲは、ループを形成し、これは、β−シート構造を接続し、場合によって、その一部を形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合的相互作用により、ＣＤＲを、適正な配向性で位置決めする足場を形成するように作用する。
ＣＤＲは主に、抗原のエピトープへの結合を担う。各鎖のＣＤＲは、Ｎ末端から始めて、順に番号付けされる、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称することが典型的であり、また、特定のＣＤＲが配置される鎖により同定されることも典型的である。したがって、ＶＨ ＣＤＲ３が、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメイン内に位置するのに対し、ＶＬ ＣＤＲ１は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメインに由来するＣＤＲ１である。ＬＨＲに結合する抗体は、特異的ＶＨ領域およびＶＬ領域配列を有し、したがって、特異的ＣＤＲ配列を有する。異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する、異なる結合性部位）を伴う抗体は、異なるＣＤＲを有する。抗体によって変動するのはＣＤＲであるが、ＣＤＲ内の限定された数のアミノ酸位置だけが、抗原への結合に直接関与する。ＣＤＲ内のこれらの位置を、特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ぶ。
本明細書で使用される場合、「抗原結合性ドメイン」という用語は、抗原標的に特異的に結合しうる、任意のタンパク質またはポリペプチドドメインを指す。
「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）という用語は、本明細書で使用される場合、抗原に結合することが可能な細胞外ドメインと、細胞外ドメインが由来するポリペプチドとは異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメインと、少なくとも１つの細胞内ドメインとを含む融合タンパク質を指す。「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、場合によって、「キメラ受容体」、「Ｔボディー」、または「キメラ免疫受容体（ＣＩＲ）」と呼ばれる。「抗原に結合することが可能な細胞外ドメイン」とは、ある特定の抗原に結合しうる、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。「細胞内ドメイン」とは、細胞内の生物学的過程の活性化または阻害を引き起こすシグナルを伝達するドメインとして機能することが公知である、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。「膜貫通ドメイン」とは、細胞膜にわたることが公知であり、細胞外ドメインと、シグナル伝達ドメインとを連結するように機能しうる、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。キメラ抗原受容体は、任意選択で、細胞外ドメインと、膜貫通ドメインとの間のリンカーとして用いられる「ヒンジドメイン」を含みうる。本明細書では、各ドメインの構成要素をコードする、非限定的な例示的ポリヌクレオチド配列、例えば、
ヒンジドメイン：ＩｇＧ１重鎖ヒンジ配列、配列番号３８：
ＣＴＣＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＧ
膜貫通ドメイン：ＣＤ２８膜貫通領域、配列番号３９：
ＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧ
細胞内ドメイン：４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域、配列番号４０：
ＡＡＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＧ
細胞内ドメイン：ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達領域、配列番号４１：
ＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＡＴＣＧＣＴＣＣ
細胞内ドメイン：ＣＤ３ゼータシグナル伝達領域、配列番号４２：
が開示される。
各例示的なドメインの構成要素についてのさらなる実施形態は、類似の生物学的機能を有する他のタンパク質であって、上記で開示した核酸配列によりコードされるタンパク質と、少なくとも７０％、または代替的に、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有するタンパク質を含む。さらに、本明細書では、このようなドメインの非限定的な例が提示される。
「組成物」は典型的に、活性薬剤、例えば、化合物または組成物と、希釈剤、結合剤、安定化剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバントなど、不活性（例えば、検出可能な薬剤または標識）または活性な、天然に存在するまたは天然に存在しない担体との組合せを意図し、薬学的に許容される担体を含む。担体はまた、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、および炭水化物（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、およびオリゴ糖を含む糖；アルジトール、アルドン酸、エステル化糖などの誘導体化糖；ならびに多糖または糖ポリマー）などの医薬賦形剤および添加剤も含み、これらは単独または組合せで存在することが可能であり、単独または組合せにより、重量または容量で、１〜９９．９９％を構成する。例示的なタンパク質賦形剤は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清アルブミン、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどを含む。緩衝能においてもまた機能しうる、代表的なアミノ酸／抗体構成要素は、アラニン、アルギニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルタームなどを含む。炭水化物賦形剤もまた、本技術の範囲内において意図されており、その例は、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなどの単糖；ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなどの二糖；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなどの多糖；ならびにマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール ソルビトール（グルシトール）、およびミオイノシトールなどのアルジトールを含むがこれらに限定されない。
本明細書で使用される「コンセンサス配列」という用語は、複数の配列のシリーズをアラインメントすることにより決定されるアミノ酸または核酸配列であり、複数の配列の各対応する位置における、アミノ酸または塩基の主要な選択肢を表す、理想的な配列を規定する、アミノ酸または核酸配列を指す。複数の配列シリーズの配列に基づき、シリーズのコンセンサス配列は、配列の各々と、ゼロ、１つ、少数、またはこれを超える置換により異なりうる。複数の配列シリーズの配列に応じてまた、シリーズの、１つを超えるコンセンサス配列を決定することができる。コンセンサス配列の生成は、精緻な数学的解析下に置かれている。多様なソフトウェアプログラムを使用して、コンセンサス配列を決定することができる。
本明細書で使用される場合、「ＨＬＡ−Ｇ」という用語（Ｂ２ミクログロブリンまたはＭＨＣ−Ｇとしてもまた公知である）は、この名称と関連する特異的分子と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、膜結合型アイソフォーム（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４）、可溶性アイソフォーム（例えば、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６、ＨＬＡ−Ｇ７）、および膜結合型アイソフォームの、タンパク質分解性切断により発生する可溶性形態（例えば、ｓＨＬＡ−Ｇ１）を含むがこれらに限定されない、そのいくつかのアイソフォームのうちのいずれか１つを含むがこれに限定されないＨＬＡ−Ｇと、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。本明細書では、ＨＬＡ−Ｇ配列の例を提示する。加えて、以下のＧｅｎＢａｎｋ受託番号：
ＮＭ＿００２１２７．５ ＸＭ＿００６７１５０８０．１ ＸＭ＿００６７２５０４１．１ ＸＭ＿００６７２５７００．１ ＸＭ＿００６７２５９０９．１
と関連するタンパク質配列は、例示的である。例は、ＮＭ＿００２１２７．５の配列：
ＭＶＶＭＡＰＲＴＬＦＬＬＬＳＧＡＬＴＬＴＥＴＷＡＧＳＨＳＭＲＹＦＳＡＡＶＳＲＰＧＲＧＥＰＲＦＩＡＭＧＹＶＤＤＴＱＦＶＲＦＤＳＤＳＡＣＰＲＭＥＰＲＡＰＷＶＥＱＥＧＰＥＹＷＥＥＥＴＲＮＴＫＡＨＡＱＴＤＲＭＮＬＱＴＬＲＧＹＹＮＱＳＥＡＳＳＨＴＬＱＷＭＩＧＣＤＬＧＳＤＧＲＬＬＲＧＹＥＱＹＡＹＤＧＫＤＹＬＡＬＮＥＤＬＲＳＷＴＡＡＤＴＡＡＱＩＳＫＲＫＣＥＡＡＮＶＡＥＱＲＲＡＹＬＥＧＴＣＶＥＷＬＨＲＹＬＥＮＧＫＥＭＬＱＲＡＤＰＰＫＴＨＶＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＡＥＩＩＬＴＷＱＲＤＧＥＤＱＴＱＤＶＥＬＶＥＴＲＰＡＧＤＧＴＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨＶＱＨＥＧＬＰＥＰＬＭＬＲＷＫＱＳＳＬＰＴＩＰＩＭＧＩＶＡＧＬＶＶＬＡＡＶＶＴＧＡＡＶＡＡＶＬＷＲＫＫＳＳＤである。
上記で列挙したＧｅｎＢａｎｋ受託番号の各々と関連する配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「ＣＤ８αヒンジドメイン」という用語は、この名称と関連する特異的タンパク質断片と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、本明細書で示されるＣＤ８αヒンジドメインの配列と、少なくとも７０％、または代替的に、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。ヒト、マウス、および他の種のＣＤ８αヒンジドメインの配列例は、Ｐｉｎｔｏ， Ｒ． Ｄ．ら（２００６年）、Ｖｅｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．、１１０巻：１６９〜１７７頁において提示されている。ＣＤ８αヒンジドメインと関連する配列は、Ｐｉｎｔｏ， Ｒ． Ｄ．ら（２００６年）、Ｖｅｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．、１１０巻：１６９〜１７７頁において提示されている。このような配列の非限定的な例は、
ヒトＣＤ８アルファヒンジドメイン、配列番号３１：
ＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹ
マウスＣＤ８アルファヒンジドメイン、配列番号３２：
ＫＶＮＳＴＴＴＫＰＶＬＲＴＰＳＰＶＨＰＴＧＴＳＱＰＱＲＰＥＤＣＲＰＲＧＳＶＫＧＴＧＬＤＦＡＣＤＩＹ
ネコＣＤ８アルファヒンジドメイン、配列番号３３：
ＰＶＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＱＡＰＩＴＴＳＱＲＶＳＬＲＰＧＴＣＱＰＳＡＧＳＴＶＥＡＳＧＬＤＬＳＣＤＩＹを含む。
本明細書で使用される場合、「ＣＤ８α膜貫通ドメイン」という用語は、この名称と関連する特異的タンパク質断片と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、本明細書で示されるＣＤ８α膜貫通ドメインの配列と、少なくとも７０％、または代替的に、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。ヒトＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖（ＮＣＢＩ基準配列：ＮＰ＿００１７５９．３）のアミノ酸位置１８３〜２０３、またはマウスＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖（ＮＣＢＩ基準配列：ＮＰ＿００１０７４５７９．１）のアミノ酸位置１９７〜２１７、およびラットＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖（ＮＣＢＩ基準配列：ＮＰ＿１１３７２６．１）のアミノ酸位置１９０〜２１０と関連する断片配列は、ＣＤ８α膜貫通ドメインについてのさらなる配列例を提示する。列挙したＮＣＢＩの各々と関連する配列を、以下の通りに提示する：
ヒトＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン、配列番号３４：ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴ
マウスＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン、配列番号３５：ＩＷＡＰＬＡＧＩＣＶＡＬＬＬＳＬＩＩＴＬＩ
ラットＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン、配列番号３６：ＩＷＡＰＬＡＧＩＣＡＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＩ
本明細書で使用される場合、「ＣＤ２８膜貫通ドメイン」という用語は、この名称と関連する特異的タンパク質断片と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、本明細書で示されるＣＤ２８膜貫通ドメインの配列と、少なくとも７０％、または代替的に、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、または代替的に、少なくとも９５％の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＸＭ＿００６７１２８６２．２およびＸＭ＿００９４４４０５６．１と関連する断片配列は、ＣＤ２８膜貫通ドメインについてのさらなる非限定的配列例を提示する。列挙した受託番号の各々と関連する配列を、配列番号４１によりコードされる配列として提示する。
本明細書で使用される場合、「４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域」という用語は、この名称と関連する特異的タンパク質断片と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、本明細書で示される４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域の配列と、少なくとも７０％、または代替的に、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域の配列例は、米国特許出願公開２０１３０２６６５５１号Ａ１（米国特許出願第１３／８２６，２５８号として出願）において提示されている。米国特許出願第１３／８２６，２５８号において開示されている、関連する４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域の配列を、以下の通りに開示する：
４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域、配列番号３７：
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
本明細書で使用される場合、「ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達領域」という用語は、この名称と関連する特異的タンパク質断片と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、本明細書で示されるＣＤ２８共刺激性シグナル伝達領域の配列と、少なくとも７０％、または代替的に、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。例示的な配列ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインは、米国特許第５，６８６，２８１号；Ｇｅｉｇｅｒ， Ｔ． Ｌ．ら、Ｂｌｏｏｄ、９８巻：２３６４〜２３７１頁（２００１年）；Ｈｏｍｂａｃｈ， Ａ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６７巻：６１２３〜６１３１頁（２００１年）；Ｍａｈｅｒ， Ｊ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０巻：７０〜７５頁（２００２年）；Ｈａｙｎｅｓ， Ｎ． Ｍ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６９巻：５７８０〜５７８６頁（２００２年）；Ｈａｙｎｅｓ， Ｎ． Ｍ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１００巻：３１５５〜３１６３頁（２００２年）において提示されている。非限定的な例は、下記のＣＤ２８配列：ＭＬＲＬＬＬＡＬＮＬ ＦＰＳＩＱＶＴＧＮＫ ＩＬＶＫＱＳＰＭＬＶ ＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣ ＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥ ＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧ ＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳ ＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬ ＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱ ＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹ ＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧ ＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬ ＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳ ＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧ ＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲ ＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤ ＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧ ＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡ ＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号３８）の残基１１４〜２２０、およびそれらの同等物を含む。
本明細書で使用される場合、「ＩＣＯＳ共刺激性シグナル伝達領域」という用語は、この名称と関連する特異的タンパク質断片と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、本明細書で示されるＩＣＯＳ共刺激性シグナル伝達領域の配列と、少なくとも７０％、または代替的に、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。ＩＣＯＳ共刺激性シグナル伝達領域の非限定的な配列例は、米国特許出願公開第２０１５／００１７１４１Ａ１号に提示されており、下記に提示される例示的なポリヌクレオチド配列を含む。
ＩＣＯＳ共刺激性シグナル伝達領域、配列番号４３：
ＡＣＡＡＡＡＡＡＧＡ ＡＧＴＡＴＴＣＡＴＣ ＣＡＧＴＧＴＧＣＡＣ ＧＡＣＣＣＴＡＡＣＧ ＧＴＧＡＡＴＡＣＡＴ ＧＴＴＣＡＴＧＡＧＡ ＧＣＡＧＴＧＡＡＣＡ ＣＡＧＣＣＡＡＡＡＡ ＡＴＣＣＡＧＡＣＴＣ ＡＣＡＧＡＴＧＴＧＡ ＣＣＣＴＡ
本明細書で使用される場合、「ＯＸ４０共刺激性シグナル伝達領域」という用語は、この名称と関連する特異的タンパク質断片と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、本明細書で示されるＯＸ４０共刺激性シグナル伝達領域の配列と、少なくとも７０％、または代替的に、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、または代替的に、９０％の配列同一性、または代替的に、少なくとも９５％の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。ＯＸ４０共刺激性シグナル伝達領域の非限定的な配列例は、米国特許出願公開第２０１２／２０１４８５５２Ａ１号に開示されており、下記に提示される、例示的な配列を含む。
ＯＸ４０共刺激性シグナル伝達領域、配列番号４４：
ＡＧＧＧＡＣＣＡＧ ＡＧＧＣＴＧＣＣＣＣ ＣＣＧＡＴＧＣＣＣＡ ＣＡＡＧＣＣＣＣＣＴ ＧＧＧＧＧＡＧＧＣＡ ＧＴＴＴＣＣＧＧＡＣ ＣＣＣＣＡＴＣＣＡＡ ＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧ ＣＣＧＡＣＧＣＣＣＡ ＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧ ＧＣＣＡＡＧＡＴＣ
本明細書で使用される場合、「ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン」という用語は、この名称と関連する特異的タンパク質断片と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、本明細書で示されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインの配列と、少なくとも７０％、または代替的に、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインの配列例は、米国特許出願第１３／８２６，２５８号において提示されている。ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインと関連する配列を、以下の通りに列挙する：
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
本明細書で使用される場合、「Ｂ細胞」という用語は、獲得性免疫系の体液性免疫におけるリンパ球の種類を指す。Ｂ細胞は主に、抗体を作り、抗原提示細胞として用いられ、サイトカインを放出し、抗原との相互作用による活性化の後で、メモリーＢ細胞を発生させるように機能する。Ｂ細胞は、Ｔ細胞など、他のリンパ球から、細胞表面上のＢ細胞受容体の存在により識別される。Ｂ細胞は、単離することもでき、市販の供給源から得ることもできる。市販のＢ細胞株の非限定的な例は、細胞株である、ＡＨＨ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−８１４６（商標））、ＢＣ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２２３０（商標））、ＢＣ−２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２２３１（商標））、ＢＣ−３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２２７７（商標））、ＣＡ４６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１６４８（商標））、ＤＧ−７５［Ｄ．Ｇ．−７５］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２６２５（商標））、ＤＳ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１１１０２（商標））、ＥＢ−３［ＥＢ３］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−８５（商標））、Ｚ−１３８（ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ−３００１）、ＤＢ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２８９）、Ｔｏｌｅｄｏ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６３１）、Ｐｆｉｆｆｅｒ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６３２）、ＳＲ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２６２）、ＪＭ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１０４２１）、ＮＦＳ−５ Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６９３）；ＮＦＳ−７０ Ｃ１０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６９４）、ＮＦＳ−２５ Ｃ−３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６９５）、およびＳＵＰ−Ｂ１５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１９２９）を含む。さらなる例は、未分化大細胞リンパ腫に由来する細胞株、例えば、ＤＥＬ、ＤＬ−４０、ＦＥ−ＰＤ、ＪＢ６、Ｋａｒｐａｓ ２９９、Ｋｉ−ＪＫ、Ｍａｃ−２Ａ Ｐｌｙ１、ＳＲ−７８６、ＳＵ−ＤＨＬ−１、ＳＵ−ＤＨＬ−２、ＳＵ−ＤＨＬ−４、ＳＵ−ＤＨＬ−５、ＳＵ−ＤＨＬ−６、ＳＵ−ＤＨＬ−７、ＳＵ−ＤＨＬ−８、ＳＵ−ＤＨＬ−９、ＳＵ−ＤＨＬ−１０、およびＳＵ−ＤＨＬ−１６、ＤＯＨＨ−２、ＮＵ−ＤＨＬ−１、Ｕ−９３７、Ｇｒａｎｄａ ５１９、ＵＳＣ−ＤＨＬ−１、ＲＬ；ホジキンリンパ腫に由来する細胞株、例えば、ＤＥＶ、ＨＤ−７０、ＨＤＬＭ−２、ＨＤ−ＭｙＺ、ＨＫＢ−１、ＫＭ−Ｈ２、Ｌ ４２８、Ｌ ５４０、Ｌ１２３６、ＳＢＨ−１、ＳＵＰ−ＨＤ１、ＳＵ／ＲＨ−ＨＤ−１を含むがこれらに限定されない。このような市販の細胞株の非限定的な例示的供給源は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎすなわちＡＴＣＣ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）およびＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／）を含む。
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」という用語は、胸腺内で成熟するリンパ球の種類を指す。Ｔ細胞は、細胞媒介性免疫において重要な役割を果たし、Ｂ細胞など、他のリンパ球から、細胞表面上のＴ細胞受容体の存在により識別される。Ｔ細胞は、単離することもでき、市販の供給源から得ることもできる。「Ｔ細胞」は、ＣＤ３を発現させる、全ての種類の免疫細胞であって、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、およびガンマ−デルタＴ細胞を含む免疫細胞を含む。「細胞傷害性細胞」は、細胞傷害応答を媒介することが可能な細胞である、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および好中球を含む。市販のＴ細胞株の非限定的な例は、細胞株である、ＢＣＬ２（ＡＡＡ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０２（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ７０Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９００（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ８７Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０１（商標））、ＢＣＬ２ Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９９（商標））、Ｎｅｏ Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９８（商標））、ＴＡＬＬ−１０４ヒト細胞傷害性Ｔ細胞株（ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ−１１３８６）を含む。さらなる例は、例えば、Ｄｅｇｌｉｓ、ＥＢＴ−８、ＨＰＢ−ＭＬｐ−Ｗ、ＨＵＴ ７８、ＨＵＴ １０２、Ｋａｒｐａｓ ３８４、Ｋｉ ２２５、Ｍｙ−Ｌａ、Ｓｅ−Ａｘ、ＳＫＷ−３、ＳＭＺ−１、およびＴ３４などの成熟Ｔ細胞株；ならびに未成熟Ｔ細胞株、例えば、ＡＬＬ−ＳＩＬ、Ｂｅ１３、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＣＭＬ−Ｔ１、ＤＮＤ−４１、ＤＵ．５２８、ＥＵ−９、ＨＤ−Ｍａｒ、ＨＰＢ−ＡＬＬ、Ｈ−ＳＢ２、ＨＴ−１、ＪＫ−Ｔ１、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋａｒｐａｓ ４５、ＫＥ−３７、ＫＯＰＴ−Ｋ１、Ｋ−Ｔ１、Ｌ−ＫＡＷ、Ｌｏｕｃｙ、ＭＡＴ、ＭＯＬＴ−１、ＭＯＬＴ ３、ＭＯＬＴ−４、ＭＯＬＴ １３、ＭＯＬＴ−１６、ＭＴ−１、ＭＴ−ＡＬＬ、Ｐ１２／Ｉｃｈｉｋａｗａ、Ｐｅｅｒ、ＰＥＲ０１１７、ＰＥＲ−２５５、ＰＦ−３８２、ＰＦＩ−２８５、ＲＰＭＩ−８４０２、ＳＴ−４、ＳＵＰ−Ｔ１〜ＳＵＰ−Ｔ１４、ＴＡＬＬ−１、ＴＡＬＬ−１０１、ＴＡＬＬ−１０３／２、ＴＡＬＬ−１０４、ＴＡＬＬ−１０５、ＴＡＬＬ−１０６、ＴＡＬＬ−１０７、ＴＡＬＬ−１９７、ＴＫ−６、ＴＬＢＲ−１、ＴＬＢＲ−２、ＴＬＢＲ−３、およびＴＬＢＲ−４、ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２（ＣＣＬ−１２０．１）、Ｊ．ＲＴ３−Ｔ３．５（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５３）、Ｊ４５．０１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１９９０）、Ｊ．ＣａＭ１．６（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２０６３）、ＲＳ４；１１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１８７３）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ＡＴＣＣ ＣＲＭ−ＣＣＬ−１１９）；ならびに皮膚Ｔ細胞リンパ腫細胞株、例えば、ＨｕＴ７８（ＡＴＣＣ ＣＲＭ−ＴＩＢ−１６１）、ＭＪ［Ｇ１１］（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８２９４）、ＨｕＴ１０２（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１６２）を含むがこれらに限定されない。ＲＥＨ、ＮＡＬＬ−１、ＫＭ−３、Ｌ９２−２２１を含むがこれらに限定されないヌル白血病細胞株は、Ｋ５６２赤白血病、ＴＨＰ−１単球性白血病、Ｕ９３７リンパ腫、ＨＥＬ赤白血病、ＨＬ６０白血病、ＨＭＣ−１白血病、ＫＧ−１白血病、Ｕ２６６骨髄腫などの他の白血病およびリンパ腫に由来する細胞株と同様、免疫細胞の、別の市販の供給源である。このような市販の細胞株の非限定的な例示的供給源は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎすなわちＡＴＣＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）およびＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／）を含む。
本明細書で使用される場合、ナチュラルキラー細胞としてもまた公知の「ＮＫ細胞」という用語は、骨髄に由来し、生得性免疫系において極めて重要な役割を果たすリンパ球の種類を指す。ＮＫ細胞は、抗体および細胞表面上の主要組織適合性複合体の非存在下であってもなお、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞、またはストレスを受けた他の細胞に対して、迅速な免疫応答をもたらす。ＮＫ細胞は、単離することもでき、市販の供給源から得ることもできる。市販のＮＫ細胞株の非限定的な例は、細胞株である、ＮＫ−９２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２４０７（商標））、ＮＫ−９２ＭＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２４０８（商標））を含む。さらなる例は、ＮＫ細胞株である、ＨＡＮＫ１、ＫＨＹＧ−１、ＮＫＬ、ＮＫ−ＹＳ、ＮＯＩ−９０、およびＹＴを含むがこれらに限定されない。このような市販の細胞株の非限定的な例示的供給源は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎすなわちＡＴＣＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）およびＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／）を含む。
本明細書で使用される場合、「核酸配列」および「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドであれ、デオキシリボヌクレオチドであれ、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すように互換的に使用される。したがって、この用語は、一本鎖、二本鎖、または多重鎖の、ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド体、あるいはプリンおよびピリミジン塩基、または他の天然のヌクレオチド塩基、化学的もしくは生化学的に修飾されたヌクレオチド塩基、非天然のヌクレオチド塩基、または誘導体化ヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むがこれらに限定されない。
核酸配列へと適用される場合の、「〜をコードする」という用語は、その天然状態にあるか、または当業者に周知の方法により操作されるときに、ポリペプチドおよび／またはその断片のｍＲＮＡを産生するように転写および／または翻訳されうる場合、ポリペプチド「をコードする」と言われるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖とは、このような核酸の相補体であり、ここから、コード配列を推定することができる。
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、プラスミド、ウイルス、コスミド、ファージ、ＢＡＣ、ＹＡＣなどを含むがこれらに限定されない、異なる宿主間の移入のためにデザインされた核酸構築物を指す。一部の実施形態では、プラスミドベクターは、市販のベクターから調製することができる。他の実施形態では、ウイルスベクターは、当技術分野で公知の技法に従い、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶなどから作製することができる。一実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、遺伝子など、コード配列の発現を調節する、任意の配列を指す。プロモーターは、例えば、構成的、誘導的、抑制的、または組織特異的でありうる。「プロモーター」とは、転写の開始および速度を制御するポリヌクレオチド配列の領域である、制御配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および分子が結合しうる遺伝子エレメントを含有しうる。
本明細書で使用される場合、「単離細胞」という用語は一般に、組織の他の細胞から実質的に分離された細胞を指す。「免疫細胞」とは、例えば、骨髄中で産生される造血幹細胞（ＨＳＣ）、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）、および骨髄由来細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）に由来する白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ））を含む。「Ｔ細胞」とは、ＣＤ３を発現させる、全ての種類の免疫細胞であって、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、およびガンマ−デルタＴ細胞を含む免疫細胞を含む。「細胞傷害性細胞」とは、細胞傷害応答を媒介することが可能な細胞である、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および好中球を含む。
キメラ抗原受容体細胞の作製に適用される場合の、「形質導入する」または「形質導入」という用語は、外来のヌクレオチド配列を、細胞へと導入する工程を指す。一部の実施形態では、この形質導入は、ベクターを介して行う。
本明細書で使用される場合、細胞に言及して「自家」という用語は、同じ対象（レシピエントまたは宿主）から単離され、注入し戻される細胞を指す。「同種」とは、非自家細胞を指す。
「有効（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）量」または「有効（ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ）量」とは、薬剤の量、または２つもしくはこれを超える薬剤の組合せ量であって、哺乳動物または他の対象を処置するために投与されると、疾患のためのこのような処置を施すのに十分である、量または組合せ量を指す。「有効（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）量」とは、薬剤、疾患およびその重症度、ならびに処置される対象の年齢、体重などに応じて変動するであろう。
「充実性腫瘍」とは、通例、嚢胞も液体領域も含有しない、組織の異常な塊である。充実性腫瘍は、良性の場合もあり、悪性の場合もある。異なる種類の充実性腫瘍は、それらを形成する細胞型にちなんで名付けられている。充実性腫瘍の例は、肉腫、癌腫、およびリンパ腫を含む。
「卵巣がん」という用語は、卵巣の組織内で形成されるがんの種類であり、がん内の細胞を、体の他の部分に浸潤するか、またはこれらへと拡散する能力により、宿主生物に対して病的とする、悪性の形質転換を経たがんの種類を指す。本明細書における卵巣がんは、組織学的グレードが低度なＩ型がんと、組織学的グレードが高度なＩＩ型がんとを含む。特に、卵巣がんは、上皮性癌、漿液性癌、明細胞癌、性索間質腫瘍、生殖細胞腫瘍、未分化胚細胞腫、混合腫瘍、続発性卵巣がん、低悪性度潜在性腫瘍を含むがこれらに限定されない。
「前立腺がん」という用語は、男性生殖系内の腺である、前立腺内で発生するがんの種類を指す。本明細書における前立腺がんは、腺癌、肉腫、小細胞癌、神経内分泌腫瘍、移行上皮癌を含むがこれらに限定されない。
「甲状腺がん」という用語は、甲状腺内で発生するがんの種類を指す。
本明細書で使用される場合、「〜を含むこと」という用語は、組成物および方法が、列挙される要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味するように意図される。組成物および方法を規定するのに使用される場合の「〜から本質的になること」とは、意図される使用のための組合せにとって本質的に重要な他の要素を除外することを意味するものとする。例えば、本明細書で規定される通り、要素から本質的になる組成物は、単離および精製法、ならびにリン酸緩衝食塩水、保存剤など、薬学的に許容される担体から、微量の夾雑物を除外しないであろう。「〜からなること」とは、本明細書で開示される組成物を投与するための、微量を超える他の成分の要素、および実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これらの移行句の各々により規定される態様は、本開示の範囲内にある。
本明細書で使用される場合、「検出可能なマーカー」という用語は、直接的にまたは間接的に、検出可能なシグナルを発生させることが可能な、少なくとも１つのマーカーを指す。このマーカーの非網羅的なリストは、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼなどの、例えば比色定量、蛍光、発光による検出可能なシグナルを発生させる酵素、蛍光、発光色素などの発色団、電子顕微鏡法、または伝導性、電流滴定、ボルタンメトリー、インピーダンスなど、それらの電気的特性により検出される電子密度を伴う群、例えば、それらの分子が、それらの物理的および／または化学的特性の、検出可能な修飾を誘導するのに十分なサイズである、検出可能な群を含み、このような検出は、回折、表面プラズモン共鳴、表面の変動、接触角の変化などの光学法、または原子間力分光法、トンネル効果などの物理学的方法、または３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉなどの放射性分子により達成することができる。
本明細書で使用される場合、「精製マーカー」という用語は、精製または同定に有用な、少なくとも１つのマーカーを指す。このマーカーの非網羅的なリストは、Ｈｉｓ、ｌａｃＺ、ＧＳＴ、マルトース結合性タンパク質、ＮｕｓＡ、ＢＣＣＰ、ｃ−ｍｙｃ、ＣａＭ、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｃｈｅｒｒｙ、チオレドキシン、ｐｏｌｙ（ＮＡＮＰ）、Ｖ５、Ｓｎａｐ、ＨＡ、キチン結合性タンパク質、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、またはＳタンパク質を含む。適切な直接的または間接的蛍光マーカーは、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｃｈｅｒｒｙ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＤＮＰ、ＡＭＣＡ、ビオチン、ジゴキシゲニン、Ｔａｍｒａ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ローダミン、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、または他の任意の蛍光色素もしくはハプテンを含む。
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡへと転写される過程および／または転写されたｍＲＮＡが、その後、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質へと翻訳される過程を指す。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞内のｍＲＮＡのスプライシングを含みうる。遺伝子の発現レベルは、細胞または組織試料中のｍＲＮＡまたはタンパク質の量を測定することにより決定することができる。一態様では、１つの試料に由来する遺伝子の発現レベルを、対照または基準試料に由来する、この遺伝子の発現レベルと直接比較することができる。別の態様では、１つの試料に由来する遺伝子の発現レベルを、化合物の投与後に、同じ試料に由来するこの遺伝子の発現レベルと直接比較することができる。
本明細書で使用される場合、「相同性」または「同一な」、「同一性」パーセントまたは「類似性」パーセントとは、２つまたはこれを超える核酸配列またはポリペプチド配列の文脈で使用される場合、２つまたはこれを超える配列または部分配列であって、同じであるか、または指定された百分率の、同じヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有する配列または部分配列、例えば、指定された領域（例えば、本明細書で記載される抗体をコードするヌクレオチド配列または本明細書で記載される抗体のアミノ酸配列）にわたり、少なくとも６０％の同一性、好ましくは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはこれを超える同一性を有する配列または部分配列を指す。相同性は、比較を目的としてアラインメントされうる、各配列内の位置を比較することにより決定することができる。比較される配列内の位置が、同じ塩基またはアミノ酸により占有される場合、分子は、この位置において相同である。配列間の相同性の程度は、配列により共有される、マッチする位置または相同な位置の数の関数である。アラインメントおよび相同性パーセントまたは配列同一性パーセントは、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年）、補遺３０巻、７．７．１８節、表７．７．１において記載されているソフトウェアプログラムを使用して決定することができる。アラインメントのためには、デフォルトのパラメータを使用することが好ましい。好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトのパラメータを使用するＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトのパラメータ：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０の配列；ソート＝高スコア；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを使用する、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである。これらのプログラムの詳細については、以下のインターネットアドレス：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴにおいて見出すことができる。「相同性」または「同一な」、「同一性」パーセントまたは「類似性」パーセントという用語はまた、被験配列の相補体も指すか、またはこれに適用することもできる。用語はまた、欠失および／または付加を有する配列のほか、置換を有する配列も含む。本明細書で記載される通り、好ましいアルゴリズムは、ギャップなどに対処しうる。好ましくは、同一性は、少なくとも約２５アミノ酸もしくはヌクレオチドの長さである領域にわたり存在するか、またはより好ましくは少なくとも５０〜１００アミノ酸もしくはヌクレオチドの長さである領域にわたり存在する。「非類縁の」または「非相同な」配列は、本明細書で開示される配列のうちの１つと、４０％未満の同一性、または代替的に２５％未満の同一性を共有する。
「第１選択」または「第２選択」または「第３選択」という語句は、患者により受容される処置の順序を指す。第１選択治療レジメンは、最初に施される処置であるのに対し、第２または第３選択治療は、それぞれ、第１選択治療の後、または第２選択治療の後で施される。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅは、第１選択治療を、「疾患または状態のための最初の処置」として規定している。がんを伴う患者では、一次処置は、手術、化学療法、放射線療法、またはこれらの治療の組合せでありうる。当業者はまた、第１選択治療を、「一次治療および一次処置」とも称する。２００８年５月１日が最後の閲覧日である、ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖにおけるＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトを参照されたい。患者が、第１選択治療に対して、ポジティブな臨床応答を示さなかったか、または不顕性の応答を示したか、または第１選択治療を停止しているために、患者には、その後の化学療法レジメンを施すのが典型的である。
一態様では、抗体の「同等物」または「生物学的同等物」という用語は、抗体が、そのエピトープタンパク質またはその断片に選択的に結合する能力であって、ＥＬＩＳＡまたは他の適切な方法により測定される能力を意味する。生物学的に同等な抗体は、基準抗体と同じエピトープに結合する、抗体、ペプチド、抗体断片、抗体の改変体、抗体の誘導体、および抗体の模倣体（ｍｉｍｅｔｉｃ）を含むがこれらに限定されない。
明示的な列挙を伴わないが、そうでないことが意図されない限りにおいて、本開示が、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、または抗体に関する場合、このようなポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、または抗体の、同等物または生物学的同等物は、本開示の範囲内にあることが意図されることを推察されたい。本明細書で使用される場合、「その生物学的同等物」という用語は、基準タンパク質、抗体、ポリペプチド、または核酸に言及する場合、「その同等物」と同義であることを意図し、所望の構造または機能性をなおも維持しながら、最小限の相同性を有する、タンパク質、抗体、ポリペプチド、または核酸を意図する。本明細書で具体的に列挙されない限りにおいて、本明細書で言及される、任意のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはタンパク質はまた、その同等物も含むことが想定される。例えば、同等物は、少なくとも約７０％の相同性もしくは同一性、または少なくとも８０％の相同性もしくは同一性、または代替的に少なくとも約８５％、または代替的に少なくとも約９０％、または代替的に少なくとも約９５％、または代替的に９８％の相同性パーセントもしくは同一性パーセントを意図し、基準タンパク質、ポリペプチド、または核酸と実質的に同等な生体活性を呈する。代替的に、ポリヌクレオチドに言及する場合、その同等物は、ストリンジェントな条件下で、基準ポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
別の配列と、ある特定の百分率（例えば、８０％、８５％、９０％、または９５％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）とは、アラインメントし、２つの配列を比較するときに、その百分率の塩基（またはアミノ酸）が同じであることを意味する。アラインメントおよび相同性パーセントまたは配列同一性パーセントは、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年）、補遺３０巻、７．７．１８節、表７．７．１において記載されているソフトウェアプログラムを使用して決定することができる。アラインメントのためには、デフォルトのパラメータを使用することが好ましい。好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトのパラメータを使用するＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトのパラメータ：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０の配列；ソート＝高スコア；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを使用する、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである。これらのプログラムの詳細については、以下のインターネットアドレス：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴにおいて見出すことができる。
「ハイブリダイゼーション」とは、１または複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化する複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソンクリック塩基対合により生じる場合もあり、フーグスティーン結合により生じる場合もあり、他の任意の配列特異的な形で生じる場合もある。複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３つもしくはこれを超える鎖、自己ハイブリダイズする一本鎖、またはこれらの任意の組合せを含みうる。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断など、より広範な工程内のステップを構成しうる。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６倍濃度のＳＳＣ〜約１０倍濃度のＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約４倍濃度のＳＳＣ〜約８倍濃度のＳＳＣの洗浄溶液を含む。中程度のハイブリダイゼーション条件の例は、約４０℃〜約５０℃のインキュベーション温度；約９倍濃度のＳＳＣ〜約２倍濃度のＳＳＣの緩衝液濃度；約３０％〜約５０％のホルムアミド濃度；および約５倍濃度のＳＳＣ〜約２倍濃度のＳＳＣの洗浄溶液を含む。高ストリンジェンシー条件の例は、約５５℃〜約６８℃のインキュベーション温度；約１倍濃度のＳＳＣ〜約０．１倍濃度のＳＳＣの緩衝液濃度；約５５％〜約７５％のホルムアミド濃度；および約１倍濃度のＳＳＣ、０．１倍濃度のＳＳＣ、または脱イオン水の洗浄溶液を含む。一般に、ハイブリダイゼーションインキュベーション時間は、５分間〜２４時間であり、１つ、２つ、またはこれを超える洗浄ステップを伴い、洗浄インキュベーション時間は、約１、２、または１５分間である。ＳＳＣとは、０．１５ＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸緩衝液である。他の緩衝液系を使用する、ＳＳＣの同等物も利用しうることが理解される。
「腫瘍組織型に対応する正常細胞」とは、腫瘍組織と同じ組織型に由来する正常細胞を指す。非限定的な例は、肺腫瘍を有する患者に由来する正常肺細胞、または結腸腫瘍を有する患者に由来する正常結腸細胞である。
本明細書で使用される「単離された」という用語は、他の材料を実質的に含まない、分子または生物学的薬剤または細胞材料を指す。一態様では、「単離された」という用語は、天然の供給源中に存在する、他のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはタンパク質もしくはポリペプチド、または細胞もしくは細胞小器官、または組織もしくは器官のそれぞれから分離された、ＤＮＡもしくはＲＮＡなどの核酸、またはタンパク質もしくはポリペプチド（例えば、抗体またはその誘導体）、または細胞もしくは細胞小器官、または組織もしくは器官を指す。「単離された」という用語はまた、組換えＤＮＡ法により作製される場合、細胞材料、ウイルス材料、もしくは培養培地を実質的に含まない核酸もしくはペプチド、または化学合成される場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸もしくはペプチドも指す。さらに、「単離核酸」とは、断片としては天然に存在しておらず、天然の状態では見出されない核酸断片を含むことを意図する。本明細書では、「単離された」という用語はまた、他の細胞性タンパク質から単離されたポリペプチドを指すようにも使用され、精製ポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を包含することを意図する。本明細書では、「単離された」という用語はまた、他の細胞または組織から単離された細胞または組織を指すようにも使用され、培養細胞または培養組織および操作細胞または操作組織の両方を包含することを意図する。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、Ｂリンパ球の単一のクローン、または単一の抗体の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子をトランスフェクトした細胞により産生される抗体を指す。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法、例えば、ハイブリッドの抗体形成細胞を、骨髄腫細胞の、脾臓免疫細胞との融合体から作ることにより作製する。モノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体を含む。
「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」という用語は、２つまたはこれを超えるサブユニットのアミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチド模倣体の化合物を指すように、互換的に、かつ、それらの最も広い意味で使用する。サブユニットは、ペプチド結合で連結することができる。別の実施形態では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどで連結することができる。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならないが、アミノ酸の最大数には、限定がなされず、タンパク質の配列を含む場合もあり、ペプチドの配列を含む場合もある。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシン、ならびにＤ光学異性体およびＬ光学異性体の両方、アミノ酸類似体およびペプチド模倣体を含む、天然および／または非天然もしくは合成のアミノ酸を指す。
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体である、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することが可能であり、公知または未知の任意の機能を果たしうる。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含みうる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブリーの前に付与することもでき、その後に付与することもできる。ヌクレオチドの配列は、ヌクレオチド以外の構成要素で中断させることができる。ポリヌクレオチドは、標識化構成要素とのコンジュゲーションを介するなど、重合化の後でさらに修飾することができる。用語はまた、二本鎖分子および一本鎖分子の両方を指す。そうでないことが指定または要求されない限りにおいて、ポリヌクレオチドである本技術の任意の態様は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが公知であるかまたは予測される、２つの相補的な一本鎖形態の各々との両方を包含する。
本明細書で使用される場合、「精製された」という用語は、絶対的な純度を要求するのではなく、相対的な用語として意図されている。したがって、例えば、精製された核酸、ペプチド、タンパク質、生物学的複合体、または他の活性化合物とは、全部または一部において、タンパク質または他の夾雑物から単離された、核酸、ペプチド、タンパク質、生物学的複合体、または他の活性化合物である。一般に、本開示の範囲内の使用のための、実質的に精製されたペプチド、タンパク質、生物学的複合体、または他の活性化合物は、ペプチド、タンパク質、生物学的複合体、または他の活性化合物の、治療的投与のための完全医薬製剤中の、医薬担体、賦形剤、緩衝液、吸収増強剤、安定化剤、保存剤、アジュバントまたは他の共成分（ｃｏ−ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）との混合または製剤化の前に、調製物中に存在する、全ての高分子種のうちの８０％超を構成する。より典型的には、ペプチド、タンパク質、生物学的複合体、または他の活性化合物は、他の製剤成分との混合の前に、精製調製物中に存在する、全ての高分子種のうちの９０％超、しばしば９５％超を表すように精製する。他の場合、精製調製物は、本質的に均質であることが可能であり、この場合、従来の技法では、他の高分子種は、検出可能でない。
本明細書で使用される場合、「特異的結合」という用語は、抗体と抗原との、少なくとも１０−６Ｍの結合アフィニティーによる接触を意味する。ある特定の態様では、抗体は、少なくとも約１０−７Ｍ、好ましくは、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍのアフィニティーで結合する。
本明細書で使用される場合、「組換えタンパク質」という用語は、組換えＤＮＡ法により作製されるポリペプチドを指し、この場合、一般に、ポリペプチドをコードするＤＮＡを、適切な発現ベクターへと挿入し、次にこれを使用して、異種タンパク質を作製するように、宿主細胞を形質転換する。
本明細書で使用される場合、対象における疾患「を処置すること」またはその「処置」とは、（１）疾患の素因があるか、もしくはその症状をいまだ提示していない対象において、症状もしくは疾患が生じることを防止すること；（２）疾患を阻害するか、もしくはその発症を停止させること；または（３）疾患もしくは疾患の症状を改善するか、もしくは退縮を引き起こすことを指す。当技術分野で理解される通り、「処置」とは、臨床結果を含む、有益なまたは所望の結果を得るための手法である。本技術の目的では、有益なまたは所望の結果は、検出可能であれ、検出不能であれ、１または複数の症状の緩和または改善、状態（疾患を含む）の広がりの減殺、状態（疾患を含む）の安定した（すなわち、増悪させない）状況、状態（疾患を含む）の進行の遅延または緩徐化、状態（疾患を含む）の改善または軽減、および寛解（部分的であれ、完全であれ）のうちの１または複数を含みうるがこれらに限定されない。
本明細書で使用される場合、細胞、組織、または器官に関して、「〜を過剰発現させる」という用語は、タンパク質を、対照細胞、対照組織、または器官内で産生される量を超える量まで発現させることを意味する。過剰発現するタンパク質は、宿主細胞に対して内因性の場合もあり、宿主細胞に対して外因性の場合もある。
本明細書で使用される場合、「リンカー配列」という用語は、１〜１０回、または代替的に、１〜約８回、または代替的に、１〜約６回、または代替的に、約５もしくは４回、または代替的に、３回、または代替的に、２回反復されうる、１〜１０、または代替的に、８アミノ酸、または代替的に、６アミノ酸、または代替的に、５アミノ酸を含む、任意のアミノ酸配列に関する。例えば、リンカーは、３回反復されるペンタペプチドからなる、最大で１５アミノ酸残基を含みうる。一態様では、リンカー配列は、ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒの３つのコピーを含む、（グリシン４セリン）３の可撓性ポリペプチドリンカーである。
本明細書で使用される場合、「エンハンサー」という用語は、発現させる核酸配列との関連における、その場所および配向性に関わらず、核酸配列の転写を増進、改良、または改善する配列エレメントを表す。エンハンサーは、単一のプロモーターからの転写を増強する場合もあり、１つを超えるプロモーターからの転写を同時に増強する場合もある。転写を改良するこの機能性が、保持されるか、または実質的に保持される（例えば、野生型活性、すなわち全長配列の活性の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％）限りにおいて、野生型エンハンサー配列の、任意の切断された、変異された、またはこれら以外の修飾された改変体もまた、上記の規定の範囲内にある。
本明細書で使用される場合、「ＷＰＲＥ」または「ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント」という用語は、この名称と関連する特異的ヌクレオチド断片と、類似の生物学的機能を有し、本明細書で示されるＷＰＲＥ配列と、少なくとも７０％、または代替的に、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。例えば、ＷＰＲＥとは、ウッドチャック肝炎ウイルスゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｊ０４５１４）内に存在する、ヒトＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＢＶＰＲＥ）と同様の領域を指し、このゲノムの配列のうちの、１０９３〜１６８４位の５９２ヌクレオチドが、転写後調節領域に対応することを指す（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７２巻、５０８５〜５０９２頁、１９９８年）。レトロウイルスベクターを使用する解析は、目的の遺伝子の３’末端非翻訳領域へと挿入されたＷＰＲＥが、産生されるタンパク質の量を、５〜８倍増大させることを明らかにした。また、ＷＰＲＥの導入が、ｍＲＮＡの分解を抑制することも報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７３巻、２８８６〜２８９２頁、１９９９年）。広い意味では、ｍＲＮＡを安定化させることにより、アミノ酸への翻訳の効率を増大させる、ＷＰＲＥなどのエレメントもまた、エンハンサーであると考えられる。
略語一覧
ＣＡＲ：キメラ抗原受容体
ＨＬＡ：組織適合性リンパ球抗原
Ｉｐ：腹膜内
ＩＲＥＳ：内部リボソーム侵入部位
ＭＦＩ：平均蛍光強度
ＭＯＩ：感染多重度
ＰＢＭＣ：末梢血単核細胞
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
ｓｃＦｖ：単鎖可変断片
ＷＰＲＥ：ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント
上記で列挙したＧｅｎＢａｎｋ受託番号、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号、および参考文献の各々と関連する配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示を実行するための様態
遺伝子操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞による自家処置を使用して、Ｂ細胞リンパ腫および白血病において最近得られつつある、いまだかつてない結果のために（Ｍａｕｄｅ， Ｓ． Ｌ．ら（２０１４年）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．、３７１巻：１５０７〜１５１７頁；Ｐｏｒｔｅｒ， Ｄ． Ｌ．ら（２０１１年）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．、３６５巻：７２５〜７３３頁）、いくつかの研究室が、この手法を、卵巣がん、前立腺がん、および膵臓腫瘍を含む充実性腫瘍に適用し始めている。ＣＡＲ改変Ｔ細胞は、モノクローナル抗体の、ＨＬＡに依存しないターゲティング特異性を、活性化Ｔ細胞の細胞溶解活性、増殖およびホーミング特性と組み合わせるが、チェックポイント抑制に応答しない。抗原を発現させる標的を直接死滅させるそれらの能力のために、ＣＡＲ Ｔ細胞は、任意の抗原陽性細胞または組織に対して高度に毒性であることから、高度に腫瘍特異的な抗体を伴うＣＡＲを構築することが要件となっている。現況では、ヒト充実性腫瘍に対するＣＡＲ改変Ｔ細胞は、α−葉酸受容体、メソテリン、およびＭＵＣ−ＣＤ、ＰＳＭＡ、ならびに他の標的に対して構築されているが、大半は、正常組織内で、ある程度の抗原オフターゲット発現を示す。これらの構築物は、患者において、同じ例外的な結果を示していないことから、充実性腫瘍に対して使用しうる、新規の標的およびＣＡＲ Ｔ細胞の構築法を同定するためのさらなる研究に対する必要が強調される。
したがって、本開示は、ＨＬＡ−Ｇに特異的な抗体（または「抗ＨＬＡ−Ｇ」）、ならびにその使用および作製と関連する方法および組成物を提示する。加えて、本開示は、一部の態様では、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメインである、ＨＬＡ−Ｇに特異的な抗原結合性ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ならびにその使用および作製と関連する方法および組成物を提示する。
抗体およびそれらの使用
Ｉ．組成物
当技術分野では、抗体の一般的構造が公知であり、ここでは、短くまとめるにとどめる。免疫グロブリンの単量体は、ジスルフィド結合により接続された、２つの重鎖と、２つの軽鎖とを含む。各重鎖は、軽鎖のうちの１つと対合し、重鎖は、軽鎖に、ジスルフィド結合により、直接結合する。各重鎖は、定常領域（抗体のアイソタイプに応じて変化する）と、可変領域とを含む。可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３と指定され、フレームワーク領域内で支持される、３つの超可変領域（または相補性決定領域）を含む。各軽鎖は、定常領域と、可変領域とを含み、可変領域は、フレームワーク領域により、重鎖の可変領域と同様の形で支持される、３つの超可変領域（指定されたＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３）を含む。
重鎖と軽鎖との各対による超可変領域は、互いに協同して、標的抗原に結合することが可能な抗原結合性部位をもたらす。重鎖と軽鎖との対の結合特異性は、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列により規定される。したがって、特定の結合特異性をもたらす、ＣＤＲ配列のセット（すなわち、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列）を決定したら、同じ抗原結合特異性を伴う、異なる抗体をもたらすために、原則として、ＣＤＲ配列のセットを、任意の抗体の定常領域と連結された、他の任意の抗体のフレームワーク領域内の適切な位置へと挿入することができる。
一態様では、本開示は、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列と、軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列とを含む単離抗体であって、重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、ヒトＨＬＡ−Ｇのエピトープに結合する抗原結合性部位を形成する単離抗体を提示する。
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、以下の配列：（ｉ）ＧＦＮＩＫＤＴＹ（配列番号１）、（ｉｉ）ＧＦＴＦＮＴＹＡ（配列番号２）、またはそれらの各々の同等物のうちのいずれか１つで始まり、カルボキシ末端における、さらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２、もしくは１アミノ酸を後続させるアミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＨ１配列を含む。
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、以下の配列：（ｉ）ＩＤＰＡＮＧＮＴ（配列番号３）、（ｉｉ）ＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴ（配列番号４）、またはそれらの各々の同等物のうちのいずれか１つで始まり、カルボキシ末端における、さらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２、もしくは１アミノ酸を後続させるアミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＨ２配列を含む。
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、以下の配列：（ｉ）ＡＲＳＹＹＧＧＦＡＹ（配列番号５）、（ｉｉ）ＶＲＧＧＹＷＳＦＤＶ（配列番号６）、またはそれらの各々の同等物のうちのいずれか１つで始まり、カルボキシ末端における、さらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２、もしくは１アミノ酸を後続させるアミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＨ３配列を含む。
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、下記で言及されるポリヌクレオチド配列：
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＧＧＣＡＧＡＧＣＴＴＧＴＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＣＡＡＧＴＴＧＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＴＡＡＡＧＡＣＡＣＣＴＡＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＡＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＡＧＧＡＴＴＧＡＴＣＣＴＧＣＧＡＡＴＧＧＴＡＡＴＡＣＴＡＡＡＴＡＴＧＡＣＣＣＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＴＡＴＡＡＣＡＧＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＡＧＧＡＧＴＴＡＣＴＡＣＧＧＧＧＧＧＴＴＴＧＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡ（配列番号７）によりコードされるポリペプチドもしくはその抗原結合性断片、またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、アミノ酸配列：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＴＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＭＨＷＶＫＱＲＰＥＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＡＮＧＮＴＫＹＤＰＫＦＱＧＫＡＴＩＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＬＱＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＹＹＧＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号８）もしくはその抗原結合性断片、またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、下記で言及されるポリヌクレオチド配列：
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＡＡＡＧＧＡＴＣＡＴＴＧＡＡＡＣＴＣＴＣＡＴＧＴＧＣＣＧＣＣＴＴＴＧＧＴＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＡＴＡＣＣＴＡＴＧＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＴＴＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＴＣＧＣＡＴＡＡＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＡＡＴＡＡＴＴＡＴＧＣＡＡＣＡＴＡＴＴＡＴＧＣＣＧＡＴＴＣＡＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＴＧＡＴＴＣＡＣＡＡＡＧＣＡＴＧＣＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＡＣＣＴＧＡＡＡＡＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＧＧＧＴＴＡＣＴＧＧＡＧＣＴＴＣＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号９）によりコードされるポリペプチドもしくはその抗原結合性断片、またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、アミノ酸配列：
ＥＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＫＧＳＬＫＬＳＣＡＡＦＧＦＴＦＮＴＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＤＳＱＳＭＬＳＬＱＭＮＮＬＫＴＥＤＴＡＩＹＹＣＶＲＧＧＹＷＳＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１０）もしくはその抗原結合性断片、またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、以下の配列：（ｉ）ＫＳＶＳＴＳＧＹＳＹ（配列番号１１）、（ｉｉ）ＫＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号１２）、またはそれらの各々の同等物のうちのいずれか１つで始まり、カルボキシ末端における、さらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２、もしくは１アミノ酸を後続させるアミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＬ１配列を含む。
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、ＬＶＳ（配列番号１３）またはその同等物で始まり、カルボキシ末端における、さらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２、もしくは１アミノ酸を後続させるアミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＬ２配列を含む。
他の実施形態では、軽鎖可変領域は、ＲＭＳ（配列番号１４）またはその同等物で始まり、カルボキシ末端における、さらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２、もしくは１アミノ酸を後続させるアミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＬ２配列を含む。
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、以下の配列：（ｉ）ＱＨＳＲＥＬＰＲＴ（配列番号１５）、（ｉｉ）ＭＱＨＬＥＹＰＹＴ（配列番号１６）、またはそれらの各々の同等物のうちのいずれか１つで始まり、カルボキシ末端における、さらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２、もしくは１アミノ酸を後続させるアミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＬ３配列を含む。
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、ポリヌクレオチド配列：
ＧＡＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＧＣＴＴＣＣＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣＴＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡＧＧＧＣＣＡＣＣＡＴＣＴＣＡＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＴＧＴＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＧＧＣＴＡＴＡＧＴＴＡＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＣＴＴＧＴＡＴＣＣＡＡＣＣＴＡＧＡＡＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＣＡＡＣＡＴＣＣＡＴＣＣＴＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＣＴＧＣＡＡＣＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＣＡＧＴＡＧＧＧＡＧＣＴＴＣＣＴＣＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ（配列番号１７）によりコードされるポリペプチドもしくはその抗原結合性断片、またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、アミノ酸配列：
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＫＳＶＳＴＳＧＹＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＬＶＳＮＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＮＩＨＰＶＥＥＥＤＡＡＴＹＹＣＱＨＳＲＥＬＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１８）もしくはその抗原結合性断片、またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、ポリヌクレオチド配列：
ＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＣＡＣＡＣＡＧＡＣＴＡＣＡＣＣＣＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧＴＣＡＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＴＣＡＧＴＡＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＴＡＧＧＴＣＴＡＧＴＡＡＧＡＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＴＡＧＴＡＡＴＧＧＣＡＡＣＡＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＴＴＧＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＡＴＣＴＣＧＧＡＴＧＴＣＣＡＧＣＣＴＴＧＣＣＴＣＡＧＧＡＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＡＧＧＡＡＣＴＧＣＴＴＴＣＡＣＡＣＴＧＡＧＡＡＴＣＡＧＴＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＴＧＧＧＴＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＴＧＣＡＡＣＡＴＣＴＡＧＡＡＴＡＴＣＣＧＴＡＴＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡ（配列番号１９）によりコードされるポリペプチドもしくはその抗原結合性断片、またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、アミノ酸配列：
ＤＩＶＩＴＱＴＴＰＳＶＰＶＴＰＧＥＳＶＳＩＳＣＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＹＷＦＬＱＲＰＧＱＳＰＱＬＬＩＳＲＭＳＳＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＡＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＨＬＥＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２０）もしくはその抗原結合性断片、またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
本技術についての別の態様では、単離抗体は、以下の特徴：
（ａ）軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される軽鎖配列のうちのいずれかの軽鎖可変ドメインのＣＤＲと少なくとも８５％同一である、１または複数のＣＤＲを含むこと；
（ｂ）重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される重鎖配列のうちのいずれかの重鎖可変ドメインのＣＤＲと少なくとも８５％同一である、１または複数のＣＤＲを含むこと；
（ｃ）軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される軽鎖配列のうちのいずれかの軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であること；
（ｄ）ＨＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される重鎖配列のうちのいずれかの重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であること；および
（ｅ）抗体が、開示される配列のうちのいずれかが結合するエピトープと重なり合うエピトープに結合すること
のうちの１または複数を含む。
開示されるＣＤＲ配列、ならびに重鎖可変配列および軽鎖可変配列を含む例示的な抗体を、それぞれ、表１および表２に開示する。
一態様では、本開示は、３Ｈ１１およびＨＬＡ−Ｇ ４Ｅ３からなる群より選択される抗体と少なくとも８５％同一である単離抗体を提示する。
一態様では、本開示は、３Ｈ１１のＣＤＲを含む単離抗体を提示する。一態様では、本開示は、３Ｈ１１と少なくとも８５％同一である単離抗体を提示する。
一態様では、本開示は、ＨＬＡ−Ｇ ４Ｅ３のＣＤＲを含む単離抗体を提示する。一態様では、本開示は、ＨＬＡ−Ｇ ４Ｅ３と少なくとも８５％同一である単離抗体を提示する。
本明細書で提示される抗体についての一部の態様では、ＨＣ可変ドメイン配列は、３Ｈ１１の可変ドメイン配列を含み、ＬＣ可変ドメイン配列は、３Ｈ１１の可変ドメイン配列を含む。
本明細書で提示される抗体についての一部の態様では、ＨＣ可変ドメイン配列は、ＨＬＡ−Ｇ ４Ｅ３の可変ドメイン配列を含み、ＬＣ可変ドメイン配列は、ＨＬＡ−Ｇ ４Ｅ３の可変ドメイン配列を含む。
本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗体は、ヒトＨＬＡ−Ｇに、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）で結合する。本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗原結合性部位は、ヒトＨＬＡ−Ｇに特異的に結合する。
本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗体は、可溶性Ｆａｂである。
本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、ＨＣ可変ドメイン配列とＬＣ可変ドメイン配列とは、同じポリペプチド鎖の構成要素である。本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、ＨＣ可変ドメイン配列とＬＣ可変ドメイン配列とは、異なるポリペプチド鎖の構成要素である。
本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗体は、全長抗体である。
本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗体は、モノクローナル抗体である。
本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗体は、キメラまたはヒト化である。
本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、およびＦｖからなる群より選択される。
本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗体は、Ｆｃドメインを含む。本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗体は、ウサギ抗体である。本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗体は、ヒトもしくはヒト化抗体であるか、またはヒトにおいて非免疫原性である。
本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗体は、ヒト抗体のフレームワーク領域を含む。
他の態様では、本明細書で提示される抗体のＣＤＲ内の、１または複数のアミノ酸残基を、別のアミノ酸で置換する。置換は、アミノ酸の同じファミリー内の置換であるという意味で「保存的」でありうる。天然に存在するアミノ酸は、以下の４つのファミリー：
１）塩基性側鎖を伴うアミノ酸：リシン、アルギニン、ヒスチジン；
２）酸性側鎖を伴うアミノ酸：アスパラギン酸、グルタミン酸；
３）非荷電極性側鎖を伴うアミノ酸：アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン；
４）非極性側鎖を伴うアミノ酸：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン
に分けることができ、保存的置換は、これらのファミリー内で生じる。
別の態様では、１または複数のアミノ酸残基を、抗体の１または複数のＣＤＲに付加するか、またはこれらから欠失させる。このような付加または欠失は、ＣＤＲのＮもしくはＣ末端、またはＣＤＲ内の位置に施す。
抗体のＣＤＲのアミノ酸配列を、アミノ酸の付加、欠失、または置換により変化させることにより、標的抗原に対する結合アフィニティーの増大など、多様な効果を得ることができる。
このような変化させたＣＤＲ配列を含む本開示の抗体もやはり、開示される抗体と同様の特異性および感受性プロファイルで、ＨＬＡ−Ｇに結合することを察知されたい。これは、結合アッセイにより調べることができる。
抗体の定常領域もまた、変化させることができる。例えば、任意のアイソタイプ：ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、またはＩｇＭのＦｃ領域を伴う抗体を提示することができる。定常領域配列の非限定的な例は、
ヒトＩｇＤ定常領域；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８８０ 配列番号２１
ヒトＩｇＧ１定常領域；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５７ 配列番号２２
ヒトＩｇＧ２定常領域；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５９ 配列番号２３
ヒトＩｇＧ３定常領域；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８６０ 配列番号２４
ヒトＩｇＭ定常領域；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７１ 配列番号２５
ヒトＩｇＧ４定常領域；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８６１ 配列番号２６
ヒトＩｇＡ１定常領域；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７６ 配列番号２７
ヒトＩｇＡ２定常領域；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７７ 配列番号２８
ヒトＩｇカッパ定常領域；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８３４ 配列番号２９
ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
を含む。
一部の態様では、抗体は、配列番号７〜１０またはそれらの同等物のうちのいずれか１つと、少なくとも８０％同一である重鎖定常領域を含む。
一部の態様では、抗体は、配列番号１７〜２０またはそれらの同等物のうちのいずれか１つと、少なくとも８０％同一である軽鎖定常領域を含む。
本明細書で提示される抗体についての一部の態様では、抗体は、３Ｈ１１およびＨＬＡ−Ｇ ４Ｅ３抗体が結合するエピトープに結合する。
本明細書で提示される抗体についての一部の態様では、ＨＬＡ−Ｇ特異的抗体は、ヒトＨＬＡ−Ｇへの結合について、３Ｈ１１およびＨＬＡ−Ｇ ４Ｅ３と競合する。
本明細書で提示される抗体についての一部の態様では、抗体は、急速な結合、ならびに細胞への取込みおよび／または緩徐な放出を容易とするように、構造的修飾を含有する。一部の態様では、ＨＬＡ−Ｇ抗体は、急速な結合、ならびに細胞への取込みおよび／または緩徐な放出を容易とするように、抗体のＣＨ２定常重鎖領域内の欠失を含有する。一部の態様では、Ｆａｂ断片を使用して、急速な結合、ならびに細胞への取込みおよび／または緩徐な放出を容易とする。一部の態様では、Ｆ（ａｂ）’２断片を使用して、急速な結合、ならびに細胞への取込みおよび／または緩徐な放出を容易とする。
抗体、断片、およびそれらの同等物は、使用および／または保管のための製剤をもたらすように、担体、例えば、薬学的に許容される担体または他の薬剤と組み合わせることができる。
さらに、ＨＬＡ−Ｇまたはその断片のアミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる単離ポリペプチドであって、ＨＬＡ−Ｇに結合する抗体を作出するのに有用な単離ポリペプチドのほか、それらをコードする単離ポリヌクレオチドも提供される。一態様では、単離ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、標識および／もしくは連続的ポリペプチド配列（例えば、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）担体タンパク質）または、ポリヌクレオチドの場合、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドへと作動的にカップリングさせた配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多様な担体、例えば、リン酸緩衝食塩水と組み合わせることができる。さらに、単離ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む、宿主細胞、例えば、原核細胞または真核細胞、例えば、細菌、酵母、哺乳動物（ラット、サル、ハムスター、またはヒト）細胞が提供される。宿主細胞は、担体と組み合わせることができる。
ＩＩ．組成物を調製するための工程
抗体、それらの製造および使用については周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ．およびＬａｎｅ， Ｄ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９９９年において開示されている。抗体は、当技術分野で公知の標準的な方法を使用して作出することができる。抗体の例は、モノクローナル抗体、単鎖抗体、および抗体の機能的断片を含む（がこれらに限定されない）。
抗体は、一連の宿主、例えば、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト、および他の宿主において産生させることができる。宿主は、標的抗原またはＨＬＡ−ＧのＣ末端断片もしくは単離ポリペプチドなど、免疫原特性を有するその断片もしくはオリゴペプチドを注射することにより免疫化することができる。宿主種に応じて、多様なアジュバントを添加および使用して、免疫学的応答を増大させることができる。このようなアジュバントは、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、ならびにリソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、およびジニトロフェノールなどの界面活性物質を含むがこれらに限定されない。ヒトにおいて使用されるアジュバントでは、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍが特に有用である。本開示はまた、単離ポリペプチドおよびアジュバントも提示する。
ある特定の態様では、本開示の抗体は、ポリクローナル抗体、すなわち、異なるアミノ酸配列を有する、複数種類の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の混合物である。一態様では、ポリクローナル抗体は、異なるＣＤＲを有する、複数種類の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の混合物を含む。したがって、異なる抗体を産生する細胞の混合物を培養し、結果として得られる培養物から精製された抗体を使用することができる（ＷＯ２００４／０６１１０４を参照されたい）。
モノクローナル抗体の作製：ＨＬＡ−Ｇに対するモノクローナル抗体は、培養物中の連続的な細胞株による抗体分子の産生をもたらす任意の技法を使用して調製することができる。このような技法は、ハイブリドーマ法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５〜４９７頁（１９７５年）を参照されたい）；トリオーマ法；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ、４巻：７２頁（１９８３年）を参照されたい）およびヒトモノクローナル抗体を作製するＥＢＶハイブリドーマ法（例えば、Ｃｏｌｅら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．、７７〜９６頁（１９８５年）を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。ヒトモノクローナル抗体は、本技術の実施において活用することができ、ヒトハイブリドーマを使用すること（例えば、Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、８０巻：２０２６〜２０３０頁（１９８３年）を参照されたい）により作製することもでき、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ヒトＢ細胞を、エプスタインバーウイルスで形質転換すること（例えば、Ｃｏｌｅら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．、７７〜９６頁（１９８５年）を参照されたい）により作製することもできる。例えば、抗体の領域をコードする核酸の集団を単離することができる。抗体の保存的領域をコードする配列に由来するプライマーを活用するＰＣＲを使用して、抗体の部分をコードする配列を、集団から増幅し、次いで、抗体または可変ドメインなど、それらの断片をコードするＤＮＡを、増幅された配列から再構築する。このような増幅された配列はまた、ファージまたは細菌上に、融合ポリペプチドを発現させ、提示するための他のタンパク質（例えば、バクテリオファージコートまたは細菌細胞表面タンパク質）をコードするＤＮＡへと融合させることもできる。次いで、増幅された配列を発現させ、例えば、発現させた抗体またはその断片の、ＨＬＡ−Ｇポリペプチド上に存在する抗原またはエピトープに対するアフィニティーに基づき、さらに選択または単離することができる。代替的に、抗ＨＬＡ−Ｇモノクローナル抗体を発現させるハイブリドーマは、対象を、例えば、ＨＬＡ−Ｇまたはその断片のアミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる単離ポリペプチドで免疫化し、次いで、慣例的な方法を使用して、ハイブリドーマを、対象の脾臓から単離することにより調製することができる。例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎら（ＧａｌｆｒｅおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、７３巻：３〜４６頁（１９８１年））を参照されたい。標準的な方法を使用してハイブリドーマをスクリーニングすることにより、特異性（すなわち、異なるエピトープに対する）およびアフィニティーを変化させたモノクローナル抗体を作製する。所望の特性、例えば、ＨＬＡ−Ｇへの結合を伴う選択されたモノクローナル抗体は、（ｉ）ハイブリドーマにより発現された形で使用することもでき、（ｉｉ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの分子に結合させて、その特性を変更することもでき、（ｉｉｉ）モノクローナル抗体をコードするｃＤＮＡを、単離し、配列決定し、多様な形で操作することができる。一態様では、抗ＨＬＡ−Ｇモノクローナル抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子と、軽鎖導入遺伝子とを含むゲノムを有するトランスジェニックの非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られたＢ細胞であって、不死化細胞へと融合させたＢ細胞を含むハイブリドーマにより作製する。ハイブリドーマ法は、当技術分野で公知であり、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、３４９頁（１９８８年）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、５６３〜６８１頁（１９８１年）において教示されているハイブリドーマ法を含む。
ファージディスプレイ法：上記で言及した通り、本開示の抗体は、組換えＤＮＡおよびファージディスプレイ技術の適用を介して作製することができる。例えば、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、当技術分野で公知の、多様なファージディスプレイ法を使用して調製することができる。ファージディスプレイ法では、機能的な抗体ドメインを、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面に提示する。所望の結合特性を伴うファージは、抗原、典型的には、固体表面またはビーズに結合させるかまたは捕捉した抗原により、直接選択することにより、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から選択する。これらの方法において使用されるファージは典型的に、ｆｄおよびＭ１３を含む糸状ファージであって、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを、組換えにより、ファージ遺伝子ＩＩＩまたはＶＩＩＩタンパク質へと融合させた、糸状ファージである。加えて、方法を、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築（例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻：１２７５〜１２８１頁、１９８９年を参照されたい）に適応させて、ＨＬＡ−Ｇポリペプチド、例えば、ポリペプチド、またはその誘導体、断片、類似体、もしくは相同体に所望の特異性を伴うモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ有効な同定を可能とすることができる。本開示の単離抗体を作製するのに使用しうるファージディスプレイ法の他の例は、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５巻：５８７９〜５８８３頁（１９８８年）；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、８７巻：１０６６〜１０７０頁（１９９０年）；Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８２巻：４１〜５０頁（１９９５年）；Ａｍｅｓら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８４巻：１７７〜１８６頁（１９９５年）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４巻：９５２〜９５８頁（１９９４年）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ、１８７巻：９〜１８頁（１９９７年）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５７巻：１９１〜２８０頁（１９９４年）；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；ＷＯ９６／０６２１３；ＷＯ９２／０１０４７（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌら）；ＷＯ９７／０８３２０（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）；ＷＯ９２／０１０４７（ＣＡＴ／ＭＲＣ）；ＷＯ９１／１７２７１（Ａｆｆｙｍａｘ）；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、および同第５，７３３，７４３号において開示されているファージディスプレイ法を含む。
ジスルフィド結合を介してポリペプチドを接合させることにより、バクテリオファージ粒子の表面上にポリペプチドを提示するために有用な方法については、Ｌｏｈｎｉｎｇ、米国特許第６，７５３，１３６号により記載されている。上記の参考文献に記載されている通り、ファージを選択した後で、ファージに由来する抗体をコードする領域を単離し、ヒト抗体を含む全抗体、または他の任意の所望の抗原結合性断片を作出し、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む、任意の所望の宿主内で発現させるのに使用することができる。例えば、ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１２巻：８６４〜８６９頁（１９９２年）；Ｓａｗａｉら、ＡＪＲＩ、３４巻：２６〜３４頁（１９９５年）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０巻：１０４１〜１０４３頁（１９８８年）において開示されている方法など、当技術分野で公知の方法を使用して、組換えにより、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片を作製する技法もまた、利用することができる。
一般に、抗体または抗体断片は、ファージまたはファージミド粒子の表面上に存在するため、良好な結合活性を維持する改変体を同定するために、ディスプレイベクターへとクローニングされたハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体断片を、適切な抗原に対して選択することができる。例えば、Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩら、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２００１年）を参照されたい。しかし、選択および／またはスクリーニングのために、抗体断片ライブラリーを、溶解性のファージベクター（改変Ｔ７またはラムダＺａｐ系）へとクローニングすることなど、他のベクターフォーマットをこの工程のために使用しうるであろう。
抗体作製のための代替法：抗体はまた、リンパ球集団内で、ｉｎ ｖｉｖｏにおける産生を誘導することにより作製することもでき、組換え免疫グロブリンライブラリーまたは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることにより作製することもできる（Ｏｒｌａｎｄｉら、ＰＮＡＳ、８６巻：３８３３〜３８３７頁（１９８９年）；Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３４９巻：２９３〜２９９頁（１９９１年））。
代替的に、単鎖抗体を作製するための技法を使用することができる。単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、リンカーペプチド（典型的には、ほぼ５〜２５アミノ酸の長さ）により接続された、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。ｓｃＦｖにおける重鎖および軽鎖の可変領域は、同じ抗体から導出することもでき、異なる抗体から導出することもできる。ｓｃＦｖは、組換え法を使用して、例えば、ｓｃＦｖをコードするベクターの、Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主生物内の発現により合成することができる。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、上述の抗体の重鎖または重鎖の可変領域をコードするＤＮＡと、その軽鎖または軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡとから選択されるＤＮＡの、全アミノ酸配列または所望のアミノ酸配列をコードする部分的ＤＮＡを鋳型として使用し、その両端を規定するプライマー対を使用するＰＣＲにより増幅を実施し、リンカーの両端を、重鎖および軽鎖のそれぞれへとライゲーションするように、ポリペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡと、その両端を規定するプライマー対とを組み合わせる増幅をさらに実施することにより得ることができる。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターと、発現ベクターにより形質転換された宿主とは、当技術分野で公知の、従来の方法に従い得ることができる。
また、抗原結合性断片、例えば、抗体分子のペプシン消化により作製しうるＦ（ａｂ’）２断片、およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより作出しうるＦａｂ断片も、作出することができる。代替的に、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して、所望の特異性を伴うモノクローナルＦａｂ断片の、迅速かつ簡易な同定を可能とすることができる（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻：１２７５〜１２８１頁（１９８９年））。
抗体の修飾。本開示の抗体は、抗原に対するアフィニティーを増大させるように、多量体化することができる。多量体化される抗体は、１種類の抗体の場合もあり、同じ抗原の複数のエピトープを認識する、複数の抗体の場合もある。抗体の多量体化の方法としては、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインの、２つのｓｃＦｖ分子への結合、ストレプトアビジンへの結合、ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフの導入などを例示することができる。
本明細書で開示される抗体組成物は、これらの抗体のうちのいずれかと、別の薬剤との間で形成される、コンジュゲートの形態（免疫コンジュゲート）でありうる。一態様では、本明細書で開示される抗体を、放射性物質へとコンジュゲートさせる。別の態様では、本明細書で開示される抗体を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など、多様な種類の分子に結合させることができる。
抗体のスクリーニング。所望の特異性を有する抗体を同定するスクリーニングのために、多様なイムノアッセイを使用することができる。当技術分野では、特異性が確立された、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用する、競合的結合またはイムノラジオメトリックアッセイのための多数のプロトコールが周知である。このようなイムノアッセイは、ＨＬＡ−Ｇまたはその任意の断片もしくはオリゴペプチドと、その特異的抗体との間の複合体の形成についての測定を伴うことが典型的である。２つの非干渉的ＨＬＡ−Ｇエピトープに特異的なモノクローナル抗体を活用する、２部位型の、モノクローナルベースのイムノアッセイを使用しうるが、競合的結合アッセイもまた、利用することができる（Ｍａｄｄｏｘら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１５８巻：１２１１〜１２１６頁（１９８３年））。
抗体の精製。本明細書で開示される抗体は、均質性まで精製することができる。抗体の分離および精製は、従来のタンパク質分離および精製法を利用することにより実施することができる。
例だけを目的として述べると、抗体は、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動などの使用を適切に選択し、組み合わせることにより、分離および精製することができる。Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ、Ｄａｎｉｅｌ Ｒ． Ｍａｒｓｈａｋら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９６年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８年）。
クロマトグラフィーの例は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および吸着クロマトグラフィーを含む。一態様では、クロマトグラフィーは、ＨＰＬＣまたはＦＰＬＣなどの液体クロマトグラフィーを利用することにより実施することができる。
一態様では、アフィニティークロマトグラフィーにおいて、プロテインＡカラムまたはプロテインＧカラムを使用することができる。他の例示的なカラムは、プロテインＡカラムである、ＨｙｐｅｒＤ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などを含む。
ＩＩＩ．使用法
総論。本明細書で開示される抗体は、ＨＬＡ−Ｇポリペプチドの位置特定および／または定量化と関連する、当技術分野で公知の方法（例えば、適切な生理学的試料中のＨＬＡ−Ｇポリペプチドのレベルの測定における使用のための方法、診断法における使用のための方法、ポリペプチドのイメージングにおける使用のための方法など）において有用である。本明細書で開示される抗体は、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降など、標準的な技法によるＨＬＡ−Ｇポリペプチドの単離において有用である。本明細書で開示されるＨＬＡ−Ｇ抗体は、天然のＨＬＡ−Ｇポリペプチドの、生物学的試料、例えば、哺乳動物の血清または細胞からの精製のほか、組換えにより作製されるＨＬＡ−Ｇポリペプチドであって、宿主系内で発現させるＨＬＡ−Ｇポリペプチドの精製も容易としうる。さらに、ＨＬＡ−Ｇ抗体を使用して、ポリペプチドの存在度および発現パターンについて評価するために、ＨＬＡ−Ｇポリペプチド（例えば、血漿、細胞溶解物、または細胞上清中）を検出することができる。本明細書で開示されるＨＬＡ−Ｇ抗体を診断的に使用して、組織内のＨＬＡ−Ｇレベルを、臨床検査手順の一部としてモニタリングする、例えば、所与の処置レジメンの有効性を決定することができる。検出は、本明細書で開示されるＨＬＡ−Ｇ抗体を、検出可能な物質へとカップリングすること（すなわち、物理的に連結すること）により、容易とすることができる。
別の態様では、本明細書では、本明細書で開示される抗体または抗原結合性断片であって、例えば、ヒトＨＬＡ−Ｇタンパク質またはその断片を含むペプチドに結合した抗体または抗原結合性断片を含む組成物が提示される。一態様では、ペプチドを、細胞と会合させる。例えば、組成物は、本明細書で開示される抗体または抗体断片で標識された非凝集細胞試料を含むことが可能であり、この組成物は、例えば、細胞を単離するためのアフィニティークロマトグラフィー法において、またはフローサイトメトリーベースの細胞解析もしくは細胞分取のために有用である。別の例として、組成物は、本明細書で開示される抗体または抗体断片で標識された、固定組織試料または細胞スミアを含むことが可能であり、この組成物は、例えば、免疫組織化学または細胞学解析において有用である。別の態様では、抗体または抗体断片を、例えば、ＨＬＡ−Ｇタンパク質もしくはそれらの断片、ＨＬＡ−Ｇ陽性細胞、またはＨＬＡ−Ｇおよび他の細胞成分を含有する複合体を単離するためのＥＬＩＳＡ；アフィニティークロマトグラフィー；または免疫沈降法において有用な固体支持体に結合させる。別の態様では、ペプチドを、固体支持体に結合させる。例えば、ペプチドを、ペプチドに特異的な二次抗体であって、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて有用な二次抗体を介して、固体支持体に結合させることができる。別の例として、ペプチドを、例えば、本技術に従う抗体の単離または精製において有用な、クロマトグラフィーカラムに結合させることができる。別の態様では、ペプチドを、例えば、ＨＬＡ−Ｇタンパク質もしくはそれらの断片、またはＨＬＡ−Ｇおよび他の細胞成分を含有する複合体を単離するＥＬＩＳＡおよびアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降法において有用な、分画された細胞の細胞内画分（ｓｕｂ−ｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎ）を含有する溶解液または溶液などの溶液中に入れる。別の態様では、ペプチドを、例えば、ゲル電気泳動用のゲルまたはウェスタンブロット法に一般に使用されるマトリックス（ニトロセルロース製またはポリビニリデンジフルオリド製の膜など）などのマトリックスと会合させるが、この組成物は、電気泳動および／またはウェスタンブロット法などのイムノブロット法に有用である。
ＨＬＡ−Ｇポリペプチドの検出。生物学的試料中のＨＬＡ−Ｇポリペプチドのレベルを検出するための例示的な方法は、生物学的試料を、対象から得るステップと、生物学的試料を、ＨＬＡ−Ｇポリペプチドを検出することが可能な本明細書で開示されるＨＬＡ−Ｇ抗体と接触させるステップとを伴う。
一態様では、ＨＬＡ−Ｇ抗体である、３Ｈ１１、もしくはＨＬＡ−Ｇ ４Ｅ３、またはそれらの断片を、検出可能に標識する。抗体に関する「標識された」という用語は、検出可能な物質を、抗体へとカップリングすること（すなわち、物理的に連結すること）による抗体の直接的な標識のほか、直接的に標識された別の化合物との反応性による抗体の間接的な標識も包含することを意図する。間接的な標識の非限定的な例は、蛍光標識された二次抗体を使用する一次抗体の検出と、それを、蛍光標識されたストレプトアビジンにより検出しうるように、ＤＮＡプローブを、ビオチンで末端標識することとを含む。
本開示の検出法を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏならびにｉｎ ｖｉｖｏにおいて、生物学的試料中のＨＬＡ−Ｇポリペプチドの発現レベルを検出することができる。ＨＬＡ−Ｇポリペプチドを検出するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法は、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ、および免疫蛍光（例えば、ＩＨＣ）を含む。さらに、ＨＬＡ−Ｇポリペプチドを検出するためのｉｎ ｖｉｖｏ法は、対象へと標識された抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を導入するステップを含む。例だけを目的として述べると、抗体は、対象におけるその存在および場所を、標準的なイメージング技法により検出しうる放射性マーカーで標識することができる。一態様では、生物学的試料は、被験対象に由来するポリペプチド分子を含有する。
イムノアッセイおよびイメージング。抗体ベースの技法を使用して、生物学的試料（例えば、ヒト血漿）中のＨＬＡ−Ｇポリペプチドレベルをアッセイするのに、本明細書で開示されるＨＬＡ−Ｇ抗体を使用することができる。例えば、組織内のタンパク質発現は、古典的な免疫組織化学（ＩＨＣ）染色法で研究することができる（Ｊａｌｋａｎｅｎ， Ｍ．ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、１０１巻：９７６〜９８５頁（１９８５年）；Ｊａｌｋａｎｅｎ， Ｍ．ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、１０５巻：３０８７〜３０９６頁（１９８７年））。タンパク質の遺伝子発現を検出するために有用な、他の抗体ベースの方法は、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などのイムノアッセイを含む。当技術分野では、適切な抗体アッセイ標識が公知であり、グルコースオキシダーゼなどの酵素標識、ならびにヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ、１３１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネシウム（９９ｍＴｃ）などの放射性同位体または他の放射性薬剤、ならびにフルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識、ならびにビオチンを含む。
生物学的試料中のＨＬＡ−Ｇポリペプチドレベルについてアッセイすることに加えて、ＨＬＡ−Ｇポリペプチドレベルはまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、イメージングにより検出することもできる。ＨＬＡ−Ｇポリペプチドレベルについてのｉｎ ｖｉｖｏイメージングのために、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体と共に組み込みうる標識は、Ｘ線造影法、ＮＭＲ、またはＥＳＲにより検出可能な標識を含む。Ｘ線造影法に適する標識は、バリウムまたはセシウムなどの放射性同位体であって、検出可能な放射線を放出するが、対象に対して明白に有害ではない放射性同位体を含む。ＮＭＲおよびＥＳＲに適するマーカーは、対象となるｓｃＦｖクローンのための養分を標識することにより、ＨＬＡ−Ｇ抗体へと組み込みうる、重水素など、検出可能な特徴的なスピンを伴うマーカーを含む。
放射性同位元素（例えば、１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、放射線不透過物質、または核磁気的共鳴により検出可能な材料など、適切な検出可能なイメージング部分で標識されたＨＬＡ−Ｇ抗体を、対象へと導入（例えば、非経口、皮下、または腹腔内）する。当技術分野では、対象のサイズと、使用されるイメージングシステムとが、診断画像を作製するのに必要とされるイメージング部分の数量を決定することが理解されるであろう。ヒト対象のための放射性同位元素部分の場合、注射される放射能の量は通常、９９ｍＴｃ約５〜２０ミリキュリーの範囲となろう。次いで、標識されたＨＬＡ−Ｇ抗体は、特異的な標的ポリペプチドを含有する細胞の場所に、優先的に蓄積されるであろう。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍イメージングについては、Ｓ． Ｗ． Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ： Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、１３（１９８２年）において記載されている。
一部の態様では、急速な結合、ならびに細胞への取込みおよび／または緩徐な放出を容易とする構造的修飾を含有するＨＬＡ−Ｇ抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏイメージング検出法において有用である。一部の態様では、ＨＬＡ−Ｇ抗体は、急速な結合、ならびに細胞への取込みおよび／または緩徐な放出を容易とするように、抗体のＣＨ２定常重鎖領域内の欠失を含有する。一部の態様では、Ｆａｂ断片を使用して、急速な結合、ならびに細胞への取込みおよび／または緩徐な放出を容易とする。一部の態様では、Ｆ（ａｂ）’２断片を使用して、急速な結合、ならびに細胞への取込みおよび／または緩徐な放出を容易とする。
ＨＬＡ−Ｇ抗体の診断的使用。本明細書で開示されるＨＬＡ−Ｇ抗体組成物は、診断および予後診断法において有用である。したがって、本開示は、対象における、ＨＬＡ−Ｇに関連する医学的状態の診断において、本明細書で開示される抗体を使用するための方法を提示する。本明細書で開示される抗体は、それらが、ＨＬＡ−Ｇポリペプチドに対して、高レベルのエピトープ結合特異性および高結合アフィニティーを有するように選択することができる。一般に、抗体の結合アフィニティーが高いほど、標的ポリペプチドを除去せずに、非特異的に結合した材料を除去するように、イムノアッセイにおいて、よりストリンジェントな洗浄条件を実施することができる。したがって、診断アッセイにおいて有用な本技術のＨＬＡ−Ｇ抗体は通例、少なくとも１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、または１０−１２Ｍの結合アフィニティーを有する。ある特定の態様では、診断試薬として使用されるＨＬＡ−Ｇ抗体は、標準的な条件下、少なくとも１２時間、少なくとも５時間、少なくとも１時間、または少なくとも３０分間で、平衡に達するのに十分な動態会合速度（ｋｉｎｅｔｉｃ ｏｎ−ｒａｔｅ）を有する。
本技術の一部の方法は、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体のポリクローナル調製物およびポリクローナル抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の組成物を診断試薬として利用し、他の方法は、モノクローナル単離物を利用する。上記で記載した方法に従い調製されたヒト抗ＨＬＡ−Ｇポリクローナル抗体を利用する方法では、調製物は、ＨＬＡ−Ｇ抗体、例えば、標的ポリペプチドに対する、異なるエピトープ特異性を伴う抗体の取合せを含有することが典型的である。本開示の抗ＨＬＡ−Ｇモノクローナル抗体は、近縁の抗原の存在下または潜在的存在下で、単一の抗原を検出するために有用である。
本開示のＨＬＡ−Ｇ抗体を、任意の種類の生物学的試料についての診断試薬として使用することができる。一態様では、本明細書で開示されるＨＬＡ−Ｇ抗体は、ヒト生物学的試料についての診断試薬として有用である。ＨＬＡ−Ｇ抗体を使用して、様々な標準的アッセイフォーマットで、ＨＬＡ−Ｇポリペプチドを検出することができる。このようなフォーマットは、免疫沈降、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、フローサイトメトリー、ＩＨＣ、および免疫測定アッセイを含む。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８年）；米国特許第３，７９１，９３２号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８７９，２６２号；同第４，０３４，０７４号、同第３，７９１，９３２号；同第３，８１７，８３７号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８５０，５７８号；同第３，８５３，９８７号；同第３，８６７，５１７号；同第３，８７９，２６２号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；および同第４，０９８，８７６号を参照されたい。生物学的試料は、対象の任意の組織（生検材料を含む）、細胞、または体液から得ることができる。
ＨＬＡ−Ｇ抗体の予後診断的使用。本開示はまた、対象に、ＨＬＡ−Ｇポリペプチドの発現または活性の増大と関連する医学的疾患または状態を発症する危険性があるのかどうかを決定するための予後診断（または予測）アッセイ（例えば、前がん性細胞の検出）も提示する。このようなアッセイを、予後診断または予測の目的で使用して、これにより、ＨＬＡ−Ｇポリペプチドの発現を特徴とするかまたはこれと関連する、医学的疾患または状態の発症の前に、個体を予防的に処置することができる。
本開示の別の態様は、対象におけるＨＬＡ−Ｇの発現を決定して、これにより、この対象に適切な治療用または予防用化合物を選択するための方法を提示する。
代替的に、予後診断アッセイを活用して、発生中のがんおよび／または充実性腫瘍、例えば、甲状腺がんを有するか、またはこれらを発症する危険性がある対象を同定することができる。したがって、本開示は、ＨＬＡ−Ｇポリペプチドの発現レベルの上昇と関連する疾患または状態を同定するための方法であって、被験試料を対象から得、ＨＬＡ−Ｇポリペプチドを検出し、ここで、ＨＬＡ−Ｇポリペプチドのレベルの、対照試料と比較した上昇の存在により、ＨＬＡ−Ｇポリペプチドの発現レベルの上昇と関連する疾患または状態を有するか、またはこれらを発症する危険性がある対象が予測される方法を提示する。一部の態様では、ＨＬＡ−Ｇポリペプチドの発現レベルの上昇と関連する疾患または状態は、発生中のがんおよび／または充実性腫瘍からなる群より選択される。
別の態様では、本開示は、対象を、ＨＬＡ−Ｇポリペプチド発現の増大と関連する障害または状態のための化合物で有効に処置しうるのかどうかを決定するための方法であって、生物学的試料を対象から得、ＨＬＡ−Ｇ抗体を使用して、ＨＬＡ−Ｇポリペプチドを検出する方法を提示する。対象から得られる生物学的試料中の、ＨＬＡ−Ｇポリペプチドの発現レベルを決定し、無病である対象から得られる生物学的試料中で見出されるＨＬＡ−Ｇの発現レベルと比較する。疾患または状態を有することが疑われる対象から得られた試料中のＨＬＡ−Ｇポリペプチドレベルの、健常対象から得られた試料と比較した上昇は、被験対象における、ＨＬＡ−Ｇ関連疾患または状態を示す。
ＨＬＡ−Ｇポリペプチドの発現レベルの上昇により、疾患を伴う対象が、特定の種類の治療または処置に応答する可能性が高いのかどうかが示されることが公知である疾患状態は、いくつか存在する。したがって、生物学的試料中のＨＬＡ−Ｇポリペプチドを検出する方法を、例えば、対象が、治療または処置に応答する可能性について評価する予後診断法として使用することができる。対象に由来する適切な組織または体液試料中のＨＬＡ−Ｇポリペプチドレベルを決定し、適切な対照、例えば、同じ疾患を伴うが、処置に対して良好に応答した対象におけるレベルと比較する。
一態様では、本開示は、薬剤（例えば、薬物、化合物、または低分子）の、ＨＬＡ−Ｇポリペプチドの発現に対する影響をモニタリングする方法を提示する。このようなアッセイは、基礎的な薬物スクリーニングおよび臨床試験において適用することができる。例えば、薬剤がＨＬＡ−Ｇポリペプチドレベルを低下させる有効性は、ＨＬＡ−Ｇの発現の増大を呈する対象、例えば、がんと診断された患者についての臨床試験においてモニタリングすることができる。ＨＬＡ−Ｇポリペプチドの発現に影響を及ぼす薬剤は、薬剤を投与し、応答を観察することにより同定することができる。このようにして、ＨＬＡ−Ｇポリペプチドの発現パターンを、対象の、薬剤への生理学的応答を示す、マーカーとして用いることができる。したがって、この応答状態は、対象の、薬剤による処置の前、およびこの間の多様な時点において決定することができる。
本開示のさらなる態様は、患者が、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いのか、高くないのかを決定するための方法に関する。具体的な実施形態では、この方法は、患者から単離された腫瘍試料を、有効量のＨＬＡ−Ｇ抗体と接触させるステップと、腫瘍試料に結合した任意の抗体の存在を検出するステップとを含む。さらなる実施形態では、腫瘍試料に結合した抗体の存在は、患者が、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いことを指し示し、腫瘍試料に結合した抗体の非存在は、患者が、ＨＬＡ−Ｇ療法に応答する可能性が高くないことを指し示す。一部の実施形態では、方法は、有効量のＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ療法を、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いと決定された患者へと投与する、さらなるステップを含む。
ＩＶ．キット
本明細書で明示される通り、本開示は、ＨＬＡ−Ｇの発現レベルを決定するための診断法を提示する。特定の一態様では、本開示は、これらの方法を実施するためのキットのほか、組織を回収し、かつ／またはスクリーニングを実施し、かつ／または結果を解析することなど、本開示の方法を実行するための指示も提示する。
キットは、本明細書で開示されるＨＬＡ−Ｇ抗体組成物（例えば、モノクローナル抗体）と、使用のための指示とを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。キットは、例えば、痰、血清、血漿、リンパ、嚢胞液、尿、糞便、脳脊髄液、腹水、または血液を含むがこれらに限定されない、例えば、任意の体液であり、身体組織についての生検試料を含む生物学的試料中のＨＬＡ−Ｇポリペプチドの存在を検出するために有用である。被験試料はまた、腫瘍細胞、腫瘍に隣接する正常細胞、腫瘍組織型に対応する正常細胞、血液細胞、末梢血リンパ球、またはこれらの組合せでもありうる。上記で記載した方法で使用される被験試料は、アッセイフォーマットと、検出法の性格と、アッセイされる試料として使用される、組織、細胞、または抽出物とに基づき変化するであろう。当技術分野では、細胞のタンパク質抽出物または膜抽出物を調製するための方法が公知であり、活用されるシステムと適合性の試料を得るために、たやすく適応させることができる。
一部の態様では、キットは、生物学的試料中のＨＬＡ−Ｇポリペプチドに結合することが可能な、１または複数のＨＬＡ−Ｇ抗体（例えば、ＨＬＡ−Ｇ抗体である、３Ｈ１１またはＨＬＡ−Ｇ ４Ｅ３と同じ抗原結合特異性を有する抗体またはその抗原結合性断片）と；試料中のＨＬＡ−Ｇポリペプチドの量を決定するための手段と；試料中のＨＬＡ−Ｇポリペプチドの量を、標準物質と比較するための手段とを含みうる。ＨＬＡ−Ｇ抗体のうちの１または複数は、標識することができる。キットの構成要素（例えば、試薬）は、適切な容器内にパッケージングすることができる。キットは、キットを使用して、ＨＬＡ−Ｇポリペプチドを検出するための指示をさらに含みうる。ある特定の態様では、キットは、１）例えば、固体支持体へと接合させた第１の抗体であって、ＨＬＡ−Ｇポリペプチドに結合する第１の抗体と；任意選択で；２）ＨＬＡ−Ｇポリペプチドまたは第１の抗体に結合し、検出可能な標識へとコンジュゲートさせた異なる第２の抗体とを含む。
キットはまた、例えば、緩衝剤、保存剤またはタンパク質安定化剤も含みうる。キットは、検出可能な標識を検出するために必要な構成要素、例えば、酵素または基質をさらに含みうる。キットはまた、アッセイし、被験試料と比較しうる、１つの対照試料または対照試料のシリーズも含有しうる。キットの各構成要素は、個別の容器内に封入することができ、多様な容器の全ては、キットを使用して実施されるアッセイの結果を解釈するための指示と共に、単一のパッケージ内にあってよい。本開示のキットは、キットの容器上または容器内に書面を含有しうる。書面は、キット内に含有される試薬を、どのようにして使用するのかについて記載する。
適宜、これらの示唆されるキットの構成要素は、当業者による使用に好都合なように、パッケージングすることができる。例えば、これらの示唆されるキットの構成要素は、溶液中または液体分散物などとして提供することができる。
Ｖ．担体
抗体はまた、多くの異なる担体に結合させることもできる。したがって、本開示はまた、抗体と、活性または不活性の、別の物質とを含有する組成物も提示する。周知の担体の例は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、およびマグネタイトを含む。本開示の目的では、担体の性格は、可溶性の場合もあり、不溶性の場合もある。当業者は、結合性抗体に適する他の担体について知っているか、または慣例的な実験を使用して、このような担体を確認することができるであろう。
キメラ抗原受容体およびそれらの使用
Ｉ．組成物
本開示は、細胞外、膜貫通および細胞内ドメインを含む細胞活性化部分を含むか、またはこれらから本質的になるＨＬＡ−Ｇに結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提示する。細胞外ドメインは、他に抗原結合性ドメインと称する、標的特異的な結合性エレメントを含む。細胞内ドメインまたは細胞質ドメインは、共刺激性シグナル伝達領域およびゼータ鎖部分を含む。ＣＡＲは、任意選択で、最大で３００アミノ酸、好ましくは１０〜１００アミノ酸、より好ましくは２５〜５０アミノ酸のスペーサードメインをさらに含みうる。
抗原結合性ドメイン。ある特定の態様では、本開示は、ＨＬＡ−Ｇに特異的な抗原結合性ドメインを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおこれからなるＣＡＲを提示する。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメインを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおこれからなる。さらなる実施形態では、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメインを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおこれからなる。
一部の実施形態では、抗体の重鎖可変領域は、配列番号７〜１０またはそれらの各々の同等物を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはこれらからなり、かつ／あるいは配列番号１〜６またはそれらの各々の同等物を含む、１または複数のＣＤＲ領域を含む。一部の実施形態では、抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１７〜２０またはそれらの各々の同等物を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはこれらからなり、かつ／あるいは配列番号１１〜１６またはそれらの各々の同等物を含む、１または複数のＣＤＲ領域を含む。
膜貫通ドメイン。膜貫通ドメインは、天然の供給源から導出することもでき、合成の供給源から導出することもできる。供給源が、天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来しうる。本開示で特に使用される膜貫通領域は、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＴＣＲに由来しうる。代替的に、膜貫通ドメインは、合成であることが可能であり、この場合、膜貫通ドメインは主に、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含むであろう。フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンの三残基の組（ｔｒｉｐｌｅｔ）が、合成の膜貫通ドメインの各末端において見出されることが好ましい。任意選択で、好ましくは、２〜１０アミノ酸の間の長さの、短鎖オリゴペプチドリンカー、またはポリペプチドリンカーは、ＣＡＲの膜貫通ドメインと、細胞質シグナル伝達ドメインとの連結を形成しうる。グリシン−セリンの二残基の組（ｄｏｕｂｌｅｔ）は、特に適切なリンカーをもたらす。
細胞質ドメイン。ＣＡＲの細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが配置された免疫細胞の、従来のエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化を担う。細胞内シグナル伝達ドメインとは、エフェクター機能シグナルを伝達し、免疫細胞を、その特異的機能を果たすように導く、タンパク質の部分を指す。シグナル伝達ドメインの全体を使用することもでき、切断部分が、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分である限りにおいて、その切断部分を使用することもできる。ＴＣＲおよび共受容体のほか、それらの誘導体または改変体の細胞質配列は、ＣＡＲにおける使用のための細胞内シグナル伝達ドメインとして機能しうる。本開示で特に使用される細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲ、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤＳ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄに由来しうる。ＴＣＲを介して発生するシグナルは、単独では、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であるので、二次または共刺激性シグナルもまた、要求されうる。したがって、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、またはＣＤ８３に特異的に結合するリガンドを含むがこれらに限定されない共刺激性シグナル伝達分子の細胞内領域もまた、ＣＡＲの細胞質ドメインに組み入れることができる。
一部の実施形態では、キメラ抗原受容体の細胞活性化部分は、ＣＤ８タンパク質、ＣＤ２８タンパク質、４−１ＢＢタンパク質、およびＣＤ３−ゼータタンパク質からなる群より選択される、１または複数のタンパク質またはそれらの断片を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインである。
具体的な実施形態では、ＣＡＲは、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、共刺激性シグナル伝達領域、およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおこれらからなる。さらなる実施形態では、共刺激性シグナル伝達領域は、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達領域および４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域の一方または両方を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、検出可能なマーカーまたは精製マーカーをさらに含みうる。
ＩＩ．ＣＡＲを調製するための工程
本明細書ではまた、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ発現細胞を作製する方法であって、（ｉ）単離細胞の集団に、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸配列を形質導入するステップと；（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記核酸配列の形質導入に成功した、前記単離細胞の亜集団を選択し、これにより、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ発現細胞を作製するステップとを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる方法も提示される。一態様では、単離細胞は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞からなる群より選択される。
本開示の態様は、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲを含む単離細胞と、このような細胞を作製する方法とに関する。細胞は、原核細胞または真核細胞である。一態様では、細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。真核細胞は、任意の好ましい種に由来することが可能であり、例えば、動物細胞、ヒト、ネコ科動物、またはイヌ科動物細胞などの哺乳動物細胞でありうる。
具体的な実施形態では、単離細胞は、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達領域および／または４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域、ならびにＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる外因性ＣＡＲを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。ある特定の実施形態では、単離細胞は、Ｔ細胞、例えば、動物Ｔ細胞、哺乳動物Ｔ細胞、ネコ科動物Ｔ細胞、イヌ科動物Ｔ細胞、またはヒトＴ細胞である。ある特定の実施形態では、単離細胞は、ＮＫ細胞、例えば、動物ＮＫ細胞、哺乳動物ＮＫ細胞、ネコ科動物ＮＫ細胞、イヌ科動物ＮＫ細胞、またはヒトＮＫ細胞である。
ある特定の実施形態では、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ発現細胞を作製する方法であって、（ｉ）単離細胞の集団に、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲをコードする核酸配列を形質導入するステップと；（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記核酸配列を形質導入することに成功した、細胞の亜集団を選択するステップとを含むか、または代替的にこれらから本質的になる方法が開示される。一部の実施形態では、単離細胞は、Ｔ細胞、動物Ｔ細胞、哺乳動物Ｔ細胞、ネコ科動物Ｔ細胞、イヌ科動物Ｔ細胞またはヒトＴ細胞であり、これにより、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ Ｔ細胞を作製する。ある特定の実施形態では、単離細胞は、ＮＫ細胞、例えば、動物ＮＫ細胞、哺乳動物ＮＫ細胞、ネコ科動物ＮＫ細胞、イヌ科動物ＮＫ細胞、またはヒトＮＫ細胞であり、これにより、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ ＮＫ細胞を作製する。
単離細胞の供給源。本明細書で開示される細胞の拡大および遺伝子改変の前に、細胞を、対象（例えば、自家療法を伴う実施形態における）から得ることもでき、市販の培養物から得ることもできる。
細胞は、対象におけるいくつかの供給源であって、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む供給源から得ることができる。
当技術分野では、対象となる細胞を単離する方法が周知であり、本出願にたやすく適応させることができ；例示的な方法については、下記の実施例で記載する。本開示と関連する使用のための単離法は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）システム；ＳＴＥＭｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＥａｓｙＳｅｐ（商標）、ＲｏｂｏＳｅｐ（商標）、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）、ＳｅｐＭａｔｅ（商標）；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＭＡＣＳ（商標）細胞分離キット、ならびに他の市販の細胞分離および単離キットを含むがこれらに限定されない。免疫細胞の特定の亜集団は、ビーズまたはこのようなキットで利用可能な他の結合剤であって、固有の細胞表面マーカーに特異的なビーズまたは結合剤を使用することにより単離することができる。例えば、ＭＡＣＳ（商標）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを使用して、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を単離することができる。
代替的に、細胞は、Ｔ細胞については、細胞株である、ＢＣＬ２（ＡＡＡ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０２（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ７０Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９００（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ８７Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０１（商標））、ＢＣＬ２ Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９９（商標））、Ｎｅｏ Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９８（商標））を含むがこれらに限定されず；ＮＫ細胞については、細胞株である、ＮＫ−９２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２４０７（商標））、ＮＫ−９２ＭＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２４０８（商標））を含むがこれらに限定されない、市販の細胞培養物を介して得ることができる。
ベクター。ＣＡＲは、ベクターを使用して調製することができる。本開示の態様は、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲをコードする単離核酸配列と、ＣＡＲをコードする単離核酸配列およびその相補体ならびにそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるベクターとに関する。
一部の実施形態では、単離核酸配列は、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達領域および／または４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域、ならびにＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなるＣＡＲをコードする。具体的な実施形態では、単離核酸配列は、（ａ）抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメインに続き、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン、（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメインに続き、（ｄ）ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達領域および／または４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域に続き、（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをコードする配列を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
一部の実施形態では、単離核酸配列は、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメインをコードする配列の上流におけるＫｏｚａｋコンセンサス配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。一部の実施形態では、単離核酸は、抗生物質耐性を付与するポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、単離核酸配列は、ベクター内に含まれる。ある特定の実施形態では、ベクターは、プラスミドである。他の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。具体的な実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。
例示的なベクターの調製および前記ベクターを使用するＣＡＲ発現細胞の作出については、下記の実施例で詳細に論じる。まとめると、天然または合成の、ＣＡＲをコードする核酸の発現は、ＣＡＲポリペプチドまたはその部分をコードする核酸を、プロモーターへと作動可能に連結し、構築物を、発現ベクターへと組み込むことにより達成することが典型的である。ベクターは、真核細胞における複製および組込みに適しうる。当技術分野では、ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を作製するための方法が周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
一態様では、「ベクター」という用語は、非分裂細胞および／または緩徐に分裂する細胞に、感染および形質導入し、標的細胞のゲノムへと組み込む能力を保持する組換えベクターを意図する。いくつかの態様では、ベクターは、野生型ウイルスに由来するか、またはこれに基づく。さらなる態様では、ベクターは、野生型レンチウイルスに由来するか、またはこれに基づく。このようなベクターの例は、限定せずに述べると、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、サル免疫不全症ウイルス（ＳＩＶ）、およびネコ免疫不全症ウイルス（ＦＩＶ）を含む。代替的に、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）など、他のレトロウイルスを、ベクター骨格のためのベースとして使用しうることも想定される。本開示に従うウイルスベクターが、特定のウイルスの構成要素に必ずしも制約されないことは明らかであろう。ウイルスベクターは、２つまたはこれを超える、異なるウイルスに由来する構成要素を含むことが可能であり、また、合成の構成要素も含みうる。ベクターの構成要素を操作して、標的細胞への特異性など、所望の特徴を得ることができる。
本開示の組換えベクターは、霊長動物および非霊長動物に由来する。霊長動物レンチウイルスの例は、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因作用物質である、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、およびサル免疫不全症ウイルス（ＳＩＶ）を含む。非霊長動物のレンチウイルス群は、原型的な「遅発性ウイルス」である、ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）のほか、類縁の、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ならびに、より近年になって記載された、ネコ免疫不全症ウイルス（ＦＩＶ）およびウシ免疫不全症ウイルス（ＢＩＶ）を含む。当技術分野では、先行技術による組換えレンチウイルスベクターが公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，９２４，１２３号；同第７，０５６，６９９号；同第７，０７，９９３号；同第７，４１９，８２９号；および同第７，４４２，５５１号を参照されたい。
米国特許第６，９２４，１２３号は、ある特定のレトロウイルス配列が、標的細胞ゲノムへの組込みを容易とすることについて開示する。この特許は、各レトロウイルスゲノムがｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖと呼ばれる遺伝子であって、ビリオンタンパク質および酵素をコードする遺伝子を含むことについて教示する。これらの遺伝子は、両方の末端において、末端反復（ＬＴＲ）と呼ばれる領域で挟まれている。ＬＴＲは、プロウイルスの組込みおよび転写を担う。ＬＴＲはまた、エンハンサー−プロモーター配列としても用いられる。言い換えると、ＬＴＲは、ウイルス遺伝子の発現を制御しうる。レトロウイルスＲＮＡによるカプシド形成は、ウイルスゲノムの５’末端に配置されたプサイ配列により生じる。ＬＴＲ自体は、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５と呼ばれる３つのエレメントに分けうる、同一な配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に固有の配列に由来する。Ｒは、ＲＮＡの両方の末端において反復される配列に由来し、Ｕ５は、ＲＮＡの５’末端に固有の配列に由来する。３つのエレメントのサイズは、異なるレトロウイルスの間で大幅に変動しうる。ウイルスゲノムでは、ポリ（Ａ）付加部位（終結）は、右側のＬＴＲ内のＲとＵ５との間の境界にある。Ｕ３は、細胞性タンパク質と、場合によって、ウイルス転写活性化タンパク質とに応答性の、プロモーター配列および複数のエンハンサー配列を含む、プロウイルスの転写制御エレメントの大半を含有する。
構造遺伝子である、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ自体に関しては、ｇａｇは、ウイルスの内部構造タンパク質をコードする。ｇａｇタンパク質は、タンパク質分解により、成熟タンパク質ＭＡ（マトリックス）、ＣＡ（カプシド）、およびＮＣ（ヌクレオカプシド）へとプロセシングされる。ｐｏｌ遺伝子は、ゲノムの複製を媒介するＤＮＡポリメラーゼ、関連するＲＮａｓｅ Ｈおよびインテグラーゼ（ＩＮ）を含有する逆転写酵素（ＲＴ）をコードする。
ウイルスベクター粒子を作製するためには、ベクターのＲＮＡゲノムを、宿主細胞内で、それをコードするＤＮＡ構築物から発現させる。ベクターゲノムによりコードされない粒子の構成要素は、宿主細胞内で発現する、さらなる核酸配列（通例、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子の一方または両方を含む「パッケージング系」）により、トランスでもたらされる。ウイルスベクター粒子の作製のために要求される配列のセットは、一過性トランスフェクションにより宿主細胞へと導入することもでき、宿主細胞ゲノムへと組み込むこともでき、諸方法を組み合わせた形でもたらすこともできる。当業者には、関与する技法が公知である。
本開示における使用のためのレトロウイルスベクターは、Ｌｅｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｒｐ．製の、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＬｅｎｔｉシリーズ、ｖｅｒｓｉｏｎ ４、６、および６．２の「ＶｉｒａＰｏｗｅｒ」系；Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの研究室で作出され、使用されているｐＨＩＶ−７−ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製の「Ｌｅｎｔｉ−Ｘ」レンチウイルスベクターである、ｐＬＶＸ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製のｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏ；Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のｐＬｅｍｉＲ；およびＣｈａｒｉｔｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（ＣＢＦ）、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙの研究室で作出され、使用されているｐＬＶを含むがこれらに限定されない。
外因性核酸を、宿主細胞へと導入するか、または、そうではなく、細胞を、本開示の阻害剤へと曝露するのに使用される方法に関わらず、宿主細胞内の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイを実施することができる。このようなアッセイは、例えば、サザンおよびノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲならびにＰＣＲなど、当業者に周知の「分子生物学」アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット）または本明細書で記載されるアッセイにより、特定のペプチドの存在または非存在を検出して、本開示の範囲内に収まる薬剤を同定するアッセイなどの「生化学」アッセイを含む。
パッケージングベクターおよび細胞株。ＣＡＲは、パッケージングベクターおよび細胞株を使用することにより、レトロウイルスパッケージング系へとパッケージングすることができる。パッケージングプラスミドは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターを含むがこれらに限定されない。パッケージングベクターは、遺伝子物質の、細胞への送達を容易とするエレメントおよび配列を含有する。例えば、レトロウイルス構築物は、複製能力のないレトロウイルスベクターをパッケージングするのに要求される全てのビリオンタンパク質をトランスでコードする、複製能力のないレトロウイルスゲノムに由来する、少なくとも１つのレトロウイルスヘルパーＤＮＡ配列を含む、パッケージングプラスミドであり、複製能力のあるヘルパーウイルスの産生を伴わずに、高力価で、複製能力のないレトロウイルスベクターをパッケージングすることが可能なビリオンタンパク質を作製するためのレトロウイルス構築物である。レトロウイルスＤＮＡ配列は、ウイルス５’ＬＴＲの、天然のエンハンサーおよび／またはプロモーターをコードする領域を欠き、ヘルパーゲノムをパッケージングする一因となるプサイ機能配列、および３’ＬＴＲの両方を欠くが、外来のポリアデニル化部位、例えば、ＳＶ４０ポリアデニル化部位と、ウイルスの産生が所望される細胞型内の効率的な転写を導く外来のエンハンサーおよび／またはプロモーターとをコードする。レトロウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）などの白血病ウイルスである。外来のエンハンサーおよびプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）最初期（ＩＥ）エンハンサーおよびプロモーター、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭＭＳＶ）のエンハンサーおよびプロモーター（Ｕ３領域）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＵ３領域、脾臓病巣形成ウイルス（Ｓｐｌｅｅｎ Ｆｏｃｕｓ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｖｉｒｕｓ）（ＳＦＦＶ）のＵ３領域、または天然のモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーターへと接続されたＨＣＭＶ ＩＥエンハンサーでありうる。レトロウイルスパッケージングプラスミドは、プラスミドベースの発現ベクターによりコードされる、２つのレトロウイルスヘルパーＤＮＡ配列からなることが可能であり、この場合、例えば、第１のヘルパー配列は、同種指向性（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）であるＭＭＬＶまたはＧＡＬＶのｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするｃＤＮＡを含有し、第２のヘルパー配列は、ｅｎｖタンパク質をコードするｃＤＮＡを含有する。宿主範囲を決定するｅｎｖ遺伝子は、異種指向性（ｘｅｎｏｔｒｏｐｉｃ）、両種指向性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）、同種指向性、多種指向性（ｐｏｌｙｔｒｏｐｉｃ）（ミンク病巣形成）、もしくは１０Ａ１マウス白血病ウイルスｅｎｖタンパク質、またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）ｅｎｖタンパク質、ヒト免疫不全症ウイルスｅｎｖ（ｇｐ１６０）タンパク質、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）Ｇタンパク質、ヒトＩ型およびＩＩ型Ｔ細胞白血病（ＨＴＬＶ）ｅｎｖ遺伝子産物をコードする遺伝子、前述のｅｎｖ遺伝子のうちの１もしくは複数の組合せに由来するキメラエンベロープ遺伝子、または前述のｅｎｖ遺伝子生成物の細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインをコードするキメラエンベロープ遺伝子、および所望の標的細胞上の特異的表面分子を指向するモノクローナル抗体に由来しうる。
パッケージング工程では、パッケージングプラスミドと、ＬＨＲを発現させるレトロウイルスベクターとを、ヒト胎児性腎細胞、例えば、２９３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５７３、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）など、ウイルスを産生することが可能な、哺乳動物細胞の第１の集団へと一過性に共トランスフェクトして、高力価の組換えレトロウイルス含有上清を作製する。本発明の別の方法では、次いで、この、一過性にトランスフェクトされた細胞の第１の集団を、哺乳動物の標的細胞、例えば、ヒトリンパ球と共培養して、標的細胞に、外来遺伝子を、高効率で形質導入する。本発明のさらに別の方法では、上記で記載した一過性にトランスフェクトされた細胞の第１の集団に由来する上清を、哺乳動物の標的細胞、例えば、ヒトリンパ球または造血幹細胞とインキュベートして、標的細胞に、外来遺伝子を、高効率で形質導入する。
別の態様では、パッケージングプラスミドを、ヒト胎児性腎細胞、例えば、２９３細胞など、ウイルスを産生することが可能な、哺乳動物細胞の第１の集団内で安定的に発現させる。レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターは、選択可能なマーカーによる共トランスフェクションまたは偽型ウイルスの感染により、細胞へと導入する。いずれの場合にも、ベクターは、組み込まれる。代替的に、ベクターは、エピソームで維持されたプラスミドに導入することができる。高力価の組換えレトロウイルス含有上清が作製される。
Ｔ細胞の活性化および拡大：所望のＣＡＲを発現させるＴ細胞の遺伝子的改変の前であれ、後であれ、細胞は、米国特許第６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，９０５，６８０号；同第６，６９２，９６４号；同第５，８５８，３５８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８１号；同第７，１４４，５７５号；同第７，０６７，３１８号；同第７，１７２，８６９号；同第７，２３２，５６６号；同第７，１７５，８４３号；同第５，８８３，２２３号；同第６，９０５，８７４号；同第６，７９７，５１４号；同第６，８６７，０４１号において記載されている方法など、一般に公知の方法を使用して、活性化させ、拡大することができる。ｅｘ ｖｉｖｏにおけるＨＬＡ−Ｇ抗原による刺激は、選択されたＣＡＲを発現させる細胞亜集団を活性化させ、拡大することができる。代替的に、細胞は、ＨＬＡ−Ｇ抗原との相互作用により、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて活性化させることができる。
当技術分野では、対象となる細胞を活性化させる方法が周知であり、本出願にたやすく適応させることができ；例示的な方法については、下記の実施例で記載する。本開示と関連する使用のための単離法は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）システム活性化および拡大キット；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈｏｓｆｌｏｗ（商標）活性化キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＭＡＣＳ（商標）活性化／拡大キット、および対象となる細胞の活性化部分に特異的な、他の市販の細胞キットを含むがこれらに限定されない。免疫細胞の特定の亜集団は、ビーズまたはこのようなキットにおいて利用可能な他の薬剤を使用することにより活性化させるかまたは拡大することができる。例えば、α−ＣＤ３／α−ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を使用して、単離Ｔ細胞の集団を活性化させ、拡大することができる。
ＩＩＩ．使用法
治療的適用。本開示の方法態様は、それを必要とする対象における腫瘍の増殖を阻害し、かつ／またはそれを必要とするがん患者を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、腫瘍は、充実性腫瘍である。一部の実施形態では、腫瘍／がんは、甲状腺腫瘍／甲状腺がん、乳房の腫瘍／乳がん、卵巣腫瘍／卵巣がん、または前立腺腫瘍／前立腺がんである。一部の実施形態では、腫瘍またはがんは、ＨＬＡ−Ｇを発現または過剰発現させる。ある特定の実施形態では、これらの方法は、対象または患者へと、有効量の単離細胞を投与するステップを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。さらなる実施形態では、この単離細胞は、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲを含む。なおさらなる実施形態では、単離細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。一部の実施形態では、単離細胞は、処置される対象または患者に対して自家である。さらなる態様では、腫瘍は、ＨＬＡ−Ｇ抗原を発現させ、対象は、本明細書で記載される診断法などの診断法により、治療のために選択されている。
本明細書で開示されるＣＡＲ細胞は、単独で投与することもでき、希釈剤、公知の抗がん治療剤、および／またはサイトカインもしくは免疫刺激性である他の細胞集団など、他の構成要素と組み合わせて投与することもできる。これらは、第１選択治療、第２選択治療、第３選択治療、またはさらなる治療として投与することができる。さらなる治療の非限定的な例は、化学療法剤または生物学的薬剤を含む。適切な処置レジメンは、主治医または主治獣医が決定する。
本発明の医薬組成物は、処置または防止される疾患に適切な形で投与することができる。投与の数量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類および重症度などの因子により決定されるが、適切な投与量は、臨床試験により決定することができる。
ＩＶ．担体
本発明のさらなる態様は、担体と、本明細書で開示される実施形態において記載される生成物（例えば、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲを含む単離細胞、任意の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体またはＣＡＲ細胞のための単離核酸、ベクター、単離細胞、抗ＨＬＡ−Ｇ）のうちの１または複数とを含む組成物に関する。
略述すると、特許請求される組成物のうちのいずれか１つを含むがこれに限定されない、本発明の医薬組成物は、１または複数の、薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせた、本明細書で記載される標的細胞集団を含みうる。このような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含みうる。本開示の組成物は、経口、静脈内、局所、経腸、および／または非経口投与のために製剤化することができる。ある特定の実施形態では、本開示の組成物を、静脈内投与のために製剤化する。
細胞または組成物の投与は、単回用量で行うこともでき、処置の過程を通して、連続的に行うこともでき、間欠的に行うこともできる。最も有効な投与手段および投与量を決定する方法は、当業者に公知であり、治療のために使用される組成物、治療目的、および処置される対象と共に変動するであろう。主治医が選択する用量レベルおよびパターンにより、単回投与を実行することもでき、複数回投与を実行することもできる。当技術分野では、適切な投与製剤および薬剤を投与する方法が公知であ。さらなる態様では、本発明の細胞および組成物を、他の処置と組み合わせて投与することができる。
当技術分野で公知であり、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６４１９１において記載されている方法を使用して、細胞および細胞集団を、宿主へと投与する。本発明の細胞または組成物のこの投与は、実験的およびスクリーニングアッセイのための、所望の疾患、障害、または状態についての動物モデルを作出するために行うことができる。
以下の例は、本開示を実行に移す、多様な場合に使用しうる手順を例示する。
（実施例１−マウス抗ヒトＨＬＡ−Ｇモノクローナル抗体の作出）
抗原
ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原のアルファ鎖Ｇ抗原は、ＭｙｂｉｏＳｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ（型番：ＭＢＳ７１７４１０）から購入した。これは、細菌内で作られた組換えタンパク質であり、ＨＩＳタグ、５０ＫＤの分子量（９０％純度）、およびＧＳＨＳＭＲＹＦＳＡ ＡＶＳＲＰＧＲＧＥＰ ＲＦＩＡＭＧＹＶＤＤ ＴＱＦＶＲＦＤＳＤＳ ＡＣＰＲＭＥＰＲＡＰ ＷＶＥＱＥＧＰＥＹＷ ＥＥＥＴＲＮＴＫＡＨ ＡＱＴＤＲＭＮＬＱＴ ＬＲＧＹＹＮＱＳＥＡ ＳＳＨＴＬＱＷＭＩＧ ＣＤＬＧＳＤＧＲＬＬ ＲＧＹＥＱＹＡＹＤＧ ＫＤＹＬＡＬＮＥＤＬ ＲＳＷＴＡＡＤＴＡＡ ＱＩＳＫＲＫＣＥＡＡ ＮＶＡＥＱＲＲＡＹＬ ＥＧＴＣＶＥＷＨＬＡ−Ｇ ＹＬＥＮＧＫＥＭＬＱ ＲＡＤＰＰＫＴＨＶＴ ＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴ ＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰ ＡＥＩＩＬＴＷＱＲＤ ＧＥＤＱＴＱＤＶＥＬ ＶＥＴＲＰＡＧＤＧＴ ＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰ ＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨ ＶＱＨＥＧＬＰＥＰＬ ＭＬＲＷＫＱＳＳＬＰ ＴＩＰＩＭＧＩ ＶＡＧＬＶＶＬＡＡＶ ＶＴＧＡＡＶＡＡＶＬ ＷＲＫＫＳＳＤ（配列番号３０）の配列を有する。
免疫化手順
Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入された、４週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、完全フロイントアジュバント（初回および２回目の免疫化）または不完全フロイントアジュバント（３回目および４回目の免疫化）で乳化させた１０μｇの抗原により、２週間ごとに４回免疫化した。マウスに、免疫化１回当たり、マウスの背部における、３つの個別のスポットへと分けられた、合計２５μｇの抗原／アジュバントを皮内注射した。最終回の免疫化の１０日後、血液試料を得、抗原でコーティングしたプレート上のＥＬＩＳＡ手順により滴定した。次いで、最高力価を示すマウスの静脈内に、５回目の免疫化ブーストを、アジュバントを伴わずに施したが、この場合、側方尾静脈を介して、滅菌リン酸緩衝食塩水の１００μｌ溶液中の１０μｇを注射した。
ハイブリドーマの作出
４日後、これらのマウスを屠殺し、ハイブリドーマ手順のために、脾臓を摘出した。脾臓細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地溶液中に分散させた後で、ＰＥＧ（Ｈｙｂｒｉ ＭＡＸ、分子量：１４５０、型番：ｐ７１８１、Ｓｉｇｍａ）を使用して、脾臓細胞を、マウスＮＳＯ細胞と融合させた。次いで、ＨＡＴ選択を使用して、融合した細胞だけを増殖させた。次いで、ハイブリドーマ細胞を増殖させるウェルからの上清を、まず、抗原でコーティングしたプレートに対するＥＬＩＳＡにより、次いで、ＨＬＡ−Ｇ陽性および陰性のヒト腫瘍細胞株（ＪＡＲ栄養膜癌）についてのフローサイトメトリーによりスクリーニングした。正で高値の平均蛍光指数（ＭＦＩ）を示すハイブリドーマを、限界希釈法によるサブクローニングのために選択した。次いで、サブクローンを、フローサイトメトリーにより再度調べ、液体窒素中で凍結させ、２Ｌの容器中で拡大してから、抗体を、タンデム（ｔａｎｄｏｎ）のプロテインＡまたはＧおよびイオン交換クロマトグラフィー法により精製した。次いで、精製された抗体を、バイアルに入れ、使用するまで、−２０℃で保管した。
フローサイトメトリーの手順およびデータ
抗原でコーティングしたプレートに対するＥＬＩＳＡにより陽性であることが見出されたハイブリドーマからの上清を使用して、フローサイトメトリーを使用するスクリーニング法を、ＨＬＡ−Ｇ陽性細胞株（ＪＥＧ−３栄養膜癌）および陰性細胞株（Ｋ５６２、Ｊｕｒｋａｔ）に対して実施した。次いで、高い平均蛍光指数（ＭＦＩ）をもたらすハイブリドーマをサブクローニングし、ＨＬＡ−Ｇに対する選択的陽性度（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ）について再スクリーニングした。下記の図１に示される通り、親ハイブリドーマである、３Ｈ１１および４Ｅ３のサブクローンは、ＨＬＡ−Ｇを発現させるＪＥＧ−３細胞株に対して、高ＭＦＩをもたらし続けた。これらのデータから、下記で記載される通りに、ＣＡＲ−Ｔ細胞を作出するのに、３Ｈ１１−１２および４Ｅ３−１を選択した。
選択された抗体による免疫組織化学
抗体である４Ｅ３およびそのサブクローンは、標準的な免疫組織化学手順および抗原回復法を使用してＨＬＡ−Ｇ陽性組織を染色することを見出した。図２Ａ〜２Ｄに示す通り、乳頭状甲状腺癌など、抗原陽性腫瘍の細胞質および細胞膜のいずれにおいても、ＨＬＡ−Ｇの陽性度が見られた（図２Ａ、２Ｂ）が、そのＨＬＡの発現を保持する（図２Ｄ）正常甲状腺組織では、ＨＬＡ−Ｇは陰性であった（図２Ｃ）。免疫組織化学を使用する、ＨＬＡ−Ｇについてのコンパニオン診断抗体の利用可能性は、来るべき臨床試験において、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ Ｔ細胞療法から利益を得る可能性が高い患者の同定を可能とするであろう。
（実施例２−ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ Ｔ細胞の作出）
単鎖ＨＬＡ−Ｇ抗体遺伝子の構築および合成
本発明者らの研究室で作出された、２つの高結合性抗ＨＬＡ−Ｇ抗体（４Ｅ３−１および３Ｈ１１−１２）のＤＮＡ配列は、ＭＣＬＡＢ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）から得た。両方の抗体を試験して、下記で記載されるアッセイにおいて、どの抗体が、最も有効なＣＡＲをもたらすのかを決定する。下記で示される通り、以下のタンデム遺伝子：コザックコンセンサス配列；ＣＤ８シグナルペプチド；抗ＨＬＡ−Ｇ重鎖可変領域；（グリシン４セリン）３可撓性ポリペプチドリンカー；それぞれの抗ＨＬＡ−Ｇ軽鎖可変領域；ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン；ならびにＣＤ２８、４−１ＢＢ、およびＣＤ３ζ細胞内共刺激性シグナル伝達ドメインからなる、第２世代または第３世代（図３）のＣＡＲベクターを構築する。ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインのＤＮＡ配列は、Ｃａｒｌ Ｊｕｎｅによる特許（ＵＳ２０１３０２８７７４８Ａ１を参照されたい）から確認される。抗ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ遺伝子は、Ｇｅｎｅｗｉｚ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ）が、ベクター宿主にアンピシリン耐性を付与する、ｂｌａ遺伝子を含有するｐＵＣ５７ベクター骨格内で合成する。
ＣＡＲ遺伝子の、レンチウイルスプラスミドへのサブクローニング
ＮｏｖａＢｌｕｅ Ｓｉｎｇｌｅｓ（商標）化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を、抗ＨＬＡ−ＧプラスミドｃＤＮＡで形質転換する。形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞の増殖後、ＣＡＲプラスミドを精製し、一晩にわたるＴ４ ＤＮＡリガーゼ反応（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を介して、ＨＩＶ−１末端反復（ＬＴＲ）、パッケージングシグナル（Ψ）、ＥＦ１αプロモーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、およびウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含有するＨＩＶ−１ベースのレンチウイルスベクターへと挿入されるように、適切な制限酵素で消化する。次いで、ＮｏｖａＢｌｕｅ Ｓｉｎｇｌｅｓ（商標）化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を、結果として得られる、抗ＨＬＡ−Ｇを含有するレンチウイルスプラスミドで形質転換する。
レンチウイルス粒子の作製
トランスフェクションの前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０ｍＬのｃｏｍｐｌｅｔｅ−Ｔｅｔ−ＤＭＥＭ中に、１００ｍｍの組織培養処理プレート１枚当たりの細胞４．０×１０６個で播種し、加湿された５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、一晩にわたりインキュベートする。８０〜９０％コンフルエントに達したら、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に結合するプラスミド含有ナノ粒子の形成を容易とするように特許権のある反応緩衝液およびポリマーに加えて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＣＡＲ遺伝子のレンチウイルスプラスミドと、レンチウイルスのエンベロープ構成要素およびカプシド構成要素を形成するのに必要な遺伝子を含有するレンチウイルスパッケージングプラスミドとを共トランスフェクトする。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養物を、３７℃で、４時間にわたりインキュベートした後で、トランスフェクション培地を、新鮮なｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｔｅｔ ＤＭＥＭ １０ｍＬで置きかえる。次いで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、さらなる４８時間にわたりインキュベートし、その後、細胞上清を採取し、主要なレンチウイルスカプシドタンパク質である、ｐ２４に対するサンドイッチＥＬＩＳＡを介して、レンチウイルス粒子について調べる。レンチウイルス含有上清をアリコートに分け、標的であるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に形質導入するために使用するまで、−８０℃で保管する。
ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋末梢血Ｔ細胞の精製、活性化、および濃縮
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を伴う密度勾配遠心分離により濃縮された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳを伴う遠心分離により回収および洗浄する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞についてポジティブ選択するように、磁気的に活性化させたＬＳカラムを使用して、これらのヒトＴ細胞サブセットを単離するのに、ＭＡＣＳ ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）キットを使用する。次いで、磁気的に結合したＴ細胞を、ＭＡＣＳ磁気分離器から取り出し、ＬＳカラムからフラッシュ洗浄し、新鮮な完全培地中で洗浄する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の純度は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用するフローサイトメトリーにより評価し、必要な場合、ＵＳＣのフローサイトメトリーコア施設で実施される蛍光活性化細胞分取により濃縮する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、適切な細胞培養容器内で、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を補充された完全培地中、１ｍＬ当たりの細胞１．０×１０６個の密度で維持し、これに、α−ＣＤ３／α−ＣＤ２８ Ｈｕｍａｎ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｓｌｂａｄ、ＣＡ）を添加して、培養Ｔ細胞を活性化させる。Ｔ細胞に、ＣＡＲ−レンチウイルス粒子を用いて形質導入する前に、５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２日間にわたりインキュベートする。
ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入
活性化Ｔ細胞を回収し、死細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離、またはＭＡＣＳ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の使用により除去する。６ウェルプレートに、活性化Ｔ細胞を、完全培地１ｍＬ当たりの細胞１．０×１０６個の濃度で播種する。種々のウェルに対して、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ含有レンチウイルス粒子を、細胞懸濁液へと、１、５、１０、および５０など、感染多重度（ＭＯＩ）を変化させて添加する。レンチウイルス粒子と、標的細胞表面との間の相互作用を容易とすることにより、形質導入を支援するカチオン性ポリマーであるポリブレンを、４μｇ／ｍＬの最終濃度で添加する。プレートを、３２℃、８００×ｇで、１時間にわたり遠心分離する。遠心分離後、レンチウイルス含有培地を吸引し、細胞ペレットを、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を伴う、新鮮な完全培地中に再懸濁させる。細胞を、５％ＣＯ２の加湿されたインキュベーター内、３７℃で一晩にわたり静置する。形質導入の３日後、細胞をペレット化させ、ＩＬ−２および４００μｇ／ｍＬのジェネティシン（Ｇ４１８スルフェート）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を伴う、新鮮な完全培地中に再懸濁させる。ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ改変Ｔ細胞は、フローサイトメトリーおよびサザンブロット解析により評価して、形質導入手順の成功を裏付ける。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイの前に、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＦＡＣＳにより濃縮し、ｉｎ ｖｉｖｏ研究のために、１：１に混合する。
カルセイン放出細胞傷害アッセイによる、ＣＡＲの有効性についてのｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
ＨＬＡ−Ｇ抗原陽性および陰性ヒト細胞株を、回収し、洗浄し、完全培地中に１ｍＬ当たりの細胞１．０×１０６個の濃度で再懸濁させる。カルセイン−アセトキシメチル（ＡＭ）を、１５μＭで、標的細胞試料へと添加し、次いで、これを、５％ＣＯ２の加湿されたインキュベーター内、３７℃で、３０分間にわたりインキュベートする。染色した陽性および陰性標的細胞を、２回洗浄し、遠心分離により、完全培地中に再懸濁させ、ウェル１つ当たりの細胞１．０×１０４個で、９６ウェルプレートへと添加する。ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ Ｔ細胞を、完全培地中に、５０：１、５：１、および１：１のエフェクター対標的細胞比で、プレートへと添加する。完全培地および２％のｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を伴う完全培地中に懸濁させた染色標的細胞を、それぞれ、自発的放出対照および最大放出対照として用いる。プレートを、３６５×ｇおよび２０℃で、２分間にわたり遠心分離してから、インキュベーターに戻して、３時間にわたり静置する。次いで、プレートを、１０分間にわたり遠心分離し、細胞上清を、黒色のポリスチレン製９６ウェルプレート上のそれぞれのウェルへとアリコートに分け、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）ＨＴマイクロプレートリーダー上、それぞれ、４８５／２０ｎｍおよび５２８／２０ｎｍの励起および発光で、蛍光について評価する。
Ｌｕｍｉｎｅｘバイオアッセイによるヒトサイトカインの定量化。
研究室で慣例的に実施される標準的な手順を使用して、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ改変Ｔ細胞ならびにＨＬＡ−Ｇ陽性および陰性腫瘍細胞株の上清を、ＣＡＲ Ｔ細胞活性化の尺度としてのサイトカインの分泌について測定する。バックグラウンドの活性を同定するために、非活性化ヒトＴ細胞を使用して、データを、培地単独および培養物と比較する。ＩＬ−２、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−１２、および他の関連するサイトカインの濃度を、インキュベーション工程中の時間にわたり測定する。
２つのＨＬＡ−Ｇ陽性がん異種移植片モデルにおける、ＣＡＲ Ｔ細胞有効性についてのｉｎ ｖｉｖｏ評価
２つの異なるヒト腫瘍細胞株異種移植片腫瘍モデルを使用して、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、さらに評価する。いずれのモデルについても、５×１０６個のＨＬＡ−Ｇ陽性またはＨＬＡ−Ｇ陰性充実性腫瘍細胞株の注射により、充実性腫瘍を、６〜８週齢の雌ヌードマウスの皮下において確立する。腫瘍が、０．５ｃｍの直径に達したら、マウス（ｎ＝５）の群を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究の結果に基づき、最も活性のＨＬＡ−Ｇ抗体から構築された１または３×１０７個の、陰性対照としてのヒトＴ細胞またはＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ Ｔ細胞で、静脈内において処置する。次いで、腫瘍容量を、キャリパーにより、毎週３回測定し、容量増大曲線を作成して、実験的処置の、対照を上回る有効性を裏付ける。
ＨＬＡ−Ｇは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃの発現を喪失して、免疫認識を回避するヒト充実性腫瘍を処置するためのＣＡＲ Ｔ細胞開発にとって、傑出した標的であることが見出されている。これは、妊娠中の胎盤を例外として、正常組織内の発現が最小限であり、したがって、患者におけるオフターゲットの陽性度および毒性が極めて限定的であるはずである。
（実施例３−抗ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ Ｔ細胞）
ＣＡＲレンチウイルス構築物の構築
ＣＡＲは、ＨＬＡ−Ｇに特異的に結合する、細胞外抗原結合性部分またはｓｃＦＶからなる。ｓｃＦＶは、ＣＤ８ヒンジ領域を介して、ＣＤ８膜貫通領域を含む細胞質シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ２８、４−１ＢＢ、およびＣＤ３ｚに由来するシグナル伝達ドメイン（図５）へと接続される。シグナル伝達ドメインを含むｓｃＦＶ配列は、合成により、Ｇｅｎｅｗｉｚ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が合成した。プラスミドを精製し、一晩にわたるＴ４ ＤＮＡリガーゼ反応（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を介して、ＨＩＶ−１ ５’および３’末端反復（ＬＴＲ）、パッケージングシグナル（Ψ）、ＥＦ１αプロモーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびサルウイルス４０起点（ＳＶ４０）を含有するＨＩＶ−１ベースのバイシストロニックレンチウイルスベクター（ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓｉｇｎａｌ Ｈｉｌｌ、ＣＡ）へと挿入されるように、適切な制限酵素で消化する。次いで、ＮｏｖａＢｌｕｅ Ｓｉｎｇｌｅｓ（商標）化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を、結果として得られる、ＣＡＲを含有するレンチウイルスプラスミドで形質転換する。
レンチウイルス粒子の作製
トランスフェクションの前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％の透析ＦＣＳを補充した、２０ｍＬのＤＭＥＭ中に１５０ｃｍ２の組織培養処理フラスコ１つ中の細胞４．０×１０６個で播種し、加湿された５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、一晩にわたりインキュベートする。８０〜９０％コンフルエントに達したら、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、加湿された５％ＣＯ２インキュベーター内のペニシリン／ストレプトマイシンを伴わない、１％の透析ＦＣＳを補充した、２０ｍｌのＤＭＥＭ中、３７℃で、２時間にわたりインキュベートする。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ｐＬＶＸ−Ｂ７−Ｈ４−ＣＡＲプラスミドと、レンチウイルスのエンベロープ構成要素およびカプシド構成要素を形成するのに必要な遺伝子を含有するレンチウイルスパッケージングプラスミドとを共トランスフェクトする。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に結合するプラスミド含有ナノ粒子の形成を容易とするように、特許権のある反応緩衝液およびポリマーもまた添加する。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養物を、３７℃で、２４時間にわたりインキュベートした後で、トランスフェクション培地を、新鮮な完全ＤＭＥＭ ２０ｍＬで置きかえる。レンチウイルス上清を、２４時間ごとに、３日間にわたり回収し、上清を、４℃、１，２５０ｒｐｍで、５分間にわたり遠心分離するのに続き、濾過滅菌および超遠心分離機内、４℃、２０，０００ｇで、２時間にわたる遠心分離を行う。濃縮されたレンチウイルスは、７％のトレハロースおよび１％ＢＳＡを補充したＰＢＳ中に再懸濁させる。次いで、レンチウイルスを、標的であるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に形質導入するために使用するまで、アリコート中、−８０℃で保管する。２４時間後に採取された細胞上清を、主要なレンチウイルスカプシドタンパク質である、ｐ２４に対するサンドイッチＥＬＩＳＡを介して、レンチウイルス粒子について調べる。蛍光タンパク質マーカーであるＺｓＧｒｅｅｎの、蛍光顕微鏡下における可視化により決定されるトランスフェクション効率は、３０％〜６０％の間であると推定された。
ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋末梢血Ｔ細胞の精製、活性化、および濃縮
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を伴う密度勾配遠心分離により濃縮された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳを伴う遠心分離により回収および洗浄する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞についてのネガティブ選択を使用して、これらのヒトＴ細胞サブセットを磁気的に単離するのに、Ｔ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の純度は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用するフローサイトメトリーにより評価し、蛍光活性化細胞分取により濃縮する。１：１に混合されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、適切な細胞培養容器内で、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を補充された完全な５０％のクリック培地／５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地中、１ｍＬ当たりの細胞１．０×１０６個の密度で維持し、これに、α−ＣＤ３／α−ＣＤ２８ Ｈｕｍａｎ Ｔ−ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒビーズ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加して、培養Ｔ細胞を活性化させる。次いで、Ｔ細胞に、ＣＡＲレンチウイルス粒子を用いて形質導入する前に、５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２日間にわたりインキュベートする。
ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入
活性化Ｔ細胞を回収し、死細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離、またはＭＡＣＳ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の使用により除去する。６ウェルプレートに、活性化Ｔ細胞を、完全培地中、１ｍＬ当たりの細胞１．０×１０６個の濃度で播種する。細胞に、細胞へのトランスフェクション補助剤である、Ｌｅｎｔｉｂｌａｓｔ（Ｏｚ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を補充したレンチウイルス粒子を用いて形質導入する。次いで、形質導入された細胞を、加湿された５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２４時間にわたりインキュベートする。細胞をスピンダウンし、培地を交換するのに続き、Ｔ−ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒビーズ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を添加する。
細胞傷害アッセイ
ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）細胞傷害キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して決定する。活性化Ｔ細胞を回収し、１×１０６個の細胞に、上記で記載したＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲレンチウイルス構築物を形質導入する。Ｔ−ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒビーズ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、２日間にわたり細胞を活性化させてから、細胞傷害アッセイを行う。製造元のプロトコールに従い、標的細胞の最適数を決定する。アッセイのために、適切な標的細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２４時間にわたり、９６ウェルプレート内で三連で平板培養するのに続き、活性化ＣＡＲ Ｔ細胞を、２０：１、１０：１、５：１、および１：１の比で添加し、５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２４時間にわたりインキュベートする。細胞を、３７℃で、４５分間にわたり溶解させ、１，２５０ｒｐｍで、５分間にわたり遠心分離する。次いで、上清を、未使用の９６ウェルプレートへと移すのに続き、反応混合物を、３０分間にわたり添加する。停止溶液を使用して、反応を停止させ、６５０ｎｍで吸光度補正して、プレートを、４５０ｎｍで読み取る。
ウェスタンブロット法
ＲＩＰＡ緩衝液を使用して、ＨＬＡ−ＣＡＲを発現させるＴ細胞を溶解させる。タンパク質濃度は、ブラッドフォード法により推定する。５０マイクログラムのタンパク質溶解物を、１２％の還元ポリアクリルアミドゲル上で泳動させるのに続き、ニトロセルロース膜へと移す。膜は、０．０５％のＴｗｅｅｎを補充したＴＢＳ中に５％の脱脂粉乳中で、１時間にわたりブロッキングする。次いで、ＣＤ３ζに特異的な抗体（１：２５０）を使用して、膜を、４℃で、一晩にわたりインキュベートする。３回の洗浄の後、膜を、二次抗体中でインキュベートし、化学発光を使用して、バンドを検出する。膜をストリッピングし、β−アクチンについて再プローブする。
ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍退縮アッセイ
Ｆｏｘｎ１ヌルマウスに、ＨＬＡ−Ｇを発現させる悪性卵巣がん細胞株であるＳＫＯＶ３を注射する。０．２ｍＬの接種物を使用して、２００ｕｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の２×１０６個のＳＫＯＶ３細胞を、マウスの左脇腹へと注射する。αＣＤ３／ＣＤ２８ ａｃｔｉｖａｔｏｒ複合体（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で、Ｔ細胞を、２日間にわたり活性化させる。次いで、活性化Ｔ細胞に、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲレンチウイルス粒子を用いて形質導入するのに続き、αＣＤ３／ＣＤ２８ ａｃｔｉｖａｔｏｒ複合体により、さらに２日間にわたり活性化する。ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲを発現させる活性化Ｔ細胞（２．５×１０６個）を、腫瘍接種後７日目に、マウスへと注射する。ノギスを使用して、毎週２回、腫瘍サイズを評価し、容量を計算する。
ＨＬＡ−ＧＣＡＲ Ｔ細胞についての細胞傷害
卵巣細胞株であるＳＫＯＶ３（図６）を使用して、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞溶解活性について検討した。ＳＫＯＶ３は、ＦＡＣＳ解析により決定される通り、ＨＬＡ−Ｇを発現させる。ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ Ｔ細胞を、２０：１、１０：１、５：１、および１：１のエフェクター細胞対標的細胞比で、ＳＫＯＶ３へと添加した。１０：１の比で、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ Ｔ細胞は、４２％の溶解率で、標的ＳＫＯＶ３細胞の溶解の増大を示す。これと比較して、非形質導入Ｔ細胞は、試験した比のいずれでも、ＳＫＯＶ３細胞を溶解させなかった。
ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲのタンパク質発現
ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞は、ウェスタンブロット法により示される（図７）通り、ＣＡＲのタンパク質を発現させる。ＣＡＲの推定サイズは、約６０ｋＤａである。β−アクチンを、ローディング対照として使用した。ＣＡＲのために使用されるシグナル伝達ドメインをターゲティングする、ＣＤ３ζ抗体を使用して、ＣＡＲタンパク質を検出した。
均等物
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本技術が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。
本明細書で例示的に記載される本技術は、本明細書では具体的に開示されない、任意の１または複数の要素、１または複数の限定の非存在下で、適切に実施することができる。したがって、例えば、「〜を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を含有すること」などの用語は、広く、限定を伴わずに読み取られるべきものである。加えて、本明細書で利用される用語および表現は、限定的な用語ではなく、記載的な用語として使用されており、このような用語および表現の使用において、示され、記載される特徴の、任意の均等物またはそれらの部分を除外する意図は存在しないが、特許請求される本技術の範囲内では、多様な改変が可能であることが認識されている。
したがって、本明細書で提示される材料、方法、および例は、好ましい態様を表すものであり、例示的なものであり、本技術の範囲に対する限定として意図されるものではないことを理解すべきである。
本明細書では、本技術について、広く、かつ、一般的に記載してきた。一般的開示の中に収まるより狭い種および亜属的群分けの各々もまた、本技術の一部を形成する。これは、本技術についての一般的記載であって、排除される材料が、本明細書で具体的に列挙されるのかどうかに関わらず、任意の対象物を属から除外する条件または否定的限定を伴う記載を含む。
加えて、マーカッシュ群との関係で、本技術の特徴または態様について記載する場合、当業者は、本技術が、これにより、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの亜群との関係でもまた記載されることを認識するであろう。
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、各々が参照により個別に組み込まれた場合と同じ程度に、参照によりそれらの全体において明示的に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が支配する。
他の態様は、以下の特許請求の範囲において明示される。

Claims (30)

  1. 重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列と、軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列とを含む単離抗体、またはその抗原結合性断片であって、アミノ酸配列：
    ＧＳＨＳＭＲＹＦＳＡ ＡＶＳＲＰＧＲＧＥＰ ＲＦＩＡＭＧＹＶＤＤ ＴＱＦＶＲＦＤＳＤＳ ＡＣＰＲＭＥＰＲＡＰ ＷＶＥＱＥＧＰＥＹＷ ＥＥＥＴＲＮＴＫＡＨ ＡＱＴＤＲＭＮＬＱＴ ＬＲＧＹＹＮＱＳＥＡ ＳＳＨＴＬＱＷＭＩＧ ＣＤＬＧＳＤＧＲＬＬ ＲＧＹＥＱＹＡＹＤＧ ＫＤＹＬＡＬＮＥＤＬ ＲＳＷＴＡＡＤＴＡＡ ＱＩＳＫＲＫＣＥＡＡ ＮＶＡＥＱＲＲＡＹＬ ＥＧＴＣＶＥＷＬＨＲ ＹＬＥＮＧＫＥＭＬＱ ＲＡＤＰＰＫＴＨＶＴ ＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴ ＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰ ＡＥＩＩＬＴＷＱＲＤ ＧＥＤＱＴＱＤＶＥＬ ＶＥＴＲＰＡＧＤＧＴ ＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰ ＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨ ＶＱＨＥＧＬＰＥＰＬ ＭＬＲＷＫＱＳＳＬＰ ＴＩＰＩＭＧＩ ＶＡＧＬＶＶＬＡＡＶ ＶＴＧＡＡＶＡＡＶＬ ＷＲＫＫＳＳＤ（配列番号３０）を含む、ＨＬＡ−Ｇのエピトープに結合し、
    （１）前記ＨＣが、
    （ａ）アミノ酸配列ＧＦＮＩＫＤＴＹ（配列番号１）で示されるＨＣ ＣＤＲＨ１；
    （ｂ）アミノ酸配列ＩＤＰＡＮＧＮＴ（配列番号３）で示されるＨＣ ＣＤＲＨ２；および
    （ｃ）アミノ酸配列ＡＲＳＹＹＧＧＦＡＹ（配列番号５）で示されるＨＣ ＣＤＲＨ３
    を含み；かつ
    前記ＬＣが、
    （ａ）アミノ酸ＫＳＶＳＴＳＧＹＳＹ（配列番号１１）で示されるＬＣ ＣＤＲＬ１；
    （ｂ）アミノ酸配列ＬＶＳ（配列番号１３）で示されるＬＣ ＣＤＲＬ２；および
    （ｃ）アミノ酸配列ＱＨＳＲＥＬＰＲＴ（配列番号１５）で示されるＬＣ ＣＤＲＬ３
    を含み、あるいは
    （２）前記ＨＣが、
    （ａ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＮＴＹＡ（配列番号２）で示されるＨＣ ＣＤＲＨ１；
    （ｂ）アミノ酸配列ＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴ（配列番号４）で示されるＨＣ ＣＤＲＨ２；および
    （ｃ）アミノ酸配列ＶＲＧＧＹＷＳＦＤＶ（配列番号６）で示されるＨＣ ＣＤＲＨ３
    を含み；かつ
    前記ＬＣが、
    （ａ）アミノ酸ＫＳＶＳＴＳＧＹＳＹ（配列番号１１）で示されるＬＣ ＣＤＲＬ１；
    （ｂ）アミノ酸配列ＲＭＳ（配列番号１４）で示されるＬＣ ＣＤＲＬ２；および
    （ｃ）アミノ酸配列ＭＱＨＬＥＹＰＹＴ（配列番号１６）で示されるＬＣ ＣＤＲＬ３
    を含む、単離抗体。
  2. 前記ＨＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、配列番号８のアミノ酸配列を含み、および前記ＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、配列番号１８のアミノ酸配列を含み、または前記ＨＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、および前記ＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、あるいはそれらの各々の少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する同等物を含む、請求項１に記載の抗体。
  3. 前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体の群より選択され、前記抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、およびＦｖからなる群より選択される、請求項１から２のいずれか一項に記載の抗体。
  4. 請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体、および任意選択で、検出可能な標識を含む、単離ｅｘ ｖｉｖｏ複合体。
  5. 請求項４に記載の複合体を含む単離ｅｘ ｖｉｖｏ細胞。
  6. 生物学的試料中のＨＬＡ−Ｇを検出するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、前記試料を、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体と接触させるステップと、前記抗体または前記抗原結合性断片の、ＨＬＡ−Ｇへの結合により形成された複合体を検出するステップとを含む、方法。
  7. 前記試料が、細胞試料または組織試料を含み、任意選択で、前記試料が、がんを有すると診断されているか、がんを有すると疑われているか、またはがんを有する危険性がある対象から得られる、請求項６に記載の方法。
  8. 前記がんが、前立腺がんまたは卵巣がんからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
  9. 前記検出が、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ウェスタンブロット法、フローサイトメトリー、またはＥＬＩＳＡのうちの１または複数を含む、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 対象、任意選択で哺乳動物から単離された試料中の病的細胞を検出する方法であって、
    （ａ）前記試料中のＨＬＡ−Ｇに結合する、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体により形成された複合体を検出することにより、前記対象に由来する生物学的試料中のＨＬＡ−Ｇのレベルを検出するステップであって、任意選択で、前記対象に由来する生物学的試料が、前立腺または卵巣から単離された試料のうちの１または複数を含む、ステップと；
    （ｂ）ステップ（ａ）において観察されたＨＬＡ−Ｇのレベルを、対照の生物学的試料中で観察されるＨＬＡ−Ｇのレベルと比較するステップと
    を含み、
    ＨＬＡ−Ｇのレベルが、前記対照の生物学的試料中で観察されるレベルと比較して上昇する場合に、前記病的細胞が検出され、ＨＬＡ−Ｇのレベルが、前記対照の生物学的試料中で観察されるレベルと比較して上昇しない場合に、前記病的細胞が検出されない、
    方法。
  11. 前記検出が、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ウェスタンブロット法、フローサイトメトリー、またはＥＬＩＳＡのうちの１または複数を含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記哺乳動物が、マウス、ネコ科動物、イヌ科動物、ヒツジ、ウシ、サル、およびヒトの群より選択される、請求項１０から１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. ＨＬＡ−Ｇを検出するためのキットであって、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体と、使用のための指示とを含む、キット。
  14. 腫瘍試料中のＨＬＡ−Ｇを検出するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
    （ａ）前記試料を、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体と接触させるステップと；
    （ｂ）前記抗体または前記抗原結合性断片の、ＨＬＡ−Ｇへの結合により形成された複合体を検出するステップと
    を含む、方法。
  15. （ａ）抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメイン；（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達領域および／または４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域；ならびに（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記抗ＨＬＡ−Ｇ抗体が、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体である、ＣＡＲ。
  16. 検出可能なマーカーまたは精製マーカーをさらに含む、請求項１５に記載のＣＡＲ。
  17. 請求項１５または１６に記載のＣＡＲをコードする単離核酸配列またはその相補体またはそれらの各々の同等物。
  18. 抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメインまたはＨＬＡ−Ｇリガンドの上流に配置されたＫｏｚａｋコンセンサス配列、および／あるいは抗生物質耐性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１７に記載の単離核酸。
  19. 請求項１７または１８に記載の単離核酸配列を含むベクター。
  20. 請求項１５または１６に記載のＣＡＲ；および／または請求項１７または１８に記載の単離核酸；および／または請求項１９に記載のベクターを含む単離細胞。
  21. Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、請求項２０に記載の単離細胞。
  22. 請求項１から３のいずれか一項に記載の単離抗体をコードする単離核酸またはその相補体。
  23. 担体と、請求項１５もしくは１６に記載のＣＡＲを含む単離細胞；および／または請求項１７、１８もしくは２２に記載の単離核酸；および／または請求項１９に記載のベクター；および／または請求項２０もしくは２１に記載の単離細胞；および／または請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体；および／または請求項４に記載の複合体のうちの１または複数とを含む、組成物。
  24. ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ発現細胞を作製する方法であって、
    （ｉ）単離細胞の集団に、請求項１５または１６に記載のＣＡＲをコードする核酸配列を形質導入するステップと；
    （ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記核酸配列の形質導入に成功した、前記単離細胞の亜集団を選択し、これにより、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ発現細胞を作製するステップと
    を含む、方法。
  25. 腫瘍の増殖の阻害を必要とする対象、任意選択でヒト対象における腫瘍の増殖を阻害する、および／またはがんの処置を必要とする患者、任意選択でヒト患者におけるがんを処置するための、請求項２０または２１に記載の単離細胞を含む、組成物。
  26. 前記単離細胞が、処置される前記対象に対して自家である、請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記腫瘍が、充実性腫瘍、任意選択で、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍、または前立腺がん腫瘍である、および／または前記がんが、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍、または前立腺がん腫瘍である、請求項２５または２６に記載の組成物。
  28. 腫瘍細胞またはがん細胞が、ＨＬＡ−Ｇを発現または過剰発現させる、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の組成物。
  29. 患者が、ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いのか、高くないのかを決定するための、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体を含む組成物であって、前記組成物が、前記患者から単離された腫瘍試料と接触させられ、前記腫瘍試料に結合した前記抗体の存在が検出されることを特徴とし、前記腫瘍試料に結合した抗体の存在は、前記患者が、前記ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いことを指し示し、前記腫瘍試料に結合した前記抗体の非存在は、前記患者が、前記ＨＬＡ−Ｇ療法に応答する可能性が高くないことを指し示す、組成物。
  30. 前記ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ療法が、前記ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いと決定された前記患者へと投与されることを特徴とする、請求項２９に記載の組成物。
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